KR102036389B1 - 조작된 미생물 및 미생물 오일 생산을 위한 방법 - Google Patents

조작된 미생물 및 미생물 오일 생산을 위한 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102036389B1
KR102036389B1 KR1020147013207A KR20147013207A KR102036389B1 KR 102036389 B1 KR102036389 B1 KR 102036389B1 KR 1020147013207 A KR1020147013207 A KR 1020147013207A KR 20147013207 A KR20147013207 A KR 20147013207A KR 102036389 B1 KR102036389 B1 KR 102036389B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
delete delete
ala
gly
leu
thr
Prior art date
Application number
KR1020147013207A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140091004A (ko
Inventor
그레고리 스테파노포울로스
미첼 타이
사가르 차크라보르티
Original Assignee
메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 filed Critical 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
Publication of KR20140091004A publication Critical patent/KR20140091004A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102036389B1 publication Critical patent/KR102036389B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/649—Biodiesel, i.e. fatty acid alkyl esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0097—Oxidoreductases (1.) acting on reduced flavodoxin as donor (1.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6458—Glycerides by transesterification, e.g. interesterification, ester interchange, alcoholysis or acidolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/0102—Diacylglycerol O-acyltransferase (2.3.1.20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
    • C12Y401/03006—Citrate (pro-3S)-lyase (4.1.3.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01002—Acetyl-CoA carboxylase (6.4.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19001—Stearoyl-CoA 9-desaturase (1.14.19.1), i.e. DELTA9-desaturase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03008—ATP citrate synthase (2.3.3.8)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명의 일부 측면은 오일 생산을 위한 조작된 미생물을 제공한다. 또한 미생물 조작 및 조작된 미생물의 사용 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 지질 합성의 비율-제어 단계의 조합, 예를 들어, 지질 합성을 위한 대사물, 아세틸-CoA, ATP 또는 NADPH를 생성하는 단계 (푸시(push) 단계), 및 지질 합성의 피드백 억제를 매개하는 지질 합성 경로의 생성물 또는 중간체를 격리하는 단계 (풀(pull) 단계)의 조합을 조정하도록 조작된 미생물을 제공한다. 그러한 푸시-앤드-풀(push-and-pull) 조작된 미생물은 대단히 향상된 전환 수율 및 TAG 합성 및 저장 특성을 나타낸다.

Description

조작된 미생물 및 미생물 오일 생산을 위한 방법 {ENGINEERED MICROBES AND METHODS FOR MICROBIAL OIL PRODUCTION}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119 하에 2011년 10월 19일 출원된 미국 가출원 U.S.S.N. 61/548,901; 및 2012년 6월 22일 출원된 미국 가출원 U.S.S.N. 61/663,263을 우선권 주장하고, 이들 가출원은 둘 다 "조작된 미생물 및 미생물 오일 생산을 위한 방법"이라는 명칭을 갖고, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 미국 에너지부로부터 수여받은 수혜번호 제DE-AR0000059호 하의 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
지속가능하게 생산된 바이오연료는 화석 연료에 대한 대안이고 화석 연료-관련 오염 및 온실 가스 배출을 피하면서 용이하게 접근가능한 화석 연료 비축분의 감소 완화를 도울 수 있고 따라서 합리적인 에너지에 대해 증가하는 요구를 지속가능한 방식으로 충족시킬 수 있다. 탄소원의 지질로의 효율적인 전환에 적합한 방법 및 오일-생산 유기체의 개발이 미생물 바이오연료 생산의 광범위한 실시를 위한 선행조건이다.
본 발명의 특정 측면의 요약
높은 전환 수율이 성취될 수 있다면 종속영양성 유기체에 의한 미생물 오일 생산은 재생 가능 자원으로부터 바이오연료의 비용-효율적 생산을 위한 가장 유망한 경로이다. 재생 가능 공급원료로부터 비용-효율적으로 미생물 오일을 생산하는 것의 핵심은 탄수화물에서 오일로의 높은 전환 수율이다. 대사 공학은 이 목적 달성에 적용되는 실행 기술인 것으로 드러났고 화학, 제약 및 연료 생성물의 합성에서 미생물 생체 촉매의 성능을 뚜렷이 향상시키는 성공적인 경로 조작의 다수의 실시예가 존재한다.
오일 생산을 위한 미생물 조작에서의 선행 노력은 지방산 합성 경로에서의 추정 비율-제어 단계를 증폭시키는데 중점을 두어 왔다. 그러한 증폭의 한가지 큰 결점은 지방산 합성 경로 내로의 탄소 플럭스(flux)를 증가시키는 것이 세포에서의 포화 지방산의 수준을 증가시키고, 이는 지방산 생합성의 강력한 음성 피드백 루프를 활성화시킨다는 점이다
본 개시내용의 일부 측면은 또한 본원에서 "푸시(push)" 대사 경로로 지칭되는 상류, 대사물-형성 경로의 증폭을, 또한 본원에서 "풀(pull)" 경로로 지칭되는 하류, 생성물-격리 경로의 플럭스에서의 유사한 증가와 조합시키는 미생물 조작에 대한 전략을 제공한다. 본 발명의 일부 측면은 미생물에서의 푸시-앤드-풀(push-and-pull) 변형의 균형잡힌 조합이 그들의 항상성(homeostatic) 생리학적 수준으로부터 중간체 대사물의 농도의 큰 변화 없이 지질 합성 경로 내로의 큰 탄소 플럭스 증폭을 초래함을 제공하고, 따라서 지질 합성의 피드백 억제를 피한다.
본 개시내용의 일부 측면은, 전환 효율에 대한 단일-가지 변형, 예컨대, 푸시-단독 변형 또는 풀-단독 변형의 효과가 세포에서의 합성 수율의 보상적 조절 때문에 전형적으로 제한되고, 미생물 세포에서의 지질 생합성의 푸시 및 풀 단계의 일관된 조정이 지질 생산에 대한 놀라운 상승작용 효과를 초래한다는 인식에 관한 것이다.
예를 들어, 본 개시내용의 일부 측면은 또한 본원에서 푸시-풀 변형으로 지칭되는, 그들의 지질 생합성 경로에서의 변형의 조합을 포함하는 유전적으로 변형된 유지성(oleaginous) 미생물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공되는 미생물은 지질 합성에 요구되는 대사물 또는 중간체의 증가된 생산에 영향을 미치는 변형, 및 지질 합성의 생성물, 예를 들어, 트리아실글리세롤의 세포 내 저장 형태 지질로의 격리를 초래하는 변형을 포함하고 따라서 이의 생성물의 일부에 의한, 예컨대 지방산 또는 디아실글리세롤에 의한 지질 합성의 피드백 억제를 완화시킨다. 일부 실시양태에서, 대사 푸시 및 대사 풀 경로의 변형의 조합은 상승 효과적으로 증가된 지질 생산을 초래한다. 일부 실시양태에서, 푸시 변형은 세포에서의 지질-합성 빌딩 블록, 또는 지질 합성에 대한 대사물의 증가된 수준을 초래한다. 일부 실시양태에서, 풀 변형은 지질 합성에 대한 피드백 억제를 완화시킨다.
본 발명의 일부 측면은 지질 생합성의 푸시- 및 풀 경로에 동시에 영향을 미치는 유전자 변형을 포함하는 미생물을 제공한다. 예를 들어, 푸시 및 풀 변형은 오일 생산을 위한 모델 미생물인 유지성 효모 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)에 도입되었다. 트리글리세리드 (TAG) 합성 경로의 최종 단계인 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGA1)의 과다발현이 예시적인 풀 변형으로서 조사되었다. DGA1 과다발현은 대조 미생물에 비해 건조 세포 중량 (DCW)의 33.8％의 지질 함량까지 지질 생산에서 4배 증가를 초래하였다. 지방산 합성의 제1 수행 단계인 아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC1)의 과다발현이 예시적인 푸시 변형으로서 조사되었다. ACC1 과다발현은 대조군에 비해 17.9％의 지질 함량까지 지질 함량을 2배로 증가시켰다. 탠덤(tandem) 유전자 발현 구축물로부터의 ACC1 및 DGA1의 동시 공발현이 예시적인 푸시-풀 변형으로서 조사되었다. 동시 ACC1 및 DGA1 과다발현은 ACC1 + DGA1 공발현의 상승작용 효과를 입증하며 지질 함량을 41.4％까지 추가로 증가시켰다.
ACC1 + DGA1 형질전환체의 지질 생산 특징은 2-L 생물반응기 발효에서 탐구되었고, 120시간 후에 61.7％ 지질 함량을 성취하였다. 전체 수율 및 생산성은 각각 0.195 g/g 및 0.143 g/L/hr인 반면, 발효의 지질 축적기 동안 최대 수율 및 생산성은 0.270 g/g 및 0.253 g/L/hr이었다. 이 연구는 유지성 효모 와이.　리폴리티카에 의한 탁월한 지질 생산 능력 및 지질 합성 경로의 두 가지 중요한 단계의 대사 공학의 효과를 입증하고, 이는 플럭스를 지질 합성으로 우회시키는 작용을 하며 TAG 합성을 위한 원동력을 창출한다.
본 발명의 일부 측면은 오일-생산 미생물, 예를 들어, 유지성 효모에 사용하기 위한 신규 과다발현 플랫폼을 제공한다. 본 발명의 일부 측면은 코딩 서열 및 인트론을 포함하는 전사체의 전사를 구동하는 프로모터, 예를 들어, 인트론 및 코딩 서열을 포함하는 핵산 서열의 상류에 위치하는 번역 신장 인자-1α (TEF) 프로모터를 포함하는 발현 구축물을 제공한다. 본 개시내용의 일부 측면은 그러한 인트론-함유 발현 구축물이 인트론이 없는 TEF 프로모터에 비해 발현을 17배 이상 증가시킬 수 있음을 제공한다.
본 개시내용의 일부 측면은 DGA1 유전자 산물의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는 단리된 유지성 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 유지성 세포는 ACC1 유전자 산물의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 유지성 세포는 SCD 유전자 산물의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 유지성 세포는 ACL 유전자 산물의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형은 유전자 산물의 발현을 증가시키는 핵산 구축물, 즉 (a) 적합한 동종 또는 이종 프로모터의 제어 하에 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트, 및/또는 (b) 세포의 게놈 내로 삽입되는 경우 유전자 산물의 발현 수준을 조정하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구축물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 유도성 또는 구성적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 TEF 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 발현 구축물은 인트론을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인트론은 전사 개시 부위의 하류이다. 일부 실시양태에서, 인트론은 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열 내에 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 천연 유전자의 과다발현을 초래하는 유전자 산물을 코딩하는 천연 유전자의 천연 조절을 억제 또는 방해한다. 일부 실시양태에서, 천연 유전자의 천연 조절의 억제 또는 방해는 유전자의 발현을 조절하는 조절 영역, 또는 조절 영역의 일부의 결실, 분열(disruption), 돌연변이 및/또는 치환에 의해 매개된다. 일부 실시양태에서, 유전자 산물은 전사체이다. 일부 실시양태에서, 유전자 산물은 단백질이다. 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 유전자 산물의 증가된 발현은 탄소원의 지질, 예컨대, 지방산, 지방산 유도체 및/또는 트리아실글리세롤 (TAG)로의 전환에 대한 이로운 표현형을 세포에게 수여한다. 일부 실시양태에서, 이로운 표현형은 변형된 지방산 프로파일, 변형된 TAG 프로파일, 증가된 지방산 및/또는 트리아실글리세롤 합성 속도, 증가된 전환 수율, 세포 내 증가된 트리아실글리세롤 축적, 및/또는 세포의 지질체 내 증가된 트리아실글리세롤 축적을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 지방산 또는 TAG의 합성 속도는 동일한 세포 유형의 비변형된 세포에 비해 2배 이상 증가된다. 일부 실시양태에서, 세포의 지방산 또는 TAG의 합성 속도는 동일한 세포 유형의 비변형된 세포에 비해 5배 이상 증가된다. 일부 실시양태에서, 세포의 지방산 또는 TAG의 합성 속도는 동일한 세포 유형의 비변형된 세포에 비해 10배 이상 증가된다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 0.025 g/g 내지 약 0.32 g/g (예컨대, 생산된 지질 g/ 소비된 탄소원 g)의 범위 내의 전환 비율로 탄소원을 지방산 또는 TAG로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 0.11 g/g 이상의 전환 비율로 탄소원을 지방산 또는 TAG로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 0.195 g/g 이상의 전환 비율로 탄소원을 지방산 또는 TAG로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 0.24 g/g 이상의 전환 비율로 탄소원을 지방산 또는 TAG로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 0.27 g/g 이상의 전환 비율로 탄소원을 지방산 또는 TAG로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 세포는 지질체 또는 공포(vacuole)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포, 조류 세포, 진균 세포, 또는 효모 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 유지성 효모 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 와이. 리폴리티카 세포이다.
본 개시내용의 일부 측면은 유지성 세포, 예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 유지성 세포를 포함하는 배양물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 배양물은 탄소원을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 발효성 당을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발효성 당은 C6 당이다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 글루코스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 유기산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유기산은 아세트산이다. 일부 실시양태에서, 아세트산은 5％ vol/vol 이상, 10％ vol/vol 이상, 15％ vol/vol 이상, 20％ vol/vol 이상, 25％ vol/vol 이상, 또는 30％ vol/vol 이상의 농도이다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 아세테이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아세테이트는 1％ vol/vol 이상의 농도이다. 일부 실시양태에서, 아세테이트는 2％ vol/vol 이상의 농도이다. 일부 실시양태에서, 아세테이트는 3％ vol/vol 이상의 농도이다. 일부 실시양태에서, 아세테이트는 4％ vol/vol 이상의 농도이다. 일부 실시양태에서, 아세테이트는 5％ vol/vol 이상의 농도이다. 일부 실시양태에서, 배양물은 글리세롤을 포함한다. 일부 실시양태에서, 글리세롤은 약 2％ vol/vol의 농도이다. 일부 실시양태에서, 배양물은 5％ 이상, 10％ 이상, 15％ 이상, 또는 20％ 이상의 용존 산소 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 배양물은 pH 7.0 내지 pH 7.5의 범위 내의 pH를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 배양물은 황산암모늄을 포함한다. 일부 실시양태에서, 배양물은 황산암모늄 및 아세트산을 1:2의 비로 포함한다. 일부 실시양태에서, 배양물은 5 g/l 내지 60 g/l의 지질 역가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 배양물은 0.04 g/l/h 내지 0.60 g/l/h의 지질 생산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 배양물은 0.1 g/l/h 내지 1 g/l/h의 최대 지질 생산성을 나타낸다.
본 개시내용의 일부 측면은 DGA1 유전자 산물의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는, 단리된 유지성 세포와 탄소원을 접촉시키는 것; 및 세포에 의한 탄소원의 지방산 또는 트리아실글리세롤로의 적어도 부분적 전환에 적합한 조건 하에 세포와 접촉시킨 탄소원을 인큐베이션하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 유지성 세포는 ACC1 유전자 산물의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유지성 세포는 SCD 유전자 산물의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유지성 세포는 ACL 유전자 산물의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 유지성 세포는 본원에 기재되는 바와 같은 조작된 단리된 유지성 세포이다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 발효성 당을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 글루코스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 아세테이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아세테이트는 1％ vol/vol 이상, 2％ vol/vol 이상, 3％ vol/vol 이상, 4％ vol/vol 이상, 또는 5％ vol/vol 이상의 농도이다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 아세트산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아세트산은5％ vol/vol 이상, 10％ vol/vol 이상, 15％ vol/vol 이상, 20％ vol/vol 이상, 25％ vol/vol 이상, 또는 30％ vol/vol 이상의 농도이다. 일부 실시양태에서, 방법은 5％ 이상, 10％ 이상, 15％ 이상, 또는 20％ 이상의 수준의 용존 산소를 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접촉 및/또는 인큐베이션은 pH 7.0 내지 pH 7.5의 범위 내의 pH에서 수행된다.
70. 제53항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 황산암모늄과 접촉시키는 것을 포함하는 방법. 일부 실시양태에서, 방법은 세포를 1:2의 비의 황산암모늄 및 아세트산과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포를 글리세롤과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포를 약 2％ vol/vol의 농도의 글리세롤과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 유지성 세포와 접촉된 탄소원은 반응기에서 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 단리된 유지성 세포와 접촉되고 탄소원의 지방산 또는 트리아실글리세롤로의 전환을 위해 유가배양(fed batch) 공정에서 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 단리된 유지성 세포와 접촉되고 탄소원의 지방산 또는 트리아실글리세롤로의 전환을 위해 연속 공정에서 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 방법은 추가적인 양의 탄소원 또는 일정량의 추가 탄소원을 단리된 유지성 세포와 접촉된 탄소원과 인큐베이션 단계 중에 1회 이상 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 지방산 또는 트리아실글리세롤은 단리된 유지성 세포와 접촉된 탄소원으로부터 용매 추출에 의해 추출된다. 일부 실시양태에서, 용매 추출은 클로로포름 메탄올 추출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용매 추출은 헥산 추출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지방산 또는 트리아실글리세롤은 단리된 유지성 세포와 접촉된 탄소원으로부터 분리되고 그 후 에스테르교환에 의해 정제된다.
본 개시내용의 일부 측면은 세포 내 DGA1 유전자 산물의 발현 증가에 의한 유지성 세포 내 지방산 프로파일, 트리아실글리세롤 프로파일, 지방산 합성 속도, 트리아실글리세롤 합성 속도, 지방산 유도체 축적의 정도, 지방산 유도체 분비 속도, 탄수화물의 지방산 또는 지방산 유도체로의 전환 비율, 및/또는 탄수화물의 지방산 또는 지방산 유도체로의 전환의 유효 수율을 변형하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 ACC1 유전자 산물, SCD 유전자 산물, 및/또는 ACL 유전자 산물의 발현을 증가시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 지방산 유도체 축적의 정도는 지질체 내 지방산 유도체 축적의 정도이다. 일부 실시양태에서, 지방산 유도체는 트리아실글리세롤이다. 일부 실시양태에서, 유지성 세포 내 지방산 프로파일, 트리아실글리세롤 프로파일, 지방산 합성 속도, 트리아실글리세롤 합성 속도, 지방산 유도체 축적의 정도, 지방산 유도체 분비 속도, 탄수화물의 지방산 또는 지방산 유도체로의 전환 비율, 및/또는 탄수화물의 지방산 또는 지방산 유도체로의 전환의 유효 수율을 변형하는 것은 유지성 세포 내 지방산 합성 속도, 트리아실글리세롤 합성 속도, 지방산 유도체 축적의 정도, 지방산 유도체 분비 속도, 탄수화물의 지방산 또는 지방산 유도체로의 전환 비율, 및/또는 탄수화물의 지방산 또는 지방산 유도체로의 전환의 유효 수율을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포에서 탄수화물의 지방산 또는 지방산 유도체로의 전환 효율을 변경하는 것은 전환 효율을 2배 이상 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포에서 탄수화물의 지방산 또는 지방산 유도체로의 전환 효율을 변경하는 것은 전환 효율을 3배 이상 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포에서 탄수화물의 지방산 또는 지방산 유도체로의 전환 효율을 변경하는 것은 전환 효율을 4배 이상 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포에서 탄수화물의 지방산 또는 지방산 유도체로의 전환 효율을 변경하는 것은 전환 효율을 5배 이상 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 효모 세포이다. 일부 실시양태에서, 효모 세포는 야로위아 종 세포이다. 일부 실시양태에서, 유지성 효모는 와이. 리폴리티카이다.
본 개시내용의 일부 측면은 a) 서열 2 (와이. 리폴리티카 DGA1)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 b) a)의 뉴클레오티드 서열과 85％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 서열 2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 1을 포함한다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 분자 및 이종 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 이종 프로모터는 번역 신장 인자 (TEF) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 이종 프로모터는 인트론을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 프로모터는 개시 코돈을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인트론은 서열 2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 번역 출발 부위의 하류이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트 또는 본원에 기재된 벡터의 적어도 일부를 포함하는 세포를 제공한다.
본원의 주제 물질은 일부 경우에, 특정 문제에 대해 상호 관련된 생성물, 대안적 해결책, 및/또는 단일 시스템 또는 물품의 다수의 상이한 용도를 수반할 수 있다.
본 발명의 기타 이점, 특징, 및 용도는 특정 비-제한적 실시양태의 상세한 설명, 도면, 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1. 와이. 리폴리티카에서의 지질 합성을 위한 주요 대사 경로의 개요.
도 2. 배양 50시간 후 상이한 프로모터 하의 β-갈락토시다제의 효소 활성.
도 3. ACC1 + DGA1 형질전환체 (MTYL065)의 생물반응기 발효.
도 4. 2-L 생물반응기 발효에서의 ACC1 + DGA1 형질전환체의 지방산 프로파일 (FAP).
도 5. 아세테이트를 탄소원으로서 2-L 생물반응기에서 성장한 ACC + DGA 형질전환체의 지방산 프로파일.
도 6. 아세테이트 상에서 ACC +DGA1 와이. 리폴리티카에 의한 지방산 생산.
도 7. 조합 발현 구축 반응식. 지질 축적 유전자 표적의 조합을 함유하는 플라스미드의 구축을 위한 클로닝 경로 및 전략. 이러한 플라스미드는 그 후 지질 축적의 연구를 위해 와이. 리폴리티카로 변형되었다.
도 8. pMT092와 비교하여 pMT053을 통해 통합될 경우의 TEFin-DGA 카세트의 전사 발현.
도 9. 대조 균주에 대해 정규화된 총 지방산 함량에 의해 측정된, 조합 구축물을 발현하는 와이. 리폴리티카 균주 중 상대 지질 생산성 및 수율. 상응하는 유전자 표적에 대해 변형된 과다발현 카세트의 존재 (+) 또는 부재 (-)가 그래프 밑에 표시된다. 생산성 (연회색 막대)은 상대 지질 축적으로서 배양의 초기 100시간 이내에 계산되었다. 수율은 지질 축적을 소비된 당으로 나눔으로써 계산되었다. 배지의 C/N 비는 20이었다. 결과는 다수의 실험을 거친 평균값이다.
도 10. 균주 MTYL089에서의 표적 유전자의 전사 발현. 발현은 내부적으로 액틴 발현에 대해 정규화되고, 대조 (MTYL038) 균주에 대해 비교되고 성장의 66시간 후에 취득하였다.
도 11. 균주 MTYL089, 과다발현 ACC, D9, ACL12 및 DGA의 배치 생물반응기 발효. C/N 몰비는 100이었다. 모든 샘플 채취는 3회 수행되었다.
도 12. 2-L 발효 말기의 균주 MTYL089의 현미경검사. 정상 광 현미경검사 (좌측 그림)는 다수의 세포가 효모 형태이고, 큰 공포를 함유함을 나타낸다. 형광 현미경검사 (우측 그림)는 이러한 공포가 중성 지질로 구성됨을 가리킨다.
도 13. 지방산 프로파일과 균주 MTYL065 및 MTYL089의 비교. 총 지방산 함량에 대해 정규화하면서, 각각의 발효에서의 최종 시점으로부터 취득한 지방산 프로파일.
도 14. 질소 (mM), 비-지질 및 지질 역가 (g/L)의 경향.
도 15. 지질 역가 (g/L), 지질 함량 (％) 및 C/N 비의 경향. 제1 축은 지질 역가 및 지질 함량을 건조 세포 중량의 ％로서 나타낸다. 제2 축은 C/N 비를 나타낸다. C/N 비는 아세테이트의 빠른 소비 때문에 마지막에 하락한다.
도 16. 상 - 형광 없이 유침 (oil immersion) 현미경 (100X) 하에 관찰된 '유동 (floating) 세포'. 하 - 형광 하의 동일한 프레임이 선홍색 지질체를 나타낸다.
본 발명의 특정 실시양태의 상세한 설명
액체 바이오연료는 기후 변화에 대한 걱정을 완화하고 공급 불확실성을 순조롭게 하는 것을 도울 수 있는, 화석 연료에 대한 유망한 대안이다 (1). 바이오디젤, 제트 오일 및 기타 오일-유래 연료는 특히 항공 및 대형 차량 운송에 필요하다. 이들은 현재 식물성 오일로부터만 독점적으로 생산되고, 이는 고가이며 지속 불가능한 경로이다 (2). 매력적인 가능성은 재생 가능 탄수화물 공급원료의 오일로의 비-광합성 전환이다 (3). 바이오디젤에 대해, 오일 공급원료를 위한 식물성 오일로부터 미생물 오일 생산으로의 변화는 다수의 추가적인 이점을 제공한다: 다양한 공급원료에 대한 적응성, 토지 요구에서의 가요성, 효율적인 공정 순환 회전율, 및 규모 확대의 용이함 (4). 또한 미생물 생산을 위한 생물학적 플랫폼은 추가의 최적화에 대해 더욱 유전적으로 다루기 쉽다.
탄수화물의 오일로의 전환을 위한 비용-효율적 미생물 기술에 대한 핵심은 탄수화물에서 오일로의 높은 전환 수율이다. 대사 공학은 이 목적 달성에 적용되는 실행 기술인 것으로 드러났고 화학, 제약 및 연료 생성물의 합성에서 미생물 생체 촉매의 성능을 뚜렷이 향상시킨 성공적인 경로 조작의 다수의 실시예가 존재한다 (5). 높은 지질 합성으로 미생물을 조작하는 선행 노력은 지방산 합성 경로에서의 추정 비율-제어 단계를 증폭시키는데 중점을 두고 있다 (6). 그러나 이러한 노력은 혼합된 결과를 산출하였고, 짐작컨대 지방산 플럭스의 조정이 포화 지방산의 수준을 증가시켰기 때문이며, 이는 지방산 생합성을 위한 음성 피드백 루프를 제공하는 지방산 생합성 효소의 강력한 알로스테릭 억제제이다 (7). 본 발명자들은 대사물-형성 경로인 상류의 증폭을 대사물-소비 경로인 하류의 플럭스에서의 유사한 증가와 조합하는 접근법을 기재한다. 균형잡힌 경우에, 이 푸시-앤드-풀 전략은 그들의 항상성 생리학적 수준으로부터 중간체 대사물의 농도의 큰 벗어남 없이 큰 플럭스 증폭을 성취할 수 있다.
유지성 효모 야로위아 리폴리티카는 미생물 오일 생산에 대한 매력적인 후보이고, 이는 또한 광범위한 기타 산업 적용에서의 유용함을 입증하고 있다: 시트르산 생산, 단백질 생산 (예컨대, 프로테아제 및 리파제), 및 생물적 환경 정화 (8-10). 완전히 서열분석된 게놈 및 증가 추세의 유전 공학 도구를 사용하여, 와이.　리폴리티카의 조작이 비교적 용이하게 성취될 수 있다 (11). 와이.　리폴리티카는 또한 배양물 내에서 강력한 것으로 발견되었고, 다양한 기질 상에서 성장할 수 있었고, 농공산업 잔류물, 산업용 글리세롤, 및 산업용 지방의 지질 생산에 사용되고 있다 (12-14). 이는 탁월한 지질 축적 능력을 갖고, 통상적으로 지질 내에서 36％ 이하의 이의 건조 세포 중량 (DCW)을 축적한다 (15).
와이.　리폴리티카에서의 드 노보(de novo) 지질 합성을 위한 대사 경로가 완전히 설계되기 시작하고 있고, 지질 합성의 현재 모델은 도 1에 도시된다: 당분해에 진입하는 글루코스가 TCA 순환에 사용하기 위한 피루베이트로서 미토콘드리아에 들어간다; 그러나, 과잉 아세틸-coA는 미토콘드리아로부터 시토졸로 시트레이트 셔틀(shuttle)을 통해 이송된다. 시토졸 아세틸-CoA가 그 후 지방산 합성의 제1 단계로서 아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC)에 의해 말로닐-CoA로 전환된다. 지방산 합성 후에, 트리아실글리세롤 (TAG) 합성이 케네디 (Kennedy) 경로를 뒤따르고, 이는 소포체 (ER) 및 지질체에서 발생한다. 아실-CoA는 리소포스파티드산 (LPA)을 형성하기 위한 글리세롤-3-포스페이트 백본으로의 아실화를 위해 사용되는 전구체이고, 이는 포스파티드산 (PA)을 형성하기 위해 추가로 아실화된다. PA는 그 후 디아실글리세롤 (DAG)을 형성하기 위해 탈인산화되고 그 후 TAG를 생산하기 위해 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGA)에 의한 최종 아실화가 발생한다.
아세틸-CoA의 미토콘드리아로부터 시토졸로의 이송이 시트레이트의 ATP-시트레이트 리아제 (ACL)-매개 절단에 의해 시트레이트 셔틀을 통해 수행되며 아세틸-CoA 및 옥살로아세테이트 (OAA)를 수득한다. 아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC)가 그 후 지질 생합성에 대한 제1 수행 단계를 촉진시키면서, 시토졸 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 전환시키고, 이는 지방산 신장을 위한 주요 전구체이다. 완성된 지방 아실-CoA 쇄는 그 후 케네디 경로를 통한 트리아실글리세롤 (TAG)의 최종 어셈블리를 위해 소포체 (ER) 또는 지질체 막으로 이송된다. 와이.　리폴리티카에서 생산된 저장 지질의 80％ 초과가 TAG의 형태이다 (16). 시토졸 OAA는 말산 데히드로게나제에 의해 말레이트로 전환되고 미토콘드리아로 재이송되어 시트레이트 셔틀 순환을 완료한다. NADPH 형태의 환원 등가물이 펜토스 포스페이트 경로 또는 말산 효소에 의해 트랜스히드로게나제 순환에서 제공된다. 와이.　리폴리티카에서, 높은 PPP 플럭스 및 비효과적인 말산 효소 과다발현은 전자(the former)가 NADPH를 위한 주요 공급원임을 제시한다 (4, 17).
세포내 지질 축적은 두 가지 방법을 통해 발생할 수 있다: 드 노보 지질 합성 또는 외인성 지방산 및 지질의 엑스 노보(ex novo) 혼입. 지질 축적은 영양 공급이 과잉 탄소의 존재 하에 고갈되는 경우 가장 통상적으로 발생한다. 배양물에서, 이 상태는 전형적으로 정지상의 시작과 일치한다. 실제로, 가장 통상적으로 사용되는 제한적-영양 물질은 질소이고, 이것이 배지 조성물에서 용이하게 조절 가능하기 때문이다 (15). 이러한 유도성 조건에도 불구하고, 지질 합성 경로는 유기체가 세포 성장과 에너지 저장의 균형을 잡도록 고도로 조절된다. 예를 들어, ACC 단독이 다단계로 다수의 인자에 의해 조절된다 (7).
이러한 엄격한 조절은 특정 경우에 회피되었다. 퍼옥시솜 산화 경로를 제거하고 글리세롤 대사를 조작함으로써, 와이.　리폴리티카는 신생 지질 축적을 통해 40％-70％ 지질을 달성할 수 있었다(18, 19). Δ6- 및 Δ12-데새투라제 유전자의 공발현에 의해 γ-리놀렌산 (GLA)의 상당한 생산이 가능하게 되었다 (20). 그러나, 와이.　리폴리티카에서 지질 생합성 경로를 조작하는 것은 여전히 상대적으로 미개척 상태이고 생산성을 최대화하는 효과적인 지질 생산 경로의 조작을 위한 전략은 여전히 개발 중이다.
본 개시내용의 일부 측면은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체의 생산을 위한 조작된 미생물을 제공한다. "바이오연료"라는 용어는 생물학적 공급원, 예컨대 살아있는 세포, 미생물, 진균, 또는 식물로부터 유래한 연료를 지칭한다. 상기 용어에는, 예를 들어, 생물학적 공급원으로부터, 예를 들어, 통상적인 추출, 증류, 또는 정제 방법에 의해, 직접 수득된 연료 및 생물학적 공급원으로부터 수득된 바이오연료 전구체를, 예를 들어 화학적 변형, 예컨대 에스테르교환 절차에 의해 가공하여 생산된 연료가 포함된다. 직접 수득가능한 바이오연료의 예는 알콜, 예컨대 에탄올, 프로판올, 및 부탄올, 지방, 및 오일이다. 바이오연료 전구체 (예컨대, 지질)의 가공에 의해 수득되는 바이오연료의 예는 바이오디젤 (예컨대, 지질의 에스테르교환에 의해 수득됨), 및 녹색 디젤/변형된 오일 연료 (예컨대, 오일의 수소화에 의해 수득됨)이다. 지방산 메틸 (또는 에틸) 에스테르로도 또한 지칭되는 바이오디젤은 오늘날 경제학적으로 가장 중요한 바이오연료 중 하나이며, 수산화나트륨 및 메탄올 (또는 에탄올)이 지질, 예를 들어, 트리아실글리세롤과 반응하여 바이오디젤 및 글리세롤을 생성하는 지질의 에스테르교환에 의해 산업적 규모로 생산될 수 있다.
산업적-규모의 바이오디젤 생산을 위한 공급원료에는 동물 지방, 식물성 오일, 팜 오일, 대마, 대두, 평지씨, 아마, 해바라기, 및 유지성 조류가 있다. 다른 접근법에서는, 바이오매스를 미생물에 의해 바이오연료 전구체, 예를 들어, 지질로 전환시키며, 이를 후속적으로 추출 및 추가 가공하여 바이오연료를 생산한다. "바이오매스"라는 용어는 살아있는 세포 또는 유기체, 예를 들어, 미생물의 성장 및/또는 증식에 의해 생성되는 물질을 지칭한다. 바이오매스는 세포, 미생물 및/또는 세포내 내용물, 예를 들어 세포 지방산 및 TAG, 및 또한 세포외 물질을 함유할 수 있다. 세포외 물질에는 세포에 의해 분비된 화합물, 예를 들어, 분비된 지방산 또는 TAG가 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 바이오연료 생산을 위한 바이오매스의 중요한 유형은 조류 바이오매스 및 식물-유래 바이오매스, 예를 들어, 옥수수 대 및 목재 섬유이다. 일부 실시양태에서, 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 바이오매스는 식물 유래 당, 예를 들어, 사탕수수 또는 옥수수 유래 당을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 일부 측면은, 예를 들어, 경제학적으로 실행가능한 산업적-규모의 바이오디젤 생산에 유용한 지질의 미생물 공급원의 조작 및 개발에 관한 것이다. "지질"이라는 용어는 지방산 및 그의 유도체를 지칭한다. 따라서, 지질의 예에는 지방산 (FA, 포화 및 불포화 둘 다); 아실글리세롤로도 또한 지칭되는 글리세리드 또는 글리세로지질 (예컨대, 모노글리세리드 (모노아실글리세롤), 디글리세리드 (디아실글리세롤), 트리글리세리드 (트리아실글리세롤, TAG, 또는 중성 지방); 포스포글리세리드 (글리세로인지질); 비(非)글리세리드 (스핑고지질, 스테롤 지질 (콜레스테롤 및 스테로이드 호르몬 포함), 프레놀 지질 (테르페노이드 포함), 지방 알콜, 왁스, 및 폴리케티드); 및 복합 지질 유도체 (당-연결 지질 또는 당지질, 및 단백질-연결 지질)가 있다. 지질은 살아있는 세포 및 미생물의 형질 막의 필수적인 부분이다. 일부 세포 및 미생물도 또한 지질을 생산하여, 예를 들어 지질체, 지질 액적, 또는 공포 내에 트리아실글리세롤의 형태로 에너지를 저장한다.
본 발명의 일부 측면은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 조작된 미생물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 미생물은 그의 지질 대사가 지질 생산을 위해 최적화되도록 조작된다. "지질 대사"라는 용어는 지질의 생성 또는 분해를 수반하는 분자 과정을 지칭한다. 지방산 합성, 지방산 산화, 지방산 탈포화, TAG 합성, TAG 저장 및 TAG 분해는 세포의 지질 대사의 일부인 과정의 예이다. 따라서, "지방산 대사"라는 용어는 지방산의 합성, 생성, 변환 또는 분해를 수반하는 모든 세포성 또는 유기체성 과정을 지칭한다. 지방산 합성, 지방산 산화, TAG 합성, 및 TAG 분해는 세포의 지방산 대사의 일부인 과정의 예이다.
"트리아실글리세롤" (TAG, 때로 트리글리세리드로도 또한 지칭됨)라는 용어는 글리세롤 분자의 3개의 히드록실 (OH) 기의 각각에 3개의 지방산 분자, 즉 지방족 모노카르복실산이 에스테르 결합을 통해 하나씩 공유결합되어 있는 단일 분자의 글리세롤을 포함하는 분자를 지칭한다. 트리아실글리세롤은 그의 환원된 무수 특성으로 인해 고도로 집약된 대사 에너지 저장고이며 바이오디젤 생산에 적합한 공급원료이다.
다수의 세포 및 유기체는 대사 에너지를 지방산 및 지방산 유도체, 예컨대 TAG의 형태로 저장한다. 지방산 및 그의 유도체, 예컨대 TAG는 대사 에너지를 저장하는 이상적인 형태를 제공한다. C-C 결합에 함유된 에너지는 β-산화 (형식상으로는 지방산 생합성의 역에 상응하지만, 상이한 분자 경로를 구성하는 상이한 효소에 의해 매개 및 조절되는 반응)에 의해 효율적으로 방출될 수 있다. 미생물은 외부적 공급, 내인성 전환, 및 드 노보 합성으로부터 지방산을 산출할 수 있다. 본 발명의 일부 측면은 외부적으로 공급된 탄소원으로부터 지방산 또는 지방산 유도체, 예컨대 TAG를 효율적으로 합성 및 저장할 수 있는 미생물의 능력을 기반으로 하는 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 미생물의 규명에 관한 것이다.
천연 지방산 분자는 통상 4 내지 28개의 탄소 원자의 비분지형 지방족 쇄, 또는 꼬리를 갖는다. 지방산은 지방족 쇄의 모든 탄소 원자가 C-C 단일 결합을 통해 연결된 경우 "포화된" 것으로, 또는, 2개 이상의 탄소 원자가 C-C 이중 결합을 통해 연결된 경우 "불포화된" 것으로 지칭된다. 불포화 지방산은 막 유동성, 세포 활성, 대사 및 유전자 전사를 지배하는 핵 사건의 조절에서 중요한 역할을 한다.
효모에서 지방산의 구성은 주로 C16 및 C18 지방산, 예를 들어 팔미트산 (C16), 팔미톨레산 산 (C16), 스테아르산 (C18) 및 올레산 (C18)으로 이루어져 있다. 팔미트산은 16개의 탄소 원자의 지방족 쇄를 갖는 비분지형 포화 지방산 (탄소 원자/불포화 결합: 16.0)이다. 스테아르산은 18개의 탄소 원자의 지방족 쇄를 갖는 비분지형 포화 지방산 (18.0)이다. 팔미톨레산 산은 16개의 탄소 원자의 지방족 쇄를 갖는 단일불포화 지방산 (16.1)이다. 올레산은 18개의 탄소 원자의 지방족 쇄를 갖는 단일불포화 지방산 (18.1)이다. 효모 내 소수의 지방산 종에는 C14 및 C26 지방산이 포함되며, 이들은 각각 단백질 변형에서 또는 스핑고지질 및 GPI 앵커의 성분으로서 필수적인 기능을 한다.
지방산의 드 노보 합성에는 상당한 양의 대사물, 아세틸-CoA, ATP 및 NADPH가 이용되며, 그에 따라 이는 이들 화합물에 의존하는 다른 세포 과정과 경쟁한다. NADPH는 지방산 신장 사이클 내 2개의 환원 단계에 필요하며, 지방산 합성을 세포의 대사 상태에 연결시켜, 지방산 합성을 증가된 ATP/AMP 비, 상승된 환원 등가물 및 상승된 아세틸-CoA 풀(pool)에 의해 시사되는 세포의 고에너지 부하 상태로만 제한시킨다. 거의 모든 세포내 소기관은 지방산 대사에 연루되어 있으며, 이는 지방산 항상성의 유지가 다중적 수준에서 조절을 필요로 함을 시사한다. 지질 생합성을 위한 대사물, 아세틸-CoA, ATP, 또는 NADPH를 생성하는 지질 합성 단계는 때로 본원에서 지질 합성의 "푸시(push) 단계"로 지칭된다. 세포에서 지질 합성을 위한 대사물, 아세틸-CoA, ATP, 또는 NADPH의 생산을 증가시키는 과정의 증폭 (예를 들어, 상기와 같은 대사물-생산 과정을 매개하는 유전자 산물을 과다발현시켜 증폭함)은 본원에서 때로 "푸시 변형"으로 지칭된다.
효모를 비롯한 대부분의 유기체는 다양한 탄소원으로부터 지방산을 드 노보 합성할 수 있다. 초기 단계에서, 아세틸-CoA는 효소 아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC; 효모에서 ACC1 및 HFA1에 의해 코딩됨)에 의해 CO2의 첨가에 의해 카르복실화되어 말로닐-CoA로 된다. 비오틴은 이 반응에서 필수적인 보조인자이며, 효소 비오틴:아포단백질 리가제 (효모에서 BPL1/ACC2에 의해 코딩됨)에 의해 ACC 아포단백질에 공유 부착된다. ACC는 비오틴 카르복실 운반 단백질 (BCCP) 도메인, 비오틴-카르복실라제 (BC) 도메인, 및 카르복실-트랜스퍼라제 (CT) 도메인을 내포하는 삼관능성 효소이다. 대부분의 박테리아에서, 이들 도메인은 개별적인 폴리펩티드로서 발현되며, 이종중합체성 복합체로 조립된다. 이와 반대로, 미토콘드리아 ACC 변이체 (효모에서는 Hfa1)를 비롯한 진핵 ACC는 단일 폴리펩티드 상에서 이들 기능들을 보유한다. ACC에 의해 생성된 말로닐-CoA는 지방산 신타제, FAS, 및 엘롱가제에 의해 촉매되는 일련의 순환적 반응에서 2개의 탄소 공여자로 소용된다.
드 노보 지방산 합성의 중간 생성물은 포화 지방산이다. 포화 지방산은 효모를 비롯한 진핵생물에서 불포화 지방산의 전구체인 것으로 알려져 있다. 불포화 지방산은 일반적으로 데새투라제로 불리는 특수 효소에 의한 포화 지방산 내의 C-C 단일 결합의 탈포화에 의해 생성된다. 포화 지방산의 불포화 지방산으로의 전환을 지배하는 제어 메카니즘은 충분히 규명되지 않고 있다. 진핵생물에서, 불포화 지방산은 막 유동성, 세포 활성, 대사 및 유전자 전사를 지배하는 핵 사건의 조절에서 중요한 역할을 한다. 전형적으로, 효모 지방산의 약 80％가 단일불포화되어 있는데, 이는 이들이 지방족 쇄 내에 1개의 불포화 결합을 함유함을 의미한다.
지방산은 지방산 합성의 강력한 억제제이며, 지방산에 의한 지방산 합성의 피드백 억제는 오일 생산을 위한 미생물의 조작에 있어 주요한 장애물이다. 본 개시내용의 일부 측면은, 지질 합성의 푸시 변형이 전형적으로 지질 합성의 지방산-매개 피드백 억제를 중단시킬 수 없는 반면, 푸시 변형 (예컨대, ACC1 과다발현)과 풀(pull) 변형 (예컨대, DGA1 과다발현)의 조합은 피드백 억제를 효율적으로 우회하여, 증가된 탄소 플럭스를 지질 합성 경로 (예를 들어, 세포의 지질체 또는 공포에 저장된 TGA에서의 지질 합성 경로)로 완전히 실현할 수 있다는 인식에 기반한 것이다.
본 개시내용의 일부 측면은 오일 생산을 위한 미생물의 조작을 위한 전략을 제공한다. 일부 실시양태에서, 그러한 전략은 지질 합성의 푸시- 및 풀-단계를 동시에 증폭시키도록 하는 유지성 미생물 (예를 들어, 와이.　리폴리티카)의 유전자 조작을 이용한다. 본원에 개시된 바와 같이, 이러한 전략을 이용하여 유지성 효모 숙주 세포에서의 지질 생산의 상당한 증가를 달성하였다.
본 개시내용의 일부 측면은, 푸시-앤드-풀 변형, 예를 들어, 지질 합성 경로를 위한 대사물을 생성하는 대사 단계 및 지질 합성의 피드백 억제를 매개하는 합성 생성물을 격리시키는 대사 단계의 동시 증폭이 푸시-단독 또는 풀-단독 변형의 조작과 비교하여 지질 합성 경로 내로의 탄소 플럭스의 상당한 증가를 가져온다는 인식에 기반한 것이다. 본 발명의 일부 측면은 유지성 미생물 (예를 들어, 야로위아 리폴리티카)에서의 DGA1 유전자 산물의 과다발현이 지질 합성 경로 내로의 탄소 플럭스의 현저한 증가를 가져오며, ACC1 유전자 산물의 동시 과다발현이 DGA1 과다발현과 협력 작용하여, 다양한 탄소 기질로부터의 산업적-규모 오일 생산에 적합한 매우 강화된 탄소 플럭스 특성을 갖는 푸시-앤드-풀 변형된 미생물을 산출한다는 놀라운 발견에 관한 것이다.
미생물에서 대사물-생성 단계 (예컨대, 말로닐-CoA의 생산) 및 또한 생성물-격리 대사 단계 (예컨대, 디아실글리세롤의 트리아실글리세롤로의 아실화)의 균형잡힌 조절이 지질 합성 내로의 순 탄소 플럭스의 상당한 증가를 가져온다는 발견은 조작된 세포의 도움에 의해 재생가능한 탄소원을 바이오연료 또는 바이오연료 전구체로 전환시키는 것을 목적으로 하는 공정에 있어 중대한 시사점을 갖는다. 본 발명의 일부 측면에 기초하면, 미생물, 예를 들어 유지성 효모, 예컨대 와이. 리폴리티카의 지질 합성 대사를, 산업적-규모의 탄수화물의 바이오연료 또는 바이오연료 전구체로의 전환에 매우 바람직한 표현형, 예컨대 지질체 또는 공포에서의 지방산 합성, TAG 합성, 및 지방산 및 TAG 저장의 현저한 증가를 부여하는 방식으로 변형시키는 것이 이제 가능하다.
본 발명의 일부 측면에 따르면, 본원에서 제공되는 방법에 따라 미생물에서의 지질 대사를, 예를 들어 지질 합성의 대사물-생성 (푸시) 단계를 매개하는 유전자 산물 및 생성물-격리 (풀) 단계를 매개하는 유전자 산물을 동시에 과다발현시킴으로써 변형시키게 되면, 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산 공정에서 사용하기에 최적화된 미생물을 생성할 수 있게 된다. 본 발명의 일부 측면은 지질 생합성의 푸시 단계 및 풀 단계를 동시에 증폭시켜 미생물에서의 지방산 대사를 조작하여, 미생물에서 지방산 및 지방산 유도체의 증가된 합성 속도 및 축적을 가져오는 전략 및 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 측면은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 미생물의 지질 대사를 조절하는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성의 조절을 가져오는 유전자 변형을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일부 측면에 따른 그러한 유전자 변형은 변형된 미생물을 탄소원, 예를 들어, 탄수화물 공급원으로부터 지질의 대규모 생산을 위해 최적화하기 위해 탄수화물의 지방산 및/또는 TAG로의 전환을 증가시키는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 일부 측면에 따라 제공되는 일부 변형, 예를 들어, 특정 유전자 산물의 과다발현, 녹아웃, 녹-다운(knock-down), 활성화 및/또는 억제는 단독으로 또는 조합하여, 및/또는 당업자에 공지된 다른 변형과 조합하여 실시될 수 있다. "변형"이라는 용어는 특정 유전자 산물의 유전자 조작, 예를 들어, 과다발현, 녹아웃, 녹-다운, 활성화 및/또는 억제, 및 비-유전자 조작, 예를 들어, 성장 배지, 기질, 기질 전처리, pH, 온도, 전환 공정 등의 조작 둘 다를 지칭한다.
유전자 발현의 조절로도 또한 본원에서 지칭되는 유전자 발현의 변형은, 발현의 천연 조절에 대한 방해 또는 억제, 과다발현, 발현의 억제, 또는 주어진 유전자의 발현의 완전한 철폐일 수 있다. 천연 유전자 서열, 예를 들어 천연 DGA1 또는 ACC1 유전자 서열의 상류에 이종 프로모터의 삽입, 또는 프로모터 내 조절 서열 (예를 들어 포화 지방산에 의한 DGA1 또는 ACC1 유전자의 피드백 억제를 매개하는 조절 서열)의 결실은 발현의 천연 조절에 대한 방해 또는 억제의 예이다. 유전자 발현의 조절을 위한 전략으로는, 예를 들어 재조합 기술, 예컨대 유전자 적중법 또는 바이러스성 전달에 의한 유전자 변경, 또는 비-유전자 변경, 예를 들어 유전자 발현의 상향- 또는 하향-조절을 가져오는 것으로 공지된 환경 변경, 또는 조절제, 예를 들어 약물 또는 소형 RNA 분자의 표적 세포로의 일시적 전달을 들 수 있다. 미생물에 대한 유전자 및 비-유전자 변경 방법은 당업자에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 모두 본원에 참고로 포함되는 문헌 [J. Sambrook and D. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (January 15, 2001)]; [David C. Amberg, Daniel J. Burke; and Jeffrey N. Strathern, Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April 2005)]; [John N. Abelson, Melvin I. Simon, Christine Guthrie, and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volume 194 (Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press (March 11, 2004)]; [Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume 350 (Methods in Enzymology, Vol 350), Academic Press; 1st edition (July 2, 2002)]; [Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C, Volume 351, Academic Press; 1st edition (July 9, 2002)]; [Gregory N. Stephanopoulos, Aristos A. Aristidou and Jens Nielsen, Metabolic Engineering: Principles and Methodologies, Academic Press; 1 edition (October 16, 1998)]; 및 [Christina Smolke, The Metabolic Pathway Engineering Handbook: Fundamentals, CRC Press; 1 edition (July 28, 2009)]에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 "과다발현"이라는 용어는, 참조 세포, 예를 들어, 동일한 세포 유형의 야생형 세포 또는 동일한 세포 유형이나 특정 변형, 예를 들어, 유전자 변형이 결여된 세포와 비교하여, 주어진 세포, 세포 유형 또는 세포 상태에서 주어진 유전자 산물의 발현 수준이 증가된 것을 지칭한다. 야생형 세포에서는 DGA1 또는 ACC1 유전자 발현을 억제했을 포화 지방산의 농축을 보이는 와이. 리폴리티카 세포에서 DGA1 및/또는 ACC1 유전자의 강제된 계속된 발현은 유전자 과다발현의 한 예이다.
본 발명의 일부 측면은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 미생물에서 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 1 (DGA1) 유전자 산물의 활성을 조작하는 방법을 제공한다. DGA1 유전자는 아실-CoA를 아실 공여자로서 사용하여 디아실글리세롤을 아실화하는 트리아실글리세롤 (TAG) 형성의 말단 단계를 촉매하는 아실트랜스퍼라제를 코딩한다. 이 아실트랜스퍼라제 반응의 결과물은 트리아실글리세롤이며, 이는 지방산 자체와 동일한 지방산 합성에 대한 억제 피드백 효과를 보이지 않는다. TAG는 전형적으로 지질 생성 세포에서 지질체 또는 공포에 저장된다. 일부 실시양태에서, 조작은 과다발현이다. 일부 실시양태에서, 조작은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 미생물을 이종 프로모터, 예를 들어, 구성적 또는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 DGA1 유전자 산물, 예를 들어, DGAT2 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 구축물과 접촉시켜 실시된다. 일부 실시양태에서, DGA1 유전자 산물을 코딩하는 핵산은 서열 1의 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, DGA1은 와이. 리폴리티카 DGA1, 예를 들어, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 와이. 리폴리티카 DGA1이다. 일부 실시양태에서, 미생물은 와이. 리폴리티카이다. 일부 실시양태에서, 미생물에서 DGA1 유전자 산물의 활성의 조작은 대규모의 탄수화물의 지질로의 전환을 위해 유익한 표현형, 예를 들어 증가된 지질 합성 속도, 증가된 탄수화물의 지질로의 전환 효율, 증가된 지질 저장 및, 증가된 성장 속도, 탄소원 또는 지질 생성물의 상승된 농도에 대한 증가된 내성을 부여하도록 실시된다. DGA1 유전자 및 유전자 산물 서열은 당업자에 익히 공지되어 있다. 예시적인 대표적인 유전자 및 유전자 산물 서열은 NCBI 데이터베이스 (www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 항목 XM_504700 하에서 찾을 수 있다.
DGA1 핵산 및 단백질 서열의 적합한 서열의 비제한적 예가 하기에 제공된다. 다른 종으로부터의 서열을 비롯한 추가의 적합한 DGA1 서열은 당업자에 명백할 것이며, 본 발명은 이러한 점에 있어서 제한되지 않는다.
Figure 112014046108244-pct00001
본 발명의 일부 측면은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 미생물에서, 예를 들어, 와이. 리폴리티카에서 아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC) 유전자 산물을 조작하는 방법을 제공한다. ACC 유전자 산물은 지방산 합성에서 주된 C2-전구체인 아세틸-CoA의 말로닐-CoA로의 전환을 매개하며, 이는 지방산 합성에 전념하는 제1의 단계인 것으로 고려되며, 이는 또한 지방산 합성에서 속도-제한 단계인 것으로 시사된 바 있다 (문헌 [Cao Y, Yang J, Xian M, Xu X, Liu W. Increasing unsaturated fatty acid contents in Escherichia coli by coexpression of three different genes. Appl Microbiol Biotechnol. 2010] 참조). 일부 실시양태에서, ACC 활성 조작은 ACC 과다발현이다. 일부 실시양태에서, 조작은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 미생물을 이종 프로모터, 예를 들어, 구성적 또는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 ACC 유전자 산물, 예를 들어, ACC1 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 구축물과 접촉시켜 실시된다. 일부 실시양태에서, ACC 유전자 산물을 코딩하는 핵산은 서열 3의 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ACC 유전자 산물은 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 ACC1 단백질이다. 일부 실시양태에서, 미생물에서 ACC 과다발현은 지방산 합성 속도를 증가시키고/거나 탄수화물의 바이오연료 또는 바이오연료 전구체로의 대규모 전환을 위해 유익한 표현형, 예를 들어 증가된 지질 합성 속도, 증가된 탄수화물의 지질 전환 효율, 증가된 지질 저장 및, 증가된 성장 속도, 물질, 예컨대 탄소원, 바이오연료 또는 바이오연료 전구체, 또는 독성 물질의 농축에 대한 증가된 내성을 부여한다. ACC 유전자 및 유전자 산물 서열은 당업자에 익히 공지되어 있다. 예시적인 대표적인 유전자 및 유전자 산물 서열은 NCBI 데이터베이스 (www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 GeneID: 855750 및 2909424에 대한 항목 하에, 또는 항목 NC_006069 하에 찾을 수 있다.
ACC 핵산 및 단백질 서열의 적합한 서열의 비제한적 예가 하기에 제공된다. 다른 종으로부터의 서열을 비롯한 추가적인 적합한 ACC 서열은 당업자에 명백할 것이며, 본 발명은 이러한 점에 있어서 제한되지 않는다.
ACC 코딩 핵산 서열:
Figure 112014046108244-pct00002
Figure 112014046108244-pct00003
Figure 112014046108244-pct00004
Figure 112014046108244-pct00005
Figure 112014046108244-pct00006
Figure 112014046108244-pct00007
본 발명의 일부 측면은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 미생물에서 스테아로일-CoA-데새투라제 (SCD)의 활성을 조작하는 방법을 제공한다. SCD는 CoA에 커플링된 스테아르산의 C9 및 C10 사이에 이중 결합을 삽입하는 Δ9 데새투라제이며, 이는 본원의 다른 곳에서 보다 상세히 기재되는 탈포화 지방산 및 그의 유도체의 생성에서 핵심 단계이다. 일부 실시양태에서, 조작은 과다발현이다. 일부 실시양태에서, 조작은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 미생물을 이종 프로모터, 예를 들어, 구성적 또는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 SCD 유전자 산물, 예를 들어, SCD 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 구축물과 접촉시켜 실시된다. 일부 실시양태에서, SCD 유전자 산물을 코딩하는 핵산은 서열 5의 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, SCD는 와이. 리폴리티카 SCD, 예를 들어, 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 와이. 리폴리티카 SCD이다. 일부 실시양태에서, 미생물은 와이. 리폴리티카이다. 일부 실시양태에서, 미생물에서 SCD의 활성의 조작은 탄수화물의 지질로의 대규모 전환을 위해 유익한 표현형, 예를 들어 증가된 지질 합성 속도, 증가된 탄수화물의 지질로의 전환 효율, 증가된 지질 저장 및, 증가된 성장 속도, 탄소원 또는 지질 생성물의 상승된 농도에 대한 증가된 내성을 부여하도록 실시된다. 스테아로일-CoA 데새투라제 유전자 및 유전자 산물 서열은 당업자에 익히 공지되어 있다. 예시적인 대표적인 유전자 및 유전자 산물 서열은 NCBI 데이터베이스 (www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 GeneID: 852825에 대한 항목 하에 찾을 수 있다.
SCD 핵산 및 단백질 서열의 적합한 서열의 비제한적 예가 하기에 제공된다. 다른 종으로부터의 서열을 비롯한 추가적인 적합한 SCD 서열은 당업자에 명백할 것이며, 본 발명은 이러한 점에 있어서 제한되지 않는다.
Figure 112014046108244-pct00008
Figure 112014046108244-pct00009
본 발명의 일부 측면은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 미생물에서의 ATP-시트레이트 리아제 (ACL)의 활성의 조작 방법을 제공한다. ACL은 TCA 회로의 생성물로서 미토콘드리아 밖으로 이동되는 시트레이트를 절단함으로써 시토졸 아세틸-CoA를 제공한다. 시트레이트를 옥살로아세테이트 및 아세틸-CoA로 절단하여, ACL 유전자 산물은 ACC를 위한 아세틸-CoA 기질을 제공하며, 이는 그 후 지방산 합성에서 주요 C2-전구체인 아세틸-CoA의 말로닐-CoA로의 전환을 매개하며, 이는 본원의 다른 곳에 보다 자세히 기재된 바와 같이 지방산 합성에서 첫번째 수임 단계라고 고려된다. 일부 실시양태에서, ACL 유전자 산물은 별도의 유전자에 의해 코딩되는 2개의 서브유닛을 포함하는 단백질이다. 일부 실시양태에서, ACL 유전자 산물은 동일한 유전자에 의해 코딩되는 2개의 서브유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작은 과다발현이다. 일부 실시양태에서, 조작은 이종 프로모터, 예를 들어 구성적 또는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 ACL 유전자 산물, 예를 들어 ACL 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 구축물과 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 미생물을 접촉시킴으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, ACL 유전자 산물을 코딩하는 핵산은 서열 7 및 서열 9의 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ACL은 와이. 리폴리티카 ACL, 예를 들어 서열 8 및 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 와이. 리폴리티카 ACL이다. 일부 실시양태에서, 미생물은 와이. 리폴리티카이다. 일부 실시양태에서, 미생물에서 ACL 활성의 조작은 대규모 탄수화물의 지질로의 전환, 예를 들어 증가된 지질 합성 속도, 증가된 탄수화물의 지질로의 전환 효율, 증가된 지질 저장 및 증가된 성장 속도, 탄소원 또는 지질 생성물의 상승된 농도에 대한 증가된 내성을 위한 유익한 표현형을 부여하도록 수행된다. ATP-시트레이트 리아제 유전자 및 유전자 산물 서열은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 예시적인 대표적 유전자 및 유전자 산물 서열은 NCBI 데이터베이스 (www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 GeneID: 2912101 및 2910381에 대한 입력 하에 찾을 수 있다.
ACL 핵산 및 단백질 서열의 적합한 서열의 비제한적 예는 하기 제공된다. 다른 종으로부터의 서열을 포함하는 추가의 적합한 ACL 서열은 당업자에게 명백할 것이고, 본 발명은 본 측면에서 제한되지 않는다.
ATP 시트레이트 리아제 (야로위아 리폴리티카) 서브유닛 1, ACL1 DNA
YALI0E34793g
XM_504787
Figure 112014046108244-pct00010
ATP 시트레이트 리아제 (야로위아 리폴리티카) 서브유닛 1, ACL1 단백질
YALI0E34793p
XP_504787
Figure 112014046108244-pct00011
ATP 시트레이트 리아제 (야로위아 리폴리티카) 서브유닛 2, ACL2 DNA
YALI0D24431g
XM_503231
Figure 112014046108244-pct00012
ATP 시트레이트 리아제 (야로위아 리폴리티카) 서브유닛 2, ACL2 단백질
YALI0D24431p
XP_503231
Figure 112014046108244-pct00013
본 발명의 일부 측면은 본원에 기재된 바와 같은 변형, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 DGA1 변형, 본원에 기재된 바와 같은 ACC1 변형, 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 SCD 변형 중 임의의 변형을 포함하는 오일 생산을 위한 유지성 미생물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 푸시 변형 및 본원에 기재된 바와 같은 풀 변형을 포함하는 변형된 유지성 미생물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 푸시 변형은 ACC1 유전자 산물의 과다발현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 풀 변형은 DGA1 및/또는 SCD 유전자 산물의 과다발현을 포함한다.
본 발명의 일부 측면은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 요구되는 및/또는 원하는 표현형을 미생물, 예를 들어 와이. 리폴리티카에 부여하는 유전자 산물을 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 와이. 리폴리티카로부터 유래된 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DGA1 유전자 산물, 예를 들어 DGA1 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 ACC1 유전자 산물, 예를 들어 ACC1 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 데새투라제, 예를 들어 Δ9 데새투라제를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 와이. 리폴리티카 Δ9 데새투라제 (SCD)를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 과다발현이 지질 생합성의 푸시 변형을 나타내는 유전자 산물 (예를 들어, ACC1 유전자 산물) 및 과다발현이 지질 생합성의 풀 변형을 나타내는 유전자 산물 (예를 들어, DGA1 및/또는 SCD 유전자 산물)을 포함하는 유전자 산물의 조합을 예를 들어 다중 시스트론에서 코딩하는 핵산이 제공된다.
용어 "핵산"은 다중 연결된 뉴클레오티드를 포함하는 분자를 지칭한다. "핵산" 및 "핵산 분자"는 교환가능하게 사용되고, 올리고리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 상기 용어는 또한 폴리뉴클레오시드 (즉, 폴리뉴클레오티드에서 포스페이트를 제외함) 및 임의의 다른 유기 염기 함유 핵산을 포함한다. 유기 염기는 아데닌, 우라실, 구아닌, 티민, 시토신 및 이노신을 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산은 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 핵산은 천연 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 또는 핵산 합성기를 이용하여 합성될 수 있다 (즉, 합성적). 핵산의 단리는 당업계에서 통상적으로 수행되고, 적합한 방법은 표준 분자 생물학 교과서에서 찾을 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Maniatis' Handbook of Molecular Biology] 참조). 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 DNA 또는 RNA, 예컨대 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, mRNA, cDNA, rRNA, miRNA, PNA 또는 LNA, 또는 그의 조합일 수 있다. 비-자연 발생 핵산, 예컨대 박테리아 인공 염색체 (BAC) 및 효모 인공 염색체 (YAC)가 또한 본 발명의 일부 측면에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 측면은 핵산 유도체의 사용에 관한 것이다. 특정 핵산 유도체의 사용은 특히 뉴클레아제를 함유할 수 있는 생물학적 샘플에 노출되는 경우 본 발명의 핵산의 소화를 방지함으로써 본 발명의 핵산의 안정성을 증가시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 유도체는 비-자연 발생 핵산 또는 그의 유닛이다. 핵산 유도체는 비-자연 발생 요소, 예컨대 비-자연 발생 뉴클레오티드 및 비-자연 발생 백본 연결을 함유할 수 있다. 본 발명의 일부 측면에 따른 핵산 유도체는 포스포로티오에이트 연결, 포스포디에스테르 변형된 핵산, 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 핵산의 조합, 메틸포스포네이트, 알킬포스포네이트, 포스페이트 에스테르, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카르바메이트, 카르보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세트아미데이트, 카르복시메틸 에스테르, 메틸포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, p-에톡시, 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 백본 변형을 함유할 수 있다. 핵산의 백본 조성물은 동종 또는 이종일 수 있다.
본 발명의 일부 측면에 따른 핵산 유도체는 당 및/또는 염기에서 치환 또는 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 핵산 유도체는 3' 위치에서의 히드록실 기가 아니고 5' 위치에서의 포스페이트 기가 아닌 저분자량 유기 기 (예를 들어, 2'-O-알킬화 리보스 기)에 공유결합으로 부착된 백본 당을 갖는 핵산을 포함할 수 있다. 핵산 유도체는 비-리보스 당, 예컨대 아라비노스를 포함할 수 있다. 핵산 유도체는 치환된 퓨린 및 피리미딘, 예컨대 C-5 프로핀 변형된 염기, 5-메틸시토신, 2-아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 하이포크산틴, 2-티오우라실 및 슈도이소시토신을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA), DNA, RNA, 또는 이들의 공-핵산(co-nucleic acid), 예컨대 DNA-LNA 공-핵산을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "단리된 핵산 분자"는 그의 자연 환경에 존재하지 않는 핵산, 예를 들어 (i) 세포 또는 미생물, 예를 들어 박테리아 또는 효모로부터 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 숙주 세포의 알칼리 용해 및 핵산의 후속적 정제에 의해, 예를 들어 실리카 흡착 절차에 의해 추출되고/거나 정제된 핵산; (ii) 시험관내에서, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭된 핵산; (iii) 클로닝에 의해 재조합으로 생산된 핵산, 예를 들어 발현 벡터로 클로닝된 핵산; (iv) 예를 들어, 시험관내 효소적 소화에 의해 또는 전단 및 후속적 겔 분리에 의해 단편화되고 크기 분리된 핵산; 또는 (v) 예를 들어, 화학적 합성에 의해 합성된 핵산을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 용어 "단리된 핵산 분자"는 (vi) 임의의 자연 발생 핵산과 화학적으로 현저히 상이한 핵산을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 용이하게 조작될 수 있다. 따라서, 벡터로 클로닝된 핵산, 또는 숙주 세포로 전달되고 숙주 게놈으로 통합된 핵산은 단리된 것으로 여겨지나, 그의 천연 숙주, 예를 들어 숙주의 게놈 내의 그의 천연 상태의 핵산은 아니다. 단리된 핵산은 실질적으로 정제될 수 있으나 정제될 필요는 없다. 예를 들어, 클로닝 또는 발현 벡터 내에서 단리된 핵산은 그것이 존재하는 세포 내에 오직 적은 양의 백분율의 물질을 포함할 수 있다는 측면에서 순수하지 않다. 그러나, 상기 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, 이러한 핵산은 단리된 것이다.
본 발명의 일부 측면은 프로모터 또는 다른 전사 활성화 요소에 연결된 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 미생물에 요구되는 또는 바람직한 표현형을 부여하는 유전자 산물을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 유전자 산물을 코딩하고 프로모터에 연결된 핵산이 발현 벡터 또는 발현 구축물에 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구축물"은 숙주 미생물, 예를 들어 유지성 효모에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 명시된 핵산 요소를 갖는 재조합으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 구축물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 부분일 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사될 코딩 핵산을 포함한다. 프로모터는 전사될 핵산의 전사를 촉진하는 핵산 요소이다. 프로모터는 프로모터가 전사를 제어하는 핵산 서열의 동일한 가닥 및 상류 (또는 5')에 전형적으로 위치된다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사될 코딩 핵산을 포함한다. 이종 프로모터는 주어진 핵산 서열에 자연적으로 작동가능하게 연결되지 않은 프로모터이다. 예를 들어, 와이. 리폴리티카에서 DGA1 유전자는 와이. 리폴리티카 DGA1 유전자 프로모터에 자연적으로 작동가능하게 연결된다. 그러므로, 예를 들어 발현 구축물에서 DGA1 유전자 또는 그의 부분에 작동가능하게 연결된 야생형 와이. 리폴리티카 DGA1 유전자 프로모터 이외의 임의의 프로모터는 본 문맥에서 이종 프로모터일 것이다. 예를 들어, DGA1 유전자 산물을 코딩하는 핵산에 연결된 TEF1 프로모터는 DGA1 문맥에서 이종 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 핵산, 예를 들어 DGA1, ACC1 및/또는 SCD 유전자 산물을 코딩하는 핵산을 포함한다. 용어 "구성적 프로모터"는 그의 회합된 유전자의 연속적 전사를 허용하는 프로모터를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 핵산, 예를 들어 DGA1, ACC1 및/또는 SCD 유전자 산물을 코딩하는 핵산을 포함한다. 본원에서 용어 "조건성 프로모터"와 교환가능하게 사용되는 용어 "유도성 프로모터"는 오직 생물적 또는 무생물적 인자의 존재 또는 부재 하에 그의 회합된 유전자의 전사를 허용하는 프로모터를 지칭한다. 약물-유도성 프로모터, 예를 들어 테트라시클린/독시시클린 유도성 프로모터, 타목시펜-유도성 프로모터, 뿐만 아니라 활성이 되기 위해 재조합 사건에 의존하는 프로모터 (예를 들어, loxP 부위의 cre-매개 재조합)가 당업계에 익히 공지된 유도성 프로모터의 예이다.
본 개시내용의 일부 측면은 유지성 미생물에서의 이종 프로모터로부터의 주어진 유전자 산물의 과다발현이 각각의 발현 구축물에 인트론을 포함시킴으로써 유의하게 향상될 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 이러한 인트론-향상된 프로모터를 포함하는 유지성 미생물 및 발현 구축물 및 벡터에서 유전자 과다발현을 위한 인트론-향상된 구성적 프로모터를 제공한다. 일부 실시양태에서, TEF 프로모터 서열, 전사 출발 부위, 전사 출발 부위의 하류에 있는 인트론 서열, 및 코딩 핵산 서열, 예를 들어 DGA1, ACC1 및/또는 SCD 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 인트론-향상된 TEF 프로모터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 인트론은 번역 출발 부위의 하류에 위치하나, 유전자 서열의 오픈 리딩 프레임 내에, 예를 들어 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열의 개시 코돈 뒤에, 그러나 종결 부위 앞에 위치한다. 일부 실시양태에서, 인트론은 번역 출발 부위, 예를 들어 ATG 개시 코돈의 바로 하류, 그러나 코딩 서열의 나머지의 상류에 위치된다. 예시 목적을 위해, 인트론-향상된 발현 구축물의 비제한적 예시적인 구조가 하기 제공된다:
5'--TEF 프로모터 -- 전사 출발 부위 -- 인트론 -- DGA1 코딩 서열--3'. 인트론-향상된 발현 구축물의 또 다른 비제한적 예시적인 구조가 하기 제공된다:
5'--TEF 프로모터 -- 전사 출발 부위 - 개시 코돈 -- 인트론 -- DGA1 코딩 서열 -- 정지 코돈 -- 3'. ACC1 및 SCD 유전자 산물에 대한 발현 구축물은 각각 ACC 또는 SCD 코딩 서열에 대해 치환된 DGA1 코딩 서열을 가질 것이다.
적합한 TEF 프로모터 서열, 뿐만 아니라 적합한 인트론 서열은 당업자에게 명백할 것이다. 일부 인트론-희박 TEF 프로모터 서열은 예를 들어 미국 특허 제6,265,185호에 개시되어 있다. 일부 예시적인 대표적 서열이 하기 제공된다. 그러나, 본 발명은 본 측면에 제한되지 않는 것으로 이해될 것이다.
예시적인 TEF 프로모터 서열:
Figure 112014046108244-pct00014
예시적인 인트론 서열:
Figure 112014046108244-pct00015
프로모터와 인트론 서열 사이에 개시 코돈 (ATG)을 포함하는 예시적인 TEF 프로모터-인트론 서열:
Figure 112014046108244-pct00016
발현 벡터 또는 발현 구축물을 미생물, 예를 들어 효모 세포로 전달하는 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 발현 벡터를 포함하는 핵산은 관련 생물학적 분야의 숙련가에게 익히 공지된 다양한 방법에 의해 원핵 및 진핵 미생물로 전달될 수 있다. 본 발명의 일부 측면에 따라 핵산을 미생물로 전달하는 방법은 상이한 화학적, 전기화학적 및 생물학적 접근법, 예를 들어 열 쇼크 형질전환, 전기천공, 형질감염, 예를 들어 리포솜-매개 형질감염, DEAE-덱스트란-매개 형질감염 또는 인산칼슘 형질감염을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, DGA1, ACC1 및/또는 SCD를 코딩하는 핵산 서열의 조합을 포함하는 핵산 구축물, 예를 들어 발현 구축물은 유전 물질을 운반하기 위한 비히클 또는 벡터를 사용하여 숙주 미생물에 도입된다. 유전 물질을 미생물로 운반하기 위한 벡터는 당업자에게 익히 공지되어 있고, 예를 들어 플라스미드, 인공 염색체 및 바이러스 벡터를 포함한다. 구성적 또는 유도성 이종 프로모터, 녹아웃 및 녹다운 구축물을 포함하는 발현 구축물을 포함하는 핵산 구축물의 구축 방법, 뿐만 아니라 미생물에 핵산 또는 핵산 구축물을 전달하기 위한 방법 및 벡터는 당업자에게 익히 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [J. Sambrook and D. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (January 15, 2001)]; [David C. Amberg, Daniel J. Burke; and Jeffrey N. Strathern, Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April 2005)]; [John N. Abelson, Melvin I. Simon, Christine Guthrie, and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volume 194 (Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press (March 11, 2004)]; [Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume 350 (Methods in Enzymology, Vol 350), Academic Press; 1st edition (July 2, 2002)]; [Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C, Volume 351, Academic Press; 1st edition (July 9, 2002)]; [Gregory N. Stephanopoulos, Aristos A. Aristidou and Jens Nielsen, Metabolic Engineering: Principles and Methodologies, Academic Press; 1 edition (October 16, 1998)]; 및 [Christina Smolke, The Metabolic Pathway Engineering Handbook: Fundamentals, CRC Press; 1 edition (July 28, 2009)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 모두 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 요구되는 또는 바람직한 표현형을 미생물에 부여하는 유전자 산물을 코딩하는 유전자의 천연 프로모터, 예를 들어 천연 DGA1, ACC1 또는 SCD 프로모터는 그의 전사 활성의 조절을 변경시키기 위해 미생물에서 변형된다. 일부 실시양태에서, 변형된 프로모터는 그의 비변형된 대응부와 비교하여 증가된 전사 활성을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "변형된 프로모터"는 그의 뉴클레오티드 서열이 인공적으로 변경된 프로모터를 지칭한다. 뉴클레오티드 결실(들), 삽입(들) 또는 돌연변이(들)는 단독으로 또는 조합으로, 이러한 인공 변경의 예이다. 인공 프로모터 변경은 표적화된 방식으로, 예를 들어 상동 재조합 접근법, 예컨대 유전자 표적화, 녹아웃, 녹인, 부위-지정 돌연변이유발, 또는 인공 아연 핑거 뉴클레아제-매개 전략에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 이러한 변경은 무작위 또는 유사-무작위 사건, 예컨대 조사 또는 비-표적화된 뉴클레오티드 통합 및 후속적 선택에 의해 수행될 수 있다. 프로모터 변형은 일반적으로 각각의 프로모터의 전사 활성화 특성을 조정하기 위해 방식화된다. 예를 들어, 상승된 세포내 지방산 수준에 대한 반응으로 DGA1, ACC1 또는 SCD 프로모터의 억압을 매개하는 조절 요소의 분열 또는 결실은 심지어 상승된 세포내 지방산 수준의 조건 하에 각각의 유전자의 연속적 전사 활성화를 초래할 것이다. 유사하게, 구성적으로 활성 전사 활성화제 요소의 조건성 프로모터 영역으로의 삽입은 통상적으로 억제 조건 하에 각각의 유전자의 과다발현에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어 증가된 전사율을 초래하는 표적화된 분열을 위한 미생물에서 천연 프로모터, 예를 들어 천연 DGA1, ACC1 또는 SCD 프로모터의 표적화된 분열을 위한 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다.
본 발명의 일부 측면은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체의 대규모 생산을 위한 요구되는 및/또는 바람직한 표현형을 나타내도록 미생물, 예를 들어 와이. 리폴리티카를 조작하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 일부 측면은 바이오연료 생산을 위해 최적화된 미생물을 수득하기 위한 지질 합성 경로의 대사 공학에 관한 것이다. 본 발명의 일부 측면은 바이오연료 생산을 위해 최적화된 미생물을 수득하기 위해 지질 합성 경로로의 탄소 흐름을 조절하는 유전자의 발현을 조정하는 유전자 변형의 조합을 포함하는 대사 공학에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형의 조합은 푸시 변형 및 풀 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 푸시 변형은 세포에서 지질 합성을 위한 대사물, 아세틸-CoA, ATP 또는 NADPH의 수준을 증가시키는 유전자 변형, 예를 들어 ACC1 유전자 산물의 과다발현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 풀 변형은 피드백 억제 기능을 나타내는 지질 합성의 생성물 또는 중재자, 예를 들어 지방산의 수준을 감소시키는 유전자 변형이다. 일부 실시양태에서, 풀 변형은 DGA1 및/또는 SCD 유전자 산물의 과다발현을 포함한다.
본 발명의 일부 측면은 와이. 리폴리티카의 천연 지질 대사를 조정함으로써 와이. 리폴리티카 매개된 탄소원의 지질로의 전환 효율을 크게 증가시키는 방법을 제공한다. 현저하게 및 예기치 않게, 본 발명에 의해 제공되는 일부 방법에 따른 지질 대사의 푸시-앤드-풀 변형의 조합은 각각 오직 푸시 또는 풀 과정을 조정하는 개별 변형과 비교하여 지질 합성 경로로의 유의하게 증가된 탄소 흐름을 부여한다.
본 발명의 일부 측면은 대규모 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위해 조작된 및/또는 최적화된 미생물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 일부 측면에 의해 제공되는 방법에 의해 또는 핵산 또는 단백질을 이용하여 조작되는 조작된 미생물, 예를 들어 본원에서 제공되는 바와 같은 발현 구축물 또는 발현 구축물의 조합이 제공되며, 지질 합성의 푸시 과정을 매개하는 유전자 산물 (예를 들어, ACC1 생성물) 및 지질 합성의 풀 과정을 매개하는 유전자 산물 (예를 들어, DGA1 및/또는 SCD 유전자 산물)의 조합의 과다발현에 이르게 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 일부 측면에 따라 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 요구되는 및/또는 바람직한 표현형을 미생물에 부여하는 유전자 산물의 푸시-앤드-풀 조합을 과다발현하는 조작된 미생물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 증가된 DGA1, ACC1 및/또는 SCD 유전자 산물 활성을 포함하는 미생물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 미생물은 증가된 지방산 합성 속도, 증가된 TAG 저장, 및/또는 추가의 요구되는 또는 바람직한 형질을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "증가된 합성 속도" 또는 "합성의 증가된 속도"는 미생물 지질 합성의 문맥에서, 예를 들어 본원에 기재된 오일-생성 미생물의 지방산 합성 속도의 문맥에서, 동일한 종의 야생형 미생물에서 상응하는 합성 속도와 비교하여 증가된 조작된 미생물에서의 합성 속도를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 조작된 와이. 리폴리티카 미생물에서의 증가된 TAG 합성 속도는 야생형 와이. 리폴리티카에서의 TAG 합성 속도와 비교하여 증가된 지질 합성 속도를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 증가된 지질 합성 속도, 예를 들어 증가된 TAG 또는 총 지질 합성 속도는 세포의 배양물, 예를 들어 조작된 미생물의 배양물의 지방산 합성 속도를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 증가된 지질 합성 속도는 0.01 g/L/h 이상 (시간 당 배양물 리터 당 지질의 그램), 0.004 g/L/h 이상, 0.05 g/L/h 이상, 0.1 g/L/h 이상, 0.14 g/L/h 이상, 0.15 g/L/h 이상, 0.2 g/L/h 이상, 0.3 g/L/h 이상, 0.4 g/L/h 이상, 0.5 g/L/h 이상, 0.6 g/L/h 이상, 0.7 g/L/h 이상, 0.8 g/L/h 이상, 0.9 g/L/h 이상, 1 g/L/h 이상, 2 g/L/h 이상, 3 g/L/h 이상, 4 g/L/h 이상, 5 g/L/h 이상, 6 g/L/h 이상, 7 g/L/h 이상, 8 g/L/h 이상, 9 g/L/h 이상, 10 g/L/h 이상 또는 25 g/L/h 이상의 지질 합성 속도, 예를 들어 TAG 합성 속도 또는 총 지질 합성 속도이다.
일부 실시양태에서, 본 문맥에서 합성 속도는 생물반응기의 완전 실행에 걸쳐 측정된 합성 속도이며, 예를 들어 생물반응기를 실행한 총 시간 또는 지질 생산을 측정한 총 시간에 걸쳐 합성된 지질, 예를 들어 TAG의 총량으로부터 합성 속도를 계산한다. 본 유형의 합성 속도는 또한 본원에서 종종 "총 지질 생산성" 또는 "전체 지질 생산성"이라고 지칭되고, 전형적으로 g/L/h (실행 시간(시) 당 배양 배지 리터 당 생산된 지질의 그램)으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 조작된 미생물, 예를 들어 야생형 미생물, 예를 들어 야생형 와이. 리폴리티카와 비교하여 총 지질 생산성의 5배 이상 증가, 6배 이상 증가, 7배 이상 증가, 8배 이상 증가, 9배 이상 증가, 10배 이상 증가, 12배 이상 증가, 10배 이상 증가, 12.5배 이상 증가, 15배 이상 증가, 20배 이상 증가, 30배 이상 증가, 40배 이상 증가, 50배 이상 증가, 60배 이상 증가, 70배 이상 증가, 80배 이상 증가, 90배 이상 증가, 100배 이상 증가, 500배 이상 증가 또는 1000배 이상 증가를 나타내는, ACC1 유전자 산물, DGA1 유전자 산물 및/또는 SCD 유전자 산물을 과다발현하는 조작된 와이. 리폴리티카가 제공된다.
일부 실시양태에서, 증가된 총 지질 합성 속도 또는 증가된 총 지질 생산성은 0.01 g/L/h 이상, 0.004 g/L/h 이상, 0.05 g/L/h 이상, 0.1 g/L/h 이상, 0.14 g/L/h 이상, 0.15 g/L/h 이상, 0.2 g/L/h 이상, 0.3 g/L/h 이상, 0.4 g/L/h 이상, 0.5 g/L/h 이상, 0.6 g/L/h 이상, 0.7 g/L/h 이상, 0.8 g/L/h 이상, 0.9 g/L/h 이상, 1 g/L/h 이상, 2 g/L/h 이상, 3 g/L/h 이상, 4 g/L/h 이상 또는 5 g/L/h 이상이다.
일부 실시양태에서, 합성 속도는 예를 들어 최적 성장 조건 및 영양소에 대한 노출 하에 측정된 최대 합성 속도 또는 피크 합성 속도이다. 본 유형의 합성 속도는 또한 본원에서 종종 "최대 지질 생산성"이라고 지칭된다. 일부 실시양태에서, 증가된 최대 지질 합성 속도는 0.2 g/L/h 이상, 0.3 g/L/h 이상, 0.4 g/L/h 이상, 0.5 g/L/h 이상, 0.6 g/L/h 이상, 0.7 g/L/h 이상, 0.8 g/L/h 이상, 0.9 g/L/h 이상, 1 g/L/h 이상, 2 g/L/h 이상, 3 g/L/h 이상, 4 g/L/h 이상, 5 g/L/h 이상, 6 g/L/h 이상, 7 g/L/h 이상, 8 g/L/h 이상, 9 g/L/h 이상, 10 g/L/h 이상 또는 25 g/L/h 이상의 지질 합성 속도, 예를 들어 TAG 합성 속도이다.
일부 실시양태에서, 조작된 미생물은 유지성 효모, 예를 들어 와이. 리폴리티카이다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 조작된 효모는 하나 이상의 매우 바람직하고 예기치 않은 표현형 특징, 예를 들어 증가된 탄소의 오일로의 전환 비율 또는 효율, 지질체에서의 증가된 지질 축적을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 측면에 의해 제공되는 조작된 미생물, 예를 들어 조작된 효모는 약 0.02 g/g (생산된 오일, 지질 또는 TAG g/ 소비된 탄소, 예를 들어 글루코스, 아세테이트 또는 아세트산 g) 내지 약 0.3 g/g의 범위 내의 탄소의 오일로의 전환 비율 (또한 본원에서 "지질 수율"이라고 지칭됨)을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 측면에 의해 제공되는 조작된 미생물, 예를 들어 조작된 효모는 약 0.010 g/g, 약 0.02 g/g, 약 0.025 g/g, 약 0.03 g/g, 약 0.04 g/g, 약 0.05 g/g, 약 0.06 g/g, 약 0.07 g/g, 약 0.075 g/g, 약 0.08 g/g, 약 0.09 g/g, 약 0.1 g/g, 약 0.11 g/g, 약 0.12 g/g, 약 0.13 g/g, 약 0.14 g/g, 약 0.15 g/g, 약 0.16 g/g, 약 0.17 g/g, 약 0.18 g/g, 약 0.19 g/g, 약 0.2 g/g, 약 0.21 g/g, 약 0.22 g/g, 약 0.23 g/g, 약 0.24 g/g, 약 0.25 g/g, 약 0.26 g/g, 약 0.27 g/g, 약 0.28 g/g, 약 0.29 g/g, 약 0.3 g/g, 약 0.31 g/g, 약 0.32 g/g 또는 근접 이론값의 탄소의 오일로의 전환 비율을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 측면에 의해 제공되는 조작된 미생물, 예를 들어 조작된 효모는 약 0.010 g/g 이상 (생산된 지질 g/ 소비된 탄소, 예를 들어 글루코스, 아세테이트 또는 아세트산 g), 약 0.02 g/g 이상, 약 0.025 g/g 이상, 약 0.03 g/g 이상, 약 0.04 g/g 이상, 약 0.05 g/g 이상, 약 0.06 g/g 이상, 약 0.07 g/g 이상, 약 0.075 g/g 이상, 약 0.08 g/g 이상, 약 0.09 g/g 이상, 약 0.1 g/g 이상, 약 0.11 g/g 이상, 약 0.12 g/g 이상, 약 0.13 g/g 이상, 약 0.14 g/g 이상, 약 0.15 g/g 이상, 약 0.16 g/g 이상, 약 0.17 g/g 이상, 약 0.18 g/g 이상, 약 0.19 g/g 이상, 약 0.2 g/g 이상, 약 0.21 g/g 이상, 약 0.22 g/g 이상, 약 0.23 g/g 이상, 약 0.24 g/g 이상, 약 0.25 g/g 이상, 약 0.26 g/g 이상, 약 0.27 g/g 이상, 약 0.28 g/g 이상, 약 0.29 g/g 이상, 약 0.3 g/g 이상, 약 0.31 g/g 이상, 약 0.32 g/g 또는 근접 이론값의 탄소의 오일로의 전환 비율을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "지질 역가"는 미생물 지질 합성의 문맥에서, 예를 들어 본원에 기재된 오일-생성 미생물의 지방산 합성의 문맥에서, 오일-생성 미생물을 포함하는 미생물 배양물의 부피 당 합성된 지질의 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 미생물, 예를 들어 조작된 와이. 리폴리티카 미생물은 1 g/L 이상 (미생물 배양물 리터 당 지질 그램), 2 g/L 이상, 3 g/L 이상, 4 g/L 이상, 5 g/L 이상, 6 g/L 이상, 7 g/L 이상, 8 g/L 이상, 9 g/L 이상, 10 g/L 이상, 15 g/L 이상, 20 g/L 이상, 25 g/L 이상, 30 g/L 이상, 40 g/L 이상, 50 g/L 이상, 60 g/L 이상, 70 g/L 이상, 80 g/L 이상, 90 g/L 이상, 100 g/L 이상, 200 g/L 이상 또는 250 g/L 이상의 지질 역가를 달성할 수 있거나 달성한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 조작된 미생물은 탄소의 오일로의 전환 동안 증가된 지질 역가를 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "증가된 지질 역가"는 미생물 지질 합성의 문맥에서, 예를 들어 본원에 기재된 오일-생성 미생물의 지방산 합성의 문맥에서, 동일한 조건하에 (예를 들어, 동일한 C/N 비, 동일한 산소 양, 동일한 pH, 동일한 영양소 등을 갖는 동일한 성장 배지에서) 동일한 종의 야생형 미생물의 상응하는 지질 역가와 비교하여 증가된 오일-생성 미생물을 포함하는 미생물 배양물의 부피 당 합성된 지질의 양을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 조작된 와이. 리폴리티카 미생물에 의해 달성되는 증가된 지질 역가는 동일한 조건 하에 야생형 와이. 리폴리티카에 의해 달성될 수 있는 지질 역가와 비교하여 증가된 지질 역가를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 증가된 지질 역가는 1 g/L 이상 (미생물 배양물 리터 당 지질 그램), 2 g/L 이상, 3 g/L 이상, 4 g/L 이상, 5 g/L 이상, 6 g/L 이상, 7 g/L 이상, 8 g/L 이상, 9 g/L 이상, 10 g/L 이상, 15 g/L 이상, 20 g/L 이상, 25 g/L 이상, 30 g/L 이상, 40 g/L 이상, 50 g/L 이상, 60 g/L 이상, 70 g/L 이상, 80 g/L 이상, 90 g/L 이상, 100 g/L 이상, 200 g/L 이상 또는 250 g/L 이상의 지질 역가를 지칭한다.
본 발명의 일부 측면은 발효성 당, 예를 들어 C6 당, 예컨대 글루코스, 및 유기 산, 예를 들어 아세트산 및/또는 그의 염, 예를 들어 아세테이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 탄소원을 사용할 수 있는 오일 생산을 위한 조작된 미생물을 제공한다.
본 발명의 일부 측면은 본원에서 제공되는 유전적으로 변형된 미생물의 배양물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 배양물은 본원에서 제공되는 유전적으로 변형된 미생물 및 배지, 예를 들어 액체 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 배양물은 본원에서 제공되는 유전적으로 변형된 미생물 및 탄소원, 예를 들어 발효성 탄수화물 공급원, 또는 유기 산 또는 그의 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 배양물은 본원에서 제공되는 유전적으로 변형된 미생물, 및 생존, 성장, 및/또는 미생물에 의한 탄수화물의 바이오연료 또는 바이오연료 전구체로의 전환에 순종적인, 염도, 오스몰농도 및 pH의 조건을 확립하는 염 및/또는 완충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 배양물은 추가의 성분, 예를 들어 첨가제를 포함한다. 첨가제의 비제한적 예는 영양소, 효소, 아미노산, 알부민, 성장 인자, 효소 억제제 (예를 들어, 프로테아제 억제제), 지방산, 지질, 호르몬 (예를 들어, 덱사메타손 및 지베렐산), 미량 원소, 무기 화합물 (예를 들어, 환원제, 예컨대 망가니즈), 산화환원-조절제 (예를 들어, 항산화제), 안정화제 (예를 들어, 디메틸술폭시드), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 젤라틴, 항생제 (예를 들어, 브레펠딘 A), 염 (예를 들어, NaCl), 킬레이트제 (예를 들어, EDTA, EGTA), 및 효소 (예를 들어, 셀룰라제, 디스파제, 히알루로니다제, 또는 DNase)이다. 일부 실시양태에서, 상기 배양물은 조건성 또는 유도성 프로모터로부터 전사를 유도하거나 억제하는 약물, 예를 들어 독시시클린, 테트라시클린, 타목시펜, IPTG, 호르몬 또는 금속 이온을 포함할 수 있다.
특정 배양 조건, 예를 들어 탄소원의 농도는 배양될 각각의 조작된 미생물에 의존적인 반면, 미생물 배양물의 생성을 위한 일반적 방법 및 배양 조건은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [J. Sambrook and D. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (January 15, 2001)]; [David C. Amberg, Daniel J. Burke; and Jeffrey N. Strathern, Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April 2005)]; [John N. Abelson, Melvin I. Simon, Christine Guthrie, and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volume 194 (Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press (March 11, 2004)]; [Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume 350 (Methods in Enzymology, Vol 350), Academic Press; 1st edition (July 2, 2002)]; 및 [Christine Guthrie and Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C, Volume 351, Academic Press; 1st edition (July 9, 2002)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 모두 본원에 참고로 포함된다. 오일 생산을 위해, 본원에 기재된 조작된 미생물의 배양물은 당업계에 공지된 바와 같이 오일 축적에 적합한 조건 하에 배양된다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 미생물은 동일한 종류의 야생형 미생물 및/또는 다른 미생물, 예를 들어 탄소원의 바이오연료 또는 바이오연료 전구체로의 전환을 위한 미생물 배양물을 오염시키는 것으로 흔히 발견되는 미생물보다 성장 이점을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 측면에 의해 제공되는 조작된 미생물의 성장 및/또는 증식 이점은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 비-멸균 배양 및 발효 조건의 이용 가능성으로 환언되며, 이는 오염 미생물에 의한 배양물 과도성장의 문제점이 경감되거나 완전히 없어지기 때문이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 측면에 의해 제공되는 조작된 미생물은 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 비-멸균 조건 하에 배양된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 비-멸균 공급원료, 비-멸균 배양 배지, 비-멸균 보충물, 또는 비-멸균 생물반응기 (예를 들어, 비-멸균 조건 하의 개방 반응기)가 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위해 사용된다.
다양한 상이한 미생물, 예를 들어 효모, 예컨대 유지성 효모, 박테리아, 조류 및 진균의 다양한 공급원으로부터의 미생물은 본 발명의 일부 측면에 따라 유전적으로 변형되고 산업-규모 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위해 사용될 수 있다. 적합한 효모 세포의 비제한적 예는 야로위아 리폴리티카, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 에스. 바야누스(S. bayanus), 에스. 케이. 락티스(S. K. lactis), 왈토미세스 리포페르. 모르티에렐라 알피네(Waltomyces lipofer . Mortierella alpine), 모르티에렐라 이사벨리나(Mortierella isabellina), 한세눌라 폴리모르파.(Hansenula polymorpha.), 뮤코르 로욱시이(Mucor rouxii), 트리코스포론 쿠타네우(Trichosporon cutaneu), 로도토룰라 글루티니스 사카로미세스 디아스타시쿠스(Rhodotorula glutinis Saccharomyces diastasicus), 슈와니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) 및 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로부터의 세포이다. 적합한 박테리아의 비제한적 예는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라(Salmonella), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 스트렙토미세스(Streptomyces), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 로도코쿠스(Rhodococcus) 종, 스트렙토미세스(Streptomyces) 종 및 알칼리게네스(Alcaligenes) 종이다. 적합한 진균 세포의 비제한적 예는 예를 들어 아스페르길루스 쉬로우사미이(Aspergillus shirousamii), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 및 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei)와 같은 종으로부터 배양될 수 있다. 적합한 조류 세포의 비제한적 예는 네오클로리스 올레오아분단스(Neochloris oleoabundans), 세네데스무스 오블리쿠우스(Scenedesmus obliquus), 난노클로롭시스(Nannochloropsis) 종, 두날리엘라 테르티올렉타(Dunaliella tertiolecta), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 에메르소니이(Chlorella emersonii) 및 스피룰리나 막시마(Spirulina maxima)로부터의 세포이다.
본 발명의 일부 측면은 본원에서 제공되는 유전적으로 변형된 미생물을 이용하여 바이오연료 또는 바이오연료 전구체를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이오연료 또는 바이오연료 전구체를 산업 규모로 생산하는 방법이 제공된다.
다양한 탄소원은 본원에서 제공되는 방법 및/또는 유전적으로 변형된 미생물을 이용하여 바이오연료 또는 바이오연료 전구체로 전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 탄수화물을 포함한다. 당, 전분 및 섬유는 본원에서 제공되는 전환 방법에 적합한 탄수화물 공급원의 비제한적 예이다. 본 발명의 일부 측면에 따라, 탄수화물 공급원은 정제당 및/또는 비정제당, 전분, 및/또는 섬유, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 당의 비제한적 예는 발효성 당, 예컨대 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 크실로스 및 락토스이다. 전분의 비제한적 예는 아밀라제 및 아밀로펙틴이다. 섬유의 비제한적 예는 식물 섬유, 예컨대 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 목재 섬유이다. 본 발명의 일부 측면은 탄소원으로서 산업 부산물, 중간체 또는 폐기물, 예를 들어 비가공 식물 추출물, 당밀, 여물 또는 하수의 사용에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 탄소원은 조류로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 조류 바이오매스는 구체적으로 미생물-매개 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산에서 탄소원으로서 사용하기 위해 생산된다.
일부 실시양태에서, 탄소원으로서 저렴하고 풍부하고 쉽게 이용가능한 탄소원 공급원료를 사용하는 것을 포함하는, 바이오연료 또는 바이오연료 전구체의 생산 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스가 탄소원으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스는 산업 부산물 또는 폐기물로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스는 식물 또는 조류 바이오매스로부터 직접 유래된다. 식물 또는 조류 바이오매스는 가장 풍부한 공급원료 중 하나이고, 상당한 양의 비-발효성 당 및 섬유, 예를 들어 셀룰로스 및 헤미-셀룰로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이오매스 공급원료는 비-발효성 당 또는 섬유를 발효성 당으로 전환시키도록 전처리되어, 미생물 성장 및 미생물-매개 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산에 이용가능하게 된다. 일부 실시양태에서, 바이오매스 공급원료의 전처리는 당업자에게 공지된 전처리 방법, 예를 들어 묽은 산 또는 암모니아 섬유 확장 (AFEX) 방법을 이용하여 셀룰로스 및/또는 헤미셀룰로스 성분을 단량체 당으로 탈중합하는 것을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Yang B, Wyman CE. Dilute acid and autohydrolysis pretreatment. Methods Mol Biol. 2009;581:103-14]; [Balan V, Bals B, Chundawat SP, Marshall D, Dale BE, Lignocellulosic biomass pretreatment using AFEX Methods Mol Biol. 2009;581:61-77] 참조). 바이오매스 중합체를 단량체 당으로 탈중합하는 다른 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 본 발명의 일부 실시양태에서 사용되는 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 비-발효성 당을 함유하는 바이오매스 공급원료는 비-발효성 당을 단량체성 발효성 당으로 탈중합하는 묽은 산 방법을 이용하여 전처리된다. 일부 실시양태에서, 바이오매스는 적당히 온화한 온도에서 규정된 시간의 기간 동안 묽은 황산으로 처리된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 바이오매스는 약 0.5％, 약 1％, 약 2％, 약 3％, 약 4％, 약 5％ 또는 약 6％ 황산으로 처리된다. 일부 실시양태에서, 바이오매스는 약 30℃, 약 37℃, 약 40℃, 약 50℃, 약 60℃, 약 70℃, 약 80℃, 약 90℃, 약 100℃, 약 110℃, 약 120℃, 약 130℃, 약 140℃, 약 150℃, 약 175℃, 약 200℃에서 또는 약 200℃ 초과에서 처리된다.
일부 실시양태에서, 생성된 가수분해물은 불용성 리그닌 및 가용성 셀룰로스성 및 헤미셀룰로스성 중합체를 함유한다. 후자 생성물은 당업자에게 익히 공지된 방법, 예를 들어 셀룰라제 또는 다른 가수분해 효소를 이용한 처리에 의해 헥소스 및 펜토스 당, 예컨대 글루코스 및 크실로스 단량체를 생성하도록 추가로 처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 묽은 산에 의한 비-발효성 당의 전처리는 성장을 억제하고, 생존력을 감소시키고/거나 본 발명의 측면에 따라 조작되지 않은 미생물의 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 억제하는 독성 화합물을 포함하는 부산물의 생성을 초래한다. 일부 실시양태에서, 전처리된 공급원료는 세척되고, 미생물 성장 및 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 지지하는 배지로 보충되고/거나, 해독을 위해 과다석회화(over-liming)된다.
일부 실시양태에서, 비-발효성 당을 함유하는 바이오매스 공급원료는 비-발효성 당을 단량체성 발효성 당으로 탈중합하는 AFEX 방법을 이용하여 전처리된다. 일부 실시양태에서, 바이오매스는 고온 및 고압에서 규정된 시간의 기간 동안 액체 암모니아로 처리된다. 일부 실시양태에서, 바이오매스는 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분, 약 60분, 약 70분, 약 80분, 약 90분 동안 또는 더 오랫동안 처리된다. 일부 실시양태에서, 바이오매스는 약 30℃, 약 37℃, 약 40℃, 약 50℃, 약 60℃, 약 70℃, 약 80℃, 약 90℃, 약 100℃, 약 110℃, 약 120℃, 약 130℃, 약 140℃, 약 150℃, 약 175℃, 약 200℃에서 또는 약 200℃ 초과에서 처리된다. 일부 실시양태에서, AFEX 전처리는 공급원료에 함유된 결정질 셀룰로스의 무정형 발효성 형태로의 전환을 초래한다. 일부 실시양태에서, AFEX 전처리된 바이오매스 공급원료는 미생물 성장 및/또는 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 억제하는 상당한 양의 독성 부산물을 함유하지 않고, 미생물 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 해독 전에 해독 없이 사용된다.
일부 실시양태에서, 전처리된 또는 전처리되지 않은 바이오매스 공급원료는 당 중합체를 가수분해하거나 탈중합하는 효소, 예를 들어 셀룰라제 또는 헤미셀룰라제 효소로 처리된다. 일부 실시양태에서, 공급원료는 액체 상에서 효소와 접촉되고, 효소가 바이오매스 공급원료 중 상당한 양의 비-발효성 당 또는 섬유를 가수분해하거나 탈중합하기에 충분한 시간 동안 탈중합 또는 가수분해 반응을 촉매하게 하는 온도에서 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 가용성 발효성 당 분획을 함유하는, 효소와 접촉되는 공급원료의 액체 상은 가수분해 및 탈중합을 위한 인큐베이션 후에 비-발효성 당 및 섬유를 포함하는 고체 상으로부터 예를 들어 원심분리에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 공급원료의 액체 분획은 후속적으로 바이오연료 또는 바이오연료 전구체로의 전환을 위한 미생물, 예를 들어 본 발명의 측면에 의해 제공되는 미생물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 비-발효성 당 또는 섬유의 효소적 전환은 통합된 바이오프로세스에서, 예를 들어 생산된 발효성 당의 바이오연료 또는 바이오연료 전구체로의 미생물적 전환에서와 동일한 시간 및/또는 동일한 반응기에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 효소적 전환이 먼저 수행되고, 효소와 접촉된 공급원료는 후속적으로 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산을 위한 미생물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 효소적 및 미생물적 전환은 동일한 시간 및 동일한 반응기에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 조작된 미생물, 예를 들어 DGA1, ACC1 및/또는 SCD 유전자 산물을 과다발현하는 야로위아 리폴리티카는 주요 탄소원으로서 아세테이트 상에서 성장된다. 일부 실시양태에서, 미생물은 약 1％, 약 2％, 약 3％, 약 4％, 약 5％, 약 6％, 약 7％, 약 8％, 약 9％, 약 10％ vol/vol, 약 20％ vol/vol, 약 25％ vol/vol 또는 약 30％ vol/vol의 농도를 갖는 아세트산 용액에서 성장된다. 일부 실시양태에서, 아세테이트 농도는 약 3％ 내지 10％ wt/vol이다. 일부 실시양태에서, 주요 탄소원으로서 아세테이트 또는 아세트산 상에서 배양된 본원에서 제공되는 바와 같은 유전적으로 변형된 미생물을 포함하는 세포 배양물은 글리세롤과 접촉되거나 "스파이킹(spiking)"된다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 미생물은 글리세롤과 간헐적으로 접촉된다. 일부 실시양태에서, 미생물은 글리세롤과 연속적으로 또는 반연속적으로 접촉된다. 일부 실시양태에서, 미생물은 약 0.5％, 약 1％, 약 2％, 약 3％, 약 4％ 또는 약 5％ vol/vol 농도의 글리세롤과 접촉된다. 본원에서 제공되는 조작된 미생물을 글리세롤과 접촉시키는 것은 TAG의 생산을 위한 대사물, 뿐만 아니라 탄수화물로부터 지방산의 생산을 위한 환원 모이어티를 제공한다. 일부 실시양태에서, 글리세롤 스파이킹(spiking)은 아세테이트 이외의 탄소원, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 탄소원을 사용하는 바이오연료 또는 바이오연료 전구체 생산 방법에서 수행된다.
일부 실시양태에서, DGA1 유전자 산물, 및/임의로 ACC1 및/또는 SCD 유전자 산물을 과다발현하는 본원에서 제공되는 조작된 미생물, 예를 들어 야로위아 리폴리티카는, 예를 들어 배양물 중에서 소정의 시간 이후, 예를 들어 8시간 이후, 24시간 이후 또는 48시간 이후에 미생물을 추가량의 탄소원과 접촉시키거나, 또는 소정 양의 추가의 탄소원과 접촉시켜 성장 프로세스 또는 배양 기간 동안 보충되는 탄소원, 예를 들어 아세테이트 또는 아세트산 상에서 성장된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조작된 미생물은, 먼저 예를 들어 낮은 탄소 대 질소 (C/N) 비, 예를 들어 약 10, 약 20, 약 25, 약 30, 30 미만, 25 미만, 또는 20 미만의 C/N 비를 포함하는 배양 배지에서 최초 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66 또는 72시간 동안 성장된다. 일부 실시양태에서, 낮은 C/N 비는 원하는 C/N 비를 얻기 위해 배양 배지에 질소 공급원, 예를 들어 암모니아를 보강하여 달성된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 탄소원, 예를 들어 아세테이트 또는 아세트산이 본원에서 기재된 것과 같은 오일-생성 미생물의 배양물에 공급되는 실시양태에서, 탄소원은 질소 공급원, 예를 들어 암모니아로 보강되어 있다. 일부 실시양태에서, 질소 공급원의 보강은 배양물 중에서 초기 기간 이후에, 예를 들어 배양물 중에서 최초 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66 또는 72시간 동안 이후에 중지되어, 이에 따라 배양물 중의 조작된 미생물이 질소 공급원을 소비하도록 하고, 이는 결과적으로 C/N 비의 증가를 유발한다. 이러한 C/N 비의 변화는 질소 공급원이 보강되지 않은 추가의 탄소원의 배양물에의 공급에 의해, 예를 들어 암모니아 또는 임의의 다른 질소 공급원이 보강되지 않은 아세트산 또는 아세테이트의 공급에 의해 늘어나거나 또는 빨라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기재된 조작된 미생물에 의한 오일 생산을 위한 최적의 C/N 비는 80 내지 120의 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, 대규모 미생물-매개 탄수화물 -> 지질 전환을 위한 발효 공정은 생물반응기에서 수행될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "생물반응기" 및 "발효기" (이는 상호교환적으로 사용됨)는 생물학적 및/또는 화학 반응이 일어나는 외장(enclosure) 또는 부분적 외장을 의미하며, 이의 적어도 일부는 살아있는 유기체 또는 살아있는 유기체의 일부분을 포함한다. "대규모 생물반응기" 또는 "공업적 규모 생물반응기"는 생성물, 예를 들어 바이오연료 또는 바이오연료 전구체, 예를 들어 지방산 및/또는 TAG를 상업적 또는 준-상업적 규모로 생성하기 위해 사용되는 생물반응기이다. 통상적으로, 대규모 생물반응기는 리터, 수백 리터, 수천 리터 또는 그 이상의 범위의 부피를 갖는다.
본 발명의 측면에 따른 생물반응기는 미생물 또는 미생물 배양물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물반응기는 본 발명의 측면에 의해 제공되는, 예를 들어 건조 상태로 제공되는 임의의 단리된 미생물의 포자 및/또는 임의의 종류의 휴면 세포 유형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 탄수화물 공급원을 이러한 생물반응기에 추가하는 것은 휴면 세포의 활성화, 예를 들어 효모 포자의 발아, 및 후속적인 탄수화물 공급원의 적어도 부분적으로 바이오연료 또는 바이오연료 전구체로의 전환을 유발할 수 있다.
본 발명의 측면에 따른 일부 생물반응기는 세포 배양 시스템을 포함할 수 있으며, 여기서 미생물은 이동하는 액체 및/또는 기포와 접촉 상태에 있다. 본 발명의 측면에 따른 미생물 또는 미생물 배양물은 현탁액 중에서 성장되거나 또는 고체 상 담체에 부착되어 성장될 수 있다. 담체 시스템의 비제한적 예에는 마이크로담체 (예를 들어, 다공성 또는 비-다공성일 수 있는 중합체 구, 마이크로비드 및 마이크로디스크), 특정 화학적 기 (예를 들어, 3급 아민 기)가 도입된 가교 비드 (예를 들어, 덱스트란), 비다공성 중합체 섬유에 포획된 세포를 포함하는 2D 마이크로담체, 3D 담체 (예를 들어, 다공성 섬유를 포함할 수 있는 담체 섬유, 중공 섬유, 다중 카트리지 반응기 및 반투과성 막), 감소된 이온 교환 능력을 갖는 마이크로담체, 캡슐화 세포, 모세관, 및 응집체가 포함된다. 담체는 덱스트란, 젤라틴, 유리 및 셀룰로스와 같은 물질로부터 제작할 수 있다.
본 발명의 측면에 따른 공업적 규모 탄수화물 -> 지질 전환 프로세스는 연속, 반-연속 또는 비-연속 모드로 작동될 수 있다. 본 발명에 따른 작동 모드의 비제한적 예에는 회분배양, 유가배양, 장기 회분배양(extended batch), 반복 회분배양(repetitive batch), 배출/유입, 회전-벽, 회전 플라스크(spinning flask), 및/또는 관류 작동 모드가 있다.
일부 실시양태에서, 생물반응기는 기질 스톡, 예를 들어 탄수화물 공급원의 연속 또는 반-연속 보충, 및/또는 반응기로부터 생성물, 예를 들어 분비된 지질, 지질을 포함하는 유기 상, 및/또는 원하는 지질 함량을 나타내는 세포의 연속 또는 반-연속 분리를 가능하게 하도록 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 생물반응기의 비제한적인 예에는 교반 탱크 발효기, 회전식 혼합 장치에 의해 교반되는 생물반응기, 케모스타트(chemostat), 진탕 장치에 의해 교반되는 생물반응기, 에어리프트 발효기, 충전층 반응기, 고정층 반응기, 유동층 생물반응기, 파동 유발 교반을 이용하는 생물반응기, 원심성 생물반응기, 롤러 병, 및 중공 섬유 생물반응기, 롤러 장치 (예를 들어, 벤치탑(benchtop), 카트-탑재 및/또는 자동화된 종류), 수직-적층된 플레이트, 스피너 플라스크, 교반 또는 진동 플라스크, 진탕 멀티웰 플레이트, MD 병, T-플라스크, 럭스(Roux) 병, 다중-표면 조직 배양 번식기, 변형된 발효기, 및 코팅된 비드 (예를 들어, 세포 부착을 방지하기 위한, 혈청 단백질, 니트로셀룰로스 또는 카르복시메틸 셀룰로스로 코팅된 비드)가 있다.
본 발명의 측면에 따른 생물반응기 및 발효기는 반응 파라미터를 측정하고/거나 조절하기 위한 센서 및/또는 제어 시스템을 임의로 포함할 수 있다. 반응 파라미터의 비제한적인 예에는 생물학적 파라미터, 예를 들어 성장 속도, 세포 크기, 세포수, 세포 밀도, 세포 유형 또는 세포 상태, 화학적 파라미터, 예를 들어 pH, 산화환원-전위, 반응 기질 및/또는 생성물의 농도, 용해된 기체의 농도, 예컨대 산소 농도 및 CO2 농도, 영양소 농도, 대사물 농도, 글루코스 농도, 글루타민 농도, 피루베이트 농도, 인회석 농도, 올리고펩티드의 농도, 아미노산의 농도, 비타민의 농도, 호르몬의 농도, 첨가제의 농도, 혈청 농도, 이온 강도, 이온의 농도, 상대 습도, 몰농도, 오스몰농도, 기타 화학물질, 예를 들어 완충제, 아주반트 또는 반응 부산물의 농도, 물리적/기계적 파라미터, 예를 들어 밀도, 전도도, 교반 정도, 압력, 및 유속, 전단 응력, 전단 속도, 점도, 색상, 탁도, 광 흡수, 혼합 속도, 전환 비율, 및 또한 열역학적 파라미터, 예컨대 온도, 광 강도/품질 등이 있다.
본원에서 기재된 파라미터를 측정할 수 있는 센서는 관련 기계 및 전자 분야의 업자들에게 잘 알려져 있다. 본원에 기재된 센서로부터의 입력 사항을 기초로 하여 생물반응기에서의 파라미터를 조절할 수 있는 제어 시스템은 생물반응기 공학 분야의 업자들에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 측면에 따른 바이오연료 또는 바이오연료 전구체로의 전환을 위해 이용되는 탄소원의 유형은 이용되는 특정 미생물에 따라 결정된다. 본 발명의 측면에 따라 제공되는 일부 미생물은 특정 탄수화물 공급원을 효율적으로 전환할 수 있지만, 반면 상이한 탄수화물 공급원은 동일한 미생물에 의해 높은 효율로 처리될 수 없거나 또는 전혀 처리될 수 없다. 본 발명의 측면에 따르면, 유지성 효모 와이. 리폴리티카는 예를 들어 당, 예컨대 글루코스, 프룩토스, 수크로스 및/또는 락토스, 및 당의 함유량이 높은 탄수화물 공급원, 예를 들어 당밀 및 식물 섬유를 지방산 및 그의 유도체로 효율적으로 전환시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 탄소원 원료로부터 생성된 바이오연료 또는 바이오연료 전구체, 예를 들어 지방산 또는 트리아실글리세롤은 적어도 부분적으로 본 발명의 측면에 의해 제공되는 미생물, 예를 들어 유지성 효모, 예컨대 와이. 리폴리티카 세포에 의해 분비된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 측면에 의해 제공되는 미생물을 생물반응기에서 수용액 중 탄수화물 공급원과 접촉시키며, 분비된 바이오연료 또는 바이오연료 전구체는 수성 상으로부터 분리될 수 있는 유기 상을 형성한다. 본원에서 사용되는 용어 유기 상은 비-극성 유기 화합물, 예를 들어 지방산, TAG 및/또는 다른 비-극성 지질을 포함하는 액체 상을 의미한다. 또한, 본 발명에 따른 유기 상은 미생물, 탄수화물, 또는 각각의 생물반응기에서 발견되는 다른 상에서 발견되는 다른 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 공업적 규모 상 분리에 유용한 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 유기 상은 연속적 또는 반-연속적으로 사이포닝된다. 일부 실시양태에서, 유기 상을 연속적으로 또는 반-연속적으로 추출하는 분리기를 포함하는 생물반응기가 이용된다.
일부 실시양태에서, 바이오연료 또는 바이오연료 전구체는 본 발명의 측면에 따른 세포에 축적된다. 일부 실시양태에서, 바람직한 양의 바이오연료 또는 바이오연료 전구체가 축적된 세포는 예를 들어 원심분리, 침강 또는 여과에 의해 생물반응기로부터 연속적으로 또는 반-연속적으로 분리된다. 추가적으로, 세포 분리는 예를 들어 물리적 세포 특성, 예컨대 세포 크기 또는 밀도의 변화를 기초로 당업자들에게 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 후속적으로, 축적된 바이오연료 또는 바이오연료 전구체는 당업자들에게 잘 알려진 표준 추출 방법, 예를 들어 용매 헥산 추출을 사용하여 각각의 세포로부터 추출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 미생물 세포를 수집하고, 수집된 세포 부피의 헥산으로 3회 추출한다. 일부 실시양태에서, 추출된 바이오연료 또는 바이오연료 전구체를 추가로 정제한다. 일부 실시양태에서, 바이오연료 전구체, 예를 들어 트리아실글리세롤은 당업자들에게 잘 알려진 방법, 예를 들어 에스테르교환 절차를 사용하여 바이오연료, 예를 들어 바이오디젤로 전환시킨다.
본 발명의 상기 실시양태 및 다른 실시양태의 기능 및 이점은 하기 실시예로부터 보다 완전하게 이해될 것이다. 하기 실시예는 본 발명의 이익을 예시하려고 하지만, 본 발명의 전체 범주를 예시하려고 하지는 않는다. 따라서, 실시예 섹션은 본 발명의 범주를 제한하려고 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다.
실시예
실시예 1.
물질 및 방법
효모 균주, 성장, 및 배양 조건
본 연구에서 사용된 와이. 리폴리티카 균주는 야생형 와이.　리폴리티카 W29 균주 (ATCC20460)로부터 유래되었다. 모든 형질전환에서 사용된 영양요구성 Po1g (Leu-)는 이스턴 바이오테크 컴퍼니(Yeastern Biotech Company; 대만 타이페이(Taipei, Taiwan) 소재)로부터 수득하였다. 본 연구에서 사용된 모든 균주는 하기 표 1에 열거되어 있다.
표 1. 와이. 리폴리티카 균주에 대한 전체 지방산 함량, 수율 및 분포. 전체 지방산 함량은 100시간 이후 50 mL 배양물에 대하여 평균 ± S.D. (n = 3)로 주어진다 (20의 C/N 몰비). 지방산 프로파일은 전체 지방산에 대한 지방산의 백분율로서 주어지며, 오차는 2.5％ 미만이다.
Figure 112014046108244-pct00017
에스케리키아 콜라이에 대한 배지 및 성장 조건은 문헌 [Sambrook et al.(21)]에 이미 기재되어 있으며, 와이. 리폴리티카에 대해서는 문헌 [Barth and Gaillardin(11)]에 이미 기재되어 있다. 풍부 배지 (YPD)는 20 g/L 박토(Bacto) 펩톤 (디프코 래보러토리즈(Difco Laboratories; 미국 미시건주 디트로이트(Detroit, MI) 소재)), 10 g/L 효모 추출물 (디프코), 20 g/L 글루코스 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich; 미국 미주리주 세인트 루이스(St. Louis, MO) 소재))로 제조하였다. YNB 배지는 1.7 g/L 효모 질소 베이스 (아미노산 없음) (디프코), 0.69 g/L CSM-Leu (MP 바이오메디칼스(MP Biomedicals; 미국 오하이오주 솔론(Solon, OH) 소재)) 및 20 g/L 글루코스로 제조하였다. 선택적 YNB 플레이트는 1.7 g/L 효모 질소 베이스 (아미노산 없음), 0.69 g/L CSM-Leu, 20 g/L 글루코스 및 15 g/L 박토 한천 (디프코)을 함유하였다.
하기 배지를 사용하여 진탕 플라스크 실험을 수행하였다: 1.7 g/L 효모 질소 베이스 (아미노산 없음), 1.5 g/L 효모 추출물 및 50 g/L 글루코스. 동결된 스톡으로부터, 전배양물을 YNB 배지 (팔콘(Falcon) 튜브 중 5 mL, 200 rpm, 28℃, 24시간)에 접종하였다. 밤샘 배양물을 250 mL 에를렌마이어 진탕 플라스크 내의 50 mL의 배지에 0.05의 광학 밀도 (A600)로 접종하고, 100시간 (200 rpm, 28℃) 동안 인큐베이션하고, 이후 바이오매스, 당 함량 및 지질 함량을 취하고 분석하였다.
생물반응기 규모 발효를 2-리터 배플 교반-탱크 생물반응기에서 수행하였다. 사용된 배지는 1.5 g/L 효모 질소 베이스 (아미노산 및 황산암모늄 없음), 2 g/L 황산암모늄, 1 g/L 효모 추출물 및 90 g/L 글루코스를 함유하였다. 선택적 플레이트로부터, 초기 전배양물을 YPD 배지 (250 mL 에를렌마이어 플라스크 중 40 mL, 200 rpm, 28℃, 24시간)에 접종하였다. 밤샘 전배양물로부터 기하급수적으로 성장한 세포를 2-L 반응기 (2.5 vvm 통기, pH 6.8, 28℃, 250 rpm 교반)에서 0.1의 광학 밀도 (A600)로 생물반응기 내로 옮겼다. 시점 샘플을 후속의 지질 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다. 당 유기 산 함량을 HPLC에 의해 측정하였다. 2일밤 동안 60℃에서 건조된 샘플로부터 중량적으로 측정하여 바이오매스를 측정하였다.
플라스미드 구축
본 연구 전반에 걸쳐 표준 분자 유전적 기술을 이용하였다 (21). 클로닝에 사용되는 제한 효소 및 퓨전 고-정확성 (Phusion High-Fidelity) DNA 폴리머라제는 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs; 미국 메사추세츠주 입스위치 (Ipswich, MA) 소재)로부터 수득하였다. 효모 형질전환체로부터의 게놈 DNA는 이스타 게노믹 (Yeastar Genomic) DNA 키트 (자이모 리서치 (Zymo Research; 미국 캘리포니아주 어바인(Irvine, CA) 소재))를 사용하여 제조하였다. 모든 구축된 플라스미드는 서열결정(sequencing)에 의해 확인하였다. PCR 생성물 및 DNA 단편을 PCR 정제 키트 또는 QIAEX II 키트 (퀴아젠(Qiagen; 미국 캘리포니아주 발렌시아(Valencia, CA) 소재))로 정제하였다. 사용된 플라스미드는 표 3에 기재되어 있다. 사용된 프라이머는 표 4에 기재되어 있다.
플라스미드 pMT010은, 프라이머 MT078 및 MT079를 사용하여 와이. 리폴리티카 Po1g 게놈 DNA로부터의 번역 신장 인자-1α (TEF) 프로모터 영역 (등록 번호: AF054508)을 증폭시켜 구축되었다. 앰플리콘을 이스턴 바이오테크 컴퍼니(대만 타이페이 소재)로부터 얻어진 개시 벡터 pINA1269 (pYLEX1로도 알려져 있음)의 SalI 및 KpnI 부위 사이에 삽입하였다. 또한, 제한 부위를 다중-클로닝 부위에 추가하기 위해 역방향 프라이머 MT079에 포함된 것은 MluI 및 NsiI 부위였다.
플라스미드 pMT015는, 와이. 리폴리티카 Po1g 게놈 DNA로부터의 TEF 프로모터, 및 ATG 개시 코돈 및 113 bp의 내인성 인트론 (등록 번호: CR382129)을 함유하는 5' 코딩 영역을 증폭시켜 구축되었다. 프라이머 MT118 및 MT122를 이 증폭을 위해 사용하였으며, pMT010의 SalI 및 MluI 부위 사이에 삽입하였다. 클로닝 목적을 위하여, 일부 인트론을 생략하여, SnaBI 제한 부위가 도입될 수 있도록 하였다. 따라서, 유전자를 이 플라스미드에 클로닝하는 것은 유전자의 ATG 개시 코돈의 생략, TAACCGCAG의 5' 프라이머의 출발 지점에의 추가, 및 5' 말단에서의 평활 말단 라이게이션을 필요로 한다.
플라스미드 pMT025는, 프라이머 MT170 및 MT171을 사용하여 LacZ 유전자를 증폭시키고, 이. 콜라이로부터 β-갈락토시다제를 코딩하고, 이를 개시 벡터 pINA1269의 PmlI 및 BamHI 부위에 삽입하여 구축되었다. 플라스미드 pMT038은, 프라이머 MT168 및 MT169를 사용하여 LacZ 유전자를 증폭시키고, 이를 pMT010의 MluI 및 NsiI 부위에 삽입하여 구축되었다. LacZ가 다수의 MluI 부위를 함유하기 때문에, AscI를 매칭 오버행(matching overhang)을 갖는 MT168에 대한 5' 제한 부위로서 사용하였다. 플라스미드 pMT037은, LacZ 유전자를 증폭시키고, 이를 pMT015의 SnaBI 및 NsiI 부위에 삽입하여 구축되었다. 프라이머 MT172 및 MT169가 사용되었으며, 여기서 정방향 프라이머 MT127은 LacZ의 ATG 개시 코돈이 생략되어 있으며, 대신 pMT015의 인트론 서열을 완전하게 하는 서열 TAACCGCAG로 시작한다.
플라스미드 pMT013은, 프라이머 MT080 및 MT081을 사용하여 와이.　리폴리티카 Po1g 게놈 DNA (등록 번호: XM_501721)로부터 ACC1 유전자를 증폭시키고, 이를 pMT010의 MluI 및 NsiI 부위에 삽입하여 구축되었다. 플라스미드 pMT040은, 프라이머 MT222 및 MT137을 사용하여 pMT013으로부터의 ACC1 유전자 및 그의 종결자를 증폭시키고, 이를 PmlI 및 ClaI로 절단된 개시 벡터 pINA1269에 삽입하여 구축되었다.
플라스미드 pMT053은, 프라이머 MT271 및 MT272를 사용하여 와이.　리폴리티카 Po1g 게놈 DNA (등록 번호: XM_504700)로부터의 DGA1 유전자를 증폭시켜 구축되었다. 증폭된 유전자를 NsiI로 절단하고, pMT037의 구축에서와 동일한 방식으로 PMT015에 삽입하였다.
ACC1 및 DGA1 둘 다를 발현할 수 있는 단일 플라스미드를 생성하기 위하여, 프라이머 MT220 및 MT265를 사용하여 프로모터-유전자-종결자 카세트를 pMT053으로부터 증폭시켰다. 이후, 이를 DpnI 및 AseI로 절단하고, pMT040에 삽입하였으며, 이를 NruI 및 AseI로 절단하여 탠덤 유전자 구축물 pMT065를 생성하였다. 선별을 용이하게 하기 위해 AseI 제한 부위를 선택하였는데, 이는 암피실린 내성 마커 내에 있기 때문이다. NruI이 평활 말단 제한 부위이기 때문에, 앰플리콘의 삽입은 NruI 부위의 총 수를 증가시켜 진행성 삽입을 촉진하지 않는다.
플라스미드를 NotI 또는 SacII 중 하나로 선형화하고, 문헌 [Chen et al.(22)]에서 기재된 1-단계 리튬 아세테이트 형질전환 방법에 따라 Po1g에 염색체적으로 통합하였다. 형질전환체를 선택 배지에 플레이팅하고, 제조된 게놈 DNA의 PCR에 의해 확인하였다. 이후, 확인된 형질전환체를 -80℃에서 동결된 스톡으로서, 및 4℃에서 선택적 YNB 플레이트 상에서 보관하였다.
RNA 단리 및 전사체 정량화
효모 균주를 YNB 상에서 24시간 동안 성장시키고, 수거하고, 액체 질소로 동결시키고, 80℃에서 보관하였다. 샘플을 액체 질소에서 파괴하고, 전체 RNA를 알엔이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit) (퀴아젠)를 사용하여 와이. 리폴리티카로부터 단리하고, 생산업체의 지시에 따라 단리 단계 중에 RNase-무함유 DNase로 처리하였다. 단리된 RNA를 260 nm에서 분광광도측정법으로 정량화하였다. SYBR 그린을 갖는 아이스크립트 원-스텝(iScript One-Step) RT-PCR 키트 (바이오-라드(Bio-Rad), 미국 캘리포니아주 허큘레스(Hercules, CA) 소재))를 사용하여 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 상대적 정량화는 내부 대조군으로서 액틴을 코딩하는 ACT1을 사용한 2Δ CT 방법에 기초하였다. 샘플을 3회 분석하였다.
β- 갈락토시다제 검정
시그마-알드리치로부터의 β-gal 검정 키트를 사용하여 LacZ 효소 활성을 측정하였다. 세포를 PBS 완충액에 재현탁시키고, 2분 동안 500 μm 유리 비드 (시그마-알드리치)와 함께 볼텍싱하여 용해시켰다. 40 μL의 세포 용해물을 47 mg/mL ONPG, 0.6M Na2HPO4-7H2O, 0.4M NaH2PO4-H2O, 0.1M KCl, 0.01M MgSO4-7H2O를 함유한 340 μL의 반응 믹스로 옮겼다. 발생할 색상 변화를 위해 반응물을 37℃에서 인큐베이션하고, 마지막으로 500 μL의 1M 탄산나트륨을 사용하여 켄칭하였다. 이어서, 420 nm에서 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 인큐베이션 시간 및 건조 세포 중량으로 나눈 효소 활성에 기초하여 효소 단위를 계산하였다.
지질 분석
문헌 [Folch et al (23)]의 절차를 이용하여 전체 지질을 추출하였다. 측정된 양 (대략 1 mg)의 세포 바이오매스를 1 mL의 클로로포름:메탄올 (2:1) 용액에 현탁시키고, 1시간 동안 볼텍싱하였다. 원심분리 후, 500 μL를 125 μL의 염수 용액으로 옮겼다. 상부 수성 층을 제거하고, 하부 층을 증발시키고, 100 μL의 헥산에 재현탁시켰다. 이어서, 에스테르교환을 수행할 때까지 샘플을 -20℃에서 보관하였다.
각 샘플에 메탄올 중 2％ (wt/vol) 황산 1 mL를 첨가하여 전체 지질 추출물의 에스테르교환을 수행하였다. 이어서, 샘플을 60℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 일부 증발시킨 후, 1 mL의 헥산을 첨가하고, 10분 동안 볼텍싱하여 지방산 메틸 에스테르 (FAME)를 추출하였다. 이어서, 상기 헥산 800 μL를 GC 분석을 위해 유리 바이알로 옮겼다.
불꽃-이온화 검출기 및 모세관 칼럼 에이치피-이노왁스(HP-INNOWAX) (30 m x 0.25 mm)가 장착된 브루커(Bruker) 450-GC 기기를 사용하여 FAME의 GC 분석을 수행하였다. GC 오븐 조건은 다음과 같았다: 150℃ (1분), 10분 동안 230℃로 상승, 2분 동안 230℃에서 유지. 분할 비는 10:1이었다. 메틸 트리데카노에이트 (C13:0)로 표준화된 시판되는 FAME 표준과 비교하여 지방산을 확인하고, 정량화하였다. 5종의 FAME, 즉, 메틸 팔미테이트 (C16:0), 메틸 팔미톨레에이트 (C16:1), 메틸 스테아레이트 (C18:0), 메틸 올레에이트 (C18:1), 메틸 리놀레에이트 (C18:2) (시그마-알드리치)에 대한 전체 지방산 함량의 합으로 전체 지질 함량을 계산하였다. 클로로포름-메탄올 추출액에 대한 트리데칸산의 첨가물을 내부 표준으로 사용하였고, 이는 전체 분석 절차 내내 수행되었으며, 그의 메틸 에스테르로 에스테르교환되었다.
결과 및 논의
번역 신장 인자-1α의 발현-향상 인트론을 사용한 높은 발현 플랫폼의 확립
와이.　리폴리티카 내 유도성 및 구성적 프로모터를 비롯한 다수의 프로모터가 유전자 발현에 이용가능하다 (24). TEF 프로모터는 원래 강한 구성적 프로모터로 확인되었지만, 후속적인 클로닝 및 특성화로 인해 유도성 XPR2 프로모터에 비해 낮은 발현을 나타내었다 (25). 보다 최근에, 하이브리드 hp4d 프로모터가 그의 강한 준-구성적 발현으로 보편화되었으며 (26), 높은 단백질 발현이 요구되는 다수의 적용분야에서 사용된 바 있다 (20, 27, 28).
TEF에 대한 게놈 서열의 분석 결과, 오픈 리딩 프레임의 5' 영역에서의 개시 코돈 바로 다음에 122-bp의 스플라이시오솜 인트론이 존재한다는 것이 밝혀졌다. 프로모터-근접 스플라이시오솜 인트론은 종종 다양한 유기체에서 그의 상응하는 유전자의 발현에 큰 영향을 미치는 것으로 밝혀진 바 있다 (29). 본 발명자들은 TEF의 강한 발현이 상기 인트론에 따라 달라졌으며, 발현 벡터에서 프로모터와 함께 인트론을 포함함으로써 보다 강한 발현이 얻어질 수 있다는 것을 추측하였다. 사실상, TEF 프로모터의 초기 스크리닝 및 단리는 cDNA 라이브러리에서의 풍부화를 위한 인트론 향상에 거의 의존적이었으며, 이러한 특징은 인트론이 스플라이싱된 후에는 나타나지 않았을 것이다.
LacZ를 발현하는 플라스미드 pMT025, pMT037 및 pMT038을 구축하여, 다음 3가지 프로모터의 상대적 발현을 비교하였다: 합성 하이브리드 프로모터 (php4d), 인트론이 없는 TEF 프로모터 (pTEF) 및 인트론이 있는 TEF 프로모터 (pTEFin). 현저하게, 50시간의 배양 후 TEFin 프로모터는 인트론이 없는 TEF 프로모터에 비해 17배 발현 상승 및 hp4d 프로모터에 비해 5배 발현 상승을 나타낸다.
인간 세포 및 효모에서의 단지 2배부터 옥수수에서의 1000배 초과까지 다른 시스템에서 관찰된 인트론 향상은 더욱 다양하다 (30, 31). 인트론은 조절 요소를 함유하고, mRNA 외수송(export)을 용이하게 하고, 전사 개시 속도를 증가시키는 다수의 방식으로 유전자 발현을 향상시키는 것으로 알려져 있다 (29). 인트론 유전자는 집단으로서 비-인트론 유전자에 비해 보다 높은 발현 수준을 나타내는 경향이 있다. 예를 들어, 에스. 세레비지아에에서 인트론 유전자는 전체 유전자 수의 단지 4％ 미만을 나타내지만, 세포에서 생성되는 전체 RNA의 27％를 차지한다 (32). 게놈 와이.　리폴리티카는 그의 유전자의 10.6％의 인트론을 함유하는 반면에, 에스. 세레비지아에는 단지 4.5％의 인트론을 함유한다 (33). 본 발명의 고유의 목적 유전자를 향상시키는 이러한 내인성 과정의 협력은 발현을 최대화하기 위한 간단한 방법을 나타내며, 이는 넓은 범위의 진핵 유기체에 적용될 수 있다. 예를 들어, 반자낭균 효모(hemiascomycetous yeast) 사이에 스플라이스 서열의 높은 서열 상동성이 존재한다 (34). 인트론의 기능, 진화 및 용도에 대해 좀 더 밝혀내기 위한 연구는 계속되는 반면에, 생명공학적 목적을 위한 인트론의 이용은 비교적 미개발된 기회이다.
ACC1 및 DGA1 의 과다발현은 지질 축적을 현저히 증가시킴
발현-향상 인트론과 함께 TEF 프로모터의 사용은 와이.　리폴리티카에서의 높은 유전자 발현을 위한 탁월한 플랫폼을 제공한다. 따라서, 본 발명자들은, 와이.　리폴리티카 및 에스.　세레비지아에 둘 다에서의 지질 축적에 중요한 것으로 밝혀진 바 있는 DGA1 (pMT053)의 과다발현을 위해 이를 사용하였다 (19, 35). 이미 2개의 내인성 프로모터-근접 인트론을 갖는 ACC1은 TEFin 프로모터를 사용하여 클로닝되지 않았다. 대신에, TEF 및 hp4d 프로모터 (각각 pMT013 및 pMT040)를 사용하여 클로닝되었다. 성장 속도 및 지질 생산은 상기 2종의 프로모터 간에 비교적 유사하였고 (데이터로 나타내지는 않음), 이에 따라 php4d-ACC1을 지질 시험 및 ACC1+DGA1 (pMT065)의 탠덤 유전자 구축에 사용하였다. 또한, hp4d 프로모터는 ACC1+DGA1 구축물에서 두 직렬 유전자 카세트의 상동 재조합 가능성을 최소화하기 위해 선택되었다. 탠덤 유전자 구축을 이용한 와이. 리폴리티카에서의 2종의 유전자의 동시 공발현은 도처에서 성공적으로 수행된 바 있다 (20).
지질 생산에 대한 ACC1 및 DGA1 과다발현의 효과는 먼저 진탕 플라스크 실험에서 평가되었다. 대조군 LacZ 균주는 단지 8.77％ (g/g DCW)의 지질을 생산하였고, 이는 단독 기질로서 글루코스를 사용한 진탕 플라스크에서의 야생형 수행과 유사하였다 (36). ACC1 및 DGA1 형질전환체는 둘 다 대조군을 능가하였고, 각각 17.9％ 및 33.8％의 지질 함량을 축적하였다. 특히, DGA1은 ACC1보다 거의 2배, 대조군보다 거의 4배 많은 지질 축적을 나타내었다. 대조군으로부터 생산된 바이오매스는 다른 균주보다 현저히 많았고, 이는 ACC1 및 DGA1의 발현이 와이.　리폴리티카의 성장 가능성에 혼란을 줄 수 있음을 시사한다. 전체 오일 수율은 0.32 g/g의 이론적 최대 수율에 비해 비교적 낮았다 (37). 또한, ACC1은 현저히 많은 리놀레산을 생산하고, DGA1은 보다 높은 스테아르산 비율을 유지하는 것과 같이 지방산 프로파일에서 약간의 변화가 있었다. 올레산 비율은 모든 형질전환체에 걸쳐 비교적 균일하게 유지되었다.
두 단일 유전자 형질전환체를 개선한 ACC1+DGA1은 41.4％의 지질 함량을 달성할 수 있었고, 이는 대조군에 비해 4.7배 개선된 것이었다. 바이오매스 생산은 단일 형질전환체에 비해 개선되었지만, 대조군보다는 적었다. 오일 수율은 0.114 g/g 또는 이론적 수율의 35％로 비례하여 개선되었다.
진핵 유기체에서, ACC의 과다발현은 지질 생산의 제한된 개선만을 충족시켰다. 비-유지성 효모 한세눌라 폴리모르파에서의 유지성 진균 뮤코르 로욱시이로부터의 ACC1의 이종 발현은 전체 지방산 함량의 40％ 증가 (3.8％에서 5.3％)만을 달성할 수 있었다 (38). 식물에서, 아라비돕시스(Arabidopsis) ACC1의 과다발현은 효소 활성의 극적인 증가를 일으키지만, 최종 지질 함량은 30％ 이하로 증가시킨다 (39, 40). 이는 진핵체에서의 상기 효소에 대해 유지되는 강한 대사 및 조절 규제로 인해 개선이 제한되는 것으로 추정된다. ACC 발현 및 활성은 다수의 전사 인자, 단백질 키나제 및 대사물에 의해 영향을 받는다 (41). 예를 들어, 칸디다(Candida) (야로위아) 리폴리티카에서, 아세틸-CoA 신테타제 돌연변이체에서의 아실-CoA의 축적은 ACC 활성을 8배 감소시킨다 (42). 그럼에도 불구하고, 와이.　리폴리티카는 그의 유지성 특성에 크게 기여하는 진핵 유기체 내 조절 예외를 나타내고, 이로써 본 발명자들은 내인성 ACC1의 과다발현을 통해 지질 함량의 2배 증가를 달성한다.
최근, DGA의 역할이 지질 합성에 중요한 것으로 밝혀졌다. 와이.　리폴리티카에서, DGA1p는 지질체의 막 표면에 대부분 위치하며, 트리글리세리드 리파제 (TGL3)와 협력 작용하여 지질체의 내부 및 외부에서 TAG 플럭스의 균형을 맞춘다 (16). 따라서, TAG의 저장은 그의 TGL3p 대응물과 관련하여 DGA1p의 상대적 활성 (및 풍부함)에 매우 의존적일 것으로 예상된다. 또한, DGA가 인지질 합성으로부터 플럭스를 우회시켜, 보다 많은 플럭스가 여전히 필수적인 인지질을 생산하는 데 필요한 만큼의 지질 합성을 위한 추진력을 만들어 낸다는 것을 가정하였다 (6). 결과적으로, DGA1의 과다발현은 지질 축적에 현저한 영향을 미쳤다. 유지성 Δsnf2 돌연변이체에서의 DGA1 과다발현은 에스. 세레비지아에에서 2.3배 증가된 최대 27％의 지질 함량 축적을 유발하였다 (35). 식물에서, 아라비돕시스 DGAT 과다발현은 잎에서 20배 및 전체적으로 2배의 지질 함량 증가를 유발하였다 (43).
지방산과 TAG 합성 경로 사이의 균형은 아실-CoA 중간체를 중심으로 하는데, 이는 아실-CoA 중간체가 지방산 (상류) 경로에서는 생성물 및 피드백 억제제로서, TAG (하류) 경로에서는 주요 전구체로서 기능하기 때문이다. 상류 경로의 상향 조절은 지방산 합성의 처리량을 증가시키고, 특히 ACC의 경우에는 시토졸 아세틸-CoA와 경쟁할 임의 경로로부터 플럭스를 우회시킨다. 하류 경로의 상향 조절은, 아실-CoA 중간체를 고갈시키고 지질체에서의 TAG의 저장 속도를 증가시켜 추진력을 만든다. 그러나, 개별적으로 조정시 세포 대사 및 성장에 부작용을 일으킬 수 있는 불균형을 초래할 수 있다.
ACC1 및 DGA1을 공발현시킴으로써, 상류 및 하류 경로가 둘 다 동시에 상향 조절되고, 이는 중간체-매개 조절을 혼란시키지 않으면서 지질 생산을 증가시킨다. 또한, ACC로부터의 지질 합성을 통한 높은 플럭스와 DGA에 의한 TAG의 지질체로의 격리에 의해 제공되는 추진력이 조합된다. 그 결과, 지질 축적이 대조군보다 거의 5배 넘게 상승작용적으로 증가한다. 사실상, 대사 저하(metabolic sink)와 함께 과다생산 및 추진력의 결합은 대사 공학, 특히 바이오연료의 최근 작업에서 매우 강력한 전략이 되었다 (44-46).
ACC1 + DGA1 형질전환체의 발효 수행
ACC1+DGA1 형질전환체 (MTYL065)를 추가로 특성화하고, 그의 지질 축적 특성을 연구하기 위해서, 2-L 교반-탱크 생물반응기를 이용하여 대규모 발효를 수행하였다. 글루코스 농도를 증가시키고, 황산암모늄 농도를 감소시켜 100의 C/N 몰비를 달성하였다. 지질 축적을 위한 최적의 C/N 몰비는 전형적으로 80-120의 범위이다 (15).
120시간의 발효 과정 중에 글루코스는 완전히 소비되었고, 최종 바이오매스는 28.49 g/L에 달하였다 (도 3). 최종 지질 함량은 61.7％의 DCW였고, 이는 진탕 플라스크 실험에 비해 지질 축적의 50％ 증가이다. 이를 엑스 노보 지질 축적 반응식에서 발견된 값 (19, 50) 뿐만 아니라 다른 당 발효 (28, 47-49)와 적절히 비교한다. 전체 수율 및 생산성은 각각 0.195 g/g 및 0.143 g/L/hr이었지만, 70-100시간 사이에 관찰된 최대 지질 생산 중에는 0.270 g/g의 수율 및 0.253 g/L/hr의 생산성에 도달하였다 (표 2). 이 시기 동안 생산된 거의 모든 바이오매스는 지질 함량 증가에 의해 설명될 수 있다. 달성된 전체 및 최대 수율은 TAG 합성에 대한 이론적 수율의 60.9％ 및 84.3％이다.
표 2. ACC1+DGA1 형질전환체의 2-L 생물반응기 발효에 대한 수율 및 생산성 계산. 수율은 생산된 지질 (g)을 소비된 글루코스 (g)로 나누어 계산됨. 생산성은 시간 당 생산된 지질의 농도에 의해 계산됨. 최대 값은 70-100시간 사이의 시점으로부터 계산됨.
오일 수율 (g/ 글루코스 g)
전체 0.195
최대 0.270
오일 생산성 (g/L/ hr )
전체 0.143
최대 0.253
규모 확장 동안에 지방산 프로파일이 극적으로 변화하였다 (도 4). 스테아르산의 상대적 고갈, 및 팔미트산 및 올레산의 풍부화가 관찰되었고, 결국 올레산이 전체 지방산의 49.3％를 차지하였다. 올레산 및 스테아르산 사이의 비는 발효 내내 꾸준히 증가하였고 (데이터로 나타내지는 않음), 마침내 4.6의 비에 이르렀다. 이는 진탕 플라스크 실험에서 나타난 1.3의 비로부터의 극적인 변화이다. 유사한 실험을 탄소원으로 아세테이트를 사용하여 수행하였다. 지방산 프로파일을 134시간에 분석하였고, 결과는 도 5에 나타나 있다.
높은 상대 올레에이트 농도 (58.5％ 이하)는 또한 다른 2-L 발효에서 관찰되었고 (51), 50％ 초과 지질 함량으로 축적되는 다른 유지성 효모의 프로파일과 보다 더 유사하다 (15). 급속한 지질 생산의 상태에서, 올레산은 보다 급속하게 저장되고 보다 용이하게 축적될 수 있는데, 이는 DGA1p가 상이한 아실-CoA에 대해 다양한 특이성을 갖는 것으로 공지되고; 에스. 세레비지아에에서, C18:1이 C18:0의 2배 활성을 갖는 가장 바람직한 기질이기 때문이다 (52). 더욱이, 높은 올레산 농도는 또한 생물반응기에서 달성되는 보다 높은 통기 속도에 대한 반응이며, 진탕 플라스크 발효에서 용이하게 나타나지 않을 수 있다.
ACC1+DGA1 균주에서 나타나는 높은 지질 함량, 수율 및 생산성은 지질 합성 경로를 통해 높은 플럭스에 적응하는 와이. 리폴리티카의 고유한 능력을 입증한다. 추가의 변형 및 공정 최적화로, 조작된 지질 합성 경로를 갖는 와이. 리폴리티카는 지질의 왕성하고 효율적인 드 노보 합성에서 유망한 돌파구를 생성할 수 있다.
표 3. 본 연구에 사용된 균주 및 플라스미드
Figure 112014046108244-pct00018
표 4. 본 연구에 사용된 프라이머
Figure 112014046108244-pct00019
조작된 ACC + DGA 균주를 사용한 아세테이트로부터의 지질의 생산
야로위아 리폴리티카는 천연적으로 유기 산 아세테이트 상에서 성장한다. 아세테이트는 비-광합성 탄소 고정 경로를 통해 이산화탄소 또는 일산화탄소로부터 호모아세토겐 유기체에 의해 높은 수율로 생산될 수 있기 때문에 매력적인 기질이다. 아세테이트는 아세틸-coA 카르복실라제 (ACC)를 통한 지질 합성을 위한 주요 전구체인 아세틸-coA의 형태로 세포 대사 경로에 들어간다. 따라서, 지질 축적을 위한 강한 추진력으로 커플링된 효소를 이용하는 아세틸-CoA의 직접적인 과다발현이 있기 때문에, ACC + DGA 균주는 아세테이트 기질 상의 지질 생산을 위한 유망한 후보인 것으로 보였다.
2-리터 생물반응기 발효를 탄소 기질로서 아세테이트를 갖는 ACC+DGA 균주를 사용하여 수행하였다 (도 6). 높은 산소 함량에서, 아세테이트는 낮은 바이오매스 생성으로 급속하게 소비되는 것으로 관찰되었으며, 따라서 발효는 지질 생산 및 수율을 최대화하는 질소 및 산소 둘 다가 제한된 조건 하에서 수행되었다.
오일 생산의 최종 역가는 130시간 후 5.5 g/L였으며, 이는 총 8.9 g/L 바이오매스 건조 세포 중량의 62％를 구성한다. 아세테이트 상의 전체 지질 수율은 오일 0.152 g/아세테이트 g이었다. 지질 생산기 (90 내지 130시간 사이) 동안, 최대 지질 생산은 오일 0.27 g/아세테이트 g의 수율로 달성되었으며, 이는 이론적인 최대 수율의 96％이다.
글루코스 상의 발효에 대한 발효 특징의 비교는 보다 낮은 바이오매스 수율 및 성장 속도에도 불구하고, 지질 축적 및 최대 지질 수율이 상응하였음을 나타낸다.
표 5. 글루코스 및 아세테이트 상의 발효의 비교
Figure 112014046108244-pct00020
결론
지질 생합성은 긴밀하게 조절되는 대사 경로이다. 지질의 생산을 위한 공업적으로 관련된 적용을 위해, 세심한 대사 조작이 수율 및 생산성을 최대화하는 데 필요하다. 유지성 효모 와이. 리폴리티카의 사용은 지질 축적을 위한 높은 능력 및 지질 대사 경로를 조작하기 위한 도구를 갖는 것으로부터 이익을 얻는다. 본원에서, 본 발명자들은 지질 합성 경로, ACC1 및 DGA1에서 2가지 중요한 유전자의 인트론-향상된 공동-과다발현이 온건한 C/N 비 하에서도 지질의 생산에 대한 추진력을 제공함을 나타낸다. 2가지 효소가 지질 합성의 최초 및 최종 단계를 수행할 때, TAG를 향한 탄소 플럭스의 동시 추출 및 유입은 최소 중간체 축적으로 증진된 생산을 허용하며, 이는 억제를 유도할 수 있다. 얻어지는 ACC1+DGA1 균주는 0.143 g/L/hr의 전체 부피 생산성에서 드 노보 합성을 통해 지질로서 그의 DCW의 62％ 이하를 축적할 수 있었다.
(a) 경로 유전자의 강한 과다발현, (b) 상류 및 하류 경로의 균형, (c) 목적하는 경로를 향한 플럭스의 전환, 및 (d) 최종 생성물을 향한 추진력의 개념은 대사 네트워크가 조작되고, 목적 생성물의 생성에 대해 최적화되는 대사 공학의 실시에서 중요한 전략이다. 지질 축적에 관한 이들 개념의 실행은 미세조류를 포함한 다수의 생물학적 플랫폼에 용이하게 확장될 수 있다. 이들 전략은 생물학적으로 유도된 화학물질 및 연료의 왕성하고 효율적인 상품-규모 생산의 기술을 가능하게 하는 데 기초가 될 것이다. 지질 생합성에 대한 그의 적용은 미생물 오일 과다생산 및 비용-효율적 바이오연료 제조를 위한 경로를 가능하게 한다.
참조문헌
Figure 112014046108244-pct00021
Figure 112014046108244-pct00022
Figure 112014046108244-pct00023
실시예 2.
야로위아 리폴리티카에서의 지질 합성 유전자의 조합 발현
세포 대사의 연구는 대사 공학을 이용하여 설명될 수 있다. 대사 공학은 유기체에서의 대사 경로를 조작하는 재조합 DNA 기술의 사용이다 (문헌 [Bailey 1991]). 특정 대사 네트워크의 조작 및 공학을 통해, 제어 인자 및 속도-제한 단계가 확인 및 설명될 수 있다. 특정 유기체 또는 경로에 대한 기존의 지식 및 도구를 기반으로, 어떻게 새로운 교란이 목적 생성물의 생성을 방향수정 및 제어하는 데 사용될 수 있는지 평가할 수 있다.
지질 생합성은 건강, 암 및 의약에서부터 생화학물질 및 바이오연료 생산에 이르기까지 폭넓은 적용을 갖는 대사 공학에 이용되는 연구를 위한 탁월한 경로이다 (문헌 [Beopoulos et al. 2011; Courchesne et al. 2009]; [Kohlwein and Petschnigg 2007]). 박테리아에서 인간에 이르기까지 폭넓은 범위의 유기체에서 지질 생합성을 위한 생리학, 효소학 및 대사는 비교 및 탐색적 분석 둘 다를 위한 강한 지식 근거를 형성하며 광범위하게 연구되었다 (문헌 [Kurat et al. 2006]; [Ohlrogge and Jaworski 1997]). 지질 대사는 세포 성장 및 증식에서부터 에너지 저장 및 대사에 이르기까지 세포 생리학의 다수의 측면에서 필수적인 역할을 한다 (문헌 [Kohlwein and Petschnigg 2007]; [Tehlivets et al. 2007]). 의학적 및 산업적 목적 둘 다에 이들 경로를 이용하기 위해, 어느 교란이 전체 공정 상에서 가장 큰 영향을 갖는지를 이해하는 것이 중요하다.
유지성 효모 야로위아 리폴리티카는 지질 대사를 연구하는 탁월한 모델 유기체가 된다. 유지성 효모로서, 와이. 리폴리티카는 탄소 풍부 환경에서 36％ 이하의 지질을 천연적으로 축적할 수 있다. (문헌 [Beopoulos et al. 2009]). 이들 지질은 지질체에서 트리아실글리세리드 (TAG)의 형태로 저장된다. 이는 서열화된 게놈 및 이용가능한 유전적 도구의 범위를 갖는 가장 광범위하게 연구된 '비-통상적' 효모 종 중 하나이다 (문헌 [Barth and Gaillardin 1997]). 이는 다수의 산업적 적용에 사용되었고, 단백질 분비, 소수성 기질 이용, 지질 대사, 및 미토콘드리아 호흡을 위한 모델 유기체로서 검토되었다 (문헌 [Beckerich et al. 1998]; [Beopoulos et al. 2009]; [Coelho et al. 2010]; [Kerscher et al. 2002]). 와이. 리폴리티카는 다량의 지질을 천연적으로 축적하는 반면, 그의 지질 축적 특징을 추가로 증가시키거나 다르게는 개선하는 데 다수의 공학적 노력이 성공적이었다 (문헌 [Beopoulos et al. 2008]; [Chuang et al. 2010]; [Dulermo and Nicaud 2011]; [Zhang et al. 2011]). 그러나, 조사된 유전자 조작의 수 및 다양성은 이 목적을 위해 상대적으로 제한된 채 남아있었고, 지질 과다생산을 위한 플랫폼으로서의 와이. 리폴리티카에 대한 잠재성은 상대적으로 조사되지 않은 채 남아있다.
다수의 관심의 유전자 표적은 다양한 접근법 및 전략을 통해 지질 축적과 연결되었다 (문헌 [Courchesne et al. 2009]). 아세틸-coA 카르복실라제 (ACC)는 경로로 유입되는 플럭스를 제어하는 지방 생합성에서의 속도-제한 단계로서 일반적으로 알려져 있다. 이는 지방산 신장에 이용될 수 있는 말로닐-coA를 생성하는 것을 책임진다. ACC는 그의 주요 대사 전구체로서 시토졸 아세틸-coA를 이용한다. 대부분의 진핵생물에서 시토졸 아세틸-coA를 공급하는 효소는 ATP 시트레이트 리아제 (ACL)이다. ACL는 TCA 회로의 생성물로서 미토콘드리아로부터 셔틀된 시트레이트를 절단하여 아세틸-coA 및 옥살로아세테이트를 형성한다. 지방산 생산이 지방산 신타제 복합체로 완료된 후, 아실-coA 분자는 소포체에서 신장 및 탈포화를 통해 추가로 조작될 수 있다. 이들 공정은 다른 대사 경로에서 저장 또는 이용을 용이하게 하는 아실-coA 쇄의 화학적 특성을 개질하는 것을 돕는다. Δ9-데새투라제 (D9)와 같은 효소는 스테아로일-coA 분자를 올레오일-coA 분자로 전환하며, 이는 지질 조절 및 대사 둘 다에서 매우 중요한 것으로 보인다 (문헌 [Dobrzyn and Ntambi 2005]). 지질 어셈블리 및 저장에서의 최종 단계는 효소 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGA)를 통한 디아실글리세롤 (DAG)의 TAG로의 전환이다. 이 단계는 소포체 및 지질체의 표면 둘 다에서 일어나며, 후자는 유기체의 에너지 필요에 따라 TAG 어셈블리 및 분해의 동적 평형을 확립한다 (문헌 [Athenstaedt et al. 2006]). 와이. 리폴리티카에서, 다수의 DGA 유전자는 이 작용을 수행하는 것으로 확인되었다 (문헌 [Zhang et al. 2011]). 이들 효소적 단계는 지질 축적에 대한 흥미로운 관계를 나타낸다. ACC는 지질 합성에 유입되는 플럭스를 제어하며, 박테리아 에스케리키아 콜라이에서의 ACC의 과다발현은 지방산 합성에서 6배 증가를 초래하였다 (문헌 [Davis et al. 2000]). ACL의 제어 하에 있는 시트레이트 셔틀은 비-유지성 진균에 비해 유지성 진균에서 상이하게 관찰되며, 지질 생합성 경로 내로의 높은 플럭스를 위한 필수적인 경로로서 추측된다 (문헌 [Boulton and Ratledge 1981]; [Vorapreeda et al. 2012]). 또한, ACL의 탈활성화는 지질 생산에서 바람직하지 않은 현상인 시트레이트 축적 및 분비를 유도하는 것으로 생각된다 (문헌 [Papanikolaou and Aggelis 2002]; [Papanikolaou et al. 2002]). D9는 암 대사에 관련되었으며, 포유동물 종양 세포에서 상향조절된다. 이는 잠재적으로 지질생성의 강한 양성 조절제이며, 암 세포에서 발견되는 급속한 성장에 필요한 지질 생산을 용이하게 한다 (문헌 [Dobrzyn and Ntambi 2005]; [Hulver et al. 2005]; [Ntambi and Miyazaki 2004]). DGA는 지질 저장을 위한 최종 수행 단계이며, 에스. 세리비지아에 Δsnf2 돌연변이체에서의 DGA의 과다발현은 지질 축적의 극적인 증가를 초래하였다 (문헌 [Kamisaka et al. 2007]). 이들 결과는 흥미로운 결과 및 영향을 생성한 반면, 단일 모델 유기체 내에서의 이들의 기여의 분석은 어떻게 이들이 증가된 지질 생산에 기여 및 협력할 수 있는지를 조직적으로 확인가능하게 할 수 있다.
본원에서, 본 발명자들은 지질 생합성에 관련된 몇몇 중요한 유전자의 영향을 주시하며, 유지성 효모 와이. 리폴리티카에서 지질 축적의 증가에 대한 이들의 기여를 조사한다. 유전자 표적의 개별 및 조합 둘 다의 과다발현에 의해, 본 발명자들은 어떻게 유전자가 지질 생합성 경로를 통해 플럭스에 긍정적으로 영향을 줄 수 있는지를 조사할 수 있다. 더욱이, 본 발명자들은 높은 생산성을 달성하는 세포 내에서의 균형있는 대사 플럭스의 중요성을 설명하는 2가지 후보 균주의 지질 생산 성능을 조사한다.
재료 및 방법
효모 균주, 성장, 및 배양 조건
본 연구에서 사용된 와이. 리폴리티카 균주는 야생형 와이. 리폴리티카 W29 균주 (ATCC20460)로부터 유래되었다. 모든 형질전환에 사용된 영양요구성 Po1g (Leu-)는 이스턴 바이오테크 컴퍼니 (대만 타이페이 소재)로부터 수득하였다. 본 연구에서 사용된 모든 균주는 표 6에 열거되어 있다. 구축된 플라스미드는 SacII로 선형화하고, 첸 (Chen) 등에 의해 기재된 1-단계 리튬 아세테이트 형질전환 방법에 따라 Po1g 내로 염색체로 통합하였다 (문헌 [Chen et al. 1997]). MTYL 형질전환체는 MTYL088 및 MTYL089를 제외하고 그의 상응하는 통합된 플라스미드의 넘버링 후에 명명되었다. 균주 MTYL088 및 MTYL089의 구축을 위해, 균주 MTYL078 및 MTYL079는 2가지 추가의 라운드의 형질전환을 받았다: (1) 내인성 URA를 녹아웃시키기 위한 선택적 5-FOA 상의 URA KO 카세트로 형질전환; (2) SacII로 선형화된 PMT092로 형질전환. 형질전환체를 선택적 배지 상에 플레이팅하고, 제조된 게놈 DNA의 PCR에 의해 확인하였다. 그 후, 확인된 형질전환체를 -80℃에서 동결된 글리세롤 스톡으로서, 및 4℃에서 선택적 YNB 플레이트 상에서 저장하였다. 각각의 균주에 대한 유전자의 설계된 과다발현의 요약은 표 7에 기재되어 있다.
에스케리키아 콜라이에 대한 배지 및 성장 조건은 샘브루크 (Sambrook) 등에 의해 이전에 기재되었으며 (문헌 [Sambrook and Russell 2001]), 와이. 리폴리티카에 대해서는 바쓰 (Barth) 및 게일라딘 (Gaillardin)에 의해 기재되었다 (문헌 [Barth and Gaillardin 1997]). 풍부 배지 (YPD)를 20 g/L 박토 펩톤 (디프코 래보러토리즈, 미국 미시간주 디트로이트 소재), 10 g/L 효모 추출물 (디프코), 20 g/L 글루코스 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로 제조하였다. YNB 배지는 1.7 g/L 효모 질소 염기 (아미노산 없음) (디프코), 0.69 g/L CSM-Leu (MP 바이오메디칼스, 미국 오하이오주 솔론 소재), 및 20 g/L 글루코스로 제조하였다. 선택적 YNB 플레이트는 1.7 g/L 효모 질소 염기 (아미노산 없음), 0.69 g/L CSM-Leu, 20 g/L 글루코스, 및 15 g/L 박토 한천 (디프코)을 함유하였다. 진탕 플라스크 실험을 하기 배지를 사용하여 수행하였다: 1.7 g/L 효모 질소 염기 (아미노산 없음), 1.5 g/L 효모 추출물, 및 50 g/L 글루코스. 동결된 스톡으로부터, 전배양물을 YNB 배지 (팔콘 튜브 중 5 mL, 200 rpm, 28℃, 24시간) 내로 접종하였다. 밤새 배양한 배양물을 250 mL 에를렌마이어 진탕 플라스크 중 배지 50 mL 내로 광학 밀도 (A600) 0.05로 접종하고, 100시간 동안 인큐베이션하고 (200 rpm, 28℃), 그 후 바이오매스, 당 함량, 및 지질 함량을 취하여 분석하였다.
생물반응기 규모 발효를 2-리터 배플 교반된-탱크 생물반응기에서 수행하였다. 사용된 배지는 1.7 g/L 효모 질소 염기 (아미노산 및 황산암모늄 없음), 2 g/L 황산암모늄, 1 g/L 효모 추출물, 및 90 g/L 글루코스를 함유하였다. 선택적 플레이트로부터, 초기 전배양물을 YPD 배지 (250 mL 에를렌마이어 플라스크 중 40 mL, 200 rpm, 28℃, 24시간)에 접종하였다. 밤샘 전배양물로부터 기하급수적으로 성장한 세포를 2-L 반응기 (2.5 vvm 통기, pH 6.8, 28℃, 250 rpm 교반)에서 0.1의 광학 밀도 (A600)로 생물반응기 내로 옮겼다. 시점 샘플을 후속 지질 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다. 당 유기 산 함량을 HPLC에 의해 측정하였다. 세척되고 2일밤 동안 60℃에서 건조된 샘플로부터 중량적으로 측정하여 바이오매스를 측정하였다.
유전적 기술
본 연구 전반에 걸쳐 표준 분자 유전적 기술을 이용하였다 (문헌 [Sambrook and Russell 2001]). 클로닝에 사용된 제한 효소 및 퓨전 고-정확성 DNA 폴리머라제는 뉴잉글랜드 바이오랩스 (미국 메사추세츠주 입스위치 소재)로부터 수득하였다. 효모 형질전환체로부터의 게놈 DNA는 이스타 게노믹 DNA 키트 (자이모 리서치, 미국 캘리포니아주 어바인 소재)를 사용하여 제조하였다. 모든 구축된 플라스미드는 서열결정에 의해 확인하였다. PCR 생성물 및 DNA 단편을 PCR 정제 키트 또는 QIAEX II 키트 (퀴아젠, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)로 정제하였다. 사용된 플라스미드는 표 6에 기재되어 있다. 사용된 프라이머는 표 9에 기재되어 있다.
URA3의 결실
와이. 리폴리티카의 균주에서의 마커의 유용성을 증가시키기 위해, 우라실 독립영양을 코딩하는 유전자, 오로티딘-5'-포스페이트 데카르복실라제 (URA3, 등록 번호: AJ306421)를 증폭하고, URA 영양요구성 균주의 생성을 위한 녹아웃 카세트의 기초로서 사용하였다. URA 오픈 리딩 프레임의 상류 및 하류 서열을 프라이머 쌍 MT310 - MT311 및 MT312 - MT313을 각각 사용하여 증폭시켰다. 프라이머를 2개의 앰플리콘이 23 bp 중복 영역을 운반하도록 설계한다. 2개의 앰플리콘의 정제시, 생성물 둘 다를 혼합하고, 프라이머 MT310 및 MT313을 사용하여 PCR을 수행하여 상류 및 하류 앰플리콘을 융합하는 456 bp 앰플리콘을 생성한다. 이 DNA를 정제하고, 이어서 Po1g 내로 형질전환시켰다. 그 후, 형질전환된 세포를 우라실 및 5-플루오로오로트산 (5-FOA)을 함유하는 선택적 배지 플레이트 상에 플레이팅하였다. 성장한 콜로니를 5-FOA 플레이트 상에 재플레이팅하여 URA 영양요구성을 위해 재선택하고, 제조된 게놈 DNA의 PCR에 의해 확인하였다. 얻어진 ΔLEU2 ΔURA3 균주를 MTYL100으로 명명하였다.
플라스미드 구축
플라스미드 pMT010, pMT015, pMT038, pMT040, pMT013 및 pMT065의 구축을 상기에 기재하였으며, 본원에 기재된 방법과 유사하다. ATP:시트레이트 리아제 서브유닛 1을 발현하는 플라스미드 pMT047을 와이. 리폴리티카 Po1g 게놈 DNA로부터의 ACL1 유전자 (등록 번호: XM_504787)를 증폭시키고, 이를 프라이머 MT252 및 MT253을 사용하여 pMT010의 MluI 및 NsiI 부위 내로 삽입함으로써 구축하였다. ATP:시트레이트 리아제 서브유닛 2를 발현하는 플라스미드 pMT049를 와이. 리폴리티카 Po1g 게놈 DNA로부터의 ACL2 유전자 (등록 번호: XM_503231)를 증폭시키고, 이를 프라이머 MT254 및 MT255를 사용하여 pMT010의 MluI 및 NsiI 부위 내로 삽입함으로써 마찬가지로 구축하였다. 델타-9 지방산 데새투라제 (D9)를 발현하는 플라스미드 pMT061을 Po1g 게놈 DNA (등록 번호: XM_501496)로부터 증폭시키고, 프라이머 MT283 및 MT284로 제한 부위 PmlI 및 BamHI을 사용하여 php4d 프로모터의 제어 하에 pINA1269 내로 삽입하였다.
다중 유전자 (pMT050, pMT065, pMT066, pMT073, pMT074, pMT075, pMT078, pMT079)를 발현하는 플라스미드를 제조하기 위해, 프로모터-유전자-터미네이터 카세트를 프라이머 MT220 및 MT265를 사용하여 1개의 플라스미드로부터 증폭시켰다. 그 후, 이를 DpnI 및 AseI로 소화시키고, NruI 및 AseI로 소화된 제2 플라스미드 내로 삽입하여 탠덤 유전자 구축물 pMT065를 생성하였다. AseI 제한 부위를 그것이 암피실린 저항성 마커 내에 있기 때문에 선택을 용이하게 하기 위해 선택하였다. NruI은 평활 말단 제한 부위이기 때문에, 삽입의 라이게이션은 NruI 부위의 총 수를 증가시키지 않으며, 따라서 동일한 공정을 이용하여 반복 삽입이 가능하다. 이들 플라스미드의 조합 구축에 사용된 전체 서열 및 반응식은 도 7에 기재되어 있다. 상보적 벡터의 구축을 위해, pACYCDUET-1을 그것이 상이한 백본, 선택적 마커 및 복제 원점을 이용하기 때문에 상보적 셔틀 벡터로서 선택하였다. LIP2의 상류 서열 (등록 번호: XM_500282)을 프라이머 쌍 MT316 - MT317을 사용하여 와이. 리폴리티카 Po1g 게놈 DNA로부터 증폭시키고, 제한 부위 BamHI 및 EcoRI을 사용하여 pDUET 내로 통합시켰다. LIP2의 하류 서열을 프라이머 쌍 MT318 - MT319를 사용하여 증폭시키고, 제한 부위 KpnI 및 AvrII를 사용하여 pDUET 내로 통합시켰다. 효모 우라실 독립영양을 위한 선택적 마커를 프라이머 쌍 MT314 - MT315를 사용하여 플라스미드 JMP62-URA로부터 증폭시키고, 제한 부위 PvuI 및 KpnI을 사용하여 pDUET 내로 통합시켰다. 얻어진 플라스미드 pMT091은 상류 및 하류 LIP2 서열에 의해 플랭킹된 다중-클로닝 부위 및 URA3 마커를 함유하였다. 제한 효소 SacII로의 소화는 플라스미드를 선형화하고, 외래 및 불필요한 DNA의 통합을 최소화하면서 플라스미드 백본으로부터의 통합 벡터를 분리한다. 상보적 플라스미드의 사용은 원래의 pINA1269 백본 상의 발현 카세트의 구축 및 그 후 제한 효소 서브클로닝을 이용한 카세트의 pMT091로의 운반을 요구한다. 거대 다중-클로닝 부위 및 차등 항생제 마커는 클로닝 및 선택 공정을 용이하게 한다.
RNA 단리 및 전사체 정량화
42시간 동안 성장시킨 진탕 플라스크 배양물을 수집하고, 10,000g에서 5 분 동안 원심분리하였다. 각각의 펠릿을 트리졸 시약 (인비트로젠 (Invitrogen)) 1.0 ml에 재현탁시키고, 산-세척된 유리 비드 100 μL를 첨가하였다 (시그마-알드리치). 튜브를 4℃에서 15분 동안 볼텍싱하여 세포 용해가 일어나게 하였다. 그 후, 튜브를 12,000g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 새로운 2-mL 튜브에 수집하였다. 그 후, 200 μL 클로로포름을 첨가하고, 튜브를 10초 동안 수동 진탕하였다. 튜브를 다시 12,000g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상부 수성 상 400 μL를 새로운 튜브로 옮기고, 동등 부피의 페놀-클로로포름-이소아밀 알콜 (pH 4.7) (암비온 (Ambion), 미국 텍사스주 오스틴 소재)을 첨가하였다. 튜브를 다시 10초 동안 수동 진탕하고, 12,000g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상부 상 250 μL를 동등 부피의 차가운 에탄올 및 1/10 부피의 아세트산나트륨 (pH 5.2)을 갖는 새로운 튜브로 옮겼다. 튜브를 -20℃에서 30분 동안 냉각시켜 침전을 촉진시켰다. 그 후, 튜브를 12,000g에서 5분 동안 원심분리하고, 70％ 에탄올로 2회 세척하고, 60℃ 오븐에서 건조시키고, 마지막으로 RNAse 무함유 물에 재현탁시켰다. RNA 양을 나노드롭 (NanoDrop) ND-1000 분광광도계 (나노드롭 테크놀로지즈 (NanoDrop Technologies), 미국 델라웨어주 윌밍톤(Wilmington, DE) 소재)를 사용하여 분석하고, 샘플을 -80℃ 동결기에 저장하였다. qRT-PCR 분석을 바이오-라드 아이시클러 (Bio-Rad iCycler) iQ 실시간 PCR 검출 시스템을 이용하여 SYBR 그린 (바이오-라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)을 갖는 아이스크립트 원-스텝 RT-PCR 키트를 사용하여 수행하였다. 형광 결과를 실시간 PCR 마이너를 사용하여 분석하고, 상대적 정량화 및 통계적 분석을 참조 유전자로서 액틴 및 참조 균주로서 MTYL038을 사용하여 REST 2009 (퀴아젠)으로 측정하였다 (문헌 [Zhao and Fernald 2005]). 샘플은 4회 분석하였다.
지질 추출 및 정량화
총 지질을 폴치 (Folch) 등에 의한 절차를 이용하여 추출하였다 (문헌 [Folch et al. 1957]). 측정된 양의 세포 바이오매스 (대략 1 mg)를 클로로포름:메탄올 (2:1) 용액 1 mL에 현탁시키고, 1시간 동안 볼텍싱하였다. 원심분리 후, 500 μL를 125 μL 염수 용액에 옮겼다. 상부 수성 층을 제거하고, 바닥 층을 증발시키고, 100 μL 헥산에 재현탁시켰다. 그 후, 샘플을 에스테르교환까지 -20℃에서 저장하였다.
총 지질 추출물의 에스테르교환을 각각 샘플에 메탄올 중 1 mL 2％ (wt/vol) 황산을 첨가함으로써 수행하였다. 샘플을 이어서 60℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 샘플을 부분적으로 증발시키고, 지방산 메틸 에스테르 (FAME)를 1 mL 헥산을 첨가하고, 10분 동안 볼텍싱함으로써 추출하였다. 800 μL의 이 헥산을 그 후 GC 분석을 위해 유리 바이알 내에 옮겼다.
불꽃-이온화 검출기 및 모세관 칼럼 에이치피-이노왁스 (30 m x 0.25 mm)가 장착된 브루커 450-GC 기기를 사용하여 FAME의 GC 분석을 수행하였다. GC 오븐 조건은 다음과 같았다: 150℃ (1분), 10분 동안 230℃로 상승, 2분 동안 230℃에서 유지. 분할 비는 10:1이었다. 메틸 트리데카노에이트 (C13:0)로 표준화된 시판되는 FAME 표준과 비교하여 지방산을 확인하고, 정량화하였다. 5종의 FAME, 즉, 메틸 팔미테이트 (C16:0), 메틸 팔미톨레에이트 (C16:1), 메틸 스테아레이트 (C18:0), 메틸 올레에이트 (C18:1), 메틸 리놀레에이트 (C18:2) (시그마-알드리치)에 대한 전체 지방산 함량의 합으로 전체 지질 함량을 계산하였다. 클로로포름-메탄올 추출액에 대한 트리데칸산의 첨가물을 내부 표준으로 사용하였고, 이는 전체 분석 절차 내내 수행되었으며, 그의 메틸 에스테르로 에스테르교환되었다.
결과 & 논의
상보적 벡터 구축은 DGA 의 발현에 대한 대안적 방법을 가능하게 한다.
와이. 리폴리티카에서 유전자 발현을 위한 대안적 및 상보적 방법을 제공하기 위해, URA 마커를 모 균주 Po1g에서 녹아웃시켰다. 상보적 통합 벡터의 설계의 일부로서, 리파제 LIP2 유전자를 이 유전자가 잘 특징화되어있고 드 노보 지질 합성 및 축적에 대한 무시할 수 있거나 또는 중립의 효과를 가질 가능성이 있기 때문에 도킹 부위로서 선택하였다. 따라서 상보적 벡터를 통합하는 공정에서, LIP2는 녹아웃될 것이다. 유전자 발현에 대한 상보적 벡터의 구축 시, 유전자의 발현이 어느 형질전환 벡터가 사용되었는지에 따라 영향을 받을지에 대해 검사가 필요하였다. 이를 시험하기 위해, 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGA)를 코딩하는 유전자를 pMT015 및 pMT091 벡터 둘 다 내에 클로닝하였다. 발현 카세트는 두 벡터 모두에서 동일한 반면, 도킹 부위는 상이하였다: pMT015 (및 모든 pINA1269-기반 벡터)에 대한 pBR322 도킹 부위, 및 pMT091에 대한 LIP2 유전자. 이들 벡터의 형질전환 및 게놈 통합의 확인 시, 추출된 RNA의 RT-PCR을 두 균주 모두에 대해 수행하였으며, 두 경우 모두에서 대조군 균주 (MTYL038)에 비해 DGA의 과다발현을 검사하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 두 균주 모두는 MTYL038 대조군 균주에 비해 DGA 발현의 32배 증가를 나타냈다. 이들 결과는 가능한 후성적 현상으로부터의 검출가능한 간섭 없이 상보적 벡터로서의 pMT091 및 유전자 발현에 대한 대안적 도킹 부위로서의 LIP2의 사용을 입증한다.
조합 구축물의 완전한 조사는 선택 유전자를 갖는 개선된 균주를 확인한다.
유전자 표적의 기여 및 상호작용을 조사하기 위해, 다양한 중간체 유전자 발현 조합에 걸쳐 조사를 수행하여, 형질전환된 균주의 지질 생산 능력을 시험하였다. 표 7은 13개의 구축된 균주 및 이들의 상응하는 유전자 상향조절을 기재한다. 지질 축적뿐만 아니라 지질 생산성을 비교하기 위해 지질 측정을 모두 100시간의 배양 후 수행하였다. 산업적 목적상, 느리게 성장하며 높은 수율을 생산하는 균주는, 빠르게 성장하며 중간정도로 높은 수율의 균주보다 여전히 덜 유용할 수 있기 때문에 전체 생산성이 총 지질 함량보다 더 중요한 측정치이다. 지질 생산성 및 수율의 완전한 조사의 결과는 도 9에 도시된다.
단일 유전자 과다발현 (MTYL040, MTYL053, MTYL050, MTYL061)만을 함유하는 균주의 검사 후, ACC 및 DGA는 생산성 및 수율 둘 다에서 명백한 개선을 가졌다. ACL 및 D9는 생산성 또는 수율 중 하나에서 어떠한 유의한 증가도 가지지 않았다. 이들 결과는 와이. 리폴리티카에 대해, ACC 및 DGA는 지질 생합성에 대해 제어를 나타내며, 속도-제한 단계인 반면, ACL 및 D9는 유사한 현상을 나타내지 않는다는 것을 나타낸다.
ACC 및 DGA의 효과는 상기 상세히 논의된 바 있으나, DGA는 지질의 격리 및 아실-coA 중간체를 고갈에 의해 추진력을 발생시키는 반면, ACC는 지질 합성으로 플럭스를 우회시키고 시토졸 아세틸-coA 풀을 더 빠르게 동원시킴으로써 수율을 증가시킨다. 2개의 유전자가 균주 MTYL065에서 조합된 경우, 이들은 균형있는 중간체로서 아실-coA를 갖는 지질 합성 경로 내의 푸시-앤드-풀 역학을 확립함으로써 상승작용적 반응을 생성시킨다.
다른 유전자와 조합된 경우, 유전자 D9는 지질 생산성에 대해 약간의 이익을 부여할 수 있었다. 예를 들어, D9 및 DGA를 과다발현하는 MTYL069는 DGA 과다발현만을 함유하는 MTYL053 보다 더 높은 지질 생산성을 가졌다. 유사하게, ACC 및 D9를 과다발현하는 MTYL066은 ACC만을 과다발현하는 MTYL040 보다 더 높은 지질 생산성을 가졌다. 그러나, ACC+D9+DGA를 과다발현하는 MTYL073은 MTYL065 보다 더 낮은 지질 생산성을 나타냈다. MTYL089 및 그의 D9-결핍 변이체, MTYL088 사이의 유의차는 없었다. 축적 및 생산성에 대한 일부 이익이 관찰된 반면, 수율에 대한 이익은 유의하지 않았다. D9가 다른 유전자와 조합되어 지질 생산만을 개선시킨다는 관찰은 D9는 지질 합성 공정에 비해 강한 조절 또는 속도-제한 제어를 갖지 않으나, 그의 효소적 작용은 다른 유전자의 효과를 확대하는 호의적인 조건을 제공한다는 점을 제시한다. 지질체 막 및 소포체 상의 막-연관 효소로서, D9는 지질 축적기 중에 상향조절된다 (문헌 [Morin et al. 2011]). 여러 지질 합성 효소는 D9 탈포화의 생성물인 올레에이트에 대해 가장 높은 특이성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Oelkers et al. 2002]). 이는 또한 와이. 리폴리티카가 탄소원으로서 올레에이트 상에서 매우 빠르게 성장하고, 이 기질로부터 성장하여 광범위하게 연구되었다는 관찰에서 입증된다 (문헌 [Beopoulos et al. 2008; Fickers et al. 2005]). 따라서, 올레에이트의 증가된 농도는 지질 생산 또는 수율을 특이적으로 유도하지는 않는 반면, 지방산 풀이 더 빠르게 격리되도록 형질전환시킨다. 이는 격리 증가는 지질 합성이 다른 조작에 의해 이미 상향조절된 경우에만 발생할 것이기 때문에, 최종적으로 수율의 증가 없이 더 빠른 속도의 지질 축적을 초래한다.
이에 반해서, ACL 과다발현을 다른 유전자와 조합하는 경우, 지질 생산성은 감소하는 경항을 가졌다. MTYL078 및 MTYL079는 ACC 및/또는 D9를 과다발현함에도 불구하고 지질 생산에서 유의한 증가를 나타내지 않았다. ACC+ACL+DGA를 갖는 MTYL088은 대조군에 비해 지질 생산을 증가시켰으나, MTYL065에 비해 어떠한 지질 생산 개선도 나타내지 않았다. 이들 결과는 ACL은 대사 네트워크 전반에 걸쳐 탄소 플럭스의 분배에 영향을 줄 수 있는 반면, ACL의 과다발현은 독립적으로 또는 다른 지방형성 개선과 조합되어, 지질 생산을 유의하게 촉진시키지 않으며, 대부분의 경우 지질 생산성을 낮춤을 나타낸다. 이는 ATP 시트레이트 리아제는 비-유지성 효모에 비해 유지성 효모에서 구별되어 발현되는 효소인 반면, 다양한 유기체에서의 유전자의 활성은 측정된 올레아지니시티(oleaginicity)와 상관관계가 없다는 관찰과 유사하다 (문헌 [Boulton and Ratledge 1981]).
지질 조사로부터의 또다른 관찰은 DGA의 발현은 다수의 다른 표적과 함께 생산성 및 수율 둘 다에서 유사한 반응을 전형적으로 야기한다는 것이다. 이들 구축물에서 발생하는 발현 또는 활성에서의 일부 포화가 있는 것이 가능한 반면, 이러한 정체된 반응은 또한 이 조사에서의 측정된 특징이 고정기 지질 축적 또는 생산성이 아니라 초기 전체 생산성이었기 때문에 사용된 실험의 제한으로 인한 것일 수 있다. 추가로, 균주 MTYL065는 가장 강한 생산성을 명백히 나타낸 반면, 수율은 여러 정체된 균주와 상대적으로 유사하였다. 이는 이들 균주 모두는 플럭스를 지질로 성공적으로 우회시켜 증가된 수율을 얻는 반면, MTYL065는 높은 생산성 및 수율 둘 다를 달성하기 위해 상류 및 하류 경로에 대한 그의 균형에 있어서 예외적이라는 것을 제시한다. 이들 결과는 성장-커플링된 생성물의 대사 공학에서의 흔한 주제인, 최적의 생산성 및 수율을 달성하는데 있어서 대사 플럭스 네트워크에 대한 교란을 균형 맞추는 것의 중요성을 강조한다 (문헌 [Feist et al. 2010; Tyo et al. 2007]).
완전한 구축물의 RT - PCR 분석은 MTYL089 에서의 과다발현을 나타낸다.
지질 조사의 정체된 영역을 탐구하기 위해, ACC+D9+ACL12+DGA를 과다발현하는 균주 MTYL089를 추가로 조사하였다. 상기 균주를 2개의 플라스미드, pMT079 및 pMT092의 와이. 리폴리티카의 ΔLEU 및 ΔURA MTYL100 배경 균주로의 형질전환으로부터 구축하였다. 2개의 플라스미드의 사용은, pMT079가 이미 4개의 탠덤 발현 카세트를 포함하였고 23 kb의 길이였기 때문에, 주로 플라스미드 크기 고려로 인한 것이었다. 게놈 DNA의 PCR은 각각의 개별 발현 카세트의 정확한 통합의 확인으로 균주 내에의 두 플라스미드 모두의 성공적인 통합을 확인하였다. 대조군 균주에 비해 완성되고 확인된 균주의 RT-PCR 분석은 5개 유전자 모두의 적절한 전사 과다발현을 확인하였다 (도 10). TEFin 발현하의 유일한 유전자인 DGA의 강한 과다발현은 동일한 프로모터를 이용하는 다수의 카세트로부터의 잠재적 경쟁이 있음에도 스플라이시오솜 인트론의 향상 특징을 입증한다. 인트론이 없는 TEF 프로모터의 제어하의 ACC는 가장 낮은 발현을 나타냈다. 또한 TEF 프로모터의 제어하의 ACL의 2개의 서브유닛은 hp4d 프로모터의 제어 하의 D9보다 더 높은 발현을 나타냈다. 샘플링이 지수 성장기 (여기서 hp4d가 준-성장 의존성 발현을 나타낼 수 있음 (문헌 [Madzak et al. 2000])) 훨씬 후에 발생하였으므로, hp4d 및 TEF의 구성적 발현은 모두 상대적으로 서로 가까운 것으로 보인다. 이들 결과는 표적 유전자의 충분한 과다발현을 나타낸다.
MTYL089 의 2-L 발효는 강한 지질 축적 능력을 입증한다.
균주 MTYL089에서의 유전자 발현의 확인 후, 균주의 지방형성 수행을 2-L 생물반응기 발효에서 시험하였다. 배지의 C/N 비를 지질 축적의 촉진에 도움을 주기 위해 100으로 조정하였다. C/N 비는 질소가 고갈된 후 발효에서 이용가능한 과량의 탄소를 결정하며, 시트레이트 생산에 걸쳐 지질 생산을 최적화하기 위한 섬세한 균형잡기를 종종 요구한다 (문헌 [Beopoulos et al. 2009]). 도 11은 배치 발효의 기간에 대한 시간 프로파일을 나타낸다. 발효 185시간 후, 모든 90 g/L의 글루코스가 소비되면서, 26 g/L의 바이오매스 (건조 세포 중량) 및 지질 0.109 g/L/hr의 생산성에 대해 76.8％의 주목할만한 지질 함량을 수득한다. 글루코스에 대한 지질의 전체 수율은 지질 0.227 g/글루코스 g이었으며, 이는 이론적 최대 수율의 70％이다. 지질 축적기 중, 66 내지 185시간에서, 각각 지질 0.154 g/L/hr 및 지질 0.277 g/글루코스 g에서 최대 지질 생산성 및 수율을 달성하였으며, 상기 수율은 최대 이론적 수율의 85％로 증가한다.
도 12에 나타낸 발효의 끝에서의 세포 배양의 현미경검사는 모든 세포가 사실상 세포의 전체 부피를 차지하는 큰 공포를 함유하는 것을 나타낸다. 담적색(Nile red) 염색 및 형광은 공포가 대부분 중성 지질로 이루어진 것을 나타낸다. 전형적으로 덜 생산적인 소수 균사 세포조차도 (문헌 [Coelho et al. 2010]) 유의한 지질 축적을 나타내어 세포의 길이에 따라 다수의 지질체를 생산한다.
배양물에서 관찰된 지질의 극적인 축적에도 불구하고, 다수의 특징이 특히 MTYL065를 사용한 이전 연구과 비교하여 바람직하지 않은 것으로 나타났다. 먼저, 75시간에서 시작되는 지질 생산을 수반하여 발생하는 유의한 양의 시트레이트 생산이 있었다. 시트레이트는 지질 생합성 경로의 중간체이며, 옥살로아세테이트 및 지방형성 전구체 아세틸-coA로의 효소적 전환을 위한 ATP 시트레이트 리아제를 이용한다. MTYL089 균주에서의 두 ACL 효소 모두의 과다발현에도 불구하고, 시트레이트의 축적은 여전히 관찰되었다. C/N 비가 너무 높아서, 지질 생산 대신 시트레이트 생산으로 이어지는 것으로 보여질 수 있으나 (문헌 [Beopoulos et al. 2009]), 본 발명자의 결과는 시트레이트 및 지질 둘 다가 동시에 생성되는 것으로 나타난다. 두 생성물 모두의 이러한 커플링된 생산은 별개의 균주 MTYL065로의 실험에서 관찰된 지질 생산기에 이은 시트레이트 생산기와 상이하다. 추가로, C/N 비는 MTYL065의 배치 발효에 맞추어졌는데, 이는 이러한 큰 양의 시트레이트 생산을 나타내지 않았다. 이는 경로 내에의 높은 상류 플럭스와 조합된 발효 조건 하의 불충분한 양의 ATP 생성이 세포내 시트레이트 풀의 축적으로 이어졌으며, 최종적으로 분비로 이어졌을 가능성이 더 크다는 것을 나타낸다. 추가로, 유의하게 더 낮은 생산성이 MTYL089에서 관찰되었다. 통기가 발효 전반에 걸쳐 불변으로 유지되기 때문에, 산소-제한 성장은 발효의 마지막 단계에서 예상된다. 그러나, 선형 성장의 개시는 MTYL065보다 이 발효에서 훨씬 앞서 발생하였으며, 이는 바이오매스 농도가 대략 6 g/L에 도달한지 단지 1일 후에 발생하였다. 선형 성장의 앞선 개시는 더 긴 발효 시간을 야기하였으며, 따라서 더 높은 지질 함량에도 불구하고 더 낮은 생산성을 야기하였다. 통기가 또한 MTYL065의 발효 조건에 맞추어졌기 때문에 MTYL089의 대사 변화가 성장에 대해 더 큰 제한을 두는 가능성이 있다. 반면, MTYL089는 MTYL065에서의 지질 0.195 g/글루코스 g에 비해 0.227 g/g의 더 나은 전체 지질 수율을 나타냈다. 이는 또한 17.6 g/L에 비해 20.2 g/L 지질의 더 높은 역가로 발효를 종료하였다.
표 8은 균주 MTYL065 및 MTYL089의 2-L 발효 사이의 주요 성능 특성의 비교를 요약한다. 지방산 프로파일의 비교 (도 13)는 단일불포화 지방산 팔미톨레에이트 및 올레에이트에 대한 더 강한 선호도를 갖는 균주 사이의 지방산의 분배에서의 약간의 변화만을 나타낸다. ACL 및 D9 과다발현의 추가의 효과는 지질 합성에 대한 플럭스를 증가시키는 것으로 보이나, 성장 속도에 대한 상당한 대가가 있다. 추가로, 세포 대사에 의한 ATP 생성에서의 맞는 증가는 없기 때문에, 시트레이트는 지질 합성 경로에서 이용되기보다는 부산물로서 분비된다. 지질 합성 및 저장은 공급원에 대한 성장과 강하게 경쟁할 수 있기 때문에, 긴밀한 조절이 이 활성을 감당하기 위해 일반적으로 필요하다 (문헌 [Tehlivets et al. 2007]). 이들 4개의 유전자 표적의 과다발현은 많은 이 조절을 밝혔으며, 결과적으로 본 발명자들은 세포 성장 및 지질 생산의 우선순위화 사이의 강한 경쟁을 관찰한다. 대사 공학에서의 흔한 주제로서, 특정 생성물의 생산을 최대화하는 것은 종종 목적 생성물로의 플럭스 및 유기체의 전반적인 건강 및 성장을 균형잡는 것을 요구한다. MTYL065 및 MTYL089 사이의 대조는 이 필요성을 명백히 입증하며, MTYL065는 지질 합성 경로를 통해 더 최적화된 플럭스를 예시한다.
결론
지질 생합성의 성분은 익히 공지되어 있지만, 여전히 어떻게 유전자 교란이, 특히 조합으로, 이 경로를 통해 능력 및 플럭스에 영향을 주는지에 대해 많이 알려지지 않았다. 유지성 효모 와이. 리폴리티카를 연구함으로써, 본 발명자들은 지질 생산에 대한 천연 능력을 갖는 숙주 유기체를 이용하여 대사 공학이 지질 생산성 및 수율을 개선시킬 수 있는 정도를 연구할 수 있다. 본 발명자들은 4개의 유전자 표적 - ACC, D9, ACL, DGA -를 연구하여 모든 4개의 표적 과다발현을 갖는 균주를 갖는 2-L 생물반응기에서 76.8％의 주목할만한 지질 함량을 달성할 수 있다. 조합 과다발현을 통한 이들 유전자 표적의 추가의 조사에 의해, 본 발명자들은 지질 생산에 대한 이들 유전자의 양성 영향의 순위를 매길 수 있었으며, 여기서 DGA 및 ACC는 강한 양성 기여자이며, D9는 다른 유전자와 조합된 경우에만 약간의 기여를 하며, 끝으로 ACL은 유의한 양성 기여를 하지 않는다. 본 발명자들은 또한 개별 효과 사이의 가능한 상호작용을 조사하여, ACC 및 DGA 사이의 가장 강한 상승작용적 상호작용을 확인할 수 있었다. 미생물 지질의 생산은 넓은 범위의 용도를 가지며, 바이오디젤의 생산에서의 그의 이용에 대해 빠른 주목을 받는다. 지질 합성의 중앙 경로의 대사 공학은 이들 미래 기술 및 공정을 가능하게 하는 실마리를 제공하는데 있어서 중요할 것이다.
참조문헌
Figure 112014046108244-pct00024
Figure 112014046108244-pct00025
Figure 112014046108244-pct00026
Figure 112014046108244-pct00027
표 6. 본 연구에 사용된 균주 및 플라스미드
Figure 112014046108244-pct00028
표 7. 4개의 표적: 아세틸-coA 카르복실라제 (ACC), 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (DGA), ATP: 시트레이트 리아제 (ACL12), 및 Δ9-데새투라제 (D9)에 대한 과다발현 카세트의 존재 (+) 또는 부재 (-)로 표지한, 지질 축적에 대해 검사된 모든 균주의 목록.
Figure 112014046108244-pct00029
표 8. 균주 MTYL065 및 MTYL089 사이의 발효 특징의 비교. 2-L 생물반응기에서 수행된 두 발효 모두의 C/N 비는 100이었음. 글루코스 반응기는 90g/L 글루코스로 초기에 충전됨.
Figure 112014046108244-pct00030
표 9. 본 연구에 사용된 프라이머. 관련 제한 부위는 볼드체임.
Figure 112014046108244-pct00031
실시예 3.
물질 및 방법
효모 균주, 성장, 및 배양 조건
실시예 1에서 논의된 바와 같은 야로위아 리폴리티카의 ACC+DGA1 형질전환체 균주 (MTLY065)를 본 섹션에 기재된 실험에서 사용하였다. YPD 배지를 실시예 1에 기재된 바와 같이 준비하였다. 생물반응기에서 사용된 배지 구성성분은 효모 질소 염기 (아미노산 및 황산암모늄 없음) (암레스코(Amresco)), 효모 추출물 (디프코), 황산암모늄 (매크론 케미칼스(Macron Chemicals)), 아세트산나트륨 (매크론 케미칼스) 및 아세트산 (시그마 알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)이었다. 생물반응기 실행을 2L 배플 교반 탱크 반응기에서 수행하였다. 생물반응기에 대한 접종물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 준비하였다.
생물반응기 작동: 아세테이트, 아세트산, 및 황산암모늄 공급
반응기내 초기 배지 조성물은 30 g/L 아세트산나트륨, 2.5 g/L 효모 추출물, 4.25 g/L 효모 질소 염기 및 2.4 g/L 황산암모늄이다. 본 섹션에 기재된 실험에서 사용된 효모 추출물 및 효모 질소 염기 농도는 실시예 1에서 논의된 것에 비해 더 높았다. 바이오매스 생산에 충분한 질소를 제공하도록 탄소 대 질소 비 (C/N)를 20으로 선택하였다. 캐스케이드 제어를 사용하여 반응기에서 불변 용존 산소 수준을 항상 20％로 유지하였다. pH 설정점을 7.3으로 사용하였다.
높은 세포 밀도를 생성한 다음 이를 지질 축적을 위한 플랫폼으로서 역할하도록 하기 위하여, 아세트산을 공급함으로써 30 g/L 아세트산나트륨의 탄소원을 보충하는 전략을 고안하여 실행하였다. 아세트산의 사용은 성장 및 분열하는 세포에 탄소원을 제공하는 동시에 pH 제어를 제공하는 이중 목적에 기여하는, 여러 이점을 가졌다. 성장 초기 기간에 낮은 C/N 비를 유지하기 위하여, 질소 공급원을 아세트산과 동시에 공급하였다. 성장 초기 기간은 30％ (vol/vol) 아세트산의 리터 당 15 g/L 황산암모늄을 공급하는 것을 포함하였다. 다음 공급은 순수한 100％ 아세트산 (및 황산암모늄 없음)을 함유하였고, 이에 따라 질소가 세포에 의해 소모되고 배지로부터 고갈되기 때문에 C/N 비의 증가가 창출되고, 결과적으로 지질 축적이 향상되었다.
실행의 초반에 작동 부피는 1.6 L였다. 1 L의 상기 산 및 황산암모늄 용액 처음 60시간에 거쳐 추가하였다. 대략 200 ml의 순수한 아세트산을 다음 40시간에 거쳐 추가하였다. 배양물 부피는 측정의 목적으로 24시간마다 수행된 샘플링 외에 어떠한 시점에서도 제거되지 않았다. 반응기에 들어가는 추가의 부피를 보완하도록, 액체를 증발하도록 하였다. 높은 통기 속도 (2.5 vvm)는 충분한 증발을 유도하는데, 이는 반응기의 부피를 유지하는데 도움을 준다. 증발이 있었음에도, 브로쓰의 부피는 실행 중에 대략 1.8 L까지 약간 상승하였다.
배양물 브로쓰의 광학 밀도 (OD)를 24시간마다 측정하였다. 샘플을 지질 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다. HPLC 분석은 반응기에서의 아세테이트 수준을 산출하였다. 암모늄을 YSI 7100 암모늄 전극 (YSI 라이프 사이언시스(YSI Life Sciences))으로 측정하였다. 바이오매스는 실시예 1에서 논의된 바와 같이 측정되었다.
지질 분석
지질 분석은 직접 에스테르교환 프로토콜을 포함하는데, 이는 U.S. 특허 7,932,077 및 문헌 [Griffiths et al. LIPIDS (2010) 45:1053-1060]으로부터 적합화되며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 상기 프로토콜은 0.5 N 메톡시드 나트륨 및 18 M 황산 (시그마 알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)을 사용한다. 메톡시드 나트륨을 수산화나트륨 (매크론 케미칼스) 및 메탄올 (시그마 알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)을 사용하여 인하우스(in-house) 생성하였다. 500 μl의 상기 0.5 N 메톡시드 나트륨을 먼저 1 mg의 펠렛화된 세포 샘플에 첨가한 다음, 1시간 동안 볼텍싱하였다. 이에 뒤이어 40 μl 황산 및 500 μl 헥산을 첨가하고, 30분 동안 또다른 볼텍싱 단계에 의해 에스테르교환된 메틸 에스테르를 헥산내에 용해시켰다. 반응 혼합물을 8000 rpm에서 1분 동안 원심분리하고, 800 μl의 상부 헥산 상을 GC 바이알내로 옮기고 GC-FID에서 분석하였다. 방법을 작동하는 GC 칼럼, 및 최종 분석은 트리데칸산 대신 대조군으로서 글리세릴 트리헵타데카노에이트를 사용한 점을 제외하고는 실시예 1에서 논의된 방법에 따랐다.
결과 및 논의
생물반응기 실행의 결과를 표 10에 요약하였다.
표 10. 아세테이트를 갖는 생물반응기 실행의 결과
Figure 112014046108244-pct00032
도 14 및 15는 대표적인 아세테이트 생물반응기 실행 동안 질소, 비-지질 및 지질 역가, 지질 함량 및 C/N 비의 경향을 나타낸다. 질소를 반응기 내에 피딩한 경우, 비-지질 바이오매스는 성장 초기 기간 동안 상승하였다. 48시간 후, 거의 모든 바이오매스 증가는 지질 축적으로 인한 것이었다. 상기 기간에, 세포는 0.24 g/g의 수율 및 1 g/L/h의 속도로 지질을 합성하여 55 g/L의 최종 지질 역가를 생성하였고, 이는 실시예 1에 기재된 실험에서 달성된 역가보다 적어도 10배 더 높다. 그러나, 최종 지질 함량 및 전체 지질 수율은 실시예 1의 지질 함량 및 전체 지질 수율과 매우 유사하였다. 상기 수치는 사용된 미생물 균주에 대체로 의존한다. 상기 지질의 거의 70％는 올레에이트인 것으로 밝혀졌고, 이는 실시예 1에 기재한 결과와 일치한다.
본원에 논의된 실행은 상기 언급한 작동 전략 및 최적의 공정 조건의 선정을 통해 ACC+DGA1 돌연변이체를 이용하는 지질 생산을 극대화하는 것을 목적으로 하였다. 상기 실행의 결과와 실시예 1에 나타낸 것과의 비교를 하기 표 11에 나타내었다. 10배의 역가 향상 및 14배의 전체 생산성 향상이 아세테이트 실행간에 나타난다.
표 11. 실시예 1에 나타낸 실행과 아세테이트상의 실행의 비교
Figure 112014046108244-pct00033
원심분리에서 높은 지질 함량 (80％ 초과)을 갖는 세포는 가라앉지 않고 상부에 유동한다. 이러한 세포는 현미경 하에 오일로 가득한 것으로 나타난다. 도 16은 담적색으로 염색시 유침 현미경 (100x)하의 그러한 세포를 나타낸다. 밝은 스팟이 지질 공포이다.
본원 명세서에 언급된 모든 출판물, 특허 및 서열 데이터베이스 목록은 개별 출판물 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것처럼 그 전문이 이로써 참조로 포함된다. 저촉의 경우, 본원이 본원의 임의의 정의를 포함하여 규제할 것이다.
등가물 및 범위
당업자는 통상적인 실험만을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 명세서에 제한되는 것을 의도하지는 않으나, 첨부된 특허청구범위에 제시된 것과 같다.
청구항에서, "a", "an" 및 "the"와 같은 관사는 반대로 표시되거나 달리 문맥으로부터 명백하지 않은 경우 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 하나의 그룹의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"이 포함된 청구범위 또는 명세서는 반대로 표시되거나 달리 문맥으로부터 명백하지 않은 경우, 그룹 구성원의 하나, 하나 초과, 또는 모두가 특정 생성물 또는 공정에서 존재하거나, 사용되거나, 그렇지 않으면 그와 관련되는 경우에 충족되는 것으로 사료된다. 본 발명은 그룹 중 정확히 하나의 구성원이 특정 생성물 또는 공정에서 존재하거나, 사용되거나, 그렇지 않으면 그와 관련되는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 또한 그룹 구성원의 하나 초과 또는 모두가 특정 생성물 또는 공정에서 존재하거나, 사용되거나, 그렇지 않으면 그와 관련되는 실시양태를 포함한다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 청구항 또는 명세서의 관련 부분으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 절, 서술적 용어 등이 또다른 청구항내에 도입되는 모든 변형, 조합, 및 치환을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 또다른 청구항에 종속하는 임의의 청구항은 동일한 기초 청구항에 종속하는 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하도록 변경될 수 있다. 또한, 청구항이 조성물을 재인용하는 경우, 달리 표시되지 않는 한 또는 모순 또는 불일치가 발생할 것이 당업자에게 명백하지 않은 한, 본원에 개시된 임의의 목적을 위한 조성물을 사용하는 방법이 포함되고, 본원에 개시된 임의의 제조 방법 또는 당업계에 공지된 방법에 따라 조성물을 제조하는 다른 방법이 포함되는 것으로 이해될 것이다.
요소가 목록으로서, 예컨대 마쿠쉬 그룹 형식으로 표시되는 경우, 상기 요소의 각각의 하위그룹도 개시되어 있는 것이고, 임의의 요소(들)이 상기 그룹으로부터 제거될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 용어 "포함하는"은 개방된 것을 의도하고 추가의 요소 또는 단계의 포함을 허용한다는 것에 주의한다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 측면이 특정한 요소, 특징, 단계 등을 포함하는 것으로 언급된 경우, 본 발명 또는 본 발명의 측면의 특정 실시양태가 그러한 요소, 특징, 단계 등으로 이루어지거나 그로 본질적으로 이루어지는 것으로 이해되어야 한다. 단순성의 목적을 위해, 이들 실시양태는 본원에서 이에 구체적으로 제시되지 않았다. 따라서, 하나 이상의 요소, 특징, 단계 등을 포함하는 본 발명의 각각의 실시양태에 대해, 본 발명은 또한 이들 요소, 특징, 단계 등으로 이루어지거나 본질적으로 이루어지는 실시양태를 제공한다.
범위가 특정되는 경우, 종점은 포함된다. 더불어, 달리 표시되지 않거나 달리 문맥 및/또는 당업자의 이해로부터 명백하지 않은 한, 범위로서 나타낸 값은 문맥이 달리 분명하게 구술하지 않는 경우 본 발명의 다른 실시양태에 명시된 범위에 속하는 임의의 특정한 값을 상기 범위의 하한치의 단위의 10분의 1로 취할 수 있음이 이해되어야 한다. 달리 나타내지 않거나 문맥 및/또는 달리 당업자의 이해로부터 명백하지 않은 한, 범위로서 나타낸 값은 상기 특정 범위 내에 속하는 임의의 부분범위를 취할 수 있고, 여기서 부분범위의 종점은 상기 범위의 하한치의 단위의 10분의 1과 동일한 정도의 정확도로 나타내지는 점이 또한 이해되어야 한다.
추가로, 본 발명의 임의의 특정한 실시양태는 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명백하게 배제될 수 있음이 이해되어야 한다. 범위가 특정된 경우, 범위에 속하는 임의의 값은 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명백하게 배제될 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 임의의 실시양태, 요소, 특징, 적용, 또는 측면은, 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 배제될 수 있다. 간결성의 목적을 위해, 하나 이상의 요소, 특징, 목적, 또는 측면이 배제된 모든 실시양태는 본원에 명백하게 제시되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Massachusetts Institute of Technology Stephanopoulos, Gregory Tai, Mitchell Chakraborty, Sagar <120> ENGINEERED MICROBES AND METHODS FOR MICROBIAL OIL PRODUCTION <130> M0656.70253WO00 <140> Not yet assigned <141> 2012-10-19 <150> US 61/548,901 <151> 2011-10-19 <150> US 61/663,263 <151> 2012-06-22 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1545 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 1 atgactatcg actcacaata ctacaagtcg cgagacaaaa acgacacggc acccaaaatc 60 gcgggaatcc gatatgcccc gctatcgaca ccattactca accgatgtga gaccttctct 120 ctggtctggc acattttcag cattcccact ttcctcacaa ttttcatgct atgctgcgca 180 attccactgc tctggccatt tgtgattgcg tatgtagtgt acgctgttaa agacgactcc 240 ccgtccaacg gaggagtggt caagcgatac tcgcctattt caagaaactt cttcatctgg 300 aagctctttg gccgctactt ccccataact ctgcacaaga cggtggatct ggagcccacg 360 cacacatact accctctgga cgtccaggag tatcacctga ttgctgagag atactggccg 420 cagaacaagt acctccgagc aatcatctcc accatcgagt actttctgcc cgccttcatg 480 aaacggtctc tttctatcaa cgagcaggag cagcctgccg agcgagatcc tctcctgtct 540 cccgtttctc ccagctctcc gggttctcaa cctgacaagt ggattaacca cgacagcaga 600 tatagccgtg gagaatcatc tggctccaac ggccacgcct cgggctccga acttaacggc 660 aacggcaaca atggcaccac taaccgacga cctttgtcgt ccgcctctgc tggctccact 720 gcatctgatt ccacgcttct taacgggtcc ctcaactcct acgccaacca gatcattggc 780 gaaaacgacc cacagctgtc gcccacaaaa ctcaagccca ctggcagaaa atacatcttc 840 ggctaccacc cccacggcat tatcggcatg ggagcctttg gtggaattgc caccgaggga 900 gctggatggt ccaagctctt tccgggcatc cctgtttctc ttatgactct caccaacaac 960 ttccgagtgc ctctctacag agagtacctc atgagtctgg gagtcgcttc tgtctccaag 1020 aagtcctgca aggccctcct caagcgaaac cagtctatct gcattgtcgt tggtggagca 1080 caggaaagtc ttctggccag acccggtgtc atggacctgg tgctactcaa gcgaaagggt 1140 tttgttcgac ttggtatgga ggtcggaaat gtcgcccttg ttcccatcat ggcctttggt 1200 gagaacgacc tctatgacca ggttagcaac gacaagtcgt ccaagctgta ccgattccag 1260 cagtttgtca agaacttcct tggattcacc cttcctttga tgcatgcccg aggcgtcttc 1320 aactacgatg tcggtcttgt cccctacagg cgacccgtca acattgtggt tggttccccc 1380 attgacttgc cttatctccc acaccccacc gacgaagaag tgtccgaata ccacgaccga 1440 tacatcgccg agctgcagcg aatctacaac gagcacaagg atgaatattt catcgattgg 1500 accgaggagg gcaaaggagc cccagagttc cgaatgattg agtaa 1545 <210> 2 <211> 514 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 2 Met Thr Ile Asp Ser Gln Tyr Tyr Lys Ser Arg Asp Lys Asn Asp Thr 1 5 10 15 Ala Pro Lys Ile Ala Gly Ile Arg Tyr Ala Pro Leu Ser Thr Pro Leu 20 25 30 Leu Asn Arg Cys Glu Thr Phe Ser Leu Val Trp His Ile Phe Ser Ile 35 40 45 Pro Thr Phe Leu Thr Ile Phe Met Leu Cys Cys Ala Ile Pro Leu Leu 50 55 60 Trp Pro Phe Val Ile Ala Tyr Val Val Tyr Ala Val Lys Asp Asp Ser 65 70 75 80 Pro Ser Asn Gly Gly Val Val Lys Arg Tyr Ser Pro Ile Ser Arg Asn 85 90 95 Phe Phe Ile Trp Lys Leu Phe Gly Arg Tyr Phe Pro Ile Thr Leu His 100 105 110 Lys Thr Val Asp Leu Glu Pro Thr His Thr Tyr Tyr Pro Leu Asp Val 115 120 125 Gln Glu Tyr His Leu Ile Ala Glu Arg Tyr Trp Pro Gln Asn Lys Tyr 130 135 140 Leu Arg Ala Ile Ile Ser Thr Ile Glu Tyr Phe Leu Pro Ala Phe Met 145 150 155 160 Lys Arg Ser Leu Ser Ile Asn Glu Gln Glu Gln Pro Ala Glu Arg Asp 165 170 175 Pro Leu Leu Ser Pro Val Ser Pro Ser Ser Pro Gly Ser Gln Pro Asp 180 185 190 Lys Trp Ile Asn His Asp Ser Arg Tyr Ser Arg Gly Glu Ser Ser Gly 195 200 205 Ser Asn Gly His Ala Ser Gly Ser Glu Leu Asn Gly Asn Gly Asn Asn 210 215 220 Gly Thr Thr Asn Arg Arg Pro Leu Ser Ser Ala Ser Ala Gly Ser Thr 225 230 235 240 Ala Ser Asp Ser Thr Leu Leu Asn Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Ala Asn 245 250 255 Gln Ile Ile Gly Glu Asn Asp Pro Gln Leu Ser Pro Thr Lys Leu Lys 260 265 270 Pro Thr Gly Arg Lys Tyr Ile Phe Gly Tyr His Pro His Gly Ile Ile 275 280 285 Gly Met Gly Ala Phe Gly Gly Ile Ala Thr Glu Gly Ala Gly Trp Ser 290 295 300 Lys Leu Phe Pro Gly Ile Pro Val Ser Leu Met Thr Leu Thr Asn Asn 305 310 315 320 Phe Arg Val Pro Leu Tyr Arg Glu Tyr Leu Met Ser Leu Gly Val Ala 325 330 335 Ser Val Ser Lys Lys Ser Cys Lys Ala Leu Leu Lys Arg Asn Gln Ser 340 345 350 Ile Cys Ile Val Val Gly Gly Ala Gln Glu Ser Leu Leu Ala Arg Pro 355 360 365 Gly Val Met Asp Leu Val Leu Leu Lys Arg Lys Gly Phe Val Arg Leu 370 375 380 Gly Met Glu Val Gly Asn Val Ala Leu Val Pro Ile Met Ala Phe Gly 385 390 395 400 Glu Asn Asp Leu Tyr Asp Gln Val Ser Asn Asp Lys Ser Ser Lys Leu 405 410 415 Tyr Arg Phe Gln Gln Phe Val Lys Asn Phe Leu Gly Phe Thr Leu Pro 420 425 430 Leu Met His Ala Arg Gly Val Phe Asn Tyr Asp Val Gly Leu Val Pro 435 440 445 Tyr Arg Arg Pro Val Asn Ile Val Val Gly Ser Pro Ile Asp Leu Pro 450 455 460 Tyr Leu Pro His Pro Thr Asp Glu Glu Val Ser Glu Tyr His Asp Arg 465 470 475 480 Tyr Ile Ala Glu Leu Gln Arg Ile Tyr Asn Glu His Lys Asp Glu Tyr 485 490 495 Phe Ile Asp Trp Thr Glu Glu Gly Lys Gly Ala Pro Glu Phe Arg Met 500 505 510 Ile Glu <210> 3 <211> 7270 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 3 atgcgactgc aattgaggac actaacacgt cggtttttca ggtgagtaaa cgacggtggc 60 cgtggccacg acagccgagg cgtcacgatg ggccagacga gcacattctc gccgccacaa 120 cctcgccagc acaagaaact aacccagtat ggcttcagga tcttcaacgc cagatgtggc 180 tcccttggtg gaccccaaca ttcacaaagg tctcgcctct catttctttg gactcaattc 240 tgtccacaca gccaagccct caaaagtcaa ggagtttgtg gcttctcacg gaggtcatac 300 agttatcaac aaggtgagta tttgacgttt agactgtata acaggcggcc gcagtgcaac 360 aacgaccaaa aagggtcgaa aaagggtcga aaacggacac aaaagctgga aaacaagagt 420 gtaatacatt cttacacgtc caattgttag acaaacacgg ctgttcggtc ccaaaaccac 480 cagtatcacc tattttccac ttgtgtctcg gatctgatca taatctgatc tcaagatgaa 540 atttacgcca ccgacatgat attgtgattt tcggattctc cagaccgagc agattccagc 600 aataccacca cttgcccacc ttcagcggcc tctcggcgcg attcgccact ttccccaacg 660 agtgttacta acccaggtcc tcatcgctaa caacggtatt gccgcagtaa aggagatccg 720 ttcagtacga aaatgggcct acgagacctt tggcgacgag cgagcaatct cgttcaccgt 780 catggccacc cccgaagatc tcgctgccaa cgccgactac attagaatgg ccgatcagta 840 cgtcgaggtg cccggaggaa ccaacaacaa caactacgcc aacgtcgagc tgattgtcga 900 cgtggctgag cgattcggcg tcgatgccgt gtgggccgga tggggccatg ccagtgaaaa 960 tcccctgctc cccgagtcgc tagcggcctc tccccgcaag attgtcttca tcggccctcc 1020 cggagctgcc atgagatctc tgggagacaa aatttcttct accattgtgg cccagcacgc 1080 aaaggtcccg tgtatcccgt ggtctggaac cggagtggac gaggttgtgg ttgacaagag 1140 caccaacctc gtgtccgtgt ccgaggaggt gtacaccaag ggctgcacca ccggtcccaa 1200 gcagggtctg gagaaggcta agcagattgg attccccgtg atgatcaagg cttccgaggg 1260 aggaggagga aagggtattc gaaaggttga gcgagaggag gacttcgagg ctgcttacca 1320 ccaggtcgag ggagagatcc ccggctcgcc catcttcatt atgcagcttg caggcaatgc 1380 ccggcatttg gaggtgcagc ttctggctga tcagtacggc aacaatattt cactgtttgg 1440 tcgagattgt tcggttcagc gacggcatca aaagattatt gaggaggctc ctgtgactgt 1500 ggctggccag cagaccttca ctgccatgga gaaggctgcc gtgcgactcg gtaagcttgt 1560 cggatatgtc tctgcaggta ccgttgaata tctgtattcc catgaggacg acaagttcta 1620 cttcttggag ctgaatcctc gtcttcaggt cgaacatcct accaccgaga tggtcaccgg 1680 tgtcaacctg cccgctgccc agcttcagat cgccatgggt atccccctcg atcgaatcaa 1740 ggacattcgt ctcttttacg gtgttaaccc tcacaccacc actccaattg atttcgactt 1800 ctcgggcgag gatgctgata agacacagcg acgtcccgtc ccccgaggtc acaccactgc 1860 ttgccgaatc acatccgagg accctggaga gggtttcaag ccctccggag gtactatgca 1920 cgagctcaac ttccgatcct cgtccaacgt gtggggttac ttctccgttg gtaaccaggg 1980 aggtatccat tcgttctcgg attcgcagtt tggtcacatc ttcgccttcg gtgagaaccg 2040 aagtgcgtct cgaaagcaca tggttgttgc tttgaaggaa ctatctattc gaggtgactt 2100 ccgaaccacc gtcgagtacc tcatcaagct gctggagaca ccggacttcg aggacaacac 2160 catcaccacc ggctggctgg atgagcttat ctccaacaag ctgactgccg agcgacccga 2220 ctcgttcctc gctgttgttt gtggtgctgc taccaaggcc catcgagctt ccgaggactc 2280 tattgccacc tacatggctt cgctagagaa gggccaggtc cctgctcgag acattctcaa 2340 gacccttttc cccgttgact tcatctacga gggccagcgg tacaagttca ccgccacccg 2400 gtcgtctgag gactcttaca cgctgttcat caacggttct cgatgcgaca ttggagttag 2460 acctctttct gacggtggta ttctgtgtct tgtaggtggg agatcccaca atgtctactg 2520 gaaggaggag gttggagcca cgcgactgtc tgttgactcc aagacctgcc ttctcgaggt 2580 ggagaacgac cccactcagc ttcgatctcc ctctcccggt aagctggtta agttcctggt 2640 cgagaacggc gaccacgtgc gagccaacca gccctatgcc gagattgagg tcatgaagat 2700 gtacatgact ctcactgctc aggaggacgg tattgtccag ctgatgaagc agcccggttc 2760 caccatcgag gctggcgaca tcctcggtat cttggccctt gatgatcctt ccaaggtcaa 2820 gcatgccaag ccctttgagg gccagcttcc cgagcttgga ccccccactc tcagcggtaa 2880 caagcctcat cagcgatacg agcactgcca gaacgtgctc cataacattc tgcttggttt 2940 cgataaccag gtggtgatga agtccactct tcaggagatg gttggtctgc tccgaaaccc 3000 tgagcttcct tatctccagt gggctcatca ggtgtcttct ctgcacaccc gaatgagcgc 3060 caagctggat gctactcttg ctggtctcat tgacaaggcc aagcagcgag gtggcgagtt 3120 tcctgccaag cagcttctgc gagcccttga gaaggaggcg agctctggcg aggtcgatgc 3180 gctcttccag caaactcttg ctcctctgtt tgaccttgct cgagagtacc aggacggtct 3240 tgctatccac gagcttcagg ttgctgcagg ccttctgcag gcctactacg actctgaggc 3300 ccggttctgc ggacccaacg tacgtgacga ggatgtcatt ctcaagcttc gagaggagaa 3360 ccgagattct cttcgaaagg ttgtgatggc ccagctgtct cattctcgag tcggagccaa 3420 gaacaacctt gtgctggccc ttctcgatga atacaaggtg gccgaccagg ctggcaccga 3480 ctctcctgcc tccaacgtgc acgttgcaaa gtacttgcga cctgtgctgc gaaagattgt 3540 ggagctggaa tctcgagctt ctgccaaggt atctctgaaa gcccgagaga ttctcatcca 3600 gtgcgctctg ccctctctaa aggagcgaac tgaccagctt gagcacattc tgcgatcttc 3660 tgtcgtcgag tctcgatacg gagaggttgg tctggagcac cgaactcccc gagccgatat 3720 tctcaaggag gttgtcgact ccaagtacat tgtctttgat gtgcttgccc agttctttgc 3780 ccacgatgat ccctggatcg tccttgctgc cctggagctg tacatccgac gagcttgcaa 3840 ggcctactcc atcctggaca tcaactacca ccaggactcg gacctgcctc ccgtcatctc 3900 gtggcgattt agactgccta ccatgtcgtc tgctttgtac aactcagtag tgtcttctgg 3960 ctccaaaacc cccacttccc cctcggtgtc tcgagctgat tccgtctccg acttttcgta 4020 caccgttgag cgagactctg ctcccgctcg aaccggagcg attgttgccg tgcctcatct 4080 ggatgatctg gaggatgctc tgactcgtgt tctggagaac ctgcccaaac ggggcgctgg 4140 tcttgccatc tctgttggtg ctagcaacaa gagtgccgct gcttctgctc gtgacgctgc 4200 tgctgctgcc gcttcatccg ttgacactgg cctgtccaac atttgcaacg ttatgattgg 4260 tcgggttgat gagtctgatg acgacgacac tctgattgcc cgaatctccc aggtcattga 4320 ggactttaag gaggactttg aggcctgttc tctgcgacga atcaccttct ccttcggcaa 4380 ctcccgaggt acttatccca agtatttcac gttccgaggc cccgcatacg aggaggaccc 4440 cactatccga cacattgagc ctgctctggc cttccagctg gagctcgccc gtctgtccaa 4500 cttcgacatc aagcctgtcc acaccgacaa ccgaaacatc cacgtgtacg aggctactgg 4560 caagaacgct gcttccgaca agcggttctt cacccgaggt atcgtacgac ctggtcgtct 4620 tcgagagaac atccccacct cggagtatct catttccgag gctgaccggc tcatgagcga 4680 tattttggac gctctagagg tgattggaac caccaactcg gatctcaacc acattttcat 4740 caacttctca gccgtctttg ctctgaagcc cgaggaggtt gaagctgcct ttggcggttt 4800 cctggagcga tttggccgac gtctgtggcg acttcgagtc accggtgccg agatccgaat 4860 gatggtatcc gaccccgaaa ctggctctgc tttccctctg cgagcaatga tcaacaacgt 4920 ctctggttac gttgtgcagt ctgagctgta cgctgaggcc aagaacgaca agggccagtg 4980 gattttcaag tctctgggca agcccggctc catgcacatg cggtctatca acactcccta 5040 ccccaccaag gagtggctgc agcccaagcg gtacaaggcc catctgatgg gtaccaccta 5100 ctgctatgac ttccccgagc tgttccgaca gtccattgag tcggactgga agaagtatga 5160 cggcaaggct cccgacgatc tcatgacttg caacgagctg attctcgatg aggactctgg 5220 cgagctgcag gaggtgaacc gagagcccgg cgccaacaac gtcggtatgg ttgcgtggaa 5280 gtttgaggcc aagacccccg agtaccctcg aggccgatct ttcatcgtgg tggccaacga 5340 tatcaccttc cagattggtt cgtttggccc tgctgaggac cagttcttct tcaaggtgac 5400 ggagctggct cgaaagctcg gtattcctcg aatctatctg tctgccaact ctggtgctcg 5460 aatcggcatt gctgacgagc tcgttggcaa gtacaaggtt gcgtggaacg acgagactga 5520 cccctccaag ggcttcaagt acctttactt cacccctgag tctcttgcca ccctcaagcc 5580 cgacactgtt gtcaccactg agattgagga ggagggtccc aacggcgtgg agaagcgtca 5640 tgtgatcgac tacattgtcg gagagaagga cggtctcgga gtcgagtgtc tgcggggctc 5700 tggtctcatt gcaggcgcca cttctcgagc ctacaaggat atcttcactc tcactcttgt 5760 cacctgtcga tccgttggta tcggtgctta ccttgttcgt cttggtcaac gagccatcca 5820 gattgagggc cagcccatca ttctcactgg tgcccccgcc atcaacaagc tgcttggtcg 5880 agaggtctac tcttccaact tgcagcttgg tggtactcag atcatgtaca acaacggtgt 5940 gtctcatctg actgcccgag atgatctcaa cggtgtccac aagatcatgc agtggctgtc 6000 atacatccct gcttctcgag gtcttccagt gcctgttctc cctcacaaga ccgatgtgtg 6060 ggatcgagac gtgacgttcc agcctgtccg aggcgagcag tacgatgtta gatggcttat 6120 ttctggccga actctcgagg atggtgcttt cgagtctggt ctctttgaca aggactcttt 6180 ccaggagact ctgtctggct gggccaaggg tgttgttgtt ggtcgagctc gtcttggcgg 6240 cattcccttc ggtgtcattg gtgtcgagac tgcgaccgtc gacaatacta cccctgccga 6300 tcccgccaac ccggactcta ttgagatgag cacctctgaa gccggccagg tttggtaccc 6360 caactcggcc ttcaagacct ctcaggccat caacgacttc aaccatggtg aggcgcttcc 6420 tctcatgatt cttgctaact ggcgaggctt ttctggtggt cagcgagaca tgtacaatga 6480 ggttctcaag tacggatctt tcattgttga tgctctggtt gactacaagc agcccatcat 6540 ggtgtacatc cctcccaccg gtgagctgcg aggtggttct tgggttgtgg ttgaccccac 6600 catcaactcg gacatgatgg agatgtacgc tgacgtcgag tctcgaggtg gtgtgctgga 6660 gcccgaggga atggtcggta tcaagtaccg acgagacaag ctactggaca ccatggctcg 6720 tctggatccc gagtactcct ctctcaagaa gcagcttgag gagtctcccg attctgagga 6780 gctcaaggtc aagctcagcg tgcgagagaa gtctctcatg cccatctacc agcagatctc 6840 cgtgcagttt gccgacttgc atgaccgagc tggccgaatg gaggccaagg gtgtcattcg 6900 tgaggctctt gtgtggaagg atgctcgtcg attcttcttc tggcgaatcc gacgacgatt 6960 agtcgaggag tacctcatta ccaagatcaa tagcattctg ccctcttgca ctcggcttga 7020 gtgtctggct cgaatcaagt cgtggaagcc tgccactctt gatcagggct ctgaccgggg 7080 tgttgccgag tggtttgacg agaactctga tgccgtctct gctcgactca gcgagctcaa 7140 gaaggacgct tctgcccagt cgtttgcttc tcaactgaga aaggaccgac agggtactct 7200 ccagggcatg aagcaggctc tcgcttctct ttctgaggct gagcgggctg agctgctcaa 7260 ggggttgtga 7270 <210> 4 <211> 2266 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 4 Met Arg Leu Gln Leu Arg Thr Leu Thr Arg Arg Phe Phe Ser Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Ser Ser Thr Pro Asp Val Ala Pro Leu Val Asp Pro Asn Ile 20 25 30 His Lys Gly Leu Ala Ser His Phe Phe Gly Leu Asn Ser Val His Thr 35 40 45 Ala Lys Pro Ser Lys Val Lys Glu Phe Val Ala Ser His Gly Gly His 50 55 60 Thr Val Ile Asn Lys Val Leu Ile Ala Asn Asn Gly Ile Ala Ala Val 65 70 75 80 Lys Glu Ile Arg Ser Val Arg Lys Trp Ala Tyr Glu Thr Phe Gly Asp 85 90 95 Glu Arg Ala Ile Ser Phe Thr Val Met Ala Thr Pro Glu Asp Leu Ala 100 105 110 Ala Asn Ala Asp Tyr Ile Arg Met Ala Asp Gln Tyr Val Glu Val Pro 115 120 125 Gly Gly Thr Asn Asn Asn Asn Tyr Ala Asn Val Glu Leu Ile Val Asp 130 135 140 Val Ala Glu Arg Phe Gly Val Asp Ala Val Trp Ala Gly Trp Gly His 145 150 155 160 Ala Ser Glu Asn Pro Leu Leu Pro Glu Ser Leu Ala Ala Ser Pro Arg 165 170 175 Lys Ile Val Phe Ile Gly Pro Pro Gly Ala Ala Met Arg Ser Leu Gly 180 185 190 Asp Lys Ile Ser Ser Thr Ile Val Ala Gln His Ala Lys Val Pro Cys 195 200 205 Ile Pro Trp Ser Gly Thr Gly Val Asp Glu Val Val Val Asp Lys Ser 210 215 220 Thr Asn Leu Val Ser Val Ser Glu Glu Val Tyr Thr Lys Gly Cys Thr 225 230 235 240 Thr Gly Pro Lys Gln Gly Leu Glu Lys Ala Lys Gln Ile Gly Phe Pro 245 250 255 Val Met Ile Lys Ala Ser Glu Gly Gly Gly Gly Lys Gly Ile Arg Lys 260 265 270 Val Glu Arg Glu Glu Asp Phe Glu Ala Ala Tyr His Gln Val Glu Gly 275 280 285 Glu Ile Pro Gly Ser Pro Ile Phe Ile Met Gln Leu Ala Gly Asn Ala 290 295 300 Arg His Leu Glu Val Gln Leu Leu Ala Asp Gln Tyr Gly Asn Asn Ile 305 310 315 320 Ser Leu Phe Gly Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His Gln Lys Ile 325 330 335 Ile Glu Glu Ala Pro Val Thr Val Ala Gly Gln Gln Thr Phe Thr Ala 340 345 350 Met Glu Lys Ala Ala Val Arg Leu Gly Lys Leu Val Gly Tyr Val Ser 355 360 365 Ala Gly Thr Val Glu Tyr Leu Tyr Ser His Glu Asp Asp Lys Phe Tyr 370 375 380 Phe Leu Glu Leu Asn Pro Arg Leu Gln Val Glu His Pro Thr Thr Glu 385 390 395 400 Met Val Thr Gly Val Asn Leu Pro Ala Ala Gln Leu Gln Ile Ala Met 405 410 415 Gly Ile Pro Leu Asp Arg Ile Lys Asp Ile Arg Leu Phe Tyr Gly Val 420 425 430 Asn Pro His Thr Thr Thr Pro Ile Asp Phe Asp Phe Ser Gly Glu Asp 435 440 445 Ala Asp Lys Thr Gln Arg Arg Pro Val Pro Arg Gly His Thr Thr Ala 450 455 460 Cys Arg Ile Thr Ser Glu Asp Pro Gly Glu Gly Phe Lys Pro Ser Gly 465 470 475 480 Gly Thr Met His Glu Leu Asn Phe Arg Ser Ser Ser Asn Val Trp Gly 485 490 495 Tyr Phe Ser Val Gly Asn Gln Gly Gly Ile His Ser Phe Ser Asp Ser 500 505 510 Gln Phe Gly His Ile Phe Ala Phe Gly Glu Asn Arg Ser Ala Ser Arg 515 520 525 Lys His Met Val Val Ala Leu Lys Glu Leu Ser Ile Arg Gly Asp Phe 530 535 540 Arg Thr Thr Val Glu Tyr Leu Ile Lys Leu Leu Glu Thr Pro Asp Phe 545 550 555 560 Glu Asp Asn Thr Ile Thr Thr Gly Trp Leu Asp Glu Leu Ile Ser Asn 565 570 575 Lys Leu Thr Ala Glu Arg Pro Asp Ser Phe Leu Ala Val Val Cys Gly 580 585 590 Ala Ala Thr Lys Ala His Arg Ala Ser Glu Asp Ser Ile Ala Thr Tyr 595 600 605 Met Ala Ser Leu Glu Lys Gly Gln Val Pro Ala Arg Asp Ile Leu Lys 610 615 620 Thr Leu Phe Pro Val Asp Phe Ile Tyr Glu Gly Gln Arg Tyr Lys Phe 625 630 635 640 Thr Ala Thr Arg Ser Ser Glu Asp Ser Tyr Thr Leu Phe Ile Asn Gly 645 650 655 Ser Arg Cys Asp Ile Gly Val Arg Pro Leu Ser Asp Gly Gly Ile Leu 660 665 670 Cys Leu Val Gly Gly Arg Ser His Asn Val Tyr Trp Lys Glu Glu Val 675 680 685 Gly Ala Thr Arg Leu Ser Val Asp Ser Lys Thr Cys Leu Leu Glu Val 690 695 700 Glu Asn Asp Pro Thr Gln Leu Arg Ser Pro Ser Pro Gly Lys Leu Val 705 710 715 720 Lys Phe Leu Val Glu Asn Gly Asp His Val Arg Ala Asn Gln Pro Tyr 725 730 735 Ala Glu Ile Glu Val Met Lys Met Tyr Met Thr Leu Thr Ala Gln Glu 740 745 750 Asp Gly Ile Val Gln Leu Met Lys Gln Pro Gly Ser Thr Ile Glu Ala 755 760 765 Gly Asp Ile Leu Gly Ile Leu Ala Leu Asp Asp Pro Ser Lys Val Lys 770 775 780 His Ala Lys Pro Phe Glu Gly Gln Leu Pro Glu Leu Gly Pro Pro Thr 785 790 795 800 Leu Ser Gly Asn Lys Pro His Gln Arg Tyr Glu His Cys Gln Asn Val 805 810 815 Leu His Asn Ile Leu Leu Gly Phe Asp Asn Gln Val Val Met Lys Ser 820 825 830 Thr Leu Gln Glu Met Val Gly Leu Leu Arg Asn Pro Glu Leu Pro Tyr 835 840 845 Leu Gln Trp Ala His Gln Val Ser Ser Leu His Thr Arg Met Ser Ala 850 855 860 Lys Leu Asp Ala Thr Leu Ala Gly Leu Ile Asp Lys Ala Lys Gln Arg 865 870 875 880 Gly Gly Glu Phe Pro Ala Lys Gln Leu Leu Arg Ala Leu Glu Lys Glu 885 890 895 Ala Ser Ser Gly Glu Val Asp Ala Leu Phe Gln Gln Thr Leu Ala Pro 900 905 910 Leu Phe Asp Leu Ala Arg Glu Tyr Gln Asp Gly Leu Ala Ile His Glu 915 920 925 Leu Gln Val Ala Ala Gly Leu Leu Gln Ala Tyr Tyr Asp Ser Glu Ala 930 935 940 Arg Phe Cys Gly Pro Asn Val Arg Asp Glu Asp Val Ile Leu Lys Leu 945 950 955 960 Arg Glu Glu Asn Arg Asp Ser Leu Arg Lys Val Val Met Ala Gln Leu 965 970 975 Ser His Ser Arg Val Gly Ala Lys Asn Asn Leu Val Leu Ala Leu Leu 980 985 990 Asp Glu Tyr Lys Val Ala Asp Gln Ala Gly Thr Asp Ser Pro Ala Ser 995 1000 1005 Asn Val His Val Ala Lys Tyr Leu Arg Pro Val Leu Arg Lys Ile 1010 1015 1020 Val Glu Leu Glu Ser Arg Ala Ser Ala Lys Val Ser Leu Lys Ala 1025 1030 1035 Arg Glu Ile Leu Ile Gln Cys Ala Leu Pro Ser Leu Lys Glu Arg 1040 1045 1050 Thr Asp Gln Leu Glu His Ile Leu Arg Ser Ser Val Val Glu Ser 1055 1060 1065 Arg Tyr Gly Glu Val Gly Leu Glu His Arg Thr Pro Arg Ala Asp 1070 1075 1080 Ile Leu Lys Glu Val Val Asp Ser Lys Tyr Ile Val Phe Asp Val 1085 1090 1095 Leu Ala Gln Phe Phe Ala His Asp Asp Pro Trp Ile Val Leu Ala 1100 1105 1110 Ala Leu Glu Leu Tyr Ile Arg Arg Ala Cys Lys Ala Tyr Ser Ile 1115 1120 1125 Leu Asp Ile Asn Tyr His Gln Asp Ser Asp Leu Pro Pro Val Ile 1130 1135 1140 Ser Trp Arg Phe Arg Leu Pro Thr Met Ser Ser Ala Leu Tyr Asn 1145 1150 1155 Ser Val Val Ser Ser Gly Ser Lys Thr Pro Thr Ser Pro Ser Val 1160 1165 1170 Ser Arg Ala Asp Ser Val Ser Asp Phe Ser Tyr Thr Val Glu Arg 1175 1180 1185 Asp Ser Ala Pro Ala Arg Thr Gly Ala Ile Val Ala Val Pro His 1190 1195 1200 Leu Asp Asp Leu Glu Asp Ala Leu Thr Arg Val Leu Glu Asn Leu 1205 1210 1215 Pro Lys Arg Gly Ala Gly Leu Ala Ile Ser Val Gly Ala Ser Asn 1220 1225 1230 Lys Ser Ala Ala Ala Ser Ala Arg Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1235 1240 1245 Ser Ser Val Asp Thr Gly Leu Ser Asn Ile Cys Asn Val Met Ile 1250 1255 1260 Gly Arg Val Asp Glu Ser Asp Asp Asp Asp Thr Leu Ile Ala Arg 1265 1270 1275 Ile Ser Gln Val Ile Glu Asp Phe Lys Glu Asp Phe Glu Ala Cys 1280 1285 1290 Ser Leu Arg Arg Ile Thr Phe Ser Phe Gly Asn Ser Arg Gly Thr 1295 1300 1305 Tyr Pro Lys Tyr Phe Thr Phe Arg Gly Pro Ala Tyr Glu Glu Asp 1310 1315 1320 Pro Thr Ile Arg His Ile Glu Pro Ala Leu Ala Phe Gln Leu Glu 1325 1330 1335 Leu Ala Arg Leu Ser Asn Phe Asp Ile Lys Pro Val His Thr Asp 1340 1345 1350 Asn Arg Asn Ile His Val Tyr Glu Ala Thr Gly Lys Asn Ala Ala 1355 1360 1365 Ser Asp Lys Arg Phe Phe Thr Arg Gly Ile Val Arg Pro Gly Arg 1370 1375 1380 Leu Arg Glu Asn Ile Pro Thr Ser Glu Tyr Leu Ile Ser Glu Ala 1385 1390 1395 Asp Arg Leu Met Ser Asp Ile Leu Asp Ala Leu Glu Val Ile Gly 1400 1405 1410 Thr Thr Asn Ser Asp Leu Asn His Ile Phe Ile Asn Phe Ser Ala 1415 1420 1425 Val Phe Ala Leu Lys Pro Glu Glu Val Glu Ala Ala Phe Gly Gly 1430 1435 1440 Phe Leu Glu Arg Phe Gly Arg Arg Leu Trp Arg Leu Arg Val Thr 1445 1450 1455 Gly Ala Glu Ile Arg Met Met Val Ser Asp Pro Glu Thr Gly Ser 1460 1465 1470 Ala Phe Pro Leu Arg Ala Met Ile Asn Asn Val Ser Gly Tyr Val 1475 1480 1485 Val Gln Ser Glu Leu Tyr Ala Glu Ala Lys Asn Asp Lys Gly Gln 1490 1495 1500 Trp Ile Phe Lys Ser Leu Gly Lys Pro Gly Ser Met His Met Arg 1505 1510 1515 Ser Ile Asn Thr Pro Tyr Pro Thr Lys Glu Trp Leu Gln Pro Lys 1520 1525 1530 Arg Tyr Lys Ala His Leu Met Gly Thr Thr Tyr Cys Tyr Asp Phe 1535 1540 1545 Pro Glu Leu Phe Arg Gln Ser Ile Glu Ser Asp Trp Lys Lys Tyr 1550 1555 1560 Asp Gly Lys Ala Pro Asp Asp Leu Met Thr Cys Asn Glu Leu Ile 1565 1570 1575 Leu Asp Glu Asp Ser Gly Glu Leu Gln Glu Val Asn Arg Glu Pro 1580 1585 1590 Gly Ala Asn Asn Val Gly Met Val Ala Trp Lys Phe Glu Ala Lys 1595 1600 1605 Thr Pro Glu Tyr Pro Arg Gly Arg Ser Phe Ile Val Val Ala Asn 1610 1615 1620 Asp Ile Thr Phe Gln Ile Gly Ser Phe Gly Pro Ala Glu Asp Gln 1625 1630 1635 Phe Phe Phe Lys Val Thr Glu Leu Ala Arg Lys Leu Gly Ile Pro 1640 1645 1650 Arg Ile Tyr Leu Ser Ala Asn Ser Gly Ala Arg Ile Gly Ile Ala 1655 1660 1665 Asp Glu Leu Val Gly Lys Tyr Lys Val Ala Trp Asn Asp Glu Thr 1670 1675 1680 Asp Pro Ser Lys Gly Phe Lys Tyr Leu Tyr Phe Thr Pro Glu Ser 1685 1690 1695 Leu Ala Thr Leu Lys Pro Asp Thr Val Val Thr Thr Glu Ile Glu 1700 1705 1710 Glu Glu Gly Pro Asn Gly Val Glu Lys Arg His Val Ile Asp Tyr 1715 1720 1725 Ile Val Gly Glu Lys Asp Gly Leu Gly Val Glu Cys Leu Arg Gly 1730 1735 1740 Ser Gly Leu Ile Ala Gly Ala Thr Ser Arg Ala Tyr Lys Asp Ile 1745 1750 1755 Phe Thr Leu Thr Leu Val Thr Cys Arg Ser Val Gly Ile Gly Ala 1760 1765 1770 Tyr Leu Val Arg Leu Gly Gln Arg Ala Ile Gln Ile Glu Gly Gln 1775 1780 1785 Pro Ile Ile Leu Thr Gly Ala Pro Ala Ile Asn Lys Leu Leu Gly 1790 1795 1800 Arg Glu Val Tyr Ser Ser Asn Leu Gln Leu Gly Gly Thr Gln Ile 1805 1810 1815 Met Tyr Asn Asn Gly Val Ser His Leu Thr Ala Arg Asp Asp Leu 1820 1825 1830 Asn Gly Val His Lys Ile Met Gln Trp Leu Ser Tyr Ile Pro Ala 1835 1840 1845 Ser Arg Gly Leu Pro Val Pro Val Leu Pro His Lys Thr Asp Val 1850 1855 1860 Trp Asp Arg Asp Val Thr Phe Gln Pro Val Arg Gly Glu Gln Tyr 1865 1870 1875 Asp Val Arg Trp Leu Ile Ser Gly Arg Thr Leu Glu Asp Gly Ala 1880 1885 1890 Phe Glu Ser Gly Leu Phe Asp Lys Asp Ser Phe Gln Glu Thr Leu 1895 1900 1905 Ser Gly Trp Ala Lys Gly Val Val Val Gly Arg Ala Arg Leu Gly 1910 1915 1920 Gly Ile Pro Phe Gly Val Ile Gly Val Glu Thr Ala Thr Val Asp 1925 1930 1935 Asn Thr Thr Pro Ala Asp Pro Ala Asn Pro Asp Ser Ile Glu Met 1940 1945 1950 Ser Thr Ser Glu Ala Gly Gln Val Trp Tyr Pro Asn Ser Ala Phe 1955 1960 1965 Lys Thr Ser Gln Ala Ile Asn Asp Phe Asn His Gly Glu Ala Leu 1970 1975 1980 Pro Leu Met Ile Leu Ala Asn Trp Arg Gly Phe Ser Gly Gly Gln 1985 1990 1995 Arg Asp Met Tyr Asn Glu Val Leu Lys Tyr Gly Ser Phe Ile Val 2000 2005 2010 Asp Ala Leu Val Asp Tyr Lys Gln Pro Ile Met Val Tyr Ile Pro 2015 2020 2025 Pro Thr Gly Glu Leu Arg Gly Gly Ser Trp Val Val Val Asp Pro 2030 2035 2040 Thr Ile Asn Ser Asp Met Met Glu Met Tyr Ala Asp Val Glu Ser 2045 2050 2055 Arg Gly Gly Val Leu Glu Pro Glu Gly Met Val Gly Ile Lys Tyr 2060 2065 2070 Arg Arg Asp Lys Leu Leu Asp Thr Met Ala Arg Leu Asp Pro Glu 2075 2080 2085 Tyr Ser Ser Leu Lys Lys Gln Leu Glu Glu Ser Pro Asp Ser Glu 2090 2095 2100 Glu Leu Lys Val Lys Leu Ser Val Arg Glu Lys Ser Leu Met Pro 2105 2110 2115 Ile Tyr Gln Gln Ile Ser Val Gln Phe Ala Asp Leu His Asp Arg 2120 2125 2130 Ala Gly Arg Met Glu Ala Lys Gly Val Ile Arg Glu Ala Leu Val 2135 2140 2145 Trp Lys Asp Ala Arg Arg Phe Phe Phe Trp Arg Ile Arg Arg Arg 2150 2155 2160 Leu Val Glu Glu Tyr Leu Ile Thr Lys Ile Asn Ser Ile Leu Pro 2165 2170 2175 Ser Cys Thr Arg Leu Glu Cys Leu Ala Arg Ile Lys Ser Trp Lys 2180 2185 2190 Pro Ala Thr Leu Asp Gln Gly Ser Asp Arg Gly Val Ala Glu Trp 2195 2200 2205 Phe Asp Glu Asn Ser Asp Ala Val Ser Ala Arg Leu Ser Glu Leu 2210 2215 2220 Lys Lys Asp Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ala Ser Gln Leu Arg Lys 2225 2230 2235 Asp Arg Gln Gly Thr Leu Gln Gly Met Lys Gln Ala Leu Ala Ser 2240 2245 2250 Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Glu Leu Leu Lys Gly Leu 2255 2260 2265 <210> 5 <211> 1449 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 5 atggtgaaaa acgtggacca agtggatctc tcgcaggtcg acaccattgc ctccggccga 60 gatgtcaact acaaggtcaa gtacacctcc ggcgttaaga tgagccaggg cgcctacgac 120 gacaagggcc gccacatttc cgagcagccc ttcacctggg ccaactggca ccagcacatc 180 aactggctca acttcattct ggtgattgcg ctgcctctgt cgtcctttgc tgccgctccc 240 ttcgtctcct tcaactggaa gaccgccgcg tttgctgtcg gctattacat gtgcaccggt 300 ctcggtatca ccgccggcta ccaccgaatg tgggcccatc gagcctacaa ggccgctctg 360 cccgttcgaa tcatccttgc tctgtttgga ggaggagctg tcgagggctc catccgatgg 420 tgggcctcgt ctcaccgagt ccaccaccga tggaccgact ccaacaagga cccttacgac 480 gcccgaaagg gattctggtt ctcccacttt ggctggatgc tgcttgtgcc caaccccaag 540 aacaagggcc gaactgacat ttctgacctc aacaacgact gggttgtccg actccagcac 600 aagtactacg tttacgttct cgtcttcatg gccattgttc tgcccaccct cgtctgtggc 660 tttggctggg gcgactggaa gggaggtctt gtctacgccg gtatcatgcg atacaccttt 720 gtgcagcagg tgactttctg tgtcaactcc cttgcccact ggattggaga gcagcccttc 780 gacgaccgac gaactccccg agaccacgct cttaccgccc tggtcacctt tggagagggc 840 taccacaact tccaccacga gttcccctcg gactaccgaa acgccctcat ctggtaccag 900 tacgacccca ccaagtggct catctggacc ctcaagcagg ttggtctcgc ctgggacctc 960 cagaccttct cccagaacgc catcgagcag ggtctcgtgc agcagcgaca gaagaagctg 1020 gacaagtggc gaaacaacct caactggggt atccccattg agcagctgcc tgtcattgag 1080 tttgaggagt tccaagagca ggccaagacc cgagatctgg ttctcatttc tggcattgtc 1140 cacgacgtgt ctgcctttgt cgagcaccac cctggtggaa aggccctcat tatgagcgcc 1200 gtcggcaagg acggtaccgc tgtcttcaac ggaggtgtct accgacactc caacgctggc 1260 cacaacctgc ttgccaccat gcgagtttcg gtcattcgag gcggcatgga ggttgaggtg 1320 tggaagactg cccagaacga aaagaaggac cagaacattg tctccgatga gagtggaaac 1380 cgaatccacc gagctggtct ccaggccacc cgggtcgaga accccggtat gtctggcatg 1440 gctgcttag 1449 <210> 6 <211> 482 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 6 Met Val Lys Asn Val Asp Gln Val Asp Leu Ser Gln Val Asp Thr Ile 1 5 10 15 Ala Ser Gly Arg Asp Val Asn Tyr Lys Val Lys Tyr Thr Ser Gly Val 20 25 30 Lys Met Ser Gln Gly Ala Tyr Asp Asp Lys Gly Arg His Ile Ser Glu 35 40 45 Gln Pro Phe Thr Trp Ala Asn Trp His Gln His Ile Asn Trp Leu Asn 50 55 60 Phe Ile Leu Val Ile Ala Leu Pro Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ala Pro 65 70 75 80 Phe Val Ser Phe Asn Trp Lys Thr Ala Ala Phe Ala Val Gly Tyr Tyr 85 90 95 Met Cys Thr Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Tyr His Arg Met Trp Ala 100 105 110 His Arg Ala Tyr Lys Ala Ala Leu Pro Val Arg Ile Ile Leu Ala Leu 115 120 125 Phe Gly Gly Gly Ala Val Glu Gly Ser Ile Arg Trp Trp Ala Ser Ser 130 135 140 His Arg Val His His Arg Trp Thr Asp Ser Asn Lys Asp Pro Tyr Asp 145 150 155 160 Ala Arg Lys Gly Phe Trp Phe Ser His Phe Gly Trp Met Leu Leu Val 165 170 175 Pro Asn Pro Lys Asn Lys Gly Arg Thr Asp Ile Ser Asp Leu Asn Asn 180 185 190 Asp Trp Val Val Arg Leu Gln His Lys Tyr Tyr Val Tyr Val Leu Val 195 200 205 Phe Met Ala Ile Val Leu Pro Thr Leu Val Cys Gly Phe Gly Trp Gly 210 215 220 Asp Trp Lys Gly Gly Leu Val Tyr Ala Gly Ile Met Arg Tyr Thr Phe 225 230 235 240 Val Gln Gln Val Thr Phe Cys Val Asn Ser Leu Ala His Trp Ile Gly 245 250 255 Glu Gln Pro Phe Asp Asp Arg Arg Thr Pro Arg Asp His Ala Leu Thr 260 265 270 Ala Leu Val Thr Phe Gly Glu Gly Tyr His Asn Phe His His Glu Phe 275 280 285 Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Leu Ile Trp Tyr Gln Tyr Asp Pro Thr 290 295 300 Lys Trp Leu Ile Trp Thr Leu Lys Gln Val Gly Leu Ala Trp Asp Leu 305 310 315 320 Gln Thr Phe Ser Gln Asn Ala Ile Glu Gln Gly Leu Val Gln Gln Arg 325 330 335 Gln Lys Lys Leu Asp Lys Trp Arg Asn Asn Leu Asn Trp Gly Ile Pro 340 345 350 Ile Glu Gln Leu Pro Val Ile Glu Phe Glu Glu Phe Gln Glu Gln Ala 355 360 365 Lys Thr Arg Asp Leu Val Leu Ile Ser Gly Ile Val His Asp Val Ser 370 375 380 Ala Phe Val Glu His His Pro Gly Gly Lys Ala Leu Ile Met Ser Ala 385 390 395 400 Val Gly Lys Asp Gly Thr Ala Val Phe Asn Gly Gly Val Tyr Arg His 405 410 415 Ser Asn Ala Gly His Asn Leu Leu Ala Thr Met Arg Val Ser Val Ile 420 425 430 Arg Gly Gly Met Glu Val Glu Val Trp Lys Thr Ala Gln Asn Glu Lys 435 440 445 Lys Asp Gln Asn Ile Val Ser Asp Glu Ser Gly Asn Arg Ile His Arg 450 455 460 Ala Gly Leu Gln Ala Thr Arg Val Glu Asn Pro Gly Met Ser Gly Met 465 470 475 480 Ala Ala <210> 7 <211> 1953 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 7 atgtctgcca acgagaacat ctcccgattc gacgcccctg tgggcaagga gcaccccgcc 60 tacgagctct tccataacca cacacgatct ttcgtctatg gtctccagcc tcgagcctgc 120 cagggtatgc tggacttcga cttcatctgt aagcgagaga acccctccgt ggccggtgtc 180 atctatccct tcggcggcca gttcgtcacc aagatgtact ggggcaccaa ggagactctt 240 ctccctgtct accagcaggt cgagaaggcc gctgccaagc accccgaggt cgatgtcgtg 300 gtcaactttg cctcctctcg atccgtctac tcctctacca tggagctgct cgagtacccc 360 cagttccgaa ccatcgccat tattgccgag ggtgtccccg agcgacgagc ccgagagatc 420 ctccacaagg cccagaagaa gggtgtgacc atcattggtc ccgctaccgt cggaggtatc 480 aagcccggtt gcttcaaggt tggaaacacc ggaggtatga tggacaacat tgtcgcctcc 540 aagctctacc gacccggctc cgttgcctac gtctccaagt ccggaggaat gtccaacgag 600 ctgaacaaca ttatctctca caccaccgac ggtgtctacg agggtattgc tattggtggt 660 gaccgatacc ctggtactac cttcattgac catatcctgc gatacgaggc cgaccccaag 720 tgtaagatca tcgtcctcct tggtgaggtt ggtggtgttg aggagtaccg agtcatcgag 780 gctgttaaga acggccagat caagaagccc atcgtcgctt gggccattgg tacttgtgcc 840 tccatgttca agactgaggt tcagttcggc cacgccggct ccatggccaa ctccgacctg 900 gagactgcca aggctaagaa cgccgccatg aagtctgctg gcttctacgt ccccgatacc 960 ttcgaggaca tgcccgaggt ccttgccgag ctctacgaga agatggtcgc caagggcgag 1020 ctgtctcgaa tctctgagcc tgaggtcccc aagatcccca ttgactactc ttgggcccag 1080 gagcttggtc ttatccgaaa gcccgctgct ttcatctcca ctatttccga tgaccgaggc 1140 caggagcttc tgtacgctgg catgcccatt tccgaggttt tcaaggagga cattggtatc 1200 ggcggtgtca tgtctctgct gtggttccga cgacgactcc ccgactacgc ctccaagttt 1260 cttgagatgg ttctcatgct tactgctgac cacggtcccg ccgtatccgg tgccatgaac 1320 accattatca ccacccgagc tggtaaggat ctcatttctt ccctggttgc tggtctcctg 1380 accattggta cccgattcgg aggtgctctt gacggtgctg ccaccgagtt caccactgcc 1440 tacgacaagg gtctgtcccc ccgacagttc gttgatacca tgcgaaagca gaacaagctg 1500 attcctggta ttggccatcg agtcaagtct cgaaacaacc ccgatttccg agtcgagctt 1560 gtcaaggact ttgttaagaa gaacttcccc tccacccagc tgctcgacta cgcccttgct 1620 gtcgaggagg tcaccacctc caagaaggac aacctgattc tgaacgttga cggtgctatt 1680 gctgtttctt ttgtcgatct catgcgatct tgcggtgcct ttactgtgga ggagactgag 1740 gactacctca agaacggtgt tctcaacggt ctgttcgttc tcggtcgatc cattggtctc 1800 attgcccacc atctcgatca gaagcgactc aagaccggtc tgtaccgaca tccttgggac 1860 gatatcacct acctggttgg ccaggaggct atccagaaga agcgagtcga gatcagcgcc 1920 ggcgacgttt ccaaggccaa gactcgatca tag 1953 <210> 8 <211> 650 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 8 Met Ser Ala Asn Glu Asn Ile Ser Arg Phe Asp Ala Pro Val Gly Lys 1 5 10 15 Glu His Pro Ala Tyr Glu Leu Phe His Asn His Thr Arg Ser Phe Val 20 25 30 Tyr Gly Leu Gln Pro Arg Ala Cys Gln Gly Met Leu Asp Phe Asp Phe 35 40 45 Ile Cys Lys Arg Glu Asn Pro Ser Val Ala Gly Val Ile Tyr Pro Phe 50 55 60 Gly Gly Gln Phe Val Thr Lys Met Tyr Trp Gly Thr Lys Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Pro Val Tyr Gln Gln Val Glu Lys Ala Ala Ala Lys His Pro Glu 85 90 95 Val Asp Val Val Val Asn Phe Ala Ser Ser Arg Ser Val Tyr Ser Ser 100 105 110 Thr Met Glu Leu Leu Glu Tyr Pro Gln Phe Arg Thr Ile Ala Ile Ile 115 120 125 Ala Glu Gly Val Pro Glu Arg Arg Ala Arg Glu Ile Leu His Lys Ala 130 135 140 Gln Lys Lys Gly Val Thr Ile Ile Gly Pro Ala Thr Val Gly Gly Ile 145 150 155 160 Lys Pro Gly Cys Phe Lys Val Gly Asn Thr Gly Gly Met Met Asp Asn 165 170 175 Ile Val Ala Ser Lys Leu Tyr Arg Pro Gly Ser Val Ala Tyr Val Ser 180 185 190 Lys Ser Gly Gly Met Ser Asn Glu Leu Asn Asn Ile Ile Ser His Thr 195 200 205 Thr Asp Gly Val Tyr Glu Gly Ile Ala Ile Gly Gly Asp Arg Tyr Pro 210 215 220 Gly Thr Thr Phe Ile Asp His Ile Leu Arg Tyr Glu Ala Asp Pro Lys 225 230 235 240 Cys Lys Ile Ile Val Leu Leu Gly Glu Val Gly Gly Val Glu Glu Tyr 245 250 255 Arg Val Ile Glu Ala Val Lys Asn Gly Gln Ile Lys Lys Pro Ile Val 260 265 270 Ala Trp Ala Ile Gly Thr Cys Ala Ser Met Phe Lys Thr Glu Val Gln 275 280 285 Phe Gly His Ala Gly Ser Met Ala Asn Ser Asp Leu Glu Thr Ala Lys 290 295 300 Ala Lys Asn Ala Ala Met Lys Ser Ala Gly Phe Tyr Val Pro Asp Thr 305 310 315 320 Phe Glu Asp Met Pro Glu Val Leu Ala Glu Leu Tyr Glu Lys Met Val 325 330 335 Ala Lys Gly Glu Leu Ser Arg Ile Ser Glu Pro Glu Val Pro Lys Ile 340 345 350 Pro Ile Asp Tyr Ser Trp Ala Gln Glu Leu Gly Leu Ile Arg Lys Pro 355 360 365 Ala Ala Phe Ile Ser Thr Ile Ser Asp Asp Arg Gly Gln Glu Leu Leu 370 375 380 Tyr Ala Gly Met Pro Ile Ser Glu Val Phe Lys Glu Asp Ile Gly Ile 385 390 395 400 Gly Gly Val Met Ser Leu Leu Trp Phe Arg Arg Arg Leu Pro Asp Tyr 405 410 415 Ala Ser Lys Phe Leu Glu Met Val Leu Met Leu Thr Ala Asp His Gly 420 425 430 Pro Ala Val Ser Gly Ala Met Asn Thr Ile Ile Thr Thr Arg Ala Gly 435 440 445 Lys Asp Leu Ile Ser Ser Leu Val Ala Gly Leu Leu Thr Ile Gly Thr 450 455 460 Arg Phe Gly Gly Ala Leu Asp Gly Ala Ala Thr Glu Phe Thr Thr Ala 465 470 475 480 Tyr Asp Lys Gly Leu Ser Pro Arg Gln Phe Val Asp Thr Met Arg Lys 485 490 495 Gln Asn Lys Leu Ile Pro Gly Ile Gly His Arg Val Lys Ser Arg Asn 500 505 510 Asn Pro Asp Phe Arg Val Glu Leu Val Lys Asp Phe Val Lys Lys Asn 515 520 525 Phe Pro Ser Thr Gln Leu Leu Asp Tyr Ala Leu Ala Val Glu Glu Val 530 535 540 Thr Thr Ser Lys Lys Asp Asn Leu Ile Leu Asn Val Asp Gly Ala Ile 545 550 555 560 Ala Val Ser Phe Val Asp Leu Met Arg Ser Cys Gly Ala Phe Thr Val 565 570 575 Glu Glu Thr Glu Asp Tyr Leu Lys Asn Gly Val Leu Asn Gly Leu Phe 580 585 590 Val Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ile Ala His His Leu Asp Gln Lys 595 600 605 Arg Leu Lys Thr Gly Leu Tyr Arg His Pro Trp Asp Asp Ile Thr Tyr 610 615 620 Leu Val Gly Gln Glu Ala Ile Gln Lys Lys Arg Val Glu Ile Ser Ala 625 630 635 640 Gly Asp Val Ser Lys Ala Lys Thr Arg Ser 645 650 <210> 9 <211> 1494 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 9 atgtcagcga aatccattca cgaggccgac ggcaaggccc tgctcgcaca ctttctgtcc 60 aaggcgcccg tgtgggccga gcagcagccc atcaacacgt ttgaaatggg cacacccaag 120 ctggcgtctc tgacgttcga ggacggcgtg gcccccgagc agatcttcgc cgccgctgaa 180 aagacctacc cctggctgct ggagtccggc gccaagtttg tggccaagcc cgaccagctc 240 atcaagcgac gaggcaaggc cggcctgctg gtactcaaca agtcgtggga ggagtgcaag 300 ccctggatcg ccgagcgggc cgccaagccc atcaacgtgg agggcattga cggagtgctg 360 cgaacgttcc tggtcgagcc ctttgtgccc cacgaccaga agcacgagta ctacatcaac 420 atccactccg tgcgagaggg cgactggatc ctcttctacc acgagggagg agtcgacgtc 480 ggcgacgtgg acgccaaggc cgccaagatc ctcatccccg ttgacattga gaacgagtac 540 ccctccaacg ccacgctcac caaggagctg ctggcacacg tgcccgagga ccagcaccag 600 accctgctcg acttcatcaa ccggctctac gccgtctacg tcgatctgca gtttacgtat 660 ctggagatca accccctggt cgtgatcccc accgcccagg gcgtcgaggt ccactacctg 720 gatcttgccg gcaagctcga ccagaccgca gagtttgagt gcggccccaa gtgggctgct 780 gcgcggtccc ccgccgctct gggccaggtc gtcaccattg acgccggctc caccaaggtg 840 tccatcgacg ccggccccgc catggtcttc cccgctcctt tcggtcgaga gctgtccaag 900 gaggaggcgt acattgcgga gctcgattcc aagaccggag cttctctgaa gctgactgtt 960 ctcaatgcca agggccgaat ctggaccctt gtggctggtg gaggagcctc cgtcgtctac 1020 gccgacgcca ttgcgtctgc cggctttgct gacgagctcg ccaactacgg cgagtactct 1080 ggcgctccca acgagaccca gacctacgag tacgccaaaa ccgtactgga tctcatgacc 1140 cggggcgacg ctcaccccga gggcaaggta ctgttcattg gcggaggaat cgccaacttc 1200 acccaggttg gatccacctt caagggcatc atccgggcct tccgggacta ccagtcttct 1260 ctgcacaacc acaaggtgaa gatttacgtg cgacgaggcg gtcccaactg gcaggagggt 1320 ctgcggttga tcaagtcggc tggcgacgag ctgaatctgc ccatggagat ttacggcccc 1380 gacatgcacg tgtcgggtat tgttcctttg gctctgcttg gaaagcggcc caagaatgtc 1440 aagccttttg gcaccggacc ttctactgag gcttccactc ctctcggagt ttaa 1494 <210> 10 <211> 497 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 10 Met Ser Ala Lys Ser Ile His Glu Ala Asp Gly Lys Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 His Phe Leu Ser Lys Ala Pro Val Trp Ala Glu Gln Gln Pro Ile Asn 20 25 30 Thr Phe Glu Met Gly Thr Pro Lys Leu Ala Ser Leu Thr Phe Glu Asp 35 40 45 Gly Val Ala Pro Glu Gln Ile Phe Ala Ala Ala Glu Lys Thr Tyr Pro 50 55 60 Trp Leu Leu Glu Ser Gly Ala Lys Phe Val Ala Lys Pro Asp Gln Leu 65 70 75 80 Ile Lys Arg Arg Gly Lys Ala Gly Leu Leu Val Leu Asn Lys Ser Trp 85 90 95 Glu Glu Cys Lys Pro Trp Ile Ala Glu Arg Ala Ala Lys Pro Ile Asn 100 105 110 Val Glu Gly Ile Asp Gly Val Leu Arg Thr Phe Leu Val Glu Pro Phe 115 120 125 Val Pro His Asp Gln Lys His Glu Tyr Tyr Ile Asn Ile His Ser Val 130 135 140 Arg Glu Gly Asp Trp Ile Leu Phe Tyr His Glu Gly Gly Val Asp Val 145 150 155 160 Gly Asp Val Asp Ala Lys Ala Ala Lys Ile Leu Ile Pro Val Asp Ile 165 170 175 Glu Asn Glu Tyr Pro Ser Asn Ala Thr Leu Thr Lys Glu Leu Leu Ala 180 185 190 His Val Pro Glu Asp Gln His Gln Thr Leu Leu Asp Phe Ile Asn Arg 195 200 205 Leu Tyr Ala Val Tyr Val Asp Leu Gln Phe Thr Tyr Leu Glu Ile Asn 210 215 220 Pro Leu Val Val Ile Pro Thr Ala Gln Gly Val Glu Val His Tyr Leu 225 230 235 240 Asp Leu Ala Gly Lys Leu Asp Gln Thr Ala Glu Phe Glu Cys Gly Pro 245 250 255 Lys Trp Ala Ala Ala Arg Ser Pro Ala Ala Leu Gly Gln Val Val Thr 260 265 270 Ile Asp Ala Gly Ser Thr Lys Val Ser Ile Asp Ala Gly Pro Ala Met 275 280 285 Val Phe Pro Ala Pro Phe Gly Arg Glu Leu Ser Lys Glu Glu Ala Tyr 290 295 300 Ile Ala Glu Leu Asp Ser Lys Thr Gly Ala Ser Leu Lys Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Asn Ala Lys Gly Arg Ile Trp Thr Leu Val Ala Gly Gly Gly Ala 325 330 335 Ser Val Val Tyr Ala Asp Ala Ile Ala Ser Ala Gly Phe Ala Asp Glu 340 345 350 Leu Ala Asn Tyr Gly Glu Tyr Ser Gly Ala Pro Asn Glu Thr Gln Thr 355 360 365 Tyr Glu Tyr Ala Lys Thr Val Leu Asp Leu Met Thr Arg Gly Asp Ala 370 375 380 His Pro Glu Gly Lys Val Leu Phe Ile Gly Gly Gly Ile Ala Asn Phe 385 390 395 400 Thr Gln Val Gly Ser Thr Phe Lys Gly Ile Ile Arg Ala Phe Arg Asp 405 410 415 Tyr Gln Ser Ser Leu His Asn His Lys Val Lys Ile Tyr Val Arg Arg 420 425 430 Gly Gly Pro Asn Trp Gln Glu Gly Leu Arg Leu Ile Lys Ser Ala Gly 435 440 445 Asp Glu Leu Asn Leu Pro Met Glu Ile Tyr Gly Pro Asp Met His Val 450 455 460 Ser Gly Ile Val Pro Leu Ala Leu Leu Gly Lys Arg Pro Lys Asn Val 465 470 475 480 Lys Pro Phe Gly Thr Gly Pro Ser Thr Glu Ala Ser Thr Pro Leu Gly 485 490 495 Val <210> 11 <211> 406 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 11 agagaccggg ttggcggcgc atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60 cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttctcc ccacatatca 120 aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180 cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240 gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300 aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360 cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaa 406 <210> 12 <211> 122 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 12 gtgagtttca gaggcagcag caattgccac gggctttgag cacacggccg ggtgtggtcc 60 cattcccatc gacacaagac gccacgtcat ccgaccagca ctttttgcag tactaaccgc 120 ag 122 <210> 13 <211> 531 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEF promoter-intron sequence <400> 13 Ala Gly Ala Gly Ala Cys Cys Gly Gly Gly Thr Thr Gly Gly Cys Gly 1 5 10 15 Gly Cys Gly Cys Ala Thr Thr Thr Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Thr Thr 35 40 45 Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Thr Thr Gly Ala Cys Cys Cys Cys Ala 50 55 60 Ala Ala Thr Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Ala Gly Cys Gly 65 70 75 80 Gly Gly Cys Cys Cys Ala Ala Cys Cys Cys Cys Gly Gly Cys Gly Ala 85 90 95 Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Cys Cys 100 105 110 Ala Cys Ala Thr Ala Thr Cys Ala Ala Ala Cys Cys Thr Cys Cys Cys 115 120 125 Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Cys Cys Ala Cys Ala Cys Thr Thr Gly 130 135 140 Cys Cys Gly Thr Thr Ala Ala Gly Gly Gly Cys Gly Thr Ala Gly Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala 165 170 175 Thr Cys Thr Ala Cys Gly Cys Thr Thr Gly Thr Thr Cys Ala Gly Ala 180 185 190 Cys Thr Thr Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Gly Thr Thr Thr Cys Thr 195 200 205 Thr Thr Gly Thr Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys Gly Gly 210 215 220 Gly Thr Ala Ala Cys Cys Cys Ala Thr Gly Cys Cys Gly Gly Ala Cys 225 230 235 240 Gly Cys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gly Cys Thr Thr Thr 260 265 270 Gly Thr Gly Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala Cys Thr Thr Thr Ala Gly 275 280 285 Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Thr Ala Thr Ala Ala Ala Ala Gly Ala 290 295 300 Cys Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Cys Cys Gly Ala Ala Thr Thr 305 310 315 320 Ala Cys Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Thr 325 330 335 Thr Cys Thr Cys Thr Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr Thr Gly Thr Cys 340 345 350 Ala Ala Cys Thr Cys Ala Cys Ala Cys Cys Cys Gly Ala Ala Ala Thr 355 360 365 Cys Gly Thr Thr Ala Ala Gly Cys Ala Thr Thr Thr Cys Cys Thr Thr 370 375 380 Cys Thr Gly Ala Gly Thr Ala Thr Ala Ala Gly Ala Ala Thr Cys Ala 385 390 395 400 Thr Thr Cys Ala Ala Ala Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Thr Thr 405 410 415 Thr Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Ala 420 425 430 Thr Thr Gly Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Ala 435 440 445 Gly Cys Ala Cys Ala Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Thr 450 455 460 Gly Gly Thr Cys Cys Cys Ala Thr Thr Cys Cys Cys Ala Thr Cys Gly 465 470 475 480 Ala Cys Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Gly Cys Cys Ala Cys Gly Thr 485 490 495 Cys Ala Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Thr Thr 500 505 510 Thr Thr Thr Gly Cys Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Ala Cys Cys Gly 515 520 525 Cys Ala Gly 530 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 14 gactgtcgac agagaccggg ttggcggcgc atttgtg 37 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 15 gactggtacc tcaagatgca tagcacgcgt tttgaatgat tcttatactc 50 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 16 ggcagtcgac agagaccggg ttggcggc 28 <210> 17 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 ttattcacgc gtgtagatac gtactgcaaa aagtgctggt cgga 44 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 18 aatgaccatg attacggatt cactgg 26 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 ctaggtggat ccttattttt gacaccagac caactggtaa 40 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 20 taaccgcaga ccatgattac ggattcactg gcc 33 <210> 21 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 21 ctaggtatgc atatgaccat gattacggat tcactgg 37 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 22 cttacaggta ccttattttt gacaccagac caactggtaa 40 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 23 gactacgcgt cacaatgcga ctgcaattga 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 24 tagcatgcat tcacaacccc ttgagcagct 30 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 25 aatgcgactg caattgagga cactaa 26 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 26 cgttgaatcg atttcggaca cgggcatctc ac 32 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 27 taaccgcaga ctatcgactc acaatactac aagtcgcg 38 <210> 28 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 28 ctaggtatgc atttactcaa tcattcggaa ctctggg 37 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 29 cccggcaaca attaatagac tggat 25 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 30 ttcggacacg ggcatctcac 20 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 31 cttacaacgc gtatgtctgc caacgagaac atctcc 36 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 32 ctaggtatgc atctatgatc gagtcttggc cttgga 36 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 33 cttacaacgc gtatgtcagc gaaatccatt cacga 35 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 34 ctaggtatgc atttaaactc cgagaggagt ggaagc 36 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 35 aatggtgaaa aacgtggacc aagtg 25 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 36 ctcacaggat ccctaagcag ccatgccaga catacc 36 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 37 cccggcaaca attaatagac tggat 25 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 38 ttcggacacg ggcatctcac 20 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 39 tccaggccgt cctctccc 18 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 40 ggccagccat atcgagtcgc a 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 41 aacggaggag tggtcaagcg a 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 42 ttatggggaa gtagcggcca a 21 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 43 gaccgactcc aacaaggacc ctt 23 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 44 gggttgggca caagcagcat 20 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 45 gcttctcacg gaggtcatac agt 23 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 46 ctgcggcaat accgttgtta g 21 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 47 cctccttggt gaggttggtg gt 22 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 48 gcgacgatgg gcttcttgat c 21 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 49 ccttcaaggg catcatccgg 20 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 50 cgcctcgtcg cacgtaaatc t 21

Claims (105)

  1. 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(DGA1) 유전자 산물 및 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC1) 유전자 산물의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하고, 유전자 변형이:
    DGA1 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 제1 핵산 구축물; 및
    ACC1 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 제2 핵산 구축물을 포함하며;
    여기서 제1 핵산 구축물이 번역 신장 인자-1α(TEF) 프로모터 서열, 전사 출발 부위, 및 전사 출발 부위의 하류에 있는 인트론 서열을 포함하는 인트론-향상된 프로모터를 추가로 포함하는 것인, 단리된 유지성(oleaginous) 효모 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 스테아로일-CoA-데새투라제(SCD) 유전자 산물; 및
    (b) ATP-시트레이트 리아제(ACL) 유전자 산물 중 적어도 하나의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 추가로 포함하고;
    유전자 변형이
    (i) SCD 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트; 및 (ii) ACL 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트 중 적어도 하나를 포함하는 핵산 구축물; 또는
    인트론-향상된 프로모터, 및 SCD 및 ACL 유전자 산물 중 적어도 하나를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 것인,
    단리된 유지성 효모 세포.
  3. 제1항에 있어서, 유전자 산물이 전사체 또는 단백질인 단리된 유지성 효모 세포.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 구축물이 세포의 게놈 내로 삽입되는 것인 단리된 유지성 효모 세포.
  5. 제4항에 있어서, 유전자 산물의 증가된 발현이 탄소원의 지방산, 지방산 유도체 및 트리아실글리세롤(TAG) 중 적어도 하나로의 전환에 유리한 표현형을 세포에 부여하며, 상기 유리한 표현형이 변형된 지방산 프로파일, 변형된 TAG 프로파일, 지방산, 또는 트리아실글리세롤, 또는 지방산과 트리아실글리세롤 둘 다의 증가된 합성 속도, 증가된 전환 수율, 세포 내 증가된 트리아실글리세롤 축적, 및 세포의 지질체 내 증가된 트리아실글리세롤 축적 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 단리된 유지성 효모 세포.
  6. 제5항에 있어서, 세포가 0.025 g/g 내지 0.32 g/g (생산된 TAG g/ 소비된 글루코스 g)의 전환 비율로 탄소원을 지방산 또는 TAG로 전환시키는 것인, 단리된 유지성 효모 세포.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 와이. 리폴리티카(Y. lipolytica) 세포인, 단리된 유지성 효모 세포.
  8. 탄소원을 DGA1 유전자 산물의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 유지성 효모 세포 또는 그의 배양물과 접촉시키고;
    상기 세포에 의해 상기 탄소원이 지방산 또는 트리아실글리세롤로 적어도 부분적으로 전환하기에 적합한 조건 하에서, 상기 세포와 접촉한 상기 탄소원을 인큐베이션하는 것
    을 포함하며, 여기서 탄소원은
    (a) 발효성 당,
    (b) 글루코스,
    (c) 아세테이트, 및
    (d) 아세트산
    중 적어도 하나를 포함하고, 상기 아세테이트의 농도는 1％ vol/vol 이상이고, 상기 아세트산의 농도는 5％ vol/vol 이상인, 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
  86. 삭제
  87. 삭제
  88. 삭제
  89. 삭제
  90. 삭제
  91. 삭제
  92. 삭제
  93. 삭제
  94. 삭제
  95. 삭제
  96. 삭제
  97. 삭제
  98. 삭제
  99. 삭제
  100. 삭제
  101. 삭제
  102. 삭제
  103. 삭제
  104. 삭제
  105. 삭제
KR1020147013207A 2011-10-19 2012-10-19 조작된 미생물 및 미생물 오일 생산을 위한 방법 KR102036389B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161548901P 2011-10-19 2011-10-19
US61/548,901 2011-10-19
US201261663263P 2012-06-22 2012-06-22
US61/663,263 2012-06-22
PCT/US2012/061101 WO2013059649A1 (en) 2011-10-19 2012-10-19 Engineered microbes and methods for microbial oil production

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140091004A KR20140091004A (ko) 2014-07-18
KR102036389B1 true KR102036389B1 (ko) 2019-10-24

Family

ID=48141406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147013207A KR102036389B1 (ko) 2011-10-19 2012-10-19 조작된 미생물 및 미생물 오일 생산을 위한 방법

Country Status (8)

Country Link
US (2) US8951776B2 (ko)
EP (2) EP2768954B1 (ko)
JP (1) JP6294827B2 (ko)
KR (1) KR102036389B1 (ko)
CN (2) CN109468241A (ko)
BR (1) BR112014009245A2 (ko)
RU (1) RU2652875C2 (ko)
WO (1) WO2013059649A1 (ko)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3312271A1 (en) 2010-03-02 2018-04-25 Massachusetts Institute Of Technology Microbial engineering for the production of fatty acids and fatty acid derivatives
KR102036389B1 (ko) * 2011-10-19 2019-10-24 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 조작된 미생물 및 미생물 오일 생산을 위한 방법
CN104364358A (zh) * 2012-04-09 2015-02-18 Bp生物燃料英国有限公司 用于生产生物燃料和其他可再生材料的低多糖微生物
CN105431529A (zh) * 2013-05-03 2016-03-23 德克萨斯大学系统董事会 用于真菌脂质生产的组合物和方法
AU2015252916B2 (en) * 2014-05-01 2018-08-09 Ginkgo Bioworks, Inc. Increasing cellular lipid production by increasing the activity of diacylglycerol acyltransferase and decreasing the activity of triacylglycerol lipase
US10260077B2 (en) * 2014-05-29 2019-04-16 Novogy, Inc. Increasing lipid production in oleaginous yeast
KR102311681B1 (ko) 2015-07-28 2021-10-12 삼성전자주식회사 내산성을 갖는 효모 세포, 그를 이용하여 유기산을 생산하는 방법 및 상기 내산성 효모 세포를 생산하는 방법
JP2017039078A (ja) * 2015-08-19 2017-02-23 太平洋セメント株式会社 排水の処理方法
WO2017070065A1 (en) * 2015-10-20 2017-04-27 Massachusetts Institute Of Technology Strain and bioprocess engineering for high lipid production
EP3652300A4 (en) 2017-07-13 2021-06-23 Radici Chimica S.p.A. BIOLOGICAL PROCEDURES FOR MODIFYING CELLULAR CARBON FLOW
CN107904199A (zh) * 2017-11-30 2018-04-13 杭州唯铂莱生物科技有限公司 用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞和方法
CN110358692B (zh) * 2018-04-09 2021-07-27 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 生产神经酸的重组酵母菌株及其应用
WO2019241322A1 (en) * 2018-06-13 2019-12-19 Manus Bio, Inc. Enzymes, methods, and host cells for producing carminic acid
CN109929870B (zh) * 2019-02-20 2021-03-16 天津大学 糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用
GB202010630D0 (en) * 2020-07-10 2020-08-26 Imp College Innovations Ltd Methods

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005118814A2 (en) 2004-06-04 2005-12-15 Fluxome Sciences A/S Metabolically engineered cells for the production of polyunsaturated fatty acids
WO2010025374A2 (en) 2008-08-29 2010-03-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Manipulation of snf1 protein kinase activity for altered oil content in oleaginous organisms
US20100081178A1 (en) 2008-10-23 2010-04-01 Targeted Growth, Inc. Modified photosynthetic microorganisms for producing triglycerides
WO2010075440A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Targeted Growth, Inc. Modified photosynthetic microorganisms with reduced glycogen and their use in producing carbon-based products

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL145307A (en) * 1999-04-01 2007-12-03 Basf Plant Science Gmbh Class of enzymes in the biosynthetic pathway for the production of triacylglycerol and recombinant dna molecules encoding these enzymes
US7267976B2 (en) * 2003-07-02 2007-09-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous yeasts
US7202356B2 (en) * 2003-11-14 2007-04-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fructose-bisphosphate aldolase regulatory sequences for gene expression in oleaginous yeast
US7273746B2 (en) * 2004-11-04 2007-09-25 E.I. Dupont De Nemours And Company Diacylglycerol acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7588931B2 (en) 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US7198937B2 (en) * 2004-11-04 2007-04-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina diacylglycerol acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
EP2045327B8 (en) 2005-03-08 2012-03-14 BASF Plant Science GmbH Expression enhancing intron sequences
BRPI0810973A2 (pt) * 2007-05-24 2014-10-07 Du Pont "sementes transgênicas, método de aumento do teor total de ácido graxo, método de aumento do teor total de ácido graxo e ácidos oleico e esteárico, método de aumento do teor total de ácido graxo e redução do teor de ácidos linolênico, linoleico e palmítico, produtos, polinucleotídeo isolado, construção de dna recombinante, célula, semente oleaginosa transgênica e método de aumento do teor total de ácido graxo de uma semente oleaginosa"
US20100317073A1 (en) * 2007-12-04 2010-12-16 The Ohio State University Research Foundation Molecular approaches for the optimization of biofuel production
WO2011026008A1 (en) 2009-08-28 2011-03-03 Phycal Llc Biofuel from recombinant oleginous algae using sugar carbon sources
EP2516638A1 (en) * 2009-12-24 2012-10-31 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant membrane bound o-acyl transferase (mboat) family protein sequences and their uses for altering fatty acid compositions
US20110177564A1 (en) 2010-01-15 2011-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Bioprocess and microbe engineering for total carbon utilization in biofuel production
EP3312271A1 (en) * 2010-03-02 2018-04-25 Massachusetts Institute Of Technology Microbial engineering for the production of fatty acids and fatty acid derivatives
TW201144442A (en) 2010-05-17 2011-12-16 Dow Agrosciences Llc Production of DHA and other LC-PUFAs in plants
WO2012087963A1 (en) 2010-12-20 2012-06-28 Targeted Growth, Inc. Modified photosynthetic microorganisms for producing lipids
EP2655592A2 (en) 2010-12-20 2013-10-30 Matrix Genetics, LLC Modified photosynthetic microorganisms for producing lipids
TW201307553A (zh) 2011-07-26 2013-02-16 Dow Agrosciences Llc 在植物中生產二十二碳六烯酸（ｄｈａ）及其他長鏈多元不飽和脂肪酸（ｌｃ－ｐｕｆａ）之技術
KR102036389B1 (ko) * 2011-10-19 2019-10-24 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 조작된 미생물 및 미생물 오일 생산을 위한 방법
WO2013116517A2 (en) * 2012-02-03 2013-08-08 Matrix Genetics, Llc Modified photosynthetic microorganisms for continuous production of carbon-containing compounds
JP2015509533A (ja) * 2012-03-09 2015-03-30 マトリックス ジェネティクス， エルエルシー 修飾されたジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質およびその使用方法
US9096876B2 (en) 2012-06-22 2015-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Engineered microbes and methods for microbial oil overproduction from cellulosic materials

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005118814A2 (en) 2004-06-04 2005-12-15 Fluxome Sciences A/S Metabolically engineered cells for the production of polyunsaturated fatty acids
JP2008501323A (ja) * 2004-06-04 2008-01-24 フラクスオーム サイエンセズ エイ／エス 多価不飽和脂肪酸生産のための代謝改変細胞
WO2010025374A2 (en) 2008-08-29 2010-03-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Manipulation of snf1 protein kinase activity for altered oil content in oleaginous organisms
US20100081178A1 (en) 2008-10-23 2010-04-01 Targeted Growth, Inc. Modified photosynthetic microorganisms for producing triglycerides
WO2010075440A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Targeted Growth, Inc. Modified photosynthetic microorganisms with reduced glycogen and their use in producing carbon-based products

Also Published As

Publication number Publication date
US8951776B2 (en) 2015-02-10
BR112014009245A2 (pt) 2020-10-27
EP3388516A1 (en) 2018-10-17
CN109468241A (zh) 2019-03-15
US9862977B2 (en) 2018-01-09
EP2768954A1 (en) 2014-08-27
RU2014119784A (ru) 2015-11-27
JP2014530626A (ja) 2014-11-20
JP6294827B2 (ja) 2018-03-14
EP2768954A4 (en) 2015-09-23
KR20140091004A (ko) 2014-07-18
EP2768954B1 (en) 2018-12-05
WO2013059649A1 (en) 2013-04-25
CN104160020A (zh) 2014-11-19
US20130143282A1 (en) 2013-06-06
US20150167034A1 (en) 2015-06-18
RU2652875C2 (ru) 2018-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102036389B1 (ko) 조작된 미생물 및 미생물 오일 생산을 위한 방법
US10006065B2 (en) Microbial engineering for the production of fatty acids and fatty acid derivatives
Tai et al. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production
US9879248B2 (en) Engineered microbes and methods for microbial oil overproduction from cellulosic materials
US11142770B2 (en) Isolated oleaginous yeast
AU2011266953B2 (en) Production of Biodiesel by yeast from lignocellulose and glycerol
US20230039548A1 (en) Yeast Cells and Methods for Producing Fatty Alcohols
Kumari et al. Tailored designing of a diploid S. cerevisiae natural isolate for increased production of fatty acid ethyl ester
Fazili et al. Role of Cytosolic Malic Enzyme in Oleaginicity of High-Lipid-Producing Fungal Strain Mucor circinelloides WJ11. J. Fungi 2022, 8, 265
Dong et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for de novo production of odd-numbered medium-chain fatty acids
Calvey Physiology and Engineering of the Oleaginous Yeast Lipomyces starkeyi

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)