WO2014136028A1 - Levures mutantes ayant une production accrue de lipides et d'acide citrique - Google Patents

Levures mutantes ayant une production accrue de lipides et d'acide citrique Download PDF

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WO2014136028A1
WO2014136028A1 PCT/IB2014/059343 IB2014059343W WO2014136028A1 WO 2014136028 A1 WO2014136028 A1 WO 2014136028A1 IB 2014059343 W IB2014059343 W IB 2014059343W WO 2014136028 A1 WO2014136028 A1 WO 2014136028A1
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endogenous
glycerol
coa
gene
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PCT/IB2014/059343
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Inventor
Jean-Marc Nicaud
Athanasios Beopoulos
Séraphim PAPANIKOLAOU
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique
Centre National De La Recherche Scientifique
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01079—2-Methylcitrate dehydratase (4.2.1.79)

Definitions

  • the present invention relates to mutant yeasts having high production of lipids and citric acid.
  • Some oleaginous microorganisms are capable of converting substrates, such as fats or glycerol, into lipids, especially triglycerides and fatty acids. These oleaginous microorganisms have the capacity to accumulate significant amounts of lipids, at least 20% of their dry matter.
  • yeasts there are a few so-called unconventional oleaginous species, among which mention may be made of the genera Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon or Yarrowia (see for reviews Beopoulos et al., 2009a, Papanikolaou et al. al, 201 la and 2011b).
  • Yarrowia lipolytica is a hemiascomycete yeast. It is considered as a model of bioconversion for the production of proteins, enzymes and lipid derivatives (see for review Nicaud, 2012). It is naturally present in polluted environments of oil and especially in the heavy fractions, which testifies of its potential of degradation of the organic substrates. This yeast has already been successfully tested for its ability to degrade organic substrates such as naphthalene, dibenzofuran and trinitrotoluene (see for review: Thevenieau et al, 2009a and 2009b, Beopoulos et al., 2009b and 2009c).
  • Y. lipolytica is one of the most studied oleaginous yeasts because of not only its ability to accumulate lipids up to more than 50% o of its dry matter according to a defined culture profile, but also its unique ability to accumulate linoleic acid at high levels (more than 50% of the fatty acids produced) as well as high value added lipids, such as stearic acid, palmitic acid and oleic acid, in proportions similar to those found in cocoa butter (Papanikolaou et al, 2001, Papanikolaou et al, 2010).
  • Y. lipolytica can be efficiently cultured on a wide variety of hydrophobic compounds (free fatty acids, triacylglycerols, n-alkanes, etc.), thanks to the expression of multigene families encoding key enzymes involved in the decomposition of these compounds (for example, acyl-CoA oxidases, lipases).
  • the uptake of these lipid substrates may result in a modification of the fatty acid composition of both the residual substrate and the accumulated fat, sometimes resulting in the synthesis of lipids with interesting properties (Papanikolaou et al, 2001; Beopoulos et al. , 2009a, Papanikolaou et al, 2010, 201 la and 2011b).
  • lipids in Y. lipolytica is carried out either by the de novo biosynthesis of fatty acids via the production of fatty acid precursors such as acetyl-CoA and malonyl-CoA and their integration into the lipid biosynthesis pathway. (Kennedy's way), either by the ex novo accumulation, via the incorporation of the pre-existing fatty acids into the fermentation medium or deriving from the hydrolysis of the oils, fats, triglycerides and methyl esters of the culture medium and their accumulation inside the cell.
  • the main pathways of de novo bio synthesis of lipids in Y. lipolytica and Saccharomyces cerevisiae S. cerevisiae; so-called non-oleaginous yeast
  • ⁇ -oxidation is a pathway of fatty acid degradation that occurs mainly in peroxisomes (whose biogenesis is controlled by the PEX genes). This pathway allows the formation of acetyl-CoA from even-chain fatty acids and propionyl-CoA from odd-chain fatty acids.
  • the ⁇ -oxidation comprises four successive reactions during which the carbon chain of the acyl-CoA is reduced by two carbon atoms. Once the reaction has been performed, the reduced acyl-CoA of two carbons can return to the spiral of ⁇ -oxidation (Lynen's helix) and undergo a further reduction of two carbons.
  • decarboxylation cycles may be interrupted depending on the nature of Facyl-CoA, the availability of substrate, the presence of coenzyme A, acetyl-CoA or the NAD + / NADH ratio.
  • TAG triacylglycerol fatty acids
  • the active form of acyl-CoA formed is oxidized by a molecule of Flavin Adenine Dinucleotide (F AD) to form a trans-A 2 -enoyl-CoA molecule by means of an acyl-CoA oxidase (AOX).
  • F AD Flavin Adenine Dinucleotide
  • AOX acyl-CoA oxidase
  • lipolytica has been widely described (Wang et al, 1999a, Lickova et al., 2004).
  • acyl-CoA oxidases in Y. lipolytica, encoded by the POX1 to 6 genes, which have different substrate specificities (Wang et al, 1999a and 1999b, Luo et al, 2000 and 2002).
  • the trans- ⁇ 2 - Enoyl-CoA is then hydrated with 2-enoyl-CoA hydratase.
  • the formed 3-hydroxyacyl CoA molecule is oxidized by NAD + to form a 3-ketoacyl-CoA molecule.
  • lipolytica generally a limitation in nitrogen or phosphate (Papanikolaou and Aggelis, 2009, Papanikolaou et al, 2011a ).
  • SCO lipids
  • nitrogen deficiency must be imposed only.
  • C carbon
  • N nitrogen
  • lipolytica cell growth is carried out on substrates based on glycerol or sugar ("oses"), it is capable of either producing in large quantities only intra-cellular fats (Tsigie et al, 2011, Fontanille et al, 2012) to produce only citric acid without accumulating significant amounts of cellular lipids (Anastassiadis et al, 2002, Papanikolaou et al, 2002 and 2008, Tai and Stephanopoulos, 2013). It has been reported that according to the culture conditions, Y.
  • lipolytica can simultaneously produce citric acid (-50 g / L) and lipids (-32% of its dry matter) (André et al, 2009), or sequentially produce cellular lipids and citric acid (Makri et al, 2010).
  • the biosynthetic pathway involved in limiting nitrogen to the oleaginous yeast culture medium for the production of lipids is known (see review by Beopoulos et al, 2009a).
  • the limitation of active nitrogen to deaminase which results in a decrease in the concentration of AMP (adenosine monophosphate) in the mitochondria.
  • This decrease in AMP concentration inhibits the enzyme isocitrate dehydrogenase, which catalyzes the conversion of isocitrate to ⁇ -ketoglutarate ( ⁇ -KG).
  • Aconitase catalyzes the isomerization of isocitrate to citrate in mitrochondria.
  • the citrate then exits mitochondria and is converted to acetyl-CoA and oxaloacetate by ATP-citrate in the cytosol.
  • Acetyl-CoA accumulated in large quantities in the cytosol allows the synthesis of fatty acid also in large quantities.
  • Mutant Y. lipolytica strains capable of producing higher amounts of lipid or citric acid than wild-type strains were obtained.
  • Rywiiiska et al. (2009) obtained mutant strains of Y. lipolytica acetate negative (ace " unable to grow on acetate as sole source of carbon and energy) able to bio-convert, in batch fermentation, glycerol (used as a substrate) citric acid more efficiently than the wild strain they derive from, Tai et al. (2012) obtained a genetically modified strain of Y.
  • DGA1 diacylglycerol acyltransferase
  • ACC1 acetyl-CoA carboxylase
  • mutant strains of yeast capable of accumulating greater amounts of lipids and / or citric acid compared to wild-type strains.
  • a genetically modified Yarrowia lipolytica yeast strain whose PHD1 gene (present on chromosome F, YALI0F02497g) coding for 2-methylcitrate dehydratase has been deleted, and grown on glycerol, not only exhibits slowed consumption of glycerol, but also increased production of lipids and citric acid, compared to the Yarrowia lipolytica W29 yeast strain of wild type from which it derives.
  • 2-methylcitrate dehydratase (nomenclature EC 4.2.1.79) is a mitochondrial protein that catalyzes the conversion of 2-methylcitrate to 2-methyl-cis-aconitate in the 2-methylcitrate cycle of propionate metabolism (Uchiyama et al. , 1982).
  • 2-methylcitrate dehydratase is a 520 amino acid protein encoded by the PHD1 gene (YALI0F02497g).
  • the amino acid sequence of Y. lipolytica CLIB122 2-methyl citrate dehydratase is available under accession number G1: 50554999 (or GI: 49650778) in the GENBANK database, and represented by the sequence SEQ ID NO 1.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding this 2-methylcitrate dehydratase is available under access number GI: 50554998 in the GENBANK database.
  • the inventors have determined that the amino acid sequence of Yarrowia lipolytica 2-methylcitrate dehydratase (SEQ ID NO: 1) has at least 55% identity and at least 70% similarity with the 2-methylcitrate dehydratases of hemiascomycetes.
  • lactis available under access number KLLA0E14213p in the Genoîevures database 59% identity and 74% similarity to that of Remothecium gossypii available under accession number ERGO0G08404p in the Genoîevures database, 61% of identity and 72% similarity to that of Candida glabrata available under access number CAGL0L09108p in the Genoîevures database, 67% identity and 78% »similarity to that of Pichia sorbitophila available under accession number PISO0A12716p in the Genoîevures database, and 67% identity and 79% similarity to that of Pichia sorbitophila available under access number PISO0B12783p in the Genoîevures database.
  • the inventors have also determined that the amino acid sequence of Yarrowia lipolytica 2-methylcitrate dehydratase (SEQ ID NO: 1) has at least 85% identity and at least 90% similarity with 2-methylcitrate dehydratases.
  • Candida strains of the same clade as that of Y. lipolytica in particular 98.7% identity and 99.6% similarity with that of the CBS9722 strain of C gallium, 97.9% identity and 99, 4% similarity with that of C, yahushimensis strain CBS10253, 96.5% identity and 98.1% similarity with that of C. phangngensis strain CBS 10407, 95.6% identity and 98 , 5% similarity to that of C.
  • alimentaria strain CBS10151 and 87.3% identity and 94% similarity to that of C. hispaniensis strain CBS9996, Inhibition of the expression or activity of 2-methyl citrate dehydratase in yeast provides a mutant yeast strain capable of producing lipids and citric acid when grown on medium. suitable (eg, glycerol) not deficient.
  • one or more additional mutations such as mutations leading to a deficiency of beta-oxidation of fatty acids (eg inhibition of endogenous genes POX1-6, MFE1, POT1 and / or PEX), and / or leading to the accumulation of lipids (eg, inhibition of the endogenous gene GUT2 and / or overexpression of the endogenous gene GPD1) and / or leading to a deficiency of remobilization of triglycerides (eg, inhibition of endogenous TGL3 and / or TGL4 genes) and / or leading to an increase in lipid production efficiency (eg, overexpression of endogenous ACC1, LRO1 DGA1 and / or DGA2 genes) and / or an increase in NADPH cofactor production for lipid synthesis (eg, overexpression of the MAE1 endogenous gene) and / or leading to the production of acetyl-
  • mutations leading to a deficiency of beta-oxidation of fatty acids eg inhibition
  • the subject of the present invention is therefore a mutant yeast strain, characterized in that the expression or the activity of the endogenous 2-methylcitrate dehydratase (EC 4.2.1.79) of said strain is inhibited and that in addition the expression or the activity of acyl-coenzyme A oxidases (EC 6.2.1.3), the multifunctional protein of beta-oxidation (EC 4.2.1.74), 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase (EC 2.3.1.16), one or more proteins encoded by a PEX gene involved in the metabolism of yeast peroxisomes (preferably peroxin 10), one or more triacylglycerol lipases (EC 3.1.1.3) and / or glycerol-3-phosphate dehydrogenase ( EC 1.1.99.5) endogenous of said strain is inhibited, and / or one or more endogenous gene genes (all genes) encoding a glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD (+)) (EC 1.1.1
  • Said mutant strain of yeast is capable of producing a greater amount of lipid and / or citric acid than the parent strain of yeast from which it derives.
  • the present invention includes all yeast strains and in particular yeast strains belonging to the genera Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Lipomyces, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizzosaccharomyces, Trichosporon or Yarrowia.
  • said yeast strain is an oleaginous yeast strain.
  • Oleaginous yeast strains are well known to those skilled in the art. They have the capacity to accumulate significant amounts of lipids, at least 20% of their dry matter (see Ratledge, 1994). They generally belong to the genus Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium (e.g., Rhodosporidium toruloides), Rhodotorula (e.g., Rhodotura glutinis), Trichosporon or Yarrowia.
  • a more particularly preferred strain in the sense of the present invention is a Yarrowia yeast strain, more preferably Yarrowia lipolytica.
  • said mutant yeast strain is auxotrophic for leucine (Leu " ) and optionally for Porotidine-5'-phosphate decarboxylase (Ura " ),
  • 2-methylcitrate dehydratase an enzyme (EC 4.2.1.79) which catalyzes the conversion of 2-methyl-citrate to 2-methyl-cis-aconitate and which has at least 55% identity, and in ascending order preferably at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identity, or 70% similarity, and in ascending order preferably at least 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99% or 100% of similarity with the SEQ ID NO: 1 acid sequence, when the sequences are aligned along their entire length.
  • said 2-methylcitrate dehydratase comprises a prpD region (corresponding to the domain PR 09425 in the CDD database; Marchler-Bauer et al., 201 1) having the consensus sequence SEQ ID NO: 8 (corresponding to amino acids 37 to 517 of the sequence SEQ ID NO: 1).
  • the POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 and POX6 genes encode 6 isoforms of acyl-coenzymeA oxidase (AOX, EC 6.2.1.3) involved, less partially, in the ⁇ -oxidation of fatty acids. Inhibition, partial or total, of the expression or the activity of these isoenzymes leads to the increase of the lipid accumulation due to the absence of consumption of synthesized lipids. More particularly, the coding sequence of the POX1 to POX6 genes and the peptide sequence of AOX1 to AOX6 of Y.
  • AOX5 YALIOC23859g / YALIOC23859p
  • POX6 I AOX6 YALI0E06567g / YALI0E06567p.
  • the peptide sequences of Y. lipolytica acyl-CoA oxidases have 45% identity or 50% similarity with those of other yeasts. The degree of identity between the acyl-CoA oxidases varies from 55 to 70% (or 65 to 76% similarity) (International Application WO 2006/064131).
  • a method of inhibiting endogenous AOX expression in a Y. lipolytica strain has been described in International Applications WO 2006/064131, WO 2010/004141 and WO 2012/001144.
  • the multifunctional protein of beta-oxidation has three domains: two domains with 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activity (EC 4.2.1.74, domains A and B) and one domain with enoyl-CoA hydratase activity (EC 4.2.1.17, domain C),
  • This enzyme is encoded by the gene MFE1 ("Multifunctional enzyme type 1") (Haddouche et al, 2011). More particularly, the coding sequence of the MFE1 gene and the peptide sequence of Y. lipolytica CLIB122 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and enoyl-CoA hydratase are available in Genolevures or GenBank databases under the access number or the name. next: YALI0E 15378g / YALI0E 15378p. A method of inhibiting the expression of said endogenous multifunctional protein in a Y. lipolytica strain has been described by Haddouche et al. (2011).
  • 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase (EC 2.3.1.16) is encoded by the gene POT1 ("Peroxisomal Oxoacyl Thiolase 1") (Berninger et al, 1993). More particularly, the coding sequence of the POT1 gene and the peptide sequence of the 3-oxoacyl-CoA thiolase of Y. lipolytica CLIB122 are available in the Genolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI018568g / YALI018568p . A method of inhibiting the expression of endogenous 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase in a Y. lipolytica strain has been described by Berninger et al (1993).
  • the PEX genes involved in the metabolism of peroxisomes in yeasts, in particular in Y. lipolytica are described in Table 1 below.
  • the coding sequence PEX genes are available in Genolevures or GenBank databases. It has been described in International Application WO 2006/064131 and by Thevenieau et al. (2007) that when the peroxisome is not properly assembled or when it is not functional, the fatty acids are not properly degraded.
  • the endogenous expression or activity of peroxin (encoded by the PEX10 gene) of said strain is inhibited.
  • PEX23 PEX30 YLR324w YALI0D273O2g Integral peroxisomal peroxin membrane
  • PEX32 YBR168w
  • triacylglycerol lipases (EC 3.1.1.3) are encoded by TGL genes (Beopoulos et al, 2009 and 2012).
  • the expression or the activity of the lipase triacylglycerol encoded by the TGL3 gene and / or the lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene, preferably of the lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene is inhibited.
  • lipolytica CLIB122 are available in the Genolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALIOD 17534g / YALIOD 17534p .
  • the coding sequence of the TGL4 gene and the peptide sequence of the lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene of Y. lipolytica CLIB122 are available in the Génolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALIOF1001Og / YALI0F10010p.
  • a method of inhibiting the expression of an endogenous triacylglycerol lipase in a strain of Y. lipolytica has been described in International Application WO 2012/001144 and by Dulermo et al. (2013).
  • glycerol 3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.99.5) is encoded by the GUT2 gene (Beopoulos et al., 2008). More particularly, the GUT2 gene encodes the Gut2p isoform of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, which catalyzes the glycerol-3-phosphate oxidation reaction to DHAP ("glycerol dehydratase-reactivation factor") (Beopoulos et al, 2008). ). The coding sequence of the GUT2 gene and the peptide sequence of the glycerol 3-phosphate dehydrogenase of Y.
  • lipolytica CLIB122 are available in the Genolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0B 13970g / YALI0B 13970p.
  • a method of inhibiting the expression of said endogenous glycerol 3-phosphate dehydrogenase in a strain of Y. lipolytica has been described in International Applications WO 2010/004141 and WO 2012/001 144 and by Beopoulos et al (2008).
  • glycerol-3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.18) is encoded by the GPD1 gene (Dulermo et al., 201 1). More particularly, the coding sequence of the GPD1 gene and the peptide sequence of the glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD (+)) of Y. lipolytica CLIB122 are available in Génolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0B02948g / YALI0B02948p. A method of overexpressing endogenous glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD (+)) in a Y. lipolytica strain has been described in International Application WO 2012/001144.
  • acetyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.2) is encoded by the ACC1 gene (Tai et al, 2012, Beopoulos et al, 2012). More particularly, the coding sequence of the ACC1 gene and the peptide sequence of acetyl-CoA carboxylase of Y. lipolytica CLIB122 are available in the Génolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0C11407g / YALI0C11407p. A method of overexpressing endogenous acetyl-CoA carboxylase in a Y. lipolytica strain has been described by Thai et al (2012).
  • acyl-CoA diacylglycerol acyltransferases
  • DGAT EC 2.3.1.20
  • DGA1 and DGA2 are coded by two genes: DGA1 and DGA2 (Beopoulos et al, 2009 and 2012, Tai et al, 2012, International Application WO 2012/001144).
  • DGA1 and DGA2 are coded by two genes: DGA1 and DGA2 (Beopoulos et al, 2009 and 2012, Tai et al, 2012, International Application WO 2012/001144).
  • the coding sequence of the gene DGA1 and the peptide sequence of acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferases 1 of Y. lipolytica CLIB122 are available in the Genolevures or GenBank databases under the access number or the following name: YALI0E32769g / YALI0E32769p .
  • the coding sequence of the DGA2 gene and the peptide sequence of the acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferases 2 of Y. lipolytica CLIB122 are available in the Genolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0D07986g / YALI0D07986p.
  • an acyl-CoA: diacylglycerol acyl transferase has been described by ani et al (2013).
  • a method of overexpressing one or both endogenous DGATs (DGAT1 and / or DGAT2) in a strain of Y. lipolytica has been described by Beopoulos et al (2012) and by Tai et al. (2012).
  • the DGA2 gene is overexpressed in the strain according to the invention.
  • citrate lyase In yeasts, citrate lyase (E.C. 2.3.3.8) consists of two subunits (A and B) encoded by two genes (ACL1 and ACL2, respectively) (Beopoulos et al, 2009). ATP citrate lyase from certain oleaginous yeasts has been characterized by Boulton et al (1981). More particularly, the coding sequence of the ACL1 and ACL2 genes and the peptide sequence of Y. lipolytica CLIB122 ⁇ citrateasease subunits A and B are available in Genolevures or GenBank databases under access numbers or names.
  • ACL1 I subunit A YALI0E34793g / YALI0E347939p
  • ACL2 I subunit B YALI0D24431g / YALI0D24431p.
  • the malic enzyme (EC 1.1.1.40) is encoded by the MAE1 gene (Beopoulos et al, 2009a). More particularly, the coding sequence of the MAE1 gene and the Peptide sequence of the Y. lipolytica CLIB122 malic enzyme is available in Genolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0E18634g / YALI0E18634p. A method of overexpressing the endogenous malic enzyme in a strain of Y. lipolytica has been described by Zhang et al. (2013).
  • PDAT phospholipiddiacylglycerol acyltransferase
  • LRO1 encoded by the LRO1 gene, is an enzyme capable of catalyzing the formation of triacylglycerol from 1, 2-i7z-diacylglycerol (Beopoulos et al, 2009 and 2012). More particularly, the coding sequence of the LRO1 gene and the peptide sequence of the phospholipid: diacylglycerol acyltransferase of Y. lipolytica CLIB122 are available in the Genolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0E16797g / YALI0E16797p. A method of overexpressing endogenous phospholipid: diacylglycerol acyltransferase in a strain of Y. lipolytica has been described by Beopoulos et al. (2012).
  • acetate-CoA ligase In yeasts, acetate-CoA ligase, acetyl-CoA synthetase (EC 6.2.1.1), acyl-CoA synthetase and coumarate-CoA ligases (EC 6.2.1.12) are proteins belonging to the Génolevure GL3C0072 family.
  • Acetyl-CoA synthetase (EC 6.2.1.1) belongs to the Génolevure GL3C0072 family. It is encoded by the ACS2 gene. More particularly, the coding sequence of the ACS2 gene and the peptide sequence of Y. lipolytica CLIB122 acetyl-CoA synthetase are available in the Génolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0F05962g / YALI0F05962p. The overexpression & ACS2 makes it possible to increase the acetyl-CoA pool. A method of overexpressing endogenous acetyl-CoA synthetase in a strain of Y. lipolytica has been described by Zhou et al (2012).
  • Delta (9) -desaturase (EC 1.14.19.1) is encoded by the OLEl gene, (Thevenieau and Nicaud, 2013). More particularly, the coding sequence of the OLEl gene and the Peptide sequence of Del ta (9) -desaturas of Y. lipolytica CLIB122 are available in Genolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0C05951g / YALI0C05951p. Overexpression of OLE / enriches the oil produced in C 18: 1 ( n- ).
  • Delta (12) -desaturase (EC 1.14.19.6) is encoded by the FAD2 gene
  • the coding sequence of the FAD2 gene and the peptide sequence of the Y. lipolytica delta (12) -desaturase CLIB122 are available in the Genolevures or GenBank databases under the access number or the following name: YALI0B10153g / YALI0B10153p .
  • Overexpression of FAD2 enriches the oil produced in C18: 2 (n-6) .
  • a method of overexpressing Mortierella alpina delta (12) -desaturase in a strain of Y. lipolytica has been reported by Chuang et al. (2009).
  • Finvertase In yeasts, Finvertase (EC 3.2.1.26) is encoded by the SUC2 gene (Lazar et al, 2013). More particularly, the coding sequence of the SUC2 gene and the peptide sequence of S. cerevisiae Pinvertase are available in the Uniprot or GenBank databases under the accession number or the following name: P00724 / YIL162W. Overexpression of SUC2 allows the use of pure sucrose and molasses (Lazar et al, 2013). A method of overexpressing endogenous acetyl-CoA synthetase in a strain of S. cerevisiae has been described by Chen et al. (2010).
  • An advantageous strain within the meaning of the present invention is a mutant strain of yeast, preferably a mutant strain of Yarrowia, more preferably of Yarrowia lipolytica, in which the expression or the activity of the endogenous 2-methylcitrate dehydratase of said strain.
  • the 2-methylcitrate dehydratase encoded by the PHD1 gene in the case of Yarrowia is inhibited, and the ⁇ -xydation of the fatty acids of said strain is also inhibited.
  • Inhibition of the ⁇ -oxidation of fatty acids of said strain can be achieved by inhibiting the expression or activity of all endogenous acyl-coenzyme oxidase isoforms of said strain (in particular the 6 acyl-isoforms of coenzymeA oxidase encoded by the POX1 to POX6 genes in the case of Yarrowia) and / or by inhibiting the expression or the activity of the multifunctional protein of the endogenous beta-oxidation of said strain (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation).
  • the inhibition of ⁇ -oxidation of the fatty acids of said strain is obtained by inhibiting the expression or the activity of all the endogenous acyl-coenzymeA oxidase isoforms of said strain (in particular the 6 isoforms of acyl-coenzymeA oxidase encoded by the genes POXÎ to POX6 in the case of Yarrowia) and / or by inhibiting the expression or the activity of the multifunctional protein of the endogenous beta-oxidation of said strain (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation coded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia).
  • Another advantageous strain within the meaning of the present invention is a mutant strain of yeast, preferably a mutant strain of Yarrowia, more preferably of Yarrowia lipolytica, in which the expression or the activity of the endogenous 2-methylhydrate dehydratase (in particular the 2-methyl citrate dehydratase encoded by the gene PHD1 in the case of Yarrowia), one or more endogenous triacylglycerol lipases (in particular the lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia) and the multifunctional protein of the endogenous beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation coded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia) of said strain is inhibited.
  • Y. lipolytica strain JMY3433 described hereinafter.
  • Another advantageous strain within the meaning of the present invention is a mutant strain of yeast, preferably a mutant strain of Yarrowia, more preferably of Yarrowia lipolytica, in which the expression or the activity of endogenous 2-methylcitrate dehydratase (in particularly the 2-methylcitrate dehydratase encoded by the gene PHD1 in the case of Yarrowia), one or more endogenous triacylglycerol lipases (in particular the lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia) and the multifunctional protein of the endogenous beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation coded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia) of said strain is inhibited, and the endogenous genes encoding an acyl-CoA; diacylglycerol acyltransferase (in particular the DGA2 gene in the case of Yarrowia) and a g
  • Another advantageous strain within the meaning of the present invention is a mutant strain of yeast, preferably a mutant strain of Yarrowia, more preferably of Yarrowia lipolytica, in which the expression or the activity of endogenous 2-methylcitrate dehydratase (in particularly the 2-methylcitrate dehydratase encoded by the gene PHDÎ in the case of Yarrowia), of one or more endogenous triacylglycerol lipases (in particular lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia) and the multifunctional protein of endogenous beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation coded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia) of said strain is inhibited , and the endogenous genes encoding an acyl-CoA: diacylglycerol acyl transferase e (in particular the DGA2 gene in the case of Yarrowia), a g
  • Another advantageous strain within the meaning of the present invention is a mutant strain of yeast, preferably a mutant strain of Yarrowia, more preferably of Yarrowia lipolytica, in which the expression or the activity of the endogenous 2-methyl citrate dehydratase (in particular the 2-methyl citrate dehydratase encoded by the gene PHD1 in the case of Yarrowia), one or more endogenous triacylglycerol lipases (in particular the lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia) and the multifunctional protein endogenous beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation encoded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia) of said strain is inhibited, and the endogenous genes encoding an acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (in particular the DGA2 gene in the case of Yarrowia), a glycerol-3
  • Another advantageous strain within the meaning of the present invention is a mutant strain of yeast, preferably a mutant strain of Yarrowia, more preferably of Yarrowia lipolytica, in which the expression or the activity of endogenous 2-methylcitrate dehydratase (in particularly the 2-methylcitrate dehydratase encoded by the gene PHD1 in the case of Yarrowia), one or more endogenous triacylglycerol lipases (in particular the lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia) and the multifunctional protein of the endogenous beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of the beta-oxidation coded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia) of said strain is inhibited, and the endogenous genes encoding an acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (in particular the DGA2 gene in the case of Yarrowia), a g
  • Another advantageous strain within the meaning of the present invention is a mutant strain of yeast, preferably a mutant strain of Yarrowia, more preferably of Yarrowia lipolytica, in which the expression or the activity of endogenous 2-methylcitrate dehydratase (in particularly the 2-methylcitrate dehydratase encoded by the gene PHD1 in the case of Yarrowia), one or more endogenous triacylglycerol lipases (in particular the lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia), the multifunctional protein of the endogenous beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation encoded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia) and one or more endogenous peroxins, such as peroxin 10 (in particular peroxin 10 encoded by the gene PEX10 in the case of Yarrowia) of said strain is inhibited, and endogenous genes encoding acyl-Co
  • Another advantageous strain within the meaning of the present invention is a mutant strain of yeast, preferably a mutant strain of Yarrowia, more preferably of Yarrowia lipolytica, in which the expression or the activity of endogenous 2-methylcitrate dehydratase (in particularly the 2-methylcitrate dehydratase encoded by the gene PHDÎ in the case of Yarrowia), one or more endogenous triacylglycerol lipases (in particular the lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia) and the multifunctional protein of the endogenous beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation coded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia) of said strain is inhibited, and the endogenous genes encoding an acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (in particular the DGA2 gene in the case of Yarrowia), a gly
  • Another advantageous strain in the sense of the present invention is a mutant strain of yeast, preferably a mutant strain of Yarrowia, preferably of Yarrowia lipolytica, in which the expression or the activity of the endogenous 2-methylcitrate dehydratase (in particular the 2-methylcitrate dehydratase encoded by the PHD1 gene in the case of Yarrowia), of one or more endogenous triacylglycerol lipases (in particular the triacylglycerol lipase encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia) and the multifunctional protein of endogenous beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation coded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia) of said strain is inhibited, and the endogenous genes encoding an acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (in particular the DGA2 gene in the case of Yarrowia), a gly
  • Another advantageous strain within the meaning of the present invention is a mutant strain of yeast, preferably a mutant strain of Yarrowia, more preferably of Yarrowia lipolytica, in which the expression or the activity of endogenous 2-methylcitrate dehydratase (in particularly the 2-methylcitrate dehydratase encoded by the gene PHDÎ in the case of Yarrowia), one or more endogenous triacylglycerol lipases (in particular the lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia) and the multifunctional protein of the endogenous beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation coded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia) of said strain is inhibited, and the endogenous genes encoding an acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (in particular the DGA2 gene in the case of Yarrowia), a gly
  • Another advantageous strain within the meaning of the present invention is a mutant strain of yeast, preferably a mutant strain of Yarrowia, more preferably of Yarrowia lipolytica, in which the expression or the activity of endogenous 2-methylcitrate dehydratase (in particular the 2-methylcitrate dehydratase encoded by the gene PHDI in the case of Yarrowia), of one or more endogenous triacylglycerol lipases (in particular lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia) and the multifunctional protein of endogenous beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation coded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia) of said strain is inhibited , and the endogenous genes encoding an acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (in particular the DGA2 gene in the case of Yarrowia), a gly
  • Another advantageous strain within the meaning of the present invention is a mutant strain of yeast, preferably a mutant strain of Yarrowia, more preferably of Yarrowia lipolytica, in which the expression or the activity of the endogenous 2-methylcitrate dehydratase of said strain is inhibited, expression of the endogenous TGL4 gene of said strain is inhibited and the endogenous GPD1 and ACC1 genes of said strain are overexpressed.
  • Inhibition of the expression or activity of an enzyme defined in the present invention may be total or partial. It can be obtained in various ways by methods known in themselves to those skilled in the art.
  • this inhibition can be obtained by mutagenesis of the gene encoding said enzyme.
  • Mutagenesis of the gene coding for said enzyme may occur at the level of the coding sequence or sequences for regulating the expression of this gene, in particular at the level of the promoter, leading to an inhibition of the transcription or translation of the said enzyme.
  • the mutation at the level of the coding sequence is carried out in the sequence coding for the prpD region of 2-methylcitrate dehydratase.
  • Mutagenesis of the gene encoding said enzyme can be performed by genetic engineering. For example, it is possible to delete all or part of said gene and / or to insert an exogenous sequence. Methods for deleting or inserting a given genetic sequence into yeast, particularly Y, lipolytica, are well known to those skilled in the art (see review Madzak et al., 2004). By way of example, it is possible to use the method called POP ⁇ / POP OUT which has been used in yeasts, particularly in Y. lipolytica, for the deletion of the LEU2, URA3 and XPR2 genes (Barth et al. Gaillardin, 1996).
  • a very advantageous method according to the present invention consists in replacing the coding sequence of the gene coding for the said enzyme with an expression cassette containing the sequence of a gene coding for a selection marker (eg, the URA3 gene [YALI0E26719g] coding for orotidine-5'-phosphate decarboxylase). It is also possible to introduce one or more point mutations in the gene coding for said enzyme, having the consequence of shifting the reading frame and / or of introducing a stop codon into the sequence and / or of inhibiting transcription or translation. of the gene encoding said enzyme.
  • a selection marker eg, the URA3 gene [YALI0E26719g] coding for orotidine-5'-phosphate decarboxylase.
  • Mutagenesis of the gene coding for said enzyme can also be carried out using physical agents (for example radiation) or chemical agents. This mutagenesis also makes it possible to introduce one or more point mutations in the gene encoding said enzyme.
  • the mutated gene coding for said enzyme may be identified for example by PC using primers specific for said gene.
  • selection markers for the complementation of an auxotrophy also commonly referred to as auxotrophy markers, are well known to those skilled in the art.
  • the selection marker URA3 is well known to those skilled in the art. More specifically, a yeast strain whose URA3 gene (sequence available in Genolevures databases under the name YALI0E26741g or UniProt under access number Q12724), coding for orotidine-5'-phosphate decarboxylase, is inactivated (for example by deletion), will not be able to grow on a medium not supplemented with uracil.
  • the integration of the selection marker URA3 in this yeast strain will then restore the growth of this strain on a medium lacking uracil.
  • the selection marker LEU2 described in particular in US Pat. No. 4,937,189 is also well known to those skilled in the art. More specifically, a yeast strain whose LEU2 gene (YALI0C00407g), encoding ⁇ -isopropylmate dehydrogenase e, is inactivated (for example by deletion), will not be able to grow on a medium not supplemented with leucine. As before, the integration of the selection marker LEU2 into this yeast strain will then restore the growth of this yeast. strain on a medium not supplemented with leucine.
  • the ADE2 selection marker is also well known to those skilled in the field of yeast transformation.
  • a yeast strain whose ADE2 gene (YALI0B23188g), coding for phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, is inactivated (for example by deionization), will not be able to grow on a medium not supplemented with adenine.
  • the integration of the selection marker ADE2 in this yeast strain will then restore the growth of this strain on a medium not supplemented with adenine.
  • Y. lipolytica strains auxotrophic Leu "Ura” were described by Barth and Gaillardin, 1996.
  • Y. lipolytica strain auxotrophic Leu "Ura” Ade “have been described in particular in application WO 2009/098263.
  • the subject of the present invention is also a process for obtaining a mutant yeast strain according to the present invention from a parent yeast strain, comprising a step of mutagenesis of the gene coding for 2-methylcitrate dehydratase as defined. above in said parent yeast strain, and furthermore one or more mutagenesis steps in said parent yeast strain leading to the inhibition of one or more of the endogenous genes encoding acyl-coenzyme A oxidases (EC 6.2.1.3 ), the multi-functional protein of beta-oxidation (EC 4.2.1.74), 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase (EC 2.3.1.16), the proteins encoded by the PEX genes involved in the metabolism of yeast peroxisomes (from preferably peroxin 10), lipases triacylglycerol (EC 3.1.1.3) and / or glycerol 3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.99.5) (in particular the genes POX1 to POX6, MFE1, POT1, PEX, PEX
  • said method comprises:
  • the inhibition of ⁇ -oxidation of the fatty acids of said strain can be carried out as described above; or
  • mutagenesis steps leading to the inhibition of endogenous genes of said strain coding for 2-methylcitrate dehydratase (in particular 2-methylcitrate dehydratase encoded by the PHD1 gene in the case of Yarrowia), one or more triacylglycerol lipases (in particularly the lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia), the multifunctional protein of beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation coded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia) and one or more peroxins such as peroxin (in particular peroxin encoded by the PEX10 gene in the case of Yarrowia), and mutagenesis steps leading to overexpression of one or more of the endogenous genes of said acyl-encoding strain.
  • 2-methylcitrate dehydratase in particular 2-methylcitrate dehydratase encoded by the PHD1 gene in the case of Yarrowia
  • CoA diacylglycerol acyltransferase (in particular the DGA2 gene in the case of Yarrowia), a glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD (+)) (in particular the gene GPD1 in the case of Yarrowia) and ATP citrate lyase (in particular the ACL1 and ACL2 genes in the case of Yarrowia); or
  • steps of mutagenesis leading to the inhibition of the endogenous genes of said strain coding for 2-methylcitrate dehydratase (in particular the 2-methylcitrate dehydratase encoded by the PHD1 gene in the case of Yarrowia), one or more triacylglycerol lipases (in particular the triacylglycerol lipase encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia) the multifunctional protein of beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation coded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia), and steps of mutagenesis leading to the overexpression of one or more of the endogenous genes of the said strain encoding an acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (in particular the DGA2 gene in the case of Yarrowia), a glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD (+) ) (in particular the GPD1 gene in the case
  • mutagenesis steps leading to the inhibition of endogenous genes of said strain coding for 2-methylcitrate dehydratase (in particular 2-methylcitrate dehydratase encoded by the PHD1 gene in the case of Yarrowia), one or more triacylglycerol lipases (in particular the triacylglycerol lipase encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia) and the multifunctional protein of beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation coded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia), and steps of mutagenesis leading to the overexpression of one or more of the endogenous genes of the said strain encoding an acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (in particular the DGA2 gene in the case of Yarrowia), a glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD (+) ) (in particular the GPD1 gene in the case of
  • mutagenesis steps leading to the inhibition of the endogenous genes of said strain coding for 2-methylcitrate dehydratase (in particular the 2-methylcitrate dehydratase encoded by the PHD1 gene in the case of Yarrowia), one or more endogenous triacylglycerol lipases (in especially the lipase triacylglycerol encoded by the TGL4 gene in the case of Yarrowia) and the multifunctional protein of endogenous beta-oxidation (in particular the multifunctional protein of beta-oxidation coded by the MFE1 gene in the case of Yarrowia), and mutagenesis steps leading to the overexpression of one or more of the endogenous genes of the said strain encoding an acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (in particular the DGA2 gene in the case of Yarrowia), a glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD (+)) (NAD (+)) (
  • Inhibition and / or overexpression of endogenous genes can be performed by genetic engineering.
  • Said parent yeast strain may be a yeast strain of wild-type (e.g., strain Y. lipolytica W29) or mutant (e.g., strain Y. lipolytica Po d).
  • the mutagenesis step comprises the deletion of the coding sequence of the gene coding for a given enzyme (eg, 2-methylcitrate dehydratase) and optionally the replacement of this coding sequence by a sequence exogenous, such as, for example, the sequence of a gene encoding a selectable marker (eg, the URA3 gene).
  • a given enzyme eg, 2-methylcitrate dehydratase
  • a sequence exogenous such as, for example, the sequence of a gene encoding a selectable marker (eg, the URA3 gene).
  • the present invention also relates to a process for increasing the production of lipids and / or citric acid of a yeast strain, characterized in that the expression or the activity of the yeast strain is inhibited in said yeast strain.
  • 2-methylcitrate dehydratase 2-methylcitrate dehydratase.
  • the method for increasing the production of lipids further comprises the inhibition in said yeast strain of the expression of one or more of the endogenous genes encoding acyl-coenzyme A oxidases (EC 6.2.1.3 ), the multifunctional protein of beta-oxidation (EC 4.2.1.74), the 3-oxoacyl-co enzyme A thiolase (EC 2.3.1.16), the proteins encoded by the PEX genes involved in the metabolism of yeast peroxisomes, in particular peroxin 10, triacylglycerol lipases (EC 3.1.1.3) and / or glycerol 3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.99.5) (in particular the POX1 to POX6, MFE1, POT1, PEX, TGL3, TGL4 and GUT2 genes in the case of Yarrowia) and / or overexpression in said yeast strain of one or more of the endogenous genes encoding a glycerol-3-phosphate dehydrogenase (NAD (+)) (
  • the present invention also relates to the use of a mutant yeast strain whose expression or the activity of endogenous 2-methylcitrate dehydratase (EC 4.2.1.79) of said strain is inhibited for the production of lipids and / or or citric acid.
  • a mutant yeast strain according to the present invention as defined above is used for the production of lipids and / or citric acid.
  • Lipid production may be favored over citric acid production when the mutant strain of yeast according to the present invention is grown by controlling the value of the ratio between the rate of carbon consumption and the rate of nitrogen consumption, as described in International Application WO 2010/076432. Lipid production can also be favored over citric acid production using a mutant strain according to the present invention overexpressing the genes encoding ATP citrate lyase, ACC (acetyl-coA carboxylase), DGA1 (diacylglycerol). acyltransferase 1) and / or DGA2 (diacylglycerol acyltransferase 2). Methods for promoting lipid accumulation are also described by Beopoulos et al. (2009).
  • the present invention also relates to a method for producing lipids and / or citric acid, comprising a step of culturing a mutant strain of yeast whose expression or the activity of 2-methylcitrate dehydratase (EC 4.2 .1.79) endogenous of said strain is inhibited on a suitable medium.
  • the process for producing lipids and / or citric acid comprising a step of culturing a mutant yeast strain according to the present invention as defined above on a suitable medium.
  • the medium contains glucose and / or glycerol as a carbon source, preferably the medium contains as glycerol carbon source only.
  • Glycerol can be crude or pure.
  • said medium is not deficient in nitrogen.
  • lipids can be favored over the production of citric acid as indicated above.
  • Figure 1 Kinetics of ammonium ion (A) consumption, biomass production (B), glycerol consumption (C) and total citric acid (D) production during growth of strains of Yarrowia lipolytica W29 and JMY1203 grown on a medium containing glycerol (Glol) limited in nitrogen.
  • Figure 2 Kinetics of total lipids in dry biomass (%, w / w) during growth of strains of Yarrowia lipolytica W29 (A) and JMY1203 (B) in a nitrogen-limited glycerol-based medium.
  • Figure 3 Schematic representation of the construction of mutant strains according to the invention.
  • FIG. 4 Visualization of lipid accumulation by BodiPy staining of lipid bodies produced by strains JMY3776 and JMY4209.
  • Figure 5 followsed by different parameters (growth, glycerol consumption, production of citrate, mannitol and fatty acids) during the growth of strains JMY2900, JMY3776 and JMY4079 in Glol 6% and Glol9%.
  • EXAMPLE PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF MUTANT STRAINS OF YARROWIA LIPOLYTICA YEAST IN WHICH AT LEAST
  • the mutant strains of Y. lipolytica according to the present invention are derived from the auxotrophic strain of Y. lipolytica Pold (Leu " Ura " CLIB 139, genotype MatA Ura3-302, Leu2-270, xpr2-322), itself derived from the wild strain of Y. lipolytica W29 (genotype MatA; ATCC20460) by genetic modification.
  • the Pold and W29 strains have been described by Barth and Gaillardin (1996). These two strains Pold and W29 show no differences in the production of lipids and citric acid.
  • Yeast cells were cultured on YPD (Barth et al., 1996) or YNBCas (YNBD with 0.2% casamino acid) media for selection of transformants.
  • the strain Escherichia coli Machl-Tl (Invitrogen) was used for the transformation and amplification of the recombinant plasmid DNA.
  • Cells were cultured on LB medium (Sambrook et al., 1989). Kanamycin (40 g mL) was used for plasmid selection.
  • the PHD1 gene (YALI0F02497) of the Y. lipolytica Pold strain was deleted by replacing the coding region of this gene with a cassette containing the URA3 gene as a selection marker, according to the gene disruption method ("gene disruption"). ) described by Fickers et al. (2003). More specifically, the promoter (P) and terminator (T) regions of the YAL10F02497 [Tl] gene were obtained by PC amplification of Y.
  • YALI0F02497-P1 SEQ ID NO : 2
  • YALIOF02497-P2 SEQ ID NO: 3
  • YALI0F02497-T1 SEQ ID NO: 4
  • YALI0F02497-T2 SEQ ID NO: 5
  • Primers YALI0F02497-P2 and YALI0F02497-T1 were designed to introduce an Iscel restriction site at the 3 'end of the P fragment and at the 5' end of the T fragment.
  • the corresponding P-Iscel and T-Iscel fragments were were grouped together and used as matrices for the amplification of the V-Iscel-cassette cassette with the pair of primers YALI0F02497-P1 / YALI0F02497-T2.
  • the V-Iscel-cassette cassette was cloned into the plasmid pCR4®Blunt-TOPO (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France), and transformed into the E. coli strain. coli Machl-Tl (Invitrogen).
  • the resulting construct named pYALI0F02497-PT (JME739), was verified by restriction analysis with Iscel and sequenced.
  • the loxR-t / 43-loxP fragment encoding the URA3 gene was excised from plasmid JMPÎ21 (Fickers et al., 2003) by Iscel restriction and cloned at the corresponding site in YALI0F02497-PT so as to insert the URA3 selection marker between the fragment P and T of the V-Iscel-cassette cassette at the Iscel site.
  • the resulting construct, designated pYALI0F02497-PUT comprises the PUT cassette of the YALI0F02497 gene (cassette YALI0F02497-PUT).
  • the deletion AYALI0F02497 :: URA3 was introduced into the Y. lipolytica Pold strain (JMY1 5), according to the method described by Fickers et al. (2003), resulting in the deleted strain JMY1203 (genotype MatA, Ura3-302, Leu2-270, xpr2-322, AYALI0F02497 :: URA3).
  • the disabling cassette was amplified by PCR and used to transform the Y. lipolytica Pold strain.
  • the Ura + transformants were selected on Yas BCas medium.
  • the vectors JME1619 and JME2246 were constructed by cloning the coding sequences of the ACL1 and ACL2 genes between the BamH1 and Avril restriction sites of the m-62-pTEF-URA3ex vectors (Beopoulos et al., 2012) and JM-62-pTEF-LEU2ex. (Beopoulos et al, 2014) respectively.
  • the coding sequences of the ACL1 and ACL2 genes were amplified using the following oligonucleotides:
  • ACL1-S CGCGGATCCCACAATGTCTGCCAACGAGAACATCTCCCGATTCGAC (SEQ ID NO: 9), sense oligonucleotide, carrying the BamHI restriction site.
  • ACL1-A CACCCTAGGTCTATGATCGAGTCTTGGCCTTGGAAACGTC (SEQ ID NO: 10), antisense oligonucleotide, carrying the restriction site Avril.
  • the amplicon thus obtained was then digested with the enzymes BamHI and Vllll and cloned into the vector JMP62-pTEF-LEU2ex, generating the vector JME1619.
  • ACL2 contains two BamHI restriction sites, the cloning of this sequence necessitated the use of different oligonucleotides in order to eliminate these restriction sites, without however modifying the sequence of the protein derived from this gene.
  • ACL2-A CACGGATCCCACAATGTCAGCGAAATCCATTCACGAGGCCGAC (SEQ ID NO: 11), sense oligonucleotide, carrying the BamHI restriction site.
  • ACL2-B ATGCCTAGGTTAAACTCCGAGAGGAGTGGAAGCCTCAGTAGAAG (SEQ ID NO: 12), antisense oligonucleotide, carrying the restriction site Avril.
  • ACL2-C G AG AGG GCG ACTGG AT 7CTCTTCT ACC AC (SEQ ID NO: 13), sense oligonucleotide, carrying a mutation to remove a BamHl restriction site.
  • ACL2-Dd GTGGTAGAAGAGAATC ⁇ AGTCGCCCTCTC (SEQ ID NO: 14), antisense oligonucleotide, carrying a mutation allowing the removal of a Bam restriction site.
  • ACL2-E CTTCACCCAGGTTGGTCCACCTTCAAGGGC (SEQ ID NO: 15), sense oligonucleotide, carrying a mutation to remove a BamHI restriction site.
  • ACL2-F GCCCTTGAAGGTGGAGCCAACCTGGGTGAAG (SEQ ID NO: 16), antisense oligonucleotide, carrying a mutation to remove a BamHl restriction site
  • MAE 1 -sens CGCGGATC CAC AC AATGTT ACGAC (SEQ ID NO: 17), sense oligonucleotide, carrying the BamHI restriction site.
  • ACL1-antisense GCGCCTAGGCTAGTCGTAATCCCG (SEQ ID NO: 18), antisense oligonucleotide, carrying the restriction site ⁇ vrll.
  • the amplicon thus obtained was then digested with the enzymes BamHI and Avril and cloned into the vector JMP62-pTEF-URA3ex, generating the vector JME2248.
  • BamCytoATG AACGCGGATCCCACAATGGCTTCAGGATCTTCAACG (SEQ ID NO:
  • ACCavSph GTCCAAGCTCGGGAAGCTG (SEQ ID NO: 20)
  • ACCrevIntron CCGTTGTT AGCG AT GGA C CTTGTTG AT ATGACCTC ATGACCTC (SEQ ID NO: 21)
  • AvrRevACC AGCTATCGATAATCCTAGGTCACAACCCCTTGAGCAGCTC (SEQ ID NO:
  • antisense oligonucleotide bearing Clal and Avril sites.
  • the ACC1 gene being particularly long and containing an intron (containing a site
  • Amplicon 1 BamCytoATG and ACCrevIntron (184 bp),
  • Amplicon 5 BamCytoATG and AvrRevACC (7270 bp),
  • Amplicons 1 and 2 were then fused with BamCytoATG and ACCavSph primers.
  • Amplicons 1 + 2 and Pamplicon 5 were digested with BamHI + SphI.
  • the amplicon 5 digested with BamHI + SphI makes it possible to obtain a fragment of 1876 bp, called the 5 'fragment.
  • the fragments thus digested (1 + 2 and 5 ') were subsequently cloned by 3-way ligation between the BamHI and XbaI sites of the vector Bluescript (-) KS, generating the vector JME2412.
  • Amplicons 3 and 4 were then fused with the ACCamXba and AvrRevACC primers.
  • the 3 + 4 amplicon was then digested with XbaI and ClaI and cloned by 3-way ligation between the XbaI and ClaI sites of the Bluescript ( ⁇ ) KS vector, generating the JME2413 vector.
  • JME2412 and JME2413 vectors were then digested with lai and ClaI to release the 1 + 2 + 5 'and 3 + 4 fragments with compatible ends. These two fragments thus digested were subsequently cloned by 3-way ligation between the BamHI and ClaI sites of the Buescript (-) KS vector, generating the JME2406 vector.
  • the coding sequence of the ACC1 gene thus reconstructed has finally been digested by the enzymes Bam I + Avril, to be cloned between the BamHI + Avril sites of the vector JMP62 pTefLEU2ex, generating the vector JME2408.
  • the strain JMY1203 was made protophobic by conversion of the leu2-270 locus to its wild version.
  • the strain JMY3279 was obtained after excision of the selection marker URA3ex of strain JMY1203, according to the principle described by Fickers et al. (2003).
  • This strain was then successively transformed with the inactivation cassettes of the genes MFE1 (JME1077) and TGL4 (JME1000), already described in Dulermo and Nicaud (201 1) and Dulermo et al. (2013), respectively.
  • the URASex and LEU2ex markers of the strain JMY3396 thus obtained were then excised (Fickers et al., 2003), generating strain JMY3433.
  • strain JMY3776 was obtained after excision of the selection markers URA3ex and LEU2ex (Fickers et al, 2003) and then successive transformation with the overexpression cassettes of the genes yICXi (JME1619) and ACL2 (JME2246).
  • Wild strain Y. lipolytica W29 and genetically modified strains were used for fermentations.
  • the culture medium used contained (in g / L): KH 2 PO 4 4.7; Na 2 HPO 4 2.5; MgSO 4 x7H 2 O 1.5; CaCl 2 x2H 2 0 0.1; FeCl 3 x 6H 2 0.15; ZnS0 4 x7H 2 0 0.02; MnSO 4 xH 2 O 0.06 (Papanikolaou et al, 2002). Ammonium sulfate and yeast extract were used as nitrogen sources at a concentration of 0.25 to 2.5 g, respectively.
  • Crude glycerol (Hellenic industry of glycerin and fatty acids SA, purity about 70%, g / g, impurities composed of potassium and sodium salts 12%, w / w, non-glycerol organic material 1%, v 17%, g / g and methanol ⁇ 0.1%, g / g) was used as the sole source of carbon for different concentrations.
  • the initial pH for all media is 6.0 ⁇ 0.1.
  • analytical grade glucose AnaalaR, BDH, UK
  • strains of Y. lipolytica JMY2900 (reference), JMY3776 (Aphdl Amfel Atgl4 + p TEF-D GA2-LEU2ex + pTEF ⁇ GPD1-URA3ex) and strain JMY4079 (Aphdl Amfel Atgl4 + pTEF-DGA2 + pTEF-GPD1 + pTEF-ACLFURA3ex + pTEF -LEU2ex) were evaluated for their ability to produce lipids in vials with baffles.
  • the culture medium used contained: 60 g / L of pure glycerol (Glol medium 6%) or
  • the biomass concentration (X, g / L) was determined by the dry weight (85 ⁇ 5 ° C / 24 h).
  • glucose (Glc, in g / L) and organic acids were analyzed by HPLC as described by André et al (2009).
  • the iso-citric acid concentration was determined by an enzymatic method, by measuring the NADP3 ⁇ 4 produced during the conversion of isocitric acid to ⁇ -ketoglutaric acid, catalyzed by iso-citrate dehydrogenase, as described by Papanikolaou et al. . (2002).
  • the total amount of citric acid (citric and isocitric acid) produced was characterized as Cit (in g / L).
  • the determination of ammonium ions was made using a selective ammonium electrode (Hach 95-12, Germany).
  • Cellular total lipids (L, in g / L) were extracted from dry biomass with 2: 1 (v / v) chloroform / methanol and were gravimetrically determined. Cellular lipids were fractionated into their lipid fractions. Briefly, a known weight of extracted lipids (about 200 mg) was dissolved in chloroform (3 ml) and fractionated using a column (25 x 100 mm) of silicic acid, activated by heating at 110 ° overnight. C (Fakas et al, 2006).
  • the total cellular lipids (L, in g L) were extracted from the milled dry biomass (20 to 30 mg) with a mixture of chloroform / methanol 2/1 (v / v), according to the protocol from Folch and Lee (1957) and were gravimetrically determined.
  • Total cell lipids were converted to their fatty acid methyl esters (FAME) by the method of Browse (Browse et al., 1986).
  • the FAMEs were analyzed in a gas chromatograph (GC-FID) (Varian, GC-430) according to Beopoulos et al. (2008). FAMEs were identified by comparison with stallions.
  • Table 2 Quantitative data of strains of Y. lipolytica W29 and JMY1203 from cultures on media limited to nitrogen and containing glucose or glycerol as a substrate at an initial concentration of 40 g / L. Representation of biomass (X, g L), lipids (L, g L), total citric acid (Cit, g L), consumed glycerol (Glol CO ns, g / L) and glucose consumed ( Glc C0E1 s, g L) when: the maximum amount of lipids in the dry weight of yeast (%, g / g) (a) and the maximum concentration of total citric acid (b) are reached.
  • strains W29 and JMY1203 consumed, with comparable levels, available extracellular nitrogen (initial NH4 + at 55 ⁇ 10 ppm, nitrogen depletion in 60 ⁇ 5 hours after inoculation).
  • the strain W29 has a higher biomass production than the strain JMY1203 on the two substrates, between 10.7-12.5 g ⁇ L.
  • biomass production reaches a maximum of 7 g / L in the presence of glycerol; on glucose, the biomass concentration decreases during culture to 1.8 g / L, suggesting cell lysis at the end of culture.
  • citrate production increases after the exhaustion of the nitrogen of the medium, leading to its secretion.
  • citrate production is superior on glucose, reaching g / g.
  • Strain JM1203 has opposite characteristics on glucose; citrate production and conversion rates are from g / g, respectively, whereas on crude glycerol the Cit max was 2.04 times higher (31 g / L), corresponding to a 37.4% increase in the conversion rate reaching 0.78 g / g. These results indicate a difference in carbon flux according to growth on glucose or glycerol for the two strains, which have an opposite phenotype.
  • strain JMY1203 produces less biomass compared to strain W29, it shows a 1.74-fold increase in lipids, reaching 10.1%, g / g, of dry weight (PS) on glucose and 1.49 times more lipids on glycerol, reaching 14.9%, g / g, PS.
  • Glycerol is a better substrate for lipid accumulation for these two strains,
  • strain W29 A rapid decrease in accumulated lipid is observed for strain W29 or the lipid content decreases from 5.8 to 2.4%, g / g, PS (58% decrease in lipid level) on glucose and from 10 to 1 , 6%, g / g, PS on glycerol.
  • the amount of accumulated lipids decreases from 10.1 to 5.1%, g / g, PS (49.5% decrease) on glucose and from 14.9 to 10%, g / g, PS (32.9% decrease) on glycerol. It is then observed that the strain W29 remobilizes these lipid glucose reserves more rapidly than the strain JMY1203. On glycerol medium remobilization is similar for both strains.
  • lipid accumulation clearly depends on the concentration of glycerol during the growth phase where nitrogen was not limiting, while lipid degradation during the nitrogen deficiency phase was not not affected by glycerol concentration (Figure 2B). Lipid accumulation reached 26.6%, g / g, PS for an initial concentration of glycerol (Glolo) of 90 g L, and 14.9% for a Glolo of 40 g / L.
  • Citric acid is the main compound of total citrate produced, since the iso-citric acid dosage showed that the isocitric acid was about 5-8%, g / g, of the total citric acid produced regardless of the strain tested and the Glolo concentration of the medium. In the test with the Cit max amount reached, the amount of isocitric acid assayed was about 5%, g / g, of Cit.
  • the exceptional Yat / Gioi value that has been obtained shows that the genetically modified strain JMY1203 can be used to promote the conversion of crude glycerol to citric acid.
  • the fatty acid composition (AG) of the cellular lipids produced was studied at the end of the growth phases for the two strains cultivated on glucose and crude glycerol. It is shown in Tables 4 (strain W29) and 5 (strain JMY1203) hereinafter.
  • Table 4 Fatty acid composition of the total cellular lipids produced by the strain Yarrowia lipolytica W29 during its growth in a limited nitrogen medium containing glucose (at 40 g / l) or glycerol (at 40, 60 or 90 g / L).
  • the culture conditions are identical to those described for Tables 2 and 3.
  • LE end of the exponential phase.
  • ES beginning of the stationary phase.
  • S stationary phase.
  • composition of AG has been modified as a function of the Glolo concentration used and the fermentation time, and that differences have also been observed between growth on glucose and on glycerol.
  • Some differences in AG profiles were observed between the two strains used, because the cultivation of strain W29 led to the synthesis of a microbial lipid less rich in oleic acid ( A9 C38: 1) and richer in linoleic acid. (A9 '12 C18: 2) for the JMY1203 strain.
  • strain JMY1203 (Citric acid produced per unit of glycerol consumed) of the strain JMY1203 according to the present invention is higher than that of different strains of Y. lipolytica described in the prior art. iv) Growth of strains JMY2900, JMY3776 and JMY4209 in gfycerol 6% and 9% and consumption of glycerol over time
  • the growth of the JMY3776 and JMY4079 strains is approximately 30% to 40% less than the growth of the JMY2900 reference strain.
  • the final biomass after 96h of culture was 10.56 g / L and 12.36 g / L for JMY3776 and JMY4079, against 18.48 g / L for JMY2900.
  • the analysis of the optical density curves during the growth of the different strains led to the same observation (Fig. 5 and Table 8).
  • JMY2900 consumes glycerol more quickly than JMY3776 and JMY4079 ( Figure 5).
  • Glycerol is completely exhausted from the medium at 48h in the case of the three strains cultured in 6% Glol medium, and 48 for JMY2900 and 72 hours for JMY3776 and JMY4079 in Glol 9% medium (FIG. 5).
  • the growth continues more or less strongly depending on the strains after exhaustion of glycerol. It is quite possible that the metabolites secreted by the different strains, as explained below, in the culture medium, can be used to ensure the growth of the latter after exhaustion of glycerol (Figure 5).
  • Table 8 Production of fatty acids, biomass, citric acid and mannitol by strains JMY2900, JMY3776 and JMY4079 after 96 hours of growth in Glol medium 6% and 9%.
  • X dry biomass
  • Lipids CA
  • YCA / S OR YMnfs biomass yield / lipid / citric acid / mannitol based on the consumed substrate
  • Yux or YCA / X OR Yu n v lipid / citric acid / mannitol yield relative to the biomass produced.
  • JMY2900 appears to be more likely to produce mannitol, with a production of 1 1.4 g / L after 48 h growth in 6% Glol and 14.8 g / L after 48 h growth in 9% Glol ( Figure 5).
  • the medium no longer containing glycerol
  • strain JMY2900 re ⁇ consomme mannitol she secreted into the culture medium ( Figure 5), which allows undoubtedly to continue its growth after 48 h of culture.
  • the levels of citric acid and mannitol are relatively comparable from one strain to another, except for mannitol which remains 3 times more concentrated (7.5 g / L vs. 2 to 2.8 g / L) in 9% Glol culture medium of JMY2900 compared to strains derived from the Aphdl mutant (Table 8 and Figure 5).
  • Cl 8: 1 (n-9), C16: 0, C16: 1 (n-7), C18: 0 and C18: 2 (n-6) represent about 50%, 15 to 20%, 4 to 5%, 7 to 8% and 6.5% of the total fatty acids in Glol 6%. However in Glol 9%, the proportion of C18: 1 (n-9) decreases to 45% in favor of C16: 0, which represents 25% of fatty acids.
  • Table 9 Fatty acid profile (in% of the total fatty acids) of strains JMY2900, JMY3776 and JMY4079 after 96 hours of growth in Glol medium 6% and Glol 9%.

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Abstract

La présente invention concerne une souche mutante de levure dans laquelle au moins l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase est inhibée, et l'utilisation de cette souche pour la production de lipides et d'acide citrique.

Description

LEVURES MUTANTES AYANT UNE PRODUCTION ACCRUE DE LIPIDES
ET D'ACIDE CITRIQUE
La présente invention concerne des levures mutantes présentant une production élevée de lipides et d'acide citrique.
Il existe actuellement une surabondance en glycérol brut sur le marché, qui est principalement due à la demande croissante en bio-diésel (le glycérol étant le principal sous- produit de la production de bio-diésel). De même, de grandes quantités de glycérol aqueux sont générées lors de la production de bio-éthanoî et/ou de boissons alcoolisées (par exemple par fermentation) ou lors de la saponification des graisses.
La conversion du glycérol en produits à plus forte valeur ajoutée au moyen de technologies chimiques et/ou de fermentation présente un très fort intérêt.
Certains micro organismes oléagineux sont capables de convertir des substrats, tels que des matières grasses ou du glycérol, en lipides, notamment en triglycérides et acides gras. Ces microorganismes oléagineux possèdent la capacité d'accumuler des quantités importantes de lipides, à hauteur d'au moins 20% de leur matière sèche. Chez les levures, on trouve quelques espèces oléagineuses, dites non-conventionnelles, parmi lesquelles on peut citer celles appartenant aux genres Candida, Cryptoccocus, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia (voir pour revues Beopoulos et al., 2009a ; Papanikolaou et al, 201 la et 2011b).
Yarrowia lipolytica est une levure hémiascomycète. Elle est considérée comme un modèle de bioconversion pour la production des protéines, des enzymes et de dérivés lipidiques (voir pour revue Nicaud, 2012). Elle est naturellement présente dans des environnements pollués de pétrole et notamment dans les fractions lourdes, ce qui témoigne de son potentiel de dégradation des substrats organiques. Cette levure a déjà été testée avec succès pour sa capacité de dégradation des substrats organiques comme le naphthalène, le dibenzofurane et le trinitrotoluène (voir pour revue : Thevenieau et al, 2009a et 2009b ; Beopoulos et al. , 2009b et 2009c).
Y. lipolytica est l'une des levures oléagineuses les plus étudiées en raison non seulement de sa capacité à accumuler des lipides à hauteur de plus de 50%o de sa matière sèche selon un profil de culture défini, mais aussi de sa capacité unique à accumuler de l'acide linoléique à des niveaux élevés (plus de 50% des acides gras produits) ainsi que des lipides à haute valeur ajoutée, tels que l'acide stéarique, de l'acide palmitique et de l'acide oléique, dans des proportions similaires à celles que l'on trouve dans le beurre de cacao (Papanikolaou et al, 2001 ; Papanikolaou et al, 2010).
Y. lipolytica peut être efficacement cultivée sur une grande variété de composés hydrophobes (acides gras libres, triacylglycérols, n-alcanes, etc.), grâce à l'expression de familles multigéniques codant pour des enzymes clés impliquées dans la décomposition de ces composés (par exemple, acyl-CoA oxydases, lipases). L'assimilation de ces substrats lipidiques peut entraîner une modification de la composition en acides gras tant du substrat résiduel que de la matière grasse accumulée, ayant parfois comme résultat la synthèse de lipides avec des propriétés intéressantes (Papanikolaou et al, 2001 ; Beopoulos et al, 2009a ; Papanikolaou et al, 2010 ; 201 la et 2011b).
La synthèse des lipides chez Y. lipolytica s'effectue soit par la biosynthèse de novo d'acides gras via la production des précurseurs des acides gras comme l'acétyl-CoA et le malonyl-CoA et leur intégration dans la voie de biosynthèse des lipides (voie de Kennedy), soit par l'accumulation ex novo, via l'incorporation des acides gras préexistant dans le milieu de fermentation ou dérivant de l'hydrolyse des huiles, des graisses, des triglycérides et des esters méthyliques du milieu de culture et leur accumulation à l'intérieur de la cellule. Les voies principales de bio synthèse de novo des lipides chez Y. lipolytica et Saccharomyces cerevisiae {S. cerevisiae ; levure dite non-oléagineuse) sont bien conservées.
Chez les levures, la β-oxydation est une voie de dégradation des acides gras qui se situe principalement dans les peroxysomes (dont la biogénèse est contrôlée par les gènes PEX). Cette voie permet la formation d'acétyl-CoA à partir d'acides gras à chaîne paire et de propionyl-CoA à partir d'acides gras à chaîne impaire. La β-oxydation comporte quatre réactions successives au cours desquelles la chaîne carbonée de l'acyl-CoA est réduite de deux atomes de carbone. Une fois la réaction opérée, l'acyl-CoA réduit de deux carbones peut retourner dans la spirale de la β-oxydation (hélice de Lynen) et subir une nouvelle réduction de deux carbones. Ces cycles de décarboxylation peuvent être interrompus suivant la nature de Facyl-CoA, la disponibilité en substrat, la présence de coenzyme A, d'acétyl-CoA ou selon le ratio NAD+/NADH. Dans la première étape de la β-oxydation, après la libération des acides gras des triacylglycérols (TAG) par les lipases, la forme active d'acyl-CoA formé est oxydée par une molécule de Flavine Adénine Dinucléotide (F AD) pour former une molécule de trans- A2-énoyl-CoA grâce à une acyl-CoA oxydase (AOX). La β-oxydation chez Y. lipolytica a été largement décrite (Wang et al, 1999a ; lickova et al. 2004). Il existe 6 acyl-CoA oxydases chez Y. lipolytica, codées par les gènes POX1 à 6, qui présentent des spécificités différentes vis-à-vis du substrat (Wang et al, 1999a et 1999b ; Luo et al, 2000 et 2002). Le trans-Δ2- énoyl-CoA est ensuite hydraté par la 2-énoyl-CoA hydratase. La molécule de 3-hydroxyacyI CoA formée est oxydée par le NAD+ pour former une molécule de 3-cétoacyl-CoA. Ces deux dernières étapes sont catalysées par une protéine bifonctionnelle codée par le gène MFE1 (protéine multifonctionnelle ayant une fonction d'acyl-CoA hydratase et de 3-hydroxyacyl- CoA déshydrogénase). Le 3-oxoacyl-CoA thioester est alors clivé par une 3-oxoacyl-CoA thiolase codée par le gène POTÎ (Einerhand et al, 1995). Un coenzyme A est ensuite ajouté pour former un acétyl-CoA et un acyl-CoA diminué de deux carbones. Des souches mutantes de Y. lipolytica dans lesquelles la bêta-oxydation des acides gras est invalidée en raison de la délétion des 6 gènes POX endogènes ont été décrites par Beopoulos et al. (2008) et dans la Demande Internationale WO 2012/001144.
Différents procédés ont été développés pour permettre la fermentation du glycérol par Y. lipolytica et le convertir en lipide d'organisme unicelluîaire (SCO, « single cell oil ») et/ou en acide citrique (citrate) (Papanikolaou et al, 2002 ; Rywinska et al, 2009 ; Beopoulos et al, 2009a), Les biosynthèses, à la fois de SCO et d'acide citrique, à partir du glycérol ou d'autres substrats (e.g., des hexoses) utilisés comme unique substrat ou en co-substrat dans les premières étapes de culture, sont biochimiquement équivalentes et s'effectuent après une limitation (carence) nutritionnelle dans le milieu de culture de Y. lipolytica, généralement une limitation en azote ou phosphate (Papanikolaou et Aggelis, 2009 ; Papanikolaou et al, 2011a). Plus précisément, pour la production de lipides (SCO), il faut imposer une limitation en azote en jouant sur le rapport C/N avec une forte concentration en carbone (C) et une faible concentration en azote (N) et pour la production d'acide citrique, il faut imposer une carence en azote uniquement. En outre, quand la croissance cellulaire de Y. lipolytica s'effectue sur des substrats à base de glycérol ou de sucre (« oses »), elle est capable soit de produire en grandes quantités uniquement des graisses intra-cellulaires (Tsigie et al, 2011 ; Fontanille et al, 2012) soit de produire uniquement de l'acide citrique sans accumuler des quantités importantes de lipides cellulaires (Anastassiadis et al, 2002 ; Papanikolaou et al, 2002 et 2008 ; Tai and Stephanopoulos, 2013). Il a été rapporté que selon les conditions de culture, Y. lipolytica peut produire simultanément de l'acide citrique (-50 g/L) et des lipides (-32% de sa matière sèche) (André et al, 2009), ou produire de manière séquentielle des lipides cellulaires et de l'acide citrique (Makri et al, 2010).
La voie de biosynthèse impliquée lors d'une limitation en azote dans le milieu de culture des levures oléagineuses pour la production de lipides est connue (voir pour revue Beopoulos et al, 2009a). La limitation en azote active ΑΜΡ désaminase, ce qui entraîne une diminution de la concentration d'AMP (adénosine monophosphate) dans les mitochondries. Cette diminution de la concentration d'AMP inhibe l'enzyme isocitrate déshydrogénase, qui catalyse la conversion de l'isocitrate en a-cétoglutarate (α-KG). L'aconitase catalyse l'isomérisation de l'isocitrate en citrate dans les mitrochondries. Le citrate sort alors des mitochondries et est transformé en acétyl-CoA et oxaloacétate par l'ATP-citrate dans le cytosol. L'acétyl-CoA accumulé en grande quantité dans le cytosol permet la synthèse d'acide gras également en grande quantité.
Des souches de Y. lipolytica mutantes (obtenues par mutation naturelle ou génétiquement modifiées) capables de produire des quantités plus élevées de lipides ou d'acide citrique par rapport aux souches sauvages ont été obtenues. Par exemple, Rywiiiska et al. (2009) ont obtenu des souches mutantes de Y. lipolytica acétate négatif (ace" ; incapables de croître sur acétate comme seule source de carbone et d'énergie) capables de bio-convertir, en fermentation discontinue, le glycérol (utilisé comme substrat) en acide citrique plus efficacement que la souche sauvage dont elles dérivent. Tai et al. (2012) ont obtenu une souche de Y. lipolytica génétiquement modifiée sur-exprimant la diacylglycérol acyltransférase (DGA1) et l'acétyl-CoA carboxylase (ACC1) capable d'accroître la production de lipides à partir du glucose, dans des conditions de culture avec un rapport C N fort ou modéré, par rapport à la souche sauvage dont elle dérive. Des souches mutantes capables d'accumuler des quantités de lipides plus importantes par rapport aux souches sauvages ont aussi été décrites dans les Demandes Internationales WO 2010/004141 et WO 2012/001144.
Il apparaît donc souhaitable d'obtenir des souches mutantes de levure capables d'accumuler des quantités de lipides et/ou d'acide citrique plus importantes par rapport aux souches sauvages.
De manière surprenante, les inventeurs ont montré qu'une souche de levure Yarrowia lipolytica génétiquement modifiée dont le gène PHD1 (présent sur le chromosome F, YALI0F02497g) codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase a été délété, et cultivé sur glycérol, présente non seulement une consommation ralentie de glycérol, mais aussi une production accrue de lipides et d'acide citrique, par rapport à la souche de levure Yarrowia lipolytica W29 de type sauvage dont elle dérive.
Chez les levures, la 2-méthylcitrate déshydratase (nomenclature EC 4.2.1.79) est une protéine mitochondriale qui catalyse la conversion du 2-méthylcitrate en 2-méthyl-cis aconitate dans le cycle du 2-méthylcitrate du métabolisme du propionate (Uchiyama et al, 1982).
En particulier, chez Yarrowia lipolytica, la 2-méthylcitrate déshydratase est une protéine de 520 acides aminés, codée par le gène PHD1 (YALI0F02497g). La séquence d'acides aminés de la 2-méthyl citrate déshydratase de Y. lipolytica CLIB122 est disponible sous le numéro d'accès Gï:50554999 (ou GI:49650778) dans la base de données GENBANK, et représentée par la séquence SEQ ID NO : 1. La séquence nucléotidique de l'ADNc codant cette 2-méthylcitrate déshydratase est disponible sous le numéro d'accès GI:50554998 dans la base de données GENBANK.
Les Inventeurs ont déterminé que la séquence d'acides aminés de la 2-méthylcitrate déshydratase de Yarrowia lipolytica (SEQ ID NO : 1) présente au moins 55% d'identité et au moins 70% de similarité avec les 2-méthylcitrate déshydratases des hémiascomycètes, en particulier 62% d'identité et 73% de similarité avec celle de Saccharomyces cerevisiae disponible sous le numéro d'accès SACE0P06226p dans la base de données Génoîevures (Sherman et al, 2009 ; http://genolevures.org/), 62% d'identité et 75% de similarité avec celle de Zygosaccharomyces rouxii disponible sous le numéro d'accès ZYRO0F04466p dans la base de données Génoîevures, 61% d'identité et 75% de similarité avec celle de Saccharomyces kluyveri disponible sous le numéro d'accès SAKL0B02948p dans la base de données Génoîevures, 62% d'identité et 76% de similarité avec celle de Kluyveromyces lactis var. lactis disponible sous le numéro d'accès KLLA0E14213p dans la base de données Génoîevures, 59% d'identité et 74% de similarité avec celle de Remothecium gossypii disponible sous le numéro d'accès ERGO0G08404p dans la base de données Génoîevures, 61% d'identité et 72% de similarité avec celle de Candida glabrata disponible sous le numéro d'accès CAGL0L09108p dans la base de données Génoîevures, 67% d'identité et 78%» de similarité avec celle de Pichia sorbitophila disponible sous le numéro d'accès PISO0A12716p dans la base de données Génoîevures, et 67% d'identité et 79% de similarité avec celle de Pichia sorbitophila disponible sous le numéro d'accès PISO0B12783p dans la base de données Génoîevures.
Les Inventeurs ont également déterminé que la séquence d'acides aminés de la 2-méthylcitrate déshydratase de Yarrowia lipolytica (SEQ ID NO : 1) présente au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité avec les 2-méthylcitrate déshydratases de souches de Candida de la même clade que celle de Y. lipolytica, en particulier 98,7% d'identité et 99,6% de similarité avec celle de la souche de C galli CBS9722, 97,9% d'identité et 99,4% de similarité avec celle de la souche de C, yahushimensis CBS10253, 96,5% d'identité et 98,1% de similarité avec celle de la souche de C. phangngensis CBS 10407, 95,6% d'identité et 98,5% de similarité avec celle de la souche de C. alimentaria CBS10151, et 87,3% d'identité et 94% de similarité avec celle de la souche de C. hispaniensis CBS9996, L'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthyl citrate déshydratase dans une levure permet d'obtenir une souche de levure mutante capable de produire des lipides et de l'acide citrique lorsqu'elle est cultivée sur un milieu approprié {e.g., glycérol) non carencé.
Outre la mutation conduisant à l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase, une ou plusieurs mutations additionnelles, telles que des mutations conduisant à une déficience de la bêta-oxydation des acides gras (e.g. inhibition des gènes endogènes POX1-6, MFE1, POT1 et/ou PEX), et/ou conduisant à l'accumulation des lipides {e.g., inhibition du gène endogène GUT2 et/ou surexpression du gène endogène GPD1) et/ou conduisant à une déficience de la remobilisation des triglycérides {e.g., inhibition des gènes endogènes TGL3 et/ou TGL4) et/ou conduisant à une augmentation du rendement de production de lipides {e.g., surexpression des gènes endogènes ACC1, LROl DGAl et/ou DGA2) et/ou conduisant à une augmentation de la production de cofacteur NADPH pour la synthèse de lipides {e.g., surexpression du gène endogène MAE1) et/ou conduisant à la production d'acétyl-CoA à partir du citrate qui est utilisé par la FAS ifatty acid synthase) pour la synthèse des acyî-CoA (élongation de la chaîne carboné des acides gras en court de synthèse) {e.g., surexpression des gènes endogènes ACL1 et ACL2), et/ou conduisant à la production d'acétyl-CoA à partir de l'acétate qui est utilisé par la FAS ifatty acid synthase) pour la synthèse des acyl-CoA (élongation de la chaîne carboné des acides gras en court de synthèse) {e.g., surexpression du gène endogène A CS2).
La présente invention a donc pour objet une souche mutante de levure, caractérisée en ce que l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase (EC 4.2.1.79) endogène de ladite souche est inhibée et qu'en outre l'expression ou l'activité des acyl-coenzyme A oxydases (EC 6.2.1.3), de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation (EC 4.2.1.74), de la 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase (EC 2.3.1.16), d'une ou plusieurs protéines codées par un gène PEX impliqué dans le métabolisme des peroxysomes des levures (de préférence la peroxine 10), d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol (EC 3.1.1.3) et/ou de la glycérol 3- phosphate déshydrogénase (EC 1.1.99.5) endogènes de ladite souche est inhibée, et/ou un ou plusieurs des gènes (de préférences tous les gènes) endogènes codant une glycérol-3- phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (EC 1.1.1.18), une acétyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.2), une acyl-CoA:diacylgîycérol acyltransférases (EC 2.3.1.20), une ATP citrate lyase (EC 2.3.3.8), une enzyme malique (EC 1.1.1.40), une acétyl-CoA synthétase (EC 6.2.1.1), une Delta(9 désaturase (EC 1.14.19.1), une Delta(12)-désaturase (EC 1.14.19.6 ) et/ou une invertase (EC 3.2.1.26) sont surexprimés.
Ladite souche mutante de levure est capable de produire une plus grande quantité de lipides et/ou d'acide citrique que la souche parente de levure dont elle dérive.
La présente invention inclut toutes les souches de levures et notamment les souches de levure appartenant aux genres Candida, Cryptoccocus, Hansenula, Kluyveromyces, Lipomyces, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizzosaccharomyces, Trichosporon ou Yarrowia.
De préférence, ladite souche de levure est une souche de levure oléagineuse. Les souches de levure oléagineuse sont bien connues de l'homme du métier. Elles possèdent la capacité d'accumuler des quantités importantes de lipides, à hauteur d'au moins 20% de leur matière sèche (voir Ratledge, 1994). Elles appartiennent généralement au genre Candida, Cryptoccocus, Lipomyces, Rhodosporidium (e.g., Rhodosporidium toruloides), Rhodotorula {e.g., Rhodotura glutinis), Trichosporon ou Yarrowia.
Une souche plus particulièrement préférée au sens de la présente invention est une souche de levure de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica.
Avantageusement, ladite souche mutante de levure est auxotrophe pour la leucine (Leu") et éventuellement pour Porotidine-5'-phosphate décarboxylase (Ura"),
On entend par 2-méthylcitrate déshydratase, une enzyme (EC 4.2.1.79) qui catalyse la conversion du 2-méthyîcitrate en 2~méthyl-cis aconitate et qui possède au moins 55% d'identité, et par ordre croissant de préférence au moins 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% d'identité, ou 70% de similarité, et par ordre croissant de préférence au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de similarité avec la séquence d'acides SEQ ID NO : 1, lorsque les séquences sont alignées sur toute leur longueur.
Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité et de similarité indiqués ici sont calculés à partir d'un alignement global des séquences d'acides aminés effectué à l'aide de l'algorithme « needle » (Needleman et Wunsch, 1970) en utilisant les paramètres par défaut : « Matrix » : EBLOSUM62, « Gap penalty » : 10,0 et « Extend penalty » : 0,5. L'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase peut être obtenue de diverses manières par des méthodes connues en elles mêmes.
De préférence, ladite 2-méthylcitrate déshydratase comprend une région prpD (correspondant au domaine PR 09425 dans la base de données CDD ; Marchler-Bauer et al, 201 1) présentant la séquence consensus SEQ ID NO : 8 (correspondant aux acides aminés 37 à 517 de la séquence SEQ ID NO : 1 ).
Chez les levures, les gènes POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 et POX6 codent respectivement 6 isoformes d'acyl-coenzymeA oxydase (AOX ; EC 6.2.1.3) impliquées, au moins partiellement, dans la β-oxydation des acides gras. L'inhibition, partielle ou totale, de l'expression ou de l'activité de ces isoenzymes conduit à l'augmentation de l'accumulation de lipide dû a l'absence de consommation des lipides synthétisés. Plus particulièrement, la séquence codante des gènes POX1 à POX6 et la séquence peptidique des AOX1 à AOX6 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous les numéros d'accès ou noms suivants : POX1 I AOX1 = YALI0E32835g / YALI0E32835p, POX2 ! AOX2 = YALI0F10857g / YALIOF10857p ; POX3 I AOX3 - YALI0D24750g / YALÏ0D24750p ; POX4 ! AOX4 = YALI0E27654g / YALI0E27654p ; POX5 ! AOX5 = YALI0C23859g / YALI0C23859p ; POX6 I AOX6 = YALI0E06567g / YALI0E06567p. Les séquences peptidiques des acyl-CoA oxydases de Y. lipolytica présentent 45% d'identité ou 50% de similarité avec celles des autres levures. Le degré d'identité entre les acyl-CoA oxydases varie de 55 à 70% (ou 65 à 76% de similarité) (Demande Internationale WO 2006/064131). Un procédé d'inhibition de l'expression des 6 AOX endogènes dans une souche de Y. lipolytica a été décrit dans les Demandes Internationales WO 2006/064131, WO 2010/004141 et WO 2012/001144.
Chez les levures, la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation possède trois domaines : deux domaines ayant une activité 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase (EC 4.2.1.74 ; domaines A et B) et un domaine ayant une activité énoyl-CoA hydratase (EC 4.2.1.17 ; domaine C), Cette enzyme est codée par le gène MFE1 (« Multifunctional enzyme type 1 ») (Haddouche et al, 2011). Plus particulièrement, la séquence codante du gène MFE1 et la séquence peptidique de la 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase et énoyl-CoA hydratase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0E 15378g / YALI0E 15378p. Un procédé d'inhibition de l'expression de ladite protéine multifonctionnelle endogène dans une souche de Y. lipolytica a été décrit par Haddouche et al. (2011).
Chez les levures, la 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase (EC 2.3.1.16) est codée par le gène POTl (« Peroxisomal Oxoacyl Thiolase 1 ») (Berninger et al, 1993). Plus particulièrement, la séquence codante du gène POTl et la séquence peptidique de la 3-oxoacyl-CoA thiolase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI018568g / YALI018568p. Un procédé d'inhibition de l'expression de la 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase endogène dans une souche de Y. lipolytica a été décrit par Berninger et al (1993).
Les gènes PEX impliqués dans le métabolisme des peroxysomes chez les levures, notamment chez Y. lipolytica sont décrits dans le Tableau 1 ci-dessous. La séquence codante des gènes PEX est disponible dans les bases de données Génolevures ou GenBank. Il a été décrit dans la Demande Internationale WO 2006/064131 et par Thevenieau et al. (2007) que lorsque le peroxysome n'est pas correctement assemblé ou lorsqu'il n'est pas fonctionnel, les acides gras ne sont pas correctement dégradés. Avantageusement, l'expression ou l'activité de la peroxine 10 (codée par le gène PEX10) endogène de ladite souche est inhibée.
Tableau 1 :
Gène N° accession chez N° accession chez Fonction
S. cerevisiae Y. lipolytica
PEX1 YKL 197C YALI0C15356g AAA-peroxin
PEX2 YJL210W YALI0F01012g RING-finger peroxin which functions in peroxisomal matrix protein import
PEX3 YDR329C YALI0F22539g Peroxisomal membrane protein (PMP)
PEX4 YGR133W YALI0E0462Og Peroxisomal biquitin conjugating
enzyme
PEX5 YDR244W YALI0F28457g Peroxisomal membrane signal receptor
PEX6 YNL329C YALI0C 18689g AAA-peroxin
PEX7 YDR142C YALI0F 18480g Peroxisomal signal receptor
PEX8 YGR077C Intraperoxisomal organizer of the
peroxisomal import machinery
PEX9 YALI0E 14729g Peroxisomal intégral membrane protein
PEX 10 YDR265W YALI0C 1023g Peroxisomal membrane E3 ubiquitin ligase
PEX 11 YOL147C YALI0C04092g Peroxisomal membrane protein
PEX 12 YMR026C YALI0D26642g C3HC4-type RI NG-finger peroxisomal membrane peroxin
PEX 13 YLR191 W YALI0C05775g Intégral peroxisomal membrane
PEX 14 YGL153W YALI0E9405g Peroxisomal membrane peroxin
PEX 15 YOL044W Phosphorylated tail-anchored type II intégral peroxisomal membrane protein
PEX 16 YALI0E16599g Intraperoxisomal peripheral membrane peroxin
PEX 17 YNL214W Peroxisomal membrane peroxin
PEX 18 YHR160C Peroxin
PEX 19 YDL065C YALI0B22660g Chaperone and import receptor
PEX20 YALI0E06831g Peroxin
PEX21 YGR239C Peroxin
PEX22 YAL055W Putative peroxisomal membrane protein
PEX23 PEX30 : YLR324w YALI0D273O2g Intégral peroxisomal membrane peroxin
PEX31 :
YGR004w
PEX32 : YBR168w
PEX25 YPL112C YALI0D05005g Peripheral peroxisomal membrane
peroxin
PEX27 YOR193W Peripheral peroxisomal membrane
protein PEX28 YHR150W YALIOD 11858g Peroxisomal intégral membrane peroxin
YALI0F19580g
PEX29 YDR479C YALI0F19580g Peroxisomal intégral membrane peroxin
PEX30 YLR324W YALI0D27302g Peroxisomal intégral membrane protein
PEX31 YGR004W YALI0D27302g Peroxisomal intégral membrane protein
PEX32 YBR168W YALI0D27302g Peroxisomal intégral membrane protein
Chez les levures, les lipases triacylglycérol (EC 3.1.1 .3) sont codées par les gènes TGL (Beopoulos et al, 2009 et 2012). De manière avantageuse l'expression ou l'activité de la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL3 et/ou de la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4, de préférence de la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4, est inhibée. La séquence codante du gène TGL3 et la séquence peptidique de la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL3 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOD 17534g / YALIOD 17534p. La séquence codante du gène TGL4 et la séquence peptidique de la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOFlOOlOg / YALI0F10010p. Un procédé d'inhibition de l'expression d'une lipase triacylglycérol endogène dans une souche de Y. lipolytica a été décrit dans la Demande Internationale WO 2012/001144 et par Dulermo et al. (2013).
Chez les levures, la gîycérol 3-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.99.5) est codée par le gène GUT2 (Beopoulos et al., 2008). Plus particulièrement, le gène GUT2 code l'isoforme Gut2p de la glycérol-3 -phosphate déshydrogénase, laquelle catalyse la réaction d'oxydation du glycérol-3-phosphate en DHAP (« glycerol dehydratase-reactivation factor ») (Beopoulos et al, 2008). La séquence codante du gène GUT2 et la séquence peptidique de la glycérol 3-phosphate déshydrogénase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0B 13970g / YALI0B 13970p. Un procédé d'inhibition de l'expression de ladite glycérol 3-phosphate déshydrogénase endogène dans une souche de Y. lipolytica a été décrit dans les Demandes Internationales WO 2010/004141 et WO 2012/001 144 et par Beopoulos et al (2008).
Chez les levures, la glycérol-3-phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (EC 1.1.1.18) est codée par le gène GPDl (Dulermo et al., 201 1). Plus particulièrement, la séquence codante du gène GPDl et la séquence peptidique de la glycérol-3-phosphate déshydrogénase (NAD(+)) de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0B02948g / YALI0B02948p. Un procédé de surexpression de la glycérol-3 -phosphate déshydrogénase (NAD(+)) endogène dans une souche de Y. lipolytica a été décrit dans la Demande Internationale WO 2012/001 144.
Chez les levures, l'acétyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.2) est codée par le gène ACCl (Tai et al, 2012, Beopoulos et al, 2012). Plus particulièrement, la séquence codante du gène ACCl et la séquence peptidique de Pacétyl-CoA carboxylase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0C11407g / YALI0C11407p. Un procédé de surexpression de l'acétyl- CoA carboxylase endogène dans une souche de Y. lipolytica a été décrit par Thai et al (2012).
Chez les levures, les acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférases (DGAT ; EC 2.3.1.20) sont codées par deux gènes : DGA1 et DGA2 (Beopoulos et al, 2009 et 2012 ; Tai et al, 2012 ; Demande Internationale WO 2012/001144). Plus particulièrement, la séquence codante du gène DGA1 et la séquence peptidique de acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférases 1 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0E32769g / YALI0E32769p. La séquence codante du gène DGA2 et la séquence peptidique de l'acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférases 2 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0D07986g / YALI0D07986p. Chez Rhodoturula glutanis, une acyl-CoA:diacylglycéroî acyl transféras e a été décrite par ani et al (2013). Un procédé de surexpression d'une ou des deux DGAT (DGAT1 et/ou DGAT2) endogènes dans une souche de Y. lipolytica a été décrit par Beopoulos et al (2012) et par Tai et al. (2012). De manière avantageuse, le gène DGA2 est surexprimé dans la souche selon l'invention.
Chez les levures, ΓΑΤΡ citrate lyase (E.C. 2.3.3.8) consiste en deux sous-unités (A et B) codées par deux gènes (ACL1 et ACL2 respectivement) (Beopoulos et al, 2009). L'ATP citrate lyase de certaines levures oléagineuses a été caractérisée par Boulton et al (1981). Plus particulièrement, la séquence codante des gènes ACL1 et ACL2 et la séquence peptidique des sous-unités A et B de ΑΤΡ citrate îyase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous les numéros d'accès ou les noms suivants : ACL1 I sous-unité A : YALI0E34793g / YALI0E347939p, et ACL2 I sous-unité B : YALI0D24431g / YALI0D24431p. Un procédé de surexpression de l'ATP citrate lyase endogène dans une souche de Y, lipolytica a été décrit par Zhou et al (2012).
Chez les levures, l'enzyme malique (EC 1.1.1.40) est codée par le gène MAE1 (Beopoulos et al, 2009a). Plus particulièrement, la séquence codante du gène MAE1 et la séquence peptidique de l'enzyme malique de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0E18634g / YALI0E18634p. Un procédé de surexpression de l'enzyme malique endogène dans une souche de Y. lipolytica a été décrit par Zhang et al. (2013).
Chez les levures, la phospholipiderdiacylglycérol acyltransférase (PDAT ; EC
2.3.1.158), codée par le gène LROl, est une enzyme capable de catalyser la formation du triacylgîycérol à partir du 1 ,2-i7z-diacylglycérol (Beopoulos et al, 2009 et 2012). Plus particulièrement, la séquence codante du gène LROl et la séquence peptidique de la phospholipide:diacylglycérol acyltransférase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0E16797g / YALI0E16797p. Un procédé de surexpression de la phospholipide:diacylglycérol acyltransférase endogène dans une souche de Y. lipolytica a été décrit par Beopoulos et al. (2012).
Chez les levures, l'acétate-CoA ligase, l'acétyl-CoA synthétase (EC 6.2.1.1), les acyl-CoA synthétase et les coumarate-CoA ligases (EC 6.2.1.12) sont des protéines appartenant à la famille Génolevure GL3C0072 composée de 39 gènes qui sont codées par les gènes dont les séquences peptidique sont disponibles dans la base de données Génolevures sous les numéro d'accès SACE0A00462p, SACE0B07502p, SACE0L04796p, CAGL0B02717p CAGL0K06853p, CAGL0L00649p, ZY O0C00682p, ZYRO0E01936p, ZYRO0Fl4410p, SAKL0A06996p, SAKL0D14608p, SAKL0H14542p, KLTH0G11 198p, KLTH0H06490p, KLLAOA03333p, KLLA0D17336p, ERGO0A08558p, ERGO0D18634p, ERGO0G04994p, DEHA2D12606p, DEHA2E05676p5 PISO0K02452p, PISO0 15036p, PISO0L02453p, PISO0L15037p, YALI0A14234p, YALI0A15103p, YALI0B05456p, YALI0B07755p, YALI0C05885p, YALI0C09284p, YALI0D17314p, YALI0E05951p, YALI0E1 1979p, YALI0E12419p, YALI0E12859p, YALI0E20405p, YALÎ0F05962p et YALI0F06556p. L'acétyl-CoA synthétase (EC 6.2.1.1) appartient à la famille Génolevure GL3C0072. Elle est codée par le gène ACS2. Plus particulièrement, la séquence codante du gène ACS2 et la séquence peptidique de l'acétyl-CoA synthétase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0F05962g / YALI0F05962p. La surexpression &ACS2 permet d'augmenter le pool d'acétyl-CoA. Un procédé de surexpression de l'acétyl-CoA synthétase endogène dans une souche de Y. lipolytica a été décrit par Zhou et al, (2012).
Chez les levures, la Delta(9)-désaturase (EC 1.14.19.1) est codée par le gène OLEl, (Thevenieau et Nicaud, 2013). Plus particulièrement, la séquence codante du gène OLEl et la séquence peptidique de Del ta(9) -désaturas e de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0C05951g / YALI0C05951p. La surexpression d'OLE/ permet d'enrichir l'huile produite en C 18 : 1 (n- ).
Chez les levures, la Delta(12)-désaturase (EC 1.14.19.6) est codée par le gène FAD2
(Beopoulos et al., 2014). Plus particulièrement, la séquence codante du gène FAD2 et la séquence peptidique de la Delta(12)-désaturase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0B10153g / YALI0B10153p. La surexpression de FAD2 permet d'enrichir l'huile produite en C18:2(n-6). Un procédé de surexpression de la Delta(12)-désaturase de Mortierella alpina dans une souche de Y. lipolytica a été décrit par Chuang et al, (2009).
Chez les levures, Finvertase (EC 3.2.1.26) est codée par le gène SUC2 (Lazar et al, 2013). Plus particulièrement, la séquence codante du gène SUC2 et la séquence peptidique de Pinvertase de S. cerevisiae sont disponibles dans les bases de données Uniprot ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : P00724 / YIL162W. La surexpression de SUC2 permet l'utilisation du saccharose pur et de la mélasse (Lazar et al, 2013). Un procédé de surexpression de l'acétyl-CoA synthétase endogène dans une souche de S. cerevisiae a été décrit par Chen et al, (2010).
Une souche avantageuse au sens de la présente invention est une souche mutante de levure, de préférence une souche mutante de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica, dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2~méthylcitrate déshydratase endogène de ladite souche (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia) est inhibée, et la β- xydation des acides gras de ladite souche est également inhibée. L'inhibition de la β-oxydation des acides gras de ladite souche peut être réalisée en inhibant l'expression ou l'activité de toutes les isoformes d'acyl-coenzymeA oxydase endogènes de ladite souche (en particulier les 6 isoformes d'acyl-coenzymeA oxydase codées par les gènes POX1 à POX6 dans le cas de Yarrowia) et/ou en inhibant l'expression ou l'activité de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène de ladite souche (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFE1 dans le cas de Yarrowia) et/ou en inhibant l'expression ou l'activité de la 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase endogène de ladite souche (en particulier la 3-oxoacyl- coenzyme A thiolase codée par le gène POT1 dans le cas de Yarrowia) et/ou en inhibant l'expression ou l'activité d'une ou plusieurs protéines codées par les gènes PEX impliqués dans le métabolisme des peroxysomes des levures. De préférence, l'inhibition de la β-oxydation des acides gras de ladite souche est obtenue en inhibant l'expression ou l'activité de toutes les isoformes d'acyl-coenzymeA oxydase endogènes de ladite souche (en particulier les 6 isoformes d'acyl-coenzymeA oxydase codées par les gènes POXÎ à POX6 dans le cas de Yarrowia) et/ou en inhibant l'expression ou l'activité de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène de ladite souche (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia).
Une autre souche avantageuse au sens de la présente invention est une souche mutante de levure, de préférence une souche mutante de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica, dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthyîcitrate déshydratase endogène (en particulier la 2-méthyl citrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia) et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia) de ladite souche est inhibée. Un exemple d'une telle souche est la souche de Y. lipolytica JMY3433 décrite ci-après.
Une autre souche avantageuse au sens de la présente invention est une souche mutante de levure, de préférence une souche mutante de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica, dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia) et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia) de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl-CoA;diacylglycérol acyltransférase (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia) et une glycérol-3- phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia) sont surexprimés. Un exemple d'une telle souche est la souche de Y. lipolytica JMY3776 décrite ci-après.
Une autre souche avantageuse au sens de la présente invention est une souche mutante de levure, de préférence une souche mutante de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica, dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHDÎ dans le cas de Yarrowia), d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia) et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia) de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl-CoA:diacylglycérol acyl transféras e (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3- phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia) et une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACL1 et ACL2 dans le cas de Yarrowia) sont surexprimés. Un exemple d'une telle souche est la souche de Y. lipolytica JMY4079 décrite ci-après.
Une autre souche avantageuse au sens de la présente invention est une souche mutante de levure, de préférence une souche mutante de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica, dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthyl citrate déshydratase endogène (en particulier la 2-méthyl citrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia) et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia) de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3- phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia) et une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACL1 et ACL2 dans le cas de Yarrowia), une enzyme malique (en particulier le gène MAEl dans le cas de Yarrowia) et une acétyl-CoA carboxylase (en particulier le gène ACC1 dans le cas de Yarrowia) sont surexprimés. Un exemple d'une telle souche est la souche de Y. lipolytica JMY4209 décrite ci-après.
Une autre souche avantageuse au sens de la présente invention est une souche mutante de levure, de préférence une souche mutante de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica, dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia) et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia) de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyî-CoA:diacylglycérol acyltransférase (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3- phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia) et une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACLJ et ACL2 dans le cas de Yarrowia), une enzyme malique (en particulier le gène MAE1 dans le cas de Yarrowia) et une acétyl-CoA carboxylase (en particulier le gène ACC1 dans le cas de Yarrowia) sont surexprimés,
Une autre souche avantageuse au sens de la présente invention est une souche mutante de levure, de préférence une souche mutante de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica, dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia), de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia) et d'une ou plusieurs peroxines endogènes, telles que la peroxine 10 (en particulier la peroxine 10 codée par le gène PEX10 dans le cas de Yarrowia) de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3-phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia) et une ATP citrate lyase (en particulier les gènes A CL1 Q\ ACL2 dans le cas de Yarrowia) sont surexprimés.
Une autre souche avantageuse au sens de la présente invention est une souche mutante de levure, de préférence une souche mutante de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica, dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHDÎ dans le cas de Yarrowia), d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia) et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia) de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3- phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia), une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACL1 et ACL2 dans le cas de Yarrowia) et une acétyl-CoA synthétase (en particulier le gène ACS2 dans le cas de Yarrowia) sont surexprimés.
Une autre souche avantageuse au sens de la présente invention est une souche mutante de levure, de préférence une souche mutante de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica, dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia) et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia) de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3- phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia), une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACL1 et ACL2 dans le cas de Yarrowia), une acétyl-CoA synthétase (en particulier le gène ACS2 dans le cas de Yarrowia) et une Delta(9)- désaturase et/ou une Delta(12)-désaturase (en particulier les gènes OLE1 et/ou FAD2 respectivement dans le cas de Yarrowia), sont surexprimés.
Une autre souche avantageuse au sens de la présente invention est une souche mutante de levure, de préférence une souche mutante de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica, dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHDÎ dans le cas de Yarrowia), d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia) et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia) de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3- phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia), une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACL1 et ACL2 dans le cas de Yarrowia), une acétyl-CoA synthétase en particulier le gène ACS2 dans le cas de Yarrowia), une Delta(9)- désaturase et/ou une Delta(12)-désaturase (en particulier les gènes OLE1 et/ou FAD2 respectivement dans le cas de Yarrowia) et une invertase (en particulier le gène SUC2 dans le cas de Yarrowia) sont surexprimés.
Une autre souche avantageuse au sens de la présente invention est une souche mutante de levure, de préférence une souche mutante de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica, dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHDI dans le cas de Yarrowia), d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia) et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia) de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3- phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (NAD(+)) (en particulier le gène GPDl dans le cas de Yarrowia), une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACL1 et ACL2 dans le cas de Yarrowia), une enzyme malique (en particulier le gène MAE1 dans le cas de Yarrowia), une acétyl-CoA synthétase (en particulier le gène ACS2 dans le cas de Yarrowia) et une acétyl- CoA carboxylase (en particulier le gène ACC1 dans le cas de Yarrowia) sont surexprimés.
Une autre souche avantageuse au sens de la présente invention est une souche mutante de levure, de préférence une souche mutante de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica, dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène de ladite souche est inhibée, l'expression du gène endogène TGL4 de ladite souche est inhibée et les gènes endogènes GPDl et ACCl de ladite souche sont surexprimés.
L'inhibition de l'expression ou de l'activité d'une enzyme définie dans la présente invention peut être totale ou partielle. Elle peut être obtenue de diverses manières par des méthodes connues en elles mêmes de l'homme du métier.
De manière avantageuse, cette inhibition peut être obtenue par mutagenèse du gène codant pour la dite enzyme.
La mutagenèse du gène codant pour la dite enzyme peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression de ce gène, notamment au niveau du promoteur, conduisant à une inhibition de la transcription ou de la traduction de la dite enzyme.
Avantageusement, en ce qui concerne l'inhibition par mutagenèse du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase, la mutation au niveau de la séquence codante est effectuée dans la séquence codant la région prpD de la 2-méthylcitrate déshydratase.
La mutagenèse du gène codant pour la dite enzyme peut être effectuée par génie génétique. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène. Des méthodes permettant de déléter ou d'insérer une séquence génétique donnée chez la levure, en particulier chez Y, lipolytica, sont bien connues de l'homme du métier (voir pour revue Madzak et al., 2004). A titre d'exemple, on peut utiliser la méthode appelée POP ΓΝ / POP OUT qui a été utilisée chez les levures, particulièrement chez Y. lipolytica, pour la délétion des gènes LEU2, URA3 et XPR2 (Barth et Gaillardin, 1996). On peut également utiliser la méthode SEP (Maftahi et al, 1996) qui a été adaptée chez Y. lipolytica pour la délétion des gènes POX (Wang et al, 1999a). Avantageusement, on peut aussi utiliser la méthode SEP/Cre développée par Fickers et al. (2003) et décrite dans la Demande Internationale WO 2006/064131. En outre, des méthodes permettant d'inhiber l'expression ou l'activité d'une enzyme (ou protéine) de levure sont décrites dans la Demande Internationale WO 2012/001144. Une méthode très avantageuse selon la présente invention consiste à remplacer la séquence codante du gène codant pour la dite enzyme par une cassette d'expression contenant la séquence d'un gène codant pour un marqueur de sélection (e.g,, le gène URA3 [YALI0E26719g] codant pour l'orotidine-5'- phosphate decarboxylase). On peut aussi introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles dans le gène codant pour la dite enzyme, ayant pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou d'inhiber la transcription ou la traduction du gène codant pour la dite enzyme.
La mutagenèse du gène codant pour la dite enzyme peut aussi être effectuée à l'aide d'agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Cette mutagenèse permet aussi d'introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles dans le gène codant pour la dite enzyme.
Le gène muté codant pour la dite enzyme peut être identifié par exemple par PC à l'aide d'amorces spécifiques dudit gène.
Il est possible d'utiliser toute méthode de sélection connue de l'homme du métier compatible avec le gène (ou les gènes) marqueur(s) utilisés. Les marqueurs de sélection permettant la complémentation d'une auxotrophie, également communément appelés marqueurs d 'auxotrophie, sont bien connus de l'homme du métier. Le marqueur de sélection URA3 est bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de levure dont le gène URA3 (séquence disponible dans les bases de données Génolevures sous le nom YALI0E26741g ou UniProt sous le numéro d'accès Q12724), codant pour l'orotidine-5'- phosphate décarboxylase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en uracile. L'intégration du marqueur de sélection URA3 dans cette souche de levure permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu dépourvu d'uracile. Le marqueur de sélection LEU2 décrit notamment dans le brevet US 4,937,189 est également bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de levure dont le gène LEU2 (YALI0C00407g), codant la β-isopropylmaîate déshydro gênas e, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en leucine. Comme précédemment, l'intégration du marqueur de sélection LEU2 dans cette souche de levure permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en leucine. Le marqueur de sélection ADE2 est également bien connu de l'homme du métier dans le domaine de la transformation de la levure. Une souche de levure dont le gène ADE2 (YALI0B23188g), codant pour la phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, est inactivé (par exemple par déîétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en adénine. Là encore, l'intégration du marqueur de sélection ADE2 dans cette souche de levure permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en adénine. Des souches de Y. lipolytica auxotrophiques Leu" Ura" ont été décrites par Barth et Gaillardin, 1996. Des souches de Y. lipolytica auxotrophiques Leu" Ura" Ade" ont été décrites notamment dans la Demande WO 2009/098263.
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une souche mutante de levure selon la présente invention à partir d'une souche de levure parente, comprenant une étape de mutagenèse du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase telle que définie ci-dessus dans ladite souche de levure parente, et en outre une ou plusieurs étapes de mutagenèse dans ladite souche de levure parente conduisant à l'inhibition d'un ou plusieurs des gènes endogènes codant les acyl-coenzyme A oxydases (EC 6.2.1.3), la protéine multi fonctionnelle de la beta-oxydation (EC 4.2.1.74), la 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase (EC 2.3.1.16), les protéines codée par les gènes PEX impliqués dans le métabolisme des peroxysomes des levures (de préférence la peroxine 10), les lipases triacylglycérol (EC 3.1.1.3) et/ou la glycérol 3-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.99.5) (en particulier les gènes POX1 à POX6, MFE1, POT1, PEX, PEX10, TGL3, TGL4 et GUT2 dans le cas de Yarrowia), et/ou une étape de mutagenèse dans ladite souche de levure parente conduisant à la surexpression d'un ou plusieurs des gènes endogènes codant une glycérol-3 -phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (EC 1.1.1.18), une acétyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.2), une acyl- Co A :diacyl glycérol acyltransférases (EC 2.3.1.20), une ATP citrate lyase (EC 2.3.3.8), une enzyme malique (EC 1.1.1.40), une acétyl-CoA synthétase (EC 6.2.1.1), une Delta(9)- désaturase (EC 1.14.19.1), une Delta(12)-désaturase (EC 1.14.19.6 ) et/ou une invertase (EC 3.2.1.26) (en particulier les gènes GPD1, ACC1, DGA1, DGA2, ACLJ, ACL2, MAE1, ACS2, OLE1, FAD2 et/ou SUC2, dans le cas de Yarrowia).
Selon des modes de réalisation avantageux du procédé d'obtention d'une souche mutante de levure selon la présente invention, ledit procédé comprend :
des étapes de mutagenèse conduisant à l'inhibition des gènes codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase endogène de ladite souche (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHDl dans le cas de Yarrowia) et à l'inhibition de la β-oxydation des acides gras de ladite souche. L'inhibition de la β-oxydation des acides gras de ladite souche peut être réalisée telle que décrite ci-dessus ; ou
des étapes de mutagenèse conduisant à l'inhibition des gènes endogènes de ladite souche codant pour la 2-méthyl citrate déshydratase (en particulier la 2-méthyîcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), une ou plusieurs lipases triacylglycérol (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL3 ou TGL4, de préférence TGL4, dans le cas de Yarrowia) et la protéine multifonctionnelle de la beta- oxydation (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia), et des étapes de mutagenèse conduisant à la surexpression d'un ou plusieurs des gènes endogènes de la dite souche codant pour une acyl- CoA:diacyîglycérol acyltransférase endogène (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia) et une glycérol-3-phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia) ; ou
des étapes de mutagenèse conduisant à l'inhibition des gènes endogènes de ladite souche codant pour la 2-méthyl citrate déshydratase (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), une ou plusieurs lipases triacylglycérol (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL3 ou TGL4, de préférence TGL4, dans le cas de Yarrowia) et la protéine multifonctionnelle de la beta- oxydation (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia), et des étapes de mutagenèse conduisant à la surexpression d'un ou plusieurs des gènes endogènes de la dite souche codant pour une acyl- CoA:diacylglycérol acyltransférase endogène (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3-phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia) et une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACL1 et ACL2 dans le cas de Yarrowia) ; ou
des étapes de mutagenèse conduisant à l'inhibition des gènes endogènes de ladite souche codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), une ou plusieurs lipases triacylglycérol (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL3 ou TGL4, de préférence TGL4, dans le cas de Yarrowia) et la protéine multifonctionnelle de la beta- oxydation (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia), et des étapes de mutagenèse conduisant à la surexpression d'un ou plusieurs des gènes endogènes de la dite souche codant pour une acyl- CoA:diacylglycérol acyltransférase (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3-phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia), une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACL1 et ACL2 dans le cas de Yarrowia), une enzyme malique (en particulier le gène MAE1 dans le cas de Yarrowia) et une acétyi-CoA carboxylase (en particulier le gène ACC1 dans le cas de Yarrowia) ; ou
- des étapes de mutagenèse conduisant à l'inhibition des gènes endogènes de ladite souche codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), une ou plusieurs lipases triacylglycérol (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia), la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia) et une ou plusieurs peroxines telles que la peroxine 10 (en particulier la peroxine 10 codée par le gène PEX10 dans le cas de Yarrowia), et des étapes de mutagenèse conduisant à la surexpression d'un ou plusieurs des gènes endogènes de la dite souche codant pour une acyl- CoA:diacylglycérol acyltransférase (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3 -phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia) et une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACL1 et ACL2 dans le cas de Yarrowia) ; ou
des étapes de mutagenèse conduisant à l'inhibition des gènes endogènes de ladite souche codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), une ou plusieurs lipases triacylglycérol (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia) la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia), et des étapes de mutagenèse conduisant à la surexpression d'un ou plusieurs des gènes endogènes de la dite souche codant pour une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3 -phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia), une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACL1 QX ACL2 dans le cas de Yarrowia) et une acétyl-CoA synthétase (en particulier le gène A CS2 dans le cas de Yarrowia) ; ou
- des étapes de mutagenèse conduisant à l'inhibition des gènes endogènes de ladite souche codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase (en particulier la 2-méthyîcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), une ou plusieurs lipases triacylglycérol (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia) et la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia), et des étapes de mutagenèse conduisant à la surexpression d'un ou plusieurs des gènes endogènes de la dite souche codant pour une acyl-CoA:diacylglycérol acyî transféras e (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol- 3 -phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia), une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACLl et ACL2 dans le cas de Yarrowia), une acétyl-CoA synthétase (en particulier le gène ACS2 dans le cas de Yarrowia), une Delta(9)-désaturase et/ou une Delta(12)-désaturase (en particulier les gènes OLE! et/ou FAD2 respectivement dans le cas de Yarrowia) ; ou
- des étapes de mutagenèse conduisant à Finhibition des gènes endogènes de ladite souche codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), une ou plusieurs lipases triacylglycérol (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia) et la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia), et des étapes de mutagenèse conduisant à la surexpression d'un ou plusieurs des gènes endogènes de la dite souche codant pour une acyI-CoA:diacylglycérol acyltransférase (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3 -phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia), une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACLl et ACL2 dans le cas de Yarrowia), une acétyl-CoA synthétase en particulier le gène ACS2 dans le cas de Yarrowia), une Delta(9)-désaturase et/ou une Delta(12)-désaturase (en particulier les gènes OLE1 et/ou FAD2 respectivement dans le cas de Yarrowia), et une invertase (en particulier le gène SUC 2 dans le cas de Yarrowia) ; ou
des étapes de mutagenèse conduisant à l'inhibition des gènes endogènes de ladite souche codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia), une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes (en particulier la lipase triacylglycérol codée par le gène TGL4 dans le cas de Yarrowia) et la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène (en particulier la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation codée par le gène MFEl dans le cas de Yarrowia), et des étapes de mutagenèse conduisant à la surexpression d'un ou plusieurs des gènes endogènes de la dite souche codant pour une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase (en particulier le gène DGA2 dans le cas de Yarrowia), une glycérol-3- phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (NAD(+)) (en particulier le gène GPD1 dans le cas de Yarrowia), une ATP citrate lyase (en particulier les gènes ACLl et ACL2 dans le cas de Yarrowia), une enzyme malique (en particulier le gène MAE1 dans le cas de Yarrowia), une acétyî-CoA synthétase (en particulier le gène ACS2 dans le cas de Yarrowia) et une acétyl- CoA carboxylase (en particulier le gène ACCJ dans le cas de Yarrowia) ; ou
des étapes de mutagenèse conduisant à l'inhibition des gènes codant pour la 2- méthylcitrate déshydratase endogène de ladite souche (en particulier la 2-méthylcitrate déshydratase codée par le gène PHD1 dans le cas de Yarrowia) et du gène TGL4 endogène et une étape de mutagenèse conduisant à la surexpression des gènes endogènes GPD1 et ACC1.
L'inhibition et/ou la surexpression des gènes endogènes peuvent être effectuées par génie génétique.
Ladite souche de levure parente peut être une souche de levure de type sauvage {e.g, la souche de Y. lipolytica W29) ou mutante (e.g., la souche de Y. lipolytica Po d).
Selon un mode de réalisation avantageux de ce procédé, l'étape de mutagenèse comprend la délétion de la séquence codante du gène codant pour une enzyme donnée (e.g,, la 2-méthylcitrate déshydratase) et éventuellement le remplacement de cette séquence codante par une séquence exogène, telle que, par exemple, la séquence d'un gène codant pour un marqueur de sélection {e.g., le gène URA3).
La présente invention a également pour objet un procédé pour augmenter la production de lipides et/ou d'acide citrique d'une souche de levure, caractérisé en ce que l'on inhibe dans ladite souche de levure l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase.
L'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase peut être réalisée comme décrit ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé pour augmenter la production de lipides comprend en outre l'inhibition dans ladite souche de levure de l'expression d'un ou plusieurs des gènes endogènes codant les acyl-coenzyme A oxydases (EC 6.2.1.3), la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation (EC 4.2.1.74), la 3 -oxoacyl-co enzyme A thiolase (EC 2.3.1.16), les protéines codée par les gènes PEX impliqués dans le métabolisme des peroxysomes des levures, notamment la peroxine 10, les lipases triacylglycérol (EC 3.1.1.3) et/ou la glycérol 3-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.99.5) (en particulier les gènes POX1 à POX6, MFE1, POTl, PEX, TGL3, TGL4 et GUT2 dans le cas de dans le cas de Yarrowia) et/ou la surexpression dans ladite souche de levure d'un ou plusieurs des gènes endogènes codant une glycérol-3 -phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (EC 1.1.1.18), une acétyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.2), une acyl-CoA:diacylglycéroî acyltransférases (EC 2.3.1.20), une ATP citrate lyase (EC 2.3.3.8), une enzyme malique (EC 1.1.1.40), une acétyl-CoA synthétase (EC 6.2.1.1), une Delta(9)-désaturase (EC 1.14.19.1), une Delta(12)-désaturase (EC 1.14.19.6) et/ou une invertase (EC 3.2.1.26) (en particulier les gènes GPD1, ACC1, DGA1, DGA2, ACL1, ACL2, MAEJ, ACS2, OLE1, FAD2 et/ou SUC2, dans le cas de Yarrowia).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une souche mutante de levure dont l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase (EC 4.2.1.79) endogène de ladite souche est inhibée pour la production de lipides et/ou d'acide citrique.
Avantageusement, une souche mutante de levure selon la présente invention telle que définie ci-dessus est utilisée pour la production de lipides et/ou d'acide citrique.
La production de lipides peut être favorisée par rapport à la production d'acide citrique lorsque la souche mutante de levure selon la présente invention est cultivée en contrôlant la valeur du rapport entre la vitesse de consommation de carbone et la vitesse de consommation d'azote, tel que décrit dans la Demande Internationale WO 2010/076432. La production de lipides peut aussi être favorisée par rapport à la production d'acide citrique en utilisant une souche mutante selon la présente invention surexprimant les gènes codant pour l'ATP citrate lyase, l'ACC (acétyl-coA carboxylase), DGA1 (diacylglycérol acyltransférase 1) et/ou DGA2 (diacylglycérol acyltransférase 2). Des méthodes pour favoriser l'accumulation de lipides sont aussi décrites par Beopoulos et al, (2009).
La présente invention a également pour objet un procédé de production de lipides et/ou d'acide citrique, comprenant une étape de culture d'une souche mutante de levure dont l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase (EC 4.2.1.79) endogène de ladite souche est inhibée sur un milieu approprié.
Avantageusement, le procédé de production de lipides et/ou d'acide citrique, comprenant une étape de culture d'une souche mutante de levure selon la présente invention telle que définie ci-dessus sur un milieu approprié.
Les méthodes pour extraire les lipides ou l'acide citrique qui sont produits par des levures en culture sont bien connues de l'homme du métier (Papanikolaou et al, 2001 ; 2002 et 2008 ; André et al, 2009). A titre d'exemple, les lipides totaux (extraits dans un mélange de Folch) peuvent être extraits selon la méthode décrite par Papanikolaou et al, 2001, et fractionnés selon les méthodes décrites par Guo et al, 2000 et Fakas et al, 2006, alors que les acides organiques produits et le glycérol résiduel peuvent typiquement être purifiés par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC),
Selon un mode de réalisation préféré de ce procédé, le milieu contient comme source de carbone du glucose et/ou du glycérol, de préférence le milieu contient comme source de carbone du glycérol seulement. Le glycérol peut être brut ou pur.
Avantageusement, ledit milieu n'est pas carence en azote.
La production de lipides peut être favorisée par rapport à la production d'acide citrique comme indiquée ci-dessus.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple non-limitatif illustrant l'augmentation de la production de lipides et d'acide citrique par une souche mutante de levure Y, lipolytica dans laquelle l'expression de la 2-méthylcitrate déshydratase est inhibée (souche JMY1203), par rapport à la souche sauvage de Y. lipolytica W29 dont elle dérive, ainsi que des figures annexées :
Figure 1 : Cinétique de la consommation d'ions ammonium (A), de la production de biomasse (B), de la consommation de glycérol (C) et de la production d'acide citrique total (D) au cours de la croissance des souches de Yarrowia lipolytica W29 et JMY1203 cultivées sur un milieu à base de glycérol (Glol) limité en azote. Conditions de culture : croissance dans des fioles de 250 ml à 185 t/mn, Glol0 = 90 g/L, pH initial = 6,0 ± 0,1 maintenu ensuite entre 4,8 et 6,0, TOD> 40% (v/v), température d'incubation de 28°C. Chaque point représente la moyenne de deux mesures indépendantes.
Figure 2 : Cinétique des lipides totaux dans la biomasse sèche (%, p/p) au cours de la croissance des souches de Yarrowia lipolytica W29 (A) et JMY1203 (B) dans un milieu à base de glycérol limité en azote. Conditions de culture : croissance dans des fioles de 250 ml à 185 t/mn, Glol0 = 40, 60 et 90 g/L, pH initial = 6,0 ± 0,1 maintenu ensuite entre 4,8 et 6,0, TOD> 40% (v/v), température d'incubation de 28°C. Chaque point représente la moyenne de deux mesures indépendantes.
Figure 3 : Représentation schématique de la construction de souches mutantes selon l'invention.
Figure 4 : Visualisation de l'accumulation de lipides par coloration au BodiPy des corps lipidiques produits par les souches JMY3776 et JMY4209.
Figure 5 : Suivie de différents paramètres (croissance, consommation de glycérol, production de citrate, de mannitol et d'acides gras) au cours de la croissance des souches JMY2900, JMY3776 et JMY4079, dans les milieux Glol 6% et Glol9%. EXEMPLE : OBTENTION ET CARACTÉRISATION DE SOUCHES MUTANTES DE LEVURE YARROWÏA LIPOLYTICA DANS LESQUELLES AU MOINS
L'EXPRESSION DE LA 2-MÉTHYLCITRATE DÉSHYDRATASE EST INHIBÉE 1) Matériel et méthodes
i) Souches et milieux
Les souches mutantes de Y. lipolytica selon la présente invention sont dérivées de la souche auxotrophique de Y. lipolytica Pold (Leu" Ura" ; CLIB 139 ; de génotype MatA Ura3-302, Leu2-270, xpr2-322), elle-même dérivée de la souche sauvage de Y. lipolytica W29 (de génotype MatA ; ATCC20460) par modification génétique. Les souches Pold et W29 ont été décrites par Barth et Gaillardin (1996). Ces deux souches Pold et W29 ne présentent pas de différences quant à la production de lipides et d'acide citrique. Les cellules de levure ont été cultivées sur les milieux YPD (Barth et ai, 1996) ou YNBCas (YNBD avec casamino acides 0,2%) pour la sélection des transformants.
La souche d' Escherichia coli Machl-Tl (Invitrogen) a été utilisée pour la transformation et l'amplification de l'ADN plasmidique recombinant. Les cellules ont été cultivées sur un milieu LB (Sambrook et al., 1989). La Kanamycine (40 g mL) a été utilisée pour la sélection des plasmides.
ii) Construction de la cassette de délétion YALI0F02497
Le gène PHD1 (YALI0F02497) de la souche de Y. lipolytica Pold a été délété en remplaçant la région codante de ce gène par une cassette contenant le gène URA3 comme marqueur de sélection, selon la méthode d'invalidation de gène (« gene disruption ») décrite par Fickers et al. (2003). Plus précisément, les régions promotrices (P) et terminatrices (T) du gène YAL10F02497 [Tl] ont été obtenues par amplification PC de l'ADN génomique de Y. lipolytica W29 en utilisant les paires d'amorces YALI0F02497-P1 (SEQ ID NO : 2) / YALI0F02497-P2 (SEQ ID NO : 3) pour amplifier la région promotrice, et YALI0F02497-T1 (SEQ ID NO : 4) / YALI0F02497-T2 (SEQ ID NO : 5) pour amplifier la région terminatrice. Les amorces YALI0F02497-P2 et YALI0F02497-T1 ont été conçues pour introduire un site de restriction Iscel à l'extrémité 3' du fragment P et à l'extrémité 5' du fragment T. Les fragments P-Iscel et T-Iscel correspondants ont été regroupés et utilisés comme matrices pour l'amplification de la cassette V-Iscel-Ί avec le couple d'amorces YALI0F02497-P1 / YALI0F02497-T2. La cassette V-Iscel-Ί a été clonée dans le plasmide pCR4®Blunt-TOPO (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France), et transformée dans la souche d'E. coli Machl-Tl (Invitrogen). La construction résultante, dénommée pYALI0F02497-PT (JME739), a été vérifiée par analyse de restriction avec Iscel et séquencée. Le fragment loxR-t/ 43-loxP codant pour le gène URA3 a été excisé du plasmide JMPÎ21 (Fickers et al, 2003) par restriction Iscel et cloné au site correspondant dans YALI0F02497-PT de manière à insérer le marqueur de sélection URA3 entre le fragment P et T de la cassette V-Iscel-Ί au niveau du site Iscel. La construction résultante, dénommée pYALI0F02497-PUT (JME740) comprend la cassette PUT du gène YALI0F02497 (cassette YALI0F02497-PUT).
La délétion AYALI0F02497::URA3 a été introduite dans la souche de Y. lipolytica Pold (JMY1 5), selon la méthode décrite par Fickers et al. (2003), donnant lieu à la souche délétée JMY1203 (de génotype MatA, Ura3-302, Leu2-270, xpr2-322, AYALI0F02497::URA3). La cassette d'invalidation a été amplifiée par PCR et utilisée pour transformer la souche de Y. lipolytica Pold. Les transformants Ura+ ont été sélectionnés sur milieu Y BCas. L'invalidation du gène a été vérifiée par PCR en utilisant la paire d'amorces YALI0F02497-verl (SEQ ID NO : 6) / YALIOF02497-ver2 (SEQ ID NO : 7). Deux transformants (YALI0F02497-1 et YALI0F02497-5) présentaient un fragment PCR de 3,7 kb correspondant au gène invalidé. L'invalidation du gène dans ces deux transformants a été confirmée par Southern blot,
iii) Construction des vecteur de surexpression des gènes ACLl et ACL2, du gène MAE1 et du gène ACC1
Les vecteurs JME1619 et JME2246 ont été construit en clonant les séquences codantes des gènes ACLl et ACL2 entre les sites de restrictions BamHl et Avril des vecteurs m?62-pTEF-URA3ex (Beopoulos et al, 2012) et JM?62-pTEF-LEU2ex (Beopoulos et al, 2014) respectivement. Pour cela les séquences codantes des gènes ACLl et ACL2 ont été amplifiées à l'aide des oïigonucléotides suivants :
Pour^fŒ; :
ACLl -S : CGCGGATCCCACAATGTCTGCCAACGAGAACATCTCCCGATTCGAC (SEQ ID NO : 9), oligonucléotide sens, portant le site de restriction BamHl.
ACLl -A : CACCCTAGGTCTATGATCGAGTCTTGGCCTTGGAAACGTC (SEQ ID NO : 10), oligonucléotide anti-sens, portant le site de restriction Avril.
L'amplicon ainsi obtenu a ensuite été digéré par les enzymes BamHl et ^vrll et cloné dans le vecteur JMP62-pTEF-LEU2ex, générant le vecteur JME1619.
Four ACL2 :
La séquence codante d'ACL2 contient deux sites de restriction BamHl, le clonage de cette séquence a nécessité l'utilisation de différents oïigonucléotides afin de supprimer ces sites de restriction, sans toutefois modifier la séquence de la protéine issue de ce gène. ACL2-A : CACGGATCCCACAATGTCAGCGAAATCCATTCACGAGGCCGAC (SEQ ID NO : 11), oligonucléotide sens, portant le site de restriction BamHl.
ACL2-B : ATGCCTAGGTTAAACTCCGAGAGGAGTGGAAGCCTCAGTAGAAG (SEQ ID NO : 12), oligonucléotide anti-sens, portant le site de restriction Avril.
ACL2-C : G AG AGG GC G ACTGG AT 7CTCTTCT ACC AC (SEQ ID NO : 13), oligonucléotide sens, portant une mutation permettant de supprimer un site de restriction BamHl.
ACL2-Dd : GTGGTAGAAGAGAATCÇAGTCGCCCTCTC (SEQ ID NO : 14), oligonucléotide anti-sens, portant une mutation permettant de supprimer un site de restriction Bam .
ACL2-E : CTTCACCCAGGTTGGÇTCCACCTTCAAGGGC (SEQ ID NO : 15), oligonucléotide sens, portant une mutation permettant de supprimer un site de restriction BamHl.
ACL2-F : GCCCTTGAAGGTGGAGCCAACCTGGGTGAAG (SEQ ID NO : 16), oligonucléotide anti-sens, portant une mutation permettant de supprimer un site de restriction BamHl
Afin de reconstituer un gène ACL2 compatible pour un clonage dans les sites BamHl et Avril du vecteur ÎMP62-pTEF-LEU2ex, trois amplicons utilisant les amorces ACL2- A/ACL2-Dd, ACL2-C/ACL2-F et ACL2-B/ACL2-E ont été amplifiés. Enfin, ces amplicons ont été raboutés par PCR fusion en utilisant les oligonucléotides ACL2-A et ACL2-B. L'amplicon ainsi obtenu a ensuite été digéré par les enzymes BamHl et Avril et cloné dans le vecteur ]M?62-pTEF-LEU2ex, générant le vecteur JME2246.
Pour MAE Ί :
MAE 1 -sens : CGCGGATC C C AC AATGTT ACGAC (SEQ ID NO : 17), oligonucléotide sens, portant le site de restriction BamHl.
ACL1 -antisens : GCGCCTAGGCTAGTCGTAATCCCG (SEQ ID NO : 18), oligonucléotide anti-sens, portant le site de restriction ^vrll.
L'amplicon ainsi obtenu a ensuite été digéré par les enzymes BamHl et Avril et cloné dans le vecteur JMP62-pTEF-URA3ex, générant le vecteur JME2248.
Pour A CC 1 :
BamCytoATG : AACGCGGATCCCACAATGGCTTCAGGATCTTCAACG (SEQ ID NO :
19), oligonucléotide sens, portant le site de restriction BamHl.
ACCavSph : GTCCAAGCTCGGGAAGCTG (SEQ ID NO : 20) ACCrevIntron : CCGTTGTT AGCG AT G A GGA C CTTGTTG AT A ACTGT ATGACCTC (SEQ ID NO : 21)
ACCdirlntron : GAGGTCATACAGTTATCAACAAGGTCCTCATCGCTAACAACG (SEQ ID NO : 22)
ACCamXba : AGTATCTCATTTCCGAGGCTG (SEQ ID NO : 23)
ACCdirBamKO : CTGGACACCATGGCTCGTCTTGATCCCGAGTACTCCTCTCTC (SEQ ID NO : 24)
ACCrevBamKO : GAGAGAGGAGTACTCGGGATCAAGACGAGCCATGGTGTCCAG (SEQ ID NO : 24)
AvrRevACC : AGCTATCGATAATCCTAGGTCACAACCCCTTGAGCAGCTC (SEQ ID
NO : 26), oligonucléotide anti-sens, portant les sites Clal et Avril.
Le gène ACCl étant particulièrement long et contenant un intron (contenant un site
Notï, important dans la libération de la cassette de surexpression), et des sites de restriction inadéquats (Notl dans Γ intron et un site BamHl) pour un clonage dans le vecteur JMP62- pTEF~LEU2ex ouvert par BamHl et Avril, différents amplicons ont été amplifiés afin de supprimer P intron et les sites de restriction Notl et BamHl, Ainsi, 4 amplicons ont été obtenus en utilisant les couples d'amorces suivants :
- Amplicon 1 : BamCytoATG et ACCrevIntron (184 pb),
- Amplicon 2 : ACCdirlntron et ACCavSph (2207 pb),
- Amplicon 3 : ACCamXba et ACCrevBamKO (2101 pb),
- Amplicon 4 : ACCdirBamKO et AvrRevACC (585 pb),
- Amplicon 5 : BamCytoATG et AvrRevACC (7270 pb),
Les amplicons 1 et 2 ont ensuite été fusionnés avec les amorces BamCytoATG et ACCavSph. Les amplicons 1+2 et Pamplicon 5 ont été digérés par BamHl + Sphl. L'amplicon 5, digéré par BamHl + Sphl permet l'obtention d'un fragment de 1876 pb, appelé fragment 5'. Les fragments ainsi digéré (1+2 et 5') ont par la suite été clonés par ligation 3 voies entre les sites BamHl et Xbal du vecteur Bluescript(-)KS, générant le vecteur JME2412. Les amplicons 3 et 4 ont ensuite été fusionnés avec les amorces ACCamXba et AvrRevACC. L'amplicon 3+4 a ensuite été digéré par Xbal et Clal et cloné par ligation 3 voies entre les sites Xbal et Clal du vecteur Bluescript(~)KS, générant le vecteur JME2413. Les vecteurs JME2412 et JME2413 ont ensuite été digéré par lai et Clal afin de libérer les fragments 1+2+5' et 3+4 avec des extrémités compatibles. Ces deux fragments ainsi digérés ont, par la suite, été clonés par ligation 3 voies entre les sites BamHl et Clal du vecteur Bîuescript(-)KS, générant le vecteur JME2406. La séquence codante du gène ACCl ainsi reconstruite a enfin été digérée par les enzymes Bam l + Avril, pour être clonée entre les sites BamHl + Avril du vecteur JMP62 pTefLEU2ex, générant le vecteur JME2408.
iv) Construction des souches mutantes dérivées de la souche Aphdl(JMY1203)
La souche JMY1203 a été rendue protrophe par conversion du locus leu2-270 en sa version sauvage. La souche JMY3279 a été obtenue après excision du marqueur de sélection URA3ex de la souche JMY1203, suivant le principe décrit par Fickers et al. (2003). Cette souche a ensuite été successivement transformée avec les cassettes d'inactivation des gènes MFE1 (JME1077) et TGL4 (JME1000), déjà décrites dans Dulermo et Nicaud (201 1) et Dulermo et al. (2013), respectivement. Les marqueurs URASex et LEU2ex de la souche JMY3396 ainsi obtenue, ont ensuite été excisés (Fickers et al, 2003), générant la souche JMY3433. Cette dernière a ensuite été transformée successivement par les cassettes de surexpression LEU2ex pTEF~DGA2 (JME1822, digestion Notl, dérivé du JME1132, Beopoulos et al, 2012) et URA3ex pTEF-GPDl (JME1128, digestion Notl, Dulermo et Nicaud, 2011), générant la souche JMY3776. La souche JMY4079 a été obtenue après excision des marqueurs de sélection URA3ex et LEU2ex (Fickers et al, 2003) puis transformation successive avec les cassettes de surexpression des gènes yïCXi(JME1619) et ACL2 (JME2246). Les marqueurs URA3ex et LEU2ex de la souche JMY4079, ont ensuite été excisés (Fickers et al, 2003), générant la souche JMY4122. Cette dernière a ensuite été transformée successivement par les cassettes de surexpression URA3ex pTEF-MAEl (JME2248, digestion Notl) et LEU2ex pTEF-ACCl (JME2408, digestion Notl), générant ainsi les souches JMY4168 et JMY4209, respectivement.
Un schéma représentant la construction des différentes souches ainsi que les vecteurs utilisés est présenté Figure 3.
v) Conditions de culture pour les souches W29 et JMY1203
La souche sauvage Y. lipolytica W29 et les souches génétiquement modifiées ont été utilisées pour les fermentations.
Toutes les expériences ont été effectuées dans des fioles de culture sous agitation. Le milieu de culture utilisé contenait (en g/L): KH2P04 7,0; Na2HP04 2,5; MgS04x7H20 1,5; CaCl2x2H20 0,1 ; FeCI3x6H20 0,15; ZnS04x7H20 0,02; MnS04xH2O 0,06 (Papanikolaou et al, 2002). Le sulfate d'ammonium et l'extrait de levure ont été utilisés comme sources d'azote à une concentration de 0,25 à 2,5 g L respectivement. Le glycérol brut (Industrie hellénique de la glycérine et des acides gras SA ; pureté environ 70%, g/g, impuretés composées de sels de potassium et de sodium 12%, p/p, de matériau organique non-glycérol 1 %, v/v, d'eau 17%, g/g et de méthanol <0,1%, g/g) a été utilisé comme seule source de carbone à des concentrations différentes. Le pH initial pour tous les milieux est de 6,0 ± 0,1. Pour les expériences contrôles, du glucose de qualité analytique (AnalaR, BDH, Royaume-Uni) a été utilisé comme source de carbone.
Des fioles coniques de 250 ml remplies de 50 ± 1 mL de milieu de culture ont été inoculées avec 1 ml de pré-culture en phase exponentielle contenant 1-3x106 cellules (concentration de la biomasse initiale X0 environ 0,10 g/L). Les fioles ont été incubées à une température de 28°C et agitées à 180 t/mn dans un agitateur rotatif (New Brunswick Se, États-Unis). La pré-culture a été effectuée dans le milieu synthétique mentionné ci-dessus avec du glycérol pur (pureté 98%) utilisé en tant que substrat à 20 g/L.
vi) Conditions de culture pour les souches JMY2900, JMY3776 et JMY4079
Les souches de Y. lipolytica JMY2900 (référence), JMY3776 {Aphdl Amfèl Atgl4+ p TEF-D G A 2-LEU2ex+ pTEF~GPDl-URA3ex) et la souche JMY4079 {Aphdl Amfel Atgl4+ pTEF-DGA2+ pTEF-GPDl + pTEF-ACLFURA3ex + pTEF-LEU2ex) ont été évaluées pour leur capacité à produire des lipides, en fioles à baffles.
Le milieu de culture utilisé contenait : 60 g/L de glycérol pur (milieu Glol 6%) ou
90 g/L de glycérol pur (milieu Glol 9%), 5 g/L NH4C1 comme seule source d'azote et 1.7 g/L de YNB. Un tampon phosphate 50 mM (35 mM H2P04, 64 mM Na2HP04) est ajouté afin de maintenir à 6.8± 0,1 le pH du milieu.
Des fioles coniques de 500 ml remplies de 50 ± 1 mL de milieu de culture ont été inoculées avec 1 ml de pré-culture en phase exponentielle contenant l~3xl06 cellules (concentration de la biomasse initiale X0 environ 0,10 g/L). Les fioles ont été incubées à une température de 28°C et agitées à 160 t/mn dans un agitateur rotatif (New Brunswick Se, États-Unis). La pré-culture a été effectuée dans les milieux synthétiques mentionnés ci-dessus, vii) Méthodes analytiques
Dans tous les essais, la production de biomasse sèche, la consommation de glucose ou de glycérol, la sécrétion d'acides organiques, la concentration d'azote résiduel et la production intra-cellulaire de lipides ont été évaluées. Le pH initial du milieu de culture était de 6,0 ± 0,1, Au cours des cultures, le pH a été maintenu dans une plage comprise entre 4,8 et 6,0 par addition, périodiquement de KOH 5M. La tension en oxygène dissous (TOD en %, v/v) a été mesurée à l'aide d'une électrode sélective (oxi200 Sensodirect, Lovinbod). Tous les essais ont été effectués en conditions aérobiques (TOD> 40%, v/v, pour toutes les phases de croissance). Les cellules de levure ont été récoltées par centrifugation (Hettich Universal 320-R, Allemagne) à 10000xg/15 min et lavées 3 fois avec de l'eau distillée. La concentration en biomasse (X, g/L) a été déterminée par le poids sec (85±5°C/24 h). Le glycérol (Glol, en g/L), le glucose (Glc, en g/L) et les acides organiques ont été analysés par HPLC comme décrit par André et al (2009). La concentration en acide iso-citrique a été déterminée par un procédé enzymatique, en mesurant le NADP¾ produit lors de la conversion de l'acide isocitrique en acide α-cétoglutarique, catalysée par l'iso-citrate déshydrogénase, comme décrit par Papanikolaou et al. (2002). La quantité totale d'acide citrique (acide citrique et isocitrique) produite a été caractérisée en tant que Cit (en g/L). La détermination des ions ammonium a été faite à l'aide d'une électrode sélective d'ammonium (Hach 95-12, Allemagne).
Les lipides totaux cellulaires (L, en g/L) ont été extraits à partir de la biomasse sèche avec un mélange de chloroforme/méthanol 2/1 (v/v) et ont été déterminés par gravimétrie. Les lipides cellulaires ont été fractionnés en leurs fractions lipidiques. Brièvement, un poids connu de lipides extraits (environ 200 mg) a été dissous dans du chloroforme (3 ml) et a été fractionné en utilisant une colonne (25 x 100 mm) d'acide silicique, activé par chauffage une nuit à 110°C (Fakas et al, 2006). Des applications successives de chloroforme, d'acétone et de méthanol produisent des fractions contenant des lipides neutres (N), des glycolipides plus des sphingolipides (G+S) et des phospholipides (P), respectivement (Guo et al, 2000 ; Fakas et al, 2006). Le poids de chaque fraction a été déterminé après évaporation du solvant respectif. Les lipides totaux cellulaires ou les fractions lipidiques individuelles ont été convertis en leurs acides gras esters méthyliques (FAME) au cours d'une réaction en deux étapes avec du sodium méthanolique et du méthanol chlorhydrique (Fakas et al, 2006). Cette méthode a été choisie de manière à éviter la trans-isomérisation des acides gras. Les FAMEs ont été analysés dans un appareil de chromatographie en phase gazeuse (GC-FID) (Fisons série 8000) selon Fakas et al (2006). Les FAMEs ont été identifiés par comparaison à des étalons.
viii) Méthodes analytiques pour les souches JMY2900, JMY3776 et JMY4079
Dans tous les essais, la production de biomasse sèche, la consommation de glycérol, la sécrétion d'acides organiques et la production intracellulaire de lipides ont été évaluées. Les cellules de levure ont été récoltées par centrifugation (Hettich Universal 320-R, Allemagne) à 4000xg/5 min et lavées 3 fois avec de l'eau distillée. La concentration en biomasse (X, g L) a été déterminée par le poids sec (lyophilisation 48h). Le glycérol (Glol, en g/L), et les acides organiques ont été analysés par HPLC comme décrit par Lazar et al (2013). La quantité d'acide citrique produite a été caractérisée en tant que CA (en g/L),
Les lipides totaux cellulaires (L, en g L) ont été extraits à partir de la biomasse sèche broyée (20 à 30 mg) avec un mélange de chloroforme/méthanol 2/1 (v/v), suivant le protocole de Folch et Lee (1957) et ont été déterminés par gravimétrie. Les lipides totaux cellulaires ont été convertis en leurs acides gras esters méthyliques (FAME) par la méthode de Browse (Browse et al., 1986). Les FAMEs ont été analysés dans un appareil de chromatographie en phase gazeuse (GC-FID) (Varian, GC-430) selon Beopoulos et al. (2008). Les FAMEs ont été identifiés par comparaison à des étalons.
2) Résultats
i) Croissance des souches de Γ. lipolytica sur glucose ou giycérol brut
Les souches de Y. lipolytica W29 et JMY1203 ont été cultivées dans un milieu limité (carencé) en azote avec une concentration initiale en giycérol (GlolO) ou en glucose (GlcO) ajustée à 40 g/L. Les cultures de ces deux souches sur glucose sont considérées comme une base de comparaison. Les résultats de la cinétique sont décrits dans le Tableau 2 ci-après.
Tableau 2 : Données quantitatives des souches de Y. lipolytica W29 et JMY1203 provenant de cultures sur milieu limité en azote et contenant du glucose ou du giycérol en tant que substrat à une concentration initiale de 40 g/L. Représentation de la biomasse (X, g L), des lipides (L, g L), de l'acide citrique total (Cit, g L), du giycérol consommé (GlolCOns, g/L) et du glucose consommé (GlcC0E1s, g L) lorsque : la quantité maximale de lipides dans le poids sec de levure (%, g/g) (a) et la concentration maximale d'acide citrique total (b) sont atteintes. Conditions de culture : croissance dans des fioles de 250 ml à 185 t/mn, pH initial = 6,0 ± 0,1 maintenu ensuite entre 4,8 et 6,0, TOD> 40% (v/v), température d'incubation de 28°C. Chaque point représente la moyenne de deux mesures indépendantes.
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Dans toutes les expériences et indépendamment de la source de carbone utilisée, les souches W29 et JMY1203 ont consommé, avec des taux comparables, l'azote extra-cellulaire disponible (NH4+ initial à 55±10 ppm, épuisement de 3 'azote en 60 ± 5 heures après inoculation). La souche W29 présente une production de biomasse supérieure à celle de la souche JMY1203 sur les deux substrats, compris entre 10,7-12,5 g\L. Pour la souche JMY1203, la production de biomasse atteint un maximum de 7 g/L en présence de glycérol ; sur glucose, la concentration de biomasse diminue au cours de la culture jusqu'à 1 ,8 g/L, suggérant une lyse cellulaire en fin de culture.
La production de citrate augmente après l'épuisement de l'azote du milieu, conduisant à sa sécrétion. Pour la souche W29, la production du citrate est supérieure sur glucose, atteignant
Figure imgf000036_0001
g/g. Sur glycérol, la production de citrate maximale est 1,65 fois plus faible (Citmax=l 9, 1 g/L, taux de bioconversion en glycérol Υ<¾/ΟΜ=0,48 g/g) que sur milieu glucose et le taux de conversion a diminué de 56%. La souche JM1203 présente des caractéristiques opposées sur glucose ; la production de citrate et les taux de conversion sont de
Figure imgf000036_0002
g/g, respectivement, alors que sur glycérol brut la Citmax était 2,04 fois plus élevée (31 g/L), correspondant à une augmentation de 37,4 % du taux de conversion atteignant 0,78 g/g. Ces résultats indiquent une différence du flux de carbone selon la croissance sur glucose ou glycérol pour les deux souches, qui présentent un phénotype opposé.
De plus, même si la souche JMY1203 produit moins de biomasse comparé à la souche W29, elle présente une augmentation de 1,74 fois plus de lipides, atteignant 10,1%, g/g, du poid sec (PS) sur glucose et 1,49 fois plus de lipides sur glycérol, atteignant 14,9%, g/g, du PS. Le glycérol est un meilleur substrat en ce qui concerne l'accumulation de lipides pour ces deux souches,
Une diminution rapide des lipides accumulés est observée pour la souche W29 ou le contenu lipidique diminue de 5,8 à 2,4%, g/g, du PS (diminution de 58% du taux de lipides) sur glucose et de 10 à 1,6%, g/g, du PS sur glycérol. Ceci démontre une remobilisation importante des lipides accumulés avec une augmentation simultanée de la production d'acide citrique, particulièrement en présence de glycérol. Pour la souche JMY1203, la quantité de lipides accumulés diminue de 10,1 à 5,1 %, g/g, du PS (49,5% de diminution) sur glucose et de 14,9 à 10%, g/g, du PS (32,9% de diminution) sur glycérol. On observe alors que la souche W29 remobilise plus rapidement ces réserves lipidiques sur glucose que la souche JMY1203. Sur milieu glycérol la remobilisation est similaire pour les deux souches.
ii) Croissance des souches de Y. lipolytica sur glycérol brut à des concentrations initiales en substrat élevées
Des milieux limités en azote contenant la même quantité d'azote initiale que celle décrite précédemment mais une concentration initiale en glycérol brut plus élevée ont été utilisés (Glol0 à 60 et 90 g/L). Les résultats de la cinétique sont décrits dans le Tableau 3 ci-après. Tableau 3 : Données quantitatives des souches de Y. lipolytica W29 et JMY1203 provenant de cultures sur milieu limité en azote à une concentration initiale constante et contenant du glycérol comme substrat à deux concentrations initiales différents (Glol0, g/L). Représentation de la biomasse (X, g/L), des lipides (L, g/L), de l'acide citrique total (Cit, g/L) et du glycérol consommé (Glolcons, g/L) lorsque : la quantité maximale de lipides dans le poids sec de levure (%, g/g) {a) et la concentration maximale d'acide citrique total (b) sont atteintes. Conditions de culture : croissance dans des fioles de 250 ml à 185 t/mn, Glol0 = 60 ou 90 g/L, pH initial = 6,0 ± 0,1 maintenu ensuite entre 4,8 et 6,0, TOD> 40% (v/v), température d'incubation de 28°C. Chaque point représente la moyenne de deux mesures indépendantes.
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La représentation graphique des cinétiques des souches W29 et JMY1203 lors de l'essai Glolo = 90 g/L est montrée à la Figure 1. L'azote extra-cellulaire (NH4+ initial à 55 ± 10 mg/L) a été épuisé à environ 60 h après inoculation pour les deux souches (Figure 1A). Le taux d'absorption de l'azote était similaire indépendamment de la concentration Glolo employée ou de l'utilisation du glucose comme substrat pour les deux souches testées (cinétiques non présentées). Malgré l'épuisement en azote, la concentration de la biomasse a nettement augmenté pour la souche W29, atteignant la valeur XMAX d'environ 10 g/L après 150 h (Figure 1B) et puis a rapidement diminué. La souche JMY1203 présente un taux de croissance plus faible ; la production de biomasse a cessé après l'épuisement de l'azote assimilable du milieu de culture et a été maintenue constante jusqu'à la fin de la culture.
La consommation de glycérol a été constante et quasi-linéaire pour les deux souches testées, à la fois dans les phases de croissance en azote équilibrée (0-60 h) et limitée (60 à 330 h), avec un taux de consommation du glycérol rGloi (= -AGol/At) de 0,26 g/L pour la souche W29, valeur nettement plus élevée que 0,18 g/L obtenu pour la souche JMY1203 (Figure 1C). Bien que de l'acide citrique ait été produit par les deux souches en phase de croissance équilibrée, la production de Cit s'est principalement effectuée après épuisement en azote du milieu. La production d'acide citrique semble être presque linéaire pour la souche W29 avec un taux de production d'acide citrique total rCu (= ACit/Ai) de 0,11 g/L, alors que cette valeur est 1,54 fois plus élevée pour la souche JMY1203 (0,17 g/L.h ; Figure 1D). Les deux souches présentent le même comportement quelle que soit la concentration en glycérol, ce qui indique que les taux de consommation du glycérol et de production du citrate sont souche dépendants (sauvage vs mutant).
En ce qui concerne l'accumulation de lipides, les deux souches présentaient un comportement complètement différent (Figure 2A, B). Au cours de la phase non-limitante en azote et quelle que soit la concentration en glycérol, la souche W29 a accumulé des lipides avec un taux similaire, pour atteindre un maximum de 10% g/g du PS dans toutes les conditions testées. Cependant, après épuisement de l'azote, les lipides sont rapidement remobilisés à des concentrations faibles de glycérol, alors qu'à des fortes concentrations de glycérol les lipides ne sont pas remobilisés (Figure 3 A). Ce comportement suggère une régulation de la voie de dégradation des lipides en fonction de la concentration de glycérol. En revanche, pour la souche JMY1203, l'accumulation lipidique dépend clairement de la concentration de glycérol pendant la phase de croissance où l'azote n'était pas limitant, tandis que la dégradation des lipides pendant la phase de carence en azote n'était pas affectée en fonction de la concentration en glycérol (Figure 2B). L'accumulation de lipides atteint 26,6%, g/g, du PS pour une concentration initiale de glycérol (Glolo) de 90 g L, et 14,9% pour une Glolo de 40 g/L.
La souche W29 a présenté une concentration plus élevée de la biomasse par rapport à la souche JMY1203. Comme précédemment, l'augmentation de la concentration Glol0 a donné lieu à une diminution de la quantité de biomasse (X) produite par la souche W29, suggérant une potentielle inhibition du substrat. Une observation similaire peut être faite également pour la souche JMY1203, en tenant compte du fait que la quantité X est d'environ 7 g/L pour l'essai avec Glolo = 40 g/L, et environ 4 g/L pour l'essai avec Glolo = 90 g/L.
D'une autre part, la concentration Cit (en g/L) a sensiblement augmenté avec l'augmentation de la concentration Glolo du milieu ; la souche W29 produit deux fois plus de citrate à Glolo = 90 g/L, par rapport au taux du citrate produit à Glolo = 40 g/L. Toutefois, le rendement de conversion de l'acide citrique produit par glycérol consommé (YCMGM) est resté relativement constant à 0,45 g/g (voir les Tableaux 3 ci-dessus et 4 ci-dessous), atteignant un maximum de 0,48 g/g, ce qui suggère être le seuil de bioconversion du glycérol en acide citrique pour la souche W29, dans ces conditions de culture. Pour la souche JMY1203, même si la biomasse obtenue était nettement plus faible par rapport à la souche W29, la production de citrate et le taux de bioconversion du glycérol augmentent avec la concentration en glycérol. La quantité de citrate est passée de 31 g/L à environ 58 g/L et le rendement de bioconversion du glycérol en acide citrique (valeur Ycit/Gioi) est passé de 0,78 g/g à Glol0 = 40 g/L à la valeur impressionnante de 0,91 g/g à Glolo = 90 g/L. Ces valeurs représentent une augmentation de 1 ,6 fois pour la production de citrate et de 2,1 fois du rendement de conversion du glycérol en citrate, par rapport à la souche W29. L'acide citrique est le principal composé du citrate total produit, car le dosage de l'acide iso-citrique a montré que l'acide isocitrique était d'environ 5-8%, g/g, de l'acide citrique total produit quelle que soit la souche testée et la concentration Glolo du milieu. Dans l'essai avec la quantité Citmax atteinte, la quantité d'acide isocitrique dosée était d'environ 5%, g/g, du Cit.
La valeur Yat/Gioi exceptionnelle qui a été obtenue, montre que la souche génétiquement modifiée JMY1203 peut être utilisée pour favoriser la conversion du glycérol brut en acide citrique.
iii) Analyse des lipides
La composition en acide gras (AG) des lipides cellulaires produits a été étudiée à la fin des phases de croissance pour les deux souches cultivées sur glucose et glycérol brut. Elle est représentée aux Tableaux 4 (souche W29) et 5 (souche JMY1203) ci-après.
Tableau 4 : Composition en acides gras des lipides cellulaires totaux produits par la souche Yarrowia lipolytica W29 au cours de sa croissance dans un milieu limité en azote contenant du glucose (à 40 g/L) ou du glycérol (à 40, 60 ou 90 g/L). Les conditions de culture sont identiques à celles décrites pour les Tableaux 2 et 3. LE : fin de la phase exponentielle. ES : début de la phase stationnaire. S : phase stationnaire.
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Tableau 5 : Composition en acides gras des lipides cellulaires totaux produits par la souche Y lipolytica JM1203 au cours de sa croissance dans un milieu limité en azote contenant du glucose (à 40 g/L) ou du glycérol (à 40, 60 ou 90 g/L). Les conditions de culture sont identiques à celles décrites pour les Tableaux 2 et 3. LE : fin de la phase exponentielle. ES : début de la phase stationnaire. S : phase stationnaire.
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Il ressort de ces résultats que la composition en AG a été modifiée en fonction de la concentration Glolo utilisée et le temps de fermentation, et que des différences ont également été observées entre la croissance sur glucose et sur glycérol. Certaines différences dans les profils en AG ont été observées entre les deux souches utilisées, car la culture de la souche W29 a conduit à la synthèse d'un lipide microbien moins riche en acide oléique (A9C38: 1) et plus riche en acide linoléique (A9'12C18:2) que pour la souche JMY1203. Pour les essais équivalents sur Glol et Glc (concentration initiale de 40 g/L) (Tableau 4), la composition en AG des lipides cellulaires de la souche W29 a présenté quelques différences, puisque la culture sur glucose a été accompagnée par la synthèse d'un lipide plus riche en A9,52C18:2. Des différences dans la composition en AG des lipides cellulaires ont été observées pour la souche JMY1203, pour les essais similaires sur Glol et Glc (Tableau 5) ; la croissance sur glucose a été accompagnée par la synthèse d'un lipide plus riche en A9C18:1 et A9,12C18:2 et moins riche en AG saturé. Pour la souche W29, l'augmentation de la concentration Glol0 a entraîné une légère diminution de la concentration de A9C18:1 et une augmentation plus nette de la concentration de A9,12C18:2 (Tableau 4) ; la tendance inverse a été constatée pour la souche J Y1203 (Tableau 5). La composition en AG cellulaire a présenté une évolution en fonction du temps de culture, car dans la plupart des cas étudiés, la concentration cellulaire de A9C 18: 1 avait tendance à diminuer avec l'évolution de la fermentation.
L'analyse des différentes fractions lipidiques (N, G+S et P) pour Glol0 = 90 g/L à la phase stationnaire, a montré que pour la souche JMY1203, la quantité de la fraction N est plus élevée que celle pour la souche W29 (voir Tableau 6 ci-après). Tableau 6 : Distribution des fractions lipidiques et composition en acides gras des lipides totaux (T), des lipides neutres (N), des glycolipides plus des sphingolipides (G+S) et de phospholipides (P) des souches de Y. lipolytica W29 et JMY1203 au cours de leur croissance dans un milieu limité en azote contenant du glycérol (à 90 g/L). Les conditions de culture sont identiques à celles décrites au Tableau 3 ci-dessus. Le point d'échantillonnage pour l'analyse des lipides est situé dans la phase stationnaire de croissance (110-160 h).
Figure imgf000041_0001
L'analyse des différentes fractions lipidiques (N, G+S et P) a montré que la composition en AG de ces fractions présentait des similitudes avec la composition en AG des lipides totaux, alors que la fraction P était légèrement plus riche en AG poly- insaturés (principalement Δ9'1218:2) (Tableau 6). Les différences dans les quantités de N, G+S et P pour les souches W29 et JMY1203 peut se refléter dans la composition différente en AG des lipides totaux de ces levures (voir Tableaux 4 et 5). Dans les essais avec les plus faibles quantités de lipides totaux produits (cas de la souche W29), de plus grandes quantités des fractions G+S et P (en %, p/p, dans les lipides totaux) (qui sont plus insaturés), ont été synthétisées.
Le rendement de production d'acide citrique par la souche JMY1203 a été comparé à celui de plusieurs souches de Y. lipolytica connues et cultivées dans des conditions diverses de fermentation sur des supports composés de glycérol brut ou pur. Les résultats sont présentés au Tableau 7 ci-après (légendes : n.r. : Non renseigné dans le document. * : D = 0,009 h . $ : D = 0,021 h"1. § : Valeur totale de l'acide citrique, la teneur en acide isocitrique représente environ 5%, p/p, de l'acide citrique total). Tableau 7 :
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Les résultats montrent que le rendement de conversion du glycérol en acide citrique
(acide citrique produit par unité de glycérol consommé) de la souche JMY1203 selon la présente invention est plus élevé que celui de différentes souches de Y. lipolytica décrites dans l'art antérieur. iv) Croissance des souches JMY2900, JMY3776 et JMY4209 en gfycérol 6% et 9% et consommation du glycérol au cours du temps
Les souches de Y. Hpolytica JMY2900, JMY3776 et JMY4079 ont été cultivées durant 96 h dans le milieu Glol 6% et le milieu Glol 9%. Leur croissance a été déterminée par mesure de densité optique à 600 nm (D06oo)- Après 96 h de croissance, la masse de biomasse sèche de chaque souche à été mesurée.
Dans le milieu Glol 6%, la croissance des souches JMY3776 et JMY4079 est inférieure d'environ 30% à 40% à la croissance de la souche de référence JMY2900. La biomasse finale après 96h de culture étant de 10,56 g/L et 12,36 g/L pour JMY3776 et JMY4079, contre 18,48 g/L pour JMY2900. L'analyse des courbes de densité optique au cours de la croissance des différentes souches aboutie à la même constatation (Fig. 5 et Tableau 8).
Dans le milieu Glol 9%, la croissance des souches JMY3776 et JMY4079 est assez proche d'un point de vue de la densité optique, cependant la biomasse finale obtenue après 96h de culture est très différente : 18,26 g/L et 10,62 g/L pour JMY3776 et JMY4079, contre 15,24 g/L pour JMY2900 (Figure 5 et Tableau 8). La souche JMY3776 semble bien mieux croître dans le milieu Glol 9% que les autres souches.
Concernant la consommation de glycérol par les différentes souches dans les deux milieux testés, il est possible de constater que JMY2900 consomme plus rapidement le glycérol que JMY3776 et JMY4079 (Figure 5).
Le glycérol est totalement épuisé du milieu à 48h dans le cas des trois souches cultivées en milieu Glol 6%, et à 48 pour JMY2900 et à 72 h pour JMY3776 et JMY4079 en milieu Glol 9% (Figure 5). Cependant la croissance se poursuit plus ou moins fortement en fonction des souches après épuisement du glycérol. Il est fort possible que les métabolites sécrétés par les différentes souches, comme cela est expliqué ci-après, dans le milieu de culture, puissent être utilisés pour assurer la croissance de ces dernières après épuisement du glycérol (Figure 5).
Tableau 8 : Production d'acides gras, de biomasse, d'acide citrique et de mannitol par les souches JMY2900, JMY3776 et JMY4079 après 96 h de croissance en milieu Glol 6% et 9%. Milieu Glol 6% (96 h de croissance) Milieu Glol 9% (96 h de croissance)
Paramètres JMY2900 JMY3776 JMY4079 Paramètres JMY2900 JMY3776 JMY4079
X g/L 18,5 10,6 12,4 X g/L 1 ,24 18,26 10,62
Υχ/s g/g 0,308 0,176 0,206 Υχ/s g/g 0,17 0,20 0,12
L g/L 4,0 4,8 5,1 L g/L 2,9 7,7 4,0
YLX g/ 0,22 0,45 0,41 Yu g/g 0,19 0,42 0,38
YL/S g/g 0,07 0,080 0,085 YL/S g/g 0,03 0,086 0,044
CA g/L 0,26 0,06 0,05 CA g/L 0,1 0,1 0,1
YcA/X g/g 0,014 0,006 0,004 YcA/X g/g 0,01 0,004 0,01
YcA/S g/g 0,004 0,001 0,001 YcA g/g 0,002 0,001 0,001
Mnt g/L 3,2 2,7 2,9 Mnt g/L 7,5 2,0 2,8
YMU g/g 0,17 0,26 0,23 v g/g 0,49 0,1 1 0,27
Y M m/S g/g 0,053 0,046 0,048 ï Mnt/S g/g 0,083 0,022 0,032
Symboles: X, biomasse sèche ; L, lipides ; CA, acide citrique ; Mnt, mannitol ; Y¾s ou YL-S OU YCA/S OU YMnfs, rendement de biomasse/lipide/acide citrique/mannitol par rapport au substrat consommé ; Yux ou YCA/X OU Yunv , rendement de lipide/acide citrique/mannitol par rapport à la biomasse produite.
v) Cinétique de production d'acide citrique et de mannitol par les souches JMY2900, JMY3776 et JMY4079 durant la croissance en milieux Glol 6% ou Glol 9%
Que ce soit dans le milieu Glol 6% ou 9%, les productions d'acide citrique des souches sont relativement comparables. En effet les souches JMY3776 et JMY4079 produisent nettement plus de citrate que la souche JMY2900 (Figure 5). Dans les deux milieux, le pic de production, entre 12 et 17 g/L, coïncide avec l'épuisement du glycérol. Ceci indique que ces deux souches re-consomment le citrate une fois que tout le glycérol a été consommé. Ce citrate participe certainement à la croissance des souches entre 48 et 72 h en milieux Glol 6% et entre 72 et 96 h en milieux Glol 9%. A l'inverse, la souche sauvage ne produit que peu de citrate, et ce de manière temporaire (Figure 5). Par contre, JMY2900 semble plus prompt à produire du mannitol, avec une production de 1 1,4 g/L après 48 h de croissance en Glol 6% et de 14,8 g/L après 48 h de croissance en Glol 9% (Figure 5). A partir de 48 h, le milieu ne contenant plus de glycérol, la souche JMY2900 re~consomme le mannitol qu'elle a sécrétée dans le milieu de culture (Figure 5), ce qui lui permet sans doute de pouvoir poursuivre sa croissance après 48 h de culture. Après 96 h de croissance, les niveaux d'acide citrique et de mannitol sont relativement comparable d'une souche à l'autre, excepté pour le mannitol qui reste 3 fois plus concentrer (7,5 g/L contre 2 à 2,8 g/L) dans le milieu de culture Glol 9% de JMY2900 par rapport aux souches dérivées du mutant Aphdl (Tableau 8 et Figure 5).
vi) Production de lipides par les souches JMY2900, JMY3776 et JMY4079 durant la croissance en milieux Glol 6% ou Glol 9%
La production d'acide gras au cours des 96 h de culture a été analysée pour les trois souches dans les milieux Glol 6% et 9% (Figure 5). Il apparaît très clairement que les souches JMY3776 et J Y4079 produisent nettement plus d'acides gras que la souche JMY2900. Dans le milieu Glol 6%, l'accumulation maximale d'acides gras est atteinte à 72 h. Ces derniers représentent alors 40,5 et 45,5 % du poids sec des souches JMY4079 et 3776, respectivement, contre seulement 20,1% du poids sec de la souche JMY2900 (Figure 5). Dans le milieu Glol 9%, l'accumulation maximale d'acides gras est atteinte également après 72 h de culture. Cependant, le contenu en acide gras est réduit de 10 et 20% dans les souches JMY3776 et JMY4079 par rapport au milieu Glol 6% au même temps (Figure 5).
Il est également intéressant de constater que les différentes souches continuent d'accumuler des lipides après l'épuisement du glycérol, et cela dans les deux milieux de culture testés (Figure 5). Cependant cette accumulation est plus rapide dans les souches JMY3776 et JMY4079. De la même manière, entre 72 et 96 h, en milieu Glol 9%, alors que la source de carbone majoritaire dans le milieu est l'acide citrique, la souche JMY4079 continue d'accumuler fortement des lipides (Figure 5). Ceci implique que cette souche, dont la croissance s'est fortement ralentie, est capable de convertir une partie de l'acide citrique en acides gras. Il est fort probable que cela soit dû à la surexpression des gènes ACL1 etACL2.
Finalement, après 96 h de culture, le rendement de production de lipide atteint 4 et 2,9 g/L pour JMY2900, 4,8 et 7,7 g/L pour JMY3776 et 5,1 et 4 g/L pour JMY4079 dans les milieux Glol 6% et Glol 9% respectivement (Tableau 8). Ces rendements pourraient être largement améliorés dans le cas de cultures en Fed-batch en bioréacteur. Cela permettrait d'optimiser la croissance des souches JMY3776 et JMY4079, ainsi que d'optimiser la conversion du glycérol en acide gras tout en évitant la sécrétion d'acide citrique ou de mannitol dans le milieu de culture.
vii) Profile d'acides gras des souches JMY2900, JMY3776 et JMY4079 durant la croissance en milieux Glol 6% ou Glol 9%
L'analyse des profiles d'acides gras synthétisés par la souche JMY2900, révèle que la composition en acides gras ne varie pas d'un (ou très peu) d'un milieu à l'autre (cf. Tableau 9 ci-dessous). Le Cl 8: 1 (n-9) représente près de 55% des acides gras totaux. Les C16:0, C16 :l(n-7), C18:0 et C18:2(n-6) ne représentant environ que 11.5%, 5%, 9% et 9% des acides gras totaux. Dans le cas des souches JMY3776 et JMY4079, elles présentent un contenu en acides gras assez proche, mais variant de la souche JMY2900 et qui varie en fonction du milieu de culture. Ainsi, le Cl 8:1 (n-9), C16:0, C16 :l(n-7), C18:0 et C18:2(n-6) représentent environ 50%, 15 à 20%, 4 à 5%, 7 à 8% et 6,5% des acides gras totaux en Glol 6%. Cependant en Glol 9%, la proportion de C18:l(n-9) diminue à 45% au profit du C16:0, qui représente 25% des acides gras.
Tableau 9 : Profile d'acide gras (en % des acides gras totaux) des souches JMY2900, JMY3776 et JMY4079 après 96 h de croissance en milieu Glol 6% et Glol 9%.
Figure imgf000046_0001
Il est probable que la synthèse accrue de lipides dans les souches JMY3776 et JMY4079 entraîne une saturation de l'élongase, enzyme chargée d'allonger les acides gras, dont le C16:0 en Cl 8:0, mais aussi de la Delta9-désaturase, enzyme chargée de désaturer le C18:0 en C18: l (n-9). REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Souche mutante de levure, caractérisée en ce que l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase (EC 4,2.1.79) endogène de ladite souche est inhibée et qu'en outre l'expression ou l'activité des acyl-coenzyme A oxydases (EC 6.2.1.3), de la protéine multifonctionnelle de la beta- oxydation (EC 4.2.1.74), de la 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase (EC 2.3.1.16), d'une ou plusieurs protéines codées par un gène PEX impliqué dans le métabolisme des peroxysomes des levures, d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol (EC 3.1.1.3) et/ou de la glycérol 3-phosphate déshydrogénases (EC 1.1.99.5) endogènes de ladite souche est inhibée, et/ou un ou plusieurs des gènes endogènes codant une glycérol-3- phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (EC 1.1.1.18), une acétyl-CoA carboxylase (EC 6,4.1.2), une acyl-CoA:diacylglycéroî acyltransférases (EC 2.3.1.20), une ATP citrate lyase (EC 2.3.3.8), une enzyme m alique (EC 1.1.1.40), une acétyl-CoA synthétase (EC 6.2.1.1), une Delta(9)-désaturase (EC 1.14.19.1), une Delta(12)-désaturase (EC 1.14.19.6 ) et/ou une invertase (EC 3.2.1.26) sont surexprimés.
2. Souche mutante selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est une souche mutante de levure oléagineuse appartenant au genre Candida, Cryptoccocus, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporon ou Yarrowia.
3. Souche mutante selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle appartient au genre Yarrowia.
4. Souche mutante selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est une souche de Yarrowia lipolytica.
5. Souche mutante selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe constitué par :
une souche dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène de ladite souche est inhibée, et la β-oxydation des acides gras de ladite souche est également inhibée,
une souche dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène, d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène de ladite souche est inhibée,
une souche dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène, d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl- CoA:diacylglycérol acyltransférase endogène et une glycérol-3-phosphate déshydrogénase (NAD(+)) sont surexprimés,
une souche dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène, d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl- CoA:diacylglycérol acyltransférase, une glycérol-3 -phosphate déshydrogénase (NAD(+)) et une ATP citrate lyase sont surexprimés,
une souche dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène, d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes, de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène et d'une ou plusieurs peroxines endogènes de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase, une glycérol- 3 -phosphate déshydrogénase (NAD(+)) et une ATP citrate lyase sont surexprimés,
une souche dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène, d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl- CoA:diacylglycérol acyltransférase, une glycérol-3 -phosphate déshydrogénase (NAD(+)), une ATP citrate lyase et une acétyl-CoA synthétase sont surexprimés,
une souche dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène, d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl- CoA:diacylglycérol acyltransférase, une glycérol-3-phosphate déshydrogénase (NAD(+)), une ATP citrate lyase, une acétyl-CoA synthétase, une Delta(9)- et/ou une Delta(12)-désaturase sont surexprimés,
une souche dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène, d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl- CoA:diacylglycérol acyltransférase, une glycérol-3-phosphate déshydrogénase (NAD(+)), une ATP citrate lyase, une acétyl-CoA synthétase, une Delta(9)- et/ou une Delta(12)-désaturase, et une invertase sont surexprimés,
une souche dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène, d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl- CoA:diacylglycérol acyltransférase, une glycérol-3-phosphate déshydrogénase (NAD(+)), une ATP citrate lyase, une enzyme malique et une acétyl-CoA carboxylase sont surexprimés.
une souche dans laquelle l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène, d'une ou plusieurs lipases triacylglycérol endogènes et de la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation endogène de ladite souche est inhibée, et les gènes endogènes codant une acyl- CoA:diacylglycérol acyltransférase, une glycérol-3-phosphate déshydrogénase (NAD(+)), une ATP citrate lyase, une enzyme malique, une acétyl-CoA synthétase et une acétyl-CoA carboxylase sont surexprimés.
6. Procédé d'obtention d'une souche mutante de levure selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 à partir d'une souche de levure parente, caractérisée en ce qu'il comprend une étape de mutagenèse du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase dans ladite souche de levure parente et en outre une ou plusieurs étapes de mutagenèse dans ladite souche de levure parente conduisant à l'inhibition d'un ou plusieurs des gènes endogènes codant les acyl-coenzyme A oxydases (EC 6.2.1.3), la protéine multifonctionnelle de la beta- oxydation (EC 4.2.1.74), la 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase (EC 2.3.1.16), les protéines codée par les gènes PEX impliqués dans le métabolisme des peroxysomes des levures, les lipases triacylglycérol (EC 3.1.1.3) et/ou la glycérol 3-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.99.5), et/ou une étape de mutagenèse dans ladite souche de levure parente conduisant à la surexpression d'un ou plusieurs des gènes endogènes codant une glycérol-3-phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (EC 1.1.1.18), une acétyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.2), une acyî- CoA:diacylglycérol acyltransférases (EC 2,3.1 ,20), une ATP citrate lyase (EC 2.3.3.8), une enzyme malique (EC 1.1.1.40), une acétyl-CoA synthétase (EC 6.2.1.1), une Delta(9)- désaturase (EC 1.14.19.1), une Delta(12)-désaturase (EC 1.14.19.6 ) et/ou une invertase (EC 3.2.1.26).
7. Procédé pour augmenter la production de lipides et/ou d'acide citrique d'une souche de levure, caractérisé en ce que l'on inhibe dans ladite souche de levure l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en que l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase est obtenue par mutagenèse du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de délétion du gène codant pour la 2-méthylcitrate déshydratase.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9 pour augmenter la production de lipides, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'inhibition dans ladite souche de levure de l'expression d'un ou plusieurs des gènes endogènes codant les acyl-coenzyme A oxydases (EC 6.2.1.3), la protéine multifonctionnelle de la beta-oxydation (EC 4.2.1.74), la 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase (EC 2.3.1.16), les protéines codée par les gènes PEX impliqués dans le métabolisme des peroxysomes des levures, les lipases triacylglycéroî (EC 3.1.1.3) et/ou la gîycérol 3-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.99.5) et/ou la surexpression dans ladite souche de levure d'un ou plusieurs des gènes endogènes codant une glycérol-3 -phosphate déshydrogénase (NAD(+)) (EC 1.1.1.18), une acétyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.2), une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférases (EC 2.3.1.20), une ATP citrate lyase (EC 2.3.3.8), une enzyme malique (EC 1.1.1.40), une acétyl-CoA synthétase (EC 6.2.1.1), une Delta(9) -désaturas e (EC 1.14.19.1), une Delta(12)-désaturase (EC 1.14.19.6) et/ou une invertase (EC 3.2.1.26).
11. Utilisation d'une souche mutante de levure dont l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase (EC 4.2.1.79) endogène de ladite souche est inhibée ou d'une souche mutante de levure selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la production de lipides et/ou d'acide citrique.
12. Procédé de production de lipides et/ou d'acide citrique, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de culture d'une souche mutante de levure dont l'expression ou l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase (EC 4.2.1.79) endogène de ladite souche est inhibée ou d'une souche mutante de levure selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 sur un milieu approprié.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit milieu contient comme source de carbone du glucose et/ou du glycérol.
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