WO2014178014A1 - Levures mutantes capables de produire un acide gras inhabituel - Google Patents

Levures mutantes capables de produire un acide gras inhabituel Download PDF

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WO2014178014A1
WO2014178014A1 PCT/IB2014/061116 IB2014061116W WO2014178014A1 WO 2014178014 A1 WO2014178014 A1 WO 2014178014A1 IB 2014061116 W IB2014061116 W IB 2014061116W WO 2014178014 A1 WO2014178014 A1 WO 2014178014A1
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strain
yeast
oleate
endogenous
expression
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Application number
PCT/IB2014/061116
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English (en)
Inventor
Jean-Marc Nicaud
Alain Marty
Athanasios Beopoulos
Jonathan VERBEKE
Florence BORDES
Marie GUICHARD
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Institut National De La Recherche Agronomique
Centre National De La Recherche Scientifique
Institut National Des Sciences Appliquees De Toulouse
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    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil

Definitions

  • the present invention relates to mutant yeasts capable of producing an unusual fatty acid by bioconversion or neosynthesis and the use of these yeasts for the production of this unusual fatty acid.
  • Industrial fatty acids come mainly from mineral oils or vegetable oils. These industrial fatty acids are intended for various applications, such as food, paints and varnishes, lubricants, waterproofing agents, plastics and polymers. They may be of very diverse structures, for example polyunsaturated fatty acids, with very short or very long chains, having hydroxyl or epoxy groups, or having one or more conjugated double or triple bonds.
  • the cost of obtaining industrial fatty acids from mineral oils is expensive because of the increasing cost of the raw material and the chemical treatment costs of these mineral oils.
  • Some plant species produce fatty acids with interesting properties in the industrial field but these species are generally wild, exotic and / or non-agronomic species.
  • microorganisms especially yeast strains
  • production of industrial fatty acids represents an alternative to the use of fossil and plant resources.
  • an unusual fatty acid is a fatty acid that is not naturally synthesized by it.
  • Ricinoleic acid (12-hydroxy-9-cis-octadecenoic acid, C18: 1-OH) is an omega-9-hydroxylated fatty acid, which is unusual in yeasts.
  • Ricinoleic Acid (RA) and its derivatives have several industrial applications, for example in food as additives, textiles as surfactants or pigment-wetting agents, paper as antifoam agents or waterproofing additives. , plastics for the manufacture of Nylon-1 1, plasticizers, tubes or films, perfumes and cosmetics as emulsifiers or deodorants, electronics for the manufacture of capacitor fluids, polyurethane or resins of polyamide, pharmaceuticals, paints, inks, adhesives and lubricants.
  • ricinoleic acid has been proposed as a component of biodiesel and as a lubricant additive to replace sulfur-based lubricant compounds in petroleum diesel.
  • Ricinoleic acid accounts for about 90% of the total fatty acids of castor beans (Ricinus communia) (Yamamoto et al., 2008).
  • the high ricinoleic acid content in castor oil combined with high oil content in castor beans and the multitude of ricinoleic acid applications, makes castor oil a high-value oilseed crop.
  • a major disadvantage to extensive castor culture is the high content in its seeds of ricin, an extremely toxic protein (Knight, 1979). The use of ricin has long raised public health concerns.
  • the genetic engineering strategy in these model species consists of a heterologous expression of castor oleate ( ⁇ 12) hydroxylase or Claviceps purpurea, encoded by the gene FAH12, Indeed, during the biosynthesis of ricinoleic acid, the oleic acid is hydroxylated by the Fahl2p enzyme in the sn-2 position of phosphatidylcholine mainly in the endoplasmic reticulum (Bafor et al., 1991). The hydroxylation takes place at the 12-position of the esterified oleic acid.
  • Oleate desaturases and oleate hydroxylases belong to the same family of membrane proteins and have a similar peptide sequence and function. They share the same oleic substrate and their reactions are very competitive (Broun et al., 1998). Oleate ( ⁇ 12) desaturase (FAD2) preferentially forms linoleic acid and oleate hydroxyase preferably forms oleic acid.
  • RcFAH12 and Ricinus communis acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase leads to an increase in the accumulation of hydroxylated fatty acids up to 30% of the total fatty acids in the seeds, but this represents an ever lower content than that found in castor seeds (Lu et al, 2006, Burgal et al, 2008). It is nevertheless necessary to overexpress at least one acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (DGA) in these plants.
  • DGA diacylglycerol acyltransferase
  • pombe yeasts which do not contain genes encoding oleate ( ⁇ 12) desaturases - the heterologous expression of C. purpurea oleate ( ⁇ 12) hydroxyase CpFAH12) leads to an accumulation of ricinoleic acid at 8% and 53% of total fatty acids (Mavraganis et al., 2010, Holic et al, 2012).
  • Pacyl-CoA diacylglycerol acyltransferase of C. purpurea (CpDGAT2)
  • RcFAH12 the ricinoleic acid content increases slightly up to 10% of total fatty acids.
  • Vernolic acid (12,13-epoxy-9-cis-octadecenoic acid, 3 ⁇ 4 ⁇ 32 0 3 ) is an epoxidized omega-9 fatty acid, which is also unusual in yeasts. Vernolic acid has several industrial applications, for example in glues, paints, plastics, inks, textiles and the pharmaceutical industry. Vernolic acid represents at least 60% of the total fatty acids of the seeds of Vernonia galamensis and Euphorbia lagascae.
  • Some oleaginous microorganisms are capable of converting substrates, such as fats, sugars or glycerol, into lipids, especially triglycerides and fatty acids. These oleaginous microorganisms have the capacity to accumulate significant amounts of lipids, at least 20% of their dry matter.
  • yeasts there are a few oleaginous species, so-called unconventional, among which we can mention those belonging to the genera Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon or Yarrowia (see for reviews Beopoulos et al, 2009, Papanikolaou et al. , 201 and 201 lbs).
  • Yarrowia lipofytica is a hemiascomycete yeast. It is considered as a model of bioconversion for the production of proteins, enzymes and lipid derivatives (see for review Nicaud, 2012). It is naturally present in polluted environments of oil and in particular in the heavy fractions. Y. lipofytica is one of the most studied oleaginous yeasts because of its ability to accumulate lipids up to more than 50% of its dry matter according to a defined culture profile, or even more than 80% of its material.
  • Y. lipofytica is also able to accumulate more than 90% of neutral lipids, in the form of triacylglycerols (TAG).
  • TAG triacylglycerols
  • lipofytica can be efficiently cultured on a wide variety of hydrophobic compounds (free fatty acids, triacylglycerols, n-alkanes, etc.) as the sole source of carbon and energy, through the expression of multigene families encoding enzymes. key involved in the decomposition of these compounds (eg, acyl-CoA oxidases, lipases) (Papanikolaou et al., 2001, Beopoulos et al, 2009a, Papanikolaou et al, 2010, 201 1a and 201 lb). The synthesis of lipids in Y.
  • lipofytica is carried out either by the de novo biosynthesis of fatty acids via the production of fatty acid precursors such as acetyl-CoA and raalonyl-CoA and their integration in the pathway of lipid biosynthesis (Kennedy's pathway), either by the ex novo accumulation, via the incorporation of the pre-existing fatty acids in the fermentation medium or deriving from the hydrolysis of the oils, fats, triglycerides and methyl esters of the culture medium and their accumulation inside the cell.
  • the main pathways of de novo lipid biosynthesis in Y. lipolytica and Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae, so-called non-oleaginous yeast) are well preserved.
  • the genes involved in the metabolism of fatty acids in yeasts, in particular in Y. lipolytica are described in Beopoulos et al (2009) and International Application WO 2010/004141.
  • ⁇ -oxidation is a pathway of fatty acid degradation that occurs only in peroxisomes. This pathway allows the formation of acetyl-CoA from even-chain fatty acids and propionyl-CoA from odd-chain fatty acids.
  • the ⁇ -oxidation comprises four successive reactions during which the carbon chain of the acyl-CoA is reduced by two carbon atoms. Once the reaction has been performed, the reduced acyl-CoA of two carbons can return to the spiral of ⁇ -oxidation (Lynen's helix) and undergo a further reduction of two carbons.
  • acyl-CoA decarboxylation cycles may be interrupted depending on the nature of the acyl-CoA, the availability of substrate, the presence of coenzyme A, acetyl-CoA or the NAD + / NADH ratio.
  • TAG triacylglycerol fatty acids
  • the active form of acyl-CoA formed is oxidized by a molecule of Flavin Adenine Dinucleotide (F AD) to form a trans-A 2 -enoyl-CoA molecule by means of an acyl-CoA oxidase (AOX).
  • F AD Flavin Adenine Dinucleotide
  • ⁇ -oxidation in Y, lipolytica has been widely described (Wang et al, 1999b, Mlickova et al 2004).
  • the trans-A 2 -enoyl-CoA is then hydrated with 2-enoyl-CoA hydratase.
  • the formed 3-hydroxyacyl CoA molecule is oxidized by NAD + to form a 3-ketoacyl-CoA molecule.
  • lipolytica in which the beta-oxidation of fatty acids is invalidated due to the deletion of the 6 endogenous POX genes have been described by Beopoulos et al (2008) and in International Application WO 2012/001144. strains mutants show an increase in lipid accumulation relative to the parent strains.
  • Y. lipolytica is currently used for the industrial processing of ricinoleic acid into ⁇ -decalactone, an aromatic compound with fruity and oily notes that can be found naturally in fruit and fermented foods (Schrader et al. , 2004).
  • the ⁇ -oxidation pathway responsible for the degradation of lipid reserves, was abolished by the deletion of the 6 POX genes coding for the 6 endogenous Acyl-CoA oxidases (AOX1 to AOX6).
  • the accessibility of the oleic substrate in the form of phospholipids for an enzyme was facilitated by the invalidation of the 3 genes encoding endogenous triacylglycerol acyltransferases (DGA1, DGA2, LRO1), in order to prevent the storage of oleic acid in the form of TAG.
  • DGA1, DGA2, LRO1 endogenous triacylglycerol acyltransferases
  • lipolytica matrix containing the poxl-6 ⁇ , d ⁇ gA, dga2A, lrolAfad2 genetic modifications is named JMY2159. It is incapable of degrading oleic acid, storing it in the form of triglycerides and converting it by desaturation to linoleic acid.
  • JMY2159 matrix strain From this JMY2159 matrix strain, the inventors then obtained genetically modified Y. lipolytica yeast mutant strains possessing a considerable capacity for lipid accumulation and capable of synthesizing ricinoleic acid up to more than 7% of their concentration. dry matter.
  • This rate of ricinoleic acid production of strain JMY2556 can be further increased by increasing the copy number of the CpFAH12 and YlLRO1 genes, or by inhibiting the expression of the endogenous 2-methylcitrate dehydratase of the strain and / or overexpressing a gene.
  • acylglycerol acyltransferase monoacylglycerol acyltransferase, patatin-like triacylglycerol lipase, at least one of the two subunits of PATP citrate lyase, diacylglycerol: choline-O phosphotransferase, ethanolamine phosphotransferase, phospholipase A 2 , an acyl-CoA: lysophosphatidylcholine acyltransferase, a cytochrome-b 5 reductase, inositol / phosphatidyl inositol phosphatase and elongase.
  • genetically modified Y. lipolytica yeast mutant strains capable of synthesizing ricinoleic acid are also capable of secreting it.
  • This property of these mutant strains has an advantage for the production of ricinoleic acid in large quantities (it is not necessary to lyse the cells to obtain ricinoleic acid).
  • Yarrowia lipolytica can also be done in other oleaginous yeasts. These mutant oleaginous yeast strains can be used as alternatives to ricinoleic acid production by castor, as they are easy to grow, irrespective of season and climate.
  • the subject of the present invention is therefore a process for obtaining a mutant strain of oleaginous yeast useful as a yeast matrix strain for obtaining other mutant strains of oleaginous yeast comprising:
  • Steps (a) to (d) of the method according to the present invention can be implemented in any order, simultaneously or sequentially.
  • step (a) above the inhibition of beta-oxidation of fatty acids defined in step (a) above is obtained by:
  • Oleaginous yeast strains are well known to those skilled in the art. They have the ability to accumulate significant amounts of lipids, at least 20% of their dry matter (Ratledge, 1994). They generally belong to the genus Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium (e.g., Rhodosporidium toruloides), Rhodotorula (e.g., Rhodotura tinota), Trichosporon or Yorrowia.
  • Lipomyces starkeyi see Joint Genome institute (JGI) and Rhodosporidium toruloides, see Kumar et al (2012) and Zhu et al. (2012).
  • JGI Joint Genome institute
  • Rhodosporidium toruloides see Kumar et al (2012) and Zhu et al. (2012).
  • a more particularly preferred strain in the sense of the present invention is a Yarrowia yeast strain, more preferably Yarrowia lipolytica.
  • yeast strain is meant a yeast strain from which other genetic modifications can be made in said strain.
  • Inhibition of the expression or activity of an enzyme defined in the present invention may be total or partial. It can be obtained in various ways by methods known in themselves to those skilled in the art.
  • this inhibition can be obtained by mutagenesis of the gene encoding said enzyme.
  • Mutagenesis of the gene coding for said enzyme may occur at the level of the coding sequence or sequences for regulating the expression of this gene, in particular at the level of the promoter, leading to an inhibition of the transcription or translation of said enzyme.
  • Mutagenesis of the gene encoding said enzyme can be performed by genetic engineering. For example, it is possible to delete all or part of said gene and / or to insert an exogenous sequence. Methods for deleting (deleting) or inserting a given genetic sequence into yeast, particularly Y. polytica, are well known to those skilled in the art (see for review Barth and Gaillardin, 1996, Madzak et al, 2004).
  • POP IN / POP OUT which has been used in yeasts, particularly in Y, lipolytica, for the deletion of the LEU2, URA3 and XPR2 genes (Barth and Gaillardin, 1996). It is also possible to use the SEP method (Maftahi et al., 1996) which has been adapted from Y. lipolytica for the deletion of FOX genes (Wang et al., 1999b).
  • SEP / Cre method developed by Fickers et al (2003) and described in International Application WO 2006/064131.
  • An advantageous method according to the present invention consists in replacing the coding sequence of the gene coding for said enzyme with an expression cassette containing the sequence of a gene coding for a selection marker. It is also possible to introduce one or more point mutations in the gene coding for said enzyme, having the consequence of shifting the reading frame and / or of introducing a stop codon into the sequence and / or of inhibiting the transcription or translation of the gene encoding said enzyme.
  • Mutagenesis of the gene coding for said enzyme can also be carried out using physical agents (for example radiation) or chemical agents. This mutagenesis also makes it possible to introduce one or more point mutations in the gene coding for said enzyme.
  • the mutated gene coding for said enzyme may be identified, for example, by PCR using primers specific for said gene.
  • selection markers for the complementation of an auxotrophy also commonly referred to as auxotrophy markers, are well known to those skilled in the art.
  • the selection marker URA3 is well known to those skilled in the art. More specifically, a yeast strain including the URA3 gene (sequence available in Genolevures databases (http://genolevures.org) under the name YALI0E26741g or UniProt under access number Q12724), encoding orotidine- S'-phosphate decarboxylase, is inactivated (eg by deletion), will not be able to grow on a medium not supplemented with uracil.
  • the integration of the selection marker URA3 in this yeast strain will then restore the growth of this strain on a medium lacking uracil.
  • the selection marker LEU2 described in particular in US Pat. No. 4,937,189 is also well known to those skilled in the art. More specifically, a yeast strain whose LEU2 gene (YALI0C00407g), encoding ⁇ -isopropylmalate dehydrogenase, is inactivated (for example by deletion), will not be able to grow on a medium not supplemented with leucine. As previously, the integration of the selection marker LEU2 in this yeast strain will then restore the growth of this strain on a medium not supplemented with leucine.
  • the ADE2 selection marker is also well known to those skilled in the field of yeast transformation.
  • said mutant yeast strain is auxotrophic for leucine (Leu " ) and optionally for Porotidine-5 '-phosphate decarboxylase (Ura " ).
  • 3 POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 and POX6 genes encode 6 isoforms of acyl-coenzymeA oxidases (AOX, EC 6.2.1.3) involved, at least partially, in the ⁇ -oxidation of fatty acids. Inhibition, partial or total, of the expression or the activity of these isoenzymes leads to the accumulation by yeasts of dodecanedioic acid, without consumption of the accumulated lipids. More particularly, the coding sequence of the POX1-6 genes and the peptide sequence of AOX1-6 of Y. lipolytica CLIB122 are available in Genolevures databases (http://genolevures.org/) or GenBank under access numbers.
  • POX1 I AOX1 YALI0E32835g / YALI0E32835p
  • POX2I AOX2 YAL10F10857g / YAL10F10857p
  • POX3! AOX3 YALI0D24750g / YALI0D24750p
  • POX4 / AOX4 YALI0E27654g / YALI0E27654p
  • POX5 I AOX5 YALIOC23859g / YALI0C23859p
  • lipolytica acyl-CoA oxidases have 45% identity or 50% similarity with those of other yeasts.
  • the degree of identity between the acyl-CoA oxidases varies from 55 to 70% (or 65 to 76% similarity) (International Application WO 2006/064131).
  • a method of inhibiting the expression of Endogenous AOX in a strain of Y. lipolytica has been described in International Applications WO 2006/064131, WO 2010/004141 and WO 2012/001144,
  • the multifunctional enzyme has three domains: two domains with 3-hydroxyacyi-CoA dehydrogenase activity (EC 4.2.1.74, domains A and B) and a domain with enoyl-CoA hydratase activity (EC 4.2. 1.17, domain C).
  • This enzyme is encoded by the gene MFE1 ("Multifunctional enzyme type 1"). More particularly, the coding sequence of the MFE1 gene and the peptide sequence of Y. lipolytica CLIB122 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and enoyl-CoA hydratase are available in Genolevures or GenBank databases under the access number or the name. next: YALIOE 15378g / YALI0E15378p. A method of inhibiting the expression of said endogenous multifunctional enzyme in a strain of Y, lipolytica has been described by Haddouche et al. (201 1).
  • 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase (E.C. 2.3.1.16) is encoded by the gene POT1 ("Peroxisomal Oxoacyl Thiolase 1"). More particularly, the coding sequence of the POT1 gene and the peptide sequence of the 3-oxoacyl-CoA thiolase of Y. lipolytica CLIB122 are available in the Genolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALIO 18568g / YALIO 18568p. A method of inhibiting the expression of endogenous 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase in a Y. lipolytica strain has been described by Berninger et al. (1993).
  • acyl-CoA diacylglycerol acyltransferases
  • DGA1 and DGA2 are encoded by two genes: DGA1 and DGA2 (Beopoulos et al, 2009 and 2012, International Application WO 2012/001144). More particularly, the coding sequence of the DGA1 gene and the peptide sequence of the acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferases 1 of Y. lipolytica CLIB122 are available in the Genolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0E32769g / YALI0E32769p. The coding sequence of the DGA2 gene and the peptide sequence of the acyl-CoA: diacylglyceryl acyltransferases 2 of Y.
  • lipolytica CLIB122 are available in the Génolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0D07986g / YALI0D07986p.
  • Rhodoturula glutanis an acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase has been described by Rani et al. (2013).
  • a method of inhibiting the expression of one or both endogenous DGATs (DGAT1 and / or DGAT2) in a Y. lipolytica strain has been described by Beopoulos et al (2012).
  • yeasts naturally have a gene encoding an oleate ( ⁇ 12) desaturase (EC 1.14.19.6) which is encoded by the FAD2 gene.
  • Y. lipolytica possesses this gene whereas S. this evisiae (which is not considered as an oleaginous yeast) does not possess it (Ratledge, 2004, Beopoulos et al, 2008).
  • the coding sequence of the FAD2 gene and the peptide sequence of the oleate ( ⁇ 12) desaturase of Y. lipolytica CLIB122 are available in the Genolevures or GenBank databases under the access number or the following name: YALIOB10153g / YALI0B10153p . If the yeast strain does not possess a gene encoding an oleate ( ⁇ 12) desaturase, then step (c) of the method according to the present invention will not be implemented.
  • phospholipid: diacylglycerol acyltransferase (PDAT, E.C. 2.3.1.158) is encoded by the LRO1 gene (Beopoulos et al, 2009 and 2012; International Application WO 2012/001144). More particularly, the coding sequence of the LRO1 gene and the peptide sequence of the phospholipid: diacylglycerol acyltransferase of Y. lipolytica CLIB122 are available in the Genolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0E16797g / YALI0E16797p. A method of inhibiting endogenous PDAT in a Y. lipolytica strain has been described by Beopoulos et al (2012).
  • the present invention also relates to a process for obtaining a mutant strain of oleaginous yeast capable of synthesizing an unusual omega-9 fatty acid, comprising the steps (a) to (c) defined above, optionally the step (d) defined above, and furthermore the expression in said strain of a heterologous enzyme having oleate hydroxylase activity (EC 1.14.99.33) or oleate epoxidase (EC 1.14.99.- Lee et al, 1998) .
  • these mutant strains of oleaginous yeast capable of synthesizing an unusual omega-9 fatty acid are also capable of secreting said unusual omega-9 fatty acid.
  • heterologous enzyme an enzyme that does not naturally possess oleaginous yeasts. It can be an enzyme from any prokaryotic or eukaryotic organism.
  • Enzymes exhibiting oleate hydroxylase or oleate epoxidase activity are known to those skilled in the art.
  • the use of a particular enzyme having a hydroxylase or epoxidase activity is dependent on the unusual omega-9 fatty acid that one of ordinary skill in the art wishes to produce in the mutant strain of oleaginous yeast.
  • the unusual omega-9 fatty acid is ricinoleic acid and said method comprises the expression in said strain of a heterologous enzyme having an oleate ( ⁇ 12) hydroxylase activity, such as a oleate ( ⁇ 12) hydroxylase (FAH12) or a mutated oleate ( ⁇ 12) desaturase (FAD2) to exhibit oleate ( ⁇ 12) hydroxylase activity, preferably an oleate ( ⁇ 12) hydroxylase.
  • a heterologous enzyme having an oleate ( ⁇ 12) hydroxylase activity such as a oleate ( ⁇ 12) hydroxylase (FAH12) or a mutated oleate ( ⁇ 12) desaturase (FAD2) to exhibit oleate ( ⁇ 12) hydroxylase activity, preferably an oleate ( ⁇ 12) hydroxylase.
  • said oleate ( ⁇ 12) hydroxylase is the oleate ( ⁇ 12) hydroxylase of Ricinus communis (RcFAH12) or comes from a fungus of the division of ascomycetes, preferably from the family of Clavicipitaceae, more preferably of the genus Claviceps and most preferably of the species Claviceps purpurea (CpFAH12).
  • the peptide sequence of the enzyme RcFAH12 is available in the GenBank database under accession number GI: 187940238.
  • a nucleotide sequence encoding RcFAH12 optimized for its expression in yeast is represented by the sequence SEQ ID NO: 21.
  • the peptide sequence of the CpFAH12 enzyme is available in the GenBank database under accession number GI: 194271137.
  • a nucleotide sequence encoding CpFAH12 optimized for its expression in yeast is represented by the sequence SEQ ID NO: 22.
  • the mutated oleate ( ⁇ 12) desaturase with oleate ( ⁇ 12) hydroxylase activity can be obtained by domain exchange of the oleate ( ⁇ 12) desaturase by one or more domains of an oleate ( ⁇ 12) hydroxylase conferring the hydroxylase activity ( H2 and / or H3 domains), and / or by mutagenesis (eg, substitution) of one or more amino acids of the oleate ( ⁇ 12) desaturase by one or more amino acids of an oleate ( ⁇ 12) desaturase conferring an activity hydroxylase.
  • mutated oleate desaturases with oleate hydroxylase activity have been described by Broun et al (1998) and Broadwater et al. (2002).
  • the mutated oleate ( ⁇ 12) desaturase comes from a fungus of the family Clavicipitaceae, more preferably from the genus Claviceps and more preferably from the species Claviceps purpurea (CpFAD2, Meesapyodsuk et al., 2007) or comes from a yeast of the family of hemiascomycetes, preferably of the genus Yarrowia and more preferably of the species Yarrowia lipolytica (Y1FAD2: YALI0B10153g / YALI0B101539).
  • C. purpurea the amino acid sequence of oleate desaturase (CpFAD2) has 86% identity with the amino acid sequence of oleate hydroxylase (CpFAH12). The difference in function between the desaturase and the hydroxylase of C. purpurea is therefore contained in the amino acids corresponding to the 14% of divergent sequences between these two enzymes.
  • Mutated CpFAD2 (chimeric proteins) with oleate activity ( ⁇ 12) hydroxylase are represented as SEQ ID NO: 49, 50 and 51, preferably SEQ ID NO: 51,
  • the overexpression of an enzyme (endogenous, orthologous, heterologous) defined in the present invention in a mutant yeast strain according to the present invention can be obtained in various ways by methods known per se.
  • Overexpression of an enzyme defined in the present invention may be effected by placing one or more (preferably two or three) copies of the open reading phase of the sequence encoding said enzyme under the control of appropriate regulatory sequences.
  • Said regulatory sequences comprise promoter sequences placed upstream (5 ') of the open reading phase of the sequence encoding said enzyme, and terminator sequences placed downstream (3') of the open reading phase of the sequence encoding said enzyme.
  • Promoter sequences that can be used in yeast are well known to those skilled in the art and can correspond in particular to inducible or constitutive promoters.
  • promoters that can be used in the process according to the present invention, mention may be made in particular of the promoter of a Y. lipolytica gene which is strongly repressed by glucose and which is inducible by fatty acids or triglycerides.
  • the promoter of the FBA1 gene coding for fructose-bisphosphate aldolase (Application US 2005/0130280), the promoter of the GPM gene coding for phosphoglycerate mutase (International Application WO 2006/0019297), the promoter of the YAT1 gene encoding the transporter of ammonium (US 2006/0094102), the GPAT gene promoter encoding glycerol-3-phosphate O-acyltransferase (US Application 2006/0057690), the TEF gene promoter (Muller et al., 1998; US Application 2001/6265185). ), the hybrid promoter hp4d (International Application WO 96/41889) or the hybrid promoters XPR2 described in Mazdak et al. (2000).
  • Terminator sequences that can be used in yeast are also well known to those skilled in the art. Examples of terminator sequences that may be used in the process according to the invention include the terminator sequence of the PGK1 gene and the terminator sequence of the LIP2 gene described in International Application WO 01/83773.
  • the nucleotide sequence of the coding sequences of the heterologous genes can be optimized for its expression in yeast by methods well known to those skilled in the art (see for review Hedfalk, 2012). Overexpression of an endogenous enzyme can be achieved by replacing sequences controlling the expression of said endogenous enzyme with regulatory sequences allowing for stronger expression, such as those described above. Those skilled in the art can thus replace the copy of the gene encoding an endogenous enzyme in the genome, as well as its own regulatory sequences, by transforming the mutant yeast strain with a linear polynucleotide comprising the open reading phase of the sequence encoding said endogenous enzyme under the control of regulatory sequences such as those described above.
  • said polynucleotide is flanked by sequences that are homologous to sequences located on either side of the gene encoding said endogenous chromosomal enzyme.
  • Selection markers may be inserted between the sequences ensuring the recombination in order to allow, after transformation, to isolate the cells where the integration of the fragment has occurred by highlighting the corresponding markers.
  • the promoter and terminator sequences used belong to genes different from that encoding the endogenous enzyme to be overexpressed, so as to minimize the risks of unwanted recombination in the genome of the yeast strain.
  • the overexpression of an endogenous enzyme can also be obtained by introducing into the yeast strain according to the invention supernumerary copies of the gene coding for said endogenous enzyme under the control of regulatory sequences such as those described above.
  • Said additional copies encoding said endogenous enzyme may be carried by an episomal vector, i.e. capable of replicating in yeast.
  • these additional copies are carried by an integrative vector, i.e. integrating at a given location in the yeast genome (Mazdak et al, 2004).
  • the polynucleotide comprising the gene encoding said endogenous enzyme under the control of regulatory regions is integrated by targeted integration.
  • Targeted integration of a gene into the yeast genome is a molecular biology technique well known to those skilled in the art; a DNA fragment is cloned into an integrative vector, introduced into the cell to be transformed, which DNA fragment then integrates by homologous recombination into a targeted region of the recipient genome (Orr-Weaver et al, 1981).
  • Yeast transformation methods are also well known to those skilled in the art and are described, in particular, by Ito et al (1983), Klebe et al. (1983) and Gysler et al (1990). Selection markers may also be inserted between the sequences ensuring the recombination in order to allow, after transformation, to isolate the cells where the integration of the fragment has occurred by highlighting the corresponding markers. Said additional copies may also be carried by PCR fragments whose ends are homologous to a given yeast locus, thus allowing the integration of said copies into the yeast genome by homologous recombination.
  • Said additional copies may also be carried by autocloning vectors or PCR fragments whose ends have a zeta region absent from the yeast genome, thus allowing integration of said copies into the yeast genome by random insertion as described. in US Application 2012/0034652.
  • Any known gene transfer method of the prior art can be used to introduce into a yeast strain a disabling cassette of a gene or introduce a gene encoding an enzyme.
  • the process for obtaining a mutant strain of oleaginous yeast capable of synthesizing ricinoleic acid according to the present invention further comprises the overexpression in said yeast strain of an enzyme capable of catalyze the formation of triacylglycerol (TAG) from the 1, 2-j * R-diacylglycerol.
  • TAG triacylglycerol
  • This enzyme capable of catalyzing the formation of triacylglycerol (TAG) from 1,2-iH-diacylglycerol can be an acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (DGAT, EC 2.3.1.20) or a phospholipid: diacylglycerol acyltransferase (PDAT, EC 2.3 .1.158).
  • This enzyme may be endogenous to said yeast strain.
  • this enzyme is a PDAT, more preferably the endogenous PDAT of said yeast strain.
  • PDAT allows the transfer of ricinoleic acid from phospholipid to diacylglycerol.
  • a monoacylglycerol acyltransferase advantageously a yeast monoacylglycerol acyltransferase, advantageously also endogenous monoacylglycerol acyltransferase of said strain (this process for obtaining a mutant strain of oleaginous yeast and the strain obtained by this method being particularly advantageous) and / or
  • a patatin-like triacylglycerol lipase advantageously a patatin-like triacylglycerol lipase of yeast, advantageously still the endogenous patatin-like triacylglycerol lipase of said strain and / or the inhibition of the expression or the activity of the endogenous 2-methylcitrate dehydratase of said strain (this process for obtaining a mutant strain of oleaginous yeast and the strain obtained by this method being particularly advantageous) and or
  • a diacylglycerol choline-0 phosphotransferase
  • a diacylglycerol yeast choline-O phosphotransferase
  • diacylglycerol endogenous choline-O phosphotransferase of said strain
  • an ethanolamine phosphotransferase advantageously a yeast ethanoamine phosphotransferase, advantageously also endogenous ethanolamine phosphotransferase of said strain and / or
  • a phospholipase A 2 advantageously a yeast phospholipase A 2 , advantageously also endogenous phospholipase A 2 of said strain and / or
  • an acyl-CoA lysophosphatidylcholine acyltransferase
  • a yeast acyl-CoA lysophosphatidylcholine acyltransferase
  • an endogenous acyl-CoA lysophosphatidylcholine acyltransferase of said strain and / or
  • cytochrome-bs reductase advantageously of an endogenous cytochrome-b 5 reductase of said strain (this process for obtaining a mutant strain of oleaginous yeast and the strain obtained by this method being particularly advantageous) and / or the overexpression of an inositol / phosphatidyl inositol phosphatase, advantageously endogenous inositol / phosphatidyl inositol phosphatase of said strain and / or
  • the enzymes overexpressed in said yeast strain may be from any prokaryotic or eukaryotic organism.
  • the coding sequence of the genes encoding these enzymes can be optimized for its expression in yeast by methods well known to those skilled in the art (see for review Hedfalk, 2012).
  • at least one of the overexpressed enzymes is endogenous to said strain, preferably all the overexpressed enzymes are endogenous to said strain.
  • monoacylglycerol acyltransferase In yeasts, monoacylglycerol acyltransferase (MAGT; 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase, EC 2.3.1.51) is encoded by the SLC1 gene (Beopoulos et al, 2009 and 2012; International Application WO 2012/001 144 ). More particularly, the coding sequence of the SLC1 gene and the peptide sequence of the Y. lipolytica CLIB122 monoacylglycerol acyltransferase are available in the Genolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0E18964g / YALI0E18964p.
  • patatin-like triacylglycerol lipase (TGL5, triacylglycerol lipase, E.C. 3.1.1.3) is encoded by the TGL5 gene (Beopoulos et al, 2009 and 2012). More particularly, the coding sequence of the TGL5 gene and the peptide sequence of the patatin-like triacylglycerol lipase of Y. lipolytica CLIB122 are available in Génolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0D16379g / YALI0D16379p.
  • 2-methyl citrate dehydratase (EC 4.2.1.79) is a mitochondrial protein that catalyzes the conversion of 2-methylcitrate to 2-methyl-cis aconitate in the 2-methyl citrate cycle of propionate metabolism (Uchiyama et al. al, 1982, Tabuchi et al, 1981). It is encoded by the PHD1 gene. More particularly, the coding sequence of the PHD1 gene and the peptide sequence of Y. lipolytica CLIB122 methylhydrate dehydratase are available in the Génolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0F02497g / YALI0F02497p.
  • citrate lyase In yeasts, citrate lyase (E.C. 2.3.3.8) consists of two subunits encoded by two genes (ACL1 and ACL2, respectively) (Beopoulos et al, 2009). ATP citrate lyase from certain oleaginous yeasts has been characterized by Boulton et al (1981). More particularly, the coding sequence of the ACL1 and ACL2 genes and the peptide sequence of Y. lipolytica CLIB122 citrate lyase subunits A and B are available in Genolevures or GenBank databases under access numbers or names. following: ACL1! sub-unit A: YALI0E34793g / YALI0E347939p, and ACL2! subunit B: YALI0D2443 lg / YALI0D2443 lp.
  • diacylglycerol choline-O phosphotransferase (EC 2.7.8.2) is encoded by the CPT1 gene. More particularly, the coding sequence of the CPT1 gene and the peptide sequence of diacylglycerol: choline-O phosphotransferase of Y. lipolytica CLIB122 are available in Genolevures or GenBank databases under the access number or the following name: YALI0E26565g / YALI0E26565p.
  • EPT1 ethanolamine phosphotransferase
  • EPT1 E.C. 2.7.8.1
  • the coding sequence of the EPT1 gene and the peptide sequence of Y. lipolytica CL11B122 ethanolamine phosphotransferase are available in the Genolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALIOC 10989g / YALIOC 10989p.
  • phospholipase A 2 (PLA2, EC 3.1.1.3, 3.1.1.13, 3.1.1.4 and 2.3.1.51) is encoded by the LPA1 gene. More particularly, the coding sequence of the LPA1 gene and the peptide sequence of Y. lipolytica CLIB122 phospholipase A 2 are available in the Génolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALIOF1001Og / YALIOF1001Op.
  • acyl-CoA lysophosphatidyl choline acyltransferases (LPCAT) (EC 2.3.1.51, 2.3.1.23, 2.3.1.-) are coded by 3 genes, LCA1, LCA2 and LCA3, respectively. coding of the LCA1, LCA2 and LCA3 genes and the peptide sequence of Y.
  • LPCAT lysophosphatidyl choline acyltransferases
  • lipolytica CLIB122 acyl-CoA lysophosphatidylcholine acyltransferases 1, 2 and 3 are available in the Genolevures or GenBank databases under the following access numbers or names: LCA1: YALI0F19514g / YALI0F19514p; LCA2: YALI0C20625g / YAL1OC20625p and LCA3: YALIOC14036g / YAL1OC14036p.
  • cytochrome-bs reductases In yeasts, cytochrome-bs reductases (E.C. 1.6.2.2) are encoded by two genes, MCR1 and CBRI respectively (Sickmann et al., 2003, Dujon et al., 2004). More particularly, the coding sequence of the MCR1 and CBRI genes and the peptide sequence of Y. lipolytica CLIB122 cytochrome-b5 reductases are available in the Genolevures or GenBank databases under the following accession numbers or names: MCR1: YALI0D11330g / YALI0D1 1330p and CBRI: YALI0D04983g / YALIOD04983p.
  • inositol / phosphatidylinositol phosphatase (E.C. 3.1.3.-) is encoded by the SAC1 gene (Whitters et al, 1993). More particularly, the coding sequence of the SAC1 gene and the peptide sequence of the inositol / phosphatidyl inositol phosphatase of Y. lipolytica CLIB122 are available in the Genolevures or GenBank databases under the accession number or the following name: YALI0D05995g / YALI0D05995p .
  • elongases In yeasts, elongases (EC 2.3.1.199) are encoded by two genes, ELO1 and EL02, respectively. More particularly, the coding sequence of the ELO1 and EL02 genes and the peptide sequence of the elongases A and B respectively of Y. lipolytica.
  • CLIB 122 are available in Genolevures or GenBank databases under the following access numbers or names: ELOl; YALIOF06754g, and EL02: YAL1B20196g.
  • the unusual omega-9 fatty acid is vernolic acid and said The method comprises expressing in said strain a heterologous enzyme having oleate ( ⁇ 12) epoxidase activity.
  • ⁇ oleate ( ⁇ 12) epoxidase is that of Crepis a ⁇ pina, Crupis Palaestina or Vernonia ga ⁇ amensis (Lee et al, 1998).
  • the present invention also relates to:
  • mutant strain of oleaginous yeast useful as a yeast matrix strain for obtaining other oleaginous yeast mutant strains obtainable by a method according to the present invention defined above and
  • a mutant strain of oleaginous yeast capable of synthesizing an unusual omega-9 fatty acid, preferably capable of producing ricinoleic acid or vernolic acid, more preferably ricinoleic acid, obtainable by a method according to the present invention defined above.
  • mutant strains of oleaginous yeast useful as strains of yeast matrices for obtaining other mutant strains of oleaginous yeast, those of genotype:
  • mutant strains of oleaginous yeast capable of synthesizing ricinoleic acid include those of genotype:
  • these mutant strains of oleaginous yeast capable of synthesizing an unusual omega-9 fatty acid, such as ricinoleic acid or vernolic acid, are also capable of secreting said unusual omega-9 fatty acid.
  • the present invention also relates to the use of a mutant strain of oleaginous yeast capable of synthesizing an unusual omega-9 fatty acid according to the present invention as defined above for the production of an omega-9 fatty acid.
  • Said omega-9 fatty acid is preferably ricinoleic acid or vernolic acid, more preferably ricinoleic acid.
  • the present invention also relates to a method for producing omega-9 fatty acid, comprising a step of culturing on a suitable medium of a mutant strain of oleaginous yeast capable of synthesizing an unusual omega-9 fatty acid according to the present invention.
  • Said omega-9 fatty acid is preferably ricinoleic acid or vernolic acid, more preferably ricinoleic acid.
  • Said process for producing omega-9 fatty acid comprises a first step of culturing said mutant oleaginous yeast strain according to the present invention in a suitable medium and a second step of harvesting the omega-9 fatty acids produced by the omega-9 fatty acid culture. 'Step 1.
  • Said appropriate medium may comprise different carbonaceous sources for growth such as for example glucose, sucrose or glycerol. Complex sources of supply of this carbon substrate can also be used such as molasses. It may also include vegetable oils or oleic acid as a bioconversion substrate.
  • Said appropriate medium may be a rich medium based on yeast extract, tryptone or peptone (for example yeast extract 5g / L-glucose 50g / L), or a conventional minimum medium as described by Mlickova et al. (2004) or optimized for said yeast (International Application WO 2007/144445, Emond et al, 2010) comprising trace elements, iron and vitamins as well as orthophosphoric acid and ammonia or any other source of nitrogen known to those skilled in the art.
  • Oleaginous yeast culture can be carried out as a fermentor.
  • Figure 1 Table describing plasmids and E. coli strains coli and
  • Y. lipolytica used to obtain mutant strains of Y. lipolytica according to the present invention.
  • Figure 2 Schematic representation of the construction of mutant strains of Y. lipolytica according to the present invention and their genotype.
  • Figure 3 Primer pairs used for cloning genes of interest.
  • FIG. 4 Fatty acid composition (percentages with respect to total fatty acids) of mutant yeast (A) strains expressing R. communis oleate hydroxylase (RcFAH12) or C. purpurea (CpFAH12) in different genetic backgrounds and ( B) co-expressing RcFAH12 or CpHAH12 and R. communis oleate desaturase (RcDGAT2), C. purpurea (CpDGAT2) or Y. lipolytica (Y1LRO1) in different genetic backgrounds.
  • RcFAH12 R. communis oleate hydroxylase
  • CpFAH12 C. purpurea
  • Y1LRO1 Y. lipolytica
  • Figure 5 Evolution of the amount (in g / L of culture) of ricinoleic acid produced during fermentation by strain JMY3030.
  • the extracellular quantity of ricinoleic acid is shown in black.
  • the intracellular amount of ricinoleic acid is represented in gray.
  • the label above gives the extracellular ricinoleic acid%.
  • Figure 6 Sequence of primers used for cloning genes involved in the lipid metabolism of Y. lipolytica.
  • the sense primers (for) contain a BamHI site
  • the anti-sense primers (rev) contain an April site. Introduced sites are underlined.
  • BamH1 internal sites in the ACL2 gene were removed by base modification (in bold) at the BamHI site.
  • BamHI, BamHI, and VllII sites are underlined.
  • Figure 7 Diagram of the strategy adopted for the amplification of the ACL2 gene of Y. Upolytica while eliminating the two BamHI restriction sites.
  • Figure 8 Schematic representation of the construction of mutant strains of Y. Upolytica from strain JMY2853 (A) and JMY3431 (B) according to the present invention and their genotype.
  • Figure 9 (A) Y. Upolytica yeast mutant strains obtained from strain JMY2853 (Ura-, Leu-) by overexpression or deletion of a target gene. The results of the genetic modifications on the production of ricinoleic acid are represented in percentage compared to the strain JMY2556. The strain JMY2556 (Ura +, Leu-) was used as a control because it has the same auxotrophies as the strains constructed. (B) Y. Upolytica yeast mutant strains obtained from strain JMY3431 (Ura-, Leu-) by overexpression of a target gene. The results of the genetic modifications on ricinoleic acid production are represented as a percentage with respect to strain JMY3030. * +: overexpression; -: deletion.
  • Figure 10 Comparison of the amount (in ⁇ g / ml of culture) of ricinoleic acid produced in the neosynthesis by the strains derived from the strain (A) JMY2556 and by the strains derived from the strain (B) JMY3431 (JMY3030).
  • Figure 11 (A) Schematic representation of different chimeric proteins between a desaturase (in gray) and a hydroxylase (in black). (B) Lipid composition of different strains after 96h of vial culture containing 5% glucose (YED 5 ) for the mutant strains of yeast QPF-CpFAH12, QPF-H2_hyd, QPF-H2 / H3_hyd and QPF-H2 / H3 Jiyd Cterm .
  • the mutant strains of Y. Upolytica are derived from the auxotrophic strain of
  • Upolytica Pold (Leu " Ura " CLIB 139, genotype MatA Ura3 ⁇ 302, Leu2-270, xpr2-322), itself derived from the wild strain of Y.
  • Upolytica W29 (genotype MatA, ATCC 20460) by genetic modification. The Pold and W29 strains have been described by Barth and Gaillardin (1996). The strains used to obtain the strains according to the present The invention is shown in the table of Figure 1. Their construction is shown in Figure 2 and described in detail below.
  • the medium and culture conditions of lipofytica were described by Barth and Gaillardin (1996). Rich medium (YPD), minium + glucose medium (YNB) and minimum medium + casamino acids (YNBcasa) or uracil (YNBura) were prepared as described by Mlickova et al. (2004).
  • the minimum medium (YNB) contains 0.17% (w / v) yeast nitrogen base (without amino acid and ammonium sulfate, YNBww, Difco, Paris, France), 0.5% (w / v) of NH 4 Ci, 0.1% (w / v) yeast extract (Bacto-DB) and 50 mM phosphate buffer (pH 6.8).
  • the glucose medium for the neosynthesis of ricinoleic acid (YED 5 ) contains 1% (w / v) yeast extract (Bacto-DB) and 5% (w / v) glucose.
  • Escherichia coli strain Machl-T1 (Invitrogen) was used for transformation and amplification of recombinant plasmid DNA.
  • Cells were cultured on LB medium (Sambrook et al., 1989). Kanamycin (40 ⁇ g / mL) was used for plasmid selection.
  • the lipofytica by transformation by the lithium acetate method.
  • the Ura + and Leu + transformants were selected on YNBcasa and YNBura media, respectively.
  • the corresponding ylA12-ver1 and ylA12-ver2 primers were used to verify gene disruption by PCR amplification of genomic loci. Excision of the markers was performed using the Cre-lox recombinase system by transformation with the pUB4-CreI replicative plasmid (JME547) as described by Fickers et al. (2003). The strains were then cured from the plasmid by successive replications on rich medium.
  • the genes of interest were placed under the control of the constituent constitutive promoter TEF.
  • Yarrowia llpolytica (Muller et al, 1998).
  • the codons of the heterologous genes encoding hydroxylase and acyltransferase were optimized for yeast expression and synthesized by Genscript (New Jersey, USA).
  • the coding genes were then inserted between the BamHI-AvrII restriction sites of the JMP62-derived expression vector containing the pTEF promoter and the URA3ex selection marker (JME1046) described by Nicaud et al. (2002).
  • the JMP62 vectors containing the LEU2ex selection marker were obtained by replacing the marker using the Iscel restriction site upstream / downstream of URA3ex in the JME802 vector (Fickers et al, 2003, Nicaud et al, 2002). . Plasmids were digested with NotI prior to transformation. Transformants were selected by auxotrophy on the appropriate minimal medium.
  • Lipids of the equivalent of 10 OD units of cells in lyophilized culture were extracted by the procedure described by Folch et al (1957) for TLC analysis (thin layer chromato graphy) or were directly converted to their methyl esters. for GC analysis, as described by Browse et al. (1986).
  • GC analysis of the fatty acid methyl esters (FAMEs) was performed on a gas chromatograph (Varian 3900) equipped with a flame ionization detector and a Varian FactorFour vf-23ms column, with a specification washing at 260 ° C of 3pA (30m, 0.25mm, 0.25 ⁇ m).
  • the fatty acids (FA) were identified by comparison with the commercial standard fatty acid methyl esters (FAME32, Supelco, methyl ricinoleate, Sigma) and quantified by the internal standard method with the addition of 50 g of Cl 7: 0 commercial (Sigma).
  • the analysis of the culture supernatants was carried out as follows: a volume of culture is mixed with one volume of isopropanol, centrifuged (1 minute 13,000 rpm) and filtered through 0.2 ⁇ . Twenty microliters of the mixture are injected in HPLC with 254 nm UV detection on a Cl 8 reverse phase column (Luna® 5 ⁇ Cl 8 (2) 100 ⁇ , LC Column 151 ⁇ 4.6 mm, Ea) at 40 ° C. with as quenched a methanol / water / trifluoroacetic acid mixture 90/10 / 0.3 at 1 ml / min.
  • Pre-coated TLC plates (G60 silica, 20 x 20 cm, 0.25 mm thick) from Merck (Germany) were used.
  • the lipid classes were separated with hexane / ethyl ether / acetic acid solvent, 80/20/1 (v / v / v).
  • the plates were sprayed with 1% sulfuric vanillin in ethanol and incubated at 105 ° C for 10 min.
  • the different lipid classes were identified using commercial standards (Nu-shek, USA).
  • RcFAH12 and CpFAH12 were optimized for their expression in yeast (SEQ ID NO: 21 and 22 respectively).
  • the Y. lipolytica gene encoding endogenous ⁇ 12 desaturase was deleted before the heterologous expression of oleate hydroxylases. This deletion was carried out both in the Pold strain and the strain JMY1233 (poxl-6). The resulting mutants, designated JMY1366 and JMY1762 respectively, were unable to synthesize linoleic acid.
  • the JMY2159 strain containing deletions invalidating ⁇ -oxidation (poxl-6A), the synthesis of TAGs (dgalA dgalA Irol) and ⁇ 12 desaturation (fad2A) is named PQF for simplification.
  • the deleted mutant strain of TAG acyltransferases expressing RcFAH12 contains 7% ricinoleic acid, which suggests that the absence of enzymatic activity in the above constructs is due largely to the unavailability of the substrate (oleic acid esterified in TAG).
  • the homologous construct expressing CpFAH12 contained up to 29% ricinoleic acid ( Figure 4A).
  • strain PQF-CpFAH12 JMY2324) and 1.5: 1 for strain PQF-CpFAH12x2 (JMY2511).
  • the fraction of unsaturated C18 fatty acids oleic acid, linoleic acid and ricinoleic acid
  • fad2A ⁇ RcF ⁇ H12 strain JMY1760
  • poxl-6Afad2A-RcFAH12 strain JMY1763
  • All strains derived from PQF accumulated lipids at about 5% dry weight.
  • the level of ricinoleic acid synthesis is related to the accumulation capacity of the yeast strains, it has been independently expressed, under the control of the pTEF promoter, the ricinoleic acid-specific acyltransferase DGAT2.
  • R. communis R. communis
  • C. pur pur ae CpDGAT2
  • the coding sequences of RcDGAT2 and CpDGAT2 were optimized for their expression in yeast (SEQ ID NO: 23 and 24 respectively).
  • the strain CpFAH12 overexpressing the native LRO1 acyltransferase of Y, lipolytica (JMY2556 [Ura +, Leu-] or JMY2853 [Ura-, Leu-], the number of the strain varying according auxotrophies) has accumulated ricinoleic acid up to 42% of its total lipids, with a fraction representing 20% of the total ricinoleic acid, esterified to TAG. This corresponds to a 1, 4-fold increase in ricinoleic acid accumulation relative to the parental strain (JMY2511). The accumulation of lipids reached 13% of the dry weight of the cells, corresponding to an increase of 2.5 times compared to the strains not expressing LROl.
  • the amount of ricinoleic acid produced reached 700 ⁇ / ⁇ . (or 63mg / g dry weight).
  • the oleate hydroxylase is capable of continuing the hydroxylation reaction following the formation of linoleic acid (22%), but with a hydroxylation ratio on the desaturation of raising to 2: 1.
  • strain JMY2853 served as a matrix yeast strain for multicopy overexpression of the genes coding for the CpFAH12 and Y1L 01 enzymes.
  • a strain comprising 3 copies of CpFAH12 and 2 copies of the YlLRO1 acyltransferase was obtained (strain JMY3030). It produces up to 53% of ricinoleic acid in neosynthesis on a glucose medium.
  • Strain JMY3030 (containing 3 copies of CpFAH12 and 2 copies of YlLRO1) was used as a 10 L fermenter (4 L liquid volume).
  • the culture conditions are perfectly controlled (regulation of pH, temperature and aeration).
  • the quantity of biomass and thus of producing cells is then improved, which makes it possible to increase the production of ricinoleic acid.
  • the fermentation was conducted in fed-batch mode, with glucose as a carbon source for growth and oleic acid as a bioconversion substrate.
  • the culture was carried out on the minimum medium optimized for Yarrowia lipo ⁇ ytica (synthetic), with addition of trace elements, iron and vitamins, as described in International Application WO 2007/144445, with 160 g / L of glucose and 24 mg of glucose. g / L of oleic acid in total and a pH adjusted to 6 with orthophosphoric acid and ammonia.
  • the culture was inoculated to a biomass concentration of 0.48 g / L and the average growth rate was 0.19 h "1.
  • the cell concentration reached 90 g C dw / L.
  • Four controlled additions of oleic acid were made, firstly by adding 20% (v / v) oleic acid emulsion and then non-emulsified oleic acid (80% pure).
  • the final concentration of ricinoleic acid produced is 12 g / L, with a purity of 60% on the total lipids.
  • the insertion of the genes of interest into the JMP62-Ura3ex-pTEF vector is made by amplifying the genes with the primers described in FIG. 6 in which the BamHI and Avril restriction enzyme sequences at the 5 'ends have been introduced. and 3 'respectively. Plasmids and PC products are digested with enzymes and ligated to obtain the expression vectors.
  • the expression vectors were verified by sequencing.
  • Phospholipase A2 (YALIOF1001Og), TGL5 (YALIOD 16379g), LCAT3 (YALI0C14036g) and LR02 (YALI0E08206g) were made from synthetic genes directly synthesized and cloned (Euro fins).
  • the genes capable of increasing the neosynthesis of ricinoleic acid identified have been the subject of new strains constructs from the JMY3431 matrix strain.
  • the insertion of the genes of interest into the JMP62-Ura3ex-pTEF vector is made by amplifying the genes with the primers described in FIG. 6 in which the BamHI and Avril restriction enzyme sequences at the 5 'ends have been introduced. and 3 'respectively. Plasmids and PCR products are digested with enzymes and ligated to obtain the expression vectors.
  • EXAMPLE V EVOLUTION OF OLEATATASE DEATURASE OF F. LIPOLYTICA IN OLATEATE H YDROX YL A SE
  • hydroxylases and desaturases are homologous enzymes that belong to the same protein family and share a strong similarity, both in their sequence and in their function: both modify oleic acid (either by creating a desaturation or creating a hydroxylation).
  • C. purpurea P hydroxylase and Y. lipolytica desaturase from two different organisms share only 47% identical amino acids. It was therefore chosen to work initially with C. purpurea desaturase which has 86% amino acids identical to those of its hydroxylase. Thus, the difference in function between the desaturase and the hydroxylase of this fungus is contained in the 14% of divergent sequences between these two enzymes.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse utile comme souche de levure matrice pour l'obtention d'autres souches mutantes de levure oléagineuse qui sont capables de produire un acide gras inhabituel. La présente invention concerne également les souches mutantes de levure obtenues par ce procédé.

Description

LEVURES MUTANTES CAPABLES DE PRODUIRE
UN ACIDE GRAS INHABITUEL
La présente invention concerne des levures mutantes capables de produire un acide gras inhabituel par bioconversion ou par néosynthèse et l'utilisation de ces levures pour la production de cet acide gras inhabituel.
Les acides gras industriels proviennent principalement des huiles minérales ou des huiles végétales. Ces acides gras industriels sont destinés à différentes applications, comme l'alimentation, les peintures et vernis, les lubrifiants, les imperméabilisants, les plastiques et les polymères. Ils peuvent être de structures très diverses, par exemple acides gras polyinsaturés, à chaînes très courtes ou très longues, possédant des groupes hydroxyles ou époxy, ou possédant une ou plusieurs double ou triple liaisons conjuguées. Le coût d'obtention d'acides gras industriels à partir d'huiles minérales est onéreux en raison du coût de plus en plus élevé de la matière première et des coûts de traitement chimique de ces huiles minérales. Certaines espèces végétales produisent des acides gras aux propriétés intéressantes dans le domaine industriel mais ces espèces sont généralement des espèces sauvages, exotiques et/ou non-agronomiques.
L'utilisation de micro-organismes, en particulier de souches de levure, pour la production d'acides gras industriels représente une alternative à l'utilisation des ressources fossiles et végétales.
Chez une levure, un acide gras inhabituel est un acide gras qui n'est pas naturellement synthétisé par celle-ci.
L'acide ricinoléique (acide 12-hydroxy-9-cis-octadécénoïque ; C18:l-OH) est un acide gras oméga-9 hydroxylé, qui est inhabituel chez les levures. L'acide ricinoléique (AR) et ses dérivés trouvent plusieurs applications industrielles, par exemple dans l'alimentation en tant qu'additifs, le textile en tant que tensioactifs ou agents mouillant de pigments, le papier en tant qu'agents antimousse ou additifs imperméabilisants, le plastique pour la fabrication du Nylon-1 1, des plastifiants, des tubes ou des films, les parfums et cosmétiques en tant qu'émulsifiants ou déodorants, l'électronique pour la fabrication des fluides de condensateurs, du polyuréthane ou des résines de polyamide, les produits pharmaceutiques, les peintures, les encres, les adhésifs et les lubrifiants. Plus récemment, l'acide ricinoléique a été proposé en tant que composant du biodiésel et comme additif lubrifiant pour remplacer des composés lubrifiants à base de soufre dans le diesel de pétrole. L'acide ricinoléique représente environ 90% des acides gras totaux des graines de ricin (Ricinus communia) (Yamamoto et ai. , 2008). La forte teneur en acide ricinoléique dans l'huile de ricin, associée à une teneur élevée en huile dans les graines de ricin et à la multitude d'applications de l'acide ricinoléique, font du ricin une culture oléagineuse à forte valeur économique. Cependant, un inconvénient majeur à la culture extensive du ricin est la teneur élevée dans ses graines de la ricine, une protéine extrêmement toxique (Knight, 1979). L'utilisation de la ricine a longtemps soulevé des préoccupations de santé publique. En raison de législations sur la santé, la plupart de l'approvisionnement des pays occidentaux en acide ricinoléique repose sur l'importation de l'huile de ricin provenant de pays en développement, dans lesquels l'instabilité économique entraîne souvent des fluctuations de l'offre, de la qualité et du prix de l'huile (Chan et al, 2010).
Il n'existe pas de nombreuses sources alternatives au ricin pour produire de l'acide ricinoléique. La seule espèce connue pour produire des quantités significatives d'acide ricinoléique est Claviceps purpurea - l'ergot de seigle - qui accumule dans ses sclérotes de l'acide ricinoléique jusqu'à hauteur de 23% de ses lipides totaux (Meesapyodsuk et al, 2008). A titre de comparaison, le coton, le soja et les espèces de Lesquerella produisent de l'acide ricinoléique à hauteur de 0,27%, 0,03%> et 0,3% de leurs lipides totaux, respectivement (Yamamoto et al. , 2008).
La quantité limitée de sources naturelles d'acide ricinoléique a conduit les chimistes à développer des procédés pour la préparation d'hydroxy- acides gras à partir d'huiles végétales commerciales (Dahlke B et al, 1995). Parallèlement, des efforts considérables d'ingénierie génétique ont été réalisés pour produire de l'acide ricinoléique dans les graines de la plante modèle Arabidopsis thaliana et chez les levures modèles Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe. Cependant, ces levures ne sont pas des levures oléagineuses, c'est à dire qu'elles ne possèdent pas la capacité d'accumuler des quantités importantes de lipides. La stratégie d'ingénierie génétique dans ces espèces modèles consiste en une expression hétérologue de l'oléate (Δ12) hydroxylase de ricin ou de Claviceps purpurea, codée par le gène FAH12, En effet, au cours de la biosynthèse de l'acide ricinoléique, l'acide oléique est hydroxylé par l'enzyme Fahl2p en position sn-2 de la phosphatidylcholine principalement, dans le réticulum endoplasmique (Bafor et al, 1991) L'hydroxylation s'effectue à la position 12 de l'acide oléique estérifié.
Les oléate désaturases et les oléate hydroxylases appartiennent à la même famille de protéines membranaires et possèdent une séquence peptidique et une fonction similaires. Elles partagent le même substrat oléique et leurs réactions sont très compétitives (Broun et al. , 1998). L'oléate (Δ12) désaturase (FAD2) forme préférentiellement de l'acide linoléique et l'oléate hydroxyîase forme préférentiellement de l'acide oléique.
Pour la production d'acide ricinoléique chez A. thaliana, il a donc été proposé de déléter le gène codant l'oléate (Δ12) désaturase avant l'expression de l'oléate (Δ12) hydroxyîase. Cependant, l'expression transgénique de l'oléate (Δ12) hydroxyîase de Ricinus communis (RcFAH12) conduit à l'accumulation d'acide ricinoléique et d'autres acides gras hydroxylés à hauteur seulement de 15-20% des acides gras totaux dans les graines d'A. thaliana (Broun et Somerville, 1997 ; Smith et al, 2003). La co-expression transgénique de RcFAH12 et de l'acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase de Ricinus communis (RcDGAT2) conduit à une augmentation de l'accumulation d'acides gras hydroxylés jusqu'à 30% des acides gras totaux dans les graines, mais cela représente une teneur toujours plus faible celle que l'on trouve dans les graines de ricin (Lu et al, 2006 ; Burgal et al, 2008). Il est néanmoins nécessaire de surexprimer au moins une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase (DGA) dans ces plantes à? A. thaliana génétiquement modifiées pour augmenter la production d'acide ricinoléique. Pour la production d'acide ricinoléique chez les levures S. cerevisiae et S. pombe - qui ne contiennent pas de gènes codant pour des oléate (Δ12) désaturases - l'expression hétérologue de l'oléate (Δ12) hydroxyîase de C. purpurea (CpFAH12) conduit à une accumulation d'acide ricinoléique à hauteur respectivement de 8% et 53% des acides gras totaux (Mavraganis et al, 2010. ; Holic et al , 2012). Chez S. cerevisiae, lorsque Pacyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase de C. purpurea (CpDGAT2) est co-exprimée avec RcFAH12, la teneur en acide ricinoléique augmente faiblement jusqu'à 10% des acides gras totaux (Mavraganis et al , 2010). Néanmoins, les lipides totaux dans ces levures représentent seulement environ 5% du poids sec des cellules (CDW). Ces levures mutantes ne peuvent donc pas être considérées comme des solutions alternatives à la production d'acide ricinoléique. Il est à noter qu'il n'est pas nécessaire d'inhiber la bêta- oxydation des acides gras de ces levures S. cerevisiae et S pombe génétiquement modifiées pour que celles-ci produisent de l'acide ricinoléique. Ces résultats montrent que l'expression transgénique d'une oléate (Δ12) hydroxyîase seule ou en combinaison avec une acyltransférase spécifique de l'acide ricinoléique (DGAT2) chez A. thaliana et les levures ne suffit pas à produire de l'acide ricinoléique à une teneur élevée comme l'on trouve dans l'huile de ricin.
Il existe donc un besoin d'obtenir des organismes mutants capables d'accumuler des quantités d'acide ricinoléique comparables à celles que l'on trouve chez le ricin. L'acide vernolique (acide 12,13-époxy-9-cis-octadécénoïque ; ¾Η3203) est un acide gras oméga-9 époxydé, qui est également inhabituel chez les levures. L'acide vernolique trouve plusieurs applications industrielles, par exemple dans les colles, les peintures, les plastiques, les encres, le textile et l'industrie pharmaceutique. L'acide vernolique représente au moins 60% des acides gras totaux des graines de Vernonia galamensis et d'Euphorbia lagascae.
Certains microorganismes oléagineux sont capables de convertir des substrats, tels que des matières grasses, des sucres ou du glycérol, en lipides, notamment en triglycérides et acides gras. Ces microorganismes oléagineux possèdent la capacité d'accumuler des quantités importantes de lipides, à hauteur d'au moins 20% de leur matière sèche. Chez les levures, on trouve quelques espèces oléagineuses, dites non-conventionnelles, parmi lesquelles on peut citer celles appartenant aux genres Candida, Cryptoccocus, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia (voir pour revues Beopoulos et al, 2009 ; Papanikolaou et al, 201 la et 201 lb).
Yarrowia lipofytica est une levure hémiascomycète. Elle est considérée comme un modèle de bioconversion pour la production des protéines, des enzymes et de dérivés lipidiques (voir pour revue Nicaud, 2012). Elle est naturellement présente dans des environnements pollués de pétrole et notamment dans les fractions lourdes. Y. lipofytica est l'une des levures oléagineuses les plus étudiées en raison non seulement de sa capacité à accumuler des lipides à hauteur de plus de 50% de sa matière sèche selon un profil de culture défini, voire plus de 80% de sa matière sèche lorsque des modifications génétiques appropriées sont effectuées, mais aussi de sa capacité unique à accumuler de l'acide linoléique à des niveaux élevés (plus de 50% des acides gras produits dans certaines conditions de culture) ainsi que des lipides à haute valeur ajoutée, tels que l'acide stéarique, de l'acide palmitique et de l'acide oléique (Papanikolaou et al., 2001 ; Beopoulos et al. 2008 ;Papanikolaou et al., 2010 ; Dulermo et Nicaud 2011). Y. lipofytica est aussi capable d'accumuler plus de 90% de lipides neutres, sous forme de triacylglycérols (TAG). Y. lipofytica peut être efficacement cultivée sur une grande variété de composés hydrophobes (acides gras libres, triacylglycérols, n-alcanes, etc.) comme seule source de carbone et d'énergie, grâce à l'expression de familles multigéniques codant pour des enzymes clés impliquées dans la décomposition de ces composés (e.g. , acyl-CoÀ oxydases, lipases) (Papanikolaou et al., 2001 ; Beopoulos et al, 2009a ; Papanikolaou et al , 2010 ; 201 1a et 201 lb). La synthèse des lipides chez Y. lipofytica s'effectue soit par la biosynthèse de novo d'acides gras via la production des précurseurs des acides gras comme l'acétyl-CoA et le raalonyl-CoA et leur intégration dans la voie de biosynthèse des lipides (voie de Kennedy), soit par l'accumulation ex novo, via l'incorporation des acides gras préexistant dans le milieu de fermentation ou dérivant de l'hydrolyse des huiles, des graisses, des triglycérides et des esters méthyîiques du milieu de culture et leur accumulation à l'intérieur de la cellule. Les voies principales de biosynthèse de novo des lipides chez Y. lipolytïca et Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae ; levure dite non-oléagineuse) sont bien conservées. Les gènes impliqués dans le métabolisme des acides gras chez les levures, en particulier chez Y. lipolytica, sont décrits dans Beopoulos et al (2009) et la Demande Internationale WO 2010/004141.
Chez les levures, la β-oxydation est une voie de dégradation des acides gras qui se situe uniquement dans les peroxysomes. Cette voie permet la formation d'acétyl-CoA à partir d'acides gras à chaîne paire et de propionyl-CoA à partir d'acides gras à chaîne impaire. La β-oxydation comporte quatre réactions successives au cours desquelles la chaîne carbonée de l'acyl-CoA est réduite de deux atomes de carbone. Une fois la réaction opérée, l'acyl-CoA réduit de deux carbones peut retourner dans la spirale de la β-oxydation (hélice de Lynen) et subir une nouvelle réduction de deux carbones. Ces cycles de décarboxylation peuvent être interrompus suivant la nature de l'acyl-CoA, la disponibilité en substrat, la présence de coenzyme A, d'acétyl-CoA ou selon le ratio NAD+/NADH. Dans la première étape de la β-oxydation, après la libération des acides gras des triacylglycérols (TAG) par les lipases, la forme active d'acyl-CoA formé est oxydée par une molécule de Flavine Adénine Dinucléotide (F AD) pour former une molécule de trans-A2-énoyl-CoA grâce à une acyl-CoA oxydase (AOX). La β-oxydation chez Y, lipolytica a été largement décrite (Wang et al, 1999b ; Mlickova et al 2004). Il existe 6 acyl-CoA oxydases chez Y. lipolytica, codées par les gènes POXl à 6, qui présentent des spécificités différentes vis-à-vis du substrat (Wang et al , 1999a et 1999b ; Luo et al, 2000 et 2002). Le trans-A2-énoyl-CoA est ensuite hydraté par la 2-énoyl-CoA hydratase. La molécule de 3-hydroxyacyl CoA formée est oxydée par le NAD+ pour former une molécule de 3-cétoacyl-CoA. Ces deux dernières étapes sont catalysées par une protéine bifonctionnelle codée par le gène MFE1 (enzyme multifonctionnelle ayant une fonction de 3-hydroxyacyI-CoA déshydrogénase). Le 3-oxoacyl-CoA thioester est alors clivé par une 3-oxoacyl-CoA thiolase codée par le gène POT1 (Einerhand et al, 1995). Un coenzyme A est ensuite ajouté pour former un acétyl-CoA et un acyl-CoA diminué de deux carbones. Des souches mutantes de Y. lipolytica dans lesquelles la bêta- oxydation des acides gras est invalidée en raison de la délétion des 6 gènes POX endogènes ont été décrites par Beopoulos et al (2008) et dans la Demande Internationale WO 2012/001 144. Ces souches mutantes présentent une augmentation de l'accumulation des lipides par rapport aux souches parentes.
Par ailleurs, Y. lipolytica est actuellement utilisée pour la transformation industrielle de l'acide ricinoléique en γ-décalactone, un composé aromatique avec des notes fruitées et huileuses que l'on peut trouver naturellement dans les fruits et les aliments fermentes (Schrader et al, 2004).
Dans le cadre de leurs recherches, les inventeurs ont obtenu une souche mutante de levure Yarrowîa lipolytica génétiquement modifiée qui peut être utile comme souche de levure matrice pour l'obtention d'autres souches mutantes de Y. lipolytica capables de produire des acides gras oméga-9 inhabituels. Dans cette souche de Y. lipolytica génétiquement modifiée, l'oléate (Δ12) désaturase endogène (encodée par le gène FÂD2) a été invalidée afin d'empêcher la transformation de l'acide oléique en acide linoléique. La voie de la β-oxydation, responsable de la dégradation des réserves lipidiques, a été abolie par la délétion des 6 gènes POX codants pour les 6 Acyl-CoA oxydases (AOX1 à AOX6) endogènes. L'accessibilité du substrat oléique sous forme de phospholipides pour une enzyme (par exemple une hydroxylase ou une époxydase) a été facilitée par l'invalidation des 3 gènes codant pour les triacylglycérol acyltransférases endogènes (DGAl, DGA2, LROl), afin d'empêcher le stockage de l'acide oléique sous forme de TAG. Cette souche mutante de Y. lipolytica matrice contenant les 10 modifications génétiques poxl- 6à,dgalA,dga2A,lrolAfad2 est dénommée JMY2159. Elle est incapable de dégrader l'acide oléique, de le stocker sous forme de triglycérides et de le transformer par désaturation en acide linoléique.
A partir de cette souche matrice JMY2159, les inventeurs ont ensuite obtenu des souches mutantes de levure Y. lipolytica génétiquement modifiées possédant une capacité considérable d'accumulation de lipides et capable de synthétiser de l'acide ricinoléique jusqu'à plus de 7% de leur matière sèche. L'expression hétérologue dans la souche matrice JMY2159 d'une séquence nucléotidique codant l'oléate (Δ12) hydroxylase de Ricinus communis (RcFAH12), sous le contrôle du promoteur constitutif TEF, a permis d'obtenir une souche mutante (dénommée JMY2331) produisant de l'acide ricinoléique à hauteur de 7% de ses lipides totaux. L'expression hétérologue dans la souche matrice JMY2159 d'une ou de deux séquences nucléotidiques codant l'oléate (Δ12) hydroxylase de Claviceps purpurea (CpFAH12), respectivement sous le contrôle du promoteur constitutif TEF, a donné lieu à des souches mutantes (dénommée J Y2324 et JMY251 1 respectivement) capable d'accumuler de l'acide ricinoléique à hauteur de 29% et 35% respectivement de leurs lipides totaux. La surexpression dans une souche similaire à la souche JMY251 1 (dans laquelle les deux séquences nucléotidiques codant CpFAH12 sont respectivement sous le contrôle du promoteur TEF ; souche JMY2527) de la phospholipide:diacylglycérol acyltransférase (PDAT) endogène codée par le gène YlLROl, qui est une enzyme capable de catalyser la formation du triacylglycérol à partir du 1,2-in-diacylglycérol permet d'atteindre une accumulation d'acide ricinoléique dans la souche mutante ainsi obtenue (dénommée JMY2556 ou JMY2853 selon les auxotrophies de la souche) à hauteur de 42% de ses lipides totaux. Ce taux de production d'acide ricinoléique de la souche JMY2556 peut être encore augmenté en augmentant le nombre de copies des gènes CpFAH12 et YlLROl, ou en inhibant l'expression de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène de la souche et/ou en surexprimant une ou plusieurs des enzymes endogènes de ladite souche suivantes : la monoacylglycérol acyltransférase, la patatin-like triacylglycérol lipase, au moins une des deux sous-unités de PATP citrate lyase, la diacylglycérol:choline-0 phosphotransférase, l'éthanolamine phosphotransférase, la phospholipase A2, une acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltransférase, une cytochrome-b5 réductase, l'inositol/phosphatidyl inositol phosphatase et l'élongase.
En outre, de manière surprenante, les souches mutantes de levure Y. lipolytica génétiquement modifiées capables de synthétiser de l'acide ricinoléique (notamment la souche JMY3030) sont également capables de le sécréter. Cette propriété de ces souches mutantes présente un avantage pour la production d'acide ricinoléique en grande quantité (il n'est pas nécessaire de lyser les cellules pour obtenir l'acide ricinoléique).
Les modifications génétiques effectuées chez Yarrowia lipolytica peuvent aussi l'être chez les autres levures oléagineuses. Ces souches mutantes de levure oléagineuse peuvent être utilisées comme alternatives à la production d'acide ricinoléique par le ricin, dans la mesure où elles sont faciles à cultiver, et ce indépendamment des saisons et du climat.
La présente invention a donc pour objet un procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse utile comme souche de levure matrice pour l'obtention d'autres souches mutantes de levure oléagineuse comprenant :
(a) l'inhibition de la bêta-oxydation des acides gras dans ladite souche,
(b) l'inhibition de l'expression ou de l'activité d'une ou plusieurs des acyl- CoA:diacylgIycérol acyltransférases (DGAT) endogènes de ladite souche, de préférence de toutes les DGAT endogènes de ladite souche,
(c) l'inhibition de l'expression ou de l'activité de l'oléate désaturase (FAD2) endogène de ladite souche, et éventuellement (d) l'inhibition de l'expression ou de l'activité d'une phospholipide:diacylglycérol acyltransférase (PDAT) endogène de ladite souche.
Les étapes (a) à (d) du procédé selon la présente invention peuvent être mises en œuvre dans n'importe quel ordre, simultanément ou séquentiellement.
Selon un mode de réalisation avantageux de ce procédé, l'inhibition de la bêta- oxydation des acides gras définie à l'étape (a) ci-dessus est obtenue par :
- l'inhibition de l'expression ou de l'activité des acyl-CoA oxydas es (AOX) endogènes de ladite souche et/ou
- l'inhibition de l'expression ou de l'activité de l'enzyme multifonctionnelle ayant les activités 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase et énoyl-CoA hydratase endogène de ladite souche et/ou
- l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 3-oxoacyl-CoA thiolase endogène de ladite souche.
Les souches de levure oléagineuse sont bien connues de l'homme du métier. Elles possèdent la capacité d'accumuler des quantités importantes de lipides, à hauteur d'au moins 20% de leur matière sèche (Ratledge, 1994). Elles appartiennent généralement au genre Candida, Cryptoccocus, Lipomyces, Rhodosporidium (e.g., Rhodosporidium toruloides), Rhodotorula (e.g., Rhodotura gï tinis), Trichosporon ou Yorrowia.
Les génomes de Lipomyces et de Rhodosporidium ont été séquencés : pour Lipomyces starkeyi, voir le Joint Génome institute (JGI) et pour Rhodosporidium toruloides, voir Kumar et al (2012) et Zhu et al. (2012).
Une souche plus particulièrement préférée au sens de la présente invention est une souche de levure de Yarrowia, de préférence encore de Yarrowia lipolytica.
On entend par souche de levure matrice une souche de levure à partir de laquelle d'autres modifications génétiques peuvent être effectuées dans ladite souche.
L'inhibition de l'expression ou de l'activité d'une enzyme définie dans la présente invention peut être totale ou partielle. Elle peut être obtenue de diverses manières par des méthodes connues en elles mêmes de l'homme du métier.
De manière avantageuse, cette inhibition peut être obtenue par mutagenèse du gène codant pour ladite enzyme.
La mutagenèse du gène codant pour ladite enzyme peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression de ce gène, notamment au niveau du promoteur, conduisant à une inhibition de la transcription ou de la traduction de ladite enzyme. La mutagenèse du gène codant pour ladite enzyme peut être effectuée par génie génétique. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène. Des méthodes permettant de déléter (supprimer) ou d'insérer une séquence génétique donnée chez la levure, en particulier chez Y. lïpolytica, sont bien connues de l'homme du métier (voir pour revue Barth et Gaillardin, 1996 ; Madzak et al, 2004). A titre d'exemple, on peut utiliser la méthode appelée POP IN / POP OUT qui a été utilisée chez les levures, particulièrement chez Y, lipolytica, pour la délétion des gènes LEU2, URA3 etXPR2 (Barth et Gaillardin, 1996). On peut également utiliser la méthode SEP (Maftahi et al, 1996) qui a été adaptée chez Y. lipolytica pour la délétion des gènes FOX (Wang et al, 1999b). Avantageusement, on peut aussi utiliser la méthode SEP/Cre développée par Fickers et al (2003) et décrite dans la Demande Internationale WO 2006/064131. En outre, des méthodes permettant d'inhiber l'expression ou l'activité d'une enzyme chez les levures sont décrites dans la Demande Internationale WO 2012/001144. Une méthode avantageuse selon la présente invention consiste à remplacer la séquence codante du gène codant pour ladite enzyme par une cassette d'expression contenant la séquence d'un gène codant pour un marqueur de sélection. On peut aussi introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles dans le gène codant pour ladite enzyme, ayant pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou d'inhiber la transcription ou la traduction du gène codant pour ladite enzyme.
La mutagenèse du gène codant pour ladite enzyme peut aussi être effectuée à l'aide d'agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Cette mutagenèse permet aussi d'introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles dans le gène codant pour ladite enzyme.
Le gène muté codant pour ladite enzyme peut être identifié par exemple par PCR à l'aide d'amorces spécifiques dudit gène.
Il est possible d'utiliser toute méthode de sélection connue de l'homme du métier compatible avec le gène (ou les gènes) marqueur(s) utilisés. Les marqueurs de sélection permettant la complémentation d'une auxotrophie, également communément appelés marqueurs d'auxotrophie, sont bien connus de l'homme du métier. Le marqueur de sélection URA3 est bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de levure dont le gène URA3 (séquence disponible dans les bases de données Génolevures (http://genolevures.org ) sous le nom YALI0E26741g ou UniProt sous le numéro d'accès Q12724), codant pour l'orotidine-S'-phosphate décarboxylase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en uracile. L'intégration du marqueur de sélection URA3 dans cette souche de levure permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu dépourvu d'uracile. Le marqueur de sélection LEU2 décrit notamment dans le brevet US 4,937,189 est également bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de levure dont le gène LEU2 (YALI0C00407g), codant la β-isopropylmalate déshydrogénase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en leucine. Comme précédemment, l'intégration du marqueur de sélection LEU2 dans cette souche de levure permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en leucine. Le marqueur de sélection ADE2 est également bien connu de l'homme du métier dans le domaine de la transformation de la levure. Une souche de levure dont le gène ADE2 (YALI0B23188g), codant pour la phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en adénine. Là encore, l'intégration du marqueur de sélection ADE2 dans cette souche de levure permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en adénine. Des souches de Y. lipolytica auxotrophiques Leu Ura" ont été décrites par Barth et Gaillardin, 1996.
Avantageusement, ladite souche mutante de levure est auxotrophe pour la leucine (Leu") et éventuellement pour Porotidine-5' -phosphate décarboxylase (Ura").
Chez les levures, 6 gènes POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 et POX6 codent 6 isoformes d'acyl-coenzymeA oxydases (AOX ; E.C. 6.2.1.3) impliquées, au moins partiellement, dans la β-oxydation des acides gras. L'inhibition, partielle ou totale, de l'expression ou de l'activité de ces isoenzymes conduit à l'accumulation par les levures d'acide dodécanedioïque, sans consommation des lipides accumulés. Plus particulièrement, la séquence codante des gènes POX1-6 et la séquence peptidique des AOX1-6 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures (http://genolevures.org/) ou GenBank sous les numéros d'accès ou noms suivants ; POX1 I AOX1 = YALI0E32835g / YALI0E32835p, POX2 I AOX2 = YALI0F10857g / YALI0F10857p ; POX3 ! AOX3 = YALI0D24750g / YALI0D24750p ; POX4 / AOX4 = YALI0E27654g / YALI0E27654p ; POX5 I AOX5 = YALI0C23859g / YALI0C23859p ; POX6 ! AOX6 - YALI0E06567g / YALIOE06567p. Les séquences peptidiques des acyl-CoA oxydases de Y. lipolytica présentent 45 % d'identité ou 50 % de similarité avec celles des autres levures. Le degré d'identité entre les acyl-CoA oxydases varie de 55 à 70 % (ou 65 à 76 % de similarité) (Demande Internationale WO 2006/064131). Un procédé d'inhibition de l'expression des 6 AOX endogènes dans une souche de Y. lipolytica a été décrit dans les Demandes Internationales WO 2006/064131, WO 2010/004141 et WO 2012/001 144,
Chez les levures, l'enzyme multifonctionnelle possède trois domaines : deux domaines ayant une activité 3-hydroxyacyi-CoA déshydro gênas e (E.C. 4.2.1.74 ; domaines A et B) et un domaine ayant une activité énoyl-CoA hydratase (E.C. 4.2.1.17 ; domaine C). Cette enzyme est codée par le gène MFE1 (« Multifunctional enzyme type 1 »). Plus particulièrement, la séquence codante du gène MFE1 et la séquence peptidique de la 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase et énoyl-CoA hydratase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOE 15378g / YALI0E15378p. Un procédé d'inhibition de l'expression de ladite enzyme multifonctionnelle endogène dans une souche de Y, lipolytica a été décrit par Haddouche et al. (201 1).
Chez les levures, la 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase (E.C. 2.3.1.16) est codée par le gène POT1 (« Peroxisomal Oxoacyl Thiolase 1 »). Plus particulièrement, la séquence codante du gène POT1 et la séquence peptidique de la 3-oxoacyl-CoA thiolase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIO 18568g / YALIO 18568p. Un procédé d'inhibition de l'expression de la 3-oxoacyl-coenzyme A thiolase endogène dans une souche de Y. lipolytica a été décrit par Berninger et al. (1993).
Chez les levures, les acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférases (DGAT ; E.C.
2.3.1.20) sont codées par deux gènes : DGA1 et DGA2 (Beopoulos et al, 2009 et 2012 ; Demande Internationale WO 2012/001144). Plus particulièrement, la séquence codante du gène DGA1 et la séquence peptidique de l'acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférases 1 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0E32769g / YALI0E32769p. La séquence codante du gène DGA2 et la séquence peptidique de l'acyl-CoA:diacylglycéroî acyltransférases 2 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0D07986g / YALI0D07986p. Chez Rhodoturula glutanis, une acyl-CoA:diacylglycéroI acyltransférase a été décrite par Rani et al. (2013). Un procédé d'inhibition de l'expression d'une ou des 2 DGAT (DGATl et/ou DGAT2) endogènes dans une souche de Y. lipolytica a été décrit par Beopoulos et al (2012).
Certaines levures possèdent naturellement un gène codant pour une oléate (Δ12) désaturase (E.C. 1.14.19.6) qui est codée par le gène FAD2. Par exemple, Y. lipolytica possède ce gène alors que S. ce evisiae (qui n'est pas considérée comme une levure oléagineuse) ne le possède pas (Ratledge, 2004 ; Beopoulos et al, 2008). Plus particulièrement, la séquence codante du gène FAD2 et la séquence peptidique de l'oléate (Δ12) désaturase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOB10153g / YALI0B10153p. Si la souche de levure ne possède pas de gène codant pour une oléate (Δ12) désaturase, alors l'étape (c) du procédé selon la présente invention ne sera pas mise en œuvre.
Chez les levures, la phospholipide:diacylglycérol acyltransférase (PDAT ; E.C. 2.3.1.158) est codée par le gène LROl (Beopoulos et al, 2009 et 2012 ; Demande Internationale WO 2012/001144). Plus particulièrement, la séquence codante du gène LROl et la séquence peptidique de la phospholipide:diacylgiycérol acyltransférase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0E16797g / YALI0E16797p. Un procédé d'inhibition de la PDAT endogène dans une souche de Y. lipolytica a été décrit par Beopoulos et al (2012).
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel, comprenant les étapes (a) à (c) définies ci-dessus, éventuellement l'étape (d) définie ci-dessus, et en outre l'expression dans ladite souche d'une enzyme hétérologue présentant une activité oléate hydroxylase (E.C. 1.14.99.33) ou oléate époxydase (E.C. 1.14.99.- ; Lee et al , 1998).
Avantageusement, ces souches mutantes de levure oléagineuse capables de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel sont également capables de sécréter ledit acide gras oméga-9 inhabituel.
On entend par enzyme hétérologue, une enzyme que ne possèdent pas naturellement les levures oléagineuses. Ce peut être une enzyme provenant de tout organisme procaryote ou eucaryote.
Des enzymes présentant une activité oléate hydroxylase ou oléate époxydase (Lee et al, 1998) sont connues de l'homme du métier. L'utilisation d'une enzyme particulière présentant une activité hydroxylase ou époxydase dépend de l'acide gras oméga-9 inhabituel que l'homme du métier souhaite faire produire à la souche mutante de levure oléagineuse.
Selon un mode de réalisation préféré de ce procédé, l'acide gras oméga-9 inhabituel est l'acide ricinoléique et ledit procédé comprend l'expression dans ladite souche d'une enzyme hétérologue présentant une activité oléate (Δ12) hydroxylase, telle qu'une oléate (Δ12) hydroxylase (FAH12) ou une oléate (Δ12) désaturase (FAD2) mutée pour qu'elle présente une activité oléate (Δ12) hydroxylase, de préférence une oléate (Δ12) hydroxylase.
Selon un mode de réalisation avantageux de ce procédé, ladite oléate (Δ12) hydroxylase est l'oléate (Δ12) hydroxylase de Ricinus communis (RcFAH12) ou provient d'un champignon de la division des ascomycètes, de préférence de la famille des Clavicipitaceae, de préférence encore du genre Claviceps et tout préférentiellement de l'espèce Claviceps purpurea (CpFAH12).
La séquence peptidique de l'enzyme RcFAH12 est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès GI: 187940238. Une séquence nucléotidique codant RcFAH12 optimisée pour son expression chez la levure est représentée par la séquence SEQ ID NO : 21.
La séquence peptidique de l'enzyme CpFAH12 est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès GI: 194271137. Une séquence nucléotidique codant CpFAH12 optimisée pour son expression chez la levure est représentée par la séquence SEQ ID NO : 22.
L'oléate (Δ12) désaturase mutée présentant une activité oléate (Δ12) hydroxylase peut être obtenue par échange de domaine de l'oléate (Δ12) désaturase par un ou plusieurs domaine d'une oléate (Δ12) hydroxylase conférant l'activité hydroxylase (domaines H2 et/ou H3), et/ou par mutagénèse (e.g., substitution) d'un ou plusieurs acides aminés de l'oléate (Δ12) désaturase par un ou plusieurs acides aminés d'une oléate (Δ12) désaturase conférant une activité hydroxylase. A titre d'exemple chez les plantes, des oléate désaturases mutées présentant une activité oléate hydroxylase ont été décrites par Broun et al (1998) et Broadwater et al. (2002).
Avantageusement, l'oléate (Δ12) désaturase mutée provient d'un champignon de la famille des Clavicipitaceae, de préférence encore du genre Claviceps et de préférence encore de l'espèce Claviceps purpurea (CpFAD2 ; Meesapyodsuk et al, 2007) ou provient d'une levure de la famille des hémiascomycètes, de préférence du genre Yarrowia et de préférence encore de l'espèce Yarrowia lipolytica (Y1FAD2 : YALI0B10153g / YALI0B101539).
Chez C. purpurea, la séquence d'acides aminés de l'oléate désaturase (CpFAD2) possède 86 % d'identité avec la séquence d'acides aminés de l'oléate hydroxylase (CpFAH12). La différence de fonction entre la désaturase et l'hydroxylase de C. purpurea est donc contenue dans les acides aminés correspondant aux 14% de séquences divergentes entre ces 2 enzymes. Des CpFAD2 mutées (protéines chimères) présentant une activité oléate (Δ12) hydroxylase sont représentées en tant que SEQ ID NO : 49, 50 et 51, de préférence SEQ ID NO : 51 ,
La surexpression d'une enzyme (endogène, orthologue, hétérologue) définie dans la présente invention dans une souche mutante de levure selon la présente invention peut être obtenue de diverses manières par des méthodes connues en elles mêmes.
La surexpression d'une enzyme définie dans la présente invention peut être effectuée en plaçant une ou plusieurs (de préférence deux ou trois) copies de la phase ouverte de lecture de la séquence codant ladite enzyme sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées. Lesdites séquences régulatrices comprennent des séquences promotrices, placées en amont (en 5') de la phase ouverte de lecture de la séquence codant ladite enzyme, et des séquences terminatrices, placées en aval (en 3') de la phase ouverte de lecture de la séquence codant ladite enzyme.
Des séquences promotrices qui peuvent être utilisées chez la levure sont bien connues de l'homme du métier et peuvent correspondre notamment à des promoteurs inductibles ou constitutifs. A titre d'exemple de promoteurs utilisables dans le procédé selon la présente l'invention, on peut citer notamment le promoteur d'un gène de Y. lipolytica qui est fortement réprimé par le glucose et qui est inductible par les acides gras ou les triglycérides tel que le promoteur POX2 du gène de l'acyl CoA oxydas e 2 (AOX2) de Y. lipolytica et le promoteur du gène LIP2 décrit dans la Demande Internationale WO 01/83773. On peut aussi utiliser le promoteur du gène FBA1 codant la fructose-bisphosphate aldolase (Demande US 2005/0130280), le promoteur du gène GPM codant la phosphoglycerate mutase (Demande Internationale WO 2006/0019297), le promoteur du gène YÀT1 codant le transporteur de l'ammonium (US 2006/0094102), le promoteur du gène GPAT codant la glycérol-3 -phosphate O-acyltransférase (Demande US 2006/0057690), le promoteur du gène TEF (Muller et al, 1998 ; Demande US 2001/6265185), le promoteur hybride hp4d (Demande Internationale WO 96/41889) ou encore les promoteurs hybrides XPR2 décrits dans Mazdak et al. (2000).
Des séquences terminatrices qui peuvent être utilisées chez la levure sont également bien connues de l'homme du métier. On peut citer, à titre d'exemple de séquences terminatrices utilisables dans le procédé selon l'invention, la séquence terminatrice du gène PGKl et la séquence terminatrice du gène LIP2 décrits dans la Demande Internationale WO 01/83773.
La séquence nucléotidique des séquences codantes des gènes hétérologues peut être optimisée pour son expression dans la levure par des méthodes bien connues de l'homme du métier (voir pour revue Hedfalk, 2012). La surexpression d'une enzyme endogène peut être obtenue en remplaçant les séquences contrôlant l'expression de ladite enzyme endogène par des séquences régulatrices permettant une expression plus forte, telles que celles décrites ci-dessus. L'homme du métier peut ainsi remplacer la copie du gène codant une enzyme endogène dans le génome, ainsi que ses séquences régulatrices propres, par transformation de la souche mutante de levure par un polynucléotide linéaire comprenant la phase ouverte de lecture de la séquence codant ladite enzyme endogène sous le contrôle de séquences régulatrices telles que celles décrites ci-dessus. Avantageusement, ledit polynucléotide est encadré par des séquences qui sont homologues de séquences situées de chaque côté du gène codant ladite enzyme endogène chromosomique. Des marqueurs de sélection peuvent être insérés entre les séquences assurant la recombinaison afin de permettre, après transformation, d'isoler les cellules où l'intégration du fragment s'est produite par mise en évidence des marqueurs correspondant. Avantageusement aussi, les séquences promotrices et terminatrices utilisées appartiennent à des gènes différents de celui codant pour l'enzyme endogène à surexprimer, de manière à minimiser les risques de recombinaison non désirée dans le génome de la souche de levure.
La surexpression d'une enzyme endogène peut aussi être obtenue par l'introduction dans la souche de levure selon l'invention de copies surnuméraires du gène codant ladite enzyme endogène sous le contrôle de séquences régulatrices telles que celles décrites ci-dessus. Lesdites copies supplémentaires codant ladite enzyme endogène peuvent être portées par un vecteur épisomal, c'est-à-dire capable de se répliquer dans la levure. De préférence, ces copies supplémentaires sont portées par un vecteur intégratif, c'est-à-dire s'intégrant à un endroit donné dans le génome de la levure (Mazdak et al, 2004). Dans ce cas, le polynucléotide comprenant le gène codant ladite enzyme endogène sous le contrôle de régions régulatrices est intégré par intégration ciblée.
L'intégration ciblée d'un gène dans le génome d'une levure est une technique de biologie moléculaire bien connue de l'homme du métier ; un fragment d'ADN est cloné dans un vecteur intégratif, introduit dans la cellule à transformer, lequel fragment d'ADN s'intègre alors par recombmaison homologue dans une région ciblée du génome receveur (Orr-Weaver et al, 1981). Des procédés de transformation des levures sont également bien connus de l'homme du métier et sont décrits, notamment, par Ito et al (1983), Klebe et al. (1983) et Gysler et al (1990). Des marqueurs de sélection peuvent aussi être insérés entre les séquences assurant la recombinaison afin de permettre, après transformation, d'isoler les cellules où l'intégration du fragment s'est produite par mise en évidence des marqueurs correspondant. Lesdites copies supplémentaires peuvent aussi être portées par des fragments de PCR dont les extrémités sont homologues à un locus donné de la levure, permettant ainsi l'intégration desdites copies dans le génome de la levure par recombinaison homologue.
Lesdites copies supplémentaires peuvent également être portées par des vecteurs d' autoclonage ou des fragments de PCR dont les extrémités présentent une région zeta absente du génome de la levure, permettant ainsi l'intégration desdites copies dans le génome de la levure par insertion aléatoire comme décrit dans la Demande US 2012/0034652.
Toute méthode de transfert de gène connue de l'art antérieur peut être utilisée pour introduire dans une souche de levure une cassette d'invalidation d'un gène ou introduire un gène codant une enzyme. De préférence, on utilise la méthode à l'acétate de lithium et au polyéthylène glycol décrite par Gaillardin et aï. (1987) et Le Dali et al. (1994).
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser de l'acide ricinoléique selon la présente invention, il comprend en outre la surexpression dans ladite souche de levure d'une enzyme capable de catalyser la formation du triacylglycérol (TAG) à partir du 1 ,2-j*R-diacylglycérol.
Cette enzyme capable de catalyser la formation du triacylglycérol (TAG) à partir du 1,2-iH-diacylglycéroî peut être une acyl-CoA:diacylglycérol acyltransférase (DGAT ; E.C. 2.3.1.20) ou une phospholipide:diacylglycérol acyltransférase (PDAT ; E.C. 2.3.1.158). Cette enzyme peut être endogène de ladite souche de levure. De préférence, cette enzyme est une PDAT, de préférence encore la PDAT endogène de ladite souche de levure. La PDAT permet de transférer l'acide ricinoléique du phospholipide au diacylglycérol.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser de l'acide ricinoléique selon la présente invention, il comprend en outre :
- la surexpression d'une monoacylglycérol acyltransférase, avantageusement d'une monoacylglycérol acyltransférase de levure, avantageusement encore de la monoacylglycérol acyltransférase endogène de ladite souche (ce procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse et la souche obtenue par ce procédé étant particulièrement avantageux) et/ou
- la surexpression d'une patatin-like triacylglycérol lipase, avantageusement d'une patatin- like triacylglycérol lipase de levure, avantageusement encore de la patatin-like triacylglycérol lipase endogène de ladite souche et/ou - l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène de ladite souche (ce procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse et la souche obtenue par ce procédé étant particulièrement avantageux) et/ou
- la surexpression d'au moins une des deux sous-unités de ΓΑΤΡ citrate lyase, avantageusement d'au moins une des deux sous-unités de ΓΑΤΡ citrate lyase de levure, avantageusement encore d'au moins une des deux sous-unités de ΑΤΡ citrate lyase endogène de ladite souche et/ou
- la surexpression d'une diacylglycérol:choline-0 phosphotransférase, avantageusement d'une diacylgIycérol:choline-0 phosphotransférase de levure, avantageusement encore de la diacylglycérol:choline-0 phosphotransférase endogène de ladite souche (ce procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse et la souche obtenue par ce procédé étant particulièrement avantageux) et/ou
- la surexpression d'une éthanolamine phosphotransférase, avantageusement d'une éthanoîamine phosphotransférase de levure, avantageusement encore de l'éthanolamine phosphotransférase endogène de ladite souche et/ou
- la surexpression d'une phospholipase A2, avantageusement d'une phospholipase A2 de levure, avantageusement encore de la phospholipase A2 endogène de ladite souche et/ou
- la surexpression d'une acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltransférase, avantageusement d'une acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltransférase de levure, avantageusement encore d'une acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltransférase endogène de ladite souche et/ou
- la surexpression d'une cytochrome-bs réductase, avantageusement d'une cytochrome-b5 réductase endogène de ladite souche (ce procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse et la souche obtenue par ce procédé étant particulièrement avantageux) et/ou - la surexpression d'une inositol/phosphatidyl inositol phosphatase, avantageusement de l'inositol/phosphatidyl inositol phosphatase endogène de ladite souche et/ou
- la surexpression d'une élongase, avantageusement d'une élongase endogène de ladite souche.
Les enzymes surexprimées dans ladite souche de levure peuvent provenir de tout organisme procaryote ou eucaryote. La séquence codante des gènes codant ces enzymes peut être optimisée pour son expression dans la levure par des méthodes bien connues de l'homme du métier (voir pour revue Hedfalk, 2012). Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, au moins une des enzymes surexprimées est endogène de ladite souche, de préférence toutes les enzymes surexprimées sont endogènes de ladite souche.
Chez les levures, la monoacylglycérol acyltransférase (MAGT ; 1-acyl-sn- glycérol-3-phosphate acyltransférase ; E.C. 2.3.1.51) est codée par le gène SLC1 (Beopoulos et al, 2009 et 2012 ; Demande Internationale WO 2012/001 144). Plus particulièrement, la séquence codante du gène SLC1 et la séquence peptidique de la monoacylglycérol acyltransférase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0E18964g / YALI0E18964p.
Chez les levures, la patatin-like triacylglycérol lipase (TGL5 ; triacylglycérol lipase ; E.C. 3.1.1.3) est codée par le gène TGL5 (Beopoulos et al, 2009 et 2012). Plus particulièrement, la séquence codante du gène TGL5 et la séquence peptidique de la patatin- like triacylglycérol lipase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0D16379g / YALI0D16379p.
Chez les levures, la 2 -méthyl citrate déshydratase (E.C. 4.2.1.79) est une protéine mitochondriale qui catalyse la conversion du 2-méthylcitrate en 2-méthyl-cis aconitate dans le cycle du 2 -méthy citrate du métabolisme du propionate (Uchiyama et al, 1982 ; Tabuchi et al, 1981). Elle est codée par le gène PHD1. Plus particulièrement, la séquence codante du gène PHD1 et la séquence peptidique de la méthylcitrate déshydratase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0F02497g / YALI0F02497p.
Chez les levures, ΓΑΤΡ citrate lyase (E.C. 2.3.3.8) consiste en deux sous-unités codées par deux gènes (ACL1 et ACL2 respectivement) (Beopoulos et al , 2009). L'ATP citrate lyase de certaines levures oléagineuses a été caractérisée par Boulton et al (1981). Plus particulièrement, la séquence codante des gènes ACL1 et ACL2 et la séquence peptidique des sous-unités A et B de ΓΑΤΡ citrate lyase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous les numéros d'accès ou les noms suivants : ACL1 ! sous-unité A : YALI0E34793g / YALI0E347939p, et ACL2 ! sous-unité B : YALI0D2443 lg / YALI0D2443 lp.
Chez les levures, la diacyîglycérol:choline-0 phosphotransférase (E.C. 2.7.8.2) est codée par le gène CPT1. Plus particulièrement, la séquence codante du gène CPT1 et la séquence peptidique de la diacylglycérol:choline-0 phosphotransférase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0E26565g / YALI0E26565p.
Chez les levures, Péthanolamine phosphotransférase (EPT1 ; E.C. 2.7.8.1) est codée par le gène EPT1. Plus particulièrement, la séquence codante du gène EPT1 et la séquence peptidique de l'éthanolamine phosphotransférase de Y. lipolytica CLÏB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOC 10989g / YALIOC 10989p.
Chez les levures, la phospholipase A2 (PLA2 ; E.C. 3.1.1.3 ; 3.1.1.13 ; 3.1.1.4 et 2.3.1.51) est codée par le gène LPA1. Plus particulièrement, la séquence codante du gène LPA1 et la séquence peptidique de la phospholipase A2 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALIOFlOOlOg / YALIOFlOOlOp.
Chez les levures, les acyl-CoA:lysophosphatidy!choline acyltransférases (LPCAT ; (E.C. 2.3.1.51 ; 2.3.1.23 ; 2.3.1.-) sont codées par 3 gènes, respectivement LCA1, LCA2 et LCA3. Plus particulièrement, la séquence codante des gènes LCA1, LCA2 et LCA3 et la séquence peptidique des acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltransférases 1, 2 et 3 de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous les numéros d'accès ou les noms suivants : LCA1 : YALI0F19514g / YALI0F19514p ; LCA2 : YALI0C20625g / YALI0C20625p et LCA3 : YALI0C14036g / YALI0C14036p.
Chez les levures, les cytochrome-bs réductases (E.C. 1.6.2.2) sont codées par deux gènes, respectivement MCRl et CBRI (Sickmann et al., 2003 ; Dujon et al., 2004). Plus particulièrement, la séquence codante des gènes MCRl et CBRI et la séquence peptidique des cytochrome-b5 réductases de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous les numéros d'accès ou les noms suivants : MCRl : YALI0D11330g / YALI0D1 1330p et CBRI : YALI0D04983g/ YALIOD04983p.
Chez les levures, l'inositol/phosphatidyl inositoî phosphatase (E.C. 3.1.3.-) est codée par le gène SACl (Whitters et al , 1993). Plus particulièrement, la séquence codante du gène SACl et la séquence peptidique de l'inositol/phosphatidyl inositoî phosphatase de Y. lipolytica CLIB122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous le numéro d'accès ou le nom suivant : YALI0D05995g / YALI0D05995p.
Chez les levures, les élongases (E.C. 2.3.1.199) sont codées par deux gènes, respectivement ELOl et EL02. Plus particulièrement, la séquence codante des gènes ELOl et EL02 et la séquence peptidique des élongases A et B respectivement de Y. lipolytica CLIB 122 sont disponibles dans les bases de données Génolevures ou GenBank sous les numéros d'accès ou les noms suivants : ELOl ; YALI0F06754g, et EL02 : YALÏ0B20196g.
Selon un autre mode de réalisation préféré du procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel selon la présente invention, l'acide gras oméga-9 inhabituel est l'acide vernolique et ledit procédé comprend l'expression dans ladite souche d'une enzyme hétérologue présentant une activité oléate (Δ12) époxydase.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, Γ oléate (Δ12) époxydase est celle de Crépis aïpina, Crépis Palaestina ou Vernonia gaïamensis (Lee et al, 1998).
La présente invention a également pour objet :
- une souche mutante de levure oléagineuse utile comme souche de levure matrice pour l'obtention d'autres souches mutantes de levure oléagineuse, susceptible d'être obtenue par un procédé selon la présente invention définie ci-dessus et
- une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel, de préférence capable de produire de l'acide ricinoléique ou de l'acide vernolique, de préférence encore de l'acide ricinoléique, susceptible d'être obtenue par un procédé selon la présente invention définie ci-dessus.
On peut citer, à titre d'exemple de souches mutantes de levure oléagineuse utiles comme souches de levures matrices pour l'obtention d'autres souches mutantes de levure oléagineuse, celles de génotype :
- poxFôA dgalA IrolA dga2A fad2Â ou
- ura3~302 leu2-270 xpr2-322 poxl-6A dgalA IrolA dga2A fad2A.
On peut citer, à titre d'exemple de souches mutantes de levure oléagineuse capables de synthétiser de l'acide ricinoléique celles de génotype :
-poxl-6A dgalA IrolA dga2Afad2A PTEF-CpFAH12
-poxl-6A dgalA IrolA dga2Afad2A pTEF- CpFAH12x2 pTEF-LROl
-poxl-6A dgalA IrolA dga2Afad2A pTEF-CpFAHl 2x3 pTEF-LR01x2
- poxl~6A dga A IrolA dga2Af d2A pTEF-CpFAH12x2 pTEF-LROl pTEF-cpFAH12 pTef- LROl
- poxF6A dgalA IrolA dga2Afad2A pTEF-CpFAHl 2x2 pTEF-LROl pTEF-ACLl
-poxl-6A dgalA IrolA dga2Afad2A pTEF-CpFAHl 2x2 pTEF-LROl pTEF-ACL2
-poxl~6A dgalA. IrolA dga2A fad2A pTEF-CpFAHl 2x2 pTEF-LROl phdlA
-poxFÔA dgalA IrolA dga2Afad2A TEF-CpFAHl 2x2 pTEF-LROl pTEF-SLCl -poxl-6A dgalA IrolA dga2Afad2A pTEF-CpFAHl 2x2 pTEF-LROl pTEF-SACl
-poxl-6A dgalA IrolA dga2Afad2A pTEF-CpFAH12x2 pTEF-LROl pTEF-LR02
-poxl-6à dgalA IrolA dga2 fad2A pTEF-CpFAHl 2x2 pTEF-LROl pTEF-TGL5
-poxl-6A dgalA IrolA dga2 fad2A TEF- CpFAHl 2x2 pTEF-LROl pTEF-MCRl
- poxl-6A dgalA IrolA dga2 fad2A p TEF- CpFAHl 2x2 pTEF-LROl pTEF-LCA 1
-poxl-6A dgalA IrolA dga2Afad2A pTEF "-CpFAHl '2x2 pTEF-LROl pTEF-LCA2
~poxl-6A dgalA IrolA dga2Afad2A pTEF-CpFAHl 2x2 pTEF-LROl pTEF-LCA3
- poxl-6A dgalA IrolA dga2A fad2A pTEF-CpFAHl 2x2 pTEF-LROl pTEF-LPAl
-poxl-6A dgalA IrolA dga2Afad2A pTEF-CpFAHl 2x2 pTEF-LROl pTEF-CFTl
-poxl-6A dgalA IrolA dga2Afad2A pTEF-CpFAH12x2 pTEF-LROl pTEF-EPTl
-poxl-6A dgalA IrolA dga2Afad2A pTEF-CpFAHl 2x2 pTEF-LROl pTEF-ELOA
-poxl-6A dgalA IrolA dga2 fad2A pTEF-CpFAHl 2x2 pTEF-LROl pTEF-ELOB
-poxl-6A dgalA IrolA dga2Afad2A pTEF-CpFAHl 2x3 pTEF-LR01x2 pTEF-MCRl -poxl~6A dgalA IrolA dga2 fad2A pTEF-CpFAHl 2x3 pTEF-LR01x2 pTEF-LCAl
Avantageusement, ces souches mutantes de levure oléagineuse capables de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel, tel que l'acide ricinoléique ou l'acide vernolique, sont également capables de sécréter ledit acide gras oméga-9 inhabituel.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel selon la présente invention telle que définie ci-dessus pour la production d'un acide gras oméga-9. Ledit acide gras oméga-9 est de préférence de l'acide ricinoléique ou de l'acide vernolique, de préférence encore de l'acide ricinoléique.
La présente invention a également pour objet un procédé de production d'acide gras oméga-9, comprenant une étape de culture sur un milieu approprié d'une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel selon la présente invention telle que définie ci-dessus. Ledit acide gras oméga-9 est de préférence de l'acide ricinoléique ou de l'acide vernolique, de préférence encore de l'acide ricinoléique.
Ledit procédé de production d'acide gras oméga-9 comprend une première étape de culture de ladite souche mutante de levure oléagineuse selon la présente invention dans un milieu approprié et une seconde étape de récolte des acides gras oméga-9 produits par la culture à l'étape 1.
Ledit milieu approprié peut comprendre différentes sources carbonées pour la croissance telles que par exemple du glucose, du saccharose ou du glycérol. Des sources complexes d'apport de ce substrat carboné peuvent également être utilisées telles que des mélasses. Il peut aussi comprendre des huiles végétales ou de l'acide oléique comme substrat de bioconversion. Ledit milieu approprié peut être un milieu riche à base d'extrait de levure, de tryptone ou de peptone (par exemple extrait de levure 5g/L-glucose 50g/L), ou un milieu minimum classique tel que décrit par Mlickova et al. (2004) ou optimisé pour ladite levure (Demande Internationale WO 2007/144445 ; Emond et al, 2010) comprenant des oligoéléments, du fer et des vitamines ainsi que de l'acide orthophosphorique et de l'ammoniac ou toute autre source d'azote connue de l'homme du métier.
Les milieux de culture et les procédés de culture des levures oléagineuses sont bien connues de l'homme du métier.
La culture des levures oléagineuse peut être réalisée en fermenteur.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à l'obtention d'une souche mutante de levure Y. lipolytica matrice selon la présente invention et de souches mutantes de levure Y. lipolytica capables de synthétiser de l'acide ricinoléique, ainsi que des figures annexées :
Figure 1 : Tableau décrivant les plasmides et les souches d'E. coli et de
Y. lipolytica utilisés pour l'obtention des souches mutantes de Y. lipolytica selon la présente invention.
Figure 2 : Représentation schématique de la construction des souches mutantes de Y. lipolytica selon la présente invention et leur génotype.
Figure 3 : Couples d'amorces utilisés pour le clonage des gènes d'intérêt.
Figure 4 : Composition en acides gras (pourcentages par rapport aux acides gras totaux) de souches mutantes de levure (A) exprimant l'oléate hydroxylase de R. communis (RcFAH12) ou de C. purpurea (CpFAH12) dans différents fonds génétiques et (B) co-exprimant RcFAH12 ou CpHAH12 et l'oléate désaturase de R. communis (RcDGAT2), de C. purpurea (CpDGAT2) ou de Y. lipolytica (YlLROl) dans différents fonds génétiques.
Figure 5 : Evolution de la quantité (en g/L de culture) d'acide ricinoléique produit au cours de la fermentation par la souche JMY3030. La quantité extracellulaire d'acide ricinoléique est représentée en noir. La quantité intracellulaire d'acide ricinoléique est représentée en gris. L'étiquette au-dessus donne le % d'acide ricinoléique extracellulaire.
Figure 6 : Séquence des amorces utilisées pour le clonage des gènes impliqués dans le métabolisme lipidique de Y. lipolytica. Les amorces sens (for) contiennent un site BamHl, les amorces anti-sense (rev) contiennent un site Avril. Les sites introduits sont soulignés. Les sites internes BamHl dans le gène ACL2 on été éliminés par la modification d'une base (en gras) au site BamHl. Les sites BamHl, BamHl mutés et ^vrll sont soulignés. Figure 7 : Schéma de la stratégie adoptée pour l'amplification du gène ACL2 de Y. Upolytica tout en éliminant les deux sites de restrictions BamHl.
Figure 8 : Représentation schématique de la construction des souches mutantes de Y. Upolytica à partir de la souche JMY2853 (A) et JMY3431 (B) selon la présente invention et leur génotype.
Figure 9 : (A) Souches mutantes de levure Y. Upolytica obtenues à partir de la souche JMY2853 (Ura-, Leu-) par surexpression ou délétion d'un gène cible. Les résultats des modifications génétiques sur la production d'acide ricinoléique sont représentés en pourcentage par rapport à la souche JMY2556. La souche JMY2556 (Ura+, Leu-) a été utilisée comme contrôle car elle présente les mêmes auxotrophies que les souches construites. (B) Souches mutantes de levure Y. Upolytica obtenues à partir de la souche JMY3431 (Ura-, Leu-) par surexpression d'un gène cible. Les résultats des modifications génétiques sur la production d'acide ricinoléique sont représentés en pourcentage par rapport à la souche JMY3030. * + : surexpression ; - : délétion.
Figure 10 : Comparaison de la quantité (en μg/mL de culture) d'acide ricinoléique produit en néosynthèse par les souches dérivantes de la souche (A) JMY2556 et par les souches dérivantes de la souche (B) JMY3431 (JMY3030).
Figure 11 : (A) Représentation schématique de différentes protéines chimères entre une désaturase (en gris) et une hydroxylase (en noir). (B) Composition lipidique de différentes souches après 96h de culture en fiole contenant 5% de glucose (YED5) pour les souches mutantes de levure QPF-CpFAH12, QPF-H2_hyd, QPF-H2/H3_hyd et QPF- H2/H3 Jiyd Cterm.
EXEMPLE I : OBTENTION ET CARACTÉRISATION D'UNE SOUCHE MUTANTE DE LEVURE Y. UPOLYTICA MATRICE POUR L'OBTENTION D'AUTRES SOUCHES MUTANTES DE LEVURE ; SOUCHES MUTANTES DE LEVURE OBTENUES À PARTIR DE LADITE SOUCHE DE LEVURE MATRICE ET CAPABLES DE SYNTHÉTISER DE L'ACIDE RICINOLÉIQUE
1) Matériel et méthodes
i) Souches et milieux
Les souches mutantes de Y. Upolytica sont dérivées de la souche auxotrophique de
Y. Upolytica Pold (Leu" Ura" ; CLIB 139 ; de génotype MatA Ura3~302, Leu2~270, xpr2-322), elle-même dérivée de la souche sauvage de Y. Upolytica W29 (de génotype MatA ; ATCC 20460) par modification génétique. Les souches Pold et W29 ont été décrites par Barth et Gaillardin (1996). Les souches utilisées pour l'obtention des souches selon la présente invention sont présentées dans le tableau de la Figure 1. Leur construction est représentée à la Figure 2 et décrite en détail ci-dessous.
Le milieu et les conditions de culture de Y lipofytica ont été décrits par Barth et Gaillardin (1996). Un milieu riche (YPD), un milieu minium + glucose (YNB) et un milieu minimum + casaminoacides (YNBcasa) ou uracile (YNBura) ont été préparés comme décrit par Mlickova et al. (2004). Le milieu minimum (YNB) contient 0, 17% (p/v) de base azotée de levure (sans acide aminé et sulfate d'ammonium, YNBww; Difco, Paris, France), 0,5% (p/v) de NH4Ci, 0,1% (p/v) d'extrait de levure (Bacto-DB) et 50 mM de tampon phosphate (pH 6,8). Le milieu glucose pour la néosynthèse de l'acide ricinoléique (YED5) contient 1% (p/v) d'extrait de levure (Bacto-DB) et 5% (p/v) de glucose.
La souche d' Escherichîa coli Machl-Tl (Invitrogen) a été utilisée pour la transformation et l'amplification de l'ADN plasmidique recombinant. Les cellules ont été cultivées sur un milieu LB (Sambrook et ai, 1989). La Kanamycine (40 μg/mL) a été utilisée pour la sélection des plasmides.
ii) Techniques générales de biologie moléculaire
Les techniques de biologie moléculaire standards, bien connues de l'homme du métier, ont été utilisées. Les enzymes de restriction ont été obtenues auprès de New England Biolabs (Evry, France). L'ADN génomique des transformants de levure a été obtenu comme décrit par Querol et al (1992). Un cycleur thermique (Applied Biosystem 2720) et les ADN poiymérases Taq (Takara, Shiga, Japon) et Pyrobest (Takara, Shiga, Japon) ont été utilisés pour l'amplification PCR. Les fragments amplifiés ont été purifiés avec le kit de purification QIAgen (Qiagen, Hilden, Allemagne) et les fragments digérés d'ADN ont été récupérés à partir de gels d'agarose avec le kit d'extraction de gel QIAquick (Qiagen). L'ensemble de programmes STADEN (Dear et Staden, 1991) a été utilisé pour l'analyse des séquences. La transformation des cellules de levure a été réalisée par la méthode à l'acétate de lithium (Gaillardin et al, 1985).
iii) Construction de souches de Y. lipofytica disruptées et excision du marqueur Les cassettes de délétion ont été produites par amplification par PCR comme décrit par Fickers et al (2003) en utilisant les couples d'amorces décrits par Beopoulos et al. (2008 et 2012) et à la Figure 3. Les cassettes PT (voir Fickers et al, 2003) ont ensuite été insérées dans le vecteur PCR4RBlunt-TOPO (Life Technologies, Carlsbad, Californie) et le marqueur auxotrophe (URA3 ou LEU2) a ensuite été inséré par clonage au niveau du site Iscel des vecteurs pour générer les vecteurs JME correspondants (PUT ou PLT) (voir Figure 1). Les cassettes de disruption PUT et PLT ont été introduites dans le génome de Y. lipofytica par transformation par la méthode à l'acétate de lithium. Les transformants Ura+ et Leu+ ont été sélectionnés sur les milieux YNBcasa et YNBura, respectivement. Les amorces ylA12-verl et ylA12-ver2 correspondantes (voir Figure 3) ont été utilisées pour vérifier la disruption du gène par amplification PCR des loci génomiques. L'excision des marqueurs a été réalisée en utilisant le système de recombinase Cre-lox par transformation avec le plasmide réplicatif pUB4-Crel (JME547) comme décrit par Fickers et al. (2003). Les souches ont ensuite été curées du plasmide par réplications successives sur milieu riche.
iv) Clonage et expression des hydroxylases et acyltransférases hétérologues sous le contrôle du promoteur constitutif TEF
Les gènes d'intérêt ont été placés sous le contrôle du promoteur constitutif TEF de
Yarrowia llpolytica (Muller et al, 1998). Les codons des gènes hétérologues codant pour une hydroxylase et une acyltransferase ont été optimisés pour une expression dans la levure et synthétisé par Genscript (New Jersey, USA). Les gènes codant ont ensuite été insérés entre les sites de restriction BamHl-Avrll du vecteur d'expression dérivé de JMP62 contenant le promoteur pTEF et le marqueur de sélection URA3ex (JME1046) décrit par Nicaud et al. (2002). Les vecteurs JMP62 contenant le marqueur de sélection LEU2ex ont été obtenus par le remplacement du marqueur à l'aide du site de restriction Iscel en amont / aval d'URA3ex dans le vecteur JME802 (Fickers et al, 2003 ; Nicaud et al , 2002). Les plasmides ont été digérés par Notl préalablement à la transformation. Les transformants ont été sélectionnés par auxotrophie sur le milieu minimal adéquat.
v) Analyse des lipides
Les lipides de l'équivalent de 10 unités DO de cellules en culture lyophilisées ont été extraits par la procédure décrite par Folch et al (1957) pour l'analyse CCM (chromato graphie sur couche mince) ou ont été directement convertis en leurs esters méthyliques pour l'analyse GC, tel que décrit par Browse et al. (1986). L'analyse GC des esters méthyliques d'acides gras (EMAG) a été réalisée sur un chromatographe en phase gazeuse (Varian 3900) équipé d'un détecteur à ionisation de flamme et d'une colonne Varian FactorFour vf-23ms, avec une spécification de lavage à 260°C de 3pA (30 m, 0,25 mm, 0,25 μιΐϊ). Les acides gras (AG) ont été identifiés par comparaison avec les esters méthyliques d'acides gras standards commerciaux (FAME32, Supelco; ricinoléate de méthyîe, Sigma) et quantifiés par la méthode standard interne avec l'ajout de 50 g de Cl 7:0 commercial (Sigma).
L'analyse des surnageants de culture a été réalisée comme suit : un volume de culture est mélangé à un volume d'isopropanol, centrifugé (1 minute 13 000 rpm) et filtré sur 0.2μ. Vingt microlitre du mélange sont injectés en HPLC avec détection UV 254 nm sur une colonne en phase reverse Cl 8 (Luna® 5 μιιι Cl 8(2) 100 Â, LC Column 151 x 4.6 mm, Ea) à 40°C avec comme éîuant un mélange Méthanol/Eau/acide trifluoroacétique 90/10/0.3 à lmL/min.
vi) Analyse des lipides par chromatographie sur couche mince (CCM)
Des plaques CCM pré-revêtues (silice G60, 20 x 20 cm, 0,25 mm d'épaisseur) de Merck (Allemagne) ont été utilisées. Les classes de lipides ont été séparées avec le solvant hexane / éther éthylique / acide acétique, 80/20/1 (v/v/v). Pour la révélation, les plaques ont été pulvérisées avec 1% de vanilline sulfurique dans de l'éthanol et incubées à 105°C pendant 10 min. Les différentes classes de lipides ont été identifiées à l'aide d'étalons commerciaux (Nu-chek, USA).
2) Résultats
i) Comparaison de l'expression hétérologue des oléate hydroxylases de Claviceps purpurea (CpFAH12) et de Ricinus communis (RcFAHH) pour la production de d'acide ricinoléique
Pour évaluer les capacités enzymatiques des oléate (Δ12) hydroxylases de plante (R. communis) et de champignon (C. purpurea) à synthétiser des acides gras hydroxylés dans Y. lipolytica, les gènes codant RcFAH12 et CpFAH12 ont été exprimés indépendamment l'un de l'autre, sous le promoteur constitutif fort pTEF, dans différents fonds génétiques de Y. lipolytica.
Les séquences codantes de RcFAH12 et CpFAH12 ont été optimisées pour leur expression dans la levure (SEQ ID NO : 21 et 22 respectivement).
Afin d'éviter la conversion d'acide oléique en acide linoléique par la désaturase endogène de Y. lipolytica, le gène de Y. lipolytica codant la Δ12 désaturase endogène (FAD2 ; YALI0B10153g) a été délété avant l'expression hétérologue des oléate hydroxylases. Cette délétion a été effectuée à la fois dans la souche Pold et la souche JMY1233 (poxl-6 ). Les mutants obtenus, dénommés JMY1366 et JMY1762 respectivement, ont été incapables de synthétiser de l'acide linoléique.
La souche JMY2159 rassemblant les délétions invalidant la β-oxydation (poxl-6A), la synthèse des TAG (dgalA dgalA IrolÂ) et la désaturation Δ12 (fad2A) est nommée PQF pour simplification.
Les cultures ont été effectuées en mode batch sur un milieu contenant du glucose (YED5), en favorisant la néosynthèse des lipides. Comme le montre la Figure 4 A, les mutants fad2Â exprimant l'hydroxylase de ricin (RcFAH12) ont réussi à synthétiser et accumuler de l'acide ricinoléique à seulement 0,3% de ses lipides totaux, indépendamment de leur aptitude à réaliser une β-oxydation (souches JMY1760 et JMY1763). La souche mutante délétée des TAG acyltransférases exprimant RcFAH12 (JMY2331) contient 7% d'acide ricinoléique, ce qui suggère que l'absence d'activité enzymatique dans les constructions précédentes est due en grande partie à l'indisponibilité du substrat (acide oléique estérifié en TAG). La construction homologue exprimant la CpFAH12 (JMY2324) contenait jusqu'à 29% d'acide ricinoléique (Figure 4A). Ces résultats démontrent que l'enzyme fongique est plus performante dans Y. lipolytica que l'enzyme de plante.
En outre, toutes les souches testées ont été capables de synthétiser de l'acide linoléique (Cl 8:2), en raison du potentiel bien connu des enzymes oléate hydroxylases à posséder une activité bi fonctionnelle hydroxylation / désaturation. Chez les souches exprimant RcFAH12, l'acide linoléique s'élevait à 0,5% des lipides totaux, alors que pour les souches exprimant CpFAH12 ce pourcentage s'élevait à 15% des lipides totaux. Le rapport de l'hydroxylation sur l'activité de désaturation, ne semble pas seulement être spécifique de l'espèce, mais est aussi lié à l'activité enzymatique. Il était de 10:1 pour la souche PQF-RcFAH12 (JMY2331) et 2:1 pour la souche PQF-CpFAH12 (JMY2324).
ii) Amélioration de la production d'acide ricinoléique: augmentation du nombre de copies des hydroxylases et co~expression avec des acyltransférases spécifiques de l'acide ricinoléique
L'expression d'une copie supplémentaire de l'hydroxylase CpFAH12 dans le même contexte génétique (JMY251 1) a permis d'obtenir une souche mutante produisant de l'acide ricinoléique à hauteur de 35% de ses lipides totaux (Figure 4B). Ces résultats démontrent que l'efficacité de l'hydroxylation est associée au nombre de copies exprimées. En outre, pour les souches exprimant CpFAH12 le pourcentage d'acide linoléique s'élève à 15% et 21% des lipides totaux en fonction de la simple ou double surexpression de CpFAH12 respectivement (souches JMY2324 et JMY2511). Là aussi, le rapport de l'hydroxylation sur l'activité de désaturation ne semble pas seulement être spécifique de l'espèce, mais est aussi lié à l'activité enzymatique. Il était de 2:1 pour la souche PQF-CpFAH12 (JMY2324) et de 1,5:1 pour la souche PQF-CpFAH12x2 (JMY2511). Cependant, la fraction d'acides gras C18 insaturés (acide oléique, acide linoléique et acide ricinoléique) est restée constante et a représenté environ 70% des lipides totaux pour toutes les souches testées. En termes d'accumulation de lipides, la souche fad2A~RcFÀH12 (JMY1760) a accumulé des lipides jusqu'à 4% du son poids sec, alors que pour la souche poxl-6Afad2A-RcFAH12 (JMY1763) l'accumulation de lipides a atteint 7% du poids sec. Toutes les souches dérivées de PQF ont accumulé des lipides à environ 5% du poids sec.
Pour déterminer si le niveau de la synthèse d'acide ricinoléique est lié à la capacité d'accumulation des souches de levure, il a été exprimé de manière indépendante, sous le contrôle du promoteur pTEF, l'acyîtransférase spécifique de l'acide ricinoléique DGAT2 de R. communis (RcDGAT2) et de C. pur pur ea (CpDGAT2) respectivement, dans la souche PQF-CpFÀH12. Les séquences codantes de RcDGAT2 et CpDGAT2 ont été optimisées pour leur expression dans la levure (SEQ ID NO : 23 et 24 respectivement). Il a aussi été surexprimé dans la souche PQF-CpFAHl 2 l'acyîtransférase Y1LR01 native qui utilise le groupe sn-2 des phospholipides où se produit l'hydroxylatîon comme le donneur d'acyle pour l'estérification des TAG. La composition en acides gras des mutants exprimant l'acyîtransférase est présentée à la Figure 4B. Une diminution significative de 2 fois le niveau d'acide ricinoléique a été observée dans la souche co-exprimant CpFAH12-RcDGAT2 (JMY2329), en comparaison à la souche parente exprimant hydroxylase de C. purpurea (JMY2324), accumulant de l'acide ricinoléique à seulement 14% des lipides totaux. Les deux souches ont accumulé des lipides jusqu'à 5% de leur poids sec, mettant en évidence la baisse importante de la quantité d'acide ricinoléique produite lorsque l'acyîtransférase DGAT2 de R. communis est exprimée. Dans la souche co-exprimant FAH12/DGAT2 de C. purpurea (JMY2517) seulement 5% d'acide ricinoléique a été détectée (environ 5% des lipides totaux). Concernant la souche co-exprimant FAH12/DGAT2 de R. communis (JMY2235) l'accumulation de RA était de 2,5%» des lipides totaux (environ 5% de lipides totaux), qui correspond à une diminution de 3 fois par rapport à la souche parentale n'exprimant pas la RcDGAT2 (JMY2231). Toutes les souches exprimant DGAT étaient cependant capables de former du TAG, bien que de l'acide ricinoléique n'ait pas été détectée dans cette fraction. Ces résultats démontrent que la spécificité vis-à-vis de l'acide ricinoléique des DGATs de R. communis et C. purpurea est altérée lorsqu'elles sont exprimées dans Y. lipolytica. Néanmoins, la souche CpFAH12 sur-exprimant l'acyîtransférase LROl native de Y, lipolytica (JMY2556 [Ura+, Leu-] ou JMY2853 [Ura-, Leu-], le numéro de la souche variant selon les auxotrophies) a accumulé de l'acide ricinoléique jusqu'à 42% de ses lipides totaux, avec une fraction représentant 20% de l'acide ricinoléique total, estérifié en TAG. Cela correspond à une augmentation de 1 ,4 fois de l'accumulation d'acide ricinoléique par rapport à la souche parentale (JMY2511). L'accumulation de lipides a atteint 13% du poids sec des cellules, correspondant à une augmentation de 2,5 fois par rapport aux souches n'exprimant pas LROl . La quantité d'acide ricinoléique produite a atteint 700μ§/ιηΙ. (ou 63mg/g de poids sec). En accord avec les résultats précédents, dans toutes les souches testées l'oléate hydroxylase est capable de continuer la réaction d'hydroxylation suivant la formation de l'acide linoléique (22%), mais avec un ratio d'hydroxylation sur la désaturation s'élevant à 2: 1.
La souche JMY2853 a servi comme souche de levure matrice pour la surexpression en multicopie des gènes codant les enzymes CpFAH12 et Y1L 01. Une souche comprenant 3 copies de CpFAH12 et 2 copies de l'acyltransferase YlLROl a été obtenue (souche JMY3030). Elle produit jusqu'à 53% d'acide ricinoléique en néosynthèse sur un milieu glucose.
EXEMPLE II : PRODUCTION D'ACIDE RICINOLÉIQUE PAR LA SOUCHE DE LEVURE Y. LIPOLYTICA JMY3030 EN FERMENTEUR EN MODE FED-BATCH
La souche JMY3030 (contenant 3 copies de CpFAH12 et 2 copies de YlLROl) a été utilisée en fermenteur de 10 L (4 L de volume liquide). En fermenteur, les conditions de culture sont parfaitement contrôlées (régulation du pH, de la température et de l'aération). La quantité de biomasse et donc de cellules productrices est alors améliorée ce qui permet d'augmenter la production de l'acide ricinoléique.
La fermentation a été conduite en mode fed-batch, avec du glucose comme source carbonée pour la croissance et de l'acide oléique comme substrat de bioconversion.
La culture a été réalisée sur le milieu minimum optimisé pour Yarrowia lipoïytica (synthétique), avec ajout d'oligoéléments, de fer et de vitamines, tel que décrit dans la Demande Internationale WO 2007/144445, avec 160 g/L de glucose et 24 g/L d'acide oléique au total et un pH régulé à 6 avec de l'acide orthophosphorique et de l'ammoniac.
La culture a été ensemencée à une concentration en biomasse de 0,48 g/L et le taux de croissance moyen a été de 0,19 h"1. La concentration cellulaire a atteint 90 gCdw/L. Quatre ajouts contrôlés d'acide oléique ont été réalisés, d'abord par ajout d'émulsion d'acide oléique à 20% (v/v) puis d'acide oléique non émulsionné (pur à 80%).
La concentration finale d'acide ricinoléique produit est de 12 g/L, avec une pureté de 60% sur les lipides totaux.
L'acide ricinoléique est sécrété dans le milieu de culture, le pourcentage dans le surnageant est plus élevé en début de culture (où près de 95 % de l'acide ricinoléique se trouve dans la partie surnageant) qu'en fin de culture ou il reste majoritaire dans le surnageant mais sa proportion diminue jusqu'à 78% (voir Figure 5). EXEMPLE III : MODIFICATIONS GENETIQUES DE LA SOUCHE DE LEVURE Y. LIPOLYTICA JMY2853 (JMY2556) POUR AUGMENTER SA PRODUCTION D'ACIDE RICINOLÉIQUE
Des gènes susceptibles d'augmenter la néosynthèse de l'acide ricinoléique ont également été identifiés. Ces nouveaux gènes cibles ont fait l'objet de nouvelles constructions de souches à partir de la souche matrice JMY2853.
L'insertion des gènes d'intérêt dans le vecteur JMP62-Ura3ex-pTEF est faite par l'amplification des gènes avec les amorces décrites à la Figure 6 dans lesquelles ont été introduites les séquences des enzymes de restriction BamHI et Avril aux extrémités 5' et 3' respectivement. Les plasmides et les produits de PC sont digérés par les enzymes et ligaturés pour obtenir les vecteurs d'expression.
Pour le gène YIACL2 qui contient deux sites de restriction BamHI, des mutations ont été introduites permettant d'éliminer ces sites (voir Figure 7).
Les vecteurs d'expression ont été vérifiés par séquençage.
Les constructions des autres vecteurs d'expression contenant les gènes
Phospholipase A2 (YALIOFlOOlOg), TGL5 (YALIOD 16379g), LCAT3 (YALI0C14036g) et LR02 (YALI0E08206g) ont été réalisées à partir de gènes synthétiques directement synthétisés et clonés (Euro fins).
Certaines souches mutantes obtenues présentent des résultats significatifs aussi bien dans la bioconversion de l'acide oléique en acide ricinoléique que dans l'accumulation des lipides produits. Leur construction est représentée à la Figure 8A et les résultats de ces souches mutantes sont présentés à la Figure 9A et 10A.
EXEMPLE IV : MODIFICATIONS GENETIQUES DE LA SOUCHE DE LEVURE Y. LIPOLYTICA JMY3431 (JMY3030) POUR AUGMENTER SA PRODUCTION D'ACIDE RICINOLÉIQUE
Les gènes susceptibles d'augmenter la néosynthèse de l'acide ricinoléique identifiés ont fait l'objet de nouvelles constructions de souches à partir de la souche matrice JMY3431.
L'insertion des gènes d'intérêt dans le vecteur JMP62-Ura3ex-pTEF est faite par l'amplification des gènes avec les amorces décrites à la Figure 6 dans lesquelles ont été introduites les séquences des enzymes de restriction BamHI et Avril aux extrémités 5' et 3' respectivement. Les plasmides et les produits de PCR sont digérés par les enzymes et ligaturés pour obtenir les vecteurs d'expression.
Les vecteurs d'expression ont été vérifiés par séquençage. Certaines souches mutantes obtenues présentent des résultats significatifs aussi bien dans la bioconversion de l'acide oléique en acide ricinoléique que dans l'accumulation des lipides produits. Leur construction est représentée à la Figure 8B et les résultats de ces souches mutantes sont présentés à la Figure 9B et 10B.
EXEMPLE V : EVOLUTION DE L'OLÉATE DÉSATURASE D'F. LIPOLYTICA EN OLÉATE H YDROX YL A SE
De manière à obtenir un microorganisme ne contenant pas de gènes provenant d'une espèce différente, il a été envisagé de transformer la désaturase de Y. lîpofytica en hydroxylase. En effet, les hydroxylases et les désaturases sont des enzymes homologues qui appartiennent à la même famille de protéine et qui partagent une forte similarité, tant dans leur séquence que dans leur fonction : toutes deux modifient l'acide oléique (soit en créant une désaturation soit en créant une hydroxylation).
Cependant P hydroxylase de C. purpurea et la désaturase de Y, lipolytica venant de deux organismes différents, elles ne partagent que 47% d'acides aminés identiques. Il a donc été choisi de travailler dans un premier temps avec la désaturase de C. purpurea qui possède 86 % d'acides aminés identiques à ceux de son hydroxylase. Ainsi, la différence de fonction entre la désaturase et Phydroxylase de ce champignon est contenue dans les 14% de séquences divergentes entre ces deux enzymes.
Des chimères entre la désaturase de C. purpurea (CpFAD2) et Phydroxylase de C. purpurea (CpFAH12) ont été construites et exprimées dans la souche poxl~6AdgalAlrolAdga2Afad2A (notée QPF). La représentation de ces protéines chimères est schématisée à la Figure 1 1 A. Les domaines H2 (acides aminés 189 à 233), H3 (358-434) et H3 Cterm (358-477) de Phydroxylase CpFAH12 ont été intégrés dans la désaturase (CpFAD2). Ces domaines ont été identifiés comme cruciaux dans la fonction d'hydroxylation de la protéine. Les séquences peptidiques correspondant à ces chimères sont les séquences SEQ ID NO : 49 (H2-hyd), 50 (H2/H3-hyd) et 51 (H2/H3-hyd Cterm).
Dans toutes les souches exprimant ces chimères une production d'acide ricinoléique a pu être observée (voir Figure 1 1B ), celle-ci représentant 2% des acides gras pour la souche QPF-H2_hyd, 20% pour la souche QPF-H2/H3 Jiyd, et 30% pour la souche QPF-H2/H3_hyd Cterm. Cette dernière souche permet de retrouver un niveau d'hydroxylation identique à celui obtenu avec la souche exprimant Phydroxylase CpFAH12. (29% d'hydroxylation).
Une exploration plus poussée des résidus d'acide aminé responsables de la fonction d'hydroxylation de l'enzyme a permis d'identifier plus précisément trois positions dans la fonction d'hydroxylation. Une souche exprimant un variant de la désaturase CpFAD2 combinant seulement 3 mutations (CpFAD2 A197G, T198I, et A370C) permet d'obtenir 10% d'hydroxylation contre 29% pour l'hydroxylase CpFAH12.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse utile comme souche de levure matrice pour l'obtention d'autres souches mutantes de levure oléagineuse comprenant :
(a) inhibition de la bêta-oxydation des acides gras dans ladite souche,
(b) l'inhibition de l'expression ou de l'activité d'une ou plusieurs des acyl- CoA:diacylglycérol acyltransférases endogènes de ladite souche,
(c) l'inhibition de l'expression ou de l'activité de oléate désaturase endogène de ladite souche, et éventuellement
(d) l'inhibition de l'expression ou de l'activité d'une phospholipide:diacylglycérol acyltransférase endogène de ladite souche.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inhibition de la bêta- oxydation des acides gras définie à l'étape (a) est obtenue par :
l'inhibition de l'expression ou de l'activité des acyl-CoA oxydases endogènes de ladite souche et/ou
l'inhibition de l'expression ou de l'activité de l'enzyme multifonctionnelle ayant les activités 3-hydroxyacyl-CoA déshydrogénase et énoyl-CoA hydratase endogène de ladite souche et/ou
l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 3-oxoacyl-CoA thiolase endogène de ladite souche.
3. Procédé d'obtention d'une souche mutante de levure oléagineuse capable de synthétiser un acide gras oméga-9 inhabituel, comprenant les étapes (a) à (c) définies à la revendication 1, éventuellement l'étape (d) définie à la revendication 1, et en outre l'expression dans ladite souche d'une enzyme hétéroîogue présentant une activité oléate hydroxylase ou oléate époxydase.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la souche mutante de levure appartient au genre choisi parmi Candida, Cryptoccocm, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporon ou Yarrowia.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la souche mutante de levure est une souche mutante de Yarrowia lipolytica.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que l'acide gras oméga-9 inhabituel est l'acide ricinoléique et en ce qu'il comprend l'expression dans ladite souche d'une enzyme hétérologue présentant une activité oléate (Δ12) hydroxylase.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'enzyme présentant une activité oléate (Δ12) hydroxylase est une oléate (Δ12) hydroxylase ou une oléate (Δ12) désaturase mutée pour qu'elle présente une activité oléate (Δ12) hydroxylase.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que Poléate (Δ12) hydroxylase est l'oléate (Δ12) hydroxylase de Ricinus communis (RcFAH12) ou provient d'un champignon de la division des ascomycètes.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'oléate (Δ12) hydroxylase provient d'un champignon de la famille des Clavicipitaceae, de préférence du genre Claviceps et de préférence encore de l'espèce Claviceps purpurea (CpFAH12).
10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'oléate (Δ12) désaturase mutée provient d'un champignon de la famille des Clavicipitaceae, de préférence du genre Claviceps et de préférence encore de l'espèce Claviceps purpurea (CpFAD2) ou provient d'une levure de la famille des hémiascomycètes, de préférence du genre Yarrowia et de préférence encore de l'espèce Yarrowia lipolytica (Y1FAD2).
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la surexpression dans ladite souche d'une enzyme capable de catalyser la formation du triacylglycérol (TAG) à partir du 1 ,2-^-diacylglycérol.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'enzyme capable de catalyser la formation du TAG à partir du 1 ,2-,ïR-diacylglycérol est une phospholipide:diacylglycérol acyltransférase (PDAT), de préférence la PDAT endogène de ladite souche.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre :
la surexpression d'une monoacylglycérol acyltransférase et/ou
la surexpression d'une patatin-like triacylglycérol lipase et/ou
l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la 2-méthylcitrate déshydratase endogène de ladite souche et/ou la surexpression d'au moins une des deux sous-unités d'une ATP citrate lyase et/ou
la surexpression d'une diacylglycérol:choline-0 phosphotransférase et/ou la surexpression d'une éthanolamine phosphotransférase et/ou
la surexpression d'une phospholipase A2 et/ou
la surexpression d'une acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltransférase et/ou
la surexpression d'une cytochrome-bs réductase et/ou la surexpression d'une inositol/phosphatidyl inositol phosphatase et/ou la surexpression d'une élongase.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que toutes les enzymes surexprimées sont endogènes de ladite souche.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que l'acide gras oméga-9 inhabituel est l'acide vernolique et en ce qu'il comprend l'expression dans ladite souche d'une enzyme hétéroîogue présentant une activité oléate (Δ12) époxydase.
16. Souche mutante de levure oléagineuse caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par le procédé défini à l'une quelconque des revendications 1 à 15.
17. Utilisation d'une souche mutante de levure susceptible d'être obtenue par le procédé défini à l'une quelconque des revendications 3 à 15 pour la production d'un acide gras oméga-9.
18. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que l'acide gras oméga-9 est l'acide ricinoléique et en ce que la souche mutante de levure est susceptible d'être obtenue par le procédé défini à l'une quelconque des revendications 6 à 14.
19. Procédé de production d'acide gras oméga-9, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de culture sur un milieu approprié d'une souche mutante de levure susceptible d'être obtenue par le procédé défini à l'une quelconque des revendications 3 à 15.
20. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'acide gras oméga-9 est l'acide ricinoléique et en ce que la souche mutante de levure est susceptible d'être obtenue par le procédé défini à l'une quelconque des revendications 6 à 14.
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