CN101437953A - 用于改变含油生物的多不饱和脂肪酸和油含量的二酰基甘油酰基转移酶 - Google Patents

用于改变含油生物的多不饱和脂肪酸和油含量的二酰基甘油酰基转移酶 Download PDF

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Abstract

本发明提供了酰基转移酶，其适用于在含油酵母(例如，解脂耶氏酵母)中生产富含ω脂肪酸的微生物油。更具体地，已经从解脂耶氏酵母和高山被孢霉分离出了编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT1)的基因。这些基因编码参与酵母中油生物合成的终端步骤的酶。预期各自在改变含油酵母油中生产的多不饱和脂肪酸的量方面起关键作用。

Description

用于改变含油生物的多不饱和脂肪酸和油含量的二酰基甘油酰基转移酶
本申请要求享有2004年11月4日提交的美国临时申请60/624812的优先权。
发明领域
本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT1)和酰基-CoA：甾醇-酰基转移酶的核酸片段的鉴别。这些酶可以用于改变含油微生物(例如含油酵母)中的油量。
发明背景
本发明指向会积累富含长链ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸(“PUFA”；例如，18:3，18:4，20:3，20:4，20:5和22:6脂肪酸)的油的含油酵母的开发。为此，基因工程的进展，已经增强了含油酵母(大多数限于18:2脂肪酸生产)的天然能力，导致20:4(花生四烯酸，或“ARA”)、20:5(二十碳五烯酸，或“EPA”)和22:6(二十二碳六烯酸，或“DHA”)PUFA在转化体解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中的生产。通过在含油宿主中导入和表达编码ω-3/ω-6生物合成途径的异源基因，生产这些ω-3和ω-6脂肪酸(参见共同未决的美国专利申请号10/840579，在这里整体引作参考)。但是，除了开发将适当的脂肪酸去饱和酶和延伸酶导入这些特定的宿主生物中的技术外，还必须加强PUFA在合成之后向贮藏脂类库中的转化。
大多数游离脂肪酸会被酯化成辅酶A(CoA)，生成酰基-CoA。这些分子又是细胞内质网中甘油脂合成的底物，在这里生成磷脂酸和二酰基甘油(DAG)。这些代谢中间产物中的任一种都可以指向膜磷脂(例如，磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰胆碱)，或DAG可以指向形成三酰基甘油(TAG)，即真核细胞中脂类的主要贮藏品。
2篇关于酵母中的TAG生物合成的综合综述(包括关于参与的基因和导致TAG合成的代谢中间产物的细节)是：D.Sorger和G.Daum，Appl.Microbiol.Biotechnol.61：289-299(2003)；和H.Müllner和G.Daum，ActaBiochimica Polonica，51(2)：323-347(2004)。但是，作者承认，迄今进行的大多数工作都集中在酿酒酵母上，仍然存在关于TAG形成和调节的许多问题。
简而言之，已经为酿酒酵母中的TAG合成描述了3条途径(Sandager，L.等，J.Biol.Chem.277(8)：6478-6482(2002))。首先，TAG主要从DAG和酰基-CoA合成，这通过二酰基甘油酰基转移酶(即，DGAT2，由DGA1基因编码)的活性。但是，最近，还已经鉴别出了磷脂:二酰基甘油酰基转移酶(即，PDAT，由LRO1基因编码)，它负责将磷脂和DAG分别转化成溶血磷脂和TAG，从而通过独立于酰基-CoA的机理生成TAG(Dahlqvist等，PNAS.97(12)：6487-6492(2000))。最后，已知2种酰基-CoA:甾醇-酰基转移酶(由ARE1和ARE2基因编码)会利用酰基-CoA和甾醇生成甾醇酯(和少量的TAG；参见Sandager，L.等，Biochem.Soc.Trans.28(6)：700-702(2000))。总之，PDAT和DGAT2负责酿酒酵母中约95％的油生物合成。
尽管已经在多种其它生物中鉴别出了每种上述酰基转移酶基因的同系物，并在公开文献中公开，几乎难以从含油生物中得到基因。关于酵母，将包含在耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属内、且可以积累至少25％干细胞重的油的这些物种分类成含油的。但是，在该独特的酵母科中，仅仅分离和表征了2种酰基转移酶。它们包括来自解脂耶氏酵母的DGAT2和PDAT(参见共同未决的美国专利申请号10/882760，在这里整体引作参考)。但是，与在酿酒酵母中的发现不同，发现解脂耶氏酵母DGAT2和PDAT仅仅部分地负责生物的总油生物合成。
仍然需要鉴别编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT1)和酰基-CoA:甾醇-酰基转移酶的基因，其可以用于含油酵母的表达，生产PFUA。进行本工作，以鉴别和表征参与含油酵母解脂耶氏酵母的油生物合成的其它基因。关于该生物中油生物合成的天然机理的理解，可以用于开发修饰转化体含油酵母中重组生产的脂肪酸(例如，长链PUFA，例如ARA，EPA和DHA)向贮藏脂类库(即，TAG部分)的转化的技术。
通过从含油酵母解脂耶氏酵母分离编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT1)和酰基-CoA:甾醇-酰基转移酶(ARE2)的基因，申请人已经解决了所述问题。总之，解脂耶氏酵母的PDAT、DGAT2和DGAT1负责最高达约95％油生物合成(同时ARE2可以另外对油生物合成作出微小贡献)。此外，从高山被孢霉(Mortierella alpina)(一种含油真菌)克隆了定向进化同源的DGAT1基因，并鉴别了从公开的序列数据库克隆的4种其它的真菌DGAT1定向进化同源(即，粗糙链孢霉，玉米赤霉PH-1，Magnaporthe grisea和构巢曲霉)。利用这些真菌DGAT1蛋白序列，申请人已经发现了可以用于鉴别该蛋白家族中的随后基因的辨别特征。这些DGAT1基因可以用于修饰含油酵母中长链游离脂肪酸(例如，ω-3和/或ω-6脂肪酸)向TAG库的转化。
发明简述
本发明涉及编码酰基转移酶的基因的发现。该基因和编码的酶可以用于操控微生物(尤其是含油酵母)中商业上有用的油的生产。因此，本发明提供了编码二酰基甘油酰基转移酶-1酶的分离的核酸分子，其选自：
(a)编码选自SEQ ID NO：14和18的氨基酸序列的分离的核酸分子；
(b)能在下述杂交条件下与(a)杂交的分离的核酸分子：0.1X SSC、0.1％ SDS、65℃，并用2X SSC、0.1％ SDS洗涤，然后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤；或
(c)与(a)或(b)完全互补的分离的核酸分子。
类似地，本发明提供了编码酰基-CoA:甾醇-酰基转移酶的分离的核酸分子，其选自：
(a)编码SEQ ID NO：16所述的氨基酸序列的分离的核酸分子；
(b)在下述杂交条件下与(a)杂交的分离的核酸分子：0.1X SSC、0.1％ SDS、65℃，并用2X SSC、0.1％ SDS洗涤，然后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤；或
(c)与(a)或(b)完全互补的分离的核酸分子。
另外，本发明提供了由本发明的分离的核酸分子编码的多肽以及表达它们的遗传嵌合体和宿主细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，其编码选自下述的氨基酸基序：
a)SEQ ID NO：31；
b)SEQ ID NO：32；
c)SEQ ID NO：33；
d)SEQ ID NO：34；
e)SEQ ID NO：35；
f)SEQ ID NO：36；
g)SEQ ID NO：37；
h)SEQ ID NO：23；
i)SEQ ID NO：24；
j)SEQ ID NO：25；
k)SEQ ID NO：26；
l)SEQ ID NO：27；
m)SEQ ID NO：28；
n)SEQ ID NO：29；和
o)SEQ ID NO：30。
在另一个实施方案中，本发明提供了选自下述的氨基酸基序序列：
a)SEQ ID NO：31；
b)SEQ ID NO：32；
c)SEQ ID NO：33；
d)SEQ ID NO：34；
e)SEQ ID NO：35；
f)SEQ ID NO：36；
g)SEQ ID NO：37；
h)SEQ ID NO：23；
i)SEQ ID NO：24；
j)SEQ ID NO：25；
k)SEQ ID NO：26；
l)SEQ ID NO：27；
m)SEQ ID NO：28；
n)SEQ ID NO：29；和
o)SEQ ID NO：30。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了提高转化的宿主细胞中三酰基甘油含量的方法，其包含：
(a)提供转化的宿主细胞，其包含：
(i)在合适的调控序列控制下的至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因，所述酶具有选自SEQ ID NO：14，18，19，20，21和22的氨基酸序列；和，
(ii)脂肪酸源；
(b)在表达至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因的条件下，培养步骤(a)的细胞，导致脂肪酸转化成三酰基甘油；和
(c)任选地回收步骤(b)的三酰基甘油。
以类似的方式，本发明提供了增加转化的宿主细胞中三酰基甘油的ω-3或ω-6脂肪酸含量的方法，其包含：
(a)提供转化的宿主细胞，其包含：
(i)编码功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因；
(ii)在合适的调控序列控制下的至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因，所述酶具有选自SEQ ID NO：14，18，19，20，21和22的氨基酸序列；
(b)在表达(i)和(ii)的基因的条件下，培养步骤(a)的细胞，导致至少一种ω-3或ω-6脂肪酸的生成，和它向三酰基甘油的转化；和
(c)任选地回收步骤(b)的三酰基甘油。
相关地，本发明提供了提高转化的宿主细胞中三酰基甘油含量的方法，其包含：
(a)提供转化的宿主细胞，其包含：
(i)在合适的调控序列控制下的至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶-1酶的基因，所述酶包含所有下述的氨基酸基序：
1)SEQ ID NO：31；
2)SEQ ID NO：32；
3)SEQ ID NO：33；
4)SEQ ID NO：34；
5)SEQ ID NO：35；
6)SEQ ID NO：36；和
7)SEQ ID NO：37；
和，
(ii)脂肪酸源；
(b)在表达至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因的条件下，培养步骤(a)的细胞，导致脂肪酸转化成三酰基甘油；和
(c)任选地回收步骤(b)的三酰基甘油。
以类似的方式，本发明提供了提高转化的宿主细胞中三酰基甘油含量的方法，其包含：
(a)提供转化的宿主细胞，其包含：
(i)在合适的调控序列控制下的至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因，所述酶包含所有下述的氨基酸基序：
1)SEQ ID NO：23；
2)SEQ ID NO：24；
3)SEQ ID NO：25；
4)SEQ ID NO：26；
5)SEQ ID NO：27；
6)SEQ ID NO：28；
7)SEQ ID NO：29；和
8)SEQ ID NO：30；
和，
(ii)脂肪酸源；
(b)在表达至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因的条件下，培养步骤(a)的细胞，导致脂肪酸转化成三酰基甘油；和
(c)任选地回收步骤(b)的三酰基甘油。
或者，本发明提供了提高转化的宿主细胞中三酰基甘油的ω-3或ω-6脂肪酸含量的方法，其包含：
(a)提供转化的宿主细胞，其包含：
(i)编码功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因；和
(ii)在合适的调控序列控制下的至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因，所述酶包含所有下述的氨基酸基序：
1)SEQ ID NO：31；
2)SEQ ID NO：32；
3)SEQ ID NO：33；
4)SEQ ID NO：34；
5)SEQ ID NO：35；
6)SEQ ID NO：36；和
7)SEQ ID NO：37；
(b)在表达(i)和(ii)的基因的条件下，培养步骤(a)的细胞，导致至少一种ω-3或ω-6脂肪酸的生成，和它向三酰基甘油的转化；和
(c)任选地回收步骤(b)的三酰基甘油。
在另一个实施方案中，本发明提供了提高转化的宿主细胞中三酰基甘油的ω-3或ω-6脂肪酸含量的方法，其包含：
(a)提供转化的宿主细胞，其包含：
(i)编码功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因；和
(ii)在合适的调控序列控制下的至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因，所述酶包含所有下述的氨基酸基序：
1)SEQ ID NO：23；
2)SEQ ID NO：24；
3)SEQ ID NO：25；
4)SEQ ID NO：26；
5)SEQ ID NO：27；
6)SEQ ID NO：28；
7)SEQ ID NO：29；和
8)SEQ ID NO：30；
(b)在表达(i)和(ii)的基因的条件下，培养步骤(a)的细胞，导致至少一种ω-3或ω-6脂肪酸的生成，和它向三酰基甘油的转化；和
(c)任选地回收步骤(b)的三酰基甘油。
在一个实施方案中，本发明提供了鉴别具有二酰基甘油酰基转移酶-1活性的多肽的方法，其包含：
a)得到怀疑具有二酰基甘油酰基转移酶-1活性的多肽的氨基酸序列；和，
b)在步骤(a)的多肽氨基酸序列中，鉴别所有下述氨基酸基序序列的存在：
1)SEQ ID NO：31；
2)SEQ ID NO：32；
3)SEQ ID NO：33；
4)SEQ ID NO：34；
5)SEQ ID NO：35；
6)SEQ ID NO：36；和
7)SEQ ID NO：37；
其中步骤(a)的所有基序序列在多肽中的存在，是二酰基甘油酰基转移酶-1活性的指标。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴别具有二酰基甘油酰基转移酶-1活性的真菌多肽的方法，其包含：
a)得到怀疑具有二酰基甘油酰基转移酶-1活性的真菌多肽的氨基酸序列；和，
b)在步骤(a)的多肽氨基酸序列中，鉴别所有下述氨基酸基序序列的存在：
1)SEQ ID NO：23；
2)SEQ ID NO：24；
3)SEQ ID NO：25；
4)SEQ ID NO：26；
5)SEQ ID NO：27；
6)SEQ ID NO：28；
7)SEQ ID NO：29；和
8)SEQ ID NO：30；
其中步骤(a)的所有基序序列在多肽中的存在，是二酰基甘油酰基转移酶-1活性的指标。
附图简述和序列描述
图1显示了含油酵母中脂类积累的生化机理的示意图。
图2解释了ω-3和ω-6脂肪酸生物合成途径。
图3解释了用于解脂耶氏酵母中的基因表达的质粒载体pY5的构建。
图4提供了下述质粒的质粒图谱：(A)pY20；(B)pLV13；(C)pMDGAT1-17；和(D)pZUF-Mod-1。
图5描绘了在总脂类部分中生成最高达15％ EPA的不同解脂耶氏酵母菌株的开发。
图6提供了下述质粒的质粒图谱：(A)pKUNF12T6E；(B)pDMW232；(C)pZP3L37；(D)pY37/F15；和(E)pKO2UM26E。
图7提供了下述质粒的质粒图谱：(A)pZKUM；(B)pKO2UF2PE；(C)pZKUT16；(D)pZP217+Ura；和(E)pZUF17。
图8a，8b，8c，8d，8e，8f，8g和8h是使用Clustal W，使用DNASTAR的Megalign程序对DGAT1蛋白的比对。
通过以下的详细说明和所附的序列说明，能够更全面地理解本发明，这些内容构成了本发明的一部分。
以下序列符合37 C.F.R.§1.821-1.825的规定(＂Requirements forPatent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or AminoAcid Sequence Disclosures-the Sequence Rules＂)，并且，符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(Rules 5.2和49.5(a-bis)，和Administrative Instructions的Section208和Annex C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合37C.F.R.§1.822的规定。
SEQ ID NO：1-38，112-115，117-120，122，123，125，126，130，131，133-136，140，141和169-174是如表1所鉴别的ORF编码基因或蛋白(或其片段)或蛋白基序。
表1
基因和蛋白SEQ ID号的总结
 
描述和缩写 核酸SEQ ID NO. 蛋白SEQ ID NO.
解脂耶氏酵母DGAT2(“Yl DGAT2”) 1(2119bp)3(1380bp)5(1068bp) 2(514AA)4(459AA)6(355AA)
解脂耶氏酵母PDAT(“Yl PDAT”) 7(2326bp) 8(648AA)
 
解脂耶氏酵母YALI-CDS2011.1(也参见GenBank登记号NC_006072，碱基974607-976238，基因座标记＝＂YALI0F06578g＂)             9(1632bp) 10(543AA)
解脂耶氏酵母YALI-CDS2141.1(也参见GenBank登记号CR382130，碱基1026155-1027735，基因座标记＝＂YALI0D07986g”)             11(1581bp) 12(526AA)
解脂耶氏酵母DGAT1(“Yl DGAT1”)      13(1578bp) 14(526AA)
解脂耶氏酵母ARE2(“Yl ARE2”) 15(1632bp) 16(543AA)
高山被孢霉DGAT1(“Ma DGAT1”)   17(1578bp) 18(525AA)
高山被孢霉DGAT1-内部cDNA片段 175(604bp) --
粗糙链孢霉DGAT1(“Nc DAGAT1”)  -- 19(533AA)
玉米赤霉DGAT1(“Fm DAGAT1”) -- 20(499AA)
Magnaporthe grisea DGAT1(“Mg DAGAT1”)          -- 21(503AA)
构巢曲霉DGAT1(“An DAGAT1”) -- 22(458AA)
真菌 DGAT1 基序 #1 -- 23
真菌 DGAT1 基序 #2 -- 24
真菌 DGAT1 基序 #3 -- 25
真菌 DGAT1 基序 #4 -- 26
真菌 DGAT1 基序 #5 -- 27
真菌 DGAT1 基序 #6 -- 28
真菌 DGAT1 基序 #7 -- 29
真菌 DGAT1 基序 #8 -- 30
通用 DGAT1 基序 #1 -- 31
 
通用 DGAT1 基序 #3 -- 32
通用 DGAT1 基序 #4 -- 33
通用 DGAT1 基序 #5 -- 34
通用 DGAT1 基序 #6 -- 35
通用 DGAT1 基序 #7 -- 36
通用 DGAT1 基序 #8 -- 37
真菌 DGAT2 基序 -- 38
合成的延伸酶基因，其源自高山被孢霉，为在解脂耶氏酵母中的表达进行了密码子优化                     112(957bp) 113(318AA)
合成的Δ6去饱和酶，其源自高山被孢霉，为在解脂耶氏酵母中的表达进行了密码子优化                   114(1374bp) 115(457AA)
串珠镰孢Δ12去饱和酶 117(1434bp) 118(477AA)
合成的延伸酶基因，其源自金黄色破囊壶菌，为在解脂耶氏酵母中的表达进行了密码子优化                 119(819bp) 120(272AA)
高山被孢霉Δ5去饱和酶 122(1341bp) 123(446AA)
合成的Δ17去饱和酶基因，其源自异丝水酶，为在解脂耶氏酵母中的表达进行了密码子优化                 125(1077bp) 126(358AA)
解脂耶氏酵母Δ12去饱和酶 130(1936bp) 131(419AA)
深黄被孢霉Δ12去饱和酶 133(1203bp) 134(400AA)
高山被孢霉Δ6去饱和酶“B” 135(1521bp) 136(458AA)
合成的C16延伸酶基因，其源自褐鼠，为在解脂耶氏酵母中的表达进行了密码子优化                          140(804bp) 141(267AA)
褐家鼠DGAT2(“Mm DGAT1”) -- 169(388AA)
大豆DGAT1(“Gm DGAT1”) -- 170(504AA)
拟南芥DGAT1(“At DGAT1”) -- 171(520AA)
 
稻DGAT1(“Os DGAT1”) -- 172(500AA)
Perilla frutescens DGAT1(“PfDGAT1”)                    -- 173(534AA)
小麦DGAT1(Ta DGAT1”) -- 174(508AA)
SEQ ID NO：55，82，110，121，124，128，129，137-139，144，164，165和168是如表2中鉴别的质粒。
表2
质粒SEQ ID号的总结
 
质粒 对应图 SEQ ID NO
pY20 4A 55(8,196bp)
pLV13 4B 82(5,105bp)
pKUNF12T6E 6A 110(12,649bp)
pDMW232 6B 121(10,945bp)
pZP3L37 6C 124(12,690bp)
pY37/F15 6D 128(8,194bp)
pKO2UM26E 6E 129(10,448bp)
pZKUM 7A 137(4,313bp)
pKO2UF2PE 7B 138(10,838bp)
pZKUT16 7C 139(5,833bp)
pZP217+Ura 7D 144(7,822bp)
pZUF17 7E 164(8,165bp)
pMDGAT1-17 4C 165(8,666bp)
pZUF-MOD-1 4D 168(7,323bp)
SEQ ID NO：39和40分别对应用于分离TEF启动子的引物TEF5’和TEF3’。
SEQ ID NO：41和42分别对应用于分离XPR2转录终止子的引物XPR5’和XPR3’。
SEQ ID NO：43-54分别对应用于质粒构建的引物YL5，YL6，YL9，YL10，YL7，YL8，YL3，YL4，YL1，YL2，YL61和YL62。
SEQ ID NO：56对应含有大肠杆菌潮霉素抗性基因的1kB DNA片段(提供的氨基酸序列为SEQ ID NO：57)。
SEQ ID NO：58对应含有耶氏酵母Ura3基因的1.7kB DNA片段(提供的氨基酸序列为SEQ ID NO：59)，其用引物KU5和KU3(分别是SEQID NO：60和61)扩增。
SEQ ID NO：62和64分别是鉴别为P7和P8的简并引物，其用于分离解脂耶氏酵母DGAT2。
SEQ ID NO：63和65分别是与简并引物P7和P8相对应的氨基酸共有序列。
SEQ ID NO：66-68分别对应用于染色体步移的引物P80，P81和LinkAmp引物1。
SEQ ID NO：69-72分别对应引物P95，P96，P97和P98，其用于解脂耶氏酵母DGAT2基因的靶向破坏。
SEQ ID NO：73-75分别对应引物P115，P116和P112，其用于筛选破坏的解脂耶氏酵母DGAT2基因的靶向整合。
SEQ ID NO：76和78分别是鉴别为P26和P27的简并引物，其用于分离解脂耶氏酵母PDAT。
SEQ ID NO：77和79分布是与简并引物P26和P27相对应的氨基酸共有序列。
SEQ ID NO：80，81，83和84分别对应引物P39，P42，P41和P40，其用于解脂耶氏酵母PDAT基因的靶向破坏。
SEQ ID NO：85-88分别对应引物P51，P52，P37和P38，其用于筛选破坏的解脂耶氏酵母PDAT基因的靶向整合。
SEQ ID NO：89对应引物P79，其用于从援救的质粒扩增全长解脂耶氏酵母DGAT2基因。
SEQ ID NO：90和91分别对应引物P84和P85，其用于从援救的质粒扩增全长解脂耶氏酵母PDAT基因。
SEQ ID NO：92和93分别是鉴别为P201和P203的简并引物，其用于分离解脂耶氏酵母DGAT1。
SEQ ID NO：94-99分别对应引物P214，P215，P216，P217，P218和P219，其用于解脂耶氏酵母DGAT1基因的靶向破坏。
SEQ ID NO：100和101分别对应引物P226和P227，其用于筛选破坏的解脂耶氏酵母DGAT1基因的靶向整合。
SEQ ID NO：102和103分别是鉴别为P205和P208的简并引物，其用于分离解脂耶氏酵母ARE2。
SEQ ID NO：104-109分别对应引物P220，P221，P222，P223，P224和P225，其用于解脂耶氏酵母ARE2基因的靶向破坏。
SEQ ID NO：111，116，127和132分别对应下面的解脂耶氏酵母启动子：果糖-二磷酸醛缩酶+内含子(FBAIN；973bp)，果糖-二磷酸醛缩酶(FBA；1001bp)，果糖-二磷酸醛缩酶+修饰的内含子(FBAINm；924bp)，甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT；1130bp)。
SEQ ID NO：142和143分别对应引物P239和P240，其用于测序解脂耶氏酵母DGAT1 ORF。
SEQ ID NO：145-147分别对应BD-Clontech Creator 
Figure A200580045917D0023105141QIETU
cDNA文库试剂盒引物SMART IV寡核苷酸，CDSIII/3’PCR引物和5’-PCR引物。
SEQ ID NO：148对应M13正向引物，其用于测序高山被孢霉cDNA文库。
SEQ ID NO：149对应部分cDNA序列(601 bp)，其编码推定的高山被孢霉DGAT1基因。
SEQ ID NO：150和151分别对应引物MARE2-N1和MARE2-N2，其用于克隆推定的高山被孢霉DGAT1基因的5’-末端区域。
SEQ ID NO：152和153分别对应来自ClonTech’s UniversalGenomeWalkerTM试剂盒的基因组步移衔接子，其用于基因组步移。
SEQ ID NO：154和155分别对应引物AP1和AP2，其用于基因组步移，分离高山被孢霉DGAT1的5’-末端区域。
SEQ ID NO：156对应高山被孢霉DGAT1 cDNA片段的5’-末端序列(1683bp)。
SEQ ID NO：157和158分别对应引物ARE-N3-1和ARE-N3-2，其用于克隆推定的高山被孢霉DGAT1基因的3’-末端区域。
SEQ ID NO：159和160分别对应引物AP和UAP，其用于基因组步移，分离高山被孢霉DGAT1的3’-末端区域。
SEQ ID NO：161对应高山被孢霉DGAT1 cDNA片段的3’-末端序列(184bp)。
SEQ ID NO：162和163分别对应引物MACAT-F1和MACAT-R，其用于克隆高山被孢霉DGAT1ORF。
SEQ ID NO：166和167分别对应引物pzuf-mod1和pzuf-mod2，其用于建立“对照”质粒pZUF-MOD-1。
发明详述
根据本发明，申请人已经分离和证实了编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT1)酶的解脂耶氏酵母基因的鉴别，该酶可以用于将脂肪酸转化贮藏三酰基甘油(TAG)。还已经从高山被孢霉分离了定向进化同源基因，并在粗糙链孢霉，玉米赤霉PH-1，Magnaporthe grisea和构巢曲霉中鉴别。而且，本发明提供了用于从真菌生物容易地鉴别其它DGAT1基因的基序。在另一个实施方案中，已经分离了编码酰基-CoA:甾醇-酰基转移酶(ARE2)酶的解脂耶氏酵母基因。每种这样的基因可以用于改变在转化体含油酵母中生产的长链多不饱和脂肪酸(PUFA)的量。
PUFA的重要性是不容置疑的。例如，某些PUFA是健康细胞的重要的生物学成分，且被认为是：＂必需＂脂肪酸，它不能够在哺乳动物体内从头合成，相反，必须从饮食中获得或者通过亚油酸(LA)或α-亚麻酸(ALA)的进一步去饱和及延伸产生；细胞质膜的成分，其中它们能够以诸如磷脂或TAG的形式存在；为正常发育(特别是婴儿脑发育)所必需，和组织形成和修复所必需；和，在哺乳动物体内起着重要作用的若干生物活性的类花生酸类物质(例如前列环素，类花生酸类物质，白三烯和前列腺素)的前体。另外，长链ω-3 PUFA的高摄入，会产生心血管保护作用(Dyerberg，J.等，Amer.J.Clin Nutr.28：958-966(1975)；Dyerberg，J.等，Lancet 2(8081)：117-119(July 15，1978)；Shimokawa，H.，World Rev Nutr Diet，88：100-108(2001)；von Schacky，C.和Dyerberg，J.，World Rev Nutr Diet，88：90-99(2001))。此外，许多其它的研究证明了通过施用ω-3和/或ω-6脂肪酸赋予的对抗许多症状和疾病(例如，哮喘，牛皮癣，湿疹，糖尿病，癌症)的许多种健康益处。
这样，本发明具有多种用途。通过本文所披露的方法积累的PUFA或其衍生物，可用作饮食代用品，或补充物，特别是婴儿配方，用于静脉内喂饲患者或用于预防或治疗营养不良。或者，可以将纯化的PUFA(或其衍生物)掺入烹饪油，脂肪，或配制的人造奶油中，以便在正常使用时，受体能接受到所需数量的饮食补充。还可将PUFA掺入婴儿配方，营养补充物或其它食品中，并且可以用作抗炎剂或降胆甾醇剂。可任选将所述组合物用于药物学用途(人或兽医)。在这种场合下，PUFA通常是口服的，不过，可以通过能够成功地吸收它们的任何途径施用，例如，肠胃外(例如皮下，肌内或静脉内)，直肠内，阴道内或局部(例如，作为皮肤油膏或洗液)。
给人或动物补充通过重组方法生产的PUFA，可以导致水平增加的添加的PUFA，以及它们的代谢产物。例如，用ARA治疗，不仅能够产生水平增加的ARA，而且还能产生ARA的下游产物，如前列腺素。复杂的调控机制，可能需要组合各种PUFA，或者添加PUFA的不同缀合物，以便预防、控制或克服这样的机制，以便在个体内获得理想水平的特定的PUFA。
定义
在本说明书中，使用了多种术语和缩写。提供了以下定义。
＂开放读框＂缩写为ORF。
＂聚合酶链反应＂缩写为PCR。
＂美国典型培养物保藏中心＂缩写为ATCC。
＂多不饱和脂肪酸＂缩写为PUFA。
“酰基-CoA:甾醇-酰基转移酶”缩写为ARE2。
“磷脂:二酰基甘油酰基转移酶”缩写为PDAT。
“二酰基甘油酰基转移酶”缩写为DAG AT或DGAT。
“二酰基甘油”缩写为DAG。
“三酰基甘油”缩写为TAG。
“辅酶A”缩写为CoA。
术语＂脂肪酸＂表示具有各种链长的长链脂族酸(链烷酸)，从约C12-C22(不过已知可以采用更长和更短链长的酸)。主要的链长为C16至C22。脂肪酸的结构是通过简单的符号系统＂X:Y＂表示的，其中，X是在特定脂肪酸中的碳(C)原子的总数，而Y是双键的数量。
通常，脂肪酸被划分成饱和的或不饱和的。术语＂饱和脂肪酸＂表示在它们的碳主链之间没有＂双键＂的脂肪酸。相反，＂不饱和脂肪酸＂沿它们的碳主链具有＂双键＂(它们最常见的是顺式构型)。＂单不饱和脂肪酸＂沿碳主链只有一个＂双键＂(例如，对于棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1)来说，通常位于第9和第10个碳原子之间)，而＂多不饱和脂肪酸＂(或＂PUFA＂)沿碳主链具有至少两个双键(例如，对于亚油酸(18:2)来说位于第9和第10、第12和第13个碳原子之间；对于α-亚麻酸(18:3)来说位于第9和第10、第12和第13、第15和第16个碳原子之间)。
＂PUFA＂可以划分成两种主要类型(根据最靠近脂肪酸碳链的甲基末端的第一个双键的位置(n))。因此，＂ω-6脂肪酸＂(ω-6或n-6)的第一个不饱和双键距离该分子的ω(甲基)末端六个碳原子，并且一共还具有两个或两个以上双键，每一个随后的不饱和出现在朝向该分子羧基末端的三个额外的碳原子。相反，＂ω-3脂肪酸＂(ω-3或n-3)的第一不饱和的双键距离该分子的ω末端三个碳原子，并且一共还具有三个或三个以上双键，每一个随后的不饱和出现在朝向该分子羧基末端的三个额外的碳原子。
在本说明书中，将利用ω-参考系统表示碳原子的编号，双键的编号，和最接近ω碳原子的双键的位置，从ω碳原子开始计数(它是用于这种目的的第1号)。在下面的表1中示出了这种命名方法，表示在标题为＂简化符号＂的栏目中。该表的其余部分归纳了ω-3和ω-6脂肪酸的常用名，在说明书中将要使用的缩写，以及每一种化合物的化学名称。
表3
多不饱和脂肪酸的命名
 
常用名 缩写 化学名 简化符号
亚油酸 LA 顺式-9，12-十八碳二烯酸 18:2 ω-6
γ-亚油酸 GLA 顺式-6，9，12-十八碳三烯酸 18:3 ω-6
二十碳二烯酸 EDA 顺式-11，14-二十碳二烯酸 20:2 ω-6
二高-γ-亚油酸 DGLA 顺式-8，11，14-二十碳三烯酸 20:3 ω-6
花生四烯酸 ARA 顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸 20:4 ω-6
α-亚麻酸 ALA 顺式-9，12，15-十八碳三烯酸 18:3 ω-3
 
十八碳四烯酸 STA 顺式-6，9，12，15-十八碳四烯酸 18:4 ω-3
二十碳三烯酸 ETrA 顺式-11，14，17-二十碳三烯酸 20:3 ω-3
二十碳四烯酸 ETA 顺式-8，11，14，17-二十碳四烯酸 20:4 ω-3
二十碳五烯酸 EPA 顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸 20:5 ω-3
二十二碳五烯酸 DPA 顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸 22:5 ω-3
二十二碳六烯酸 DHA 顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸 22:6 ω-3
＂微生物油＂或＂单细胞油＂是微生物(例如，藻类，含油酵母和丝状真菌)在它们的生命期内天然生成的那些油。术语＂油＂表示在25℃是液体并且通常是多不饱和的脂类物质。相反地，术语“脂肪”表示在25℃是固体并且通常是饱和的脂类物质。
“脂质体”表示通常以特定蛋白和磷脂单分子层为边界的脂滴。这些细胞器是大多数生物运输/贮藏中性脂类的地方。认为脂质体源自含油TAG-生物合成酶的内质网的微域；并且，它们的合成和大小似乎受特定蛋白组分的控制。
“中性脂类”表示在细胞、脂质体中作为贮藏脂肪和油常见的那些脂类，并因在细胞pH而得名，该脂类不携带带电荷的基团。通常，它们是完全非极性的，对水没有亲和力。中性脂类通常表示甘油和脂肪酸的单-、二-和/或三酯，也分别称作单酰基甘油、二酰基甘油或TAG(或一起称作酰基甘油)。从酰基甘油释放出游离的脂肪酸，必须发生水解反应。
术语“三酰基甘油”、“油”和“TAG”表示由3个与甘油分子酯化的脂肪酰基残基组成的中性脂类(在本文的公开内容中，可互换地使用这些术语)。这种油可以含油长链PUFA，以及更短的饱和和不饱和脂肪酸和更长链饱和脂肪酸。因而，“油生物合成”通常表示TAG在细胞中的合成。
术语“DAG AT”表示二酰基甘油酰基转移酶(也称作酰基-CoA-二酰基甘油酰基转移酶或二酰基甘油O-酰基转移酶)(EC 2.3.1.20)。该酶负责酰基-CoA和1，2-二酰基甘油向TAG和CoA的转化(从而参与TAG生物合成的终端步骤)。存在两个DAG AT酶家族：DGAT1和DGAT2。前一家族与酰基-CoA：胆甾醇酰基转移酶(ACAT)基因家族具有同源性，后一家族不相关(Lardizabal等，J.Biol.Chem.276(42)：38862-28869(2001))。
术语“PDAT”表示磷脂：二酰基甘油酰基转移酶(EC 2.3.1.158)。该酶负责酰基从磷脂的sn-2位置向1，2-二酰基甘油的sn-3位置的转移，从而产生溶血磷脂和TAG(从而参与TAG生物合成的终端步骤)。该酶与DGAT(EC 2.3.1.20)的不同之处在于，通过独立于酰基-CoA的机理合成TAG。
术语“ARE2”表示酰基-CoA：甾醇-酰基转移酶(EC 2.3.1.26；也称作甾醇-酯合酶2酶)，其催化下面的反应：酰基-CoA+胆甾醇＝CoA+胆甾醇酯。
术语＂PUFA生物合成途径酶＂表示与PUFA的生物合成相关的以下任何酶(以及编码所述酶的基因)，包括：4去饱和酶，5去饱和酶，Δ6去饱和酶，Δ12去饱和酶，Δ15去饱和酶，Δ17去饱和酶，Δ9去饱和酶，Δ8去饱和酶和/或延伸酶。
术语＂ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径＂表示一组基因，当它们在合适的条件下表达时，编码能催化ω-3和/或ω-6脂肪酸生产的酶。通常，与ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径相关的基因编码某些或所有以下的酶：Δ12去饱和酶，Δ6去饱和酶，延伸酶(s)，Δ5去饱和酶，Δ17去饱和酶，Δ15去饱和酶，Δ9去饱和酶，Δ8去饱和酶和Δ4去饱和酶。在图2中示出了典型的途径，它可以通过各种中间产物将油酸转化成DHA，并且证实了如何由普通来源生产ω-3和ω-6脂肪酸。该途径天然地分成2部分，其中一部分会产生ω-3脂肪酸，而另一部分仅产生ω-6脂肪酸。仅产生ω-3脂肪酸的部分在本文中称作ω-3脂肪酸生物合成途径，而仅产生ω-6脂肪酸的部分在本文中称作ω-6脂肪酸生物合成途径。
在ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的上下文中，本文使用的术语“功能性的”表示，该途径中的有些(或全部)基因会表达有活性的酶。应当理解，“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”或“功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”并不意味着需要上面段落列出的所有基因，因为许多脂肪酸产物仅需要表达该途径的基因的子集。
术语＂去饱和酶＂表示多肽，其能够对一种或多种脂肪酸去饱和(即导入双键)，以产生单-或多不饱和脂肪酸。尽管在本说明书中ω-参考系统被用于表示特殊的脂肪酸，更常见的是，利用Δ-系统从底物的羧基末端开始计数以表示去饱和酶的活性。本发明特别感兴趣的是：Δ12去饱和酶，它能使脂肪酸在从该分子的羧基末端开始计数的第12和第13个碳原子之间去饱和，并催化油酸转化成LA；Δ15去饱和酶，它能催化LA转化成ALA；Δ17去饱和酶，它能催化ARA转化成EPA和/或DGLA转化成ETA；Δ6去饱和酶，它能催化LA转化成GLA和/或ALA转化成STA；Δ5去饱和酶，它能催化DGLA转化成ARA和/或ETA转化成EPA；Δ4去饱和酶，它能催化DPA转化成DHA；Δ8去饱和酶，它能催化EDA转化成DGLA和/或ETrA转化成ETA；Δ9去饱和酶，它能催化棕榈酸酯转化成棕榈油酸(16:1)和/或硬脂酸酯转化成油酸(18:1)。
术语＂延伸酶＂表示多肽，其能够延伸脂肪酸碳链，产生比延伸酶作用的脂肪酸底物长2个碳原子的酸。这种延伸过程是通过与脂肪酸合酶相关的多步骤机制发生的，其中，CoA是酰基载体(Lassner等，ThePlant Cell 8：281-292(1996))。简单地讲，丙二酰-CoA与长链酰基-CoA缩合，产生CO2和β-酮酰基-CoA(其中，酰基部分业已延长了两个碳原子)。随后的反应包括还原成β-羟酰基-CoA，脱水形成烯酰基-CoA，并且第二次还原，产生延长的酰基-CoA。由延伸酶催化的反应的例子是将GLA转化成DGLA，STA转化成ETA和将EPA转化成DPA。因此，延伸酶可以具有不同的特异性。例如，C16/18延伸酶优选C16底物，C8/20延伸酶优选C18底物，而C20/22延伸酶优选C20底物。以类似的方式，Δ9延伸酶能分别催化LA和ALA转化成EDA和ETrA。
术语＂含油的＂表示倾向于以脂类形式贮藏它们的能源的生物(Weete，In：Fungal Lipid Biochemistry，2nd ed.，Plenum，1980)。通常，所述微生物的细胞PUFA含量遵循S形曲线，其中，脂类的浓度增加，直到在后对数期或早期静止生长期达到最大值，然后在晚期静止期和死亡期逐渐减少(Yongmanitchai and Ward，Appl.Environ，Microbiol.57：419-25(1991))。
术语＂含油酵母＂表示被分类为产油酵母的微生物。通常，含油微生物的细胞油或三酰基甘油含量遵循S形曲线，其中，脂类的浓度增加，直到在后对数期或早期静止生长期达到最大值，然后在晚期静止期和死亡期逐渐减少(Yongmanitchai and Ward，Appl.Environ，Microbiol.57：419-25(1991))。含油微生物经常积累超过它们干细胞重约25％的油。含油酵母的例子包括，但不限于以下属：耶氏酵母属，假丝酵母属，红酵母属，红冬孢属，隐球酵母属，丝孢酵母属和油脂酵母属。
术语＂可发酵的碳源＂表示微生物能够代谢以便产生能量的碳源。本发明的典型的碳源包括，但不限于：单糖，寡糖，多糖，链烷，脂肪酸，脂肪酸酯，甘油单酯，甘油二酯，甘油三酯，二氧化碳，甲醇，甲醛，甲酸酯以及含碳的胺。
术语“分离的核酸片段”和“分离的核酸分子”可互换地使用，指单链或双链RNA或DNA聚合物，它任选包括合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的多核酸片段可能由一个或多个cDNA、基因组DNA或合成DNA的片段组成。
当单链形式的核酸分子可以在适当的温度和溶液离子强度条件下退火成其它核酸分子时，核酸分子可以与另一种核酸分子(例如cDNA、基因组DNA、或RNA分子)“杂交”。杂交和洗涤条件是众所周知的，且示例在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)，尤其是其中的第11章和表11.1(在这里整体引作参考)。稳定和离子强度条件决定了杂交的“严格性”。可以调节严格性，以筛选适度类似的片段(例如从远相关的生物筛选同源序列)至高度类似的片段(例如从紧密相关的生物筛选会复制功能性酶的基因)。杂交后洗涤决定了严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤，从用6X SSC、0.5％ SDS在室温洗涤15min开始，然后重复使用2X SSC、0.5％ SDS、45℃ 30min，然后重复使用0.2XSSC、0.5％ SDS、50℃ 30min 2次。一组更优选的严格条件使用更高的温度，其中洗涤与上面相同，例外是，在0.2X SSC、0.5％ SDS中的最后2次30min洗涤的温度升高到60℃。另一组优选的高严格条件使用在0.1X SSC、0.1％ SDS、65℃的2次最后洗涤。另一组严格条件包括，例如，在0.1X SSC、0.1％ SDS、65℃杂交，并用2X SSC、0.1％SDS洗涤，然后用0.1X SSC、0.1％ SDS洗涤。
杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管依赖于杂交的严格性，碱基之间的错配也是可能的。核酸杂交的适当严格性取决于核酸长度和互补程度，本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性的程度越高，具有这些序列的核酸的杂合体的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(对应更高的Tm)以下述次序降低：RNA:RNA，DNA:RNA，DNA:DNA。对于长度大于100核苷酸的杂合体，已经建立了计算Tm的方程(参见Sambrook等，同上，9.50-9.51)。对于与更短核酸(即，寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，且寡核苷酸的长度会决定它的特异性(参见Sambrook等，同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，杂交核酸的长度是至少约10核苷酸。优选地，杂交核酸的最小长度是至少约15核苷酸；更优选至少约20核苷酸；且最优选地，长度是至少约30核苷酸。而且，技术人员会认识到，根据探针长度等因素，可以根据需要调节温度和洗涤溶液盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的＂主要部分＂是，包括多肽的一定数目的氨基酸序列或基因的一定数目的核苷酸序列的部分，所述数目足够通过本领域技术人员对所述序列进行的人工评估，或通过计算机自动化的序列比较，以及使用诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，等，J.Mol.Biol.215：403-410(1993))的算法的鉴定，而推测性地鉴定该多肽或基因。通常，10或更多个连续氨基酸或30或更多个核苷酸的序列是必需的，以便推定地将多肽或核酸序列鉴别为与已知蛋白或基因同源。此外，关于核苷酸序列，包含20-30个连续核苷酸的基因特异性的寡核苷酸探针可以用于依赖于序列的基因鉴别(例如，DNA杂交)和分离(例如，细菌菌落或噬菌体的原位杂交)方法中。另外，12-15个碱基的短寡核苷酸可以用作PCR的扩增引物，以便得到包含引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“主要部分”包含足够长度的序列，以便特异性地鉴别和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书披露了编码一种或多种特定酵母和真菌蛋白的部分或全部氨基酸和核苷酸序列。技术人员利用本文所提供的序列，可以将所披露序列的全部或主要部分用于本领域技术人员所公知的目的。因此，本发明包括在所附序列表中所提供的完整序列，以及如上文所定义的这些序列的主要部分。
术语＂互补的＂被用于表示能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的相互关系。例如，对于DNA来说，腺嘌呤互补于胸腺嘧啶，而胞嘧啶互补于鸟嘌呤。因此，本发明还包括分离的核酸片段，它互补于在所附序列表中提供的完整序列，以及基本上类似的核酸序列。
如本领域已知的，术语“同一性百分比”是通过对比序列所测定的2个或多个多肽序列或2个或多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关度，根据情况可以通过这样的序列串之间的匹配来测定。通过已知的方法，包括但不限于下述的那些，可以容易地计算“同一性”和“相似性”1.)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.，Ed.)OxfordUniversity：NY(1988)；2.)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.，Ed.)Academic：NY(1993)；3.)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，Eds.)Humania：NJ(1994)；4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(vonHeinje，G.，Ed.)Academic(1987)；和5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.，Eds.)Stockton：NY(1991)。优选的测定同一性的方法用于建立测试序列之间的最佳匹配。测定同一性和相似性的方法被编译成可公开得到的计算机程序。使用LASERGENE生物信息学计算包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的Megalign程序，可以进行序列比对和同一性百分比计算。除非另有说明，使用Clustal比对方法(Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989))，利用缺省参数(GAPPENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)，进行序列的多重比对。使用Clustal方法的逐对比对的缺省参数是：KTUPLE 1，GAPPENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。
适当的核酸片段(本发明的分离的多核苷酸)编码与本文报告的氨基酸序列至少约70％一致、优选地至少约75％一致、更优选地至少约80％一致的多肽。优选的核酸片段编码与本文报告的氨基酸序列约85％一致的氨基酸序列。更优选的核酸片段编码与本文报告的氨基酸序列至少约90％一致的氨基酸序列。最优选地，编码与本文报告的氨基酸序列至少约95％一致的氨基酸序列的核酸片段。适当的核酸片段不仅具有上面的同源性，而且典型地编码具有至少50氨基酸、优选地至少100氨基酸、更优选地至少150氨基酸、更优选地至少200氨基酸、且最优选地至少250氨基酸的多肽。
＂密码子简并性＂表示遗传密码的性质，它允许改变核苷酸序列，而又不影响所编码的多肽的氨基酸序列。技术人员在用核苷酸密码子表示特定氨基酸时，充分理解由特定宿主细胞所表现出来的＂密码子偏倚＂。因此，在合成用于改善在宿主细胞中的表达的基因时，需要设计所述基因，使得它的密码子选择的频率接近宿主细胞的优选密码子选择的频率。
当指基因或核酸分子的编码区时，术语＂密码子优化的＂表示修饰密码子，使得改变的密码子反映宿主生物的典型的密码子选择，而又不改变由所述DNA编码的多肽。
当与DNA序列相关时，＂化学合成的＂表示组成核苷酸是在体外组装的。DNA的人工化学合成，可以通过使用业已建立的方法完成；或可以利用多种商业化仪器中的一种进行自动化的化学合成。＂合成基因＂可以由寡核苷酸基本单位组装，它们是利用本领域技术人员所公知的方法化学合成的。将这些基本单位连接在一起并且退火，形成基因片段，然后酶促组装，构建完整的基因。因此，可以对基因进行修饰，根据核苷酸序列的优化优化基因表达，体现宿主细胞的密码子偏倚。如果密码子选择偏向宿主优选的密码子，技术人员可以理解成功的基因表达的可能性。优选密码子的确定可以根据对来自宿主细胞的基因的检查，其中，可以获得序列信息。
＂基因＂表示能表达特定蛋白的核酸片段，包括位于编码序列前面(5′非编码序列)和后面(3′非编码序列)的调控序列。＂天然基因＂表示天然与它自身的调控序列一起出现的基因。＂嵌合基因＂表示不是天然基因的任何基因，包括不是天然一起存在的调控和编码序列。因此，嵌合基因可以包括来自不同来源的调控序列和编码序列，或来自相同的来源，但是以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。＂内源基因＂表示存在于生物基因组上的天然位置上的天然基因。＂外源＂基因表示正常情况下不存在于宿主生物中，而是通过基因转移导入所述宿主生物的基因。外源基因可以包括插入非天然生物的天然基因，或嵌合基因。＂转基因＂是业已通过转化方法导入所述基因组的基因。＂密码子优化的基因＂是具有经过设计以便模拟宿主细胞的优选的密码子选择频率的密码子选择频率的基因。
＂编码序列＂表示编码特定氨基酸序列的DNA序列。＂合适的调控序列＂表示位于编码序列上游(5′非编码序列)，序列内，或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，并且，它能影响相关编码序列的转录，RNA加工或稳定性，或翻译。调控序列可以包括启动子，翻译前导序列，内含子，聚腺苷酸化识别序列，RNA加工位点，效应物结合位点和茎-环结构。
＂启动子＂表示能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3′侧。启动子可能完全来自天然基因，或者由来自天然存在的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。本领域技术人员可以理解的是，不同的启动子能够指导基因在不同的组织或细胞类型中的表达，或者在发育的不同阶段的表达，或者对不同的环境或生理学条件作出反应的表达。能导致基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常被称作＂组成型启动子＂。还应当理解的是，由于在大多数场合下，调控序列的确切边界未能完全确定，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语＂3′非编码序列＂或＂转录终止子＂表示位于编码序列下游的DNA序列。它包括聚腺苷酸化识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。聚腺苷酸化信号通常以影响聚腺苷酸添加在mRNA前体的3′末端为特征。所述3′区能够影响相关编码序列的转录，RNA加工或稳定性，或翻译。
＂RNA转录物＂表示由RNA聚合酶催化的DNA序列转录而得到的产物。当RNA转录物是所述DNA序列的完整的互补拷贝时，它被称作初级转录物，或者它可以是来自初级转录物的转录后加工的RNA序列，并且被称作成熟的RNA。＂信使RNA＂或＂mRNA＂表示没有内含子，并且能够由细胞翻译成蛋白的RNA。＂cDNA＂表示双链DNA，它是互补于mRNA并且由mRNA衍生的。＂有义＂RNA表示包括mRNA，并能够由细胞翻译成蛋白的RNA转录物。＂反义＂RNA表示互补于靶初级转录物或mRNA的全部或部分的RNA，并且它能抑制靶基因的表达(U.S.5,107,065；WO 99/28508)。反义RNA的互补性可以是与特定基因转录物的任何部分，即，位于5′非编码序列，3′非编码序列，或编码序列互补的。＂功能性RNA＂表示反义RNA，核酶RNA，或不能翻译，但仍然能影响细胞加工的其它RNA。
术语＂可操作地连接的＂表示核酸序列缔合在一个核酸片段上，其中一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它就是与该编码序列可操作地连接的(即，所述编码序列受所述启动子的转录控制)。编码序列能够沿有义或反义方向可操作地与调控序列连接。
在本文中，术语＂表达＂表示来自本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可以表示mRNA翻译成多肽。
＂转化＂表示将核酸分子转入宿主生物，导致了遗传学稳定的遗传性。例如，核酸分子可以是能自主复制的质粒；或者它可以整合到宿主生物的基因组中。包括转化的核酸片段的宿主生物被称作＂转基因＂或＂重组＂或＂转化的＂生物。
术语＂质粒＂，＂载体＂和＂盒＂表示染色体外元件，它通常携带有不是细胞的中央代谢部分的基因，并且通常是环状双链DNA片段形式的。所述基因可以是自主复制的序列，基因组整合序列，噬菌体或核苷酸序列，线性或环状的单或双链DNA或RNA，可以来自任何来源，其中，多个核苷酸序列业已连接或重组成独特的结构，它能够将启动子片段和选定的基因产物的DNA序列，以及合适的3′非翻译序列导入细胞。＂转化盒＂表示包括外源基因，并且除了外源基因之外还具有能促进在特定宿主细胞中转化的元件的特定载体。＂表达盒＂表示包括外源基因，并且除了外源基因之外，还具有能够增强基因在外源宿主中表达的元件的特定载体。
术语“同源重组”表示2个DNA分子之间的DNA片段的交换(在杂交过程中)。交换的片段侧接2个DNA分子之间相同的核苷酸序列(即，“同源区域”)。
术语“同源区域”表示核酸片段上彼此具有同源性的参与同源重组的核苷酸序列段。有效的同源重组通常发生在这些同源区域的长度是至少约10bp的位置，其中至少约50bp的长度是优选的。典型地，用于重组的片段含有至少2个其中希望靶向基因破坏或替换的同源区域。
术语＂序列分析软件＂表示可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。＂序列分析软件＂可以是通过商业渠道获得的或者独立开发的。典型的序列分析软件包括，但不限于：1.)GCG程序组(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)；4.)Sequencher(Gene Codes Corporation，AnnArbor，MI)；和5.)采用了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Editor(s)：Suhai，Sandor.Plenum：NewYork，NY)。在本申请的范围内应当理解的是，在将序列分析软件用于分析时，分析的结果是基于有关程序的＂缺省值＂的，除非另有说明。在本文中，＂缺省值＂表示任何组的值或参数，它是在初次初始化时最初随所述软件加载的。
术语“保守域”或“基序”指沿着进化上相关的蛋白的比对序列的特定位置保守的一组氨基酸。尽管在其它位置的氨基酸可以在同源蛋白之间不同，在特定位置高度保守的氨基酸表示蛋白的结构、稳定性或活性所必须的氨基酸。因为通过它们在蛋白同系物家族的比对序列中的高度保守可以鉴别出它们，它们可以用作标识符或“标记”，以确定具有新测定的序列的蛋白是否属于以前鉴别的蛋白家族。在DGAT1酶(即，动物，植物和真菌)中普遍发现的基序提供为SEQ ID NO：31-37；在DGAT1中发现的对真菌生物特异性的基序提供为SEQ ID NO：23-30。
本发明所使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，并且披露于以下文献中：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(此后称作＂Maniatis＂)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等，Current ProtocolsinMolecular Bioloqy，由Greene Publishing Assoc.andWiley-Interscience(1987)出版。
脂肪酸和三酰基甘油的微生物生物合成
通常，在含油微生物中的脂类积累是由存在于生长培养基中的总碳氮比引发(图1)。当细胞耗尽了可利用的氮源时(例如，当碳与氮的比例超过约40时)，细胞一磷酸腺苷(AMP)的消耗导致线粒体中AMP-依赖型异柠檬酸脱氢酶活性的终止和柠檬酸的积累，并且将柠檬酸转移到细胞质，并且随后通过ATP-柠檬酸裂解酶裂解，产生乙酰-CoA和草酰乙酸。乙酰-CoA是脂肪酸从头合成的主要结构块。尽管任何能够有效代谢产生乙酰-CoA的化合物都可用作脂肪酸的前体，葡萄糖是这种类型反应中的主要碳源(图1)。通过糖酵解将葡萄糖转化成丙酮酸，并且然后将丙酮酸转入线粒体，在这里，它能够通过丙酮酸脱氢酶转化成乙酰-CoA。由于乙酰-CoA不能直接通过线粒体膜转入细胞质，乙酰-CoA上的两个碳与草酰乙酸缩合，产生柠檬酸(通过柠檬酸合酶催化)。柠檬酸被直接转入细胞质，在这里，它被ATP-柠檬酸酶裂解，再生乙酰-CoA和草酰乙酸。草酰乙酸通过转化成苹果酸重新进入三羧酸循环。
丙二酰-CoA的合成是脂肪酸生物合成的第一个关键步骤，它是在细胞质中进行的。丙二酰-CoA是通过乙酰-CoA羧化酶催化由乙酰-CoA的羧化产生的。脂肪酸合成是通过多种酶脂肪酸合酶复合物(＂FAS＂)催化的，并且通过八种二碳片段(来自乙酰-CoA的乙酰基团)的缩合进行，形成16-碳饱和脂肪酸棕榈酸。更具体地讲，FAS催化一系列的7个反应，该系列包括以下反应(Smith，S.FASEB J，8(15)：1248-59(1994))：
1.乙酰-CoA和丙二酰-CoA被转移到FAS的酰基载体肽(ACP)上。所述乙酰基团然后被转移到丙二酰基团上，形成β-酮丁酰基-ACP，并且释放CO2。
2.所述β-酮丁酰基-ACP发生还原(通过β-酮酰基还原酶)和脱水(通过β-羟酰基脱水酶)，形成反式-单不饱和的脂肪酰基。
3.通过NADPH还原双键，产生比最初的基团长两个碳原子的饱和脂肪酰基。然后再生了丁酰基-基团与新的丙二酰基团缩合，并且重复所述延伸过程的能力。
4.当脂肪酰基变成16个碳原子长时，硫酯酶活性会水解它，释放游离的棕榈酸(16:0)。
尽管棕榈酸合成发生在胞质中，更长链饱和及不饱和脂肪酸衍生物的形成发生在线粒体和内质网(ER)中，其中ER是主要的系统。更具体地，棕榈酸(16:0)是硬脂酸(18:0)、棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1)的前体，通过延伸酶和去饱和酶的作用产生棕榈酸。例如，通过Δ9去饱和酶的作用，分别将棕榈酸和硬脂酸转化成它们的不饱和衍生物，即棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1)。
TAG(脂肪酸的主要贮藏单位)是通过一系列反应形成的，包含：1.)通过酰基转移酶，将1个分子的酰基-CoA酯化成甘油-3-磷酸，产生溶血磷脂酸；2.)通过酰基转移酶，酯化第二个分子的酰基-CoA，产生1，2-二酰基甘油磷酸(通常称作磷脂酸)；3.)通过磷脂酸磷酸酶除去磷酸，得到1，2-二酰基甘油(DAG)；和4.)通过另一种酰基转移酶(例如，PDAT，DGAT1或DGAT2)的作用，添加第三个脂肪酸，形成TAG(图1)。
可以将许多种脂肪酸掺入TAG，包括饱和和不饱和脂肪酸和短链和长链脂肪酸。可以被酰基转移酶(例如，DAG AT或PDAT)掺入TAG的脂肪酸的有些非限制性实例包括：羊脂酸(10:0)，月桂酸(12:0)，肉豆蔻酸(14:0)，棕榈酸(16:0)，棕榈油酸(16:1)，硬脂酸(18:0)，油酸(18:1)，异油酸(18:1)，亚油酸(18:2)，桐酸(18:3)，γ--亚麻酸(18:3)，α--亚麻酸(18:3)，十八碳四烯酸(18:4)，花生酸(20:0)，二十碳二烯酸(20:2)，二高-γ--亚油酸(20:3)，二十碳三烯酸(20:3)，花生四烯酸(20:4)，二十碳四烯酸(20:4)，二十碳五烯酸(20:5)，山俞酸(22:0)，二十二碳五烯酸(22:5)，二十二碳六烯酸(22:6)，木蜡酸(24:0)，神经酸(24:1)，蜡酸(26:0)和褐霉酸(28:0)脂肪酸。在本发明的优选的实施方案中，最希望将PUFA掺入TAG。
酰基转移酶和它们在TAG生物合成的终端步骤中的作用
编码DGAT1的基因
历史上，认为DGAT1(负责第三个酰基转移酶反应，其中酰基-CoA基团从酰基-CoA转移到DAG的sn-3位置，形成TAG)是特异性地参与TAG合成的唯一酶。已知该酶与酰基-CoA:胆甾醇酰基转移酶(ACAT)同源；但是，最近的研究已经证实了与ACAT基因家族无关的一个新的DAG酰基转移酶(DAG AT)酶家族。因而，现在的命名法区分了与ACAT基因家族有关的DAG AT酶(DGAT1家族)和无关的DAG AT酶(DGAT2家族)(Lardizabal等，J.Biol.Chem.276(42)：38862-28869(2001))。
通过遗传手段，已经鉴别了许多编码DGAT1酶的基因，且可以公开得到一些这样的基因的DNA序列。例如，有些非限制性实例包括下面的GenBank登记号：AY445635(橄榄)；AF384160(小鼠)；NM_053437(挪威大鼠)；NM_174693(牛)；AY116586(猪)；AY327327和AY327326(Toxoplasma gondii)；AF298815(Perilla frutescens)；和AF164434(Brassicanapus)。另外，专利文献提供了DGAT1基因的许多其它的DNA序列(和/或关于几种上述基因和它们的分离方法的细节)。参见，例如：U.S.6,100,077(人)；U.S.6,552,250(Brassica)；U.S.6,344,548(人，小鼠，Arabidopsis)；US 2004/0088759A1(植物)；和US 2004/0078836A1(Farese等)。
编码DGAT2的基因
DGAT2家族的成员似乎存在于真核生物的所有主要门中(真菌，植物，动物和基本真核生物)。这样，通过遗传手段已经鉴别出了许多编码DGAT2酶的基因，且可以公开得到一些这样的基因的DNA序列。例如，有些非限制性实例包括下面的GenBank登记号：NC_001147(基因座NP_014888；酿酒酵母)；NM_012079(人)；NM_127503，AF051849和AJ238008(拟南芥)；NM_026384，NM_010046和AB057816(小鼠)；AY093657(猪)；AB062762(大鼠)；AF221132(秀丽隐杆线虫)；AF391089和AF391090(拉曼被孢霉)；AF129003(烟草)；和，AF251794和AF164434(Brassica napus)。另外，专利文献提供了DGAT2基因的许多其它的DNA序列(和/或关于几种上述基因和它们的分离方法的细节)。参见，例如：US2003/124126(Cases等)；WO 2001/034814(Banas等)；和US 2003/115632，US 2003/0028923和US 2004/0107459(Lardizabal等)。Lardizabal等的工作包括来自下述物种的DGAT2的DNA序列，例如，拉曼被孢霉，粗糙链孢霉，酿酒酵母，大麦，玉米，Glycine max，小麦，果蝇科，人类，裂殖酵母属，白色念珠菌和拟南芥。
最近，已经分离了来自含油酵母解脂耶氏酵母的DGAT2酶，并表征在共同未决的美国专利申请号10/882760(在本文中整体引作参考)。简而言之，从解脂耶氏酵母克隆部分推定的DGAT2 DNA片段后，进行内源解脂耶氏酵母基因的靶向破坏，以测试片段的同一性。破坏菌株的低含油量证实，消除了天然的DGAT2活性。随后，组装全长解脂耶氏酵母DGAT2基因(2119bp；SEQ ID NO：1)，其包含3个成套的开放读码框：1.)ORF 1：SEQ ID NO：1的核苷酸+291至+1835，对应由SEQ ID NO：2编码的蛋白(514氨基酸残基)；2.)ORF 2：SEQ ID NO：1的核苷酸+456至+1835，对应SEQ ID NO：3(1380碱基)和由SEQ IDNO：4编码的蛋白(459氨基酸残基)；和3.)ORF 3：SEQ ID NO：1的核苷酸+768至+1835 of，对应SEQ ID NO：5(1068碱基)和由SEQ IDNO：6编码的蛋白(355氨基酸残基)。
编码PDAT的基因
如Dahlqvist等(Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)97：6487-6492(2000))和Oelkers等(J.Biol.Chem.275：15609-15612(2000))最近证实的，在没有酰基-CoA的情况下，也可以发生TAG合成，这是通过独立于酰基-CoA的PDAT酶。更具体地，PDAT会从磷脂酰胆碱底物的sn-2位置去除酰基，转移到DAG的sn-3位置，生成TAG；并且，尽管还没有将PDAT的功能表征为DGAT2，已经推定PDAT在有些油料种子植物的从磷脂去除“罕见”脂肪酸中起主要作用(Banas，A.等，Biochem.Soc.Trans.28(6)：703-705(2000))。
PDAT在结构上与卵磷脂：胆甾醇酰基转移酶(LCAT)家族的蛋白有关。通过遗传手段已经鉴别出了几种编码PDAT酶的基因，且可以公开得到一些这样的基因的DNA序列。例如，有些非限制性实例包括下面的GenBank登记号：P40345(酿酒酵母)；O94680和NP_596330(裂殖酵母属)；和，NP_190069和AB006704[gi：2351069](拟南芥)。另外，专利文献提供了PDAT基因的许多其它的DNA序列(和/或关于几种上述基因和它们的分离方法的细节)；参见，例如，WO 2000/060095(Dahlqvist等)。
并且，与本文内容特别相关地，以类似于上述DGAT2的方式已经分离了来自含油酵母解脂耶氏酵母的PDAT酶，并表征在共同未决的美国专利申请号10/882760中。另外，在推定的PDAT基因中具有破坏的菌株的低含油量证实，消除了天然的PDAT活性。随后，组装全长解脂耶氏酵母PDAT基因(2326bp；SEQ ID NO：7)。
编码ARE2的基因
H.Yang等(Science.272(5266)：1353-1356(1996))首先研究了酵母中的甾醇酯化方法，其中发现，2个基因(ARE1和ARE2)编码ACAT-相关酶，它们允许胆甾醇的酯化。仅可以公开得到少数ARE2基因的DNA序列。例如，参见GenBank登记号：Q876L2(贝酵母)，P53629(酿酒酵母)和Q10269(裂殖酵母属)。
PDAT，DGAT1，DGAT2和ARE2之间的相互作用
在酿酒酵母中，4个基因(即，ARE1，ARE2，DGA1[编码DGAT2]和LRO1[编码PDAT])有助于油生物合成。PDAT和DGAT2负责最高达约95％的油生物合成(Sandager，L.等，J.Biol.Chem.277(8)：6478-6482(2002)；Oelkers et.al.J.Biol.Chem.277：8877(2002))。
令人惊奇地，根据共同未决的美国专利申请号10/882760所述的解脂耶氏酵母中工作，PDAT和DGAT2似乎仅仅部分地负责油生物合成。因而，显然至少一种其它的DAG AT必须在TAG形成中起作用。如本申请所述的，酵母解脂耶氏酵母中的油生物合成需要PDAT、DGAT1和DGAT2的活性，同时ARE2可以另外对油生物合成作出微小贡献。这与酿酒酵母中负责油生物合成的酶显著不同，其中仅仅DGAT2和PDAT是主要的DAG AT。
ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸的生物合成
将LA转化成GLA、DGLA和ARA(ω-6途径)和将ALA转化成STA、ETA、EPA、DPA和DHA(ω-3途径)的代谢过程包含，通过添加2个碳单元延长碳链，和通过添加双键使分子去饱和(图2)。这需要一系列的去饱和和延伸酶。更具体地，通过Δ12去饱和酶的作用，将油酸转化成LA(18:2)，它是ω-6脂肪酸的第一个。按以下方法产生后续的ω-6脂肪酸：1.)通过Δ6去饱和酶的作用，将LA转化成GLA；2.)通过延伸酶的作用，将GLA转化成DGLA；和3.)通过Δ5去饱和酶的作用，将DGLA转化成ARA。以类似的方式，通过Δ15去饱和酶的作用，将亚油酸(LA)转化成ALA，即ω-3脂肪酸的第一个。通过一系列类似于ω-6脂肪酸的步骤，产生后续的ω-3脂肪酸。具体地讲：1.)通过Δ6去饱和酶的活性，将ALA转化成STA；2.)通过延伸酶的活性，将STA转化成ETA；和3.)通过Δ5去饱和酶的活性将ETA转化成EPA。或者，ETA和EPA可以通过Δ17去饱和酶的活性，分别由DGLA和ARA产生。还可以通过延伸酶和Δ4去饱和酶的活性，进一步将EPA转化成DHA。
在替代实施方案中，Δ9延伸酶能分别催化LA和ALA转化成EDA和ETrA。Δ8去饱和酶然后可以将这些产物分别转化成DGLA和ETA。
很多微生物，包括藻类、细菌、霉菌、真菌和酵母，都可以通过正常细胞代谢过程合成PUFA和ω脂肪酸。进行过充分研究的是真菌，包括Schizochytrium aggregatm，破囊壶菌属的种和高山被孢霉。很多沟鞭藻类(Dinophyceaae)都能天然产生高浓度的PUFA。这样，通过遗传手段已经鉴别出了许多参与PUFA生产的去饱和酶和延伸酶基因，且可以公开得到一些这样的基因的DNA序列(非限定性例子如下)：AY131238，Y055118，AY055117，AF296076，AF007561，L11421，NM_031344，AF465283，AF465281，AF110510，AF465282，AF419296，AB052086，AJ250735，AF126799，AF126798(Δ6去饱和酶)；AF199596，AF226273，AF320509，AB072976，AF489588，AJ510244，AF419297，AF07879，AF067654，AB022097(Δ5去饱和酶)；AF489589.1，AY332747(Δ4脂肪酸去饱和酶)；AAG36933，AF110509，AB020033，AAL13300，AF417244，AF161219，AY332747，AAG36933，AF110509，AB020033，AAL13300，AF417244，AF161219，X86736，AF240777，AB007640，AB075526，AP002063(Δ12去饱和酶)；NP_441622，BAA18302，BAA02924，AAL36934(Δ15去饱和酶)；AF338466，AF438199，E11368，E11367，D83185，U90417，AF085500，AY504633，NM_069854，AF230693(Δ9去饱和酶)；和AX464731，NM_119617，NM_134255，NM_134383，NM_134382，NM_068396，NM_068392，NM_070713，NM_068746，NM_064685(延伸酶)。
另外，专利文献提供了参与PUFA生产的很多其它基因的DNA序列。参见，例如：U.S.5,968,809(Δ6去饱和酶)；U.S.5,972,664和U.S.6,075,183(Δ5去饱和酶)；WO 91/13972和U.S.5,057,419(Δ9去饱和酶)；WO 93/11245(Δ15去饱和酶)；WO 94/11516，U.S.5,443,974和WO 03/099216(Δ12去饱和酶)；WO 00/12720和U.S.2002/0139974A1(延伸酶)；U.S.2003/0196217 A1(Δ17去饱和酶)；WO 00/34439(Δ8去饱和酶)；和，WO 02/090493(Δ4去饱和酶)。上述每一份专利和专利申请都在本文中整体引作参考。
根据宿主细胞、底物利用度和期望的末端产物，几种去饱和酶和延伸酶可以用于生产PUFA。选择具有去饱和酶或延伸酶活性的特定多肽的考虑因素包括：1.)所述多肽的底物特异性；2.)所述多肽或它的成分是否是限速酶；3.)所述去饱和酶或延伸酶是否是合成目标PUFA所必需的；和/或4.)所述多肽所需要的辅因子。表达的多肽优选具有与它在宿主细胞中的部位的生物化学环境相容的参数。例如，所述多肽可能必须与宿主细胞中的其它酶竞争底物。因此，在确定特定多肽修饰PUFA在特定宿主细胞中的生产的合适性时，需要考虑KM和所述多肽比活性的分析。用于特定宿主细胞中的多肽是这样的多肽，它能在存在于预期宿主细胞中的生物化学条件下起作用，但原本可以是具有能够修饰目标脂肪酸底物的去饱和酶或延伸酶活性的任何多肽。
DGAT1酰基转移酶的序列鉴别
尽管可以得到几种编码DGAT1的基因(同上)，其可以用于在含油酵母(例如，解脂耶氏酵母)中的异源表达，天然酶的表达有时胜过异源(或“外来”)酶。该优选可能发生，因为：1.)为与细胞中的其它酶和蛋白的相互作用，优化了天然酶；和2.)异源基因不可能在宿主生物中具有相同的密码子选择。关于宿主生物的天然DGAT1序列的知识，会促进靶向破坏对同源染色体基因的破坏。而且，如本发明已经证实的，理解会实现生物中的TAG合成的酰基转移酶基因的完整互补序列，能容易地以多种方式操纵宿主生物产生的油含量。
使用BLASTP比对方法，利用低复杂性过滤和下面的参数：Expectvalue＝10，matrix＝Blosum 62(Altschul，等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))，将解脂耶氏酵母DGAT1核苷酸碱基(SEQ IDNO：13)和推定的氨基酸(SEQ ID NO：14)序列与公开数据库进行对比，会揭示大多数相似的已知序列在526个氨基酸长度与本文报告的DGAT1的氨基酸序列具有约55％同一性。
使用BLASTP比对方法(Altschul，等，同上)，将高山被孢霉DGAT1核苷酸碱基(SEQ ID NO：17)和推定的氨基酸(SEQ ID NO：18)序列与公开数据库进行对比，会揭示大多数相似的已知序列在525个氨基酸长度与本文报告的DGAT1的氨基酸序列具有约49％同一性。而且，将解脂耶氏酵母DGATI与高山被孢霉DGAT1进行对比，会揭示两种蛋白是32.4％一致的。
类似地，将粗糙链孢霉DGAT1氨基酸(SEQ ID NO：19)序列与解脂耶氏酵母DGAT1氨基酸(SEQ ID NO：14)进行对比，会揭示533氨基酸长度的约37％同一性；将玉米赤霉PH-1 DGAT1氨基酸(SEQ ID NO：20)序列与解脂耶氏酵母DGAT1氨基酸(SEQ ID NO：14)进行对比，会揭示499氨基酸长度的约38.1％同一性；将Magnaporthe grisea DGAT1氨基酸(SEQ ID NO：21)序列与解脂耶氏酵母DGAT1氨基酸(SEQ ID NO：14)进行对比，会揭示503氨基酸长度的约36.2％同一性；将构巢曲霉DGAT1氨基酸(SEQ ID NO：22)序列与解脂耶氏酵母DGAT1氨基酸(SEQ IDNO：14)进行对比，会揭示458氨基酸长度的约41.7％同一性。
更优选的DGAT1氨基酸片段与本文的序列(即，SEQ ID NO：14，18，19，20，21，22)具有至少约70％-80％同一性，其中具有85％-90％同一性的那些序列是特别合适的，且具有约95％同一性的那些序列是最优选的。类似地，优选的与本发明的ORF相对应的DGAT1编码核酸序列(即，SEQID NO：13和17)是编码活性蛋白的那些，且它们与编码本文报道的DGAT1的核酸序列具有至少约70％-80％同一性，其中具有85％-90％同一性的那些序列是特别合适的，且具有约95％同一性的那些序列是最优选的。
ARE2酰基转移酶的序列鉴别
使用BLASTP比对方法，利用低复杂性过滤和下面的参数：Expectvalue＝10，matrix＝Blosum 62(Altschul，等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))，将解脂耶氏酵母ARE2核苷酸碱基(SEQ ID NO：15)和推定的氨基酸(SEQ ID NO：16)序列与公开数据库进行对比，会揭示大多数相似的已知序列在543个氨基酸长度与本文报告的ARE2的氨基酸序列具有约44％同一性。更优选的ARE2氨基酸片段与本文的序列具有至少约70％-80％同一性，其中具有85％-90％同一性的那些序列是特别合适的，且具有约95％同一性的那些序列是最优选的。类似地，优选的与本发明的ORF相对应的ARE2编码核酸序列是编码活性蛋白的那些，且它们与编码本文报道的ARE2的核酸序列具有至少约70％-80％同一性，其中具有85％-90％同一性的那些序列是特别合适的，且具有约95％同一性的那些序列是最优选的。
同系物的分离
每一种本发明的酰基转移酶核酸片段可以用于从相同或其它微生物物种分离编码同源蛋白的基因。使用序列依赖性的方法分离同源基因，是本领域众所周知的。序列依赖性的方法的实例包括但不限于：1.)核酸杂交方法；2.)DNA和RNA扩增方法，如通过使用各种核酸扩增技术所例证的[例如，聚合酶链反应(PCR)，Mullis等，美国专利4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor，S.等，Proc.Acad.Sci.USA 82：1074(1985)；或链置换扩增(SDA)，Walker，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)]；和3.)文库构建和筛选互补的方法。
例如，通过使用本领域技术人员熟知的方法，使用本发明的核酸片段的全部或一部分作为DNA杂交探针，来从任何目标酵母或真菌筛选文库，可以直接分离编码与本文所述DGAT1和ARE2类似的蛋白或多肽的基因。通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)，可以设计和合成基于本发明的核酸序列的特异性寡核苷酸探针。此外，通过技术人员已知的方法(例如，随机引物DNA标记，切口平移或末端标记技术)，可以将完整序列直接用于合成DNA探针，或使用可得到的体外转录系统，合成RNA探针。另外，可以设计特异性的引物，并用于扩增本发明序列的一部分(或全长)。可以在扩增反应过程中直接标记得到的扩增产物，或在扩增反应后标记，并用作探针，来在适当严格性条件下分离全长DNA片段。
典型地，在PCR-类扩增技术中，引物具有不同的序列，且彼此不互补。根据希望的测试条件，引物的序列应当设计成能提供靶核酸的有效且可靠的复制。PCR引物设计方法是本领域常见的且众所周知的(Thein和Wallace，＂The use of oligonucleotides as specific hybridizationprobes in the Diagnosis of Genetic Disorders＂，in Human GeneticDiseases：A Practical Approach，K.E.Davis Ed.，(1986)pp 33-50，IRL：Herndon，VA；和Rychlik，W.，In Methods in Molecular Biology，White，B.A.Ed.，(1993)Vol.15，pp 31-39，PCR Protocols：Current Methodsand Applications.Humania：Totowa，NJ)。
通常，本发明序列的两个短片段可以用于聚合酶链反应方法中，以从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长核酸片段。聚合酶链反应也可以在克隆的核酸片段文库上进行，其中一个引物的序列源自本发明的核酸片段，且另一个引物的序列利用聚腺苷酸束，其存在于编码微生物基因的mRNA前体的3′末端。
或者，第二个引物序列可以基于源自克隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE方法(Frohman等，PNAS USA 85：8998(1988))，使用PCR扩增转录物中的单个点和3′或5′末端之间的区域的拷贝，产生cDNA。从本发明序列，可以设计朝向3′和5′方向的引物。使用可商业得到的3′RACE或5′RACE系统(例如，BRL，Gaithersburg，MD)，可以分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等，PNAS USA 86：5673(1989)；Loh等，Science 243：217(1989))。
或者，本发明的DGAT1和ARE2序列可以用作鉴别同系物的杂交剂。核酸杂交试验的基本组分包括探针，怀疑含有目标基因或基因片段的样品，和特定杂交方法。本发明的探针典型地是与待测核酸序列互补的单链核酸序列。探针可以与待测核酸序列“互补”。探针长度可以从5个碱基至数十、数千碱基，且取决于要进行的特定试验。典型地，约15碱基至约30碱基的探针长度是合适的。仅仅探针分子的一部分需要与待测核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间的互补性不需要是完全的。杂交会发生在非完全互补的分子之间，结果是，杂交区中的某些碱基部分未与适当的互补碱基配对。
杂交方法是非常确定的。典型地，必须在允许核酸杂交的条件下，混合探针和样品。这包含，在适当浓度和温度条件下，在有无机或有机盐存在下，使探针接触样品。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间可以发生任何可能的杂交。混合物中探针或靶物的浓度，决定着发生杂交所需的时间。探针或靶物浓度越高，所需的杂交温育时间越短。任选地，可以加入促溶剂。促溶剂会通过抑制核酸酶活性，稳定核酸。而且，促溶剂会在室温实现短寡核苷酸探针的灵敏且严格的杂交(Van Ness和Chen，Nucl.Acids Res.19：5143-5151(1991))。适当的促溶剂包括氯化胍，硫氰酸胍，硫氰酸钠，四氯醋酸锂，高氯酸钠，四氯醋酸铷，碘化钾和三氟醋酸铯，以及其它。典型地，促溶剂以约3M的终浓度存在。如果需要，可以向杂交混合物中加入甲酰胺，典型地，30-50％(v/v)。
可以使用多种杂交溶液。典型地，它们包含约20-60％体积(优选30％)的极性有机溶剂。常见的杂交溶液使用约30-50％ v/v甲酰胺，约0.15-1M氯化钠，约0.05-0.1缓冲剂(例如，柠檬酸钠，Tris-HCl，PIPES或HEPES(pH范围约6-9))，约0.05-0.2％去污剂(例如，十二烷基硫酸钠)，或0.5-20mM EDTA，FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500kdal)，聚乙烯吡咯酮(约250-500kdal)和血清白蛋白。在典型的杂交溶液中还包含约0.1-5mg/mL未标记的载体核酸，破碎的核酸DNA(例如，小牛胸腺或鲑精DNA，或酵母RNA)，和任选的约0.5-2％ wt/vol甘氨酸。也可以包含其它添加剂，例如体积排阻剂，包括许多极性的水-溶的或溶涨的试剂(例如，聚乙二醇)，阴离子聚合物(例如，聚丙烯酸脂或聚甲基丙烯酸脂)和阴离子糖聚合物(例如，硫酸葡聚糖)。
核酸杂交适用于许多测定形式。最适当的形式之一是夹心测定形式。夹心测定特别适用于在非变性条件下的杂交。夹心类测定的基本组分是固体支持物。固体支持物具有吸附或共价结合到它上面的固定化的核酸探针，后者未被标记，且与序列的一部分互补。
本发明的核苷酸和推定的氨基酸序列的可用性，会促进DNA表达文库的免疫筛选。可以合成代表本发明的氨基酸序列的一部分的合成肽。这些肽可以用于免疫动物，以产生对包含所述氨基酸序列的肽或蛋白具有特异性的多克隆或单克隆抗体。然后，可以将这些抗体用于筛选DNA表达文库，以分离目标全长DNA克隆(Lerner，R.A.Adv.Immunol.36：1(1984)；Maniatis，同上)。
用于提高异源表达的基因优化
根据在特定宿主生物中需要的特定TAG组成，可能需要修饰本发明的酰基转移酶和/或PUFA生物合成途径酶的表达，以达到各自最佳的转化效率。这样，可以使用许多种技术来提高和/或优化替代宿主中的目标多肽的表达。两种这样的技术包括密码子优化和基因诱变。
密码子优化
正如本领域技术人员所公知的，经常有用的是，修饰编码要在外来宿主中表达的特定多肽的密码子的一部分，使得修饰的多肽利用替代宿主偏好的密码子。使用宿主-优选的密码子，可以显著增强编码所述多肽的外源基因的表达。
通常，可以在特定的目标宿主物种中确定宿主优选的密码子，包括检查蛋白(优选大量表达的蛋白)中的密码子选择，并且确定哪些密码子是以最高频率使用的。然后，可以使用在所述宿主物种中优选的密码子完成或部分合成具有去饱和酶或延伸酶活性的目标多肽的编码序列。也可以合成所述DNA的全部(或部分)，以除去可能出现在转录的mRNA上的任何去稳定化序列或二级结构区。还可以合成所述DNA的全部(或部分)，以将碱基组成改变成在需要的宿主细胞中更优选形式。
因而，例如，可能需要修饰编码具有DGAT1活性的Mortierella多肽的密码子的一部分，以增强基因在解脂耶氏酵母中的表达，酶的底物特异性应当不同于本文公开的解脂耶氏酵母DGAT1。在共同未决的美国专利申请号10/840478(在本文中整体引作参考)中，教导了该特定生物(即，解脂耶氏酵母)的密码子选择和‘ATG’翻译起始密码子周围的共有序列；同样地，也提供了快速合成为解脂耶氏酵母中的表达优化的基因的方法。
诱变
用于合成序列并且将这些序列组合在一起的方法在文献中业已完善。例如，体外诱变和选择，定位诱变，易错PCR(Melnikov等，NucleicAcids Research，27(4)：1056-1062(February 15，1999))，＂基因改组＂或其它方法可用于获得天然存在的酰基转移酶基因的突变。这会允许体内地产生具有酰基转移酶活性的多肽，它们具有更多希望的在宿主细胞中起作用的物理和动力学参数(例如更长的半衰期或更高的从脂肪酸合成TAG的速度)。
如果需要，通过常规诱变、所得到的突变多肽的表达以及确定它们的活性，可以确定对酶活性重要的DGAT1或ARE2多肽区。突变体可以包括缺失，插入和点突变，或它们的组合。典型的功能性分析始于缺失诱变，以确定功能所需要的蛋白的N-末端和C-末端限制，然后进行内部缺失、插入或点突变，进一步确定功能所需要的区。还可以使用其它技术，如盒诱变或完全合成。例如，缺失诱变是通过使用核酸外切酶依次去掉5′或3′编码区实现的。可以获得用于这种技术的试剂盒。在缺失之后，在5′或3′缺失之后通过将包括起始或终止密码子的寡核苷酸分别连接在缺失的编码区上获得所述编码区。或者，通过各种方法，包括定位诱变、诱变PCR，或通过连接到在现有限制位点消化过的DNA，将编码起始或终止密码子的寡核苷酸插入所述编码区。内部缺失同样可以通过多种方法实现，包括使用DNA上的现有限制位点，通过使用诱变引物进行定位诱变或诱变PCR。插入是通过诸如接头-扫描诱变，定位诱变或诱变PCR的方法完成的。点突变是通过诸如定位诱变或诱变PCR的技术完成的。
还可将化学诱变用于鉴定对活性重要的酰基转移酶多肽区。表达突变的构建体，并且测定所得到的改变了的蛋白作为酰基转移酶的能力。这种结构-功能分析，可以确定哪些区可以缺失，哪些区能够承受插入，以及哪些点突变使得突变蛋白能够以基本上与天然(或密码子优化的)的酰基转移酶相同的方式起作用。
所有这样的突变蛋白和编码它们的核苷酸序列(它们源自本文所述的DGAT1和ARE2基因)都在本发明的范围内。
脂肪酸和三酰基甘油的微生物生产
与从诸如鱼或植物的天然来源中纯化相比，脂肪酸和TAG的微生物生产具有若干优点。例如：
1.)已知与高等生物相比，很多微生物具有大大简化了的油类组成，使得对需要成分的纯化更容易；
2.)微生物生产不容易出现由外部因素导致的波动，如天气和食物供应；
3.)微生物生产的油基本上不会受到环境污染物的污染；和，
4.)微生物油类生产可以通过控制培养条件操纵，特别是通过提供用于微生物表达的酶的特定底物，或通过添加化合物或通过遗传工程手段抑制不希望的生物化学途径。
关于ω-3和/或ω-6脂肪酸(更具体地，和含有那些PUFA的TAG)的生产，存在其它优点，因为微生物可以提供脂肪酸，尤其是可以具有特定用途的形式；并且，重组微生物通过在宿主中提供新的生物合成途径或通过抑制不希望的途径，从而提高需要的PUFA或其缀合形式的水平，并降低不需要的PUFA的水平，会提供改变天然存在的微生物脂肪酸的能力。
因而，关于本发明酰基转移酶基因序列的知识，可用于操纵含油酵母(特别是解脂耶氏酵母)中的脂肪酸生物合成和积累。这可能需要在脂肪酸或TAG生物合成途径内的直接代谢工程或另外操纵将碳贡献给脂肪酸生物合成途径的途径。可用于操纵生物化学途径的方法为本领域技术人员所公知。
用于正调节影响含油酵母的脂肪酸合成和油积累的基因和生物合 成途径的代谢工程
预见到，导入在适当启动子控制下的编码本文所述酰基转移酶的嵌合基因，会导致加强的脂肪酸向贮藏TAG的转化。这样，本发明包括增加含油酵母的TAG含量的方法，其包含在生产脂肪酸的转化的含油酵母宿主细胞中表达至少一种本发明的酰基转移酶，使得脂肪酸向TAG库转化。
可以将额外拷贝的酰基转移酶基因(例如，DGAT1，ARE2)导入宿主，提高脂肪酸向TAG部分的转化。通过使用更强的启动子(调控型的或组成型的)造成增强的表达，通过从mRNA或编码的蛋白上去掉/删除去稳定化序列，或者通过向mRNA增加稳定化序列(U.S.4,910,141)，也可以在转录水平上加强基因的表达。增强异源基因表达的另一个途径是，通过用能在选定的宿主微生物中优化基因表达的密码子替换天然基因的密码子，提高所编码的mRNA的翻译效率。
在一个具体的实施方案中，本发明包括提高含油酵母的TAG的ω-3和/或ω-6脂肪酸含量的方法，因为可以向生物中导入编码ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成必需的每种酶的表达盒(因为在这些生物中天然产生的PUFA限于18:2(即，LA)，和不常见的18:3(即，ALA)脂肪酸)。因而，所述方法包含：
a)提供转化的含油酵母宿主细胞，其具有编码功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径和本发明的至少一种酰基转移酶的基因；
b)在有可发酵的碳底物存在下，培养步骤(a)的酵母细胞，从而表达ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径和酰基转移酶的基因，生产ω-3和/或ω-6脂肪酸，并将ω-3和/或ω-6脂肪酸转化成TAG。
根据脂肪酸底物和转化进宿主细胞的ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的特定基因，可以生产许多种PUFA产物(在它们转化成TAG之前)。这样，可以直接地(其中将脂肪酸底物直接转化成目标脂肪酸产物，没有中间步骤或途径中间体)或间接地(其中可以联合使用多个编码PUFA生物合成途径的基因，从而发生一系列反应，生产目标PUFA)生产目标脂肪酸产物。更具体地，例如，可能希望用表达盒转化含油酵母，所述表达盒包含Δ12去饱和酶，Δ6去饱和酶，延伸酶，Δ5去饱和酶和Δ17去饱和酶，以过量生产EPA。如本领域技术人员熟知的，可以使用下面的酶活性的多种其它组合，与本文所述酰基转移酶一起在宿主中表达：Δ15去饱和酶，Δ4去饱和酶，Δ5去饱和酶，Δ6去饱和酶，Δ17去饱和酶，Δ9去饱和酶，Δ8去饱和酶和/或延伸酶(参见图2)。在特定表达盒中包含的特定基因取决于宿主细胞(和它的PUFA谱和/或去饱和酶谱)、底物的利用度和目标末端产物。
因而，在本发明的上下文中，通过上述方法中的任一种，可以调控TAG生物合成途径的表达。例如，本发明提供了编码脂肪酸生物合成途径中的关键酶的基因，其会导致TAG的贮藏。这些基因编码DGAT1和ARE2酶。特别有用的是，使用宿主生物的代谢工程的多种方式，修饰这些基因在含油酵母中的表达水平，使TAG的生产和积累最大化。在优选的实施方案中，这些基因的表达水平的修饰以及ω-3/ω-6生物合成基因的表达，可以用于使优选的PUFA的生产和在TAG库中的积累最大化。
用于负调节影响含油酵母的脂肪酸合成和油积累的不希望的基因 和生物合成途径的代谢工程
在有些实施方案中，可能有用的是，基于本文所述的完整序列、这些完整序列的互补序列、这些序列的主要部分、源自它们的密码子-优化的酰基转移酶、和与它们基本上同源的那些序列，破坏或灭活宿主生物的天然DGAT1和/或ARE2。
为了基因破坏，将外源DNA片段(通常是选择标记基因)插入要破坏的结构基因，破坏它的编码序列，并因此功能性灭活所述基因。将破坏盒转化入宿主细胞，会导致通过同源重组用无功能的破坏基因替代功能性天然基因(参见，例如：Hamilton等，J.Bacteriol.171：4617-4622(1989)；Balbas等Gene 136：211-213(1993)；Gueldener等Nucleic Acids Res.24：2519-2524(1996)；和Smith等Methods Mol.Cell.Biol.5：270-277(1996))。
当靶基因的序列已知时，反义技术是负调节基因的另一种方法。为了实现这一目的，克隆了来自所需基因的核酸片段，并且可操作地与启动子连接，使得RNA的反义链能够转录。然后将该构建体导入宿主细胞，并且生产RNA的反义链。反义RNA能通过抑制编码目标蛋白的mRNA的积累，抑制基因表达。本领域技术人员可以理解的是，特殊考虑与使用反义技术相关，以便减弱特定基因的表达。例如，反义基因的适当水平的表达可能需要使用不同的嵌合基因，其中采用本领域技术人员所公知的不同的调控元件。
尽管当序列已知时，定向基因破坏和反义技术提供了负调节基因的有效方法，业已开发了不是基于序列的其它低特异性的方法。例如，细胞可以暴露于UV辐射，然后筛选需要的表型。用化学试剂进行的诱变同样能有效产生突变体，并且通常使用的物质包括能影响非复制DNA的化学物质(例如，HNO2和NH2OH)，以及能影响复制DNA的试剂(例如，吖啶染料，特别是导致移码突变)。使用辐射或化学试剂产生突变体的特定方法在现有技术有大量报导。例如，参见：Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，2nd ed.(1989)Sinauer Associates：Sunderland，MA；或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227(1992)。
基因破坏的另一种非特异性方法是使用可转座元件或转座子。转座子是遗传元件，它能随机地插入DNA，但是随后可以根据序列回收，确定是否发生了插入。体内和体外转座转座方法是公知的。这两种方法涉及组合使用可转座元件和转座酶。当可转座元件或转座子在存在转座酶的条件下与核酸片段接触时，可转座元件能随机地插入所述核酸片段。这种技术可用于随机诱变，并且用于基因分离，因为受到破坏的基因可以根据可转座元件的序列鉴定。用于体外转座的试剂盒可以通过商业渠道获得[例如，参见：1.)The Primer Island TranspositionKit，可以从Perkin Elmer Applied Biosystems获得，Branchburg，NJ，基于酵母Ty1元件；2.)The Genome Priming System，可以从NewEngland Biolabs获得，Beverly，MA，基于细菌转座子Tn7；和3.)EZ：TN转座子插入系统，可以从Epicentre Technologies获得，Madison，WI，基于Tn5细菌转座因子]。
因而，在本发明的上下文中，可能有用的是，破坏本发明的酰基转移酶基因之一。例如，可能必须破坏减少现有脂肪酸库和/或水解TAG来调节(和/或最大化)TAG积累的基因和途径。
表达系统，盒和载体
本发明所披露的序列的基因和基因产物可以在异源微生物宿主细胞中生产，特别是在含油酵母(例如，解脂耶氏酵母)的细胞中生产。在重组微生物宿主中的表达，可用于各种脂肪酸向TAG的转化。
含有能指导外源蛋白高水平表达的调控序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员所熟知的。它们都可用于构建嵌合基因，生产本发明的酰基转移酶序列的基因产物。然后可以通过转化将这些嵌合基因导入合适的微生物，提供编码酶的高水平表达。
用于转化合适的宿主细胞的载体或DNA盒为本领域所公知。存在于所述构建体中的序列的具体选择取决于需要的表达产物(同上)、宿主细胞的性质以及推荐的分离转化细胞与未转化细胞的方式。不过，通常，所述载体或盒包括指导相关基因转录和翻译的序列，选择标记，和使得它能够自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括所述基因的5′区，它控制转录起始，和DNA片段的3′区，它控制转录终止。最优选地，两个控制区都来自转化的宿主细胞的基因，不过，可以理解的是，所述控制区不一定来自被选择用作生产宿主的特定物种的天然基因。
可用于在需要的宿主细胞中驱动本发明的ORF的表达的起始控制区或启动子是多种多样的，并且为本领域技术人员所熟知。实际上，能够指导这些基因在选定的宿主细胞中表达的任何启动子都适合本发明。在宿主细胞中的表达能够以瞬时或稳定的方式进行。瞬时表达可以通过诱导可操作地连接在目标基因上的可调控启动子的活性而实现。稳定表达可以通过使用可操作地与目标基因连接的组成型启动子而实现。例如，当宿主细胞是酵母时，提供能够在酵母细胞中起作用的转录和翻译区，特别是来自宿主物种的那些。例如，转录起始调控区可以从以下渠道获得：1.)糖酵解途径上的基因，如醇脱氢酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(参见美国专利申请号10/869630，其在这里引作参考)，磷酸甘油酸变位酶(参见美国专利申请号10/869630)，果糖二磷酸醛缩酶(参见美国专利申请号60/519971，其在这里引作参考)，磷酸葡萄糖异构酶，磷酸甘油酸激酶，甘油-3-磷酸O-酰基转移酶(参见美国专利申请号60/610060)，等；或2.)可调控的基因，如酸性磷酸酶，乳糖酶，金属硫蛋白，葡糖淀粉酶，翻译延伸因子EF1-α(TEF)蛋白(U.S.6,265,185)，核糖体蛋白S7(U.S.6,265,185)等。可以使用多种调控序列中的任意一种，这取决于是需要组成型转录还是诱导型转录，启动子在表达目标ORF方面的效率，以及构建的方便性等。
已经发现，翻译起始密码子′ATG′周围的核苷酸序列会影响酵母细胞中的表达。如果目标多肽在酵母中的表达较差，可以将外源基因的核苷酸序列修饰成包含有效的酵母翻译起始序列，以得到最佳的基因表达。为了在酵母中表达，这可以通过定位诱变无效表达的基因来实现，其中将它在框架内融合到内源酵母基因上，优选高表达基因。或者，可以确定宿主的共有翻译起始序列，并将该序列构建进异源基因，使它们在目标宿主中最佳表达(参见，例如，美国专利申请号10/840478，关于适用于解脂耶氏酵母的具体教导)。
终止区可源于获得起始区的基因的3′区或不同基因。大量终止区是已知的，并且能在多种宿主中发挥令人满意的作用(当在与产生它们的相同和不同的属和种中使用时)。终止区通常在更大程度上是根据方便性选择的，而不是因为任何特殊特性。优选地，终止区源于酵母基因，特别是糖酵母属，裂殖酵母属，假丝酵母属，耶氏酵母属或克罗维酵母属。同样已知编码γ-干扰素和α-2干扰素的哺乳动物基因的3′-区在酵母中起作用。终止控制区还可以来自优选宿主天然具有的各种基因。任选地，终止位点可以是非必需的；不过，最优选地具有。
正如技术人员所了解的，仅仅将基因插入克隆载体，不能确保它能够在需要的水平上成功地表达。根据对高表达速度的需要，业已通过操纵多种不同的遗传因子产生了多种特化的表达载体，这些遗传因子能控制来自宿主细胞的转录、翻译、蛋白稳定性、含氧极限、以及分泌。更具体地讲，业已对某些分子特征进行了操纵，以控制基因表达，包括：1.)相关转录启动子和终止子序列的性质；2.)克隆基因的拷贝数量，以及所述基因是质粒携带的或者是整合到宿主细胞的基因组上的；3.)合成的外源蛋白的最终细胞定位；4.)宿主生物的翻译效率；5.)克隆的基因蛋白在宿主细胞中的内在稳定性；和6.)克隆的基因内的密码子选择，使得它的频率达到宿主细胞优选的密码子选择的频率。上述每一种类型的修饰包括在本发明中，作为进一步优化酰基转移酶的表达的手段。
用于重组表达酰基转移酶的优选微生物宿主
用于表达本发明的DGAT1和ARE2基因和核酸片段的宿主细胞包括微生物宿主，其在大范围的温度和pH值下，在多种饲料上生长，所述饲料包括简单的或复杂的碳水化合物，有机酸和醇，和/或烃。尽管在本发明中所披露的基因已经为在含油酵母(特别是解脂耶氏酵母)中的表达进行了分离，预见到，由于转录、翻译和蛋白生物合成细胞器是高度保守的，任何细菌、酵母、藻类和/或丝状真菌都是适合表达本发明的核酸片段的宿主。
优选的微生物宿主是含油生物，例如含油酵母。这些含油生物可天然地进行油类合成和积累，其中总含油量可以占大于约25％细胞干重，更优选地大于约30％细胞干重，且最优选地大于约40％细胞干重。另外，存在使用这些生物生产PUFA的基础，参见共同未决的美国专利申请号10/840579，在本文中整体引作参考。通常被确定为含油酵母的属包括，但不限于：耶氏酵母属，假丝酵母属，红酵母属，红冬孢属，隐球酵母属，丝孢酵母属和油脂酵母属。更具体地讲，典型的油类合成酵母包括：类酵母红冬孢，斯达氏油脂酵母，产油油脂酵母，拉可夫氏假丝酵母，铁红假丝酵母，热带假丝酵母，产朊假丝酵母，茁芽丝孢酵母，皮状丝孢酵母，胶粘红酵母，禾木科红酵母，和解脂耶氏酵母(以前被划分为解脂假丝酵母)。
最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；而在其它实施方案中，最优选的是解脂耶氏酵母菌株，被命名为ATCC #20362，ATCC #8862，ATCC#18944，ATCC #76982，ATCC #90812和/或LGAM S(7)1(PapanikolaouS.，和Aggelis G.，Bioresour.Technol.82(1)：43-9(2002))。
微生物宿主的转化
一旦获得了适合在含油酵母中表达的编码多肽的DNA，将它放入能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或者将它直接整合到宿主细胞的基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地进行，或者可以通过使用含有与宿主基因组具有足够同源性以靶定宿主基因座内的重组区域的构建体靶定。当所述构建体被靶定于内源基因座时，转录和翻译调控区的全部或某些可以通过内源基因座提供。
当两个或两个以上的基因由独立的复制载体表达时，希望每一个载体具有不同的选择方式，并且应当缺少与其它构建体的同源性，以保持稳定表达，并且防止构建体之间的元件的重新分类。对调控区、选择方式和导入的构建体的繁殖方法的明智的选择，可以通过实验确定，所有导入的基因在需要的水平上表达，以提供需要产物的合成。
可以通过任何标准技术，将包括目标基因的构建体导入宿主细胞。所述技术包括转化(例如，乙酸锂转化[Methods in Enzymology，194：186-187(1991)])，原生质体融合，bolistic冲击，电穿孔，显微注射，或能够将目标基因导入宿主细胞的任何其它方法。可用于含油酵母(即，解脂耶氏酵母)的更具体的技术包括美国专利号4,880,741和5,071,764和Chen，D.C.等(Appl MicrobiolBiotechnol.48(2)：232-235(1997))。
为了方便起见，已通过任何方法操纵以摄入DNA序列(例如，表达盒)的宿主细胞在本文中被称作＂转化的＂或＂重组的＂。转化的宿主具有至少一个拷贝的表达构建体，并且可以具有两个或两个以上拷贝，这取决于所述基因是整合在所述基因组上，扩增的，或者存在于具有多个拷贝的染色体外元件上。转化的宿主细胞可以通过选择包含在导入的构建体上的标记而鉴定。或者，可以将独立的标记构建体与需要的构建体共同转化，因为很多转化技术能将很多DNA分子导入宿主细胞。通常，选择转化的宿主在选择性培养基上生长的能力。选择性培养基可以掺入抗生素或缺少未转化的宿主生长所需要的因子，如养分或生长因子。导入的标记基因可以产生抗生素抗性，或者编码必须的生长因子或酶，当它在转化的宿主中表达时能够在选择培养基上生长。当所表达的标记蛋白可以直接或间接检测时，还可以进行转化宿主的选择。所述标记蛋白可以单独表达，或者作为与另一种蛋白的融合体形式表达。标记蛋白可以通过以下方法检测：1.)它的酶促活性(例如，β-半乳糖苷酶可以将底物X-gal[5-溴-4-氯-3-吲哚基--D-半乳吡喃糖苷]转化成有颜色的产物；荧光素酶可以将荧光素转化成发光产物)；或2.)它的产生光或修饰特征(例如，Aequorea victoria的绿色荧光蛋白在用蓝色光线照射时会发出荧光)。或者，可将抗生素用于检测存在于例如目标蛋白上的标记蛋白或分子量标记。例如，能表达标记蛋白或标记的细胞可以肉眼筛选，或者通过诸如FACS的技术或使用抗生素淘选。为了选择酵母转化体，可以使用能够在酵母中起作用的任何标记。理想的是，对卡那霉素，潮霉素和氨基糖苷G418的抗性是目标，以及在缺少尿嘧啶或亮氨酸的培养基上生产的能力。
在转化之后，适合本发明序列的基因产物(和任选地，在宿主细胞中表达的其它PUFA酶)的底物，可以由所述宿主天然地或转基因地生产，或者可以外源提供它们。
三酰基甘油生物合成和积累的发酵方法
在能优化脂肪酸生物合成基因和酰基转移酶基因的活性的条件下，培养转化的微生物宿主细胞。这会产生最大的和最经济的脂肪酸产量，后者有可以转化成贮藏TAG。通常，可以优化的培养基条件包括碳源的类型和量，氮源的类型和量，碳-氮的比例，氧气水平，生长温度，pH，生物量生产期的长度，油积累期的长度，以及细胞收获时间。目标微生物、如含油酵母生长在复杂培养基(例如，酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养液(YPD))或确定的基本培养基中，后者缺少生长所必需的成分，从而强制选择目标表达盒(例如，Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))。
本发明的发酵培养基必须包括合适的碳源。合适的碳源包括，但不限于：单糖(例如，葡萄糖，果糖)，二糖(例如，乳糖，蔗糖)，寡糖，多糖(例如，淀粉，纤维素或它们的混合物)，糖醇(例如，甘油)或可更新饲料的混合物(例如，干酪乳清渗透物，玉米浆，甜菜糖浆，大麦芽)。另外，碳源可以包括链烷，脂肪酸，脂肪酸酯，甘油单酯，甘油二酯，甘油三酯，磷脂，和脂肪酸的各种商业来源，包括植物油(例如，大豆油)和动物脂肪。另外，碳源可以包括一-碳源(例如，二氧化碳，甲醇，甲醛，甲酸和含碳胺)，业已证实了其转化成关键生物化学中间产物的代谢转化。因此，预计，用于本发明的碳源可以包括多种含碳底物，并且仅仅受宿主生物的选择的限制。尽管上述所有碳源及其混合物预计都适合本发明，优选的碳源是糖和/或脂肪酸。最优选的是葡萄糖和/或含有10-22个碳的脂肪酸。
氮可以由无机(例如，(NH4)2SO4)或有机来源(例如，尿素或谷氨酸)提供。除了合适的碳和氮源之外，发酵培养基必须还包括合适的矿物质，盐，辅因子，缓冲液，维生素，和本领域技术人员已知的适合微生物生长，并且促进PUFA生产所需要的酶促途径的其它成分。特别关注若干金属离子(例如，Mn+2，Co+2，Zn+2，Mg+2)，它们能促进脂类和PUFA的合成(Nakahara，T.等，Ind.Appl.Single CellOils，D.J.Kyle and R.Colin，eds.pp 61-97(1992))。
本发明的优选的生长培养基是常见的商业制备的培养基，如酵母Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。其它确定的或合成的生长培养基也可以使用，并且适合特定微生物生长的培养基是微生物学或发酵科学领域的技术人员所公知的。用于发酵的合适的pH范围通常为约pH 4.0-pH 8.0，其中pH 5.5-pH 7.0是起始生长条件的优选范围。发酵可以在需氧或厌氧条件下进行，其中，微需氧条件是优选的。
通常，高水平脂肪酸和TAG在含油酵母细胞中的积累，需要两个阶段的过程，因为在脂肪的生长和合成/贮藏之间的代谢状态必须是＂平衡的＂。因此，最优选地，需要两个阶段的发酵过程在含油酵母中生产油。在该方法中，发酵的第一阶段被用于制备和积累细胞物质，并且以快速细胞生长和细胞分裂为特征。在发酵的第二阶段，优选在培养物中建立氮剥夺条件，促进高水平的脂类积累。这种氮剥夺的作用是降低细胞中AMP的有效浓度，从而减弱线粒体的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶的活性。当出现这种情况时，将积累柠檬酸，因此在细胞质中形成了乙酰-CoA的丰富资源，并且启动了脂肪酸合成。因此，这一阶段以细胞分裂终止，随后是脂肪酸的合成和TAG的积累为特征。
尽管细胞通常生长在约30℃，某些研究业已在较低温度下增加了不饱和脂肪酸的合成(Yongmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.57：419-25(1991))。根据工艺的经济学，这种温度偏移可能在两个阶段的发酵的第一阶段之后发生，此时，业已出现了大量的微生物生长。
预计，可以采用多种发酵工艺设计，其中，使用本发明的酰基转移酶基因商业化生产脂肪酸和TAG是理想的。例如，用重组微生物宿主商业生产含有PUFA的TAG，可以通过分批发酵，补料-分批发酵或连续发酵工艺生产。
分批发酵工艺是封闭的系统，其中，培养基组成是在工艺开始时确定的，并且不再进行超出在工艺过程中维持pH和氧气含量需要的进一步补充。因此，在培养过程开始时，用需要的微生物接种所述培养基，并且可以在不向培养基中添加其它来源(即，碳和氮源)条件下具有生长或代谢活性。在分批发酵工艺中，该系统的代谢物和生物量组成经常地改变，直到培养终止。在典型的分批发酵工艺中，细胞从停滞阶段发展到高速生长的对数期，并最终达到静止期，在这里，生长速度减弱或终止。在不处理的条件下，静止阶段的细胞会最终死亡。标准的分批发酵工艺的变化是补料-分批发酵工艺，其中，在发酵过程中将碳源连续地添加到发酵罐中。补料-分批发酵工艺同样适用于本发明。当代谢物抑制倾向于抑制细胞代谢或希望在任何时间在培养基中具有有限数量的来源时，补料-分批工艺是有用的。测定补料-分批系统中的碳源是困难的，因此，可以根据可测定因子的变化估算，如pH，溶解氧和废气(例如，CO2)的分压。分批和补料-分批培养方法是本领域技术人员所公知的和熟悉的，并且其例子可以参见以下文献：Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology.2nd ed.，(1989)Sinauer Associates：Sunderland，MA；或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227(1992)，在此引作参考。
利用本发明的基因商业化生产脂肪酸的方法还可以通过连续发酵工艺实现，其中，将确定成分的培养基连续添加到生物反应器中，同时取出等量的培养物体积，用于产物回收。连续培养通常将细胞保持在恒定细胞密度的对数生长期。连续或半连续培养方法能够调节会影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或多种因素中的任意一种。例如，一种方法可以限制碳源，并且允许所有其它参数适当地代谢。在其它系统中，可以连续地改变影响生长的多种因素，同时保持通过培养基浊度测定的细胞浓度恒定。连续系统试图保持稳态生长，因此，细胞生长速度必须与由于将培养基从培养物中排出而导致的细胞减少。调节连续培养工艺的营养成分和生长因子的方法，以及用于增加生产形成速度的技术为工业微生物学领域所熟知，并且上文提到的Brock详细披露了多种方法。
脂肪酸的纯化
脂肪酸，包括PUFA，可以作为游离脂肪酸形式出现在宿主微生物中，或者以诸如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂的酯化形式出现，并且可以通过本领域所熟知的多种方法从宿主细胞中提取。酵母脂类的提取技术、品质分析和可接受性标准的一种概述是以下文献：Z.Jacobs(Critical Reviews in Biotechnology 12(5/6)：463-491(1992))。有关下游加工的简单概述还可以参见A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.45：271-312(1997))。
通常，纯化脂肪酸(包括PUFA)的方法可以包括用有机溶剂萃取，超声波处理，超临界流体萃取(例如，使用二氧化碳)，皂化和物理方法，如压力，或它们的组合。特别感兴趣的是用甲醇和氯仿在存在水的条件下萃取(E.G.，Bligh & W.J.Dyer，Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917(1959))。如果需要，可以将含水层酸化，使带负电荷的部分质子化，并因此增加了想得到的产物向有机层中的分配。在萃取之后，可以通过在氮气流下蒸发除去有机溶剂。当以缀合形式分离时，可以对所述产物进行酶促或化学裂解，释放游离的脂肪酸或目标更低复杂性的缀合物，并且然后可以进行进一步的操纵，生产需要的最终产物。理想的是，用氢氧化钾裂解脂肪酸的缀合形式。
如果需要进一步纯化，可以采用标准方法。所述方法可以包括萃取，用尿素处理，分级结晶化，HPLC，分级蒸馏，硅胶层析，高速离心或蒸馏，或这些技术的组合。对诸如酸或烯基的活性基团的保护，可以在任何步骤通过已知技术(例如，烷基化，离子化)完成。所使用的方法包括脂肪酸甲基化，产生甲酯。类似地，可以在任何步骤除去保护基团。理想的是，纯化含有GLA，STA，ARA，DHA和EPA的级份可以通过用尿素处理和/或分级蒸馏实现。
优选实施方案的说明
本文所披露的研究工作的最终目的是开发含油酵母，它能积累富含ω-3和/或ω-6 PUFA的TAG。为此，必须鉴定酰基转移酶，它能够在含油酵母中有效地起作用，以便能够合成优选的TAG，并且在贮藏脂质库中积累。更具体地，修饰这些酰基转移酶的表达水平，会增加脂肪酸(和，更具体地，PUFA)向TAG的转化。因而，为了操纵掺入在宿主细胞中生产的TAG部分中的ω-3/ω-6 PUFA的量，必需鉴别有效的酰基转移酶。
在本发明中，申请人已经从解脂耶氏酵母分离和克隆了编码DGAT1和ARE2的基因。该工作是在下述令人惊奇的发现下完成的，即解脂耶氏酵母DGAT2和PDAT仅仅部分地负责油生物合成(基于分析双敲除的突变体；参见共同未决的美国专利申请号10/882760)。本文证实了DGAT1基因的活性，这基于耶氏酵母菌株的低含油量(总脂肪酸作为％干细胞重)，其中已经通过同源重组进行靶向基因替换，破坏了天然DGAT1(实施例9)。另外，预期本发明的DGAT1和ARE2基因的超量表达会增加油含量(总脂肪酸作为％干细胞重)，这基于得到的结果，其中超量表达耶氏酵母DGAT1(实施例12)。
鉴别解脂耶氏酵母DGAT1(SEQ ID NO：13和14)后，搜索专有的高山被孢霉cDNA序列数据库，以鉴别定向进化同源基因。这会导致DGAT1同系物的鉴别，从而测定其完全核苷酸序列(SEQ ID NO：17)。基于这两个新序列，申请人然后能鉴别一套独特的真菌DGAT1定向进化同源物，其参与TAG的合成。更具体地，使用本领域技术人员熟知的BLAST算法，基于耶氏酵母和被孢霉属DNA序列与GenBank数据库的对比，已经从粗糙链孢霉(SEQ ID NO：19)，玉米赤霉PH-1(SEQ IDNO：20)，Magnaporthe grisea(SEQ ID NO：21)和构巢曲霉(SEQ ID NO：22)中鉴别出这些DGAT1。
但是，当与来自小鼠(SEQ ID NO：169)、大豆(SEQ ID NO：170)、拟南芥(SEQ ID NO：171)、稻(SEQ ID NO：172)、紫苏属(SEQ ID NO：173)和小麦(SEQ ID NO：174)的DGAT1序列相比对时，这6个DGAT1序列的分析，会揭示真菌特异性的且上述非真菌生物的DGAT1中缺少的独特特征(即，真菌基序#1-8，在本文中称作SEQ ID NO：23-30)。而且，在更宽的上下文中，还发现了在DGAT1酶中普遍存在的共有基序(SEQ IDNO：31-37)。就SEQ ID NO：14而言，这些独特的真菌和通用保守域是在氨基酸97-105，278-284，334-341，364-374，418-424，415-424，456-466和513-519之间。如本领域技术人员熟知的，这些基序因而可以是DGAT1诊断性的，且允许快速鉴别新DGAT1。本文所述的基序可以与Lardizabal等(US 04/0107459 A1)最近描述的‘FxxPxYR’基序(SEQ ID NO：38)区分开，后者优选地用于鉴别真菌起源的DGAT2。
申请人的结论是，这些DGAT1和ARE2酰基转移酶基因可以用于在各种微生物宿主中的表达，尤其是含油酵母(例如，解脂耶氏酵母)中的超量表达。可以产生其它益处，因为酰基转移酶的表达也可以置于对天然基因没有调节限制的强组成型或调节型启动子的控制下。
实施例
本发明还确定了以下实施例。应当理解的是，这些实施例尽管指明了本发明的优选实施方案，但是仅作为说明形式提供。通过上述讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的实质性特征，并且，在不超出本发明的构思和范围的前提下，可以对本发明进行各种改变和改进，适应各种用途和条件。
一般方法
用于实施例中的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知的，并且披露于以下文献中：1.)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2.)T.J.Silhavy，M.L.Bennan，and L.W.Enquist，Experiments withGene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；和3.)Ausubel，F.M.等，Current Protocols in MolecularBiology，published by Greene Publishing Assoc.and Wiley-interscience(1987)。
适合微生物培养物维持和生长的材料和方法为本领域所公知。适合在以下实施例中使用的技术可以参见以下文献：Manual of Methodsfor General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg and G.Briggs Philips，Eds)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或参见Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbookof Industrial Microbiology，2nd ed.，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)。用于生长和保持微生物细胞的所有试剂，限制酶和材料都是从Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，DIFCO Laboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，或Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO)获得的，除非另有说明。
大肠杆菌TOP10细胞和大肠杆菌electromax DH10B细胞是从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得的。大肠杆菌DH5α的最大效率感受态细胞是从GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)获得的。大肠杆菌(XL1-Blue)感受态细胞是从Stratagene公司(San Diego，CA)购买的。大肠杆菌菌株通常生长在37℃在Luria Bertani(LB)平板上。按照标准方法(Sambrook等，同上)进行一般分子克隆。寡核苷酸是由Sigma-Genosys(Spring，TX)合成的。
使用在聚合酶生产商推荐的缓冲液中的DNA聚合酶，在热循环仪中进行所有聚合酶链反应(PCR)。除非另有说明，如下进行扩增：在95℃初步变性1min，然后是30个变性循环：在95℃ 30sec，在55℃退火1min，和在72℃延伸1min。进行在72℃ 10min的最后延伸循环，然后在4℃终止反应。将PCR产物克隆进Promega’s pGEM-T-easy载体(Madison，WI)，除非另有说明。
使用载体和插入片段特异性的引物的组合，使用染料终止子技术(U.S.5,366,860；EP 272,007)，在ABI自动测序仪上产生DNA序列。在Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)中进行序列编辑。所有序列代表在两个方向覆盖至少2次。使用DNASTAR软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，进行基因序列对比。通过DNASTAR的Megalign程序，使用Clustal W，利用下面的参数，测定这些蛋白之间的同一性百分比：gap penalty＝10，gap length penalty＝0.2，delaydivergent seqs(％)＝30，DNA transition weight＝0.5和Gonnet系列的蛋白重量矩阵。
缩写的含义如下：＂sec＂表示秒，＂min＂表示分钟，＂h＂表示小时，＂d＂表示天，＂μL＂表示微升，＂mL＂表示毫升，＂L＂表示升，＂μM＂表示微摩尔浓度，＂mM＂表示毫摩尔浓度，＂M＂表示摩尔浓度，＂mmol＂毫摩尔，＂μmole＂表示微摩尔，＂g＂表示克，＂μg＂表示微克，＂ng＂表示纳克，＂U＂表示单位，＂bp＂表示碱基对，而＂kB＂表示千碱基。
解脂耶氏酵母的转化和培养
解脂耶氏酵母菌株ATCC #20362，#76982和#90812购自美国典型培养物中心(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株通常生长在28℃、YPD琼脂上(1％酵母提取物，2％细菌用蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)。
按照Chen，D.C.等(Appl.Microbiol Biotechnol.48(2)：232-235(1997))的方法，进行解脂耶氏酵母的转化。简单地讲，将耶氏酵母在YPD平板上划线，并且在30℃生长约18小时。将几个大环的细胞从平板上刮下，并且重新悬浮在1mL转化缓冲液中，该缓冲液包括：2.25mL的50％ PEG，平均分子量3350；0.125mL的2M乙酸锂，pH 6.0；0.125mL的2M DTT；和50μg的剪切的鲑精DNA。然后，在100μl的重新悬浮的细胞中温育约500ng线性化的质粒DNA，并且在39℃保持1小时，以15分钟的间隔进行涡旋混合。将细胞涂布到选择培养基平板上，并且在30℃保持2-3天。
为了选择转化体，通常使用基本培养基(“MM”)；of MM的组成如下：不含硫酸铵或氨基酸的0.17％酵母氮碱基(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)，2％葡萄糖，0.1％脯氨酸，pH 6.1。在适当时，添加腺嘌呤、亮氨酸、赖氨酸和/或尿嘧啶，至终浓度0.01％(从而产生“MMA”，“MMLe”，“MMLy”和“MMU”选择培养基，各自用20g/L琼脂制备)。
或者，在5-氟乳清酸(“FOA”；即5-氟尿嘧啶-6-甲酸单水合物)选择培养基上选择转化体，所述培养基包含：不含硫酸铵或氨基酸的0.17％酵母氮碱基(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)，2％葡萄糖，0.1％脯氨酸，75mg/L尿嘧啶，75mg/L尿苷，900mg/L FOA(Zymo Research Corp.，Orange，CA)和20g/L琼脂。
为了促进含油条件，如下制备高葡萄糖培养基(“HGM”)：14g/LKH2PO4，4g/LK2HPO4，2g/L MgSO4·7H2O，80g/L葡萄糖(pH 6.5)。
解脂耶氏酵母的脂肪酸分析
为了脂肪酸分析，离心收集细胞，并如Bligh，E.G.& Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917(1959))所述提取脂类。通过甲氧基钠对脂类提取物的酯交换(Roughan，G.，和Nishida I.Arch Biochem Biophys.276(1)：38-46(1990))，制备脂肪酸甲基酯，并随后用配备30-m X 0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。烘箱温度以3.5℃/min，从170℃(维持25min)升至185℃。
为了直接的碱基酯交换，收获耶氏酵母培养物(3mL)，在蒸馏水中洗涤一次，在真空下在Speed-Vac中干燥5-10min。将甲氧基钠(100μl，1％)加入样品，然后旋转样品，并摇动20min。加入3滴1M NaCl和400μl己烷后，搅拌样品并离心。取出上层，并通过上述的GC进行分析。
实施例1
构建适合解脂耶氏酵母中的基因表达的质粒
本实施例描述了质粒pY5，pY5-13，pY20和pLV5的构建。
质粒pY5的构建
构建了质粒pY5，即pINA532(由Dr.Claude Gaillardin馈赠，InsitutNational Agronomics，Centre de biotechnologie Agro-Industrielle，laboratoire de Genetique Moleculaire et Cellularie INRA-CNRS，F-78850 Thiverval-Grignon，France)的衍生物，用于在解脂耶氏酵母中表达异源基因，如图3所示。
首先，将包括pINA532的ARS18序列和LEU2基因的部分消化的3598bp EcoRl片段亚克隆到pBluescript(Strategene，San Diego，CA)的EcoRl位点上，制备pY2。通过PCR扩增来自解脂耶氏酵母基因组DNA的TEF启动子(Muller S.，等，Yeast，14：1267-1283(1998))，用TEF5′(SEQ ID NO：7)和TEF3′(SEQ ID NO：8)作引物。PCR扩增是在50μl的总体积中进行的，它包括：100ng耶氏酵母基因组DNA，含有下述成分的PCR缓冲液：10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH 8.75)，2mM MgSO4，0.1％ Triton X-100，100μg/mLBSA(最终浓度)，200μM每一种脱氧核糖核苷三磷酸，10皮摩尔每一种引物和1μl的PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene)。扩增是按以下方法进行的：首先在95℃变性3分钟，然后进行35轮以下循环：95℃1分钟，56℃30秒，72℃1分钟。在72℃进行了10分钟的最终延伸，然后在4℃终止反应。将418bp PCR产物连接到pCR-Blunt上，制备pIP-tef。将pIP-tef的BamHI/EcoRV片段亚克隆到pY2的BamHI/Smal位点上，制备pY4。
使用pINA532作模板，用XPR5’(SEQ ID NO：41)和XPR3’(SEQ IDNO：42)作引物，通过PCR扩增XPR2转录终止子。PCR扩增是在50μl的总体积中进行的，使用上述成分和条件。用SacII消化179bp的PCR产物，然后连接到pY4的SacII位点上，制备pY5。因此，pY5(参见图3)可用作耶氏酵母-大肠杆菌穿梭质粒，它包含：耶氏酵母自主复制序列(ARS18)；ColE1质粒复制起点；氨苄青霉素-抗性基因(AmpR)，用于在大肠杆菌中选择；耶氏酵母LEU2基因(E.C.1.1.1.85，编码异丙基苹果酸异构酶)，用于在耶氏酵母中选择；翻译延伸启动子(TEFP)，用于在耶氏酵母中表达异源基因；和细胞外蛋白酶基因终止子(XPR2)，用于耶氏酵母中表达的异源基因的转录终止。
质粒DY5-13的构建
作为pY5的衍生物构建了pY5-13，以促进在解脂耶氏酵母中的亚克隆和异源基因表达。更具体地，用pY5作模板，通过6轮定位诱变构建了pY5-13。通过用寡核苷酸YL5和YL6(SEQ ID NO：43和44)进行定位诱变，从pY5消除SalI和ClaI位点，制备pY5-5。通过用寡核苷酸YL9和YL10(SEQ ID NO：45和46)进行定位诱变，将SalI位点导入pY5-5的LEU2基因和the TEF启动子之间，制备pY5-6。通过用寡核苷酸YL7和YL8(SEQ ID NO：47和48)进行定位诱变，将PacI位点导入pY5-6的LEU2基因和ARS18之间，制备pY5-8。使用寡核苷酸YL3和YL4(SEQID NO：49和50)，将NcoI位点导入pY5-8的TEF启动子的翻译起始密码子周围，制备pY5-9。使用YL1和YL2寡核苷酸(SEQ ID NO：51和52)，消除pY5-9的LEU2基因内的NcoI位点，制备pY5-12。最后，使用寡核苷酸YL61和YL62(SEQ ID NO：53和54)，将BsiWI位点导入pY5-12的ColEI和XPR2区之间，制备pY5-13。
质粒pY20和pLV5的构建
质粒pY20(SEQ ID NO：55)是pY5的衍生物。如下构建它：将含有嵌合潮霉素抗性基因的Not I片段插入pY5的Not I位点。更具体地，PCR扩增大肠杆菌潮霉素抗性基因(SEQ ID NO：56；“HPT”；Kaster，K.R.等，Nucleic Acids Res.11：6895-6911(1983))，用于表达。该嵌合基因具有在解脂耶氏酵母TEF启动子控制下的潮霉素抗性ORF。
质粒pLV5是pY20的衍生物。通过用耶氏酵母Ura3基因替代潮霉素抗性基因，构建它。使用寡核苷酸KU5和KU3(SEQ ID NO：60和61)作为引物，并使用耶氏酵母基因组DNA作为模板，PCR扩增含有耶氏酵母Ura3基因的1.7kB DNA片段(SEQ ID NO：58)。
实施例2
部分解脂耶氏酵母酰基-CoA：二酰基甘油酰基转移酶(DGAT2)基因的 克隆和内源DGAT2基因的破坏
本实施例描述了使用简并PCR引物来分离解脂耶氏酵母DGAT2的部分编码序列，和使用该部分序列来破坏解脂耶氏酵母中的天然基因。
使用简并PCR引物和染色体步移，通过PCR，从解脂耶氏酵母克隆部分 推定的DGAT2序列
使用DNeasy Tissue试剂盒(Qiagen，目录号69504)，从解脂耶氏酵母(ATCC #76982)分离基因组DNA，并重新悬浮于试剂盒缓冲液AE，DNA浓度为0.5μg/μl。使用基因组DNA作为模板，和几种用于编码在不同的已知DGAT2(即，GenBank登记号NC_001147[酿酒酵母]和AF391089和AF391090[拉曼被孢霉])中保守的氨基酸序列的简并引物，进行PCR扩增。用下表所示的简并引物P7和P8，得到了最好的结果。
表4
用于扩增部分推定的DGAT2的简并引物
 
引物组 描述 简并核苷酸序列 对应的氨基酸序列
P7 (32)29-聚体 5’-AACTACATCTTCGGCTAYCAYCCNCAYGG-3’(SEQ ID NO：62) NYIFGYHPHG(SEQ ID NO：63)
P8 (48)29-聚体 5’-AGGGACTCGGAGGCGCCGCCNCANACDAT-3’(SEQ ID NO：64) 与IVVGGASESL(SEQ ID NO：65)互补
[注：缩写是核苷酸和蛋白的标准写法。使用如下的核酸简并代码：Y＝C/T；D＝A/G/T；和N＝A/C/G/T]
使用生产商的推荐和Accuprime Taq聚合酶(Invitrogen)，在RoboCycler Gradient 40PCR仪器(Stratagene)中进行PCR。如一般方法中所述，进行扩增。
通过4％ NuSieve(FMC)琼脂糖凝胶电泳，检测预期的PCR产物(约264bp)，分离，纯化，克隆进
Figure A200580045917D00671
克隆载体(Invitrogen)，并测序。基于BLAST程序分析(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215：403-410(1993))，得到的序列(包含在SEQ ID NO：1中)与已知的DGAT2具有同源性。
使用264bp片段作为起始点，使用
Figure A200580045917D00681
 Walker试剂盒(Invitrogen，目录号K8000-01)，通过染色体步移得到了673bp片段。在6步中完成染色体步移，简述如下：
1.)用限制酶Pst I或Sac I消化基因组DNA(5μg)，离去3′突出；
2.)用0.1U小牛肠碱性磷酸酶处理消化过的DNA，将DNA脱去磷酸；
3.)使用DGAT2特异性的引物P80(SEQ ID NO：66)和Taq聚合酶，进行引物延伸；
4.)加入
Figure A200580045917D0068111921QIETU
连接物(1μl)，在37℃温育反应5min，将
Figure A200580045917D0068111921QIETU
连接物连接到DNA；
5.)使用DGAT2基因特异性的引物，P81(SEQ ID NO：67)和LinkAmp引物1(SEQ ID NO：68)，进行PCR；和
6.)用引物P81和LinkAmp引物1，将新扩增的片段测序。
通过染色体步移得到的673bp片段的序列也表现出与已知DGAT2序列的同源性。
靶向破坏解脂耶氏酵母DGAT2基因
通过用称作质粒pY21DGAT2的靶向盒对内源DGAT2基因的同源重组-介导的替换，进行解脂耶氏酵母ATCC #90812和ATCC #76982中的DGAT2基因的靶向破坏。pY21DGAT2源自质粒pY20(实施例1；SEQID NO：55)。更具体地，通过将570bp Hind III/Eco RI片段插入类似地线性化的pY20，制备pY21DGAT2。570bp DNA片段含有(按5’至3’方向)：3′同源序列位置+1090至+1464(SEQ ID NO：1的编码序列(ORF))，Bgl II限制位点和5′同源序列位置+906至+1089(SEQ ID NO：1显示的编码序列(ORF))。分别使用两对PCR引物P95和P96(SEQ ID NO：69和70)和P97和P98(SEQ ID NO：71和72)，通过从染色体步移得到的673bp DGAT2PCR产物PCR扩增3’和5’序列，制备片段。
通过Bgl II限制消化，将pY21DGAT2线性化，并转化进对数中期解脂耶氏酵母ATCC #90812和ATCC #76982细胞，如一般方法中所述。将细胞涂布到YPD潮霉素选择平板，并在30℃维持2-3天。
分离4个解脂耶氏酵母ATCC #76982潮霉素-抗性菌落和14个解脂耶氏酵母ATCC #90812潮霉素-抗性菌落，通过PCR筛选靶向破坏。一组PCR引物(P115和P116[分别是SEQ ID NO：73和74])用于在同源重组后扩增特异性的连接片段。另一对PCR引物(P115和P112[SEQ IDNO：75])用于检测天然基因。
ATCC #76982菌株的所有(4/4)潮霉素-抗性菌落都是对连接片段阳性的，且对天然片段阴性的；并且，ATCC #90812菌株的2/14潮霉素-抗性菌落是对连接片段阳性的，且对天然片段阴性的。因而，在这6个菌株中证实了靶向整合。通过称作“S-D2”的破坏菌株之一的总脂类的GC分析，进一步证实了基因的破坏(参见实施例9)。
实施例3
部分解脂耶氏酵母磷脂:二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)基因的克隆和 内源PDAT基因的破坏
本实施例描述了使用简并PCR引物来分离解脂耶氏酵母PDAT的部分编码序列，和使用该部分序列来破坏解脂耶氏酵母的天然基因
使用简并PCR引物和染色体步移，通过PCR，从解脂耶氏酵母克隆部分 推定的PDAT序列
使用DNeasy Tissue试剂盒(Qiagen，目录号69504)，从解脂耶氏酵母(ATCC #76982)分离基因组DNA，并重新悬浮于试剂盒缓冲液AE，DNA浓度为0.5μg/μl。使用基因组DNA作为模板，和几对编码在不同的已知PDAT(GenBank登记号NP 190069和AB006704[(gi：2351069拟南芥]，和NP_596330[裂殖酵母属]；和酿酒酵母Lro 1基因[Dahlqvist等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6487(2000)])中保守的氨基酸序列的简并引物，进行PCR扩增。用下表所示的简并引物P26和P27，得到了最好的结果。
表5
用于扩增部分推定的PDAT的简并引物
 
引物组 描述 简并核苷酸序列 对应的氨基酸序列
P26 (32)29-聚体 5’-ATGCTGGACAAGGAGACCGGNCTNGAYCC-3′(SEQ ID NO：76) MLDKETGLDP(SEQ ID NO：77)
P27 (16)33-聚体 5’-CCAGATGACGTCGCCGCCCTTGGGNARCATNGA-3’(SEQ ID NO：78) 与SMLPKGGEVIW(SEQ ID NO：79)互补
[注：缩写是核苷酸和蛋白的标准写法。使用如下的核酸简并代码：R＝A/G；Y＝C/T；和N＝A/C/G/T]
使用一般方法所述的扩增条件，在RoboCycler Gradient 40PCR仪器(Stratagene)中进行PCR。通过4％ NuSieve(FMC)琼脂糖凝胶电泳，检测预期的PCR产物(约600bp)，分离，纯化，克隆进
Figure A200580045917D00701
克隆载体(Invitrogen)，并测序。基于BLAST程序分析(Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215：403-410(1993))，得到的序列(包含在SEQ ID NO：7中)与已知的PDAT具有同源性。
靶向破坏解脂耶氏酵母PDAT基因
在对PDAT的该约600bp部分编码区测序后，在“Yeast projectGenolevures”(Center for Bioinformatics，LaBRI，Talence Cedex，France)的公开解脂耶氏酵母蛋白数据库中发现了编码该序列的更大DNA片段(也参见Dujon，B.等，Nature 430(6995)：35-44(2004))。这允许使用PCR引物P39和P42(SEQ ID NO：80和81)分离1008bp基因组DNA片段，其包含来自解脂耶氏酵母ATCC #90812的PDAT基因的一部分。
通过用称作pLV13(SEQ ID NO：82)的靶向盒对内源PDAT基因的同源重组-介导的替换，进行解脂耶氏酵母ATCC #90812中的PDAT基因的靶向破坏。pLV13源自质粒pLV5(实施例1)。更具体地，通过将992bpBam HI/Eco RI片段插入类似地线性化的pLV5，制备pLV13。992bp DNA片段含有(按5’至3’方向)：3′同源序列位置+877至+1371(SEQ IDNO：7的编码序列(ORF))，Bgl II限制位点和5′同源序列位置+390至+876(SEQ ID NO：7的编码序列(ORF))。分别使用两对PCR引物P39和P41(SEQ ID NO：80和83)和P40和P42(SEQ ID NO：84和81)，从上述1008bp PCR产物PCR扩增3’和5’序列，制备片段。
通过Bgl II限制消化，将pLV13线性化，并通过醋酸锂方法(一般方法)转化进对数中期解脂耶氏酵母ATCC #90812细胞。将细胞涂布到Bio101 DOB/CSM-Ura选择平板，并在30℃维持2-3天。
分离10个解脂耶氏酵母ATCC #90812菌落，通过PCR筛选靶向破坏。一组PCR引物(P51和P52[分别是SEQ ID NO：85和86])用于扩增靶向盒。另一组PCR引物(P37和P38[分别是SEQ ID NO：87和88])用于检测天然基因。10/10菌株都是对连接片段阳性的，且3/10菌株是对天然片段阴性的，因而，在这3个菌株中证实了成功的靶向整合。通过称作“S-P”的破坏菌株之一的总脂类的GC分析，进一步证实了基因的破坏(参见实施例9)。
实施例4
构建在PDAT和DGAT2基因中含有破坏的解脂耶氏酵母双敲除菌株
本实施例描述了PDAT和DGAT2基因受到破坏的双敲除菌株的建立。
更具体地，用质粒pLV13(来自实施例3)转化解脂耶氏酵母ATCC#90812潮霉素-抗性的“S-D2”突变体(含有来自实施例2的DGAT2破坏)，并通过PCR筛选转化体，如实施例3所述。证实2/12转化体的DGAT2和PDAT基因被破坏。通过称作“S-D2-P”的破坏菌株之一的总脂类的GC分析，进一步证实了基因的破坏(参见实施例9)。
实施例5
克隆全长解脂耶氏酵母DGAT2和PDAT基因
本实施例描述了通过质粒援救恢复侧接破坏的DGAT2和PDAT基因的基因组序列，使用援救的质粒中的序列来PCR天然基因的完整ORF。将全长基因和它们的推定氨基酸序列分别与其它真菌DGAT2和PDAT序列相对比。
解脂耶氏酵母DGAT2和PDAT基因的质粒援救
由于整个pY21DGAT2和pLV13载体(它们各自含有大肠杆菌氨苄西林-抗性的基因和大肠杆菌ori)的插入破坏了酰基转移酶基因，可以在大肠杆菌中援救侧接PDAT和DGAT2序列。为此，使用DNeasy Tissue试剂盒，分离解脂耶氏酵母菌株“S-D2”的基因组DNA(携带破坏的DGAT2基因；实施例2)和解脂耶氏酵母菌株“S-P”(携带破坏的PDAT基因；实施例3)的基因组DNA。更具体地，以200μl的反应体积，用50U下述限制酶消化10μg基因组DNA：对于DGAT2--Age I和Nhe I；对于PDAT--Kpn I，Pac I和Sac I。用苯酚：氯仿提取消化的DNA，并重新悬浮于40μl去离子水。消化的DNA(10μl)在200μl含有3U T4 DNA连接酶的连接混合物中自连接。每个连接反应在16℃进行12小时。用苯酚：氯仿提取连接的DNA，并重新悬浮于40μl去离子水。最后，将1μl重新悬浮的连接的DNA用于电穿孔转化大肠杆菌，并涂布到含有氨苄西林(Ap)的LB上。分离Ap-抗性的转化体，并分析质粒的存在。在恢复的或援救的质粒中发现了下面的插入片段大小(表5和6)：
表6
恢复的DGAT2质粒的插入片段大小，根据限制酶
 
酶 质粒插入片段大小(kB)
AgeI 2.3
NheI 9.5
表7
恢复的PDAT质粒的插入片段大小，根据限制酶
 
酶 质粒插入片段大小(kB)
Kpn I 6.9
Sac I 5.4
Sph I 7.0
从测序引物P79(SEQ ID NO：89)和P95(SEQ ID NO：69)开始DGAT2援救的质粒的测序。相反地，从测序引物P84(SEQ ID NO：90)和P85(SEQID NO：91)开始PDAT质粒的测序。
基于测序结果，组装编码解脂耶氏酵母DGAT2基因的全长基因(2119bp；SEQ ID NO：1)。更具体地，该序列编码1545碱基的开放读码框(ORF)(SEQ ID NO：1的核苷酸+291至+1835)，而推定的氨基酸序列长度是514个残基(SEQ ID NO：2)。由于该ORF在位置1、以及位置56和160具有起始密码子(‘ATG’)，它含有至少2个额外的嵌套的(更小的)ORF。更具体地，一个ORF是1380碱基长(SEQ ID NO：1的核苷酸+456至+1835，对应SEQ ID NO：3)，具有459残基的推定氨基酸序列(SEQ IDNO：4)；另一个ORF是1068碱基长(SEQ ID NO：1核苷酸+768至+1835，对应SEQ ID NO：5)，具有355残基的推定氨基酸序列(SEQ IDNO：6)。
SEQ ID NO：5编码的ORF与其它已知DGAT2酶具有高度的相似性，因为SEQ ID NO：5中的破坏消除了天然基因的DAG AT功能(参见实施例9)，已经将SEQ ID NO：6的多肽清楚地鉴别为具有DGAT2功能性。
上述的DGAT2蛋白测序和分析后，将解脂耶氏酵母DGAT2蛋白序列公开在“Yeast project Genolevures”(由Center for Bioinformatics，LaBRI，
Figure A200580045917D00731
 A30，Université Bordeaux 1，351，cours de la Libération，33405 Talence Cedex，France支持)的公开解脂耶氏酵母蛋白数据库中(也参见Dujon，B.等，Nature 430(6995)：35-44(2004))。更具体地，将本文公开的序列鉴别为ORF YALI-CDS2240.1，其编码514氨基酸，据报道该蛋白与tr|Q08650酿酒酵母YOR245C DGA1酰基-CoA：二酰基甘油酰基转移酶具有一些相似性。
以与推定DGAT2的全长序列相似的方式，基于测序结果组装了编码解脂耶氏酵母PDAT基因的全长基因(2326bp；SEQ ID NO：7)。更具体地，该序列编码1944碱基的开放读码框(SEQ ID NO：7的核苷酸+274至+2217)，而推定的氨基酸序列长度是648残基(SEQ ID NO：8)。
上述的PDAT蛋白测序和分析后，将解脂耶氏酵母PDAT蛋白序列公开为“Yeast project Genolevures”(同上)的公开解脂耶氏酵母蛋白数据库的一部分。将本文公开的PDAT序列鉴别为ORF YALI-CDS1359.1，其编码648氨基酸，据报道该蛋白与sp|P40345酿酒酵母YNR008w LRO1具有一些相似性，即介导二酰基甘油酯化的卵磷脂胆甾醇酰基转移酶-样基因。
实施例6
鉴别其它推定的解脂耶氏酵母DAG AT
为了鉴别耶氏酵母中的其它DAG AT，使用酿酒酵母ARE1(ScARE1；GenBank登记号CAA42296)和ARE2(Sc ARE2；GenBank登记号P53629)蛋白序列(Yang，H.等，Science.272(5266)：1353-1356(1996))，搜索“Yeast project Genolevures”(同上)的公开解脂耶氏酵母蛋白数据库。作为第一次和第二次采样，两次搜索分别鉴别出了下面的解脂耶氏酵母ORF：
(1)YALI-CDS2011.1：注解“类似于sp|P53629酿酒酵母YNR019w ARE2酰基-CoA甾醇酰基转移酶，假定开始”；543氨基酸长(SEQ ID NO：9和10)；和
(2)YALI-CDS2141.1：注解“未命名的蛋白产物；略微类似于tr|Q9FUL6 Perilla frutescens二酰基甘油酰基转移酶(PfDGAT1)，假定开始”；526氨基酸长(SEQ ID NO：11和12)。通过DNASTAR的Megalign程序，使用Clustal W，根据一般方法所述的参数，测定这些蛋白之间的同一性百分比。下面显示了同一性百分比(％)，其中％同一性定义为两种蛋白之间一致的氨基酸的百分比：
表8
已知酰基转移酶和解脂耶氏酵母ORF之间的同一性百分比
 
Sc ARE1 Sc ARE2 Pf DGAT1
YALI-CDS2141.1 16.6 14.5 29.5
YALI-CDS2011.1 32.6 33.8 18.4
基于该对比，YALI-CDS2141.1和YALI-CDS2011.1(在本文中分别称作“Yl DGAT1”和“Yl ARE2”)是候选ORF，它们可能编码在耶氏酵母中具有DAG AT功能性的蛋白。
分析上述蛋白后，将解脂耶氏酵母菌株CLIB99完整基因组公开在GenBank中，作为Genolevures计划的一部分。因而，鉴别为YALI-CDS2011.1的ORF对应着GenBank登记号NC_006072，基因座标记＝＂YALI0F06578g”，且鉴别为YALI-CDS2141.1的ORF对应着GenBank登记号CR382130，基因座标记＝＂YALI0D07986g＂。
实施例7
解脂耶氏酵母酰基-CoA：二酰基甘油酰基转移酶(DGAT1)基因的克隆 和内源DGAT1基因的破坏
本实施例描述了使用简并PCR引物来分离解脂耶氏酵母DGAT1的全长编码序列(由ORF YALI-CDS2011.1编码(实施例6))，和使用该序列来破坏解脂耶氏酵母中的天然基因。
使用简并PCR引物，通过PCR，从解脂耶氏酵母克隆推定的DGAT1序 列
使用简并PCR引物P201和P203(分别是SEQ ID NO：92和93)和解脂耶氏酵母ATCC #76982(来自实施例2)基因组DNA作为模板，通过PCR克隆全长Yl DGAT1 ORF。需要简并引物，因为不知道编码YlDGAT1的核苷酸序列。
使用一般方法所述的组分和热循环仪条件，在RoboCycler Gradient40PCR仪器中进行PCR。通过琼脂糖凝胶电泳检测预期的PCR产物(约1.6kB)，分离，纯化，克隆进
Figure A200580045917D00751
克隆载体(Invitrogen)，并部分地测序，以证实它的同一性。
解脂耶氏酵母DGAT1基因的靶向破坏
通过靶向盒对内源DGAT1基因的同源重组-介导的替换(使用实施例2所述的方法)，进行解脂耶氏酵母ATCC #90812中的推定DGAT1基因的靶向破坏。更具体地，将1.6kB分离的Yl DGAT1 ORF(SEQ ID NO：13)用作PCR模板分子，构建由下述组分组成的Yl DGAT1靶向盒：5’同源Yl DGAT1序列，耶氏酵母亮氨酸2(Leu2)基因，和3’同源Yl DGAT1序列。为此，首先使用下述的引物组，分别扩增靶向盒的每个部分：
●上引物P214和下引物P215(分别是SEQ ID NO：94和95)，用于扩增5’同源DGAT1序列；
●上引物P216和下引物P217(分别是SEQ ID NO：96和97)，用于扩增3’同源DGAT1序列；和，
●上引物P218和下引物P219(分别是SEQ ID NO：98和99)，用于扩增Leu2基因(GenBank登记号AAA35244)。
如一般方法中所述，使用Pfu Ultra聚合酶(Stratagene，目录号600630)进行PCR，并纯化。将3种正确大小的、纯化的片段混合到一起，作为使用PCR引物P214和P219(SEQ ID NO：94和99)的第二个PCR反应的模板分子，得到Yl DGAT1破坏盒。
凝胶纯化靶向盒，并用于转化对数中期野生型解脂耶氏酵母(ATCC#90812)。如一般方法中所述进行转化。
将转化体涂布到Bio101 DOB/CSM-Leu选择平板上，并在30℃维持2-3天。通过PCR筛选几种亮氨酸原养型，以证实靶向的DGAT1破坏。更具体地，一组PCR引物(P226和P227[分别是SEQ ID NO：100和101])用于扩增破坏盒和天然靶基因之间的连接。另一组PCR引物(P214和P217[分别是SEQ ID NO：94和97])用于检测天然基因。
所有亮氨酸原养型菌落都是对连接片段阳性的，且是对天然片段阴性的，因而，在这些菌株中证实了靶向整合。通过称作“S-D1”的破坏菌株之一的总脂类的GC分析，进一步证实了基因的破坏(参见实施例9)。
以类似的方式，将DGAT1靶向盒用于破坏菌株的DGAT1基因，所述菌株含有在PDAT(来自实施例3的“S-P”)或DGAT2(来自实施例2的“S-D2”)中的单个破坏，或在PDAT和DGAT2中的两个破坏(来自实施例4的“S-D2-P”)。这会建立在DGAT1和PDAT(“S-D1-P”)中、在DGAT2和DGAT1(“S-D2-D1”)中具有双敲除、以及在DGAT2、DGAT1和PDAT中具有三敲除的菌株(“S-D2-D1-P”)。
实施例8
解脂耶氏酵母酰基-CoA:甾醇-酰基转移酶(ARE2)基因的克隆和内源 ARE2基因的破坏
本实施例描述了使用简并PCR引物来分离解脂耶氏酵母ARE2的全长编码序列(由ORF YALI-CDS2141.1编码(实施例6))，和使用该序列来破坏解脂耶氏酵母中的天然基因。
使用简并PCR引物，通过PCR，从解脂耶氏酵母克隆推定的ARE2序列
使用简并PCR引物P205和P208(分别是SEQ ID NO：102和103)和解脂耶氏酵母ATCC #76982(来自实施例2)基因组DNA作为模板，通过PCR克隆全长Yl ARE2 ORF。需要简并引物，因为不知道编码YlARE2的核苷酸序列。使用实施例7所述的方法，进行PCR。检测预测大小的PCR产物。
靶向破坏解脂耶氏酵母ARE2基因(预示的)
通过靶向盒对内源ARE2基因的同源重组-介导的替换，进行解脂耶氏酵母ATCC #90812中ARE2基因的靶向破坏(如实施例7所述)。更具体地，将约1.6kB分离的编码推定Yl ARE2蛋白的ORF(SEQ ID NO：15)用作PCR模板分子，构建由下述组分组成的Yl ARE2靶向盒：5’同源YlARE2序列，耶氏酵母亮氨酸2(Leu2)基因，和3’同源Yl ARE2序列。为此，首先使用下述的引物组，如实施例7所述，分别扩增靶向盒的每个部分：
●上引物P220和下引物P221(分别是SEQ ID NO：104和105)，用于扩增5’同源ARE2序列；
●上引物P222和下引物P223(分别是SEQ ID NO：106和107)，用于扩增3’同源ARE2序列；和，
●上引物P224和下引物P225(分别是SEQ ID NO：108和109)，用于扩增Leu2基因。
纯化后，将每种正确大小的片段混合到一起，作为使用引物P220和P223的PCR反应的模板分子，得到靶向盒。凝胶纯化产物后，将靶向盒用于转化对数中期野生型和突变型解脂耶氏酵母(ATCC #90812)菌株，所述菌株含有在PDAT(来自实施例3的“S-P”)、DGAT2(来自实施例2的“S-D2”)或DGAT1(来自实施例7的“S-D1”)中的单个破坏，或在PDAT和DGAT2中的两个破坏(来自实施例4的“S-D2-P”)，在PDAT和DGAT1中的两个破坏(来自实施例7的“S-D1-P”)，在DGAT1和DGAT2中的两个破坏(来自实施例7的“S-D1-D2”)，或在PDAT、DGAT2和DGAT1中的三个破坏(来自实施例7的“S-D1-D2-P”)。如一般方法中所述，进行转化。
将转化体涂布到Bio101 DOB/CSM-Leu选择平板上，并在30℃维持2-3天。使用实施例7所述的方法，通过PCR筛选几种亮氨酸原养型，以证实靶向的ARE2破坏。
实施例9
测定突变型和野生型解脂耶氏酵母菌株(ATCC #90812)中的TAG含量
本实施例描述了对比野生型和突变型解脂耶氏酵母ATCC #90812中的TAG含量，所述菌株含有：(1)在PDAT，DGAT2和DGAT1中的单个破坏；(2)在PDAT和DGAT2，DGAT1和PDAT，和DGAT1和DGAT2中的两个破坏；和(3)在PDAT，DGAT2和DGAT1中的三个破坏。
更具体地，使用会诱导油的条件，分别培养野生型和突变型解脂耶氏酵母的单个菌落，所述菌株含有在PDAT(“S-P”，来自实施例3)、DGAT2(“S-D2”，来自实施例2)、DGAT1(“S-D1”，来自实施例7)中的单个破坏，在PDAT和DGAT2(“S-D2-P”，来自实施例4)、DGAT1和PDAT(“S-D1-P”，来自实施例7)、DGAT1和DGAT2(“S-D1-D2”，来自实施例7)中的两个破坏，和三个破坏(“S-D1-D2-P”，来自实施例7)。将1菌环量的来自每种培养物的细胞分别接种进3mL YPD培养基，在30℃，在摇床(300rpm)上生长过夜。收获细胞，并在0.9％ NaCl中洗涤一次，重新悬浮于50mL HGM。然后，使细胞在摇床上生长48小时。在水中洗涤细胞，低压冻干细胞碎片。二十(20)mg干细胞重用于总脂肪酸的GC分析，并将油级分用于TLC(在下文中)和GC分析。
薄层色谱(TLC)
在下面的5个步骤中，描述了TLC使用的方法：(1)将内部标准品15:0脂肪酸(10μl 10mg/mL)加入2-3mg干细胞量，然后使用甲醇/氯仿方法提取总脂。(2)使用25-50μl微量吸管，将提取的脂(50μl)印迹到绘在离5 x 20cm硅胶60平板底部约1英寸的光束线上。(3)然后在N2下干燥TLC平板，并插入含有约100mL 80:20:1 己烷:乙醚:醋酸溶剂的罐中。(4)分离带后，将碘蒸汽吹过平板的一侧，以鉴别带。这允许使用剃刀刀片刮掉在平板的另一侧上的样品，用于进一步分析。(5)如一般方法中所述，进行刮掉的样品的基础酯交换和GC分析。
GC分析的结果
在表9中显示了GC结果。将培养物描述为“S”菌株(野生型)，“S-P”(PDAT敲除)，“S-D1”(DGAT1敲除)，“S-D2”(DGAT2敲除)，“S-D1-D2”(DGAT1和DGAT2敲除)，“S-P-D1”(PDAT和DGAT1敲除)，“S-P-D2”(PDAT和DGAT2敲除)和“S-P-D1-D2”(PDAT，DGAT1和DGAT2敲除)。使用的缩写是：“WT”＝野生型；“FAs”＝脂肪酸；“dcw”＝干细胞重；并且，“FAs％ dcw，％ WT”＝相对于野生型中的％的FAs％ dcw，其中“S”菌株是野生型。
表9
在PDAT、DGAT2和DGAT1中具有一个、两个或三个破坏的耶氏酵母 ATCC #90812菌株的脂含量
Figure A200580045917D00791
表9中的结果提供了DGAT1是DAG AT的证据，因为它的破坏导致了与野生型菌株相比的低含油量。上面显示的结果也证实了3种DAG AT对油生物合成的相对贡献。DGAT2的贡献最大，而PDAT和DGAT1的贡献相等，但是小于DGAT2。三敲除菌株脂的约3％残余油含量可能是Yl ARE2的贡献(参见实施例8)。
实施例10
建立生产EPA的解脂耶氏酵母ATCC #20362菌株MU和菌株 Y2067U
本实施例描述了菌株MU和菌株Y2067U的构建，它们各自源自解脂耶氏酵母ATCC #20362，其中每个菌株都能生产相对于总脂类高浓度的EPA(图5)。如实施例11，12和15(在下文中)所述，基于TAG含量和/或脂肪酸组成的分析，在这些EPA生产菌株中检查了不同酰基转移酶敲除和酰基转移酶基因对表达的影响。
本文菌株MU的开发，需要构建菌株M4(生产8％ DGLA)，菌株Y2034(生产10％ ARA)，菌株E(生产10％ EPA)，菌株EU(生产10％EPA)和菌株M26(生产14％)。菌株Y2067U的开发，首先需要建立菌株EU的衍生物，称作菌株Y2067(生产15％ EPA)。
构建生产8％ DGLA的菌株M4
制备构建体pKUNF12T6E(图6A；SEQ ID NO：110)，将4个嵌合基因(包含Δ12去饱和酶，Δ6去饱和酶和2延伸酶)整合进野生型耶氏酵母菌株ATCC #20362的Ura3基因座，从而实现DGLA的生产。pKUNF12T6E质粒含有下面的组分：
表10
质粒pKUNF12T6E(SEQ ID NO：110)的描述
 
在SEQ IDNO：110内的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述
AscI/BsiWI(9420-8629) 耶氏酵母Ura3基因(GenBank登记号AJ306421)的784bp 5’部分
SphI/PacI(12128-1) 耶氏酵母Ura3基因(GenBank登记号AJ306421)的516bp 3’部分
 
SwaI/BsiWI(6380-8629) FBAIN::EL1S:Pex20，包含：●FBAIN：FBAIN启动子(SEQ ID NO：111；也参见美国专利申请号60/519971)●EL1S：密码子-优化的延伸酶1基因(SEQ IDNO：112)，源自高山被孢霉(GenBank登记号AX464731)●Pex20：来自耶氏酵母Pex20基因(GenBank登记号AF054613)的Pex20终止子序列
BglII/SwaI(4221-6380) TEF::Δ6S::Lip1，包含：●TEF：TEF启动子(GenBank登记号AF054508)●Δ6S：密码子-优化的Δ6去饱和酶基因(SEQID NO：114)，源自高山被孢霉(GenBank登记号AF465281)●Lip1：来自耶氏酵母Lip1基因(GenBank登记号Z50020)的Lip1终止子序列
PmeI/ClaI(4207-1459) FBA::F.Δ12::Lip2，包含：●FBA：FBA启动子(SEQ ID NO：116；也参见美国专利申请号60/519971)●F.Δ12：串珠镰孢Δ12去饱和酶基因(SEQ IDNO：117)●Lip2：来自耶氏酵母Lip2基因(GenBank登记号AJ012632)的Lip2终止子序列
ClaI/PacI(1459-1) TEF::EL2S::XPR，包含：●TEF：TEF启动子(GenBank登记号AF054508)●EL2S：密码子-优化的延伸酶基因(SEQ IDNO：119)，源自金黄色破囊壶菌(U.S.6,677,145)●XPR：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登记号M17741)的XPR终止子序列
根据一般方法，用AscI/SphI消化pKUNF12T6E质粒，然后用于转化野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362。将转化的细胞涂布到FOA选择培养基平板上，并在30℃维持2-3天。挑取FOA抗性菌落，并划线到MM和MMU选择平板上。将能在MMU平板上生长、但是不能在MM平板上生长的菌落选择为Ura-菌株。然后，将Ura-菌株的单个菌落接种进液体MMU，在30℃，在250rpm/min下，摇动2天。
通过离心收集细胞，提取脂类，通过酯交换制备脂肪酸甲基酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。
GC分析证实了DGLA在含有pKUNF12T6E的4个嵌合基因的转化体中的存在(图6A)，但是不存在于野生型耶氏酵母对照菌株中。大多数选择的32 Ura-菌株生产占总脂约6％的DGLA。有2个菌株(即，菌株M4和13-8)生产占总脂约8％的DGLA。
构建生产10％ ARA的菌株Y2034
制备构建体pDMW232(图6B；SEQ ID NO：121)，将2个Δ5嵌合基因整合进耶氏酵母菌株M4的Leu2基因。质粒pDMW232含有下面的组分：
表11
质粒pDMW232(SEQ ID NO：121)的描述
 
在SEQ IDNO：121内的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述
AscI/BsiWI(5550-4755) 耶氏酵母Leu2基因(GenBank登记号AF260230)的788bp 5’部分
SphI/PacI(8258-8967) 耶氏酵母Leu2基因(GenBank登记号AF260230)的703bp 3’部分
 
SwaI/BsiWI(2114-4755) FBAIN::MA Δ5::Pex20，包含：●FBAIN：FBAIN启动子(SEQ ID NO：111；也参见美国专利申请号60/519971)●MA Δ5：高山被孢霉Δ5去饱和酶基因(SEQID NO：122)(GenBank登记号AF067654)●Pex20：耶氏酵母Pex20基因(GenBank登记号AF054613)的Pex20终止子序列
SwaI/ClaI(2114-17) TEF::MA Δ5::Lip1，包含：●TEF：TEF启动子(GenBank登记号AF054508)●MA Δ5：如关于FBAIN::MA Δ5::Pex20所述(同上)●Lip1：耶氏酵母Lip1基因(GenBank登记号Z50020)的Lip1终止子序列
PmeI/ClaI(5550-4755) 耶氏酵母Ura3基因(GenBank登记号AJ306421)
根据一般方法，用AscI/SphI消化质粒pDMW232，然后用于转化菌株M4。转化后，将细胞涂布到MMLe平板上，并在30℃维持2-3天。挑取来自每个转化的在MMLe平板上生长的单个菌落，并划线到MM和MMLe平板上。将能在MMLe平板上生长、但是不能在MM平板上生长的那些菌落选择为Leu2-菌株。然后，将Leu2-菌株的单个菌落接种进液体MMLe培养基，在30℃，在250rpm/min下，摇动2天。
通过离心收集细胞，提取脂类，通过酯交换制备脂肪酸甲基酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。
GC分析证实了ARA在pDMW232转化体中的存在，但是不存在于亲本M4菌株中。更具体地，在48个选择的含有pDMW232的Leu2-转化体中，有34个菌株生产少于5％的ARA，11个菌株生产6-8％ARA，且3个菌株生产占工程化的耶氏酵母的总脂约10％的ARA。一个生产10％ARA的菌株称作“Y2034”。
构建生产约10％ EPA的菌株E
制备构建体pZP3L37(图6C；SEQ ID NO：124)，将3个合成的Δ17去饱和酶嵌合基因整合进Y2034菌株的酰基-CoA氧化酶3(即，POX3)基因。质粒pZP3L37含有下面的组分：
表12
质粒pZP3L37(SEQ ID NO：124)的描述
 
在SEQ ID NO：124内的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述
AscI/BsiWI(6813-6043) 耶氏酵母Pox3基因(GenBank登记号AJ001301)的763bp 5’部分
SphI/PacI(9521-10345) 耶氏酵母Pox3基因(GenBank登记号AJ001301)的818bp 3’部分
ClaI/BsiWI(4233-6043) TEF::Δ17S::Pex20，包含：●TEF：TEF启动子(GenBank登记号AF054508)●Δ17S：密码子-优化的Δ17去饱和酶基因(SEQ ID NO：125)，源自异丝水酶(US2003/0196217 A1)●Pex20：耶氏酵母Pex20基因(GenBank登记号AF054613)的Pex20终止子序列
ClaI/PmeI(4233-1811) FBAIN::Δ17S::Lip2，包含：●FBAIN：FBAIN启动子(SEQ IDNO：111；也参见美国专利申请号60/519971)●Δ17S：SEQ ID NO：125(同上)●Lip2：耶氏酵母Lip2基因(GenBank登记号AJ012632)的Lip2终止子序列
PmeI/SwaI(1811-1) 耶氏酵母Leu2基因(GenBank登记号AF260230)
PacI/SwaI(10345-1) FBAINm::Δ17S::Pex16，包含：●FBAINm：FBAINm启动子(SEQ IDNO：127；也参见美国专利申请号60/519971)●Δ17S：SEQ ID NO：125(同上)●Pex16：耶氏酵母Pex16基因(GenBank登记号U75433)的Pex16终止子序列
根据一般方法，用AscI/SphI消化质粒pZP3L37，然后用于转化菌株Y2034。转化后，将细胞涂布到MM平板上，并在30℃维持2-3天。挑取在MM平板上生长的共48个转化体，并重新划线到新鲜的MM平板上。生长后，将这些菌株单独地接种进液体MM，在30℃，在250rpm/min下，摇动2天。通过离心收集细胞，提取脂类，通过酯交换制备脂肪酸甲基酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。
GC分析证实了EPA在大多数含有pZP3L37的转化体中的存在，但是不存在于亲本菌株(即，Y2034)中。更具体地，在48个选择的含有pZP3L37的转化体中，有18个菌株生产少于2％的EPA，14个菌株生产2-3％ EPA，且1个菌株生产占工程化的耶氏酵母的总脂约7％的EPA。
在如下(“两阶段生长条件”)培养菌株后，进一步分析生产7％EPA的菌株。首先，使细胞一式三份地生长在液体MM中，在30℃、250rpm/min下摇动48小时。离心收集细胞，吸取液体上清液。将沉淀的细胞重新悬浮于HGM，在30℃、250rpm/min摇动下生长72小时。再次离心收集细胞，吸取液体上清液。
GC分析证实，在两阶段生长后，该工程化的菌株生产占总脂约10％的EPA。该菌株称作“E”菌株。
构建生产约10％ EPA的菌株EU
通过鉴别5-FOA抗性的菌株E突变细胞，建立菌株EU(Ura-)。更具体地，将一环耶氏酵母E菌株细胞接种进3mL YPD培养基，并在30℃、250rpm/min摇动下生长24小时。用YPD稀释培养物至OD6000.4，染料培养另外4小时。将培养物涂布(100μl/平板)到FOA选择平板，并在30℃维持2-3天。挑取共16个FOA抗性菌落，并划线到MM和FOA选择平板上。其中，10个菌落在FOA选择平板上生长，但是不在MM平板上生长，将它们选择为潜在的Ura-菌株。
将这些菌株之一用作pY37/F15转化宿主，所述pY37/F15包含嵌合GPD::串珠镰孢Δ15::XPR2基因和作为选择标记的Ura3基因(图6D；SEQ ID NO：128)。在MM平板上选择3天后，数百菌落在平板上生长，不存在不含有质粒的转化对照的菌落生长。该5-FOA抗性菌株称作菌株“EU”。
然后，将EU菌株的单个菌落接种进另外含有0.1g/L尿苷的液体MMU，并在30℃、250rpm/min摇动下培养2天。离心收集细胞，提取脂类，通过酯交换制备脂肪酸甲基酯，随后用Hewlett-Packard 6890GC分析。GC分析证实，EU菌株生产占总脂约10％的EPA。
构建生产约14％ EPA的菌株M26
使用构建体pZKO2UM26E(图6E，SEQ ID NO：129)来将一串嵌合基因(包含延伸酶，Δ6去饱和酶和Δ12去饱和酶)和Ura3基因整合进菌株EU的耶氏酵母Δ12去饱和酶基因位点。质粒pKO2UM26E含有下面的组分：
表13
质粒pKO2UM26E(SEQ ID NO：129)的描述
 
在SEQ ID NO：129内的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述
HindIII/AscI(1-728) 耶氏酵母Δ12去饱和酶基因(SEQ IDNO：130)的728bp 5’部分
SphI/EcoRI3436-3992) 耶氏酵母Δ12去饱和酶基因(SEQ IDNO：130)的556bp 3’部分
BsiWI/HindIII(11095-1) GPAT::EL1S::XPR，包含：●GPAT：GPAT启动子(SEQ ID NO：132；也参见美国专利申请号60/610060)●EL1S：密码子-优化的延伸酶1基因(SEQ ID NO：112)，源自高山被孢霉(GenBank登记号AX464731)●XPR：耶氏酵母Xpr2基因(GenBank登记号M17741)的终止子序列
 
BglII/BsiWI(8578-11095) FBAIN::M.Δ12.Pex20，包含：●FBAIN：FBAIN启动子(SEQ IDNO：111；也参见美国专利申请号60/519971)●M.Δ12：深黄被孢霉Δ12去饱和酶基因(GenBank登记号AF417245；SEQ IDNO：133)■Pex20：耶氏酵母Pex20基因(GenBank登记号AF054613)的Pex20终止子序列
SalI/PacI(6704-8202) 耶氏酵母Ura3基因(GenBank登记号AJ306421)
EcoRI/SalI(3992-6704) FBAIN::M.Δ6B::Pex20，包含：●FBAIN：FBAIN启动子(SEQ IDNO：111；也参见美国专利申请号60/519971)●M.Δ6B：高山被孢霉Δ6去饱和酶基因“B”(GenBank登记号AB070555；SEQ IDNO：135)●Pex20：耶氏酵母Pex20基因(GenBank登记号AF054613)的Pex20终止子序列
根据一般方法，用SphI/AscI消化质粒pKO2UM26E，然后用于转化EU菌株。转化后，将细胞涂布到MM平板上，并在30℃维持2-3天。
挑取在MM平板上生长的共48个转化体，并重新划线到新鲜的MM平板上。生长后，将这些菌株单独地接种进液体MM，在30℃，在250rpm/min下，摇动1天。通过离心收集细胞，提取脂类，通过酯交换制备脂肪酸甲基酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。
GC分析证实，在MM培养基中生长1天后，在几乎所有含有pKO2UM26E的转化体中生成了EPA。在48个选择的转化体中，有5个菌株生产少于4％的EPA，23个菌株生产4-5.9％ EPA，9个菌株生产6-6.9％ EPA，且11个菌株生产占工程化的耶氏酵母的总脂7-8.2％的EPA。选择生产8.2％ EPA的菌株，用于使用两阶段生长方法(即，48小时MM+96小时HGM)的进一步分析。GC分析证实，该工程化的菌株生产占总脂约14％的EPA。该菌株称作菌株“M26”。M26菌株相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362的最终基因型如下：Pox3-，Y.Δ 12-，FBA::F.Δ 12::Lip2，FBAIN::M Δ 12::Pex20，TEF::Δ 6S::Lip1，FBAIN::Δ 6B::Pex20，FBAIN::E1S::Pex20；GPAT::E1S::Xpr，TEF::E2S::Xpr；FBAIN::MA Δ 5::Pex20，TEF::MA Δ 5::Lip1，FBAIN::Δ 17S::Lip2，FBAINm::Δ 17S::Pex16和TEF::Δ 17S::Pex20。
构建生产EPA的菌株MU
菌株MU是菌株M26的Ura营养缺陷型。通过用5μg已经用PacI和HincII消化的质粒pZKUM(图7A；SEQ ID NO：137)转化菌株M26，制备该菌株。使用Frozen-EZ酵母转化试剂盒(Zymo ResearchCorporation，Orange，CA)，进行转化，通过将100μl转化的细胞混合物涂布到琼脂平板上，选择转化体，所述琼脂平板含有下述培养基：6.7g/L酵母氮碱基(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)，20g/L葡萄糖，50mg/L尿嘧啶和800mg/L FOA。7天后，出现涂布在MM和MMU琼脂平板上的小菌落。它们都是Ura营养缺陷型。将菌株之一称作“MU”。
构建生产约15％ EPA的菌株Y2067
构建质粒pKO2UF2PE(图7B；SEQ ID NO：138)，来将含有2个嵌合基因(包含异源Δ12去饱和酶和延伸酶)和Ura3基因的串整合进菌株EU(同上)的天然耶氏酵母Δ12去饱和酶基因。质粒pKO2UF2PE含有下面的组分：
表14
质粒pKO2UF2PE(SEQ ID NO：138)的描述
 
在SEQ ID NO：138内的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述
AscI/BsiWI(3382-2645) 耶氏酵母Δ12去饱和酶基因(SEQ IDNO：130)的730bp 5’部分
 
SphI/EcoRI(6090-6646) 耶氏酵母Δ12去饱和酶基因(SEQ IDNO：130)的556bp 3’部分
SwaI/BsiWI/(1-2645) FBAINm::F.Δ 12DS::Pex20，包含：●FBAINm：FBAINm启动子(SEQ IDNO：127；也参见美国专利申请号60/519971)●F.Δ12：串珠镰孢Δ12去饱和酶基因(SEQ ID NO：117)●Pex20：耶氏酵母Pex20基因(GenBank登记号AF054613)的Pex20终止子序列
SwaI/PmeI(1-8525) GPAT::EL1S::OCT，包含：●GPAT：GPAT启动子(SEQ ID NO：132；也参见美国专利申请号60/610060)●EL1S：密码子-优化的延伸酶1基因(SEQID NO：112)，源自高山被孢霉(GenBank登记号AX464731)●OCT：耶氏酵母OCT基因(GenBank登记号X69988)的OCT终止子序列
EcoRI/PacI(6646-8163) 耶氏酵母Ura3基因(GenBank登记号AJ306421)
根据一般方法，用AscI/SphI消化质粒pKO2UF2PE，然后用于转化菌株EU(不同之处是，将菌株EU划线到YPD平板上，生长约36小时，然后悬浮于转化缓冲液[相对于18小时])。转化后，将细胞涂布到MM平板上，并在30℃维持2-3天。挑取在MM平板上生长的共72个转化体，并重新划线到新鲜的MM平板上。生长后，将这些菌株单独地接种进液体MM，在30℃，在250rpm/min下，摇动2天。通过离心收集细胞，提取脂类，通过酯交换制备脂肪酸甲基酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。
GC分析证实，EPA存在于几乎所有含有pKO2UF2PE的转化体中。更具体地，在72个选择的转化体中，有17个菌株生产8-9.9％ EPA，27个菌株生产10-10.9％ EPA，16个菌株生产11-11.9％ EPA，且7个菌株生产占工程化的耶氏酵母的总脂12-12.7％的EPA。选择生产12.7％EPA的菌株，用于使用两阶段生长条件的进一步分析。GC分析证实，在两阶段生长后，该工程化的菌株生产占总脂约15％的EPA。该菌株称作菌株“Y2067”。
构建生产约14％、具有Ura-表型的EPA菌株Y2067U
为了破坏Y2067菌株的Ura3基因，建立构建体pZKUT16(图7C；SEQ ID NO：139)来将TEF::rELO2S::Pex20嵌合基因整合进菌株Y2067的Ura3基因。rELO2S是密码子-优化的rELO基因，它编码会将16:0延伸成18:0的大鼠肝酶。质粒pZKUT16含有下面的组分：
表15
质粒pZKUT16(SEQ ID NO：139)的描述
 
在SEQ ID NO：139内的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述
BsiWI/PacI(1-721) 耶氏酵母Ura3基因(GenBank登记号AJ306421)的721bp 5’部分
SalI/ClaI(3565-4289) 耶氏酵母Ura3基因(GenBank登记号AJ306421)的724bp 3’部分
ClaI/BsiWI(4289-1) TEF::rELO2S::Pex20，包含：●TEF：TEF启动子(GenBank登记号AF054508)●rELO2S：密码子-优化的rELO2延伸酶基因(SEQ ID NO：140)，源自大鼠(GenBank登记号AB071986)●Pex20：耶氏酵母Pex20基因(GenBank登记号AF054613)的Pex20终止子序列
根据一般方法，用SalI/PacI消化质粒pZKUT16，然后用于转化Y2067菌株。转化后，将细胞涂布到FOA选择平板上，并在30℃维持2-3天。
挑取在FOA平板上生长的共24个转化体，并分别重新划线到MM平板和FOA平板上。选择能在FOA平板上生长、但是不能在MM平板上生长的菌株作为Ura-菌株。将共10个Ura-菌株单独地接种进液体MM培养基，在30℃，在250rpm/min下，摇动1天。通过离心收集细胞，提取脂类，通过酯交换制备脂肪酸甲基酯，随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。
GC分析证实，在MMU培养基中生长1天后，在所有含有pZKUT16的转化体中存在5-7％ EPA。选择生产6.2％ EPA的菌株，用于使用两阶段生长条件(48小时MM+96小时HGM)的进一步分析。GC分析证实，该工程化的菌株生产占总脂约14％的EPA。该菌株称作菌株“Y2067U”。该菌株相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362的最终基因型如下：Ura3-，Pox3-，Y.Δ 12-，FBA::F.Δ 12::Lip2，FBAINm::F.Δ12::Pex20，TEF::Δ 6S::Lip1，FBAIN::E1S::Pex20；GPAT::E1S::Oct，TEF::E2S::Xpr；FBAIN::MA Δ 5::Pex20，TEF::MA Δ 5::Lip1，FBAIN::Δ 17S::Lip2，FBAINm::Δ 17S::Pex16，TEF::Δ 17S::Pex20和TEF::rELO2S::Pex20。
实施例11
测定为EPA生物合成工程化的突变型和野生型解脂耶氏酵母菌株MU 中的TAG含量
本实施例描述了菌株MU(解脂耶氏酵母ATCC #20362的工程化菌株，能生产大于10％ EPA)的不同酰基转移酶敲除菌株中的TAG含量和脂肪酸组成。更具体地，在菌株MU中，建立了在PDAT，DGAT2和DGAT1中的单个破坏，和在PDAT和DGAT2中的两个破坏。在4种不同生长条件下生长后，对比每个这样的菌株的脂含量和组成。
更具体地，使用实施例2，3，和7所述的方法(不同之处是，DGAT1破坏的选择依赖于URA3基因)，在菌株MU中建立PDAT，DGAT2，DGAT1中的单个破坏(同上，实施例10)。这会产生单敲除菌株，分别称作“MU-D1”(破坏DGAT1)，“MU-D2”(破坏DGAT2)和“MU-P”(破坏PDAT)。通过PCR证实各个敲除菌株。另外，破坏MU-D2菌株的PDAT基因，并通过PCR证实破坏。得到的双敲除菌株称作“MU-D2-P”。
分析MU-D1，MU-D2，MU-P和M-D2-P敲除菌株，以确定每个敲除对脂含量和组成的影响，如下所述。而且，还使用促油的生长条件，来确定它们对总脂含量的影响。因而，共进行了4个不同的实验，分别称作“实验A”，“实验B”，“实验C”和“实验E”。更具体地，将3环来自含有上述每种菌株的平板的细胞接种进MMU[实验B和C是3mL；实验A和E是50mL]，并在30℃摇床中生长24小时(实验A，B和C)或48小时(实验E)。收获细胞，在HGM中洗涤一次，重新悬浮于HGM(实验A和E是50mL；且实验B是3mL)或含有尿嘧啶的HGM(“HGMU”)(实验C是3mL)，并如上培养4天。将一份(1mL)用于根据一般方法所述的GC脂分析，第二份用于测定培养物在600nm的OD。收获实验A和E的剩余培养物，在水中洗涤一次，低压冻干，用于干细胞重(dcw)测定。相反地，使用显示它们的关系的方程，从它们的OD600，确定实验B和C的dcw。还测定了实验A，B，C和E中的不同菌株各自的脂肪酸组成。
在下面的表16中显示了结果。将培养物描述为“MU”菌株(亲本EPA生产菌株)，“MU-P”(PDAT敲除)，“MU-D1”(DGAT1敲除)，“MU-D2”(DGAT2敲除)和“MU-D2-P”(DGAT2和PDAT敲除)。使用的缩写是：“WT”＝野生型(即，MU)；“OD”＝光密度；“dcw”＝干细胞重；“TFAs”＝总脂肪酸；和，“TFAs％ dcw，％ WT”＝相对于野生型(“MU”)菌株的TFAs ％ dcw。将脂肪酸鉴别为16:0，16:1，18:0，18:1(油酸)，18:2(LA)，GLA，DGLA，ARA，ETA和EPA；且各自的组成表示为占总脂肪酸的％。
数据证实，转化细胞中的脂含量随生长条件而变化。而且，每种酰基转移酶对脂含量的贡献也变化。更具体地，在实验B，C和E中，DGAT2对油生物合成的贡献大于PDAT或DGAT1。相反地，如实验A所证实的，在DGAT2，DGAT1和PDAT中的单敲除会导致大约相同的脂含量降低(即，分别是48％，49％和42％降低[参见“TFAs ％ dcw，％ WT”])。
实施例12
解脂耶氏酵母DGAT1的测序和在耶氏酵母启动子控制下的ORF表达
本实施例描述了Yl DGAT1的测序和包含解脂耶氏酵母TEF启动子Yl DGAT1和解脂耶氏酵母peroxin(Pex20)终止子的嵌合基因(即，aTEF::Yl DGAT1::Pex20基因)在野生型耶氏酵母菌株中的超量表达。
测序解脂耶氏酵母DGAT1
首先，使用简并引物P201和P203(SEQ ID NO：92和93)和作为模板的解脂耶氏酵母ATCC #90812基因组DNA(来自实施例2)，PCR-扩增解脂耶氏酵母DGAT1的ORF。如一般方法中所述，使用Roche AppliedSciences(Indianapolis，IN)的Expand High Fidelity PCR系统，进行PCR。
通过标准的琼脂糖凝胶电泳，分离预期的1.6kB片段，纯化，并克隆进来自(Carlsbad，CA)的pCR4-TOPO载体，制备质粒pYAP42-23。将质粒pYAP42-23转化进大肠杆菌XL2；并且，通过质粒微量制备分析和NotI或NcoI限制酶消化，确认包含pYAP42-23的转化体。根据在一般方法中所述的方法，使用测序引物T7，T3，P239(SEQ ID NO：142)和P240(SEQ ID NO：143)，对质粒pYAP42-23中的DNA插入片段测序，得到YlDGAT1 ORF的完整核苷酸序列。
将Yl DGAT1 ORF的核苷酸序列提供为SEQ ID NO：13；翻译产物具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。基于BLAST程序分析(Basic LocalAlignment Search Tool；Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215：403-410(1993))，将得到的序列与其它已知蛋白相对比。更具体地，SEQ ID NO：13与在实施例7中得到的Yl DGAT1部分序列相同，例外是，在简并PCR引物区域存在6个沉默突变。这些涂布包括：在位置6的A-至-G突变；在位置21的A-至-G突变；在位置24的A-至-G突变；在位置1548的T-至-C突变；在位置1552的C-至-T突变；和在位置1557的T-至-C突变。因为这些突变源自简并PCR引物的使用，SEQ ID NO：13的推定氨基酸序列(即，SEQ ID NO：14)与ORF YALI-CDS2141.1(SEQ ID NO：12，对应GenBank登记号NC_006072，基因座标记＝＂YALI0F06578g”)相同。
构建解脂耶氏酵母DGAT1嵌合基因
用NcoI和Not I消化质粒pYAP23-42 1小时，分离含有Yl DGAT1的1.6kB片段，并插入NcoI-和Not I-消化的pZP217+Ura(SEQ ID NO：144；图7DA)，从而将在TEF启动子和PEX20-3’终止子区域控制下的ORF克隆进靶向耶氏酵母POX2基因的整合载体。通过微量制备分析证实正确的转化体，并将得到的质粒称作“pYDA1”。
根据一般方法，加工质粒pZP217+Ura和pYDA1转化进解脂耶氏酵母的菌株“MU-D2”(同上，实施例11)。将转化体涂布到MM上，挑取单个菌落，纯化，并分析，以确定超量表达的DGAT1对脂含量的影响。更具体地，分析下述培养物中的脂含量：“MU”(“野生型”)，用pZP217+Ura转化的MU-D2，和用pYDA1转化的MU-D2(克隆#5，6，7和16)。将几环来自上述每种菌株的细胞接种进50mL MM，在30℃摇床中生长48小时。收获细胞，在HGM中洗涤一次，重新悬浮于30mL HGM培养基，如上所述生长另外4天。生长后，使用来自每种培养物的100μL等分试样，测定在600nm的吸光度(OD600)，1mL等分试样用于GC分析。为此，收获1mL样品，在水中洗涤一次，离心，沉淀用于按照基本方法的直接酯交换的脂测定和GC分析(如一般方法中所述)。收获剩余的培养物，在水中洗涤一次，低压冻干，得到干细胞重。
在下面的表中显示了结果。将培养物描述为“MU”菌株(“野生型”)和“MU-D2”(DGAT2敲除)。使用的缩写是：“WT”＝野生型(即，具有DGAT2敲除的菌株MU-D2)；“OD”＝光密度；“dcw”＝干细胞重；“TFAs”＝总脂肪酸；和，“TFAs ％ dcw，％ WT”＝相对于野生型(“MU-D2”)菌株的TFAs ％ dcw。
表17
工程化成生产EPA和超量表达DGAT1的耶氏酵母菌株中的脂含量
 
菌株 OD dcw，mg TFAs，μg TFAs％ dcw TFAs ％ dcw，％ WT
MU 2.1 33 195 17.0
MU-D2+pZP217+Ura 1.8 31 82 7.7 100
MU-D2+pYDA1，克隆#5 2.1 31 192 17.8 231
MU-D2+pYDA1，克隆#6 1.3 22 338 21.3 278
MU-D2+pYDA1，克隆#7 4.4 72 146 5.9 76
MU-D2+pYDA1，克隆#16 2.2 34 195 16.9 220
总之，结果证实，DGAT1的超量表达能补偿菌株MU-D2中DGAT2活性的缺失，导致脂含量约等于或大于菌株MU(即，MU-D2+pYDA1，克隆#5，6和16具有约等于或大于菌株MU的脂含量(测量为TFAs ％dcw))。MU-D2+pYDA1，克隆#5，6和16中的该脂含量大于对照菌株MU-D2+pZP217+Ura的2倍。这些结果进一步证实，耶氏酵母DGAT1编码参与油生物合成的功能性DAG AT。
与克隆#5，6和16相比，转化体MU-D2+pYDA1，克隆#7没有表现出脂含量的增加。但是，由于这些染色体整合通常是随机的，可以预见到这样的偏差。
实施例13
高山被孢霉cDNA文库的构建和测序
本实施例描述了高山被孢霉cDNA文库的构建和和随后的文库测序
合成高山被孢霉cDNA
根据制造商的方案，使用BD-Clontech Creator  cDNA文库试剂盒(Mississauga，ON，Canada)，合成了高山被孢霉cDNA。
更具体地，在23℃，将高山被孢霉菌株ATCC #16266在60mL YPD培养基(2％细菌用酵母提取物，3％细菌用肽胨，2％葡萄糖)中培养3天。通过在Beckman GH3.8转子中3750rpm离心10min，沉淀细胞，并重新悬浮于6X 0.6mL Trizole试剂(Invitrogen)。将重新悬浮的细胞转移到6个2mL螺旋帽试管中，每个试管装有0.6mL 0.5mm玻璃珠。在Biospec(Bartlesville，OK)微珠搅拌机上，在HOMOGENIZE设置，匀浆细胞2min。短时间离心试管，沉淀珠子。将液体转移至4个新的1.5mL微量离心试管，向每个试管中加入0.2mL氯仿/异戊醇(24:1)。用手摇动试管1min，静置3min。然后在4℃，在14,000rpm离心试管10min。将上层转移至4个新试管。将异丙醇(0.5mL)加入每个试管中。在室温温育试管15min，然后在14,000rpm、4℃离心10min。各用1mL 75％乙醇(由无RNA酶的水制备)洗涤沉淀，并在空气中干燥。然后，将总RNA样品重新溶于500μl水，使用1:50稀释的RNA样品，在A260nm测量RNA的量。得到共计3.14mg RNA。
根据制造商的方案，用Qiagen Rneasy总RNA Midi试剂盒进一步纯化该总RNA样品。从而，将总RNA样品稀释至2mL，并与含有80μl -巯基乙醇和5.6mL 100％乙醇的8mL缓冲液RLT相混合。将样品分成4份，装载4 RNeasy midid柱。然后，在4500Xg离心柱5min。为了洗涤柱，装载2mL缓冲液RPE，在4500Xg离心柱2min。重复洗涤步骤1次，例外是，将离心延长至5min。如下洗脱总RNA：向每个柱中应用250μl无RNA酶的水，等待1min，在4500Xg离心3min。
按照Pharmacia的试剂盒手册，从上面的总RNA样品分离聚A(+)RNA。简而言之，使用2个寡-dT-纤维素柱。各用1mL高盐缓冲液，洗涤柱2次。将来自前一步骤的总RNA样品稀释至2mL总体积，并调节至10mM Tris/HCl，pH 8.0，1mM EDTA。在65℃加热样品5min，然后置于冰上。加入样品缓冲液(0.4mL)，然后在重力进料下，将样品装载到2个寡-dT-纤维素柱上。在350Xg离心柱2min，各用0.25mL高盐缓冲液洗涤2次，每次洗涤后在350Xg离心2min。在相同的离心程序后，再用低盐缓冲液洗涤柱3次。通过各用0.25mL预热至65℃的洗脱缓冲液洗涤柱4次，洗脱聚(A)+RNA，随后进行相同的离心程序。重复整个纯化过程一遍。得到的纯化的聚(A)+RNA的浓度为30.4ng/μl。
使用BD-Clontech描述的LD-PCR方法和0.1μg聚A(+)RNA样品，制备cDNA。更具体地，就第1链cDNA合成而言，将3μl聚(A)+RNA样品与1μl SMART IV寡核苷酸(SEQ ID NO：145)和1μl CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：146)相混合。在72℃加热混合物2min，在冰上冷却2min。向试管中加入下述物质：2μl第1链缓冲液，1μl 20mM DTT，1μl10mM dNTP混合物和1μl Powerscript逆转录酶。在42℃温育混合物1小时，然后在冰上冷却。
将第1链cDNA合成混合物用作PCR反应的模板。更具体地，反应混合物含有下述物质：2μl第1链cDNA混合物，2μl 5’-PCR引物(SEQ IDNO：147)，2μl CDSIII/3’-PCR引物(SEQ ID NO：146)，80μl水，10μl 10XAdvantage 2 PCR缓冲液，2μl 50X dNTP混合物和2μl 50X Advantage 2聚合酶混合物。将热循环仪条件设定为：95℃ 20sec，然后是在GenAmp 9600仪器上的14个95℃ 5sec和68℃ 6min的循环。通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，定量PCR产物。
将75μl上述PCR产物(cDNA)与3μl 20μg/μl蛋白酶K(与试剂盒一起提供)相混合。在45℃温育混合物20min，然后加入75μl水，用150μl苯酚:氯仿:异戊醇混合物(25:24:1)提取混合物。用150μl氯仿:异戊醇(25:1)进一步提取水相。然后，将水相与15μl 3M醋酸钠，2μl 20μg/μl糖原和400μl 100％乙醇相混合。立即在离心机中在室温在14000rpm离心混合物20min。用150μl 80％乙醇洗涤沉淀一次，在空气中干燥，溶于79μl水。
随后用SfiI消化溶解的cDNA(将79μl cDNA与10μl 10X SfiI缓冲液，10μl SfiI酶和1μl 100X BSA相混合，在50℃温育混合物2小时)。加入二甲苯蓝染料(2μl 1％)。然后完全按照制造商的方案，在与试剂盒一起提供的Chroma Spin-400柱上分离混合物。通过琼脂糖凝胶电泳，分析从柱收集的级分。合并含有cDNA的前3个级分，并用乙醇沉淀cDNA。将沉淀的cDNA重新溶于7μl水，并连接进试剂盒-提供的pDNR-LIB。
文库测序
将连接产物用于转化大肠杆菌XL-1 Blue电穿孔感受态细胞(Stratagene)。得到估计共2 x 106菌落。使用M13正向引物(SEQ IDNO：148)，通过Agencourt Bioscience Corporation(Beverly，MA)，进行cDNA文库的测序。
实施例14
鉴别和克隆高山被孢霉二酰基甘油酰基转移酶(DGAT1)基因
本实施例描述了在9,984 cDNA序列之一内的推定的高山被孢霉DGAT1的鉴别。更具体地，使用BLAST程序分析(Basic Local AlignmentSearch Tool；Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215：403-410(1993))，将解脂耶氏酵母DGAT1蛋白序列(实施例7，SEQ ID NO：14)用作针对每个高山被孢霉cDNA序列的查询序列。1个cDNA片段与解脂耶氏酵母DGAT1具有显著同源性，因而暂时鉴别为高山被孢霉DGAT1(SEQ IDNO：175)。随后进行BLAST分析，使用SEQ ID NO：175作为针对公开得到的序列数据库的查询，证实了该cDNA的与来自几种其它物种的DGAT1的显著程度的相似性。然后，将cDNA末端快速扩增(RACE)技术和基因组步移用于分离其整个高山被孢霉编码序列。
分离基因组DNA
使用QiaPrep Spin微量制备试剂盒(Qiagen，目录号627106)，从高山被孢霉(ATCC #16266)分离基因组DNA。刮下在YPD琼脂平板上生长的细胞，重新悬浮于1.2mL试剂盒缓冲液P1。将重新悬浮的细胞置于2个2.0mL螺旋帽试管中，每个试管装有0.6mL玻璃珠(0.5mm直径)。在Biospec(Bartlesville，OK)微珠搅拌机上，在HOMOGENIZE设置，匀浆细胞2min。然后在Eppendorf微量离心机中在14,000rpm离心试管2min。将上清液(0.75mL)转移至3个1.5mL微量离心试管。向每个试管中加入等体积的试剂盒缓冲液P2。通过反转混合试管3次后，将0.35mL缓冲液N3加入每个试管。通过反转混合试管5次，再次混合物内容物。在Eppendorf微量离心机中在14,000rpm离心混合物5min。将每个试管的上清液转移进分开的试剂盒离心柱中。在14,000rpm离心柱1min，用缓冲液PE洗涤一次，再在14,000rpm离心柱1min，然后在14,000rpm最后离心1min。将缓冲液EB(50μl)加入每个柱中，静置1min。然后通过在14,000rpm离心1min，洗脱基因组DNA。
克隆推定的DGAT1基因的5’-末端区域
使用Clontech Universal GenomeWalkerTM试剂盒(Palo Alto，CA)来得到一片与高山被孢霉DGAT1的5’-末端区域相对应的基因组DNA。基于可得到的部分DGAT1基因序列(SEQ ID NO：149)，合成下面的克隆用引物：MARE2-N1和MARE2-N2(SEQ ID NO：150和151)。
简而言之，用DraI，EcoRV，PvuII或StuI单独地消化2.5μg每个高山被孢霉基因组DNA，使用Qiagen Qiaquick PCR纯化试剂盒，纯化消化的DNA样品，并用各30μl试剂盒缓冲液EB洗脱，并用如下所示的基因组步移接头(SEQ ID NO：152[上链]和153[下链])，连接纯化的样品：
5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3’
                                    3’-H2N-CCCGACCA-5’
更具体地，每种连接反应混合物含有1.9μl 25μM基因组步移接头，1.6μl10X连接缓冲液，0.5μl T4 DNA连接酶和4μl纯化的消化的基因组DNA样品之一。在16℃温育反应混合物过夜。通过在70℃温育5min，终止反应。然后，将72μl 10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH 7.4缓冲液加入每种连接反应混合物。
然后，使用每种连接产物作为模板，进行4个PCR反应。每种PCR反应混合物含有1μl连接混合物，1μl 20μM MARE2-N1(SEQ IDNO：150)，2μl 10μM试剂盒引物AP1(SEQ ID NO：154)，21μl水和25μlExTaq预混合Taq 2X PCR溶液(TaKaRa Bio Inc.，Otsu，Shiga，520-2193，Japan)。如下进行PCR扩增：30个循环，在94℃变性30sec，在55℃退火30sec，和在72℃延伸90sec。最后的延伸是在72℃ 7min，随后在4℃终止反应。
使用1μl作为模板的1:50稀释的第一种PCR产物，1μl 20μMMARE2-N2(SEQ ID NO：151)，2μl 10uM试剂盒引物AP2(SEQ IDNO：155)，21μl水和25μl ExTaq预混合Taq 2X PCR溶液(TaKaRa)，进行第二个PCR反应。使用与上面相同的条件，进行PCR反应30个循环。
当DraI-消化的且接头-连接的基因组DNA用作模板时，观察到约1.6kb PCR产物。使用Qiagen PCR纯化试剂盒，纯化该片段，连接进pCR2.1-TOPO，并测序。序列(SEQ ID NO：156)的分析证实，该DNA片段是DGAT1 cDNA片段的5’-末端延伸。
克隆推定的DGAT1基因的3’-末端区域
为了通过RACE克隆推定的DGAT1基因的3’-区域，合成了下面的引物：ARE-N3-1和ARE-N3-2(分别是SEQ ID NO：157和158)。
按照制造商的方案，使用InVitrogen的3’-末端RACE试剂盒，进行3’-末端RACE。简而言之，将在11μl水中的90ng高山被孢霉聚A(+)RNA样品与1μl 10μM接头引物(AP，SEQ ID NO：159)溶液相混合。在70℃加热混合物10min，在冰上冷却2min。然后，加入2μl各10X PCR缓冲液，25mM MgCl2和0.1M DTT，和1μl 10mM dNTP混合物。在42℃加热反应混合物3min，然后加入试剂盒-提供的SuperscriptII逆转录酶(1μl)。该反应在42℃进行50min。此后，在70℃加热反应混合物15min，在冰上冷却2min。加入来自试剂盒的RNaseH(1μl)，将整个混合物在37℃温育20min。
将反应混合物(2μl)直接用作PCR模板。PCR反应混合物含有1μl20μM ARE-N3-1(SEQ ID NO：157)，2μl 10uM试剂盒引物UAP(SEQID NO：160)，25μl ExTaq预混合Taq 2X PCR溶液(TaKaRa)和20μl水。如前所述进行PCR扩增。然后，将稀释的PCR反应混合物(1μl1:10稀释)用作第二轮PCR的模板，所述第二轮PCR使用相同条件，例外是，用引物ARE-N3-2(SEQ ID NO：158)替代引物AREN3-1。
从PCR得到约300bp片段。用Qiagen的QiaQuick PCR纯化试剂盒纯化后，将片段克隆进pCR2.1-TOPO，并测序。序列分析证实，该序列编码DGAT1 cDNA的3’-末端，包含聚A尾(SEQ ID NO：161)。
编码高山被孢霉DGAT1的核苷酸序列的完全组装
组装5’-区域(SEQ ID NO：156)、起始的cDNA片段(SEQ ID NO：149)和3’-区域(SEQ ID NO：161)的序列，产生整个高山被孢霉DGAT1编码序列(SEQ ID NO：17)。5’-区域基因组序列包含内含子(SEQ ID NO：17内的核苷酸碱基449-845)。
实施例15
为生产多不饱和脂肪酸而工程化的解脂耶氏酵母菌株Y2067U中的高 山被孢霉DGAT1的表达
本实施例描述了高山被孢霉DGAT1在解脂耶氏酵母菌株Y2067U中的表达(同上，实施例10)，和MDGAT1表达对生产的EPA和其它PUFA的终浓度的影响。
如下克隆高山被孢霉DGAT1 ORF。首先，为了辅助克隆cDNA，将DGAT1的第2个密码子的序列从‘ACA’改变成‘GCA’，导致从苏氨酸至丙氨酸的氨基酸变化。这通过用引物MACAT-F1和MACAT-R(分别是SEQ ID NO：162和163)扩增高山被孢霉DGAT1 ORF的整个编码区来实现。更具体地，PCR反应混合物含有1μl各20μM引物MACAT-F1和MACAT-R溶液，1μl高山被孢霉cDNA(同上，实施例13)，22μl水和25μl ExTaq预混合2X Taq PCR溶液(TaKaRa Bio Inc.，Otsu，Shiga，520-2193，Japan)。如下进行扩增：在94℃初步变性150sec，随后30个下述循环，在94℃变性30sec，在55℃退火30sec，在72℃延伸90sec。进行在72℃ 10min的最后延伸循环，然后在4℃终止反应。从PCR反应得到约1600bp DNA片段。根据制造商的方案，使用Qiagen的PCR纯化试剂盒，进行纯化。
将高山被孢霉DGAT1 ORF插入Nco I-和Not I-消化的质粒pZUF17(SEQ ID NO：164；图7E)，使得ORF克隆在FBAIN启动子(SEQID NO：111)和PEX20-3’终止子区域控制下。但是，由于DGAT1 ORF含有内在的NcoI位点，克隆必需进行2个分开的限制酶消化。首先，用BamHI和Nco I消化约2μg纯化的PCR产物。反应混合物含有20U每种酶(Promega)和6μl限制缓冲液D，总体积为60μl。在37℃温育混合物2小时。通过琼脂糖凝胶电泳分离约320bp片段，并使用Qiagen QiaexII凝胶纯化试剂盒进行纯化。单独地，使用与上面相同的反应条件，例外是用Not I替代Nco I，用BamHI和Not I消化约2μg纯化的PCR产物，如上分离和纯化约1280bp片段。最后，用Nco I和Not I消化约3μgpZUF17，并如上纯化，制备约7kB片段。
在三向连接中，将约7kB Nco I/Not I pZUF17片段，约320bp NcoI/BamHI DGAT1片段和约1280bp BamHI/Not I DGAT1片段连接到一起，在室温温育过夜。连接混合物含有100ng 7kB片段以及320bp和1280bp片段各200ng，2μl连接酶缓冲液，和2U T4 DNA连接酶(Promega)，总体积为20μl。根据制造商的方案，将连接产物用于转化大肠杆菌Top10化学感受态细胞(Invitrogen)。将转化的单个菌落(共12个)用于接种培养物，用于微量制备分析。限制图谱和测序证实，5/12菌落携带目标质粒，其称作“pMDGAT1-17”(图4C；SEQ ID NO：165)。
如下制备“对照”载体pZUF-MOD-1(SEQ ID NO：168)。首先，使用pDNR-LIB(ClonTech，Palo Alto，CA)作为模板，将引物pzuf-mod1(SEQID NO：166)和pzuf-mod2(SEQ ID NO：167)用于扩增252bp“填充片段”DNA片段。用Qiagen QiaQuick PCR纯化试剂盒纯化扩增的片段，使用标准条件，用NcoI和NotI消化，然后再用QiaQuick PCR纯化试剂盒进行纯化。将该片段连接进类似地消化的NcoI-/NotI-剪切的pZUF17载体(SEQ ID NO：164；图10E)，并将得到的连接混合物用于转化大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen)。使用Qiagen QiaPrep Spin微量制备试剂盒，从4个得到的菌落纯化质粒DNA。用NcoI和NotI消化纯化的质粒，证实约250bp片段的存在。得到的质粒称作“pZUF-MOD-1”(图4D；SEQ IDNO：168)。
根据一般方法，分别用pMDGAT1-17和pZUF-MOD-1转化解脂耶氏酵母菌株Y2067U(来自实施例10，生成占总脂14％的EPA)。使转化体在添加了氨基酸的合成MM中生长2天，然后在HGM中生长4天。基于GC分析(如一般方法中所述)，在表18中显示了含有pMDGAT1-17的2个转化体和含有pZUF-MOD-1的2个转化体的脂肪酸谱。将脂肪酸鉴别为18:0，18:1(油酸)，18:2(LA)，GLA，DGLA，ARA，ETA和EPA；和各自的组成表达为总脂肪酸的％。
表18
工程化成超量表达高山被孢霉DGAT1的耶氏酵母菌株Y2067U 中的脂含量
Figure A200580045917D01031
如上面所证实的，来自质粒pMDGAT1-17的高山被孢霉DGAT1的表达，使EPA浓度从“对照”菌株的约13.3％分别增加到约14.1％(“Y2067U+pMDGAT1-17 #1”)和约15.1％(“Y2067U+pMDGAT1-17#2”)。
实施例16
鉴别DGAT1真菌同系物
本实施例描述了使用解脂耶氏酵母和高山被孢霉DGAT1序列(分别是SEQ ID NO：13和17)来鉴别其它真菌中的定向进化同源蛋白。
通过与BLAST“nr”数据库(comprising all non-redundant GenBankCDS translations，序列derived from the 3-dimensional structureBrookhaven蛋白Data Bank，the SWISS-PROT蛋白序列数据库，EMBL和DDBJ数据库)中包含的序列进行BLAST搜索相似性，鉴别了定向进化同源的DGAT1真菌蛋白。使用National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)提供的BLASTN算法，分析解脂耶氏酵母和高山被孢霉DGAT1序列(SEQ ID NO：13和17)与“nr”数据库中包含的所有公开得到的DNA序列的相似性。在所有读码框中翻译DNA序列，并使用NCBI提供的BLASTX算法(Gish，W.和States，D.J.Nature Genetics 3：266-272(1993))，与“nr”数据库中包含的所有公开得到的蛋白序列对比相似性。这些搜索鉴别出了4种定向进化同源的蛋白(如下面的表19所示)。另外，表19显示了解脂耶氏酵母DGAT1序列(SEQ ID NO：13)与本文公开的每种DGAT1蛋白之间的序列对比的结果，表达为观察到的“％同一性”(定义为两种蛋白之间一致的氨基酸的百分比)。
表19
解脂耶氏酵母DGAT1与来自真菌的定向进化同源的DGAT1的对比
 
生物 缩写 ％同一性 GenBank登记号，参照和注解 SEQID NO
高山被孢霉 MaDGAT1 32.4 --- 18
粗糙链孢霉菌株OR74A NcDAGAT1 37.0 XP_322121；gi|32403016|ref|XP_322121.1|假定蛋白；gi|28918105|gb|EAA27786.1|假定蛋白 19
玉米赤霉PH-1 FmDAGAT1 38.1 EAA77624；gi|42554781|gb|EAA77624.1|假定蛋白FG06688.1 20
Magnaporthegrisea 70-15 MgDAGAT1 36.2 EAA52634；gi|38106308|gb|EAA52634.1|假定蛋白MG05326.4 21
构巢曲霉FGSC A4 AnDAGAT1 41.7 EAA57945；gi|40738755|gb|EAA57945.1|假定蛋白AN6159.2 22
实施例17
鉴别通用的和真菌的DGAT1基序
本实施例描述了使用本发明的DGAT1序列，以及其它已知DGAT1序列，来鉴别真菌的和通用的DGAT1基序。
为了鉴别指示DGAT1蛋白的基序(即，一组沿着进化相关蛋白的比对序列在特定位置上保守的氨基酸)，首先必须建立DGAT1序列的比对。为此，使用下面的真菌序列：SEQ ID NO：14，18，19，20，21和22。另外，在比对排列中也包含来自6种非真菌来源的DGAT1定向进化同源物：小鼠(Mm DGAT1；GenBank登记号AF384160，对应本文的SEQ ID NO：169)；大豆(Gm DGAT1；US20040088759A1的SEQ IDNO：16，对应本文的SEQ ID NO：170)；拟南芥(At DGAT1；US20040088759A1的SEQ ID NO：2，对应本文的SEQ ID NO：171)；稻(Os DGAT1；US20040088759A1的SEQ ID NO：14，对应本文的SEQ IDNO：172)；小麦(Ta DGAT1；US20040088759A1的SEQ ID NO：22，对应本文的SEQ ID NO：174)；和Perilla frutescens(Pf；GenBank登记号AF298815，对应本文的SEQ ID NO：173)。
使用DNASTAR的Megalign程序，使用具有下述参数的Clustal W和Gonnet系列蛋白重量矩阵进行比对：gap penalty＝10，gap lengthpenalty＝0.2，delay divergent seqs(％)＝30，DNA transition weight＝0.5。在图8a，8b，8c，8d，8e，8f，8g和8h中，显示了该比对的结果。基于比对分析，鉴别出了真菌DGAT1序列独有的8个基序。另外，还推定了普遍存在于来自植物、动物和真菌的DGAT1序列中的7个基序。
表20
真菌的和通用的DGAT1基序
 
基序 比对位置＊ 真菌基序序列和SEQ ID NO 通用基序序列和SEQ ID NO
#1 97-104 (F/Y)xGFxN(L/I)(M/G)(SEQ ID NO：23) xxGxxNxx(SEQ ID NO：31)
#2 278-284 (P/O)YPxN(I/V)T(SEQ ID NO：24) n/a
#3 334-340 QYAxPx(L/M)(SEQ ID NO：25) Q(Y/W)xxPxx(SEQ ID NO：32)
#4 364-374 KL(A/S)(T/S)x1 SXX(I/V)WL(其中x1不是P)(SEQ ID NO：26) KL(A/S)xxxxxxWL(SEQ ID NO：33)
#5 418-424 PV(Y/N)(O/T/I)(Y/F)(F/M)(K/R)(SEQ ID NO：27) PVxxxxx(SEQ ID NO：34)
 
#6 415-424 WN(K/R/S)PV(Y/N)x1 (Y/F)(F/M)(K/R)(其中x1不是K)(SEQ ID NO：28) WNxPVxxxxx(SEQ ID NO：35)
#7 456-466 LxGxPTHxx(I/Y)G(SEQ ID NO：29) xxxxPxxxxxx(SEQ ID NO：36)
#8 513-519 A(L/F)(L/M)Y(F/Y)X(A/H)(SEQ ID NO：30) x(L/F)(L/M)Yxxx(SEQ ID NO：37)
＊[注：比对位置是相对于本文鉴别为SEQ ID NO：14的解脂耶氏酵母DGAT1。以粗体显示且标有下划线的那些残基仅在真菌DGAT1序列中是保守的]
在蛋白同系物家族的序列比对中位于位置97-104，278-284，334-340，364-374，418-424，415-424，456-466和513-519(其中比对位置是相对于SEQ ID NO：14)的这些基序在DGAT1蛋白中具有高度的保守性；这样，预期位于该位置的氨基酸残基是蛋白的结构、稳定性或活性所必需的。基于观察到的序列保守性，本领域技术人员会知道如何使用SEQ IDNO：23-37提供的基序作为标识符或“标记”，来确定具有新确定的序列的蛋白是否属于本文所述的DGAT1蛋白家族。
序列表
<110>E.I.duPont de Nemours and Company
<120>用于改变含油生物的多不饱和脂肪酸和油含量的二酰基甘油酰基转移酶
<130>CL2717 PCT
<140>US 11/024,544
<141>2004-12-29
<160>175
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2119
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>CDS
<222>(291)..(1835)
<223>DGAT2开放读码框，包含2个更小的内部开放读码框
<220>
<221>misc_feature
<222>(291)..(293)
<223>起始密码子(’ATG’)
<220>
<221>misc_feature
<222>(456)..(458)
<223>起始密码子(’ATG’)
<220>
<221>misc_feature
<222>(768)..(770)
<223>起始密码子(’ATG’)
<400>1
Figure A200580045917D01081
Figure A200580045917D01091
Figure A200580045917D01101
<210>2
<211>514
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<400>2
Figure A200580045917D01112
Figure A200580045917D01121
Figure A200580045917D01131
<210>3
<211>1380
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<400>3
Figure A200580045917D01132
<210>4
<211>459
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<400>4
Figure A200580045917D01142
Figure A200580045917D01151
Figure A200580045917D01161
<210>5
<211>1068
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<400>5
Figure A200580045917D01162
Figure A200580045917D01171
<210>6
<211>355
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<400>6
Figure A200580045917D01191
<210>7
<211>2326
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>misc_feature
<222>(2271)..(2271)
<223>n是a，c，g，或t
<400>7
Figure A200580045917D01192
<210>8
<211>648
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<400>8
Figure A200580045917D01202
Figure A200580045917D01221
<210>9
<211>1632
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>misc_feature
<223>菌株CLIB99，染色体F
<300>
<308>GenBank NC_006072，碱基974607-976238，基因座标记＝″YALIOF06578g″
<309>2004-07-30
<313>(1)..(1632)
<400>9
Figure A200580045917D01241
<210>10
<211>543
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>菌株CLIB99，染色体F
<300>
<308>GenBank NC_006072，基因座标记＝″YALIOF06578g″
<309>2004-07-30
<313>(1)..(543)
<400>10
Figure A200580045917D01251
Figure A200580045917D01261
Figure A200580045917D01271
<210>11
<211>1581
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>misc_feature
<223>菌株CLIB99，染色体D
<300>
<308>GenBank CR382130，碱基1026155-1027735，基因座标记＝″YALIOD07986g″
<309>2005-04-17
<313>(1)..(1581)
<400>11
Figure A200580045917D01272
Figure A200580045917D01281
<210>12
<211>526
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>菌株CLIB99，染色体D
<300>
<308>GenBank CR382130，基因座标记＝″YALIOD07986g″
<309>2005-04-17
<313>(1)..(526)
<400>12
Figure A200580045917D01291
Figure A200580045917D01301
<210>13
<211>1578
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<400>13
Figure A200580045917D01312
<210>14
<211>526
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>misc_feature
<222>(518)..(518)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<400>14
Figure A200580045917D01322
Figure A200580045917D01331
<210>15
<211>1632
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<400>15
Figure A200580045917D01351
Figure A200580045917D01361
<210>16
<211>543
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<400>16
Figure A200580045917D01362
Figure A200580045917D01371
Figure A200580045917D01381
<210>17
<211>1578
<212>DNA
<213>高山被孢菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(466)..(466)
<223>n是a，c，g，或t
<400>17
Figure A200580045917D01382
Figure A200580045917D01391
<210>18
<211>525
<212>PRT
<213>高山被孢菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(156)..(156)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<400>18
Figure A200580045917D01392
Figure A200580045917D01411
<210>19
<211>533
<212>PRT
<213>粗糙链孢霉
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>菌株OR74A
<300>
<308>GenBank登记号XP_322121
<309>2005-01-26
<313>(1)..(533)
<400>19
Figure A200580045917D01422
Figure A200580045917D01431
Figure A200580045917D01441
<210>20
<211>499
<212>PRT
<213>玉米赤霉PH-1
<300>
<308>GenBank登记号EAA77624
<309>2004-02-13
<313>(1)..(499)
<400>20
Figure A200580045917D01451
Figure A200580045917D01461
Figure A200580045917D01471
<210>21
<211>503
<212>PRT
<213>Magnaporthe grisea 70-15
<300>
<308>GenBank登记号EAA52634
<309>2003-10-31
<313>(1)..(503)
<400>21
Figure A200580045917D01481
Figure A200580045917D01491
<210>22
<211>458
<212>PRT
<213>构巢曲霉FGSC A4
<300>
<308>GenBank登记号EAA57945
<309>2004-09-09
<313>(1)..(458)
<400>22
Figure A200580045917D01501
Figure A200580045917D01511
<210>23
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>真菌DGAT1基序#1
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa＝F或Y
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa＝L或I
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa＝M或G
<400>23
Figure A200580045917D01521
<210>24
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>真菌DGAT1基序#2
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa＝P或Q
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝I或V
<400>24
Figure A200580045917D01531
<210>25
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>真菌DGAT1基序#3
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa＝L或M
<400>25
Figure A200580045917D01532
<210>26
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>真菌DGAT1基序#4
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa＝A或S
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝T或S
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa＝can not be P
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(8)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa＝I或V
<400>26
Figure A200580045917D01541
<210>27
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>真菌DGAT1基序#5
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa＝Y或N
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝Q或T或I
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa＝Y或F
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝F或M
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa＝K或R
<400>27
Figure A200580045917D01542
<210>28
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>真菌DGAT1基序#6
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa＝K或R或S
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝Y或N
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa不能是K
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa＝Y或F
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa＝F或M
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝K或R
<400>28
<210>29
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>真菌DGAT1基序#7
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(9)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝I或Y
<400>29
Figure A200580045917D01561
<210>30
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>真菌DGAT1基序#8
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝L或F
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa＝L或M
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa＝F或Y
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa＝A或H
<400>30
<210>31
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Universal DGAT1基序#1
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(5)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(8)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<400>31
Figure A200580045917D01572
<210>32
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>通用DGAT1基序#3
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Y或W
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(4)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(7)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<400>32
Figure A200580045917D01581
<210>33
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>通用DGAT1基序#4
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa＝A或S
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(9)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<400>33
Figure A200580045917D01582
<210>34
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>通用DGAT1基序#5
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(7)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<400>34
Figure A200580045917D01583
<210>35
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>通用DGAT1基序#6
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(10)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<400>35
Figure A200580045917D01591
<210>36
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>通用DGAT1基序#7
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(4)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(11)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<400>36
<210>37
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>通用DGAT1基序#8
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝L或F
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa＝L或M
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(7)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<400>37
Figure A200580045917D01601
<210>38
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>真菌DGAT2基序
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>Xaa可以是任意的天然存在的氨基酸
<300>
<302>二酰基甘油酰基转移酶核酸序列和相关产物
<310>US 2004/0107459 A1
<311>2003-07-31
<312>2004-06-03
<313>(1)..(7)
<400>38
<210>39
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物TEF5’
<400>39
Figure A200580045917D01611
<210>40
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物TEF3’
<400>40
Figure A200580045917D01612
<210>41
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物XPR5’
<400>41
Figure A200580045917D01613
<210>42
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物XPR3’
<400>42
Figure A200580045917D01614
<210>43
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL5
<400>43
Figure A200580045917D01615
<210>44
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL6
<400>44
Figure A200580045917D01621
<210>45
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL9
<400>45
Figure A200580045917D01622
<210>46
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL10
<400>46
Figure A200580045917D01623
<210>47
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL7
<400>47
<210>48
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL8
<400>48
Figure A200580045917D01625
<210>49
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL3
<400>49
Figure A200580045917D01631
<210>50
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL4
<400>50
<210>51
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL1
<400>51
Figure A200580045917D01633
<210>52
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL2
<400>52
<210>53
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL61
<400>53
Figure A200580045917D01635
<210>54
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物YL62
<400>54
Figure A200580045917D01641
<210>55
<211>8196
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pY20
<400>55
Figure A200580045917D01642
Figure A200580045917D01651
Figure A200580045917D01661
Figure A200580045917D01671
Figure A200580045917D01691
<210>56
<211>1026
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>56
Figure A200580045917D01692
<210>57
<211>341
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>57
Figure A200580045917D01701
Figure A200580045917D01711
<210>58
<211>1710
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<400>58
Figure A200580045917D01712
Figure A200580045917D01721
<210>59
<211>286
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<400>59
Figure A200580045917D01722
Figure A200580045917D01731
<210>60
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物KU5
<400>60
Figure A200580045917D01741
<210>61
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物KU3
<400>61
<210>62
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P7
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>n是a，c，g，或t
<400>62
Figure A200580045917D01743
<210>63
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>DGAT2共有序列
<400>63
Figure A200580045917D01744
<210>64
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P8
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>n是a，c，g，或t
<400>64
Figure A200580045917D01751
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>DGAT2共有序列
<400>65
<210>66
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P80
<400>66
Figure A200580045917D01753
<210>67
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P81
<400>67
Figure A200580045917D01754
<210>68
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LinkAmp引物1
<400>68
Figure A200580045917D01761
<210>69
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P95
<400>69
Figure A200580045917D01762
<210>70
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P96
<400>70
Figure A200580045917D01763
<210>71
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P97
<400>71
<210>72
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P98
<400>72
Figure A200580045917D01765
<210>73
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P115
<400>73
Figure A200580045917D01771
<210>74
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P116
<400>74
<210>75
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P112
<400>75
Figure A200580045917D01773
<210>76
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P26
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>n是a，c，g，或t
<400>76
Figure A200580045917D01774
<210>77
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PDAT共有序列
<400>77
Figure A200580045917D01781
<210>78
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P27
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(25)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(31)..(31)
<223>n是a，c，g，或t
<400>78
Figure A200580045917D01782
<210>79
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>PDAT共有序列
<400>79
Figure A200580045917D01783
<210>80
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P39
<400>80
Figure A200580045917D01791
<210>81
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P42
<400>81
Figure A200580045917D01792
<210>82
<211>5105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pLV13
<220>
<221>misc_feature
<222>(4446)..(4446)
<223>n是a，c，g，或t
<400>82
Figure A200580045917D01793
Figure A200580045917D01801
Figure A200580045917D01821
<210>83
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P41
<400>83
<210>84
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P40
<400>84
Figure A200580045917D01823
<210>85
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P51
<400>85
Figure A200580045917D01831
<210>86
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P52
<400>86
Figure A200580045917D01832
<210>87
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P37
<400>87
Figure A200580045917D01833
<210>88
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P38
<400>88
<210>89
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P79
<400>89
Figure A200580045917D01835
<210>90
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P84
<400>90
Figure A200580045917D01841
<210>91
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P85
<400>91
Figure A200580045917D01842
<210>92
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P201
<400>92
Figure A200580045917D01843
<210>93
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P203
<220>
<221>misc_feature
<222>(38)..(38)
<223>n是a，c，g，或t
<400>93
Figure A200580045917D01844
<210>94
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P214
<400>94
Figure A200580045917D01851
<210>95
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P215
<400>95
Figure A200580045917D01852
<210>96
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P216
<400>96
Figure A200580045917D01853
<210>97
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P217
<400>97
<210>98
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P218
<400>98
Figure A200580045917D01855
<210>99
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P219
<400>99
Figure A200580045917D01861
<210>100
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P226
<400>100
Figure A200580045917D01862
<210>101
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P227
<400>101
<210>102
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P205
<220>
<221>misc_feature
<222>(39)..(39)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(42)..(42)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(45)..(45)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(48)..(48)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(51)..(51)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(54)..(54)
<223>n是a，c，g，或t
<400>102
Figure A200580045917D01871
<210>103
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P208
<220>
<221>misc_feature
<222>(44)..(44)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(47)
<223>n是a，c，g，或t
<400>103
Figure A200580045917D01872
<210>104
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P220
<400>104
Figure A200580045917D01873
<210>105
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P221
<400>105
Figure A200580045917D01881
<210>106
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P222
<400>106
Figure A200580045917D01882
<210>107
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P223
<400>107
Figure A200580045917D01883
<210>108
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P224
<400>108
Figure A200580045917D01884
<210>109
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P225
<400>109
Figure A200580045917D01885
<210>110
<211>12649
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pKUNF12T6E
<220>
<221>misc_feature
<222>(2507)..(2507)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(2512)..(2515)
<223>n是a，c，g，或t
<400>110
Figure A200580045917D01891
Figure A200580045917D01901
Figure A200580045917D01921
Figure A200580045917D01931
Figure A200580045917D01941
Figure A200580045917D01951
Figure A200580045917D01961
<210>111
<211>973
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>misc_feature
<223>启动子FBAIN
<400>111
Figure A200580045917D01962
Figure A200580045917D01971
<210>112
<211>957
<212>DNA
<213>高山被孢菌
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的延伸酶1(密码子优化的)
<400>112
Figure A200580045917D01972
Figure A200580045917D01981
<210>113
<211>318
<212>PRT
<213>高山被孢菌
<300>
<308>GenBank登记号AX464731
<309>2002-07-16
<313>(1)..(318)
<400>113
<210>114
<211>1374
<212>DNA
<213>高山被孢菌
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的δ-6去饱和酶(密码子优化的)
<400>114
Figure A200580045917D01992
Figure A200580045917D02001
<210>115
<211>457
<212>PRT
<213>高山被孢菌
<300>
<308>GenBank登记号AF465281
<309>2002-02-04
<313>(1)..(457)
<400>115
Figure A200580045917D02002
Figure A200580045917D02011
Figure A200580045917D02021
<210>116
<211>1001
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>misc_feature
<223>启动子FBA
<400>116
Figure A200580045917D02031
<210>117
<211>1434
<212>DNA
<213>串珠镰孢
<220>
<221>misc_feature
<223>δ-12去饱和酶
<400>117
Figure A200580045917D02032
<210>118
<211>477
<212>PRT
<213>串珠镰孢
<400>118
Figure A200580045917D02042
Figure A200580045917D02051
Figure A200580045917D02061
<210>119
<211>819
<212>DNA
<213>金黄色破囊壶菌
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的延伸酶(密码子优化的)
<400>119
Figure A200580045917D02071
<210>120
<211>272
<212>PRT
<213>金黄色破囊壶菌
<400>120
Figure A200580045917D02072
Figure A200580045917D02081
<210>121
<211>10945
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pDMW232
<400>121
Figure A200580045917D02091
Figure A200580045917D02111
Figure A200580045917D02141
Figure A200580045917D02151
<210>122
<211>1341
<212>DNA
<213>高山被孢菌
<220>
<221>misc_feature
<223>δ-5去饱和酶
<300>
<308>GenBank登记号AF067654
<309>1998-11-11
<313>(1)..(1341)
<400>122
Figure A200580045917D02161
<210>123
<211>446
<212>PRT
<213>高山被孢菌
<300>
<308>GenBank登记号AF067654
<309>1998-11-11
<313>(1)..(446)
<400>123
Figure A200580045917D02162
Figure A200580045917D02171
Figure A200580045917D02181
<210>124
<211>12690
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pZP3L37
<400>124
Figure A200580045917D02182
Figure A200580045917D02191
Figure A200580045917D02201
Figure A200580045917D02211
Figure A200580045917D02221
Figure A200580045917D02231
Figure A200580045917D02241
Figure A200580045917D02251
Figure A200580045917D02261
<210>125
<211>1077
<212>DNA
<213>异丝水酶
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的δ-17去饱和酶(密码子优化的)
<400>125
Figure A200580045917D02262
<210>126
<211>358
<212>PRT
<213>异丝水酶
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>菌株：ATCC #56851
<400>126
Figure A200580045917D02271
<210>127
<211>924
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>misc_feature
<223>启动子FBAINm
<400>127
Figure A200580045917D02282
Figure A200580045917D02291
<210>128
<211>8194
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pY37/F15
<400>128
Figure A200580045917D02292
Figure A200580045917D02301
Figure A200580045917D02311
Figure A200580045917D02321
Figure A200580045917D02341
<210>129
<211>10448
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pKO2UM26E
<400>129
Figure A200580045917D02342
Figure A200580045917D02351
Figure A200580045917D02361
Figure A200580045917D02371
Figure A200580045917D02381
Figure A200580045917D02391
Figure A200580045917D02401
<210>130
<211>1936
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>CDS
<222>(283)..(1539)
<223>δ-12去饱和酶
<400>130
Figure A200580045917D02411
Figure A200580045917D02421
Figure A200580045917D02431
<210>131
<211>419
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<400>131
Figure A200580045917D02432
Figure A200580045917D02441
Figure A200580045917D02451
<210>132
<211>1130
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>misc_feature
<223>GPAT启动子
<400>132
Figure A200580045917D02452
<210>133
<211>1203
<212>DNA
<213>深黄被孢霉
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1203)
<223>δ-12去饱和酶
<300>
<308>GenBank登记号AF417245
<309>2001-10-11
<313>(1)..(1203)
<400>133
Figure A200580045917D02471
<210>134
<211>400
<212>PRT
<213>深黄被孢霉
<400>134
Figure A200580045917D02481
<210>135
<211>1521
<212>DNA
<213>高山被孢菌
<220>
<221>misc_feature
<223>δ-6去饱和酶
<300>
<308>GenBank登记号AB070555
<309>2004-07-28
<313>(1)..(1521)
<400>135
Figure A200580045917D02501
Figure A200580045917D02511
<210>136
<211>458
<212>PRT
<213>高山被孢菌
<300>
<308>GenBank登记号AB070555
<309>2004-07-28
<313>(1)..(458)
<400>136
Figure A200580045917D02512
Figure A200580045917D02521
Figure A200580045917D02531
<210>137
<211>4313
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pZKUM
<400>137
Figure A200580045917D02541
Figure A200580045917D02551
<210>138
<211>10838
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pKO2UF2PE
<220>
<221>misc_feature
<222>(1615)..(1618)
<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(1623)..(1623)
<223>n是a，c，g，或t
<400>138
Figure A200580045917D02561
Figure A200580045917D02571
Figure A200580045917D02581
Figure A200580045917D02591
Figure A200580045917D02601
Figure A200580045917D02611
Figure A200580045917D02621
<210>139
<211>5833
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pZKUT16
<400>139
Figure A200580045917D02622
Figure A200580045917D02631
Figure A200580045917D02641
Figure A200580045917D02651
Figure A200580045917D02661
<210>140
<211>804
<212>DNA
<213>褐鼠
<220>
<221>misc_feature
<223>合成的C16延伸酶(密码子优化的)
<400>140
Figure A200580045917D02662
<210>141
<211>267
<212>PRT
<213>褐鼠
<300>
<308>GenBank登记号AB071986
<309>2005-04-19
<313>(1)..(267)
<400>141
Figure A200580045917D02663
<210>142
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P239
<400>142
Figure A200580045917D02682
<210>143
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P240
<400>143
Figure A200580045917D02683
<210>144
<211>7822
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pZP217+Ura
<400>144
Figure A200580045917D02684
Figure A200580045917D02691
Figure A200580045917D02701
Figure A200580045917D02711
Figure A200580045917D02721
Figure A200580045917D02731
<210>145
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SMART IV oligonucleotide
<400>145
Figure A200580045917D02732
<210>146
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CDSIII/3’PCR引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(57)
<223>thymidine(dT)；参见BD Biosciences Clontech的SMART cDNA technology
<220>
<221>misc_feature
<222>(59)..(59)
<223>n是a，c，g，或t
<400>146
Figure A200580045917D02733
<210>147
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>5’-PCR引物
<400>147
Figure A200580045917D02741
<210>148
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物M13
<400>148
Figure A200580045917D02742
<210>149
<211>601
<212>DNA
<213>高山被孢菌
<400>149
Figure A200580045917D02743
<210>150
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物MARE2-N1
<400>150
Figure A200580045917D02744
<210>151
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物MARE2-N2
<400>151
Figure A200580045917D02751
<210>152
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基因组步移衔接子-1
<400>152
Figure A200580045917D02752
<210>153
<211>8
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>基因组步移衔接子-2
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5’末端与-P04基团缔合
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>3’末端与-H2N基团缔合
<400>153
Figure A200580045917D02753
<210>154
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物AP1
<400>154
Figure A200580045917D02754
<210>155
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物AP2
<400>155
Figure A200580045917D02761
<210>156
<211>1683
<212>DNA
<213>高山被孢菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(1093)..(1093)
<223>n是a，c，g，或t
<400>156
Figure A200580045917D02762
Figure A200580045917D02771
<210>157
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ARE-N3-1
<400>157
<210>158
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ARE-N3-2
<400>158
Figure A200580045917D02773
<210>159
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物AP
<400>159
Figure A200580045917D02774
<210>160
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物UAP
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>N＝尿嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>N＝尿嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>N＝尿嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>N＝尿嘧啶
<400>160
Figure A200580045917D02781
<210>161
<211>184
<212>DNA
<213>高山被孢菌
<400>161
Figure A200580045917D02782
<210>162
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物MACAT-F1
<400>162
Figure A200580045917D02791
<210>163
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物MACAT-R
<400>163
Figure A200580045917D02792
<210>164
<211>8165
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pZUF17
<400>164
Figure A200580045917D02793
Figure A200580045917D02801
Figure A200580045917D02811
Figure A200580045917D02821
Figure A200580045917D02831
Figure A200580045917D02841
<210>165
<211>8666
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pMDGAT1-17
<220>
<221>misc_feature
<222>(467)..(467)
<223>n是a，c，g，或t
<400>165
Figure A200580045917D02851
Figure A200580045917D02861
Figure A200580045917D02871
Figure A200580045917D02881
Figure A200580045917D02891
<210>166
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PZUF-mod1
<400>166
<210>167
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PZUF-mod2
<400>167
Figure A200580045917D02893
<210>168
<211>7323
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pZUF-MOD-1
<400>168
Figure A200580045917D02901
Figure A200580045917D02911
Figure A200580045917D02931
Figure A200580045917D02941
<210>169
<211>388
<212>PRT
<213>褐家鼠
<300>
<308>GenBank登记号AF384160
<309>2001-10-16
<313>(1)..(388)
<400>169
Figure A200580045917D02942
Figure A200580045917D02951
Figure A200580045917D02961
<210>170
<211>504
<212>PRT
<213>大豆
<300>
<302>植物二酰甘油酰基转移酶
<310>US 20040088759
<311>2003-10-21
<312>2004-05-06
<313>(1)..(504)
<400>170
Figure A200580045917D02962
Figure A200580045917D02971
Figure A200580045917D02981
<210>171
<211>520
<212>PRT
<213>拟南芥
<300>
<302>植物二酰甘油酰基转移酶
<310>US20040088759
<311>2003-10-21
<312>2004-05-06
<313>(1)..(520)
<400>171
Figure A200580045917D02982
Figure A200580045917D02991
Figure A200580045917D03001
Figure A200580045917D03011
<210>172
<211>500
<212>PRT
<213>稻
<300>
<302>植物二酰甘油酰基转移酶
<310>US 20040088759
<311>2003-10-21
<312>2004-05-06
<313>(1)..(500)
<400>172
<210>173
<211>534
<212>PRT
<213>Perilla frutescens
<300>
<308>GenBank登记号AF298815
<309>2000-10-16
<313>(1)..(534)
<400>173
Figure A200580045917D03032
Figure A200580045917D03041
Figure A200580045917D03051
Figure A200580045917D03061
<210>174
<211>508
<212>PRT
<213>小麦
<300>
<302>植物二酰甘油酰基转移酶
<310>US 20040088759
<311>2003-10-21
<312>2004-05-06
<313>(1)..(508)
<400>174
Figure A200580045917D03062
Figure A200580045917D03071
Figure A200580045917D03081
<210>175
<211>604
<212>DNA
<213>高山被孢菌
<400>175
Figure A200580045917D03082

Claims (39)

1.编码二酰基甘油酰基转移酶-1酶的分离的核酸分子，其选自：
(a)编码选自SEQ ID NO：14和18的氨基酸序列的分离的核酸分子；
(b)能在下述杂交条件下与(a)杂交的分离的核酸分子：0.1X SSC、0.1％ SDS、65℃，并用2X SSC、0.1％ SDS洗涤，然后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤；或
(c)与(a)或(b)完全互补的分离的核酸分子。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其选自SEQ ID NO：13和17。
3.由权利要求1的分离的核酸分子编码的多肽。
4.由权利要求2的分离的核酸分子编码的多肽。
5.分离的核酸分子，其包含编码至少526个氨基酸的二酰基甘油酰基转移酶-1酶的第一个核苷酸序列，基于BLASTP比对方法，当与具有SEQ ID NO：14所述序列的多肽相对比时，所述酶具有至少70％同一性；
或包含第一个核苷酸序列的互补序列的第二个核苷酸序列。
6.分离的核酸分子，其包含编码至少525个氨基酸的二酰基甘油酰基转移酶-1酶的第一个核苷酸序列，基于BLASTP比对方法，当与具有SEQ ID NO：18所述序列的多肽相对比时，所述酶具有至少70％同一性；
或包含第一个核苷酸序列的互补序列的第二个核苷酸序列。
7.编码酰基-CoA：甾醇-酰基转移酶的分离的核酸分子，其选自：
(a)编码SEQ ID NO：16所述的氨基酸序列的分离的核酸分子；
(b)在下述杂交条件下与(a)杂交的分离的核酸分子：0.1X SSC、0.1％SDS、65℃，并用2X SSC、0.1％ SDS洗涤，然后用0.1X SSC、0.1％ SDS洗涤；或
(c)与(a)或(b)完全互补的分离的核酸分子。
8.权利要求7的分离的核酸分子，其选自SEQ ID NO：15。
9.由权利要求7的分离的核酸分子编码的多肽。
10.由权利要求8的分离的核酸分子编码的多肽。
11.分离的核酸分子，其包含编码至少543个氨基酸的酰基-CoA：甾醇-酰基转移酶的第一个核苷酸序列，基于BLASTP比对方法，当与具有SEQ ID NO：16所述序列的多肽相对比时，所述酶具有至少70％同一性；
或包含第一个核苷酸序列的互补序列的第二个核苷酸序列。
12.嵌合基因，其包含可操作地连接到适当的调控序列上的权利要求1或权利要求7的分离的核酸分子。
13.转化的宿主细胞，其包含权利要求12的嵌合基因。
14.权利要求13的转化的宿主细胞，其选自藻类、细菌、霉菌、真菌和酵母。
15.权利要求14的转化的宿主细胞，其中所述酵母是含油酵母。
16.权利要求15的转化的宿主细胞，其中所述含油酵母细胞选自耶氏酵母属，假丝酵母属，红酵母属，红冬孢属，隐球酵母属，丝孢酵母属和油脂酵母属。
17.权利要求16的转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞是解脂耶氏酵母。
18.权利要求17的转化的宿主细胞，其中所述解脂耶氏酵母选自下述的菌株：解脂耶氏酵母ATCC #20362，解脂耶氏酵母ATCC #8862，解脂耶氏酵母ATCC #18944，解脂耶氏酵母ATCC #76982，解脂耶氏酵母ATCC #90812和解脂耶氏酵母LGAM S(7)1。
19.得到编码二酰基甘油酰基转移酶-1酶的核酸分子的方法，其包含：
a)用权利要求1的核酸分子探测基因组文库；
b)鉴别能与权利要求1的核酸分子杂交的DNA克隆；和
c)测序包含在步骤(b)中鉴别出的克隆的基因组片段；
其中测序的基因组片段编码二酰基甘油酰基转移酶-1酶。
20.得到编码二酰基甘油酰基转移酶-1酶的核酸分子的方法，其包含：
a)合成至少一种寡核苷酸引物，其与选自SEQ ID NO：13和17的序列的一部分相对应；和
b)使用步骤(a)的寡核苷酸引物，扩增存在于克隆载体中的插入片段；
其中扩增的插入片段编码二酰基甘油酰基转移酶1的编码氨基酸序列的一部分。
21.权利要求19或20的方法的产物。
22.分离的核酸分子，其编码选自下述的氨基酸基序：
a)SEQ ID NO：31；
b)SEQ ID NO：32；
c)SEQ ID NO：33；
d)SEQ ID NO：34；
e)SEQ ID NO：35；
f)SEQ ID NO：36；
g)SEQ ID NO：37；
h)SEQ ID NO：23；
i)SEQ ID NO：24；
j)SEQ ID NO：25；
k)SEQ ID NO：26；
l)SEQ ID NO：27；
m)SEQ ID NO：28；
n)SEQ ID NO：29；和
o)SEQ ID NO：30。
23.选自下述的氨基酸基序序列：
a)SEQ ID NO：31；
b)SEQ ID NO：32；
c)SEQ ID NO：33；
d)SEQ ID NO：34；
e)SEQ ID NO：35；
f)SEQ ID NO：36；
g)SEQ ID NO：37；
h)SEQ ID NO：23；
i)SEQ ID NO：24；
j)SEQ ID NO：25；
k)SEQ ID NO：26；
l)SEQ ID NO：27；
m)SEQ ID NO：28；
n)SEQ ID NO：29；和
o)SEQ ID NO：30。
24.提高转化的宿主细胞中三酰基甘油含量的方法，其包含：
(a)提供转化的宿主细胞，其包含：
(i)在合适的调控序列控制下的至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因，所述酶具有选自SEQ ID NO：14，18，19，20，21和22的氨基酸序列；和，
(ii)脂肪酸源；
(b)在表达至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因的条件下，培养步骤(a)的细胞，导致脂肪酸转化成三酰基甘油；和
(c)任选地回收步骤(b)的三酰基甘油。
25.增加转化的宿主细胞中三酰基甘油的ω-3或ω-6脂肪酸含量的方法，其包含：
(a)提供转化的宿主细胞，其包含：
(i)编码功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因；
(ii)在合适的调控序列控制下的至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因，所述酶具有选自SEQ ID NO：14，18，19，20，21和22的氨基酸序列；
(b)在表达(i)和(ii)的基因的条件下，培养步骤(a)的细胞，导致至少一种ω-3或ω-6脂肪酸的生成，和它向三酰基甘油的转化；和
(c)任选地回收步骤(b)的三酰基甘油。
26.提高转化的宿主细胞中三酰基甘油含量的方法，其包含：
(a)提供转化的宿主细胞，其包含：
(i)在合适的调控序列控制下的至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶-1酶的基因，所述酶包含所有下述的氨基酸基序：
1)SEQ ID NO：31；
2)SEQ ID NO：32；
3)SEQ ID NO：33；
4)SEQ ID NO：34；
5)SEQ ID NO：35；
6)SEQ ID NO：36；和
7)SEQ ID NO：37；
和，
(ii)脂肪酸源；
(b)在表达至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因的条件下，培养步骤(a)的细胞，导致脂肪酸转化成三酰基甘油；和
(c)任选地回收步骤(b)的三酰基甘油。
27.提高转化的宿主细胞中三酰基甘油含量的方法，其包含：
(a)提供转化的宿主细胞，其包含：
(i)在合适的调控序列控制下的至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因，所述酶包含所有下述的氨基酸基序：
1)SEQ ID NO：23；
2)SEQ ID NO：24；
3)SEQ ID NO：25；
4)SEQ ID NO：26；
5)SEQ ID NO：27；
6)SEQ ID NO：28；
7)SEQ ID NO：29；和
8)SEQ ID NO：30；
和，
(ii)脂肪酸源；
(b)在表达至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因的条件下，培养步骤(a)的细胞，导致脂肪酸转化成三酰基甘油；和
(c)任选地回收步骤(b)的三酰基甘油。
28.提高转化的宿主细胞中三酰基甘油的ω-3或ω-6脂肪酸含量的方法，其包含：
(a)提供转化的宿主细胞，其包含：
(i)编码功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因；
和
(ii)在合适的调控序列控制下的至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因，所述酶包含所有下述的氨基酸基序：
1)SEQ ID NO：31；
2)SEQ ID NO：32；
3)SEQ ID NO：33；
4)SEQ ID NO：34；
5)SEQ ID NO：35；
6)SEQ ID NO：36；和
7)SEQ ID NO：37；
(b)在表达(i)和(ii)的基因的条件下，培养步骤(a)的细胞，导致至少一种ω-3或ω-6脂肪酸的生成，和它向三酰基甘油的转化；和
(c)任选地回收步骤(b)的三酰基甘油。
29.提高转化的宿主细胞中三酰基甘油的ω-3或ω-6脂肪酸含量的方法，其包含：
(a)提供转化的宿主细胞，其包含：
(i)编码功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因；和
(ii)在合适的调控序列控制下的至少一种编码二酰基甘油酰基转移酶1酶的基因，所述酶包含所有下述的氨基酸基序：
1)SEQ ID NO：23；
2)SEQ ID NO：24；
3)SEQ ID NO：25；
4)SEQ ID NO：26；
5)SEQ ID NO：27；
6)SEQ ID NO：28；
7)SEQ ID NO：29；和
8)SEQ ID NO：30；
(b)在表达(i)和(ii)的基因的条件下，培养步骤(a)的细胞，导致至少一种ω-3或ω-6脂肪酸的生成，和它向三酰基甘油的转化；和
(c)任选地回收步骤(b)的三酰基甘油。
30.根据权利要求25，28或29的方法，其中所述编码功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因选自去饱和酶和延伸酶。
31.根据权利要求30的方法，其中所述去饱和酶选自：Δ9去饱和酶，Δ12去饱和酶，Δ6去饱和酶，Δ5去饱和酶，Δ17去饱和酶，Δ8去饱和酶，Δ15去饱和酶和Δ4去饱和酶。
32.根据权利要求24-29中的任一项的方法，其中所述宿主细胞选自藻类、细菌、霉菌、真菌和酵母。
33.根据权利要求32的方法，其中所述宿主细胞是含油酵母。
34.根据权利要求33的方法，其中所述含油酵母是选自下列属的成员：耶氏酵母属，假丝酵母属，红酵母属，红冬孢属，隐球酵母属，丝孢酵母属和油脂酵母属。
35.根据权利要求34的方法，其中所述含油酵母是解脂耶氏酵母。
36.根据权利要求35的方法，其中所述解脂耶氏酵母是选自下列的菌株：解脂耶氏酵母ATCC #20362，解脂耶氏酵母ATCC #8862，解脂耶氏酵母ATCC #18944，解脂耶氏酵母ATCC #76982，解脂耶氏酵母ATCC #90812和解脂耶氏酵母LGAM S(7)1。
37.根据权利要求24，25，26，27，28或29中的任一项的方法，其中所述脂肪酸选自：硬脂酸，油酸，亚油酸，γ-亚油酸，二高-γ-亚油酸，花生四烯酸，α-亚油酸，十八碳四烯酸，二十碳四烯酸，二十碳五烯酸，二十二碳五烯酸，二十碳二烯酸和二十碳三烯酸。
38.鉴别具有二酰基甘油酰基转移酶-1活性的多肽的方法，其包含：
a)得到怀疑具有二酰基甘油酰基转移酶-1活性的多肽的氨基酸序列；和，
b)在步骤(a)的多肽氨基酸序列中，鉴别所有下述氨基酸基序序列的存在：
1)SEQ ID NO：31；
2)SEQ ID NO：32；
3)SEQ ID NO：33；
4)SEQ ID NO：34；
5)SEQ ID NO：35；
6)SEQ ID NO：36；和
7)SEQ ID NO：37；
其中步骤(a)的所有基序序列在多肽中的存在，是二酰基甘油酰基转移酶-1活性的指标。
39.鉴别具有二酰基甘油酰基转移酶-1活性的真菌多肽的方法，其包含：
a)得到怀疑具有二酰基甘油酰基转移酶-1活性的真菌多肽的氨基酸序列；和，
b)在步骤(a)的多肽氨基酸序列中，鉴别所有下述氨基酸基序序列的存在：
1)SEQ ID NO：23；
2)SEQ ID NO：24；
3)SEQ ID NO：25；
4)SEQ ID NO：26；
5)SEQ ID NO：27；
6)SEQ ID NO：28；
7)SEQ ID NO：29；和
8)SEQ ID NO：30；
其中步骤(a)的所有基序序列在多肽中的存在，是二酰基甘油酰基转移酶-1活性的指标。
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