CN116622675A - 一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及其应用，所述突变体命名为P46N‑pRML，是将米黑根毛霉脂肪酶前导肽中第46位氨基酸从脯氨酸突变成天冬酰胺，突变体P46N‑pRML的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的米黑根毛霉脂肪酶突变体，具有较高的酶活性。本发明通过构建恰当的表达载体，使米黑根毛霉脂肪酶突变体基因在巴斯德毕赤酵母X‑33中分泌表达，表达的单双酰脂肪酶大部分分泌到细胞外，降低了分离纯化成本，而且表达效率较高，最适反应温度和pH耐受性分别提升到45～50℃和pH 5～11，酶的比活也提高到1.9倍。本发明为米黑根毛霉脂肪酶的工业化应用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及其应用。
背景技术
酶是一种绿色生物催化剂，在催化反应过程中具有反应条件温和、副产物少、环境友好性等特点，因而受到越来越多的关注并逐渐替代繁琐、昂贵的化学法。
脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3)因为其可以催化水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应等多种化学反应，在食品、医药、生物能源、化妆品等行业中具体广泛应用，被称为第三大工业用酶。
米黑根毛霉脂肪酶(RML)是一种1,3-位置专一性的脂肪酶，作用于三酰甘油的1位和3位酯键，在工业上也有十分广泛的应用。在医药行业，由于RML对底物具有高度的选择性，反应的副产物少、操作简单，一般用于手性药物的不同对应异构体之间的拆分，但克服传统方法制备手性药物存在分离难度大、成本高等缺点。在食品行业，RML可以制备食品乳化剂二酰基甘油(DAG)，催化丁醇和丁酸合成食用香精丁酸丁酯，通过对原料中的脂肪酸的分解，转化成具有特殊香气的物质，增加产品风味。在生物能源行业，RML能够催化废弃油脂、动物油脂、大豆油及微藻油为底物制备生物柴油。目前有越来越多的微生物来源的脂肪酶被开发出来，因为其性质的不同而在不同领域中发挥着重大的作用。
现有技术虽然已经证明RML具有特异性，并已尝试应用到食品乳化剂和生物柴油的制备中，但由于RML产量不高，导致该酶成本过高，限制了其工业化应用。因此提高酶的比活，筛选高效分泌表达体系，提高酶活水平，是亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及其应用，与野生型RML相比，该突变体的酶比活、最适反应温度、pH耐受范围和胞外酶活产量均得到提高。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种米黑根毛霉脂肪酶突变体，所述突变体命名为P46N-pRML，是将米黑根毛霉脂肪酶前导肽中第46位氨基酸从脯氨酸突变成天冬酰胺，突变体P46N-pRML的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
编码上述米黑根毛霉脂肪酶突变体的基因，所述基因命名为p46n-prml，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
表达上述米黑根毛霉脂肪酶突变体的基因工程菌。
上述基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
将米黑根毛霉脂肪酶突变体的编码基因p46n-prml插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICMαA上，构建得到在巴斯德毕赤酵母中的表达载体pPICMα-p46n-prml；再将所述表达载体pPICMα-p46n-prml导入到巴斯德毕赤酵母X-33中，即得；
所述表达载体pPICMαA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
优选地，所述米黑根毛霉脂肪酶突变体的编码基因p46n-prml插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICMαA上的目的基因拷贝数为1-5。
一种米黑根毛霉脂肪酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)培养上述的基因工程菌，培养条件为：温度28℃，初始pH为7，180rpm摇床培养16～18h；
步骤2)经诱导表达获得米黑根毛霉脂肪酶突变体P46N-pRML，诱导条件为：每24h补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0％，摇瓶培养。
优选地，步骤2)所述摇瓶培养的时间为120～170h；所述米黑根毛霉脂肪酶突变体P46N-pRML的最适反应温度为45～50℃，最适反应pH为6～7。
本发明的有益效果如下：
本发明的米黑根毛霉脂肪酶突变体，具有较高的酶活性。本发明通过构建恰当的表达载体，使米黑根毛霉脂肪酶突变体基因在巴斯德毕赤酵母X-33中分泌表达，表达的脂肪酶大部分分泌到细胞外，降低了分离纯化成本，而且表达效率较高，在摇瓶培养的条件下，以甲醇诱导培养时，分泌到胞外的酶量可达270mg/L，以橄榄油为底物，酶活可达1450U/mL，酶比活提高1.91倍。同时进一步研究发现，含4个拷贝的突变体基因(p46n-prml)的巴斯德毕赤酵母菌株对细胞生长影响不大，以橄榄油为底物，酶活能达到3150U/mL，胞外分泌量能达到591mg/L。本发明为该酶的工业化应用奠定了基础。
附图说明
图1为实施例2中突变体基因p46n-prml和野生型pro-rml核苷酸序列比对；
图2为实施例2中突变体P46N-pRML和野生型PRO-RML氨基酸序列比对；
图3为实施例2中pPICMα-p46n-prml的质粒图谱；
图4为实施例3中pPICMα-p46n-prml电转化到巴斯德毕赤酵母X-33，在YPDS培养基上经Zeocin抗性筛选的图；
图5为实施例3中PCR筛选鉴定阳性转化子的琼脂糖凝胶电泳图；
图6为实施例3中摇瓶培养的野生型和突变体菌株的细胞密度、胞外酶活、酶活分泌效率及比活检测图：A为细胞生长曲线，B为胞外酶活曲线，C为酶活分泌效率，D为比活；
图7为实施例4中比较野生型、1拷贝突变体菌株和4拷贝突变体菌株的细胞生长及胞外酶活：A为细胞生长曲线，B为胞外酶活曲线。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步详细说明。
以下实施例所用实验试剂如无特别说明，均通过商业途径购买。
巴斯德毕赤酵母X-33购自赛默飞世尔科技(ThermoFisher)，货号为C18000。
pPICZαA购自赛默飞世尔科技(ThermoFisher)，货号为V19520。
实施例1
一种米黑根毛霉脂肪酶突变体，为便于表述，将该突变体命名为P46N-pRML。突变体P46N-pRML是将米黑根毛霉脂肪酶前导肽中第46位氨基酸从脯氨酸(Pro，P)突变成天冬酰胺(Asn，N)，密码子从CCC突变为AAC，得到米黑根毛霉脂肪酶突变体基因p46n-prml，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因全长为1017bp。分析表明，突变体基因p46n-prml中GC含量为48.7％，编码339个氨基酸组成的蛋白，由基因p46n-prml编码的突变体P46N-pRML的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。突变体P46N-pRML蛋白大小理论值为36.8KDa，等电点预测为4.89(http://web.expasy.org/compute_pi/)，活性中心是214位Ser，257位His，273位Asp。
实施例2
将突变体基因p46n-prml与表达载体可操作地连接，得到能够表达突变体P46N-pRML蛋白的重组表达载体，进一步将该重组表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达突变体P46N-pRML的基因工程菌。具体步骤如下：
(1)巴斯德毕赤酵母表达载体pPICMαA的构建
pPICMαA载体是由pPICZαA演变来的。是将pPICZαA中来源于酿酒酵母的信号肽序列根据毕赤酵母密码子的偏爱性进行优化后获得的，具体的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
(2)把突变体基因p46n-prml委托通用生物(安徽)股份有限公司进行基因合成，再将基因片段插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICMαA(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)上的EcoRⅠ和XbαⅠ位点之间，转化到大肠杆菌DH5α，经Zeocin抗性筛选，EcoRⅠ和XbαⅠ双酶切验证以及测序分析，获得在巴斯德毕赤酵母中的表达载体pPICMα-p46n-prml。
基因p46n-prml的核苷酸序列与野生型(pro-rml，NCBI上注释的序列号为A02536.1，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示)比对图如图1所示。
突变体P46N-pRML的氨基酸序列与野生型(PRO-RML，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示)比对图如图2所示。
表达载体pPICMα-p46n-prml的质粒图谱如图3所示。
(3)再将表达载体pPICMα-p46n-prml电转至巴斯德毕赤酵母X-33中，获得表达突变体P46N-pRML的基因工程菌P46N-pRML-X33。
(4)实验结果
以橄榄油为底物，通过NaOH滴定法测突变体P46N-pRML与野生型PRO-RML的酶学性质，包括最适反应温度、最适反应pH、温度耐受性、pH耐受性以及酶比活，比较结果如下表1所示。
表1野生型与突变体的酶学性质比较
由表1可知，米黑根毛霉脂肪酶突变体P46N-pRML的最适反应温度为45～50℃，最适反应pH为6～7，温度耐受性35～45℃，pH耐受性为5～11，酶比活为5323.6U/mg，与野生型PRO-RML相比，突变体P46N-pRML的酶比活、最适反应温度和pH耐受范围均得到提高。
实施例3
本实施例提供一种制备实施例1的米黑根毛霉脂肪酶突变体P46N-pRML的方法，其是通过培养实施例2的基因工程菌P46N-pRML-X33，经诱导表达获得突变体P46N-pRML。具体步骤如下：
(1)培养实施例2的基因工程菌P46N-pRML-X33
将巴斯德毕赤酵母重组菌株P46N-pRML-X33在相应抗性的YPD平板上划线长出单菌落，挑单菌落于10mL的BMGY培养基中，摇床28℃，180rpm培养16～18h，待OD600生长4-6时作为发酵种子液；取3mL上述种子液接种于50mL BMMY(pH为7)培养基中，加入终浓度为1.34％的YNB(酵母氮源)和终浓度为1％的甲醇，摇床28℃，180rpm培养，获得发酵液。
(2)经诱导表达获得米黑根毛霉脂肪酶突变体P46N-pRML
诱导条件为：每24h取500μL发酵液，用于检测菌株生长情况(OD600)、胞外酶活，再加入终浓度为1％(v/v)的甲醇继续诱导培养；发酵过程待菌株胞外酶活停止增加时结束，发酵结束后9000rpm离心2min，弃菌体，收集发酵液上清4℃保存。培养时间为120～170h。
(3)设置对照组
以1拷贝的野生型PRO-RML的生产菌株1pRML-X33为对照组。
以1拷贝的突变体P46N-pRML的工程菌株P46N-1pRML-X33为实验组。
两者同时发酵，比较细胞生长、胞外酶活、酶活分泌效率及酶比活，以观察突变体P46N-pRML对酶产量的影响。
(4)实验结果
按照产商提供的说明书中的方法制备巴斯德毕赤酵母X-33的感受态细胞，向感受态细胞加入8～10μL线性化质粒溶液(约7μg线性化质粒)，用枪头轻混后转移至2mm内径的电转杯(-20℃预冷)；将bio-rad Micro Pulser电转仪的程序模式设置为“Sc2”，电击一次，立即加入1mL冰预冷的1M山梨醇，吹吸混匀并转移至1.5mL无菌的EP管中，30℃水浴复苏3h；取上述转化液80μL，涂布于含有Zeocin的YPDS固体培养基平板上；将平板在28℃条件下倒置培养3～4天，待其生长出转化子，然后提取转化子基因组DNA，进行PCR验证筛选获得阳性重组菌株。
电转化后的Zeocin筛选图如图4所示，经电转化后，在Zeocin抗性的YPDS平板上可以长出转化子。
PCR筛选鉴定阳性转化子的琼脂糖凝胶电泳图如图5所示，用引物P1、P2扩增后，扩增条带理论大小为180bp，即可认定为阳性突变菌株，图5中6号为用质粒作的正对照，电泳结果显示1-5号菌株均为阳性突变菌株。
P1(SEQ ID No.6)：AGCATTGATGGTGGTATCCGC；
P2(SEQ ID No.7)：ATAGATGAGCGTGCTCCAAGT。
将1pRML-X33对照组和P46N-1pRML-X33实验组均按照本实施例步骤(1)和(2)的方法培养并诱导表达，比较两菌株的细胞生长、胞外酶活、酶活分泌效率及比活，结果如图6所示。
由图6可知，与野生型菌株相比，突变体菌株的细胞生长没有受到影响(图6中A)，但是胞外酶活显著提升到1450U/mL(图6中B)，酶活分泌效率从36.6U/OD600提高到56.15U/OD600(图6中C)，酶比活从2782.9U/mg提升到5323.6U/mg(图6中D)。
实施例4
本实施例利用实施例2的基因工程菌，筛选获得一株含4个拷贝的基因p46n-prml的巴斯德毕赤酵母重组子P46N-4pRML-X33，培养并诱导其表达突变体P46N-pRML，培养和诱导条件与实施例3中的P46N-1pRML-X33一致。具体步骤如下：
(1)突变菌株拷贝数的确定
参考酵母基因组提取试剂盒(天根生物，货号DP307-2)提取重组酵母菌株的基因组DNA。检测酵母基因组DNA的浓度，并计算模板量，以只含1个rml拷贝的酵母基因组作为模板，并梯度稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，q-PCR检测不同浓度酵母基因组中目的基因rml和内参基因gap的Ct值，建立rml和gap基因模板量的log值与Ct值的标准曲线。将多拷贝重组菌株的rml和gap的Ct值分别带入上述标准曲线，得到目的基因和内参基因的模板量，按下列公式计算拷贝数：
结果如下表2所示：
表2突变菌株的拷贝数及野生型对比
| 菌株 | Ct(rml) | Ct(gap) | 拷贝数 |
| 1pRML-X33 | 20.33±0.11 | 20.64±0.08 | 1.06±0.04 |
| P46N-4pRML-X33 | 12.27±0.07 | 14.26±0.26 | 3.94±0.06 |
| P46N-1pRML-X33 | 18.66±0.32 | 18.14±0.15 | 0.79±0.06 |
由表2可知，经荧光定量PCR后确定两株拷贝数分别为1和4的P46N-pRML菌株，分别命名为P46N-1pRML-X33和P46N-4pRML-X33。
(2)实验结果
摇瓶发酵pRML-X33、P46N-1pRML-X33和P46N-4pRML-X33，摇瓶发酵条件同实施例3步骤(1)和(2)，比较三者细胞生长和产酶情况，如图7所示。
由图7中A可知，三个菌株的OD600值均在22.5-25.8之间，差别不大。
由图7中B可知，1拷贝野生型菌株pRML-X33胞外酶活为825U/mL；P46N-1pRML-X33的胞外酶活为1450U/mL，是1拷贝野生型菌株的1.75倍；P46N-4pRML-X33的胞外酶活为3150U/mL，是P46N-1pRML-X33的2.2倍，达到了pRML-X33菌株3.8倍。
以上所述仅为本发明的示例性实施例，并非因此限制本发明专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种米黑根毛霉脂肪酶突变体，其特征在于，所述突变体命名为P46N-pRML，是将米黑根毛霉脂肪酶前导肽中第46位氨基酸从脯氨酸突变成天冬酰胺，突变体P46N-pRML的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.编码权利要求1所述米黑根毛霉脂肪酶突变体的基因，其特征在于，所述基因命名为p46n-prml，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.表达权利要求1所述米黑根毛霉脂肪酶突变体的基因工程菌。
4.权利要求3所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将米黑根毛霉脂肪酶突变体的编码基因p46n-prml插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICMαA上，构建得到在巴斯德毕赤酵母中的表达载体pPICMα-p46n-prml；再将所述表达载体pPICMα-p46n-prml导入到巴斯德毕赤酵母X-33中，即得；所述表达载体pPICMαA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述米黑根毛霉脂肪酶突变体的编码基因p46n-prml插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPICMαA上的目的基因拷贝数为1-5。
6.权利要求1所述的一种米黑根毛霉脂肪酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)培养如权利要求3所述的基因工程菌，培养条件为：温度28℃，初始pH为7，180rpm摇床培养16～18h；
步骤2)经诱导表达获得米黑根毛霉脂肪酶突变体P46N-pRML，诱导条件为：每24h补充一次诱导物甲醇，至甲醇终浓度为1.0％，摇瓶培养。
7.根据权利要求6所述的一种米黑根毛霉脂肪酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤2)所述摇瓶培养的时间为120～170h；所述米黑根毛霉脂肪酶突变体P46N-pRML的最适反应温度为45～50℃，最适反应pH为6～7。
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