CN106687595A - 通过提高二酰基甘油酰基转移酶活性并降低三酰甘油脂酶活性来提高细胞脂质产量 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于通过上调二酰基甘油酰基转移酶并下调三酰甘油脂酶以提高细胞的三酰基甘油含量的方法和组合物。在一些实施方案中，表达了DGA1蛋白并敲除了天然TGL3基因，从而分别增加三酰基甘油的合成以及减少其消耗。

Description

通过提高二酰基甘油酰基转移酶活性并降低三酰甘油脂酶活 性来提高细胞脂质产量

优先权声明

本申请要求于2014年5月1日提交的美国临时专利申请号61/987,098；和于2014年12月10日提交的美国临时专利申请号62/090,169的优先权权益。

背景技术

脂质具有多种工业应用，包括在化妆品和食品工业中，以及用作生物柴油和生物化学产品的前体。微生物脂质由包括经充分表征的酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）在内的许多产油生物体生产。可以通过上调或下调或缺失涉及脂质通路的基因来提高产油生物体内的脂质产率。例如，据报道，上调天然解脂耶氏酵母DGA1显著提高脂质产率和生产率(Metabolic Engineering 15:1-9 (2013))。

解脂耶氏酵母DGA1是由解脂耶氏酵母二酰基甘油酰基转移酶基因DGAT2编码的2型二酰基甘油酰基转移酶。DGA1是脂质通路中的关键酶之一，并且其涉及三酰基甘油(TAG)合成的最终步骤。三酰基甘油是解脂耶氏酵母中储存性脂质的主要形式。最新数据表明，DGA1效率可能是产油生物体内高水平的脂质积聚的显著因素(Metabolic Engineering15:1-9 (2013))。另外，来自其它物种的DGA1基因可以被引入到宿主基因组中并对脂质产量和组成具有显著影响。例如，相比野生型解脂耶氏酵母菌株，其它产油酵母如圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）和斯达氏油脂酵母（Lipomyces starkeyi）能够积聚明显更多的脂质。结果表明，在解脂耶氏酵母中过表达来自具有更高天然脂质产量水平的生物体的DGA1，相比过表达天然解脂耶氏酵母DGA1，对解脂耶氏酵母脂质产量具有更大的影响(USSN 61/943,664；通过引用并入)。尽管试图通过过表达来自高山被孢霉（Mortierella alpine）的DGA1来提高解脂耶氏酵母中的脂质产率，但尚未报道对脂质产量水平有显著影响(美国专利7,198,937；通过引用并入)。

还已经研究了涉及脂质分解或从脂质生物合成中吸取流量的通路的基因的缺失。Dulermo 等人证实，三酰甘油脂酶基因TGL3的缺失使得解脂耶氏酵母所积聚的总脂质含量几乎加倍(Biochimica Biophysica Acta 1831:1486-95 (2013))。TGL3蛋白是负责解脂耶氏酵母中三酰基甘油降解的第一步的两种细胞内脂肪酶之一。

发明概述

在一些实施方案中，本发明提供了经转化的产油细胞，其包含第一基因修饰和第二基因修饰，其中所述第一基因修饰提高天然二酰基甘油酰基转移酶的活性或编码所述产油细胞原生的或来自不同物种的二酰基甘油酰基转移酶基因的至少一个拷贝，而其中所述第二基因修饰降低所述产油细胞中三酰甘油脂酶的活性。

在一些方面，本发明提供了提高细胞的脂质含量的方法，其包括用第一核酸和第二核酸转化亲代细胞，其中所述第一核酸提高天然二酰基甘油酰基转移酶的活性或包含二酰基甘油酰基转移酶基因，而所述第二核酸降低三酰甘油脂酶的活性。作为另外一种选择，同一核酸可以同时包含上述两种元件。因此，本发明还提供了提高细胞的脂质含量的方法，其包括用核酸转化亲代细胞，其中所述核酸降低所述细胞中三酰甘油脂酶的活性，并且所述核酸包含二酰基甘油酰基转移酶基因或提高天然二酰基甘油酰基转移酶的活性。

另外，在一些方面，本发明提供了提高细胞的三酰基甘油含量的方法，其包括：(a)提供细胞，包含(i) 第一基因修饰，其中所述第一基因修饰提高天然二酰基甘油酰基转移酶的活性，或编码产油细胞原生的或来自不同物种的二酰基甘油酰基转移酶基因的至少一个拷贝；和(ii) 第二基因修饰，其降低所述细胞中三酰甘油脂酶的活性；(b) 在表达所述第一基因修饰的条件下生长所述细胞，从而生产三酰基甘油；以及(c) 任选地回收所述三酰基甘油。

本领域技术人员将容易认识到，本发明非常适于实施目标并获得所提及的以及本文内在的那些结果和优点。本文所述的实施方案不旨在限制本发明的范围。参照以下说明、附图和权利要求将更好地理解本发明的这些以及其它特征、方面和优点。

附图简述

图1 示出了用于在解脂耶氏酵母菌株NS18（得自ARS培养物保藏中心，NRRL# YB 392）中过表达二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因NG66的pNC243构建体的图谱。在转化前，通过PacI/NotI限制性内切酶消化使载体pNC243线性化。“2u ori”表示酿酒酵母的来自2 μm 环形质粒的复制起点；“pMB1 ori”表示大肠杆菌pMB1的来自pBR322质粒的复制起点；“AmpR”表示用作氨苄青霉素选择标志物的bla基因；“PR2”表示解脂耶氏酵母GPD1启动子，-931至-1；“NG66”表示由GenScript合成的天然圆红冬孢酵母DGA1 cDNA；“TER1”表示解脂耶氏酵母CYC1终止子，停止后300个碱基对；“PR22”表示酿酒酵母TEF1启动子，-412至-1；“NG3”表示用作诺尔丝菌素选择标志物的诺尔斯链霉菌Nat1基因；“TER2”表示酿酒酵母CYC1终止子，停止后275个碱基对；而“Sc URA3”表示酿酒酵母URA3营养缺陷型酵母选择标志物。

图2 是描绘解脂耶氏酵母菌株NS421（其为三酰甘油脂酶敲除菌株）和解脂耶氏酵母菌株NS377（其为过表达二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因NG66的三酰甘油脂酶敲除菌株）的基于荧光的脂质测定法的结果的图。

图3 是描绘解脂耶氏酵母菌株NS281（其过表达二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因NG66）和解脂耶氏酵母菌株NS377（其包含三酰甘油脂酶敲除并且过表达二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因NG66）的气相色谱分析的结果的图。

图4 描绘了用于在解脂耶氏酵母中过表达NG112基因(麦角菌（C. purpurea）DGA2)的pNC327构建体的图谱。在转化前，通过PacI/AscI限制性内切酶消化使载体pNC327线性化。“2u ori”表示酿酒酵母的来自2 μm 环形质粒的复制起点；“pMB1 ori”表示大肠杆菌pMB1的来自pBR322质粒的复制起点；“AmpR”表示用作氨苄青霉素选择标志物的bla基因；“PR3”表示解脂耶氏酵母TEF1启动子，-406至+125；“NG112”表示由GenScript合成的麦角菌DGA2基因；“TER1”表示解脂耶氏酵母CYC1终止子，停止后300 bp；“PR1”表示酿酒酵母TEF1启动子，-406至-1；“NG76”表示用作博莱霉素选择标志物的印度斯坦链异壁菌BLE基因；“TER7”表示解脂耶氏酵母TEF1终止子，停止后400 bp；而“Sc URA3”表示酿酒酵母URA3营养缺陷型酵母选择标志物。

图5 包括三个图板，标记为图板(A)、(B)和(C)。本图描绘了通过基于荧光的测定法或如由气相色谱法测定的干细胞重量 的百分比所测量的解脂耶氏酵母菌株NS297、NS281、NS450、NS377和NS432的脂质积聚。Ns297表达 解脂耶氏酵母 DGA1的额外的拷贝；NS281表达圆红冬孢酵母DGA1；NS450表达圆红冬孢酵母DGA1和麦角菌DGA2；NS377表达圆红冬孢酵母并且携带解脂耶氏酵母TGL3的缺失；NS432表达圆红冬孢酵母DGA1和麦角菌DGA2并且携带解脂耶氏酵母TGL3的缺失。在图板(A)中，于48孔平板中发酵96小时后，通过荧光测定法分析菌株，其中针对每种构建体分析两个或三个转化体。在图板(B)中，于50-mL烧瓶中发酵96小时后，通过荧光测定法和气相色谱法分析菌株。在图板(C)中，于1-L生物反应器中发酵140小时后，通过气相色谱法分析菌株。NS281、NS377和NS432的数据是得自重复的生物反应器发酵的平均值。NS450的数据表示得自单次生物反应器发酵的值。

发明详述

概述

公开了用于生成具有增加的三酰基甘油含量的经转化的产油细胞的方法和组合物。破坏酵母的三酰甘油脂酶基因TGL3消除耗尽三酰基甘油含量的通路。另外，过表达二酰基甘油酰基转移酶DGA1增加可以合成三酰基甘油的蛋白质的量。因此，将DGA1过表达与TGL3缺失结合可能是进一步提高细胞的三酰基甘油含量的有吸引力的方法；然而，操纵影响代谢途径的蛋白质即使在最好的情况下也是不可预测的。抑制基因修饰的作用的细胞相对于获得所需特性的那些往往具有选择优势。因此，显示所需表型的细胞通常难以工程改造。

公开了成功结合TGL3缺失与DGA1过表达以提高细胞的三酰基甘油含量。在解脂耶氏酵母菌株中缺失TGL3并同时表达圆红冬孢酵母DGA1二酰基甘油酰基转移酶得到相比携带单一基因修饰的菌株更高的三酰基甘油含量。

定义

本文中所用的冠词“一（个、种……）”（“a”和“an”）指代物品的一（个、种……）或不止一（个、种……）（即，至少一（个、种……））语法对象。譬如，“要素”意指一个（种）要素或不止一个（种）要素。

术语“活性”指代细胞发挥功能的总体能力。例如，降低细胞中三酰甘油脂酶的活性的基因修饰可能减少细胞中三酰甘油脂酶的量或降低三酰甘油脂酶的效率。三酰甘油脂酶敲除减少所述细胞中三酰甘油脂酶的量。作为另外一种选择，三酰甘油脂酶基因的突变可能降低其三酰甘油脂酶蛋白质产物的效率，而对细胞的三酰甘油脂酶的量影响甚微。降低三酰甘油脂酶效率的突变可能影响活性位点，例如，通过改变一个或多个活性位点残基；其可能损害该酶的动力学（kinetics），例如，通过空间阻挡底物或产物；其可能影响蛋白质折叠或动力学（dynamics），例如，通过降低正确折叠的酶的比例；其可能影响蛋白质定位，例如，通过防止所述脂肪酶定位到脂质颗粒上；或其可能影响蛋白质降解，例如，通过添加一个或多个蛋白质裂解位点或通过添加靶向所述蛋白质的蛋白水解的一个或多个残基或氨基酸序列。这些突变影响编码区。降低三酰甘油脂酶活性的突变可能转而影响基因的转录或翻译。例如，三酰甘油脂酶增强子或启动子的突变可以通过减少其表达而降低三酰甘油脂酶活性。突变或缺失三酰甘油脂酶基因的非编码部分（如其内含子）也可能减少转录或翻译。另外，三酰甘油脂酶的上游调节因子的突变可能影响三酰甘油脂酶活性；例如，过表达一种或多种阻遏子可能降低三酰甘油脂酶活性，而一种或多种活化因子的敲除或突变可能类似地降低三酰甘油脂酶活性。提高细胞中二酰基甘油酰基转移酶的活性的基因修饰可能增加细胞中二酰基甘油酰基转移酶的量或提高二酰基甘油酰基转移酶的效率。例如，所述基因修饰可能简单地将二酰基甘油酰基转移酶的额外的拷贝插入到细胞中，使得所述额外的拷贝被转录并翻译成额外的功能性二酰基甘油酰基转移酶。所添加的二酰基甘油酰基转移酶基因可以是所述宿主生物体原生的或来自不同的生物体。作为另外一种选择，突变或缺失天然二酰基甘油酰基转移酶基因的非编码部分（如其内含子）也可能增加翻译。可以通过添加引起更多转录的新的启动子来改变天然的二酰基甘油酰基转移酶基因。类似地，可将增强子添加到二酰基甘油酰基转移酶基因中以增加转录，或可从二酰基甘油酰基转移酶基因中突变或缺失沉默子以增加转录。天然基因的编码区的突变也可能提高二酰基甘油酰基转移酶活性，例如，通过产生不与抑制性蛋白质或分子相互作用的蛋白质变体。过表达一种或多种活化因子可能通过增加二酰基甘油酰基转移酶蛋白质的表达来提高二酰基甘油酰基转移酶活性，而敲除或突变一种或多种阻遏子可能类似地提高二酰基甘油酰基转移酶活性。

术语“生物活性部分”指代这样的氨基酸序列，其短于全长氨基酸序列，但具有所述全长序列的至少一种活性。例如，二酰基甘油酰基转移酶的生物活性部分可能指代DGA1或DGA2的一个或多个域，其具有将酰基辅酶A和二酰基甘油转化成三酰基甘油的生物活性。DGA1的生物活性部分包括这样的肽或多肽，其包含与所述DGA1蛋白的氨基酸序列充分相同或来源于所述DGA1蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列，例如，如SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示的氨基酸序列，其包含少于所述全长DGA1的氨基酸，并具有DGA1蛋白的至少一种活性。类似地，DGA2蛋白的生物活性部分包括这样的肽或多肽，其包含与所述DGA2蛋白的氨基酸序列充分相同或来源于所述DGA2蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列，例如，如SEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、63、65、67、69、71、73或75中所示的氨基酸序列，其包含少于所述全长DGA2的氨基酸，并具有DGA2蛋白的至少一种活性。DGA3蛋白的生物活性部分包括这样的肽或多肽，其包含与所述DGA3蛋白的氨基酸序列充分相同或来源于所述DGA3蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列，例如，如SEQ ID NO: 83或85中所示的氨基酸序列，其包含少于所述全长DGA3的氨基酸，并具有DGA3蛋白的至少一种活性。二酰基甘油酰基转移酶的生物活性部分可能包含，例如，100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695或696个氨基酸。通常，生物活性部分包含具有催化活性的域或基序，所述催化活性是将酰基辅酶A和二酰基甘油转化成三酰基甘油。DGA1蛋白的生物活性部分可以是多肽，其长度为例如278个氨基酸。

术语“DGAT1”指代编码1型二酰基甘油酰基转移酶蛋白的基因，如编码DGA2蛋白的基因。

术语“DGAT2”指代编码2型二酰基甘油酰基转移酶蛋白的基因，如编码DGA1蛋白的基因。

术语“DGAT3”指代编码2型二酰基甘油酰基转移酶蛋白的基因，如编码DGA3蛋白的基因。

“二酰基甘油酯”、“二酰基甘油”和“甘油二酯”是由甘油和两个脂肪酸构成的酯类。

术语“二酰基甘油酰基转移酶”和“DGA”指代催化从二酰基甘油形成三酰基甘油酯的任何蛋白质。二酰基甘油酰基转移酶包括1型二酰基甘油酰基转移酶(DGA2)、2型二酰基甘油酰基转移酶(DGA1)以及所有催化上述反应的同系物。

术语“二酰基甘油酰基转移酶，1型”和“1型二酰基甘油酰基转移酶”指代DGA2和DGA2直系同源物。

术语“二酰基甘油酰基转移酶，2型”和“2型二酰基甘油酰基转移酶”指代DGA1和DGA1直系同源物。

术语“二酰基甘油酰基转移酶，3型”和“3型二酰基甘油酰基转移酶”指代DGA3和DGA3直系同源物。

术语“域”指代蛋白质的氨基酸序列的一部分，其能够独立于该蛋白质的其余部分而折叠成稳定的三维结构。

术语“药物”指代任何这样的分子，其抑制细胞生长或增殖，从而为含有赋予针对该药物的抗性的基因的细胞提供选择优势。药物包括抗生素、抗菌剂、毒素和杀虫剂。

“干重”和“干细胞重量”意指在相对不存在水的情况下测定的重量。例如，提到产油细胞包含以干重计指定百分比的特定组分意指该百分比是基于已经除去基本上所有水之后的细胞重量计算的。

术语“编码”指代包含编码区、编码区的一部分的核酸，或其补体。DNA和RNA均可编码基因。DNA和RNA均可编码蛋白质。

术语“外源性”指代被引入细胞中的任何物质。“外源性核酸”是穿过细胞膜进入细胞的核酸。外源性核酸可含有存在于细胞的天然基因组中的核苷酸序列和/或此前不存在于该细胞的基因组中的核苷酸序列。外源性核酸包括外源性基因。“外源性基因”是已经被引入细胞中的（例如，通过转化/转染）编码用于RNA和/或蛋白质表达的核酸，并且也被称为“转基因”。包含外源性基因的细胞可被称为重组细胞，可向其中引入额外的外源性基因。外源性基因可来自与接受转化的细胞相同或不同的物种。因此，外源性基因可以包括在细胞的基因组中占据不同位置的天然基因或相对于该基因的内源性拷贝处于不同的控制之下。外源性基因可在细胞中具有不止一个拷贝。外源性基因可作为基因组中（核或质体）的插入或作为游离分子被保持在细胞中。

术语“表达”指代细胞中核酸或氨基酸序列（例如，肽、多肽或蛋白质）的量。基因的表达增加指代该基因的转录增加。氨基酸序列、肽、多肽或蛋白质的表达增加指代编码该氨基酸序列、肽、多肽或蛋白质的核酸的翻译增加。

术语“基因”，如本文中所用，可涵盖含有外显子（特别是编码涉及特定活性的多肽序列的多核苷酸序列）的基因组序列。该术语还涵盖并非来源于基因组序列的合成的核酸。在某些实施方案中，所述基因缺少内含子，因为其是根据cDNA的已知DNA序列和蛋白质序列合成的。在其它实施方案中，所述基因是合成的、非天然cDNA，其中密码子已经基于密码子使用而被优化用于在解脂耶氏酵母中表达。该术语还可以包括包含上游、下游和/或内含子核苷酸序列的核酸分子。

术语“基因修饰”指代转化的结果。根据定义，每种转化均引起基因修饰。

术语“同系物”，如本文中所用，指代：(a) 肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于未经修饰的所考虑的蛋白质具有氨基酸置换、缺失和/或插入并且与其所来源于的未经修饰的蛋白质具有相似的生物及功能活性，和(b)核酸，其编码具有(a)中所述的相同特性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。

“诱导型启动子”是这样的启动子，其响应于特定刺激而介导可操作地连接的基因的转录。

术语“整合的”指代作为细胞的基因组中的插入（如染色体中的插入，包括质体基因组中的插入）而保持在该细胞中的核酸。

“处于可操作的连接”指代两个核酸序列（如控制序列（通常是启动子）和所连接的序列（通常是编码蛋白质的序列，也被称为编码序列））之间的功能性连接。如果启动子可以介导基因的转录，则其与该基因处于可操作的连接。

术语“敲除突变”或“敲除”指代这样的基因修饰，其阻止天然基因被转录及翻译成功能性蛋白质。

术语“天然的”指代细胞或亲代细胞在转化事件之前的组成。“天然基因”指代尚未通过转化事件被引入细胞中的编码蛋白质的核苷酸序列。“天然蛋白质”指代由天然基因编码的氨基酸序列。

术语“核酸”指代任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可发挥任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析所定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的DNA、具有任何序列的分离的RNA、核酸探针以及引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸及核苷酸类似物。如果存在，可能在组装该聚合物之前或之后将修饰赋予所述核苷酸结构。多核苷酸可如通过与标记组分结合而被进一步修饰。在本文提供的所有核酸序列中，U核苷酸与T核苷酸是可互换的。

术语“亲代细胞”指代细胞从其演变而来的每种细胞。细胞的基因组由亲代细胞的基因组和对所述亲代细胞的基因组的任何后续基因修饰所构成。

如本文中所用，术语“质粒”指代与生物体的基因组DNA在物理上分离的环状DNA分子。质粒可在被引入宿主细胞之前被线性化（本文中称为线性化质粒）。线性化质粒可能不会自我复制，但可能整合到生物体的基因组DNA中并与之一同复制。

术语“部分”指代肽、寡肽、多肽、蛋白质域以及蛋白质。编码“蛋白质的一部分”的核苷酸序列既包括可以被转录和/或翻译的核苷酸序列，也包括必须经历一个或多个重组事件从而被转录和/或翻译的核苷酸序列。例如，核酸可包含编码选择标志物蛋白的一个或多个氨基酸的核苷酸序列。此核酸可以经工程改造以与编码所述蛋白质的其余部分的一个或多个不同的核苷酸序列重组。此类核酸可用于生成敲除突变，因为只有与靶序列的重组可能重构全长选择标志物基因，而随机整合事件不太可能得到可以产生功能性标志物蛋白的核苷酸序列。多肽的“生物活性部分”是存在于该多肽的氨基酸序列中的任何氨基酸序列，其短于完整的氨基酸序列但可以发挥与全长多肽相同的功能。二酰基甘油酰基转移酶的生物活性部分包括存在于全长二酰基甘油酰基转移酶中的任何氨基酸序列，其可以催化从二酰基甘油和酰基辅酶A形成三酰基甘油。多肽的生物活性部分包括该多肽的这些部分，其具有与全长肽相同的活性，并且每个部分具有高于背景的活性。例如，二酰基甘油酰基转移酶的生物活性部分可能相对于全长多肽具有百分之0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9、100、100.1、100.2、100.3、100.4、100.5、100.6、100.7、100.8、100.9、101、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400或更高的活性。多肽的生物活性部分可能包括肽的这些部分，其缺少将该多肽靶向细胞区室的域。

“启动子”是指导核酸转录的核酸控制序列。如本文中所用，启动子包含转录起始位点附近的必要核酸序列。启动子还任选地包含远端增强子或阻遏子元件，其可以位于距离转录起始位点多达数千碱基对。

“重组体”指代这样的细胞、核酸、蛋白质或载体，其由于外源性核酸的引入或天然核酸的改变已经被修饰。因此，例如，重组细胞可以表达不存在于天然形式的（非重组的）细胞中的基因，或以与由非重组细胞表达那些基因不同的方式表达天然基因。重组细胞可以包含但不限于这样的重组核酸，其编码基因产物或抑制元件如降低细胞中活性基因产物水平的突变、敲除、反义、干扰RNA(RNAi)或dsRNA。“重组核酸”是这样的核酸，其通常通过操纵核酸例如使用聚合酶、连接酶、核酸外切酶和核酸内切酶而最初体外形成，或者处于通常不存在于自然界中的形式。可产生重组核酸例如以将两个或多个核酸置于可操作的连接。因此，通过连接通常不天然相连的DNA分子而在体外形成的分离的核酸或表达载体，对于本发明而言均被认为是重组的。一旦重组核酸被制造并引入宿主细胞或生物体中，其可使用该宿主细胞的体内细胞机制进行复制；然而，这类核酸，一旦被重组产生，尽管之后被细胞内复制，对于本发明而言其依然被认为是重组的。类似地，“重组蛋白”是采用重组技术（即，通过表达重组核酸）制造的蛋白质。

术语“调控区”指代影响基因的转录或翻译但不编码氨基酸序列的核苷酸序列。调控区包括启动子、操纵子、增强子和沉默子。

“转化”指代将核酸转移到宿主生物体或宿主生物体的基因组中，得到基因上稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物体被称为“重组的”、“转基因的”或“转化的”生物体。因此，本发明的分离的多核苷酸可以被并入重组构建体（通常为DNA构建体），其能够被引入宿主细胞并在其中复制。此类构建体可以是这样的载体，其包含复制系统和能够在给定的宿主细胞中转录并翻译多肽编码序列的序列。通常，表达载体包含，例如，处于5'和3'调控序列的转录控制下的一个或多个克隆的基因以及选择标志物。此类载体还可以含有启动子调控区（例如，控制诱导型或组成型、环境或发育调控的、或位置特异性表达的调控区）、转录起始位点、核糖体结合位点、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。

术语“经转化的细胞”指代已经历过转化的细胞。因此，经转化的细胞包含亲代的基因组和可遗传的基因修饰。

术语“三酰基甘油酯”、“三酰基甘油”、“三甘油酯”和“TAG”是由甘油和三个脂肪酸构成的酯类。

术语“三酰甘油脂酶”指代可以催化从三酰基甘油移除脂肪酸链的任何蛋白质。三酰甘油脂酶包括TGL3、TLG3/4和TGL4。

术语“载体”指代这样的装置，通过其可以使核酸在生物体、细胞或细胞组分之间传播和/或转移。载体包括质粒、线性DNA片段、病毒、细菌噬菌体、原病毒、噬粒、转座子和人工染色体等，其可能或可能无法自主复制或整合到宿主细胞的染色体中。

微生物工程改造

A.概述

在本发明的某些实施方案中，微生物经基因修饰以增加其三酰基甘油含量。

基因和基因产物可被引入微生物宿主细胞中。用于表达基因和核酸分子的合适的宿主细胞是可广泛见于真菌或细菌科的微生物宿主。合适的宿主菌株的实例包括但不限于：真菌或酵母物种，如Arxula、曲霉菌属、裂殖壶菌属、假丝酵母属、麦角菌属、隐球菌属、小克银汉霉属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、Leucosporidiella、油脂酵母属、被孢霉属、Ogataea、毕赤酵母属、原囊藻属、根霉菌属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、银耳属、丝孢酵母属、耶氏酵母属；或细菌物种，如蛋白菌和放线菌的成员，以及不动杆菌属、节杆菌属、短杆菌属、食酸菌属、芽孢杆菌属、梭状芽胞杆菌属、链霉菌属、埃希杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属和棒状杆菌属。解脂耶氏酵母和Arxula adeninivorans适合用作宿主微生物，因为其可以积聚占其重量的很大百分比的三酰基甘油。

微生物表达系统和含有指导外来蛋白质的高水平表达的调控序列的表达载体是本领域技术人员已知的。这些中的任一者均可被用于构建嵌合基因以产生相关序列的基因产物中的任一者。然后这些嵌合基因可以通过转化技术被引入到适当的微生物中以提供这些酶的高水平表达。

例如，编码酶的基因可以被克隆到合适的质粒中，并可以用所得质粒转化作为宿主的上述起始亲代菌株。此方法可以增加编码这些酶的基因中的每一者的拷贝数，并因而可以提高这些酶的活性。所述质粒不受特定的限制，只要其使得所需的基因修饰能遗传给该微生物的子代。

可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。所述载体或盒通常含有指导相关基因的转录和翻译的序列、选择标志物和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含携带转录起始控制的基因的5’区和控制转录终止的DNA片段的3’区。当两个控制区均来源于与转化的宿主细胞同源的基因时，是优选的，但应当理解，此类控制区不必来源于被选作生产宿主的特定物种原生的基因。

载体的启动子、cDNA和3'UTR以及其它元件可以通过克隆技术使用分离自天然来源的片段生成(Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (第4版, 2012); 美国专利号 4,683,202; 通过引用并入)。作为另外一种选择，元件可以使用已知方法合成生成(Gene 164:49-53 (1995))。

B.同源重组

同源重组是互补DNA序列对齐并交换同源区的能力。含有与所靶向的基因组序列(“模板”)同源的序列的转基因DNA(“供体”)被引入到生物体中并随后被重组至基因组中对应的同源基因组序列的位点。

在宿主生物体中进行同源重组的能力对于什么可以在分子遗传学水平上进行具有许多实际的影响，并且可用于生成可以生产所需产物的微生物。就其本质，同源重组是精确的基因靶向事件，并因此，大多数生成的具有相同靶向序列的转基因系在表型上将基本上相同，使得需要筛选少得多的转化事件。同源重组还靶向基因插入宿主染色体事件，可能导致出色的遗传稳定性，即使在不存在遗传选择的情况下。因为不同的染色体基因座将可能影响基因表达（即使来自外源性启动子/UTR），所以同源重组可以是在不熟悉的基因组环境中查询基因座并评估这些环境对基因表达的影响的方法。

使用同源重组的特别有用的基因工程改造方法是指派特定的宿主调控元件（如启动子/UTR）从而以高度特异的方式驱动异源基因表达。

因为同源重组是精确的基因靶向事件，所以其可以被用于精确地修饰目标基因或区内的任何核苷酸，只要已经识别出足够的侧接区。因此，同源重组可以被用作修饰影响RNA和/或蛋白质的基因表达的调控序列的方法。其还可以被用于修饰蛋白质编码区，借此修饰酶活性如底物特异性、亲和力和Km，从而影响宿主细胞代谢中的所需变化。同源重组提供了操纵宿主基因组的有力手段，其导致基因靶向、基因转换、基因缺失、基因重复、基因倒置以及交换基因表达调控元件如启动子、增强子和3'UTR。

同源重组可以通过以下方式实现：使用含有内源性序列片断的靶向构建体以“靶向”内源性宿主细胞基因组内的目标基因或区。此类靶向序列可以位于目标基因或区的5’、目标基因/区的3’或甚至侧接目标基因/区。此类靶向构建体可以作为具有额外的载体主链的超螺旋质粒DNA、不含载体主链的PCR产物或作为线性化分子而被转化到宿主细胞中。在一些情况下，可能有利的是先通过用限制性内切酶切割转基因DNA而使转基因DNA（供体DNA）内的同源序列暴露。此步骤可以提高重组效率并降低不期望事件的发生率。提高重组效率的其它方法包括使用PCR以生成含有与被靶向的基因组序列同源的线性末端的转化转基因DNA。

C.载体和载体组分

根据本发明的用于转化微生物的载体可以通过本领域技术人员熟悉的已知技术根据本文的公开内容制备。载体通常含有一个或多个基因，其中每个基因编码表达所需产物（基因产物），并且被可操作地连接至一个或多个控制序列，所述控制序列调控基因表达或将基因产物靶向重组细胞中的特定位置。

1.控制序列

控制序列是这样的核酸，其调控编码序列的表达或将基因产物引导至细胞内或细胞外的特定位置。调控表达的控制序列包括例如，调控编码序列转录的启动子和终止编码序列转录的终止子。另一种控制序列是位于编码序列末端的3'未翻译序列，其编码多腺苷酸化信号。将基因产物引导至特定位置的控制序列包括编码信号肽的那些，其将其所附接的蛋白质引导至细胞内或细胞外的特定位置。

因此，用于在微生物中表达基因的示例性载体设计含有所需基因产物（例如，选择标志物或酶）的编码序列，所述编码序列与在酵母中有活性的启动子处于可操作的连接。作为另外一种选择，如果所述载体不含与目标编码序列处于可操作连接的启动子，则所述编码序列可以被转化到细胞中使得在载体整合时其被可操作地连接至内源性启动子。

用于表达基因的启动子可以是天然连接至该基因的启动子或不同的启动子。

启动子通常可以被表征为组成型或诱导型。组成型启动子通常是活跃或发挥功能以在所有时间（或在细胞生命周期中的某些时间）以相同水平驱动表达。相反地，诱导型启动子仅响应于刺激而活跃（或使之失活）或显著上调或下调。两种类型的启动子均可应用于本发明的方法中。可用于本发明的诱导型启动子包括响应于刺激（如外源提供的小分子、温度（加热或冷却）、培养基中缺氮，等）而介导可操作连接的基因的转录的那些。合适的启动子可以活化基本上沉默的基因的转录，或（优选大幅度地）上调以低水平转录的可操作连接的基因的转录。

包含终止区控制序列是任选的，并且如果采用，则该选择主要是出于方便，因为终止区是相对可互换的。所述终止区可能是转录起始区（启动子）原生的，可能是目标DNA序列原生的，或可能是得自另一种来源的（参见，例如，Chen & Orozco, Nucleic AcidsResearch 16:8411 (1988)）。

2.基因和密码子优化

通常，基因包含启动子、编码序列和终止控制序列。当通过重组DNA技术组装时，基因可能被称为表达盒并且可能侧接限制性位点以方便插入到载体中，所述载体用于将所述重组基因引入到宿主细胞中。所述表达盒可以侧接来自基因组或其它核酸靶标的DNA序列以促进通过同源重组将所述表达盒稳定整合到基因组中。作为另外一种选择，所述载体及其表达盒可能保持未整合的状态（例如，附加体），在这种情况下，所述载体通常包含复制起点，其能够提供所述载体DNA的复制。

载体上常见的基因是编码蛋白质的基因，其表达允许将含有该蛋白质的重组细胞与不表达该蛋白质的细胞区分开来。此类基因及其对应的基因产物被称为可选择标志物或选择标志物。在可用于转化本发明的生物体的转基因构建体中可以采用多种选择标志物中的任一种。

为了重组蛋白的最优表达，采用产生具有待转化的宿主细胞所优化使用的密码子的mRNA的编码序列是有利的。因此，转基因的正确表达可以要求该转基因的密码子使用与将在其中表达该转基因的生物体的特定密码子偏好相匹配。虽然构成此效应的基础的精确机制有许多，但包括可用的氨酰化tRNA集合与正在细胞中合成的蛋白质的适当平衡，再加上转基因信使RNA(mRNA)的更有效的翻译（当此需要满足时）。当转基因中的密码子使用未被优化，可用的tRNA集合不足以允许转基因mRNA的有效翻译，导致核糖体延误和终止以及该转基因mRNA可能的不稳定性。

D.转化

可以通过任何合适的技术转化细胞，例如，基因枪、电穿孔、玻璃微珠转化以及碳化硅晶须转化。用于将转基因引入到微生物中的任何便利的技术均可用于本发明中。转化可以通过以下方法实现：例如，D. M. Morrison (Methods in Enzymology 68:326 (1979))的方法、通过用氯化钙增加受体细胞对DNA的渗透性的方法(Mandel & Higa, J. MolecularBiology, 53:159 (1970))等。

在产油酵母（例如，解脂耶氏酵母）中表达转基因的实例可见于文献中(Bordes 等人，J. Microbiological Methods, 70:493 (2007); Chen 等人，Applied Microbiology& Biotechnology 48:232 (1997))。在细菌如大肠杆菌中表达外源性基因的实例是众所周知的(Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (第4版，2012))。

根据本发明的用于转化微生物的载体可以通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备。在一个实施方案中，用于在微生物中表达基因的示例性载体设计含有编码酶的基因，所述基因与在该微生物中有活性的启动子处于可操作的连接。作为另外一种选择，如果所述载体不含与目标基因处于可操作连接的启动子，则所述基因可以被转化到细胞中使得在载体整合时其被可操作地连接至天然启动子。所述载体还可以含有编码蛋白质的第二个基因。任选地，一个或两个基因均后接含有多腺苷酸化信号的3'未翻译序列。编码这两个基因的表达盒可以在所述载体上物理连接或位于单独的载体上。还可以使用微生物共转化，其中同时使用不同的载体分子以转化细胞(Protist 155:381-93 (2004))。可以任选地基于在存在抗生素或其它选择标志物的情况下生长的能力（在缺少所述抗性盒的细胞将无法生长的条件下）选择经转化的细胞。

示例性核酸、细胞和方法

A. 二酰基甘油酰基转移酶核酸分子及载体

所述二酰基甘油酰基转移酶可能是1型二酰基甘油酰基转移酶、2型二酰基甘油酰基转移酶、3型二酰基甘油酰基转移酶或催化二酰基甘油转化成三酰基甘油酯的任何其它蛋白质。在一些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶是DGA1。例如，所述二酰基甘油酰基转移酶可能是由选自以下的DGAT2基因编码的DGA1蛋白：Arxula adeninivorans、土曲霉、裂殖壶菌、麦角菌、密粘褶菌、斯达氏油脂酵母、花药黑粉菌、季也蒙毕赤酵母、三角褐指藻、禾柄锈菌、倒卵形红冬孢酵母、圆红冬孢酵母、禾本红酵母和解脂耶氏酵母。

所述DGAT2基因可能具有SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62中所示的核苷酸序列。在其它实施方案中，所述DGAT2基因与SEQID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62基本上相同，并且所述核苷酸序列编码的蛋白质保持了由SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62编码的蛋白质的功能活性，尽管由于天然的等位基因变化或诱变而在核苷酸序列上有所不同。在另一个实施方案中，所述DGAT2基因包含与SEQ IDNO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62至少约70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或以上相同的核苷酸序列。

所述DGA1可能具有SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述DGA1与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61基本上相同，并且保持了SEQID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61的蛋白质的功能活性，尽管由于天然的等位基因变化或诱变而在氨基酸序列上有所不同。在另一个实施方案中，所述DGA1蛋白包含与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或以上相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶是DGA2。例如，所述二酰基甘油酰基转移酶可能是由存在于选自以下的生物体中的DGAT1基因编码的DGA2蛋白：Arxula adeninivorans、土曲霉、球毛壳菌、麦角菌、斯达氏油脂酵母、蝗绿僵菌、冬虫夏草菌、三角褐指藻、季也蒙毕赤酵母、圆红冬孢酵母、禾本红酵母、绿木霉和解脂耶氏酵母。

所述DGAT1基因可能具有SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、64、66、68、70、72、74或76中所示的核苷酸序列。在其它实施方案中，所述DGAT1基因与SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、64、66、68、70、72、74或76基本上相同，并且所述核苷酸序列编码的蛋白质保持了由SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、64、66、68、70、72、74或76编码的蛋白质的功能活性，尽管由于天然的等位基因变化或诱变而在核苷酸序列上有所不同。在另一个实施方案中，所述DGAT1基因包含与SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、64、66、68、70、72、74或76至少约70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或以上相同的核苷酸序列。

所述DGA2可能具有SEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、63、65、67、69、71、73或75中所示的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述DGA2与SEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、63、65、67、69、71、73或75基本上相同，并且保持了SEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、63、65、67、69、71、73或75的蛋白质的功能活性，尽管由于天然的等位基因变化或诱变而在氨基酸序列上有所不同。在另一个实施方案中，所述DGA2蛋白包含与SEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、63、65、67、69、71、73或75至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或以上相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶是DGA3。例如，所述二酰基甘油酰基转移酶可能是由存在于选自以下的生物体中的DGAT3基因编码的DGA3蛋白：蓖麻和花生。

所述DGAT3基因可能具有SEQ ID NO: 84或86中所示的核苷酸序列。在其它实施方案中，所述DGAT3基因与SEQ ID NO: 84或86基本上相同，并且所述核苷酸序列编码的蛋白质保持了由SEQ ID NO: 84或86编码的蛋白质的功能活性，尽管由于天然的等位基因变化或诱变而在核苷酸序列上有所不同。在另一个实施方案中，所述DGAT3基因包含与SEQ IDNO: 84或86至少约70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或以上相同的核苷酸序列。

所述DGA3可能具有SEQ ID NO: 83或85中所示的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述DGA3与SEQ ID NO: 83或85基本上相同，并且保持了SEQ ID NO: 83或85的蛋白质的功能活性，尽管由于天然的等位基因变化或诱变而在氨基酸序列上有所不同。在另一个实施方案中，所述DGA3蛋白包含与SEQ ID NO: 83或85至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或以上相同的氨基酸序列。

所述DGAT1、DGAT2和DGAT3基因可包含保守置换、缺失和/或插入，而同时仍然编码具有功能性二酰基甘油酰基转移酶活性的蛋白质。例如，可针对特定的宿主细胞优化所述DGAT1、DGAT2或DGAT3密码子，可置换不同的密码子以便于如引入限制性位点或生成最佳PCR引物，或者可出于另一目的而置换密码子。类似地，可改变所述核苷酸序列以产生保守氨基酸置换、缺失和/或插入。

所述DGA1、DGA2和DGA3多肽可包含保守置换、缺失和/或插入，而同时仍然保持功能性二酰基甘油酰基转移酶活性。保守置换表是本领域熟知的(Creighton, Proteins (第2版, 1992))。

可使用重组DNA操纵技术容易地制造氨基酸置换、缺失和/或插入。操纵DNA序列以产生蛋白质的置换、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。这些方法包括：M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB, Cleveland, OH)、Quick Change定点诱变(Stratagene, San Diego,CA)、PCR介导的定点诱变以及其它定点诱变方案。

为了确定两个氨基酸序列或两个核苷酸序列的百分比同一性，可以出于最佳比较的目的而将这些序列对齐（例如，可以出于最佳比对的目的而在第一和第二氨基酸或核苷酸序列的一个或两个中引入空位，并且可以出于比较目的而忽略非相同序列）。出于比较目的而对齐的参考序列的长度可以是所述参考序列的长度的至少95%。然后可以比较处于对应的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当所述第一序列中的位置与所述第二序列中的对应位置被相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置是相同的（如本文中所用，氨基酸或核酸的“同一性”等同于氨基酸或核酸的“同源性”）。所述两个序列之间的百分比同一性是所述序列共享的相同位置的数量的函数，并同时考虑到空位的数量以及每个空位的长度，需要引入所述空位以用于所述两个序列的最佳比对。

比较序列并确定两个序列之间的百分比同一性可以使用数学算法完成。在一个实施方案中，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch(J.Molecular Biology 48:444-453 (1970))的算法确定，该算法已经被结合到GCG软件包的GAP程序中(可从http://www.gcg.com获得)，使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵，而空位权重为16、14、12、10、8、6或4并且长度权重为1、2、3、4、5或6。在又另一个实施方案中，两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用GCG软件包的GAP程序(可从http://www.gcg.com获得)确定，使用NWSgapdna.CMP矩阵，而空位权重为40、50、60、70或80并且长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一个实施方案中，两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W. Miller的算法(Computer Applications in the Biosciences 4:11-17(1988))确定，该算法已经被结合到ALIGN程序(版本 2.0 或 2.0U)中，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12并且空位罚分为4。

可以用于确定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括但不限于：BLAST程序套件，例如，BLASTN、MEGABLAST、BLASTX、TBLASTN、TBLASTX和BLASTP，以及Clustal程序，例如，ClustalW、ClustalX和Clustal Omega。

当相对于GenBank DNA序列以及其它公共数据库中的核酸序列而评价给定的核酸序列时，通常使用BLASTN程序进行序列搜索。BLASTX程序可有效用于针对GenBank蛋白质序列以及其它公共数据库中的氨基酸序列来搜索已经在全部阅读框中被翻译的核酸序列。

使用例如CLUSTAL-W程序进行选定序列的比对以确定两个或多个序列之间的“%同一性”。

“编码序列”或“编码区”指代具有生产蛋白质产物（如氨基酸或多肽）所必需的序列信息（当表达该序列时）的核酸分子。所述编码序列可能在已翻译区内包含未翻译序列（包括内含子或5'或3'未翻译区）并且/或者由其组成，或可能缺少此类介入的未翻译序列（例如，如在cDNA中）。

用于整个说明书中以指代包含核苷酸序列和/或由其组成的核酸的缩写是常规的单字母缩写。因此，当包含在核酸中时，天然存在的编码核苷酸缩写如下：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。同样，除非另外指明，否则本文提供的核酸序列均为5̕’→3̕’方向。

如本文中所用，术语“互补的”及其派生词被用于涉及通过众所周知的法则为核酸配对，其中A与T或U配对，而C与G配对。互补可以是“部分的”或“完全的”。在部分互补中，根据碱基配对法则，仅一些核酸碱基是匹配的；而在完全或总体互补中，根据配对法则，所有的碱基都是匹配的。正如本领域众所周知的，核酸链之间的互补程度可能对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。所述杂交的效率和强度取决于检测方法。

如本文中所用，“DGA1”意指二酰基甘油酰基转移酶2型(DGAT2)。DGA1是膜整合蛋白，其催化油类生物合成的最终酶促步骤以及植物、真菌和哺乳动物中三酰基甘油的生产。DGA1可能在改变产生于产油生物体的油类中的长链多不饱和脂肪酸的数量上起关键作用。DGA1与酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶("ACAT")有关。此酶负责将酰基从酰基辅酶A转移至1,2-二酰基甘油("DAG")的sn-3位置以形成三酰基甘油("TAG")(从而涉及TAG生物合成的最终步骤)。在植物和真菌中，DGA1与膜和脂质体部分结合，特别是在含油种子中，其有助于储存用作能量储备的碳。据信，TAG是细胞中用于储存能量的重要化学物质。已知DGA1可以调节TAG结构并指导TAG合成。

DGA1多核苷酸和多肽序列可能来源于具有极高的天然的脂质积聚水平的高产油生物体。(Bioresource Technology 144:360-69 (2013); Progress Lipid Research 52:395-408 (2013); Applied Microbiology & Biotechnology 90:1219-27 (2011);European Journal Lipid Science & Technology 113:1031-51 (2011); FoodTechnology & Biotechnology 47:215-20 (2009); Advances Applied Microbiology51:1-51 (2002); Lipids 11:837-44 (1976))。具有据报道约50%及更高的脂质含量的生物体的列表示于表1中。圆红冬孢酵母和斯达氏油脂酵母具有最高的脂质含量。在表1的生物体中，有五种具有可公开访问的DGA1序列：圆红冬孢酵母、斯达氏油脂酵母、裂殖壶菌、土曲霉和麦角菌（在表1中以粗体表示）。

表1：具有据报道约50%及以上的脂质含量的产油真菌的列表。具有可公开访问的DGA1基因序列的生物体以粗体表示。

用于过表达DGA1基因的核酸构建体在USSN 61/943,664中有述(在此通过引用并入)。图1示出了用于在解脂耶氏酵母中过表达圆红冬孢酵母DGA1基因NG66(SEQ ID No.6)的表达构建体pNC243。在转化前，通过PacI/NotI限制性内切酶消化使DGA1表达构建体线性化（图1）。所述线性表达构建体各自包含DGA1基因和Nat1基因的表达盒，用作诺尔丝菌素(NAT)选择的标志物。

用于过表达DGA2基因和/或其它二酰基甘油酰基转移酶的核酸构建体可使用上述方法和/或本领域已知的其它方法来生成。

B.三酰甘油脂酶核酸分子及载体

三酰甘油脂酶通过移除一个或多个脂肪酸链来耗尽细胞的三酰基甘油。因此，降低细胞的净三酰甘油脂酶活性可增加所述细胞的三酰基甘油。这种降低可通过降低所述酶的效率而实现，例如，通过使其活性位点的氨基酸突变，或通过减少所述酶的表达。例如，TGL3敲除突变将降低三酰甘油脂酶的活性，因为其阻止细胞转录TGL3。

在一些实施方案中，所述三酰甘油脂酶是TGL3、TGL3/4或TGL4。

解脂耶氏酵母中的TGL3基因编码三酰甘油脂酶蛋白TGL3(SEQ ID No. 19)。SEQID No.20含有TGL3核苷酸序列、100个上游核苷酸和100个下游核苷酸。因此，SEQ ID No.20核苷酸序列可被用于设计能够与天然解脂耶氏酵母三酰甘油脂酶基因中的核酸序列重组的核酸。

敲除盒SEQ ID No.27和28能够与解脂耶氏酵母中的天然TGL3基因重组。因此，在一些实施方案中，由SEQ ID No.27和28编码的核酸可被用于在解脂耶氏酵母中生成三酰甘油脂酶敲除突变。SEQ ID No.27和28各自含有潮霉素抗性基因hph的一些部分。分离的序列均不编码功能性蛋白质，但所述两个序列能够编码功能性激酶，其在成功重组时赋予潮霉素抗性。另外，SEQ ID No.27和SEQ ID No.28均不含启动子或终止子，因而其依靠与解脂耶氏酵母TGL3基因的同源重组以使得hph基因被转录和翻译。这样，可通过在含有潮霉素的培养基上生长细胞而选择成功转化的产油细胞。

敲除盒SEQ ID NO.27可通过用引物NP1798(SEQ ID NO.23)和引物NP656(SEQ IDNO.24)扩增潮霉素抗性基因hph(SEQ ID NO.22)而制备。敲除盒SEQ ID NO.28可通过用引物NP655(SEQ ID NO.25)和引物NP1799(SEQ ID NO.26)扩增潮霉素抗性基因hph(SEQ IDNO.22)而制备。

可使用不同的方法设计敲除了解脂耶氏酵母中的TGL3基因的核酸(BiochimicaBiophysica Acta 1831:1486-95 (2013))。本文公开的方法以及本领域已知的其它方法可被用于敲除其它物种中的不同三酰甘油脂酶基因。例如，这些方法可被用于降低下列基因的活性：Arxula adeninivorans的TGL3基因(SEQ ID NO:78)、Arxula adeninivorans的TGL3/4基因(SEQ ID NO:80)和/或Arxula adeninivorans的TGL4基因(SEQ ID NO:82)。类似地，这些方法可被用于降低解脂耶氏酵母中TGL4基因(SEQ ID NO:88)的活性。

C.经转化的产油细胞

在一些实施方案中，所述经转化的产油细胞是原核细胞，如细菌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞，如哺乳动物细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、原生生物细胞、藻类细胞、禽类细胞、植物细胞或昆虫细胞。

所述细胞可选自：Arxula、曲霉菌属、裂殖壶菌属、假丝酵母属、麦角菌属、隐球菌属、小克银汉霉属、地霉属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、Kodamaea、Leucosporidiella、油脂酵母属、被孢霉属、Ogataea、毕赤酵母属、原囊藻属、根霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、银耳属、丝孢酵母属、Wickerhamomyces以及耶氏酵母属。

在一些实施方案中，所述细胞选自：Arxula adeninivorans、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、裂殖壶菌、产朊假丝酵母、麦角菌、白色隐球菌、弯曲隐球菌、Cryptococcus ramirezgomezianus、土隐球菌、Cryptococcus wieringae、刺孢小克银汉霉、山茶小克银汉霉、发酵地霉、多形汉森酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、奥默柯达菌、Leucosporidiella creatinivora、产油油脂酵母、斯达氏油脂酵母、子囊菌油脂酵母、深黄被孢霉、高山被孢霉、Ogataea polymorpha、Pichia ciferrii、季也蒙毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、树干毕赤酵母、左氏原壁菌、少根根霉、Rhodosporidium babjevae、圆红冬孢酵母菌、海洋红冬孢酵母、粘红酵母、胶红酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、Tremella enchepala、皮状丝孢酵母、发酵性丝孢酵母、Wickerhamomyces ciferrii和解脂耶氏酵母。

在某些实施方案中，所述经转化的产油细胞是耐高温酵母细胞。在一些实施方案中，所述经转化的产油细胞是马克斯克鲁维酵母。

在某些实施方案中，所述细胞是解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans。

D. 增加细胞中的二酰基甘油酰基转移酶

蛋白质活性可通过过表达该蛋白质而提高。可使用各种基因修饰而在细胞中过表达蛋白质。在一些实施方案中，所述基因修饰增加天然二酰基甘油酰基转移酶的表达。可通过修饰天然二酰基甘油酰基转移酶基因的上游转录调节因子来过表达天然二酰基甘油酰基转移酶，例如，通过增加转录活化因子的表达或减少转录阻遏子的表达。作为另外一种选择，可通过与外源性核酸重组而用组成活性的或诱导型启动子置换天然二酰基甘油酰基转移酶基因的启动子。

在一些实施方案中，所述基因修饰编码二酰基甘油酰基转移酶基因的至少一个拷贝。所述二酰基甘油酰基转移酶基因可能是该细胞原生的或来自不同物种的基因。在某些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是来自以下的II型二酰基甘油酰基转移酶基因：Arxula adeninivorans、土曲霉、裂殖壶菌、麦角菌、密粘褶菌、斯达氏油脂酵母、花药黑粉菌、季也蒙毕赤酵母、三角褐指藻、禾柄锈菌、倒卵形红冬孢酵母、圆红冬孢酵母、禾本红酵母或解脂耶氏酵母。在某些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是来自以下的I型二酰基甘油酰基转移酶基因：Arxula adeninivorans、土曲霉、球毛壳菌、麦角菌、斯达氏油脂酵母、蝗绿僵菌、冬虫夏草菌、三角褐指藻、季也蒙毕赤酵母、圆红冬孢酵母、禾本红酵母、绿木霉或解脂耶氏酵母。在某些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是来自以下的III型二酰基甘油酰基转移酶基因：蓖麻或花生。在某些实施方案中，通过用编码二酰基甘油酰基转移酶的基因转化细胞来过表达二酰基甘油酰基转移酶。所述基因修饰可编码二酰基甘油酰基转移酶基因的一个或不止一个拷贝。在某些实施方案中，所述基因修饰编码来自圆红冬孢酵母的DGA1蛋白的至少一个拷贝。在一些实施方案中，所述基因修饰编码来自圆红冬孢酵母的DGA1蛋白的至少一个拷贝，并且所述经转化的产油细胞是解脂耶氏酵母。

在某些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶基因可遗传给经转化的产油细胞的子代。在一些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是可遗传的，因为其位于质粒上。在某些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是可遗传的，因为其被整合到经转化的产油细胞的基因组中。

E. 降低细胞中的三酰甘油脂酶活性

在一些实施方案中，所述经转化的产油细胞包含降低天然三酰甘油脂酶的活性的基因修饰。此类基因修饰可影响调控三酰甘油脂酶基因转录的蛋白质，所述修饰包括减少转录活化因子的表达和/或增加转录阻遏子的表达。影响调控蛋白的修饰可同时减少三酰甘油脂酶的表达并且改变其它基因的表达概况，使得细胞平衡向增加三酰基甘油积聚的方向移动。作为另外一种选择，所述基因修饰可以是引入小干扰RNA或编码小干扰RNA的核酸。在其它实施方案中，所述基因修饰包括核酸与天然三酰甘油脂酶基因的调控区的重组，所述调控区包括操纵子、启动子、该启动子的上游序列、增强子以及该基因的下游序列。

在一些实施方案中，所述经转化的产油细胞包含由同源重组事件组成的基因修饰。在某些实施方案中，所述经转化的产油细胞包含由天然三酰甘油脂酶基因与核酸之间的同源重组事件组成的基因修饰。因此，所述基因修饰使三酰甘油脂酶基因缺失、阻止其转录或阻止可以被转录成完全活性蛋白质的基因的转录。同源重组事件可突变或缺失天然三酰甘油脂酶基因的一部分。例如，所述同源重组事件可突变天然三酰甘油脂酶的活性位点处的一个或多个残基，从而降低所述脂肪酶的效率或使其失活。作为另外一种选择，所述同源重组事件可影响翻译后修饰、折叠、稳定性或在细胞内的定位。在某些实施方案中，所述基因修饰是三酰甘油脂酶敲除突变。敲除突变是优选的，因为其消除了耗尽细胞的三酰基甘油含量的通路，从而增加了细胞的三酰基甘油含量。

敲除突变可缺失三酰甘油脂酶基因。另外，所述敲除突变可用编码不同蛋白质的基因置换三酰甘油脂酶基因。所述基因可被可操作地连接至外源性启动子。在某些实施方案中，所述基因并未被连接至外源性启动子，而是将所述基因构造成与三酰甘油脂酶基因重组，使得所述三酰甘油脂酶基因的启动子驱动所述基因的转录。因此，如果所述基因随机整合到细胞的基因组中，其不太可能被表达。用于生成敲除的方法是本领域熟知的(参见，例如，Fickers 等人，J. Microbiological Methods 55:727 (2003))。

在某些实施方案中，所述基因修饰包括两个同源重组事件。在第一个事件中，编码基因的一部分的核酸与三酰甘油脂酶基因重组，而在第二个事件中，编码所述基因的其余部分的核酸与三酰甘油脂酶基因重组。所述基因的这两个部分经过设计使得它们除非相互重组，否则均没有功能。这两个事件进一步减小所述基因可以在随机整合事件之后被表达的可能性。

在某些实施方案中，所述基因编码显性选择标志物。因此，可通过筛选所述标志物来选择敲除细胞。在一些实施方案中，所述显性选择标志物是药物抗性标志物。药物抗性标志物是这样的显性选择标志物：当由细胞表达时，其允许该细胞在存在通常将抑制细胞生长和/或存活的药物的情况下生长和/或存活。表达药物抗性标志物的细胞可以通过使细胞在存在该药物的情况下生长来进行选择。在一些实施方案中，所述药物抗性标志物是抗生素抗性标志物。在一些实施方案中，所述药物抗性标志物赋予针对选自下列的药物的抗性：两性霉素B、杀念菌素、菲律宾菌素、哈霉素、纳他霉素、制霉菌素、裂霉素、白呋唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、丝他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬净、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、苯甲酸、环吡酮、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤普罗近、水蓼二醛、托萘酯、结晶紫、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、大观霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明、链霉素、氯碳头孢、厄他培南、多利培南、亚胺培南、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢洛林酯、头孢比普、替考拉宁、万古霉素、特拉万星、克林霉素、林可霉素、达托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、硝基呋喃妥因、利奈唑胺、泼斯唑来、雷得唑来、特地唑胺、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦、克拉维酸、杆菌肽、粘杆菌素、多粘菌素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺酰亚胺、柳氮磺胺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑、复方新诺明、磺酰胺橘红、去甲金霉素、多西环素、米诺环素、土霉素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷汀、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普丁、达福普汀、甲砜霉素、替加环素、替硝唑、甲氧苄氨嘧啶、遗传霉素、诺尔丝菌素、潮霉素、博莱霉素和嘌呤霉素。

在一些实施方案中，所述显性选择标志物是营养标志物。营养标志物是这样的显性选择标志物：当由细胞表达时，其使得细胞能够使用一种或多种特定的营养来源而生长或存活。表达营养标志物的细胞可以通过使细胞在有限营养的条件下生长来进行选择，在该条件下，表达所述营养标志物的细胞可以存活和/或生长，但缺少所述营养标志物的细胞无法存活和/或生长。在一些实施方案中，所述营养标志物选自：乳清酸核苷5-磷酸脱羧酶、亚磷酸特异性氧化还原酶、α-酮戊二酸依赖性次磷酸双加氧酶、碱性磷酸酶、氨腈水合酶、三聚氰胺脱氨酶、氰尿酸酯酰胺水解酶、缩二脲水解酶、尿素酰基裂解酶、氰尿酰胺氨基水解酶、鸟嘌呤脱氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亚磷酸氢化酶、甘油磷酸二酯酶、对硫磷水解酶、亚磷酸脱氢酶、二苯并噻吩脱硫酶、芳香脱亚磺酸酶、NADH依赖性FMN还原酶、氨基嘌呤转运蛋白、羟胺氧化还原酶、蔗糖酶、β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纤维素酶和普鲁兰酶。

可使用不同的方法敲除解脂耶氏酵母中的TGL3基因(参见，例如，Dulermo 等人，Biochimica Biophysica Acta 1831:1486 (2013))。本文公开的方法以及本领域已知的其它方法可被用于敲除其它物种中的不同三酰甘油脂酶基因。例如，这些方法可被用于敲除下列基因：Arxula adeninivorans的TGL3基因(SEQ ID NO:78)、Arxula adeninivorans的TGL3/4基因(SEQ ID NO:80)或Arxula adeninivorans的TGL4基因(SEQ ID NO:82)。类似地，这些方法可被用于敲除解脂耶氏酵母的TGL4基因(SEQ ID NO:88)。

在一些实施方案中，基因修饰减少天然三酰甘油脂酶基因的表达，其减少程度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%。

在一些实施方案中，基因修饰降低天然三酰甘油脂酶基因的效率，其降低程度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%。

在一些实施方案中，基因修饰降低天然三酰甘油脂酶基因的活性，其降低程度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%。

F.通过同时过表达二酰基甘油酰基转移酶来降低细胞中的三酰甘油脂酶活性

在一些实施方案中，所述经转化的产油细胞包含三酰甘油脂酶敲除突变和增加天然二酰基甘油酰基转移酶的表达的基因修饰。在某些实施方案中，所述经转化的产油细胞包含三酰甘油脂酶敲除突变和编码二酰基甘油酰基转移酶基因的至少一个拷贝的基因修饰，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是所述细胞原生的或来自不同物种的细胞。在其它实施方案中，TGL3基因被破坏而DGA1蛋白被过表达。

在一些实施方案中，一个核酸增加天然二酰基甘油酰基转移酶的表达或编码二酰基甘油酰基转移酶基因的至少一个拷贝，而第二个核酸降低细胞中三酰甘油脂酶的活性。在一些实施方案中，同一个核酸编码二酰基甘油酰基转移酶基因的至少一个拷贝并且降低细胞中三酰甘油脂酶的活性。例如，被设计成敲除三酰甘油脂酶基因的核酸还可含有二酰基甘油酰基转移酶基因的一个拷贝。

G.三酰基甘油的生产

在某些实施方案中，所述经转化的产油细胞在存在外源性脂肪酸、葡萄糖、乙醇、木糖、蔗糖、淀粉、淀粉糊精、甘油、纤维素和/或乙酸的情况下生长。可在培养过程中加入这些底物以提高脂质产量。所述外源性脂肪酸可包括：硬脂酸、油酸、亚油酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳二烯酸和/或二十碳三烯酸。

在某些实施方案中，本发明涉及由本文所述的经修饰的宿主细胞生产的产物。在某些实施方案中，所述产物是油、脂质或三酰基甘油。在一些实施方案中，所述产物是棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸或亚油酸。在某些实施方案中，所述产物是饱和脂肪酸。因此，所述产物可能是：辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四酸或蜡酸。在一些实施方案中，所述产物是不饱和脂肪酸。因此，所述产物可能是：肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、6(Z)-十六碳烯酸（sapienic acid）、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、亚反油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥子酸或二十二碳六烯酸。

在一些实施方案中，所述产物包括18-碳脂肪酸。在一些实施方案中，所述产物包括油酸、硬脂酸或亚油酸。例如，所述产物可能是油酸。

在一些实施方案中，本发明涉及经转化的产油细胞，其包含第一基因修饰和第二基因修饰。所述第一基因修饰可提高天然二酰基甘油酰基转移酶的活性。作为另外一种选择，所述第一基因修饰可编码二酰基甘油酰基转移酶基因的至少一个拷贝，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是所述产油细胞原生的或来自不同物种。所述第二基因修饰可降低所述产油细胞中三酰甘油脂酶的活性。

在一些实施方案中，所述第二基因修饰是三酰甘油脂酶敲除突变。

在一些实施方案中，所述第一基因修饰编码二酰基甘油酰基转移酶基因的至少一个拷贝，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是所述产油细胞原生的或来自不同物种。在一些实施方案中，二酰基甘油酰基转移酶基因被整合到所述细胞的基因组中。

在一些实施方案中，所述经转化的产油细胞选自：藻类、细菌、霉菌、真菌、植物和酵母。在某些实施方案中，所述经转化的产油细胞是酵母。所述经转化的产油细胞可选自：Arxula、曲霉菌属、裂殖壶菌属、假丝酵母属、麦角菌属、隐球菌属、小克银汉霉属、地霉属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、Kodamaea、Leucosporidiella、油脂酵母属、被孢霉属、Ogataea、毕赤酵母属、原囊藻属、根霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、银耳属、丝孢酵母属、Wickerhamomyces以及耶氏酵母属。在某些实施方案中，所述经转化的产油细胞选自：Arxula adeninivorans、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、裂殖壶菌、产朊假丝酵母、麦角菌、白色隐球菌、弯曲隐球菌、Cryptococcus ramirezgomezianus、土隐球菌、Cryptococcus wieringae、刺孢小克银汉霉、山茶小克银汉霉、发酵地霉、多形汉森酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、奥默柯达菌、Leucosporidiella creatinivora、产油油脂酵母、斯达氏油脂酵母、子囊菌油脂酵母、深黄被孢霉、高山被孢霉、Ogataea polymorpha、Pichia ciferrii、季也蒙毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、树干毕赤酵母、左氏原壁菌、少根根霉、Rhodosporidium babjevae、圆红冬孢酵母菌、海洋红冬孢酵母、粘红酵母、胶红酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、Tremella enchepala、皮状丝孢酵母、发酵性丝孢酵母、Wickerhamomyces ciferrii和解脂耶氏酵母。在其它实施方案中，所述经转化的产油细胞是解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans。

在一些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是II型二酰基甘油酰基转移酶基因。所述二酰基甘油酰基转移酶基因可能是来自以下的II型二酰基甘油酰基转移酶基因：Arxula adeninivorans、土曲霉、裂殖壶菌、麦角菌、密粘褶菌、斯达氏油脂酵母、花药黑粉菌、季也蒙毕赤酵母、三角褐指藻、禾柄锈菌、倒卵形红冬孢酵母、圆红冬孢酵母、禾本红酵母或解脂耶氏酵母。

在一些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是I型二酰基甘油酰基转移酶基因。所述二酰基甘油酰基转移酶基因可能是来自以下的I型二酰基甘油酰基转移酶基因：Arxula adeninivorans、土曲霉、球毛壳菌、麦角菌、斯达氏油脂酵母、蝗绿僵菌、冬虫夏草菌、三角褐指藻、季也蒙毕赤酵母、圆红冬孢酵母、禾本红酵母、绿木霉或解脂耶氏酵母。

在一些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是III型二酰基甘油酰基转移酶基因。所述二酰基甘油酰基转移酶基因可能是来自以下的III型二酰基甘油酰基转移酶基因：蓖麻或花生。

在一些实施方案中，所述三酰甘油脂酶是TGL3、TGL3/4或TGL4。

在一些实施方案中，本发明涉及来源于经转化的产油细胞的产物。在某些实施方案中，所述产物是油、脂质或三酰基甘油。

在一些实施方案中，本发明涉及提高细胞的脂质含量的方法，其包括用第一核酸和第二核酸转化亲代细胞。所述第一核酸可提高天然二酰基甘油酰基转移酶的活性，或包含二酰基甘油酰基转移酶基因。所述第二核酸可降低三酰甘油脂酶的活性。所述第一核酸和第二核酸可能是相同的。因此，在一些实施方案中，本发明涉及提高细胞的脂质含量的方法，其包括用核酸转化亲代细胞，其中所述核酸降低所述细胞中三酰甘油脂酶的活性，并且包含二酰基甘油酰基转移酶基因或提高天然二酰基甘油酰基转移酶的活性。

在一些实施方案中，本发明涉及提高细胞的三酰基甘油含量的方法，其包括提供细胞并生长该细胞。所述细胞可包含第一基因修饰和第二基因修饰。所述第一基因修饰可提高天然二酰基甘油酰基转移酶的活性或编码二酰基甘油酰基转移酶基因的至少一个拷贝，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是所述产油细胞原生的或来自不同物种。所述第二基因修饰可降低所述细胞中三酰甘油脂酶的活性。所述细胞可在其中所述第一基因修饰被表达的条件下生长，从而生产三酰基甘油。在一些实施方案中，回收所述三酰基甘油。

在一些实施方案中，所述第一核酸包含二酰基甘油酰基转移酶基因。所述二酰基甘油酰基转移酶基因可编码I型二酰基甘油酰基转移酶多肽、II型二酰基甘油酰基转移酶多肽或III型二酰基甘油酰基转移酶多肽。

在一些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶基因包含下列中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ IDNO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ IDNO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 64、SEQ IDNO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 84或SEQ ID NO: 86，或其中任一项的补体。

在一些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶基因包含与下列中所示的核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQID NO: 84或SEQ ID NO: 86，或其中任一项的补体。

在一些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶多肽包含下列中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ IDNO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ IDNO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 63、SEQ IDNO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 85，或其中任一项的生物活性部分。

在一些实施方案中，所述二酰基甘油酰基转移酶多肽包含与下列中所示的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ IDNO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ IDNO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ IDNO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 85，或其中任一项的生物活性部分。

在一些实施方案中，所述第二核酸能够与三酰甘油脂酶基因中的核酸序列和/或三酰甘油脂酶基因的调控区中的核酸序列重组。在某些实施方案中，所述第二核酸能够与TGL3、TGL3/4或TGL4基因中的核酸序列和/或TGL3、TGL3/4或TGL4基因的调控区中的核酸序列重组。所述第二核酸可包含编码蛋白质或蛋白质的一部分的基因。在某些实施方案中，所述第二核酸包含编码蛋白质的基因，所述蛋白质赋予对药物的抗性。在其它实施方案中，所述第二核酸包含编码蛋白质的基因，所述蛋白质使得细胞能够在一种或多种特定营养来源上较同一物种的天然生物体更快地生长或增殖。

本说明书通过下列实施例进一步说明，在任何情况下这些实施例都不应被理解为限制性的。所有引用的参考文献（包括如在整个本申请中所引用的文献参考、授权专利、公布的专利申请和GenBank登录号）的内容均明确地以引用方式并入本文。当以引用方式并入本文的资料中术语的定义与本文所用的那些冲突时，以本文所用的定义为准。

实施例

实施例1：在解脂耶氏酵母中过表达DGA1的方法

用于过表达DGA1基因的核酸构建体在USSN 61/943,664中有述(在此通过引用并入)。图1示出了用于在解脂耶氏酵母中过表达圆红冬孢酵母DGA1基因NG66(SEQ ID No.6)的表达构建体pNC243。在转化前，通过PacI/NotI限制性内切酶消化使DGA1表达构建体线性化。所述线性表达构建体各自包含DGA1基因和Nat1基因的表达盒，用作诺尔丝菌素(NAT)选择的标志物。

使用如Chen(Applied Microbiology & Biotechnology 48:232-35 (1997))中所述的转化方案将DGA1表达构建体随机整合到解脂耶氏酵母菌株NS18(得自ARS培养物保藏中心, NRRL# YB 392)的基因组中。在含有500 µg/mL NAT的YPD平板上选择转化体，并通过如下所述的荧光染色脂质测定法筛选积聚脂质的能力。对于每种表达构建体，分析了八个转化体。

对于大多数构建体，转化体之间存在显著的菌落变异，这可能是由于仅具有功能性Nat1盒的细胞中缺少功能性DGA1表达盒，或由于DGA1整合位点对DGA1表达的负面影响。然而，所有的转化体均具有显著提高的脂质含量。

在强力启动子下过表达天然解脂耶氏酵母DGA1(NG15)，相比亲代菌株NS18，将脂质含量提高了约2倍（如通过细胞荧光测得的）。通过过表达圆红冬孢酵母DGA1(NG66、NG67)和斯达氏油脂酵母DGA1(NG68)生成显示出最高荧光的转化体（相比NS18高出约3倍）。

在某些实验中，天然圆红冬孢酵母DGA1(NG49)的过表达对解脂耶氏酵母中脂质产量的影响不如合成版的不含有内含子的圆红冬孢酵母DGA1基因的影响那么高。此结果可能表明，解脂耶氏酵母中圆红冬孢酵母DGA1基因的基因剪接不是很有效。在某些实验中，针对在解脂耶氏酵母中表达圆红冬孢酵母DGA1基因的密码子优化对脂质产量没有积极效果。

为了选择具有最高脂质产量水平的菌株，对表达NG15(解脂耶氏酵母DGA1)或NG66(圆红冬孢酵母DGA1)的解脂耶氏酵母菌株NS18转化体进行了筛选。对于NG15，通过脂质测定法就最高脂质积聚筛选了约50个菌落，并将最佳转化体命名为NS249。对于NG66，筛选了80个菌落，并选择了8个最佳菌落用于进一步分析。在摇瓶中生长菌株NS249以及选定的8个NG66转化体，并通过脂质测定法分析脂质含量，以及通过HPLC分析葡萄糖消耗。过表达圆红冬孢酵母DGA1的解脂耶氏酵母菌株具有明显高于具有在与圆红冬孢酵母DGA1相同的启动子下表达的天然解脂耶氏酵母DGA1基因的解脂耶氏酵母菌株的脂质含量。同时，NG66转化体具有明显更少的葡萄糖残留在培养基中，表明NG66能更有效地将葡萄糖转化成脂质。两种DGA1基因之间效率的差异可能归因于解脂耶氏酵母中圆红冬孢酵母DGA1更高水平的表达，或更高水平的圆红冬孢酵母DGA1特异活性，或二者皆有。将表现最好的具有整合的NG66基因的转化体之一命名为NS281。

实施例2：在解脂耶氏酵母中敲除三酰甘油脂酶敲除基因的方法

为了测试将DGA1过表达与TGL3缺失结合而导致解脂耶氏酵母中更高的脂质积聚的想法，在解脂耶氏酵母野生型菌株NS18(得自NRLL# YB-392)及其过表达DGA1的衍生型NS281中缺失了TGL3。NS281过表达如上所述来自圆红冬孢酵母的DGA1基因。如下，缺失解脂耶氏酵母TGL3基因(YALI0D17534g, SEQ ID NO: 20)：通过PCR从含有潮霉素抗性基因(“hph,”SEQ ID NO:22)的质粒扩增两片段式缺失盒，使用引物对NP1798-NP656和NP655-NP1799(SEQ ID NO: 23-26)。根据USSN 61/819,746中开发的方案(通过引用并入本文)，将所得PCR片段(SEQ ID NO: 27 & 28)共转化到NS18和NS281中。在hph盒中省略启动子和终止子以及将hph编码序列分为两个PCR片段减少了这些片断的随机整合将赋予潮霉素抗性的可能性。只有当hph基因通过同源重组整合在TGL3基因座时，才应当表达该基因，使得TGL3启动子和终止子可以指导其转录。通过PCR筛选潮霉素抗性菌落以确认不存在TGL3并且存在tgl3::hyg特定产物。在NS18中缺失TGL3得到菌株NS421。在NS281中缺失TGL3得到菌株NS377。

实施例3：过表达DGA1的TGL3敲除相比仅TGL3敲除积聚更多的脂质

使含有TGL3敲除的NS421和含有TGL3缺失并同时过表达圆红冬孢酵母DGA1的NS377在24孔平板中于有限氮条件下生长，以促进脂质积聚。

具体地讲，在经过高压蒸汽消毒的24孔平板的每个孔中装入1.5 mL的含有0.5 g/L 尿素、1.5 g/L 酵母提取物、0.85 g/L 酪蛋白氨基酸、1.7 g/L YNB(不含氨基酸和硫酸铵)、100 g/L 葡萄糖 和 5.11 g/L 邻苯二甲酸氢钾(25mM)的过滤灭菌的培养基。使用已经在YPD琼脂平板上于30℃温育1-2天的酵母菌株给每个孔接种。用多孔盖覆盖该24孔平板，并在30℃、70-90% 湿度以及900 rpm下于Infors Multitron ATR摇床上温育。96小时后，在分析型微孔板上向20 μL的细胞中加入20 μL 100%的乙醇，并在4℃温育30分钟。然后，在Costar 96孔、黑色、底部透明的平板中，将20 μL的细胞/乙醇混合物加入到80 μl的含有50 μL 1 M 碘化钾、1 mM μL Bodipy 493/503、0.5 μL 100% DMSO、1.5 μL 60% PEG4000 和 27 μL 水的预混合溶液中，并用透明封条覆盖。用SpectraMax M2分光光度计(Molecular Devices)动力学测定法在30℃监测Bodipy荧光，并通过用荧光除以600 nm处的吸光度进行标准化。将一式三份生长实验数据取平均值。

NS377积聚了大约两倍于NS421的脂质量，这表明TGL3缺失与DGA1过表达的组合相对于仅TGL3缺失，提高了细胞的脂质含量(图2)。

实施例4：过表达DGA1并含有TGL3缺失的细胞较过表达DGA1但没有TGL3修饰的细 胞积聚更多的TAG

使用高细胞密度补料分批葡萄糖工艺在1升的生物反应器中生长过表达圆红冬孢酵母DGA1的NS281和含有TGL3缺失并同时过表达圆红冬孢酵母DGA1的NS377。118小时后，通过气相色谱法分析细胞以测量脂质含量（以干细胞重量的百分比的形式）。将同一样品的一式三份色谱法测量结果取平均值。NS377的脂质含量较NS281高出大约4%，这表明TGL3缺失与DGA1过表达的组合得到优于仅DGA1过表达的结果(图3)。

实施例5：包含编码二酰基甘油酰基转移酶并降低三酰甘油脂酶的活性的基因修 饰的细胞积聚更多的TAG

为了测试将DGA1和DGA2过表达与TGL3缺失结合而导致解脂耶氏酵母中更高的脂质积聚的想法，在菌株NS377中过表达来自麦角菌的DGA2。如实施例4中所述，菌株NS377含有TGL3缺失并过表达来自圆红冬孢酵母的DGA1。基于先前的实验选择了来自麦角菌的DGA2，所述实验证实此基因与来自圆红冬孢酵母的DGA1的组合提高解脂耶氏酵母的脂质含量(USSN 62/004,502, 通过引用并入)。

图4示出了pNC327的图谱，该表达构建体用于在NS377中过表达麦角菌DGA2。在转化前，用PacI/AscI限制性内切酶消化使所述构建体线性化。所述线性表达构建体包含麦角菌DGA2基因和BLE基因的表达盒，用作博莱霉素(ZEO)选择的标志物。通过荧光脂质测定法分析转化体，并将最佳脂质生产者定名为NS432。

比较了菌株NS297、NS281、NS450、NS377和NS432的脂质产量。使用分批葡萄糖工艺(在48孔平板或50-mL烧瓶中)或使用高细胞密度补料分批葡萄糖工艺(在1-L生物反应器中)生长 这些菌株的子集。通过荧光测定法或气相色谱法分析脂质含量，并发现菌株NS432相比其亲代菌株NS377和不含TGL3敲除的菌株具有更高的脂质含量(图5)。这些结果证实了在TGL3敲除中过表达DGA1和DGA2的优点。

通过引用的并入

本文引用的所有美国专利、美国专利申请公布、外国专利、外国专利公布以及非专利文献均以引用方式并入本文。

等同形式

本领域技术人员在不使用超过常规实验的情况下将认识到或将能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同形式。此类等同形式旨在为以下权利要求书所涵盖。

Claims (20)

1. 经转化的产油细胞，其包含：

第一基因修饰，其中所述第一基因修饰提高天然二酰基甘油酰基转移酶的活性或编码二酰基甘油酰基转移酶基因的至少一个拷贝，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是所述产油细胞原生的或来自不同物种；和

第二基因修饰，其中所述第二基因修饰降低所述产油细胞中三酰甘油脂酶的活性。

2.权利要求1的经转化的产油细胞，其中所述第二基因修饰是三酰甘油脂酶敲除突变。

3.权利要求1或2的经转化的产油细胞，其中所述三酰甘油脂酶是TGL3、TGL3/4或TGL4。

4.权利要求1-3中任一项的经转化的产油细胞，其中所述第一基因修饰编码二酰基甘油酰基转移酶基因的至少一个拷贝，所述二酰基甘油酰基转移酶基因是所述产油细胞原生的或来自不同物种。

5.权利要求4的经转化的产油细胞，其中所述二酰基甘油酰基转移酶基因是I型二酰基甘油酰基转移酶基因、II型二酰基甘油酰基转移酶基因或III型二酰基甘油酰基转移酶基因。

6. 权利要求5的经转化的产油细胞，其中所述二酰基甘油酰基转移酶基因是来自以下的I型二酰基甘油酰基转移酶基因：Arxula adeninivorans、土曲霉、球毛壳菌、麦角菌、斯达氏油脂酵母、蝗绿僵菌、冬虫夏草菌、三角褐指藻、季也蒙毕赤酵母、圆红冬孢酵母、禾本红酵母、绿木霉或解脂耶氏酵母。

7. 权利要求5的经转化的产油细胞，其中所述二酰基甘油酰基转移酶基因是来自以下的II型二酰基甘油酰基转移酶基因：Arxula adeninivorans、土曲霉、裂殖壶菌、麦角菌、密粘褶菌、斯达氏油脂酵母、花药黑粉菌、季也蒙毕赤酵母、三角褐指藻、禾柄锈菌、倒卵形红冬孢酵母、圆红冬孢酵母。

8.权利要求5的经转化的产油细胞，其中所述二酰基甘油酰基转移酶基因是来自以下的III型二酰基甘油酰基转移酶基因：蓖麻或花生。

9.权利要求5-8中任一项的经转化的产油细胞，其中二酰基甘油酰基转移酶基因的所述至少一个拷贝被整合到所述细胞的基因组中。

10.权利要求1-9中任一项的经转化的产油细胞，其中所述细胞选自藻类、细菌、霉菌、真菌、植物和酵母。

11.权利要求10的经转化的产油细胞，其中所述细胞选自：Arxula、曲霉菌属、裂殖壶菌属、假丝酵母属、麦角菌属、隐球菌属、小克银汉霉属、地霉属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、Kodamaea、Leucosporidiella、油脂酵母属、被孢霉属、Ogataea、毕赤酵母属、原囊藻属、根霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、银耳属、丝孢酵母属、Wickerhamomyces以及耶氏酵母属。

12. 权利要求11的经转化的产油细胞，其中所述细胞选自：Arxula adeninivorans、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、裂殖壶菌、产朊假丝酵母、麦角菌、白色隐球菌、弯曲隐球菌、Cryptococcus ramirezgomezianus、土隐球菌、Cryptococcus wieringae、刺孢小克银汉霉、山茶小克银汉霉、发酵地霉、多形汉森酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、奥默柯达菌、Leucosporidiella creatinivora、产油油脂酵母、斯达氏油脂酵母、子囊菌油脂酵母、深黄被孢霉、高山被孢霉、Ogataea polymorpha、Pichia ciferrii、季也蒙毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、树干毕赤酵母、左氏原壁菌、少根根霉、Rhodosporidium babjevae、圆红冬孢酵母菌、海洋红冬孢酵母、粘红酵母、胶红酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、Tremella enchepala、皮状丝孢酵母、发酵性丝孢酵母、Wickerhamomyces ciferrii和解脂耶氏酵母。

13. 权利要求12的经转化的产油细胞，其中所述细胞是解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans。

14.提高细胞的脂质含量的方法，其包括用第一核酸和第二核酸转化亲代细胞；其中所述第一核酸提高天然二酰基甘油酰基转移酶的活性或包含二酰基甘油酰基转移酶基因；而所述第二核酸降低三酰甘油脂酶的活性。

15.权利要求14的方法，其中所述第一核酸包含二酰基甘油酰基转移酶基因。

16.权利要求15的方法，其中所述二酰基甘油酰基转移酶基因编码I型二酰基甘油酰基转移酶多肽、II型二酰基甘油酰基转移酶多肽或III型二酰基甘油酰基转移酶多肽。

17. 权利要求15的方法，其中所述二酰基甘油酰基转移酶基因编码选自以下的氨基酸序列：

(a) 以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ IDNO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ IDNO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ IDNO: 39、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 85，或其中任一项的生物活性部分；和

(b) 与以下中所示的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ IDNO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ IDNO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ IDNO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 85，或其中任一项的生物活性部分。

18.权利要求14-17中任一项的方法，其中所述第二核酸能够与三酰甘油脂酶基因中的核酸序列和/或三酰甘油脂酶基因的调控区中的核酸序列重组。

19.权利要求14-17中任一项的方法，其中所述第二核酸能够与TGL3、TGL3/4或TGL4基因中的核酸序列和/或TGL3、TGL3/4或TGL4基因的调控区中的核酸序列重组。

20. 权利要求14-19中任一项的方法，其中所述细胞是解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans。