BR112014009245A2

BR112014009245A2 - célula oleaginosa e método para produção de óleos microbiano

Info

Publication number: BR112014009245A2
Application number: BR112014009245-1A
Authority: BR
Inventors: Gregory Stephanopoulos; Mitchell Tai; Sagar Chakraborty
Original assignee: Massachusetts Institute Of Technology
Priority date: 2011-10-19
Filing date: 2012-10-19
Publication date: 2020-10-27
Also published as: EP2768954A1; EP2768954B1; EP3388516A1; JP2014530626A; US20130143282A1; CN104160020A; JP6294827B2; RU2014119784A; RU2652875C2; CN109468241A; KR102036389B1; US9862977B2; KR20140091004A; US8951776B2; EP2768954A4; WO2013059649A1; US20150167034A1

Abstract

micróbios construídos e métodos para produção de óleo microbiano. alguns aspectos da presente invenção proporcionam micróbios construídos para a produção de óleo. métodos para a engenharia microbiana e para uso de micróbios construídos são também aqui fornecidos. em algumas modalidades, os micróbios são fornecidos os quais são construídos para modular uma combinação de etapas de controle de taxa de síntese de lipídios, por exemplo, uma combinação de uma etapa de geração de metabólitos, acetil-coa, atp ou nadph para síntese de lipídios (uma etapa de envio), e uma etapa de sequestrar um produto ou um intermediário de uma via da síntese de lipídios que medeia a inibição do retorno de síntese de lipídios (uma etapa de trazer). tais micróbios construídos com vai-e-vem apresentam rendimentos de conversão bastante reforçados e propriedades de síntese e armazenamento de tag.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLULA OLEAGINOSA E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ÓLEOS MICRO- BIANO".

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Estes pedidos reivindicam prioridade sob 35 USC $ 119 ao pedido de patente provisório US U.S.S.N. 61/548,901, depositado em 19 de outubro de 201; e pedido de patente provisório US U.S.S.N. 61/663,263, depositado em 22 de junho de 2012, ambos intitulados "Engineered Microbes and Methods for Microbial Oil Production", todo o conteúdo de cada um dos quais é aqui incorporado por referência.

APOIO GOVERNAMENTAL

[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob No. De Concessão DE-ARO000059 emitido pelo Departamento de Energia dos EUA. O governo tem certos direitos nesta invenção.

ANTECEDENTES

[003] Biocombustíveis produzidos de forma sustentável são uma alternativa aos combustíveis fósseis e podem ajudar a aliviar o esgo- tamento dos estoques de combustíveis fósseis de fácil acesso, evitan- do a poluição associada a combustíveis fósseis e emissões de gases de efeito estufa, satisfazendo assim a demanda crescente de energia a preços acessíveis de uma forma sustentável. O desenvolvimento de métodos e de organismos produtores de óleo adequados para a con- versão eficiente de fontes de carbono para lipídios é pré-requisito para a implementação generalizada da produção de biocombustíveis micro- bianos.

SUMÁRIO DE ALGUNS ASPECTOS DA INVENÇÃO

[004] Produção de óleo microbiano por organismos heterotrófi- cos é um caminho mais promissor para a produção rentável de bio- combustíveis a partir de fontes renováveis desde que altos forneci- mentos de conversão possam ser alcançados. A chave para a produ-

ção de óleo microbiano rentável a partir de matérias-primas renováveis é um carboidrato elevado para rendimento de conversão de óleo. En- genharia metabólica surgiu como a tecnologia que permite ser aplica- da para esse fim e existem numerosos exemplos de engenharia que muito melhoram o desempenho de biocatalisadores microbianos na síntese de produtos químicos, farmacêuticos e produtos de combustí- veis.

[005] Esforços anteriores de micróbios construídos para a produ- ção de óleo têm sido centrados na amplificação de etapas de controle de taxa presumida na via de síntese de ácidos graxos. Uma desvanta- gem significativa de tais amplificações é que o aumento do fluxo de carbono na via da síntese de ácidos graxos aumenta o nível de ácidos graxos saturados na célula, que ativam um ciclo de feedback negativo potente de biossíntese de ácidos graxos.

[006] Alguns aspectos da presente divulgação proporcionam uma estratégia para a engenharia de micróbio que combina a amplificação a montante, vias de formação de metabólitos, também aqui referidas como "empurrar" vias metabólicas, com um aumento semelhante no fluxo a jusante, vias de produto sequestrantes, também aqui referidas como "puxar" vias. Alguns aspectos desta invenção proveem que uma combinação equilibrada de modificações push-and-pull em um micró- bio resultam em grandes amplificações de fluxos de carbono em vias de síntese de lipídios, sem desvios significativos das concentrações de metabólitos intermediários de seus níveis fisiológicos homeostáticos, evitando assim a inibição do feedback de síntese de lipídios.

[007] Alguns aspectos da presente divulgação referem-se ao re- conhecimento de que os efeitos de modificações de único ramo, como por exemplo, modificações apenas de push ou modificações apenas de pull, somente sobre a eficiência da conversão são tipicamente limi- tada por causa da regulação compensatória de rendimento na síntese na célula, e que uma modulação concertada de etapas push and pull de biossíntese de lipídios nas células microbianas resulta em um efeito sinérgico surpreendente na produção de lipídios.

[008] Por exemplo, alguns aspectos da presente divulgação pro- porcionam micróbios oleaginosos geneticamente modificados que compreendem uma combinação de modificações em suas vias bios- sintéticas de lipídios, também aqui referidas como modificações push- pull. Em algumas modalidades, um micróbio aqui proporcionado com- preende uma modificação efetuando um aumento da produção de me- tabolitos ou produtos intermediários necessários para a síntese de lipí- dios e uma modificação resultando no sequestro de um produto de sín- tese de lipídios, por exemplo, de triacilglicerol em um lipídio de arma- zenamento no interior da célula, aliviando assim a inibição do feedback de síntese de lipídios por alguns de seus produtos, por exemplo, por ácidos graxos ou diacilgliceróis. Em algumas modalidades, a combina- ção de modificações das vias metabólicas pull e vias metabólicas push resulta na produção de lipídios sinergicamente aumentada. Em algu- mas modalidades, os resultados de modificação de push em um nível aumentado de blocos de construção de síntese lipídica, ou metabolitos para a síntese de lipídios, na célula. Em algumas modalidades, a mo- dificação de pull alivia a inibição de feedback de síntese de lipídios.

[009] Alguns aspectos da presente invenção proporcionam mi- cróbios que compreendem as modificações genéticas que simultane- amente afetando uma via de push e uma de pull de biossíntese de li- pídios. Por exemplo, modificações push and pull foram introduzidas em um modelo de micróbio para a produção de óleo, a levedura olea- ginosa Yarrowia lipolytica. A sobre-expressão de diacilglicerol acil- transferase (DGA1), a etapa final da via de síntese de triglicerídeo (TAG) foi investigada como uma modificação de pull exemplar. Sobre- expressão de DGA1 resultou em um aumento de 4 vezes na produção de lipídio sobre micróbios de controle, para um teor de lipídios de 33,8% de peso celular seco (DCW). A sobre-expressão de acetil-CoA carboxilase (ACC1), a primeira etapa comprometida da síntese dos ácidos graxos, foi investigada como uma modificação de push exem- plar. Sobre-expressão de ACC1 aumentou conteúdo lipídico 2 vezes sobre o controle, a um teor de lipídios de 17,9%. Coexpressão simul- tânea de ACC1 e DGA1 de um construto de expressão genética em tandem foi investigada como uma modificação de push-pull exemplar. Sobre-expressão de ACC1 e DGA1 simultânea aumentou ainda mais o conteúdo lipídico de 41,4%, demonstrando efeitos sinérgicos de Coex- pressão de ACC1 + DGAT1.

[0010] As características de produção de lipídios do transformante ACC1 + DGAT1 foram exploradas em um biorreator de fermentação 2- L, alcançando 61,7% de teor lipídico após 120 horas. O rendimento global e a produtividade eram 0,195 g/g e 0,143 g/L/h, respectivamen- te, enquanto que o rendimento e a produtividade máxima foi de 0,270 g/g e 0,253 g/L/h durante a fase de acumulação lipídica da fermenta- ção. Este trabalho demonstra a excelente capacidade para a produção de lipídios pela levedura oleaginosa Y. lipolytica e os efeitos de enge- nharia metabólica das duas etapas importantes do processo de sínte- se de lipídios, que atua para desviar o fluxo para a síntese de lipídios e cria força motriz para a síntese de TAG.

[0011] Alguns aspectos da presente invenção proporcionam uma nova plataforma de sobre-expressão para uso em micróbios produto- res de óleo, por exemplo, em levedura oleaginosa. Alguns aspectos da presente invenção proporcionam construtos de expressão compreen- dendo um promotor de transcrição de condução de uma transcrição que compreende uma sequência de codificação e um íntron, por e- xemplo, um promotor de fator-1a de alongamento de tradução (TEF) posicionado a montante de uma sequência de ácido nucleico que compreende um íntron e uma sequência de codificação. Alguns aspec- tos dessa divulgação proveem que tais construtos de expressão con- tendo íntrons são capazes de aumentar a expressão em pelo menos 17 vezes ao longo do promotor TEF sem íntron.

[0012] Alguns aspectos da presente divulgação proveem uma cé- lula oleaginosa isolada compreendendo uma modificação genética que aumenta a expressão de um produto de gene DGA1. Em algumas mo- dalidades, a célula oleaginosa isolada compreende adicionalmente uma modificação genética que aumenta a expressão de um produto de gene de ACC1. Em algumas modalidades, a célula oleaginosa isolada compreende adicionalmente uma modificação genética que aumenta a expressão de um produto de gene de SCD. Em algumas modalidades, a célula oleaginosa isolada compreende adicionalmente uma modifica- ção genética que aumenta a expressão de um produto de gene de ACL. Em algumas modalidades, a modificação genética compreende um construto de ácido nucleico que aumenta a expressão do produto de gene, o construto de ácido nucleico compreendendo: (a) um casse- te de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o produto de gene sob o controle de um promotor homó- logo ou heterólogo adequado, e/ou (b) uma sequência de ácido nuclei- co que modula o nível de expressão do produto de gene quando inse- rido no genoma da célula. Em algumas modalidades, o promotor é um induzível ou um promotor constitutivo. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de TEF. Em algumas modalidades, o constru- to de expressão adicionalmente compreende um íntron. Em algumas modalidades, o íntron está a jusante do local de iniciação da transcri- ção. Em algumas modalidades, o íntron está dentro da sequência de ácido nucleico que codifica o produto de gene. Em algumas modalida- des, o construto de ácido nucleico inibe ou interrompe a regulação na- tural de um gene nativo que codifica o produto de gene, resultando em sobre-expressão do gene nativo.

Em algumas modalidades, a inibição ou interrupção da regulação natural do gene nativo é mediada pela eliminação, ruptura, mutação e/ou substituição de uma região regula- dora, ou parte de uma região reguladora que regula a expressão gené- tica.

Em algumas modalidades, o produto de gene é uma transcrição.

Em algumas modalidades, o produto de gene é uma proteína.

Em al- gumas modalidades, o construto de ácido nucleico é inserido no ge- noma da célula.

Em algumas modalidades, o aumento da expressão do produto de gene confere um fenótipo benéfico para a conversão de uma fonte de carbono em um lipídio, por exemplo, um ácido graxo, de- rivado de ácido graxo e/ou triacilglicerol (TAG) para a célula.

Em al- gumas modalidades, o fenótipo benéfico compreende um perfil de áci- do graxo modificado, um perfil TAG modificado, um aumento de ácido graxo e/ou taxa de síntese de triacilglicerol, um aumento de rendimen- to de conversão, um aumento da acumulação de triacilgliceróis na cé- lula, e/ou um aumento da acumulação de triacilgliceróis em um corpo lipídico da célula.

Em algumas modalidades, a taxa de síntese de um ácido graxo ou um TAG da célula é pelo menos 2 vezes maior, em comparação com células não modificadas do mesmo tipo de célula.

Em algumas modalidades, a taxa de síntese de um ácido graxo ou um TAG da célula é pelo menos 5 vezes maior, em comparação com célu- las não modificadas do mesmo tipo de célula.

Em algumas modalida- des, a taxa de síntese de um ácido graxo ou um TAG da célula é pelo menos 10 vezes maior, em comparação com células não modificadas do mesmo tipo de célula.

Em algumas modalidades, a célula converte uma fonte de carbono em um ácido graxo ou em um TAG, a uma taxa de conversão dentro da faixa de cerca de 0,025 9g/g a cerca de 0,32 9/g (por exemplo, g de lipídios produzidos / q de fonte de carbono con- sumida). Em algumas modalidades, a célula converte uma fonte de carbono em um ácido graxo ou em um TAG, a uma taxa de conversão de pelo menos cerca de 0,11 g/g. Em algumas modalidades, a célula converte uma fonte de carbono em um ácido graxo ou em um TAG, a uma taxa de conversão de pelo menos cerca de 0,195 9g/g. Em algu- mas modalidades, a célula converte uma fonte de carbono em um áci- do graxo ou em um TAG, a uma taxa de conversão de pelo menos cerca de 0,24 g/g. Em algumas modalidades, a célula converte uma fonte de carbono em um ácido graxo ou em um TAG, a uma taxa de conversão de pelo menos cerca de 0,27 g/g. Em algumas modalida- des, a célula compreende um corpo de lipídio ou vacúolo. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de bactéria, uma célula de algas, uma célula de fungo, ou uma célula de levedura. Em algumas modali- dades, a célula é uma célula de levedura oleaginosa. Em algumas modalidades, a célula é uma célula Y. lipolytica.

[0013] Alguns aspectos da presente divulgação proveem uma cul- tura compreendendo uma célula oleaginosa, por exemplo, uma célula oleaginosa, como aqui descrita. Em algumas modalidades, a cultura adicionalmente compreende uma fonte de carbono. Em algumas mo- dalidades, a fonte de carbono compreende um açúcar fermentável. Em algumas modalidades, o açúcar é um açúcar fermentável C6. Em al- gumas modalidades, a fonte de carbono compreende glicose. Em al- gumas modalidades, a fonte de carbono compreende um ácido orgâni- co. Em algumas modalidades, o ácido orgânico é ácido acético. Em algumas modalidades, o ácido acético é a uma concentração de pelo menos 5% v/v, pelo menos 10% vol/vol, pelo menos 15% vol/vol, de pelo menos 20% vol/vol, de pelo menos 25% vol/vol, ou pelo menos 30% vol/vol. Em algumas modalidades, a fonte de carbono compreen- de acetato. Em algumas modalidades, o acetato está presente em uma concentração de pelo menos 1% vol/ívol. Em algumas modalida- des, o acetato está presente em uma concentração de pelo menos 2% em vol/vol. Em algumas modalidades, o acetato está presente em uma concentração de pelo menos 3% vol/vol. Em algumas modalidades, o acetato está presente em uma concentração de pelo menos 4% em vol/ívol. Em algumas modalidades, o acetato está presente em uma concentração de pelo menos 5% vol/vol. Em algumas modalidades, a cultura compreende glicerol. Em algumas modalidades, o glicerol está em uma concentração de cerca de 2% vol/vol. Em algumas modalida- des, a cultura compreende um nível de oxigênio dissolvido de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, ou pelo menos 20%. Em algumas modalidades, a cultura apresenta um pH dentro da faixa de pH 7,0 a pH 7,5. Em algumas modalidades, a cultura compreende sulfato de amônio. Em algumas modalidades, a cultura compreende sulfato de amônio e ácido acético a uma razão de 1:2. Em algumas modalidades, a cultura apresenta uma titulação lipídica, entre 5 g/l e 60 g/l. Em algumas modalidades, a cultura apresenta uma produção de lipídios entre 0,04 g/L/h, e 0,60 g/L/h. Em algumas modalidades, a cultura apresenta uma produtividade máxima de lipídios de entre 0,1 glL/h, e 1 g/L/h.

[0014] Alguns aspectos da presente divulgação proveem um mé- todo que compreende contatar uma fonte de carbono com uma célula oleaginosa isolada, a célula, compreendendo uma modificação genéti- ca que aumenta a expressão de um produto de gene DGA1; e incubar a fonte de carbono em contato com a célula em condições adequadas para a conversão pelo menos parcial da fonte de carbono em um ácido graxo ou um triacilglicero| pela célula. Em algumas modalidades, a cé- lula oleaginosa adicionalmente compreende uma modificação genética que aumenta a expressão de um produto de gene de ACC1. Em algu- mas modalidades, a célula oleaginosa adicionalmente compreende uma modificação genética que aumenta a expressão de um produto de gene de SCD. Em algumas modalidades, a célula oleaginosa adicio- nalmente compreende uma modificação genética que aumenta a ex-

pressão de um produto de gene de ACL.

Em algumas modalidades, a célula oleaginosa isolada é uma célula oleaginosa isolada construída, tal como aqui descrito.

Em algumas modalidades, a fonte de carbono compreende um açúcar fermentável.

Em algumas modalidades, a fon- te de carbono compreende glicose.

Em algumas modalidades, a fonte de carbono compreende acetato.

Em algumas modalidades, o acetato está presente em uma concentração de pelo menos 1% v/v, de pelo menos 2% em vol/vol, de pelo menos 3% em vol/vol, de pelo menos 4% em vol/vol, ou de pelo menos 5% vol/vol.

Em algumas modalida- des, a fonte de carbono compreende ácido acético.

Em algumas mo- dalidades, o ácido acético está a uma concentração de pelo menos 5% vlv, pelo menos 10% vol/vol, de pelo menos 15% vol/vol, de pelo me- nos 20% vol/vol, de pelo menos 25% vol/vol, ou pelo menos 30% vol/vol.

Em algumas modalidades, o método compreende contatar a célula com o oxigênio dissolvido a um nível de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, ou pelo menos 20%. Em algumas mo- dalidades, contatar e/ou incubar é realizado a um pH dentro da faixa de pH 7,0 a pH 7,5. 70. O método de qualquer uma das reivindicações 53-69, em que o método compreende contatar a célula com o sulfato de amônio.

Em algumas modalidades, o método compreende contatar a célula com sulfato de amônio e ácido acético a uma razão de 1:2. Em algumas modalidades, o método adicionalmente compreende con- tatar as células com glicerol.

Em algumas modalidades, o método compreende contatar as células com glicerol a uma concentração de cerca de 2% vol/vol.

Em algumas modalidades, a fonte de carbono em contato com a célula oleaginosa isolada é incubada em um reator.

Em algumas modalidades, a fonte de carbono é colocada em contato com a célula oleaginosa isolada e incubada para conversão da fonte de carbono em um ácido graxo ou um triacilglicerol em um processo de alimentação em batelada.

Em algumas modalidades, a fonte de carbo-

no é colocada em contato com a célula oleaginosa isolada e incubada para conversão da fonte de carbono em um ácido graxo ou um triacil- glicerol em um processo contínuo. Em algumas modalidades, o méto- do adicionalmente compreende contatar uma quantidade adicional da fonte de carbono ou uma quantidade de uma fonte de carbono adicio- nal com a fonte de carbono em contato com as células oleaginosas isoladas uma ou mais vezes durante a etapa de incubação. Em algu- mas modalidades, o ácido graxo ou o triacilglicerol é extraído da fonte de carbono em contato com a célula oleaginosa isolada por extração do solvente. Em algumas modalidades, a extração do solvente com- preende uma extração de clorofórmio metanol. Em algumas modalida- des, a extração do solvente compreende uma extração com hexano. Em algumas modalidades, o ácido graxo ou o triacilglicerol é separado da fonte de carbono em contato com a célula oleaginosa isolada e posteriormente refinado por transesterificação.

[0015] Alguns aspectos da presente divulgação proveem um mé- todo compreendendo modificar o perfil dos ácidos graxos, o perfil de triacilglicerol, a taxa de síntese dos ácidos graxos, a taxa de síntese de triacilglicerol, a excepa da acumulação de derivado de ácido graxo, a taxa de secreção de derivado de ácido graxo, a taxa de conversão de carboidrato em ácido graxo ou derivado de ácido graxo, e/ou o rendi- mento eficiente de conversão de carboidratos em ácido graxo ou deri- vado de ácido graxo em uma célula oleaginosa aumentando na célula a expressão de um produto de gene DGA1. Em algumas modalidades, o método adicionalmente compreende aumentar na célula a expressão de um produto de gene de ACC1, de um produto de gene de SCD, e/ou de um produto de gene de ACL. Em algumas modalidades, a ex- cepa da acumulação de derivado de ácido graxo é a excepa da acu- mulação de derivado de ácido graxo em um corpo de lipídios. Em al- gumas modalidades, o derivado de ácido graxo é um triacilglicerol. Em algumas modalidades, a modificação do perfil dos ácidos graxos, o perfil de triacilglicerol, a taxa de síntese dos ácidos graxos, a taxa de síntese de triacilglicerol, a excepa da acumulação de derivado de áci- do graxo, a taxa de secreção de derivado de ácido graxo, a taxa de conversão de carboidrato em ácido graxo ou derivado de graxo ácido, e/ou o rendimento eficiente de conversão de carboidrato em ácido gra- xo ou derivado de graxo ácido na célula oleaginosa compreende o aumento da taxa de síntese de ácidos graxos, a taxa de síntese de triacilglicerol, a excepa da acumulação de derivado de ácido graxo, a taxa de secreção de derivado de ácido graxo, a taxa de conversão de carboidrato em ácido graxo ou derivado de graxo ácido, e/ou o rendi- mento eficiente de conversão de carboidrato em ácido graxo ou deri- vado de graxo ácido na célula oleaginosa. Em algumas modalidades, modificar a eficiência de conversão de carboidrato em ácido graxo ou derivado de graxo ácido da célula compreende o aumento da eficiên- cia de conversão em pelo menos duas vezes. Em algumas modalida- des, modificar a eficiência de conversão de carboidrato em ácido graxo ou derivado de graxo ácido da célula compreende o aumento da efici- ência de conversão em pelo menos 3 vezes. Em algumas modalida- des, modificar a eficiência de conversão de carboidrato em ácido graxo ou derivado de graxo ácido na célula compreende o aumento da efici- ência de conversão em pelo menos 4 vezes. Em algumas modalida- des, modificar a eficiência de conversão de carboidrato em ácido graxo ou derivado de graxo ácido na célula compreende o aumento da efici- ência de conversão em pelo menos 5 vezes. Em algumas modalida- des, a célula é uma célula de levedura. Em algumas modalidades, a célula de levedura é uma célula Yarrowia sp. Em algumas modalida- des, a levedura oleaginosa é Y. lipolytica.

[0016] Alguns aspectos da presente divulgação proveem uma mo- lécula de ácido nucleico isolada, compreendendo: a) uma sequência de nucleotídeos que codifica SEQ ID NO: 2 (Y. lipolytica DGal), ou b) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à se- quência de nucleotídeos de a). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica SEQ ID NO: 2 compreende SEQ ID NO:

1. Alguns aspectos da presente divulgação proporcionam um cassete de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico isolada tal como aqui descrito e um promotor heterólogo. Em algumas modali- dades, o promotor é um promotor um promotor constitutivo ou induzí- vel. Em algumas modalidades, o promotor heterólogo é um promotor do Fator de Alongamento de Tradução (TEF). Em algumas modalida- des, o promotor heterólogo compreende um íntron. Em algumas moda- lidades, o promotor heterólogo adicionalmente compreende um códon de início. Em algumas modalidades, o íntron está a jusante do local de início de tradução da sequência de nucleotídeos que codifica SEQ ID NO: 2. Alguns aspectos da presente divulgação proporcionam um ve- tor compreendendo um cassete de expressão tal como aqui descrito. Alguns aspectos da presente divulgação proporcionam uma célula compreendendo um cassete de expressão tal como aqui descrito, ou pelo menos uma parte de um vetor aqui descrito.

[0017] O objeto desta aplicação pode envolver, em alguns casos, produtos inter-relacionados, soluções alternativas para um problema particular, e/ou uma pluralidade de diferentes usos de um único siste- ma ou artigo.

[0018] Outras vantagens, características e utilizações da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada de certas modalidades não limitantes, desenhos e reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0019] Figura 1. Visão geral das principais vias metabólicas para a síntese de lipídios em Y. lipolytica.

[0020] Figura 2. Atividade enzimática de B-galactosidase sob dife-

rentes promotores, após 50 horas de cultura.

[0021] Figura 3. Fermentação em biorreator de transformante ACC1 + DGA1 (MTYLO65).

[0022] Figura 4. Perfil de Ácidos Graxos (FAP) de transformante ACC1 + DGal em fermentação em biorreator 2 L.

[0023] Figura 5. O perfil de ácidos graxos de transformante ACC + DGA cultivado em biorreator 2 L com acetato como fonte de carbono.

[0024] Figura 6. Produção de ácido graxo por ACC + DGA1 Y. /i- polytica em acetato.

[0025] Figura 7. Esquema construto de expressão combinatório. Via de clonagem e estratégia para a construção de plasmídeos con- tendo uma combinação de alvos de genes de acúmulo de lipídios. Es- tes plasmídeos foram então transformados em Y. lipolytica para o es- tudo de acumulação de lipídios.

[0026] Figura 8. Expressão transcricional de cassete TEFin-DGA quando integrado via pMTO53 comparado a pMT092.

[0027] Figura 9. Produtividade relativa e rendimento de lipídios entre as cepas de Y. lipolytica que expressam os construtos combina- tórios, tal como medido pelo teor total de ácido graxo normalizado para a cepa de controle. A presença (+) ou ausência (-) de um cassete de sobre-expressão transformado para o alvo genético correspondente são indicadas abaixo do gráfico. A produtividade (barras cinza claro) foi calculada como o acúmulo de lipídios relativos dentro das primeiras 100 horas de cultura. Cálculos de rendimento foram feitos dividindo acúmulo de lipídios por açúcar consumido. A relação C/N de meios foi

20. Os resultados são valores médios calculados em vários experi- mentos.

[0028] Figura 10. Expressão transcricional de alvo genético na cepa MTYLO89. Expressão é internamente normalizada para a ex pressão de actina, e comparada com uma cepa de controle (MT-

YLO038) e foi feita após 66 horas de crescimento.

[0029] Figura 11. Fermentação em biorreator de batelada de cepa MTYLO89, sobre-expressão de ACC, D9, ACL12 e DGA, razão molar C/N foi de 100. Todas as amostras foram realizadas em triplicado.

[0030] Figura 12. Microscopia de cepa MTYLO89 no final de fer- mentação 2-L. A microscopia de luz normal (imagem esquerda) mostra que a maioria das células está sob a forma de levedura, e contêm grandes vacúolos. A microscopia de fluorescência (imagem direita) indica que esses vacúolos são compostos de lipídios neutros.

[0031] Figura 13. Comparação dos perfis de ácidos graxos entre as cepas MTYLO65 e MTYLO89. Perfis de ácidos graxos tomados a partir do ponto do tempo final, nas respectivas fermentações, normali- zando o conteúdo total de ácidos graxos.

[0032] Figura 14. Tendências de nitrogênio (mM), titulações lipídi- cas e não lipídicas (g/L).

[0033] Figura 15. Tendências de titulação lipídica (g/L), conteúdo de lipídios (%) e relação C/N. Eixo primário mostra titulação lipídica e teor de lipídios em % em peso seco. Eixo secundário mostra relação C/N. Relação C/N cai no final devido ao rápido consumo de acetato.

[0034] Figura 16. Topo - "Células flutuantes" vistas sob o micros- cópio de imersão em óleo (100X) sem fluorescência. Embaixo - O mesmo quadro sob fluorescência mostra o corpo lipídico vermelho bri- lhante DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES DA INVEN-

ÇÃO

[0035] Os biocombustíveis líquidos são uma alternativa promissora aos combustíveis fósseis que podem ajudar a aliviar as preocupações sobre a mudança climática e suavizar as incertezas de abastecimento (i). Biodiesel, óleo de aviação e outros combustíveis derivados do óleo, em particular, são necessários para a aviação e veículo de transporte pesado. São presentemente produzidos exclusivamente a partir de ó- leos vegetais que é um recurso caro e não sustentável (2). Uma possi- bilidade interessante é a conversão não fotossintética de matérias- primas de carboidratos renováveis para o óleo (3). Para o biodiesel, uma transição de óleo vegetal para a produção de óleo microbiano pa- ra a matéria-prima do óleo apresenta inúmeras vantagens adicionais: adaptabilidade a diversas matérias-primas, a flexibilidade nos requisi- tos de terra, volume de negócios de ciclo do processo eficiente e facili- dade de aumento de escala (4). As plataformas biológicas para a pro- dução microbiana também são geneticamente mais tratáveis para pos- terior otimização.

[0036] A chave para uma tecnologia microbiana de baixo custo para a conversão de carboidratos em óleos é um rendimento de con- versão de carboidrato elevado em óleo. Engenharia metabólica surgiu como a permissão da tecnologia aplicada para esse fim e existem nu- merosos exemplos de engenharia de vias de sucesso que melhoraram sensivelmente o desempenho de biocatalisadores microbianos na sín- tese de produtos químicos, farmacêuticos e combustíveis (5). Esforços anteriores em micróbios construídos com alta síntese de lipídios têm sido centrados na amplificação de etapas de controle de taxa presumi- da na via da síntese do ácido graxo (6). Estes esforços, no entanto, têm produzido resultados mistos, presumivelmente porque modular o fluxo de ácidos graxos deu origem aos níveis de ácidos graxos satura- dos, que são inibidores alostéricos potentes de enzimas biossintéticas de ácidos graxos proporcionando um ciclo de feedback negativo para a biossíntese de ácidos graxos (7). Aqui nós descrevemos uma abor- dagem que combina a ampliação de vias de formação de metabólitos a montante com um aumento semelhante no fluxo de vias de consumo de metabólitos a jusante. Quando equilibrado, esta estratégia push and pull pode alcançar grandes ampliações de fluxo, sem desvios sig-

nificativos das concentrações de metabólitos intermediários de seus níveis fisiológicos homeostáticos.

[0037] A levedura oleaginosa Yarrowia lipolytica é um candidato atraente para a produção microbiana de óleo, o qual também revelou a sua utilidade em uma vasta gama de outras aplicações industriais: produção de ácido cítrico, produção de proteína (por exemplo, protea- ses e lipases), e biorremediação (8-10). Com um genoma completa- mente sequenciado e um corpo crescente de ferramentas de engenha- ria genética, engenharia de Y. lipolytica pode ser conseguida com rela- tiva facilidade (11). Y. lipolytica, também foi encontrada para ser robus- ta em cultura, capaz de crescer em uma variedade de substratos, e tem sido utilizada para a produção de lipídio em resíduos agroindustri- ais, glicerol industrial e gorduras industriais (12-14). Possui excelente capacidade de acúmulo de lipídios, comumente acumulando até 36% do seu peso seco (DCW) em lipídios (15).

[0038] As vias metabólicas para a síntese de novo de lipídios em Y. lipolytica estão começando ser totalmente mapeadas, e um modelo atual de síntese de lipídios encontra-se ilustrado na Figura 1: Glicose entrando em glicólise que entra na mitocôndria como piruvato para uso no ciclo de TCA; no entanto, excesso de acetil-CoA é transportado das mitocôndrias para o citossol através do serviço do citrato. Acetil-CoA citosólico é então convertido em malonil-CoA por acetil-CoA carboxila- se (ACC), como a primeira etapa da síntese dos ácidos graxos. Após a síntese dos ácidos graxos, síntese de triacilglicerol (TAG) segue a via de Kennedy, que ocorre no retículo endoplasmático (ER) e corpos de lipídios. Acil-CoA é o precursor utilizado para acilação para a estrutura principal de glicerol-3-fosfato para formar o ácido lisofosfatídico (LPA), o qual é posteriormente acilado para formar ácido fosfatídico (PA). PA é depois desfosforilado para formar diacilglicerol (DAG) e, em seguida, uma acilação final ocorre por diacilglicerol aciltransferase (DAG) para produzir TAG.

[0039] Transporte de acetil-CoA da mitocôndria para o citoplasma é realizado por liase de ATP-citrato (ACL) mediada por clivagem de citrato através da válvula de citrato produzindo acetil-CoA e oxaloace- tato (EAA). Acetil-CoA carboxilase (ACC), em seguida, catalisa a pri- meira etapa comprometida para a biossíntese de lipídios, convertendo acetil-CoA citosólico em malonil-CoA, que é o precursor primário para alongamento de ácidos graxos. Cadeias de acil-CoA graxa completas são então transportadas para o retículo endoplasmático (ER) ou mem- branas de lipídios corporais para o conjunto final de triacilglicerol (TAG), através da via de Kennedy. Mais de 80% dos lipídios de arma- zenamento produzidos em Y. lipolytica estão na forma de TAG (16). OAA citosólico é convertido em malato por desidrogenase málica e transportado de volta para a mitocôndria para completar o ciclo de ser- viço de transporte de citrato. Redutores equivalentes na forma de NADPH são fornecidos quer por via de fosfato de pentose ou por en- zima málica no ciclo transhidrogenase. Em Y. lipolytica, alto fluxo PPP e ineficaz sobre-expressão da enzima málica sugerem que a primeira é a principal fonte de NADPH (4, 17).

[0040] Acúmulo de lipídios intracelulares pode ocorrer através de dois métodos: síntese de lipídios de novo ou incorporação ex novo de ácidos graxos exógenos e lipídios. Acúmulo de lipídios mais comu- mente ocorre quando o suprimento de nutrientes se esgota na presen- ça de excesso de carbono. Em cultura, este estado tipicamente coinci- de com o início da fase estacionária. Na prática, o nutriente limitante mais comumente utilizado é nitrogênio, como é facilmente controlável, em composições de meios (15). Apesar destas condições induzíveis, vias de síntese de lipídios são altamente reguladas para que o orga- nismo equilibre o crescimento de células com o armazenamento de energia. Por exemplo, ACC sozinho é regulado em vários níveis e por múltiplos fatores (7).

[0041] Este regulamento apertado foi contornado em certos casos. Ao eliminar as vias de oxidação peroxisomais e construir metabolismo de glicerol, Y. lipolytica foi capaz de alcançar 40 - 70 % de lipídios a- través de acúmulo de lipídios ex novo (18, 19). A coexpressão genéti- ca desaturase A6- e A12- permitidos para a produção significativa de ácido y-linolênico (GLA) (20). No entanto, as vias de biossíntese de lipídios construídos em Y. lipolytica são ainda relativamente inexplora- das e estratégias ainda estão sendo desenvolvidas para a engenharia eficaz das vias de produção de lipídios para maximizar a produção.

[0042] Alguns aspectos desta divulgação fornecem micróbios pro- jetados para a produção de biocombustível ou precursor de biocom- bustíveis. O termo "biocombustível" refere-se a um combustível que é derivado de uma fonte biológica, tal como uma célula viva, micróbio, fungos, ou plantas. O termo inclui, por exemplo, de combustível obtido diretamente a partir de uma fonte biológica, por exemplo, por extração convencional, destilação, ou métodos de refinação, e combustível pro- duzido através da transformação de um precursor de biocombustível obtido a partir de uma fonte biológica, por exemplo, por modificação química, tal como procedimentos de transesterificação. Exemplos de biocombustíveis que são diretamente obtidos são os álcoois, tais como etanol, propanol e butanol, gordura e óleo. Exemplos de biocombustí- veis que são obtidos por transformação de um precursor de biocom- bustíveis (por exemplo, um lipídio) são o biodiesel (por exemplo, pro- duzido pela transesterificação de um lipídio), e diesel verde / combus- tíveis de óleo modificados (por exemplo, produzidos por hidrogenação de um óleo). O biodiesel, também referido como metil éster (ou etil) de ácido graxo é um dos biocombustíveis economicamente mais impor- tantes hoje em dia e pode ser produzido em escala industrial, por tran- sesterificação dos lipídios, no qual o hidróxido de sódio e metanol (ou etanol) reage com um lipídio, por exemplo, um triacilglicerol, para pro- duzir o biodiesel e glicerol.

[0043] Matérias-primas para a produção em escala industrial de biodiesel incluem gorduras animais, óleos vegetais, azeite de dendê, cânhamo, soja, canola, linhaça, girassol, oleaginosas e algas. Em ou- tras abordagens, a biomassa é convertida por um micróbio em um precursor de biocombustíveis, por exemplo, um lipídio, que é, subse- quentemente, extraído e ainda processado para produzir um biocom- bustível. O termo "biomassa" refere-se ao material produzido pelo crescimento e/ou a propagação de uma célula viva ou organismo, por exemplo, um micróbio. Biomassa pode conter células, micróbios e/ou conteúdo intracelular, por exemplo, os ácidos graxos celulares e mar- cações, bem como material extracelular. O material extracelular inclui, mas não está limitado a, compostos secretados pela célula, por exem- plo, ácidos graxos ou TAGs secretados. Importantes tipos de biomas- sa para a produção de biocombustíveis são biomassa de algas e bio- massa de origem vegetal, por exemplo, palha de milho e fibra de ma- deira. Em algumas modalidades, a biomassa para produção de bio- combustível ou precursor de biocombustíveis pode compreender açú- cares derivados de plantas, por exemplo, açúcares derivados de cana ou de milho.

[0044] Alguns aspectos da presente divulgação se referem à en- genharia e desenvolvimento de uma fonte microbiana de lipídios, úteis, por exemplo, para a produção de biodiesel economicamente viável em escala industrial. O termo "lipídio" refere-se a ácidos graxos e seus de- rivados. Por conseguinte, exemplos de lipídios incluem ácidos graxos (FA, ambos saturados e insaturados); glicerídeos ou glicerolipídios, também conhecido como acilgliceróis (como monoglicerídeos (monoa- cilgliceróis), diglicerídeos (Diacilgliceróis), triglicerídeos (triacilgliceróis, tags, ou gorduras neutras); fosfoglicerídeos (glicerofosfolipídios); non-

glicerídeos (esfingolipídios, lipídios, esteróis, incluindo o colesterol e hormônios esteróides, lipídios prenol incluindo terpenos, álcoois gra- xOS, ceras, e policetídeos); e derivados de lipídios complexos (lipídios ligados com açúcar ou glicolipídios, e lipídios ligados à proteína). Os lipídios são uma parte essencial da membrana plasmática de células vivas e micróbios. Algumas células e micróbios também produzem |i- pídios para armazenar energia, por exemplo, na forma de triacilglice- róis em corpos lipídicos, gotículas lipídicas ou vacúolos.

[0045] Alguns aspectos da presente invenção referem-se aos mi- cróbios projetados para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível. Em algumas modalidades, os micróbios aqui forneci- dos são concebidos para otimizar seu metabolismo para a produção de lipídios. O termo "metabolismo de lipídios" refere-se aos processos moleculares que envolvem a criação ou a degradação dos lipídios. Síntese dos ácidos graxos, oxidação de ácidos graxos, dessaturação de ácidos graxos, síntese de TAG, armazenamento de TAG e degra- dação de TAG são exemplos de processos que fazem parte do meta- bolismo lipídico de uma célula. Por conseguinte, o termo "metabolismo de ácidos graxos" refere-se a todos os processos celulares ou orga- nísmicos que envolvem a síntese, criação, transformação ou degrada- ção dos ácidos graxos. Síntese dos ácidos graxos, oxidação de ácidos graxos, síntese de TAG e degradação de TAG são exemplos de pro- cessos que fazem parte do metabolismo de ácidos graxos de uma cé- lula.

[0046] O termo "triacilglicerol" (TAG, por vezes também referido como triglicerídeos) refere-se a uma molécula que compreende uma única molécula de glicerol covalentemente ligada a três moléculas de ácido graxo, ácidos monocarboxílicos alifáticos, por meio de ligações de éster, uma em cada um dos três grupos hidroxilas da molécula de glicerol (OH). Triacilgliceróis são armazenamentos altamente concen-

trados de energia metabólica por causa de sua natureza anidro redu- zida e são uma matéria-prima adequada para a produção de biodiesel.

[0047] Muitas células e organismos armazenam energia metabóli- ca na forma de ácidos graxos e derivados de ácido graxo, tais como TAGs. Os ácidos graxos e seus derivados, tais como TAGs, fornecem uma forma ideal para armazenar energia metabólica. A energia contida nas ligações CC pode ser liberada de forma eficiente por B-oxidação, uma reação normalmente equivalente ao reverso da biossíntese de ácidos graxos, mas é mediada e regulada por diferentes enzimas que constituem uma via molecular diferente. Micróbios podem derivar áci- dos graxos a partir de alimentação externa, volume de endógeno, e síntese de novo. Alguns aspectos da presente invenção referem-se à identificação de um micro-organismo para a produção de biocombustí- veis ou precursor de biocombustíveis com base na capacidade do mi- cro-organismo para sintetizar e armazenar ácidos graxos ou derivados de ácidos graxos, tais como TAGs, de forma eficiente a partir de uma fonte de carbono fornecida externamente.

[0048] Moléculas de ácidos graxos naturais têm geralmente uma cadeia não ramificada alifática, ou cauda, de 4 a 28 átomos de carbo- no. Os ácidos graxos são referidos como "saturados", se todos os á- tomos de carbono da cadeia alifática são ligados através de uma liga- ção simples CC, ou como "insaturados", se dois ou mais átomos de carbono estão ligados através de uma ligação dupla CC. Os ácidos graxos insaturados desempenham papéis importantes na regulação da fluidez da membrana, atividade celular, metabolismo e eventos nuclea- res que regulam a transcrição do gene.

[0049] O espectro de ácidos graxos em levedura consiste na maior parte de ácidos graxos C16 e C18, por exemplo, ácido palmítico (CI 6), ácido palmitoleico (CI 6), ácido esteárico (CI 8) e ácido oleico (CI 8). O ácido palmítico é um ácido graxo saturado não ramíificado, com uma cadeia alifática de 16 átomos de carbono (átomos de carbono / liga- ções insaturadas: 16.0). O ácido esteárico é um ácido graxo saturado não ramificado com uma cadeia alifática de 18 átomos de carbono (18.0). Ácido palmitoleico é um ácido graxo monoinsaturado com uma cadeia alifática de 16 átomos de carbono (16.1). O ácido oleico é um ácido graxo monoinsaturado com uma cadeia alifática de 18 átomos de carbono (18.1). Espécies de ácidos graxos menores em levedura incluem ácidos graxos C14 e C26, que desempenham funções essen- ciais na modificação da proteína ou como componentes de esfingolipí- dios e âncoras de GPI, respectivamente.

[0050] A síntese de novo de ácidos graxos utiliza quantidades substanciais de metabolitos, acetil-CoA, ATP e NADPH, e, portanto, compete com outros processos celulares que são dependentes destes compostos. NADPH é requerido para as duas etapas de redução do ciclo de alongamento do ácido graxo, que liga a síntese dos ácidos graxos ao estado metabólico da célula e resulta em síntese de ácido graxo sendo limitada às condições de carga de alta energia das célu- las, indicadas pelo aumento da relação ATP / AMP, equivalentes de redução elevada e grupo de acetil-CoA elevado. Quase todas as orga- nelas subcelulares estão envolvidas no metabolismo dos ácidos gra- xos, indicando que manutenção da homeostase de ácido graxo exige regulamentação em vários níveis. Etapas de síntese lipídica que ge- ram metabólitos, acetil-CoA, ATP, ou NADPH para a biossíntese de lipídios, por vezes, são aqui referidas como "etapas de push" de sínte- se de lipídios. A amplificação de um processo que aumenta a produ- ção de um metabolito, acetil-CoA, ATP, ou NADPH, para a síntese de lipídios em uma célula, por exemplo, sobre-expressando um produto de gene de que media tal um processo de produção de metabolito, é por vezes aqui referida como uma "modificação de push.”

[0051] A maioria dos organismos, incluindo as leveduras, é capaz de sintetizar os ácidos graxos de novo a partir de uma variedade de fontes de carbono. Em uma etapa inicial, acetil-CoA é carboxilado pela adição de CO, a malonil-CoA, pela enzima acetil-CoA carboxilase (ACC; codificado por ACC1 e HFA1 em levedura). A biotina é um cofa- tor essencial na presente reação, e está ligada de forma covalente à apoproteína ACC, pela enzima biotina: apoproteína ligase (codificado por BPL1/ACC2 em levedura). ACC é uma enzima trifuncional, alber- gando um domínio de proteína transportadora de biotina de carboxila (BCCP), um domínio de biotina-carboxilase (BC), e um domínio de carboxil-transferase (CT). Na maior parte das bactérias, estes domí- nios foram expressos como polipeptídeos individuais e montados em um complexo heteromérico. Em contraste, o ACC eucariótico, incluin- do variantes ACC mitocondriais (Hfal em levedura) abrigam estas fun- ções em um único polipeptídeo. Malonil-CoA produzido por ACC serve como um doador de dois átomos de carbono de uma série cíclica de reações catalisadas por sintase dos ácidos graxos, FAS, e elongases.

[0052] O produto imediato da síntese de novo de ácidos graxos é ácidos graxos saturados. Os ácidos graxos saturados são conhecidos por serem os precursores de ácidos graxos insaturados em eucarióti- cos, incluindo levedura. Os ácidos graxos insaturados são geralmente produzidos por dessaturação de ligações simples C-C em ácidos gra- xos saturados por enzimas especializadas, chamadas desaturases. Os mecanismos de controle que regulam o metabolismo dos ácidos gra- xos saturados em ácidos graxos insaturados são bem compreendidos. Nos eucariotas, os ácidos graxos insaturados desempenham papéis importantes na regulação da fluidez da membrana, a atividade celular, metabolismo e eventos nucleares que regulam a transcrição do gene. Tipicamente, cerca de 80% de ácidos graxos de levedura são monoin- saturados, o que significa que contêm uma ligação insaturada na sua cadeia alifática.

[0053] Os ácidos graxos são potentes inibidores da síntese dos ácidos graxos e da inibição de feedback da síntese de ácidos graxos por ácidos graxos é um obstáculo importante nos micróbios construí- dos para a produção de óleo. Alguns aspectos da presente divulgação são baseados no reconhecimento de que, embora as modificações de push de síntese de lipídios sejam tipicamente incapazes de substituir inibição de feedback mediada por ácido graxo da síntese de lipídios, uma combinação de uma modificação de push (por exemplo, sobre- expressão ACC1), com uma modificação de pull (por exemplo, a so- bre-expressão DGal), pode eficientemente ignorar a inibição do feed- back, assim realizando plenamente o aumento do fluxo de carbono para a via de síntese de lipídios, por exemplo, em TGAs armazenados em um corpo de lipídios ou vacúolo da célula.

[0054] Alguns aspectos desta divulgação fornecem estratégias pa- ra construir micróbios para a produção de óleo. Em algumas modali- dades, tais estratégias empregam engenharia genética de micróbios oleaginosos, por exemplo, Y. lipolytica, para amplificar simultaneamen- te uma etapa de push and pull de síntese de lipídios. Tal como aqui divulgado, os aumentos significativos da produção de lipídios em célu- las hospedeiras de levedura oleaginosa foram alcançados usando es- tas estratégias.

[0055] Alguns aspectos da presente divulgação são baseados no reconhecimento de que modificações push and pull, por exemplo, a amplificação simultânea de etapas metabólicas que produzem metabo- litos de vias de síntese de lipídios e de etapas metabólicas que se- questram os produtos de síntese mediando inibição de feedback da síntese de lipídios, resulta em um aumento significativo do fluxo de carbono em vias de síntese de lipídios em relação à engenharia de modificações de apenas push e apenas pull. Alguns aspectos da pre- sente invenção referem-se à surpreendente descoberta de que a so-

bre-expressão de um produto de gene DGal em um micróbio oleagino- so, por exemplo, Yarrowia lipolytica, resulta em um aumento significa- tivo no fluxo de carbono para vias de síntese de lipídios, e que a so- bre-expressão simultânea de um produto de gene de ACC1 com DGAL a sobre-expressão, resultando em um micróbio modificado push and pull com propriedades de fluxo de carbono muito melhoradas que são adequadas para a produção de óleo em escala industrial a partir de uma variedade de substratos de carbono.

[0056] A descoberta de que uma modulação equilibrada das eta- pas de geração de metabólito (por exemplo, produção de malonil- CoA), bem como as etapas metabólicas sequestrantes de produtos (por exemplo, acilação de diacilgliceróis a triacilgliceróis) em um mi- cróbio resulta em um aumento significativo do fluxo de carbono líquido na síntese de lipídios tem grande implicação nos processos com o ob- jetivo de converter fontes de carbono renováveis em biocombustíveis ou precursores de biocombustíveis com a ajuda de células modifica- das. Com base em alguns aspectos da presente invenção, é agora possível alterar o metabolismo da síntese de lipídico de um micróbio, por exemplo, uma levedura oleaginosa, tal como Y. lipolytica, de uma maneira que confere fenótipos altamente desejáveis para o carboidrato em escala industrial para conversão de biocombustível ou precursor de biocombustível, tal como os aumentos notáveis na síntese de ácido graxo, síntese de TAG e armazenamento de ácido graxo e de TAG em corpos lipídicos ou vacúolo.

[0057] De acordo com alguns aspectos da presente invenção, mo- dificar o metabolismo lipídico em um micróbio de acordo com os méto- dos aqui fornecidos, por exemplo, por sobre-expressão simultânea de um produto de gene que media uma etapa de geração de metabólito (push) e um produto de gene mediando uma etapa sequestrante de produto (pull) de síntese de lipídios, permite a geração de um micróbio otimizado para a utilização em processos de produção de biocombus- tíveis ou precursores de biocombustível. Alguns aspectos desta inven- ção fornecem estratégias e métodos de engenharia do metabolismo de ácidos graxos em um micróbio, amplificando simultaneamente uma etapa de pull e uma etapa push da biossíntese de lipídios, resultando em aumento da taxa de síntese e acúmulo de ácidos graxos e deriva- dos de ácidos graxos no micróbio.

[0058] Alguns aspectos da presente invenção proporcionam méto- dos que incluem as modificações genéticas resultantes da modulação da expressão e/ou atividade de produtos de genes que regulam o me- tabolismo dos lipídios de micróbios para a produção de biocombustí- veis ou precursor de biocombustível. Tais modificações genéticas de acordo com alguns aspectos da presente invenção são destinadas a aumentar a conversão de carboidrato em ácido graxo e/ou em TAG, a fim de otimizar o micróbio modificado para produção em larga escala de lipídios a partir de uma fonte de carbono, por exemplo, uma fonte de carboidratos. Algumas modificações fornecidas de acordo com al- guns aspectos da presente invenção, por exemplo, a sobre-expressão, knockout, knock-down, ativação e/ou inibição de produtos de genes específicos, pode ser efetuada isoladamente ou em combinação, e/ou em combinação com outras modificações conhecidas dos versados na técnica. O termo "modificação" refere-se tanto a manipulação genética, por exemplo, a sobre-expressão, knockout, knock-down, ativação e/ou inibição de produtos de genes específicos, e manipulação não genéti- ca, por exemplo, manipulação do meio de crescimento, substrato, pré- tratamento de substrato, pH, temperatura, processo de conversão, etc.

[0059] Uma modificação da expressão genética, também aqui re- ferida como uma modulação da expressão genética, pode ser uma perturbação ou inibição da regulação natural da expressão, uma so- bre-expressão, uma inibição da expressão, ou uma supressão comple-

ta da expressão de um dado gene.

A inserção de um promotor heteró- logo a montante de uma sequência de um gene nativo, por exemplo, o sequência de gene de ACC1 ou DGA1 nativo, ou a deleção de se- quências de regulação no interior de um promotor, por exemplo, se- quências reguladoras que medeiam a inibição por feedback do gene de ACC1 DGA1 ou pelos ácidos graxos saturados, são exemplos de uma interrupção ou inibição da regulação natural de expressão.

Estra- tégias para a modulação da expressão genética podem incluir altera- ções genéticas, por exemplo, por tecnologias recombinantes, tais co- mo a segmentação do gene ou transduções virais, ou alterações não genéticas, por exemplo, alterações ambientais conhecidas para resul- tar na regulação para cima ou para baixo da expressão genética, ou entrega transiente de moduladores, por exemplo, fármacos ou peque- nas moléculas de RNA para as células alvo.

Métodos de alterações genéticas e não genéticas de micróbios são bem conhecidos dos ver- sados na técnica, e são descritos, por exemplo, em J.

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[0060] O termo "sobre-expressão", conforme aqui utilizado, refere- se a um aumento do nível de expressão de um dado produto de gene em uma dada célula, tipo de célula ou estado de células, em compara- ção com uma célula de referência, por exemplo, uma célula do tipo selvagem do mesmo tipo de célula ou uma célula do mesmo tipo de célula, mas sem uma alteração específica, por exemplo, uma modifi- cação genética. Expressão contínua forçada do gene DGA1 e/ou ACC1 em células Y. lipolytica que exibem concentrações de ácidos graxos saturados que inibiriam a expressão genética de DGA1 ou ACC1 em células do tipo selvagem é um exemplo de sobre-expressão genética.

[0061] Alguns aspectos da presente invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de um produto de gene de diacilglicerol aciltransferase (DGA1) em um micróbio para produção de biocombustíveis ou precursor de biocombustível. O gene DGA1 codifi- ca uma aciltransferase que catalisa a etapa final de formação de tria- cilglicerol (TAG), acilando diacilglicerol usando acil-CoA como um do- ador de acila. O resultado desta reação de aciltransferase são triacil- gliceróis, que não exibem o mesmo efeito de retroalimentação inibitória sobre a síntese de ácidos graxos, como os ácidos graxos em si. TAGs são normalmente armazenados em corpos lipídicos ou vacúolos em células produtoras de lipídios. Em algumas modalidades, a manipula- ção é uma sobre-expressão. Em algumas modalidades, a manipulação é efetuada contatando um micróbio para produção de biocombustíveis ou precursor de biocombustível com um construto de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica um produto de gene de

DGA1, por exemplo, uma proteína DGAT2, operativamente ligada a um promotor heterólogo, por exemplo, um promotor constitutivo ou in- duzível. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica um produto de gene DGA1 compreende a sequência de codificação de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o DGA1 é Y. lipolytica DGA1, por exemplo, Y. lipolytica DGA1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o micró- bio é Y. lipolytica. Em algumas modalidades, a manipulação da ativi- dade de um produto de gene DGA1 em um micróbio é realizada para conferir um fenótipo benéfico para a conversão de carboidratos em larga escala em lipídios, por exemplo, taxa de síntese de lipídios au- mentada, eficiência de conversão de carboidratos em lipídios aumen- tada, armazenamento de lipídios aumentado, taxa de crescimento au- mentada, tolerância aumentada a concentrações elevadas de uma fon- te de carbono ou um produto de lipídios. Sequências de gene DGA1 e produtos de genes são bem conhecidas dos versados na técnica. Se- quências de genes representante e produto de gene exemplares po- dem ser encontradas em XM 504700 no banco de dados NCBI (www.ncbi.nlm. nih.gov).

[0062] Exemplos não limitantes de sequências adequadas de se- quências de ácidos nucleicos DGA1 e de proteínas são fornecidos a- baixo. Sequências de DGA1 adequadas adicionais, incluindo sequên- cias de outras espécies, serão evidentes para aqueles versados na técnica, e a invenção não está limitada a este respeito.

>gil50554582|ref|XM 504700.1) Yarrowia lipolytica YALIOE3S2769p (YALIOES2769g) mRNA, cds completa

ATGACTATCGACTCACAATACTACAAGTCGCGAGACAAAAACGAC ACGGCACCCAAAATCGCGGGAATCCGATATGCCCCGCTATCGAC ACCATTACTCAACCGATGTGAGACCTTCTCTCTGGTCTGGCACATT TTCAGCATTCCCACTTTCCTCACAATTTTCATGCTATGCTGCGCAA TTCCACTGCTCTGGCCATTTGTGATTGCGTATGTAGTGTACGCTGT TAAAGACGACTCCCCGTCCAACGGAGGAGTGGTCAAGCGATACT CGCCTATTTCAAGAAACTTCTTCATCTGGAAGCTCTTTGGCCGCTA CTTCCCCATAACTCTGCACAAGACGGTGGATCTGGAGCCCACGCA CACATACTACCCTCTGGACGTCCAGGAGTATCACCTGATTGCTGA GAGATACTGGCCGCAGAACAAGTACCTCCGAGCAATCATCTCCAC CATCGAGTACTTTCTGCCCGCCTTCATGAAACGGTCTCTTTCTATC AACGAGCAGGAGCAGCCTGCCGAGCGAGATCCTCTCCTGTCTCC CGTTTCTCCCAGCTCTCCGGGTTCTCAACCTGACAAGTGGATTAA CCACGACAGCAGATATAGCCGTGGAGAATCATCTGGCTCCAACG GCCACGCCTCGGGCTCCGAACTTAACGGCAACGGCAACAATGGC ACCACTAACCGACGACCTTTGTCGTCCGCCTCTGCTGGCTCCACT GCATCTGATTCCACGCTTCTTAACGGGTCCCTCAACTCCTACGCC AACCAGATCATTGGCGAAAACGACCCACAGCTGTCGCCCACAAAA CTCAAGCCCACTGGCAGAAAATACATCTTCGGCTACCACCCCCAC GGCATTATCGGCATGGGAGCCTTTGGTGGAATTGCCACCGAGGG AGCTGGATGGTCCAAGCTCTTTCCGGGCATCCCTGTTTCTCTTAT GACTCTCACCAACAACTTCCGAGTGCCTCTCTACAGAGAGTACCT CATGAGTCTGGGAGTCGCTTCTGTCTCCAAGAAGTCCTGCAAGGC CCTCCTCAAGCGAAACCAGTCTATCTGCATTGTCGTTGGTGGAGC ACAGGAAAGTCTTCTGGCCAGACCCGGTGTCATGGACCTGGTGC TACTCAAGCGAAAGGGTTTTGTTCGACTTGGTATGGAGGTCGGAA ATGTCGCCCTTGTTCCCATCATGGCCTTTGGTGAGAACGACCTCT ATGACCAGGTTAGCAACGACAAGTCGTCCAAGCTGTACCGATTCC AGCAGTTTGTCAAGAACTTCCTTGGATTCACCCTTCCTTTGATGCA TGCCCGAGGCGTCTTCAACTACGATGTCGGTCTTGTCCCCTACAG GCGACCCGTCAACATTGTGGTTGGTTCCCCCATTGACTTGCCTTA TCTCCCACACCCCACCGACGAAGAAGTGTCCGAATACCACGACC

GATACATCGCCGAGCTGCAGCGAATCTACAACGAGCACAAGGAT GAATATTTCATCGATTGGACCGAGG- GGGCAAAGGAGCCCCAGAGTTCCGAATGATTGAGTAA (SEQ ID NO: 1) >gil50554583|ref|XP. 504700.1| YALIOES2769p [Yarrowia lipolytica

MTIDSQYYKSRDKNDTAPKIAGIRYAPLSTPLLNRCETFSLVWHIFSIP TFLTIFMLCCAIPLLWPFVIAYVVYAVKDDSPSNGGVVKRYSPISRNFF IWKLFGRYFPITLHKTVDLEPTHTYYPLDVQEYHLIAERYWPQNKYLR AIISTIEYFLPAFMKRSLSINEQEQPAERDPLLSPVSPSSPGSQPDKW!I NHDSRYSRGESSGSNGHASGSELNGNGNNGTTNRRPLSSASAGST ASDSTLLNGSLNSYANQIIGENDPQLSPTKLKPTGRKYIFGYHPHGIIG MGAFGGIATEGAGWSKLFPGIPVSLMTLTNNFRVPLYREYLMSLGVA SVSKKSCKALLKRNQSICIVVGGAQESLLARPGVMDLVLLKRKGFVRL GMEVGNVALVPIMAFGENDLYDQVSNDKSSKLYRFQQFVKNFLGFTL

PLMHARGVFNYDVGLVPYRRPVNIVVGSPIDLPYLPHPTDEEVSEYH DRYIAELQRIYNEHKDEYFIDWTEEGKGAPEFRMIE (SEQ ID NO: 2)

[0063] Alguns aspectos da presente invenção proporcionam um método para a manipulação de uma acetil-CoA carboxilase (ACC), produto de gene em um micróbio para produção de biocombustíveis ou precursor de biocombustíveis, por exemplo, em Y. lipolytica. Produ- tos de genes ACC mediam a conversão de acetil-CoA, o C2-precursor principal na síntese dos ácidos graxos, para malonil-CoA, que é consi- derado a primeira etapa comprometida na síntese dos ácidos graxos e tem sido sugerida para ser também a etapa limitante da velocidade na síntese de ácidos graxos (ver Cao Y, Yang J, Xian M, Xu X, Liu W. In- creasing unsaturated fatty acid contents in Escherichia coli by coex-

pression of three different genes. App! Microbiol Biotechnol. 2010). Em algumas modalidades, a manipulação da atividade ACC é a sobre- expressão ACC. Em algumas modalidades, a manipulação é efetuada contatando um micróbio para produção de biocombustíveis ou precur- sor de biocombustível, com um construto de expressão que compre- ende um ácido nucleico que codifica para um produto de gene de ACC, por exemplo, uma proteína de ACC1, operativamente ligada a um promotor heterólogo por exemplo, um promotor constitutivo ou in- duzível. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica para um produto de gene ACC compreende a sequência de codificação de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o produto de gene ACC é uma proteína ACC1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, a sobre-expressão de ACC em um micróbio aumenta a taxa de síntese dos ácidos graxos e/ou confere um fenótipo benéfico para conversão de carboidratos em larga escala em biocombustível ou precursor de biocombustíveis, por exem- plo, aumento da taxa de síntese de lipídios, aumento da eficiência de conversão de carboidratos em lipídio, aumento do armazenamento de lipídios e, aumento da taxa de crescimento, aumento da tolerância a concentrações de uma substância, por exemplo, uma fonte de carbo- no, um biocombustível ou precursor de biocombustível, ou uma subs- tância tóxica. Sequências de genes ACC e produtos de gene são bem conhecidas dos versados na técnica. Sequências de genes represen- tantes e produto de gene exemplares podem ser encontradas sob a entrada para GenelDs: 855.750 e 2.909.424, ou sob a entrada NC 006069 no banco de dados do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

[0064] Exemplos não limitantes de sequências adequadas de se- quências de ácido nucleico ACC e proteína são fornecidos a seguir. Sequências ACC adequadas adicionais, incluindo sequências de ou- tras espécies, serão evidentes para aqueles versados na técnica, e a invenção não está limitada a este respeito.

[0065] ACC que codifica a sequência de ácido nucleico: atgcgactgcaattgaggacactaacacgtcaggttttteaggtgagtaaacgacggtagecgatag ccacgacagcegaggcegteacgataggecagacgagcacattcetegeegecacaacetegec agcacaagaaactaacccagtataggcttcaggatctteaacgecagatgatagcteccetiggtaga cecccaacattcacaaagatetegecteteatttetttagacteaattetgtecacacagecaageccet caaaagtcaaggagtttatagcetteteacggaggteatacagttateaacaaggtgagtatttgac gtttagactgtataacaggeggcecgcagtigcaacaacgaccaaaaagggtcgaaaaagggte gaaaacggacacaaaagctggaaaacaagagtgataatacattcttacacgtccaattgttagac aaacacggctatticggtcccaaaaccaccagtatceacctattttecacttgtateteggatetgatca taatctgatctoaagatgaaatttacgccacegacatgatattgtagatttteggattetecagacega gcagattccagcaataccaccacttgeccacetteageggecteteggegegattegecactttec ccaacgagtattactaacccaggtecteategetaacaacggtatigeegcagtaaaggagatce gttcagtacgaaaatgggcctacgagacctttagegacgagegagcaatetegtteacegtcatg gecaccecceegaagatetegetgccaacgeegactacattagaatagcegatceagtacgtegagg tgccceggaggaaccaacaacaacaactacgccaacgtegagcetgattgtegacgtagetgage gattcggcegtegatgcegigtaggceggatagagecatgccagigaaaatccectgcteceega gtcgctageggcecteteceegeaagattgtetteateggeceteceggagetaccatgagatctecta ggagacaaaatttcttetaccattgtageccagcacgcaaaggtecegtatateccgtagtetaga accggagtggacgagattgtagttaacaagagcaccaacctegtgtecgtatecgaggagatat acaccaagggctgcaccaceggteceaageagggtetagagaaggctaagcagattggattec cegtgatgatceaaggcetteegagggaggaggaggaaagagtattegaaagatigagegagag gaggacttcgaggctacttaccaccaggtegagagagagatceceggcetegeccatettcattat gcagcttgcaggcaatgcceeggcatttagaggatacagcettctagetgatcagtacggcaacaata tttcactatttagtegagattattcggttrcagegacggcatraaaagattattgaggagactectatga ctgtggctagecagcagaccttcactgccatagagaaggctgcegtgegacteggtaagcettate ggatatgatctetgcaggtacegttgaatatctgtatticecatagaggacgacaagttetacttetiggag ctgaatccectegtettcaggtegaacatcctaccacegagatagtcaceggatateaacetgeceget geccagcttcagategecatgggtatccceccetegategaateaaggacattegtetettttacgagtat taacccteacaccaccactecaattgatttegacttetegggegaggatgctigataagacacage gacgtccegtececegaggteacacceactgacttigcegaatracateegaggaccectagagaga gtttecaagecetecggaggatactatgcacgagceteaacttecgatectegtceaacgatatagagtta cttctecgttagtaaccagggagatatccattegtteteggattegcagtttagtcacatettegectte ggtgagaaccgaagtacatetegaaagceacatggttattgcttitaaaggaactatctattcgagat gacttcegaaccacegtegagtaccteateaagetgetagagacaceggactticgaggacaac accatcaccaceggctagctagatgagcttatetecaacaagetgactacegagegaceegact cgattectegetattgtttatagtgctgctaccaaggcccategagettecegaggactctatigecaccet acatgagcttegctagagaagggccaggtecetgctegagacatteteaagaccecttttececgtta acttcatctacgagggccageggtacaagtteacegecacecagtegtctaaggactettacacg ctatteatcaacggttetegatgcgacattagagttagacctctttetaacgagtagtattctatatettgt aggtgggagatcecacaatatetactagaaggaggaggttagagecacgegactatetatigact ccaagacctgaccttctegaggtagagaacgacccecacteagcettegateteceteteceggtaag ctagttaagttcctagtegagaacggegaccacgtgcgagecaaccagecctatgcegagattga aggtcatgaagatgtacatgactctcactgcteaggaggacagtattgtccagcetgataaageag ceceggttccaceategaggctagegacatecteggtatettggeccttgatgatcecttccaagatea agcatgccaagcccetttaagggecagettecegagettagacececcacteteageggtaacaa gccteateagegatacgagcactgccagaacgtgctecataacattctacttggtttegataacca ggtagtgatgaagtccactctteaggagatggttggtctactcegaaacectgagcettecttatetec agtggactcatcaggtatettetetacacaceegaatagagegecaagetagatgactactettgctag tctcattgacaaggecaagcagegaggtagegagtttectaccaageagoettetacgageccetta agaaggaggcgagctetagegaggtegatgegcetettecageaaactettgctectetatttaacet tgctegagagtaccaggacagtcettgctatecacgagcetteaggttgctacaggaccttctacagge ctactacgactctgaggccecgattctacggacccaacgtacgatgacgaggatatcattcteaaget tegagaggagaacegagattetettegaaagattgtaatageccagetateteattetegagtegg agccaagaacaaccttgtactggceccttctegatgaatacaaggtaggecegaccaggctggeace gactctectacctecaacgtgcacgttigcaaagtacttgcgacctatactgcgaaagattgtagag ctaggaatctegagcttetgccaaggtatctetagaaagecegagagattcteatecagtgegetetge cetetetaaaggagegaactgaccagcttigagcacattctacgatcttetategtegagtetegata cggagaggttagtctagagcacegaacteceegagecgatattcteaaggagattgtegacteca agtacattgtctttgatgtacttaccecagttetttacecacgatgatecctagategtecttgctacecta gagctgatacatccegacgagcettgcaaggacctactecatcctagacatceaactaccaccaggacte ggacctgccetecegteatetegtggegatttagactgectaccatgtegtetactttatacaactcagt agtgatcettetagetecaaaacececactteececteggtatetegagetgatteegtetecgactttteg tacaccgttgagegagactetgctecegetegaaceggagegattgttgcegtgccteatetggat gatctggaggatgactctgactegtattictagagaacctgcccaaacgaggcgctagtcettgccatet ctattagtactagcaacaagagtgccgctactictactegtgacgactactactactgcegettcatec gttgacactggcctgtecaacatttgcaacgttatgattggtcgggttgatgagtctgatgacgacga cactctgattgccegaateteccaggteattgaggactttaaggaggactttgaggcctattctetao gacgaatcaccttctectteggcaactecegagatacttatcccaagtattteacgttecgaggece cgcatacgaggaggaccccactatcegacacattgagcctgactetagecttceagetagageteg ceegtetatecaacttegacateaagectgtecacacegacaacegaaacatcecacgtatacga ggctactggcaagaacgctgacttcegacaagegattettcaccegaggtategtacgacctagte gtcttegagagaacatceccecacceteggagtateteatttecgaggetgaceggcteatgagegata ttttaggacgctctagaggtgatiggaaccaccaacteggatcteaaccacatttteateaacttetea gccgtetttactetaaagecegaggagattgaagcetacctttagegatttectagagegatttageca acgtctgtggegacttcgagtcaceggtgcegagatcegaatgatggtatcegaceccegaaacta gcetetgactttecetetacgagcaatgatcaacaacgtetetagttacgatigtacagtctgagctatacg ctgaggccaagaacgacaagggccagtgagattttraagtetetaggcaagecegactecatgca catgcggtctateaacactecetaccecaccaaggagtggctacageccaagegatacaagge ccatctgatgggtaccacctactactatgactteceegagcetatticegacagtecattgagteggact ggaagaagtatgacggcaaggctecegacgatceteatgacttgcaacgagcetgattetegatga ggactctggegagctgcaggaggtgaacegagageceggegecaacaacgteggtatagttac gtagaagtttgaggccaagacccecegagtacectegaggcecegatettteategtagtagecaacg atatcaccttecagattggttegtttagecetgctgaggaccagttettettcaaggtaacggagetag ctegaaagcteggtattectegaatetatetgtetaccaactetagtactegaateggcattactgac gagctegttggcaagtacaagattgcgtagaacgacgagactgacccctecaagggettcaagt acctttactteacecetgagtetettgeccacecteaagecegacactgattgteaccactgagatigag gaggagggtcccaacgagegtagagaagoegteatgtgatcgactacattgteggagagaaggac gatcteggagtegagtatetacagagcetetagteteattacaggegecacttctegagectacaag gatatctteacteteactettgteacetategatecattagtateggtacttaccttgttegtettagteaa cgagccatccagattgagggecageccateatteteactagtgceccegecatraacaagetact taggtegagagatetactettccaacttgcagcettggtggtactcagatcatgtacaacaacggtatat ctcatctgactgccegagatgatcteaacgagtgtecacaagatcatgcagtagctateatacatec ctgcttctegaggtettecagtgccetatteteceteacaagacegatgtataggategagacgatgac gttecagectatecgaggegagcagtacgatattagatggcttatttetagcegaactetegaggat gatactttegagtetagtetetttyacaaggactcetttecaggagactetatetagectaggecaaggg tattattattagtegagcetegtettageggcatteccetteggtateattagtategagactgegacegte gacaatactacccecectgcegateeegecaacecgagactetatigagatgagcacctetgaagecg geccagatttagtaccccaacteggaccticaagaccteteaggecateaacgacttcaaccatagtg aggcgcttccteteatgattcttactaactagegagacttttetagtgagtcagegagacatgtacaat gaggttctcaagtacggatcttteattattgatactctagttaactacaagcagcececcatcatagtatac atcccteccaceggtaagetacgagatagttcttagattatagttgaccccaccateaacteggac atgatggagatgtacgctgacgtegagtetegaggtagtatactagagecegagggaatagteg gtatcaagtaccgacgagacaagctactggacaccatggctegtetagatccegagtactectet ctcaagaagcagcttgaggagtctecegattetaaggagcteaaggateaageteagegtacgag agaagtcteteatgeccatetaccagcagatetecgtgcagtttgcegacttgcatgacegageta gcegaataggaggccaagagtateattegtaagactettatatagaaggatgactegtegattettetto tggcgaatcegacgacgattagtcgaggagtacctcattaccaagatcaatagcattctagcectett gcacteggctigagtgatetagetegaateaagtegtagaagectgaccactettgatraggagctetga cegggagtattgcegagtagtttaacgagaactectgatgcegtetetgctegacteagegageteaa gaaggacgcttctgcecagtegtttacttcteaactgagaaaggacegacagggtactetecagg gcatgaagcaggctctegcettetetttetaaggetagagegggctgagctactcaaggagattgtga (SEQ ID NO: 3) >gil50548503|ref|lXP 501721.1) YALIOC11407p [Yarrowia lipolytica

MRLQLRTLTRRFFSMASGSSTPDVAPLVDPNIHKGLASHFFGLNSVH TAKPSKVKEFVASHGGHTVINKVLIANNGIAAVKEIRSVRKWAYETFG DERAISFTVMATPEDLAANADYIRMADQYVEVPGGTNNNNYANVELI VDVAERFGVDAVWAGWGHASENPLLPESLAASPRKIVFIGPPGAAM RSLGDKISSTIVAQHAKVPCIPWSGTGVDEVVVDKSTNLVSVSEEVYT KGCTTGPKQGLEKAKQIGFPVMIKASEGGGGKGIRKVEREEDFEAAY HQVEGEIPGSPIFIMOLAGNARHLEVQLLADQYGNNISLFGRDCSVQ RRHQKIIEEAPVTVAGQQTFTAMEKAAVRLGKLVGYVSAGTVEYLYS HEDDKFYFLELNPRLQVEHPTTEMVTGVNLPAAQLQIAMGIPLDRIKDI RLFYGVNPHTTTPIDFDFSGEDADKTQRRPVPRGHTTACRITSEDPG EGFKPSGGTMHELNFRSSSNVWGYFSVGNQGGIHSFSDSQFGHIFA FGENRSASRKHMVVALKELSIRGDFRTTVEYLIKLLETPDFEDNTITTG WLDELISNKLTAERPDSFLAVVCGAATKAHRASEDSIATYMASLEKG QVPARDILKTLFPVDFIYEGQRYKFTATRSSEDSYTLFINGSRCDIGVR PLSDGGILCLVGGRSHNVYWKEEVGATRLSVDSKTCLLEVENDPTQL RSPSPGKLVKFLVENGDHVRANQPYAEIEVMKMYMTLTAQEDGIVQL MKQPGSTIEAGDILGILALDDPSKVKHAKPFEGQLPELGPPTLSGNKP HQRYEHCQNVLHNILLGFDNQVVMKSTLQEMVGLLRNPELPYLQWA HQVSSLHTRMSAKLDATLAGLIDKAKQRGGEFPAKQLLRALEKEASS GEVDALFQQTLAPLFDLAREYQDGLAIHELQVAAGLLQAYYDSEARF CGPNVRDEDVILKLREENRDSLRKVVMAQLSHSRVGAKNNLVLALLD EYKVADOQAGTDSPASNVHVAKYLRPVLRKIVELESRASAKVSLKAREI LIQCALPSLKERTDQLEHILRSSVVESRYGEVGLEHRTPRADILKEVV DSKYIVFDVLAQFFAHDDPWIVLAALELYIRRACKAYSILDINYHQDSD LPPVISWRFRLPTMSSALYNSVVSSGSKTPTSPSVSRADSVSDFSYT VERDSAPARTGAIVAVPHLDDLEDALTRVLENLPKRGAGLAISVGASN KSAAASARDAAAAAASSVDTGLSNICNVMIGRVDESDDDDTLIARISQ VIEDFKEDFEACSLRRITFSFGNSRGTYPKYFTFRGPAYEEDPTIRHIE PALAFQLELARLSNFDIKPVHTDNRNIHVYEATGKNAASDKRFFTRGI VRPGRLRENIPTSEYLISEADRLMSDILDALEVIGTTNSDLNHIFINFSA VFALKPEEVEAAFGGFLERFGRRLWRLRVTGAEIRMMVSDPETGSA FPLRAMINNVSGYVVQOSELYAEAKNDKGQWIFKSLGKPGSMHMRSIN TPYPTKEWLQPKRYKAHLMGTTYCYDFPELFRQSIESDWKKYDGKA PDDLMTCNELILDEDSGELQEVNREPGANNVGMVAWKFEAKTPEYP RGRSFIVVANDITFQIGSFGPAEDQFFFKVTELARKLGIPRIYLSANSG ARIGIADELVGKYKVAWNDETDPSKGFKYLYFTPESLATLKPDTVVTT EIEEEGPNGVEKRHVIDYIVGEKDGLGVECLRGSGLIAGATSRAYKDI FTLTLVTCRSVGIGAYLVRLGQRAIQIEGQAPIILTGAPAINKLLGREVYS SNLQLGGTQAIMYNNGVSHLTARDDLNGVHKIMQWLSYIPASRGLPVP VLPHKTDVWDRDVTFQPVRGEQYDVRWLISGRTLEDGAFESGLFDK DSFQETLSGWAKGVVVGRARLGGIPFGVIGVETATVDNTTPADPANP DSIEMSTSEAGQVWYPNSAFKTSQAINDFNHGEALPLMILANWRGFS GGQARDMYNEVLKYGSFIVDALVDYKQPIMVYIPPTGELRGGSWVVVD PTINSDMMEMYADVESRGGVLEPEGMVGIKYRRDKLLDTMARLDPE YSSLKKQLEESPDSEELKVKLSVREKSLMPIYQQISVAQFADLHDRAG RMEAKGVIREALVWKDARRFFFWRIRRRLVEEYLITKINSILPSCTRLE

CLARIKSWKPATLDQGSDRGVAEWFDENSDAVSARLSELKKDASAQ SFASQLRKDRAQGTLAOGMKQALASLSEAERAELLKGL (SEQ ID NO: 4).

[0066] Alguns aspectos da presente invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de uma estearoil-CoA- dessaturase (SCD) em um micro-organismo para produção de bio- combustíveis ou precursor de biocombustível. SCD é uma desaturase 49 que insere uma ligação dupla entre C9 e C10 do ácido esteárico acoplado a CoA, uma etapa fundamental na geração de ácidos graxos dessaturados e seus derivados, como descrito em mais detalhe neste documento. Em algumas modalidades, a manipulação é uma sobre- expressão. Em algumas modalidades, a manipulação é efetuada por contato de um micróbio para produção de biocombustíveis ou precur- sor de biocombustível, com um construto de expressão que compre- ende um ácido nucleico que codifica para um produto de gene de SCD, por exemplo, uma proteína de SCD, operativamente ligada a um promotor heterólogo, por exemplo, um promotor constitutivo ou induzí- vel. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica para um produto de gene de SCD compreende a sequência de codificação de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o SCD é Y. lipolytica SCD,

por exemplo, Y. lipolytica SCD compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o micróbio é Y. lipolytica. Em algumas modalidades, a manipulação da atividade de SCD em um micróbio é realizada para conferir um fenótipo benéfico para conversão de carboidratos de grande escala em lipídios, por e- xemplo, aumento da taxa de síntese de lipídios, aumento da eficiência de conversão de carboidratos em lipídios, aumento de armazenamento de lipídios e, aumento da taxa de crescimento, aumento da tolerância a concentrações elevadas de uma fonte de carbono ou um produto de lipídios. Sequências de estearoil-CoA-dessaturase e produtos de ge- nes são bem conhecidos dos versados na técnica. Sequências de ge- nes representante e produto de gene exemplares podem ser encon- tradas sob a entrada para GenelD: 852.825 no banco de dados do NCBI (www .ncbi.nlm.nih.gov).

[0067] Exemplos não limitantes de sequências adequadas de áci- do nucleico SCD e sequências proteicas são fornecidos abaixo. Se- quências de SCD adequadas adicionais, incluindo sequências de ou- tras espécies, serão evidentes para aqueles versados na técnica, e a invenção não está limitada a este respeito. >gil50548052|reflXM 5014961) Yarrowia lipolytica YALIOCOS951p (YALIOCOS5951g) mRNA, complete cds

ATGGTGAAAAACGTGGACCAAGTGGATCTCTCGCAGGTCGACACC ATTGCCTCCGGCCGAGATGTCAACTACAAGGTCAAGTACACCTCC GGCGTTAAGATGAGCCAGGGCGCCTACGACGACAAGGGCCGCCA CATTTCCGAGCAGCCCTTCACCTGGGCCAACTGGCACCAGCACAT CAACTGGCTCAACTTCATTCTGGTGATTGCGCTGCCTCTGTCGTC CTTTGCTGCCGCTCCCTTCGTCTCCTTCAACTGGAAGACCGCCGC GTTTGCTGTCGGCTATTACATGTGCACCGGTCTCGGTATCACCOGC CGGCTACCACCGAATGTGGGCCCATCGAGCCTACAAGGCCGCTC TGCCCGTTCGAATCATCCOTTGCTCTGTTTGGAGGAGGAGCTGTCG AGGGCTCCATCCGATGGTGGGCCTCGTCTCACCGAGTCCACCAC CGATGGACCGACTCCAACAAGGACCCTTACGACGCCCGAAAGGG ATTCTGGTTCTCCCACTTTGGCTGGATGCTGCTTGTGCCCAACCC CAAGAACAAGGGCCGAACTGACATTTCTGACCTCAACAACGACTG GGTTGTCCGACTCCAGCACAAGTACTACGTTTACGTTCTCGTCTTC ATGGCCATTGTTCTGCCCACCCTCGTCTGTGGCTTTGGCTGGGGC GACTGGAAGGGAGGTCTTGTCTACGCCGGTATCATGCGATACACC TTTGTGCAGCAGGTGACTTTCTGTGTCAACTCCCTTGCCCACTGG ATTGGAGAGCAGCCCTTCGACGACCGACGAACTCCCCGAGACCA CGCTCTTACCGCCCTGGTCACCTTTGGAGAGGGCTACCACAACTT CCACCACGAGTTCCCCTCGGACTACCGAAACGCCCTCATCTGGTA CCAGTACGACCCCACCAAGTGGCTCATCTGGACCCTCAAGCAGG TTGGTCTCGCCTGGGACCTCCAGACCTTCTCCCAGAACGCCATCG AGCAGGGTCTCGTGCAGCAGCGACAGAAGAAGCTGGACAAGTGG CGAAACAACCTCAACTGGGGTATCCCCATTGAGCAGCTGCCTGTC ATTGAGTTTGAGGAGTTCCAAGAGCAGGCCAAGACCCGAGATCTG GTTCTCATTTCTGGCATTGTCCACGACGTGTCTGCCTTTGTCGAG CACCACCCTGGTGGAAAGGCCCTCATTATGAGCGCCGTCGGCAA GGACGGTACCGCTGTCTTCAACGGAGGTGTCTACCGACACTCCAA CGCTGGCCACAACCTGCTTGCCACCATGCGAGTTTCGGTCATTCG AGGCGGCATGGAGGTTGAGGTGTGGAAGACTGCCCAGAACGAAA

AGAAGGACCAGAACATTGTCTCCGATGAGAGTGGAAACCGAATCC ACCGAGCTGGTCTCCAGGCCACCCG- GTCGAGAACCCCGGTATGTCTGGCATGGCTGCTTAG (SEQ ID NO:5) >gil50548053|ref|lXP 501496.1| YALIOCOS951p [Yarrowia lipolytica

MVKNVDQVDLSQVDTIASGRDVNYKVKYTSGVKMSQGAYDDKGRHI SEQPFTWANWHQHINWLNFILVIALPLSSFAAAPFVSFNWKTAAFAV GYYMCTGLGITAGYHRMWAHRAYKAALPVRIILALFGGGAVEGSIRW WASSHRVHHRWTDSNKDPYDARKGFWFSHFGWMLLVPNPKNKGR TDISDLNNDWVVRLQHKYYVYVLVFMAIVLPTLVCGFGWGDWKGGL VYAGIMRYTFVQQVTFCVNSLAHWIGEQPFDDRRTPRDHALTALVTF GEGYHNFHHEFPSDYRNALIWYQYDPTKWLIWTLKQVGLAWDLQTF SQNAIEQGLVAOQRQAKKLDKWRNNLNWGIPIEQLPVIEFEEFQEQAKT RDLVLISGIVHDVSAFVEHHPGGKALIMSAVGKDGTAVFNGGVYRHS

NAGHNLLATMRVSVIRGGMEVEVWKTAQNEKKDQNIVSDESGNRIH RAGLQATRVENPGMSGMAA (SEQ ID NO:6)

[0068] Alguns aspectos da presente invenção proporcionam um método para a manipulação da atividade de uma liase de ATP-citrato (LCA) em um micróbio para produção de biocombustíveis ou precursor de biocombustível. ACL fornece acetil-CoA citosólico através da cliva- gem de citrato que é empurrado para fora das mitocôndrias como um produto do ciclo do TCA. Clivagem de citrato em oxaloacetato e acetil- CoA, produtos dos genes de ACL proporciona um substrato de acetil- CoA para ACC, que, em seguida, medeia a conversão de acetil-CoA, o C2-precursor principal na síntese dos ácidos graxos, a malonil-CoA, que é considerado a primeira etapa comprometida na síntese dos áci- dos graxos, tal como descrito em mais detalhe neste documento. Em algumas modalidades, um produto de gene LCA é uma proteína cons- tituída por duas subunidades codificadas por genes separados. Em algumas modalidades, um produto de gene LCA é composto por duas subunidades codificadas pelo mesmo gene. Em algumas modalidades, a manipulação é uma sobre-expressão. Em algumas modalidades, a manipulação é efetuada por contato de um micróbio para produção de biocombustível ou precursor de biocombustível com um construto de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica para um produto de gene do LCA, por exemplo, uma proteína de ACL, operati- vamente ligada a um promotor heterólogo, por exemplo, um promotor constitutivo ou induzível. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica para um produto de gene LCA compreende as sequências de codificação de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 9. Em algumas moda- lidades, o ACL é Y. lipolytica ACL, por exemplo, Y. lipolytica ACL com- preendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o micróbio é Y. lipolytica. Em algumas modalidades, a manipulação da atividade de um ACL em um micróbio é realizada para conferir um fenótipo benéfico para conversão de carboidratos em larga escala em lipídios, por exemplo, aumento da taxa de síntese de lipídios, aumento da eficiência de conversão de carboidratos em lipídio, aumento do armazenamento de lipídios e, um aumento da taxa de crescimento, com uma maior tolerância para as concentrações elevadas de uma fonte de carbono ou um produto de lipídios. Sequências de genes de liase de ATP-citrato e produtos de genes são bem conhecidos dos versados na técnica. Sequências de genes representantes e produto de gene exemplares podem ser en- contradas sob a entrada para GenelD: 2912101 e 2910381 no banco de dados do NCBI (www. NCBI. NIm. Nih. Ir v).

[0069] Exemplos não limitantes de sequências adequadas de se- quências de ácido nucleico ACL e proteínas são fornecidos abaixo. Sequências ACL adequadas adicionais, incluindo sequências de ou- tras espécies, serão evidentes para aqueles versados na técnica, e a invenção não está limitada a este respeito.

ATP Citrate Lyase (Yarrowia lipolytica) subunidade 1, ACL1

DNA YALIOES4793g XM 504787 atgtctgccaacgagaacatctecegattegacgecectataggcaaggageacceeegectacg agctcettecataaccacacacgatctttegtetataggtetecagectegagectagccagggtatacta gacttcgacttcatctataagegagagaaccccetecgtggeeggtateatetatecetteggegges agttcgtcaccaagatgtactaggacaccaaggagactcttctecetatetaccagcaggtegag aaggcegetgecaageacecegaggtegatgategtggteaactttgectectetegateegtetact cetetaccatggagcetactegagtacececagttcegaacceategecattattgcegagggtatec ccgagegacgagecegagagatcetecacaaggeccagaagaagggtatagaccatcattggt cecegcetacegteggaggatattraagecegattgcttcaaggattagaaacaccecggagatatgatag acaacattgtegcctecaagetetacegaceeggctecagttigectacgtetecaagtecggagga atgtccaacgagctgaacaacattatcteteacaccacegacagtatetacgagggtattactattg gtggtgacegatacccetagtactaccttcatigaccatatcctgcgatacgaggecgacceccaagt gtaagatcatcgtectecttggtaagattagtagtattgaggagtaccgagtcategagactattaa gaacggccagatcaagaagccecategtegettgggccattggtacttgtacctecatgttecaagac tgaggtticagtteggccacgeeggctecataggecaactecgaccectggagactgccaaggctaag aacgcegecatgaagtetactagettetacgtececgatacettiegaggacatgccegaggtectt gcecegagctetacgagaagatggtegecaagggegagcetatetegaatetetagagectagaggtec ccaagatcececattgactactettaggeccaggagcttggtettatecgaaagecegcetgacttteate tcecactattteecgatgacegaggecaggagcttetgtacgctggcatgcecatttecgagatttteaa ggaggacattgagtatcgagcggtateatatetetactatagttecgacgacgactececgactacge ctccaagtttettgagatgagtteteatacttactgctaaccacggtecegeegtateeggtgccatga acaccattatcaccaccegagcetagtaaggatceteatttettecetaggttactagtetectgaccatta gtaccegatteggaggtactettgacggtactgccacegagttcaccactgcctacgacaagggt ctgteccccegacagttegttgataccatacgaaagcagaacaagctgattcctagtatiggecat cgagtcaagtctegaaacaacccecegatttecgagtegagcettgteaaggactttattaagaagaa ctteccetecacecagetactegactacgcccttgctgtegaggaggateaccaccetecaagaagg acaacctgattctgaacgttgacggtgactattgctatttettttategateteatgegatettgeggtacet ttactgtagaggagactgaggactacctcaagaacggtattcteaacggtetattegtteteggteg atccattaggtceteattgcecaccatetegatecagaagegacteaagaceggtetatacegacatect tgggacgatatcacctacctagttagecaggaggctattecagaagaagegagtegagateage gceggcegacgttttcaaggecaagactegatcatag (SEQ ID NO: 7) ATP Citrate Lyase (Yarrowia lipolytica) subunidadet 1, Proteína ACL1 YALIOE3S4793p XP 504787

MSANENISRFDAPVGKEHPAYELFHNHTRSFVYGLQPRACQGMLDF DFICKRENPSVAGVIYPFGGQFVTKMYWGTKETLLPVYYQQVEKAAAK HPEVDVVVNFASSRSVYSSTMELLEYPQFRTIA!IAEGVPERRAREILH KAQKKGVTIIGPATVGGIKPGCFKVGNTGGMMDNIVASKLYRPGSVA YVSKSGGMSNELNNIISHTTDGVYEGIAIGGDRYPGTTFIDHILRYEAD PKCKIIVLLGEVGGVEEYRVIEAVKNGQIKKPIVAWAIGTCASMFKTEV QFGHAGSMANSDLETAKAKNAAMKSAGFYVPDTFEDMPEVLAELYE KMVAKGELSRISEPEVPKIPIDYSWAQELGLIRKPAAFISTISDDRGQE LLYAGMPISEVFKEDIGIGGVMSLLWFRRRLPDYASKFLEMVLMLTAD HGPAVSGAMNTIITTRAGKDLISSLVAGLLTIGTRFGGALDGAATEFTT AYDKGLSPRQFVDTMRKQNKLIPGIGHRVKSRNNPDFRVELVKDFVK KNFPSTQLLDYALAVEEVTTSKKDNLILNVDGAIAVSFVDLMRSCGAF

TVEETEDYLKNGVLNGLFVLGRSIGLIAHHLDQKRLKTGLYRHPWDDI TYLVGQEAIQKKRVEISAGDVSKAKTRS (SEQ ID NO: 8) ATP Citrate |yase (Yarrowia lipolytica) subunidade 2, ACL2 DNA YALIOD24431g XM 503231 atgtcagcgaaatccattcacgaggecgacggcaaggccctactegeacactttetatecaagge gecegtgtgggcegagcagcageccateaacacgtttaaaataggcacacccaagetagegte tctgacgttegaggacggegtggececegagcagatettegecgecgetgaaaagaccetacece tggctactggagtceggcgccaagtttatagecaagecegaccageteatraagegacgagge aaggceggcctactagtactcaacaagtcgtaggaggagtgcaagecetggategecegagegg gcegecaagecceateaacgtagaggagcattgacgagagtgctgegaacattcctagtcgageccet ttgtgccccacgaccagaagcacgagtactacatcaacatecactecgtacgagagggegact ggatcctettetaccacgagggaggagtcgacgteggegacgtaggacgecaaggecgecaag atccteatececegttgacatigagaacgagtacecetecaacgecacgeteaceaaggagoetact ggcacacgtgccegaggaccagcaccagaccctactegactticatraaceggetetacgecgte tacgtcegatcectacagtttacgtatctagagatcaaccececectagtegtgatceccacegeceaggge gtcgaggtecactacctagatcettgceggcaagetegaccagacegcagagtttgagtgeggec ccaagtgggctactagcgeggtececegeegetetagggecaggategtcaccattgacgecggetec accaaggtgtecategacgeeggeceegecatgagtettececgetecttteggtegagagcetgtec aaggaggaggcgtacattgcggagctegattecaagaceggagcettetetaaagetgactattet caatgccaagggcegaatetagaccecttatagctagtagaggagcctecgategtctacgecgac gecattgegtetacegactttactaacgagetegecaactacggegagtactetagegeteceaac gagacccagacctacgagtacgccaaaaccgtactggatctcataacceggggegacgcteac ccegagggcaaggtactattcattageggaggaategecaacttcacccaggttggatccacctt caagggcatcatcegggcceticeggagactaccagtettetetacacaaccacaaggatgaagattt acgtgcgacgaggcggateccaactggcaggaggagtetacagttgatcaagteggctagegacg agctgaatctgcccatggagatttacggeccegacatgcacgatategagtattattectttageteta cttggaaagceggceccaagaatgteaagecttttageaceggaccttetactgaggcttccactecte tceggagtttaa (SEQ ID NO: 9) ATP Citrate lyase (Yarrowia lipolytica) subunidade 2, Proteína ACL2 YALIOD24431p XP 503231

MSAKSIHEADGKALLAHFLSKAPVWAEQQPINTFEMGTPKLASLTFE DGVAPEQIFAAAEKTYPWLLESGAKFVAKPDQLIKRRGKAGLLVLNK SWEECKPWIAERAAKPINVEGIDGVLRTFLVEPFVPHDQKHEYYINIH SVREGDWILFYHEGGVDVGDVDAKAAKILIPVDIENEYPSNATLTKEL LAHVPEDQHQOTLLDFINRLYAVYVDLQFTYLEINPLVVIPTAQGVEVHY LDLAGKLDQTAEFECGPKWAAARSPAALGQVVTIDAGSTKVSIDAGP AMVFPAPFGRELSKEEAYIAELDSKTGASLKLTVLNAKGRIWTLVAGG GASVVYADAIASAGFADELANYGEYSGAPNETQTYEYAKTVLDLMTR GDAHPEGKVLFIGGGIANFTQVGSTFKGIIRAFRDYQSSLHNHKVKIY

VRRGGPNWQEGLRLIKSAGDELNLPMEIYGPDMHVSGIVPLALLGKR PKNVKPFGTGPSTEASTPLGV (SEQ ID NO: 10)

[0070] Alguns aspectos da presente invenção proporcionam mi- cróbios oleaginosos para a produção de óleo, compreendendo qual- quer uma das modificações aqui descritas, por exemplo, uma modifi- cação de DGA1, tal como aqui descrito, uma modificação ACC1, tal como aqui descrito, e/ou uma modificação de SCD tal como aqui des- crito. Em algumas modalidades, um micróbio oleaginoso modificado é fornecido, que compreende uma modificação de push, tal como aqui descrito e uma modificação de pull, como aqui descrito. Em algumas modalidades, a modificação de push inclui sobre-expressão de um produto de gene de ACC1. Em algumas modalidades, a modificação de pull compreende a sobre-expressão de um Um produto de gene de DGA1 e/ou SCD.

[0071] Alguns aspectos da presente invenção proveem ácidos nu- cleicos que codificam para um produto de gene que confere um fenóti- po desejado e/ou requerido para a produção de biocombustíveis ou precursor de biocombustível para um micróbio, por exemplo, Y. lipoly- tica. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ácido nucleico derivado de Y. lipolytica. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um produto de gene de DGA1, por exemplo, uma proteína de DGA1. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um produto de gene de ACC1, por exemplo, uma proteína de ACC1. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica uma dessaturase, por exemplo, uma dessaturase A9. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codi- fica Y. lipolytica A9 dessaturase (SCD). Em algumas modalidades, um ácido nucleico é fornecido o qual codifica uma combinação de produ- tos de genes, por exemplo, em vários cistrons, compreendendo um produto de gene a sobre-expressão da qual representa uma modifica- ção de push da biossíntese de lipídios (por exemplo, um produto de gene de ACC1), e um produto de gene a sobre-expressão da qual re- presenta uma modificação de pull da biossíntese de lipídios (por e- xemplo, um produto de gene DGA1 e/ou SCD).

[0072] O termo "ácido nucleico" refere-se a uma molécula que compreende vários nucleotídeos ligados. "Ácido nucleico" e "molécula de ácido nucleico" são utilizados indiferentemente e referem-se a oli- gorribonucleotídeos bem como oligodesoxiribonucleotídeos. Os termos também incluem polinucleosides (ou seja, um polinucleotídeo menos um fosfato) e qualquer outra base orgânica contendo o ácido nucleico.

As bases orgânicas incluem adenina, uracila, guanina, timina, citosina e inosina. Os ácidos nucléicos podem ser simples ou de duplo filamen- to. O ácido nucleico pode ser natural ou de ocorrência não natural. Os ácidos nucleicos podem ser obtidos a partir de fontes naturais, ou po- dem ser sintetizados utilizando um sintetizador de ácido nucleico (ou seja, sintético). O isolamento de ácidos nucleicos é realizado rotinei- ramente na técnica e métodos apropriados podem ser encontrados em livros de texto de biologia molecular convencionais. (Vide, por exem- plo, Maniatis' Handbook of Molecular Biology). O ácido nucleico pode ser DNA ou RNA, tais como o DNA genômico, DNA mitocondrial, mR- NA, cDNA, rRNA, miRNA, PNA ou LNA, ou uma combinação destes, como descrito aqui. Ácidos nucleicos não ocorrem naturalmente, tais como cromossomas artificiais de bactérias (BACs) e cromossomas ar- tificiais de levedura (YACs), também podem ser utilizados de acordo com alguns aspectos da presente invenção.

[0073] Alguns aspectos da presente invenção dizem respeito à uti- lização de derivados de ácidos nucleicos. A utilização de determinados derivados de ácido nucleico pode ser maior na estabilidade do que os ácidos nucleicos da invenção, impedindo a sua digestão, particular- mente quando eles são expostos à amostra biológica que pode conter nucleases. Tal como aqui utilizado, um derivado de ácido nucleico é um ácido nucleico de ocorrência não natural ou uma unidade do mes- mo. Derivados de ácidos nucleicos podem conter elementos de ocor- rência não natural, tais como nucleotídeos ocorrência não natural liga- ções estruturais de ocorrência não natural. Derivados de ácido nuclei- co de acordo com alguns aspectos da presente invenção podem con- ter modificações de estrutura principal tais como, mas não limitadas a ligações de fosforotioato, ácidos nucleicos modificados por fosfodigeri- do, combinações de fosfodigerido e ácido nucleico de fosforotioato, metilfosfonato, alquilfosfonatos, ésteres de fosfato, alquilfosfonotioa-

tos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres de fosfato, ace- tamidatos, carboximetil ésteres, metilfosforotioato, fosforoditioato, p- etóxi, e suas combinações. A estrutura principal da composição dos ácidos nucleicos pode ser homogênea ou heterogênea.

[0074] Derivados de ácido nucleico de acordo com alguns aspec- tos da presente invenção podem conter substituições ou modificações em açúcares e/ou bases. Por exemplo, alguns derivados de ácidos nucleicos podem incluir ácidos nucleicos com açúcares de estrutura principal que estão ligados de forma covalente grupos orgânicos de peso molecular baixo diferentes do grupo hidroxila na posição 3' e dife- rentes de um grupo fosfato na posição 5' (por exemplo, um grupo ribo- se 2'-O-alquilado). Derivados de ácidos nucleicos podem incluir açúca- res não ribose como a arabinose. Derivados de ácidos nucleicos po- dem conter as purinas substituídas e pirimidinas, tais como bases mo- dificadas por C-5, 5-metilcitosinay 2-aminopurina,y 2-amino-6- cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, 2-tiouracilo e pseudoisoci- tosina.

[0075] Em algumas modalidades, um ácido nucleico pode com- preender um ácido nucleico peptídico (PNA), um ácido nucleico blo- queado (LNA), DNA, RNA, ou um ácido conucleico do acima, tais co- mo ácido co-nucleico de DNA-LNA.

[0076] Tal como aqui utilizado, o termo "molécula isolada de ácido nucleico" refere-se a um ácido nucleico que não está no seu ambiente natural, por exemplo, um ácido nucleico que foi (i) extraído e/ou purifi- cado a partir de uma célula ou um micro-organismo, por exemplo, uma bactérias ou levedura, por meio de métodos conhecidos na área, por exemplo, através de lise alcalina da célula hospedeira e subsequente purificação do ácido nucleico, por exemplo, por um processo de adsor- ção de sílica; (ii) amplificado in vitro, por exemplo, por reação em ca- deia polimerase (PCR); (iii) produzido de forma recombinante por clo-

nagem, por exemplo, um ácido nucleico clonado em um vetor de ex- pressão; (iv) fragmentado e separado em tamanho, por exemplo, por digestão enzimática in vitro ou por corte e separação em gel subse- quente; ou (v) sintetizado por, por exemplo, síntese química. Em al- gumas modalidades, o termo "molécula isolada de ácido nucleico" re- fere-se a (vi) um ácido nucleico que é química e marcadamente dife- rente de qualquer ácido nucleico que ocorre naturalmente. Em algu- mas modalidades, um ácido nucleico isolado pode ser facilmente ma- nipulado por técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na área. Consequentemente, um ácido nucleico clonado em um vetor, ou um ácido nucleico entregue a uma célula hospedeira e integrado no ge- noma do hospedeiro é considerado isolado, mas um ácido nucleico no seu estado nativo no seu hospedeiro natural, por exemplo, no genoma do hospedeiro, não é. Um ácido nucleico isolado pode ser substanci- almente purificado, mas não precisa ser. Por exemplo, um ácido nucle- ico que está isolado em um vetor de clonagem ou de expressão não é puro em que compreende apenas uma pequena percentagem do ma- terial na célula que ele reside. Tal um ácido nucleico é isolado, no en- tanto, como o termo é aqui utilizado.

[0077] Alguns aspectos da presente invenção referem-se aos áci- dos nucleicos que codificam um produto de gene que confere um fenó- tipo necessário ou desejável para um micróbio para produção de bio- combustível ou precursor de biocombustível que estão ligados a um promotor, ou outro elemento de ativação da transcrição. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o produto de gene e ligado a um promotor está compreendido no vetor de expressão ou um cons- truto de expressão. Tal como aqui utilizado, os termos "vetor de ex- pressão" ou "construto de expressão" referem-se a um construto de ácido nucleico, gerado por via recombinante, ou sinteticamente, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permitem a transcrição de um ácido nucleico particular em um micro-organismo hospedeiro, por exemplo, uma levedura oleaginosa. Em algumas mo- dalidades, o vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus ou fragmento de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o vetor de expressão inclui o ácido nucleico que codifica para ser transcrito ope- racionalmente ligado a um promotor. Um promotor é um elemento de ácido nucleico que facilita a transcrição de um ácido nucleico a ser transcrito. Um promotor está normalmente localizado no mesmo fila- mento e a montante (ou 5') da sequência de ácido nucleico da trans- crição que controla ele. Em algumas modalidades, o vetor de expres- são inclui o ácido nucleico que codifica para ser transcrito operacio- nalmente ligado a um promotor heterólogo. Um promotor heterólogo é um promotor não naturalmente ligado operativamente a uma determi- nada sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o gene de DGA1 em Y. lipolytica é naturalmente ligado operacionalmente ao promotor do gene DGA1 Y. lipolytica. Qualquer promotor diferente do promotor do gene Y. lipolytica DGA1 tipo selvagem operativamente ligado ao gene DGA1, ou suas partes, por exemplo, em um construto de expressão, seria, por conseguinte, um promotor heterólogo, no presente contexto. Por exemplo, um promotor TEF1 ligado a um ácido nucleico que codi- fica um produto de gene DGA1 é um promotor heterólogo, no contexto DGA1.

[0078] Em algumas modalidades, o vetor de expressão inclui um ácido nucleico de codificação, por exemplo, um ácido nucleico que co- difica um produto de gene DGA1, ACC1, e/ou SCD, operativamente ligado a um promotor constitutivo. O termo "promotor constitutivo" refe- re-se a um promotor que permite a transcrição contínua do seu gene associado. Em algumas modalidades, o vetor de expressão inclui um ácido nucleico de codificação, por exemplo, um ácido nucleico que co- difica um Produto de gene DGA1, ACC1, e/ou SCD, operativamente ligado a um promotor induzível. O termo "promotor induzível", aqui in- diferentemente utilizado com o termo "promotor condicional", refere-se a um promotor que permite a transcrição do seu gene associado ape- nas na presença ou na ausência de fatores abióticos ou bióticos. Pro- motores induzíveis com o fármaco, por exemplo, promotores induzí- veis de tetraciclina / doxiciclina, promotores induzíveis de tamoxifeno, assim como promotores, que dependem de um evento de recombina- ção, a fim de estarem ativos, por exemplo, a recombinação mediada por cre de locais loxP, são exemplos de promotores induzíveis que são bem conhecidos na técnica.

[0079] Alguns aspectos da presente divulgação referem-se à sur- preendente descoberta de que a sobre-expressão de um determinado produto de gene a partir de um promotor heterólogo em micro- organismos oleaginosos pode ser significativamente aumentada atra- vés da inclusão de um íntron no respectivo construto de expressão. Alguns aspectos da presente divulgação proporcionam um promotor constitutivo reforçado por íntron para a sobre-expressão genética em micro-organismos oleaginosos e construtos de expressão e vetores que compreendem este promotor reforçado por íntron. Em algumas modalidades, um promotor TEF melhorado por íntron é fornecido, que compreende uma sequência de promotor TEF, um local de início da transcrição, uma sequência intrônica a jusante do local de início da transcrição, e uma sequência de codificação de ácido nucleico, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto de gene DGA1, ACC1 e/ou SCD. Em algumas modalidades, o íntron é posicionado a jusante do local de início da tradução, ainda dentro da estrutura de leitura aberta da sequência do gene, por exemplo, após o códon de iniciação, mas antes do local de terminação da sequência de ácido nucleico que codifica o produto de gene. Em algumas modalida- des, o íntron está posicionado imediatamente a jusante do local de iní-

cio da tradução, por exemplo, um códon de iniciação ATG, mas a mon- tante do resto da sequência de codificação. Para fins de ilustração, uma estrutura não limitante exemplar de um construto de expressão com capacidade de íntron é fornecida como se segue:

[0080] 5' — promotor de TEF — local de início de transcrição — ín- tron - sequência de codificação DGA1 3'. Outra estrutura exemplar não limitante de um construto de expressão com capacidade de íntron é fornecida como se segue:

[0081] 5' — promotor de TEF - local de início de transcrição — có- don de início — íntron - sequência de codificação de DGA1 — códon de parada --3'. Construtos de expressão para produtos do gene de ACC1 e SCD teriam sequência de codificação DGA1 substituída por uma se- quência de codificação ACC ou SCD, respectivamente.

[0082] As sequências de promotores de TEF adequadas, bem co- mo sequências de íntrons adequadas serão evidentes para os versa- dos na técnica. Algumas sequências de promotores de TEF menos íntron são divulgadas, por exemplo, na Patente U.S no. 6.265.185. AI- gumas sequências exemplares, representativas são fornecidas abaixo. No entanto, será entendido que a invenção não está limitada a este respeito. Sequências de promotores de TEF exemplares: agagaccgggttggcggcgcatttgtateccaaaaaacagcecceccaattgececaatigacecea aattgacccagtagegggeccaaceceggegagageccccttetececacatateaaacetece ceggtteccacacttgecgttaagggegtagggtactgcagtetagaatetacgacttgttcagacttt gtactagtttetttatetagecatcegggtaacccatgceggacgcaaaatagactactgaaaatttt tttactttatagttaggactttagccaagagtataaaagaccacegtececegaattacctttectettett ttcetetetetecttgteaacteacaceegaaategttaagcatttecttetaagtataagaatcattcaa a (SEQ ID NO:11) Sequência de íntron exemplar: gtgagttteagaggcagcagcaattgccacgggetttyageacacggeegggtatagtccecatte ccatcegacacaagacgccacgteateegaccagreactttttacagtactaacegcag —(SEQ ID NO: 12) Sequência de íntron - promotor de TEF compreendendo um codon de início (ATG) entre o promotor e as sequências de íntron: agagaccggattggcgagegcatttatgteccaaaaaacagececaattigeeccaattgacecea aattgacccagtagegggeccaaceceggegagageccccttetececacatateaaacetece ceggtteccacacttgecgttaagggcegtagggtactgcagtetagaatetacgacttgttcagacttt gtactagtttctttatetagecatcegggtaaccecatgceggacgcaaaatagactactgaaaatttt tttactttatagttaggactttagccaagagtataaaagaccacegitececgaattacctttectettett ttetetetetecttgteaacteacaceegaaategttaagcatttecttetaagtataagaatcatticaa aATGqgtgagtttcagaggcagcagcaattgccacagactttaagcacacagccegagtatagte ccatteeccategacacaagacgaccacgateatecgaccagceactttttacagtactaacegeag (SEQ ID NO: 13)

[0083] Métodos para entregar os vetores de expressão ou constru- tos de expressão em micro-organismos, por exemplo, em células de levedura, são bem conhecidos dos versados na técnica. Os ácidos nu- cleicos, incluindo vetores de expressão, podem ser entregues aos mi- cróbios procariotas e eucariotas através de vários métodos bem co- nhecidos dos versados nas técnicas biológicas relevantes. Os méto- dos para a entrega de ácidos nucleicos para um micróbio, de acordo com alguns aspectos da presente invenção, incluem, mas não estão limitados a, diferentes abordagens biológicas e químicas, eletroquími- ca e, por exemplo, a transformação de choque térmico, eletroporação, transfecção, por exemplo, transfecção mediada por lipossomas, trans- fecção mediada por DEAE-dextrano ou transfecção de fosfato de cál- cio. Em algumas modalidades, um construto de ácido nucleico, por e- xemplo, um construto de expressão que compreende uma combinação de DGA1, ACC1, e/ou SCD que codifica as sequências de ácidos nu- cleicos, é introduzido no micro-organismo hospedeiro através de um veículo, ou vetor, para a transferência de material genético. Os vetores para a transferência de material genético para micróbios são bem co- nhecidos dos versados na técnica e incluem, por exemplo, plasmí- deos, cromossomas artificiais e vetores virais. Os métodos para a construção de construtos de ácidos nucleicos, incluindo os construtos de expressão que compreendem promotores constitutivos ou induzí- veis heterólogos, construtos de knockout e knockdown, assim como os métodos e vetores para a entrega de um ácido nucleico ou construto de ácido nucleico para um micróbio são bem conhecidos dos versados na técnica, e são descritos, por exemplo, em J. Sambrook and D. Rus- sell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La- boratory Press; 3rd edition (January 15, 2001); David C. Amberg, Da- niel J. Burke; and Jeffrey N. Strathern, Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April 2005); John N. Abelson, Melvin |. Simon, Chris- tine Guthrie, and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecu- lar Biology, Part A, Volume 194 (Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press (March 11, 2004); Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume 350 (Methods in Enzymology, Vol 350), Academic Press; 1st edition (July 2, 2002); Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C, Volume 351, Academic Press; 1st edition (July 9, 2002); Gregory N. Stephanopou- los, Aristos A. Aristidou and Jens Nielsen, Metabolic Engineering: Prin- ciples and Methodologies, Academic Press; 1 edition (October 16, 1998); e Christina Smolke, The Metabolic Pathway Engineering Hand- book: Fundamentals, CRC Press; 1 edition (July 28, 2009), todos os quais são aqui incorporados por referência.

[0084] Em algumas modalidades, o promotor nativo de um gene que codifica um produto de gene que confere um fenótipo necessário ou desejável para um micróbio, por exemplo, DGA1 nativo, ACC1, ou promotor de SCD, é modificado em que o micróbio para alterar a regu- lação da sua atividade de transcrição. Em algumas modalidades, o promotor modificado exibe um aumento da atividade de transcrição em comparação com o seu homólogo não modificado. O termo "promotor modificado", tal como aqui utilizado, refere-se a um promotor da se- quência nucleotídica dos quais foi alterado artificialmente. Deleção (ões), inserção (ões) ou uma mutação (ões) de nucleotídeos, sozinho ou em combinação, são exemplos de tais alterações artificiais. Altera- ções de promotores artificiais podem ser efetuadas de uma forma ori- entada, por exemplo, por abordagens de recombinação homóloga, tal como a orientação genética, knockout, knockin, mutagênese dirigida ao local, ou estratégias mediadas por nucleases de dedos de zinco artificiais. Em alternativa, essas alterações podem ser efetuadas por um evento aleatório ou quase aleatório, como a irradiação ou integra- ção de nucleotídeos não específicos e posterior seleção. Modificações do promotor, em geral, são formadas de modo a modular as proprie- dades de ativação de transcrição do promotor respectivo. Por exem- plo, o rompimento ou supressão de um elemento regulador que media a repressão de um promotor DGA1, ACC1, ou SCD em resposta a ní- veis de ácidos graxos intracelulares elevados levariam à continuação de ativação da transcrição do gene respectivo, mesmo sob condições de elevados níveis de ácidos graxos intracelulares. Do mesmo modo, a inserção de um elemento ativador de transcrição constitutivamente ativo em uma região de promotor condicional pode efetuar sobre- expressão do respectivo gene em condições normalmente inibidoras. Os métodos para a ruptura direcionada de um promotor nativo, por e- xemplo, um DGA1 nativo, ACC1, ou promotor SCD, em um micróbio, por exemplo, por ruptura direcionada resultando em um aumento da taxa de transcrição, são bem conhecidos dos versados na técnica.

[0085] Alguns aspectos da presente invenção referem-se à enge-

nharia de um micróbio, por exemplo, Y. lipolytica, que exibe um fenóti- po necessário e/ou desejável para a produção em grande escala de um biocombustível ou precursor de biocombustível. Alguns aspectos da presente invenção referem-se a engenharia metabólica da via de síntese de lipídios a fim de produzir um micróbio otimizado para a pro- dução de biocombustíveis. Alguns aspectos da presente invenção re- ferem-se à engenharia metabólica que compreende uma combinação de modificações genéticas que modulam a expressão genética que regulam o fluxo de carbono para uma via de síntese de lipídios, a fim de se obter um micróbio otimizado para a produção de biocombustí- veis. Em algumas modalidades, a combinação da modificação genéti- ca inclui uma modificação de push e uma modificação de pull. Em al- gumas modalidades, a modificação de push inclui uma modificação genética que aumenta o nível de metabólitos, acetil-CoA, ATP, ou NADPH, para a síntese de lipídios em uma célula, por exemplo, a so- bre-expressão de um produto de gene de ACC1. Em algumas modali- dades, a alteração de pull é uma modificação genética que diminui o nível de um produto ou intermediário de síntese lipídica que apresenta uma função inibidora de feedback, por exemplo, um ácido graxo. Em algumas modalidades, a modificação de pull compreende a sobre- expressão de um produto de gene de DGA1 e/ou SCD.

[0086] Alguns aspectos da presente invenção proporcionam méto- dos para aumentar grandemente a eficiência da conversão da fonte de carbono mediada por Y. lipolytica a em lipídios modulando o metabo- lismo lipídico nativo de Y. lipolytica. Surpreendente e inesperadamen- te, combinações de modificações de push-and-pull de metabolismo lipídico de acordo com alguns métodos fornecidos pela presente in- venção conferem um aumento significativo do fluxo de carbono para vias de síntese lipídicas, em comparação com as modificações indivi- duais que modulam apenas processos de push ou pull, respectivamen-

te.

[0087] Alguns aspectos da presente invenção referem-se a um mi- cróbio construído e/ou otimizado para a produção de biocombustível em grande escala ou precursor de biocombustível. Em algumas moda- lidades, um micróbio construído é provido que foi manipulado por um método ou usando um ácido nucleico ou proteína fornecidos por al- guns aspectos da presente invenção, por exemplo, um construto de expressão ou uma combinação de construtos de expressão, tal como aqui fornecido, resultando na sobre-expressão de uma combinação de um produto de gene mediando um processo de push de síntese de lipídios (por exemplo, um produto de ACC1), e um produto de gene que media um processo de pull de síntese de lipídios (por exemplo, um produto de gene DGA1 e/ou SCD). Em algumas modalidades, um micróbio construído é fornecido, que sobre-expressa uma combinação de push e pull, de produtos de genes que, de acordo com alguns as- pectos da presente invenção, conferem um fenótipo requerido e/ou desejável para a produção de biocombustíveis ou precursor de bio- combustível para o micróbio. Em algumas modalidades, um micro- organismo que compreende uma atividade de produto de gene de DGA1, ACC1, e/ou SCD aumentada é fornecido. Em algumas modali- dades, o micróbio exibe um aumento da taxa de síntese de ácidos graxos, um aumento do armazenamento de TAG, e/ou uma caracterís- tica necessária ou desejável adicional.

[0088] O termo "taxa de síntese aumentada" ou "aumento da taxa de síntese", tal como aqui utilizado no contexto da síntese de lipídios microbiana, por exemplo, no contexto de uma taxa de síntese de áci- dos graxos de um micróbio produtor de óleo aqui descrito, refere-se a uma taxa de síntese em um micro-organismo modificado que é au- mentada em comparação com a taxa de síntese correspondente em um micro-organismo de tipo selvagem da mesma espécie. Por exem-

plo, um aumento da taxa de síntese de TAG em um micróbio Y. lipoly- tica construído aqui descrito refere-se a taxa de síntese de lipídios, que é aumentada em comparação com a taxa de síntese de TAG em Y. lipolytica de tipo selvagem. Em algumas modalidades, um aumento da taxa de síntese de lipídios, por exemplo, de TAG ou de síntese total de lipídios, se refere a uma taxa de síntese de ácidos graxos de uma cultura de células, por exemplo, de uma cultura de micro-organismos modificados. Em algumas modalidades, um aumento da taxa de sínte- se de lipídios é uma taxa de síntese de lipídios, por exemplo, de sínte- se de TAG ou síntese de lipídios total de pelo menos 0,01g/L/h (g de lipídio por litro de cultura por hora), pelo menos 0.004g/L/h, pelo me- nos 0.05g/L/h, pelo menos 0,1g/L/h, pelo menos 0.14g/L/h, pelo menos

0.159/L/h, pelo menos 0,2 g/L/h, pelo menos 0.3g/L/h, pelo menos

0.49/L/h, pelo menos 0.5g/L/h, pelo menos 0.6g/L/h, pelo menos

0.79/L/h, pelo menos 0.8g/L/h, pelo menos 0.9g/L/h, pelo menos 1g/L/h, pelo menos 2g/L/h, pelo menos 3g/L/h, pelo menos 49/L/h, pelo menos 5g/L/h, pelo menos 6g/L/h, pelo menos 79/L/h, pelo menos 8g/L/h, pelo menos 9g/L/h, pelo menos 10g/L/h, ou de pelo menos 259g/L/h.

[0089] Em algumas modalidades, a taxa de síntese neste contex- to, é a taxa de síntese medida ao longo de uma execução completa de um biorreator, por exemplo, o cálculo da taxa de síntese a partir da quantidade total de lipídios, por exemplo, TAG, sintetizado durante o tempo total que o biorreator foi executado ou a produção de lipídios no tempo total em que foi medida. Este tipo de taxa de síntese também é aqui referido por vezes como "produtividade de lipídio total" ou "produ- tividade de lipídio geral" e é normalmente fornecido em g/L/h (gramas de lipídios produzidos por litro de meio de cultura por tempo de execu- ção em horas). Em algumas modalidades, um micróbio construído é fornecido, por exemplo, uma Y. lipolytica construída que sobre-

expressa um produto de gene de ACC1, um produto de gene de DGA1, e/ou um produto de gene de SCD, que apresenta pelo menos um aumento de 5 vezes, pelo menos um aumento de 6 vezes, pelo menos um aumento de 7 vezes, pelo menos um aumento de 8 vezes, pelo menos um aumento de 9 vezes, pelo menos um aumento de 10 vezes, pelo menos um aumento de 12 vezes, pelo menos um 10 - au- mento pelo menos um aumento de 12,5 vezes, pelo menos um au- mento de 15 vezes, pelo menos um aumento de 20 vezes, pelo menos um aumento de 30 vezes, pelo menos um aumento de 40 vezes, pelo menos um aumento de 50 vezes dobrar pelo menos um aumento de 60 vezes, pelo menos um aumento de 70 vezes, pelo menos um au- mento de 80 vezes, pelo menos um aumento de 90 vezes, pelo menos um aumento de 100 vezes, pelo menos um aumento de 500 vezes, ou pelo menos um aumento de 1000 vezes na produtividade do lipídio total, em comparação com um micro-organismo de tipo selvagem, por exemplo, Y. lipolytica de tipo selvagem.

[0090] Em algumas modalidades, um aumento da taxa de síntese de lipídio total ou um aumento da produtividade de lipídio total é pelo menos 0,01g/L/h, pelo menos 0.004g/L/h, pelo menos 0.05g/L/h, pelo menos 0,1g/L/h, pelo menos 0.14g/L/h, pelo menos 0.15g/L/h, pelo menos 0.2g/L/h, pelo menos 0.3g/L/h, pelo menos 0,4 g/L/h, pelo me- nos 0.5g9/L/h, pelo menos 0.6g/L/h, pelo menos 0.7g9/L/h, pelo menos

0.8g/L/h, pelo menos 0.9g/L/h, pelo menos Ig/L/h, pelo menos 2g/L/h, pelo menos 3g/L/h, pelo menos 49/L/h, ou pelo menos 59g/L/h.

[0091] Em algumas modalidades, a taxa de síntese é a taxa má- xima de síntese, ou a taxa de pico de síntese, medida, por exemplo, sob condições ideias de crescimento e exposta a nutrientes. Este tipo de taxa de síntese também é aqui referido às vezes como "produtivi- dade de lipídio máxima". Em algumas modalidades, uma taxa máxima aumentada de síntese de lipídios é uma taxa de síntese de lipídios, por exemplo, de síntese de TAG, de pelo menos 0.2g/L/h, pelo menos

0.3g/L/h, pelo menos 0,4 g/L/h, pelo menos 0.5g9/L/h, pelo menos

0.6g/L/h, pelo menos 0.7g9/L/h, pelo menos 0.8g9/L/h, pelo menos

0.9g/L/h, pelo menos Ig/L/h, pelo menos 2g/L/h, pelo menos 3g/L/h, pelo menos 49g/L/h, pelo menos 5g/L/h, pelo menos 6g/L/h pelo menos 7 gll/h, pelo menos 8g/L/h, pelo menos 9g/L/h, pelo menos 10g/L/h, ou pelo menos 25g/L/h.

[0092] Em algumas modalidades, o micróbio construído é uma le- vedura oleaginosa, por exemplo, Y. lipolytica. Em algumas modalida- des, uma levedura construída fornecida por esta invenção apresenta uma ou mais características fenotípicas altamente desejáveis e ines- peradas, por exemplo: aumento da taxa de conversão de carbono para óleo ou eficiência, aumento da acumulação de lipídios no corpo de um lipídio.

[0093] Em algumas modalidades, um micróbio construído, por e- xemplo, uma levedura construída, fornecida por aspectos da presente invenção exibe uma taxa de conversão de carbono em óleo, também aqui referida como "rendimento de lipídio", dentro do intervalo de cerca de 0,02 g/g (g de óleo, lipídios, ou TAG produzido / g de carbono, por exemplo, glicose, acetato, ou ácido acético consumido) e cerca de 0,3 9/9. Em algumas modalidades, o micróbio construído, por exemplo, a levedura construída, fornecida por aspectos da presente invenção exi- be uma taxa de conversão de carbono para óleo de cerca de 0,0109/9g, cerca de 0,02 9g/g, cerca de 0,025 g/g, cerca de 0,03 g/g, cerca de 0,04 9/g, cerca de 0,05 g/g, cerca de 0,06 g/g, cerca de 0,07 9g/g, cerca de 0,075 9/9, cerca de 0,08 g/g, cerca de 0,09 g9/g, cerca de O. Ig/g , cerca de 0,119/g, cerca de 0,12 9g/g, cerca de 0,13 9/g, cerca de 0,14 d/g, cerca de 0,15 g/g, cerca de 0,16 9/g, cerca de 0,17 g/g, cerca de 0,18 9/g, cerca de 0,19 g/g, cerca de 0,2 g/g, cerca de 0,21 9g/g, cerca de 0,22 g/g, cerca de 0,23 g/g, cerca de 0,24 9/g, cerca de 0,25 g/g, cerca de 0,26 g/g, cerca de 0,27 g/g, cerca de 0,28 g/g, cerca de 0,29 d/g, cerca de 0,3 g/g, cerca de 0,319/g, cerca de 0.329/g, ou se aproxi- mando de valores teóricos. Em algumas modalidades, o micróbio construído, por exemplo, a levedura construída, fornecida por aspectos da presente invenção exibe uma taxa de conversão de carbono para óleo de pelo menos cerca de 0,010g/g (g de lipídios produzidos / g de carbono, por exemplo, glicose, acetato, ou ácido acético consumido) pelo menos de cerca de 0,02 9g/g, pelo menos cerca de 0,025 g/g, pelo menos cerca de 0,03 g/g, pelo menos cerca de 0,04 9g/g, pelo menos cerca de 0,05 g/g, pelo menos cerca de 0,06 9g/g, pelo menos cerca de 0,07 g/g, pelo menos cerca de 0,075 g/g, pelo menos cerca de 0,08 9/g, pelo menos cerca de 0,09 g/g, pelo menos cerca de O. 1/g pelo menos cerca de 0,119/g, pelo menos cerca de 0,12 g/g, pelo menos cerca de 0,13 g/g, pelo menos cerca de 0,14 g/g, pelo menos cerca de 0,15 g/g, pelo menos cerca de 0,16 g/g, pelo menos cerca de 0,17 d/g, pelo menos cerca de 0,18 g/g, pelo menos cerca de 0,19 g/g, pelo me- nos cerca de 0,2 g/g, pelo menos cerca de 0,21 g/g, pelo menos cerca de 0,22 g/g, pelo menos cerca de 0,23 g/g, pelo menos cerca de 0,24 9/g, pelo menos cerca de 0,25 g/g, pelo menos cerca de 0,26 9g/g pelo menos cerca de 0,27 g/g, pelo menos cerca de 0,28 9g/g, pelo menos cerca de 0,29 g/g pelo menos cerca de 0,3 g/g pelo menos cerca de 0,319/g, pelo menos cerca de 0,32 g/g, ou aproximando-se os valores teóricos.

[0094] O termo "titulação lipídica", tal como aqui utilizado no con- texto da síntese de lipídios microbiana, por exemplo, no âmbito de uma síntese dos ácidos graxos por um micróbio produtor de óleo aqui descrito, refere-se a uma quantidade de lipídios sintetizados por volu- me de uma cultura microbiana compreendendo o micróbio produtor de óleo. Em algumas modalidades, um micróbio construído, por exemplo, um micróbio Y. lipolytica construído aqui descrito, pode atingir ou não atingir uma titulação lipídica de pelo menos 1g/L (gramas de lipídio por litro de cultura microbiana), pelo menos 2 g/L, pelo menos 3 g/L, pelo menos 4 g/L, pelo menos 5 g/L pelo menos 6 g/L pelo menos 7 g/L, pelo menos 8 g/L pelo menos 9 g/L, pelo menos 10g/L, pelo menos 15g9/L pelo menos 20 g/L pelo menos 25 g/L pelo menos 30 g/L pelo menos 40 g/L pelo menos 50 g/L pelo menos 60 g/L pelo menos 70 g/L, pelo menos 80g/L pelo menos 90 g/L, pelo menos 100g/L pelo menos 200 g/L, ou pelo menos 250 g/L.

[0095] Em algumas modalidades, um micróbio construído, tal co- mo aqui fornecido exibe uma titulação aumentada de lipídios durante a conversão de carbono em óleo. O termo "aumento da titulação lipídi- ca", tal como aqui utilizado no contexto da síntese de lipídios microbia- na, por exemplo, no âmbito de uma síntese dos ácidos graxos por um micróbio produtor de óleo aqui descrito, refere-se a uma quantidade de lipídios sintetizada por volume de uma cultura microbiana compreen- dendo o micróbio produtor de óleo que é aumentada em comparação com a correspondente titulação lipídica de um micro-organismo de tipo selvagem da mesma espécie e sob as mesmas condições (por exem- plo, no mesmo meio de crescimento, com a mesma relação C/N, a mesma quantidade de oxigênio, o mesmo pH, os mesmos nutrientes, e assim por diante). Por exemplo, um aumento da titulação lipídica con- seguida por um micróbio Y. lipolytica construído aqui descrito refere-se a uma titulação lipídica que é aumentada em comparação com a titula- ção lipídica que pode ser alcançada por um Y. lipolytica do tipo selva- gem, sob condições idênticas. Em algumas modalidades, um aumento da titulação lipídica refere-se a uma titulação lipídica de pelo menos 1g/L (gramas de lipídio por litro de cultura microbiana), pelo menos 2 g/L, pelo menos 3 g/L, pelo menos 4 g/L, pelo menos 5g/L pelo menos 6 g/L pelo menos 7 g/L, pelo menos 8 g/L pelo menos 9 g/L, pelo me- nos 10g9/L pelo menos 15 g/L pelo menos 20 g/L, pelo menos 25g/L pelo menos 30 g/L pelo menos 40 g/L pelo menos 50 g/L pelo menos 60 g/L pelo menos 70 g/L pelo menos 80 g/L pelo menos 90 g/L, pelo menos 100g/L, pelo menos 200 g/L, ou pelo menos 250 g/L.

[0096] Alguns aspectos da presente invenção proporcionam mi- cróbios construídos para a produção de óleo, que pode utilizar uma variedade de fontes de carbono, incluindo, mas não limitadas a açúca- res fermentáveis, por exemplo, açúcares C6, tais como a glicose e á- cidos orgânicos, por exemplo, ácido acético, e/ou seus sais, por e- xemplo, acetato.

[0097] Alguns aspectos da presente invenção referem-se a cultu- ras de micro-organismos geneticamente modificados aqui fornecidos. Em algumas modalidades, a cultura compreende uma bactéria geneti- camente modificada aqui proporcionada e um meio, por exemplo, um meio líquido. Em algumas modalidades, a cultura compreende uma bactéria geneticamente modificada aqui proporcionada e uma fonte de carbono, por exemplo, uma fonte de carboidratos fermentáveis, ou com um ácido orgânico ou um seu sal. Em algumas modalidades, a cultura compreende uma bactéria geneticamente modificada aqui pro- porcionada e um seu sal e/ou tampão, que estabelece as condições de salinidade, osmolaridade e pH, que são passíveis de sobrevivência, crescimento e/ou conversão de carboidrato em biocombustível ou pre- cursor de biocombustível pelo micróbio. Em algumas modalidades, a cultura compreende um componente adicional, por exemplo, um aditi- vo. Exemplos não limitativos de aditivos são nutrientes, enzimas, ami- noácidos, albumina, fatores de crescimento, inibidores de enzimas (por exemplo, inibidores da protease), ácidos graxos, lipídios, hormônios (por exemplo, dexametasona e ácido giberélico), elementos, compos- tos inorgânicos (por exemplo, agentes de redução, tais como o man- ganês), redox-reguladores (por exemplo, antioxidantes) agentes esta- bilizantes (por exemplo, dimetilsulfóxido), polietileno glicol, polivinilpir-

rolidona (PVP), gelatina, antibióticos (por exemplo, Brefeldin A), sais (por exemplo, NaCl), agentes quelantes (por exemplo, EDTA, EGTA), e enzimas (por exemplo, celulase, dispase, hialuronidase, ou DNAa- se). Em algumas modalidades, a cultura pode compreender um fárma- co induzindo ou inibindo a transcrição de um promotor condicional ou induzível, por exemplo, doxiciclina, tetraciclina, tamoxifeno, IPTG, hormônios, ou íons de metal.

[0098] Enquanto as condições de cultura específicas, por exemplo, a concentração da fonte de carbono, irão depender do respectivo mi- cro-organismo modificado para ser cultivadas, os métodos gerais e condições de cultura para a geração de culturas de micro-organismos são bem conhecidos dos versados na técnica, e são descritos, por e- xemplo, em J. Sambrook and D. Russell, Molecular Cloning: A Labora- tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (Janu- ary 15, 2001); David C. Amberg, Daniel J. Burke; and Jefírey N. Stra- thern, Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April 2005); John N. Abelson, Melvin |. Simon, Christine Guthrie, and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volume 194 (Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press (March 11, 2004); Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume 350 (Methods in Enzymology, Vol 350), Academic Press; 1st edition (July 2, 2002); and Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Mo- lecular and Cell Biology, Part C, Volume 351, Academic Press; 1st edi- tion (July 9, 2002), todas os quais são aqui incorporados por referên- cia. Para a produção de óleo, as culturas de micróbios modificadas aqui descritas são cultivadas sob condições adequadas para a acumu- lação de óleo, tal como é conhecido na técnica.

[0099] Em algumas modalidades, o micro-organismo geneticamen-

te modificado apresenta uma vantagem de crescimento sobre os mi- cróbios do tipo selvagem da mesma espécie e/ou em relação a outros micro-organismos, por exemplo, os micróbios normalmente encontra- dos para contaminar as culturas microbianas para a conversão de car- boidrato em biocombustível ou precursor de biocombustível. Em algu- mas modalidades, a vantagem de crescimento e/ou proliferação de um micróbio construído fornecido por aspectos da presente invenção tra- duz-se na possibilidade de utilizar a cultura não estéril e condições de fermentação para a produção de biocombustíveis ou precursor de bio- combustível, porque o problema do crescimento excessivo de cultura por meio da contaminação de micróbios é atenuado ou completamente abolido. Em algumas modalidades, um micróbio construído fornecido por aspectos da presente invenção é cultivado sob condições não es- téreis para a produção de biocombustíveis ou precursor de biocombus- tível. Por exemplo, em algumas modalidades, como matéria-prima não esterilizada, meios não esterilizado, os suplementos de cultura não esterilizados, ou um biorreator não esterilizado (por exemplo, em um reator aberto, sob condições não estéreis) é utilizado para a produção de biocombustíveis ou precursor de biocombustível.

[00100] Uma variedade de diferentes micróbios pode ser genetica- mente modificada de acordo com alguns aspectos da presente inven- ção e utilizada para a produção de biocombustível em escala industrial ou precursor de biocombustíveis, por exemplo, os micróbios a partir de várias fontes de levedura, tais como levedura oleaginosa, bactérias, algas e fungos. Exemplos não limitantes de células de levedura ade- quadas são as células de Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, S. bayanus, S. K. lactis, Waltomyces lipofer. Mortierella alpine, Mortierella isabellina, Hansenu- la polymorpha., Mucor rouxii, Trichosporon cutaneu, Rhodotorula gluti- nis Saccharomyces diastasicus, Schwanniomyces occidentalis, S. ce-

revisiae, Pichia stipitis, and Schizosaccharomyces pombe. Non-limiting exemplos of suitable bacteria are Bacillus subtilis, Salmonella, Esche- richia coli, Vibrio cholerae, Streptomyces, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp, Rhodococcus sp, Streptomy- ces sp, e Alcaligenes sp. Exemplos não limitantes de células de fungo adequadas podem, por exemplo, ser cultivadas a partir de espécies tais como o Shiwusamii Aspergillus, Aspergillus niger e Trichoderma reesei. Exemplos não limitantes de células de algas adequadas são células de Neochloris oleocabundans, Scenedesmus obliquus, Nannoc- hloropsis sp., Dunaliella tertiolecta, Chlorella vulgaris, Chlorella emer- sonii, e Spirulina maxima.

[00101] — Alguns aspectos da presente invenção proporcionam méto- dos para a produção de biocombustíveis ou precursores de biocom- bustíveis utilizando micro-organismos geneticamente modificados aqui fornecidos. Em algumas modalidades, são proporcionados métodos para a produção de biocombustíveis em escala industrial ou precursor de biocombustível.

[00102] Uma variedade de fontes de carbono pode ser convertida em um ou biocombustível ou precursor de biocombustível através de um método e/ou um micro-organismo geneticamente modificado, aqui fornecido. Em algumas modalidades, a fonte de carbono compreende um carboidrato. Açúcares, amidos e fibras são exemplos de fontes de carboidratos adequadas para métodos de conversão aqui proporcio- nados não limitativos. De acordo com alguns aspectos da presente invenção, uma fonte de carboidratos pode incluir um açúcar refinado e/ou não refinado, amido, e/ou fibra, ou uma combinação de qualquer um destes. Exemplos não limitativos de açúcares são os açúcares fermentáveis, tais como glicose, frutose, sacarose, xilose, e lactose. Exemplos não limitativos de amidos são amilase e amilopectina. E- xemplos não limitantes de fibras são fibras vegetais, tais como fibras de celulose, hemicelulose e de madeira. Alguns aspectos da presente invenção dizem respeito ao uso de subprodutos industriais, intermediá- rios ou produtos de resíduos, por exemplo, extratos de vegetais crus, melaço, caules e folhas, ou esgoto, como fonte de carbono. Em algu- mas modalidades, a fonte de carbono é obtida a partir de algas. Em algumas modalidades, a biomassa de algas é produzida especifica- mente para utilização como uma fonte de carbono em biocombustível mediado por micróbio ou produção de precursor de biocombustível.

[00103] Em algumas modalidades, os métodos para a produção de biocombustíveis ou precursor de biocombustível são providos os quais incluem o uso de um estoque de fonte de carbono barata, abundante, e prontamente disponível como a fonte de carbono. Em algumas mo- dalidades, a celulose ou a hemicelulose é utilizada como fonte de car- bono. Em algumas modalidades, a celulose ou a hemicelulose é deri- vada de produtos industriais, ou resíduos. Em algumas modalidades, a celulose ou a hemicelulose é derivada diretamente a partir de plantas ou biomassa de algas. Planta ou biomassa de algas é uma das maté- rias-primas mais abundantes e compreendem uma quantidade signifi- cativa de açúcares não fermentáveis e fibras, por exemplo, celulose e hemicelulose. Em algumas modalidades, matéria-prima de biomassa é previamente tratada para converter um açúcar não fermentável ou fi- bra em um açúcar fermentável, tornando-os disponíveis para o cresci- mento do micróbio e biocombustível mediado por micróbio ou produ- ção de precursor de biocombustível. Em algumas modalidades, o pré- tratamento de matérias-primas de biomassa inclui despolimerização de componentes de celulose e/ou hemicelulose em açúcares monoméri- cos utilizando um método de pré-tratamento conhecido pelos versados na técnica, por exemplo, um método de expansão de fibra de amônia ácido diluído (AFEX) (vide, por exemplo, Yang B, Wyman CE. Dilute acid and autohydrolysis pretreatment Methods Mol Biol.

2009;581:103-14; Balan V, Bals B, Chundawat SP, Marshall D, Dale BE, Lignocellulosic biomass pretreatment using AFEX Methods Mol Biol. 2009;581:61-77). Outros métodos para a despolimerização de polímeros de biomassa em açúcares monoméricos são bem conheci- dos dos versados na técnica e são contemplados para ser utilizados em algumas modalidades da presente invenção.

[00104] Em algumas modalidades, uma matéria-prima de biomassa contendo açúcares não fermentáveis é pré-tratada utilizando um mé- todo de ácido diluído para despolimerizar um açúcar não fermentável em um açúcar fermentável, monomérico. Em algumas modalidades, biomassa é tratada com ácido sulfúrico diluído a temperaturas mode- radas, por um período definido de tempo. Por exemplo, em algumas modalidades, a biomassa é tratada com cerca de 0,5%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, ou de ácido sul- fúrico de cerca de 6%. Em algumas modalidades, a biomassa é trata- da a cerca de 30 ºC, a cerca de 37 ºC, a cerca de 40 ºC, a cerca de 50 ºC, a cerca de 60 ºC, a cerca de 70 ºC, a cerca de 80 ºC, a cerca de 90 ºC, a cerca de 100 ºC, a cerca de 110 ºC, a cerca de 120 ºC, a cer- ca de 130 ºC, a cerca de 140 ºC, a cerca de 150 ºC, a cerca de 175 ºC, a cerca 200 ºC, ou acima de cerca de 200 ºC.

[00105] Em algumas modalidades, o hidrolisado resultante contém lignina insolúvel e polímeros celulósicos e hemicelulósicas solubiliza- dos. Os últimos produtos podem ser ainda tratados para gerar hexose e pentose, tais como monômeros de glicose e xilose por meio de mé- todos bem conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, por meio de tratamento com celulase, ou outras enzimas hidrolisantes. Em al- gumas modalidades, o pré-tratamento de açúcares não fermentáveis com ácido diluído resulta na geração de subprodutos tóxicos que in- cluem compostos que inibem o crescimento, diminuem a viabilidade, e/ou inibem a produção de biocombustível ou precursor de biocombus-

tível de micróbios não construídos de acordo com os aspectos desta invenção. Em algumas modalidades, a matéria-prima pré-tratada é la- vada, suplementada com meio que suporta crescimento microbiano e produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, e/ou so- bre-tratada com cal para desintoxicação.

[00106] Em algumas modalidades, uma matéria-prima de biomassa contendo açúcares não fermentáveis é pré-tratada utilizando um mé- todo AFEX para despolimerizar um açúcar não fermentável para um açúcar fermentável monomérico. Em algumas modalidades, a biomas- sa é tratada com amônia líquida à temperatura e pressão elevadas du- rante um período de tempo definido. Em algumas modalidades, a bio- massa é tratada durante cerca de 10 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 40 minutos, cerca de 50 minutos, cerca de 60 minutos, cerca de 70 minutos, cerca de 80 minutos, cerca de 90 minutos, ou mais. Em algumas modalidades, a biomassa é tratada a cerca de 30 ºC, a cerca de 37 ºC, a cerca de 40 ºC, a cerca de 50 ºC, a cerca de 60 ºC, a cerca de 70 ºC, a cerca de 80 ºC, em cerca de 90 ºC, a cerca de 100 ºC, a cerca de 110 ºC, a cerca de 120 ºC, a cerca de 130 ºC, a cerca de 140 ºC, a cerca de 150 ºC, a cerca de 175ºC, a cerca de 200 ºC, ou acima de cerca de 200 ºC. Em algumas modalida- des, o pré-tratamento AFEX resulta na conversão de celulose cristalina contida na matéria-prima em uma forma amorfa, fermentável. Em al- gumas modalidades, a matéria-prima de biomassa pré-tratada com AFEX não contém quantidades significativas de subprodutos tóxicos que inibem o crescimento microbiano e/ou produção de biocombustível ou precursor de biocombustível, e é usada sem prévia desintoxicação para produção de biocombustível microbiano ou precursor de biocom- bustível.

[00107] Em algumas modalidades, matéria-prima de biomassa, com ou sem pré-tratamento, é tratada com uma enzima que hidrolisa e despolimeriza os polímeros de açúcar, por exemplo, com uma enzima de celulase ou hemicelulase. Em algumas modalidades, a matéria- prima entra em contato com a enzima em fase líquida e incubada a uma temperatura que permite que a enzima catalise uma reação de hidrólise ou despolimerize durante um tempo suficiente para hidrolisar ou despolimerizar uma quantidade significativa do açúcar não fermen- tável ou fibra na matéria-prima de biomassa. Em algumas modalida- des, a fase líquida do material de alimentação em contato com a enzi- ma, que contém a fração de açúcar solúvel fermentável, é separada da fase sólida, incluindo açúcares não fermentáveis e as fibras, após a incubação para hidrólise e despolimerização, por exemplo, por centri- fugação. Em algumas modalidades, a fração de líquido da matéria- prima é subsequentemente contatada com um micróbio, por exemplo, um micróbio fornecido por aspectos da presente invenção, para a con- versão de biocombustível ou precursor de biocombustível. Em algu- mas modalidades, a conversão enzimática de açúcares não fermentá- veis ou fibra ocorre em um bioprocesso consolidado, por exemplo, ao mesmo tempo e/ou no mesmo reator que a conversão microbiana dos açúcares fermentáveis produzidos para biocombustível ou precursor de biocombustível. Em algumas modalidades, a conversão enzimática é realizada em primeiro lugar, e a matéria-prima em contato com a en- zima é subsequentemente contatada com o micro-organismo para a produção de biocombustíveis ou precursor de biocombustível. Em al- gumas modalidades, a conversão enzimática e microbiológica é reali- zada ao mesmo tempo e no mesmo reator.

[00108] Em algumas modalidades, um micróbio construído, tal co- mo aqui proporcionado, por exemplo, uma Yarrowia lipolytica sobre- expressando um produto de gene DGA1, ACC1, e/ou SCD, é cultivada em acetato como fonte de carbono principal. Em algumas modalida- des, o micro-organismo é cultivado em uma solução de ácido acético com uma concentração de cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10% vol/vol, cerca de 20% vol/vol, cerca de 25% vol/vol, ou cerca de 30% vol/vol. Em algumas modalidades, a concentração de acetato é entre cerca de 3% - 10% em peso / vol. Em algumas modalidades, as culturas de células compreendendo micró- bios geneticamente modificados como aqui proporcionados que são cultivados em acetato ou ácido acético como fonte de carbono princi- pal são contatadas, ou "aderidas" com glicerol modificado. Em algu- mas modalidades, os micróbios geneticamente modificados são inter- mitentemente contatados com glicerol. Em algumas modalidades, os micróbios são continuamente ou semicontinuamente contatados com glicerol. Em algumas modalidades, os micróbios são contatados com glicerol a uma concentração de cerca de 0,5%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, ou cerca de 5% vol/vol. Contatar os micróbios modificados aqui proporcionados com glicerol proporciona metabolitos para a produção de TAGs, bem como reduz porções para a produção de ácidos graxos a partir de carboidratos. Em algumas modalidades, aderência de glicerol é realizada em métodos de produ- ção de biocombustíveis ou precursores de biocombustível utilizando uma fonte de carbono diferente de acetato, por exemplo, qualquer fon- te de carbono aqui descrita.

[00109] Em algumas modalidades, um micróbio construído, tal co- mo aqui proporcionado, por exemplo, uma Yarrowia lipolytica sobre- expressando um produto de gene DGA1, e / opcionalmente e produto de gene de ACC1 e/ou SCD, é cultivada em uma fonte de carbono, por exemplo, em ácido acético ou acetato, que é alimentada durante o processo de crescimento ou período de cultura, por exemplo, conta- tando o micróbio com uma quantidade adicional da fonte de carbono, ou com uma quantidade de uma fonte de carbono adicional, após um período de tempo em cultura, por exemplo, depois de 8 horas, após 24 horas, ou após 48 horas. Em algumas modalidades, um micróbio cons- truído, tal como aqui fornecido é cultivado inicialmente, por exemplo, pelas primeiras 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, ou 72 horas em um meio de cultura que compreende uma baixa relação carbono para nitrogênio (C/N), por exemplo, uma relação C/N de cerca de 10, de cerca de 20, de cerca de 25, de cerca de 30, inferior a 30, de me- nos do que 25, ou menor do que 20. Em algumas modalidades, uma baixa relação C/N é alcançada completando o meio de cultura com uma fonte de nitrogênio, por exemplo, com amônia, para se conseguir a ração C/N pretendida. Em algumas modalidades, por exemplo, em modalidades, em que uma fonte de carbono, por exemplo, acetato ou ácido acético, é alimentada para dentro de uma cultura de micro- organismos produtores de óleo, tal como aqui descrito, a fonte de car- bono é suplementada com uma fonte de nitrogênio, por exemplo, a- mônia. Em algumas modalidades, a suplementação com uma fonte de nitrogênio é deixada após um período inicial de tempo em cultura, por exemplo, depois das primeiras 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, ou 72 horas em cultura, permitindo, assim, que os micróbios manipu- lados em cultura consumam a fonte de nitrogênio, que, por sua vez, resulta em um aumento da relação C/N. Esta mudança de relação C/N pode ser aumentada ou acelerada alimentando a fonte de carbono a- dicional na cultura que não é suplementada com uma fonte de nitrogê- nio, por exemplo, alimentado ácido acético ou acetato que não é su- plementado com amônia ou qualquer outra fonte de nitrogênio. Em al- gumas modalidades, a relação C/N ideal para a produção de óleo por um micróbio construído aqui descrito está dentro da faixa de 80-120.

[00110] Em algumas modalidades, os processos de fermentação para conversão de carboidratos mediados por micróbios de grande escala em lipídios podem ser efetuados em biorreatores. Tal como a-

qui utilizado, o termo "biorreator" e "fermentador", que são alternada- mente utilizados, referem-se a um invólucro, ou invólucro parcial, no qual uma reação biológica e/ou química ocorre, pelo menos parte dela envolve um organismo vivo ou parte de um organismo vivo. Um "bior- reator de grande escala" ou "biorreator de escala industrial" é um bior- reator que é utilizado para gerar um produto, por exemplo, um bio- combustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, um ácido graxo e/ou TAG, em uma escala comercial ou quase comercial. Bior- reatores de grande escala tipicamente têm volumes no intervalo de litros, centenas de litros, milhares de litros, ou mais.

[00111] Um biorreator de acordo com aspectos desta invenção po- de compreender um micróbio ou uma cultura microbiana. Em algumas modalidades, um biorreator pode compreender um esporo e/ou qual- quer tipo de tipo de célula dormente de qualquer micróbio isolado for- necido por aspectos desta invenção, por exemplo, em um estado seco. Em algumas modalidades, a adição de uma fonte de carboidratos a- dequada a esses biorreatores pode levar à ativação da célula dormen- te, por exemplo, para a germinação de esporos de uma levedura, e subsequente conversão da fonte de carboidrato, pelo menos em parte, em um ou biocombustível ou precursor de biocombustível.

[00112] Alguns biorreatores de acordo com aspectos da presente invenção podem incluir sistemas de cultura de células, onde os micró- bios estão em contato com líquidos em movimento e/ou bolhas de gás. Micróbios ou culturas de micróbios de acordo com os aspectos desta invenção podem ser cultivados em suspensão ou ligados a veículos de fase sólida. Exemplos não limitativos dos sistemas de veículos incluem microveículos (por exemplo, esferas de polímeros, microesferas, e mi- crodiscos que podem ser porosos ou não porosos), grânulos (por e- xemplo, dextrano) carregados com grupos químicos específicos (por exemplo, grupos amina terciárias), microveículos 2D incluindo células

7T4/134 aprisionadas em fibras poliméricas não porosas, veículos 3D (por e- xemplo, fibras de transporte, fibras ocas, reatores multicartucho, e membranas semipermeáveis que podem compreender fibras porosas), microveículos tendo capacidade reduzida de permuta iônica, células de encapsulação, capilares, e agregados. Os veículos podem ser fa- bricados a partir de materiais, tais como o dextrano, a gelatina, o vidro, e a celulose.

[00113] Processos de conversão de carboidrato em escala industri- al para lipídios, de acordo com aspectos da presente invenção podem ser operados em modos, contínuos semicontínuos ou não contínuos. Exemplos não limitativos de modos de operação, de acordo com esta invenção são de batelada, batelada alimentada, batelada estendida, batelada repetitiva, extração / enchimento, parede rotativa, balão gira- tório, e/ou modo de operação de perfusão.

[00114] Em algumas modalidades, biorreatores que podem ser utili- zados são os que permitem o reabastecimento contínuo ou semicontí- nuo do material do substrato, por exemplo, uma fonte de carboidratos e/ou separação contínua ou semicontínua do produto, por exemplo, um lipídio segregado, uma fase orgânica compreendendo um lipídio, e/ou as células que exibem um teor de lipídio desejado, do reator.

[00115] Exemplos não limitantes de biorreatores de acordo com es- ta invenção são: fermentadores de tanque agitado, biorreatores agita- dos por rotação de dispositivos de mistura, quimiostatos, biorreatores agitados por dispositivos de agitação, fermentadores de transporte aé- reo, reatores de leito, reatores de leito fixo, reatores de leito fluidizado, biorreatores empregando onda induzida por agitação, biorreatores de centrífuga, garrafas de rolo, e biorreatores de fibra oca, aparelhos de rolo (por exemplo, benchtop, cart-mounted, e/ou variedades automati- zadas), placas empilhadas verticalmente, frascos rotadores, frascos de agitação ou balanço, placas multipoços agitadas, garrafas MD, frascos

T, garrafas de Roux, propagadores de cultura de tecidos mutlissuperfí- cies, fermentadores modificados, e esferas revestidas (por exemplo, esferas revestidas com proteínas do soro, nitrocelulose, ou carboxime- tilcelulose para impedir a ligação de células).

[00116] Biorreatores e fermentadores de acordo com aspectos da presente invenção podem, opcionalmente, compreender um sensor e/ou um sistema de controle para medir e/ou ajustar os parâmetros de reação. Exemplos não limitativos de parâmetros de reação são: os pa- râmetros biológicos, por exemplo, taxa de crescimento, tamanho da célula, o número de células, a densidade de células, tipo de célula, ou estado de células, os parâmetros químicos, por exemplo, pH, redox potencial, concentração de substrato de reação e/ou produto, a con- centração de gases dissolvidos, tais como a concentração de oxigênio e concentração de CO,, concentrações de nutrientes, concentração de metabolito, concentração de glicose, concentração de glutamina, con- centração de piruvato, concentração de apatita, concentração de um oligopeptídeo, concentração de um aminoácido, concentração de uma vitamina, concentração de um hormônio, concentração de um aditivo, concentração de soro, força iônica, concentração de um íon, umidade relativa, molaridade, osmolaridade, concentração de outras substân- cias químicas, por exemplo, agentes tamponantes, adjuvantes, ou subprodutos da reação, parâmetros físicos / mecânicos, por exemplo a densidade, a condutividade, o grau de agitação, a pressão, e velocida- de de fluxo, tensão de corte, velocidade de corte, viscosidade, a cor, a turbidez, a absorção de luz, a taxa de mistura, a taxa de conversão, bem como os parâmetros termodinâmicos, tais como: a temperatura, a intensidade / qualidade de luz, etc.

[00117] Sensores capazes de medir os parâmetros, tal como aqui descritos são bem conhecidos dos versados na técnica mecânica e eletrônica relevantes. Os sistemas de controle capazes de ajustar os parâmetros de um biorreator com base nas entradas a partir de um sensor, tal como aqui descritas são bem conhecidos dos versados na técnica de engenharia de biorreator.

[00118] O tipode fonte de carbono a ser utilizada para a conversão de um biocombustível ou precursor de biocombustível de acordo com aspectos da presente invenção depende do micróbio específico em- pregue. Alguns micróbios fornecidos pelos aspectos da presente in- venção podem ser capazes de converter de forma eficiente uma fonte de carboidrato específica, enquanto que uma fonte de carboidratos diferente, não pode ser processada pelo mesmo micróbio em alta efi- ciência ou em todos. De acordo com aspectos da presente invenção, a levedura oleaginosa Y. lipolytica, por exemplo, pode converter eficien- temente os açúcares, tais como a glicose, frutose, sacarose, e/ou a lactose, e as fontes de carboidratos ricas em açúcares, por exemplo, melaço, e fibras vegetais em ácidos graxos e seus derivados.

[00119] Em algumas modalidades, um biocombustível ou precursor de biocombustível, por exemplo, um ácido graxo ou um triacilglicerol, gerado a partir de uma matéria-prima da fonte de carbono é segrega- do, pelo menos parcialmente, por um micróbio fornecido por aspectos desta invenção, por exemplo, uma levedura oleaginosa, tal como uma célula de Y. lipolytica. Em algumas modalidades, um micróbio forneci- do por aspectos da presente invenção é contatado com uma fonte de carboidratos em uma solução aquosa de um biorreator, e biocombustí- veis secretados ou precursor de biocombustível formam uma fase or- gânica que pode ser separada da fase aquosa. O termo fase orgânica, tal como aqui utilizado, refere-se uma fase líquida que compreende, um composto orgânico não polar, por exemplo um ácido graxo, TAG, e/ou outros lipídios não polares. E a fase orgânica de acordo com esta invenção pode ainda conter um micróbio, um carboidrato, ou outro composto encontrado em outras fases encontradas em um respectivo

7T7/134 biorreator. Métodos úteis para separação de fases em escala industrial são bem conhecidos dos versados na técnica. Em algumas modalida- des, a fase orgânica é contínua ou semicontinuamente desviada. Em algumas modalidades, um biorreator é empregue, que compreende um separador que contínua ou semicontinuamente extrai a fase orgânica.

[00120] Em algumas modalidades, um biocombustível ou precursor de biocombustível é acumulado nas células de acordo com os aspec- tos desta invenção. Em algumas modalidades, as células que tiveram acumulada uma quantidade desejável de biocombustível ou precursor de biocombustível, são separadas de forma contínua ou semicontinu- amente de um biorreator, por exemplo, por centrifugação, decantação, ou filtração. Separação de células pode ainda ser efetuada, por exem- plo, com base em uma mudança nas características físicas de células, tais como a dimensão da célula ou a densidade, por métodos bem co- nhecidos dos versados na técnica. O biocombustível ou precursor de biocombustível acumulado pode posteriormente ser extraído das res- pectivas células, utilizando métodos padrão de extração bem conheci- dos dos versados na técnica, por exemplo, extração de solvente hexa- no. Em algumas modalidades, as células microbianas são recolhidas e extraídas com 3 vezes o volume de hexano de células colhidas. Em algumas modalidades, o biocombustível extraído ou o precursor de biocombustível são aperfeiçoados. Em algumas modalidades, um pre- cursor de biocombustível, por exemplo um triacilglicerol é convertido em um biocombustível, por exemplo, o biodiesel, utilizando um método bem conhecido dos versados na técnica, por exemplo, um processo de transesterificação.

[00121] A função e vantagem destas e outras modalidades da pre- sente invenção será mais completamente compreendida a partir dos exemplos abaixo. Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar os be- nefícios da presente invenção, mas não exemplificam o âmbito com-

pleto da invenção. Consequentemente, será entendido que a seção exemplar não se destina a limitar o âmbito da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1. Materiais e Métodos

[00122] Cepas de leveduras, crescimento e condições de cultura

[00123] As cepas de Y. lipolytica utilizadas neste estudo eram deri- vadas da cepa Y. lipolytica W29 tipo selvagem (ATCC20460). O Po1g auxotrófico (Leu) utilizado em todas as transformações foi obtido a par- tir Yeastern Biotech Company (Taipei, Taiwan). Todas as cepas utili- zadas neste estudo estão listadas na Tabela 1. Tabela 1. Conteúdo total de ácidos graxos, produção e distribuição de cepas Y. lipolytica. O conteúdo total de ácido graxo é dado como mé- dia + SD (n = 3) de uma cultura de 50 mL, após 100 horas (razão mo- lar C/N de 20). Perfis de ácidos graxos são dados como a percenta- gem de ácidos graxos de ácidos graxos totais, com o erro menos do que 2,5%. Bio- Conte- Rendirc Ácido Graxo (Abudância Fracionária mas- údode mento %) sa(g Lipídio deóleo Ci6 C16:1 C18:0 C181 C182 DCWw) (%) (9/9 glicose) Controle 1049 877+ 2,28 20,5 3,9 240 430 8,7 (MTYLO37) 0,37 ACC1T(MT- 604 179+ 625 203 35 234 417 110 YLO40) 1,13 DGAT1T(MT- 7,53 33,8 + 9,36 183 26 34,1 38,6 6,4 YLO53) 0,55 ACC1T+YDGA 860 414% 114 160 23 328 449 40 1 (MT- 1,90 YLO65)

[00124] Meios e condições de crescimento para a Escherichia coli, foram anteriormente descritos por Sambrook et al. (21), e aqueles para Y. lipolytica foram descritos por Barth e Gaillardin (11). Meio rico (YPD)

foi preparado com 20 g/L de Bacto peptona (Difco Laboratories, De- troit, MI), extrato de levedura de 10 g/L (Disco), 20 g/L de glicose (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Meio YNB foi feito com base de nitro- gênio com 1,7 g/L de levedura (sem aminoácidos) (Difco), 0,69 g/L de CSM-Leu (MP Biomedicals, Solon, OH), e 20 g/L de glicose. Placas seletivas YNB continham 1,7 g/L de base de nitrogênio de levedura (sem aminoácidos), 0,69 g/L de CSM-Leu, 20 g/L de glicose, e 15 g/L de ágar Bacto (Disco).

[00125] Experimentos nos frascos de agitação foram realizados uti- lizando o seguinte meio: 1,7 g/L de base de nitrogênio de levedura (sem aminoácidos), 1,5 g/L de extrato de levedura e 50 g/L de glicose. De estoques congelados, pré-culturas foram inoculadas em meio YNB (5 mL em tubos Falcon, 200 rpm, 28 ºC, 24 h). Culturas durante a noite foram inoculadas em 50 mL de meio em 250 mL de um frasco de agi- tação Erlenmeyer a uma densidade óptica (Agoo) de 0,05 e deixadas incubar durante 100 horas (200 rpm, 28 ºC), após o que o conteúdo de biomassa, o açúcar, e o teor de lipídios foram colhidos e analisados.

[00126] Fermentação em escala de biorreator foi realizada em um biorreator de tanque agitado de 2 litros confundido. O meio usado con- tinha 1,5 g/L de base de nitrogênio de levedura (sem aminoácidos e sulfato de amônio), 2 g/L de sulfato de amônio, 1 g/L de extrato de le- vedura e 90 g/L de glicose. A partir de uma placa seletiva, uma pré- cultura inicial foi inoculada em meio YPD (40 mL em frasco de Erlen- meyer de 250 mL, 200 rpm, 28 ºC, 24 h). As células em crescimento exponencial a partir da pré-cultura durante a noite foram transferidas para o biorreator a uma densidade óptica (Açoo) de 0,1 no reator de 2 L (2,5 vvm de arejamento, pH 6,8, 28 ºC, 250 rpm de agitação). Amos- tras em pontos no tempo foram armazenadas a -20 ºC para análise subsequente de lipídios. O conteúdo de ácido orgânico de açúcar foi determinado por HPLC. A biomassa foi determinada por gravimetria determinada a partir de amostras secas a 60 ºC durante duas noites. Construção de Plasmídeo

[00127] Foram usadas técnicas de genética molecular padrão ao longo deste estudo (271). As enzimas de restrição e DNA polimerase de alta fidelidade Phusion utilizado na clonagem foram obtidos a partir de New England Biolabs (Ipswich, MA). O DNA genômico de transforman- tes de levedura foi preparado utilizando o kit de DNA genômico Yeas- tar (Zymo Research, Irvine, CA). Todos os plasmídeos construídos fo- ram verificados por sequenciação. Os produtos de PCR e os fragmen- tos de DNA foram purificados com o Kit de Purificação de PCR ou Kit QIAEX II (Qiagen, Valencia, CA). Os plasmídeos utilizados estão des- critos na Tabela 3. Iniciadores utilizados estão descritos na Tabela 4.

[00128] O plasmídeo pMT010 foi construído amplificando a região promotora de fator-1a de alongamento de tradução (TEF) (Número de acesso: AFOS4508) de DNA genômico de Y. lipolytica Po1g usando iniciadores MT078 e MTO79. O fragmento amplificado foi inserido entre os locais Sa/l e Kpnl do vetor de partida, plNA1269 também conhecido como pYLEX1, obtido a partir de Yeastern Sal e Kpnl Biotech Com- pany (Taipei, Taiwan). Também incluídos no iniciador reverso MT079 foram sítios Mlul e Ns/| para adicionar os sítios de restrição ao local de multiclonagem.

[00129] O plasmídeo pMTO015 foi construído por amplificação a par- tir de DNA genômico de Y. lipolytica Po1g o promotor de TEF e a regi- ão de codificação 5' contendo o códon de iniciação ATG e 113 pb do íntron endógeno (Número de acesso: CR382129). Os iniciadores MT118 e MT122 foram utilizados para esta amplificação e inseridos entre os locais de Sa/l e Mlul de pMT010. Para fins de clonagem, al- guns íntrons foram omitidos de modo que o local de restrição SnaBl poderia ser incorporado. Clonar um gene neste plasmídeo assim re- quer a omissão do códon de iniciação ATG do gene, além de TA-

ACCGCAG ao início do iniciador 5 ', e ligação de extremidades cegas no terminal 5'.

[00130] O plasmídeo pMTO025 foi construído por amplificação do gene LacZ, que codifica B-galactosidase, a partir de E. coli e inserindo- o nos locais Pm/l e BamHI do vetor de partida piNA1269 utilizando os iniciadores MT170 e MT171. O plasmídeo pMTO038 foi construído por amplificação do gene LacZ e inserindo-o nos locais Mlul e Ns/l de pMTO10 utilizando iniciadores MT168 e MT169. Uma vez que LacZ contém vários locais Mlul, Ascl foi usado como o local de restrição 5' em MT168 que tem uma saliência correspondente. O plasmídeo PpMTO37 foi construído por amplificação do gene LacZ e inserindo-o nos locais SnaBl e Ns/l de pMTO015. Foram utilizados iniciadores MT172 e MT169, onde o iniciador direto MT127 omite o códon de ini- ciação ATG do LacZ e em vez começa com a sequência de TA- ACCGCAG que completa a sequência de íntron de pMT015.

[00131] O plasmídeo pMTO013 foi construído por amplificação do gene de ACC1 a partir de DNA genômico da Y. lipolytica Po1g (Núme- ro de acesso: XM 501721) e inserindo-o nos locais M/lul e Nsil de pMTO10 utilizando iniciadores MTO80 e MTO81. Plasmídeo pMTO040 foi construído por amplificação do gene de ACC1 e seu terminador de PpMTO13 usando iniciadores MT222 e MT137 e inserindo-os no vetor de iniciação pINA1269 digerido com Pm/| e Clal.

[00132] Plasmídeo pMTO53 foi construído por amplificação do gene DGA1 de DNA genômico de Y. lipolytica Po1g (Número de Acesso: XM 504700) usando iniciadores MT271 e MT272. O gene amplificado foi digerido com Nsil e foi inserido em PMTO15 da mesma maneira como na construção de pMTO037.

[00133] Para produzir um único plasmídeo que pode expressar am- bos ACC1 e DGA1, um cassete promotor terminador de promotor de gene foi amplificado a partir de pMTO53 utilizando iniciadores MT220 e

MT265. Este foi depois digerido com Dpnl e Asel e inserido em pMTO40, que foi digerido com Nrul e Asel resultando no construto do gene em tandem pMTO65. O local de restrição Asel foi selecionado para facilitar a seleção, uma vez que reside dentro do marcador de re- sistência a ampicilina. Porque Nrul é um sítio de restrição de extremi- dade embotada, a inserção do fragmento amplificado não aumenta o número total de sítios Nrul para facilitar a inserção progressiva.

[00134] Os plasmídeos foram linearizados com ou Notl ou Sacll e cromossomicamente integrados em Po1g de acordo com o método de transformação de acetato de lítio de uma etapa descrito por Chen et al. (22). Os transformantes foram plaqueados em meio seletivo e verifica- dos por PCR de DNA genômico preparado. Os transformantes foram verificados, em seguida, armazenados como estoques congelados a - 80 ºC e em placas YNB seletivas a 4 ºC. Isolamento de RNA e quantificação de transcrição

[00135] As cepas de leveduras foram cultivadas em YNB durante 24 horas, colhidas, congeladas com nitrogênio líquido e mantidas a 80 ºC. As amostras foram esmagadas em nitrogênio líquido, e o RNA total foi isolado de Y. lipolytica com o Mini Kit RNeasy (Qiagen) e tratado com DNase isenta de RNase durante a etapa de isolamento de acordo com as instruções do fabricante. O RNA isolado foi quantificado por espectrofotometria a 260 nm. Análises qRT-PCR foram realizadas uti- lizando Kit iScript One-step RT-PCR com SYBR Green (Bio-Rad, Her- cules, CA). A quantificação relativa foi baseada no método 2 usando ACT1, que codifica para a actina, como um controle interno. As amos- tras foram analisadas em triplicado. Ensaio de B-galactosidase

[00136] A atividade da enzima LacZ foi medida utilizando o kit de ensaio de B-gal da Sigma-Aldrich. As células foram ressuspensas em tampão de PBS e lisadas por rotação com 500 um de esferas de vidro

(Sigma-Aldrich) durante 2 minutos. 40 uL do lisado celular foram trans- feridos para 340 ul da mistura reacional contendo 47 mg/ml de ONPG, 0,6 M de Na2HPO4-7H20, 0,4 M de NaH2PO4-H20, 0,1 M de KC1, 0,01 M de MgSO4-7H20. A reação foi incubada a 37 ºC para a evolu- ção de cor ocorrer, e foi finalmente arrefecida utilizando 500 ul de carbonato de sódio a 1 M. A absorvância foi então medida com um es- pectrofotômetro a 420 nm. Unidades enzimáticas são calculadas com base na atividade da enzima dividida pelo tempo de incubação e peso celular seco. Análise de Lipídio

[00137] Os lipídios totais foram extraídos utilizando o procedimento de Folch et al (23). Uma quantidade medida de biomassa celular (a- proximadamente 1 mg) foi suspensa em 1 ml de solução de clorofór- mio: metanol (2:1) e vortexada durante 1 hora. Após centrifugação, 500 uL foram transferidos para 125 ul de solução salina. A camada aquosa superior foi removida e a camada do fundo foi evaporada e suspensa em 100 ul de hexano. As amostras foram então armazena- das a -20 ºC até a transesterificação.

[00138] A transesterificação de extratos de lipídios totais foi realiza- da através da adição de 1 mL de 2% (peso / volume) de ácido sulfúrico em metanol, para cada amostra. As amostras foram então incubadas a 60 ºC durante 2 horas.

[00139] Depois das amostras terem sido parcialmente evaporadas, e os metil ésteres de ácido graxo (FAME) terem sido extraídos por adi- ção de 1 mL de hexano e vortexando durante 10 min. 800 uL deste hexano foi então transferido para frascos de vidro para análise por GC.

[00140] A análise GC de FAMESs foi realizada com um instrumento Bruker 450-GC equipado com um detector de ionização de chama e uma coluna capilar HP-INNOWAX (30 m x 0,25 mm). As condições do forno GC foram as seguintes: 150 ºC (1 min), uma elevação de 10 min para 230 ºC, mantido a 230 ºC durante 2 min. A razão de separação foi de 10:1. Ácidos graxos foram identificados e quantificados por comparação com padrões de FAME comerciais normalizados para tri- decanoato de metila (C13:0). O conteúdo de lipídio total foi calculado como a soma de conteúdo de ácidos graxos total para cinco FAMEs: palmitato de metila (C16:0), palmitoleato de metila (C16:1), estearato de metila (C18:0), oleato de metila (C18:1), linoleato de metila (C18:2) (Sigma-Aldrich). A adição de ácido tridecanóico ao fluido de extração com clorofórmio-metano! foi utilizada como padrão interno, o qual foi realizado por meio do processo de análise inteira e transesterificada em seu metil éster. Resultados e Discussão

[00141] Estabelecer uma plataforma de expressão elevada utilizan- do o íntron melhoramento de expressão de Fator-la de Alongamento de Tradução

[00142] Em Y, lipolytica, vários promotores estão disponíveis para a expressão genética, incluindo os induzíveis e constitutivos (24). O promotor de TEF foi inicialmente identificado como sendo um forte promotor constitutivo; No entanto, a clonagem e caracterização subse- quente resultaram em menor expressão em relação ao promotor indu- zível XPR2 (25). Mais recentemente, o promotor híbrido hp4d tornou- se popular pela sua forte expressão quase-constitutiva (26), e tem sido utilizado em uma série de aplicações que requerem a expressão ele- vada de proteína (20, 27, 28).

[00143] A análise da sequência genômica para TEF revela a pre- sença de um íntron spliceosomal de 122 pb, imediatamente após o códon de iniciação na região 5' do quadro de leitura aberta. Íntrons s- pliceosomais de promotor foram frequentemente encontrados para afetar drasticamente a expressão dos genes correspondentes em uma variedade de organismos (29). Especulou-se que a forte expressão de

TEF era dependente deste íntron, e que a expressão mais forte pode ser obtida através da inclusão do íntron, juntamente com o promotor no vetor de expressão. Com efeito, o rastreio inicial e isolamento do promotor TEF provavelmente, depende do realce do íntron para o en- riquecimento em bibliotecas de cDNA, uma característica que não teria sido notada uma vez que o íntron foi emendado.

[00144] —Plasmídeos pMTO025, pMTO037 e pMTO38 foram construídos expressando LacZ para comparar a expressão relativa de três promo- tores: o promotor híbrido sintético (pbhp4d), promotor TEF sem o íntron (PTEF), e promotor TEF com íntron (pTEFin). Notavelmente, o promo- tor TEFin exibe um aumento de 17 vezes na expressão sobre o pro- motor TEF sem íntron, e um aumento de 5 vezes na expressão sobre o promotor hp4d após 50 horas de cultura.

[00145] Orealce de íntron observado em outros sistemas varia mui- to: a partir de apenas 2 vezes em células humanas e de levedura para cerca de 1000 vezes em milho (30, 31). Acredita-se que os íntrons aumentem a expressão genética de várias maneiras: contendo ele- mentos reguladores, facilitando a exportação de MRNA, e aumentando as taxas de iniciação da transcrição (29). Genes intrônicas, como um grupo, tendem a exibir níveis mais elevados de expressão em relação a genes não-intrônicas. Por exemplo, em S. cerevisiae, os genes in- trônicos apenas representam menos de 4% do número total de genes, ainda consideram para 27% do RNA total gerado na célula (32). O ge- noma Y. lipolytica contém íntrons em 10,6% dos seus genes, em com- paração com apenas 4,5% em S. cerevisiae (33). Considerar este pro- cesso endógeno para melhorar os nossos próprios genes desejados representa um meio simples para maximizar a expressão, aplicável a uma ampla faixa de organismos eucarióticos. Por exemplo, existe uma elevada homologia de sequência das sequências de junção entre le- vedura de hemiascomicetos (34). Enquanto a investigação continua a esclarecer mais sobre a função, evolução e propósito de íntrons, a uti- lização de íntrons para fins biotecnológicos é uma oportunidade relati- vamente inexplorada. Sobre-expressão de ACCI e DGA1 leva a aumentos significativos no acúmulo de lipídios

[00146] A utilização do promotor de TEF, juntamente com o seu Ín- tron de reforço de expressão proporciona uma excelente plataforma para a expressão elevada de genes em Y. lipolytica. Por conseguinte, isto utilizado para a sobre-expressão de DGA1 (pMTO053), que foi de- monstrada ser importante na acumulação de lipídio em ambos Y. /i- polytica e S. cerevisiae (19, 35). AcCI, já tendo dois íntrons proximais de promotor endógeno, não foi clonado com o promotor TEFin. Em vez disso, foi clonado com promotores TEF e hp4d (pMTO13 e pMTO40, respectivamente). As taxas de crescimento e de produção de lipídios eram relativamente semelhantes entre os dois (dados não mostrados), de modo que php4d-Accl foi utilizado para experiências de lipídios e para a construção de genes em tandem de ACC1 + DGA1 (pMTO65). O promotor hp4d também foi selecionado para minimizar a possibilida- de de recombinação homóloga dos dois cassetes de genes paralelos no construto ACC1 + DGA. Coexpressão simultânea de dois genes em Y. lipolytica utilizando construção do gene em tandem tem sido reali- zada com sucesso em outra parte (20).

[00147] O efeito de sobre-expressão de ACCL e DGA1 na produção lipídica foi avaliado pela primeira vez em experimentos em frasco de agitação. A cepa LacZ de controle produziu apenas 8,77% (g/g DCW) de lipídios, que é semelhante ao desempenho do tipo selvagem em frascos de agitação com a glicose como substrato único (36). Trans- formantes ACCL e DGA1 ambos superaram o controle, acumulando 17,9% e 33,8% de teor de lipídios, respectivamente. DGA1 em particu- lar exibiu quase o dobro do acúmulo de lipídios como ACCL, quase 4 vezes sobre o controle. A biomassa gerada a partir do controle foi sig- nificativamente mais elevada do que as outras cepas, sugerindo que a expressão de AcCl e DGA1 pode perturbar o potencial de crescimento de Y. lipolytica. Rendimento global de óleo foi relativamente baixo em comparação com um rendimento máximo teórico de 0,32 9g/g (37). Houve também pequenas mudanças no perfil de ácidos graxos, com ACC1 produzindo significativamente mais ácido linoleico e DGA1 man- tendo uma proporção mais elevada de ácido esteárico. A proporção de ácido oléico ficou relativamente estável em todos os transformantes.

[00148] Melhoria em ambos os transformantes de um único gene, ACC1 + DGA1 foi capaz de alcançar 41,4% de teor de lipídios, uma melhoria de 4,7 vezes sobre o controle. A produção de biomassa foi melhorada nos transformantes individuais, mas ainda menos do que o controle. Rendimento de óleo melhorou proporcionalmente, para 0,114 9/g, ou 35% do rendimento teórico.

[00149] Em organismos eucarióticos, a sobre-expressão de ACC, foi atendida com apenas uma melhora limitada da produção de lipí- dios. A expressão heteróloga de ACCL a partir do fungo oleaginoso Mucor rouxii na levedura não oleaginosa Hansenula polimorpha só foi capaz de alcançar um aumento de 40% no teor de ácidos graxos to- tais, de 3,8% para 5,3% (38). Nas plantas, a sobre-expressão de Ara- bidopsis ACC1 levou a um aumento dramático na atividade da enzima, mas sem aumento de mais de 30% no teor de lipídio final (39, 40). Suspeita-se que as melhorias tenham sido limitadas por causa do forte controle metabólico e regulador mantido sobre esta enzima em eucari- otas. Expressão e atividade ACC é influenciada por inúmeros fatores de transcrição, proteínas quinases, e metabólitos (41). Por exemplo, em Candida (Yarwwia) lipolytica, a acumulação de acil-CoA em mutan- tes de acetil-CoA sintetase levou a uma diminuição de 8 vezes na ati- vidade de ACC (42). No entanto, Y. lipolytica pode representar uma exceção regulamentar em organismos eucarióticos, emprestando mui- to a sua natureza oleaginosa, como aqui nós conseguimos um aumen- to de 2 vezes no teor de lipídios através da sobre-expressão de ACC1 endógeno.

[00150] O papel de DGA foi apenas recentemente considerado im- portante para a síntese de lipídios. Em Y. lipolytica, DGA1p predomi- nantemente localiza-se na superfície da membrana de corpos lipídicos e atua em conjunto com lipase de triglicerídeos (TGL3) para equilibrar fluxo de TAG dentro e fora dos corpos de lipídios (16). Um, portanto, espera-se que o armazenamento de TAGs descanse muito da ativida- de relativa (e abundância) de DGA1p no que diz respeito ao seu ho- mólogo TGL3p. Também foi levantada a hipótese de que DGA desvia fluxo para longe de síntese de fosfolipídios e, assim, cria uma força motriz para a síntese de lipídios quanto mais fluxo é necessário para produzir os fosfolipídios ainda necessários (6). Consequentemente, a sobre-expressão de DGA1 levou a efeitos marcados sobre o acúmulo de lipídios. Sobre-expressão DGA1 em um mutante Asnf2 oleaginoso conduziu à acumulação de até 27% de teor de lipídios em S. cerevisi- ae, um aumento de 2,3 vezes (35). Nas plantas, a Sobre-expressão de Arabidopsis DGAT levou a um aumento de 20 vezes no teor de lipídios nas folhas, e duas vezes em geral (43).

[00151] O equilíbrio entre ácidos graxos e vias de síntese TAG gira em torno dos intermediários de acil-CoA redutase, uma vez que fun- cionam como produto e inibidores de realimentação na via de ácido graxo (a montante) e precursores primários na via de TAG (a jusante). A regulação para cima da via a montante aumenta a taxa de transfe- rência de síntese dos ácidos graxos e, em particular para ACC, desvia fluxo para longe a partir de quaisquer vias que compitam para acetil- CoA citosólico. A regulação para cima da via a jusante cria uma força motriz, esgotando intermediários de acil-CoA e aumentando a taxa de armazenamento de TAG em corpos lipídicos. No entanto, quando mo- dulados individualmente, eles podem levar a desequilíbrios que podem produzir efeitos adversos sobre o metabolismo celular e crescimento.

[00152] “Coexpressando ACC1 e DGA1, ambas as vias a montante e a jusante são simultaneamente reguladas para cima, o que leva ao aumento da produção de lipídios sem perturbar regulação mediada por intermediário. Ele também combina síntese de lipídios através de fluxo elevado a partir de ACC com a força motriz fornecida pelo sequestro de TAG em corpos lipídicos, DGA. O resultado é um aumento sinérgi- co na acumulação de lipídios, cerca de 5 vezes maior do que o contro- le. Na verdade, sobreprodução de acoplamento e forças motrizes com um depósito metabólico tem se tornado uma estratégia muito poderosa nos esforços recentes de engenharia metabólica, particularmente para os biocombustíveis (44-46). Desempenho de fermentação do transformante ACC1 + DGA1

[00153] Para melhor caracterizar o transformante ACCL + DGAL (MTYLO65) e explorar as suas características de acumulação de lipí- dios, a fermentação em grande escala foi realizada utilizando um bior- reator de tanque agitado 2-L. A concentração de glicose foi aumentada e concentração de sulfato de amônio foi reduzida para atingir uma proporção molar de C/N de 100. Razões molares C/N ideais para a acumulação de lipídios variam tipicamente de 80-120 (15).

[00154] A glicose foi completamente consumida durante o decorrer da fermentação de 120 horas, com biomassa final atingindo 28,49 g/L (Figura 3). Conteúdo lipídico final foi de 61,7% de DCW, um aumento de 50% no acúmulo de lipídios em comparação com o experimento de frasco agitado. Isto compara-se favoravelmente a outras fermentações de açúcar (28, 47-49), bem como valores encontrados em esquemas de acumulação lipídicas ex novo (19, 50). O rendimento global e a produtividade foi 0,195 g/g e 0,143 g/L/h, respectivamente; No entanto,

durante o máximo de produção de lipídio observada entre 70-100 ho- ras, com um rendimento de 0,270 9g/g, e uma produtividade de 0,253 g/L/h foram alcançados (Tabela 2). Quase toda a biomassa produzida durante esta fase pode ser explicada pelo aumento no teor de lipídios. Os rendimentos globais e máximos alcançados são de 60,9% e 84,3% do rendimento teórico para a síntese de TAG. Tabela 2. Cálculos de rendimento e produtividade para fermentação em biorreator 2-L de transformante ACC1 + DGA1. Rendimento é cal- culado por gramas de lipídios produzidos divididos por gramas de gli- cose consumida. Produtividade calculada pela concentração de lipí- dios produzidos por hora. Os valores máximos calculados a partir dos pontos de tempo entre 70-100 horas. Rendimento de óleo (g/g glicose) Geral 0,195 Máxima 0,270 Produtividade de óleo (g/L/hr) Geral 0,143 Máximo 0,253

[00155] O perfil de ácidos graxos mudou dramaticamente durante o aumento (Figura 4). Observou-se esgotamento relativo de ácido este- árico e enriquecimento de ácido palmítico e ácido oleico, com o ácido oleico, em última análise, compreendendo 49,3% de ácidos graxos to- tais. A relação entre os ácidos oleico e esteárico aumentou progressi- vamente ao longo da fermentação (dados não mostrados), que termi- na, finalmente, em uma proporção de 4,6. Esta é uma alteração dra- mática da proporção de 1,3 visto em experimentos em frascos de agi- tação. Um experimento semelhante foi realizado com acetato como fonte de carbono. O perfil de ácidos graxos foi analisado em 134 horas e os resultados são mostrados na Figura 5.

[00156] Concentrações de oleato relativas elevadas (até 58,5%)

foram também observadas em outras fermentações de 2-L (51), e são mais semelhantes aos perfis de outras leveduras oleaginosas que a- cumulam mais do que 50% de teor de lipídios (75). Em condições de produção de lipídios rápida, ácido oleico pode ser mais rapidamente armazenado e mais fácil de se acumular, como DGAlp é conhecido por ter diferentes especificidades para diferentes acil-CoA; em S. cerevisi- ae, C18:1 é o substrato mais preferido, tendo duas vezes a atividade de C18:0 (52). Além disso, a elevada concentração de ácido oleico também pode ser uma resposta à taxa de aeração superior alcançada no biorreator e não é facilmente vista em fermentações em frascos de agitação.

[00157] O elevado teor de lipídios, o rendimento e produtividade, vistos na cepa ACC1 + DGA1 demonstram a capacidade inata de Y. lipolytica de acomodar um elevado fluxo através da via de síntese de lipídios. Com novas modificações e otimização de processos, Y. lipoly- tica com vias de síntese de lipídios construías pode render descober- tas promissoras na síntese de novo robusta e eficiente de lipídios Tabela 3. Cepas e plasmídeos usados neste estudo Cepas (cepa Genótipo ou plasmídeo Fonte hospedeira) E. coli DH5a fhuA2 A(argF-lacZ)U169 phoA Invitrogen glnV44 D80 A(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR1I7 pINA1269 JMP62-LEU Yeastern PMTO10 PINAT1269 php4d::TEF Este Exemplo PMTO15 PINA1269 php4d::TEFin Este Exemplo PMTO25 hp4d-LacZ Este Exemplo PMTO38 YTEF-LacZ Este Exemplo PMTO3S7 YTEFin-LacZ Este Exemplo PMTO13 YTEF-ACC1 Este Exemplo pMTO40 php4d-ACC1 Este Exemplo

Cepas (cepa Genótipo ou plasmídeo Fonte hospedeira) PMTOS53 YTEFin-DGA Este Exemplo PMTO65 php4d-ACC1 + YTEFin-DGA Este Exemplo Y.lipolytica Po1lg MATa, leu2-270, ura3- Yeastern 302::URA3, xpr2-332, axp-2 MTYLO38 MATa, leu2-270, ura3- Este Exemplo 302::URA3, xpr2-332, axp-2 TEF- LacZ-LEU2 MTYLO3S7 MATa, leu2-270, ura3- Este Exemplo 302::URA3, xpr2-332, axp-2 TE- Fin-LacZ-LEU2 MTYLO40 MATa, leu2-270, ura3- Este Exemplo 302::URA3, xpr2-332, axp-2 hp4d-ACC1-LEU2 MTYLOS53 MATa, leu2-270, ura3- Este Exemplo 302::URA3, xpr2-332, axp-2 TE- Fin-DGA1-LEU2 MTYLO65 MATa, leu2-270, ura3- Este Exemplo 302::URA3, xpr2-332, axp-2 hp4d-ACC1 + TEFin-DGA1-LEU2 Tabela 4: Iniciadores usados neste estudo Inicia- — Descrição Sequência SEQ ID dor

PCR MTO78 TEF GACTGTCGACAGA- 14 GACCGGGTTGGCGGCG-

CATTTGTG MTO079 TEF GACTGGTACCTCAAGATGCATAG 15 CACGCGTTTTGAATGATTCTTA-

TACTC

Inicia- — Descrição Sequência SEQ ID dor MT118 TEFin GGCAGTCGACAGA- 16

GACCGGGTTGGCGGC MT122 TEFin TTATTCACGCGTGTAGATACGTA 17

CTGCAAAAAGTGCTGGTCGGA MT170 LacZ AATGACCATGATTACGGATT- 18

CACTGG MT171 LacZ CTAGGTGGATCCTTATTTTITTGA- 19

CACCAGACCAACTGGTAA MT172 LacZ TAACCGCAGACCATGATTACG- 20

GATTCACTGGCC MT173 LacZ CTAGGTATGCATATGACCAT- 21

GATTACGGATTCACTGG MT174 LacZ CTTACAGGTACCTTATTTTTGA- 22

CACCAGACCAACTGGTAA MTO8O TEF-ACC GACTACGCGTCACAATGC- 23

GACTGCAATTGA MTO81 TEF-ACC TAGCATGCATTCACAACCCCTT- 24

GAGCAGCT MT222 Hp4d-ACC AATGCGACTGCAATTGAGGA- 25

CACTAA MT137 Hp4d- CGTTGAATCGATTTITCGGA- 26 ACC1 CACGGGCATCTCAC MT271 DGA TAACCGCAGACTATCGACTCA- 27

CAATACTACAAGTCGCG MT272 DGA CTAGGTATGCATTTACTCAAT- 28

CATTCGGAACTCTGGG MT220 NrulAsel CCCGGCAACAATTAATAGACTG- 29

GAT MT265 NrulAsel TTCGGACACGGGCATCTCAC 30 RT-

PCR Actina Actina

Inicia- — Descrição Sequência SEQ ID dor LacZ LacZ ACCT1 ACC1

DGA

DGA Produção de lipídios a partir de acetato usando cepa ACC + DGA construída

[00158] —Yarrowia lipolytica cresce naturalmente no acetato de ácido orgânico. O acetato é um substrato atraente, uma vez que pode ser produzido com rendimentos elevados por organismos homoacetogêni- cos de dióxido de carbono ou monóxido de carbono por meio de vias de fixação de carbono não fotossintético. Acetato entra nas vias meta- bólicas celulares na forma de acetil-CoA, que é o principal precursor para a síntese de lipídios através do acetil-CoA carboxilase (ACC). Como tal, a cepa ACC + DGA parecia ser um candidato promissor pa- ra a produção de lipídios em substrato de acetato, uma vez que há uma sobre-expressão direta de uma enzima que utiliza acetil-CoA jun- tamente com a força motriz para a acumulação de lipídios.

[00159] Uma fermentação em biorreator de 2 litros foi realizada uti- lizando a cepa ACC + DGA com acetato como substrato de carbono (Figura 6). A um teor de oxigênio elevado, observou-se que o acetato seria rapidamente consumido com baixa geração de biomassa, de modo que a fermentação foi realizada sob nitrogênio e condições limi- tadas de oxigênio para maximizar a produção e rendimento de lipídio.

[00160] Título final de produção de óleo foi de 5,5 g/L após 130 ho- ras, o que representa 62% do total de 8,9 g/L de biomassa em peso de células secas. O rendimento global de lipídios em acetato era 0,152 g de óleo / gq de acetato. Durante a fase de produção de lipídios (entre

90-130 horas), a produção máxima de lipídios foi obtida com um ren- dimento de 0,27 g de óleo / g de acetato, que é 96% do rendimento máximo teórico.

[00161] Uma comparação entre as características de fermentação com aquela da glicose mostram que, apesar de mais baixos rendimen- tos de biomassa e taxas de crescimento, acúmulo de lipídios e rendi- mento máximo de lipídios foram proporcionais.

Tabela 5. Comparação de fermentação da glicose e acetato. Rendimento de Biomassa Geral Rendimento de Lipídio Máximo Conclusões

[00162] Biossíntese de lipídio é uma via metabólica bem regula- mentada. Para aplicações industrialmente relevantes para a produção de lipídios, é necessária engenharia metabólica pensativa para maxi- mizar a produção e produtividade. A utilização da levedura Y. lipolytica oleaginosa se beneficia de ter uma elevada capacidade de acumula- ção de lipídios e de ferramentas para a engenharia da via metabólica de lipídios. Aqui foi mostrado que o cossobre-expressão reforçada por íÍntron de dois genes importantes na via de síntese de lipídios, ACC1 e DGA1, fornece força motriz para a produção de lipídios, mesmo em relações C/N moderadas. Como as duas enzimas realizam as primei- ras e últimas etapas da síntese de lipídios, push e pull simultâneo de fluxo de carbono para TAG permite a produção aumentada de acumu- lação de intermediário mínima, que pode conduzir à inibição. A cepa ACC1 + DGA1 resultante foi capaz de acumular até 62% do seu DOW como lipídios através de síntese de novo a uma produtividade volumé- trica total de 0,143 g/L/h.

[00163] Os conceitos de (a) sobre-expressão forte de genes de vi- as, (b) o equilíbrio das vias a montante e a jusante, (c) desvio do fluxo para vias desejadas, e (d) forças motrizes para o produto final, são es- tratégias importantes na prática da engenharia metabólica, onde as redes metabólicas são projetadas e otimizadas para a geração de pro- dutos desejáveis. A implementação destes conceitos com relação ao acúmulo de lipídios pode facilmente estender-se a várias plataformas biológicas, incluindo microalgas. Estas estratégias serão fundamentais para permitir as tecnologias de produção em escala de commodities eficientes e robustas de produtos químicos e combustíveis derivados biologicamente. A sua aplicação na biossíntese de lipídios abre a via para sobreprodução de óleo microbiano e produção de biocombustível de baixo custo.

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[00164] O estudo do metabolismo celular pode ser elucidado utili- zando engenharia metabólica. A engenharia metabólica é o uso de tecnologias de DNA recombinante para manipular as vias metabólicas em organismos (Bailey, 1991). Através de manipulação e de engenha- ria de redes metabólicas específicas, e fatores que controlam as eta- pas limitantes da velocidade pode ser identificados e elaborados. A- proveitando o conhecimento e as ferramentas existentes para um or- ganismo ou via específica, pode-se avaliar como novas perturbações podem ser usadas para redirecionar e controlar a geração de produtos desejados.

[00165] Biossíntese de lipídio é uma excelente via para o estudo que usa engenharia metabólica, com amplas aplicações que vão des- de a saúde, câncer e medicina, a produção de bioquímicos e biocom- bustíveis (Beopoulos et al. 2011; Courchesne et al. 2009; Kohlwein and Petschnigg 2007). A fisiologia, enzimologia e metabolismo para a biossíntese de lipídios em uma ampla gama de organismos, de bacté- rias aos seres humanos, têm sido extensivamente estudados, forman- do uma base sólida de conhecimentos, tanto para a análise comparati- va quanto exploratória (Kurat et al 2006;. Ohlrogge e Jaworski, 1997). Metabolismo de lipídios tem um papel importante em vários aspectos da fisiologia celular, do crescimento e proliferação celular ao armaze- namento de energia e metabolismo (Kohlwein and Petschnigg 2007; Tehlivets et al. 2007). Para utilizar estas vias, tanto para fins medici- nais quanto industriais, é importante compreender que as perturba- ções têm o maior impacto sobre o processo global.

[00166] A levedura oleaginosa Yarrowia lipolytica se destaca como um excelente modelo de organismo para estudar o metabolismo lipídi- co. Como uma levedura oleaginosa, Y. lipolytica pode naturalmente acumular até 36% de lipídios em ambientes ricos em carbono (Beo- poulos et al. 2009). Estes lipídios são armazenados sob a forma de triacilglicerol (TAG) em corpos lipídicos. É uma das espécies de leve- duras "não convencionais" mais extensivamente estudadas, com um genoma sequenciado e uma gama de ferramentas genéticas disponí-

veis (Barth e Gaillardin 1997). Ela tem sido usada em várias aplica- ções industriais e tem sido vista como um modelo de organismo para a secreção da proteína, a utilização de substratos hidrófobos, metabo- lismo de lipídios, e a respiração mitocondrial (Beckerich et a. 1998, Beopoulos et al. 2009;. Coelho et al. 2010, Kerscher et al. 2002). En- quanto Y. lipolytica acumula naturalmente grandes quantidades de |li- pídios, uma série de esforços de engenharia têm sido bem sucedidos em aumentar mais ou melhorar de outro modo as suas características de acumulação de lipídios (Beopoulos et al. 2008; Chuang et al. 2010; Dulermo and Nicaud 2011; Zhang et al. 2011). No entanto, o número e a variedade de manipulações genéticas examinadas mantiveram-se relativamente limitados para este fim e o potencial de Y. lipolytica co- mo uma plataforma para a superprodução de lipídios permanece rela- tivamente inexplorado.

[00167] Um certo número de alvo genéticos interessantes tem sido associado a acúmulo de lipídios através de uma variedade de aborda- gens e estratégias (Courchesne et al. 2009). Acetil-CoA carboxilase (ACC) é geralmente conhecido como a etapa limitante da velocidade na biossíntese graxo, controlando o fluxo de entrar na via. Ela é res- ponsável pela produção de malonil-CoA, que pode ser utilizado no a- longamento de ácidos graxos. ACC utiliza acetil-CoA citosólico como principal precursor metabólico. A enzima que fornece acetil-CoA cito- sólico, na maioria dos eucariotas é a liase de citrato de ATP (ACL). ACL cliva citrato, que tem sido empurrado para fora das mitocôndrias como um produto do ciclo do TCA, para formar acetil-CoA e oxaloace- tato. Depois a produção de ácido graxo é completada com o complexo de síntese de ácidos graxos, as moléculas de acil-CoA podem ser ain- da manipuladas através de elongação e dessaturação no retículo en- doplasmático. Estes processos de ajudar a modificar as propriedades químicas das cadeias acil-CoA para facilitar o armazenamento ou a utilização de outras vias metabólicas. Enzimas como a A9-dessaturase (D9) convertem moléculas estearoil-CoA em moléculas oleoil-CoA, que parecem ser muito importantes tanto na regulação quanto no metabo- lismo lipídico (Dobrzyn e Ntambi 2005). A etapa final na montagem e armazenamento de lipídios é a conversão de diacilglicerol (DAG) em TAG através da enzima aciltransferase de diacilglicerol (DAG). Esta etapa ocorre, tanto no retículo endoplasmático quanto na superfície dos corpos de lipídios, com o último estabelece um equilíbrio dinâmico do conjunto TAG e degradação, dependendo das necessidades de energia do organismo (Athenstaedt et al. 2006). Em Y. lipolytica, um número de genes DGA foram identificados que desempenham esta função (Zhang et al. 2011).

[00168] Estas etapas enzimáticas apresentam uma interessante relação para o acúmulo de lipídios. ACC controla fluxo entrante de sín- tese lipídica, e a sobre-expressão de ACC nas bactérias de Escheri- chia coli resultou em um aumento de 6 vezes na síntese de ácidos graxos (Davis et al. 2000). O serviço de transporte de citrato, que está sob o controle de ACL, é diferencialmente observado em fungos olea- ginosos em comparação com fungos não oleaginosos, e especula-se como uma via necessária para alto fluxo na via de biossíntese de lipí- dios (Boulton and Ratledge 1981; Vorapreeda et al. 2012). Pensa-se também que a desativação de ACL leva ao acúmulo de citrato e se- creção, um fenômeno indesejável na produção de lipídios (Papaniko- laou and Aggelis 2002; Papanikolaou et al. 2002). D9 tem sido impli- cada no metabolismo do câncer, sendo regulada positivamente em células tumorais de mamíferos. É potencialmente um forte regulador positivo da lipogênese e facilita a produção necessária para o cresci- mento rápido de lipídios encontrados em células de câncer (Dobrzyn and Ntambi 2005; Hulver et al. 2005; Ntambi and Miyazaki, 2004). DGA é a etapa final comprometida para o armazenamento de lipídios,

e sobre-expressão do DGA em um mutante S. cerevisiae Asnf2 resul- tou em aumentos dramáticos no acúmulo de lipídios (Kamisaka et al. 2007). Embora estes resultados tenham produzido resultados interes- santes e implicações, a análise de suas contribuições dentro de um único modelo de organismo pode permitir identificar de forma sistemá- tica como podem contribuir e cooperar para atingir o aumento da pro- dução de lipídios.

[00169] Aqui olhou-se para o impacto de vários genes importantes envolvidos na biossíntese de lipídios e como explorar as suas contribu- ições para o aumento da acumulação de lipídios na levedura oleagino- sa Y. lipolytica. Por sobre-expressão de alvo genético, tanto individu- almente como em combinação, pode-se explorar como os genes po- dem ter um impacto positivo de fluxo através de via de biossíntese de lipídios. Além disso, foi investigado o desempenho da produção de |li- pídios de duas linhagens candidatas para elucidar a importância do fluxo metabólico equilibrado dentro da célula para atingir alta produtivi- dade. Materiais e Métodos Cepas de leveduras, crescimento e condições de cultura

[00170] As cepas de Y. /ipolytica utilizadas neste estudo foram obti- das a partir da cepa Y. lipolytica W29 tipo selvagem (ATCC20460). O Po1g auxotrófico (Leu-) utilizado em todas as transformações foi obti- do a partir de Yeastern Biotech Company (Taipei, Taiwan). Todas as cepas utilizadas neste estudo estão listadas na Tabela 6. Plasmídeos construídos foram linearizados com Sacll e cromossomicamente inte- grados em Po1g de acordo com o método de transformação do aceta- to de lítio em uma etapa descrito por Chen et al. (Chen et al. 1997). Transformantes MTYL foram nomeados após a numeração de seus respectivos plasmídeos integrados, com a exceção de MTYLO88 e MTYLO89. Para a construção de cepas MTYLO88 e MTYLO89, cepas

MTYLO78 e MTYLO79 passaram por duas rodadas adicionais de trans- formação: (1) transformada com cassete URA KO em 5-FOA seletiva para nocautear URA endógeno; (2) transformada com PMTOS9?2 lineari- zado com Sacll. Os transformantes foram plaqueados em meio seleti- vo e verificada por PCR de DNA genômico preparado. Os transforman- tes foram verificados, em seguida, armazenado como stocks de glice- rol congelado a -80 ºC e em placas YNB seletivos a 4 ºC. Um resumo do projetado sobre-expressão genética para cada cepa é descrita na Tabela 7.

[00171] Meios e condições de crescimento para a Escherichia coli, foram anteriormente descritos por Sambrook et al. (Sambrook and Russell, 2001), e aqueles para Y. lipolytica foram descritos por Barth and Gaillardin (Barth and Gaillardin 1997). Meio rico (YPD) foi prepa- rado com 20 g/L de Bacto peptona (Difco Laboratories, Detroit, MI), 10 g/L de extrato de levedura (Difco), 20 g/L de glicose (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Meio YNB foi feito com 1,7 g/L de base de nitrogênio de levedura (sem aminoácidos) (Difco), 0,689 g/L de CSM-Leu (MP Bio- medicals, Solon, OH), e 20 g/L de glicose. Placas seletivas de YNB continham 1,7 g/L de base de nitrogênio de levedura (sem aminoáci- dos), 0,69 g/L de CSM-Leu, 20 g/L de glicose, e 15 g/L de agar Bacto (Difco). Experimentos no frasco de agitação foram realizados utilizan- do o seguinte meio: 1,7 g/L de base de nitrogênio de levedura (sem aminoácidos), 1,5 g/L de extrato de levedura e 50 g/L de glicose. De estoques congelados, pré-culturas foram inoculadas em meio YNB (5 mL em tubos Falcon, 200 rpm, 28 ºC, 24 h). Culturas durante a noite foram inoculadas em 50 mL de meio em frasco de agitação Erlenme- yer de 250 mL para uma densidade óptica (A6OO) de 0,05 e deixada incubar durante 100 horas (200 rpm, 28 ºC), após isso a biomassa, o teor de açúcar, e o conteúdo lipídico foram recolhidos e analisados.

[00172] Fermentação em escala em biorreator foi realizada em um biorreator de tanque agitado de 2 litros. O meio usado continha 1,7 g/L de base de nitrogênio de levedura (sem aminoácidos e sulfato de a- mônio), 2 g/L de sulfato de amônio, 1 g/L de extrato de levedura e 90 g/L de glicose. A partir de uma placa seletiva, uma pré-cultura inicial foi inoculada em meio YPD (40 mL em 250 mL de frasco Erlenmeyer, 200 rpm, 28 ºC, 24 h). As células em crescimento exponencial a partir da pré-cultura durante a noite foram transferidas para o biorreator para uma densidade óptica (A600) de 0,1 no reator 2 L (2,5 vvm de aera- ção, pH 6,8, 28 ºC, 250 rpm de agitação). Amostras pontuais de tempo foram armazenadas a -20 ºC para análise subsequente de lipídios. O conteúdo de ácido orgânico de açúcar foi determinado por HPLC.

[00173] A biomassa foi determinada por gravimetria determinada a partir de amostras lavadas e secas a 60 ºC durante duas noites. Técnicas Genéticas

[00174] Técnicas de genética molecular padrão foram usadas ao longo deste estudo (Sambrook andRussell, 2001). As enzimas de res- trição e DNA polimerase de alta-fidelidade Phusion utilizada na clona- gem foram obtidos a partir de New England Biolabs (Ipswich, MA). O DNA genômico a partir de transformantes de levedura foi preparado utilizando o kit de DNA genômico Yeastar (Zymo Research, Irvine, CA). Todos os plasmídeos construídos foram verificados por sequen- ciação. Os produtos de PCR e os fragmentos de DNA foram purifica- dos com o Kit de Purificação de PCR ou Kit QIAEX Il (Qiagen, Valen- cia, CA). Os plasmídeos utilizados estão descritos na Tabela 6. Inicia- dores utilizados estão descritos na Tabela 9. Supressão de URA3

[00175] Para aumentar a disponibilidade de marcadores em cepas de Y. lipolytica, o gene que codifica para o prototrofia de uracila, oroti- dina-5'-fosfato descarboxilase (URA3, Número de acesso: AJ306421), foi amplificado e usado como a base de um cassete knockout para a geração de cepas URA auxotróficas. Sequências a montante e a ju- sante do quadro de URA de leitura aberta foram amplificadas utilizan- do os pares de iniciadores MT310 - MT311 e MT312 - MT313, respec- tivamente. Os iniciadores são concebidos de tal modo que os dois fragmentos amplificados transportam região de sobreposição de 23 pb. Após a purificação dos dois produtos de amplificação, os dois produtos são misturados e a PCR é realizada utilizando os iniciadores MT310 e MT313 para produzir um amplicom de 456 pb fundindo os produtos de amplificação a montante e a jusante. Este DNA foi purificado e posteri- ormente transformado em Po1g. As células transformadas foram então plaqueadas em uma placa de meio seletivo contendo uracila e ácido 5- fluoro-órico (5-FOA). Colônias que cresceram foram replaqueadas em placas 5-FOA para resselecionar para auxotrofia de URA, e verificadas por PCR de DNA genômico preparado. A cepa resultante ALEU2 AU- RA3 foi nomeada MTYL 100.

Construção de Plasmídeo

[00176] A construção de plasmídeos pMT010, pMTO15, pMTO038, PpMTO40, pMTO13 e pMTO65 foi descrita acima, e é semelhante a mé- todos descritos aqui. O plasmídeo pMTO047 expressando ATP: liase de citrato subunidade 1 foi construído através da amplificação do gene acl1 a partir de DNA genômico Po1g de Y. lipolytica (Número de aces- so: XM 504787) e inserindo-o nos locais M/ul e Nsil de pMTO10 utili- zando iniciadores MT252 e MT253. Plasmídeo pMTO049 expressando ATP: liase de citrato subunidade 2 foi igualmente construído através da amplificação do gene ACL2 a partir de DNA Po1g genômico de Y. lipolytica (Número de acesso: XM 503231) e inserindo-o nos locais Mlul e Nsil de pMT010 utilizando iniciadores MT254 e MT255. O plas- mídeo pMTO61 expressando dessaturase de ácido graxo delta-9 (D9) foi amplificado a partir de DNA genômico Po1g (Número de acesso: XM 501496) e inserido-o em plNA1269 sob o controle do promotor php4d utilizando os locais de restrição BamHI e Pmll com iniciadores MT283 e MT284.

[00177] Para produzir plasmídeos que expressam vários genes (PMTOS5O, pMTO65, pMTO66, pMTO73, pMTO74, pMTO75, pMTO78, PpMTO79), o cassete terminador de gene promotor foi amplificado a partir do plasmídeo usando um MT220 primário e MT265. Este foi, em seguida, digerido com Dpnl e Asel e inserido no segundo plasmídeo que foi digerido com Nrul e Asel resultado em constructo de gene em tandem pMTO65. O sítio de restrição Asel foi selecionado para facilitar a seleção da taxa, como seu resíduo está dentro do marcador de re- sistência a ampicilina. Porque Nrul é o sítio de restrição de fim brusco, ligadura da inserção não aumenta o número total de locais de Nrul, possibilitando inserções iterativas usando o mesmo processo. O es- quema geral e a sequência utilizada para a construção combinatória destes plasmídeos estão descritos na Figura 7. Para a construção do vetor complementar, pACYCDUET-1 foi selecionado como o vetor de transporte complementar, uma vez que ele usa a estrutura principal diferente, marcador seletivo e origem de replicação. As sequências a montante de LIP2 (número de acesso: XM 500282) foram amplifica- das a partir de DNA genômico de Y. lipolytica Po1g usando pares pri- mários MT316 - MT317 e integradas em pDUET utilizando os locais de restrição BamHI e EcoRI. A sequência a jusante de LIP2 foi amplifica- da utilizando pares de primários MT318 - MT319 e integrada em pDU- ET utilizando os locais de restrição Kpnl e Avrll. O marcador seletivo para o prototropia de uracila de levedura foi amplificado a partir do plasmídeo JMP62-URA utilizando pares de primários MT314-MT315 e integrado em pDUET utilizando os locais de restrição Pvul e Kpnl. O plasmídeo resultante pMTO091 continha o local de multi-clonagem flan- queado por sequências LIP2 a montante e a jusante e o marcador URAS. A digestão com a enzima de restrição Sacll lineariza o plasmí-

deo e separa o vetor de integração da estrutura do plasmideo, minimi- zando a integração de DNA estranho e desnecessário. Utilização do plasmídeo complementar requer a construção do cassete de expres- são na estrutura principal piNA1269 original e, em seguida, transferir o cassete sobre a pMTO091 utilizando subclonagem de enzimas de restri- ção. A local de multicionagem amplo e marcador de antibiótico dife- rencial facilita a clonagem e processo de seleção.

Isolamento de RNA e transcrição quantificação

[00178] Culturasem balão de agitação cresceram durante 42 horas foram recolhidas e centrifugadas durante 5 minutos a 10.000 g. Cada sedimento foi ressuspenso em 1,0 ml de reagente Trizol (Invitrogen) e 100 uL foram adicionados de esferas de vidro lavadas com ácido (Sigma-Aldrich). Os tubos foram centrifugadas durante 15 min a 4 ºC durante a lise celular a ocorrer. Os tubos foram então centrifugados durante 10 min a 120.000 g, a 4 ºC e o sobrenadante foi recolhido em um novo tubo de 2 mL. 200 uL de clorofórmio foi então adicionado e os tubos foram agitados manualmente durante 10 segundos. Os tubos foram novamente centrifugados durante 10 min a 120.000 g, a 4 ºC. 400 uL da fase aquosa superior foi transferida para um novo tubo, e um volume igual de álcool de fenol-clorofórmio-isoamila (pH 4,7) (Am- bion, Austin, TX) foi adicionado. Os tubos foram novamente agitados manualmente durante 10 segundos e centrifugados durante 10 min a

120.000 g, a 4 ºC. 250 uL da fase superior foi transferida para um novo tubo com um volume igual de etanol frio e 1/10th de volume de acetato de sódio (pH 5,2). Os tubos foram arrefecidos a -20 ºC durante 30 mi- nutos para promover a precipitação. Os tubos foram depois centrifuga- dos durante 5 min a 12000 g, lavados duas vezes com etanol a 70%, secos em uma estufa a 60 ºC e, finalmente, ressuspensos em RNAase isenta de água. Quantidade de RNA foi analisada utilizando um espec- trofotômetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilming-

ton, DE) e as amostras foram armazenadas em congelador a -80 ºC. qgRT-PCR análises foram realizadas utilizando Kit iScript RT-PCR de uma etapa com SYBR Green (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando o Sis- tema de Detecção em Tempo Real de PCR Bio-Rad iCycler iQ. Os re- sultados de fluorescência foram analisados por meio de PCR Miner em tempo real e quantificação relativa e a análise estatística foram deter- minadas com REST 2009 (Qiagen), utilizando actina como o gene de referência e MTYLO38 como a cepa de referência (Zhao e Fernald 2005). As amostras foram analisadas em quadruplicado. Extração de lipídios e quantificação

[00179] Os lipídios totais foram extraídos utilizando o procedimento de Folch et al (Folch et al. 1957). Uma quantidade medida de biomas- sa celular (aproximadamente 1 mg) foi suspensa em 1 mL de cloro- fórmio: solução e vortex durante 1 hora: metanol (1 2). Após centrifu- gação, 500 uL foi transferido para 125 ul de solução salina. A camada aquosa superior foi removida e a camada do fundo foi evaporada e voltou a ser suspensa em 100 ul de hexano. As amostras foram então armazenadas a -20 ºC até a transesterificação.

[00180] A transesterificação de extratos de lipídios totais foi realiza- da através da adição de 1 mL de 2% (peso / volume) de ácido sulfúrico em metanol, para cada amostra. As amostras foram então incubadas a 60 ºC durante 2 horas. Depois de que as amostras foram parcialmente evaporadas, e o metil éster de ácido graxo (FAME) foi extraído por a- dição de 1 mL de hexano e vortexada durante 10 min. 800 yu deste he- xano foi então transferido para frascos de vidro para análise por GC.

[00181] A análise GC de FAMESs foi realizada com um instrumento Bruker 450-GC equipado com um detector de ionização de chama e uma coluna capilar HP-INNOWAX (30 m x 0,25 mm). As condições do forno GC foram as seguintes: 150 ºC (1 min), um aumento de 10 min a 230 ºC, mantido a 230 ºC durante 2 min. A razão de separação foi de

10:1. Ácidos graxos foram identificados e quantificados por compara- ção com padrões de FAME comerciais normalizados para tridecanoato de metila (C13:0). O conteúdo total de lipídio foi calculado como a so- ma do total de conteúdo de ácidos graxos de cinco FAMEs: palmitato de metila (C16:0), palmitoleato de metila (C16:1), estearato de metila (C18:0), oleato de metila (C18:1), linoleato de metila (C18:2) (Sigma- Aldrich). A adição de ácido tridecanóico ao fluido de extração com clo- rofórmio-metanol foi utilizado como padrão interno, o qual foi realizado por meio do processo de análise de toda e transesterificado em seu metil éster. Resultados e Discussão Construção de Vetor Complementar Permite Método Alternativo para a Expressão de PGA.

[00182] Afim de proporcionar um método alternativo e complemen- tar para expressar genes em Y. lipolytica, o marcador de URA foi reti- rado da cepa progenitora Po1g. Como parte da concepção de um ve- tor de integração complementar, o gene da lipase LIP2 foi selecionado como o local de encaixe, como este gene é bem caracterizado e pro- vavelmente tem um efeito negligenciável ou neutra em síntese de novo de lipídios e acumulação. Assim, no processo de integração do vetor complementar, LIP2 vai ser retirado. Após a construção do vetor para a expressão genética complementar, foi necessário examinar se a ex- pressão de um gene seria afetada, dependendo de qual foi utilizada vetor de transformação. Para testar isto, o gene que codifica para a aciltransferase de diacilglicerol (DAG), foi clonado em dois vetores de PMTO15 e pMTO91. Enquanto o cassete de expressão foi a mesma em ambos os vetores, o local de encaixe era diferente: um local de anco- ragem para o pBR322 pMTO015 (e todos os vetores baseados em pl- NA1269), e o gene LIP2 de pMTO091. Após a transformação destes ve- tores e verificação de integração genômico, RT-PCR de RNA extraído foi realizada em ambas as cepas, que examina a sobre-expressão de DGA em ambos os casos, em relação a uma cepa de controle (MT- YLO38). Como mostrado na A Figura 8, ambas as cepas exibem au- mentos de 32 vezes na expressão relativa a DGA MTYLO38 cepas de controle. Estes resultados validam o uso de pMTO91 como um vetor complementar e LIP2 como um local de encaixe alternativa para a ex- pressão genética, sem interferência detectável de possíveis fenôme- nos epigenéticos. Sobrevivência completa de construtos combinatórios identifica cepas melhoradas com genes de seleção.

[00183] Afim de investigar as contribuições e interações dos alvos genéticos, uma pesquisa foi realizada através de várias combinações de expressão gênica de intermediário, o teste para as capacidades de produção de lipídios das cepas transformadas. Tabela 7 descreve as 13 cepas construídas e sua correspondente regulação para cima de gene. Medições lipídicas foram todas realizadas após 100 horas de cultura, a fim de comparar a produtividade do lipídio em vez de mera- mente acumulação de lipídios. Para fins industriais, a produtividade global é uma medida mais importante do que o conteúdo total de lipí- dios, como uma linhagem de crescimento lenta produzindo altos ren- dimentos ainda pode ser menos útil do que um rápido crescimento, cepa de rendimento moderadamente alto. Os resultados do estudo completo das produtividades de lipídios e os rendimentos estão repre- sentados na Figura 9.

[00184] Examinando cepas contendo apenas sobre-expressões de genes individuais (MTYLO40, MTYLO53, MTYLOSO, MTYLO61), ACC e DGA têm claras melhorias na produtividade e rendimento. ACL e D9 não tiveram aumentos significativos em produtividade ou rendimento. Estes resultados indicam que para Y.lipolytica, ACC e DGA exibem controle sobre a biossíntese de lipídios e são etapas de limitação de taxa, enquanto a ACL e D9 não apresentam fenômenos semelhantes.

[00185] Os efeitos da ACC e DGA foram discutidos em profundida- de acima, mas DGA cria força motriz sequestrando lipídios e esgotan- do intermediários de acil-CoA, enquanto ACC aumenta rendimentos desviando o fluxo para a síntese de lipídios e mobilizando grupo acetil- CoOA citosólico mais rapidamente. Quando os dois genes são combina- dos na cepa MTYLOG65, eles produzem uma resposta sinérgica medi- ante o estabelecimento de uma dinâmica de push and pull na via de síntese de lipídios, com acil-CoA como o intermediário equilibrado.

[00186] “Quando combinado com outros genes, a gene D9 foi capaz de conferir ligeiros benefícios para a produtividade de lipídios. Por e- xemplo, MTYLO69, sobre-expressando D9 e DGA, em produtividades de lipídios mais elevadas do que MTYLOS3, que continha apenas a sobre-expressão de DGA. Da mesma forma, MTYLO66, sobre- expressando ACC e D9, em produtividades de lipídios mais elevadas do que MTYLO40, sobre-expressando ACC sozinho. No entanto, MT- YLO073, sobre-expressando ACC + D9 + DGA, exibiu menor produtivi- dade lipídica que MTYLO65. Não houve diferenças significativas entre MTYLO89 e sua variante faltando D9, MTYLO88. Embora se tenha ob- servado alguns benefícios para a acumulação e produtividade, os be- nefícios para o rendimento não foram significativos. A observação de que D9 só melhora a produção de lipídios em combinação com outros genes parece sugerir que D9 não tem forte controle regulador ou limi- tador de taxa no processo de síntese de lipídios, porém sua ação en- zimática proporciona condições favoráveis ampliando o efeito de ou- tros genes. Como uma enzima associada à membrana na membrana lipídica e retículo endoplasmático, D9 é regulada durante as fases de acumulação de lipídios (Morin et al. 2011). Muitas enzimas de síntese lipídica foram encontradas como tendo maior especificidade para o oleato, o qual é o produto de dessaturação de D9 (Oelkers et al. 2002).

Isto também é demonstrado na observação de que Y. lipolytica cresce muito rapidamente em oleato como uma fonte de carbono e tem sido estudada extensivamente crescente fora deste substrato (Beopoulos et al. 2008, Fickers et al. 2005). Por conseguinte, um aumento da con- centração de oleato, na etapa que não seja especificamente dirigir a produção ou o rendimento de lipídios, transforma o conjunto de ácidos graxos para serem mais rapidamente sequestrados. Esta última análi- se, resulta em taxas mais rápidas de acúmulo de lipídios, sem aumen- tos de produtividade, como o aumento do sequestro só vai ocorrer em situações em que a síntese de lipídios já é regulada para cima por ou- tras manipulações.

[00187] Em contraste, quando se combina sobre-expressão de ACL com outros genes, a produtividade de lipídios tende a diminuir. MT- YLO78 e MTYLO79 não apresentaram aumentos significativos na pro- dução de lipídios, apesar de sobre-expressão de ACC e/ou D9. MT- YLO88, abrigando ACC + ACL + DGA, aumento da produção de lipí- dios sobre controle, mas não apresentou quaisquer melhorias de pro- dução de lipídios sobre MTYLO65. Estes resultados indicam que, em- bora ACL possa estar afetando a distribuição de fluxo de carbono atra- vés da rede metabólica, a sobre-expressão de ACL, seja de forma in- dependente ou em conjunto com outras melhorias lipogênicas, não promove significativamente a produção de lipídios e na maioria dos casos diminui a produtividade de lipídios. Isto é semelhante à observa- ção de que enquanto a ATP citrato-liase é uma enzima diferencialmen- te expressa em levedura oleaginosa em comparação com levedura não oleaginosa, a atividade do gene em diferentes organismos não tem correlação com a atividade oleaginosa medida (Boulton e Ratled- ge, 1981).

[00188] Outra observação a partir do levantamento de lipídios é que a expressão de DGA, juntamente com vários outros alvos normalmen-

te resulta em respostas semelhantes, tanto na produtividade quanto rendimento. Embora seja possível que haja alguma saturação na ex- pressão ou atividade que ocorre nestas construções, esta resposta estabilizada também pode ter sido devido a uma limitação do ensaio utilizado, como a característica medida no presente estudo foi a produ- tividade global inicial, em vez de fase acúmulo estacionário de lipídios ou produtividade. Além disso, enquanto a cepa MTYLO65 demonstrou claramente a produtividade mais forte, o rendimento era relativamente semelhante a muitas das cepas estabilizadas. Isto sugere que, embora todas estas cepas desviam com sucesso o fluxo para lipídios, dando maiores rendimentos, MTYLO65 é excepcional em sua balança de vias a montante e a jusante para alcançar uma alta produtividade e rendi- mento. Estes resultados destacam a importância de perturbações de equilíbrio para a rede de fluxos metabólicos para alcançar produtivida- des e rendimento óptimo, o que é um tema comum na engenharia me- tabólica de produtos aliada ao crescimento (Feist et al 2010; Tyo et al 2007).

Análise de RT-PCR de construto completo mostra sobre-expressão em MTYLO89.

[00189] Para explorar a região estabilizada do estudo de lipídios, a cepa MTYLO89, sobre-expressando ACC + D9 + ACL12 + DGA, foi investigada. A cepa foi construída a partir da transformação de dois plasmídeos, pMTO079 e pMTO092, na cepa de fundo ALEU e AURA MT- YL100 de Y. lipolytica. O uso de dois plasmídeos foi principalmente devido a considerações de tamanho de plasmídeo, como pMTO079 já incluía quatro cassetes de expressão em tandem e foi de 23 kb de comprimento. PCR de DNA genômico confirmou o sucesso da integra- ção de ambos os plasmídeos para a cepa, com a confirmação da cor- reta integração de cada cassete de expressão individual. A análise por RT-PCR da cepa concluída e verificada em relação à cepa de controle confirmou a sobre-expressão transcricional adequada de todos os cin- co genes (Figura 10). A forte sobre-expressão de DGA, que era o úni- co gene sob expressão de TEFin, demonstra as características do re- alce do íntron spliceosomal mesmo com a potencial concorrência de numerosos cassetes utilizando o mesmo promotor. ACC, que estava sob o controle do promotor de TEF sem íntrons, mostraram a menor expressão. As duas subunidades de ACL, também sob o controle de um promotor de TEF, exibiu maior expressão de D9, que estava sob controle de um promotor hp4d. Desde amostragem ocorreu bem de- pois da fase de crescimento exponencial (onde hp4d pode apresentar expressão dependente de quase crescimento (Madzak et al. 2000)), a expressão constitutiva de hp4d e TEF todos sendo relativamente pró- ximos uns dos outros. Estes resultados mostram a sobre-expressão suficiente dos genes-alvo.

2-L Fermentação de MTYLO89 demonstra forte capacidade de acúmu- lo de lipídios.

[00190] Após a verificação da expressão genética na cepa MT- YLO89, o desempenho lipogênico da cepa foi ensaiado em um biorrea- tor de fermentação de 2 L. A relação C/N do meio foi ajustado a 100 para ajudar a promover a acumulação de lipídios. A relação C/N de- termina a quantidade de excesso de carbono disponível para a fer- mentação, uma vez que nitrogênio foi esgotado, e frequentemente re- quer equilíbrio delicado para otimizar a produção de lipídios sobre a produção de citrato (Beopoulos et al. 2009). A Figura 11 mostra o per- fil do tempo para a duração da fermentação da batelada. Após 185 ho- ras de fermentação, todas o 90 g/L de glicose é consumido, dando ori- gem a 26 g/L de biomassa (peso das células secas) e 76,8% de teor de lipídios notável para uma produtividade de 0,109 g de lipídios/L/h. O rendimento total de lipídios na glicose foi 0,227 g lipídios / g de glicose, que é 70% do rendimento máximo teórico. Durante a fase de acumula-

ção de lipídios, 66-185 horas, foram obtidos de um máximo de produti- vidade e rendimento de lipídios, a 0,154 g de lipídios/L/h e 0,277 g de lipídios / g de glicose, respectivamente, com o rendimento aumentando para 85% do máximo de rendimento teórico.

[00191] Microscopia de cultura de células, mostrada na Figura 12, no fim da fermentação mostra que todas as células contêm grandes vacúolos, que ocupam a quase totalidade do volume da célula. Colo- ração vermelho Nilo e fluorescência indica que os vacúolos são pre- dominantemente compostos de lipídios neutros. Mesmo as poucas cé- lulas de hifas, que são tipicamente menos produtivas (Coelho et al. 2010), exibem acumulação de lipídios significativa produzindo vários corpos de lipídios ao longo do comprimento da célula.

[00192] Apesar do dramática acumulação de lipídios observada em cultura, várias características foram consideradas indesejáveis, parti- cularmente em comparação com o trabalho anterior utilizando MT- YLO65. Em primeiro lugar, houve uma quantidade significativa de citra- to de produção ocorrendo em simultâneo com a produção de lipídios com início às 75 horas. O citrato é um intermediário da via de biossín- tese de lipídios, utilizando liase de citrato ATP para a conversão enzi- mática para oxaloacetato e o precursor lipogênico acetil-CoA. Apesar da sobre-expressão de ambas as enzimas de LCA na cepa MTYLO89, a acumulação de citrato foi ainda observada. É possível que a relação C/N tenha sido muito elevada, o que foi mostrado para levar a produ- ção de citrato em vez de produção de lipídios (Beopoulos et al 2009.); no entanto, os nossos resultados mostram que tanto citrato quanto li- pídios estão sendo produzidos simultaneamente. Esta produção aco- plada dos dois produtos difere de uma fase de produção de lipídios discreta seguida por uma fase de produção de citrato observada nos experimentos com cepa MTYLO65. Além disso, a relação C/N foi com- binada com a fermentação da batelada de MTYLO65, que não mostra esta grande quantidade de produção de citrato. Isto indica que é mais provável que a geração de quantidades inadequadas de ATP sob con- dições de fermentação, juntamente com um elevado fluxo a montante na via, conduziu à acumulação do grupo citrato intracelular, em última análise conduzindo à secreção. Além disso, uma produção significati- vamente mais baixa foi observada em MTYLO89. Uma vez que aera- ção é mantida constante ao longo da fermentação, o crescimento com limitação de oxigênio é esperado nas últimas fases da fermentação. No entanto, o aparecimento de crescimento linear ocorreu muito mais cedo nesta fermentação do que com MTYLOG65, que ocorre somente depois de um dia, quando a concentração da biomassa atinge cerca de 6 g/L. O início mais precoce de crescimento linear resultou em um tempo de fermentação mais longo, e, portanto, menor produtividade, apesar do maior teor de lipídios. Uma vez que o aeração também foi combinada com as condições de fermentação de MTYLOG65, é provável que as alterações metabólicas de MTYLO89 estejam colocando maio- res limitações no crescimento. Por outro lado, MTYLO89 exibiu melhor rendimento de lipídios geral, 0,227 g/g em comparação com 0,195 g de lipídios / g de glicose em MTYLO65. Também terminou a fermenta- ção com uma titulação mais elevada, 20,2 g/L de lipídios, em compa- ração com 17,6 g/L.

[00193] Tabela8 resume a comparação do desempenho de carac- terísticas chave entre fermentações 2-L de cepa MTYLO65 e MT- YLO89. Comparação dos perfis de ácidos graxos (Figura 13) indica apenas pequenas mudanças na distribuição de ácidos graxos entre as cepas, tendo preferência mais forte para os ácidos graxos monoinsatu- rados palmitoleato e oleato. Os efeitos adicionais de sobre-expressão de LCA e D9 aparecem para aumentar o fluxo em direção à síntese lipídica, mas a um custo considerável para a taxa de crescimento. A- lém disso, uma vez que não há aumento correspondente na produção de ATP por o metabolismo celular, o citrato é segregado como um subproduto, em vez de utilizar no processo de síntese de lipídios. Uma vez que a síntese e armazenamento de lipídios podem competir forte- mente com o crescimento de recursos, regulação apertada é normal- mente necessária para gerenciar esta atividade (Tehlivets et al. 2007). Sobre-expressão destes quatro alvo genéticos desvendou uma grande quantidade desta regulação, e como resultado, foi observado uma for- te concorrência entre a priorização do crescimento celular e produção de lipídios. Como um tema comum na engenharia metabólica, a maxi- mização da produção de um produto em particular geralmente requer um equilíbrio entre o fluxo no sentido do produto desejado e a saúde em geral e o crescimento do organismo. Os contrastes entre MTYLO65 e MTYLO89 demonstram claramente essa necessidade, com MTYLO65 exemplificando fluxo mais otimizado através da via de síntese de lipí- dios.

Conclusão

[00194] “Embora os componentes da biossíntese de lipídios estejam bem compreendidos, existe ainda uma grande quantidade desconhe- cida sobre como perturbações genéticas, especialmente em combina- ção, afetam a capacidade e fluxo nessa via. Ao estudar a levedura o- leaginosa Y. lipolytica, somos capazes de utilizar um organismo hos- pedeiro com capacidade natural para a produção de lipídio para estu- dar a medida que a engenharia metabólica pode melhorar a produtivi- dade e rendimento de lipídio. Examinamos quatro alvo genéticos - ACC, D9, ACL, DGA - e são capazes de atingir 76,8% de teor lipídico notável em um biorreator de 2 L com uma cepa carregando todas as quatro sobre-expressões alvo. Por uma investigação mais aprofunda- da destes alvos genéticos através de sobre-expressão combinatória, fomos capazes de classificar o impacto positivo desses genes na pro- dução de lipídios, com DGA e ACC sendo fortes contribuições positi-

vas, D9 fazendo pequenas contribuições apenas quando combinado com outros genes, e, finalmente, ACL fazendo contribuições positivas significativas. Nós também fomos capazes de explorar as possíveis interações entre os efeitos individuais, identificando interação sinérgica mais forte entre ACC e DGA. A produção de lipídios microbianos tem uma ampla gama de utilizações, e rapidamente ganhou atenção para a sua utilização na produção de biodiesel. Engenharia metabólica das vias centrais de síntese de lipídios será fundamental ao proporcionar sucesso permitindo essas tecnologias e processos futuros.

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Vorapreeda T, Thammarongtham C, Cheevadhanarak S, Laoteng K. 2012. Alternative routes of acetyl-CoA synthesis identified by comparative genomic analysis: involvement in the lipid production of oleaginous yeast and fungi. Microbiology 158(1):217-228.

Zhang H, Damude HG, Yadav NS. 2011. Three diacylglyce- rol acyltransferases contribute to oil biosynthesis and normal growth in Yarrowia lipolytica. Yeast 1:25-38.

Zhao S, Fernald RD. 2005. Comprehensive Algorithm for Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction. Journal of Com- putational Biology 12(8): 1047-1064.

Tabela 6. Cepas e plasmídeos usados neste estudo Cepas (Cepa Genótipo ou plasmídio Fonte hospedeira) E. coli NEB10R araD139 A(ara-leu)7697 fhuA New England Bi- lacX74 galK (680 A(lacZ)M15) olabs mcrA galU recA1 endA1 nupG rpsL (StrR) A(mrr-hsdRMS- mcrBC) PINA1269 JMP62-LEU Yeastern PDUET1 pACYCDUET-1 Novagen JMP-URA JMP62-URA (Nicaud et al. 2002) pMTO10 PINAT1269 php4d::TEF Exemplo 1 pMTO15 PINAT1269 php4d::TEFin Exemplo 1 pMTO38 YTEF-LacZ Exemplo 1 pMTO13 YTEF-ACC1 Exemplo 1 pMTO40 php4d-ACC1 Exemplo 1 pMTO47 YTEF-ACL1 (LEU) Este Exemplo pMTO049 YTEF-ACL?2 (LEU) Este Exemplo pMTO50 YTEF-ACL1 + YTEF-ACL2 (LEU) Este Exemplo pMTO53 YTEFin-DGA Exemplo 1 pMTO61 php4d-D9 (LEU) Este Exemplo

Cepas (Cepa Genótipo ou plasmídio Fonte hospedeira) pMTO65 pPhp4d-ACC1 + YTEFin-DGA Exemplo 1 pMTO66 YTEF-ACC + YLEX-D9 (LEU) Este Exemplo pMTO073 YTEF-ACC + YLEX-D9 + YTE- Este Exemplo Fin-DGA (LEU) pMTO74 YTEF-ACC + YTEF-ACL1 (LEU) Este Exemplo pMTO75 YTEF-ACC + YLEX-D9 + YTEF- Este Exemplo ACL1 (LEU) pMTO078 YTEF-ACC + YTEF-ACL1 + Este Exemplo YTEF-ACL?2 (LEU) pMTO079 YTEF-ACC + YLEX-D9 + YTEF- Este Exemplo ACL1 + YTEF-ACL?2 (LEU) pMTO91 pACYC Lip2 KO plasmid (URA) Este Exemplo pMTO092 YTEFin-DGA (URA) Este Exemplo Y. lipolytica Po1lg MATa, leu2-270, ura3- Yeastern 302::URAS3, xpr2-332, axp-2 MTYLO38 MATa, leu2-270, ura3- Exemplo 1 302::URA3, xpr2-332, axp-2 TEF- LacZ-LEU2 MTYLO40 MATa, leu2-270, ura3- Exemplo 1 302::URA3, xpr2-332, axp-2 hp4d-ACC1-LEU2 MTYLOSO MATa, leu2-270, ura3- Este Exemplo 302::URA3, xpr2-332, axp-2 TEF- ACL1 + TEF-ACL2 MTYLOS53 MATa, leu2-270, ura3- Exemplo 1 302::URA3, xpr2-332, axp-2 TE- Fin-DGAT1-LEU2 MTYLO65 MATa, leu2-270, ura3- Exemplo 1 302::URA3, xpr2-332, axp-2 hp4d-ACC1 + TEFin-DGA1-LEU2 MTYLO66 MATa, leu2-270, ura3- Este Exemplo 302::URA3, xpr2-332, axp-2 TEF- ACC + hp4d-D9

Cepas (Cepa Genótipo ou plasmídio Fonte hospedeira) MTYLO73 MATa, leu2-270, ura3- Este Exemplo 302::URA3, xpr2-332, axp-2 TEF- ACC + hp4d-D9 + TEFin-DGA1 MTYLO78 MATa, leu2-270, ura3- Este Exemplo 302::URA3, xpr2-332, axp-2 TEF- ACC + TEF-ACL1 + TEF-ACL2 MTYLO79 MATa, leu2-270, ura3- Este Exemplo 302::URA3, xpr2-332, axp-2 TEF- ACC + hp4d-D9 + TEF-ACL1 + TEF-ACL2 MTYLO88 MATa, leu2-270, ura3- Este Exemplo 302::URA3, xpr2-332, axp-2 TEF- ACC + TEF-ACL1 + TEF-ACL2 + TEFin-DGA MTYLO89 MATa, leu2-270, ura3- Este Exemplo 302::URA3, xpr2-332, axp-2 TEF- ACC + hp4d-D9 + TEF-ACL1 + TEF-ACL2 + TEFin-DGA MTYLO092 MATa, leu2-270, ura3- Este Exemplo 302::URA3, xpr2-332, axp-2 LIP2::TEFin-DGA Tabela 7. Lista de todas as cepas analisadas por acúmulo de lipídios, rotuladas com a presença (+) ou ausência (-) de cassetes de sobre- expressão para os quatro alvos: acetil-CoA carboxilase (ACC), diacil- glicerol aciltransferase (DGA), ATP: liase de citrato (ACL12), e A9- dessaturase (D9). Plasmídio ACC DGA ACL D9 Número de Alvos MTYLO38 - - - - o MTYLO40 + - - - 1 MTYLOS53 - + - - 1 MTYLOSO - - + - 1 MTYLO61 - - - + 1

Plasmídio ACC DGA ACL D9 Número de Alvos MTYLO65 + + - - 2 MTYLO78 + - + - 2 MTYLO66 + - - + 2 MTYLO69 - + - + 2 MTYLO73 + + - + 3 MTYLO79 + - + + 3 MTYLO88 + + + - 3 MTYLO89 + + + + 4 Tabela 8. Comparação das características de fermentação entre cepas MTYLO65 e MTYLO89. Relação C/N de ambas as fermentações foram 100, realizadas em biorreatores2-L. Reator de glicose inicialmente car- regado com 90 g/L de glicose. MTYLO65 MTYLO89 Rendimento de Biomassa Geral 0,316 9d/g 0,295 g/g Rendimento de Lipídio Geral 0,195 g/g 0,227 g/g Produtividade geral 0,143 g/L/h 0,109 g/L/h Fase de Produção de Lipídio 70-120h 66-185h Rendimento de Lipídio Máximo 0,249 g/g 0,277 g/g Produtividade Máxima 0,178 g/L/h 0,154 g/L/h Titulação de Lipídio Final 17,6 g/L 20,2g9/L Tabela 9. Iniciadores usados neste estudo. Sítios de restrição relevan- tes estão em negrito. Iniciador — Descri- Sequência SEQ ID ção

PCR MT252 ACLI1 —CTTACAACGCGTATGTCTGCCA- 31

ACGAGAACATCTCC MT253 ACL1 CTAGGTATGCATCTATGATC- 32

GAGTCTTGGCCTTGGA MT254 ACL2 —CTTACAACGCGTATGTCAGCGA- 33

AATCCATTCACGA

Iniciador — Descri- Sequência SEQ ID ção “MT255 ACL2 —CTAGGTATGCATITAMACTCC- — 34 =

GAGAGGAGTGGAAGC MT283 D9 AATGGTGAAAAACGTGGACCA- 35

AGTG MT284 D9 CTCACAGGATCCCTAAGCAGC- 36

CATGCCAGACATACC MT220 Casse- CCCGGCAACAATTAATA- 37 te GACTGGAT MT265 Casse- TTCGGACACGGGCATCTCAC 38 te RT-PCR MTROO1 —Actina TCCAGGCCGTCCTCTCCC 39 MTROO2 —Actina GGCCAGCCATATCGAGTCGCA 40 MTRO31 DGA AACGGAGGAGTGGTCAAGCGA 41 MTRO32 DGA TTATGGGGAAGTAGCGGCCAA 42 MTRO33 D9 GACCGACTCCAACAAG- 43

GACCCTT MTRO34 D9 GGGTTGGGCACAAGCAGCAT 44 MTRO41 ACC GCTITCTCACGGAGGTCATACAGT 45 MTRO042 ACC CTGCGGCAATACCGTTGTTAG 46 MTRO68 —ACLI CCTCCTTGGTGAGGTTGGTGGT 47 MTRO69 —ACL1 GCGACGATGGGCTTCTTITGATC 48 MTRO70 —ACL2 CCTTCAAGGGCATCATCCGG 49 MTRO71 ACL2 CGCCTCGTCGCACGTAAATCT 50 Exemplo 3. Materiais e Métodos Cepas de leveduras, crescimento e condições de cultura

[00195] A cepa transformante ACC + DGA1 de Yarrowia lipolytica (MTLYO65), tal como discutido no Exemplo 1, foi utilizada nas experi- ências descritas nesta seção. Meios de YPD foram preparados como descrito no Exemplo 1. Os constituintes do meio utilizado no biorreator foram base de nitrogênio de levedura (sem aminoácidos e sulfato de amônio) (Amresco), extrato de levedura (Difco), sulfato de amônio (Macron Chemicals), acetato de sódio (Macron Chemicals) e ácido a- cético (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). As execuções no biorreator fo- ram realizadas em perplexos de tanque agitado 2L. O inóculo para o biorreator foi preparado como descrito no Exemplo 1.

Operação biorreator: alimentação de acetato, ácido acético e sulfato de amônio

[00196] A composição do meio inicial no reator foi: 30 g/L acetato de sódio, 2,5 g/L de extrato de levedura, 4,25 g/L de base de nitrogê- nio de levedura e 2,4 g/L de sulfato de amônio. As concentrações de extrato de levedura e base de nitrogênio de levedura usados nas expe- riências descritas nesta seção foram mais elevadas em comparação com aquelas discutidas no Exemplo 1. Uma relação carbono / nitrogê- nio (C/N) de 20 foi escolhida para fornecer nitrogênio suficiente para a produção de biomassa. O nível de oxigênio dissolvido constante de 20% foi mantido em todos os momentos no reator usando o controle em cascata. Utilizou-se um ponto de ajuste de 7,3 pH.

[00197] Afim de gerar elevadas densidades celulares, o que, em seguida, serviu como plataforma para a acumulação de lipídios, uma estratégia foi concebida e implementada, em que a fonte de carbono de 30 g/L de acetato de sódio foi completada através da alimentação de ácido acético. O uso de ácido acético tinha várias vantagens, na medida em que serve a dupla finalidade de proporcionar uma fonte de carbono para as células em crescimento e em divisão e, ao mesmo tempo, proveu o controle do pH. A fim de manter uma relação C/N bai- xa, para o período inicial de crescimento, uma fonte de nitrogênio foi alimentada em simultâneo com o ácido acético. O período inicial de crescimento envolvido alimentando 15 g/L de sulfato de amônio por litro de 30% (vol/vol) em ácido acético. A alimentação subsequente continha ácido acético puro 100% (e não sulfato de amônio), criando, assim, um aumento na relação C/N, como o nitrogênio foi consumido pelas células e esgotado a partir do meio, resultando em melhor acu- mulação de lipídios.

[00198] O volume de trabalho no início da reação foi de 1,6 L. 1 L de ácido e a solução de sulfato de amônio foi adicionado durante as primeiras 60 h. Cerca de 200 ml de ácido acético puro foi adicionado durante as 40 h subsequentes. Volume de cultura não foi removido em qualquer ponto no tempo diferente da amostragem realizada a cada 24 horas com a finalidade de medições. Para compensar o volume adi- cional entrante no reator, o líquido foi deixado evaporar. A elevada ta- xa de aeração (2,5 vvm) levou a evaporação suficiente, o que ajudou a manter o volume do reator. Mesmo com a evaporação, o volume do caldo fez subir ligeiramente para cerca de 1,8L durante a execução.

[00199] A densidade óptica (OD) do caldo de cultura foi medida a cada 24 horas. As amostras foram armazenadas a -20 ºC para análise de lipídios. A análise por HPLC resultou em níveis de acetato no rea- tor. Amônio foi medido com um eletrodo de amônio YSI 7100 (YSI Life Sciences). A biomassa foi determinada como foi discutido no Exemplo

1. Análise de Lipídio

[00200] A análise lipídica envolveu um protocolo de transesterifica- ção direta, o qual foi adaptado a partir da patente US 7,932,077 e Grif- fiths et al. LIPIDS (2010) 45: 1053-1060, todo o conteúdo de cada um dos quais são aqui incorporados por referência. O protocolo utilizado a 0,5 N de metóxido de sódio e ácido sulfúrico a 18 M (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Metóxido de sódio foi gerado em estufa usando hidróxido de sódio (Macron Chemicals) e metanol (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). 500 ul do metóxido de sódio a 0,5 N foi adicionado primeiro em 1 mg da amostra de células sedimentadas seguido por rotação durante

1 hora. Isto foi seguido pela adição de 40 ul de ácido sulfúrico e 500 ul de hexano seguido por um outro etapa de vórtice durante 30 minutos para dissolver os metil ésteres transesterificados em hexano. A mistu- ra de reação foi centrifugada durante 1 min a 8000 rpm, e 800 ul da fase de hexano superior foi transferida para frascos de GC e analisada em um GC-FID. A coluna de GC, o método de operação, e análise se- guidos os métodos descritos no Exemplo 1, exceto que gliceril trihep- tadecanoato foi utilizado como o controle, em vez do ácido tridecanói- co. Resultados e Discussão

[00201] Os resultados da execução no biorreator encontram-se re- sumidos na Tabela 10. Tabela 10. Resultados da execução no biorreator com acetato

[00202] Figuras 14 e 15 mostram tendências de nitrogênio, titula- ções lipídicas e não lipídicas, teor de lipídios e relação C/N durante uma execução no biorreator de acetato representativa. A biomassa não lipídica subiu para o período inicial de crescimento, quando o ni- trogênio, foi introduzido no reator. Depois de 48h, quase todo o au- mento de biomassa foi devido ao acúmulo de lipídios. Neste período, as células de lipídios sintetizadas com um rendimento de 0,24 9g/g e com uma taxa de fluxo de 1 g/L/h para produzir uma titulação final de lipídio de 55 g/L, que é pelo menos 10 vezes maior do que as titula- ções conseguidas nos experimentos descritos no Exemplo 1. O conte- údo final de lipídio e um rendimento de lipídios geral, no entanto, era muito semelhante ao teor de lipídios e um rendimento de lipídios geral no Exemplo 1. Estes números dependem principalmente da cepa mi- crobiana empregue. Quase 70% dos lipídios foram encontrados como sendo oleato, que é consistente com a descoberta descrita no Exem- plo 1.

[00203] A execução foi discutida aqui a qual visa maximizar a pro- dução de lipídios usando o mutante ACC + DGA1 através da adoção de estratégias operacionais acima indicadas e condições de processo ideais. Una comparação dos resultados desta execução com a apre- sentada no Exemplo 1 foram mostrados na tabela 11 abaixo. A melho- ria de titulação de 10 vezes e melhoria da produtividade geral de 14 vezes é visto entre o acetato é executado. Tabela 11. Comparação da execução em acetato com os funciona- mentos mostrados no exemplo 1 Co [emo | senen | sessão | xemplo 1) xemplo 1) sessão) Titulação de lipídio lipídio geral lipídio máxima dio geral dio máximo

[00204] As células com alto teor lipídico (maior que 80%) em centri- fugação flutuam no topo, em vez de se estabelecerem. Estas células parecem ser preenchidas com óleo sob microscópio. A Figura 16 mos- tra essas células sob um microscópio de imersão em óleo (100x) quando coradas com Vermelho do Nilo. Os pontos brilhantes são os vacúolos lipídicos.

[00205] Todas as publicações, patentes e as entradas em banco de dados de sequência mencionadas na especificação são aqui incorpo-

radas por referência em sua totalidade, como se cada publicação ou patente fosse específica e individualmente indicada para ser incorpo- rada para referência. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo quaisquer definições aqui descritas, irá controlar.

EQUIVALENTES E ÂMBITO

[00206] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usar não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção aqui descrita. O âmbito da presente invenção não se destina a ser limitado à descri- ção acima, mas em vez disso é como definido nas reivindicações ane- xas.

[00207] Nas reivindicações os artigos, tais como "um/uma" e "o/a", podem significar um ou mais do que um a menos que indicado em contrário, ou de outro modo evidente do contexto. Reivindicações ou descrições que incluem "ou" entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais do que um, ou todos os membros do grupo estiverem presentes, empregues, ou de outra for- ma corresponderem a um determinado produto ou processo, a menos que indicado ao contrário, ou de outro modo evidente do contexto. À invenção inclui modalidades em que exatamente um membro do grupo se encontra presente, empregues, ou de outra forma relevante para um determinado produto ou processo. A invenção também inclui mo- dalidades em que mais do que um, ou todos os membros do grupo se encontram presentes, empregues, ou de outra forma relevantes para um determinado produto ou processo.

[00208] Além disso, deve ser compreendido que a invenção abran- ge todas as variações, combinações e permutações no qual uma ou mais limitações, elementos, disposições, termos descritivos, etc., a partir de uma ou mais das reivindicações ou a partir de partes relevan- tes da descrição estão introduzidas em outra reivindicação. Por exem-

plo, qualquer reivindicação que seja dependente de outra reivindicação pode ser modificada para incluir uma ou mais limitações encontradas em qualquer outra reivindicação que seja dependente da mesma rei- vindicação base. Além disso, se as reivindicações recitam uma com- posição, deve ser entendido que os métodos de utilização da compo- sição para qualquer dos fins aqui descritos são incluídos, e os méto- dos de produção da composição de acordo com qualquer dos métodos de preparação aqui divulgado, ou outros métodos conhecidos na téc- nica estão incluídos, exceto de outro modo indicado ou não ser que seja evidente para um versado na técnica que surgiria uma contradi- ção ou inconsistência.

[00209] “Quando os elementos são apresentados como listas, por exemplo, no formato do grupo Markush, deve ser entendido que cada um dos subgrupos dos elementos também é divulgado, e qualquer e- lemento (s) pode ser removido do grupo. Também deve ser notado que o termo "compreendendo" destina-se a ser aberto e permitir a in- clusão de elementos ou etapas suplementares. Deve ser entendido que, em geral, onde a invenção, ou aspectos da invenção, é / são refe- ridos como compreendendo elementos particulares, características, etapas, etc., certas modalidades da invenção ou aspectos da invenção consistem, ou consistem essencialmente em, tais elementos, caracte- rísticas, etapas, etc. Para fins de simplicidade essas modalidades não foram especificamente previstas in haec verba aqui. Assim, para cada modalidade da invenção, que compreende um ou mais elementos, as características, etapas, etc., a presente invenção também proporciona modalidades, que consistem, ou consistem essencialmente em tais elementos, etapas, características, etc.

[00210] Onde intervalos são dados, ponto de fim são incluídos. A- lém disso, deve ser entendido que, a menos que indicado de outra forma ou de outra maneira evidente a partir do contexto e/ou a com-

preensão de um versado na técnica, valores que são expressos como intervalos podem assumir qualquer valor específico dentro dos interva- los mencionados, em diferentes modalidades da invenção, a décima unidade do limite inferior do intervalo de, a menos que o contexto cla- ramente indique o contrário. Deve também ser entendido que, a me- nos que indicado de outra forma ou de outra maneira evidente a partir do contexto e/ou da compreensão de um versado na técnica, os valo- res expressos como intervalos podem assumir qualquer subintervalo dentro da faixa dada, em que as extremidades da subfaixa são ex- pressas no mesmo grau de precisão que a décima unidade do limite inferior do intervalo.

[00211] Além disso, deve ser entendido que qualquer modalidade particular da presente invenção pode ser expressamente excluída de qualquer uma ou mais das reivindicações. Onde faixas são dadas, qualquer valor dentro da faixa pode ser explicitamente excluído de qualquer uma ou mais das reivindicações. Qualquer modalidade, ele- mento, recurso, aplicação, ou aspecto, composições e/ou métodos da invenção, podem ser excluídos de qualquer uma ou mais reivindica- ções. Para fins de brevidade, todas as modalidades em que um ou mais elementos, características, finalidades, ou aspectos são excluí- dos não são aqui apresentados expressamente.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula oleaginosa isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma modificação genética que aumenta a expressão de um produto do gene DGA1; e, opcionalmente, compreende ainda uma modificação genética que aumenta a expressão de (a) um produto do gene ACC1, e/ou (b) um produto do gene SCD, e/ou (c) um produto do gene ACL.

2. Célula oleaginosa isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a modificação genética compreende uma construção de ácido nucleico que aumenta a expressão do produto de gene, a construção de ácido nucleico compreendendo: (a) um cassete de expressão compreendendo uma sequên- cia de ácido nucleico que codifica o produto de gene sob o controle de um promotor homólogo ou heterólogo adequado, e/ou (b) uma sequência de ácido nucleico que modula o nível de expressão do produto de gene, quando inserido no genoma da célula; opcionalmente em que o promotor é (a) um promotor indutível ou um constitutivo, e/ou (b) um promotor de TEF.

3. Célula oleaginosa isolada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a construção de expressão adicio- nalmente compreende um íntron, e opcionalmente, (a) em que o íntron está a jusante do local de iniciação da transcrição, e/ou (b) em que o íntron está dentro da sequência de ácido nu- cleico que codifica o produto do gene.

4. Célula oleaginosa isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizada pelo fato de que a construção de ácido nucleico inibe ou interrompe a regulação natural de um gene na-

tivo que codifica o produto de gene, resultando em supere-expressão do gene nativo, e opcionalmente, em que a inibição ou interrupção da regulação natural do gene nativo é mediada pela eliminação, ruptura, mutação e/ou substituição de uma região reguladora, ou uma parte de uma região reguladora que regula a expressão do gene.

5. Célula oleaginosa isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de que o produto de gene é um transcrito ou uma proteína.

6. Célula oleaginosa isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-5, caracterizada pelo fato de que a construção de ácido nucleico é inserida no genoma da célula.

7. Célula oleaginosa isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizada pelo fato de que o aumento da ex- pressão do produto de gene confere um fenótipo benéfico para a con- versão de uma fonte de carbono em um ácido graxo, derivado de ácido graxo e/ou triacilglicerol (TAG) para a célula, e opcionalmente, em que o fenótipo benéfico compreende um perfil modificado de ácido graxo, um perfil de TAG modificado, um aumento de ácido graxo e/ou taxa de sín- tese de triacilglicerol, um aumento de rendimento de conversão, um aumento de acumulação de triacilgliceróis na célula, e/ou um aumento da acumulação de triacilgliceróis no corpo lipídico da célula.

8. Célula oleaginosa isolada, de acordo com qualquer uma a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que converte uma fonte de carbono em um ácido graxo ou um TAG a uma taxa de conversão den- tro da faixa de cerca de 0,025 g/g a cerca de 0,32 9/g (g de TAG pro- duzido / g de Glicose consumido), pelo menos cerca de 0,11 g/g, pelo menos cerca de 0,195 g/g, pelo menos cerca de 0,24 9g/g, ou pelo me- nos cerca de 0,27 g/g.

9. Célula oleaginosa isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizada pelo fato de que

(a) compreende um corpo de lipídios ou vacúolo; e/ou (b) em que a célula é uma célula de bactéria, uma célula de alga, uma célula de fungo, ou uma célula de levedura; e/ou (c) em que a célula é uma célula de levedura oleaginosa; e/ou (d) em que a célula é uma célula de Y. lipolytica.

10. Método, caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma fonte de carbono com uma célula oleaginosa isolada como definida em qualquer uma das reivindicações 1-9 ou cul- tura da mesma, a célula compreendendo uma modificação genética que aumenta a expressão de um produto de gene DGA1; e incubar a fonte de carbono em contato com a célula em condições adequadas para a conversão pelo menos parcial da fonte de carbono em um ácido graxo ou um triacilglicerol pela célula, em que a fonte de carbono opcionalmente compreende (a) um açúcar fermentável, e/ou (b) glicose, e/ou (c) acetato, e opcionalmente o acetato está presente em uma concentração de pelo menos 1% vol/vol, pelo menos 2% em vol/vol, pelo menos 3% vol/vol, pelo menos 4% em vol/vol, ou pelo menos 5 % vol/vol; e/ou (d) ácido acético, e opcionalmente, em que o ácido acético está a uma concentração de pelo menos 5% v/v, pelo menos 10% vol/vol, de pelo menos 15% vol/vol, de pelo menos 20% vol/vol, de pe- lo menos 25% vol/vol, ou de pelo menos 30% vol/vol.

11. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto, de processo, de molécula de ácido nucleico, cassete de ex- pressão, vetor, célula ou uso englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.