JP6294827B2 - 操作された微生物および微生物油生成のための方法 - Google Patents

操作された微生物および微生物油生成のための方法 Download PDF

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Description

関連出願
本願は、いずれも表題を「操作された微生物および微生物油生成（Engineered Microbes and Methods for Microbial Oil Production）」とする2011年10月19日に出願された米国仮特許出願U.S.S.N. 61/548,901、および2012年6月22日に出願された米国仮特許出願U.S.S.N. 61/663,263に対する35 U.S.C. §119に基づく優先権を主張し、これらの各々の全内容は、本明細書において参考として援用される。
政府の支援
本発明は、米国エネルギー省により与えられた助成金番号DE-AR0000059に基づく政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
背景
持続可能に生成されるバイオ燃料は、化石燃料に対する代替物であり、化石燃料に関連する汚染および温室効果ガス放出を回避しつつ、容易にアクセス可能な化石燃料のストックの枯渇を緩和し、それにより入手可能なエネルギーに対する増大する要求を持続可能な方法において満たすために役立ち得る。炭素源の脂質への効率的な転換のために好適な方法および油を生成する生物の開発は、微生物によるバイオ燃料生成の広範な実行のための必須条件である。
発明のある側面の要旨
従属栄養生物による微生物油生成は、高い転換収率を達成することができることを前提として、費用対効果の高い再生可能な資源からのバイオ燃料の生成のための最も有望な方針である。再生可能な原料からの費用対効果の高い微生物油生成への手掛かりは、炭水化物から油への高い転換収率である。代謝工学は、この目的のために適用される授権技術として現れ、化学物質、医薬および燃料生成物の合成における微生物生体触媒の性能を著しく改善した成功した経路の工学の多くの例が存在する。
微生物を油の生成のために操作することにおける先の努力は、脂肪酸合成経路における推定される速度制御のステップを増幅することに焦点を当ててきた。かかる増幅の１つの著しい欠陥は、脂肪酸合成経路中への炭素フラックスを増大することが、細胞における飽和脂肪酸のレベルを増大させ、これが、脂肪酸生合成の強力なネガティブフィードバックループを活性化することである。
本開示の幾つかの側面は、上流の、代謝物形成経路（本明細書において「プッシュ（push）」代謝経路としても言及される）の増幅と、下流の、生成物を隔離する経路（本明細書において「プル（pull）」経路としても言及される）とを組み合わせる微生物工学のための戦略を提供する。本発明の幾つかの側面は、微生物におけるプッシュ−および−プル改変の均衡のとれた組み合わせにより、中間代謝物の濃度をそれらの恒常的な生理学的レベルから著しく解離させることなく、したがって脂質合成のフィードバック阻害を回避しつつ、脂質合成経路への炭素フラックスの大きな増幅をもたらすことを提供する。
本開示の幾つかの側面は、一本枝（single-branch）改変、例えば転換効率に対するプッシュのみの改変またはプルのみの改変の効果は、典型的には、細胞における合成収率の代償的な調節の所為で限定され、微生物細胞における脂質生合成のプッシュおよびプルステップの一致した改変は、脂質合成に対して驚くべき相乗効果をもたらすという認識に関する。
例えば、本開示の幾つかの側面は、それらの脂質生合成経路における改変の組み合わせ（本明細書においてまたプッシュ−プル改変として言及される）を含む、遺伝子改変された含油性微生物を提供する。一部の態様において、本明細書において提供される微生物は、脂質合成のために必要とされる代謝物または中間体の生成の増大をもたらす改変、および、脂質合成の生成物、例えばトリアシルグリセロールの、細胞内における貯蔵形態の脂質への隔離をもたらし、それにより、その生成物の一部による、例えば脂肪酸またはジアシルグリセロールによる脂質合成のフィードバック阻害を緩和する改変を含む。一部の態様において、代謝のプッシュおよび代謝のプル経路の改変の組み合わせは、脂質生成の相乗的な増大をもたらす。一部の態様において、プッシュ改変は、細胞における脂質合成の構成単位、または脂質合成のための代謝物のレベルの増大をもたらす。一部の態様において、プル改変は、脂質合成に対するフィードバック阻害を緩和する。
本発明の幾つかの側面は、脂質生合成のプッシュ−およびプル経路に同時に影響を及ぼす遺伝子改変を含む微生物を提供する。例えば、プッシュおよびプル改変を、油生成のためのモデル微生物である含油性酵母Yarrowia lipolytica中に導入した。トリグリセリド（TAG）合成経路の最終ステップであるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGA1）の過剰発現を、例示的なプル改変として研究した。DGA1の過剰発現は、対照微生物に対して４倍の、乾燥細胞重量（DCW）の３３．８％の脂質含有量までの、脂質生成の増大をもたらした。脂肪酸合成の第１の関係するステップであるアセチル−CoAカルボキシラーゼ（ACC1）の過剰発現を、例示的なプッシュ改変として研究した。ACC1の過剰発現は、対照に対して２倍の、１７．９％の脂質含有量まで、脂質含有量を増大させた。タンデム遺伝子発現コンストラクトからのACC1およびDGA1の同時共発現を、例示的なプッシュ−プル改変として研究した。同時のACC1およびDGA1の過剰発現は、さらに、脂質含有量を４１．４％まで増大させ、ACC1＋DGA1共発現の相乗効果を示した。
ACC1＋DGA1形質転換体の脂質生成の特徴を、２Ｌのバイオリアクター発酵において調査し、１２０時間後に、６１．７％の脂質含有量を達成した。全体的な収率および生産力は、それぞれ、０．１９５ｇ／ｇおよび０．１４３ｇ／Ｌ／時間であり、一方、最大収率および生産力は、発酵の脂質蓄積期の間で０．２７０ｇ／ｇおよび０．２５３ｇ／Ｌ／時間であった。この研究は、含油性酵母Y. lipolyticaによる脂質生成のための優れた能力、および、フラックスを脂質合成へ向けるように作用しTAG合成のための駆動力を作り出す脂質合成経路の２つの重要なステップの代謝工学の効果を実証する。
本発明の幾つかの側面は、油を生成する微生物、例えば含油性酵母における使用のための、新規の過剰発現プラットフォームを提供する。本発明の幾つかの側面は、イントロンおよびコード配列を含む核酸配列の上流に位置する、コード配列およびイントロンを含む転写物の転写を駆動するプロモーター、例えば転写伸長因子（translation elongation factor）−１α（TEF）プロモーターを含む、発現コンストラクトを提供する。本開示の幾つかの側面は、かかるイントロン含有発現コンストラクトは、イントロンを含まないTEFプロモーターに対して、少なくとも１７倍発現を増大させることができることを提供する。
本開示の幾つかの側面は、DGA1遺伝子産物の発現を増大する遺伝子改変を含む単離された含油性細胞を提供する。一部の態様において、単離された含油性細胞は、ACC1遺伝子産物の発現を増大する遺伝子改変をさらに含む。一部の態様において、単離された含油性細胞は、SCD遺伝子産物の発現を増大する遺伝子改変をさらに含む。一部の態様において、単離された含油性細胞は、ACL遺伝子産物の発現を増大する遺伝子改変をさらに含む。一部の態様において、遺伝子改変は、遺伝子産物の発現を増大する核酸コンストラクトを含み、前記核酸コンストラクトは、（ａ）遺伝子産物をコードする核酸配列を、好適な同種（homologous）または異種（heterologous）のプロモーターの制御下において含む、発現カセット、ならびに／あるいは、（ｂ）細胞のゲノム中に挿入された場合に遺伝子産物の発現のレベルを調節する核酸配列を含む。一部の態様において、プロモーターは、誘導性または構成的プロモーターである。一部の態様において、プロモーターは、TEFプロモーターである。一部の態様において、発現コンストラクトはさらにイントロンを含む。一部の態様において、イントロンは、転写開始部位の下流にある。一部の態様において、イントロンは、遺伝子産物をコードする核酸配列内にある。一部の態様において、核酸コンストラクトは、遺伝子産物をコードするネイティブな遺伝子の天然の調節を阻害または破壊し、ネイティブな遺伝子の過剰発現をもたらす。一部の態様において、ネイティブな遺伝子の天然の調節の阻害または破壊は、調節領域もしくは調節領域の遺伝子の発現を調節する部分の、欠失、破壊、突然変異および／または置換により媒介される。一部の態様において、遺伝子産物は転写物である。一部の態様において、遺伝子産物はタンパク質である。一部の態様において、核酸コンストラクトは、細胞のゲノム中に挿入される。一部の態様において、遺伝子産物の増大した発現は、細胞に対して、炭素源の、脂質、例えば脂肪酸、脂肪酸誘導体および／またはトリアシルグリセロール（TAG）への転換のために有益な表現型を付与する。一部の態様において、有益な表現型は、脂肪酸プロフィールの改変、TAGプロフィールの改変、脂肪酸および／またはトリアシルグリセロールの合成速度の増大、転換収率の増大、細胞におけるトリアシルグリセロール蓄積の増大、および／または細胞の脂肪体におけるトリアシルグリセロール蓄積の増大を含む。一部の態様において、細胞の脂肪酸またはTAGの合成速度は、同じ細胞型の未改変の細胞と比較して、少なくとも２倍増大する。一部の態様において、細胞の脂肪酸またはTAGの合成速度は、同じ細胞型の未改変の細胞と比較して、少なくとも５倍増大する。一部の態様において、細胞の脂肪酸またはTAGの合成速度は、同じ細胞型の未改変の細胞と比較して、少なくとも１０倍増大する。一部の態様において、細胞は、約０．０２５ｇ／ｇ〜約０．３２ｇ／ｇの範囲の転換率において、炭素源を脂肪酸またはTAGに転換する（例えば生成される脂質のグラム数／消費される炭素源１グラム）。一部の態様において、細胞は、少なくとも約０．１１ｇ／ｇの転換率において、炭素源を脂肪酸またはTAGに転換する。一部の態様において、細胞は、少なくとも約０．１９５ｇ／ｇの転換率において、炭素源を脂肪酸またはTAGに転換する。一部の態様において、細胞は、少なくとも約０．２４ｇ／ｇの転換率において、炭素源を脂肪酸またはTAGに転換する。一部の態様において、細胞は、少なくとも約０．２７ｇ／ｇの転換率において、炭素源を脂肪酸またはTAGに転換する。一部の態様において、細胞は、脂肪体または液胞を含む。一部の態様において、細胞は、細菌細胞、藻類細胞、真菌細胞または酵母細胞である。一部の態様において、細胞は、含油性酵母細胞である。一部の態様において、細胞は、Y. lipolytica細胞である。
本開示の幾つかの側面は、含油性細胞、例えば本明細書において記載されるような含油性細胞を含む、培養物を提供する。一部の態様において、培養物はさらに炭素源を含む。一部の態様において、炭素源は、発酵性の糖を含む。一部の態様において、発酵性の糖はＣ６糖である。一部の態様において、炭素源は、グルコースを含む。一部の態様において、炭素源は、有機酸を含む。一部の態様において、有機酸は酢酸である。一部の態様において、酢酸は、少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、または少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌの濃度である。一部の態様において、炭素源は、アセタートを含む。一部の態様において、酢酸塩は、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌの濃度である。一部の態様において、アセタートは、少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌの濃度である。一部の態様において、アセタートは、少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌの濃度である。一部の態様において、アセタートは、少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌの濃度である。一部の態様において、アセタートは、少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌの濃度である。一部の態様において、培養物は、グリセロールを含む。一部の態様において、グリセロールは、約２％ｖｏｌ／ｖｏｌの濃度である。一部の態様において、培養物は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％の溶存酸素レベルを含む。一部の態様において、培養物は、ｐＨ７．０〜ｐＨ７．５の範囲内のｐＨを示す。一部の態様において、培養物は、硫酸アンモニウムを含む。一部の態様において、培養物は、硫酸アンモニウムおよび酢酸を１：２の比において含む。一部の態様において、培養物は、５ｇ／ｌ〜６０ｇ／ｌの脂質タイターを示す。一部の態様において、培養物は、０．０４ｇ／ｌ／ｈ〜０．６０ｇ／ｌ／ｈの脂質生成を示す。一部の態様において、培養物は、０．１ｇ／ｌ／ｈ〜１ｇ／ｌ／ｈの最大脂質生産力を示す。
本開示の幾つかの側面は、炭素源を単離された含油性細胞と接触させること（細胞は、DGA1遺伝子産物の発現を増大する遺伝子改変を含む）；ならびに、前記細胞による炭素源の少なくとも部分的な脂肪酸またはトリアシルグリセロールへの転換のために好適な条件下において、細胞と接触させた炭素源をインキュベートすることを含む方法を提供する。一部の態様において、含油性細胞は、ACC1遺伝子産物の発現を増大する遺伝子改変をさらに含む。一部の態様において、含油性細胞は、SCD遺伝子産物の発現を増大する遺伝子改変をさらに含む。一部の態様において、含油性細胞は、ACL遺伝子産物の発現を増大する遺伝子改変をさらに含む。一部の態様において、単離された含油性細胞は、本明細書において記載されるような、操作された単離された含油性細胞である。一部の態様において、炭素源は、発酵性の糖を含む。一部の態様において、炭素源は、グルコースを含む。一部の態様において、炭素源は、アセタートを含む。一部の態様において、アセタートは、少なくとも１％ｖｏｌ／ｖｏｌ、少なくとも２％ｖｏｌ／ｖｏｌ、少なくとも３％ｖｏｌ／ｖｏｌ、少なくとも４％ｖｏｌ／ｖｏｌ、または少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌの濃度である。一部の態様において、炭素源は、酢酸を含む。一部の態様において、酢酸は、少なくとも５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、少なくとも１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、少なくとも１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、少なくとも２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、少なくとも２５％ｖｏｌ／ｖｏｌ、または少なくとも３０％ｖｏｌ／ｖｏｌの濃度である。一部の態様において、方法は、細胞を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％のレベルの溶存酸素と接触させることを含む。一部の態様において、接触させることおよび／またはインキュベートすることは、ｐＨ７．０〜ｐＨ７．５の範囲内のｐＨにおいて行われる。
７０．請求項５３〜６９のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、方法は、細胞を硫酸アンモニウムと接触させることを含む。一部の態様において、方法は、細胞を、１：２の比における硫酸アンモニウムおよび酢酸と接触させることを含む。一部の態様において、方法は、細胞をグリセロールと接触させることをさらに含む。一部の態様において、方法は、細胞を、約２％ｖｏｌ／ｖｏｌの濃度におけるグリセロールと接触させることを含む。一部の態様において、単離された含油性細胞と接触させた炭素源をリアクター中でインキュベートする。一部の態様において、流加回分プロセスにおいて、炭素源を、単離された含油性細胞と接触させ、炭素源の脂肪酸またはトリアシルグリセロールへの転換のためにインキュベートする。一部の態様において、連続的プロセスにおいて、炭素源を、単離された含油性細胞と接触させ、炭素源の脂肪酸またはトリアシルグリセロールへの転換のためにインキュベートする。一部の態様において、方法は、炭素源のさらなる量またはさらなる炭素源のある量を、単離された含油性細胞と接触させた炭素源と、インキュベーションステップの間に１回または２回以上接触させることをさらに含む。一部の態様において、脂肪酸またはトリアシルグリセロールを、単離された含油性細胞と接触させた炭素源から、溶媒抽出により抽出する。一部の態様において、溶媒抽出は、クロロホルムメタノール抽出を含む。一部の態様において、溶媒抽出は、ヘキサン抽出を含む。一部の態様において、脂肪酸またはトリアシルグリセロールを、単離された含油性細胞と接触させた炭素源から分離し、その後、エステル転移反応により精製する。
本開示の幾つかの側面は、含油性細胞において、該細胞においてDGA1遺伝子産物の発現を増大させることにより、脂肪酸プロフィール、トリアシルグリセロールプロフィール、脂肪酸合成速度、トリアシルグリセロール合成速度、脂肪酸誘導体蓄積の程度、脂肪酸誘導体分泌の速度、炭水化物から脂肪酸または脂肪酸誘導体への転換の速度、ならびに／あるいは、炭水化物から脂肪酸または脂肪酸誘導体への転換の効率的な収率を改変することを含む、方法を提供する。一部の態様において、方法は、細胞におけるACC1遺伝子産物、SCD遺伝子産物、および／またはACL遺伝子産物発現を増大させることをさらに含む。一部の態様において、脂肪酸誘導体蓄積の程度は、脂肪体における脂肪酸誘導体蓄積の程度である。一部の態様において、脂肪酸誘導体は、トリアシルグリセロールである。一部の態様において、含油性細胞における、脂肪酸プロフィール、トリアシルグリセロールプロフィール、脂肪酸合成速度、トリアシルグリセロール合成速度、脂肪酸誘導体蓄積の程度、脂肪酸誘導体分泌の速度、炭水化物から脂肪酸または脂肪酸誘導体への転換の速度、ならびに／あるいは、炭水化物から脂肪酸または脂肪酸誘導体への転換の効率的な収率を改変することは、前記含油性細胞において、脂肪酸合成速度、トリアシルグリセロール合成速度、脂肪酸誘導体蓄積の程度、脂肪酸誘導体分泌の速度、炭水化物から脂肪酸または脂肪酸誘導体への転換の速度、ならびに／あるいは、炭水化物から脂肪酸または脂肪酸誘導体への転換の効率的な収率を増大させることを含む。一部の態様において、細胞の炭水化物から脂肪酸または脂肪酸誘導体への転換の効率を改変することは、転換の効率を少なくとも２倍増大させることを含む。一部の態様において、細胞の炭水化物から脂肪酸または脂肪酸誘導体への転換の効率を改変することは、転換の効率を少なくとも３倍増大させることを含む。一部の態様において、細胞の炭水化物から脂肪酸または脂肪酸誘導体への転換の効率を改変することは、転換の効率を少なくとも４倍増大させることを含む。一部の態様において、細胞の炭水化物から脂肪酸または脂肪酸誘導体への転換の効率を改変することは、転換の効率を少なくとも５倍増大させることを含む。一部の態様において、細胞は、酵母細胞である。一部の態様において、酵母細胞は、Yarrowia sp.細胞である。一部の態様において、含油性酵母は、Y. lipolyticaである。
本開示の幾つかの側面は、以下：ａ）配列番号２（Y. lipolyticaのDGA1）をコードするヌクレオチド配列、またはｂ）ａ）のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。一部の態様において、配列番号２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１を含む。本開示の幾つかの側面は、本明細書において記載されるような単離された核酸分子および異種プロモーターを含む、発現カセットを提供する。一部の態様において、プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである。一部の態様において、異種プロモーターは、転写伸長因子（TEF）プロモーターである。一部の態様において、異種プロモーターは、イントロンを含む。一部の態様において、異種プロモーターは、開始コドンをさらに含む。一部の態様において、イントロンは、配列番号２をコードするヌクレオチド配列の翻訳開始部位の下流にある。本開示の幾つかの側面は、本明細書において記載されるような発現カセットを含むベクターを提供する。本開示の幾つかの側面は、本明細書において記載されるような発現カセット、または本明細書において記載されるベクターの少なくとも一部を含む、細胞を提供する。
本願の主題は、一部の場合において、関連する生成物、特定の問題に対する代替的な解決方法、および／または、単一のシステムまたは物品の複数の異なる使用を含んでもよい。
本発明の他の利点、特徴および用途は、ある非限定的な態様の詳細な説明、図面および請求の範囲から明らかであろう。
Y. lipolyticaにおける脂質合成のための主要な代謝経路の概要。 ５０時間の培養の後での異なるプロモーター下におけるβ−ガラクトシダーゼの酵素活性。 ACC1+DGA1形質転換体（MTYL065）のバイオリアクター発酵。 ２Ｌのバイオリアクター発酵におけるACC1＋DGA1形質転換体の脂肪酸プロフィール（FAP）。
２Ｌのバイオリアクターにおいて炭素源としてアセタートと共に増殖させたACC＋DGA形質転換体の脂肪酸プロフィール。 ACC＋DGA1 Y. lipolyticaによるアセタートにおける脂肪酸生成。 コンビナトリアル発現構築スキーム。クローニングの方針および脂質蓄積遺伝子標的の組み合わせを含むプラスミドの構築の戦略。これらのプラスミドを、次いで、脂質蓄積の研究のためにY. lipolytica中に形質転換する。 pMT053を介して組み込まれた場合をpMT092と比較した、DGAカセットにおけるTEFの転写発現。
コンビナトリアルコンストラクトを発現するY. lipolytica株間における、対照株に対して正規化した全脂肪酸含有量により測定した、相対的脂質生産力および収率。対応する遺伝子標的のための形質転換された過剰発現カセットの存在（＋）または不在（−）を、グラフの下に示す。生産力（明灰色のバー）を、培養の初めの１００時間内における相対的脂肪蓄積として計算した。収率の計算は、脂肪蓄積を消費された糖により除算することにより行った。培地のＣ／Ｎ比は２０であった。結果は、複数の実験にわたる平均値である。 株MTYL089における標的遺伝子の転写発現。発現は、アクチンの発現に対して内部的に正規化し、対照（MTYL038）株に対して比較し、６６時間の増殖の後で取得した。 ACC、D9、ACL12およびDGAを過剰発現する株MTYL089のバッチバイオリアクター発酵。Ｃ／Ｎモル比は100であった。全てのサンプリングを、３回行った。 ２Ｌの発酵の終了時における株MTYL089の顕微鏡法。普通光顕微鏡法（左画像）は、細胞の大多数が、酵母の形態であり、大きな液胞を含むことを示す。蛍光顕微鏡法（右画像）は、これらの液胞が中性の脂質からなることを示す。
株MTYL065とMTYL089との間の脂肪酸プロフィールの比較。それぞれの発行の最後の時点から取得された脂肪酸プロフィールを、全脂肪酸含有量に対して正規化したもの。 窒素（ｍＭ）、非脂質および脂質のタイター（ｇ／Ｌ）の傾向。 脂質タイター（ｇ／Ｌ）、脂質含有量（％）およびＣ／Ｎ比の傾向。第１軸は、脂質タイターおよび脂質含有量を乾燥細胞重量の％として示す。第２軸は、Ｃ／Ｎ比を示す。Ｃ／Ｎ比は、アセタートの急速な消費に起因して、最後に低下する。 上−油浸顕微鏡（１００×）下において蛍光なしで観察される「浮遊細胞」。下−蛍光下における同じフレームは、明赤色の脂肪体を示す。
発明のある態様の詳細な説明
液体のバイオ燃料は、化石燃料に対する有望な代替物であり、気候変動についての懸念を軽減し、供給の不確実性を円滑化するために役立ち得る（１）。バイオディーゼル、ジェットオイルおよび他の油ベースの燃料は、特に、航空および重車両輸送のために必要である。それらは、現在、植物油からのみ生成され、これはコストがかかり、非持続可能な方針である（２）。魅力的な可能性は、再生可能な炭水化物原料の油への非光合成的な転換である（３）。バイオディーゼルについては、油性原料に関しての植物油から微生物油生成への移行は、多くのさらなる利点を提示する：多様な原料への適応性、土地要求におけるフレキシビリティー、効率的なプロセス周期のターンオーバー、およびスケールアップの容易性（４）。微生物による生成のための生物学的プラットフォームはまた、さらなる最適化のために、遺伝子学的により扱いやすい。
炭水化物から油への転換のための費用対効果の高い微生物工学への手掛かりは、炭水化物から油への高い転換収率である。代謝工学は、この目的のために適用される授権技術として現れ、化学物質、医薬および燃料生成物の合成における微生物生体触媒の性能を著しく改善した成功した経路の工学の多くの例が存在する（５）。高い脂質合成を有する微生物を操作することにおける先の努力は、脂肪酸合成経路における推定される速度制御のステップを増幅することに焦点を当ててきた（６）。これらの努力は、しかし、混合された結果をもたらした。これはおそらくは、脂肪酸フラックスを調節することが飽和脂肪酸のレベルを増大させ、これが脂肪酸生合成についてのネガティブフィードバックループをもたらす脂肪酸生合成酵素の強力なアロステリック阻害剤であることに起因する（７）。ここで、本発明者らは、上流の、代謝物形成経路の増幅と、下流の、代謝物消費経路のフラックスの同様の増大とを組合せるアプローチを記載する。バランスが取れた場合、このプッシュ−および−プル戦略は、中間代謝物の濃度をそれらの恒常的な生理学的レベルから著しく解離させることなく、大きなフラックス増幅を達成することができる。
含油性酵母Yarrowia lipolyticaは、微生物油生成のための魅力的な候補であり、これはまた、広範な他の工業的適用において有用性を示されている：クエン酸生成、タンパク質生成（例えばプロテアーゼおよびリパーゼ）、ならびにバイオレメディエーション（８〜１０）。完全に配列決定されたゲノムおよび増大している遺伝子操作ツールにより、Y. lipolyticaの操作は、相対的に容易に達成することができる（１１）。Y. lipolyticaはまた、培養において強力であり、多様な基質において生育することができることが見出されており、農工業用残渣における脂質生成、工業用グリセロール、および工業用脂肪のために用いられてきた（１２〜１４）。それは、優れた脂質蓄積能力を有し、一般に、脂質においてその乾燥細胞重量（DCW）の３６％まで蓄積する（１５）。
Y. lipolyticaにおけるde novo脂質合成のための代謝経路は、完全に計画され始めており、現在の脂質合成のモデルを図１において説明する。解糖系に入るグルコースは、TCA回路において使用されるためのピルバートとしてミトコンドリアに入る；しかし、過剰なアセチル−coAは、ミトコンドリアから細胞質へクエン酸シャトルを介して輸送される。細胞質のアセチル−CoAは、次いでアセチル−CoAカルボキシラーゼ（ACC）により脂肪酸合成の第１のステップとしてマロニル−CoAへと転換される。脂肪酸合成の後で、トリアシルグリセロール（TAG）合成はKennedy経路に従い、これは、小胞体（ER）および脂肪体において行われる。アシル−CoAは、リゾホスファチジン酸（LPA）を形成するためのグリセロール−３−リン酸骨格へのアシル化のために用いられる前駆体であり、リゾホスファチジン酸はさらにアシル化されてホスファチジン酸（PA）を形成する。PAは、次いで、脱リン酸化されてジアシルグリセロール（DAG）を形成し、次いで、最終のアシル化がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGA）により行われ、TAGを生成する。
ミトコンドリアから細胞質へのアセチル−CoAの輸送は、ATP−クエン酸リアーゼ（ACL）に媒介されるシトラートの切断により、クエン酸シャトルを介して行われ、アセチル−CoAおよびオキサロアセタート（OAA）を生じる。アセチル−CoAカルボキシラーゼ（ACC）が、次いで、第１の関係するステップを脂質生合成へ向けて触媒し、細胞質アセチル−CoAを、脂肪酸伸長のための一次前駆体であるマロニル−CoAへ転換する。完成した脂肪酸アシル−CoA鎖は、次いで、Kennedy経路を介するトリアシルグリセロール（TAG）の最終組み立てのために、小胞体（ER）または脂肪体膜（lipid body membrane）へ輸送される。Y. lipolyticaにおいて生成される貯蔵脂質のうちの８０％を超えるものが、TAGの形態である（１６）。細胞質OAAは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼによりマラートに転換され、ミトコンドリアに戻されて、クエン酸シャトル回路を完成させる。NADPHの形態における還元性の等価物は、ペントースリン酸経路により、またはトランスヒドロゲナーゼ回路におけるリンゴ酸酵素により、提供される。Y. lipolyticaにおいては、高いPPPフラックスおよび無効なリンゴ酸酵素の過剰発現は、前者がNADPHのための主要なソースであることを示唆する（４、１７）。
細胞内脂質蓄積は、２つの方法を介して起こり得る：de novoでの脂質合成またはex novoでの外因性の脂肪酸および脂質の組み込み。脂質蓄積は、栄養素供給が過剰な炭素の存在下において消耗する場合に、最も一般的に起こる。培養においては、この状態は、典型的には静止期の開始と一致する。実際に、最も一般的に用いられる制限栄養素は窒素であり、これは、培地の組成中で容易に制御し得るからである（１５）。これらの誘導条件にも関わらず、脂質合成経路は、生物が細胞増殖とエネルギー貯蔵との均衡を取るために、高度に調節される。例えば、ACC単独は、複数のレベルにおいて、複数の要因により、調節される（７）。
この厳格な調節は、ある場合においては回避された。ペルオキシソームの酸化経路を排除し、グリセロール代謝を操作することにより、Y. lipolyticaは、ex novoでの脂質蓄積を通して４０％〜７０％の脂質を達成することができた（１８、１９）。Δ６−およびΔ１２−不飽和化酵素遺伝子の共発現は、γ−リノレン酸（GLA）の著しい生成を可能にした（２０）。しかし、Y. lipolyticaにおいて脂質生合成経路を操作することは、なお相対的に未調査であり、戦略はなお、アウトプットを最大化するための有効な脂質生成経路の操作のために開発中である。
本開示の幾つかの側面は、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために操作された微生物を提供する。用語「バイオ燃料」とは、生きている細胞、微生物、真菌または植物などの生物学的ソースから誘導される燃料を指す。用語は、例えば、例えば従来の抽出、蒸留または精製方法、生物学的ソースから直接得られる燃料、および、例えばエステル転移反応の手順などの化学修飾により生物学的ソースから得られるバイオ燃料前駆体を処理することにより生成される燃料を含む。直接的に入手可能なバイオ燃料の例は、エタノール、プロパノールおよびブタノールなどのアルコール、脂質および油である。バイオ燃料前駆体（例えば脂質）の処理により得られるバイオ燃料の例は、バイオディーゼル（例えば脂質のエステル転移反応により生成される）、およびグリーンディーゼル／変性油燃料（例えば油の水素化により生成される）である。バイオディーゼルはまた、脂肪酸メチル（またはエチル）エステルとしても言及され、今日において経済的に最も重要なバイオ燃料の一つであり、脂質のエステル転移反応により工業的スケールにおいて生成することができ、ここで、水酸化ナトリウムおよびメタノール（またはエタノール）を、脂質、例えば、トリアシルグリセロールと反応させて、バイオディーゼルおよびグリセロールを生成する。
工業的スケールのバイオディーゼルの生成のための原料として、動物脂肪、植物油、ヤシ油、麻（hemp）、ダイズ、菜種、亜麻、ヒマワリおよび含油性藻類が挙げられる。他のアプローチにおいて、バイオマスを微生物によりバイオ燃料前駆体、例えば脂質に転換し、それを次いで抽出し、さらに処理してバイオ燃料を得る。用語「バイオマス」とは、生きている細胞または生物、例えば微生物の成長および／または増殖により生成される材料を指す。バイオマスは、細胞、微生物および／または細胞内含有物、例えば細胞の脂肪酸およびTAGS、ならびに細胞外材料を含んでもよい。細胞外材料として、限定されないが、細胞により分泌される化合物、例えば分泌される脂肪酸またはTAGが挙げられる。バイオ燃料生成のために重要な型のバイオマスは、藻類のバイオマスおよび植物由来バイオマス、例えばトウモロコシ茎葉および木質繊維である。一部の態様において、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のためのバイオマスは、植物由来の糖、例えばサトウキビまたはトウモロコシ由来の糖を含んでもよい。
本開示の幾つかの側面は、例えば経済的に実行可能な工業的スケールでのバイオディーゼル生成のために有用な、脂質の微生物ソースの操作および開発に関する。用語「脂質」とは、脂肪酸およびその誘導体を指す。したがって、脂質の例として、以下が挙げられる：脂肪酸（FA、飽和および不飽和の両方）；アシルグリセロールとしても言及されるグリセリドまたはグリセロール脂質（モノグリセリド（モノアシルグリセロール）、ジグリセリド（ジアシルグリセロール）、トリグリセリド（トリアシルグリセロール、TAG、または中性脂肪）など）；ホスホグリセリド（グリセロリン脂質）；非グリセリド（スフィンゴ脂質、コレステロールおよびステロイドホルモンを含むステロール脂質、テルペノイドを含むプレノール脂質、脂肪アルコール、ロウおよびポリケタイド）；ならびに複合脂質誘導体（糖に架橋した脂質または糖脂質、およびタンパク質に架橋した脂質）。脂質は、生きている細胞および微生物の細胞膜の必須の部分である。一部の細胞および微生物はまた、例えば脂肪体、脂肪滴、または液胞中でトリアシルグリセロールの形態において、エネルギーを貯蔵するために脂質を生成する。
本発明の幾つかの側面は、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために操作された微生物に関する。一部の態様において、本明細書において提供される微生物は、それらの脂質代謝を脂質生成のために最適化するように操作される。用語「脂質代謝」とは、脂質の作製または分解を含む分子プロセスを指す。脂肪酸合成、脂肪酸酸化、脂肪酸不飽和化、TAG合成、TAG貯蔵およびTAG分解は、細胞の脂質代謝の一部であるプロセスの例である。したがって、用語「脂肪酸代謝」とは、脂肪酸の合成、作製、形質転換または分解を含む、全ての細胞または生物のプロセスを指す。脂肪酸合成、脂肪酸酸化、TAG合成、およびTAG分解は、細胞の脂肪酸代謝の一部であるプロセスので例である。
用語「トリアシルグリセロール」（TAG、ときにトリグリセリドとしても言及される）とは、エステル結合を介して、グリセロール分子の３個のヒドロキシル（ＯＨ）基の各々に対して１個ずつ、脂肪酸分子（脂肪族モノカルボン酸）３個と共有結合した単一分子であるグリセロールを含む分子を指す。トリアシルグリセロールは、還元されており、無水の性質であるため、高度に濃縮された代謝エネルギーの貯蔵体であり、バイオディーゼル生成のための好適な原料であるからである。
多くの細胞および生物は、代謝エネルギーを、TAGなどの脂肪酸および脂肪酸誘導体の形態において貯蔵する。TAGなどの脂肪酸およびその誘導体は、代謝エネルギーの貯蔵のための理想的な形態を提供する。Ｃ−Ｃ結合中に含有されるエネルギーは、形式的には脂肪酸生合成の逆に等しいが異なる分子経路を構成する異なる酵素により媒介および調節されるβ酸化により、効率的に放出されることができる。微生物は、外部からの供給、内因的ターンオーバーおよびde novo合成から、脂肪酸を誘導することができる。本発明の幾つかの側面は、微生物がTAGなどの脂肪酸または脂肪酸誘導体を外部から供給された炭素源から効率的に合成および貯蔵する能力に基づく、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のための微生物の同定に関する。
天然の脂肪酸分子は、一般に、非分枝状の、４〜２８個の炭素原子の脂肪族鎖またはテイルを有する。脂肪酸は、脂肪族鎖の全ての炭素原子がＣ−Ｃ単結合を介して連結している場合に「飽和した」として、あるいは、２個または３個以上の炭素原子がＣ−Ｃ二重結合を介して連結している場合に「不飽和」であるとして言及される。不飽和脂肪酸は、膜の流動性、細胞の活性、代謝および遺伝子転写を支配する核のイベントの調節において、重要な役割を果たす。
酵母における脂肪酸のスペクトルは、主に、Ｃ１６およびＣ１８脂肪酸、例えばパルミチン酸（Ｃ１６）、パルミトオレイン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）およびオレイン酸（Ｃ１８）からなる。パルミチン酸は、１６個の炭素原子（炭素原子／不飽和結合：１６．０）の脂肪族鎖を有する非分枝状の飽和脂肪酸である。ステアリン酸は、１８個の炭素原子（１８．０）の脂肪族鎖を有する非分枝状の飽和脂肪酸である。パルミトオレイン酸は、１６個の炭素原子（１６．１）の脂肪族鎖を有する一価不飽和脂肪酸である。オレイン酸は、１８個の炭素原子（１８．１）の脂肪族鎖を有する一価不飽和脂肪酸である。酵母におけるマイナーな脂肪酸種として、Ｃ１４およびＣ２６脂肪酸が挙げられ、これらは、タンパク質の修飾において、またはそれぞれスフィンゴ脂質およびGPIアンカーの成分として、必須の機能を果たす。
脂肪酸のde novo合成は、相当な量の代謝物、アセチル−CoA、ATPおよびNADPHを利用し、したがって、これらの化合物に依存する他の細胞のプロセスと競合する。NADPHは、脂肪酸伸長回路における２つの還元ステップのために必要とされ、脂肪酸合成を細胞の代謝状態に関連付け、脂肪酸合成を、高いATP／AMP比、高い還元等価物および高いアセチル−CoAプールにより示される細胞の高いエネルギー負荷の状態に対して制限している。ほとんど全ての細胞内小器官は、脂肪酸代謝に関連し、このことは、脂肪酸の恒常性の維持が、複数のレベルにおける調節を必要とすることを示している。脂質生合成のための代謝物、アセチル−CoA、ATPまたはNADPHを生成する脂質合成のステップは、本明細書においてときに、脂質合成の「プッシュステップ」として言及される。細胞における脂質合成のための代謝物、アセチル−CoA、ATPまたはNADPHの生成を、例えば、かかる代謝物生成プロセスを媒介する遺伝子産物の過剰発現により増大させるプロセスの増幅は、本明細書においてときに、「プッシュ改変」として言及される。
酵母を含む殆どの生物は、多様な炭素源から脂肪酸をde novoで合成することができる。最初のステップにおいて、アセチル−CoAは、ＣＯ２の付加により、酵素アセチル−CoAカルボキシラーゼ（ACC；酵母においてはACC1およびHFA1によりコードされる）により、マロニル−CoAへとカルボキシル化される。ビオチンは、この反応における必須のコファクターであり、酵素ビオチン：アポタンパク質リガーゼ（酵母においてはBPL1/ACC2によりコードされる）によりACCアポタンパク質に共有結合する。ACCは、三官能性酵素であり、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（BCCP）ドメイン、ビオチン−カルボキシラーゼ（BC）ドメイン、およびカルビキシル−トランスフェラーゼ（CT）ドメインを保有する。殆どの細菌において、これらのドメインは、個々のポリペプチドとして発現され、ヘテロマー複合体に組み立てられる。対照的に、ミトコンドリアのACCバリアント（酵母においてはHfa1）を含む真核生物のACCは、これらの官能基を単一のポリペプチドにおいて保有する。ACCにより生成されるマロニル−CoAは、脂肪酸シンターゼ、FASおよびエロンゲナーゼ（elongase）により触媒される回路的な一連の反応において、２個の炭素の供与体として役立つ。
de novo脂肪酸合成の中間生成物は、飽和脂肪酸である。飽和脂肪酸は、酵母を含む真核生物における不飽和脂肪酸の前駆体であることが知られている。不飽和脂肪酸は、一般に、不飽和化酵素と称される特定の酵素による、飽和脂肪酸におけるＣ−Ｃ単結合の不飽和化により生成される。飽和脂肪酸の不飽和脂肪酸への転換を支配する制御機構は、よく理解されていない。真核生物においては、不飽和脂肪酸は、膜の流動性、細胞の活性、代謝および遺伝子転写を支配する核のイベントの調節において重要な役割を果たす。典型的には、酵母脂肪酸の約８０％は、一価不飽和であり、これは、それらが、その脂肪族鎖中に１つの不飽和結合を含有することを意味する。
脂肪酸は、脂肪酸合成の強力な阻害剤であり、脂肪酸による脂肪酸合成のフィードバック阻害は、油生成のために微生物を操作することにおける主要な障害である。本開示の幾つかの側面は、脂質合成のプッシュ改変は、典型的には、脂肪酸に媒介される脂質合成のフィードバック阻害を覆すことができないが、一方、プッシュ改変（例えばACC1過剰発現）とプル改変（例えばDGA1過剰発現）との組合せは、フィードバック阻害を効率的に迂回することができ、それにより、例えば細胞の脂肪体または液胞において貯蔵されるTGAにおける、脂質合成経路に対する炭素フラックスの増大を完全に実現するという認識に基づく。
本開示の幾つかの側面は、微生物を油合成のために操作するための戦略を提供する。一部の態様において、かかる戦略は、脂質合成のプッシュ−およびプル−ステップを同時に増幅するために含油性微生物、例えばY. lipolyticaの遺伝子操作を使用する。本明細書において開示されるように、含油性酵母宿主細胞における脂質生成の著しい増大が、これらの戦略を用いて達成された。
本開示の幾つかの側面は、プッシュ−および−プル改変、例えば、脂質合成経路のための代謝物を生成する代謝のステップと、脂質合成のフィードバック阻害を媒介する合成生成物を隔離する代謝のステップとの同時増幅が、プッシュ−のみ、またはプル−のみの改変の操作と比較して、脂質合成経路に対する炭素フラックスの著しい増大をもたらすという認識に基づく。本発明の幾つかの側面は、含油性微生物、例えばYarrowia lipolyticaにおけるDGA1遺伝子産物の過剰発現は、脂質合成経路に対する炭素フラックスの著しい増大をもたらし、ACC1遺伝子産物の共過剰発現はDGA1の過剰発現と相乗作用し、多様な炭素基質からの工業的スケールでの油生成のために好適な著しく高い炭素フラックス特性を有するプッシュ−および−プル改変された微生物をもたらすという、驚くべき発見に関する。
微生物における代謝物生成ステップ（例えばマロニル−CoAの生成）、ならびに生成物を隔離する代謝のステップ（例えばジアシルグリセロールのトリアシルグリセロールへのアシル化）の、バランスが取れた調節が、脂質合成への正味の炭素フラックスの著しい増大をもたらすという発見は、操作された細胞の補助により、再生可能な炭素源をバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体へと転換することを目的とするプロセスのための主要な関連を有する。本発明の幾つかの側面に基づいて、いまや、微生物、例えばY. lipolyticaなどの含油性酵母の脂質合成代謝を、工業的スケールでの炭水化物からバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体への転換のための高度に望ましい表現型を付与するように、例えば、脂肪酸合成、TAG合成、ならびに脂肪体または液胞における脂肪酸およびTAG貯蔵を著しく増大するように、改変することが可能である。
本発明の幾つかの側面により、本明細書において提供される方法に従って、例えば、脂質合成の代謝物生成（プッシュ）ステップを媒介する遺伝子産物と、生成物を隔離する（プル）ステップを媒介する遺伝子産物とを同時に過剰発現させることにより、微生物における脂質代謝を改変することは、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成プロセスにおける使用のために最適化された微生物の生成を可能にする。本発明の幾つかの側面は、脂質生合成のプッシュステップとプルステップとを同時に増幅することにより、微生物における合成速度ならびに脂肪酸および脂肪酸誘導体の蓄積の増大をもたらす、微生物における脂肪酸代謝を操作するための戦略および方法を提供する。
本発明の幾つかの側面は、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために微生物の脂質代謝を調節する、遺伝子産物の発現および／または活性の調節をもたらす遺伝子改変を含む方法を提供する。本発明の幾つかの側面によるかかる遺伝子改変は、炭素源、例えば炭水化物源からのラージスケールでの脂質の生成のために改変された微生を最適化するために、炭水化物から脂肪酸および／またはTAGへの転換を増大することを標的とする。本発明の幾つかの側面により提供される幾つかの改変、例えば特定の遺伝子産物の過剰発現、ノックアウト、ノックダウン、活性化および／または阻害は、単独で、または組み合わせにおいて、および／または当業者に公知の他の改変との組合せにおいて、もたらされ得る。用語「改変」とは、遺伝子操作、例えば特定の遺伝子産物の過剰発現、ノックアウト、ノックダウン、活性化および／または阻害と、非遺伝子的操作、例えば増殖培地、基質、基質前処理、ｐＨ、温度、転換プロセスなどの操作との両方を指す。
遺伝子発現の操作はまた、本明細書において遺伝子発現の調節としても言及され、天然の発現の調節の破壊もしくは阻害、過剰発現、発現の阻害、または所与の遺伝子の完全な無効化であってよい。ネイティブな遺伝子配列、例えばネイティブなDGA1またはACC1遺伝子配列の上流における異種プロモーターの挿入、またはプロモーター中の調節配列、例えば飽和脂肪酸によるDGA1またはACC1遺伝子のフィードバック阻害を媒介する調節配列の欠失は、天然の発現の調節の破壊または阻害の例である。遺伝子発現の調節のための戦略は、例えば遺伝子標的化もしくはウイルスによる形質導入などの組換え技術による遺伝子変異、あるいは、非遺伝子的変異、例えば遺伝子発現の上方もしくは下方調節をもたらすことが知られている環境変化、または調節因子、例えば薬物または低分子RNAの標的細胞への一過性の送達を含んでもよい。微生物の遺伝子変異および非遺伝子的変異のための方法は当業者に周知であり、例えば以下：J. SambrookおよびD. Russell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press；第３版（2001年1月15日）；David C. Amberg、Daniel J. BurkeおよびJeffrey N. Strathern、Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（2005年4月）；John N. Abelson、Melvin I. Simon、Christine GuthrieおよびGerald R. Fink、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology、パートA、第194巻（Methods in Enzymology Series, 194）、Academic Press（2004年3月11日）；Christine GuthrieおよびGerald R. Fink、Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology、パートB、第350巻（Methods in Enzymology、第350巻）、Academic Press；第１版（2002年7月2日）；Christine GuthrieおよびGerald R. Fink、Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology、パートC、第351巻、Academic Press；第１版（2002年7月9日）；Gregory N. Stephanopoulos、Aristos A. AristidouおよびJens Nielsen、Metabolic Engineering: Principles and Methodologies、Academic Press；第１版（1998年10月16日）；ならびにChristina Smolke、The Metabolic Pathway Engineering Handbook: Fundamentals、CRC Press；第１版（（2009年7月28日）において記載され、これらの全ては、本明細書において参考として援用される。
用語「過剰発現」とは、本明細書において用いられる場合、所与の細胞、細胞型または細胞の状態における所与の遺伝子産物の発現のレベルの、参照細胞、例えば同じ細胞型の野生型細胞、または同じ細胞型の細胞であるが特定の改変、例えば遺伝子改変を欠くものと比較した場合の増大を指す。Y. lipolytica細胞におけるDGA1および／またはACC1遺伝子の強制的な連続的発現が、野生型細胞においてはDGA1またはACC1遺伝子発現を阻害するであろう飽和脂肪酸の濃度を示すことは、遺伝子の過剰発現の一例である。
本発明の幾つかの側面は、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のための、微生物におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（DGA1）遺伝子産物の活性の操作のための方法を提供する。DGA1遺伝子は、アシルトランスフェラーゼをコードし、これはトリアシルグリセロール（TAG）形成の終結ステップを触媒し、アシル−CoAをアシル供与体として使用してジアシルグリセロールをアシル化する。このアシルトランスフェラーゼ反応の結果は、トリアシルグリセロであり、これは、脂肪酸合成に対して、脂肪酸自体と同じ阻害的フィードバック効果は示さない。TAGは、典型的には、脂質生成細胞において脂肪体または液胞において貯蔵される。一部の態様において、操作は過剰発現である。一部の態様において、操作は、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために、微生物を、異種プロモーター、例えば構成的または誘導性プロモーターに作動的に連結している、DGA1遺伝子産物、例えばDGAT2タンパク質をコードする核酸を含む発現コンストラクトと接触させることによりもたらされる。一部の態様において、DGA1遺伝子産物をコードする核酸は、配列番号１のコード配列を含む。一部の態様において、DGA1は、Y. lipolyticaのDGA1、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含むY. lipolyticaのDGA1である。一部の態様において、微生物は、Y. lipolyticaである。一部の態様において、微生物におけるDGA1遺伝子産物の活性の操作は、ラージスケールでの炭水化物から脂質への転換のために有益な表現型、例えば脂質合成速度の増大、炭水化物から脂質への転換効率の増大、脂質貯蔵の増大、および増殖速度の増大、高濃度の炭素源または脂質生成物に対する耐性の増大を付与するようにもたらされる。DGA1遺伝子および遺伝子産物の配列は当業者に周知である。例示的に、代表的な遺伝子および遺伝子産物の配列は、NCBIデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov）において、エントリーXM_504700の下で見出すことができる。
DGA1の核酸およびタンパク質の配列の好適な配列の非限定的な例を、以下に提供する。他の種からの配列を含むさらなる好適なDGA1配列は、当業者には明らかであり、本発明はこの側面において限定されない。
本発明の幾つかの側面は、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のための、微生物、例えばY. lipolyticaにおける、アセチル−CoAカルボキシラーゼ（ACC）遺伝子産物の操作のための方法を提供する。ACC遺伝子産物は、脂肪酸合成における主要なＣ２−前駆体であるアセチル−CoAのマロニル−CoAへの転換を媒介し、これは、脂肪酸合成における第１の関係するステップと考えられ、また、脂肪酸合成における速度に限定されるステップであると示唆されている（Cao Y, Yang J, Xian M, Xu X, Liu W. Increasing unsaturated fatty acid contents in Escherichia coli by coexpression of three different genes. Appl Microbiol Biotechnol. 2010を参照）。一部の態様において、ACC活性の操作は、ACC過剰発現である。一部の態様において、操作は、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために、微生物を、例えば構成的または誘導性プロモーターに作動的に連結している、ACC遺伝子産物、例えばACC1タンパク質をコードする核酸を含む発現コンストラクトと接触させることによりもたらされる。一部の態様において、ACC遺伝子産物をコードする核酸は、配列番号３のコード配列を含む。一部の態様において、ACC遺伝子産物は、配列番号４のアミノ酸配列を含むACC1タンパク質である。一部の態様において、微生物におけるACCの過剰発現は、脂肪酸合成速度を増大させ、および／または、ラージスケールでの炭水化物のバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の転換のために有益な表現型、例えば脂質合成速度の増大、炭水化物から脂質への転換効率の増大、脂質貯蔵の増大、および増殖速度の増大、物質（例えば炭素源、バイオ燃料もしくはバイオ燃料前駆体、または毒性の物質）の濃度に対する耐性の増大を付与する。ACC遺伝子および遺伝子産物の配列は当業者に周知である。例示的に、代表的な遺伝子および遺伝子産物の配列は、NCBIデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov）において、GeneID：855750および2909424についてのエントリーの下で、またはエントリーNC_006069の下で見出すことができる。
ACCの核酸およびタンパク質の配列の好適な配列の非限定的な例を、以下に提供する。他の種からの配列を含むさらなる好適なACC配列は、当業者には明らかであり、本発明はこの側面において限定されない。
本発明の幾つかの側面は、微生物における、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のための、ステアロイル−CoA−不飽和化酵素（SCD）の活性の操作のための方法を提供する。SCDは、CoAにカップリングされたステアリン酸のＣ９とＣ１０との間に二重結合を挿入するΔ９不飽和化酵素であり、これは脱飽和化された脂肪酸およびその誘導体の生成における重要なステップであり、本明細書において他所でより詳細に記載される。一部の態様において、操作は過剰発現である。一部の態様において、操作は、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために、微生物を、異種プロモーター、例えば構成的または誘導性プロモーターに作動的に連結している、SCD遺伝子産物、例えばSCDタンパク質をコードする核酸を含む発現コンストラクトと接触させるによりもたらされる。一部の態様において、SCD遺伝子産物をコードする核酸は、配列番号５のコード配列を含む。一部の態様において、SCDは、Y. lipolyticaのSCD、例えば配列番号６のアミノ酸配列を含むY. lipolyticaのSCDである。一部の態様において、微生物は、Y. lipolyticaである。一部の態様において、微生物におけるSCDの活性の操作は、ラージスケールでの炭水化物から脂質への転換のために有益な表現型、例えば脂質合成速度の増大、炭水化物から脂質への転換効率の増大、脂質貯蔵の増大、および増殖速度の増大、高濃度の炭素源または脂質生成物に対する増大した耐性を付与するようにもたらされる。ステアロイル−CoA不飽和化酵素の遺伝子および遺伝子産物の配列は、当業者に周知である。例示的に、代表的な遺伝子および遺伝子産物の配列は、NCBIデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov）において、GeneID：852825についてのエントリーの下で見出すことができる。
SCD核酸およびタンパク質の配列の好適な配列の非限定的な例を、以下に提供する。他の種からの配列を含むさらなる好適なSCD配列は、当業者には明らかであり、本発明はこの側面において限定されない。
本発明の幾つかの側面は、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のための、微生物における、ATP−クエン酸リアーゼ（ACL）の活性の操作のための方法を提供する。ACLは、TCA回路の生成物としてミトコンドリアからシャトル排出されるシトラートを切断することにより、細胞質アセチル−CoAを提供する。シトラートをオキサロアセタートおよびアセチル−CoAに切断することで、ACL遺伝子産物は、アセチル−CoA基質をACCに提供し、これは次いで、脂肪酸合成の主要なＣ２−前駆体であるアセチル−CoAのマロニル−CoAへの転換を媒介し、これは、脂肪酸合成における第１の関係するステップと考えられ、本明細書において他所でより詳細に記載される。一部の態様において、ACL遺伝子産物は、別々の遺伝子によりコードされる２つのサブユニットからなるタンパク質である。一部の態様において、ACL遺伝子産物は、同じ遺伝子によりコードされる２つのサブユニットからなる。一部の態様において、操作は過剰発現である。一部の態様において、操作は、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために、微生物を、異種プロモーター、例えば構成的または誘導性プロモーターに作動的に連結している、ACL遺伝子産物、例えばACLタンパク質をコードする核酸を含む発現コンストラクトと接触させることによりもたらされる。一部の態様において、ACL遺伝子産物をコードする核酸は、配列番号７および配列番号９のコード配列を含む。一部の態様において、ACLは、Y. lipolyticaのACL、例えば、配列番号８および配列番号１０のアミノ酸配列を含むY. lipolyticaのACLである。一部の態様において、微生物は、Y. lipolyticaである。一部の態様において、微生物におけるACLの活性の操作は、ラージスケールでの炭水化物から脂質への転換のために有益な表現型、例えば脂質合成速度の増大、炭水化物から脂質への転換効率の増大、脂質貯蔵の増大、および増殖速度の増大、高濃度の炭素源または脂質生成物に対する耐性の増大を付与するようにもたらされる。ATP−クエン酸リアーゼの遺伝子および遺伝子産物の配列は、当業者に周知である。例示的に、代表的な遺伝子および遺伝子産物の配列は、NCBIデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov）において、GeneID：2912101および2910381についてのエントリーの下で見出すことができる。
ACL核酸およびタンパク質の配列の好適な配列の非限定的な例を、以下に提供する。他の種からの配列を含むさらなる好適なACL配列は、当業者には明らかであり、本発明はこの側面において限定されない。
本発明の幾つかの側面は、本明細書において記載されるような改変、例えば本明細書において記載されるようなDGA1改変、本明細書において記載されるようなACC1改変、および／または本明細書において記載されるようなSCD改変のいずれかを含む、油生成のための含油性微生物を提供する。一部の態様において、本明細書において記載されるようなプッシュ改変、および本明細書において記載されるようなプル改変を含む改変された含油性微生物が提供される。一部の態様において、プッシュ改変は、ACC1遺伝子産物の過剰発現を含む。一部の態様において、プル改変は、DGA1および／またはSCD遺伝子産物の過剰発現を含む。
本発明の幾つかの側面は、微生物、例えばY. lipolyticaに対して、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために必要とされるおよび／または所望される表現型を付与する遺伝子産物をコードする、核酸を提供する。一部の態様において、核酸は、Y. lipolyticaから誘導される核酸である。一部の態様において、核酸は、DGA1遺伝子産物、例えばDGA1タンパク質をコードする。一部の態様において、核酸は、ACC1遺伝子産物、例えばACC1タンパク質をコードする。一部の態様において、核酸は、不飽和化酵素、例えばΔ９不飽和化酵素をコードする。一部の態様において、核酸は、Y. lipolyticaのΔ９不飽和化酵素（SCD）をコードする。一部の態様において、例えば複数のシストロンにおいて、その過剰発現が脂質生合成のプッシュ改変を表わす遺伝子産物（例えばACC1遺伝子産物）と、その過剰発現が脂質生合成のプル改変を表わす遺伝子産物（例えばDGA1および／またはSCD遺伝子産物）とを含む、遺伝子産物の組み合わせをコードする核酸が提供される。
用語「核酸」とは、複数の架橋されたヌクレオチドを含む分子を指す。「核酸」および「核酸分子」は、交換可能に用いられ、オリゴリボヌクレオチド、ならびにオリゴデオキシリボヌクレオチドを指す。用語はまた、ポリヌクレオシド（すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸を取ったもの）、および核酸を含有する任意の他の有機塩基を含む。有機塩基は、アデニン、ウラシル、グアニン、チミン、シトシンおよびイノシンを含む。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。核酸は、天然に存在するものであっても天然に存在しないものであってもよい。核酸は、天然のソースから入手し得るものであっても、核酸シンセサイザーを用いて合成したもの（すなわち合成）であってもよい。核酸の単離は、当該分野において慣用的に行われ、好適な方法は、標準的な分子生物学の教科書において見出すことができる（例えばManiatis’ Handbook of Molecular Biologyを参照）。核酸は、本明細書において記載されるように、DNAまたはRNA、例えばゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、mRNA、cDNA、rRNA、miRNA、PNAもしくはLNA、またはそれらのくみあわせであってよい。バクテリア人工染色体（BAC）および酵母人工染色体（YAC）などの天然に存在しない核酸もまた、本発明の幾つかの側面により用いることができる。
本発明の幾つかの側面は、核酸誘導体の使用に関する。ある核酸誘導体の使用は、本発明の核酸の安定性を、特にそれらがヌクレアーゼを含有する生物学的に暴露された場合にそれらの分解を防止することにより、増大し得る。本明細書において用いられる場合、核酸誘導体は、天然に存在しない核酸またはその単位である。核酸誘導体は、天然に存在しないヌクレオチドおよび天然に存在しない骨格架橋などの、天然に存在しないエレメントを含んでもよい。本発明の幾つかの側面による核酸誘導体は、限定されないが、ホスホロチオエート架橋、ホスホジエステルで修飾された核酸、ホスホジエステルとホスホロチオエート核酸との組合せ、メチルホスホナート、アルキルホスホナート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、カルボナート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ、およびそれらの組み合わせなどの、骨格の改変を含んでもよい。核酸の骨格の組成は、同種性（homogeneous）であっても異種性（heterogeneous）であってもよい。
本発明の幾つかの側面による核酸誘導体は、糖および／または塩基における置換または改変を含んでもよい。例えば、一部の核酸誘導体は、３’の位置においてヒドロキシル基以外の、５’の位置においてリン酸基以外の低分子有機基（例えば２’−Ｏ−アルキル化リボース基）に共有結合した骨格の糖を有する核酸を含んでもよい。核酸誘導体は、アラビノースなどの非リボース糖を含んでもよい。核酸誘導体は、Ｃ−５プロピン修飾された塩基、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、２−チオウラシルおよびプソイドイソシトシンなどの、置換されたプリンおよびピリミジンを含んでもよい。
一部の態様において、核酸は、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、DNA、RNA、または上記のものの共核酸（co-nucleic acid）、例えばDNA−LNA共核酸を含んでもよい。
本明細書において用いられる場合、用語「単離された核酸分子」とは、その天然の環境にない核酸、例えば、（ｉ）細胞または微生物、例えば細菌または酵母から、当該分野において公知の方法により、例えば宿主細胞のアルカリ溶解、およびその後の、例えばシリカ吸着の手順による核酸の精製により、抽出および／または精製された核酸；（ｉｉ）in vitroで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅された核酸；（ｉｉｉ）クローニングにより組換え的に生成された、例えば発現ベクター中にクローニングされた核酸；（ｉｖ）例えばin vitroでの酵素による消化により、または剪断およびその後のゲル分離により、分画されてサイズで分離された核酸；あるいは（ｖ）例えば化学合成により、合成された核酸を指す。一部の態様において、用語「単離された核酸分子」とは、（ｖｉ）天然に存在する核酸とは化学的に著しく異なる核酸を指す。一部の態様において、単離された核酸は、当該分野において周知の組換えDNA技術により容易に操作することができる。したがって、ベクター中にクローニングされた核酸、または宿主細胞に送達されて宿主のゲノム中に組み込まれた核酸は、単離されたものとみなされるが、その天然の宿主において、例えば宿主のゲノムにおいて、そのネイティブな状態にある核酸はそうではない。例えば、クローニングまたは発現ベクター中で単離されている核酸は、それが属している細胞中の材料をほんの低い割合で含み得る点において、純粋ではない。かかる核酸は、しかし、この用語が本明細書において用いられる場合、単離されている。
本発明の幾つかの側面は、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために必要とされるまたは望ましい表現型を、微生物に付与する遺伝子産物をコードする核酸であって、プロモーターまたは他の転写活性化エレメントに連結している前記核酸に関する。一部の態様において、遺伝子産物をコードし、プロモーターに連結している核酸は、発現ベクターまたは発現コンストラクト中に含まれている。本明細書において用いられる場合、用語「発現ベクター」または「発現コンストラクト」は、組換え的にまたは合成で生成された核酸コンストラクトであって、宿主微生物、例えば含油性酵母において特定の核酸の転写を可能にする一連の特定される核酸エレメントを有するものを指す。一部の態様において、発現ベクターは、プラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一部であってもよい。一部の態様において、発現ベクターは、プロモーターに作動的に連結している、転写されるべきコード核酸を含む。プロモーターは、転写されるべき核酸の転写を促進する核酸エレメントである。プロモーターは、典型的には、それがその転写を制御する核酸配列の同じ鎖上の上流（または５’）に位置する。一部の態様において、発現ベクターは、異種プロモーターに作動的に連結している、転写されるべきコード核酸を含む。異種プロモーターは、所与の核酸配列に対して天然では作動的に連結していないプロモーターである。例えば、Y. lipolyticaにおけるDGA1遺伝子は、天然でY. lipolyticaのDGA1遺伝子プロモーターに作動的に連結している。例えば発現コンストラクトにおいてDGA1遺伝子またはその一部に作動的に連結している、野生型Y. lipolyticaのDGA1遺伝子プロモーター以外の任意のプロモーターは、したがって、この文脈において異種プロモーターであろう。例えばDGA1遺伝子産物をコードする核酸に連結しているTEF1プロモーターは、DGA1に関して、異種プロモーターである。
一部の態様において、発現ベクターは、構成的プロモーターに作動的に連結された、コード核酸、例えばDGA1、ACC1および／またはSCDの遺伝子産物をコードする核酸を含む。用語「構成的プロモーター」とは、その関連遺伝子の連続的な転写を可能にするプロモーターを指す。一部の態様において、発現ベクターは、誘導性プロモーターに作動的に連結された、コード核酸、例えばDGA1、ACC1および／またはSCDの遺伝子産物をコードする核酸を含む。用語「誘導性プロモーター」は、本明細書において用語「条件的プロモーター」と交換可能に用いられ、生物的なまたは非生物的な因子の存在または不在下においてのみその関連遺伝子の転写を可能にするプロモーターを指す。薬物誘導性プロモーター、例えばテトラサイクリン／ドキシサイクリン誘導性プロモーター、タモキシフェン誘導性プロモーター、ならびに、活性になるために組換えイベント（例えばcreにより媒介されるloxP部位の組換え）に依存するプロモーターは、当該分野において周知の誘導性プロモーターの例である。
本開示の幾つかの側面は、含油性微生物における異種プロモーターからの所与の遺伝子産物の過剰発現を、それぞれの発現コンストラクトにおいてイントロンを含めることにより著しく増強することができるという、驚くべき発見に関する。本開示の幾つかの側面は、含油性微生物における遺伝子の過剰発現のためのイントロンにより増強された構成的プロモーター、ならびにこのイントロンにより増強されたプロモーターを含む発現コンストラクトおよびベクターを提供する。一部の態様において、イントロンにより増強されたTEFプロモーターが提供され、これは、TEFプロモーター配列、転写開始部位、転写開始部位の下流のイントロン的配列、およびコード核酸配列、例えばDGA1、ACC1および／またはSCD遺伝子産物をコードする核酸配列を含む。一部の態様において、イントロンは、翻訳開始部位の下流に位置するが、しかし遺伝子配列のオープンリーディングフレーム内、例えば、開始コドンの後であるが、遺伝子産物をコードする核酸配列の終止部位の前にある。一部の態様において、イントロンは、翻訳開始部位、例えばATG開始コドンのすぐ下流に位置するが、コード配列の残りの上流にある。説明を目的として、イントロンにより増強された発現コンストラクトの非限定的な例示的な構造を、以下のとおり提供する：
５’−−TEFプロモーター−−転写開始部位−−イントロン−−DGA1コード配列−−３’。イントロンにより増強された発現コンストラクトの別の非限定的な例示的な構造を、以下のとおり提供する：
５’−−TEFプロモーター−−転写開始部位−−開始コドン−−イントロン−−DGA1コード配列−−終止コドン−−３’。ACC1およびSCDの遺伝子産物のための発現コンストラクトは、それぞれACC1またはSCDのコード配列について置換されたDGA1コード配列を有するであろう。
好適なTEFプロモーター配列ならびに好適なイントロン配列は、当業者には明らかであろう。幾つかのイントロンを含まないTEFプロモーター配列は、例えば米国特許第6,265,185号において開示される。幾つかの例示的な代表的な配列を、以下に提供する。しかし、本発明はこのことに関して限定されないことが理解されるであろう。
発現ベクターまたは発現コンストラクトを微生物中に、例えば酵母細胞中に送達するための方法は、当業者に周知である。発現ベクターを含む核酸は、関連する生物学分野における当業者に周知の多様な方法により、原核および真核微生物に送達することができる。本発明の幾つかの側面による核酸の微生物への送達のための方法として、限定されないが、異なる化学的、電気化学的および生物学的アプローチ、例えば、熱ショック形質転換、エレクトロポレーション、トランスフェクション、例えばリポソーム媒介トランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクションまたはカルシウムリン酸トランスフェクションが挙げられる。一部の態様において、DGA1、ACC1および／またはSCDをコードする核酸配列の組み合わせを含む核酸コンストラクト、例えば発現コンストラクトは、遺伝子材料をトランスファーするためのビヒクルまたはベクターを用いて、宿主微生物中に導入される。遺伝子材料を微生物にトランスファーするためのベクターは当業者に周知であり、例えば、プラスミド、人工染色体およびウイルスベクターが挙げられる。構成的または誘導性の異種プロモーター、ノックアウトおよびノックダウンコンストラクトを含む発現コンストラクトを含む核酸コンストラクトの構築のための方法、ならびに核酸または核酸コンストラクトの微生物への送達のための方法およびベクターは当業者に周知であり、例えば以下：J. SambrookおよびD. Russell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press；第３版（2001年1月15日）；David C. Amberg、Daniel J. BurkeおよびJeffrey N. Strathern、Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（2005年4月）；John N. Abelson、Melvin I. Simon、Christine GuthrieおよびGerald R. Fink、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology、パートA、第194巻（Methods in Enzymology Series, 194）、Academic Press（2004年3月11日）；Christine GuthrieおよびGerald R. Fink、Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology、パートB、第350巻（Methods in Enzymology、第350巻）、Academic Press；第１版（2002年7月2日）；Christine GuthrieおよびGerald R. Fink、Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology、パートC、第351巻、Academic Press；第１版（2002年7月9日）；Gregory N. Stephanopoulos、Aristos A. AristidouおよびJens Nielsen、Metabolic Engineering: Principles and Methodologies、Academic Press；第１版（1998年10月16日）；ならびにChristina Smolke、The Metabolic Pathway Engineering Handbook: Fundamentals、CRC Press；第１版（（2009年7月28日）において記載され、これらの全ては、本明細書において参考として援用される。
一部の態様において、微生物に必要とされるまたは望ましい表現型を付与する遺伝子産物をコードする遺伝子のネイティブなプロモーター、例えばネイティブなDGA1、ACC1またはSCDのプロモーターは、微生物において、その転写活性の調節を変更するように、改変される。一部の態様において、改変されたプロモーターは、その未改変のカウンターパートと比較して、増大した転写活性を示す。用語「改変されたプロモーター」とは、本明細書において用いられる場合、そのヌクレオチド配列が人工的に変更されているプロモーターを指す。ヌクレオチドの欠失、挿入または変異は、単独で、または組み合わせにおいて、かかる人工的変更の例である。人工プロモーターの変更は、標的化された様式において、例えば、遺伝子の標的化、ノックアウト、ノックイン、部位特異的変異誘発、または人工のジンクフィンガーヌクレアーゼに媒介される戦略などの相同組換えアプローチによりもたらすことができる。あるいは、かかる変更は、放射線照射または標的化されていないヌクレオチドの組み込みおよびその後の選択などの、無作為または準無作為なイベントによりもたらすことができる。プロモーターの改変は、一般に、それぞれのプロモーターの転写活性化の特性を調節するために、様式化される。例えば、細胞内脂肪酸レベルの上昇に応答してのDGA1、ACC1またはSCDプロモーターの抑制を媒介する調節エレメントの破壊または欠失は、細胞内脂肪酸レベルが上昇した条件下においてすら、それぞれの遺伝子の連続する転写活性化をもたらすであろう。同様に、構成的に活性な転写アクチベーターエレメントの条件的プロモーター領域中への挿入は、通常では阻害的な条件下において、それぞれの遺伝子の過剰発現をもたらし得る。微生物におけるネイティブなプロモーター、例えば、ネイティブなDGA1、ACC1またはSCDプロモーターの標的化された破壊のための、例えば、転写速度の増大をもたらす標的化された破壊のための方法は、当業者に周知である。
本発明の幾つかの側面は、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体のラージスケールでの生成のために必要とされるおよび／または望ましい表現型を示すための、微生物、例えばY. lipolyticaの操作に関する。本発明の幾つかの側面は、バイオ燃料生成のために最適化された微生物を得るための、脂質合成経路の代謝工学に関する。本発明の幾つかの側面は、バイオ燃料生成のために最適化された微生物を得るために、脂質合成経路中への炭素フラックスを調節する遺伝子の発現を調節する遺伝子改変の組み合わせを含む、代謝工学に関する。一部の態様において、遺伝子改変の組み合わせは、プッシュ改変およびプル改変を含む。一部の態様において、プッシュ改変は、細胞における脂質合成のための代謝物、アセチル−CoA、ATPまたはNADPHのレベルを増大させる遺伝子改変、例えばACC1遺伝子産物の過剰発現を含む。一部の態様において、プル改変は、フィードバック阻害機能を示す脂質合成の生成物または中間体、例えば脂肪酸のレベルを低下させる遺伝子改変である。一部の態様において、プル改変は、DGA1および／またはSCD遺伝子産物の過剰発現である。
本発明の幾つかの側面は、Y. lipolyticaのネイティブな脂質代謝を調節することにより、Y. lipolyticaにより媒介される炭素源から脂質への転換の効率を著しく増大させるための方法を提供する。著しく、かつ予想外のことに、本発明により提供される幾つかの方法による脂質代謝のプッシュ−および−プル改変の組み合わせは、それぞれプッシュまたはプルプロセスのみを調節する個々の改変と比較して、脂質合成経路への炭素フラックスの著しい増大を付与する。
本発明の幾つかの側面は、ラージスケールでのバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために操作および／または最適化された微生物に関する。一部の態様において、本発明の幾つかの側面により提供される方法により、または、核酸もしくはタンパク質、例えば本明細書において提供されるような発現コンストラクトもしくは発現コンストラクトの組み合わせを用いて操作されている、操作された微生物が提供され、これは、脂質合成のプッシュプロセスを媒介する遺伝子産物（例えばACC1の産物）と脂質合成のプルプロセスを媒介する遺伝子産物（例えばDGA1および／またはSCDの遺伝子産物）との組合せの過剰発現をもたらす。一部の態様において、本発明の幾つかの側面により微生物にバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために必要とされるおよび／または望ましい表現型を付与するプッシュ−および−プルの遺伝子産物の組み合わせを過剰発現する、操作された微生物が提供される。一部の態様において、増大したDGA1、ACC1および／またはSCDの遺伝子産物活性を含む微生物が提供される。一部の態様において、微生物は、増大した脂肪酸合成速度、増大したTAG貯蔵、および／またはさらなる必要とされるまたは望ましい性質を示す。
用語「増大した合成速度」または「増大した合成の速度」とは、本明細書において微生物による脂質合成の文脈において、例えば、本明細書において記載される油を生成する微生物の脂肪酸合成速度の文脈において用いられる場合、操作された微生物における、同じ種の野生型微生物における対応する合成の速度と比較した場合に増大している合成の速度を指す。例えば、本明細書において記載される操作されたY. lipolytic微生物における増大したTAG合成の速度とは、野生型Y. lipolyticaにおけるTAG合成の速度と比較して増大している脂質合成の速度を指す。一部の態様において、増大した脂質合成の、例えばTAGの、または全脂質合成の速度とは、細胞の培養物の、例えば操作された微生物の培養物の、脂肪酸合成の速度を指す。一部の態様において、増大した脂質合成の速度は、少なくとも０．０１ｇ／Ｌ／ｈ（培養１リットルあたりの１時間あたりの脂質のグラム数）、少なくとも０．００４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．０５ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．１ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．１４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．１５ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．２ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．３ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．６ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．７ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．８ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．９ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも２ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも３ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも５ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも６ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも７ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも８ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも９ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１０ｇ／Ｌ／ｈ、または少なくとも２５ｇ／Ｌ／ｈの、脂質合成の、例えばTAG合成の、または全脂質合成の速度である。
一部の態様において、合成の速度とは、この文脈において、バイオリアクターの完全な実行に対して測定された合成の速度であり、例えば、バイオリアクターが実行された合計時間または脂質生成が測定された合計時間にわたり合成された脂質、例えばTAGの合計量から、合成の速度を計算する。この型の合成速度はまた、本明細書においてときに、「合計脂質生産力」または「全体的な脂質生産力」としても言及され、それは、典型的には、ｇ／Ｌ／ｈ（培養培地１リットルあたり、実行時間１時間あたりの、生成された脂質のグラム数）において提供される。一部の態様において、操作された微生物、例えば、ACC1遺伝子産物、DGA1遺伝子産物、および／またはSCD遺伝子産物を過剰発現し、野生型微生物、例えば野生型Y. lipolyticaと比較して、合計脂質生産力の少なくとも５倍の増大、少なくとも６倍の増大、少なくとも７倍の増大、少なくとも８倍の増大、少なくとも９倍の増大、少なくとも１０倍の増大、少なくとも１２倍の増大、少なくとも１０倍の増大、少なくとも１２．５倍の増大、少なくとも１５倍の増大、少なくとも２０倍の増大、少なくとも３０倍の増大、少なくとも４０倍の増大、少なくとも５０倍の増大、少なくとも６０倍の増大、少なくとも７０倍の増大、少なくとも８０倍の増大、少なくとも９０倍の増大、少なくとも１００倍の増大、少なくとも５００倍の増大、または少なくとも１０００倍の増大を示す、操作されたY. lipolyticaが提供される。
一部の態様において、増大した合計脂質合成速度または増大した合計脂質生産力は、少なくとも０．０１ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．００４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．０５ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．１ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．１４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．１５ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．２ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．３ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．６ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．７ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．８ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．９ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも２ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも３ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも４ｇ／Ｌ／ｈ、または少なくとも５ｇ／Ｌ／ｈである。
一部の態様において、合成の速度は、例えば最適な増殖条件および栄養への暴露の下で測定された、最大合成速度、またはピーク合成速度である。この型の合成速度はまた、本明細書においてときに、「最大脂質生産力」としても言及される。一部の態様において、増大した最大の脂質合成の速度は、少なくとも０．２ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．３ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．６ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．７ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．８ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも０．９ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも２ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも３ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも５ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも６ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも７ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも８ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも９ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも１０ｇ／Ｌ／ｈ、または少なくとも２５ｇ／Ｌ／ｈの、脂質合成の、例えばＴＡＧ合成の速度である。
一部の態様において、操作された微生物は、含油性酵母、例えば、Y. lipolyticaである。一部の態様において、本発明により提供される操作された酵母は、１または２以上の高度に望ましくかつ予想外の表現型の特徴、例えば炭素から油への転換の速度または効率の増大、脂肪体における脂質蓄積の増大を示す。
一部の態様において、本発明の側面により提供される操作された微生物、例えば操作された酵母は、本明細書においてまた「脂質収率」としても言及される炭素から油への転換率を、約０．０２ｇ／ｇ（生成された油、脂質またはＴＡＧのグラム数／消費された炭素、例えばグルコース、アセタートまたは酢酸１ｇ）〜約０．３ｇ／ｇの範囲内において示す。一部の態様において、本発明の側面により提供される操作された微生物、例えば操作された酵母は、約０．０１０ｇ／ｇ、約０．０２ｇ／ｇ、約０．０２５ｇ／ｇ、約０．０３ｇ／ｇ、約０．０４ｇ／ｇ、約０．０５ｇ／ｇ、約０．０６ｇ／ｇ、約０．０７ｇ／ｇ、約０．０７５ｇ／ｇ、約０．０８ｇ／ｇ、約０．０９ｇ／ｇ、約０．１ｇ／ｇ、約０．１１ｇ／ｇ、約０．１２ｇ／ｇ、約０．１３ｇ／ｇ、約０．１４ｇ／ｇ、約０．１５ｇ／ｇ、約０．１６ｇ／ｇ、約０．１７ｇ／ｇ、約０．１８ｇ／ｇ、約０．１９ｇ／ｇ、約０．２ｇ／ｇ、約０．２１ｇ／ｇ、約０．２２ｇ／ｇ、約０．２３ｇ／ｇ、約０．２４ｇ／ｇ、約０．２５ｇ／ｇ、約０．２６ｇ／ｇ、約０．２７ｇ／ｇ、約０．２８ｇ／ｇ、約０．２９ｇ／ｇ、約０．３ｇ／ｇ、約０．３１ｇ／ｇ、約０．３２ｇ／ｇの、炭素から油への転換率を示すか、または理論値に近づく。一部の態様において、本発明の側面により提供される操作された微生物、例えば操作された酵母は、少なくとも約０．０１０ｇ／ｇ（生成された脂質のグラム数／消費された炭素、例えば、グルコース、アセタートまたは酢酸１ｇ）、少なくとも約０．０２ｇ／ｇ、少なくとも約０．０２５ｇ／ｇ、少なくとも約０．０３ｇ／ｇ、少なくとも約０．０４ｇ／ｇ、少なくとも約０．０５ｇ／ｇ、少なくとも約０．０６ｇ／ｇ、少なくとも約０．０７ｇ／ｇ、少なくとも約０．０７５ｇ／ｇ、少なくとも約０．０８ｇ／ｇ、少なくとも約０．０９ｇ／ｇ、少なくとも約０．１ｇ／ｇ、少なくとも約０．１１ｇ／ｇ、少なくとも約０．１２ｇ／ｇ、少なくとも約０．１３ｇ／ｇ、少なくとも約０．１４ｇ／ｇ、少なくとも約０．１５ｇ／ｇ、少なくとも約０．１６ｇ／ｇ、少なくとも約０．１７ｇ／ｇ、少なくとも約０．１８ｇ／ｇ、少なくとも約０．１９ｇ／ｇ、少なくとも約０．２ｇ／ｇ、少なくとも約０．２１ｇ／ｇ、少なくとも約０．２２ｇ／ｇ、少なくとも約０．２３ｇ／ｇ、少なくとも約０．２４ｇ／ｇ、少なくとも約０．２５ｇ／ｇ、少なくとも約０．２６ｇ／ｇ、少なくとも約０．２７ｇ／ｇ、少なくとも約０．２８ｇ／ｇ、少なくとも約０．２９ｇ／ｇ、少なくとも約０．３ｇ／ｇ、少なくとも約０．３１ｇ／ｇ、少なくとも約０．３２ｇ／ｇの、炭素から油への転換率を示すか、または理論値に近づく。
用語「脂質タイター」は、本明細書において微生物による脂質合成の文脈において、例えば、本明細書において記載される油を生成する微生物による脂肪酸合成の文脈において用いられる場合、油を生成する微生物を含む微生物培養物の容積あたりの合成される脂質の量を指す。一部の態様において、操作された微生物、例えば本明細書において記載される操作されたY. lipolytica微生物は、少なくとも１ｇ／Ｌ（微生物培養物１リットルあたりのグラム数）、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも４ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも６ｇ／Ｌ、少なくとも７ｇ／Ｌ、少なくとも８ｇ／Ｌ、少なくとも９ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、少なくとも１５ｇ／Ｌ、少なくとも２０ｇ／Ｌ、少なくとも２５ｇ／Ｌ、少なくとも３０ｇ／Ｌ、少なくとも４０ｇ／Ｌ、少なくとも５０ｇ／Ｌ、少なくとも６０ｇ／Ｌ、少なくとも７０ｇ／Ｌ、少なくとも８０ｇ／Ｌ、少なくとも９０ｇ／Ｌ、少なくとも１００ｇ／Ｌ、少なくとも２００ｇ／Ｌ、または少なくとも２５０ｇ／Ｌの脂質タイターを達成することができるか、またはこれを達成する。
一部の態様において、本明細書において提供される操作された微生物は、炭素から油への転換の間に、増大した脂質タイターを示す。用語「増大した脂質タイター」とは、本明細書において微生物による脂質合成の文脈において、例えば、本明細書において記載される油を生成する微生物による脂肪酸合成の文脈において用いられる場合、油を生成する微生物を含む微生物培養物の容積あたりの合成された脂質の量であって、同じ種の野生型微生物の、および同じ条件下における（例えば、同じ増殖培地中で、同じＣ／Ｎ比、同じ量の酸素、同じｐＨ、同じ栄養素などによる）、対応する脂質タイターと比較して増大したものを指す。例えば、本明細書において記載される操作されたY. lipolytica微生物により達成される、増大した脂質タイターとは、同一条件下において野生型Y. lipolyticaにより達成され得る脂質タイターと比較して増大した脂質タイターを指す。一部の態様において、増大した脂質タイターとは、少なくとも１ｇ／Ｌ（微生物培養物１リットルあたりのグラム数）、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも４ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも６ｇ／Ｌ、少なくとも７ｇ／Ｌ、少なくとも８ｇ／Ｌ、少なくとも９ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、少なくとも１５ｇ／Ｌ、少なくとも２０ｇ／Ｌ、少なくとも２５ｇ／Ｌ、少なくとも３０ｇ／Ｌ、少なくとも４０ｇ／Ｌ、少なくとも５０ｇ／Ｌ、少なくとも６０ｇ／Ｌ、少なくとも７０ｇ／Ｌ、少なくとも８０ｇ／Ｌ、少なくとも９０ｇ／Ｌ、少なくとも１００ｇ／Ｌ、少なくとも２００ｇ／Ｌ、または少なくとも２５０ｇ／Ｌの脂質タイターを指す。
本発明の幾つかの側面は、限定されないが、発酵性の糖、例えばグルコースなどのＣ６糖、ならびに有機酸、例えば酢酸および／またはその塩、例えば、アセタートを含む、多様な炭素源を用いることができる、油生成のために操作された微生物を提供する。
本発明の幾つかの側面は、本明細書において提供される遺伝子改変された微生物の培養に関する。一部の態様において、培養物は、本明細書において提供される遺伝子改変された微生物、および培地、例えば液体培地を含む。一部の態様において、培養物は、本明細書において提供される遺伝子改変された微生物、および炭素源、例えば発酵性の炭水化物源または有機酸もしくはその塩を含む。一部の態様において、培養物は、本明細書において提供される遺伝子改変された微生物、ならびに、微生物による生存、増殖、および／または炭水化物からバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体への転換のために受け入れられる塩度、モル浸透圧濃度およびｐＨの条件を確立する塩および／または緩衝化剤を含む。一部の態様において、培養物は、さらなる成分、例えば添加物を含む。添加物の非限定的な例は、栄養素、酵素、アミノ酸、アルブミン、増殖因子、酵素阻害剤（例えばプロテアーゼ阻害剤）、脂肪酸、脂質、ホルモン（例えばデキサメタゾンおよびジベレリン酸）、微量元素、無機化合物（例えばマンガンなどの還元剤）、酸化還元調節剤（例えば抗酸化剤）、安定化剤（例えばジメチルスルホキシド）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（PVP）、ゼラチン、抗生物質（例えばブレフェルジンＡ）、塩（例えばＮａＣｌ）、キレート剤（例えばEDTA、EGTA）、ならびに酵素（例えばセルラーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼまたはDNase）である。一部の態様において、培養物は、条件的または誘導性プロモーターからの転写を誘導または阻害する薬物、例えばドキシサイクリン、テトラサイクリン、タモキシフェン、IPTG、ホルモンまたは金属イオンを含んでもよい。
具体的な培養条件、例えば炭素源の濃度は、培養されるべきそれぞれの操作された微生物に依存するであろうが、微生物培養物の生成のための一般的な方法および培養条件は当業者に周知であり、例えば以下：J. SambrookおよびD. Russell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press；第３版（2001年1月15日）；David C. Amberg、Daniel J. BurkeおよびJeffrey N. Strathern、Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（2005年4月）；John N. Abelson、Melvin I. Simon、Christine GuthrieおよびGerald R. Fink、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology、パートA、第194巻（Methods in Enzymology Series, 194）、Academic Press（2004年3月11日）；Christine GuthrieおよびGerald R. Fink、Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology、パートB、第350巻（Methods in Enzymology、第350巻）、Academic Press；第１版（2002年7月2日）；およびChristine GuthrieおよびGerald R. Fink、Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology、パートC、第351巻、Academic Press；第１版（2002年7月9日）において記載され、これらの全ては、本明細書において参考として援用される。油生成のために、本明細書において記載される操作された微生物の培養物は、当該分野において公知であるような油蓄積のために好適な条件下において培養される。
一部の態様において、遺伝子改変された微生物は、同じ種類の野生型微生物に対して、および／または他の微生物、例えば炭素源からバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体への転換のための微生物培養物に混入することが一般に見出される微生物に対して、生育の利点を示す。一部の態様において、本発明のこの側面により提供される操作された微生物の生育および／または増殖の利点は、非滅菌培養およびバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のための発酵条件を用いることの可能性へと翻訳される。なぜならば、混入微生物による培養物の過剰生育の問題が、緩和または完全に無効化されるからである。一部の態様において、本発明のこの側面により提供される操作された微生物は、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために、非滅菌条件下において培養される。例えば、一部の態様において、滅菌していない原料、滅菌していない培養培地、滅菌していない補給物、または滅菌していないバイオリアクター（例えば非滅菌条件下におけるオープンリアクター）が、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために用いられる。
多様な異なる微生物、例えば、含油性酵母などの多様な酵母のソース、細菌、藻類および真菌からの微生物を、本発明の幾つかの側面により遺伝子改変して、工業的スケールでのバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために用いることができる。好適な酵母細胞の非限定的な例は、Yarrowia lipolytica、Hansenula polymorpha、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、S. bayanus、S. K. lactis、Waltomyces lipofer. Mortierella alpine、Mortierella isabellina、Hansenula polymorpha.、Mucor rouxii、Trichosporon cutaneu、Rhodotorula glutinis Saccharomyces diastasicus、Schwanniomyces occidentalis、S. cerevisiae、Pichia stipitis、およびSchizosaccharomyces pombeからの細胞である。好適な細菌の非限定的な例は、Bacillus subtilis、Salmonella、Escherichia coli、Vibrio cholerae、Streptomyces、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudomonas sp、Rhodococcus sp、Streptomyces sp、およびAlcaligenes spである。好適な真菌細胞の非限定的な例は、例えば、Aspergillus shirousamii、Aspergillus nigerおよびTrichoderma reeseiなどの種から培養され得る。好適な藻類細胞の非限定的な例は、Neochloris oleoabundans、Scenedesmus obliquus、Nannochloropsis sp.、Dunaliella tertiolecta、Chlorella vulgaris、Chlorella emersoniiおよびSpirulina maximaからの細胞である。
本発明の幾つかの側面は、本明細書において提供される遺伝子改変された微生物を用いる、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のための方法を提供する。一部の態様において、工業的スケールにおけるバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のための方法が提供される。
本明細書において提供される方法および／または遺伝子改変された微生物を用いて、多様な炭素源を、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体へと転換することができる。一部の態様において、炭素源は、炭水化物を含む。糖、デンプンおよび繊維は、本明細書において提供される転換方法のために好適な炭水化物源の非限定的な例である。本発明の幾つかの側面によれば、炭水化物源は、精製されたおよび／または未精製の糖、デンプンおよび／または繊維、またはこれらのうちの任意のものの組み合わせを含んでもよい。糖の非限定的な例は、グルコース、フルクトース、スクロース、キシロースおよびラクトースなどの発酵性の糖である。デンプンの非限定的な例は、アミラーゼおよびアミロペクチンである。繊維の非限定的な例は、セルロース、ヘミセルロースおよび木質繊維などの植物繊維である。本発明の幾つかの側面は、工業的な副生成物、中間体または廃棄生成物、例えば粗植物抽出物、モラセス、トウモロコシの茎（stover）または汚水の炭素源としての使用に関する。一部の態様において、炭素源は、藻類から誘導される。一部の態様において、藻類のバイオマスが、特に微生物により媒介されるバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成における炭素源としての使用のために、生成される。
一部の態様において、安価、豊富かつ容易に入手可能な炭素原料の炭素源としての使用を含む、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のための方法が提供される。一部の態様において、セルロースまたはヘミセルロースが炭素源として用いられる。一部の態様において、セルロースまたはヘミセルロースは、工業的な副生成物または廃棄生成物から誘導される。一部の態様において、セルロースまたはヘミセルロースは、植物または藻類のバイオマスから直接的に誘導される。植物または藻類のバイオマスは、最も豊富な原料の１つであり、著しい量の非発酵性の糖および繊維、例えばセルロースおよびヘミ−セルロースを含む。一部の態様において、バイオマス原料を、非発酵性の糖または繊維を発酵性の糖へと転換するために前処理し、それにより、それらを微生物の生育および微生物に媒介されるバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために利用可能とする。一部の態様において、バイオマス原料の前処理は、当業者に公知の前処理方法、例えば希酸またはアンモニア繊維伸長（ammonia fiber expansion：AFEX）法を用いて、セルロースおよび／またはヘミセルロース成分をモノマー糖へと脱重合することを含む（例えば、Yang B, Wyman CE. Dilute acid and autohydrolysis pretreatment. Methods Mol Biol. 2009;581:103-14; Balan V, Bals B, Chundawat SP, Marshall D, Dale BE, Lignocellulosic biomass pretreatment using AFEX Methods Mol Biol. 2009;581:61-77を参照）。バイオマスポリマーのモノマー糖への脱重合のための他の方法は、当業者に周知であり、本発明の一部の態様において用いられることが企図される。
一部の態様において、非発酵性の糖を含有するバイオマス原料を、非発酵性の糖をモノマー性の発酵性の糖へと脱重合化するために、希酸法を用いて前処理する。一部の態様において、バイオマスを、中程度に穏和な温度において既定の期間にわたり希硫酸で処理する。例えば、一部の態様において、バイオマスを、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％または約６％の硫酸で処理する。一部の態様において、バイオマスを、約３０℃で、約３７℃で、約４０℃で、約５０℃で、約６０℃で、約７０℃で、約８０℃で、約９０℃で、約１００℃で、約１１０℃で、約１２０℃で、約１３０℃で、約１４０℃で、約１５０℃で、約１７５℃で、約２００℃で、または約２００℃より上で処理する。
一部の態様において、結果として生じる加水分解物は、不溶性のリグニンならびに可溶化したセルロースおよびヘミセルロースポリマーを含有する。後者の生成物を、当業者に周知の方法により、例えば、セルラーゼまたは他の加水分解酵素による処理により、さらに処理して、グルコースおよびキシロースモノマーなどのヘキソースおよびペントース糖を生成することができる。一部の態様において、非発酵性の糖の希酸による処理は、本発明の側面により操作されていない微生物の生育を阻害し、バイアビリティーを低下させ、および／またはバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成を阻害する、毒性の化合物を含む副生成物の生成をもたらす。一部の態様において、前処理した原料を洗浄し、微生物の生育およびバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成を支持する培地を添加し、および／または解毒のために消石灰に通す。
一部の態様において、非発酵性の糖を含有するバイオマス原料を、AFEX法を用いて前処理し、非発酵性の糖をモノマー性の発酵性の糖に脱重合する。一部の態様において、バイオマスを、高い温度および圧力において規定の期間にわたり、液体アンモニウムで処理する。一部の態様において、バイオマスを、約1０分間、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、約６０分間、約７０分間、約８０分間、約９０分間またはそれより長く処理する。一部の態様において、バイオマスを、約３０℃で、約３７℃で、約４０℃で、約５０℃で、約６０℃で、約７０℃で、約８０℃で、約９０℃で、約１００℃で、約１１０℃で、約１２０℃で、約１３０℃で、約１４０℃で、約１５０℃で、約１７５℃で、約２００℃で、または約２００℃より上で処理する。一部の態様において、AFEX前処理は、原料に含有される結晶性セルロースの非晶質の発酵性形態への転換をもたらす。一部の態様において、AFEXで前処理されたバイオマス原料は、微生物の生育および／またはバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成を阻害する著しい量の毒性の副生成物を含まず、前もっての解毒なしで、微生物によるバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために用いられる。
一部の態様において、バイオマス原料を、前処理を伴って、または伴わず、糖ポリマーを加水分解または脱重合する酵素で、例えばセルラーゼまたはヘミセルラーゼ酵素で処理する。一部の態様において、原料を、液相において酵素と接触させ、当該酵素が脱重合または加水分解反応を触媒することを可能にする温度において、バイオマス原料中の著しい量の非発酵性の糖または繊維を脱重合または加水分解するために十分な時間にわたり、インキュベートする。一部の態様において、可溶性の発酵性の糖の画分を含有する酵素と接触させた原料の液相を、加水分解および脱重合のためのインキュベーションの後で、非発酵性の糖および繊維を含む固相から、例えば遠心分離により分離する。一部の態様において、原料の液体の画分を、次いで、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体への転換のために、微生物、例えば本発明の側面により提供される微生物と接触させる。一部の態様において、非発酵性の糖または繊維の酵素による転換は、複合的な生物プロセス、例えば、生成された発酵性の糖のバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体への微生物による転換と同時に、および／または同じリアクターにおいて、起こる。一部の態様において、酵素による転換を第１に行い、酵素と接触させた原料を、次いで、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成のために微生物と接触させる。一部の態様において、酵素によるおよび微生物による転換を、同時に、および同じリアクターにおいて、行う。
一部の態様において、本明細書において提供される操作された微生物、例えばDGA1、ACC1および／またはSCDの遺伝子産物を過剰発現するYarrowia lipolyticaを、アセタートを主要な炭素源として生育する。一部の態様において、微生物を、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、約２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ、約２５％ｖｏｌ／ｖｏｌまたは約３０％ｖｏｌ／ｖｏｌの濃度の酢酸の溶液中で生育する。一部の態様において、アセタートの濃度は、約３％〜１０％ｗｔ／ｖｏｌである。一部の態様において、主要炭素源としてアセタートまたは酢酸において培養される本明細書において提供されるような遺伝子改変された微生物を含む細胞培養物を、グリセロールと接触、またはこれで「スパイク（spike）」する。一部の態様において、遺伝子改変された微生物を、間欠的にグリセロールと接触させる。一部の態様において、微生物を、連続的にまたは反連続的にグリセロールと接触させる。一部の態様において、微生物を、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％または約５％ｖｏｌ／ｖｏｌの濃度においてグリセロールと接触させる。本明細書において提供される操作された微生物をグリセロールと接触させることにより、TAGの生成のための代謝物、ならびに、炭水化物空の脂肪酸の生成のための還元性部分がもたらされる。一部の態様において、アセタート以外の炭素源、例えば本明細書において記載される任意の炭素源を用いるバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体の生成方法において、グリセロールによるスパイク（spiking）を行う。
一部の態様において、本明細書において提供される操作された微生物、例えば、DGA1遺伝子産物ならびに／随意にACC1および／またはSCD遺伝子産物を過剰発現するYarrowia lipolyticaを、炭素源において、例えばアセタートまたは酢酸において生育し、これは、培養における期間の後で、例えば８時間後、２４時間後または４８時間後に、微生物を炭素源のさらなる量と、またはさらなる炭素源のある量と接触させることにより、生育プロセスまたは培養期間の間に補充される。一部の態様において、本明細書において提供される操作された微生物を、第１に、例えば最初の６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６または７２時間、低い炭素対窒素（Ｃ／Ｎ）比、、例えば、約１０、約２０、約２５、約３０、３０未満、２５未満または２０未満のＣ／Ｎ比を含む培養培地において生育する。一部の態様において、低いＣ／Ｎ比は、培養培地に窒素原（例えばアンモニア）を補充して所望のＣ／Ｎ比を達成することにより達成される。一部の態様において、例えば、炭素源、例えばアセタートまたは酢酸が本明細書において記載されるような油を生成する微生物の培養物中に供給される態様において、炭素源を、窒素源、例えばアンモニアで補充する。一部の態様において、培養における最初の期間の後で、例えば培養における最初の６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６または７２時間の後で、窒素源による補充を停止し、それにより、培養中の操作された微生物が窒素源を消費することを可能にし、これは次いで、Ｃ／Ｎ比の増大をもたらす。このＣ／Ｎ比のシフトは、窒素源を補充されていないさらなる炭素源を培養中に供給することにより、例えばアンモニアまたは任意の他の窒素源を補充されていない酢酸またはアセタートを供給することにより、増強するかまたは加速させることができる。一部の態様において、本明細書において記載される操作された微生物による油生成のために最適なＣ／Ｎ比は、８０〜１２０の範囲内である。
一部の態様において、ラージスケールでの微生物に媒介される炭水化物から脂質への転換のための発酵プロセスは、バイオリアクターにおいて行ってもよい。本明細書において用いられる場合、用語「バイオリアクター」および「発酵槽」は、交換可能に用いられ、その中で、その少なくとも一部が生きている生物または生きている生物の一部を含む生物学的および／または化学的反応が起こる、筐体または部分的筐体を指す。「ラージスケールバイオリアクター」または「工業的スケールバイオリアクター」は、商業的または準商業的スケールにおいて、例えばバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体、例えば脂肪酸および／またはTAGを生成するために用いられるバイオリアクターである。ラージスケールバイオリアクターは、典型的には、リットル、数百リットル、数千リットル、またはそれより多くの範囲における容積を有する。
本発明の側面によるバイオリアクターは、微生物または微生物の培養物を含んでもよい。一部の態様において、バイオリアクターは、本発明の側面により提供される胞子および／または任意の単離された微生物の任意の種類の休止状態の細胞型、例えば乾燥状態におけるものを含んでもよい。。一部の態様において、好適な炭水化物源のかかるバイオリアクターへの添加は、休止状態の細胞の活性化、例えば酵母胞子の発芽およびその後の炭水化物源の少なくとも部分的なバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体への転換をもたらし得る。
本発明の側面による一部のバイオリアクターは、微生物が、運動する液体および／または気泡と接触させられる細胞培養システムを含んでもよい。本発明の側面による微生物または微生物の培養は、懸濁において、または固相のキャリアに付着させて生育することができる。キャリアシステムの非限定的な例として、マイクロキャリア（例えばポリマースフェア、マイクロビーズ、およびマイクロディスク；これらは多孔質または非孔質であってよい）、特定の化学基（例えば三級アミン）より荷電された架橋されたビーズ（例えばデキストラン）、非孔質ポリマー繊維中に捕捉された細胞を含む２Ｄマイクロキャリア、３Ｄキャリア（例えばキャリア繊維、中空繊維、マルチカートリッジリアクター、および半透膜；これらは多孔質繊維を含んでもよい）、低いイオン交換能力を有するマイクロキャリア、封入細胞、キャピラリー、ならびに凝集物が挙げられる。キャリアは、デキストラン、ゼラチン、ガラスおよびセルロースなどの材料から製造することができる。
本発明の側面による工業的スケールでの炭水化物から脂質への転換プロセスは、連続的、半連続的または非連続的な様式において運用することができる。本発明による運用モードの非限定的な例は、回分培養、流加培養、拡大回分培養（extended batch）、反復回分培養（repetitive batch）、draw/fill法、rotating-wall法、spinning flask法、および／または灌流方式の運用である。
一部の態様において、基質ストック、例えば炭水化物源の連続的または半連続的な補充、ならびに／または、リアクターからの生成物、例えば分泌された脂質、脂質を含む有機相、および／もしくは所望の脂質含有量を示す細胞の連続的または半連続的な分離を可能にするバイオリアクターを用いることができる。
本発明によるバイオリアクターの非限定的な例は、以下である：撹拌タンク発酵槽、回転する混合デバイスにより撹拌されるバイオリアクター、ケモスタット、振盪デバイスにより撹拌されるバイオリアクター、気泡ポンプ（airlift）発酵槽、充填床リアクター、固定床リアクター、流動床バイオリアクター、波により誘導される撹拌を用いるバイオリアクター、遠心分離バイオリアクター、回転ボトル（roller bottle）、および中空繊維バイオリアクター、回転装置（例えば、卓上用のもの、カートにマウントされたもの、および／または自動化された多様なもの）、垂直に積層されたプレート、スピナーフラスコ、撹拌または振動（rocking）フラスコ、振盪マルチウェルプレート、ＭＤボトル、Ｔフラスコ、Rouxボトル、多面組織培養プロパゲーター、改変された発酵槽、およびコートされたビーズ（例えば、細胞の付着を防止するために血清タンパク質、ニトロセルロース、またはカルボキシメチルセルロースでコートされたビーズ）。
本発明の側面によるバイオリアクターおよび発酵槽は、随意に、反応パラメーターを測定および／または調整するセンサーおよび／または制御システムを含んでもよい。反応パラメーターの非限定的な例は、以下である：生物学的パラメーター、例えば増殖速度、細胞のサイズ、細胞数、細胞密度、細胞型または細胞の状態、化学的パラメーター、例えばｐＨ、酸化還元電位、反応基質および／または生成物の濃度、酸素濃度およびＣＯ２濃度などの溶存気体の濃度、栄養素の濃度、代謝物の濃度、グルコース濃度、グルタミン濃度、ピルバート濃度、アパタイト濃度、オリゴペプチドの濃度、アミノ酸の濃度、ビタミンの濃度、ホルモンの濃度、添加物の濃度、血清濃度、イオン強度、イオンの濃度、相対湿度、モル濃度、モル浸透圧濃度、他の化学物質、例えば緩衝化剤、アジュバントまたは反応副生成物の濃度、物理的／力学的パラメーター、例えば密度、伝導率、撹拌の程度、圧力および流速、剪断応力、剪断速度、粘度、色、濁度、吸光度、混合率、転換率、ならびに、温度、光の強度／質などの熱力学的パラメーターなど。
本明細書において提供されるようなパラメーターを測定することができるセンサーは、関連する力学および電子学の分野における当業者に周知である。本明細書において提供されるようなセンサーからの入力に基づいてバイオリアクターにおけるパラメーターを調整することができる制御システムは、バイオリアクター工学の分野における当業者に周知である。
本発明の側面によるバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体への転換のために使用されるべき炭素源の型は、使用される具体的な微生物に基づく。本発明の側面により提供される一部の微生物は特定の炭水化物源を効率的に転換することができる場合があるが、一方で、異なる炭水化物源は、同じ微生物により高い効率において処理されないか、全く処理されない場合がある。本発明の側面により、例えば含油性酵母Y. lipolyticaは、グルコース、フルクトース、スクロースおよび／またはラクトース等の糖、ならびに糖を多く含む炭水化物源、例えばモラセス、および植物繊維を、脂肪酸およびその誘導体に効率的に転換することができる。
一部の態様において、炭素源原料から生成されたバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体、例えば脂肪酸またはトリアシルグリセロールは、少なくとも部分的に、本発明の側面により提供される微生物、例えばY. lipolytica細胞などの含油性酵母により分泌される。一部の態様において、本発明の側面により提供される微生物を、バイオリアクターにおいて水溶液中で炭水化物源と接触させ、分泌されたバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体は、水相から分離することができる有機相を形成する。用語、有機相とは、本明細書において用いられる場合、非極性の有機化合物、例えば脂肪酸、TAGおよび／または他の非極性の脂質を含む液相を指す。および、本発明による有機相は、微生物、炭水化物、または、それぞれのバイオリアクターにおいて見出される他の相において見出される他の化合物を、さらに含んでもよい。工業的スケールの相分離のために有用な方法は、当業者に周知である。一部の態様において、有機相は、連続的にまたは半連続的にサイフォンで吸い上げられる。一部の態様において、連続的にまたは半連続的に有機相を抽出するセパレーターを含むバイオリアクターが使用される。
一部の態様において、バイオ燃料またはバイオ燃料前駆体は、本発明の側面による細胞において蓄積される。一部の態様において、望ましい量のバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体を蓄積した細胞を、連続的にまたは半連続的に、例えば遠心分離、沈降または濾過により、バイオリアクターから分離する。細胞の分離は、さらに、例えば細胞のサイズまたは密度などの物理的な細胞の特徴に基づいて、当業者に周知の方法により、もたらされてもよい。蓄積されたバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体を、その後、当業者に周知の標準的な抽出の方法、例えば溶媒ヘキサン抽出を用いて、それぞれの細胞から抽出することができる。一部の態様において、微生物細胞を収集して、収集された細胞の容積の３倍のヘキサンで抽出する。一部の態様において、抽出されたバイオ燃料またはバイオ燃料前駆体をさらに精製する。一部の態様において、バイオ燃料前駆体、例えばトリアシルグリセロールは、当業者に周知の方法、例えばエステル転移反応の手順を用いて、バイオ燃料、例えばバイオディーゼルに転換される。
本発明のこれらのおよび他の態様の機能および利点は、以下の例からより完全に理解されるであろう。以下の例は、本発明の利益を説明することを意図されるが、本発明の完全な範囲を例示しない。したがって、例のセクションは、本発明の範囲を限定することを意味しないことが理解されるであろう。
例
例１．
材料および方法
酵母株、生育および培養条件
本研究において用いられたY. lipolytica株は、野生型Y. lipolytica W29株（ATCC20460）から誘導した。全ての形質転換において用いられた栄養要求性Po1g（Leu-）は、Yeastern Biotech Company（Taipei, Taiwan）から得た。本研究において用いられた全ての株を、表１において列記する。
Escherichia coliのための培地および生育条件は、Sambrookら（２１）により先に記載されており、Y. lipolyticaのためのものは、BarthおよびGaillardin（１１）により記載されている。富栄養培地（YPD）は、２０ｇ／ＬのBacto peptone（Difco Laboratories, Detroit, MI）、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物（Difco）、２０ｇ／Ｌのグルコース（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）により調製した。YNB培地は、１．７ｇ／Ｌの酵母窒素基礎培地（アミノ酸なし）（Difco）、０．６９ｇ／ＬのCSM-Leu（MP Biomedicals, Solon, OH）および２０ｇ／Ｌのグルコースにより作製した。選択的YNBプレートは、１．７ｇ／Ｌの酵母窒素基礎培地（アミノ酸なし）、０．６９ｇ／ＬのCSM-Leu、２０ｇ／Ｌのグルコースおよび１５ｇ／ＬのBacto agar（Difco）を含んだ。
以下の培地を用いて振盪フラスコ実験を行った：１．７ｇ／Ｌの酵母窒素基礎培地（アミノ酸なし）、１．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、および５０ｇ／Ｌのグルコース。凍結されたストックから、前培養物をYNB培地に播種した（Falconチューブにおいて５ｍＬ、２００ｒｐｍ、２８℃、２４時間）。オーバーナイト培養物を２５０ｍＬのErlenmeyer振盪フラスコ中の５０ｍＬの培地に０．０５の光学密度（Ａ６００）まで播種し、１００時間（２００ｒｐｍ、２８℃）インキュベートさせ、その後、バイオマス、糖含有量および脂質含有量を取得して分析した。
バイオリアクタースケールの発酵は、２リットルの整流された撹拌タンクバイオリアクターにおいて行った。用いられた培地は、１．５ｇ／Ｌの酵母窒素基礎培地（アミノ酸および硫酸アンモニウムなし）、２ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、および９０ｇ／Ｌのグルコースを含んだ。選択プレートから、最初の前培養物をYPD培地に播種した（２５０ｍＬのErlenmeyerフラスコ中で４０ｍＬ、２００ｒｐｍ、２８℃、２４時間）。２Ｌのリアクター（２．５ｖｖｍのエアレーション、ｐＨ６．８、２８℃、２５０ｒｐｍの撹拌）において、オーバーナイト前培養物からの対数的に増殖する細胞を、０．１の光学密度（Ａ６００）までバイオリアクターに移した。タイムポイント試料をその後の脂質分析のために−２０℃で貯蔵した。糖有機酸含有量を、HPLCにより決定した。バイオマスを、６０℃で２晩乾燥させた試料から重量測定により決定した。
プラスミド構築
本研究を通して標準的な分子遺伝学的技術を用いた（２１）。クローニングにおいて用いられた制限酵素およびPhusion High-Fidelity DNAポリメラーゼは、New England Biolabs（Ipswich, MA）から得た。酵母形質転換体からのゲノムDNAは、Yeastar Genomic DNAキット（Zymo Research, Irvine, CA）を用いて調製した。全ての構築したプラスミドをシークエンシングにより検証した。PCR生成物およびDNAフラグメントを、PCR精製キットまたはQIAEX IIキット（Qiagen, Valencia, CA）で精製した。用いたプラスミドを表３において記載する。用いたプライマーを表４において記載する。
プラスミドpMT010は、Y. lipolytica Po1gゲノムDNAからの翻訳伸長因子−１α（TEF）プロモーター領域（アクセッション番号：AF054508）を、プライマーMT078およびMT079を用いて増幅することにより構築した。アンプリコンを、Yeastern Biotech Company（Taipei, Taiwan）から入手した出発ベクターであるpINA1269（pYLEX1としても知られる）のSalIとKpnI部位との間に挿入した。また、マルチクローニング部位に制限酵素切断部位を付加するために、リバースプライマーMT079中にMluIおよびNsiI部位を含めた。
プラスミドpMT015は、Y. lipolytica Po1gゲノムDNAからTEFプロモーターおよびATG開始コドンおよび113bpの内因性イントロン（アクセッション番号：CR382129）を含む５’コード領域を増幅することにより構築した。プライマーMT118およびMT122をこの増幅に用い、pMT010中のSalIとMluI部位との間に挿入した。クローニングの目的のために、SnaBI制限酵素切断部位を組み込むことができるように、イントロンの一部を取り除いた。このプラスミド中に遺伝子をクローニングすることは、したがって、遺伝子のATG開始コドンの除去、５’プライマーの開始部位へのTAACCGCAGの付加、および５’末端における平滑末端ライゲーションを必要とする。
プラスミドpMT025は、プライマーMT170およびMT171を用いて、E. coliからのβ−ガラクトシダーゼをコードするLacZ遺伝子を増幅して、出発ベクターpINA1269のPmlIおよびBamHI部位中に挿入することにより構築した。プラスミドpMT038は、プライマーMT168およびMT169を用いて、LacZ遺伝子を増幅して、pMT010のMluIおよびNsiI部位中に挿入することにより構築した。LacZは複数のMluI部位を含むため、マッチするオーバーハングを有するMT168において５’制限酵素切断部位としてAscIを用いた。プラスミドpMT037は、LacZ遺伝子を増幅して、pMT015のSnaBIおよびNsiI部位中に挿入することにより構築した。プライマーMT172およびMT169を用い、ここで、フォワードプライマーMT127は、LacZのATG開始コドンを含まず、代わりに、pMT015のイントロン配列を完成させる配列TAACCGCAGで開始する。
プラスミドpMT013は、プライマーMT080およびMT081を用いて、Y. lipolytica Po1gゲノムDNAからのACC1遺伝子（アクセッション番号：XM_501721）を増幅して、pMT010のMluIおよびNsiI部位中に挿入することにより構築した。プラスミドpMT040は、プライマーMT222およびMT137を用いて、pMT013からACC1遺伝子およびそのターミネーターを増幅し、これをPmlおよびClaIで消化した出発ベクターpINA1269中に挿入することにより構築した。
プラスミドpMT053は、プライマーMT271およびMT272を用いて、Y. lipolytica Po1gゲノムDNAからのDGA1遺伝子（アクセッション番号：XM_504700）を増幅することにより構築した。増幅した遺伝子をNsiIで消化し、pMT037の構築におけるものと同じ様式において、PMT015中に挿入した。
ACC1およびDGA1の両方を発現することができる単一のプラスミドを生成するために、プライマーMT220およびMT265を用いて、pMT053からプロモーター−遺伝子−ターミネーターカセットを増幅した。これを次いで、DpnIおよびAseIで消化し、pMT040中に挿入し、これをNruIおよびAseIで消化することにより、タンデム遺伝子コンストラクトpMT065を得た。選択を容易にするためにAseI制限酵素切断部位を選択した。なぜならばそれはアンピシリン耐性マーカー内にあるからである。NruIは平滑末端制限酵素切断部位であり、アンプリコンの挿入はNruI部位の合計数を増加させず、累進的挿入（progressive insertion）を容易にする。
プラスミドを、NotIまたはSacIIのいずれかにより直鎖化し、Chenら（２２）により記載される１ステップ酢酸リチウム形質転換法に従って、Po1g中に染色体に組み込んだ。形質転換体を、選択培地に播種し、調製されたゲノムDNAのPCRにより検証した。検証した形質転換体を、次いで凍結されたストックとして−８０℃で、および選択的YNBプレート上４℃で、貯蔵した。
RNA単離および転写物の定量
酵母株をYNB上で２４時間生育し、収集し、液体窒素で凍結し、８０℃で維持した。試料を、液体窒素中で粉砕し、RNeasy Mini キット（Qiagen）を用いてY. lipolyticaから合計RNAを単離し、製造者の指示に従って、単離ステップの間にRNaseフリーのDNaseで処理した。単離されたRNAを、分光光度法により２６０ｎｍにより定量した。iScript One-step RT-PCRキットおよびSYBR Green（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いてqRT-PCR分析を行った。相対的定量は、ACT1を用いる２ΔＣＴ法に基づき、アクチンを内部対照としてコードした。試料を３部において分析した。
β−ガラクトシダーゼアッセイ
Sigma-Aldrichからのβ−galアッセイキットを用いてLacZ酵素活性を測定した。細胞を、PBSバッファー中に再懸濁し、５００μｍのガラスビーズ（Sigma-Aldrich）と共に２分間ボルテックスすることにより溶解した。細胞ライセートのうち４０μＬを、４７ｍｇ／ｍＬのONPG、０．６ＭのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．４ＭのＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ、０．１ＭのＫＣｌ、０．０１ＭのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏを含む３４０μＬの反応ミックス中に移した。反応を、発色を起こすために３７℃でインキュベートし、最終的に５００μＬの１Ｍの炭酸ナトリウムを用いてクエンチした。次いで、分光光度計により４２０ｎｍで吸光度を測定した。インキュベーション時間および乾燥細胞重量により除算した酵素活性に基づいて、酵素価を計算した。
脂質分析
Folchら（２３）による手順を用いて合計の脂質を抽出した。測定された量の細胞バイオマス（およそ１ｍｇ）を、１ｍＬのクロロホルム：メタノール（２：１）溶液中に懸濁し、１時間ボルテックスした。遠心分離の後で、５００μＬを、１２５μＬの生理食塩水に移した。上部の水層を取り除き、底部の層を蒸発させて、１００μＬのヘキサン中に再懸濁した。次いで、エステル転移反応まで、試料を−２０℃で貯蔵した。
合計の脂質抽出物のエステル転移反応は、１ｍＬのメタノール中２％（ｗｔ／ｖｏｌ）の硫酸を各々の試料に添加することにより行った。試料を次いで、６０℃で２時間インキュベートした。その後、試料を部分的に蒸発させ、１ｍＬのヘキサンを添加して１０分間ボルテックスすることにより脂肪酸メチルエステル（FAME）を抽出した。このヘキサンのうち８００μＬを、次いで、GC分析のためにガラスバイアルに移した。
FAMEのGC分析は、水素炎イオン化検出器を備えたBruker 450-GC装置およびキャピラリーカラムHP-INNOWAX（３０ｍ×０．２５ｍｍ）を用いて行った。GC乾燥器の条件は、以下のとおりであった：１５０℃（１分間）、２３０℃までの１０分間の勾配、２３０℃で２分間保持。分割比は１０：１であった。脂肪酸を同定して、トリデカン酸メチルに対して正規化された市販のFAME標準物（C13:0）との比較により定量した。合計の脂質含有量を、５つのFAME：パルミチン酸メチル（C16:0）、パルミトレイン酸メチル（C16:1）、ステアリン酸メチル（C18:0）、オレイン酸メチル（C18:1）、リノール酸メチル（C18:2）（Sigma-Aldrich）の合計脂肪酸含有量の合計として計算した。クロロホルム−メタノール抽出液へのトリデカン酸の添加を内部標準として用い（これは全分析手順を通して行った）、そのメチルエステルへと転移させた。
結果および考察
発現を増強する翻訳伸長因子−１αのイントロンを利用して高発現プラットフォームを確立する
Y. lipolyticaにおいて、遺伝子発現のために、誘導性のものおよび構成的なものを含む多数のプロモーターが利用可能である（２４）。TEFプロモーターは、元々、強力な構成的プロモーターであるものとして同定された。しかし、その後のクローニングおよび特徴づけは、誘導性XPR2プロモーターと比較してより低い発現をもたらした（２５）。より最近になり、ハイブリッドhp4dプロモーターが、その強力な準構成的発現によりポピュラーとなり（２６）、高いタンパク質発現を必要とする多数の用途において用いられてきた（２０、２７、２８）。
TEFについてのゲノム配列の分析は、オープンリーディングフレームの５’領域における開始コドンのすぐ後における１２２ｂｐのスプライセオソームイントロンの存在を明らかにする。プロモーターの近位のスプライセオソームイントロンは、多様な生物においてそれらの対応する遺伝子の発現に対して劇的な影響を及ぼすことが、しばしば見出されている（２９）。本発明者らは、TEFの強力な発現はこのイントロンに依存し、発現ベクターにおいてプロモーターと共にイントロンを含めることにより、より強力な発現を達成することができることを推測した。実際に、初期のTEFプロモーターのスクリーニングおよび単離は、cDNAライブラリーにおける濃縮のためのイントロンの増強に依存する可能性があり、これは、一旦イントロンがスプライスされた後では認められないであろう特徴であった。
LacZを発現するプラスミドpMT025、pMT037およびpMT038を構築し、３つのプロモーター：合成ハイブリッドプロモーター（php4d）、イントロンを含まないTEFプロモーター（pTEF）、およびイントロンを含むTEFプロモーター（pTEFin）の相対的発現を比較した。特筆すべきことに、TEFinプロモーターは、５０時間の培養の後で、イントロンを含まないTEFプロモーターに対して１７倍の発現の増大を示し、hp4dプロモーターに対して５倍の発現の増大を示す。
他の系において観察されるイントロン増強は、ヒト細胞および酵母における２倍のみから、トウモロコシにおける１０００倍より高くまで、著しく変化する（３０、３１）。イントロンは、調節エレメントを含むこと、mRNAの輸送を促進すること、および転写開始速度を増大することによる、多くの方法において遺伝子発現を増強すると考えられている（２９）。イントロン的遺伝子は、一群として、非イントロン的遺伝子と比較してより高いレベルの発現を示す傾向がある。例えば、S. cerevisiaeにおいて、イントロン的遺伝子は、合計の遺伝子カウントのうちの４％未満を代表するのみであるが、細胞において生成される合計RNAのうちの２７％を占める（３２）。Y. lipolyticaのゲノムは、S. cerevisiaeにおけるたった４．５％と比較して、その遺伝子の１０．６％においてイントロンを含む（３３）。この内因性プロセスを、本発明者ら自身の所望の遺伝子を増強するために協力させることは、発現を最大化させるための単純な手段を表わし、これは、広範な真核生物に適用可能である。例えば、半子嚢菌（hemiascomycetous）酵母の間では、スプライス配列の高い配列相同性が存在する（３４）。研究は、イントロンの機能、進化および目的についてさらに解明するために続くが、一方、バイオテクノロジーの目的のためのイントロンの利用は、相対的に未踏の好機である。
ACC1およびDGA1の過剰発現は、脂質蓄積の著しい増大をもたらす
TEFプロモーターの、その発現増強性イントロンと共の使用は、Y. lipolyticaにおける高遺伝子発現のための優れたプラットフォームを提供する。本発明者らは、したがって、これを、Y. lipolyticaおよびS. cerevisiaeの両方における脂質蓄積において重要であることが示されているDGA1の過剰発現（pMT053）のために用いた（１９、３５）。既に２つの内因性プロモーター近位のイントロンを有するACC1は、TEFinプロモーターと共にはクローニングされなかった。代わりに、それを、TEFおよびhp4dプロモーターと共にクローニングした（それぞれpMT013およびpMT040）。増殖速度および脂質生成は、２つの間で相対的に類似しており（データは示さず）、よって、php4d-ACC1を、脂質の実験のため、およびACC1＋DGA1のタンデム遺伝子構築のため（pMT065）に用いた。hp4dプロモーターをまた、ACC1＋DGA1コンストラクトにおける２つのパラレルな遺伝子カセットの相同組換えの可能性を最少化するために選択した。タンデム遺伝子構築を用いるY. lipolyticaにおける２つの遺伝子の同時共発現は、他においても首尾よく行われている（２０）。
脂質生成に対するACC1およびDGA1の過剰発現の効果は、第１に、振盪フラスコ実験において評価した。対照LacZ株は、８．７７％（ｇ／DCWのｇ）の脂質のみを生成し、これは、グルコースを単独の基質として含む振盪フラスコにおける野生型の性能と同様であった（３６）。ACC1およびDGA1の形質転換体は、いずれも対照より優れ、それぞれ１７．９％および３３．８％の脂質含有物を蓄積した。DGA1は特に、ACC1のほぼ２倍、対照に対してほぼ４倍の脂質蓄積を示した。対照から生成されたバイオマスは、他の株より著しくより高く、このことは、ACC1およびDGA1の発現が、Y. lipolyticaの増殖能力を撹乱させ得ることを示唆した。全体的な油の収率は、３２ｇ／ｇの理論上の最大収率と比較して相対的に低かった（３７）。また、脂肪酸プロフィールの僅かなシフトが存在し、ACC1が著しくより多くのリノール酸を生成し、DGA1がより高い割合のステアリン酸を維持した。オレイン酸の割合は、全ての形質転換体にわたり、相対的にフラットであり続けた。
両方の単一遺伝子形質転換体に対して改善したACC1＋DGA1は、対照に対して４．７倍の改善である４１．４％の脂質含有量を達成することができた。バイオマス 生成は、単一形質転換体に対して改善したが、なお、対照より低かった。油の収率は、０．１１４ｇ／ｇ、または理論上の収率の３５％まで比例的に改善した。
真核生物において、ACCの過剰発現は、限定された脂質生成の改善のみを叶える。含油性真菌Mucor rouxiiからのACC1の、非含油性酵母Hansenula polymorphaにおける異種性発現は、合計脂肪酸含有量の３．８％から５．３％への４０％の増大を達成することができただけであった（３８）。植物においては、シロイヌナズナのACC1の過剰発現は、酵素活性の劇的な増大をもたらしたが、３０％以下の最終脂質含有量の増大しかもたらさなかった（３９、４０）。真核生物においてこの酵素に対して維持される強力な代謝および調節の制御のために改善が限定されたことが疑われる。ACCの発現および活性は、多くの転写因子、タンパク質キナーゼおよび代謝物により影響を及ぼされる（４１）。例えば、Candida（Yarrowia）lipolyticaにおいては、アセチル−CoAシンターゼ変異体におけるアシル−CoAの蓄積は、ACC活性の８倍の低下をもたらした（４２）。それにもかかわらず、Y. lipolyticaは、真核生物における調節の例外を表わし得、これは、ここで本発明者らが内因性ACC1の過剰発現を通して脂質含有量の２倍の増大を達成したことから、その含油性質に非常に役立つ。
DGAの役割は、最近になって脂質合成のために重要であることが見出されたばかりである。Y. lipolyticaにおいて、DGA1pは、優先的に脂肪体の膜表面に局在し、トリグリセリドリパーゼ（TGL3）と協調して作用して、脂肪体内外におけるTAGフラックスの均衡をとる（１６）。したがって、TAGの貯蔵が、そのTGL3pカウンターパートに関して、DGA1pの相対的活性（および豊富さ）に依存することを期待する。また、DGAが、リン脂質合成からフラックスを遠ざけ、それにより脂質合成のための駆動力を作り出すこと（なお必要なリン脂質を生成するためにより多くのフラックスが必要とされるため）が仮説立てられている（６）。結果的に、DGA1の過剰発現は、脂質蓄積に対して著しい効果をもたらした。含油性Δsnf2変異体におけるDGA1の過剰発現は、S. cerevisiaeにおいて２７％までの脂質含有物の蓄積をもたらし、これは２．３倍の増大であった（３５）。植物においては、シロイヌナズナのDGATの過剰発現は、葉において２０倍、全体では２倍の脂質含有量の増大をもたらした（４３）。
脂肪酸とTAG合成経路との間のバランスは、それらが、脂肪酸（上流）経路における生成物およびフィードバック阻害剤と、TAG（下流）経路における一次前駆体との両方として機能するために、アシル−CoA中間体の周囲をめぐる。上流経路の上方調節は、脂肪酸合成のスループットを増大させ、ACCについては特に、フラックスを、細胞質アセチル−CoAについて競合するであろういかなる経路からも遠ざける。下流経路の上方調節は、アシル−CoA中間体を枯渇させることによる駆動力を生み出し、脂肪体におけるTAGの貯蔵の速度を増大させる。しかし、個々に調節された場合、それらは、細胞の代謝および増殖に対する有害効果をもたらし得る不均衡をもたらす。
ACC1およびDGA1を共発現させることにより、上流および下流の経路の両方を同時に上方調節し、これは、中間体により媒介される調節をかく乱することなく、脂質生成の増大をもたらした。それはまた、ACCからの脂質合成を通しての高いフラックスを、DGAによる脂肪体中へのTAGの隔離により提供される駆動力と組み合わせる。結果は、対照より殆ど５倍高い脂質蓄積の相乗的な増大である。実際に、過剰生成および駆動力を、代謝のシンク（sink）と組み合わせることは、近年の代謝工学の努力において、特にバイオ燃料のために、非常に強力な戦略となっている（４４〜４６）。
ACC1＋DGA1形質転換体の発酵性能
ACC1+DGA1形質転換体（MTYL065）をさらに特徴づけ、その脂質蓄積を調査するために、２Ｌの撹拌タンクバイオリアクターを用いて、ラージスケールでの発酵を行った。グルコース濃度を高く、硫酸アンモニウム濃度は低くして、１００のＣ／Ｎモル比を達成した。脂質蓄積のために最適なＣ／Ｎモル比は、典型的には８０〜１２０の範囲である（１５）。
グルコースは、１２０時間の発酵の過程において、完全に消費され、最終バイオマスは、２８．４９ｇ／Ｌに達した（図３）。最終脂質含有量は６１．７％のDCWであり、これは、振盪フラスコ実験と比較して５０％の脂質蓄積の増大であった。このことは、他の糖発酵（２８、４７〜４９）、ならびにex novoでの脂質蓄積スキーム（１９、５０）において見出される値と有利に比較する。全体的な収率および生産力は、それぞれ０．１９５ｇ／ｇおよび０．１４３ｇ／Ｌ／時間であった。しかし、７０〜１００時間の間に観察された最大の脂質生成の間に、０．２７０ｇ／ｇの収率および０．２５３ｇ／Ｌ／時間の生産力が達成された（表２）。この期の間に生成された殆ど全てのバイオマスは、脂質含有量の増大に起因する。達成された全体的なおよび最大収率は、TAG合成についての理論上の収率の６０．９％および８４．３％である。
脂肪酸プロフィールは、スケールアップの間に劇的に変化した（図４）。相対的なステアリン酸の枯渇ならびにパルミチン酸およびオレイン酸の濃縮が観察され、オレイン酸は最終的に合計脂肪酸の４９．３％を含んだ。オレイン酸とステアリン酸との間の比は、発酵を通して確実に増大し（データは示さず）、最終的に、４．６の比となった。これは、振盪フラスコ実験において観察された１．３の比からの劇的な変化である。アセタートを炭素源として、同様の実験を行った。脂肪酸プロフィールを１３４時間において分析し、結果を図５において示す。
高い相対的オレイン酸エステル濃度（５８．５％まで）もまた、他の２Ｌの発酵において観察されており（５１）、これは、５０％より高い脂質含有物を蓄積する他の含油性酵母のプロフィールとより類似する（１５）。迅速な脂質生成の条件において、オレイン酸がより迅速に貯蔵され、より容易に蓄積する可能性がある。なぜならば、DGA1pは、異なるアシル−CoAについて多様な特異性を有することが知られているからである。S. cerevisiaeにおいては、C18:1が最も好ましい基質であり、C18:0の２倍の活性を有する（５２）。さらに、高いオレイン酸濃度はまた、バイオリアクターにおいて達成される（振盪フラスコ発酵においては容易には観察されない）より高いエアレーション速度に対する応答である可能性がある。
ACC1＋DGA1株において観察される高い脂質含有量、収率、および生産力は、Y. lipolyticaの、脂質合成経路を通して高いフラックスを受け入れる生得の能力を示す。さらなる改変およびプロセスの最適化により、脂質合成経路を操作されたY. lipolyticaは、強力で効率的な脂質のde novo合成における有望なブレークスルーを生じ得る。
操作されたACC＋DGA株を用いるアセタートからの脂質の生成
Yarrowia lipolyticaは、天然では、有機酸のアセタートにおいて増殖する。アセタートは、ホモ酢酸生成生物により二酸化炭素または一酸化炭素から非光合成炭素固定経路を介して高収率で生成することができるため、魅力的な基質である。アセタートは、アセチル−coAカルボキシラーゼ（ACC）を介する脂質合成のための主要な前駆体であるアセチル−CoAの形態において細胞の代謝経路に入る。したがって、ACC＋DGA株は、脂質蓄積のための強力な駆動力と組み合わされた酵素を利用する直接的なアセチル−CoAの過剰発現が存在するため、アセタート基質における脂質生成のための有望な候補であると期待される。
ACC＋DGA株を用いて、アセタートを炭素基質として、２リットルのバイオリアクター発酵を行った（図６）。高い酸素含有量において、アセタートは低いバイオマス生成と共に迅速に消費されることが観察され、よって、発酵は、脂質の生成および収率を最大化するために、窒素および酸素の両方を制限した条件において行った。
油生成の最終タイターは、１３０時間後に５．５ｇ／Ｌであり、これは、合計８．９ｇ／Ｌのバイオマス乾燥細胞重量のうちの６２％に寄与した。アセタートにおける全体的な脂質収率は、油０．１５２ｇ／アセタート１ｇであった。脂質生成期（９０〜１３０時間）の間に、油０．２７ｇ／アセタート１ｇの収率において最大の脂質生成が達成され、これは、理論上の最大収率のうちの９６％であった。
グルコースにおけるものとの発酵の特徴の比較は、低いバイオマス収率および増殖速度にもかかわらず、脂質蓄積および最大の脂質収率は釣り合ったことを示す。
結論
脂質生合成は、厳格に調節された代謝経路である。脂質の生成のための工業的に妥当な適用のために、収率および生産力を最大化するための思慮深い代謝工学が必要である。含油性酵母Y. lipolyticaの使用は、脂質蓄積のための高い能力を有すること、および脂質代謝経路を操作するためのツールから利益を受ける。ここで、本発明者らは、脂質合成経路における重要な遺伝子ACC1およびDGA1のイントロンにより増強された共過剰発現が、中程度のＣ／Ｎ比の下でも、脂質の生成に向けた駆動力を提供することを示す。２つの酵素は、脂質合成の第１および最終のステップを行うので、炭素フラックスをTAGへ向ける同時のプッシュおよびプルは、阻害をもたらし得る中間体蓄積を最少にしての生成の増強を可能にする。結果として生じるACC1＋DGA1株は、de novo合成を通して、０．１４３ｇ／Ｌ／時間の全体的な容積測定による生産力において、そのDCWの６２％までを脂質として蓄積することができる。
以下：（ａ）経路遺伝子の強力な過剰発現、（ｂ）上流および下流の経路のバランス、（ｃ）所望の経路に向けてのフラックスの転換、ならびに（ｄ）最終生成物へ向けての駆動力の概念は、代謝ネットワークが操作され、望ましい生成物の生成のために最適化される代謝工学の実施における、傑出した戦略である。脂質蓄積に関するこれらの概念の実行は、微細藻類を含む多数の生物学的プラットフォームへと容易に拡大することができる。これらの戦略は、生物に由来する化学物質および燃料の、強力で効率的な商品規模の生成を可能にすることにおける基礎となるであろう。脂質生合成へのそれらの適用は、微生物油の過剰生成および費用対効果の高いバイオ燃料製造のための経路を開く。
参考文献
例２．
Yarrowia lipolyticaにおける脂質合成遺伝子のコンビナトリアル発現
細胞の代謝の研究は、代謝工学を用いて解明することができる。代謝工学は、生物における代謝経路を操作するための組換えDNA技術の使用である（Bailey 1991）。特定の代謝ネットワークの操作（manipulation）および操作（engineering）を通して、制御因子および速度を制限するステップを同定して詳述することができる。特定の生物または経路についての既存の知識およびツールに基づいて、所望の生成物の生成を再誘導および制御するために新しい摂動力（perturbation）を用いる方法を評価することができる。
脂質生合成は、代謝工学を用いる研究のための優れた経路であり、健康、癌および医薬から、生化学およびバイオ燃料生成まで広がる広範な用途を有する（Beopoulosら、2011；Courchesneら、2009；KohlweinおよびPetschnigg、2007）。細菌からヒトまでの広範な生物における脂質生合成のための生理学、酵素学および代謝は、広範に研究されており、比較分析と試験的分析当業者の両方のための強力な知識の基礎を形成している（Kuratら、2006；OhlroggeおよびJaworski、1997）。脂質代謝は、細胞の生育および増殖からエネルギーの貯蔵および代謝までの細胞生理学の多くの側面において、複合的な役割を果たす（KohlweinおよびPetschnigg、2007；Tehlivetsら、2007）。医学および工業的な目的の両方のためにこれらの経路を利用するために、どの摂動力が全体的なプロセスに対して最も大きな影響を有するかを理解することが重要である。
含油性酵母Yarrowia lipolyticaは、脂質代謝を研究するための優れたモデル生物として突出する。含油性酵母として、Y. lipolyticaは、天然で、炭素リッチな環境において、３６％までの脂質を蓄積することができる（Beopoulosら、2009）。これらの脂質は、脂肪体においてトリアシルグリセリド（TAG）の形態において貯蔵される。それは最も広範に研究されている「ありきたりでない」酵母種であり、ゲノムは配列決定されており、広範な遺伝子学的ツールが利用可能である（BarthおよびGaillardin 1997）。それは多くの工業的用途において用いられており、タンパク質分泌、疎水性基質の利用、脂質代謝、およびミトコンドリア呼吸についてのモデル生物とみなされている（Beckerichら、1998；Beopoulosら、2009；Coelhoら、2010；Kerscherら、2002）。Y. lipolyticaは天然で大量の脂質を蓄積するが、一方で、その脂肪蓄積の特徴をさらに増大させるかまたは他に改善することにおいて、多くの操作の努力が成功してきた（Beopoulosら、2008；Chuangら、2010；DulermoおよびNicaud 2011；Zhangら、2011）。しかし、検討された多くのおよび多様な遺伝子操作が、この目的の方向に相対的に限定されており、脂質の過剰生成のためのプラットフォームとしてのY. lipolyticaの潜在能力は、未だ相対的に研究されないままである。
多様なアプローチおよび戦略を通して、多数の興味深い遺伝子標的が脂質蓄積に関連付けられてきた（Courchesneら、2009）。アセチル−coAカルボキシラーゼ（ACC）は、一般に、脂肪の生合成における速度を制限するステップとして知られており、経路に入るフラックスを制御する。それは、脂肪酸伸長において利用され得るマロニル−coAの生成の原因である。ACCは、細胞質アセチル−coAをその主要な代謝前駆体として利用する。殆どの真核生物において細胞質アセチル−coAを供給する酵素は、ATPクエン酸リアーゼ（ACL）である。ACLは、TCA回路の生成物として、ミトコンドリアからシャトル排出されたシトラートを切断し、アセチル−coAおよびオキサロアセタートを形成する。脂肪酸シンターゼ複合体による脂肪酸生成が完了した後で、アシル−coA分子を、さらに、小胞体において、伸長および不飽和化を通して操作することができる。これらのプロセスは、アシル−coA鎖の化学的特性を改変して、貯蔵および他の代謝経路における利用を容易にするために役立つ。Δ９−不飽和化酵素（D9）などの酵素は、ステアロイル−coA分子を、オレイル−coA分子へと転換し、これは、脂質の調節および代謝の両方において非常に重要であると考えられる（Dobrzyn and Ntambi 2005）。脂質の組み立ておよび貯蔵における最終ステップは、酵素ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGA）を介するジアシルグリセロール（DAG）のTAGへの転換である。このステップは、小胞体および脂肪体の表面の両方において起こり、後者は、生物のエネルギー必要度に依存して、TAGの組み立ておよび分解の動的平衡を確立する（Athenstaedtら、2006）。Y. lipolyticaにおいて、この機能を行う多数のDGA遺伝子が同定されている（Zhangら、2011）。これらの酵素的ステップは、脂質蓄積に対して興味深い関連性を示す。ACCは、細菌において、脂質合成に入るフラックスおよびACCの過剰発現を制御する。Escherichia coliは、６倍の脂肪酸合成の増大をもたらす（Davisら、2000）。クエン酸シャトルは、ACLの制御下にあり、含油性真菌において、非含油性の真菌とは異なって観察され、脂質生合成経路への高いフラックスのために必要な経路として推測される（BoultonおよびRatledge、1981；Vorapreedaら、2012）。また、ACLの脱活性化は、脂質生成において望ましくない現象であるシトラートの蓄積および分泌をもたらすと考えられる（PapanikolaouおよびAggelis、2002；Papanikolaouら、2002）。D9は、癌の代謝に関連すると考えられており、哺乳動物腫瘍細胞において上方調節される。それは、脂質生成の強力な正の調節因子であり、癌細胞において見出される細胞の迅速な増殖のために必要な脂質生成を促進する（DobrzynおよびNtambi、2005；Hulverら、2005；NtambiおよびMiyazaki、2004）。DGAは、脂質貯蔵についての最後に関連するステップであり、S. cerevisiaeのΔsnf2変異体におけるDGAの過剰発現は、脂質蓄積の劇的な増大をもたらす（Kamisakaら、2007）。これらの結果は興味深い結果および暗示をもたらすが、一方で、単一のモデル生物内でのそれらの寄与の分析は、それらがどのようにして脂質生成の増大を達成するために寄与および協同し得るかを体系的に同定することを可能にする。
ここで、本発明者らは、脂質生合成に関与する幾つかの重要な遺伝子の影響に眼を留め、含油性酵母Y. lipolyticaにおける脂質蓄積を増大する方向へのそれらの寄与を研究した。個々に、および組み合わせての、遺伝子標的の過剰発現により、本発明者らは、遺伝子がどのようにして脂質生合成経路を通るフラックスに正の影響を及ぼし得るかを研究することができる。さらに、本発明者らは、高い生産力を達成するための細胞内でのバランスが取れた代謝のフラックスの重要性を解明するために、２つの候補株の脂質生成性能を調査する。
材料および方法
酵母株、生育および培養条件
本研究において用いられたY. lipolytica株は、野生型Y. lipolytica W29株（ATCC20460）から誘導した。全ての形質転換において用いられた栄養要求性Po1g（Leu-）はYeastern Biotech Company（Taipei, Taiwan）から得た。本研究において用いられた全ての株を、表６において列記する。構築したプラスミドをSacIIで直鎖化し、Chenらにより記載される１−ステップ酢酸リチウムによる形質転換方法（Chenら、1997）に従って、Po1g中に染色体に組み込んだ。MTYL形質転換体は、MTYL088およびMTYL089を例外として、それらが組み込まれた対応するプラスミドの番号付けにちなんで名づけた。株MTYL088およびMTYL089、株MTYL078およびMTYL079の構築は、２つのさらなる形質転換のラウンドを経験した：（１）内因性URAをノックアウトするために、選択的5-FOAに対するURA KOカセットで形質転換した；（２）SacIIで直鎖化したPMT092で形質転換した。形質転換体を、選択培地上に播種し、調製されたゲノムDNAのPCRにより検証した。検証された形質転換体を、次いで、凍結グリセロールストックとして−８０℃で、選択的YNBプレート上で４℃で貯蔵した。各々の株について設計された遺伝子の過剰発現の要旨を、表７において記載する。
Escherichia coliのための培地および生育条件は、Sambrookら（Sambrook and Russell 2001）により先に記載されており、Y. lipolyticaのためのものは、BarthおよびGaillardin（BarthおよびGaillardin 1997）により記載されている。富栄養培地（YPD）は、２０ｇ／ＬのBacto peptone（Difco Laboratories, Detroit, MI）、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物（Difco）、２０ｇ／Ｌのグルコース（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を用いて調製した。YNB培地は、１．７ｇ／Ｌの酵母窒素基礎培地（アミノ酸なし）（Difco）、０．６９ｇ／ＬのCSM-Leu（MP Biomedicals, Solon, OH）および２０ｇ／Ｌのグルコースを用いて作製した。選択的YNBプレートは、１．７ｇ／Ｌの酵母窒素基礎培地（アミノ酸なし）、０．６９ｇ／ＬのCSM-Leu、２０ｇ／Ｌのグルコースおよび15g/LのBacto agar（Difco）を含んだ。
以下の培地を用いて振盪フラスコ実験を行った：１．７ｇ／Ｌの酵母窒素基礎培地（アミノ酸なし）、１．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、および５０ｇ／Ｌのグルコース。凍結されたストックから、前培養物をYNB培地に播種した（Falconチューブにおいて５ｍＬ、２００ｒｐｍ、２８℃、２４時間）。オーバーナイト培養物を２５０ｍＬのErlenmeyer振盪フラスコ中の５０ｍＬの培地に０．０５の光学密度（Ａ６００）まで播種し、１００時間（２００ｒｐｍ、２８℃）インキュベートさせ、その後、バイオマス、糖含有量および脂質含有量を取得して分析した。
２リットルの整流された撹拌タンクバイオリアクターにおいて、バイオリアクタースケールの発酵を行った。用いた培地は、１．７ｇ／Ｌの酵母窒素基礎培地（アミノ酸および硫酸アンモニウムなし）、２ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、１ｇ／Ｌの酵母抽出物および９０ｇ／Ｌのグルコースを含んだ。選択プレートから、最初の前培養をYPD培地に播種した（２５０ｍＬのErlenmeyerフラスコ中で４０ｍＬ、２００ｒｐｍ、２８℃、２４時間）。２Ｌのリアクター（２．５ｖｖｍのエアレーション、ｐＨ６．８、２８℃、２５０ｒｐｍの撹拌）において、オーバーナイト前培養物からの対数的に増殖する細胞を、０．１の光学密度（Ａ６００）までバイオリアクター中に移した。タイムポイント試料を、その後の脂質分析のために−２０℃で貯蔵した。糖有機酸含有量を、HPLCにより決定した。試料から決定された重量測定により、バイオマスを決定し、６０℃で２晩乾燥させた。
遺伝学的技術
本研究を通して標準的な分子遺伝学的技術を用いた（Sambrook and Russell 2001）。クローニングにおいて用いた制限酵素およびPhusion High-Fidelity DNAポリメラーゼは、New England Biolabs（Ipswich, MA）から得た。YeastarゲノムDNAキット（Zymo Research, Irvine, CA）を用いて、酵母形質転換体からのゲノムDNAを調製した。全ての構築したプラスミドをシークエンシングにより検証した。PCR生成物およびDNAフラグメントを、PCR精製キットまたはQIAEX IIキット（Qiagen, Valencia, CA）で精製した。用いたプラスミドを表６において記載する。用いたプライマーを表９において記載する。
URA3の欠失
Y. lipolyticaの株におけるマーカーの利用可能性を増大させるために、ウラシル原栄養性をコードする遺伝子、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（URA3, アクセッション番号：AJ306421）を増幅し、URA栄養要求株の生成のためのノックアウトカセットの基礎として用いた。URAオープンリーディングフレームの上流および下流の配列を、それぞれ、プライマーペアMT310−MT311およびMT312−MT313を用いて増幅した。プライマーは、２つのアンプリコンが２３ｂｐの重複領域を担持するように設計される。２つのアンプリコンの精製の後で、両方の生成物を混合し、プライマーMT310およびMT313を用いてPCRを行い、上流および下流のアンプリコンを融合する４５６ｂｐのアンプリコンを生成する。このDNAを精製し、その後Po1g中に形質転換する。形質転換された細胞を、次いで、ウラシルおよび５−フルオロオロチン酸（5-FOA）を含有する選択培地プレート上に播種する。生育したコロニーを、5-FOAプレート上に再播種して、URA栄養要求性について選択し、調製されたゲノムDNAのPCRにより検証した。結果として生じたΔLEU2ΔURA3株を、MTYL100と名付けた。
プラスミド構築
プラスミドpMT010、pMT015、pMT038、pMT040、pMT013およびpMT065の構築は、上に記載した。それらは、ここで記載される方法と類似する。ATP：クエン酸リアーゼサブユニット１を発現するプラスミドpMT047を、プライマーMT252およびMT253を用いて、Y. lipolytica Po1gゲノムDNAからのACL1遺伝子（アクセッション番号：XM_504787）を増幅して、MT010のMluIおよびNsiI部位中に挿入することにより構築した。ATP：クエン酸リアーゼサブユニット２を発現するプラスミドpMT049を、プライマーMT254およびMT255を用いて、Y. lipolytica Po1gゲノムDNAからのACL2遺伝子（アクセッション番号：XM_503231）を増幅して、それをpMT010のMluIおよびNsiI部位中に挿入することにより、同様に構築した。デルタ−９脂肪酸不飽和化酵素（D9）を発現するプラスミドpMT061を、php4dプロモーターの制御下において、制限酵素切断部位PmlIおよびBamHIをプライマーMT283およびMT284と共に用いて、Po1gゲノムDNA（アクセッション番号：XM_501496）から増幅してpINA1269中に挿入した。
複数の遺伝子（pMT050、pMT065、pMT066、pMT073、pMT074、pMT075、pMT078、pMT079）を発現するプラスミドを生成するために、プロモーター−遺伝子−ターミネーターカセットを、プライマーMT220およびMT26を用いて１つのプラスミドから増幅した。これを次いで、DpnIおよびAseIで消化し、NruIおよびAseIで消化された第２のプラスミド中に挿入し、タンデム遺伝子コンストラクトpMT065を得た。AseI制限酵素切断部位は、アンピシリン耐性マーカー内に存在するので、選択を容易にするためにこれを選択した。NruIは平滑末端制限酵素切断部位であるので、挿入物のライゲーションは、NruI部位の合計数を増大せず、したがって、同じプロセスを用いての反復的挿入を可能にする。これらのプラスミドのコンビナトリアル構築のための全体的な配列およびスキームを、図７において記載する。相補的ベクターの構築のために、pACYCDUET-1を相補的シャトルベクターとして選択した。なぜならばそれが、異なる骨格、選択マーカーおよび複製起点を利用するからである。Y. lipolytica Po1gのゲノムDNAから、プライマーペアMT316−MT317を用いてLIP2（アクセッション番号：XM_500282）の上流の配列を増幅し、制限酵素切断部位BamHIおよびEcoRIを用いてpDUET中に組み込んだ。LIP2の下流配列を、プライマーペアMT318−MT319を用いて増幅し、制限酵素切断部位KpnIおよびAvrIIを用いてpDUET中に組み込んだ。酵母のウラシル原栄養性についての選択マーカーを、プラスミドJMP62-URAからプライマーペアMT314−MT315を用いて増幅し、制限酵素切断部位PvuIおよびKpnIを用いてpDUET中に組み込んだ。結果として生じたプラスミドpMT091は、上流と下流とのLIP2配列に挟まれたマルチクローニング部位、およびURA3マーカーを含んだ。制限酵素SacIIによる消化は、プラスミドを直鎖化し、組み込みベクターをプラスミド骨格から分離し、外来の不必要なDNAの組み込みを最少化する。相補的プラスミドの使用は、元のpINA1269骨格上での発現カセットの構築、および次いで制限酵素サブクローニングを用いてカセットをpMT091にトランスファーすることを必要とする。大きなマルチクローニング部位および判別の目安となる抗生物質マーカーは、クローニングおよび選択のプロセスを容易にする。
RNAの単離および転写物の定量
４２時間増殖させたフラスコ培養を収集し、５分間１０，０００ｇにおいて遠心分離した。各ペレットを、１．０ｍｌのTrizol試薬（Invitrogen）中に再懸濁し、１００μＬの酸で洗浄したグラスビーズを添加した（Sigma-Aldrich）。細胞溶解が起こるように、チューブを１５分間４℃においてボルテックスした。チューブを次いで、１０分間１２，０００ｇで４℃において遠心分離し、新しい２ｍＬのチューブ中に上清を収集した。２００μＬのクロロホルムを、次いで添加し、チューブを手で１０秒間振った。チューブを、再度１０分間１２，０００ｇで４℃において遠心分離した。上の水相のうちの４００μＬを、新しいチューブに移し、等容積のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（ｐＨ４．７）（Ambion, Austin, TX）を添加した。チューブを再度手で１０秒間振って、１０分間１２，０００ｇで４℃において遠心分離した。上相のうちの２５０μＬを、等容積の冷たいエタノールおよび１／１０の容積の酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と共に新しいチューブに移した。チューブを−２０℃で３０分間冷やし、沈澱を促進した。チューブを次いで、５分間１２，０００ｇで遠心分離し、７０％エタノールで２回洗浄し、６０℃のオーブンにおいて乾燥させ、最終的にRNAseフリーの水中で再懸濁した。NanoDrop ND-1000分光光度計（NanoDrop Technologies, Wilmington, DE）を用いてRNAの量を分析し、試料を−８０℃のフリーザーで貯蔵した。iScript One-step RT-PCRキットおよびSYBR Green（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いて、using the Bio-Rad iCycler iQリアルタイムPCR検出システムを用いて、qRT-PCR分析を行った。リアルタイムPCR Minerを用いて蛍光の結果を分析し、REST 2009（Qiagen）で、アクチンを参照遺伝子として、およびMTYL038を参照株として用いて（ZhaoおよびFernald 2005）、定量的および統計学的分析を決定した。試料を、４部において分析した。
脂質の抽出および定量
Folchら(Folchら、1957）による手順を用いて、合計の脂質を抽出した。測定された量の細胞のバイオマス（およそ１ｍｇ）を、１ｍＬのクロロホルム：メタノール（２：１）溶液中で懸濁し、１時間ボルテックスした。遠心分離の後で、５００μＬを、１２５μＬの生理食塩水に移した。上の水層を取り除き、底部の層を蒸発させて、１００μＬのヘキサン中に再懸濁した。次いで、試料を、エステル転移反応まで−２０℃において貯蔵した。
合計の脂質抽出物のエステル転移反応は、１ｍＬのメタノール中２％（ｗｔ／ｖｏｌ）の硫酸を各々の試料に添加することにより行った。試料を次いで、６０℃で２時間インキュベートした。その後、試料を部分的に蒸発させ、１ｍＬのヘキサンを添加して１０分間ボルテックスすることにより脂肪酸メチルエステル（FAME）を抽出した。このヘキサンのうち８００μＬを、次いで、GC分析のためにガラスバイアルに移した。
FAMEのGC分析は、水素炎イオン化検出器を備えたBruker 450-GC装置およびキャピラリーカラムHP-INNOWAX（３０ｍ×０．２５ｍｍ）を用いて行った。GC乾燥器の条件は、以下のとおりであった：１５０℃（１分間）、２３０℃までの１０分間の勾配、２３０℃で２分間保持。分割比は１０：１であった。脂肪酸を同定して、トリデカン酸メチルに対して正規化された市販のFAME標準物（C13:0）との比較により定量した。合計の脂質含有量を、５つのFAME：パルミチン酸メチル（C16:0）、パルミトレイン酸メチル（C16:1）、ステアリン酸メチル（C18:0）、オレイン酸メチル（C18:1）、リノール酸メチル（C18:2）（Sigma-Aldrich）の合計脂肪酸含有量の合計として計算した。クロロホルム−メタノール抽出液へのトリデカン酸の添加を内部標準として用い（これは全分析手順を通して行った）、そのメチルエステルへと転移させた。
結果＆考察
相補的ベクター構築はDGAの発現のための代替的方法を可能にする。
Y. lipolyticaにおいて遺伝子を発現させるための代替的および相補的な方法を提供するために、親株Po1gのURAマーカーをノックアウトした。相補的組み込みベクターの設計の一部として、ドッキング部位として細胞外リパーゼLIP2遺伝子を選択した。なぜならば、この遺伝子は、よく特徴づけられており、de novoでの脂質の合成および蓄積に対して無視し得るかまたは中性的な効果を有する可能性があるためである。したがって、相補的ベクターを組み込むプロセスにおいて、LIP2はノックアウトされるであろう。遺伝子発現のための相補的ベクターの構築の際に、遺伝子の発現が、どの形質転換ベクターを用いたかに依存して影響を及ぼされるであろうか否かを検討する必要がある。これを試験するために、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGA）をコードする遺伝子を、pMT015およびpMT091ベクターの両方へクローニングした。いずれのベクターにおいても発現カセットは同じであったが、ドッキング部位は異なった：pMT015（および全てのpINA1269に基づくベクター）についてはpBR322ドッキング部位、ならびにpMT091についてはLIP2遺伝子。これらのベクターの形質転換およびゲノム組み込みの検証の後で、抽出されたRNAのRT-PCRを両方の株について行い、対照株（MTYL038）と比較しての両方の場合におけるDGAの過剰発現を検討した。図８において示すように、いずれの株も、MTYL038対照株と比較して、３２倍のDGA発現の増大を示した。結果は、遺伝子発現のための、相補的ベクターとしてのpMT091、および代替的ドッキング部位としてのLIP2の使用を検証し、起こり得るエピジェネティックな現象からの検出可能な干渉はなかった。
コンビナトリアルコンストラクトの完全な調査は、選択遺伝子を有する改善された株を同定した。
遺伝子標的の寄与および相互作用を研究するために、形質転換株の脂質生成能力を試験するために、多様な中間遺伝子発現の組み合わせにわたり、調査を行った。表７は、１３の構築された株およびそれらの対応する遺伝子の上方調節を記載する。脂質の測定は、単なる脂質蓄積ではなく脂質生産力を比較するために、全て１００時間の培養の後で行った。工業的な目的のためには、合計の脂質含有量よりも全体的な生産力がより重要な測定である。なぜならば、ゆっくりと増殖し高収率で生成する株は、なお、早く増殖する中程度に高い収率の株よりも有用ではない場合があるからである。脂質の生産力および収率の完全な調査の結果を、図９において示す。
単一遺伝子の過剰発現（MTYL040、MTYL053、MTYL050、MTYL061）のみを含有する株を試験してみると、ACCおよびDGAが、生産力および収率の両方において明らかな改善を有する。ACLおよびD9は、生産力または収率のいずれにおいても、任意の著しい増大を有さなかった。これらの結果は、Y. lipolyticaについて、ACCおよびDGAは、脂質生合成に対する制御を示し、速度を制限するステップであるが、一方、ACLおよびD9は、同様の現象を示さないことを示す。
ACCおよびDGAの効果は上で深く議論したが、DGAは、脂質を隔離することおよびアシル−coA中間体を枯渇させることにより駆動力を生み出すが、一方、ACCは、フラックスを脂質合成に方向づけることおよび細胞質アセチル−coAのプールをより迅速に動態化することにより収率を増大させる。２つの遺伝子を株MTYL065と組み合わせた場合、それらは、脂質合成経路内において、アシル−coAをバランスが取れた中間体として、プッシュ−および−プル動力学を確立することによる相乗的応答を生成する。
他の遺伝子と組み合わせた場合、遺伝子D9は、脂質生産力に対して僅かな利益を付与することができた。例えば、D9およびDGAを過剰発現するMTYL069は、DGA過剰発現のみを含むMTYL053よりも高い脂質生産力を有した。同様に、ACCおよびD9を過剰発現するMTYL066は、ACCのみを過剰発現するMTYL040よりも高い脂質生産力を有した。しかし、ACC＋D9＋DGAを過剰発現するMTYL073は、MTYL065よりも低い脂質生産力を示した。MTYL089と、そのD9を欠失するバリアントであるMTYL088との間で、有意差は存在しなかった。蓄積および生産力について幾らかの利益が観察された一方で、収率についての利益は著しくなかった。D9が、他の遺伝子との組合せにおいて、脂質生成を改善するだけであるという観察から、D9は、脂質合成プロセスに対して強力な調節的または速度制限的な制御を有さないが、その酵素作用は、他の遺伝子の効果を拡大する有利な条件を提供することを示唆することが考えられる。脂肪体膜および小胞体における膜関連酵素として、D9は、脂質蓄積期の間に上方調節される（Morinら、2011）。多くの脂質合成酵素は、D9不飽和化の生成物であるオレイン酸エステルに対して最も高い特異性を有することが見出された（Oelkersら、2002）。このことはまた、Y. lipolyticaが、炭素源としてオレイン酸エステルにおいて非常に迅速に増殖し、この基質なしでの増殖について広範に研究されているという観察においても示される（Beopoulosら、2008；Fickersら、2005）。結果として、オレイン酸エステルの濃度の増大は、脂質の生成または収率を特に駆動しないが、脂肪酸のプールを、より迅速に隔離されるように転換する。このことは、最終的に、収率の増大を伴わずに、より速い速度の脂質蓄積をもたらす。なぜならば、隔離の増大は、脂質合成が既に他の操作により上方調節されている場合においてのみ起こるからである。
対照的に、ACLの過剰発現を他の遺伝子と組み合わせた場合、脂質生産力は減少する傾向がある。MTYL078およびMTYL079は、ACCおよび／またはD9を過剰発現するにもかかわらず、脂質生成の著しい増大を示さない。ACC＋ACL＋DGAを収容するMTYL088は、対照に対して脂質生成を増大させたが、MTYL065に対しては何らの脂質生成の改善も示さなかった。これらの結果は、ACLは代謝ネットワーク全体の炭素フラックスの分布に影響を及ぼしている可能性があるが、ACLの過剰発現は、独立してであっても他の脂質生成の改善と組み合わせてであっても、脂質生成を著しく促進せず、殆どの場合においては、脂質生産力を低下させることを示す。このことは、ATPクエン酸リアーゼは、含油性酵母において、非含油性酵母と比較して異なって発現する酵素であるが、一方で、多様な生物におけるその遺伝子の活性は、測定される含油性とは相関関係を有さないという観察と類似する（BoultonおよびRatledge、1981）。
脂質調査からの別の観察は、複数の他の標的と一緒のDGAの発現が、典型的には、生産力および収率の両方において、同様の応答をもたらしたことである。これらのコンストラクトにおいて起こる発現または活性において、幾らかの飽和状態が存在することは可能であるが、このプラトーに達した応答はまた、用いた実験の限界に起因した可能性もある。なぜならば、この調査における測定された特徴は、静止期の脂質蓄積または生産力ではなく、初期の全体的な生産力であるからである。さらに、株MTYL065は、明らかに最も強力な生産力を示す一方で、収率は、プラトーに達した株の多くと相対的に類似した。このことは、これらの株の全てが、首尾よくフラックスを脂質に方向づけ、増大した収率を提供する一方で、MTYL065は、高い生産力および収率の両方を達成するその上流と下流との経路のバランスにおいて、例外的であることを示唆する。これらの結果は、最適な生産性および収率を達成するための、代謝ネットワークのフラックスに対して均衡をとる摂動の重要性（これは、増殖と組み合わせた生成物についての代謝工学における一般的なテーマである）を強調する（Feistら、2010；Tyoら、2007）。
完全なコンストラクトのRT-PCR分析は、MTYL089における過剰発現を示す。
脂質調査のプラトーに達した領域を研究するために、ACC＋D9＋ACL12＋DGAを過剰発現する株MTYL089を、さらに調査した。株は、２つのプラスミド、pMT079およびpMT092の、Y. lipolyticaのΔLEUおよびΔURA MTYL100バックグラウンド株への形質転換から構築した。２つのプラスミドの使用は、第１にプラスミドのサイズの考慮に起因する。なぜならば、pMT079は既に４つのタンデム発現カセットを含み、２３ｋｂの長さであったからである。ゲノムDNAのPCRにより、両方のプラスミドの株中への首尾よい組み込みを確認し、各々の個々の発現カセットの正確な組み込みを確認した。完成し検証された株の対照株と比較してのRT-PCR分析により、５つの遺伝子全ての正しい転写による過剰発現を確認した（図１０）。TEFin発現下における唯一の遺伝子であるDGAの強力な過剰発現は、同じプロモーターを利用する多数のカセットからの潜在的な競合があってすら、スプライセオソームイントロンの増強の特徴を示す。イントロンを含まないTEFプロモーターの制御下にあるACCは、最も低い発現を示した。またTEFプロモーターの制御下にあるACLの２つのサブユニットは、hp4dプロモーターの制御下にあったD9より高い発現を示した。サンプリングは対数増殖期（ここでhp4dが準増殖依存的発現を示し得る（Madzakら、2000））の十分に後で行ったので、hp4dおよびTEFの構成的発現は、全て、相対的に互いに近いように観察された。これらの結果は、標的遺伝子の十分な過剰発現を示す。
MTYL089の２Ｌの発酵は、強力な脂質蓄積能力を示す。
株MTYL089における遺伝子発現の検証の後で、当該株の脂質生成性能を、２Ｌのバイオリアクター発酵において試験した。培地のＣ／Ｎ比を、脂質蓄積を促進することを補助するために１００に調整した。Ｃ／Ｎ比は、窒素が枯渇した後での発酵において利用可能な過剰炭素の量を決定し、シトラート生成に対して脂質生成を最適化するために、しばしば繊細なバランスを必要とする（Beopoulosら、2009）。図１１は、回分培養発酵の期間についての時間プロフィールを示す。１８５時間の発酵の後で、９０ｇ／Ｌのグルコースは全て消費され、２６ｇ／Ｌのバイオマス（乾燥細胞重量）、および０．１０９ｇ脂質／Ｌ／時間の生産力について著しい７６．８％の脂質含有量を生じた。グルコースに対する脂質の全体的収率は、０．２２７ｇ脂質／ｇグルコースであり、これは、理論上の最大収率の７０％である。脂質蓄積期の間（６６〜１８５時間）に、脂質の生産力および収率の最大値が、それぞれ０．１５４ｇ脂質／Ｌ／時間および０．２７７ｇ脂質／ｇグルコースにおいて達成され、収率は最大の理論上の収率の８５％まで増大した。
図１２において示される発酵の終了時における細胞培養の顕微鏡法は、全ての細胞が大きな液胞を含み、これは実質的に細胞の全容積を占めることを示す。ナイルレッド染色および蛍光は、液胞が、主に中性脂肪からなることを示す。典型的に生産力が低い幾つかの菌糸細胞（Coelhoら、2010）ですら、著しい脂質蓄積を示し、細胞の長さに沿って複数の脂肪体を生成する。
培養において観察された劇的な脂質の蓄積にもかかわらず、特に、MTYL065を用いる先の研究との比較において、多数の特徴が望ましくないことが見出された。第１に、脂質生成と同時に７５時間の時点に開始する、著しい量のシトラート生成が起こる。シトラートは、脂質生合成経路の中間体であり、オキサロアセタートおよび脂質生成の前駆体であるアセチル−coAへの酵素による転換のために、ATPクエン酸リアーゼを利用する。MTYL089株における両方のACL酵素の過剰発現にもかかわらず、シトラートの蓄積はなお観察された。Ｃ／Ｎ比が高すぎた可能性があり、これは、脂質生成の替わりにシトラート生成をもたらすことが示されている（Beopoulosら、2009）；しかし、本発明者らの結果は、シトラートと脂質との両方が、同時に生成されていることを示す。この組み合わされた両方の生成物の生成は、株MTYL065による実験において観察されるシトラート生成期が後となる別々の脂質生成期とは異なる。さらに、Ｃ／Ｎ比は、この大量のシトラート生成を示さなかったMTYL065の回分培養発酵と一致した。このことは、発酵条件下における不適当な量のATP生成が、経路への高い上流のフラックスと組み合わされて、最終的に分泌をもたらす細胞内シトラートプールの蓄積をもたらした可能性がより高いことを示す。さらに、MTYL089において、著しくより低い生産力が観察された。エアレーションは、発酵を通して一定に維持されているので、発酵の後期のステージにおいては、酸素に制限される増殖が予測される。しかし、線形増殖の開始は、この発酵において、MTYL065によるものよりはるかに早くに起こり、バイオマス濃度が約６ｇ／Ｌに達した僅か１日後に起こった。このより早い線形増殖の開始は、より長い発酵時間をもたらし、したがって、より高い脂質含有量にもかかわらず、より低い生産力をもたらす。エアレーションはまた、MTYL065の発酵条件とも一致するので、MTYL089の代謝の差異が、増殖に対してより高い制限を課している可能性がある。一方で、MTYL089は、MTYL065における０．１９５ｇ脂質／ｇグルコースと比較して、より良好な全体的な脂質収率である０．２２７ｇ／ｇを示した。それはまた、１７．６ｇ／Ｌと比較して、より高いタイターである２０．２ｇ／Ｌ脂質により発酵を終了した。
表８は、株MTYL065とMTYL089との２Ｌの発酵の間での、重要な性能特徴の比較をまとめる。脂肪酸プロフィールの比較（図１３）は、株間での僅かのみの脂肪酸の分布の差異を示し、一価不飽和脂肪酸であるパルミトレアートおよびオレアートについてより強力な性能を有する。ACLおよびD9の過剰発現のさらなる効果は、脂質合成へ向かうフラックスを増大すると考えられるが、これと一致する細胞の代謝によるATP生成の増大は存在しないので、シトラートは、脂質合成経路において利用されるより寧ろ、副生成物として分泌される。脂質の合成および貯蔵は、資源について増殖と強力に競合するので、この活性を管理するために厳格な調節が通常では必要である（Tehlivetsら、2007）。これら４つの遺伝子標的の過剰発現は、この調節の相当量を解除しており、その結果として、本発明者らは、細胞増殖と脂質生成との間の優先順位についての強力な競合を観察している。代謝工学における一般的なテーマとして、特定の生成物の生成を最大化することは、しばしば、所望の生成物へ向かうフラックスならびに生物の全体的な健康および生育の均衡をとることを必要とする。MTYL065とMTYL089との間のコントラストは、明らかにこの必要性を実証し、MTYL065は、脂質合成経路を通してのより最適化されたフラックスを例証している。
結論
脂質生合成の成分は、よく理解されているが、一方で、遺伝子の摂動が、特に組み合わせにおいて、どのようにしてこの経路を通しての能力およびフラックスに対して影響を及ぼすかについては、なお相当の未知の知見が存在する。含油性酵母Y. lipolyticaを研究することにより、本発明者らは、脂質生成についての天然の能力を有する宿主細胞を、代謝工学が脂質の生産力および収率を改善することができる範囲を研究するために利用することができる。本発明者らは、４つの遺伝子標的−ACC、D9、ACL、DGA−を検討し、４つの標的全ての過剰発現を担持する株による２Ｌのバイオリアクターにおいて、著しい７６．８％の脂質含有量を達成することができる。コンビナトリアルな過剰発現を通してのこれらの遺伝子標的のさらなる調査により、本発明者らは、脂質生成に対するこれらの遺伝子の正の影響をランク付けすることができ、DGAおよびACCは強力な正の寄与体であり、D9は他の遺伝子と組み合わされた場合にのみ僅かな寄与を果たし、最終的にACLは著しい正の寄与を果たさなかった。本発明者らはまた、個々の効果の間の起こり得る相互作用を探索して、ACCとDGAとの間に最も強力な相乗的相互作用を同定することができた。微生物による脂質の生成は、広範な用途を有し、バイオディーゼルの生成におけるその利用について、早くから注目を得て来た。脂質合成の中心的経路の代謝工学は、これらの将来的な技術およびプロセスを可能にすることにおいて成功をもたらす上で重要となるであろう。
参考文献
例３．
材料および方法
酵母株、生育および培養条件
例１において記載されるとおりのYarrowia lipolytica（MTLY065）のACC+DGA1形質転換体株を、本セクションにおいて記載される実験において使用した。YPD培地は、例１において記載されるように調製した。バイオリアクターにおいて用いた培地構成要素は、酵母窒素基礎培地（アミノ酸および硫酸アンモニウムなし）（Amresco）、酵母抽出物（Difco）、硫酸アンモニウム（Macron Chemicals）、酢酸ナトリウム（Macron Chemicals）および酢酸（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）であった。２Ｌの整流された撹拌タンクリアクターにおいて、バイオリアクターの実行を行った。バイオリアクターのための接種材料は、例１において記載されるように調製した。
バイオリアクターの運用：アセタート、酢酸および硫酸アンモニウムの供給
リアクターにおける最初の培地組成は、以下：３０ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、２．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、４．２５ｇ／Ｌの酵母窒素基礎培地および２．４ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムであった。本セクションにおいて記載される実験において用いられた酵母抽出物および酵母窒素基礎培地濃度は、例１において議論されるものと比較して高かった。バイオマス生成のために十分な窒素を提供するために、２０の炭素対窒素比（Ｃ／Ｎ）を選択した。カスケード制御を用いて、リアクターにおいて常に２０％の一定溶存酸素レベルを維持した。７．３のｐＨのセットポイントを用いた。
後で脂質蓄積のためのプラットフォームとして役立つであろう高い細胞密度をもたらすために、酢酸を供給することにより３０ｇ／Ｌの酢酸ナトリウムの炭素源を補給する戦略を考案し、実行した。酢酸の使用は、それが細胞を増殖および分裂させるための炭素源を提供することと、同時にｐＨの制御をもたらすこととの二重の目的に役立つことにおいて、幾つかの利点を有した。増殖の初期の間低いＣ／Ｎ比を維持するために、酢酸と同時に窒素源を供給した。増殖の初期は、３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）酢酸の酢酸１リットルあたり１５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを供給することを含んだ。その後の供給は、純粋な１００％酢酸（および硫酸アンモニウムなし）を含み、それにより、窒素が細胞により消費されて培地から枯渇するにつれ、Ｃ／Ｎ比の増大をもたらし、脂質蓄積の改善をもたらした。
実行の開始時における稼働容積は、酸のうちの１．６Ｌであり、硫酸アンモニウム溶液を、初めの６０時間にわたり添加した。およそ２００ｍｌの純粋な酢酸を、その後の４０時間にわたり添加した。培養容積は、２４時間ごとに測定の目的のために行われたサンプリング以外のいかなる時点においても取り除かれなかった。リアクターに入るさらなる容積を補填するために、液体を蒸発させた。高いエアレーション速度（２．５ｖｖｍ）は、十分な蒸発をもたらし、これは、リアクターの容積を維持する上で役立った。蒸発を伴ってすら、ブロスの容積は、実行の間に、およそ１．８Ｌまで僅かに上がっただけであった。
培養ブロスの光学密度（OD）を、２４時間毎に測定した。試料を、脂質分析のために−２０℃で貯蔵した。HPLC分析は、リアクターにおけるアセタートのレベルを示した。YSI 7100アンモニア電極（YSI Life Sciences）により、アンモニアを測定した。例１において議論されるように、バイオマスを決定した。
脂質分析
脂質分析は、米国特許第7,932,077号およびGriffithsら、LIPIDS（2010）45:1053-1060（これらの各々の全内容は、本明細書において参考として援用される）から適応させた直接的なエステル転移反応プロトコルを含む。プロトコルは、０．５Ｎのナトリウムメトキシドおよび１８Ｍの硫酸（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）を使用した。ナトリウムメトキシドは、水酸化ナトリウム（Macron Chemicals）およびメタノール（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）を用いて自家生成した。５００μＬの０．５Ｎのナトリウムメトキシドを、第１に、ペレット化した細胞試料のうちの１ｍｇに添加し、その後、１時間ボルテックスした。その後、４０μＬの硫酸および５００μＬのヘキサンを添加し、その後、３０分間、別のボルテックスステップを行い、エステル転移したメチルエステルをヘキサン中に溶解させた。反応混合物を、１分間８０００ｒｐｍで遠心分離し、上のヘキサン相のうちの８００μＬをGCバイアル中へ移し、GC-FIDにおいて分析した。GCカラム、操作方法、および最終分析は、トリデカン酸の替わりにトリヘプタデカン酸グリセリルを対照として用いたことを除いて、例１において議論した方法に従った。
結果および考察
バイオリアクターの実行の結果を表１０にまとめる。

図１４および１５は、代表的なアセタートバイオリアクターの実行の間の、窒素、非脂質および脂質のタイター、脂質含有量およびＣ／Ｎ比の傾向を示す。非脂質バイオマスは、窒素をリアクター中に供給した増殖の初期の間に増加した。４８時間後、殆ど全てのバイオマスは、脂質蓄積に起因して増大する。この期間において、細胞は、０．２４ｇ／ｇの収率において、および１ｇ／Ｌ／ｈの速度において、脂質を合成し、５５ｇ／Ｌの最終脂質タイターを生成したが、これは例１において記載される実験において達成されたタイターよりも少なくとも１０倍高い。最終脂質含有量および全体的な脂質収率は、しかし、例１における脂質含有量および全体的な脂質収率と非常に類似していた。これらの数値は、殆どは、使用された微生物の株に依存する。脂質のほぼ７０％はオレイン酸であることが見出され、これは、例１において記載される知見と一致する。
ここで議論される実行は、ACC＋DGA1変異体を用いて、上述の操作戦略および最適なプロセス条件の適応を通して、脂質生成を最大化することを目的とした。この実行の結果と例１において示されるものとの比較を、表１１において示す。１０倍のタイターの改善および１４倍の全体的な生産力の改善が、アセタートの実行との間で観察される。
高い脂質含有量（８０％より高い）を有する細胞は、遠心分離において沈降する代わりに浮遊する。これらの細胞は、顕微鏡下において油で充填されているように見える。図１６は、ナイルレッドで染色したかかる細胞を油浸顕微鏡（１００×）下において示す。明赤色のスポットは、脂質液胞である。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許および配列データベースエントリーは、その全体において、各々の個々の刊行物または特許が具体的におよび個別に参考として援用されることが示されているものとして、本明細書により参考として援用される。矛盾する場合、本明細書における任意の定義を含む本願が優先する。
均等物および範囲
当業者は、慣用的な実験のみを用いて、本明細書において記載される発明の特定の態様に対する多くの均等物を、認識するかまたは確認することができる。本発明の範囲は、上の記載に限定されることを意図されず、添付の請求の範囲において記載される。
請求の範囲において、「a」、「an」および「the」などの冠詞は、矛盾するかまたは他に文脈から明らかでない限りにおいて、１または１より多くを意味し得る。群の１または２以上のメンバーの間に「or」を含む請求の範囲または記載は、矛盾するかまたは他に文脈から明らかでない限りにおいて、群のメンバーのうちの１、１より多く、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに対して他の方法で関連する場合に、満たされたものとみなされる。本発明は、群のうちの正確に１のメンバーが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに対して他の方法で関連する態様を含む。本発明はまた、群のうちの１より多くまたは全てのメンバーが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに対して他の方法で関連する態様を含む。
さらに、本発明は、請求項の１または２以上からの、または説明の関連する部分からの、１または２以上の限定、要素、条項、説明的用語などが、別の請求項中に導入される、全てのバリエーション、組み合わせ、および順列を包含することが理解されるべきである。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基礎請求項に依存する任意の他の請求項において見出される１または２以上の限定を含むように改変する事ができる。さらに、請求項が組成物を記述する場合、他に示されない限りにおいて、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかでない限りにおいて、本明細書において開示される目的のいずれかのために当該組成物を使用する方法が含まれること、および本明細書において開示される製造の方法または当該分野において公知の他の方法のいずれかにより組成物を製造する方法が含まれることが理解されるべきである。
要素がリストとして、例えばマーカッシュ群式において存在する場合、要素の各々のサブグループもまた開示され、任意の要素を群から取り除くことができることが理解されるべきである。また、用語「含む（comprising）」は、オープンであることを意図され、さらなる要素またはステップの包含を許容することに注意する。一般に、本発明または本発明の側面が、特定の要素、特徴、ステップなどを含むものとして言及される場合、本発明または本発明の側面のある態様が、かかる要素、特徴、ステップなどからなるか、またはこれらから本質的になることが、理解されるべきである。単純化を目的として、これらの態様は、本明細書においてその言葉のとおりには具体的に記載されていない。したがって、１または２以上の要素、特徴、ステップなどを含む本発明の各々の態様について、本発明はまた、それらの要素、特徴、ステップなどからなるか、またはこれらから本質的になる態様を提供する。
範囲が示される場合、エンドポイントは含まれる。さらに、他に示されるか、または文脈および／もしくは当業者の理解から他に明らかでない限りにおいて、範囲として表わされる値は、文脈が明らかに他に指示しない限りにおいて、本発明の異なる態様において記述された範囲内の任意の特定の値を、当該範囲の下限の単位の１０分の１まで想定することができることが理解されるべきである。また、他に指示されるか、または文脈および／もしくは当業者の理解から他に明らかでない限りにおいて、範囲として表わされる値は、所与の範囲内の任意の部分範囲を想定することができ、ここで、部分範囲のエンドポイントは、当該範囲の下限の単位の１０分の１と同じ程度の正確さで表わされることが、理解されるべきである。
さらに、本発明の任意の特定の態様は、請求項のうちの任意の１または２以上から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。範囲が示される場合、当該範囲内の任意の値は、請求項のうちの任意の１または２以上から明示的に除外され得る。本発明の組成物および／または方法の側面の任意の態様、要素、特徴、適用または側面は、１または２以上の請求項から除外することができる。簡潔さを目的として、本明細書において、１または２以上の要素、特徴、目的または側面が除外される態様の全てを明示的には記載しない。

Claims (9)

  1. ＤＧＡ１遺伝子産物およびＡＣＣ１遺伝子産物の発現を増加させる遺伝子改変を含む単離された含油性酵母細胞であって、
    遺伝子改変が、ＤＧＡ１遺伝子産物をコードする核酸を含む発現カセットを含む第１の核酸コンストラクト；およびＡＣＣ１遺伝子産物をコードする核酸を含む発現カセットを含む第２の核酸コンストラクトを含み；
    ここで、第１の核酸コンストラクトが、翻訳伸長因子−１α（ＴＥＦ）のプロモーター配列、転写開始部位、および転写開始部位の下流にあるイントロン配列を含むイントロンにより増強されたプロモーターをさらに含む、前記細胞。
  2. ＳＣＤ遺伝子産物および／もしくはＡＣＬ遺伝子産物の発現を増加させる遺伝子改変をさらに含む請求項１に記載の単離された含油性酵母細胞であって、
    遺伝子改変が、ＳＣＤおよび／もしくはＡＣＬ遺伝子産物をコードする核酸を含む発現カセット、または
    プロモーター配列、転写開始部位、および転写開始部位の下流にあるイントロンにより増強されたプロモーターをコードする核酸ならびにＳＣＤおよび／もしくはＡＣＬ遺伝子産物をコードする核酸を含む発現カセット
    を含む核酸コンストラクトを含む、前記細胞。
  3. 遺伝子産物の増大した発現が、脂肪酸、脂肪酸誘導体および／またはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）への炭素源の転換についての有益な表現型を、含油性細胞に付与し、有益な表現型が、改変された脂肪酸プロフィール、改変されたＴＡＧプロフィール、増大した脂肪酸および／またはトリアシルグリセロールの合成速度、増大した転換収率、含油性細胞における増大したトリアシルグリセロール蓄積、ならびに／あるいは、含油性細胞の脂肪体における増大したトリアシルグリセロール蓄積を含む、請求項１または２に記載の単離された含油性酵母細胞。
  4. 細胞が、０．０２５ｇ／ｇ〜０．３２ｇ／ｇ（生成されたＴＡＧのｇ／消費されたグルコースのｇ）の範囲内の転換率において、炭素源を脂肪酸またはＴＡＧに転換する、請求項３に記載の単離された含油性酵母細胞。
  5. 炭素源を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された含油性酵母細胞またはその培養物と接触させることであって、前記細胞が、ＤＧＡ１遺伝子産物の発現を増大させる遺伝子改変を含む；および
    前記細胞による、脂肪酸またはトリアシルグリセロールへの前記炭素源の少なくとも部分的な転換に好適な条件下において、前記細胞と接触させた前記炭素源をインキュベートすること
    を含み、炭素源が、
    （ａ）発酵性の糖、および／または、
    （ｂ）グルコース、および／または、
    （ｃ）アセタート、および／または、
    （ｄ）酢酸、
    を含む方法。
  6. 細胞が、少なくとも０．１１ｇ／ｇ（生成されたＴＡＧのｇ／消費されたグルコースのｇ）の範囲内の転換率において、炭素源を脂肪酸またはＴＡＧに転換する、請求項３に記載の単離された含油性酵母細胞。
  7. 細胞が、少なくとも０．１９５ｇ／ｇ（生成されたＴＡＧのｇ／消費されたグルコースのｇ）の範囲内の転換率において、炭素源を脂肪酸またはＴＡＧに転換する、請求項３に記載の単離された含油性酵母細胞。
  8. 細胞が、少なくとも０．２４ｇ／ｇ（生成されたＴＡＧのｇ／消費されたグルコースのｇ）の範囲内の転換率において、炭素源を脂肪酸またはＴＡＧに転換する、請求項３に記載の単離された含油性酵母細胞。
  9. 細胞が、少なくとも０．２７ｇ／ｇ（生成されたＴＡＧのｇ／消費されたグルコースのｇ）の範囲内の転換率において、炭素源を脂肪酸またはＴＡＧに転換する、請求項３に記載の単離された含油性酵母細胞。
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