RU2676321C1 - Способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с применением рекомбинантного штамма-продуцента Pichia pastoris X-33/ pPICZαA-PhoA2-StV - Google Patents
Способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с применением рекомбинантного штамма-продуцента Pichia pastoris X-33/ pPICZαA-PhoA2-StV Download PDFInfo
- Publication number
- RU2676321C1 RU2676321C1 RU2018108650A RU2018108650A RU2676321C1 RU 2676321 C1 RU2676321 C1 RU 2676321C1 RU 2018108650 A RU2018108650 A RU 2018108650A RU 2018108650 A RU2018108650 A RU 2018108650A RU 2676321 C1 RU2676321 C1 RU 2676321C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phospholipase
- phoa2
- stv
- enzyme preparation
- pichia pastoris
- Prior art date
Links
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 title claims abstract description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 title claims abstract description 8
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 6
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 title claims description 6
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 23
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 claims abstract 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 21
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000006447 Phospholipases A2 Human genes 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 241000187176 Streptomyces violaceoruber Species 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 3
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 3
- 150000002327 glycerophospholipids Chemical group 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 2
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 2
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 2
- IGTHEWGRXUAFKF-NVJADKKVSA-N 1-cyclopropyl-8-(difluoromethoxy)-7-[(1r)-1-methyl-2,3-dihydro-1h-isoindol-5-yl]-4-oxoquinoline-3-carboxylic acid;methanesulfonic acid;hydrate Chemical compound O.CS(O)(=O)=O.N([C@@H](C1=CC=2)C)CC1=CC=2C(C=1OC(F)F)=CC=C(C(C(C(O)=O)=C2)=O)C=1N2C1CC1 IGTHEWGRXUAFKF-NVJADKKVSA-N 0.000 description 1
- 241001626676 Aspergillus nishimurae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102220483782 Myb/SANT-like DNA-binding domain-containing protein 1_A21D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 102000005473 Secretory Phospholipases A2 Human genes 0.000 description 1
- 108010031873 Secretory Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 230000009603 aerobic growth Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000013379 physicochemical characterization Methods 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 239000007221 ypg medium Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/165—Yeast isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01004—Phospholipase A2 (3.1.1.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/84—Pichia
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена плазмида pPICZαA-PhoA2-StV, определяющая синтез фосфолипазы А2, имеющая размер 3862 п. н. и содержащая ген фосфолипазы PhoA2-StV. Предложен штамм дрожжей Pichia pastoris Х-33, трансформированный указанной плазмидой. Предложен способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с использованием указанного штамма. Группа изобретений позволяет расширить арсенал средств для получения фосфолипазы А2 и ферментных препаратов на ее основе. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области промышленной биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности при получении лизофосфолипидов и поверхностно-активных веществ с эмульгирующими свойствами.
Фосфолипаза А2 - фермент, катализирующий гидролиз сложноэфирной связи во втором положении глицерофосфолипидов [Головач О.А., Таганович А.Д. Роль фосфолипаз А2 в патологии легких // Медицинский журнал. - 2005. - №1. - с. 1-6]. При действии фосфолипазы А2 на фосфолипид образуется 2-лизофосфолипид и жирная кислота. Стерическая и позиционная специфичность фосфолипазы А2 обусловливает ее высокую ценность в биохимии липидов и химии. Фермент используют для установления позиционного распределения жирных кислот при анализе фосфоглицеридов, для разделения рацемических смесей липидов, а также в синтезе липидов для получения фосфоглицеридов со смешанным составом жирных кислот. Таким образом, ферментный препарат фосфолипаза А2 может использоваться в пищевой промышленности в качестве вспомогательного средства для образования лизофосфолипидов и поверхностно-активных веществ с эмульгирующими свойствами [Довжикова И.В. Гистохимическое исследование фосфолипидов в плаценте беременных при герпесе // Бюллетень физиологии и патологии дыхания: Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания (Благовещенск). - 2003. - №15. - с. 19-23; Брагина Н.А., Чупин В.В., Булгаков В.Г., Шальнев А.Н. Липидные ингибиторы фосфолипазы А2 // Биоорганическая химия. - 1999. - том 25. - №2. - с. 83-96; Murakami М, Kudo I. Phospholipase А2 // J Biochem. - 2002. - Mar. - 131(3):285. - c. 92].
Известен способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с помощью генномодифицированного плесневого гриба Aspergillus niger PLA-54 (США) с геном, кодирующим фосфолипазу свиной поджелудочной железы из Aspergillus niger GAM-53, и кДНК поджелудочной железы свиньи Aspergillus niger PLA-54 с геном, продуцирующим фосфолипазу А2 из Aspergillus niger GAM-53 (NRRL3122 Aspergillus niger) [GRAS notification of phospholipase A2 from a genetically modified strain of Aspergillus niger // DSM. - 28.10.2005].
Известно также, что ферментный препарат фосфолипазы А2 можно получать с помощью штамма Trichoderma reesei RF8793 (Германия), являющегося носителем гена, кодирующего фосфолипазу А2 плесневого грибка Aspergillus nishimurae [A Lipase Enzyme Preparation Derived from Streptomyces viotaceoruber // Genencor International Inc. - 09.02.2004].
Также в США выпускают ферментный препарат фосфолипазы А2, полученный с помощью Streptomyces violaceoruber JAS-591 [A phospholipase А2 preparation produced by Streptomyces violaceoruber expressing the gene encoding phospholipase A2 from Streptomyces violaceoruber // Nagase ChemteX Corporation. - 17.08.2006].
В Японии выпускают ферментный препарат фосфолипазы А2 Streptomyces violaceoruber, полученный с применением рекомбинантного штамма-продуцента Streptomyces violaceoruber AS-10 [GRAS notification for phospholipase A2 from a genetically modified strain of Tricho-derma reesei // AB ENZYMES GmbH. - 12.10.2013].
Основным недостатком данных способов является продолжительное время культивирования штамма (более 7 суток) и использование трудоемких способов очистки ферментного препарата, таких как хроматография и высаливание, требующих внесения дополнительных дорогостоящих реагентов и дополнительной аппаратуры.
Все вышеизложенное свидетельствует о перспективности создания штаммов-продуцентов фосфолипазы А2 на основе других микроорганизмов, в частности дрожжей. Среди всех, отличных от Saccharomyces, дрожжей наиболее применяемой гетерологичной системой для производства коммерчески релевантных рекомбинантных белков являются Pichia pastoris. В сравнении с S. cerevisiae, они достигают более высоких уровней экспрессии, а гипергликозилирование у них не столь высоко. Тем не менее, наиважнейшей особенностью Pichia pastoris является то, что они могут использовать метанол в качестве единственного источника углерода и энергии. Таким образом, переключение с глюкозной среды на метанольную индуцирует высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка в этом хосте. В Pichia pastoris рекомбинантные белки могут экспрессироваться внутриклеточно, секретируясь в среду или прикрепляясь к клеточной поверхности. Поскольку метилотрофные дрожжи слабо секретируют собственные белки, секреция рекомбинантных белков в межклеточную среду предпочитается внутриклеточной продукции, поскольку представляет собой первый этап очистки рекомбинантного белка.
Известен патент RU 2409671 (МПК C12N 15/00, опубл. 20.01.2011), относящийся к рекомбинантной плазмиде pP10PLC-Bc для экспрессии гена фосфолипазы С PLC-Bc в дрожжах Pichia pastoris и штамму дрожжей Pichia pastoris PLC-Bc-1 ВКПМ Y-3359 - продуценту фосфолипазы С PLC-Bc. Отечественных аналогов на рынке ферментных препаратов фосфолипазы А2 не представлено.
Изобретение по патенту CN 104328095 (МПК A21D 8/04; С11В 3/00; C12N 1/19; C12N 15/55; C12N 15/81; C12N 9/16, опубл. 2015-02-04) относится к созданию ферментного препарата фосфолипазы А2 с наиболее приемлемым рН. Согласно ему, оптимизированную последовательность гена фосфолипазы А2, полученной из S.violaceoruber, клонируют в плазмиду pPIC9K, а затем рекомбинантная плазмида встраивается в хромосому Pichia pastoris.
Дрожжи Pichia pastoris имеют статус безопасных для человека согласно реестру Федерального управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (GRAS), что позволяет их использовать в качестве продуцентов рекомбинантных ферментов, пригодных для применения в пищевой промышленности.
Задача изобретения - конструирование рекомбинантного штамма Pichia pastoris и плазмиды, кодирующей синтез рекомбинантного белка PhoA2-StV, для получения ферментного препарата фосфолипазы А2 в лабораторных условиях.
Технический результат заключается в расширении арсенала способов получения ферментных препаратов фосфолипазы А2, разработке способа получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с содержанием целевого белка не менее 2 мг/мл.
Технический результат достигается созданием генетической конструкции в виде рекомбинантного вектора pPICZαA-PhoA2-StV и штамма Pichia pastoris Х-33/ pPICZαA-PhoA2-StV, обеспечивающих индуцируемый синтез с высоким и стабильным выходом рекомбинантной фосфолипазы А2 в культуральную среду. Способ получения рекомбинантной фосфолипазы А2 PhoA2-StV, заключается в культивировании указанного штамма-продуцента в жидкой питательной среде, выделении культуральной жидкости путем осаждения дрожжевых клеток центрифугированием, очистке и концентрировании ферментного препарата.
Ген фосфолипазы А2 SEQ ID No1 получен путем химико-ферментативного синтеза нуклеотидной последовательности, кодирующей фосфолипазу А2 в Streptomyces violaceoruber из GenBank (Sequence ID AY359866.1). Для увеличения экспрессии гена фосфолипазы А2 за счет увеличения эффективности считывания информации с данной мРНК на рибосомах последовательность была оптимизирована по ко донам для Pichia pastoris в онлайн-программе IDT (Integrated DNA Technologies).
Для решения задачи предлагается способ конструирования плазмиды pPICZαA-PhoA2-StV, обеспечивающей синтез фосфолипазы А2 в клетках дрожжей Pichia pastoris. Согласно предложенному способу осуществляют расщепление вектора pPICZαA («Invitrogen») ферментами рестрикции EcoRI SEQ ID No2 и SalI SEQ ID No3, расщепленный вектор лигируют с геном фосфолипазы А2 PhoA2-StV, затем полученной лигазной смесью трансформируют клетки Escherichia coli и отбирают клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду pPICZαA-PhoA2-StV. Проводят амплификацию плазмиды pPICZαA-PhoA2-StV в клетках Escherichia coli путем их культивирования в стерильной питательной среде LB с добавлением антибиотиков и выделение плазмиды pPICZαA-PhoA2-StV из клеток Escherichia coli с помощью набора «Plasmid Midiprep».
Экспрессия гена фосфолипазы А2 в составе плазмиды pPICZαA-PhoA2-StV находится под контролем промотора гена АОХ1, содержащего области, обеспечивающие активацию транскрипции в присутствии метанола в культуральной среде, а также область инициации транскрипции. Промотор гена АОХ1 относится к числу наиболее сильных дрожжевых промоторов. Уровень экспрессии генов, находящихся под контролем АОХ1 промотора, эффективно регулируется источниками углерода. Транскрипция гена АОХ1 полностью блокирована при выращивании дрожжей на среде с глюкозой, на среде с глицерином наблюдается только базальный уровень экспрессии гена. Использование метанола в качестве единственного источника углерода значительно усиливает экспрессию гена АОХ1 и, следовательно, генов, находящихся под контролем АОХ1 промотора. Это позволяет регулировать синтез фосфолипазы А2 в клетках дрожжей. Регулируемая экспрессия клонированного гена позволяет существенно снизить метаболическую нагрузку на клетку дрожжей.
В качестве продуцента фосфолипазы А2 предложен штамм Pichia pastoris Х-33/ pPICZαA-PhoA2-StV. Штамм Pichia pastoris Pichia pastoris Х-33/ pPICZαA-PhoA2-StV получен при трансформации штамма дрожжей Pichia pastoris Х-33 (Wild Type, «Invitrogen») плазмидой pPICZαA-PhoA2-StV согласно изобретению. Штамм Pichia pastoris Pichia pastoris Х-33/ pPICZαA-PhoA2-StV зарегистрирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Y-4333.
Рекомбинантный штамм Pichia pastoris Х-33/ pPICZαA-PhoA2-StV характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Клетки округлой, слегка овальной формы, размером 3-7 мкм, часть клеток имеет на поверхности почки или соединена с дочерними клетками.
Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на полной органической среде YPD - дрожжевой экстракт - 1%, пептон - 1%, глюкоза - 2%. Кроме того, клетки хорошо растут на минеральной среде SC: 1,34% Yeast Nitrogen Base («Difco», США), а также на других синтетических средах для дрожжей, содержащих в качестве источника углерода глюкозу (2%) или глицерин (1%). При росте на твердых средах клетки образуют гладкие, круглые колонии с матовой поверхностью, светло-кремового цвета, край неровный. При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную суспензию. Культура имеет характерный запах метилотрофных дрожжей.
Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут в пределах от 4 до 37°С. Оптимальной температурой выращивания является 30°С. При росте в аэробных условиях клетки незначительно закисляют среду. Оптимум рН для роста составляет 4,5-6,5. В качестве источника углерода клетки могут использовать многие простые соединения, такие как глюкоза, глицерин, метанол. В качестве источника азота клетки могут использовать минеральные соли в аммонийной форме, аминокислоты, мочевину. Клетки способны к аэробному и анаэробному росту.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки штамма характеризуются устойчивостью к зеоцину (25 мкг/мл).
Штамм хранится обычным способом в суспензии с глицерином (15%) при -80°С.
В результате трансформации линеаризованной плазмидой и последующей гомологичной рекомбинации происходит встраивание экспрессионной кассеты в хромосому дрожжей Pichia pastoris, что обеспечивает стабильное поддержание клонированного гена фосфолипазы А2.
Заявляемый способ получения рекомбинантной фосфолипазы А2 PhoA2-StV заключается в культивировании клеток штамма Pichia pastoris Х-33/ pPICZαA-PhoA2-StV в минеральной питательной среде BSM, выделении культуральной жидкости путем отделения биомассы центрифугированием, очистке и концентрировании ферментного препарата. Очистку ферментного препарата осуществляют с помощью ультрафильтрационных мембран с размером пор не менее 100 кДа, концентрирование ферментного препарата проводят также с помощью ультрафильтрационных мембран, но с размером пор не более 10 кДа. Выход рекомбинантной PhoA2 в результате применения описанного способа составляет не менее 0,1 г рекомбинантного белка с 1 л культуральной жидкости.
Рекомбинантный белок PhoA2 имеет молекулярную массу 14 кДа, оптимальную температуру реакции 45-50°С, оптимальный рН=8,5, повышенную активность в присутствии 1 мМ Са2+ в инкубационной среде.
Данные по физико-химической характеристике и определению ферментативной активности рекомбинантной фосфолипазы А2 свидетельствуют о наличии у исследуемого полипептида фосфолипазной активности, присущей его природному аналогу. Рекомбинантная фосфолипаза А2 может быть успешно использована в биотехнологических процессах, проводимых при температурах от 30 до 55°С и рН от 2 до 11, а также как модель для изучения молекулярных механизмов рН-устойчивости.
Существенными преимуществом заявляемого способа являются:
- использование гена, оптимизированного для экспрессии в Pichia pastoris;
- использование рекомбинантного штамма, что позволяет получать при биосинтезе большое количество высокоактивной рекомбинантной PhoA2;
- использование упрощенной схемы очистки и концентрирования рекомбинантного белка PhoA2-StV, что позволяет обеспечить невысокую себестоимость готового ферментного препарата.
Фиг. 1 Карта плазмиды pPICZαA-PhoA2-StV.
Фиг. 2 Электрофореграмма белков культуральной жидкости штамма-продуцента Pichia pastoris Х-33/ pPICZαA-PhoA2-StV. М - белковый маркер, 1-10 - культуральная жидкость трансформантов Pichia pastoris Х-33 (9 - культуральная жидкость штамма-продуцента Pichia pastoris Х-33/ pPICZαA-PhoA2-StV).
Способ получения функционально активного белка на основе использования гена, кодирующего фосфолипазу бактерии Streptomyces violaceoruber иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Конструирование плазмиды pPICZαA-PhoA2-StV.
Ген фосфолипазы А2 был получен путем химико-ферментативного синтеза нуклеотидной последовательности, кодирующей фосфолипазу А2 в Streptomyces violaceoruber, полученной из открытых баз данных.
Наработку фрагмента ДНК, содержащего полноразмерный ген PhoA2-StV, получают при помощи полимеразной цепной реакции с использованием в качестве матрицы плазмиды, содержащей синтезированный ген PhoA2-StV SEC ID No 1, и праймеры PhoA2 EcoRI for SEC ID No4 и PhoA2 Sail rev mut SEC ID No5.
Реакцию амплификации гена PhoA2 проводят с набором реагентов Accu-Prime Pfx polymerase, используя в качестве матрицы плазмиду с геном PhoA2 (50 нг) с помощью праймеров PhoA2 EcoRI for и PhoA2 Sail rev mut. Процесс амплификации состоит из 15 циклов со следующими параметрами: денатурация 95°С - 20 сек, отжиг 60°С - 20 сек, элонгация 68°С - 30 сек.
После амплификации очищеный фрагмент ДНК обрабатывают рестриктазами EcoRI и Sail, чистят на стекловолоконных фильтрах и клонируют в вектор pPICZαA, обработанный теми же рестриктазами.
Полученной лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Е. coli XL 10 Gold. Выделенные из клонов плазмиды анализируются на присутствие вставки картированием; отсутствие мутаций подтверждается секвенированием.
Пример 2. Получение штамма Pichia pastoris Х-33/ pPICZαA-PhoA2-StV, трансформированного плазмидой pPICZαA-PhoA2-StV, несущей ген фосфолипазы А2.
Штамм-продуцент получают путем трансформации химически компетентных клеток штамма Pichia pastoris Х-33 с помощью электропорации рекомбинантной плазмидой pPICZαA-PhoA2-StV.
Суспензию компетентных клеток Pichia pastoris Х-33 в количестве 40 мкл помещают в охлажденные эппендорфы. Добавляют к компетентным клеткам 5-20 мкг линеаризованной плазмиды pPICZαA-PhoA2-StV и осторожно перемешивают. Помещают эппендорфы в ледяную баню на 5 мин. Переносят смесь в охлажденную стерильную кювету для электропоратора с шириной зазора 2 мм. Электропорацию клеток проводят в режиме Fungi -> Pic. После проведения трансформации в кюветы вносят 1 мл 1 М ледяного сорбита. Переносят смесь в стерильную пробирку с 1 мл среды YPD и инкубируют при 30°С в течение 1-3 часов.
Аликвоты трансформированных клеток Pichia pastoris Х-33 100 и/или 200 мкл пересевают на твердую питательную среду YPD с антибиотиком зеоцином в концентрации 100 мкг/мл и инкубируют в термостате на +30°С в течение 48-72 ч.
Проросшие колонии трансформированных клеток Pichia pastoris Х-33 пересевают в культуральные планшеты, содержащие по 2 мл среды YPG: дрожжевой экстракт-1%, пептон - 1%, глицерин - 0,5%. В засеянные культуральные планшеты в стерильных условиях необходимо вносить по 1% метанола от объема питательной среды в каждую засеянную лунку каждые 24 часа с момента засева. Планшеты размещают в шейкере-инкубаторе и устанавливают следующие условия: скорость перемешивания - 250 об/мин, температурный режим - 30°С, продолжительность культивирования - 72 ч.
Для определения продуктивности штамма культуральную жидкость из планшетов, отделенную от биомассы, анализируют электрофорезом в 15% полиакриламидном геле. Гель окрашивают Кумасси R-250 по стандартной методике и определяют относительное количество белка в полосе целевого продукта. Содержание рекомбинантного белка в культуральной жидкости составляет не менее 50% от всех белков (Фиг. 2).
Как следует из приведенных примеров, заявляемое изобретение позволяет получать с помощью штамма-продуцента Pichia pastoris Х-33/ pPICZαA-PhoA2-StV активную рекомбинантную фосфолипазу А2, секретируемую в питательную среду.
Пример 3. Культивирование штамма Pichia pastoris Х-33/ pPICZαA-PhoA2-StV в 5 - литровом ферментере, отделение биомассы, очистка и концентрирование ферментного препарата.
Штамм-продуцент рекомбинантной фосфолипазы А2 культивируют в 5 л ферментере марки Inforce. Объем среды в ферментере - 2 л, температура во время культивирования 30°С, рН=6,0, концентрация растворенного кислорода - не менее 20%, скорость перемешивания - 900-1100 об/мин.
Инокулят в объеме 200 мл выращивают в конических колбах на 500 мл, заполненных на 100 мл питательной средой YPG с дрожжевым экстрактом -1%, пептоном - 1%, глицерином - 2%, в течение 24 ч при 30°С на орбитальной качалке с числом оборотом 250 в минуту. Инокулят вносят в ферментер, его объем составляет 10% от объема питательной среды в ферментере. Питательная среда в ферментере имеет следующий состав на 1 литр: 178 г NaH2PO4*12H2O, 0,9 г CaSO4, 18,2 г K2SO4, 14,9 г MgSO4*7H2O (стерилизуют отдельно), 4,1 г KOH, 40 г глицерина, 6 г мочевины, 41,3 г лимонной кислоты. Раствор микроэлементов (РТМ) готовят растворением в 100 мл 0,38 г CuSO4, 0,008 г NaI, 0,46 г MnSO4*7H2O, 0,023 г Na2MoO4*2H2O, 0,002 г борной кислоты, 0,092 г CoCl2*7H2O, 4,72 г ZnSO4*7H2O, 6,5 г FeSO4*7H2O, 0,5 г серной кислоты, 0,02 биотина.
Для наращивания биомассы до высоких плотностей используют подпиточный раствор, содержащий 88 мл глицерина и 2,7 мл раствора РТМ. Каждые 2 часа вносится по 37 мл подпиточного раствора. Всего внесение осуществляется 6 раз.
Через 20 часов с момента начала ферментации вносится каждый час по 8 мл заранее подготовленного индукционного раствора, состоящего из 6,7 мл стерильного раствора РТМ и 553,3 мл метанола. Через 24 часа с момента начала ферментации температуру проведения процесса снижают до 20°С. Через 95 часов с момента начала ферментации прекращают подачу индуктора и прекращают ферментацию.
После 95 часов от начала индукции клеточную массу отделяют центрифугированием. Белковый состав образцов культуральной жидкости после внесения индуктора в среду анализировался с помощью электрофореза в 10% полиакриламидном геле (Фиг. 2). Электрофорез Проводят в следующих условиях: 200 V, 50 mA, 25 W.
Отделенную от биомассы культуральную жидкость для отделения раствора целевого белка фосфолипазы А2 от высокомолекулярных примесей отправляют на ультрафильтрацию на мембранном фильтре с размером пор 100 кДа. Полученный фильтрат, содержащий целевой белок фосфолипазы А2 для отделения низкомолекулярных примесей и концентрирования отправляют на ультрафильтрацию на мембранном фильтре с размером пор 5 кДа. Содержание целевого белка в готовом ферментном препарате - не менее 10000 ед/мл.
Как следует из приведенных примеров, заявляемое изобретение позволяет получать активную рекомбинантную фосфолипазу при использовании относительно простых и надежных технологий культивирования клеток штамма- продуцента и выделения, а также ферментный препарат на ее основе в течение 20 часов, включая этап очистки и концентрирования ферментного препарата.
Перечень последовательностей
Оптимизированная нуклеотидная последовательность гена фосфолипазы А2 из Streptomyces violaceoruber
Ферменты рестрикции
Праймеры
Claims (5)
1. Плазмида pPICZαA-PhoA2-StV, определяющая синтез фосфолипазы А2, имеющая размер 3862 п.н. и содержащая синтезированный ген фософлипазы PhoA2-StV SEQ ID No 1 и праймеры: прямой PhoA2 EcoRI for SEQ ID No 4, специфичный по отношению к N-концевой последовательности PhoA2, и обратный SalI rev mut SEQ ID No 5, специфичный по отношению к С-концевой последовательности PhoA2.
2. Штамм дрожжей Pichia pastoris Х-33, трансформированный плазмидой по п.1, депонированный во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под номером ВКПМ Y-4333 - индуцибельный продуцент рекомбинантного белка, включающего аминокислотную последовательность фосфолипазы PhoA2-StV.
3. Способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2, заключающийся в культивировании штамма по п.2 в минеральной питательной среде, выделении культуральной жидкости центрифугированием биомассы, очистке и концентрировании ферментного препарата.
4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что очистка ферментного препарата осуществляется ультрафильтрацией на мембранном фильтре с размером пор не менее 100 кДа.
5. Способ по п.3, характеризующийся тем, что концентрирование ферментного препарата осуществляется ультрафильтрацией на мембранном фильтре с размером пор не более 10 кДа.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018108650A RU2676321C1 (ru) | 2018-03-07 | 2018-03-07 | Способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с применением рекомбинантного штамма-продуцента Pichia pastoris X-33/ pPICZαA-PhoA2-StV |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018108650A RU2676321C1 (ru) | 2018-03-07 | 2018-03-07 | Способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с применением рекомбинантного штамма-продуцента Pichia pastoris X-33/ pPICZαA-PhoA2-StV |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2676321C1 true RU2676321C1 (ru) | 2018-12-27 |
Family
ID=64753702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018108650A RU2676321C1 (ru) | 2018-03-07 | 2018-03-07 | Способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с применением рекомбинантного штамма-продуцента Pichia pastoris X-33/ pPICZαA-PhoA2-StV |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2676321C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2746563C1 (ru) * | 2019-12-27 | 2021-04-15 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Способ очистки рекомбинантного ферментного препарата фосфолипазы А2 из штамма продуцента Pichia pastoris |
| RU2746817C1 (ru) * | 2020-06-10 | 2021-04-21 | Общество с ограниченной ответственностью "Инновационный центр "Бирюч-новые технологии" | Способ получения штамма-продуцента фосфолипазы А2 Komagataella phaffii (Pichia pastoris) YIB Δleu2_PLA2S |
| RU2766448C2 (ru) * | 2019-12-27 | 2022-03-15 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Получение гена фосфолипазы А2 с измененным оптимумом рН путем удаления сайтов гликозилирования |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080044425A1 (en) * | 2000-09-19 | 2008-02-21 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptides having phospholipase a2 activity |
| RU2409671C1 (ru) * | 2009-07-10 | 2011-01-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах pichia pastoris гена фосфолипазы, штамм дрожжей pichia pastoris - продуцент фосфолипазы |
| RU2567659C2 (ru) * | 2009-10-28 | 2015-11-10 | Аб Энзимс Гмбх | Клонирование, экспрессия и применение кислых фосфолипаз |
-
2018
- 2018-03-07 RU RU2018108650A patent/RU2676321C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080044425A1 (en) * | 2000-09-19 | 2008-02-21 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptides having phospholipase a2 activity |
| RU2409671C1 (ru) * | 2009-07-10 | 2011-01-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах pichia pastoris гена фосфолипазы, штамм дрожжей pichia pastoris - продуцент фосфолипазы |
| RU2567659C2 (ru) * | 2009-10-28 | 2015-11-10 | Аб Энзимс Гмбх | Клонирование, экспрессия и применение кислых фосфолипаз |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| AIXIA LIU et al., Streptomyces violaceoruber Phospholipase A2: Expression in Pichia pastoris, Properties, and Application in Oil Degumming, Applied Biochemistry and Biotechnology Vol. 175, Issue 6, pp. 3195-3206, 2015. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2746563C1 (ru) * | 2019-12-27 | 2021-04-15 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Способ очистки рекомбинантного ферментного препарата фосфолипазы А2 из штамма продуцента Pichia pastoris |
| RU2766448C2 (ru) * | 2019-12-27 | 2022-03-15 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Получение гена фосфолипазы А2 с измененным оптимумом рН путем удаления сайтов гликозилирования |
| RU2746817C1 (ru) * | 2020-06-10 | 2021-04-21 | Общество с ограниченной ответственностью "Инновационный центр "Бирюч-новые технологии" | Способ получения штамма-продуцента фосфолипазы А2 Komagataella phaffii (Pichia pastoris) YIB Δleu2_PLA2S |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhong et al. | Secretion, purification, and characterization of a recombinant Aspergillus oryzae tannase in Pichia pastoris | |
| JP7261815B2 (ja) | ネルボン酸を生産する組換え酵母菌株およびその使用 | |
| KR101952469B1 (ko) | 변경된 점성 표현형을 갖는 사상균 | |
| RU2676321C1 (ru) | Способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с применением рекомбинантного штамма-продуцента Pichia pastoris X-33/ pPICZαA-PhoA2-StV | |
| JP2002514049A (ja) | ピヒア・メタノリカの栄養要求性突然変異体の製造 | |
| Böer et al. | Large-scale production of tannase using the yeast Arxula adeninivorans | |
| CN1230997A (zh) | 甲醇毕赤酵母的转化 | |
| US9926540B2 (en) | Myrmecia incisa reisigl diacylglycerol acyltransferase gene sequence and use thereof | |
| CN109957520B (zh) | 外源基因表达用毕赤酵母菌株 | |
| KR101567308B1 (ko) | 미세조류의 바이오매스와 지질 생산성을 증가시키기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도 | |
| JP4526638B2 (ja) | タンパク質の高発現システム | |
| CN116970067A (zh) | 一种提高人血清白蛋白重组表达水平的策略 | |
| US20230039558A1 (en) | Chloroplast or accumulated lipid particle enriched with an oil-body protein fusion polypeptide and method for producing the same in algae | |
| RU2746817C1 (ru) | Способ получения штамма-продуцента фосфолипазы А2 Komagataella phaffii (Pichia pastoris) YIB Δleu2_PLA2S | |
| CN114262695A (zh) | 一种生产cbga前体的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用 | |
| US20200172948A1 (en) | Recombinant polypeptide enriched algal chloroplasts, methods for producing the same and uses thereof | |
| CN101928723B (zh) | 一种新的载脂蛋白a-ⅱ的制备 | |
| CN113005110B (zh) | 一种太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶c及其编码基因与应用 | |
| RU2805486C1 (ru) | Трансформант Komagataella phaffii - продуцент рекомбинантного химозина в активной форме | |
| RU2779307C2 (ru) | Способ микробиологического синтеза прохимозина быка с использованием рекомбинантного штамма Pichia pastoris, содержащего синтетический ген варианта препрохимозина с модифицированной сигнальной последовательностью секреции | |
| Simatupang et al. | Lipolytic activity of Itb1. 1 and Lk3 thermostable lipases expressed in Escherichia coli and Pichia pastoris | |
| RU2306333C2 (ru) | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Pichia pastoris Х-33/2albumin ДЛЯ СЕКРЕЦИИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬБУМИНА | |
| KR102202504B1 (ko) | 포스포리파제 a1을 생산하는 슈도모나스 플루오레슨스 변이 균주 및 이의 용도 | |
| CN101928721B (zh) | 一种新的载脂蛋白c-ⅰ的制备 | |
| CN109517815B (zh) | 一种提高发酵罐制备酿酒酵母细胞表面展示α-半乳糖苷酶表达量的新方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210308 |