JP5278891B2 - 高度不飽和脂肪酸の生産蓄積性を有する形質転換微生物 - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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- Fats And Perfumes (AREA)
Description
上記の形質転換株の育種によって、これまでの野生酵母菌株には見られなかった高い脂質含量を持つサッカロミセス・セレビシェ菌株が得られた。しかし、それらの脂質を構成する脂肪酸は、パルミトオレイン酸、オレイン酸、パルミチン酸を主成分としたもので野生酵母菌株の持つ脂肪酸組成であった。培地中に脂肪酸を添加し、菌体内に取り込ませることによって菌体脂質含量を増大させた場合には、増大させた脂質の殆どは培地に添加した脂肪酸に依存した組成となっていた。
(1)IRA2遺伝子、PRE9遺伝子、SNF2遺伝子、SPT21遺伝子又はPHO90遺伝子、若しくはこれら遺伝子と相同性を有する遺伝子の一種以上が破壊または機能低下している微生物に、高度不飽和脂肪酸生成酵素遺伝子の少なくとも1種以上の遺伝子が導入されていることを特徴とする、形質転換微生物。
(2)導入される高度不飽和脂肪酸生成酵素遺伝子が、Δ6不飽和化酵素遺伝子、Δ5不飽和化酵素遺伝子、鎖長延長酵素遺伝子、及びこれら遺伝子と相同性を有する遺伝子から選ばれる少なくとも1種以上の遺伝子であることを特徴とする、請求項1に記載の形質転換微生物。
(3)さらに、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子、アシルCoAシンターゼ遺伝子、リン脂質:ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ遺伝子、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子、グリセロール3リン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子、及びステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子、並びにこれら遺伝子と相同性を有する遺伝子から選ばれた少なくとも1種以上の遺伝子が導入されていることを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載の形質転換微生物。
(4)導入遺伝子がベクターに挿入されていることを特徴とする、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の形質転換微生物。
(5)微生物がサッカロミセス・セレビシェに属する微生物であることを特徴とする、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の形質転換微生物。
(6)マーカー遺伝子を少なくとも含むことを特徴とする、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の形質転換微生物。
(7)マーカー遺伝子がLEU2遺伝子であることを特徴とする、上記(6)に記載の形質転換微生物。
(8)LEU2遺伝子と上記(1)〜(3)に記載の導入遺伝子が同一のプロモータにより発現制御されていることを特徴とする、上記(7)に記載の形質転換体。
(9)上記(1)〜(8)のいずれかに記載の形質転換微生物を培地に培養し、培養菌体から脂質を採取することを特徴とする、脂質の製造方法。
(10)培地が脂肪酸又は脂肪酸エステルを含有することを特徴とする、上記(9)に記載の製造方法。
(11)脂肪酸又は脂肪酸エステルが、高級不飽和脂肪酸生産代謝系に介在する脂肪酸であることを特徴とする、上記(10)に記載の製造方法。
(12)採取される脂質が、形質転換前の野生株には存在しない高度不飽和脂肪酸であることを特徴とする、上記(9)〜(11)に記載の脂質の製造方法。
当該株を使用することにより、野生株では生産し得ない高度不飽和脂肪酸を高度に含有する脂質を生産させることができる。また、元来2つ以上の不飽和結合を持つ脂肪酸を生産できないサッカロミセス・セレビシェのような生物に対し、高度不飽和脂肪酸生成酵素の形質転換を行い、かつ、原料脂肪酸の供給を伴う培養を行うことにより、代謝系の中の希望する任意の脂肪酸を生産することが可能となる。
本発明者は、上記脂質合成を抑制する遺伝子を破壊した変異株に、トリアシルグリセロール合成経路中の酵素遺伝子を前記の酵母に導入し、過剰発現させることにより脂質含量の向上に成功しており(特開2007−209240)、脂質合成を抑制する遺伝子を破壊した微生物に、上記高度不飽和脂肪酸生成酵素遺伝子に加え、このトリアシルグリセロール合成系酵素遺伝子を同時に導入することも好ましい結果を与える。
トリアシグリセロール合成系酵素遺伝子としては、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子、アシルCoA合成酵素遺伝子、リン脂質:ジアシルグリセロールトランスアシラーゼ遺伝子、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子、グリセロール3リン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子、ステロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子などの遺伝子が利用可能であり、これらのうちの1つあるいは2つ以上の遺伝子を組み合わせて発現させることによって、脂質生産性を向上させることができる。
本発明において導入する、高度不飽和脂肪酸生成酵素遺伝子及びトリアシルグリセロール合成系酵素遺伝子の由来となる生物は、宿主となる微生物と同一でもよいし、他の生物でもよく、特に制限はない。発現のしやすさや、酵素活性の強さなどを検討して、最適の酵素遺伝子を選択して使用すればよい。
また、上記高度不飽和脂肪酸生成酵素遺伝子及びトリアシルグリセロール合成系酵素遺伝子を複数導入した形質転換体を作成する際、これら酵素遺伝子が導入された株を選別するため、マーカーとなる遺伝子がそれぞれ異なった何種類かのベクターを用意し、ベクター毎にこれら酵素遺伝子をそれぞれ導入した組み換えベクターを調製して、これらベクターにより形質転換を行うこともできる。一方、1種類のベクター中に2つ以上の酵素遺伝子を組み込んで発現させてもよい。
これらのうち、LEU2遺伝子あるいはそれと相同性を有する他の生物の遺伝子をマーカーとするプラスミド等のベクターを少なくとも含むことが望ましい。LEU2遺伝子の導入は脂質生産を増大させる。したがって、LEU2遺伝子あるいはこれと相同性を有する遺伝子は、強力なプロモーターにより発現制御させることが好ましく、このためには、例えば、1種類の強力なプロモーター、ADH1プロモーター等により、LEU2遺伝子あるいはこれと相同性を有する遺伝子と高度不飽和脂肪酸生成酵素遺伝子あるいはさらにトリアシルグリセロール合成酵素系遺伝子を共発現させることが便利である。また、単にマーカー遺伝子としてのみ機能させる場合には、このような強力なプロモーターを用いずともよく、また、これら酵素遺伝子のプロモーターと別異のプロモーターを用いてもよいことは当然である。
本発明において高度不飽和脂肪酸を生産する場合、高度不飽和脂肪酸生産代謝系に介在する脂肪酸を酸又はエステルの形態で培地に添加して培養することも可能である。サッカロミセス・セレビシェのように元来2つ以上の不飽和結合を持つ脂肪酸を生産できない生物に対して高度不飽和脂肪酸生産能を付与するには、高度不飽和脂肪酸生産代謝系の多くの酵素を導入する必要があり、そのような生物に単純に高度不飽和脂肪酸生成酵素を導入することは現実的ではない。
以下に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
高度不飽和脂肪酸生産性及び脂質蓄積性の高い出芽酵母サッカロミセス・セレビシェ形質転換株の取得
(1)酵母サッカロミセス・セレビシェのSNF2遺伝子の変異株(BY4741Δsnf2株)(Mat a Leu2D0 his3D1 ura3D0 met15D0 SNF2::kanMX)(インビトロジェン社製)あるいは野生株(BY4741株)(Mat a Leu2D0 his3D1 ura3D0 met15D0) (インビトロジェン社製)を宿主として用い、これらの株にトリアシグリセロール合成系酵素遺伝子を組み込んだプラスミドで形質転換した。ベクターとして、pVT100-U(2μmを複製開始部位とするマルチコピーベクターで、インサート遺伝子の発現にグルコース培地で高発現のADH1プロモーターをもち、酵母での選択マーカーとしてURA3遺伝子を持ち、大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子をもつベクター)、pL1091-5 (pVT100-Uのマルチクローニングサイトを他の配列に置き換えたベクター)及びpL1177-2(pL1091-5と同様だが、選択マーカーとしてLEU2遺伝子を持つベクター)を用いた。それらの方法については、既に記載された方法(特開2007−209240)によった。
すなわち、酵母サッカロミセス・セレビシェのSNF2遺伝子の変異株(BY4741Δsnf2株)あるいは野生株(BY4741株)を、宿主として用い、これらの株をTG合成系の酵素の遺伝子を組み込んだプラスミドで形質転換した。トリアシグリセロールを合成する酵素は何種類か知られているが、最も主要な経路として知られているのは、ジアシルグリセロールとアシルCoAよりトリアシルグリセロールを合成する経路である(Sandager L., et al, J. Biol. Chem. 277, 6478-6482 (2002))。
得られたDGA1遺伝子は、SacI、XbaI(ニッポンジーン社製)により制限酵素処理を行って、両端がSacI切断による粘着性末端及びXbaI切断による粘着性末端を作成する。ベクターとして、pL1177-2を用い、これらも同様にSacI、XbaIで切断した。
ライゲーションしたベクターの大腸菌への形質転換は、大腸菌JM109株コンピテントセル(ニッポンジーン社製)を用いて行った。ライゲーション反応液をコンピテントセルに加え、氷中で20分間インキュベートした後、42℃45秒の熱ショックを加え、再び氷中で2分間静置した後、添付の培地に加えて、37℃、1時間培養した。培養後、アンピシリンを含むLB寒天培地にまいて、37℃で1晩培養後のアンピシリン耐性のコロニーの有無を確認した。アンピシリンを含む培地で生育したコロニーは、アンピシリン耐性遺伝子のあるベクターで形質転換した大腸菌と考えられる。
インサート遺伝子のはいったベクターで形質転換されていた大腸菌は、シングルコロニーにした後、アンピシリンを添加したLB培地中で37℃で一晩培養した。得られた大腸菌に含まれるベクターを、プラスミド抽出キット(QIAprep Spin Miniprep Kit, キアゲン社製)を用いて精製した。精製したベクターは、各種の制限酵素によって処理を行い、目的のインサート遺伝子が正しい方向に挿入されていることを確認した。
これにより、BY4741Δsnf2株及びBY4741野生株各々に、サッカロミセス・セレビシェのDGATであるyDGA1遺伝子を挿入された上記ベクター(pL1177-2/yDGA1)を形質転換した形質転換株を得た。
遺伝子としては、Oblongichytrium spp.SEK347のΔ5不飽和化酵素遺伝子であるtD5d(配列番号1)、ラットのΔ6不飽和化酵素遺伝子であるrD6d(AB021980)及びラットの鎖長延長酵素遺伝子であるrElo1(AB071985)を用いた。これらの遺伝子は、ラットのゲノムDNAを鋳型とし、表1のtD5d用、rD6d用又はrElo1用のプライマーを用いたPCRによって増幅して取得した。これらのプライマーは、既に決定されているゲノムDNA配列に基づいて、それぞれの遺伝子全長を増幅できるように設計した。また、rD6d-1及びrElo1-1はその末端に制限酵素HindIII認識部位を含み、tD5d-2, rElo1-2はその末端に制限酵素XbaI認識部位を含み、tD5d-1はその末端に制限酵素XhoI認識部位を、rD6d-2はSalI認識部位を含んでいる。
この時のPCRの増幅条件は、KOD plus polymerase (Toyobo社製)等の標準条件に準じて行った。反応液は、0.7%アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射して、予期したサイズの単一バンドが得れたことを確認した。増幅したrD6d及びrElo1は、PCR purification kit(キアゲン社製)により、プライマーなどを除いて、精製した。
インサート、ベクターともにPCR purification kitにより、制限酵素で切断された低分子のオリゴヌクレオチドを除いた後、ライゲーションによりインサート遺伝子をベクターに組み込んだ。ライゲーションは、ベクター:インサート比が1/1−1/10程度になるように混合し、Ligation Pack(ニッポンジーン社製)を用いて16℃で3時間−4.5時間反応させた。
ライゲーションしたベクターの大腸菌への形質転換は、大腸菌JM109株コンピテントセル(ニッポンジーン社製)を用いて行った。ライゲーション反応液をコンピテントセルに加え、氷中で20分間インキュベートした後、42℃45秒の熱ショックを加え、再び氷中で2分間静置した後、添付の培地に加えて、37℃、1時間培養した。培養後、アンピシリンを含むLB寒天培地にまいて、37℃で1晩培養後のアンピシリン耐性のコロニーの有無を確認した。アンピシリンを含む培地で生育したコロニーは、アンピシリン耐性遺伝子のあるベクターで形質転換した大腸菌と考えた。
インサート遺伝子のはいったベクターで形質転換されていた大腸菌は、シングルコロニーにした後、アンピシリンを添加したLB培地中で37℃で一晩培養した。得られた大腸菌に含まれるベクターを、プラスミド抽出キット(QIAprep Spin Miniprep Kit, キアゲン社製)を用いて精製した。精製したベクターは、各種の制限酵素によって処理を行い、目的のインサート遺伝子が正しい方向に挿入されていることを確認した。
その結果、得られた形質転換株を表2に示した。
デルタ6位不飽和化活性付与の脂質蓄積性の高い出芽酵母サッカロミセス・セレビシェ形質転換株による細胞外α−リノレン酸の取り込み蓄積及びステアリドン酸生産
形質転換株は、液体培地中で30℃、140rpmのロータリーシェーカーで培養した。培地は、通常のSD培地(20 g/L グルコース、6.7 g/L yeast nitrogen base w/o amino acids)に20 mg/Lヒスチジンと20 mg/Lメチオニンを加えたもの、または、更に20 mg/Lウラシルと60 mg/Lロイシンを加えたものを用い、2.5 g/L テルジトールNP-40及び1 g/L α−リノレン酸を添加した。α−リノレン酸は、エタノール溶液としてろ過滅菌したものを、培養開始直前に培地に添加した。培養は7日間行った。
培養後、菌体を遠心分離(3000rpm, 5分)によって沈降させ、105℃で3時間加熱して、その乾燥重量を測定した。さらに、乾燥させた菌体に、1 mL 10%塩酸メタノール、0.5 mLジクロロメタンを加えて、60℃で3時間反応させて脂肪酸メチルエステルを生成させた後、2 mL 飽和食塩水と1 mL ヘプタンを加えて振とう後、遠心して二層分配した。この時のヘプタン層にきた脂肪酸メチルエステルを、ガスクロマトグラフ(島津製 GC-2010, TC-70カラム)で、FIDを用いてガスクロマトグラフの滞留時間により各脂肪酸を同定し、FID面積値から内部標準を基に各脂肪酸量を算出した。内部標準としてheptadecanoic acidを用い、上記メチルエステル化の際に加えるジクロロメタンに約0.2 g/L程度の濃度となるよう精密秤量したものを溶存させ、すべての試料に内部標準脂肪酸として添加し、そのFID面積値を基準として用いた。
この実施例に示されたように、脂質合成を抑制する遺伝子の変異株にトリアシルグリセロール合成経路中の酵素遺伝子と同時に高度不飽和脂肪酸生成酵素遺伝子を導入した形質転換体を用いることにより、培地に添加した原料α−リノレン酸を細胞内に蓄積し、細胞内にステアドリン酸を生産蓄積することに成功した。
高度不飽和脂肪酸生産性及び脂質蓄積性の高い出芽酵母サッカロミセス・セレビシェ形質転換株による細胞外α−リノレン酸エステルの取り込み蓄積及びステアリドン酸生産
実施例1に示した形質転換株の内、トリアシグリセロール合成系酵素遺伝子とΔ6不飽和化酵素遺伝子の同時発現株をα−リノレン酸のエチルエステル及びメチルエステル添加下で培養を行った。培養条件等は、実施例2と同様であった。その結果を表4に示した。
高度不飽和脂肪酸生産性及び脂質蓄積性の高い出芽酵母サッカロミセス・セレビシェ形質転換株による細胞外ジホモ−γ−リノレン酸の取り込み蓄積及びアラキドン酸生産
実施例1に示した形質転換株の内、トリアシグリセロール合成系酵素遺伝子とΔ5不飽和化酵素遺伝子の同時発現株をジホモ−γ−リノレン酸添加下で培養を行った。培養条件等は、実施例2と同様であった。その結果を表5に示した。
鎖長延長化活性付与の脂質蓄積性の高い出芽酵母サッカロミセス・セレビシェ形質転換株による細胞外α−リノレン酸の取り込み蓄積及びイコサトリエン酸生産
実施例1に示した形質転換株の内、トリアシグリセロール合成系酵素遺伝子と鎖長延長酵素遺伝子の同時発現株をα−リノレン酸添加下で培養を行った。培養条件等は、実施例2と同様であった。その結果を表6に示した。
鎖長延長化活性付与の脂質蓄積性の高い出芽酵母サッカロミセス・セレビシェ形質転換株による細胞外イコサペンタエン酸の取り込み蓄積及びドコサペンタエン酸生産
実施例1に示した形質転換株の内、トリアシグリセロール合成系酵素遺伝子と鎖長延長酵素遺伝子の同時発現株をイコサペンタエン酸添加下で培養を行った。培養条件等は、実施例2と同様であった。その結果を表7に示した。
これら実施例2−6の結果を組み合わせることにより、例えば、脂質合成抑制遺伝子の変異株にトリアシルグリセロール合成経路酵素遺伝子とΔ6不飽和化酵素遺伝子と鎖長延長酵素遺伝子とΔ5不飽和化酵素遺伝子を同時に導入した形質転換体を用いることにより、培地に添加したα−リノレン酸を菌体内に蓄積させ、ステアリドン酸・イコサテトラエン酸を経て、イコサペンタエン酸の生産を行うことも可能であることが示唆され、更にはドコサペンタエン酸の生産が可能であることも示唆された。
Claims (5)
- SNF2遺伝子が破壊または機能低下しているサッカロミセス・セレビシェに属する微生物に、Δ6不飽和化酵素遺伝子、Δ5不飽和化酵素遺伝子、及び鎖長延長酵素遺伝子から選ばれる少なくとも1種以上の高度不飽和脂肪酸生成酵素遺伝子が導入され、かつDGA1遺伝子が導入されていることを特徴とする、形質転換されたサッカロミセス・セレビシェに属する微生物。
- 導入遺伝子がベクターに挿入されていることを特徴とする、請求項1に記載の形質転換微生物。
- LEU2遺伝子を少なくとも含むことを特徴とする、請求項1又は2に記載の形質転換微生物。
- LEU2遺伝子と請求項1に記載の導入遺伝子が同一のプロモータにより発現制御されていることを特徴とする、請求項3に記載の形質転換微生物。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の形質転換微生物を、α−リノレン酸、α−リノレン酸メチルエステル、α−リノレン酸エチルエステル、ジホモ−γ−リノレン酸、イコサペンタエン酸からなる群より選択される脂肪酸又は脂肪酸エステルを含む培地に培養し、培養菌体からステアリドン酸、アラキドン酸、イコサトリエン酸、ドコサペンタエン酸からなる群より選択される脂肪酸を含む脂質を採取することを特徴とする、脂質の製造方法。
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