JP5139806B2 - ヤロウィア・リポリティカ（ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の高アラキドン酸生成株 - Google Patents

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Description

関連出願との関係
本願明細書は、２００４年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６０／６２４８１２号明細書の利益を主張する。
本発明はバイオテクノロジー分野にある。より具体的には本発明は、エイコサペンタエン酸（ω−３多価不飽和脂肪酸）を高濃度で効率的に生成できる、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の遺伝子操作された株に関する。
アラキドン酸（ＡＲＡ、ｃｉｓ−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸、ω−６）は、エイコサノイド（例えば、プロスタグランジン、トロンボキサン、プロスタサイクリンおよびロイコト）の生成における重要な前駆体である。また、ＡＲＡは、早期の神経学的および視覚的な発達におけるその役割に基づいて、（１）必須長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、（２）ヒトの脳に見られる主なω−６脂肪酸、ならびに（３）母乳および多くの乳児用調製粉乳の重要な成分として認識されている。成人は肉、卵および牛乳等の食品中の食物から容易にＡＲＡを得る（および食物リノレン酸（ＬＡ）から非効率的に合成もされ得る）が、ＡＲＡ油の商業的供給源は、典型的には、天然の植物性供給源（例えばモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）（糸状菌）、ハエカビ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）、クサレカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）およびチノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）（紅藻類）の属の微生物）から生成される。最も顕著に、メリーランド州コロンビアのマーテック・バイオサイエンシーズ・コーポレーション（Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、（コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、ＭＤ））は、ＥＰＡを実質的に含まない、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）またはピシウム・インシディウオサム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｉｎｓｉｄｉｕｏｓｕｍ）のいずれか由来であるＡＲＡ含有真菌油（アラスコ（ＡＲＡＳＣＯ）（登録商標）、特許文献１）を生成する。この油の主な市場の一つは乳児用調製粉乳であり、例えばマーテック（Ｍａｒｔｅｋ）のＡＲＡ油を含有する調製粉乳が、世界中の６０を超える国で、現在入手可能である。
上述のもの等の天然の微生物供給源からのＡＲＡの入手可能性にもかかわらず、
組換え手段を使用したＡＲＡの微生物生産は、天然微生物源からの生成に比べていくつかの利点を有することが予期される。例えば宿主中への新しい生合成経路の導入によって、および／または望まれない経路の抑止によって、宿主の天然由来微生物脂肪酸プロフィールを改変し、それによって所望ＰＵＦＡ（またはその抱合形態）の生成レベルの増大をもたらし、望まれないＰＵＦＡの生成を低減することができるので、油生成に好ましい特性を有する組換え微生物を使用できる。第２に組換え微生物は、特異的用途を有するかもしれない特定形態でＰＵＦＡを提供できる。そして、最終的にさらに培養条件を調節することで、とりわけ微生物的発現酵素の特定基質源を提供することで、または望まれない生化学的経路を抑止するための化合物の添加／遺伝子操作によって、微生物油生産を操作できる。したがって、例えばその他のＰＵＦＡ下流または上流生成物の顕著な蓄積なしに、このようにして生成されたω−３対ω−６脂肪酸比率を修正し、または特定のＰＵＦＡ（例えばＡＲＡ）生成を操作することが可能である。後者の可能性は、高濃度のＡＲＡを含有する、さらにガンマリノレン酸（ＧＬＡ、γ−リノレン酸、ｃｉｓ−６，９，１２−オクタデカトリエン酸、ω−６）を欠いた微生物油の組換え供給源を提供することが望ましい本明細書中の本発明のいくつかの実施形態において、特に重要である。
ＧＬＡは、ＬＡからの、生物学的に活性のプロスタグランジンの生合成における、重要な中間体である。非常に大きな臨床、生理学および薬学的価値を有する必須のω−６ＰＵＦＡとしても認識されているが、ＧＬＡがＡＲＡと反対に作用するいくつかの用途がある。したがって、ＡＲＡを含有する、ＧＬＡを欠いている油の商業的生成が、いくつかの用途において有用性を有するであろう。
ほとんどの微生物的に生成されたＡＲＡは、（主に藻類、コケ、真菌、線形動物、およびヒトに見られる）Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路を通じて合成され、そこでは１．）Δ１２デサチュラーゼの作用によってオレイン酸がＬＡに変換され、２．）Δ６デサチュラーゼの作用によってＬＡがＧＬＡに変換され、３．）Ｃ１８／２０エロンガーゼの作用によってＧＬＡがＤＧＬＡに変換され、および３．）Δ５デサチュラーゼの作用によってＤＧＬＡがＡＲＡに変換される（図１）。しかしＡＲＡ合成のための代案のΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路がユーグレナ種などのいくつかの生物で作動し、そこではそれがＣ２０ＰＵＦＡ形成のための支配的経路である（非特許文献１、特許文献２および非特許文献２）。この経路では、Δ９エロンガーゼによってＬＡがＥＤＡに変換され、Δ８デサチュラーゼによってＥＤＡがＤＧＬＡに変換され、Δ５デサチュラーゼによってＤＧＬＡがＡＲＡに変換される。
今や多様な生物から、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼおよびΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路をコードする遺伝子が同定され特性決定されており、いくつかはその他のＰＵＦＡデサチュラーゼおよびエロンガーゼと組み合わされて異種発現されているが、これらの経路のどちらも酵母などの微生物中に導入されておらず、複雑な代謝エンジニアリングを通じて操作され、商業量のＡＲＡの経済的生産（すなわち全脂肪酸の１０％を超える）を可能にしていない。さらにこのようなエンジニアリングのための宿主生物の最も適切な選択に関して、かなりの矛盾が存在する。
最近、ピカタッジョ（Ｐｉｃａｔａｇｇｉｏ）ら（特許文献３および同時係属出願である特許文献４）は、ＡＲＡおよびＥＰＡなどのＰＵＦＡの生成のための好ましいクラスの微生物としての油性酵母、具体的にはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類された）の有用性を探求した。油性酵母は自然に油合成および蓄積ができる酵母として定義され、油蓄積は細胞乾燥重量の約８０％に達することができる。これらの生物におけるω−６およびω−３脂肪酸生成の自然の欠如にもかかわらず（自然に生成されるＰＵＦＡは１８：２脂肪酸（そしてそれほど多くはないが１８：３脂肪酸）に限定されるので）、ピカタッジョ（Ｐｉｃａｔａｇｇｉｏ）ら（特許文献３および特許文献４）は、比較的単純な遺伝子操作アプローチを使用して、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における（全脂肪酸の）１．３％のＡＲＡおよび１．９％のＥＰＡの生成、ならびにより複雑な代謝エンジニアリングを使用して２８％以下のＥＰＡの生成を実証した。しかしながら、同様の研究は特定の宿主生物におけるＡＲＡの経済的な商業生産を可能にするように実施されていない。
出願人らは、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路、またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路のどちらかを使用して、総油画分中に１０〜１４％を超えるＡＲＡを生成できる種々のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を遺伝子操作すること（それによって、２５〜２９％のＧＬＡを有する１０〜１１％のＡＲＡ油またはＧＬＡを欠いている１４％のＡＲＡ油がそれぞれ生成される）で、既述の問題を解決した。これらの油性酵母におけるＡＲＡ生産性をさらに増強する追加的代謝遺伝子操作および発酵方法が提供される。
米国特許第５６５８７６７号明細書 国際公開第００／３４４３９号パンフレット 国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレット 米国仮特許出願第６０／６２４８１２号明細書 ウォーリス（Ｗａｌｌｉｓ），Ｊ．Ｇ．およびブラウズ（Ｂｒｏｗｓｅ）Ｊ．、「アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジオロジー（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）」３６５：３０７〜３１６頁（１９９９年） キ（Ｑｉ），Ｂ．ら、「ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ）」５１０：１５９〜１６５頁（２００２年）
本発明は、アラキドン酸生成に有用な酵素的経路を有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の組換え生産宿主に関する。
したがって本発明は、
ａ）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Ｃ１８／２０エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞を提供し、
前記ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子の少なくとも１つが過剰発現される。
別の実施形態では、本発明は、
ａ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞を提供し、
前記ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子の少なくとも１つが過剰発現される。
特定の実施形態では、本発明の組換え生産宿主は、Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、Δ９デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、Ｃ１６／１８エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびＣ１４／１６エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、ならびにアシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含むがこれらに限定されない追加的経路要素をさらに含んでなってもよい。
ある特定の実施形態では、本発明は、
ａ）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｂ）ΔＣ１８／２０エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｄ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞を提供し、
背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種はイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕ２−）酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いており、および
前記ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子の少なくとも１つが過剰発現される。
別の特定の実施形態では、本発明は、
ａ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｂ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｄ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｅ）Ｃ１６／１８エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなるアラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞を提供し、
背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種はサッカロピンデヒドロゲナーゼ（Ｌｙｓ５−）酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いており、および
前記ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子の少なくとも１つが過剰発現される。
別の実施形態では、本発明は、
ａ）請求項１または２のいずれかに記載の生産宿主を培養して、アラキドン酸を含んでなる微生物油が生成され、そして、
ｂ）場合によりステップ（ａ）の微生物油を回収すること
を含んでなるアラキドン酸を含んでなる微生物油の生成方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって、および本発明の組換え生産宿主を用いることによって生成される微生物油を提供する。
代案の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる食品を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる、メディカルフード、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品を提供する。
代案の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる動物飼料を提供する。
本発明はさらに、本発明の方法によって生成される微生物油と製品、食品または動物飼料とを組み合わせることを含んでなる、アラキドン酸で栄養強化された製品、食品または動物飼料を製造する方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ヒトまたは動物によって消費可能または使用可能形態でアラキドン酸を含有する本発明の方法によって生成される微生物油を提供することを含んでなるアラキドン酸（ＡＲＡ）で強化された栄養補助食品をヒト、動物または水産養殖生物に提供する方法を提供する。
生物学的寄託
以下の命名、登録番号、および寄託日を有する以下の生物材料をバージニア州マナッサス（Ｍａｎａｓｓａ，ＶＡ）２０１１０−２２０９ユニバーシティ・ブールヴァード１０８０１の米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託した。
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本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明によって、本発明をより完全に理解できるであろう。
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
配列番号１〜１１２、１５８〜１６８、２０９、２５２、２５５、および３５７〜３６４は、表１で同定されるプロモーター、遺伝子またはタンパク質（またはその断片）をコードするＯＲＦである。
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配列番号１１３〜１５７は、表２で同定されるとおりのプラスミドである。
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配列番号３５６は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種中で最適に発現される遺伝子のコドン最適化翻訳開始部位に対応する。
配列番号１６９〜１８２は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）プロモーター領域を増幅するのに使用される、プライマーＹＬ２１１、ＹＬ２１２、ＹＬ３７６、ＹＬ３７７、ＹＬ２０３、ＹＬ２０４、ＧＰＡＴ−５−１、ＧＰＡＴ−５−２、ＯＤＭＷ３１４、ＹＬ３４１、ＯＤＭＷ３２０、ＯＤＭＷ３４１、２７２０３−Ｆ、および２７２０３−Ｒにそれぞれ対応する。
配列番号１８３〜１８６はそれぞれ、リアルタイム分析のために使用されるオリゴヌクレオチドＹＬ−ＵＲＡ−１６Ｆ、ＹＬ−ＵＲＡ−７８Ｒ、ＧＵＳ−７６７Ｆ、およびＧＵＳ−８９１Ｒである。
配列番号１８７〜２０２は、一緒になってＩ．ガルバナ（ｇａｌｂａｎａ）Δ９エロンガーゼ（すなわちそれぞれ、ＩＬ３−１Ａ、ＩＬ３−１Ｂ、ＩＬ３−２Ａ、ＩＬ３−２Ｂ、ＩＬ３−３Ａ、ＩＬ３−３Ｂ、ＩＬ３−４Ａ、ＩＬ３−４Ｂ、ＩＬ３−５Ａ、ＩＬ３−５Ｂ、ＩＬ３−６Ａ、ＩＬ３−６Ｂ、ＩＬ３−７Ａ、ＩＬ３−７Ｂ、ＩＬ３−８Ａ、およびＩＬ３−８Ｂ）のコドン最適化コード領域全体を含んでなる、８対のオリゴヌクレオチドに対応する。
配列番号２０３〜２０６は、コドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子合成中にＰＣＲ増幅のために使用される、プライマーＩＬ３−１Ｆ、ＩＬ３−４Ｒ、ＩＬ３−５Ｆ、およびＩＬ３−８Ｒにそれぞれ対応する。
配列番号２０７は、ｐＴ９（１−４）に記載の４１７ｂｐのＮｃｏＩ／ＰｓｔＩ断片であり、配列番号２０８はｐＴ９（５−８）に記載の３７７ｂｐのＰｓｔＩ／Ｎｏｔ１断片である。
配列番号２１０〜２３５は、一緒になってミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼのコドン最適化コード領域全体を含んでなる１３対のオリゴヌクレオチド（すなわちそれぞれ、Ｄ８−１Ａ、Ｄ８−１Ｂ、Ｄ８−２Ａ、Ｄ８−２Ｂ、Ｄ８−３Ａ、Ｄ８−３Ｂ、Ｄ８−４Ａ、Ｄ８−４Ｂ、Ｄ８−５Ａ、Ｄ８−５Ｂ、Ｄ８−６Ａ、Ｄ８−６Ｂ、Ｄ８−７Ａ、Ｄ８−７Ｂ、Ｄ８−８Ａ、Ｄ８−８Ｂ、Ｄ８−９Ａ、Ｄ８−９Ｂ、Ｄ８−１０Ａ、Ｄ８−１０Ｂ、Ｄ８−１１Ａ、Ｄ８−１１Ｂ、Ｄ８−１２Ａ、Ｄ８−１２Ｂ、Ｄ８−１３Ａ、およびＤ８−１３Ｂ）に対応する。
配列番号２３６〜２４３は、コドン最適化Δ８デサチュラーゼ遺伝子合成中にＰＣＲ増幅のために使用されるプライマーＤ８−１Ｆ、Ｄ８−３Ｒ、Ｄ８−４Ｆ、Ｄ８−６Ｒ、Ｄ８−７Ｆ、Ｄ８−９Ｒ、Ｄ８−１０Ｆ、およびＤ８−１３Ｒにそれぞれ対応する。
配列番号２４４はｐＴ８（１−３）に記載の３０９ｂｐのＮｃｏ／ＢｇＩＩＩ断片であり、配列番号２４５はｐＴ８（４−６）に記載の３２１ｂｐのＢｇＩＩＩ／ＸｈｏＩ断片であり、配列番号２４６はｐＴ８（７−９）に記載の２６４ｂｐのＸｈｏＩ／ＳａｃＩ断片であり、配列番号２４７はｐＴ８（１０−１３）に記載の３６９ｂｐのＳａｃ１／Ｎｏｔ１断片である。
配列番号２４８および２４９は、ｐＤＭＷ２５５におけるＤ８Ｓ−２合成中に使用される、プライマーＯＤＭＷ３９０およびＯＤＭＷ３９１にそれぞれ対応する。
配列番号２５０および２５１は、実施例７で述べられるキメラＤ８Ｓ−１：：ＸＰＲおよびＤ８Ｓ−２：：ＸＰＲ遺伝子である。
配列番号２５３および２５４は、Ｄ８Ｓ−３合成中に使用されるプライマーＯＤＭＷ３９２およびＯＤＭＷ３９３に対応する。
配列番号２５６および２５７は、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのΔ８デサチュラーゼ増幅のために使用される、プライマーＥｇ５−１およびＥｇ３−３にそれぞれ対応する。
配列番号２５８〜２６１は、Δ８デサチュラーゼクローンを配列決定するために使用される、プライマーＴ７、Ｍ１３−２８Ｒｅｖ、Ｅｇ３−２、およびＥｇ５−２にそれぞれ対応する。
配列番号２６２は、Ｄ８Ｓ−３増幅のために使用されるプライマーＯＤＭＷ４０４に対応する。
配列番号２６３は、Ｄ８Ｓ−３を含んでなる１２７２ｂｐのキメラ遺伝子である。
配列番号２６４および２６５は、クローニングされたＤ８Ｓ−３遺伝子中に新しい制限酵素部位を作り出すのに使用される、プライマーＹＬ５２１およびＹＬ５２２にそれぞれ対応する。
配列番号２６６〜２７９は、Ｄ８ＳＦを生成する部位特異的変異誘発反応で使用されるプライマーＹＬ５２５、ＹＬ５２６、ＹＬ５２７、ＹＬ５２８、ＹＬ５２９、ＹＬ５３０、ＹＬ５３１、ＹＬ５３２、ＹＬ５３３、ＹＬ５３４、ＹＬ５３５、ＹＬ５３６、ＹＬ５３７、およびＹＬ５３８にそれぞれ対応する。
配列番号２８０は、Ｗ４９７Ｌ突然変異を含んでなる突然変異ＡＨＡＳ遺伝子である。
配列番号２８１〜２８３は、ＢＤクローンテック・クリエイター・スマート（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃｒｅａｔｏｒ Ｓｍａｒｔ）（登録商標）ｃＤＮＡライブラリーキットのプライマーである、スマート（ＳＭＡＲＴ）ＩＶオリゴヌクレオチド、ＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー、および５’−ＰＣＲプライマーにそれぞれ対応する。
配列番号２８４は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡライブラリー配列決定のために使用される、Ｍ１３順方向プライマーに対応する。
配列番号２８５〜２８８および２９０〜２９１は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ２ ＯＲＦのクローニングのために使用される、プライマーＭＬＰＡＴ−Ｆ、ＭＬＰＡＴ−Ｒ、ＬＰＡＴ−Ｒｅ−５−１、ＬＰＡＴ−Ｒｅ−５−２、ＬＰＡＴ−Ｒｅ−３−１、およびＬＰＡＴ−Ｒｅ−３−２にそれぞれ対応する。
配列番号２８９および２９２は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１ ＯＲＦの５’（１１２９ｂｐ）および３’（９３８ｂｐ）領域にそれぞれ対応する。
配列番号２９３および２９４は、「対照」プラスミドｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１を作り出すために使用される、プライマーｐｚｕｆ−ｍｏｄ１およびｐｚｕｆ−ｍｏｄ２にそれぞれ対応する。
配列番号２９５および２９６は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１ ＯＲＦのクローニングのために使用される、プライマーＭＡＣＡＴ−Ｆ１およびＭＡＣＡＴ−Ｒにそれぞれ対応する。
配列番号２９７および２９８は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ２ ＯＲＦのクローニングのために使用されるプライマーＭＤＧＡＴ−ＦおよびＭＤＧＡＴ−Ｒ１にそれぞれ対応する。
配列番号２９９および３００は、縮重ＰＣＲでＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴを増幅するために使用される、プライマーＭＧＰＡＴ−Ｎ１およびＭＧＰＡＴ−ＮＲ５にそれぞれ対応する。
配列番号３０１〜３０３は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴの３’−末端増幅のために使用される、プライマーＭＧＰＡＴ−５Ｎ１、ＭＧＰＡＴ−５Ｎ２、およびＭＧＰＡＴ−５Ｎ３にそれぞれ対応する。
配列番号３０４および３０５は、ゲノムウォーキングのために使用されるクローンテック（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）のユニバーサル・ゲノムウォーカー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ）ＴＭキットからのゲノムウォーカー（Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ）アダプターに対応する。
配列番号３０６〜３０９は、ゲノムウォーキングで使用されるＰＣＲプライマーである、ＭＧＰＡＴ−５−１Ａ、Ａｄａｐｔｏｒ−１（ＡＰ１）、ＭＧＰＡＴ−３Ｎ１、およびネスティド・アダプター・プライマー（Ｎｅｓｔｅｄ Ａｄａｐｔｏｒ Ｐｒｉｍｅｒ）２（ＡＰ２）にそれぞれ対応する。
配列番号３１０および３１１は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴを増幅するために使用される、プライマーｍｇｐａｔ−ｃｄｎａ−５およびｍｇｐａｔ−ｃｄｎａ−Ｒにそれぞれ対応する。
配列番号３１２および３１３は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＥＬＯ３の３’−末端領域を単離するゲノムウォーキングのために使用される、プライマーＭＡ Ｅｌｏｎｇ３’１およびＭＡ ｅｌｏｎｇ３’２にそれぞれ対応する。
配列番号３１４および３１５は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＥＬＯ３の５’−末端領域を単離するゲノムウォーキングのために使用されるプライマーＭＡ Ｅｌｏｎｇ５’１およびＭＡ Ｅｌｏｎｇ５’２にそれぞれ対応する。
配列番号３１６および３１７は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡから完全なＥＬＯ３を増幅するために使用される、プライマーＭＡ ＥＬＯＮＧ５’ ＮｃｏＩ ３およびＭＡ ＥＬＯＮＧ３’ ＮｏｔＩ １にそれぞれ対応する。
配列番号３１８および３１９は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＹＥ２のコード領域を増幅するために使用されるプライマーＹＬ５９７およびＹＬ５９８にそれぞれ対応する。
配列番号３２０〜３２３は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＹＥ１のコード領域を増幅するために使用される、プライマーＹＬ５６７、ＹＬ５６８、ＹＬ５６９、およびＹＬ５７０にそれぞれ対応する。
配列番号３２４および３２５は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＹＥ１のクローニング中に、部位特異的変異誘発のために使用されるプライマーＹＬ５７１およびＹＬ５７２にそれぞれ対応する。
配列番号３２６および３２７は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＣＰＴ１ ＯＲＦのクローニングのために使用される、プライマーＣＰＴ１−５’−ＮｃｏＩおよびＣＰＴ１−３’−ＮｏｔＩにそれぞれ対応する。
配列番号３２８および３２９は、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＳＣ１ ＯＲＦのクローニングのために使用される、プライマーＩｓｃ１ＦおよびＩｓｃ１Ｒにそれぞれ対応する。
配列番号３３０および３３１は、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＣＬ１ ＯＲＦのクローニングのために使用される、プライマーＰｃｌ１ＦおよびＰｃｌ１Ｒにそれぞれ対応する。
配列番号３３２〜３３５は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２遺伝子の標的を定めた中断のために使用される、プライマーＰ９５、Ｐ９６、Ｐ９７、およびＰ９８にそれぞれ対応する。
配列番号３３６〜３３８は、中断されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２遺伝子の標的を定めた組み込みをスクリーニングするために使用される、プライマーＰ１１５、Ｐ１１６、およびＰ１１２にそれぞれ対応する。
配列番号３３９〜３４２は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴ遺伝子の標的を定めた中断のために使用される、プライマーＰ３９、Ｐ４１、Ｐ４０、およびＰ４２にそれぞれ対応する。
配列番号３４３〜３４６は、中断されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴ遺伝子の標的を定めた組み込みをスクリーニングするために使用される、プライマーＰ５１、Ｐ５２、Ｐ３７、およびＰ３８にそれぞれ対応する。
配列番号３４７および３４８は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１の単離のために使用される、Ｐ２０１およびＰ２０３としてそれぞれ同定される縮重プライマーである。
配列番号３４９〜３５３は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の推定ＤＧＡＴ１遺伝子の標的を定めた中断のための標的カセット創出のために使用される、プライマーＰ２１４、Ｐ２１５、Ｐ２１６、Ｐ２１７、およびＰ２１９にそれぞれ対応する。
配列番号３５４および３５５は、中断されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１遺伝子の標的を定めた組み込みをスクリーニングするために使用される、プライマーＰ２２６およびＰ２２７にそれぞれ対応する。
配列番号３６５〜３７０は、Ｗ４９７Ｌ突然変異を含んでなる突然変異ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＨＡＳ遺伝子の合成のために使用される、プライマー４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、および４１５にそれぞれ対応する。
配列番号３７１および３７２は、Ａｃｏ３’ターミネーターを含有するＮｏｔＩ／ＰａｃＩ断片を増幅するのに使用される、プライマーＹＬ３２５およびＹＬ３２６にそれぞれ対応する。
配列番号３７３は、真菌Δ１５およびΔ１２デサチュラーゼに見られるＨｉｓ Ｂｏｘ １モチーフに対応する。
配列番号３７４はΔ１５デサチュラーゼ活性を有する真菌タンパク質を示すモチーフに対応し、一方配列番号３７５はΔ１２デサチュラーゼ活性を有する真菌タンパク質を示すモチーフに対応する。
本願明細書で引用した全ての特許、特許出願、および公報は、引用することによりそれらの内容全体を組み込んだものとする。これは具体的に以下の本出願人の譲受人の同時係属出願を含む。
米国特許出願第１０／８４０４７８号明細書（２００４年５月６日出願）、
米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書（２００４年５月６日出願）、
米国特許出願第１０／８４０３２５号明細書（２００４年５月６日出願）、
米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書（２００４年６月１６日出願）、
米国特許出願第１０／８８２７６０号明細書（２００４年７月１日出願）、
米国特許出願第１０／９８５１０９号明細書（２００４年１１月１０日出願）、
米国特許出願第１０／９８７５４８号明細書（２００４年１１月１２日出願）、
米国仮特許出願第６０／６２４８１２号明細書（２００４年１１月４日出願）、
米国特許出願第１１／０２４５４５号明細書および米国特許出願第１１／０２４５４４号明細書（２００４年１２月２９日出願）、
米国仮特許出願第６０／６８９０３１号明細書（２００５年６月９日出願）、
米国特許出願第１１／１８３６６４号明細書（２００５年７月１８日出願）、
米国特許出願第１１／１８５３０１号明細書（２００５年７月２０日出願）、
米国特許出願第１１／１９０７５０号明細書（２００５年７月２７日出願）、
米国特許出願第１１／２２５３５４号明細書（２００５年９月１３日出願）、ＣＬ２８２３およびＣＬ３０２７。
主題発明に従って、出願人らは、１０％を超えるアラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４、ω−６）を生成できるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）生産宿主株を提供する。この特定の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の蓄積は、２つの異なる機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路のどちらかの導入によって達成される。第１の経路は、高レベル組換え発現のための油性酵母宿主中のΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよびΔ５デサチュラーゼ活性があるタンパク質を含んでなり、そこではＡＲＡ油はまたＧＬＡも含んでなる。後者の経路は、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼおよびΔ５デサチュラーゼ活性があるタンパク質を含んでなり、それによってあらゆるＧＬＡを欠いたＡＲＡ油の生成を可能にする。したがってこの開示は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を遺伝子操作して、ＡＲＡおよびその誘導体の商業生産を可能にできることを実証する。生成方法もまた特許請求される。
主題発明には多くの用途がある。ここで開示される方法によって作られるＰＵＦＡまたはその誘導体は、食餌代用物、または栄養補給剤、特に乳児用調製粉乳として、静脈内栄養補給を受ける患者のために、または栄養不良を防止または処置するために使用できる。代案としては、正常な使用において受容者が所望量の栄養補助を受け入れるように調合された調理油、脂肪またはマーガリン中に精製されたＰＵＦＡ（またはその誘導体）を組み込んでもよい。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養補給剤またはその他の食品に組み込んでもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としての用途があるかもしれない。場合により組成物を薬学的用途（ヒトまたは獣医学）のために使用してもよい。この場合ＰＵＦＡは、一般に経口投与されるが、例えば非経口的（例えば皮下、筋肉内または静脈内）、経直腸、経膣、または局所的（例えば軟膏またはローション）など、それによってそれらが成功裏に吸収されるあらゆる経路によって投与できる。
組換え手段によって生成されたＰＵＦＡをヒトまたは動物に補給することは、添加ＰＵＦＡレベルならびにそれらの代謝子孫の増大をもたらすことができる。例えばＡＲＡでの処置は、ＡＲＡのレベル増大だけでなく、エイコサノイドなどのＡＲＡの下流生成物をもたらす。複雑な調節機序は、このような機序を防止、調節または克服して、個体中の特異的ＰＵＦＡの所望レベルを達成するために、様々なＰＵＦＡを組み合わせ、または異なるＰＵＦＡ抱合体を添加することを望ましくする。
水産養殖飼料（すなわち乾燥飼料、半湿および湿潤飼料）は一般に栄養素組成物の少なくとも１〜２％がω−３および／またはω−６ＰＵＦＡであることを必要とするので、代案の実施形態では、ここで開示される方法によって作られたＰＵＦＡ、またはその誘導体をこれらの調合物合成において利用できる。
定義
本開示中では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。
「読み取り枠」はＯＲＦと略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
「米国微生物系統保存機関」はＡＴＣＣと略記される。
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記される。
「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」はＤＡＧ ＡＴまたはＤＧＡＴと略記される。
「リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」はＰＤＡＴと略記される。
「グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ」はＧＰＡＴと略記される。
「リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ」はＬＰＡＡＴと略記される。
「アシル−ＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ」は「ＬＰＣＡＴ」と略記される．
「アシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼ」はＡＲＥ２と略記される。
「ジアシルグリセロール」はＤＡＧと略記される。
「トリアシルグリセロール」はＴＡＧと略記される。
「Ｃｏ−酵素Ａ」はＣｏＡと略記される。
「ホスファチジル−コリン」はＰＣと略記される。
「フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）」という用語は「フザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ」と同義である。
「食品」という用語は、一般にヒトの消費に適したあらゆる食物を指す。典型的な食品としては、肉製品、穀物製品、ベーカリー食品、スナック食品、乳製品などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
「機能性食品」という用語は、それが含有する伝統的栄養素を超えて健康上の利点を提供するかもしれないあらゆる変性食物または成分を含む、潜在的に健康的な製品を包含する食物を指す。機能性食品としては、ビタミン、ハーブ、および栄養補給食品で強化されたシリアル、パンなどの食物および飲料が挙げられる。機能性食品は、その栄養価を超えて健康上の利点を提供する物質を含有し、そこでは物質は食物中に自然に存在し、または意図的に添加される。
ここでの用法では「メディカルフード」という用語は、医師の監督下で経腸的に消費または投与されるために調合され、医学的評価により広く認められている科学的原理に基づいて、独特の栄養要求性が確立されている疾患または病状の特異的食餌管理用である食物を指す［希少難病医薬法（２１ Ｕ．Ｓ．Ｃ．３６０ｅｅ（ｂ）（３））第５節（ｂ）を参照されたい］。食物は以下の場合に限り「メディカルフード」である。（ｉ）それが経口摂取またはチューブによる経腸栄養の手段による患者への部分的なまたは専用の給食のために、特別に調合され処理された製品である（その自然な状態で使用される天然由来食材とは対照的に）。（ｉｉ）それが治療的または慢性医療的必要性のために、通常の食材または特定の栄養素を経口摂取、消化、吸収、または代謝する能力が制限されたまたは損なわれた患者、またはその食餌管理が正常な食餌の修正のみでは達成できないその他の特別な医学的に判定された栄養要件を有する患者の食餌管理を対象とする。（ｉｉｉ）それが医学的評価によって判定された特異的疾患または症状から帰結する、ユニークな栄養要件の管理のために特に修正された栄養補給を提供する。（ｉｖ）それが医療的監督下で使用されることが意図される。および（ｖ）それがとりわけメディカルフードの使用指示に関して繰り返し医療的ケアを必要とする、積極的な継続中の医療的監督を受けている患者のみを対象とすることが意図される。したがって栄養補助食品または従来の食物とは異なり、独特の栄養要件が確立されている疾患または症状の特定の食餌管理を意図するメディカルフードは、特定疾患または症状のための独特の栄養補給の提供に関して科学的に妥当な効能書を有してもよい。メディカルフードは医学的監督の下で使用されるという要件によって、メディカルフードは、特別な食餌用途（例えば低アレルギー性食品）のためのより幅広いカテゴリーの食物、および健康機能をうたう食物（例えば栄養補助食品）とは区別される。
「医学的栄養物」という用語は、ここで定義されるようなメディカルフードであり、典型的に特別な食餌要件のために特にデザインされた強化飲料を指す。医学的栄養物は、一般に特定の病状または食餌条件に焦点を合わせた食餌組成物を含んでなる。市販医学的栄養物の例としては、エンシュア（Ｅｎｓｕｒｅ）（登録商標）およびブースト（Ｂｏｏｓｔ）（登録商標）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
「医薬品」という用語は、ここでの用法では、米国で販売される場合に米連邦食品医薬品化粧品法の第５０５または５０５条によって規制される化合物または物質を意味する。
「乳児用調製粉乳」という用語は、それがヒト母乳をシミュレーションすると言う理由で、ヒト幼児による消費のためにだけデザインされた食物を意味する。典型的な乳児用調製粉乳の市販例としては、シミラック（Ｓｉｍｉｌａｃ）（登録商標）、およびイソミル（Ｉｓｏｍｉｌ）（登録商標）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
「栄養補助食品」という用語は、次のような製品を指す。（ｉ）食餌に栄養補給することを意図し、したがって、従来の食物として、または食事または食餌の唯一のアイテムとして使用されない。（ｉｉ）１つもしくはそれ以上の食餌成分（例えばビタミン、ミネラル、ハーブまたはその他の植物性薬品、アミノ酸、酵素、および腺エキスをはじめとする）またはそれらの構成要素を含有する。（ｉｉｉ）丸薬、カプセル、錠剤、または液体として経口摂取することが意図される。（ｉｖ）栄養補助食品としてラベル表示される。
「食物類似物」とは、肉、チーズ、ミルクなどに関わらず、その食物対応物と似ているように製造された食物様製品であり、その対応物の外観、味、およびテクスチャを有することが意図される。したがって「食物」という用語は、ここでの用法では食物類似物もまた包含する。
「水産養殖飼料」および「アクアフィード」という用語は、水産養殖産業において天然飼料を栄養補給するまたは置き換える人造または人工餌（配合飼料）を指す。したがってアクアフィードは、養殖魚および甲殻類（すなわちより安価な基本的食物魚種［例えばコイ、イズミダイ、およびナマズなどの淡水魚］および高級またはすき間市場用のより高価な換金産物種［例えば主にエビ、サケ、マス、ハマチ、スズキ、タイ、およびハタなどの海産および通し回遊種］の双方）に有用な人工的に配合された飼料を指す。これらの配合飼料は、互いに補完して、水産養殖種のために栄養的に完全な食餌を形成する様々な割合のいくつかの成分から構成される。
「動物飼料」という用語は、家畜（ペット、農業家畜など）をはじめとする動物による消費、または例えば養魚業などの食物生産のために飼育される動物のみを意図した飼料を指す。
「飼料栄養素」という用語は、本発明の組換え生産宿主を含んでなる酵母バイオマス由来であってもよい、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、および核酸などの栄養素を意味する。
ここでの用法では「バイオマス」という用語は、商業的に顕著な量でＥＰＡを生成する組換え生産宿主の発酵からの使用済み酵母細胞物質を特に指す。
「脂肪酸」という用語は、（より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが）約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長はＣ１６〜Ｃ２２の間である。脂肪酸の構造は単純な表記法システム「Ｘ：Ｙ」によって表され、ここでＸは特定の脂肪酸中の炭素（Ｃ）原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」（または「ＰＵＦＡ」）、および「オメガ−６脂肪酸」（ω−６またはｎ−６）」対「オメガ−３脂肪酸」（ω−３またはｎ−３）の違いについてさらに詳しくは、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで提供される。
本開示においてＰＵＦＡを既述するのに使用される命名法を下の表３に示す。「略記法」と題された欄では、オメガ−参照システムが使用されて炭素数、二重結合数、およびオメガ炭素（この目的では番号１）から数えて、オメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示唆する。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸およびそれらの前駆物質の一般名、本願明細書全体で使用される略語、および各化合物の化学名を要約する。
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「高レベルＡＲＡ生成」という用語は、微生物宿主の全脂質中に少なくとも約５％のＡＲＡ、好ましくは全脂質中の少なくとも約１０％のＡＲＡ、より好ましくは全脂質中の少なくとも約１５％のＡＲＡ、より好ましくは全脂質中の少なくとも約２０％のＡＲＡ、そして最も好ましくは全脂質中の少なくとも約２５〜３０％のＡＲＡの生成を指す。ＡＲＡの構造的な形態は限定されず、したがって例えばＡＲＡは全脂質中に遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で存在してもよい。
「あらゆるＧＬＡを欠く」という用語は、約０．１％に至る検出可能レベルを有する機器を使用してＧＣ分析によって測定した場合における、微生物宿主の総脂質中のあらゆる検出可能なＧＬＡの欠如を指す。
「必須脂肪酸」という用語は、生物が特定の必須脂肪酸を新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成できず、生きるために経口摂取しなくてはならならない特定のＰＵＦＡを指す。例えば哺乳類は、必須脂肪酸ＬＡ（１８：２、ω−６）およびＡＬＡ（１８：３、ω−３）を合成できない。その他の必須脂肪酸としては、ＧＬＡ（ω−６）、ＤＧＬＡ（ω−６）、ＡＲＡ（ω−６）、ＥＰＡ（ω−３）、およびＤＨＡ（ω−３）が挙げられる。
「微生物油」または「単細胞油」は、微生物（例えば藻類、油性酵母菌、および糸状菌）によって、それらの生涯において天然に生成される油である。「油」という用語は、２５℃で液体であり、通常多価不飽和脂質である脂質物質を指す。対照的に「脂肪」という用語は、２５℃で固形物であり、通常飽和である脂質物質を指す。
「リピッドボディ」とは、通常、特定のタンパク質およびリン脂質単層に結合する脂肪滴を指す。これらの細胞小器官は、ほとんどの生物が中性脂質を輸送／貯蔵する部位である。リピッドボディは、ＴＡＧ−生合成酵素を含有する小胞体のミクロドメインから発生すると考えられ、それらの合成およびサイズは、特定のタンパク質構成要素によって調節されているように見える。
「中性脂質」とは、貯蔵脂肪および油として一般にリピッドボディの細胞に見られる脂質を指し、細胞ｐＨでは脂質が荷電群を有さないことからこう呼ばれる。一般にこれらは完全に非極性で水に対する親和性がない。中性脂質とは、一般に脂肪酸とグリセロールのモノ−、ジ−、および／またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはＴＡＧ（または集合的にアシルグリセロール）とも称される。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出するためには、加水分解反応が起きなくてはならない。
「トリアシルグリセロール」、「油」、および「ＴＡＧ」という用語は、グリセロール分子とエステル化する３個の脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す（そしてこのような用語は、本開示の全体を通して区別なく使用される）。このような油は、長鎖ＰＵＦＡ、ならびにより短い飽和および不飽和脂肪酸、および鎖長のより長い飽和脂肪酸を含有できる。したがって「油生合成」は、一般に細胞におけるＴＡＧ合成を指す。
「アシルトランスフェラーゼ」という用語は、アミノ−アシル基（ＥＣ２．３．１．−）以外の基の転移に関与する酵素を指す。
「ＤＡＧ ＡＴ」という用語は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（アシル−ＣｏＡ−ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼまたはジアシルグリセロール−Ｏ−アシルトランスフェラーゼとしても知られる）（ＥＣ２．３．１．２０）を指す。この酵素は、アシル−ＣｏＡおよび１，２−ジアシルグリセロールからＴＡＧおよびＣｏＡへの変換に関与する（したがってＴＡＧ生合成の最終段階に関与する）。ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２の２つのＤＡＧ ＡＴ酵素ファミリーが存在する。前者のファミリーはアシル−ＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）遺伝子ファミリーと類似しており、後者のファミリーは関連性がない（ラルディサバル（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌ）ら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４２）：３８８６２〜３８８６９頁（２００１年））。
「ＰＤＡＴ」という用語は、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．１５８）を指す。この酵素は、リン脂質のｓｎ−２位から１，２−ジアシルグリセロールのｓｎ−３位へのアシル基転移に関与し、その結果リゾリン脂質およびＴＡＧが得られる（したがってＴＡＧ生合成の最終段階に関与する）。この酵素はアシル−ＣｏＡ−非依存性機序を通じてＴＡＧを合成することで、ＤＧＡＴ（ＥＣ２．３．１．２０）とは異なる。
「ＡＲＥ２」という用語は、アシル−ＣｏＡ＋ステロール＝ＣｏＡ＋ステロールエステルの反応を触媒するアシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼ酵素を指す（ＥＣ２．３．１．２６、ステロール−エステルシンターゼ２酵素としてもまた知られている）。
「ＧＰＡＴ」という用語は、ｇｐａｔ遺伝子によってコードされ、アシル−ＣｏＡおよびｓｎ−グリセロール３−リン酸をＣｏＡおよび１−アシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸に変換する（リン脂質生合成の第１のステップ）グリセロール−３−リン酸−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１５）を指す。
「ＬＰＡＡＴ」という用語は、リゾホスファチジン酸−アシルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．３．１．５１）を指す。この酵素は、ＣｏＡおよび１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸（ホスファチジン酸）を生成する、１−アシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸（すなわちリゾホスファチジン酸）上へのアシル−ＣｏＡ基の転移に関与する。文献はまた、アシル−ＣｏＡ：１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸２−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼおよび／または１−アシルグリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴと略記される）としてのＬＰＡＡＴについても言及する。
「ＬＰＣＡＴ」という用語は、アシル−ＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジル−コリンアシルトランスフェラーゼを指す。この酵素は、ＣｏＡとホスファチジルコリン（ＰＣ）間のアシル基交換に関与する。ここではそれはまた、ＣｏＡとリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）をはじめとするその他のリン脂質間のアシル交換に関与する酵素も指す。
「総脂質および油画分中のパーセント（％）ＰＵＦＡ」とは、これらの画分中の全脂肪酸に対するＰＵＦＡのパーセントを指す。「全脂質画分」または「脂質画分」という用語は、どちらも油性生物中の全脂質（すなわち中性および極性）の合計を指すので、ホスファチジルコリン（ＰＣ）画分、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）画分、およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧまたは油）画分内に位置する脂質を含む。しかし「脂質」および「油」という用語は、本願明細書全体で同義的に使用される。
「ホスファチジルコリン」または「ＰＣ」という用語は、細胞膜の主要構成要素であるリン脂質を指す。ＰＣの化学構造は、一般にコリン分子、リン酸基、およびグリセロールを含んでなるとして記述でき、そこでは脂肪酸アシル鎖がＲ基として、グリセロール分子のｓｎ−１およびｓｎ−２位上に付着する。
「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と言う用語は、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよび／またはＣ２０／２２エロンガーゼをはじめとする、ＰＵＦＡの生合成に関連する酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを指す。
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」という用語は、適切な条件下で発現されると、ω−３およびω−６脂肪酸のいずれかまたは双方の生成を触媒する酵素をコードする一組の遺伝子を指す。典型的にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、以下の酵素のいくつかまたは全てをコードする。Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼ。代表的な経路は図１に示され、様々な中間体を経由するオレイン酸のＤＨＡへの変換が提供され、ω−３およびω−６脂肪酸の双方が、共通の原料からどのように生成されてもよいかを実証する。経路は自然に２つの部分に別れ、１つの部分はω−３脂肪酸、別の部分はω−６脂肪酸のみを発生させる。ω−３脂肪酸のみを発生させる部分をここでω−３脂肪酸生合成経路と称するのに対し、ω−６脂肪酸のみを発生させる部分はここでω−６脂肪酸生合成経路と称する。
「機能性」という用語は、ここでω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関する文脈で、経路中の遺伝子のいくつか（または全て）が、活性酵素を発現し、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）触媒作用または基質変換をもたらすことを意味する。いくつかの脂肪酸生成物は、この経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とするので、「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」は、上の段落で列挙される全遺伝子が必要とされることを暗示しないものとする。
「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」という用語は、最低限、Δ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよびΔ５デサチュラーゼの遺伝子を含むＡＲＡ脂肪酸生合成経路を指す。同様にして、「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」という用語は、最低限、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、およびΔ５デサチュラーゼの遺伝子を含むＡＲＡ脂肪酸生合成経路を指す。
「デサチュラーゼ」と言う用語は、不飽和化できる、すなわち１個もしくはそれ以上の脂肪酸に二重結合を導入して、興味のある脂肪酸または前駆物質を生じさせるポリペプチドを指す。特定の脂肪酸を指すために、本願明細書全体を通じてω参照システムを使用するのにもかかわらず、Δシステムを使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼの活性を示す方が都合よい。ここで特に関心が高いのは、１．）分子のカルボキシル末端から数えて８および９番めの炭素原子間で脂肪酸を不飽和化し、例えばＥＤＡからＤＧＬＡへのおよび／またはＥＴｒＡからＥＴＡへの変換を触媒するΔ８デサチュラーゼ、２．）ＬＡからＧＬＡへのおよび／またはＡＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ６デサチュラーゼ、３．）ＤＧＬＡからＡＲＡへのおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの変換を触媒するΔ５デサチュラーゼ、４．）ＤＰＡからＤＨＡへの変換を触媒するΔ４デサチュラーゼ、５．）オレイン酸からＬＡへの変換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ、６．）ＬＡからＡＬＡへのおよび／またはＧＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ、７．）ＡＲＡからＥＰＡへのおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡへの変換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ、および８．）パルミチン酸からパルミトレイン酸（１６：１）および／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への変換を触媒するΔ９デサチュラーゼである。
本発明のΔ１５デサチュラーゼに言及するときの「二元機能」という用語は、ポリペプチドが酵素基質として、オレイン酸およびリノレン酸の双方を使用する能力を有することを意味する。「酵素基質」とは、ポリペプチドが活性部位で基質に結合し、反応性様式でそれに作用することを意味する。
「エロンガーゼ系」と言う用語は、エロンガーゼ系が作用する脂肪酸基質よりも炭素２個分長い酸を生成する、脂肪酸炭素鎖の伸長に関与する４つの酵素の一揃いを指す。より具体的にはこの延長プロセスは、ＣｏＡがアシルキャリアである脂肪酸合成酵素と共同して起きる（ラスナー（Ｌａｓｓｎｅｒ）ら著、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：２８１〜２９２頁（１９９６年））。基質特異性であり、また律速でもあることが分かった第１のステップでは、マロニル−ＣｏＡが長鎖アシル−ＣｏＡと縮合して、ＣＯ２およびβ−ケトアシル−ＣｏＡを生じる（アシル部分が炭素原子２個分伸長される）。引き続く反応には、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水、および伸長されたアシル−ＣｏＡを生じる第２の還元が含まれる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、およびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。
ここでの目的では、第１の縮合反応（すなわちマロニル−ＣｏＡのβ−ケトアシル−ＣｏＡへの変換）を触媒する酵素を総称的に「エロンガーゼ」と称する。一般にエロンガーゼの基質選択性はいくぶん幅広いが、鎖長および不飽和の程度およびタイプの双方によって区別する。したがってエロンガーゼは異なる特異性を有することができる。例えばＣ１４／１６エロンガーゼは、Ｃ１４基質（例えばミリスチン酸）を利用し、Ｃ１６／１８エロンガーゼはＣ１６基質（例えばパルミチン酸）を利用し、Ｃ１８／２０エロンガーゼはＣ１８基質（例えばＧＬＡ、ＳＴＡ）を利用し、Ｃ２０／２２エロンガーゼはＣ２０基質（例えばＥＰＡ）を利用する。同様にΔ９エロンガーゼは、ＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの変換をそれぞれ触媒できる。いくつかのエロンガーゼは幅広い特異性を有するため、単一酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒できるかもしれない（それによって例えばＣ１６／１８エロンガーゼおよびＣ１８／２０エロンガーゼの双方として作用する）ことに留意することは重要である。好ましい実施形態では、適切な宿主を脂肪酸エロンガーゼの遺伝子で形質転換して、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその効果を判定し、脂肪酸エロンガーゼの特異性を経験的に判定することが最も望ましい。
「高親和力エロンガーゼ」または「ＥＬ１Ｓ」または「ＥＬＯ１」という用語は、その基質特異性が好ましくはＧＬＡに対するものであるＣ１８／２０エロンガーゼを指す（エロンガーゼ反応の生成物がＤＧＬＡ［すなわちΔ６エロンガーゼ］）。このようなエロンガーゼの１つについては、国際公開第００／１２７２０号パンフレットで述べられ、ここで配列番号１７および１８として提供される。しかし出願者らはこの酵素がまた、１８：２（ＬＡ）および１８：３（ＡＬＡ）に対してもいくらかの活性を有することを示した。したがって配列番号１８は、（そのΔ６エロンガーゼ活性に加えて）Δ９エロンガーゼ活性を示す。したがってここで配列番号１８として提供されるＣ１８／２０エロンガーゼは、本発明で述べられるようにΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路内の双方で機能し、そして例えばイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ９エロンガーゼ（配列番号４０）の代わりとして、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路内で機能できると結論された。
「ＥＬ２Ｓ」または「ＥＬＯ２」という用語は、その基質特異性が、好ましくはＧＬＡに対するもの（エロンガーゼ反応の生成物がＤＧＬＡ）および／またはＳＴＡ（エロンガーゼ反応の生成物がＳＴＡ）に対するものであるＣ１８／２０エロンガーゼを指す。このような１つのエロンガーゼについては、米国特許第６，６７７，１４５号明細書で述べられ、ここで配列番号２０および２１として提供される。
「ＥＬＯ３」という用語は、ｅｌｏ３遺伝子（配列番号５３）によってコードされるモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ酵素（ここで配列番号５４として提供される）を指す。「ＹＥ２」という用語は、ここで配列番号６１として提供される遺伝子によってコードされる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ酵素（ここで配列番号６２として提供される）を指す。ここで報告されるデータに基づいて、ＥＬＯ３およびＹＥ２は、どちらもパルミチン酸（１６：０）からステアリン酸（１８：０）への変換を優先的に触媒する。
「ＹＥ１」という用語は、ここで配列番号６４として提供される遺伝子によってコードされる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｃ１４／１６脂肪酸エロンガーゼ酵素（ここで配列番号６５として提供される）を指す。ここで報告されるデータに基づいて、ＹＥ２はミリスチン酸（１４：０）のパルミチン酸（１６：０）への変換を優先的に触媒する。
「変換効率」および「％基質変換」という用語は、それによって特定の酵素（例えばデサチュラーゼまたはエロンガーゼ）が基質を生成物に変換できる効率を指す。変換効率は以下の式に従って評価される。（［生成物］／［基質＋生成物］）×１００（式中、「生成物」には、直接生成物およびそれから誘導される経路中の全生成物が含まれる）。
「油性」と言う用語は、それらのエネルギー源を脂質の形態で保存する傾向がある生物を指す（ウィーテ（Ｗｅｅｔｅ）著、「真菌脂質生化学（Ｆｕｎｇａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第２版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０年）。一般にこれらの微生物細胞の油含量はＳ字形曲線に従い、対数増殖後期または定常増殖初期において脂質濃度が最大に達するまで増大し、次に定常増殖後期および死滅期において徐々に減少する（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）著、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５頁（１９９１年））。
「油性酵母菌」と言う用語は、油を生成できる酵母菌として分類される微生物を指す。一般に油性微生物の細胞油またはトリアシルグリセロール含量はＳ字形曲線に従い、脂質濃度は対数増殖後期または定常増殖初期において最大に達するまで増大し、次に定常増殖後期および死滅期において徐々に減少する（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）著、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５頁（１９９１年））。油性微生物が約２５％を超えるその乾燥細胞重量を油として蓄積するのは珍しくない。油性酵母菌の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。
「発酵性炭素源」と言う用語は、微生物が代謝してエネルギーを引き出す炭素源を意味する。本発明の典型的な炭素源としては、単糖類、少糖類、多糖類、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、および炭素含有アミンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ここでの用法では、「単離された核酸断片」は、場合により合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味する。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸断片は、１個またはそれ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの断片を含んでなってもよい。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍａｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）」アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化アラインメントおよび同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、一般に１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークの原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション）において使用してもよい。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとしてＰＣＲで使用してもよい。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。
「相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響することなく、ヌクレオチド配列の変更を可能にする遺伝コードにおける性質を指す。当業者は、任意のアミノ酸を特定化するためのヌクレオチドコドンの利用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、コドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようように、遺伝子をデザインすることが望ましい。
「化学的に合成された」とは、ＤＮＡ配列に関連して構成要素ヌクレオチドが、生体外で（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）構築されたことを意味する。確立した手順を使用してＤＮＡの手動化学合成を達成してもよく、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。「合成遺伝子」は、当業者に知られた手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲートしアニールして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構成する。したがってヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みを理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞から誘導された遺伝子の調査に基づくことができる。
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域を単独で指してもよく、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列する制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物ゲノムにおいてその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされた遺伝子である。
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでもよい。
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されてもよく、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなってもよく、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる開発段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いてもよいことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列のはっきりした境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
「ＧＰＡＴプロモーター」または「ＧＰＡＴプロモーター領域」という用語は、ｇｐａｔ遺伝子によってコードされるグリセロール−３−リン酸−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１５）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前にあって、発現に必要である５’上流非翻訳領域を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＡＴプロモーター領域の例については、米国特許出願第１１／２２５３５４号明細書で述べられる。
「ＧＰＤプロモーター」または「ＧＰＤプロモーター領域」という用語は、ｇｐｄ遺伝子によってコードされるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．１．２．１．１２）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前にあって、発現に必要である５’上流非翻訳領域を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＤプロモーター領域の例については、国際公開第２００５／００３３１０号パンフレットで述べられる。
「ＧＰＭプロモーター」または「ＧＰＭプロモーター領域」という用語は、ｇｐｍ遺伝子によってコードされるホスホグリセリン酸ムターゼ酵素（ＥＣ５．４．２．１）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前にあって、発現に必要である５’上流非翻訳領域を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＭプロモーター領域の例については、国際公開第２００５／００３３１０号パンフレットで述べられる。
「ＦＢＡプロモーター」または「ＦＢＡプロモーター領域」という用語は、ｆｂａ１遺伝子によってコードされるフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．２．１３）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前にあって、発現に必要である５’上流非翻訳領域を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡプロモーター領域の例については、国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレットで述べられる。
「ＦＢＡＩＮプロモーター」または「ＦＢＡＩＮプロモーター領域」という用語は、ｆｂａ１遺伝子の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前にあって発現に必要である５’上流非翻訳領域、ならびにｆｂａ１遺伝子のイントロンを有する５’コード領域部分を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮプロモーター領域の例については、国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレットで述べられる。
「ＧＰＤＩＮプロモーター」または「ＧＰＤＩＮプロモーター領域」という用語は、ｇｐｄ遺伝子の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前にあって発現に必要である５’上流非翻訳領域、ならびにｇｐｄ遺伝子のイントロンを有する５’コード領域部分を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＤＩＮプロモーター領域の例については、米国特許出願第１１／１８３６６４号明細書で述べられる。
「ＹＡＴ１プロモーター」または「ＹＡＴ１プロモーター領域」という用語は、ｙａｔ１遺伝子によってコードされるアンモニウム輸送体酵素（ＴＣ２．Ａ．４９；ＧｅｎＢａｎｋ（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＸＭ＿５０４４５７）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前にあって、発現に必要である５’上流非翻訳領域を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＹＡＴ１プロモーター領域の例については、米国特許出願第１１／１８５３０１号明細書で述べられる。
「ＥＸＰ１プロモーター」または「ＥＸＰ１プロモーター領域」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）「ＹＡＬＩ０Ｃ１２０３４ｇ」遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０１７４５）によってコードされるタンパク質の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前にあって、発現に必要である５’上流非翻訳領域を指す。「ＹＡＬＩ０Ｃ１２０３４ｇ」と、ｓｐ｜Ｑ１２２０７ Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）非古典的輸出タンパク質２（その機能が、開裂可能なシグナル配列を欠くタンパク質輸出の新規経路に関与する）との顕著な相同性に基づいて、この遺伝子をＥＸＰ１と命名されたタンパク質をコードするｅｘｐ１遺伝子とここで命名する。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＥＸＰ１プロモーター領域の例は配列番号３６４として述べられるが、これは本来、制限を意図するものではない。当業者は、ＥＸＰ１プロモーター配列の正確な境界が完全に画定されていないため、長さが増大または減少したＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有してもよいことを認識するであろう。
「プロモーター活性」という用語は、プロモーターの転写効率のアセスメントを指す。これは例えば（例えばノーザンブロット法またはプライマー伸長法による）プロモーターからのｍＲＮＡ転写量の測定によって直接に、またはプロモーターから発現する遺伝子産物量を測定して間接に判定されてもよい。
「イントロン」とは、ほとんどの真核生物において、（コード領域、５’非コード領域、または３’非コード領域のいずれかの中の）遺伝子配列中に見られる非コードＤＮＡ配列である。それらの全機能は知られていないが、いくつかのエンハンサーは、イントロン中に位置する（ジャコペリ（Ｇｉａｃｏｐｅｌｌｉ），Ｆ．ら著、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．１１：９５〜１０４頁（２００３年））。これらのイントロン配列は転写されるが、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される前にｍＲＮＡ前駆体転写物内から除去される。このイントロン除去プロセスは、イントロンのどちらかの側の配列（エクソン）の自己スプライシングによって起きる。
「エンハンサー」という用語は、隣接する真核生物プロモーターからの転写レベルを上昇させ、それによって遺伝子の転写を増大できるシス−制御配列を指す。エンハンサーは、数十キロベースのＤＮＡにわたってプロモーターに作用でき、それらが制御するプロモーターに対して５’または３’であることができる。エンハンサーはまた、イントロン内に位置できる。
「３’非翻訳配列」および「転写ターミネーター」と言う用語は、コード配列の下流に位置したＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列およびその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。３’領域は、転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響できる。
「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列の転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であるかもしれず、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とはイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それから誘導される二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１７０，０６５号明細書、国際出願公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列にあってもよい。「機能性ＲＮＡ」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞プロセスに影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。
「作動可能に連結した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能によって影響されるような、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響できる（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、それはそのコード配列と作動可能に連結する。コード配列はセンスまたはアンチセンスオリエンテーションで、制御配列に作動可能に連結できる。
「発現」と言う用語は、ここでの用法では、本発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。
「成熟」タンパク質とは、転写後処理されたポリペプチド、すなわち一次翻訳生成物中に存在するあらゆるプレまたはプロペプチドがそれから除去されたものを指す。「前駆物質」タンパク質とはｍＲＮＡ翻訳の一次生成物を指し、すなわちプレおよびプロペプチドは存在したままである。プレおよびプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであってもよい（が、これに限定されるものではない）。
「リコンビナーゼ」という用語は、部位特異的遺伝子組換えを実行して、ＤＮＡ構造を変更させる酵素を指し、トランスポサーゼ、ラムダ組み込み／切除酵素、ならびに部位特異的リコンビナーゼが挙げられる。
「リコンビナーゼ部位」または「部位特異的リコンビナーゼ配列」とは、リコンビナーゼが認識して結合するＤＮＡ配列を意味する。これは、機能性が維持されてリコンビナーゼ酵素がなおも部位を認識し、ＤＮＡ配列に結合して２つの隣接するリコンビナーゼ部位間の遺伝子組換えを触媒できるならば、野性型または突然変異リコンビナーゼ部位であってもよいものと理解される。
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物への核酸分子の転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノム中に組み込まれてもよい。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物と称される。
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
「相同的組換え」と言う用語は、（交差中の）２つのＤＮＡ分子間のＤＮＡ断片の交換を指す。交換される断片は、２個のＤＮＡ分子間で同一ヌクレオチド配列の部位（すなわち「相同性領域」）に挟まれる。「相同性領域」と言う用語は、相同的組換えに関与する、核酸断片上の互いに相同性を有するひと続きのヌクレオチド配列を指す。効果的な相同的組換えは、一般に長さが少なくとも約１０ｂｐである相同性領域で起き、少なくとも約５０ｂｐの長さが好ましい。典型的に遺伝子組換えが意図される断片は、標的を定めた遺伝子中断または置換が所望される少なくとも２つの相同性領域を含有する。
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）ウィスコンシン州マディソンのジェネティック・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＧＣＧパッケージプログラム、ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０年））、３．）ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）ミシガン州アンアーバーのジーンコーズ社（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）著、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、１９９２年会議、１１１〜２０頁、スハイ，サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）編、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに最初にロードされる、あらゆる値またはパラメーターの組を意味する。
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連するタンパク質の整合配列に沿った特定位置において保存された一組のアミノ酸を意味する。その他の位置のアミノ酸が相同的なタンパク質間で異なることができるのに対し、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性に必須のアミノ酸を示唆する。それらはタンパク質相同体ファミリーの整合配列におけるそれらの高度な保存によって同定されるので、それらは新たに判定された配列のタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判別するための識別子、または「シグネチャ」として使用できる。Δ１５デサチュラーゼ活性を有する真菌タンパク質の徴候であるモチーフは、配列番号３７４として提供される一方、Δ１２デサチュラーゼ活性を有する真菌タンパク質の徴候であるモチーフは、配列番号３７５として提供される。
ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は技術分野でよく知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（以下マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ），Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ），Ｍ．Ｌ．、およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ），Ｌ．Ｗ．著、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら著、「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７年）で述べられている。
ＡＲＡ生成に好ましい微生物宿主：ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）
本出願人らの研究（ピカタッジョ（Ｐｉｃａｔａｇｇｉｏ）ら、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレット参照）に先だって、油性酵母は、ＰＵＦＡの生産プラットフォームとして使用するのに適した微生物クラスとして以前に調査されている。典型的に油性酵母として同定された属としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）。より具体的には例示的な油合成酵母として、次が挙げられる。ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポミセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プリケリーマ（ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類された）。
油性酵母は、ＡＲＡの経済的な商業生産の宿主生物としてのそれらの使用を容易にする、いくつかの性質を有すると見なされる。第１に生物体は自然に油合成および蓄積ができるものとして定義され、そこでは油は、細胞乾燥重量の約２５％を超え、より好ましくは細胞乾燥重量の約３０％を超え、そして最も好ましくは細胞乾燥重量の約４０％を超える量を構成できる。第２に高含油量で油性酵母を生育させる技術は、十分に開発されている（例えばＥＰ第０ ００５ ２７７Ｂ１号明細書；ラトレッジ（Ｒａｔｌｅｄｇｅ），Ｃ．著、Ｐｒｏｇ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：１１９〜２０６頁（１９８２年）参照）。そして、これらの生物は、過去に多様な目的のために商業的に使用されている。例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の様々な株は、歴史的に以下の製造および生産のために使用されている。イソシトレートリアーゼ（ＤＤ第２５９６３７号明細書）；リパーゼ（ＳＵ第１４５４８５２号明細書、国際公開第２００１０８３７７３号パンフレット、ＤＤ第２７９２６７号明細書）；ポリヒドロキシアルカノアート（国際公開第２００１０８８１４４号パンフレット）；クエン酸（ＲＵ第２０９６４６１号明細書、ＲＵ第２０９０６１１号明細書、ＤＤ第２８５３７２号明細書、ＤＤ第２８５３７０号明細書、ＤＤ第２７５４８０号明細書、ＤＤ第２２７４４８号明細書、ＰＬ第１６００２７号明細書）；エリトリトール（ＥＰ第７７０６８３号明細書）；２−オキソグルタル酸（ＤＤ第２６７９９９号明細書）；γ−デカラクトン（米国特許第６，４５１，５６５号明細書、ＦＲ第２７３４８４３号明細書）；γ−ドデカラクトン（ＥＰ第５７８３８８号明細書）；およびピルビン酸（特開平０９−２５２７９０号公報）。
油性酵母として分類される生物から、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）がここでの目的で好ましい微生物宿主として選択された。この選択は、ω−６およびω−３脂肪酸をＴＡＧ画分に組み込める油性株が利用でき、生物が遺伝的操作に適しており、種が以前に食物等級クエン酸の安全食品認定（米国食品医薬品局に従った「ＧＲＡＳ」）供給源として使用された知識に基づいた。さらに別の実施形態では、高脂質含量（パーセント乾燥重量として測定される）および高容量生産性（ｇ／Ｌｈ−１として測定される）を有する野生型株の同定を目的とする予備的研究の結果、最も好ましいのはＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２、および／またはＬＧＡＭＳ（７）１（パパニコラオウ（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ），Ｓ．、およびアゲリス（Ａｇｇｅｌｉｓ），Ｇ．著、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９頁（２００２年））と命名されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である
国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで述べられるように、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、以前にω−３／ω−６生合成経路をコードする遺伝子の導入および発現によって遺伝子改変され、１．３％のＡＲＡおよび１．９％のＥＰＡをそれぞれ生成した。より具体的には（ＡＲＡ合成のためのΔ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、および高−親和力ＰＵＦＡ Ｃ１８／２０エロンガーゼ、またはＥＰＡ合成のためのΔ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、高−親和力ＰＵＦＡ Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびコドン最適化Δ１７デサチュラーゼのどちらかを含んでなる）２つの異なるＤＮＡ発現コンストラクトを別々に形質転換して、酵素オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２３）をコードするＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）染色体のＵＲＡ３遺伝子に組み込んだ。適切な基質を供給された宿主細胞のＧＣ分析からは、ＡＲＡおよびＥＰＡの生成が検出された。この研究は、ω−６およびω−３脂肪酸生成のために油性宿主が遺伝子改変される能力のコンセプトの証明を実証するのには適切であったが、総油画分中５％を超えるＡＲＡ、より好ましくは総油画分中１０％を超えるＡＲＡ、さらにより好ましくは総油画分中１５〜２０％を超えるＡＲＡ、最も好ましくは総油画分中２５〜３０％を超えるＡＲＡの合成を可能にするのに必要な複雑な代謝エンジニアリングを実施できなかった。
同時係属中の米国仮特許出願第６０／６２４８１２号明細書では、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内の複雑な代謝遺伝子操作が実施されて、（１）ＥＰＡの合成および高蓄積を可能にする好ましいデサチュラーゼおよびエロンガーゼが同定され、（２）オメガ脂肪酸の貯蔵脂質プール内への転移を可能にするアシルトランスフェラーゼ活性が操作され、（３）強力プロモーター、マルチコピー発現、および／またはコドン最適化の使用によって、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびアシルトランスフェラーゼが過剰発現され、（４）ＥＰＡの全体的蓄積を減少させるＰＵＦＡ生合成経路内の特異的遺伝子の発現が下方制御され、（５）ＥＰＡ生成に影響する経路および包括的制御因子が操作される。これによって、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のある特定の組換え株において、２８％までのＥＰＡの生成が生じる。
本願明細書では、類似した複雑な代謝遺伝子操作が実施されて、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の組換え株の総油画分中に１０〜１４％のＡＲＡが生じる。より具体的には、Ｙ２０３４株およびＹ２０４７株が遺伝子操作されて、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路を利用し、生成される油は、それぞれ１０％のＡＲＡおよび１１％のＡＲＡを含んでなる。Ｙ２２１４株が遺伝子操作されて、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を利用し、生成される油は、ＧＬＡを欠いた１４％のＡＲＡを含んでなる。利用された代謝遺伝子操作の態様、ならびにこの油性酵母中でのＡＲＡ生産性をさらに増強するために実施され得るさらなる遺伝子操作および発酵方法について下で述べる。
概説：脂肪酸およびトリアシルグリセロールの微生物生合成
一般に、油性微生物中の脂質蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素対窒素比に答えて誘発される。油性微生物中に遊離パルミチン酸（１６：０）の新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成をもたらすこのプロセスについては、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで詳細に述べられる。パルミチン酸は、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じて形成される、より長鎖の飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆物質である。例えばパルミチン酸は、Δ９デサチュラーゼの作用によってその不飽和誘導体［パルミトレイン酸（１６：１）］に変換される。同様にパルミチン酸は、Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼによって延長されてステアリン酸（１８：０）が形成し、それはΔ９デサチュラーゼによってその不飽和誘導体に変換され、それによってオレイン（１８：１）酸を生じることができる。
ＴＡＧ（脂肪酸の主要な貯蔵単位）は、以下が関与する一連の反応によって形成される。１．）リゾホスファチジン酸を生じる、アシルトランスフェラーゼによるアシル−ＣｏＡの１分子のグリセロール−３−リン酸塩へのエステル化、２．）１，２−ジアシルグリセロールリン酸塩（一般にホスファチジン酸として同定される）を生じる、アシルトランスフェラーゼによるアシル−ＣｏＡの第２の分子のエステル化、３．）１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生じる、ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸塩の除去、および４．）ＴＡＧを形成する、アシルトランスフェラーゼの作用による第３の脂肪酸の付加（図２）。
飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする、幅広い脂肪酸をＴＡＧに組み込むことができる。アシルトランスフェラーゼによってＴＡＧに組み込むことができる脂肪酸の制限を意図しない例のいくつかとしては、カプリン（１０：０）、ラウリン（１２：０）、ミリスチン（１４：０）、パルミチン（１６：０）、パルミトレイン（１６：１）、ステアリン（１８：０）、オレイン（１８：１）、バクセン（１８：１）、ＬＡ、エレオステアリン酸（１８：３）、ＡＬＡ、ＧＬＡ、アラキジン酸（２０：０）、ＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ベヘン酸（２２：０）、ＤＰＡ、ＤＨＡ、リグノセリン（２４：０）、ネルボン（２４：１）、セロチン（２６：０）、およびモンタン（２８：０）脂肪酸が挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、ＴＡＧへのＡＲＡの組み込みが最も望ましい。
ω−６脂肪酸であるＡＲＡの生合成
オレイン酸がＡＲＡに変換される代謝プロセスは、炭素原子付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合添加を通じた分子の不飽和化を伴う。これは、小胞体膜内に存在する一連の特別な不飽和化および延長酵素を必要とする。しかし図１に示され下で述べられるように、ＡＲＡ生成のための代案の経路が存在する。
具体的には、双方の経路は、Δ１２デサチュラーゼの作用によるオレイン酸から第１のω−６脂肪酸であるＬＡ（１８：２）への初期変換を必要とする。次にＡＲＡ生合成のための「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」を使用し、ＰＵＦＡが次のようにして形成される。（１）Δ６デサチュラーゼの活性によってＬＡがＧＬＡに変換される、（２）Ｃ１８／２０エロンガーゼの作用によってＧＬＡがＤＧＬＡに変換され、（３）Δ５デサチュラーゼの作用によってＤＧＬＡがＡＲＡに変換される。
代案としては、「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」を通じて、Δ９エロンガーゼの作用によってＬＡがＥＤＡに変換され、次にΔ８デサチュラーゼがＥＤＡをＤＧＬＡに変換する。引き続くΔ５デサチュラーゼの作用によるＤＧＬＡ不飽和化からは、上述のようにＡＲＡが生じる。
分かりやすくするために、これらの各経路ならびにそれらの際立った特性を下の表に要約する。
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所望ならば、基質としてＡＲＡを使用していくつかのその他のＰＵＦＡを生成できる。例えばΔ１７デサチュラーゼによって、ＡＲＡをさらにＥＰＡに不飽和化でき、引き続いてＣ２０／２２エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼの作用によって、さらにＤＨＡに変換できる。
ＡＲＡ合成のための微生物遺伝子の選択
ＡＲＡ生成のためにヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に導入することが必要な特定の機能性は、宿主細胞（およびその天然ＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質の入手可能性、および所望の最終産物に左右されることが考察される。天然宿主細胞について、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は１８：２脂肪酸を自然に生成し、したがって天然Δ１２デサチュラーゼ（配列番号２３および２４、国際公開第２００４／１０４１６７号パンフレット参照）を有することが知られている。所望の最終産物については、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現結果に対立するものとして、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の発現結果が、このようにして生成された油の最終脂肪酸プロフィールとして上に記述されている（すなわち高ＡＲＡ油の最終組成中の％ＧＬＡ）。
したがっていくつかの実施形態では、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路を通じてＡＲＡを生成することが望ましい。したがってＡＲＡ生合成のために、最低限、Δ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびΔ５デサチュラーゼの遺伝子を宿主生物に導入して発現させなくてはならない。さらに好ましい実施形態では、宿主株は、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、およびＣ１６／１８エロンガーゼの少なくとも１つをさらに含む。
代案の実施形態では、ＧＬＡの同時合成なしにＡＲＡを生成することが望ましい（したがってΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を要する）。その結果、このストラテジーは、ＡＲＡ生合成のために、最低限、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、およびΔ５デサチュラーゼの遺伝子を宿主生物に導入して発現することを要する。さらに好ましい実施形態では、宿主株は、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、およびａＣ１６／１８エロンガーゼの少なくとも１つをさらに含む。
当業者は、ＡＲＡ生合成のために所望される各酵素をコードする、様々な候補遺伝子を同定できるであろう。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列はあらゆる供給源に由来してもよく、例えば天然供給源（細菌、藻類、真菌、植物、動物などから）から単離され、半合成経路によって生成され、または新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成される。宿主中に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の供給源は本発明にとって重大でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特異的ポリペプチド選択のための配慮としては以下が挙げられる。１．）ポリペプチドの基質特異性、２．）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、３．）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のＰＵＦＡ合成に必須であるかどうか、および／または４．）ポリペプチドが必要とする補助因子。発現したポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中のその位置の生化学的環境に適合したパラメーターーを有する。例えばポリペプチドは、宿主細胞中のその他の酵素と基質獲得のために争わなくてはならないかもしれない。したがって宿主細胞中のＰＵＦＡ生成を修正する特定ポリペプチドの適合性を判定するのに、ポリペプチドのＫＭおよび比活性の分析を考慮してもよい。特定の宿主細胞で使用されるポリペプチドは、意図される宿主細胞中に存在する生化学的条件下で機能できるものであるが、それ以外には所望のＰＵＦＡを修正できるデサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する、あらゆるポリペプチドであることができる。
追加的実施形態では、特定の各デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの変換効率を考慮することもまた有用であろう。より具体的には、各酵素が基質を生成物に変換するのに１００％の効率で機能することは稀なので、宿主細胞中に生成される未精製油の最終脂質プロフィールは、典型的に（例えば１００％のＡＲＡ油とは対照的に）所望のＡＲＡならびに様々な上流中間ＰＵＦＡからなる様々なＰＵＦＡの混合物である。したがってＡＲＡ生合成を最適化するのに際し、各酵素の変換効率の配慮もまた重要な変数であり、生成物の最終所望の脂質プロフィールの観点から考慮しなくてはならない。
上の各考慮を念頭に置いて、公的に入手できる文献（例えばＧｅｎＢａｎｋ）、特許文献、およびＰＵＦＡを生成する能力を有する微生物の実験的分析に従って、適切なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性を有する候補遺伝子を同定できる。例えば以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、ＡＲＡ生合成に有用な公的に入手できる遺伝子の例を指す。ＡＹ１３１２３８、Ｙ０５５１１８、ＡＹ０５５１１７、ＡＦ２９６０７６、ＡＦ００７５６１、Ｌ１１４２１、ＮＭ＿０３１３４４、ＡＦ４６５２８３、ＡＦ４６５２８１、ＡＦ１１０５１０、ＡＦ４６５２８２、ＡＦ４１９２９６、ＡＢ０５２０８６、ＡＪ２５０７３５、ＡＦ１２６７９９、ＡＦ１２６７９８（Δ６デサチュラーゼ）、ＡＦ３９０１７４（Δ９エロンガーゼ）、ＡＦ１３９７２０（Δ８デサチュラーゼ）、ＡＦ１９９５９６、ＡＦ２２６２７３、ＡＦ３２０５０９、ＡＢ０７２９７６、ＡＦ４８９５８８、ＡＪ５１０２４４、ＡＦ４１９２９７、ＡＦ０７８７９、ＡＦ０６７６５４、ＡＢ０２２０９７（Δ５デサチュラーゼ）、ＡＡＧ３６９３３、ＡＦ１１０５０９、ＡＢ０２００３３、ＡＡＬ１３３００、ＡＦ４１７２４４、ＡＦ１６１２１９、ＡＹ３３２７４７、ＡＡＧ３６９３３、ＡＦ１１０５０９、ＡＢ０２００３３、ＡＡＬ１３３００、ＡＦ４１７２４４、ＡＦ１６１２１９、Ｘ８６７３６、ＡＦ２４０７７７、ＡＢ００７６４０、ＡＢ０７５５２６、ＡＰ００２０６３（Δ１２デサチュラーゼ）、ＡＦ３３８４６６、ＡＦ４３８１９９、Ｅ１１３６８、Ｅ１１３６７、Ｄ８３１８５、Ｕ９０４１７、ＡＦ０８５５００、ＡＹ５０４６３３、ＮＭ＿０６９８５４、ＡＦ２３０６９３（Δ９デサチュラーゼ）、およびＮＰ＿０１２３３９、ＮＰ＿００９９６３、ＮＰ＿０１３４７６、ＮＰ＿５９９２０９、ＢＡＢ６９８８８、ＡＦ２４４３５６、ＡＡＦ７０４１７、ＡＡＦ７１７８９、ＡＦ３９０１７４、ＡＦ４２８２４３、ＮＰ＿９５５８２６、ＡＦ２０６６６２、ＡＦ２６８０３１、ＡＹ５９１３３５、ＡＹ５９１３３６、ＡＹ５９１３３７、ＡＹ５９１３３８、ＡＹ６０５０９８、ＡＹ６０５１００、ＡＹ６３０５７３（Ｃ１４／１６、Ｃ１６／１８およびＣ１８／２０、エロンガーゼ）。同様に特許文献は、ＰＵＦＡ生成に関与する多くの追加的な遺伝子のＤＮＡ配列（および／または上のいくつかの遺伝子およびそれらの単離方法に関する詳細）を提供する［例えば国際公開第０２／０７７２１３号パンフレット（Δ９エロンガーゼ）、国際公開第００／３４４３９号パンフレットおよび国際公開第０４／０５７００１号パンフレット（Δ８デサチュラーゼ）、米国特許第５，９６８，８０９号明細書（Δ６デサチュラーゼ）、米国特許第５，９７２，６６４号明細書および米国特許第６，０７５，１８３号明細書（Δ５デサチュラーゼ）、国際公開第９４／１１５１６号パンフレット、米国特許第５，４４３，９７４号明細書、国際公開第０３／０９９２１６号パンフレット、および国際公開第０５／０４７４８５号パンフレット（Δ１２デサチュラーゼ）、国際公開第９１／１３９７２号パンフレットおよび米国特許第５，０５７，４１９号明細書（Δ９デサチュラーゼ）、および国際公開第００／１２７２０号パンフレット、米国特許第６，４０３，３４９号明細書、米国特許第６，６７７，１４５号明細書、米国特許第２００２／０１３９９７４ Ａ１号明細書、米国特許第２００４／０１１１７６３号明細書（Ｃ１４／１６、Ｃ１６／１８、およびＣ１８／２０エロンガーゼ）］。これらの各特許および出願は、引用することによりそれらの内容全体を本願明細書に編入する。
上の例は制限を意図するものではなく、異なる供給源に由来する（１）Δ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびΔ５デサチュラーゼ（そして場合によりΔ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼおよび／またはＣ１６／１８エロンガーゼをコードするその他の遺伝子）、または（２）Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、およびΔ５デサチュラーゼ（そして場合によりΔ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼおよび／またはＣ１６／１８エロンガーゼをコードするその他の遺伝子）をコードする多数のその他の遺伝子が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中への導入に適する。
ＡＲＡ合成のために好ましい遺伝子
しかしヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現に適することができるデサチュラーゼおよびエロンガーゼの幅広い選択にも関わらず、本発明の好ましい実施形態では、デサチュラーゼおよびエロンガーゼは以下（またはその誘導体）から選択される。
Figure 0005139806
Figure 0005139806
本出願人らは様々なエロンガーゼを分析して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で発現する際の各酵素の基質特異性および／または基質選択性を判定または確認した。例えば２つのＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）エロンガーゼのコード配列は公的に入手でき、各タンパク質は推定上の長鎖脂肪酸アシルエロンガーゼとして注釈され、またはその他の脂肪酸エロンガーゼと顕著な相同性を共有しているが、これらの酵素の基質特異性はいまだかつて判定されていない。ここで実施した分析に基づいて、ＹＥ１は基質としてＣ１４脂肪酸を優先的に使用してＣ１６脂肪酸を生成する脂肪酸エロンガーゼ（すなわちＣ１４／１６エロンガーゼ）であると判定され、ＹＥ２は基質としてＣ１６脂肪酸を優先的に使用してＣ１８脂肪酸を生成する脂肪酸エロンガーゼ（すなわちＣ１６／１８エロンガーゼ）であると判定された。同様に新規Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＥＬＯ３遺伝子の同定に際して、配列はその他の脂肪酸エロンガーゼに相同的であると特性決定された。しかしＣ１６／１８エロンガーゼとしてのＥＬＯ３の特異性を確認するために、脂質プロフィールの分析が必要であった。
Δ１２デサチュラーゼについて、本出願人らはＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で１８：２を生成する際に、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ（配列番号２７によってコードされる）が、天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼよりも高い効率で機能するという意外な発見をした（国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレット参照）。具体的には、ＴＥＦプロモーター制御下にあるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼをコードするキメラ遺伝子の発現によって以前得られた（ＬＡの生成物蓄積５９％）よりも、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でＴＥＦプロモーター制御下にあるＦ．モニリフォルメ（ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼの発現が、高いレベルの１８：２を生成する（ＬＡの生成物蓄積６８％）と判定された。これはそれぞれ８５％対７４％の％基質変換（（［１８：２＋１８：３］／［１８：１＋１８：２＋１８：３］）×１００として計算される）の差に相当する。これらの結果に基づいて、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の高ＡＲＡ生成株を操作する手段として、本真菌Ｆ．モニリフォルメ（ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼの発現は、その他の知られているΔ１２デサチュラーゼよりも好ましい（しかし当業者は、例えばコドン最適化に続いてＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でＦ．モニリフォルメ（ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼの活性が増強できることを期待するであろう）。
好ましいΔ１２デサチュラーゼとしての現行のＦ．モニリフォルメ（ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）のΔ１２酵素の同定にもかかわらず、最近、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において、おそらく改善された効率で機能する５つの新しいΔ１２デサチュラーゼが同定されている。具体的には、サッカロミセス・クリヴェリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）Δ１２デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＤ０８３７５）についてワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）ら（「バイオサイエンス，バイオケミストリー・アンド・バイオフィジオロジー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」６８（３）：７２１〜７２７頁（２００４年））で述べられているのに対し、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ１８２１６３）からのものついてはサクラダニ（Ｓａｋｕｒａｄａｎｉ）ら（「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」２６１（３）：８１２〜８２０頁（１９９９年））で述べられる。双方の配列は引き続いて利用されて、Ｓ．クリヴェリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）およびＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）Δ１５デサチュラーゼ（それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＤ１１９５２およびＡＢ１８２１６３）が同定され、これらの２対のタンパク質は、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、およびフザリウム・グラミネアリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）（国際公開第２００５／０４７４８０号パンフレットおよび国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレット参照）のものと同様に、近縁関係にある真菌Δ１２およびΔ１５デサチュラーゼの追加的な例を提供した。この発見は、真菌Δ１２デサチュラーゼ様配列の「対」が、Δ１５デサチュラーゼ活性を有する１つのタンパク質およびΔ１２デサチュラーゼ活性を有する１つのタンパク質を含んでなると思われるという出願人らの以前の仮説に追加的な支持を提供した。このようにして同様のΔ１２デサチュラーゼ様タンパク質の「対」が、クリヴェロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、およびデバリオミセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）ＣＢＳ７６７においてここで同定され、予測されたように各対の１つのメンバーは以前同定されたＳ．クリヴェリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）Δ１２デサチュラーゼ（すなわち、Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）ｇｎｌ｜ＧＬＶ｜ＫＬＬＡ０Ｂ００４７３ｇ ＯＲＦ、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＡＫ９４９５５およびＤ．ハンセニ（ｈａｎｓｅｎｉｉ）ＣＢＳ７６７ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ９０２３７）により近く整列し、およびもう１つはＳ．クリヴェリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）Δ１５デサチュラーゼ（すなわち、Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿４５１５５１、Ｄ．ハンセニ（ｈａｎｓｅｎｉｉ）ＣＢＳ７６７ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８８１８２、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＡＬ０３４９３）により近く整列した。したがってこの分析に基づいて、出願人らは、ここで配列番号３５８、３５９、３６１、３６２および３６３として同定されるデサチュラーゼをＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるその過剰発現がω−６脂肪酸の生成を増大するのに有用であることができる、推定真菌Δ１２デサチュラーゼとして同定した。
追加的な実施形態では、出願人らは、Δ１５デサチュラーゼ活性とは対照的に、Δ１２デサチュラーゼ活性を有する真菌配列を容易に区別する手段を同定した。具体的にはΔ１２デサチュラーゼ（すなわち、Ｍａｄ１２、Ｓｋｄ１２、Ｎｃｄ１２、Ｆｍｄ１２、Ｍｇｄ１２、Ａｎｄ１２、Ｆｇｄ１２、Ｄｈｄ１２ｐ、Ｋｌｄ１２ｐ、Ｃａｄ１２ｐ、およびＡｆｄ１２ｐ（上の表参照））ならびにΔ１５デサチュラーゼ（すなわち、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、Ｆ．グラミネアリウム（ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）、サッカロミセス・クリヴェリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｄ．ハンセニ（ｈａｎｓｅｎｉｉ）ＣＢＳ７６７およびアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）由来）を含んでなるアミノ酸アラインメントを分析すると、真菌Δ１５またはΔ１２デサチュラーゼの全てがフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ（国際公開第２００５／０４７４７９号パンフレット中配列番号２）の１０２位に対応する位置に、ＩｌｅまたはＶａｌアミノ酸残基のどちらかをそれぞれ含有し、それは高度に保存されたＨｉｓ Ｂｏｘ １（「ＨＥＣＧＨ」、配列番号３７３）からアミノ酸残基わずか３個分離れた位置であることが明らかになった（表６）。
Figure 0005139806
本出願人らは、真菌デサチュラーゼにおいて、この位置のＩｌｅおよびＶａｌは、それぞれΔ１５およびΔ１２デサチュラーゼ特異性の決定因子であると結論する。より具体的には本出願人らは、対応残基にＩｌｅがあるあらゆる真菌Δ１２デサチュラーゼ様タンパク質（すなわち、またはモチーフＩＸＸＨＥＣＧＨ［配列番号３７４］）はΔ１５デサチュラーゼであり、対応残基にＶａｌがあるあらゆる真菌Δ１２デサチュラーゼ様タンパク質（すなわち、またはモチーフＶＸＸＨＥＣＧＨ［配列番号３７６］）はΔ１２デサチュラーゼであると提案する。したがってこの単一ロイシン／バリンアミノ酸は、将来の真菌デサチュラーゼを同定および注釈するときに、重要な残基とみなされる。さらに真菌Δ１２デサチュラーゼ様タンパク質をコードする遺伝子（例えば国際公開第２００５／０４７４７９号パンフレットで配列番号２として述べられるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）デサチュラーゼ）において、この位置でのＩｌｅからＶａｌへの変化をもたらす突然変異が、Δ１２不飽和化などに向けた酵素特異性を変化させることが考察され、反対にこの位置でのＶａｌからＩｌｅへの変化もたらす突然変異は、Δ１５不飽和化などに向けた酵素特異性を変化させると、本出願人らはさらに仮説を立てている。
もちろん本発明の代案の実施形態では、配列番号２、５、７、９、１２、１８、２１、２４、２６、２８、３０〜３２、３４、３６、３８、４０、４５、５１、５４、６２、６５、３５８、３５９、および３６１〜３６３によってコードされるデサチュラーゼおよびエロンガーゼと実質的に同一のその他のＤＮＡもまた、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのＡＲＡ生成のために使用できる。「実質的に同一の」とは、増大する好ましさの順で、選択されるポリペプチド、またはアミノ酸配列をコードする核酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％の相同性を示すアミノ酸配列または核酸配列を意図する。ポリペプチドでは、比較配列の長さは一般に、少なくとも１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸または最も好ましくは３５個のアミノ酸である。核酸では、比較配列の長さは一般に、少なくとも５０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７５個のヌクレオチド、そして最も好ましくは１１０個のヌクレオチドである。
相同性は、典型的に配列分析ソフトウェアを使用して測定され、「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）ウィスコンシン州マディソンのジェネティック・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＧＣＧパッケージプログラム、ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０年））、３．）ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＤＮＡＳＴＡＲ、および４．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）著、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、１９９２年会議、１１１〜２０頁、スハイ，サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）編、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに最初にロードされる、あらゆる値またはパラメーターの組を意味する。一般に、このようなコンピューターソフトウェアは、様々な置換、欠失、およびその他の修正に相同性の程度を割り当てて同様の配列を対応させる。
より好ましい実施形態では、配列番号２、９、１２、１８、２１、４０、４５、および５１で述べられるものと実質的に同一のデサチュラーゼおよびエロンガーゼをコードするコドン最適化遺伝子が利用される。具体的には当業者によく知られているように、選択される宿主微生物中での最適遺伝子発現のためのコドンで天然遺伝子中のコドンを置換して、コードされるｍＲＮＡの翻訳効率を増大させることで、異種の遺伝子の発現を増大できる。したがって変性ポリペプチドが代案の宿主に好まれるコドンを使用するように、異種宿主中で発現する特定のポリペプチドをコードするコドン部分を修正することが有用であることが多く、宿主が好むコドンの使用は、ポリペプチドをコードする外来性遺伝子の発現を実質的に増強できる。
一般に宿主が好むコドンは、タンパク質（好ましくは最大量で発現するもの）中でのコドン使用を調べ、どれが最高頻度で使用されるかを判定することにより、関心のある特定の宿主種内で判定できる。次に宿主種で好まれるコドンを使用して、関心のあるポリペプチド（例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ、アシルトランスフェラーゼ）のコード配列を全部または部分的に合成できる。ＤＮＡの全部（または一部）はまた、転写ｍＲＮＡ中に存在するあらゆる不安定化配列または二次構造領域を除去するように合成できる。そして、ＤＮＡの全部（または一部）はまた、塩基組成を所望の宿主細胞中でより好まれるものに改変するように合成できる。
さらに翻訳開始コドン「ＡＴＧ」を取り囲むヌクレオチド配列が、酵母菌細胞中の発現に影響することが分かっている。所望のポリペプチドの酵母菌中での発現が不良であれば、外来性遺伝子のヌクレオチド配列を修正して効率的な酵母菌翻訳開始配列を含めさせ、最適の遺伝子発現を得ることができる。酵母菌中での発現のために、これは非効率的に発現する遺伝子を内在性酵母菌遺伝子、好ましくは高度に発現する遺伝子にインフレームで融合させることによる部位特異的変異誘発によって実施できる。代案としてはここでヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）について実証されるように、宿主中の共通翻訳開始配列を判定して、関心のある宿主中でのそれらの最適発現のために、この配列を異種性遺伝子内に組換えできる。
本発明では、上述の宿主の好みに基づいて、表５からのいくつかのデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子がヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された。これは最初にＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン使用頻度プロフィールを判定し（国際公開第０４／１０１７５７号パンフレット参照）、好ましいコドンを同定することで可能であった。次にＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での遺伝子発現をさらに最適化するために、「ＡＴＧ」開始コドン周辺の共通配列を判定した（すなわち「ＭＡＭＭＡＴＧＮＨＳ」（配列番号３６８）、ここで使用した核酸縮重コードは次のとおり。Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｓ＝Ｃ／Ｇ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、およびＮ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）。下の表７は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で発現した際の天然遺伝子とコドン最適化遺伝子の活性を比較し、各コドン最適化遺伝子に関する詳細を提供する。％Ｓｕｂ．Ｃｏｎｖ．は「％基質変換」の略語であり、Ｃｏｄｏｎ−Ｏｐｔ．は「コドン最適化」の略語である。
Figure 0005139806
本発明の追加的な代案の実施形態では、配列番号３、１０、１３、１６、１９、２２、４１、４８、および５２として表される好ましいデサチュラーゼおよびエロンガーゼと実質的に同一でない、その他のＤＮＡもまた、ここでの目的のために使用できる。例えば本発明の教示に従ったヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中への導入に有用なΔ６デサチュラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ＧＬＡまたはＳＴＡを生成する能力を有する微生物から得られてもよい。このような微生物としては、例えばモルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、コニディオボルス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、フィトファトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈａｔｈｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、チノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、コイドスポリウム（Ｃｏｉｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、およびハエカビ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属に属するものが挙げられる。チノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）属内で特に興味深いのは、Ｐ．クルエンタム（ｃｒｕｅｎｔｕｍ）である。モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属内で特に興味深いのは、Ｍ．エロンガータ（ｅｌｏｎｇａｔａ）、Ｍ．エクシグア（ｅｘｉｇｕａ）、Ｍ．ハイグロフィラ（ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）、Ｍ．ラマニアナ（ｒａｍａｎｎｉａｎａ）アングリスポラ（ａｎｇｕｌｉｓｐｏｒａ）変種、およびＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）である。ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属内で特に興味深いのは、Ｍ．シルシネロイデス（ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）およびＭ．ジャバニカス（ｊａｖａｎｉｃｕｓ）である。
代案としては、例えばＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼと実質的に同一でないが、分子のカルボキシル末端から６個めの炭素で脂肪酸分子を不飽和化できる関連デサチュラーゼもまた、デサチュラーゼがなおもＬＡをＧＬＡにおよび／またはＡＬＡをＳＴＡに効果的に変換できると仮定すれば、本発明においてΔ６デサチュラーゼとして有用であろう。したがって関連デサチュラーゼおよびエロンガーゼは、ここで開示されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼと実質的に同一に機能するそれらの能力によって同定できる（または作り出せる）。
上で提案されたように、別の実施形態では、当業者は例えばここでの目的に適切したΔ１２デサチュラーゼおよびΔ６デサチュラーゼ活性の双方を有する融合タンパク質を作り出せる。これは隣接するリンカーと共にΔ１２デサチュラーゼおよびΔ６デサチュラーゼを一緒に融合することで可能である。Δ１２デサチュラーゼまたはΔ６デサチュラーゼのどちらかが、融合タンパク質のＮ−末端部分にあることができる。適切なリンカー分子をデザインおよび合成する手段は、当業者によって容易に知られており、例えばリンカーはひと続きのアラニンまたはリジンアミノ酸であることができ、融合酵素の活性に影響しない。
最後に、配列を合成し、配列を一緒にまとめる方法は、文献においてよく確立されていることが技術分野で知られている。したがって生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での変異誘発および選択、部位特異的変異誘発、化学的突然変異誘発、「遺伝子シャフリング」法またはその他の手段を用いて、天然由来デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ遺伝子の変異を得ることができる。これによって生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でそれぞれデサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有し、宿主細胞中での機能により望ましい物理的および動力学的パラメーター（例えばより長い半減期または所望のＰＵＦＡのより高速の生成）がある、ポリペプチドの生成が可能になる。
要約すれば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのＡＲＡ生成に適したＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする好ましいデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の配列が提示されるが、これらの遺伝子が本明細書で本発明を限定することは意図されない。本明細書での目的に適するであろうＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする多数のその他の遺伝子が、多様な供給源（例えば適切なデサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する野生型、コドン最適化、合成および／または突然変異酵素）から単離し得る。これらの代案のデサチュラーゼは、１．）分子のカルボキシル末端から数えて８番目および９番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化し、ＥＤＡからＤＧＬＡへの変換を触媒する（Δ８デサチュラーゼ）、２．）ＬＡからＧＬＡへの変換を触媒する（Δ６デサチュラーゼ）、３．）ＤＧＬＡからＡＲＡへの変換を触媒する（Δ５デサチュラーゼ）、４．）オレイン酸からＬＡへの変換を触媒する（Δ１２デサチュラーゼ）、および／または５．）パルミチン酸からパルミトレイン酸および／またはステアリン酸からオレイン酸（Δ９デサチュラーゼ）への変換を触媒する能力によって特徴づけられる。同様に、本明細書での目的に適したエロンガーゼは、特定供給源からのものに限定されない。むしろここでの目的に有用な酵素は、エロンガーゼが作用する基質と比べて炭素２個分脂肪酸炭素鎖を延長し、それによって一価または多価不飽和脂肪酸を生じるそれらの能力によって特徴づけられる。より具体的にはこれらのエロンガーゼは、１．）ＬＡをＥＤＡに延長する（Δ９エロンガーゼ）、２．）Ｃ１８基質を延長してＣ２０生成物を生成する（Ｃ１８／２０エロンガーゼ）、３．）Ｃ１４基質を延長してＣ１６生成物を生成する（Ｃ１４／１６エロンガーゼ）、および／または４．）Ｃ１６基質を延長してＣ１８生成物を生成する（Ｃ１６／１８エロンガーゼ）能力によって特徴づけられる。ここでもいくつかのエロンガーゼは、幅広い基質特異性の結果として、いくつかのエロンガーゼ反応を触媒できるかもしれないことに留意することが重要である。
アシルトランスフェラーゼおよびＴＡＧ生合成終末ステップにおけるそれらの役割
アシルトランスフェラーゼは、ＴＡＧの生合成に深く関与する。ＴＡＧ合成をもたらす関与遺伝子および代謝中間体に関する詳細を含む、酵母菌におけるＴＡＧ生合成に関する２つの包括的なミニレビューは、Ｄ．ソルガー（Ｓｏｒｇｅｒ）およびＧ．ダウム（Ｄａｕｍ）著、「Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」６１：２８９〜２９９頁（２００３年）、およびＨ．ミュルナー（Ｍｕｅｌｌｎｅｒ）およびＧ．ダウム（Ｄａｕｍ）著、Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｐｏｌｏｎｉｃａ、５１（２）：３２３〜３４７頁（２００４年）である。これらのレビューの著者らは、真核生物アシルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリー（下記）の異なるクラスを明確に要約するが、脂質粒子におけるＴＡＧ合成および中性脂質形成の調節側面についてほとんど分かっていないこともまた認める。
中性脂質合成をもたらすアシル−ＣｏＡ−依存または非依存エステル化反応に関与する、４つの真核生物のアシルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーが同定されている。
（１）アシル−ＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）ファミリー、ＥＣ２．３．１．２６（ステロールアシルトランスフェラーゼとして一般的に知られている）。この遺伝子ファミリーとしては、アシル−ＣｏＡおよびステロールからＣｏＡおよびステロールエステルへの変換に関与する酵素が挙げられる。このファミリーとしてはまた、ＴＡＧ生合成の終末ステップに関与するＤＧＡＴ１も挙げられる。
（２）レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）ファミリー、ＥＣ２．３．１．４３。この遺伝子ファミリーは、ホスファチジルコリンおよびステロールからステロールエステルおよび１−アシルグリセロホスホコリンへの変換に関与する。このファミリーとしてはまた、ＴＡＧ生合成をもたらすリン脂質のｓｎ−２位から１，２−ジアシルグリセロールのｓｎ−３位へのアシル基転移に関与する、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）酵素も挙げられる。
（３）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＡＧ ＡＴ）ファミリー、ＥＣ２．３．１．２０。（ＤＧＡＴ２をはじめとする）この遺伝子ファミリーは、ＴＡＧ生合成の終末ステップに関与する。
（４）グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼおよびアシル−ＣｏＡリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ／ＬＰＡＡＴ）ファミリー。ＧＰＡＴ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１５）タンパク質がＴＡＧ生合成の第１のステップに関与するのに対し、ＬＰＡＡＴ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．５１）酵素はＴＡＧ生合成の第２のステップに関与する。このファミリーとしてはまた、リン脂質とＣｏＡの間のアシル交換を触媒するリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）が挙げられる。
これらの４つのアシルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーは一緒になって、中性脂質形成のための重複する生合成システムを表し、分別制御、代案の局在化、および異なる基質特異性（Ｈ．ミュルナー（Ｍｕｅｌｌｎｅｒ）およびＧ．ダウム（Ｄａｕｍ）、前出）の結果であるように見える。これらの４つの各遺伝子ファミリーについて、１０−３０％を超えるＡＲＡの合成を可能にするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での代謝エンジニアリングに対するそれらの重要性に基づいてここで論じる。
様々なアシルトランスフェラーゼの機能性
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのこれらのアシルトランスフェラーゼの多くの間の相互作用を図３に概略的に示す。最初にＴＡＧ生合成の直接的機序に注目すると、このプロセスにおける第１のステップは、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）（および副産物としてＣｏＡ）を生成する、ＧＰＡＴを経由する、１分子のアシル−ＣｏＡからｓｎ−グリセロール−３−リン酸へのエステル化である。次にＬＰＡＡＴによって触媒される反応である、アシル−ＣｏＡの第２の分子のエステル化によって、リゾホスファチジン酸がホスファチジン酸（ＰＡ）（および副産物としてＣｏＡ）に変換される。次にホスファチジン酸ホスファターゼは、ホスファチジン酸からのリン酸基の除去に関与して、１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生じる。そして、最終的に、ＤＡＧ ＡＴ（例えばＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２またはＰＤＡＴ）によって第３の脂肪酸がＤＡＧのｓｎ−３位に付加されて、ＴＡＧが形成する。
歴史的にＤＧＡＴ１は、アシル−ＣｏＡ基がＤＡＧに転移されてＴＡＧを形成する、アシル−ＣｏＡおよびＤＡＧからＴＡＧおよびＣｏＡへの変換に関与する反応を触媒する、ＴＡＧ合成に特異的に関与する唯一の酵素であると考えられてきた。ＤＧＡＴ１はＡＣＡＴと相同的であることが知られていたが、最近の研究はＡＣＡＴ遺伝子ファミリーと無関係のＤＡＧ ＡＴ酵素の新しいファミリーを同定した。したがって命名法は今やＡＣＡＴ遺伝子ファミリー（ＤＧＡＴ１ファミリー）と関係があるＤＡＧ ＡＴ酵素と、無関係のもの（ＤＧＡＴ２ファミリー）との間で区別する（ラルディサバル（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌ）ら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４２）：３８８６２〜３８８６９頁（２００１年））。真核生物の全ての主要な門（真菌、植物、動物、および基底真核生物）において、ＤＧＡＴ２ファミリーのメンバーが同定されている。
さらにより最近、ダルキビスト（Ｄａｈｌｑｖｉｓｔ）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９７：６４８７〜６４９２頁（２０００年））およびエルカース（Ｏｅｌｋｅｒｓ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５６０９〜１５６１２頁（２０００年））は、ＴＡＧ合成が、アシル−ＣｏＡ不在下でもアシル−ＣｏＡ−非依存性機構酵素を通じて起きることができることを発見した。具体的にはＰＤＡＴがホスファチジルコリン基質のｓｎ−２位からアシル基を除去して、ＤＡＧに転移させてＴＡＧを生じる。この酵素は、構造的にＬＣＡＴファミリーと関係があり、ＰＤＡＴの機能はＤＧＡＴ２程にはよく特性決定されていないが、ＰＤＡＴはいくつかの油料種子においてリン脂質から「異常な」脂肪酸を除去する上で主要な役割を果たすと見なされている（バナーズ（Ｂａｎａｓ），Ａ．ら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２８（６）：７０３〜７０５頁（２０００年））。
サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でのＴＡＧ合成に関して、３つの経路について述べられている（サンダガー（Ｓａｎｄａｇｅｒ），Ｌ．ら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（８）：６４７８〜６４８２頁（２００２年））。まずＴＡＧは、主にＤＧＡＴ２（ＤＧＡ１遺伝子によってコードされる）の作用によって、ＤＡＧおよびアシル−ＣｏＡから合成される。しかしより最近では、ＰＤＡＴ（ＬＲＯ１遺伝子によってコードされる）もまた同定されている。最後にアシル−ＣｏＡおよびステロールを利用してステロールエステル（および少量のＴＡＧ、サンダガー（Ｓａｎｄａｇｅｒ），Ｌ．ら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２８（６）：７００〜７０２頁（２０００年）参照）を生成する２つのアシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼ（ＡＲＥ１およびＡＲＥ２遺伝子によってコードされる）が知られている。ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２を合わせると、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）油生合成のおよそ９５％に関与している。
ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、ＰＤＡＴ、およびＡＲＥ２（下記）をコードするいくつかの公的に入手できる配列に基づいて、出願人らはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において、ＤＧＡＴ１（配列番号８１）、ＤＧＡＴ２（配列番号８９、９１、および９３［ここで配列番号８９は、配列番号９１および９３として提供される少なくとも２つの追加的ネストされたＯＲＦを含有し、配列番号９３によってコードされるＯＲＦはその他の知られているＤＧＡＴ酵素と高度の類似性を有し、配列番号９３中の中断は天然遺伝子のＤＧＡＴ機能を除去したので、配列番号９４のポリペプチドがＤＧＡＴ機能性を有することが確認された］）、ＰＤＡＴ（配列番号７６）、およびＡＲＥ２（配列番号７８）をコードする遺伝子を単離し、特性決定した。しかしＳ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で開発された、ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２がおよそ９５％の油生合成に関与するモデルとは対照的に、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ２、およびＤＧＡＴ１は、約９５％までの油生合成に関与することが発見された（さらにＡＲＥ２が油生合成にマイナーな寄与をするかもしれない）。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＴＡＧ画分中でのＡＲＡ蓄積において、その機能が重要であり得る最終アシルトランスフェラーゼ酵素はＬＰＣＡＴである。図３に示すように、この酵素（ＥＣ２．３．１．２３）はｓｎ−ホスファチジルコリンのｓｎ−２位における双方向アシル交換に関与して、ω−６およびω−３ＰＵＦＡ生合成を増強すると仮定される。この仮説は以下の研究に基づく。（１）スティン（Ｓｔｙｍｎｅ），Ｓ．およびＡ．Ｋ．ストバート（Ｓｔｏｂａｒｔ）は、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２３（２）：３０５〜１４頁（１９８４年）で、ＬＰＣＡＴがアシル−ＣｏＡプールおよびホスファチジルコリン（ＰＣ）プールの間の交換に影響すると仮定した。（２）ドマーグ（Ｄｏｍｅｒｇｕｅ），Ｆ．らは、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ ２７８：３５１１５頁（２００３年）で、ＰＣのｓｎ−２位におけるＧＬＡの蓄積、および酵母中でＡＲＡを効率的に合成できないことが、アシル−ＣｏＡプール内で起きるＰＵＦＡ生合成に伴う延長ステップの結果である一方、Δ５およびΔ６不飽和化ステップは大部分ＰＣのｓｎ−２位で起きると提案した。（３）アバディ（Ａｂｂａｄｉ），Ａ．らは、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１６：２７３４〜２７４８頁（２００４年）で、遺伝子導入油料種子植物におけるＰＵＦＡ蓄積抑圧の分析に基づいて、ＬＰＣＡＴが、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の成功裏の再構成において重要な役割を果たすと提案した。（４）（レンツ（Ｒｅｎｚ），Ａ．らは、国際公開第２００４／０７６６１７ Ａ２号パンフレットで、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の遺伝的に導入されたΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路において、延長効率を実質的に改善するシノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｔ０６Ｅ８．１）からＬＰＣＡＴをコードする遺伝子を提供した。研究者らは、デサチュラーゼが脂質結合脂肪酸（ｓｎ−２アシルＰＣ）中の二重結合の導入を触媒する一方、エロンガーゼはＣｏＡエステル化脂肪酸（アシル−ＣｏＡ）の延長を排他的に触媒するので、ＬＰＣＡＴが、リン脂質およびアシル−ＣｏＡプール間における新たに合成された脂肪酸の効率的かつ連続的な交換を可能にしたと結論した。
ＡＲＡ合成のための異種アシルトランスフェラーゼ遺伝子の選択
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で自然に生成されるＰＵＦＡは１８：２脂肪酸（もっと稀には１８：３脂肪酸）に限定されるので、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ（すなわちＬＰＡＡＴ１またはＬＰＡＡＴ２）、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、ＰＤＡＴ、およびＬＰＣＡＴをコードする宿主生物の天然遺伝子は、１８：３およびより長い脂肪酸を含んでなるＴＡＧ（例えばＡＲＡ）を効率的に合成するのが困難であると思われる。したがって場合によっては、異種の（または「外来性」）アシルトランスフェラーゼが、天然酵素よりも好ましいかもしれない。
様々な生物中で多数のアシルトランスフェラーゼ遺伝子が同定され、公共および特許文献中で開示されている。例えば以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、脂質生合成で有用な公的に入手できるアシルトランスフェラーゼ遺伝子の例を指す。ＣＱ８９１２５６、ＡＹ４４１０５７、ＡＹ３６０１７０、ＡＹ３１８７４９、ＡＹ０９３１６９、ＡＪ４２２０５４、ＡＪ３１１３５４、ＡＦ２５１７９５、Ｙ００７７１、Ｍ７７００３（ＧＰＡＴ）；Ｑ９３８４１、Ｑ２２２６７、Ｑ９９９４３、Ｏ１５１２０、Ｑ９ＮＲＺ７、Ｑ９ＮＲＺ５、Ｑ９ＮＵＱ２、Ｏ３５０８３、Ｑ９Ｄ１Ｅ８、Ｑ９２４Ｓ１、Ｑ５９１８８、Ｑ４２６７０、Ｐ２６６４７、Ｐ４４８４８、Ｑ９ＺＪＮ８、Ｏ２５９０３ Ｑ４２８６８、Ｑ４２８７０、Ｐ２６９７４、Ｐ３３３３３、Ｑ９ＸＦＷ４、ＣＱ８９１２５２、ＣＱ８９１２５０、ＣＱ８９１２６０、ＣＱ８９１２５８、ＣＱ８９１２４８、ＣＱ８９１２４５、ＣＱ８９１２４１、ＣＱ８９１２３８、ＣＱ８９１２５４、ＣＱ８９１２３５（ＬＰＡＡＴ）；ＡＹ４４５６３５、ＢＣ００３７１７、ＮＭ＿０１００４６、ＮＭ＿０５３４３７、ＮＭ＿１７４６９３、ＡＹ１１６５８６、ＡＹ３２７３２７、ＡＹ３２７３２６、ＡＦ２９８８１５、およびＡＦ１６４４３４（ＤＧＡＴ１）；およびＮＣ＿００１１４７［遺伝子座ＮＰ＿０１４８８８］、ＮＭ＿０１２０７９、ＮＭ＿１２７５０３、ＡＦ０５１８４９、ＡＪ２３８００８、ＮＭ＿０２６３８４、ＮＭ＿０１００４６、ＡＢ０５７８１６、ＡＹ０９３６５７、ＡＢ０６２７６２、ＡＦ２２１１３２、ＡＦ３９１０８９、ＡＦ３９１０９０、ＡＦ１２９００３、ＡＦ２５１７９４、およびＡＦ１６４４３４（ＤＧＡＴ２）；Ｐ４０３４５、Ｏ９４６８０、ＮＰ＿５９６３３０、ＮＰ＿１９００６９、およびＡＢ００６７０４［ｇｉ：２３５１０６９］（ＰＤＡＴ）。同様に特許文献は、ＴＡＧ生成に関与する多数の追加的な遺伝子のＤＮＡ配列（および／または上のいくつかの遺伝子に関する詳細およびそれらの単離方法）を提供する［例えば米国特許第５，２１０，１８９号明細書、国際公開第２００３／０２５１６５号パンフレット（ＧＰＡＴ）；ＥＰ第１１４４６４９Ａ２号明細書、ＥＰ第１１３１４３８号明細書、米国特許第５，９６８，７９１号明細書、米国特許第６，０９３，５６８号明細書、国際公開第２０００／０４９１５６号パンフレット、および国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレット（ＬＰＡＡＴ）；米国特許第６，１００，０７７号明細書、米国特許第６，５５２，２５０号明細書、米国特許第６，３４４，５４８号明細書、米国特許出願公開第２００４／００８８７５９Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２００４００７８８３６Ａ１号明細書（ＤＧＡＴ１）；米国特許出願公開第２００３／１２４１２６号明細書、国際公開第２００１／０３４８１４号パンフレット、米国特許出願公開第２００３／１１５６３２号明細書、米国特許出願公開第２００３／００２８９２３号明細書、および米国特許出願公開第２００４／０１０７４５９号明細書（ＤＧＡＴ２）；国際公開第２０００／０６００９５号パンフレット（ＰＤＡＴ）；および国際公開第２００４／０７６６１７Ａ２号パンフレット（ＬＰＣＡＴ）。
上の例は制限を意図するものではなく、異なる供給源に由来するＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、ＰＤＡＴ、ＧＰＡＴ、ＬＰＣＡＴ、およびＬＰＡＡＴをコードする多数のその他の遺伝子が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中への導入に適していると考察される。例えば出願人らは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）（配列番号８３および８４）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）（配列番号８５）、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ）ＰＨ−１（配列番号８６）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）（配列番号８７）、およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）（配列番号８８）から新規ＤＧＡＴ１を同定し、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）から新規ＤＧＡＴ２（配列番号９５および９６）、ＧＰＡＴ（配列番号９７および９８）、ＬＰＡＡＴ１（配列番号６７および６８）、およびＬＰＡＡＴ２（配列番号６９および７０）を同定した。
ＡＲＡ合成に好ましいアシルトランスフェラーゼ遺伝子
しかしヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現に適したアシルトランスフェラーゼの幅広い選択にもかかわらず、本発明の好ましい実施形態では、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、ＰＤＡＴ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、およびＬＰＣＡＴは、顕著な量のより鎖長の長いω−６（例えばＡＲＡ）および／またはω−３（例えばＥＰＡ、ＤＨＡ）ＰＵＦＡを生成する生物から選択される。したがって以下の酵素（またはその誘導体）が特に好ましい。
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本明細書において本発明を制限することは意図しないが、野生型生物が全脂肪酸（ＴＦＡ）の５０％を超える濃度でＡＲＡを合成できることから、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）が異種アシルトランスフェラーゼの好ましい供給源として選択された。同様にしてＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）は、そのＴＦＡの２０〜３０％までをＥＰＡとして生成できる。
もちろん本発明の代案の実施形態では、配列番号６７、６８、６９、７０、８０、８３、８４、９５、９６、９７、および９８によってコードされるアシルトランスフェラーゼと実質的に同一のその他のＤＮＡもまた、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での異種発現のために使用して、ＴＡＧ画分中のＡＲＡの生成および蓄積を容易にできる。より好ましい実施形態では、配列番号６７〜７０、８０、８３、８４、および９５〜９８で述べられるものと実質的に同一のアシルトランスフェラーゼをコードするコドン最適化遺伝子が利用された。
外来性遺伝子発現のための一般発現システム、カセット、ベクター、および形質転換
ＡＲＡの高レベル生成をもたらすものなどの外来性タンパク質の高レベル発現を指示する制御配列を含有する微生物発現システムおよび発現ベクターについては、当業者によく知られている。これらのいずれかを使用して、好ましいデサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびアシルトランスフェラーゼをコードするキメラ遺伝子を構築できる。次にこれらのキメラ遺伝子をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中に導入し、標準の形質転換法を使用して、コードした酵素の高レベル発現を提供できる。
宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはＤＮＡカセットは、技術分野でよく知られている。コンストラクト中に存在する配列の具体的選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質、および提案される形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する手段に左右される。しかし典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択マーカー、および自律複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域（例えばプロモーター）、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域（すなわちターミネーター）を含んでなる。双方の制御領域が、形質転換された宿主細胞の遺伝子に由来することが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも生産宿主として選択された特定種に天然の遺伝子に由来しなくてよいものと理解される。
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現する場合、各ベクターが異なる選択手段を有することが望ましく、他のコンストラクトに対する相同性を欠いて、安定した発現を維持し、コンストラクト中の要素の再集合を防止すべきである。調節領域、選択手段、および導入コンストラクト増殖方法の思慮深い選択は、全ての導入された遺伝子が必要なレベルで発現して、所望の生成物の合成を提供するように実験的に判定できる。
関心のある遺伝子を含んでなるコンストラクトは、あらゆる標準的技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６〜１８７頁（１９９１年）］）、プロトプラスト融合、微粒子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、または宿主細胞中に関心のある遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に適用できるより具体的な教示としては、米国特許第４，８８０，７４１号明細書、米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびチエン（Ｃｈｅｎ），Ｄ．Ｃ．ら著、「Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」４８（２）：２３２〜２３５頁（１９９７年）が挙げられる。
便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」または「組換え」とここで称する。形質転換された宿主は、遺伝子がゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数のコピー数を有する染色体外要素上に存在するかどうか次第で、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。形質転換宿主細胞は、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットおよび国際公開第２００５／００３３１０号パンフレットで述べられるようにして、様々な選択技術によって同定できる。
ここで使用するための好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンを欠く培地に生育する能力である。代案の実施形態では、５−フルオロオロト酸（５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物、「５−ＦＯＡ」）が、酵母Ｕｒａ−突然変異体の選択のために使用される。化合物はオロチジン５’−一リン酸デカルボキシラーゼ（ＯＭＰデカルボキシラーゼ）をコードする機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する酵母細胞に対して有毒である。したがってこの毒性に基づいて、５−ＦＯＡはＵｒａ−突然変異酵母株の選択および同定のために特に有用である（バーテル（Ｂａｒｔｅｌ），Ｐ．Ｌ．およびフィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ），Ｓ．著、「酵母２−ハイブリッド・システム（Ｙｅａｓｔ ２−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第７巻、１０９〜１４７頁、１９９７年）。
ここで利用された代案の好ましい選択方法は、スルホニル尿素抵抗性に基づく、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のための顕性の非抗生物質マーカーに依存する。技術はまた、半数体、二倍体、異数体または異種接合体であってもよい、その他の工業酵母株にも一般に適用できる。工業酵母株のための遺伝的形質転換システムの開発に対する次の２つの主要な制限を克服することが期待される。（１）天然の栄養要求株がほとんどなく、自然発生または誘導栄養要求性突然変異体の単離は株の倍数性によって妨げられる。（２）抗生物質抵抗性マーカーの使用は、抗生物質抵抗性遺伝子を持つ遺伝子改変生物の放出に対する制限のために、株の商業利用を制限するかもしれない。ピュイグ（Ｐｕｉｇ）らは、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．４６：１６８９〜１６９３頁（１９９８年）で、標的株をウリジン栄養要求株にするための遺伝子操作、および関心のある特質を導入するためのＵＲＡ３マーカーの引き続く使用に基づいて、これらの制限を克服する方法を開発したが、このストラテジーは日常的業務のためには面倒過ぎると見なされた。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を形質転換するためのここで開示される新しいスルホニル尿素抵抗性選択マーカーは、外来性遺伝子に依存しないが、突然変異天然遺伝子に依存する。したがってそれは栄養要求性を必要とせず、また栄養要求株ももたらさず野性型株の形質転換を可能にする。より具体的にはマーカー遺伝子（配列番号２８０）は、スルホニル尿素除草剤抵抗性を与える単一アミノ酸変化（Ｗ４９７Ｌ）を有する天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳまたはアセト乳酸シンターゼ；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）である。ＡＨＡＳは分枝鎖アミノ酸生合成経路中の最初の一般的な酵素であり、それはスルホニル尿素およびイミダゾリノン除草剤の標的である。サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ファルコ（Ｆａｌｃｏ），Ｓ．Ｃ．、ら著、Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：１８７〜１９４頁（１９８９年）；ダグルビー（Ｄｕｇｇｌｅｂｙ），Ｒ．Ｇ．、ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：２８９５頁（２００３年））の研究に基づくＷ４９７Ｌ突然変異は、知られている。最初の試験は、以下の結果として、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞が除草剤に自然に抵抗性でないことを判定した。１．）除草剤の取り込み不良または皆無、２．）ＡＨＡＳの形態の天然除草剤抵抗性の存在、および／または３．）除草剤不活性化機序の使用。これによって形質転換体選択手段としての突然変異ＡＨＡＳ遺伝子（配列番号２８０）の合成および使用が可能になった。
選択マーカーをリサイクルする追加的方法は、部位特異的リコンビナーゼシステムに依存する。簡単に述べると、部位特異的遺伝子組換えシステムは、以下の２つの要素からなる。（１）特徴的なＤＮＡ配列［例えばＬｏｘＰ］を有する遺伝子組換え部位、および（２）２つの以上の遺伝子組換え部位が、同一ＤＮＡ分子上に特定間隔で同一方向に配向する場合、特異的にＤＮＡ配列に結合して、ＤＮＡ配列間の遺伝子組換え（すなわち切除）を触媒するリコンビナーゼ酵素［例えばＣｒｅ］。複数の逐次形質転換中での使用のために好ましい一組の選択マーカーを「リサイクル」することが可能なので、この方法には選択手段としての用途がある。
さらに具体的には、宿主ゲノム中への挿入が望ましい標的遺伝子（例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ、アシルトランスフェラーゼ）、ならびに遺伝子組換え部位の側面に位置する第１の選択マーカー（例えばＵｒａ３、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ［ＨＰＴ］）を含んでなる組み込みコンストラクトを作り出す。形質転換および形質転換体の選択に続いて、第２の選択マーカー（例えばスルホニル尿素抵抗性［ＡＨＡＳ］）を保有する複製型プラスミド、およびゲノム中に導入された部位特異的遺伝子組換え部位を認識するのに適したリコンビナーゼの導入によって、第１の選択マーカーが染色体から切除される。第２のマーカーを保有する形質転換体の選択および宿主ゲノムからの第１の選択マーカーの切除の確認に続いて、次に複製型プラスミドを選択不在下で宿主からキュアリングした。これによって第１のまたは第２の選択マーカーのどちらも有さない形質転換体が生成し、したがって形質転換の別の一巡のためのキュアリング株が入手できる。当業者は、この方法が上記の特定の選択マーカーまたは部位特異的遺伝子組換えシステムに限定されないことを認識する。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における外来性遺伝子の過剰発現
当業者にはよく知られているように、遺伝子（例えばデサチュラーゼ）をクローニングベクターに単に挿入するだけでは、それが必要なレベルで成功裏に発現することは保証されない。転写、翻訳、タンパク質安定性、酸素制限、および宿主細胞からの分泌の側面を制御するいくつかの遺伝子要素を操作することが望ましいかもしれない。より具体的には以下を変化させることで、遺伝子発現を制御してもよい。関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、クローンされた遺伝子のコピー数、および遺伝子がプラスミド上にあるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか、合成された外来タンパク質の最終細胞内位置、宿主生物中の翻訳効率、宿主細胞内のクローン遺伝子タンパク質の本質的な安定性、および頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度に近づくようなクローン遺伝子内のコドン使用。これらのいくつかの過剰発現方法について下で考察し、それらはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において、例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびアシルトランスフェラーゼを過剰発現する手段として、本発明中で有用である。
所望の遺伝子の発現は、ｍＲＮＡまたはコードされたタンパク質のどちらかから不安定配列を除去／消去して、またはｍＲＮＡに安定化配列を付加して（米国特許第４，９１０，１４１号明細書）、より強力なプロモーター（調節または構成のどちらか）の使用を通じて発現増大を引き起こし、転写レベルで増大できる。
所望の宿主細胞中で、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を推進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者にはなじみが深い。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でこれらの遺伝子の発現を導くことができる、実質的にあらゆるプロモーターが本発明に適する。宿主細胞中での発現は、一時的または安定様式で達成できる。一時的発現は、関心のある遺伝子に作動可能に連結された、調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成でき、代案としては安定発現が、関心のある遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターの使用によって達成できる。一例として宿主細胞が酵母菌の場合、酵母菌細胞中で機能する転写および翻訳領域は、特に宿主種から提供される。転写開始調節領域は、例えば次から得ることができる。１．）アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸−デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ、ホスホグルコース−イソメラーゼ、ホスホグリセラートキナーゼ、グリセロール−３−リン酸−Ｏ−アシルトランスフェラーゼなどの解糖経路中の遺伝子、または２．）酸ホスファターゼ、ラクターゼ、メタロチオネイン、グルコアミラーゼ、翻訳延長因子ＥＦ１−α（ＴＥＦ）タンパク質（米国特許第６，２６５，１８５号明細書）、リボソームタンパク質Ｓ７（米国特許第６，２６５，１８５号明細書）、アンモニウム輸送体タンパク質、輸出タンパク質などの調節可能遺伝子。構成的または誘導的転写が所望されるかどうか、関心のあるＯＲＦを発現する上でのプロモーター効率、構築の容易さなど次第で、いくつかの制御配列のいずれか１つを使用できる。上に提供した例は、ここでの本発明における制限を意図しない。
当業者は承知しているように、様々なプロモーターの活性を比較する多様な方法が利用できる。このタイプの比較は、ω−６およびω−３脂肪酸生成に有用なキメラ遺伝子を構築するのに一揃いのプロモーターが必要である、将来の応用で使用するための各プロモーターの強度決定を容易にするのに有用である。したがってレポーター遺伝子（すなわちβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）遺伝子）の発現に基づいて、プロモーター活性を間接に定量化することが有用かもしれない。代案の実施形態では、より定量的な手段を使用してプロモーター活性を定量化することが有用な場合もある。適切な一方法は、リアルタイムＰＣＲの使用である（リアルタイムＰＣＲ応用の一般レビューについては、ギンジンガー（Ｇｉｎｚｉｎｇｅｒ），Ｄ．Ｊ．著、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、３０：５０３〜５１２頁（２００２年）を参照されたい）。リアルタイムＰＣＲは、蛍光性レポーターの検出および定量化に基づく。このシグナルは、反応中のＰＣＲ生成物量と正比例して増大する。各サイクルにおいて蛍光放出量を記録することで、対数期中にＰＣＲ反応をモニターすることが可能であり、そこではＰＣＲ生成物量の最初の顕著な増大が標的テンプレートの初期量に相関する。単位複製配列の定量的な検出のために、（１）蛍光性プローブの使用、または（２）ＤＮＡ結合作用物質（例えばＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ Ｉ、臭化エチジウム）の使用の２つの一般方法がある。相対遺伝子発現比較のために内部標準として内在性対照（例えば染色体性にコードされる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）を使用することが必要であり、それによって各リアルタイムＰＣＲ反応に添加された全ＤＮＡ量の差について正規化できるようになる。リアルタイムＰＣＲの具体的方法については、技術分野でたくさん書かれている。例えば「リアルタイムＰＣＲ特別号（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｉｓｓｕｅ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５（４）：３８３〜４８１頁（２００１年）を参照されたい。
リアルタイムＰＣＲ反応に続いて、以下の使用によって、記録された蛍光強度を使用してテンプレートの量を定量化する。１．）絶対標準法（生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）翻訳ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）などの既知量の標準が使用される）、２．）相対標準法（各ランにおいて既知量の標的核酸がアッセイデザインに含まれる）、または３．）遺伝子発現の相対定量化のための比較ＣＴ法（ΔΔＣＴ）（標的配列の相対量が選択された基準値のいずれかと比べられ、基準値と比較して結果が得られる）。比較ＣＴ法は、最初に標的のＣＴ値と正規化群の間の差（ΔＣＴ）を判定することを要し、ΔＣＴ＝ＣＴ（標的）−ＣＴ（正規化群）である。この値を定量化する各サンプルについて計算し、それに対して各比較がなされる基準として、１個のサンプルを選択しなくてはならない。比較ΔΔＣＴ計算は、各サンプルΔＣＴとベースラインΔＣＴの間の差を見いだし、次にこれらの値を式２−ΔΔＣＴに従って絶対値に変換することを伴う。
しかしヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現に適することができるプロモーターの幅広い選択にもかかわらず、本発明の好ましい実施形態では、プロモーターは下の表９に示すもの（またはその誘導体）から選択される。
Figure 0005139806
ＧＰＭの活性がＴＥＦとほぼ同じであるのに対し、ＧＰＤ、ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡＩＮｍ、ＧＰＤＩＮ、ＧＰＡＴ、ＹＡＴ１、およびＥＸＰ１の活性は、全てＴＥＦを超える（活性は「活性順位」と題された欄で相対様式で定量化され、「１」は最低活性のプロモーターに対応するのに対し、「７」は最高活性のプロモーターに対応する）。この定量化は、レポーターとしてのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）遺伝子（ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ），Ｒ．Ａ．著、Ｎａｔｕｒｅ．１４；３４２：８３７〜８３８頁（１９８９年））、およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｘｐｒ遺伝子の約１００ｂｐの３’領域を有するキメラ遺伝子を作り出すために各プロモーターが使用される、比較研究に基づく。各発現コンストラクト中のＧＵＳ活性は、組織化学的および／または蛍光定量的アッセイ（ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ），Ｒ．Ａ．著、「Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ」５：３８７〜４０５頁（１９８７年））によって、および／またはリアルタイムＰＣＲの使用によって測定された。
ＹＡＴ１プロモーターは、本出願人らによって、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内で同定された、油性条件（すなわち窒素制限）下で誘導可能な第１のプロモーターとして特徴づけられた、という点においてユニークである。具体的には、ＹＡＴ１プロモーターは窒素含有（例えば約０．５％までの硫酸アンモニウム）培地中で活性であるが、宿主細胞を窒素制限条件（例えば非常に低レベルのアンモニウムを含有する、またはアンモニウムを欠く培地中）下で生育させると、プロモーター活性が増大する。したがって好ましい培地は、約０．１％未満の硫酸アンモニウムまたはその他の適切なアンモニウム塩を含有するものである。より好ましい実施形態では、約８〜１２％のグルコースおよび約０．１％以下の硫酸アンモニウムを含有する高グルコース培地（ＨＧＭ）などの高い炭素対窒素（すなわちＣ：Ｎ）比の培地中で宿主細胞を生育させると、ＹＡＴ１プロモーターが誘導される。これらの条件はまた、油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中で油脂生成を誘導するのにも十分である。細胞抽出物のＧＵＳ活性に基づいて、ＹＡＴ１プロモーター活性は、細胞を最小培地からＨＧＭに移して２４時間生育させると約３７倍増大し、ＨＧＭ中で１２０時間後には活性はいくらか低下するが、なおも窒素を含んでなる最小培地中での活性よりも２５倍高い（実施例１）。
もちろん本発明の代案の実施形態では、表９で上述したプロモーター領域のいずれかに由来するその他のプロモーターもまた、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での異種発現のために使用して、ＴＡＧ画分中のＡＲＡの生成および蓄積を容易できる。特に上述のプロモーターのいずれかの長さの修正は、これらの制御配列の正確な境界が完全に画定されていないので、同一活性を有する突然変異プロモーターをもたらすことができる。代案の実施形態では、ＦＢＡＩＮおよびＧＰＤＩＮプロモーターのイントロン内に位置するエンハンサーを使用して、天然ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）プロモーターと比べて活性増大を有するキメラプロモーターを作り出すことができる（例えばキメラＧＰＭ：：ＦＢＡＩＮおよびＧＰＭ：：ＧＰＤＩＮプロモーター（配列番号１６７および１６８）は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｘｐｒ遺伝子の約１００ｂｐの３’領域によってＧＵＳレポーター遺伝子発現を推進すると、ＧＰＭプロモーター単独と比べて活性が増大した）。
終結領域は、それから開始領域が得られた遺伝子の３’領域から、または異なる遺伝子から誘導されることができる。多数の終結領域が知られており、（それらが由来するのと同一および異なる属および種の双方で使用した際に）多様な宿主において満足に機能する。終結領域は、通常特定の特性のためと言うよりも便宜的に選択される。好ましくは終結領域は、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）である酵母菌遺伝子から誘導される。γ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする哺乳類の遺伝子の３’領域もまた、酵母菌中で機能することが知られている。終結制御領域もまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子から誘導されてもよい。場合により終結部位は不必要かもしれないが、含まれることが最も好ましい。制限は意図しないが、ここでの開示で有用な終結領域としては以下が挙げられる。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞外プロテアーゼ（ＸＰＲ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１７７４１）の約１００ｂｐの３’領域；アシル−ｃｏＡオキシダーゼ（Ａｃｏ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１およびＮｏ．ＣＡＡ０４６６１；Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０３２４４）ターミネーター；Ｐｅｘ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）ターミネーター；Ｐｅｘ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７５４３３）ターミネーター；Ｌｉｐ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）ターミネーター；Ｌｉｐ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）ターミネーター；および３−オキソアシル−ｃｏＡチオラーゼ（ＯＣＴ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６９９８８）ターミネーター。
上述のデサチュラーゼ、エロンガーゼおよび／またはアシルトランスフェラーゼ遺伝子の追加的コピー（すなわち１個のコピーを超える）をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中に導入して、それによってＡＲＡ生成および蓄積を増大させてもよい。具体的には遺伝子の追加的コピーを、単一発現コンストラクト内でクローンしてもよく、および／またはプラスミドコピー数を増大させることで、またはクローンされた遺伝子のゲノム中への複数組込みによって（下記）、クローンされた遺伝子の追加的コピーを宿主細胞中に導入してもよい。例えば一実施形態では、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノム中に、５コピーのΔ９エロンガーゼ、３コピーのΔ８デサチュラーゼ、４コピーのΔ５デサチュラーゼ、１コピーのΔ１２デサチュラーゼ、および１コピーのＣ１６／１８エロンガーゼを含んでなるキメラ遺伝子を導入し組み込んで、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株（すなわちＹ２２１４株）を遺伝子操作して、１４％を超えるＡＲＡを生成した。同様に代案の実施形態では、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７株を遺伝子操作して、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノム中に、１コピーのΔ６デサチュラーゼ、２コピーのＣ１８／２０エロンガーゼ、３コピーのΔ５デサチュラーゼ、および１コピーのΔ１２デサチュラーゼを含んでなるキメラ遺伝子を導入し組み込んで、１１％を超えるＡＲＡを生成した。
一般に、油性酵母中での発現に適したＤＮＡ（例えばプロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターを含んでなるキメラ遺伝子）がひとたび得られると、それを宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れ、または宿主細胞ゲノム中に直接組み込む。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座との遺伝子組換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。本発明では依存しないが、内在性遺伝子座によって転写および翻訳調節領域の全てまたはいくつかを提供でき、コンストラクトは内在性遺伝子座を標的とする。
本発明では、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で遺伝子を発現する好ましい方法は、宿主ゲノム中への直鎖ＤＮＡ組み込みによるものである。そしてゲノム内の複数位置への組み込みは、遺伝子の高レベル発現が所望される場合に特に有用であることができる。このような目的で、複数コピー中に存在するゲノム内の配列を同定することが望ましい。
シュミット−ベルガー（Ｓｃｈｍｉｄ−Ｂｅｒｇｅｒ）らは、「Ｊ．Ｂａｃｔ．，
１７６（９）：２４７７〜２４８２頁（１９９４年）で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中に第１のレトロトランスポゾン様要素Ｙｌｔ１を発見した。このレトロトランスポゾンは、ゼータ領域と称される長い末端反復（ＬＴＲ、それぞれ長さおよそ７００ｂｐ）の存在によって特徴づけられる。Ｙｌｔ１および単独ゼータ要素は、それぞれ少なくとも３５コピー／ゲノムおよび５０〜６０コピー／ゲノムで、ゲノム内に分散様式で存在し、どちらの要素も相同的組換え部位として機能すると判定された。さらにユーレットツェック（Ｊｕｒｅｔｚｅｋ）らは、「Ｙｅａｓｔ」、１８：９７〜１１３頁（２００１年）の研究で、（両端にＬＴＲゼータ領域がある直鎖ＤＮＡを使用して）酵母ゲノムの反復領域をプラスミドの標的にすることで、低コピープラスミド形質転換体を使用して得られた発現と比べて、遺伝子発現が劇的に増大できることを実証した。したがってゼータ誘導組み込みは、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）へのプラスミドＤＮＡの複数組み込みを確実にする手段として理想的であることができ、それによって高レベル遺伝子発現を可能にする。しかし残念なことに、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の全株がゼータ領域を有するわけではない（例えばＡＴＣＣ＃２０３６２として同定された株）。株がこのような領域を欠く場合、発現カセットを含んでなるプラスミドＤＮＡを代案の遺伝子座に組み込んで、発現カセットの所望コピー数に達するようにすることもまた可能である。例えば好ましい代案の遺伝子座としては、Ｌｙｓ５遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９）、Ｕｒａ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１）、Ｌｅｕ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６０２３０）、Ｌｙｓ５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９）、Ａｃｏ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）、Ｐｏｘ３遺伝子遺伝子座（Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０３２４４；またはＡｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子遺伝子座（配列番号２３）、Ｌｉｐ１遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）および／またはＬｉｐ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）が挙げられる。
有利なことにＵｒａ３遺伝子は、５−ＦＯＡ選択（前出）と組み合わせて繰り返し使用できる。より具体的には最初に天然Ｕｒａ３遺伝子をノックアウトして、Ｕｒａ−表現型を有する株を生成でき、そこで選択は５−ＦＯＡ抵抗性に基づいて生じる。次に複数のキメラ遺伝子クラスターおよび新しいＵｒａ３遺伝子をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムの異なる遺伝子座に組み込み、それによってＵｒａ＋表現型を有する新しい株を生成することができる。引き続く組み込みは、導入されたＵｒａ３遺伝子がノックアウトされると、新しいＵｒａ３−株（これも５−ＦＯＡ選択使用して同定された）を生成する。したがってＵｒａ３遺伝子（と組み合わさった５−ＦＯＡ選択）は形質転換の複数サイクル中で選択マーカーとして使用でき、それによって容易に、遺伝的修正がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムに容易な様式で組み込めるようにする。
用途によっては、本タンパク質を異なる細胞区画に向けることが有用であろう（例えばアシル−ＣｏＡプール対ホスファチジルコリンプール）。ここで述べられる目的のためには、ＡＲＡが遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で見いだされてもよい。ＡＲＡ生合成を可能にするポリペプチドをコードする上述のキメラ遺伝子をさらに遺伝子操作して、適切な細胞内標的配列を含めてもよいことが構想された。
ユーレットツェック（Ｊｕｒｅｔｚｅｋ）らは、「Ｙｅａｓｔ」、１８：９７〜１１３頁（２００１年）で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中に組み込んだプラスミドコピー数の安定性が、使用される個々の形質転換体、受容株、および標的プラットフォームに依存することに気づいた。したがって当業者は、所望の発現レベルおよびパターンを示す株を得るために複数の形質転換体をスクリーンしなくてはならないことを認識する。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３頁（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロツェック（Ｋｒｏｃｚｅｋ）著、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１〜２）：１３３〜１４５頁（１９９３年））、タンパク質発現のウェスタン分析、ＰＵＦＡ生成物の表現型分析またはＧＣ分析によって達成されてもよい。
要約すると、上述の各手段が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における特定遺伝子産物（例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ、アシルトランスフェラーゼ）の発現を増大させるのに有用であり、バイオテクノロジーの当業者は、方法の最も適切な組み合わせを容易に選択してＡＲＡの高生産を可能にできる。
ＡＲＡ生成増大のための経路エンジニアリング
上述の方法は個々の異種遺伝子の発現をアップレギュレートするのに有用であるが、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でＡＲＡ生成を増大させるというチャレンジは、はるかにより複雑であり、様々な代謝経路の協調操作を必要とするかもしれない。ＰＵＦＡ生合成経路中の操作について最初に対処し、それにＴＡＧ生合成経路およびＴＡＧ分解経路中の望ましい操作が続く。
以前述べられたように、総油画分の５％を超えるＡＲＡ、またはより好ましくは総油画分の１０％を超えるＡＲＡ、またはさらにより好ましくは総油画分の１５〜２０％を超えるＡＲＡ、または最も好ましくは総油画分の２５〜３０％を超えるＡＲＡを生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の構築は、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路発現のために、少なくともΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびΔ５デサチュラーゼの遺伝子を要し、またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路発現のために、少なくともΔ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、およびΔ５デサチュラーゼの遺伝子を要する。しかしどちらの実施形態でも、宿主株中にΔ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼおよび／またはＣ１６／１８エロンガーゼをさらに含むことが望ましいかもしれない。
フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼは％基質変換の増大を示すので（国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレット）、場合によっては天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼをそれで置換することが有利であると立証されるかもしれない。より具体的には、どちらのΔ１２デサチュラーゼもオレイン酸からＬＡへの変換を触媒するが、２つの酵素はそれらの全体的特異性が異なる（それによって各酵素の％基質変換に影響を与える）。本出願人らはＦ．モニリフォルメ（ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼが、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼよりも高いＬＡ負荷能力をホスファチジルコリン基質のｓｎ−２位に有すると判定した（それによってΔ６デサチュラーゼによる引き続く反応が容易になる）。これに基づいて、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼのノックアウトと併せたＦ．モニリフォルメ（ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼの過剰発現は、引き続くＡＲＡへの変換に生成物増大をもたらすかもしれない。
いくつかの実施形態では、宿主生物の天然ＤＡＧ ＡＴ活性を調節し、それによってＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主の脂肪および油内のＰＵＦＡのパーセントの操作を可能にすることが有用かもしれない。具体的には油生合成は、油生成中にポリ不飽和化と競合することが予期されるので、生物体の１個もしくは以上のアシルトランスフェラーゼ（例えばＰＤＡＴおよび／またはＤＧＡＴ１および／またはＤＧＡＴ２）の活性を低下させまたは不活性化し、それによって脂肪および油画分に組み込まれる（全脂肪酸に対する）ＰＵＦＡのパーセントを同時に増大させながら、油生合成の全体的速度を低下させることが可能である。これはポリ不飽和化がより効率的に起きるようになる、または換言すれば、特異的ＤＡＧ ＡＴの活性をダウンレギュレートすることにより、油生合成とポリ不飽和化間の基質競合が減少して、油生成中のポリ不飽和化に有利になるためである。
当業者は、ダウンレギュレーションの最適レベルを解明するのに必要な技能、およびこのような阻害を達成するのに必要な手段を有する。例えばいくつかの好ましい実施形態では、単一ＤＡＧ ＡＴの活性を操作することが望ましいかもしれない（例えばＤＧＡＴ１ノックアウトを作り出す一方、ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２の活性は改変されない）。代案の実施形態では、全部で「ｎ」個の天然ＤＡＧ ＡＴおよび全部で「ｎ−１」個のアシルトランスフェラーゼ活性を含んでなる油性生物が変性され、低下した油生合成速度がもたらされる一方、残るアシルトランスフェラーゼはその野生型活性を保持する。そして、場合によっては、いくつかの好ましい油性生物中で天然ＤＡＧ ＡＴ全部の活性を操作して、ポリ不飽和化速度に対する油生合成の最適速度を達成することが望ましいかもしれない。
同様に出願人らは、対応する天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）アシルトランスフェラーゼのノックアウトと併せた異種アシルトランスフェラーゼの発現が、宿主細胞中で生成する全体的ＡＲＡを顕著に増大できると仮定した。具体的にはＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で自然に生成されるＰＵＦＡは１８：２脂肪酸に限定され、天然酵素はより長い鎖脂肪酸との反応を効率的に触媒しないかもしれないので、先に提案されたように、Ｃ２０以上の脂肪酸に対して特異性を有する異種のＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、ＰＤＡＴ、およびＬＰＣＡＴアシルトランスフェラーゼが、天然酵素よりも好ましくあり得る。この結論に基づいて、出願人らはＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）中でＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＤＧＡＴ１、およびＤＧＡＴ２をコードする遺伝子を同定し、ＥＰＡを生成する遺伝子操作されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主中でこれらの遺伝子を発現させて、増大するＰＵＦＡ生合成を得た（ここでの実施例１４〜１７）。引き続いて天然および異種アシルトランスフェラーゼ間の基質競合を低下させる手段として、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のいくつかの天然アシルトランスフェラーゼ（例えばＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２）の活性を減少させ、またはノックアウトした。ＡＲＡを生成する遺伝子操作されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主中でも、同様の結果が期待される。
ＡＲＡ生成に影響する経路および包括的制御因子の操作もまた、考慮しなくてはならない。例えばパルミチン酸（１６：０）およびステアリン酸（１８：０）などのより長鎖の飽和および不飽和脂肪酸の前駆物質の利用可能性を増大させることで、ＰＵＦＡ生合成経路中への炭素の流れを増大させることが有用である。前者の合成がＣ１４／１６エロンガーゼ活性に依存する一方、後者の合成はＣ１６／１８エロンガーゼ活性に依存する。したがって天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｃ１４／１６エロンガーゼ（配列番号６４および６５）の過剰発現は、実質的に１６：０および１６：１脂肪酸（対照株に比べて２２％増大）の生成を増大させ、同様に天然Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｃ１６／１８エロンガーゼ（配列番号６１および６２）の過剰発現は、実質的に１８：０、１８：１、１８：２、および１８：３脂肪酸（対照株に比べて１８％増大）の生成を増大させ、Ｃ１６脂肪酸の蓄積を低下させた（対照株に比べて２２％減少）。もちろんここで実証されるように、そしてイナガキ（Ｉｎａｇａｋｉ），Ｋ．らによる研究「バイオサイエンス，バイオケテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」６６（３）：６１３〜６２１頁（２００２年）提案されるように、本発明のいくつかの実施形態では、例えばドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）からの［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０７１９８６、本明細書での配列番号５０および５１］および／またはＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）からの［配列番号５３および５４］異種Ｃ１６／１８エロンガーゼを同時発現することが有用かもしれない。したがってＡＲＡ生合成のためにＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主株は、最低限、操作されてΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびΔ５デサチュラーゼ、またはΔ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、およびΔ５デサチュラーゼを発現しなくてはならないが、さらに好ましい実施形態では、宿主株は、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼおよび／またはａＣ１６／１８エロンガーゼの少なくとも１つをさらに含む。
別の好ましい実施形態では、本発明のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で脂肪酸分解およびＴＡＧ分解に影響する経路が変性され、アシル−ＣｏＡプールまたはＴＡＧ画分のどちらかの細胞中に蓄積するＡＲＡの分解が最小化されうる。これらの経路は、それぞれアシル−ＣｏＡオキシダーゼおよびリパーゼ遺伝子によって代表される。より具体的にはアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＥＣ１．３．３．６）はペルオキシソームβ−酸化反応を触媒し、分解の各サイクルはアセチル−ＣｏＡ分子と、脂肪酸基質よりも炭素原子２個分短い脂肪酸とを生じる。それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１２９９〜ＡＪ００１３０３（対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０４７０３、ＸＰ＿５０５２６４、ＸＰ＿５０３２４４、ＸＰ＿５０４４７５、およびＸＰ＿５０２１９９も参照されたい）に対応する、ＰＯＸ１、ＰＯＸ２、ＰＯＸ３、ＰＯＸ４、およびＰＯＸ５遺伝子（Ａｃｏ１、Ａｃｏ２、Ａｃｏ３、Ａｃｏ４、およびＡｃｏ５遺伝子としても知られている）によってコードされる５種のアシル−ＣｏＡオキシダーゼイソ酵素が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中に存在する。各イソ酵素は異なる基質特異性を有し、例えばＰＯＸ３遺伝子が短鎖脂肪酸に対して活性のアシル−ＣｏＡオキシダーゼをコードするのに対し、ＰＯＸ２遺伝子はより長鎖の脂肪酸に対して活性のアシル−ＣｏＡオキシダーゼをコードする（ワング（Ｗａｎｇ），Ｈ．Ｊ．ら著、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」、１８１：５１４０〜５１４８頁（１９９９年））。これらの遺伝子のいずれか１つの活性を低下させまたは除去することによって、ここでの目的に有利たり得る様式で、本発明の宿主細胞中のペルオキシソームβ−酸化を修正できることが考察される。最後にいかなる混乱も避けるために、本出願人らは上述のようなアシル−ＣｏＡオキシダーゼをＰＯＸ遺伝子として言及するが、この用語は、いくつかの公的に入手できる文献に従ったＡｃｏ遺伝子命名法と同義的に使用できる。
同様に、細胞内、膜結合、および細胞外酵素をはじめとするいくつかのリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）が、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で検出されている（ショピナ（Ｃｈｏｕｐｉｎａ），Ａ．ら著、「Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．」３５：２９７頁（１９９９年）；ピニェダ（Ｐｉｇｎｅｄｅ），Ｇ．ら著、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」１８２：２８０２〜２８１０頁（２０００年））。例えばＬｉｐ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）およびＬｉｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２４９７５１）は細胞内または膜結合であり、一方Ｌｉｐ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）は細胞外リパーゼをコードする。酵素は、ＴＡＧおよび水がＤＡＧおよび脂肪酸アニオンに直接分解される反応を触媒するので、これらの各リパーゼは中断の標的である。
さらに代案の実施形態では、好ましいヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主株中で、いくつかのホスホリパーゼの活性を操作できる。ホスホリパーゼは、膜脂質の生合成および分解において重要な役割を果たす。より具体的には「ホスホリパーゼ」という用語は、グリセロリン脂質中の１個もしくはそれ以上のエステル結合を加水分解する能力を共有する異種性酵素群を指す。全てのホスホリパーゼは基質としてリン脂質を標的とするが、各酵素は特定のエステル結合を切断する能力を有する。したがってホスホリパーゼ命名法は個々のホスホリパーゼを区別して、リン脂質分子中の特定の結合標的を示唆する。例えばホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）がグリセロール部分のｓｎ−１位で脂肪酸アシルエステル結合を加水分解するのに対し、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）はこの分子のｓｎ−２位で脂肪酸を除去する。ＰＬＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）およびＰＬＡ２（ＥＣ３．１．１．４）の作用は、それぞれ遊離脂肪酸および２−アシルリゾリン脂質または１−アシルリゾリン脂質の蓄積をもたらす。ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）（ＥＣ３．１．４．３）は、リン脂質主鎖中のリン酸ジエステル結合を加水分解して、１，２−ＤＡＧ、そして関与する特異的リン脂質種次第でホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンなどを生じる（例えばＰＬＣ１は以下の反応に関与する：１−ホスファチジル−１Ｄ−ミオ−イノシトール４，５−ビスリン酸＋Ｈ２Ｏ＝１Ｄ−ミオ−イノシトール１，４，５−トリスリン酸＋ＤＡＧ；ＩＳＣ１はイノシトールスフィンゴリン脂質−特異的ホスホリパーゼＣをコードする［サワイ（Ｓａｗａｉ），Ｈ．ら著、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７５：３９７９３〜３９７９８頁（２０００年）］）。第２のリン酸ジエステル結合はホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）（ＥＣ３．１．４．４）によって切断され、ここでも関与するリン脂質のクラス次第でホスファチジン酸およびコリンまたはエタノールアミンを生じる。ホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）は、ｓｎ−１およびｓｎ−２脂肪酸の双方を除去する能力を有し、（脂肪酸を放出するために酵素がリン脂質［ＰＬＢ活性］およびリゾリン脂質［リゾホスホリパーゼ活性］の双方から脂肪酸を切断する）、およびリゾホスホリパーゼ−アシルトランスフェラーゼ活性（遊離脂肪酸をリゾリン脂質に転移することによって酵素がリン脂質を生成できる）の双方のヒドロラーゼを有することでユニークである。形質転換ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主細胞の総油画分中に蓄積するＡＲＡの濃度を増大させるために、これらのホスホリパーゼの１個もしくはそれ以上を過剰発現することが有用かもしれない。この結果は、ホスホリパーゼがトリグリセリドの延長またはその中への組み込みのどちらかのために、アシル基をＰＣからＣｏＡプールへ放出するので観察されるであろうと仮定される。
別の代案の実施形態では、全体的ＥＰＡ生合成を増大させる手段として、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の好ましい宿主株において、ホスファチジルコリン（ＰＣ）生合成に関与するＣＤＰ−コリン経路中の酵素もまた操作できる。この技術の有用性は、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．８．２）をコードするＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＣＰＴ１遺伝子の過剰発現によって、実証され、それによって遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株においてＡＲＡ生合成増大がもたらされた。当業者はＰＣ生合成経路についてよく知っており、その他の適切な候補酵素を認識する。
上述のものなどの生化学的経路を操作する方法については当業者によく知られているが、天然遺伝子の活性を低下させるまたは排除するためのいくつかの技術の概説を下で簡単に提示する。これらの技術は上述したように、天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、ＰＤＡＴ、ＬＰＣＡＴ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ２（Ａｃｏ２またはＰｏｘ２）、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ３（Ａｃｏ３またはＰｏｘ３）および／またはリパーゼ遺伝子の活性をダウンレギュレートするのに有用であろう。
当業者は天然遺伝子活性を低下させまたは排除するために利用するのに最も適した技術を見極める知識を身に付けたているが、一般に、特定遺伝子の内在性活性は、例えば以下によって低下または除去できる。１．）標的遺伝子の全部または一部の挿入、置換および／または欠失を通じて遺伝子を中断する。２．）遺伝子の転写生成物にアンチセンス配列の転写のためのカセットを提供する。３．）天然に［または突然変異されて］特定遺伝子の活性がわずかまたは皆無である宿主細胞を使用する。４．）変異誘発したヘテロサブユニットを過剰発現することで（すなわち２つの以上ヘテロサブユニットを含んでなる酵素中で）、「優性阻害の」の結果として酵素活性を低下させる。５．）ｉＲＮＡ技術を使用する。場合によっては望まれない遺伝子経路の阻害はまた、特異的阻害物質（例えば米国特許第４，７７８，６３０号明細書で述べられるものなどのデサチュラーゼ阻害物質）の使用を通じて達成できる。
遺伝子中断では、そのコード配列を妨害し、それによって遺伝子を機能的に不活性化するために、中断させたい構造遺伝子中に外来ＤＮＡ断片（典型的に選択可能マーカー遺伝子、しかし場合により発現時に望ましい表現型を与えるキメラ遺伝子またはキメラ遺伝子クラスター）を挿入して中断させる。中断カセットの宿主細胞中への形質転換は、相同的組換えによって、機能性天然遺伝子の非機能性中断遺伝子による置換をもたらす（例えばハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら著、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」１７１：４６１７〜４６２２頁（１９８９年）；バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら著、「Ｇｅｎｅｓ」、１３６：２１１〜２１３頁（１９９３年）；ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら著、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．」２４：２５１９〜２５２４頁（１９９６年）；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら著、「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」５：２７０〜２７７頁（１９９６年）参照）。
アンチセンス技術は、標的遺伝子配列が既知の場合に遺伝子をダウンレギュレートする別の方法である。これを達成するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントをクローンして、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにプロモーターに作動可能に連結する。次にこのコンストラクトを宿主細胞に導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を生成する。アンチセンスＲＮＡは、関心のあるタンパク質をエンコードするｍＲＮＡの蓄積を防止することで、遺伝子発現を阻害する。当業者は特定遺伝子の発現を低下させるために、アンチセンス技術の使用に特別な考慮が伴うことを理解する。例えばアンチセンス遺伝子の適切な発現レベルは、当業者には既知の異なる調節因子を使用した、異なるキメラ遺伝子の使用を必要とするかもしれない。
配列が既知の場合、標的を定めた遺伝子中断およびアンチセンス技術が遺伝子をダウンレギュレートする効果的手段を提供するが、配列ベースではないその他のより特異性が低い方法が開発されている（例えばＵＶ放射線／化学物質による変異誘発または転位因子／トランスポゾンの使用、国際公開第０４／１０１７５７号パンフレットを参照されたい）。
代案の実施形態では、特定遺伝子の内在性活性はタンパク質発現を調節する制御配列を操作することで低下できる。技術分野でよく知られているように、コード配列に関連づけられた制御配列としては、コード配列上流（５’非コード配列）、中、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響する、転写および翻訳「調節」ヌクレオチド配列が挙げられる。したがって特定遺伝子の制御配列の操作とは、遺伝子のプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、開始制御領域、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造の操作を指してもよい。したがって例えばＤＡＧ ＡＴの発現をダウンレギュレートするために、ＤＡＧ ＡＴのプロモーターを消去または中断し、それによって脂質および油生合成速度を低下できる。代案としては、ＤＡＧ ＡＴの発現を駆動する天然プロモーターを、天然プロモーターと比べて低下したプロモーター活性を有する異種のプロモーターで置換できる。制御配列を操作するのに有用な方法については、当業者によく知られている。
要約すると本明細書で提供される教示を使用して、形質転換油性微生物宿主は微生物宿主の全脂質の少なくとも約５％のＡＲＡ、好ましくは全脂質の少なくとも約１０％のＡＲＡ、より好ましくは全脂質の少なくとも約１５％のＡＲＡ、より好ましくは全脂質の少なくとも約２０％のＡＲＡ、そして最も好ましくは全脂質の少なくとも約２５〜３０％のＡＲＡを生成するであろう。
ＡＲＡ合成のための発酵プロセス
形質転換された微生物宿主細胞は、キメラ遺伝子の発現（例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ、アシルトランスフェラーゼなどをコードする）を最適化する条件下で生育させて、最大かつ最も経済的なＡＲＡ収率を生じさせる。一般に最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間が挙げられる。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、一般に複合培地（例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ））で、または生育に必要な構成要素が欠如することで所望の発現カセットの選択を強要する合成最少培地（例えばミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの酵母菌窒素ベース）上で生育させる。
本発明における発酵培地は、適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源としては、単糖類（例えばグルコース、フルクトース）、二糖類（例えばラクトース、スクロース）、少糖類、多糖類（例えばデンプン、セルロースまたはそれらの混合物）、糖アルコール（例えばグリセロール）または再生可能原材料からの混合物（例えば乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜モラセス、大麦の麦芽）が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに炭素源としては、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、および植物油（例えばダイズ油）および動物脂肪をはじめとする脂肪酸の様々な商業的供給源が挙げられる。さらに炭素源としては、重要な生化学的中間体への代謝変換が実証されている一炭素源（例えば二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルメート、および炭素含有アミン）が挙げられる。したがって本発明で使用される炭素源は、多種多様な炭素含有源を包含することが考察される。上述の全ての炭素源およびそれらの混合物が本発明で適切であることが期待されるが、好ましい炭素源は糖および／または脂肪酸である。最も好ましいのは、１０〜２２個の炭素を含有するグルコースおよび／または脂肪酸である。
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸）源から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および油性酵母の生育と、ＡＲＡ生成に必須の酵素的経路の促進とに適した、当業者に既知であるその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えばＭｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）が注目されている（Ｄ．Ｊ．カイル（Ｋｙｌｅ）およびＲ．コリン（Ｃｏｌｉｎ）編、「単細胞油の工業的応用（Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｏｉｌｓ）」より、ナカハラ（Ｎａｋａｈａｒａ）Ｔ．ら著、６１〜９７頁（１９９２年））。
本発明における好ましい増殖培地は、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの酵母菌窒素ベースなどの一般的な市販の調製培地である。その他の合成または人工増殖培地もまた使用されてもよく、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の生育に適する培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．０が初期生育条件の範囲として好ましい。発酵は好気性または好気性条件下で実施されてもよく、微好気条件が好ましい。
典型的に油性酵母菌細胞中のＰＵＦＡの高レベルの蓄積は、代謝状態が生育と脂肪合成／貯蔵との間で「平衡状態」でなくてはならないので、二段階プロセスを必要とする。したがって最も好ましくは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＡＲＡ生成には、二段階発酵プロセスが必要である。このアプローチについては国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで述べられ、様々な適切な発酵プロセスデザイン（すなわちバッチ、供給バッチ、および連続）および成育中の考察についても同様に述べられる。
ＡＲＡの精製および加工
ＡＲＡをはじめとするＰＵＦＡは、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で宿主微生物中に見いだすことができ、技術分野でよく知られている多様な手段を通じて宿主細胞から抽出されてもよい。酵母菌脂質の抽出技術、品質分析、および許容性基準についての１つのレビューは、Ｚ．ジェーコブス（Ｊａｃｏｂｓ）著、「Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」 １２（５／６）：４６３〜４９１頁（１９９２年）である。下流プロセスに関する簡潔なレビューはまた、Ａ．シン（Ｓｉｎｇｈ）およびＯ．ワード（Ｗａｒｄ）著、「Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」４５：２７１〜３１２頁（１９９７年）にもある。
一般にＡＲＡおよびその他のＰＵＦＡの精製手段は、有機溶剤、超音波処理、（例えば二酸化炭素を使用した）超臨界流体抽出による抽出と、鹸化と、圧搾などの物理的手段またはそれらの組み合わせを含んでもよい。追加的詳細については、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットの教示を参照されたい。
脱酸されたおよび／または精製されたＡＲＡを含有する油は、水素化することで、様々な融解特性およびテクスチャがある脂肪をもたらすことができる。スプレッド、製菓用脂肪、硬質バター、マーガリン、ベーキングショートニングなどをはじめとする多くの加工脂肪は、室温で異なる程度の固形性を必要とし、油源の物理特性の改変のみを通じて製造できる。これは触媒的水素付加を通じて最も一般的に達成できる。
水素付加はニッケルなどの触媒の助けによって、水素が不飽和脂肪酸二重結合に付加される化学反応である。水素付加は、２つの主要効果を有する。第１に不飽和脂肪酸含量減少の結果として、油の酸化安定性が増大する。第２に脂肪酸変性が融点を上昇させて室温で半液体または固体の脂肪がもたらされるので、油の物理特性が変化する。
水素付加反応に影響する多くの変数があり、それは次に最終生成物の組成を変化させる。圧力、温度、触媒タイプおよび濃度、撹拌および反応器設計をはじめとする操作条件は、調節できるより重要なパラメーターである。選択的水素付加条件を使用して、より低不飽和のものに優先して、より高不飽和の脂肪酸を水素化できる。非常に軽いまたはブラシ水素付加（ｂｒｕｓｈ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）を用いて、液体油の安定性を増大させることが多い。さらに水素付加は液体油を物理的に固形の脂肪に変換する。水素付加の度合いは特定の最終産物のためにデザインされた、所望の性能および融解特性に左右される。ベーキング製品を製造するのに使用される液体ショートニング、市販の揚げ物およびロースト操作のために使用される固体脂肪およびショートニング、およびマーガリン製造のためのベースストックは、水素付加を通じて達成される無数の可能な油および脂肪製品の例である。水素付加および水素化製品のより詳細な説明は、パターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ），Ｈ．Ｂ．Ｗ．著、「脂肪および油の水素付加：理論および実線（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｔｓ ａｎｄ Ｏｉｌｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、米国油化学会、１９９４年、にある。
食材で使用するためのＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＡＲＡ生成株
市場は、現在、ω−３および／またはω−６脂肪酸（特にＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡ）を組み込んだ多種多様な食物および飼料製品を下支えしている。ＡＲＡを含んでなる本発明の酵母微生物油は、食物および飼料製品で機能して、現行の調合物に健康上の利点を与えることが考察される。
ここで述べられる酵母宿主によって生成されるω−３および／またはω−６脂肪酸を含有する微生物油は、食物類似物、肉製品、穀物製品、ベーカリー食品、スナック食品、および乳製品をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な食物および飼料製品で使用するのに適している。さらに本微生物油を調合物中で使用して、医学的栄養物、栄養補助食品、乳児用調製粉乳をはじめとするメディカルフード、ならびに医薬品に健康上の利点を与えてもよい。食品加工および食品配合の当業者は、特定量と組成の微生物油をどのように食品または飼料製品に添加してもよいかを理解する。このような量はここで「有効」量と称され、食品または飼料製品、製品が栄養補給を意図する食餌、またはメディカルフードまたは医学的栄養物が矯正または処置を意図する疾患に左右される。
食物類似物は、当業者によく知られているプロセスを使用して作り出すことができる。肉類似物、チーズ類似物、ミルク類似物などが挙げられる。ダイズからできた肉類似物は、ダイズタンパク質または豆腐、および共に混合されて、様々な種類の肉をシミュレートするその他の成分を含有する。これらの肉代用品は、冷凍、缶詰または乾燥食品として販売される。通常、それらはそれらが置き換える食品と同じように使用できる。肉類似物例としては、ハム類似物、ソーセージ類似物、ベーコン類似物などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
食物類似物は、それらの機能性および組成特性次第で模造品または代用品として分類できる。例えば模造チーズは、それが置き換えるようにデザインされたチーズに似てさえいればよい。しかし製品は一般に、それが置き換えるチーズと栄養的に同等であり、そのチーズに対する最小組成要求量を満たす場合にのみ代用チーズと称することができる。したがって代用品チーズは模造チーズよりも高いタンパク質レベルを有することが多く、ビタミンおよびミネラルで強化される。
ミルク類似物または非乳製品食品としては、模造ミルクおよび非乳製品冷菓（例えばダイズおよび／またはダイズタンパク質製品からできたもの）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
肉製品は、幅広い製品を包含する。米国では「肉」は、牛、豚、および羊から産する「赤身肉」を含む。赤身肉に加えて、鶏、七面鳥、アヒル、ホロホロチョウ、カモを含む家禽品目、および魚および貝類がある。生、塩蔵、および揚げ物、および塩蔵され調理された幅広い種類の調味および加工肉製品がある。ソーセージおよびホットドッグは、加工肉製品の例である。したがって「肉製品」という用語は、ここでの用法では加工肉製品を含むが、これに限定されるものではない。
シリアル食品はシリアル穀物の加工に由来する食品である。シリアル穀物としては、可食穀物（種子）を産するイネ科のあらゆる植物が挙げられる。最も普及している穀物は、大麦、コーン、雑穀、オート麦、キノア、米、ライ麦、モロコシ、ライ小麦、小麦、およびワイルドライスである。実施シリアル食品の例としては、全粒、破砕粒、挽き割り、穀粉、ふすま、胚芽、朝食用シリアル、押し出し食品、パスタなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ベーカリー製品は、上で言及され、ベーキングに匹敵する様式で、天火焼または加工された、すなわち熱に曝すことで乾燥または硬化されるあらゆるシリアル食品を含んでなる。ベーカリー製品の例としては、パン、ケーキ、ドーナツ、バー、パスタ、パン粉、ベークドスナック、ミニビスケット、ミニクラッカー、ミニクッキー、およびミニ−プレッツェルが挙げられるが、これに限定されるものではない。上述されるように、成分として本発明の油を使用できる。
スナック食品は、上または下で述べられる食品のいずれかを含んでなる。
揚げ物食品は、油で揚げた上または下で述べられる食品のいずれかを含んでなる。
飲料は、液体または乾燥粉末形態であることができる。
例えば非炭酸飲料と、生、冷凍、缶詰または濃縮果汁のフルーツジュースと、フレーバーミルクまたはプレーンミルク飲料などが挙げられる。成人および幼児栄養フォーミュラについては技術分野でよく知られ、市販されている（例えばアボット・ラボラトリーズのロス製品部門（Ｒｏｓｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からのシミラック（Ｓｉｍｉｌａｃ）（登録商標）、エンシュア（Ｅｎｓｕｒｅ）（登録商標）、ジュビディ（Ｊｅｖｉｔｙ）（登録商標）、およびアリメンタム（Ａｌｉｍｅｎｔｕｍ）（登録商標））。乳児用調製粉乳は、幼児および小児に食べさせる液体または再構成粉である。これらは、人乳の代用品として機能する。乳児用調製粉乳は幼児にとって唯一の栄養源であることが多いので、幼児の食餌において特別な役割を有する。母乳が幼児にとってなおも最良の栄養であるが、乳児用調製粉乳は、乳児が生存するだけでなく生長できる十分近い次善の策である。乳児用調製粉乳は、ますます母乳に近づいてきている。
乳製品はミルク由来製品である。ミルク類似物または非乳製品は、例えば上述した豆乳のようなミルク以外の供給源に由来する。これらの製品としては、全乳、スキムミルク、ヨーグルトまたはサワーミルクなどの発酵ミルク製品、クリーム、バター、練乳、粉ミルク、コーヒーホワイトナー、コーヒークリーマー、アイスクリーム、チーズなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
その中に本発明のＡＲＡ含有油を含めることができる追加的食品としては、例えばチューインガム、糖菓およびフロスティング、ゼラチンおよびプディング、ハードおよびソフトキャンディ、ジャムおよびゼリー、白色グラニュー糖、糖代用品、甘みソース、トッピングおよびシロップ、および乾燥ブレンド粉末ミクスが挙げられる。
健康食品および医薬品
健康食品は健康上の利点を与えるあらゆる食品であり、機能性食品、メディカルフード、医学的栄養剤、および栄養補助食品が含まれる。さらに本発明の微生物油を標準医薬組成物で使用してもよい。本遺伝子操作ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株、またはそれから生成されるＡＲＡを含んでなる微生物油は、上述のあらゆる食品中に容易に組み込んで、それによって例えば機能性食品またはメディカルフードが生成できる。例えばＡＲＡを含んでなるより濃縮された調合物としては、ヒトまたはヒト以外の動物において、栄養補助食品として使用できるカプセル、粉末、錠剤、ソフトジェル、ジェルキャップ、濃縮液、およびエマルジョンが挙げられる。
栄養補助食品における使用
ＡＲＡを含んでなるより濃縮された調合物としては、ヒトまたはヒト以外の動物において、栄養補助食品として使用できるカプセル、粉末、錠剤、ソフトジェル、ジェルキャップ、濃縮液、およびエマルジョンが挙げられる。特に、本発明のＡＲＡ油は、乳児用調製粉乳または乳児食等の栄養補助食品への組み込みに特に適している。
乳児用調製粉乳は、幼児および小児に食べさせる液体または戻した粉末である。「乳児用調製粉乳」とは、ここで幼児の哺乳において人乳に置き換えることができ、典型的に水溶液中で所望の百分率の炭水化物およびタンパク質と混合された所望の百分率の脂肪から構成される経腸栄養製品と定義される（例えば米国特許第４，６７０，２８５号明細書を参照されたい）。世界的組成研究ならびに専門家グループによって規定されるレベルに基づいて、平均的人乳は典型的に約０．２０％〜０．４０％の全脂肪酸（脂肪からの熱量が約５０％と仮定すれば）を含有し、一般にＤＨＡとＡＲＡの比率は約１：１〜１：２の範囲である（例えばミード・ジョンソン・アンド・カンパニー（Ｍｅａｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ）からのエンファミル（Ｅｎｆａｍｉｌ）ＬＩＰＩＬ（商標）およびアボット・ラボラトリーズのロス製品部門（Ｒｏｓｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からのシミラック・アドバンス（Ｓｉｍｉｌａｃ Ａｄｖａｎｃｅ）（商標）の配合を参照されたい）。乳児用調製粉乳は幼児にとって唯一の栄養源であることが多いので、幼児の食餌において特別な役割を有し、母乳が幼児にとってなおも最良の栄養であるが、乳児用調製粉乳は、乳児が生育するだけでなく生長できる十分近い次善の策である。
動物飼料における使用
動物飼料はここで総称的に、ヒト以外の動物飼料としての使用または飼料への混合が意図される製品と定義される。そして、先に記載されたように、本発明のＥＰＡ含有油は、様々な動物飼料中の成分として使用できる。
より具体的には、これに限定されるものではないが、本発明の油は、ペットフード、反芻動物および家禽飼料製品、および水産養殖飼料製品で使用できる。ペットフードはペット［例えば犬、猫、鳥、爬虫類、齧歯類］に食べさせることが意図される製品であり、これらの製品は上のシリアルおよび健康食品、ならびに肉および肉副産物、ダイズタンパク質製品、牧草および干し草生成物（例えばアルファルファ、チモシー、カラスムギまたはスズメノチャヒキ、野菜）を含むことができる。反芻動物および家禽食品は、例えば七面鳥、鶏、牛、および豚に食べさせることが意図される製品である。上のペットフードと同様に、これらの製品は、上に列挙したシリアルおよび健康食品、ダイズタンパク質製品、肉および肉副産物、および牧草および干し草製品を含むことができる。そして、水産養殖飼料（または「アクアフィード」）は、淡水または海水生物および／または動物の繁殖、養殖または飼育に関わる養殖で使用されることが意図される製品である。
高濃度のＡＲＡ、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡを生成する本遺伝子操作ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、ほとんどの動物飼料配合に含めるのに特に有用であることが考察される。必要なω−３および／またはω−６ＰＵＦＡを提供するのに加えて、酵母それ自体が、全体的な動物の健康および栄養に寄与できる有用なタンパク質およびその他の飼料栄養素源（例えばビタミン、ミネラル、核酸、複合糖質など）であり、ならびに調合物の美味性を増大する。より具体的には、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ＃２０３６２）は、乾燥細胞重量に対するパーセントとして以下のおよその化学組成を有する、３５％のタンパク質、４０％の脂質、１０％の炭水化物、５％の核酸、５％の灰分、および５％の水分。さらに炭水化物画分内では、β−グルカンがおよそ４５．６ｍｇ／ｇを構成し、マンナンがおよそ１１．４ｍｇ／ｇを構成し、キチンがおよそ５２．６ｍｇ／ｇを構成する（一方トレハロースは微量構成要素である［およそ０．７ｍｇ／ｇ］）。
かなり多数の文献が、β−グルカン、マンナン、およびキチンの免疫調節効果について調査している。細菌および真菌細胞壁の主要構成要素であるβ−グルカンが、それによって非特異的免疫を刺激する（すなわち「免疫賦活効果」）ことで水産養殖種、ペットおよび家畜およびヒトの健康を改善する手段について最もよく研究されているが、キチンおよびマンナンの双方が同様に有用な免疫賦活剤として認識されている。単純化すると、これらのβ−１，３−Ｄ−ポリグルコース分子は白血球細胞（例えばマクロファージ、好中球、および単球）の生成を非特異的様式で刺激し、それによって多様な病原体抗原または環境ストレス要因に対する感度および防御を増大させるので、免疫応答の全体的改良はβ−グルカンの使用によって達成できる。より具体的には、多数の研究が以下のβ−グルカンの機能を実証している。ウィルス性、細菌、真菌、および寄生虫性感染に対する増強された保護を与え、抗生物質およびワクチンと共に使用されるとアジュバント効果を発揮し、創傷治癒を増強し、遊離ラジカルに起因する損傷に対処し、腫瘍の緩解を増強し、細菌内毒素の毒性を和らげ、粘膜免疫を強化する（ラー（Ｒａａ），Ｊ．ら著、「ノルウェーβ−グルカン研究、自然薬品の臨床応用。免疫：抑制、機能不全、および欠損（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ Ｂｅｔａ Ｇｌｕｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｉｍｍｕｎｅ：Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎｓ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ＆ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）」（１９９０年）でレビューされている）。伝統的畜産業および水産養殖セクター内の双方における酵母β−グルカン、マンナン、およびキチンの有用性について記述している現行の文献の例としては、以下が挙げられる。Ｌ．Ａ．ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら著、「Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．」８０：２６１９〜２６２８頁（２００２年）、離乳ブタにおける栄養補給；Ｋ．Ｓ．スワンソン（Ｓｗａｎｓｏｎ）ら著、「Ｊ．Ｎｕｔｒ．」１３２：９８０〜９８９頁（２００２年）、犬における栄養補給；Ｊ．オルトゥー（Ｏｒｔｕｎｏ）ら著、「Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｏｎｏｐａｔｈ．」８５：４１〜５０頁（２００２年）、ヨーロッパヘダイに投与されたホール・サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；Ａ．ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）ら著「Ｆｉｓｈ Ｓｈｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．」１６：２４１〜２４９頁（２００４年）、ヨーロッパヘダイに投与されたホール・ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）；Ｍ．バグニ（Ｂａｇｎｉ）ら（「Ｆｉｓｈ Ｓｈｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．」１８：３１１〜３２５頁（２００５年））、β−グルカンを含有する酵母抽出物によるスズキの栄養補給；クルス−スアレス（Ｃｒｕｚ−Ｓｕａｒｅｚ），Ｌ．Ｅ．、リック−マリー（Ｒｉｃｑｕｅ−Ｍａｒｉｅ），Ｄ．、タピア−サラザール（Ｔａｐｉａ−Ｓａｌａｚａｒ），Ｍ．、オリヴェラ−ノヴォア（Ｏｌｖｅｒａ−Ｎｏｖｏａ），Ｍ．Ａ．およびシヴェラ−セレセード（Ｃｉｖｅｒａ−Ｃｅｒｅｃｅｄｏ），Ｒ．編、「（水産栄養学における進歩５、第５回水産栄養４シンポジウム紀要（Ａｖａｎｃｅｓ ｅｎ Ｎｕｔｒｉｃｉｏｎ Ａｃｕｉｃｏｌａ Ｖ．Ｍｅｍｏｒｉａｓ ｄｅｌ Ｖ Ｓｉｍｐｏｓｉｕｍ Ｉｎｔｅｒｎａｃｉｏｎａｌ ｄｅ Ｎｕｔｒｉｃｉｏｎ Ａｃｕｉｃｏｌａ）、２０００年１１月１９〜２２日、メキシコ国ユカタン州メリダ）より、Ｊ．ラー（Ｒａａ）著、魚および貝類飼料における免疫賦活剤の使用に関するレビュー。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のユニークなタンパク質：脂質：炭水化物組成、ならびにユニークな複合糖質プロフィール（１：４：４．６の比率でマンナン：β−グルカン：キチンを含んでなる）に基づいて、本発明の遺伝子改変酵母細胞（またはその一部）が、動物飼料配合に対する有用な添加剤になり得ることが考察された（例えばホール［凍結乾燥］酵母細胞として、精製された細胞壁として、精製された酵母炭水化物として、または様々なその他の分画された形態で）。
水産養殖産業については、様々な魚種の栄養所要量に対する理解の高まり、および飼料製造における技術的進歩が、水産養殖産業における栄養補給または天然飼料を置き換えるための人造または人工飼料（配合飼料）の開発および使用を可能にした。しかし一般に、魚のための水産養殖飼料に含まれる様々な栄養素の一般的割合（乾燥飼料に対するパーセント）は、３２〜４５％のタンパク質、４〜２８％の脂肪（その内少なくとも１〜２％はω−３および／またはω−６ＰＵＦＡである）、１０〜３０％の炭水化物、１．０〜２．５％のミネラル、および１．０〜２．５％のビタミンを含む。多様なその他の成分も場合により調合物に添加されてもよい。これらとしては、（１）特にサケ科および鑑賞「水槽」魚のために、肉および皮膚の着色をそれぞれ増強するカロチノイド、（２）ペレットに安定性を提供し、栄養素（例えば牛心臓肉、デンプン、セルロース、ペクチン、ゼラチン、アラビアゴム、ローカストビーン、寒天、カラゲニン、およびその他のアルギン酸塩）の水中への浸出を減少させる結合剤、（３）魚飼料の貯蔵寿命を延長し、脂肪酸敗を低下させる抗菌剤および抗酸化剤などの保存料（例えばビタミンＥと、ブチル化ヒドロキシアニソールと、ブチル化ヒドロキシトルエンと、エトキシキンと、プロピオン酸、安息香酸またはソルビン酸のナトリウムおよびカリウム塩）、（４）飼料の美味性および摂取を増強する化学誘引剤および香味料、および（５）その他の飼料原料が挙げられる。これらのその他の飼料原料としては、繊維および灰分（それぞれ充填材としておよびカルシウムおよびリン源として使用するための）、および食餌の栄養価を増強し、魚によるその受容性を高めるための植物質および／または魚粉または粉末イカ（例えば生、冷凍または乾燥藻類、鹹水エビ、ワムシまたはその他の動物性プランクトン）などの材料が挙げられる。「魚の栄養所要量（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｆｉｓｈ）」（米国学術研究会議、全米アカデミー：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、１９９３年）は、魚の必須栄養素および様々な成分の栄養素含量の詳細な説明を提供する。
完全な食餌は、栄養的にバランスがとれており、美味で、水安定性でなくてはならず、適切なサイズおよびテクスチャを有さねばならないので、アクアフィード調合物の製造には多様な要素の検討を要する。アクアフィードの栄養組成に関しては、「水産養殖飼料成分ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｆｏｒ Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｅｅｄｓ）」ヘルトランプ（Ｈｅｒｔｒａｍｐｆ），Ｊ．Ｗ．およびＦ．ピエダッド−パスカル（Ｐｉｅｄａｄ−Ｐａｓｃｕａｌ）著、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、２０００年、および「養殖魚およびエビの栄養と給餌の標準法（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｆａｒｍｅｄ Ｆｉｓｈ ａｎｄ Ｓｈｒｉｍｐ）」タコン（Ｔａｃｏｎ），Ａ．Ｇ．Ｊ．著、Ａｒｇｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：Ｒｅｄｍｏｎｄ、１９９０年を参照されたい。一般に餌は、乾燥（すなわち最終含水量６〜１０％）、半湿潤（すなわち含水量３５〜４０％）または湿潤（すなわち含水量５０〜７０％）であるように調合される。乾燥飼料としては、乾燥成分の単純なルースな混合物（すなわち「粉餌」または「ミール」）と、圧縮ペレット、クランブルまたは顆粒と、フレークとが挙げられる。魚の給餌要件次第で、ペレットは沈降しまたは浮遊するようにできる。半湿潤および湿潤飼料は単一または混合成分（例えば雑魚または調理マメ）から作られ、ケークまたはボールに成形できる。
高濃度のＡＲＡを生成する本遺伝子操作ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株が、ほとんどの水産養殖飼料に含めるのに特に有用であることが予期される。必要なω−６ＰＵＦＡを提供するのに加えて、酵母それ自体が、調合物の美味性を増大できる有用なタンパク質源である。代案の実施形態では、本Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株によって生成される油を細胞集団からの抽出および精製に続いて、水産養殖飼料配合中に直接導入できる。
好ましい実施形態の説明
本発明は、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の総脂質画分中に１０〜１４％までのＡＲＡの合成を実証する。図４に示すように、様々な遺伝子を野生型ＡＴＣＣ＃２０３６２Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に組み込んで、多数のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株が作り出され、各形質転換体株は（ＡＲＡをはじめとする）異なる量のＰＵＦＡを生成できた。Ｙ２０３４およびＹ２０４７株（Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路を発現する）ならびにＹ２２１４株（Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を発現する）の完全な脂質プロフィールを下の表１０に示す。脂肪酸は１６：０、１６：１、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、およびＡＲＡとして同定され、それぞれの組成は、全脂肪酸の％で表される。
Figure 0005139806
Ｙ２０４７株内に含有される遺伝的修正のより詳細な要約について下で述べる（完全な詳細は実施例で提供する）。
（１）ＦＢＡ：：Ｆ．Δ１２：：ＬＩＰ２キメラ遺伝子内における、１コピーのフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼの発現、
（２）ＴＥＦ：：Δ６Ｓ：：ＬＩＰ１キメラ遺伝子内における、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ由来の１コピーの合成Δ６デサチュラーゼ遺伝子（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された）の発現、
（３）ＴＥＦ：：Ｈ．Ｄ５Ｓ：：ＰＥＸ１６キメラ遺伝子内における、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）Δ５デサチュラーゼ由来の１コピーの合成Δ５デサチュラーゼ遺伝子（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された）の発現、
（４）ＦＢＡＩＮ：：ＥＬ１Ｓ：：ＰＥＸ２０キメラ遺伝子内における、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）高親和力Ｃ１８／２０エロンガーゼ由来の１コピーの合成高親和力Ｃ１８／２０エロンガーゼ遺伝子（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された）の発現、
（５）ＴＥＦ：：ＥＬ２Ｓ：：ＸＰＲキメラ遺伝子内における、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）Ｃ１８／２０エロンガーゼ由来の１コピーの合成Ｃ１８／２０エロンガーゼ遺伝子（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された）の発現、
（６）β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする天然Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌｅｕ２遺伝子の中断。
同様にＹ２２１４株内に含有される遺伝的修正のより詳細な要約について下で述べる（完全な詳細は実施例で提供する）。
（１）ＧＰＡＴ：：ＩｇＤ９ｅ：：ＰＥＸ２０、ＴＥＦ：：ＩｇＤ９ｅ：：ＬＩＰ１、およびＦＢＡＩＮｍ：：Ｄ９ｅ：：ＯＣＴキメラ遺伝子内における、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ９エロンガーゼ遺伝子由来の５コピーの合成Δ９エロンガーゼ遺伝子（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された）の発現、
（２）ＦＢＡＩＮ：：Ｄ８ＳＦ：：ＰＥＸ１６およびＧＰＤ：：Ｄ８ＳＦ：：ＰＥＸ１６キメラ遺伝子内における、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ遺伝子由来の３コピーの合成Δ８デサチュラーゼ遺伝子（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された）の発現、
（３）ＧＰＡＴ：：ＭＡΔ５：：ＰＥＸ２０およびＦＢＡＩＮ：：ＭＡΔ５：：ＰＥＸ２０キメラ遺伝子内における、２コピーのモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼの発現、
（４）ＹＡＴ１：：Ｉ．Ｄ５Ｓ：：ＬＩＰ１およびＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：Ｉ．Ｄ５Ｓ：：ＯＣＴキメラ遺伝子内における、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ５デサチュラーゼ由来の２コピーの合成Δ５デサチュラーゼ遺伝子（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された）の発現、
（５）ＦＢＡＩＮ：：Ｆ．Ｄ１２Ｓ：：ＰＥＸ２０キメラ遺伝子内における、１コピーのフザリウム・モニフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼの発現、
（６）ＧＭＰ／ＦＢＡＩＮ：：ｒＥＬＯ２Ｓ：：ＯＣＴキメラ遺伝子内における、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ｒＥＬＯ遺伝子由来の１コピーの合成Ｃ１６／１８エロンガーゼ遺伝子（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された）の発現、および
（７）サッカロピンデヒドロゲナーゼをコードする天然Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌｙｓ５遺伝子の中断。
出願人らはこれらの特定のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）組換え株において、１１％および１４％のＡＲＡの生成をそれぞれ実証するが、宿主細胞中のＡＲＡ濃度は、ここでの本発明に従った追加的遺伝的修正を通じて顕著に増大できることが考察された。さらに本明細書で述べる教示および結果に基づいて、当業者が、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路および／またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を使用した、様々なω−３および／またはω−６ＰＵＦＡ合成のための生産プラットホームとして油性酵母を使用してもたらされる、実行可能性および商業的有用性を認識することが期待される。
以下の実施例で本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながら、例示のみの目的で提供されるものとする。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必須特性を把握でき、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行って、それを様々な使用法および条件に適合できる。
一般方法
実施例で使用する標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、技術分野でよく知られており、１．）サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）、（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））、２．）Ｔ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）著、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）、および３．）オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら著、「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７年）で述べられる。
微生物培養の維持および生育に適した材料および方法は、技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、次で述べられる。フィリップス・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年）、またはトーマス（Ｔｈｏｍａｓ），Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）著、「バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）。微生物細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得た。
大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）コンピテント細胞は、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））から購入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的にルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）プレート上で３７℃で生育させた。
一般分子クローニングは、標準法に従って実施した（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前出）。オリゴヌクレオチドは、テキサス州スプリングのシグマ−ジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｓｐｒｉｎｇ，ＴＸ））によって合成された。特に断りのない限り、個々のＰＣＲ増幅反応は、以下を含んでなる５０μＬの全容積で実施した。ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００を含有する）、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ（最終濃度）、各２００μＭのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、各１０ピコモルのプライマー、およびカリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））からの１μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ。部位特異的変異誘発は、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のクイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）（商標）部位特異的変異誘発キットを使用して、製造業者の取扱説明書に従って実施した。ＰＣＲまたは部位特異的変異誘発がサブクローニンに伴う場合は、コンストラクトを配列決定して、配列にエラー導入されなかったことを確認した。ＰＣＲ生成物はウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローンした。
ＤＮＡ配列は、ベクターとインサート特異的プライマーとの組み合わせを使用して、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、ＥＰ第２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ自動シーケンサー上で生成した。ミシガン州アンアーバーのジーン・コーズ社（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）中で配列編集を実施した。全配列は、双方向で少なくとも２回のカバレッジを表す。遺伝的配列の比較は、ＤＮＡ ＳＴＡＲ（ＤＮＡ ＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）からのＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して達成された。代案としては、ジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．）から入手できるプログラムスイート（ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０、ウィスコンシン州マディソンのジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用して、遺伝的配列の操作を達成した。ＧＣＧプログラム「パイルアップ（Ｐｉｌｅｕｐ）」をギャップ創生デフォルト値１２およびギャップ延長デフォルト値４で使用した。ＧＣＧ「ギャップ（Ｇａｐ）」または「ベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）」プログラムをデフォルトギャップ創生ペナルティ５０およびデフォルトギャップ延長ペナルティ３で使用した。特に断りのない限り、あらゆるその他の場合においてＧＣＧプログラムのデフォルトパラメーターを使用した。
ＢＬＡＳＴ（基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ））アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら著、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年）および「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」２５：３３８９−３４０２頁（１９９７年））を実施して、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非冗長ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ翻訳、３次元構造ブルックヘブンタンパク質データバンク由来配列、スイスＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）に含まれる配列に対する類似性を有する単離配列を同定した。配列を全ての読み枠で翻訳し、ＮＣＢＩによって提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギッシュ（Ｇｉｓｈ），Ｗ．およびステーツ（Ｓｔａｔｅｓ），Ｄ．Ｊ．著、「Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」 ３：２６６〜２７２頁（１９９３年））を使用して、「ｎｒ」データベースに含まれる全ての公共的に入手できるタンパク質配列との類似性について比較した。
クエリー配列がそれに対して最も高い類似性を有する配列を要約するＢＬＡＳＴ比較の結果を％同一性、％類似性、および期待値に従って報告する。「％同一性」は、２つのタンパク質間で同一のアミノ酸の百分率として定義される。「％類似性」は、２つのタンパク質間で同一のまたは保存されたアミノ酸の百分率として定義される。「期待値」は、この大きさのデータベース検索で期待される、絶対的に偶然の特定スコアでのマッチ数を明記して、マッチの統計学的有意さを推定する。
略語の意味は以下の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２、＃７６９８２、および＃９０８１２株は、メリーランド州ロックビルの米国微生物系統保存機関から購入した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、ＹＰＤ寒天（１％酵母菌抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）上において通常２８℃で生育させた。代案としては「ＳＤ」培地は、以下を含んでなる。硫酸アンモニウム添加、アミノ酸無添加、および２％グルコース添加０．６７％酵母窒素ベース。
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、特に断りのない限りチェン（Ｃｈｅｎ），Ｄ．Ｃ．ら著、「Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」４８（２）：２３２〜２３５頁（１９９７年）の方法に従って実施した。簡単に述べると、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）をＹＰＤプレート上に画線培養し、３０℃でおよそ１８時間生育させた。いくつかの大型白金耳を満たす細胞をプレートからこすり取り、平均分子量３３５０の２．２５ｍＬの５０％ＰＥＧ、ｐＨ６．０の０．１２５ｍＬの２Ｍ酢酸Ｌｉ、０．１２５ｍＬの２Ｍ ＤＴＴ、および５０μｇの剪断サケ精子ＤＮＡを含有する１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁した。次に約５００ｎｇの直線化プラスミドＤＮＡを１００μＬの再懸濁細胞内でインキュベートし、１５分間隔でボルテックス混合しながら３９℃に１時間保った。細胞を選択培地プレートに蒔いて、３０℃に２〜３日間保った。
形質転換体の選択のためには、一般にＳＤ培地または最少培地（「ＭＭ」）を使用した。ＭＭの組成は以下のとおり。ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない０．１７％酵母菌窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、ｐＨ６．１。適切ならばアデニン、ロイシン、リジンおよび／またはウラシルのサプリメントを最終濃度０．０１％に添加した（それによって２０ｇ／Ｌの寒天で調製される「ＭＭＡ」、「ＭＭＬｅ」、「ＭＭＬｙ」、および「ＭＭＵ」選択培地を生成した）。
代案としては形質転換体は、次を含んでなる５−フルオロオロチン酸（「ＦＯＡ」、また５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物とも）選択培地上で選択された。ＤＩＦＣＯラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない０．１７％酵母窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、７５ｍｇ／Ｌのウラシル、７５ｍｇ／Ｌのウリジン、カリフォルニア州オレンジのザイモリサーチ社（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））からの９００ｍｇ／Ｌ ＦＯＡおよび２０ｇ／Ｌの寒天。
最後に、油生成条件を促進するためにデザインされた「二段階生育条件」のために、次のようにして高グルコース培地（「ＨＧＭ」）を調製した。１４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、８０ｇ／Ｌグルコース（ｐＨ６．５）。以下のプロトコルに従った「二段階生育条件」下で株を培養した。最初に、２５０ｒｐｍ／分間で４８時間振盪しながら３０℃の液体ＭＭ中で細胞を三連で生育させた。遠心分離によって細胞を収集し、液体上清を抽出した。ペレット化した細胞をＨＧＭに再懸濁し、３０℃において２５０ｒｐｍ／分間で振盪しながら７２時間または９６時間のどちらかで生育させた。細胞を遠心分離によって再度収集し、液体上清を抽出した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析のために、ブライ（Ｂｌｉｇｈ），Ｅ．Ｇ．およびダイヤー（Ｄｙｅｒ），Ｗ．Ｊ．著、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７頁（１９５９年）で述べられるように、細胞を遠心分離し収集して脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドでの脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステルを調製し（ローガン（Ｒｏｕｇｈａｎ），Ｇ．およびニシダ（Ｎｉｓｈｉｄａ），Ｉ．著、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８〜４６頁（１９９０年））、引き続きヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）からの３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸカラムを装着したヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。オーブン温度は３．５℃／分で、１７０℃（２５分間保持）から１８５℃であった。
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を収集し、蒸留水で１回洗浄し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）内で真空下において５〜１０分乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μＬの１％）をサンプルに添加して、次にサンプルをボルテックスし２０分間振盪した。３滴の１Ｍ ＮａＣｌおよび４００μＬのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠心分離した。上層を除去して上述のようにＧＣで分析した。
実施例１
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における高発現のためのプロモーター同定
各プロモーターと、レポーター遺伝子としてβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）遺伝子とを含んでなるコンストラクトを合成して、ＴＥＦ、ＧＰＤ、ＧＰＤＩＮ、ＧＰＭ、ＧＰＡＴ、ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、およびＹＡＴ１プロモーターのプロモーター活性を調べる比較研究を実施した（ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ），Ｒ．Ａ．著、Ｎａｔｕｒｅ．１４（３４２）：８３７〜８３８頁（１９８９年））。次に組織化学的および蛍光定量的アッセイによって（ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ），Ｒ．Ａ．著、「Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ」５：３８７〜４０５頁（１９８７年））、および／またはｍＲＮＡ定量化のためのリアルタイムＰＣＲを使用して、ＧＵＳ活性を測定した。
キメラプロモーター：：ＧＵＳ：：ＸＰＲ遺伝子を含んでなるプラスミドの構築
プラスミドｐＹ５−３０（図５Ａ、配列番号１１３）は、以下を含んだ。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律複製配列（ＡＲＳ１８）、ＣｏｌＥ１プラスミド複製起点、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中での選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子（ＡｍｐＲ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での選択のためのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＬＥＵ２遺伝子、およびキメラＴＥＦ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲ遺伝子。このプラスミドをベースとして、ＴＥＦプロモーターがその他の多様な天然Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）プロモーターによって置換される、一連のプラスミドを作り出した。
下の表１１に示すプライマー、およびテンプレートとしてのゲノムＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＮＡ、またはウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローンされた適切なＤＮＡ領域を含有するゲノムＤＮＡ断片のどちらかを使用して、推定上のプロモーター領域をＰＣＲによって増幅した。
Figure 0005139806
一般方法で述べられるようにして、ＧＰＤ、ＧＰＤＩＮ、ＧＰＭ、ＦＢＡ、およびＦＢＡＩＮについて個々のＰＣＲ増幅反応を５０μＬの全容積で実施した。サーモサイクラー条件は、次のように設定した。９５℃で１分間、５６℃で３０秒間、および７２℃で１分間を３５サイクルと、それに続く７２℃で１０分間の最終延長。
日本国滋賀県大津市５２０−２１９３のタカラバイオからのプレミクス２×ＰＣＲ溶液の１：１希釈を使用して、ＧＰＡＴプロモーターのためのＰＣＲ増幅を５０μＬの全容積で実施した。最終組成物は以下を含有した。２５ｍＭのＴＡＰＳ（ｐＨ９．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭの２−メルカプトエタノール、各２００μＭのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、各１０ピコモルのプライマー、５０ｎｇテンプレート、および１．２５Ｕのウィスコンシン州マディソンのタカラミラスバイオ（Ｔａｋａｒａ Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのタカラ（ＴａＫａＲａ）Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ。サーモサイクラー条件は、次のように設定した。９４℃で２．５分間、５５℃で３０秒間、および７２℃で２．５分間を３０サイクルと、それに続く７２℃で６分間の最終延長。
ＹＡＴ１プロモーターのＰＣＲ増幅を、ＧＰＡＴについて上述したのと比較できる組成物中で実施した。反応混合物を最初に９４℃で１５０秒間加熱した。増幅は次のように実施した。９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間を３０サイクルと、それに続く７２℃で７分間の最終延長。
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットを使用して各ＰＣＲ生成物を精製し、次に（標準条件を使用して上表に従って）制限酵素で消化して１％（ｗ／ｖ）アガロース中でのゲル電気泳動法に続いて消化生成物を精製した。次に消化したＰＣＲ生成物（ＹＡＴ１からのものを除く）を同様に消化したｐＹ５−３０ベクター中にライゲートした。次に各反応からのライゲートしたＤＮＡを使用して、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂまたは大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＨ５αを個別に形質転換した。形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天上で選択した。
ＹＡＴ１は、ｐＹ５−３０中へのクローニングに先だって追加的操作を必要とした。具体的にはＹＡＴ１ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで消化すると約６００ｂｐの断片が得られ、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化すると約２００ｂｐの断片が得られた。双方の生成物を単離し精製した。次にプラスミドｐＹＧＰＡＴ−ＧＵＳをＳａｌＩおよびＮｃｏＩで消化し、約９．５ｋＢの断片を単離して精製した。３個のＤＮＡ断片を共にライゲートしてｐＹＡＴ−ＧＵＳを作り出した。
各形質転換反応からのプラスミドＤＮＡの分析は、予想されたプラスミドの存在を立証した。これらのプラスミドを次のように命名した。ｐＹＺＧＤＧ（ＧＰＤ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる）、ｐＤＭＷ２２２（ＧＰＤＩＮ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる）、ｐＹＺＧＭＧ（ＧＰＭ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる）、ｐＹＧＰＡＴ−ＧＵＳ（ＧＰＡＴ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる）、ｐＤＭＷ２１２（ＦＢＡ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる）、ｐＤＭＷ２１４（ＦＢＡＩＮ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる）、およびｐＹＡＴ−ＧＵＳ（ＹＡＴ１：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる）。
一般方法で述べられるようにして、上の各プラスミド、およびさらにプラスミドｐＹ５−３０（ＴＥＦ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる）をＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中に別々に形質転換した。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主はＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２またはＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２、Ｙ２０３４株（下記実施例４、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路によって１０％のＡＲＡを生成できる）のいずれかであった。全ての形質転換された細胞をロイシンを欠く最小培地プレート上に播種し、３０℃に２〜３日間保った。
ＧＵＳ発現の組織化学的分析によるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）プロモーターの比較分析
プラスミドｐＹ５−３０、ｐＹＺＧＤＧ、ｐＹＺＧＭＧ、ｐＤＭＷ２１２、およびｐＤＭＷ２１４を含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２株を単一コロニーから３ｍＬのＭＭ中で３０℃においてＯＤ６００約１．０に生育させた。次に１００μＬの細胞を遠心分離によって収集し、１００μＬの組織化学的染色緩衝液に再懸濁して、３０℃でインキュベートした。染色緩衝液は、５ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）を５０μＬのジメチルホルムアミドに溶解し、続けて５ｍＬの５０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．０を添加して調製した。組織化学的染色の結果（図５Ｂ）は、コンストラクトｐＹ５−３０中のＴＥＦプロモーター、コンストラクトｐＹＺＧＤＧ中のＧＰＤプロモーター、コンストラクトｐＹＺＧＭＧ中のＧＰＭプロモーター、コンストラクトｐＤＭＷ２１２中のＦＢＡプロモーター、そしてコンストラクトｐＤＭＷ２１４中のＦＢＡＩＮプロモーターが全て活性であることを示した。ＦＢＡおよびＦＢＡＩＮプロモーターの双方が、その他の全プロモーターよりもはるかに強力であるように見え、ＦＢＡＩＮプロモーターが最も強いプロモーター活性を有した。
別の実験で、プラスミドｐＹ５−３０、ｐＹＧＰＡＴ−ＧＵＳ、ｐＹＡＴ−ＧＵＳ、およびｐＤＭＷ２１４を含有するＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０３４株を単一コロニーから５ｍＬのＳＤ培地中で３０℃においてＯＤ６００約８．０に２４時間生育させた。次に遠心分離によって１ｍＬの細胞を収集した。残る培養を遠心分離してＨＧＭで２回洗浄し、各５ｍＬのＨＧＭに再懸濁して、３０℃でさらに生育させた。２４時間および１２０時間後に、約０．２５ｍＬの各培養を遠心分離して細胞を収集した。細胞サンプルを１００μＬの組織化学的染色緩衝液（前出）個別に再懸濁した。カリフォルニア州コスタメサのＩＣＮバイオメディカルズ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ））からのザイモラーゼ（Ｚｙｍｏｌａｓｅ）２０Ｔ（５μＬの１ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれに添加して、混合物を３０℃でインキュベートした。
組織化学的染色の結果は、ＳＤ培地で２４時間生育させると、コンストラクトｐＹＧＰＡＴ−ＧＵＳ中のＧＰＡＴプロモーターが活性であり、またコンストラクトｐＹＡＴ−ＧＵＳ中のＹＡＴ１プロモーターも活性であることを示した（図５Ｃ、「ＳＤ培地中２４時間」）。比較すると、ＧＰＡＴプロモーターはＴＥＦプロモーターよりもはるかに強力であるように見え、ＦＢＡＩＮプロモーターと比べて活性減少を示した。同様に細胞をＳＤ培地で２４時間生育させると、ＹＡＴ１プロモーターはＴＥＦプロモーターよりも強力であるが、ＦＢＡＩＮプロモーターおよびＧＰＡＴプロモーターよりも顕著に弱いように見えた。しかしＨＧＭ中で２４時間生育させた細胞中では、ＹＡＴ１プロモーターはＧＰＡＴプロモーターよりも強力であり、ＦＢＡＩＮプロモーターと同程度であった（図５Ｃ、「ＨＧ培地中２４時間」）。これはＨＧＭ中で１２０時間後も同じであった（図５Ｃ、「ＨＧ培地中１２０時間」）。したがってＹＡＴ１プロモーターは、窒素制限によって油性生育条件を促進する培地であるＨＧＭ中で、誘導されるように見えた。
ＧＵＳ発現の蛍光定量的アッセイによるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）プロモーターの比較分析
ＧＵＳ活性もまた、対応する基質β−グルクロニドからの４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）生成の蛍光定量的測定によってアッセイした（ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ），Ｒ．Ａ．著、「Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ」５：３８７〜４０５頁（１９８７年））。
プラスミドｐＹ５−３０、ｐＹＺＧＤＧ、ｐＹＺＧＭＧ、ｐＤＭＷ２１２、およびｐＤＭＷ２１４を含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２株を単一コロニーから３ｍＬのＭＭ中で（上述のように）３０℃においてＯＤ６００約１．０に生育させた。次に各３ｍＬの培養を５０ｍＬのＭＭを含有する５００ｍＬフラスコに入れて、振盪培養器内で３０℃で約２４時間生育させた。細胞を遠心分離によって収集し、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）細胞溶解緩衝液に再懸濁して、カリフォルニア州ビスタのバイオ１０１（ＢＩＯ １０１（Ｖｉｓｔａ，ＣＡ））からのバイオプルベライザー（Ｂｉｏｐｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）システムを使用して溶解した。遠心分離後、上清を除去して氷上に保存した。
同様にプラスミドｐＹ５−３０、ｐＹＡＴ−ＧＵＳ、ｐＹＧＰＡＴ−ＧＵＳ、およびｐＤＭＷ２１４コンストラクトをそれぞれ含有するＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０３４株を単一コロニーから１０ｍＬのＳＤ培地中で３０℃においてＯＤ６００約５．０に４８時間生育させた。下で述べられるように、各２ｍＬの培養をＧＵＳ活性アッセイのために収集する一方、各５ｍＬの培養をＨＧＭに移した。
具体的には、５ｍＬのアリコートからの細胞を遠心分離によって収集し、５ｍＬのＨＧＭで１回洗浄してＨＧＭ中に再懸濁した。次にＨＧＭ中の培養を振盪培養器中で３０℃において２４時間生育させた。ＧＵＳ活性アッセイのために各２ｍＬのＨＧＭ培養を収集し、残る培養をさらに９６時間生育させた後、さらに各２ｍＬの培養をアッセイのために収集した。
ＳＤ培地中の各２ｍＬの培養サンプルをプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの１ｍＬの０．５×細胞培養溶解試薬に再懸濁した。再懸濁した細胞を２．０ｍＬのゴムＯリング付きネジ口試験管内で、０．６ｍＬのガラスビーズ（０．５ｍｍ直径）と混合した。次に細胞をオクラホマ州バートルズビルのバイオスペック（Ｂｉｏｓｐｅｃ（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ））からのミニビーズビーター内で、最高設定で９０秒間均質化した。均質化混合物をエッペンドルフ遠心機内で１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、細胞残骸およびビーズを除去した。上清をＧＵＳアッセイおよびタンパク質測定のために使用した。
各蛍光定量的アッセイでは、１００μＬの抽出物を７００μＬのＧＵＳアッセイ緩衝液（抽出緩衝液中２ｍＭの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（「ＭＵＧ」））に添加し、または２００μＬの抽出物を８００μＬのＧＵＳアッセイ緩衝液に添加した。混合物を３７℃に置いた。１００μＬのアリコートを０、３０、および６０分間の時点で採取して、９００μＬの停止緩衝液（１ＭのＮａ２ＣＯ３）に入れた。励起波長３６０ｎｍおよび発光波長４５５ｎｍに設定した、マサチューセッツ州フレーミングハムのパーセプティブ・バイオシステムズ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ））からのサイトフロー（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ）シリーズ４０００蛍光マルチウェルプレートリーダーを使用して、各時点を読み取った。１０μＬの抽出物および２００μＬのバイオラッド・ブラットフォード（ＢｉｏＲａｄ Ｂｒａｄｆｏｒｄ）試薬または２０μＬの抽出物および９８０μＬのバイオラッド・ブラットフォード（ＢｉｏＲａｄ Ｂｒａｄｆｏｒｄ）試薬を使用して、各サンプルの全タンパク質濃度を判定した（ブラットフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ），Ｍ．Ｍ．著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８〜２５４頁（１９７６年））。ＧＵＳ活性は、１分あたりのタンパク質１ｍｇあたりの４−ＭＵのナノモルとして表された。
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２株Ｔ中で、ＴＥＦ、ＧＰＤ、ＧＰＭ、ＦＢＡ、およびＦＢＡＩＮプロモーターを比較するようにデザインされた、これらの蛍光定量的アッセイの結果を図６Ａに示す。具体的にはＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で、ＦＢＡプロモーターはＧＰＤプロモーターよりも２．２倍強力であった。さらにＦＢＡＩＮプロモーターのＧＵＳ活性は、ＧＰＤプロモーターよりも約６．６倍強力であった。
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０３４株中でＴＥＦ、ＧＰＡＴ、ＹＡＴ１、およびＦＢＡＩＮプロモーターを比較するようにデザインされたこれらの蛍光定量的アッセイの結果を下の表に示す。
Figure 0005139806
細胞抽出物のＧＵＳ活性に基づいてＹＡＴ１プロモーター活性が定量化された上のデータに基づいて、ＹＡＴ１プロモーター活性は、細胞をＳＤ培地からＨＧＭに移して２４時間生育させると約３７倍増大した。ＨＧＭ中で１２０時間後、活性はいくらか低下したが、なおもＳＤ培地中での活性よりも２５倍高かった。対照的にＦＢＡＩＮプロモーターおよびＧＰＡＴプロモーター活性は、ＳＤ培地からＨＧＭに移すと２４時間でそれぞれ３０％および４０％低下した。ＴＥＦプロモーター活性は、ＨＧＭ中で２４時間時間後に２．３倍増大した。したがってＹＡＴ１プロモーターは油性条件下で誘導可能である。
ＧＵＳ発現の定量的なＰＣＲ分析によるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）プロモーターの比較分析
定量的ＰＣＲ分析によってｐＹ５−３０、ｐＹＺＧＤＧ、ｐＤＭＷ２２２、ｐＤＭＷ２１２、およびｐＤＭＷ２１４コンストラクトを含有するＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で、ＴＥＦ、ＧＰＤ、ＧＰＤＩＮ、ＦＢＡ、およびＦＢＡＩＮプロモーターの転写活性を判定した。これはＲＮＡの単離およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを必要とした。
より具体的にはｐＹ５−３０、ｐＹＺＧＤＧ、ｐＤＭＷ２２２、ｐＤＭＷ２１２、およびｐＤＭＷ２１４を含有するＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２株を単一コロニーから２５ｍＬエルレンマイアーフラスコ内の６ｍＬのＭＭ中で３０℃において１６時間生育させた。次に各６ｍＬのスターター培養を１４０ｍＬのＨＧＭを含有する個々の５００ｍＬフラスコに入れて、３０℃で４日間インキュベートした。各２４時間のインターバルで、１ｍＬの各培養を各フラスコから除去して光学濃度を測定し、２７ｍＬを除去して（上述のように）蛍光定量的ＧＵＳアッセイのために使用し、１．５ｍＬの２つのアリコートをＲＮＡ単離のために除去した。ＲＮＡ単離のための培養を遠心分離して細胞ペレットを生成した。
カリフォルニア州サンディエゴのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））からの修正キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮｅａｓｙミニプロトコルに従って、ＲＮＡをヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株から単離した。簡単に述べると、各サンプルのための各時点で、３４０μＬのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）の緩衝液ＲＬＴを使用して、２個の各細胞ペレットを再懸濁した。２本の各試験管からの緩衝液ＲＬＴ／細胞懸濁液混合物をカリフォルニア州サンディエゴのバイオ１０１（Ｂｉｏ１０１（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））からのビーズビーティング試験管内で合わせた。約５００μＬの０．５ｍＬガラスビーズを試験管に添加して、カリフォルニア州サンディエゴのバイオ１０１社（Ｂｉｏ１０１ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））からのバイオプルベライザー（ＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）中で設定５において２分間のビーズビーティングによって細胞を破壊した。次に１４，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によって破壊細胞をペレット化して、３５０μＬの上清を新しい微小遠心管に移した。各均質化した溶解産物にエタノール（３５０μＬの７０％）を添加した。穏やかな混合後、全サンプルを２ｍＬ収集試験管内のＲＮｅａｓｙミニカラムに入れた。サンプルを１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。緩衝液ＲＷ１（３５０μＬ）をＲＮｅａｓｙミニカラムに添加して、カラムを１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し細胞を洗浄した。溶出液は廃棄した。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のＤＮａｓｅ１原液（１０μＬ）を７０μＬの緩衝液ＲＤＤに添加して穏やかに混合した。この全ＤＮａｓｅ溶液をＲＮｅａｓｙミニカラムに入れて、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーションステップ後、３５０μＬの緩衝液ＲＷ１をミニカラムに添加して、カラムを１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。カラムを７００μＬの緩衝液ＲＷ１で２回洗浄した。ＲＮＡ分解酵素フリーの水（５０μＬ）をカラムに添加した。カラムを１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離してＲＮＡを溶出した。
全ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＲＮＡが最初にｃＤＮＡに転換され、次にリアルタイムＰＣＲを使用してｃＤＮＡが分析される、二段階ＲＴ−ＰＣＲプロトコルを使用した。カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））の高容量ｃＤＮＡアーカイブキット（製品番号４３２２１７１）およびフロリダ州ホリーヒルのメディアテック（Ｍｅｄｉａ Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｙ Ｈｉｌｌ、ＦＬ））からの分子生物学等級水（製品番号４６−０００−Ｃｏｎ）を使用して、ｃＤＮＡへの転換を実施した。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からの全ＲＮＡ（１００ｎｇ）を１０μＬのＲＴ緩衝液、４μＬの２５×ｄＮＴＰｓ、１０μＬの１０×ランダム六量体プライマー、５μＬのマルチスクライブ（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ）逆転写酵素、および０．００５μＬのＲＮＡ分解酵素阻害物質と合わせて、水で全反応容積を１００μＬにして、それをｃＤＮＡに転換した。反応をサーモサイクラー内で２５℃で１０分間、続いて３７℃で２時間インキュベートした。リアルタイム分析に先だってｃＤＮＡを−２０℃で保存した。
アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）からのＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミクス（製品番号４３０９１５５）を使用して、リアルタイム分析を実施した。逆転写反応（２μＬ）を１０μＬの２×ＳＹＢＲ ＰＣＲミクス、ＵＲＡ（すなわちプライマーＹＬ−ＵＲＡ−１６ＦおよびＹＬ−ＵＲＡ−７８Ｒ［配列番号１８３および１８４］）またはＧＵＳ（すなわちプライマーＧＵＳ−７６７ＦおよびＧＵＳ−８９１Ｒ［配列番号１８５および１８６］）のどちらかのための０．２μＬの１００μＭ順方向および逆方向プライマー、および７．２μＬの水に添加した。ＡＢＩ ７９００配列検出システム装置内で、反応を９５℃で１０分間、続いて９５℃で５秒間および６０℃で１分間を４０サイクルのサーモサイクルにかけた。各サイクル中の６０℃延長中に、リアルタイム蛍光データを収集した。
１０／２００１更新のアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）ユーザー公報＃２「遺伝子発現の相対定量化（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」に従ってΔΔＣＴ法を使用し、相対定量化を実施した。ＵＲＡ遺伝子をＧＵＳ発現の正規化のために使用した。正規子遺伝子としてのＵＲＡの使用を確証するために、ＧＵＳおよびＵＲＡのＰＣＲ効率を比較したところ、それぞれ１．０４および０．９９であった（１．００が１００％効率と等しい）。ＰＣＲ効率はどちらも１００％近いので、ＧＵＳ発現のための正規子としてのＵＲＡの使用が確証され、発現定量化のためのΔΔＣＴ法の使用についても同様であった。正規化した量をΔＣＴと称する。
異なる各株（すなわちｐＹＺＧＤＧ、ｐＤＭＷ２２２、ｐＤＭＷ２１２、およびｐＤＭＷ２１４コンストラクトを含有するＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２株）中のＧＵＳｍＲＮＡをｐＹ５−３０（ＴＥＦ：：ＧＵＳ）で、株のｍＲＮＡレベルに定量化した。したがって発現の相対定量化は、ＴＥＦ：：ＧＵＳを標準試料として株のｍＲＮＡレベルを使用して計算した。ＧＰＤ：：ＧＵＳ、ＧＰＤＩＮ：：ＧＵＳ、ＦＢＡ：：ＧＵＳ、およびＦＢＡＩＮ：：ＧＵＳの正規化した値をＴＥＦ：：ＧＵＳ標準の正規化した値と比較した。この量をΔΔＣＴと称する。次に式、２−ΔΔＣＴを使用して、ΔΔＣＴ値を絶対値に変換する。これらの値は、キメラＴＥＦ：：ＧＵＳ遺伝子と比べた、キメラＧＰＤ：：ＧＵＳ、ＧＰＤＩＮ：：ＧＵＳ、ＦＢＡ：：ＧＵＳ、およびＦＢＡＩＮ：：ＧＵＳ遺伝子を含んでなる株中のＧＵＳのｍＲＮＡレベルの増加倍数を指す。この方法を使用して、ＴＥＦプロモーターの活性をＧＰＤ、ＧＰＤＩＮ、ＦＢＡ、およびＦＢＡＩＮプロモーターと比較することが可能であった。
各ＧＵＳキメラ遺伝子のｍＲＮＡの相対定量化の結果を図６Ｂに示す。より具体的には、アッセイは、ＨＧＭ中で２４時間後にＦＢＡおよびＦＢＡＩＮプロモーターの転写活性が、ＴＥＦプロモーターよりもそれぞれ約３．３および６倍強力であったことを示した。同様にＧＰＤおよびＧＰＤＩＮプロモーターの転写活性は、ＴＥＦプロモーターよりもそれぞれ約２および４．４倍強力であった。ＦＢＡ：：ＧＵＳ、ＦＢＡＩＮ：：ＧＵＳ、ＧＰＤ：：ＧＵＳ、およびＧＰＤＩＮ：：ＧＵＳ遺伝子融合の転写活性が４日間の実験期間中に低下したのに対し、ＦＢＡＩＮおよびＧＰＤＩＮプロモーターの転写活性は、実験最終日においてＴＥＦプロモーターよりもなおも約３および２．６倍強力であった。
実施例２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において遺伝子転写を増大するのに有用なエンハンサーの同定
ＦＢＡＩＮおよびＧＰＤＩＮの強力なプロモーター活性（活性がＦＢＡおよびＧＰＤプロモーター活性をそれぞれ超える）、および各プロモーター領域内のイントロンの同定に基づいて、本研究を実施して各イントロン中にエンハンサーが存在するかどうかを判定した。
具体的には、ＧＰＭ：：ＦＢＡＩＮプロモーター融合およびＧＰＭ：：ＧＰＤＩＮプロモーター融合から成る２つのキメラプロモーターを発生させて、ＧＵＳレポーター遺伝子の発現を推進した。キメラプロモーター（「構成要素１」および「構成要素２」を含んでなる）については下の表１３で述べる。
Figure 0005139806
キメラプロモーターは、それぞれがプラスミドｐＤＭＷ２２４およびｐＤＭＷ２２５中のＧＵＳレポーター遺伝子の発現を推進するように配置される。
（実施例１で述べられるような）組織化学的アッセイからの結果に基づいて、ｐＹ５−３０、ｐＹＺＧＤＧ、ｐＹＺＧＭＧ、およびｐＤＭＷ２１４コンストラクトを含んでなるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中のＧＵＳ活性とｐＤＭＷ２２４およびｐＤＭＷ２２５を含んでなるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株のＧＵＳ活性とを比べることで、ＧＰＭ：：ＦＢＡＩＮプロモーターおよびＧＰＭ：：ＧＰＤＩＮプロモーターの活性をＴＥＦ、ＦＢＡＩＮ、ＧＰＤＩＮ、およびＧＰＭプロモーターと比較した。以前判定されたように、ＦＢＡＩＮプロモーターは最強のプロモーターであった。しかしキメラＧＰＭ：：ＦＢＡＩＮプロモーターおよびキメラＧＰＭ：：ＧＰＤＩＮプロモーターは、どちらもＧＰＭプロモーターよりもはるかに強力であり、ＧＰＤＩＮプロモーターと活性が同等であるように見えた。したがってこれはＧＰＤＩＮプロモーターおよびＦＢＡＩＮプロモーターの双方におけるエンハンサーの存在を立証した。
当業者はＧＰＤＩＮイントロンまたはＦＢＡＩＮイントロンのどちらかを使用して、同様のキメラプロモーターを容易に構築できるであろう。
実施例３
スルホニル尿素選択
るヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の遺伝的改善は、適切な非抗生物質選択可能形質転換マーカーの欠如によって妨げられてきた。本実施例は、一般に、半数体、二倍体、異数体または異型接合性であってもよい工業酵母株にもまた適用できる、スルホニル尿素抵抗性に基づくＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のための優勢な非抗生物質マーカーの開発について述べる。
理論および初期感度スクリーニング
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）は、分枝鎖アミノ酸の生合成経路の最初の一般的な酵素である。これはスルホニル尿素およびイミダゾリノン除草剤の標的である。したがってスルホニル尿素除草剤抵抗性は、微生物および植物の双方において報告されている。例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ＡＨＡＳ中の単一のＷ５８６Ｌ突然変異がスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性を与える（ファルコ（Ｆａｌｃｏ），Ｓ．Ｃ．、ら著、「Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」３０：１８７〜１９４頁（１９８９年）；ダグルビー（Ｄｕｇｇｌｅｂｙ），Ｒ．Ｇ．ら著、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」２７０：２８９５頁（２００３年））。
野性型ＡＨＡＳ Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０１２７７）およびＳ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ０７３４２）酵素のアミノ酸配列を比較すると、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵素の５８６位のＴｒｐアミノ酸残基は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）酵素４９７位のＴｒｐ残基と同等であった。したがって野性型細胞それ自身がスルホニル尿素に感応性であれば、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）酵素中のＷ４９７Ｌ突然変異は、おそらくスルホニル尿素除草剤抵抗性を与えると仮定される。当業者によく知られている方法を使用して、スルホニル尿素（クロリムロンエチル）は最小培地中に１００μｇ／ｍＬの濃度で、野性型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ＃２０３６２およびＡＴＣＣ＃９０８１２の生育を阻害するのに十分であることが判定された。
突然変異Ｗ４９７Ｌ ＡＨＡＳ遺伝子の合成
Ｗ４９７Ｌ突然変異（配列番号２８０）を含有するＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＨＡＳ遺伝子を二段階反応でゲノムＤＮＡから作り出した。最初にストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのＰｆｕウルトラ（商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号６００３８０）およびプライマー４１０および４１１［配列番号３６５および３６６］を使用して、ゲノムＤＮＡからＡＨＡＳ遺伝子の５’部分を増幅し、同様にプライマー４１２および４１３［配列番号３６７および３６８］を使用して遺伝子の３’部分を増幅した。２対のプライマーは、重複領域がＷ４９７Ｌ突然変異（「ＣＴ」が「ＴＧ」に変化する突然変異）を含むように重複した。
正確なサイズの５’および３’ＰＣＲ生成物をゲル精製して第２回目のＰＣＲのためのテンプレートとして使用し、プライマー４１４および４１５（配列番号３６９および３７０）および２つの主要ＰＣＲ反応からの生成物の混合物を使用して、突然変異遺伝子全体を増幅した。この突然変異遺伝子は、それ自体の天然プロモーターおよびターミネーター配列を保有した。酵素ＳａｌＩ／ＢｓｉＷＩでの消化に続いて、正確なサイズの第２回目のＰＣＲ生成物をゲル精製し、インフュージョン（ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ）技術によってプラスミドｐＹ３５［キメラＴＥＦ：：フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ（Ｆｍ２）遺伝子、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）複製起点、細菌アンピシリン抵抗性遺伝子、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｌｅｕ２遺伝子、およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律複製配列（ＡＲＳ）を含有する、さらに詳しくは国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレットを参照されたい］のベクター主鎖中にクローンした。インフュージョン（ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ）反応混合物をインヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＴＯＰ１０コンピテント（カタログ番号Ｃ４０４０−１０）細胞に形質転換した。ＬＢ／Ａｍｐプレート上で１日間の選択後、８個のコロニーをＤＮＡミニプレップによって分析した。制限酵素消化によって、７個のクローンが正しいことが立証された。スルホニル尿素抵抗性遺伝子ならびにＬＥＵ遺伝子を含有するそれらの１つを「ｐＹ５７」（または「ｐＹ５７．Ｙｌ．ＡＨＡＳ．ｗ４９７ｌ」、図７Ａ）と命名した。
標準酢酸リチウム法によって、ｐＹ５７および「空の」ＬＥＵで野性型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ＃９０８１２および＃２０３６２を形質転換した。「Ｎｏ−ＤＮＡ」を含んでなる形質転換調節もまた利用した。形質転換体をＭＭまたはＭＭ＋スルホニル尿素（ＳＵ、１００μｇ／ｍＬ）寒天プレートのどちらかの上に播種し、４日間の生育に続いてコロニーの存在または不在を評価した。
Figure 0005139806
上に示す結果に基づいて、ＡＨＡＳ Ｗ４９７ＬはＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２および＃２０３６２の双方において、良好な非抗生物質選択マーカーであった。引き続いて本出願人らは、１５０μｇ／ｍＬのスルホニル尿素濃度を使用した。この新しいマーカーは外来性遺伝子に依存しないが突然変異天然遺伝子に依存し、栄養要求性を必要とせず、また栄養要求性ももたらさないため、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を形質転換するのに有利である。除草剤はヒトおよび動物には無毒である。
突然変異ＡＨＡＳ酵素がここで述べられるのと類似の様式で作り出される場合、この選択方法は、一般に、半数体、二倍体、異数体または異型接合性であってもよいその他の工業酵母株に適用できることが期待される。
実施例４
Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路：全脂質の約１０〜１１％のＡＲＡを生成するＹ２０３４およびＹ２０４７株の創出
本実施例は、全脂質に対してそれぞれ１０および１１％のＡＲＡを生成できるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２由来のＹ２０３４およびＹ２０４７株の構築について述べる（図４）。これら株をともに遺伝子操作して、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路を発現した。したがって、Ｙ２０３４およびＹ２０４７株の完全な脂質プロフィールの分析が約２５〜２９％のＧＬＡの同時合成を示したことは、予想外のことではなかった。
Ｙ２０３４およびＹ２０４７株の開発は、まず、Ｍ４株（８％のＤＧＬＡを生成する）、の構築を要した。
総脂質の約８％のＤＧＬＡを生成するＭ４株の構築
コンストラクトｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅ（図７Ｂ、配列番号１１４）を生成して、野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子座に、４個のキメラ遺伝子（Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、および２つのＣ１８／２０エロンガーゼを含んでなる）を組み込み、それによってＤＧＬＡの生成を可能にした。ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅプラスミドは、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６ＥプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従って使用して野生型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２を形質転換した。形質転換細胞をＦＯＡ選択培地プレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。ＦＯＡ抵抗性コロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＵ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＵプレート上で生育できるが、ＭＭプレート上で生育できないコロニーをＵｒａ−株として選択した。次にＵｒａ−株の単一コロニーを３０℃の液体ＭＭＵ中に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。
細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ＤＧＬＡの存在をｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅの４個のキメラ遺伝子を含有する形質転換体中に示したが、野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）対照株中には示さなかった。選択された３２Ｕｒａ−株のほとんどは、全脂質の約６％のＤＧＬＡを生成した。全脂質の約８％のＤＧＬＡを生成する２つの株（すなわち株Ｍ４および１３−８）があった。
全脂質の約１０％のＡＲＡを生成するＹ２０３４およびＹ２０４７株の創出
コンストラクトｐＤＭＷ２３２（図７Ｃ、配列番号１１５）およびｐＤＭＷ２７１（図７Ｄ、配列番号１１６）を生成して、２つまたは３ついずれかのΔ５キメラ遺伝子をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｐｙｔｉｃａ）Ｍ４株Ｌｅｕ２遺伝子にそれぞれ組み込んだ。
ｐＤＭＷ２３２およびｐＤＭＷ２７１プラスミドは、それぞれ表１６および１７に説明される、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
Figure 0005139806
ｐＤＭＷ２３２およびｐＤＭＷ２７１プラスミドをそれぞれＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＭ４株を別々に形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭＬｅプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。ＭＭＬｅプレート上に生育した各形質転換からの個々のコロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＬｅプレート上に画線培養した。ＭＭＬｅプレート上で生育できるが、ＭＭプレート上で生育できないコロニーをＬｅｕ２−株として選択した。次にＬｅｕ２−株の単一コロニーを３０℃の液体ＭＭＬｅ培地中に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ＡＲＡの存在をｐＤＭＷ２３２およびｐＤＭＷ２７１形質転換体中に示したが、親Ｍ４株中には示さなかった。具体的には４８個の選択されたｐＤＭＷ２３２によるＬｅｕ２−形質転換体の内、３４株が組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の全脂質の５％未満のＡＲＡを生成し、１１株が６〜８％のＡＲＡを生成し、３株が約１０％のＡＲＡを生成した。１０％のＡＲＡを生成する株の１つを「Ｙ２０３４」と命名した。
一方、４８個の選択されたｐＤＭＷ２７１によるＬｅｕ２−形質転換体の内、３５株が組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の全脂質の５％未満のＡＲＡを生成し、１２株が６〜８％のＡＲＡを生成し、１株が約１１％のＡＲＡを生成した。１１％のＡＲＡを生成する株を「Ｙ２０４７」と命名した。
実施例５
Ｕｒａ−遺伝子型を有し、全脂質の４５％のＬＡを生成する中間体株Ｙ２０３１の創出
野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株ＡＴＣＣ＃２０３６２のＵｒａ３遺伝子座へのプラスミドｐＫＵＮＴ２（図８Ａ）のＴＥＦ：：Ｙ．Δ１２：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子の組み込みによって、Ｙ２０３１株を生成し、それによって、Ｕｒａ−遺伝子型を生成した。
具体的には、プラスミドｐＫＵＮＴ２は、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
ｐＫＵＮＴ２プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従って使用して野生型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｐｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株を形質転換した。形質転換細胞をＦＯＡ選択培地プレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。ＦＯＡ抵抗性コロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＵ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＵプレート上で生育できたがＭＭプレート上では生育できなかったコロニーを、Ｕｒａ−株として選択した。次いでＵｒａ−株のシングルコロニー（５）を３０℃の液体ＭＭＵ中に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、野生型ＡＴＣＣ＃２０３６２での約２０％のＬＡと比較して、２つのＵｒａ−株（すなわち、株＃２および＃３）では約４５％のＬＡがあったことを示した。形質転換株＃２を「Ｙ２０３１」株と命名した。
実施例６
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子の合成および機能的発現
国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレットで述べられるのと同様にして、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）のΔ９エロンガーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３９０１７４）のコドン使用頻度を最適化した。具体的には、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン、ＡＴＧ翻訳開始コドン周辺の共通配列、およびＲＮＡ安定性の一般法則（グハニヨギ（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ），Ｇ．およびＪ．ブルーアー（Ｂｒｅｗｅｒ）、「ジーン（Ｇｅｎｅ）」２６５（１〜２）：１１〜２３頁（２００１年））に従って、Ｉ．ガルバナ（ｇａｌｂａｎａ）遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号３９）に基づいて、コドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子（配列番号４１）をデザインした。翻訳開始部位の修正に加えて７９２ｂｐのコード領域の１２６ｂｐを修正し、１２３コドンを最適化した。コドン最適化遺伝子中のいずれの修正もコードされるタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３９０１７４、配列番号４０）を変化させなかった。
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ためのコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子のインビトロ合成
コドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子を次のようにして合成した。最初に、８組のオリゴヌクレオチドをデザインし、Ｉ．ガルバナ（ｇａｌｂａｎａ）Δ９エロンガーゼ遺伝子のコドン最適化コード領域（例えばＩＬ３−１Ａ、ＩＬ３−１Ｂ、ＩＬ３−２Ａ、ＩＬ３−２Ｂ、ＩＬ３−３Ａ、ＩＬ３−３Ｂ、ＩＬ３−４Ａ、ＩＬ３−４Ｂ、ＩＬ３−５Ａ、ＩＬ３−５Ｂ、ＩＬ３−６Ａ、ＩＬ３−６Ｂ、ＩＬ３−７Ａ、ＩＬ３−７Ｂ、ＩＬ３−８Ａ、およびＩＬ３−８Ｂ、配列番号１８７〜２０２に対応する）の全長を延長した。各５’−末端の４ｂｐのオーバーハングを除いて、センス（Ａ）およびアンチセンス（Ｂ）オリゴヌクレオチドの各対は相補的であった。さらに引き続くサブクローニングのために、プライマーＩＬ３−１Ｆ、ＩＬ３−４Ｒ、ＩＬ３−５Ｆ、およびＩＬ３−８Ｒ（配列番号２０３〜２０６）にもまた、それぞれＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ、およびＮｏｔ１制限部位を導入した。
５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのスペルミジン、０．５ｍＭのＡＴＰ、および１０ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０μｌの容積で、各オリゴヌクレオチド（１００ｎｇ）を３７℃で１時間リン酸化した。以下のパラメーターーを使用して、サーモサイクラー内でセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの各対を混合しアニールした。９５℃（２分間）、８５℃（２分間）、６５℃（１５分間）、３７℃（１５分間）、２４℃（１５分間）および４℃（１５分間）。このようにＩＬ３−１Ａ（配列番号１８７）をＩＬ３−１Ｂ（配列番号１８８）にアニールし、二本鎖生成物「ＩＬ３−１ＡＢ」を生成した。同様にＩＬ３−２Ａ（配列番号１８９）をＩＬ３−２Ｂ（配列番号１９０）にアニールして、二本鎖生成物「ＩＬ３−２ＡＢ」などを生成した。
次に下に示すように、アニールされた二本鎖オリゴヌクレオチドの２つの別々のプールを共にライゲートした。プール１（ＩＬ３−１ＡＢ、ＩＬ３−２ＡＢ、ＩＬ３−３ＡＢ、およびＩＬ３−４ＡＢを含んでなる）、およびプール２（ＩＬ３−５ＡＢ、ＩＬ３−６ＡＢ、ＩＬ３−７ＡＢ、およびＩＬ３−８ＡＢを含んでなる）。アニールされたオリゴヌクレオチドの各プールを２０μｌの容積で、１０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼと共に混合し、ライゲーション反応を１６℃で一晩インキュベートした。
次に各ライゲーション反応の生成物をテンプレートとして使用し、デザインされたＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。具体的には、ライゲートした「プール１」混合物（すなわちＩＬ３−１ＡＢ、ＩＬ３−２ＡＢ、ＩＬ３−３ＡＢ、およびＩＬ３−４ＡＢ）をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＩＬ３−１ＦおよびＩＬ３−４Ｒ（配列番号２０３および２０４）をプライマーとして使用し、コドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子の第１の部分をＰＣＲによって増幅した。一般方法で述べられるようにして、５０μｌの全容積でＰＣＲ増幅を実施した。増幅を次のようにして実施した。９５℃で３分間の初期変性、続いて９５℃で１分間、５６℃で３０秒間、７２℃で４０秒間を３５サイクル。７２℃で１０分間の最終延長サイクルを実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。４１７ｂｐのＰＣＲ断片をプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター中にサブクローニングして、ｐＴ９（１−４）を発生させた。
ライゲートした「プール２」混合物（すなわちＩＬ３−５ＡＢ、ＩＬ３−６ＡＢ、ＩＬ３−７ＡＢ、およびＩＬ３−８ＡＢ）をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＩＬ３−５ＦおよびＩＬ３−８Ｒ（配列番号２０５および２０６）をプライマーとして使用して、コドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子の第２の部分を同様にＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローニングして、ｐＴ９（５−８）を発生させた。
大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）をｐＴ９（１−４）およびｐＴ９（５−８）で別々に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン抵抗性形質転換体から単離した。プラスミドＤＮＡを精製し、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化して、ｐＴ９（１−４）の４１７ｂｐのＮｃｏＩ／ＰｓｔＩ断片（配列番号２０７）、およびｐＴ９（５−８）の３７７ｂｐのＰｓｔＩ／Ｎｏｔ１断片（配列番号２０８）を遊離した。次にこれらの２つの断片を組み合わせて、Ｎｃｏ１／Ｎｏｔ１で消化したｐＺＵＦ１７（配列番号１１８、図８Ｂ）と共に一方向性にライゲートして、ｐＤＭＷ２３７（図８Ｃ、配列番号１１９）を発生させた。得られたｐＤＭＷ２３７中の合成Δ９エロンガーゼ遺伝子（「ＩｇＤ９ｅ」）のＤＮＡ配列は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の最初にデザインされたコドン最適化遺伝子（すなわち配列番号４１）と全く同じであった。
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子の発現
一般方法で述べられるようにして、キメラＦＢＡＩＮ：：ＩｇＤ９ｅ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる自律複製プラスミドであるコンストラクトｐＤＭＷ２３７（図８Ｃ）をＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０３１株（実施例４）に形質転換した。ｐＤＭＷ２３７によるＹ２０３１の３つの形質転換体をＭＭ培地中で２日間にわたり個別に生育させ、細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ結果は、これらのｐＤＭＷ２３７による形質転換体中に、約７．１％、７．３％、および７．４％のＥＤＡがそれぞれ生成されたことを示した。これらのデータは、合成コドン最適化ＩｇＤ９ｅが、Ｃ１８：２をＥＤＡに変換できることを実証した。コドン最適化遺伝子の「パーセント（％）基質変換」は、約１３％と判定された。
実施例７
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるコドン最適化Δ８デサチュラーゼ遺伝子の合成
国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレットおよび実施例６（前出）で述べられるのと同様にして、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）のΔ８デサチュラーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＤ４５８７７）のコドン使用頻度を最適化した。３個の異なるコドン最適化遺伝子（すなわち「Ｄ８Ｓ−１」、「Ｄ８Ｓ−２」、および「Ｄ８Ｓ−３」）の合成にもかかわらず、いずれの遺伝子もＥＤＡをＤＧＬＡに不飽和化できなかった。したがって以前公開されたΔ８デサチュラーゼ配列は不正確であり、ｍＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、およびＰＣＲに続いて、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）からΔ８デサチュラーゼを直接単離することが必要であると仮定された。この結果、２つの同様の配列が得られ、本明細書でＥｇ５（配列番号４４および４５）およびＥｇ１２（配列番号４６および４７）と同定された。
遺伝子をサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母発現ベクター中にクローニングし、基質供給トライアルを行って、各遺伝子配列の機能分析を実施した。Ｅｇ５およびＥｇ１２のどちらもＥＤＡおよびＥＴｒＡをＤＧＬＡおよびＥＴＡにそれぞれ不飽和化できたが、Ｅｇ５はＥｇ１２よりも顕著に大きな活性を有した。
Ｅｇ５の立証されたΔ８デサチュラーゼ活性に基づいて、配列をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化し、それによって「Ｄ８ＳＦ」（配列番号４８および４９）と命名された合成機能性コドン最適化Δ８デサチュラーゼの合成をもたらした。
コドン最適化Δ８デサチュラーゼ遺伝子の予備的インビトロ合成
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン（国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺の共通配列、およびＲＮＡ安定性の一般法則（グハニヨギ（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ），Ｇ．およびＪ．ブルーアー（Ｂｒｅｗｅｒ）、「ジーン（Ｇｅｎｅ）」２６５（１〜２）：１１〜２３頁（２００１年））に従って、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）の公開配列（配列番号４２および４３）に基づいて、コドン最適化Δ８デサチュラーゼ遺伝子（「Ｄ８Ｓ−１」と命名された、配列番号２０９）をデザインした。翻訳開始部位の修正に加えて１２６０ｂｐのコード領域の２００ｂｐ（１５．９％）を修正した。第２のアミノ酸を「Ｋ」から「Ｅ」に変化させてＮｃｏＩ部位を翻訳開始コドン周辺に付加させたことを除いて、コドン最適化遺伝子中のいずれの修正もコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４３）を変化させなかった。
具体的には、コドン最適化Δ８デサチュラーゼ遺伝子を次のようにして合成した。最初に１３組のオリゴヌクレオチドをデザインして、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ遺伝子のコドン最適化コード領域（例えばＤ８−１Ａ、Ｄ８−１Ｂ、Ｄ８−２Ａ、Ｄ８−２Ｂ、Ｄ８−３Ａ、Ｄ８−３Ｂ、Ｄ８−４Ａ、Ｄ８−４Ｂ、Ｄ８−５Ａ、Ｄ８−５Ｂ、Ｄ８−６Ａ、Ｄ８−６Ｂ、Ｄ８−７Ａ、Ｄ８−７Ｂ、Ｄ８−８Ａ、Ｄ８−８Ｂ、Ｄ８−９Ａ、Ｄ８−９Ｂ、Ｄ８−１０Ａ、Ｄ８−１０Ｂ、Ｄ８−１１Ａ、Ｄ８−１１Ｂ、Ｄ８−１２Ａ、Ｄ８−１２Ｂ、Ｄ８−１３Ａ、およびＤ８−１３Ｂ、配列番号２１０〜２３５に対応する）の全長を延長した。各５’−末端の４ｂｐのオーバーハングを除いて、センス（Ａ）およびアンチセンス（Ｂ）オリゴヌクレオチドの各組は相補的であった。さらに引き続くサブクローニングのために、プライマーＤ８−１Ａ、Ｄ８−３Ｂ、Ｄ８−７Ａ、Ｄ８−９Ｂ、およびＤ８−１３Ｂ（配列番号２１０、２１５、２２２、２２７、および２３５）もまた、ＮｃｏＩ、ＢｇｌＩＩ、Ｘｈｏ１、ＳａｃＩ、およびＮｏｔ１制限部位にそれぞれ導入された。
実施例６で述べられるようにして、オリゴヌクレオチド（各１００ｎｇ）をリン酸化し、次に各センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの対を混合し、共にアニールした［例えばＤ８−１Ａ（配列番号２１０）をＤ８−１Ｂ（配列番号２１１）にアニールして二本鎖生成物「Ｄ８−１ＡＢ」を生成し、Ｄ８−２Ａ（配列番号２１２）をＤ８−２Ｂ（配列番号２１３）にアニールして二本鎖生成物「Ｄ８−２ＡＢ」などを生成した］。
次にアニールされた二本鎖オリゴヌクレオチドの４つの別個のプールを以下に示すように共にライゲートした。プール１（Ｄ８−１ＡＢ、Ｄ８−２ＡＢ、およびＤ８−３ＡＢを含んでなる）、プール２（Ｄ８−４ＡＢ、Ｄ８−５ＡＢ、およびＤ８−６ＡＢを含んでなる）、プール３（Ｄ８−７ＡＢ、Ｄ８−８ＡＢ、およびＤ８−９ＡＢを含んでなる）、およびプール４（Ｄ８−１０ＡＢ、Ｄ８−１１ＡＢ、Ｄ８−１２ＡＢ、およびＤ８−１３ＡＢを含んでなる）。アニールされたオリゴヌクレオチドの各プールを２０μｌの容積で１０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼと共に混合し、ライゲーション反応を１６℃で一晩インキュベートした。
次に各ライゲーション反応の生成物をテンプレートとして使用し、デザインされたＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。具体的には、ライゲートした「プール１」混合物（すなわちＤ８−１ＡＢ、Ｄ８−２ＡＢ、およびＤ８−３ＡＢ）をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＤ８−１ＦおよびＤ８−３Ｒ（配列番号２３６および２３７）をプライマーとして使用して、コドン最適化Δ８デサチュラーゼ遺伝子の第１の部分をＰＣＲによって増幅した。実施例６で述べられるようにして５０μｌの全容積でＰＣＲ増幅を実施した。３０９ｂｐのＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中にサブクローニングしてｐＴ８（１−３）を発生させた。
ライゲートした「プール２」混合物（すなわちＤ８−４ＡＢ、Ｄ８−５ＡＢ、およびＤ８−６ＡＢ）をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＤ８−４ＦおよびＤ８−６Ｒ（配列番号２３８および２３９）をプライマーとして使用して、コドン最適化Δ８デサチュラーゼ遺伝子の第２の部分をＰＣＲによって同様に増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローニングしてｐＴ８（４−６）を発生させた。ライゲートした「プール３」混合物（すなわちＤ８−７ＡＢ、Ｄ８−８ＡＢ、およびＤ８−９ＡＢ）をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＤ８−７ＦおよびＤ８−９Ｒ（配列番号２４０および２４１）をプライマーとして使用して、コドン最適化Δ８デサチュラーゼ遺伝子の第３の部分をＰＣＲによって同様に増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローニングしてｐＴ８（７−９）を発生させた。最後に「プール４」ライゲーション混合物（すなわちＤ８−１０ＡＢ、Ｄ８−１１ＡＢ、Ｄ８−１２ＡＢ、およびＤ８−１３ＡＢ）をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＤ８−１０ＦおよびＤ８−１３Ｒ（配列番号２４２および２４３）をプライマーとして使用して、コドン最適化Δ８デサチュラーゼ遺伝子の第４の部分をＰＣＲによって同様に増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローニングしてｐＴ８（１０−１３）を発生させた。
大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）をｐＴ８（１−３）、ｐＴ８（４−６）、ｐＴ８（７−９）、およびｐＴ８（１０−１３）で別々に形質転換して、アンピシリン抵抗性形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡを精製し、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化して、ｐＴ８（１−３）（配列番号２４４）の３０９ｂｐのＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片、ｐＴ８（４−６）（配列番号２４５）の３２１ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ断片、ｐＴ８（７−９）（配列番号２４６）の２６４ｂｐのＸｈｏＩ／ＳａｃＩ断片、およびｐＴ８（１０−１３）（配列番号２４７）の３６９ｂｐのＳａｃ１／Ｎｏｔ１断片を遊離した。次にこれらの断片を組み合わせて、Ｎｃｏ１／Ｎｏｔ１消化ｐＹ５４ＰＣ（配列番号１２０、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレット）と共に一方向性にライゲートして、ｐＤＭＷ２４０（図８Ｄ）を発生させた。これによってｐＤＭＷ２４０中に合成Δ８デサチュラーゼ遺伝子（「Ｄ８Ｓ−１」、配列番号２０９）が得られた。
公開されたミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）のΔ８デサチュラーゼアミノ酸配列（配列番号４３）と比較して、Ｄ８Ｓ−１の第２のアミノ酸では、ＮｃｏＩ部位を翻訳開始コドン周辺に付加するために「Ｋ」を「Ｅ」に変化させた。ｐＤＭＷ２４０をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＯＤＭＷ３９０およびＯＤＭＷ３９１（配列番号２４８および２４９）をプライマーとして使用して、インビトロ変異誘発によって（カリフォルニア州（ＣＡ）サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）のストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、公開されたミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ配列（配列番号４３）と全く同じアミノ酸配列を有する合成遺伝子の別のバージョンを構築した。得られたプラスミドをｐＤＭＷ２５５と命名した。ｐＤＭＷ２５５中の合成Δ８デサチュラーゼ遺伝子を「Ｄ８Ｓ−２」と命名し、アミノ酸配列は配列番号４３で記載される配列と全く同じであった。
非機能性コドン最適化Δ８デサチュラーゼ遺伝子
一般方法で述べられるようにして、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ＃７６９８２（Ｌｅｕ−）をＤＭＷ２４０（図８Ｄ）およびｐＤＭＷ２５５でそれぞれ形質転換した。組換えコンストラクトを含有する酵母をＥＤＡ［２０：２（１１，１４）］で栄養強化されたＭＭ中で生育させた。具体的には、ｐＤＭＷ２４０（Ｄ８Ｓ−１を含有する）またはｐＤＭＷ２５５（Ｄ８Ｓ−２を含有する）のどちらかを含有する形質転換体Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の単一コロニーを３ｍＬのＭＭ中でＯＤ６００約１．０に３０℃で生育させた。次に基質供給のために、１０μｇのＥＤＡ基質を含有する３ｍＬのＭＭ中で、１００μｌの細胞を３０℃で約２４時間継代培養した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
どちらの形質転換体もＥＤＡからＤＧＬＡを生成しなかったので、Ｄ８Ｓ−１およびＤ８Ｓ−２は機能性でなく、ＥＤＡを不飽和化できなかった。キメラＤ８Ｓ−１：：ＸＰＲおよびＤ８Ｓ−２：：ＸＰＲ遺伝子は、それぞれ配列番号２５０および２５１で示される。
ＧｅｎＢａｎｋ（登録番号ＡＡＤ４５８７７［配列番号４３］）に寄託されたΔ８デサチュラーゼのタンパク質配列、および国際公開第００／３４４３９号パンフレットまたはウォーリス（Ｗａｌｌｉｓ）ら、アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジオロジー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ）、３６５：３０７〜３１６頁（１９９９年））（本明細書での配列番号２５２）の間に、３個のアミノ酸の違いが見いだされた。具体的にはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＤ４５８７７には、３個のアミノ酸が欠落しているように見えた。ｐＤＭＷ２５５をテンプレートとして、ＯＤＭＷ３９２およびＯＤＭＷ３９３（配列番号２５３および２５４）をプライマーとして使用して、インビトロ変異誘発（カリフォルニア州（ＣＡ）サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）のストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））によって９ｂｐを合成Ｄ８Ｓ−２遺伝子に付加することで、国際公開第００／３４４３９号パンフレットおよびウォーリス（Ｗａｌｌｉｓ）ら（前出）（配列番号２５２）で述べられる配列と同一のタンパク質を生成した。得られたプラスミドをｐＤＭＷ２６１と称した。ｐＤＭＷ２６１中の合成Δ８デサチュラーゼ遺伝子を「Ｄ８Ｓ−３」（配列番号２５５）と命名した。ｐＤＭＷ２６１コンストラクトのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中への形質転換に続いて、上述のようにＥＤＡを使用して同様の供給実験を行った。Ｄ８Ｓ−３では、ＥＤＡのＤＧＬＡへの不飽和化は観察されなかった。
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ遺伝子の単離
ミシガン州イーストランシングのミシガン州立大学のリチャード・トリーマー（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｔｒｉｅｍｅｒ）博士の研究室からミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）を得た。１０ｍＬの活発に生育する培養から、１ｍＬのアリコートを５００ｍＬガラスびん中の２５０ｍＬのミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）（Ｅｇ）培地に移した。９７０ｍＬの水中で１ｇの酢酸ナトリウム、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの１ｇの牛肉エキス（カタログ番号Ｕ１２６−０１）、ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの２ｇのバクト（Ｂａｃｔｏ）（登録商標）トリプトン（カタログ番号０１２３−１７−３）、およびディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの２ｇのバクト（Ｂａｃｔｏ）（登録商標）酵母抽出物（カタログ番号０１２７−１７−９）を合わせてＥｇ培地を作製した。フィルター滅菌後、ノースカロライナ州バーリントンのカロライナ・バイオロジカル・サプライ・カンパニー（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）からの３０ｍＬの土壌上清（Ｓｏｉｌ−Ｗａｔｅｒ Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）（カタログ番号１５−３７９０）を無菌的に添加して最終的なＥｇ培地を生成した。ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）培養物を２３℃で１６時間の照明、８時間の暗黒サイクルで撹拌せずに２週間生育させた。
２週間後、脂質分析のために１０ｍＬの培養を取り除いて１，８００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットを水で１度洗浄し、再遠心分離した。得られたペレットを真空下で５分間乾燥させ、１００μＬの水酸化トリメチルスルホニウム（ＴＭＳＨ）に再懸濁し、振盪しながら室温で１５分間インキュベートした。その後、０．５ｍＬのヘキサンを添加して、バイアルを振盪しながら室温で１５分間インキュベートした。脂肪酸メチルエステル（ヘキサン層から注入された５μＬ）を分離して、スペルコ社（Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｉｎｃ．）からのオメガワックス（Ｏｍｅｇａｗａｘ）３２０融解石英キャピラリーカラム（カタログ番号２４１５２）を装着したヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ガスクロマトグラフを使用して定量化した。オーブン温度をプログラムして２２０℃に２．７分間保ち、２０℃／分で２４０℃に上昇させて、次にさらに２．３分間保った。ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）水素発生器によってキャリアガスを供給した。ヌチェック・プレップ社（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．）から市販される標準メチルエステル（カタログ番号Ｕ−９９−Ａ）と滞留時間を比較して、得られたクロマトグラムを図９に示す。
１，８００×ｇで１０分間の遠心分離によって残った２週間培養物（２４０ｍＬ）をペレット化し、水で１度洗浄して再遠心分離した。テキサス州フレンズウッドのテル−テスト社（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ））からのＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０（商標）試薬を使用して、提供された製造業者のプロトコル（５ｍＬの試薬を使用してＲＮＡを０．５ｍＬの水に溶解）に従って、得られたペレットから全ＲＮＡを抽出した。このようにして、ペレットから１ｍｇの全ＲＮＡ（２ｍｇ／ｍＬ）を得た。ニュージャージー州ピスカタウェイのアマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））からのｍＲＮＡ精製キットを使用して、提供された製造業者のプロトコルに従って、１ｍｇの全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離した。このようにして８５μｇのｍＲＮＡを得た。
カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標） Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのｃＤＮＡ合成用スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）（商標）選択システムを使用して、製造業者のプロトコルに従って、提供されるオリゴ（ｄＴ）プライマーによって、７６５ｎｇのｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを２０μＬの水に溶解した。
下で述べられる条件を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーＥｇ５−１およびＥｇ３−３（配列番号２５６および２５７）で、ｃＤＮＡからミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼを増幅した。具体的には、ｃＤＮＡ（１μＬ）を５０ピコモルのＥｇ５−１、５０ピコモルのＥｇ５−１、ウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からの１μＬのＰＣＲヌクレオチドミクス（１０ｍＭ）、インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液、インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの１．５μＬのＭｇＣｌ２（５０ｍＭ）、インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの０．５μＬのＴａｑポリメラーゼと合わせ、水で５０μＬにした。反応条件は９４℃で３分間、続いて９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間および７２℃で１分間を３５サイクルであった。ＰＣＲを７２℃で７分間で終了し、次に４℃に保った。５μＬに対するアガロースゲル電気泳動法によってＰＣＲ反応を分析し、分子量１．３ｋＢ前後のＤＮＡバンドが観察された。残る４５μＬの生成物をアガロースゲル電気泳動法によって分離して、カリフォルニア州オレンジのザイモリサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））からのザイモクリーン（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ）（商標）ゲルＤＮＡ回収キットを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＤＮＡバンドを精製した。得られたＤＮＡを製造業者のプロトコルに従って、プロメガプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔイージーベクター中にクローニングした。Ｔ７、Ｍ１３−２８Ｒｅｖ、Ｅｇ３−２、およびＥｇ５−２（それぞれ配列番号２５８〜２６１）を使用して複数クローンを配列決定した。
このようにして、数ｂｐのみが異なるＥｇ５（配列番号４４）およびＥｇ１２（配列番号４６）の２つのクラスのＤＮＡ配列が得られた。Ｅｇ５およびＥｇ１２の翻訳からは、それぞれ配列番号４５および４７の１個のアミノ酸のみが異なる、タンパク質配列が生じた。したがってＥｇ５のＤＮＡおよびタンパク質配列はそれぞれ配列番号４４および配列番号４５で記載され、Ｅｇ１２のＤＮＡおよびタンパク質配列はそれぞれ配列番号４６および配列番号４７で記載される。
単離されたミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ配列と公開されたミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ配列との比較
配列番号４５（Ｅｇ５）および配列番号４７（Ｅｇ１２）に記載されるタンパク質配列とＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＤ４５８７７（ｇｉ：５６３９７２４、本明細書での配列番号４３）からのタンパク質配列、およびウォーリス（Ｗａｌｌｉｓ）ら、アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジオロジー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）、３６５：３０７〜３１６頁（１９９９年）、国際公開第００／３４４３９号パンフレット）［本明細書での配列番号２５２］の公開されたタンパク質配列とのアラインメントを図１０に示す。４つの全配列で保存されたアミノ酸をアステリスク（＊）で示した。ダッシュは、プログラムによって配列の整列化を最大化するために使用された。推定上のチトクロームｂ５領域には下線を引いた。推定上のＨｉｓ ｂｏｘを太字で示す。％同一性の計算からは、Ｅｇ５Δ８デサチュラーゼタンパク質の配列が配列番号４３と９５．５％同一であり、配列番号２５２と９６．２％同一であることが明らかになり、ここで「％同一性」とは２つのタンパク質間で同一のアミノ酸の百分率として定義される。アラインメントおよび％同一性の計算は、ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのレーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクス計算スイートのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して実施した。配列の多重整列化は、デフォルトパラメーターー（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）のクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）アラインメント法（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、「コンピューター・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシーズ（ＣＡＢＩＯＳ）」．５：１５１〜１５３頁（１９８９年））を使用して実施した。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を使用したペアワイズアラインメントのデフォルトパラメーターーは、ＫＴＵＰＬＥ １、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５であった。様々なミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ配列間の違いのより完全な分析については、同時係属米国特許出願第１１／１６６９９３号を参照されたい。
サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ配列の機能分析
酵母エピソームのプラスミド（ＹＥｐ）−タイプベクターｐＲＳ４２５（クリスチャンソン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ）ら、「ジーン（Ｇｅｎｅ）」、１１０：１１９〜２２頁（１９９２年））は、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２μ内在性プラスミドからの配列、ＬＥＵ２選択マーカー、および多官能性ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋の主鎖ベースの配列を含有する。ジア（Ｊｉａ）ら、「フィジオロジカル・ゲノミクス（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」、３：８３〜９２頁（２０００年）で述べられるのと同様にして、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の強力な構成グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーターをｐＲＳ４２５のＳａｃＩＩとＳｐｅＩ部位の間でクローニングして、ｐＧＰＤ−４２５を生成した。ＮｏｔＩ部位をｐＧＰＤ−４２５のＢａｍＨＩ部位に導入し（したがってＢａｍＨＩ部位が側面にあるＮｏｔＩ部位を生成する）、それによってプラスミドｐＹ−７５をもたらした。ＮｏｔＩで消化して、Ｅｇ５（配列番号４４）およびＥｇ１２（配列番号４６）を上述のｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔイージーベクターから放出し、ｐＹ−７５のＮｏｔＩ部位中にクローニングして、ｐＹ８９−５（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−６０４８として寄託した）およびｐＹ８９−１２をそれぞれ生成した。このようにしてΔ８デサチュラーゼ（すなわちＥｇ５［配列番号４４］およびＥｇ１２［配列番号４６］）をＳ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現のための強力な構成プロモーターの後方でクローニングした。ｐＹ８９−５のマップを図８Ｅに示す。
標準酢酸リチウム形質転換手順を使用して、プラスミドｐＹ８９−５、ｐＹ８９−１２、およびｐＹ−７５をサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４１（ＡＴＣＣ＃２０１３８８）に形質転換した。カリフォルニア州カールズバッドのキュビオジーン（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのＣＳＭ−ｌｅｕで栄養強化されたＤＯＢＡ培地上で、形質転換体を選択した。各プレートからの形質転換体をキュビオジーン（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）からのＣＳＭ−ｌｅｕで栄養強化された２ｍＬのＤＯＢ培地中に接種し、３０℃で１日間生育させ、その後０．５ｍＬを１ｍＭのＥＤＡまたはＥｔｒＡのどちらかで栄養強化された同一培地に移した。これらを２５０ｒｐｍ、３０℃で一晩インキュベートして、遠心分離によってペレットを得て真空下で乾燥させた。ペレットを５０μＬのＴＭＳＨでエステル交換して、一般方法で述べられるようにしてＧＣによって分析した。ｐＹ−７５（すなわちクローン７５−１および７５−２）およびｐＹ８９−５（すなわちクローン５−６−１および５−６−２）の２つのクローンをそれぞれ分析する一方、２つの独立した形質転換からのｐＹ８９−１２の２揃いのクローン（すなわちクローン１２−８−１、１２−８−２、１２−９−１、および１２−９−２）を分析した。
ＥＤＡを供給されたクローンのＧＣ分析によって得られた脂質プロフィールを表１９に示す。ＥｔｒＡを供給されたクローンのＧＣ分析によって得られた脂質プロフィールを表２０に示す。脂肪酸は１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、２０：２［ＥＤＡ］、２０：３（８，１１，１４）［ＤＧＬＡ］、２０：３（１１，１４，１７）［ＥＴｒＡ］および２０：４（８，１１，１４，１７）［ＥＴＡ］と同定され、それぞれの組成は全脂肪酸の％として表される。
Figure 0005139806
Figure 0005139806
表１９および２０中のデータは、クローニングされたミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ）Δ８デサチュラーゼがＥＤＡおよびＥｔｒＡを不飽和化できたことを示した。配列番号４７で記載される配列は、配列番号４５で記載される配列と比べて１個のアミノ酸変化を有し、低下したΔ８デサチュラーゼ活性を有する。
表２０中のクローン７５−２によって発生した少量の２０：４（８，１１，１４，１７）は、２０：４（８，１１，１４，１７）の標準とは、わずかに異なる滞留時間を有した。このピークは、この実験中の野生型酵母によって発生した少量の異なる脂肪酸である可能性が高い。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のためにコドンの最適化されたΔ８デサチュラーゼ遺伝子さらなる修正
ｐＤＭＷ２６１中の合成Ｄ８Ｓ−３遺伝子のアミノ酸配列は、機能性ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ）Δ８デサチュラーゼ（配列番号４４および４５）のアミノ酸配列に従って補正した。ｐＤＭＷ２６１をテンプレートとして、およびオリゴヌクレオチドＯＤＭＷ４０４（配列番号２６２）およびＤ８−１３Ｒ（配列番号２４３）を使用して、合成Ｄ８Ｓ−３デサチュラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ断片をバイオ１０１（Ｂｉｏ１０１）のジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）キットで精製し、引き続いてＫｐｎ１およびＮｏｔ１で消化した（プライマーＯＤＭＷ４０４がＫｐｎＩ部位を導入したのに対し、プライマーＤ８−１３ＲはＮｏｔＩ部位を導入した）。Ｋｐｎ１／Ｎｏｔ１断片（配列番号２６３）をＫｐｎ１／Ｎｏｔ１消化ｐＫＵＮＦｍＫＦ２（図１１Ａ、配列番号１２１）中にクローニングして、ｐＤＭＷ２７７を生成した（図１１Ｂ）。
ｐＤＭＷ２７７がテンプレートとして使用される別のＰＣＲ反応において、Ｄ８Ｓ−３遺伝子の５’末端を増幅し補正するようにデザインされたオリゴヌクレオチドＹＬ５２１およびＹＬ５２２（配列番号２６４および２６５）をプライマーとして使用した。プライマーはそれぞれ５’および３’末端で、ＰＣＲ断片中のＮｃｏ１部位およびＢｇｌＩＩ部位に導入された。３１８ｂｐＰＣＲ生成物をバイオ１０１（Ｂｉｏ１０１）のジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）キットで精製し、引き続いてＮｃｏ１およびＢｇｌＩＩで消化した。消化断片をｐＤＭＷ２７７からの９５４ｂｐＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片と共に使用して、ｐＺＦ５Ｔ−ＰＰＣのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片と交換し（図１１Ｃ、配列番号１２２）、ｐＤＭＷ２８７を形成した。合成Ｄ８Ｓ−３遺伝子の５’末端を補正するのに加えて、このクローニング反応はまた、合成Δ８デサチュラーゼ遺伝子をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮプロモーター（配列番号１６２）の制御下に置いた。
次に部位特異的変異誘発反応の最終シリーズの第１の反応をｐＤＭＷ２８７で行った。第１の一揃いのプライマーであるＹＬ５２５およびＹＬ５２６（配列番号２６６および２６７）は、ｐＤＭＷ２８７中の合成Ｄ８Ｓ−３遺伝子のアミノ酸をＦからＳ（５０位）に補正するようにデザインされた。次にこの変異誘発反応から得られたプラスミドが、プライマーＹＬ５２７およびＹＬ５２８（配列番号２６８および２６９）による次の部位特異的変異誘発反応のためのテンプレートになった。これらのプライマーは、Ｄ８Ｓ−３遺伝子のアミノ酸をＦからＳ（６７位）に補正するようにデザインされ、プラスミドｐＤＭＷ２８７／ＹＬ５２７の創生をもたらした。
遺伝子の第２の四半分内の配列補正を完了するために、遺伝子の第１の四半分に対する突然変異と同時に、以下の反応を実施した。ｐＤＭＷ２８７をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＹＬ５２９およびＹＬ５３０（配列番号２７０および２７１）をプライマーとして使用して、インビトロ変異誘発反応を実施して、合成Ｄ８Ｓ−３遺伝子のアミノ酸をＣからＷ（１７７位）に補正した。プライマーＹＬ５３１およびＹＬ５３２（配列番号２７２および２７３）を使用する以下の反応において、この変異誘発反応の生成物（すなわちｐＤＭＷ２８７／Ｙ５２９）をテンプレートとして使用して、アミノ酸をＰからＬ（２１３位）に補正した。この反応生成物をｐＤＭＷ２８７／ＹＬ５２９−３１と称した。
遺伝子の第１および第２の四半分に対する突然変異と同時に、遺伝子の３’末端上で反応を同様に実施した。引き続く各変異誘発反応では、先行する反応からのプラスミド生成物を使用した。プライマーＹＬ５３３およびＹＬ５３４（配列番号２７４および２７５）をｐＤＭＷ２８７上で使用して、アミノ酸をＣからＳ（２４４位）に補正し、ｐＤＭＷ２８７／ＹＬ５３３を作り出した。プライマーＹＬ５３５およびＹＬ５３６（配列番号２７６および２７７）を使用して、ｐＤＭＷ２８７／ＹＬ５３３の合成Ｄ８Ｓ−３遺伝子中のアミノ酸をＡからＴ（２８０位）に補正して、ｐＤＭＷ２８７／ＹＬ５３３−５を形成した。最後にｐＤＭＷ２８７／ＹＬ５３３−５をテンプレートとして、ＹＬ５３７およびＹＬ５３８（配列番号２７８および２７９）をプライマーとして使用して、合成Ｄ８Ｓ−３遺伝子中で３３３位のアミノ酸ＰをＳに補正した。得られたプラスミドをｐＤＭＷ２８７／ＹＬ５３３−５−７と命名した。
ｐＤＭＷ２８７／ＹＬ５２９−３１のＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ断片およびｐＤＭＷ２８７／ＹＬ５３３−５−７のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ断片を使用して、ｐＤＭＷ２８７／ＹＬ２５７のＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片を変化させて、完全に補正された合成Δ８デサチュラーゼ遺伝子を含有するｐＤＭＷ２８７Ｆを生成し（図１１Ｄ）、Ｄ８ＳＦと命名して配列番号４８で記載した。配列番号４９は、配列番号４８のヌクレオチド２〜１２７０によってコードされるアミノ酸配列を記載し、開始メチオニンに続いて追加的バリンがあること以外は、これは配列番号４５で記載される配列と本質的に同一である。
実施例８
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子およびコドン最適化Δ８デサチュラーゼの機能発現
本実施例は、形質転換されて、実施例６および７からのコドン最適化Δ９エロンガーゼおよびコドン最適化Δ８デサチュラーゼを同時発現するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における、ＤＧＬＡ生合成および蓄積について述べる。これによってこの実験は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を発現する遺伝子の活性およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の能力の双方を立証した。
具体的にはコンストラクトｐＤＭＷ２８７ＦのキメラＦＢＡＩＮ：：Ｄ８ＳＦ：：Ｐｅｘ１６遺伝子を含んでなるＣｌａＩ／ＰａｃＩ断片（実施例７）をｐＤＭＷ２３７のＣｌａＩ／ＰａｃＩ部位に挿入し（実施例６）、コンストラクトｐＤＭＷ２９７（図１１Ｅ、配列番号１２３）を発生させた。
プラスミドｐＤＭＷ２９７は、以下の構成要素を含有した。
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次に一般方法に従って、コンストラクトｐＤＭＷ２９７をＹ２０３１株（実施例５）の形質転換のために使用した。形質転換細胞をＭＭ選択培地プレート上に播種し、２〜３日間３０℃に保った。ＭＭプレート上に生育した全部で８つの形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。生育したらこれらの株を３０℃の液体ＭＭ中に個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ＤＧＬＡが分析した全ての形質転換体中で生成されたことを示した。１株は約３．２％を生成し、４株は４．３〜４．５％を生成し、２株は５．５〜５．８％を生成し、１株は６．４％のＤＧＬＡを生成した（本明細書で「Ｙ０４８９」株と命名した）。コドン最適化Ｙ０４８９株中のＤ８ＳＦ遺伝子の「パーセント（％）基質変換」は７５％と判定された。
実施例９
Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路：全脂質の約１４％のＡＲＡを生成するＹ２２１４株の創出
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来して、全脂質に対して１４％のＡＲＡを生成できるＹ２２１４株の構築について述べる（図４）。この株は遺伝子操作されて、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を発現した。したがって最終ＡＲＡ含有油中でＧＬＡの同時合成を示さないＹ２２１４株の完全な脂質プロフィールの分析が期待された。
本明細書でのＹ２２１４株の開発は、Ｙ２１５２およびＹ２１５３株（約３．５％のＤＧＬＡを生成する）、Ｙ２１７３およびＹ２１７５株（１４〜１６％のＤＧＬＡを生成する）、およびＹ２１８３および２１８４株（５％のＡＲＡを生成する）の構築を要した。
全脂質の約３．５％のＤＧＬＡを生成するＹ２１５２およびＹ２１５３株の創出
コンストラクトｐＺＰ２Ｃ１６Ｍ８９９（図１２Ａ、配列番号１２４）を使用して、４個のキメラ遺伝子のクラスター（２つのΔ９エロンガーゼ、合成Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ、およびΔ８デサチュラーゼを含んでなる）、ならびに単一アミノ酸突然変異を含有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＨＡＳ遺伝子（アセトヒドロキシ酸シンターゼ）を組み込んだ。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の突然変異ＡＨＡＳ酵素は、スルホニル尿素抵抗性を与え、それを陽性スクリーニングマーカーとして使用した。プラスミドｐＺＰ２Ｃ１６Ｍ８９９は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＰｏｘ２遺伝子部位に組み込まれるようにデザインされたので、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
プラスミドｐＺＰ２Ｃ１６Ｍ８９９をＳｐｈＩ／ＡｓｃＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＡＴＣＣ＃２０３６２を形質転換した。形質転換に続いて細胞を１５０ｍｇのスルホニル尿素を含有するＭＭプレート上に播種し、３０℃に２〜３日間保った。スルホニル尿素抵抗性コロニーを拾って、スルホニル尿素添加ＭＭ選択プレート上に画線培養した。次に全部で９６個の形質転換体をスルホニル尿素添加液体ＭＭ中に接種し、３０℃および２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ｐＺＰ２Ｃ１６Ｍ８９９の４個のキメラ遺伝子を含有する形質転換体中にＤＧＬＡの存在を示したが、野性型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）対照株中には示さなかった。選択された９６株のほとんどは、全脂質の２％未満のＤＧＬＡを生成した。全脂質の２〜２．９％のＤＧＬＡを生成した２８株があった。全脂質の約３．５％のＤＧＬＡを生成した２株があった。株＃６５および＃７３を本明細書で「Ｙ２１５２」および「Ｙ２１５３」株とそれぞれ命名した。
全脂質の約１４〜１６％のＤＧＬＡを生成するＹ２１７３およびＹ２１７５株の創出
コンストラクトｐＤＭＷ３１４（図１２Ｂ、配列番号１２５）を使用して、４個のキメラ遺伝子のクラスター（２つのΔ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、およびΔ１２デサチュラーゼを含んでなる）をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ２１５２およびＹ２１５３株のＵｒａ３遺伝子部位中に組み込み、それによってＤＧＬＡ生成を増強した。プラスミドｐＤＭＷ３１４は、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
プラスミドｐＤＭＷ３１４をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２１５２およびＹ２１５３株を形質転換した。形質転換細胞をＦＯＡ選択培地プレート上に播種し、３０℃に２〜３日間保った。ＦＯＡ抵抗性コロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＵ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＵプレート上で生育できるがＭＭプレート上では生育できないコロニーをＵｒａ−株として選択した。次にＵｒａ−株の単一コロニーを液体ＭＭＵ中に接種し、３０℃および２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ｐＤＭＷ３１４の４つのキメラ遺伝子を含有するほとんど全ての形質転換体において、ＤＧＬＡの生成増大を示した。４８個の選択されたｐＤＭＷ３１４によるＹ２１５２のＵｒａ−株のほとんどは、全脂質の約６〜８％のＤＧＬＡを生成した。全脂質の約１３．９％のＤＧＬＡを生成した１株（すなわち＃４７、本明細書で「Ｙ２１７３」と命名される）があった。
２４個の選択されたｐＤＭＷ３１４によるＹ２１５３のＵｒａ−株のほとんどは、全脂質の約６〜８％のＤＧＬＡを生成した。全脂質の約１６．３％および１７．２％のＤＧＬＡをそれぞれ生成した２株があった（すなわち＃６および＃１１、本明細書で「Ｙ２１７５」および「Ｙ２１７６」株と命名される）。
全脂質の約５％のＡＲＡを生成するＹ２１８３およびＹ２１８４株の創出
コンストラクトｐＤＭＷ３２２（図１２Ｃ、配列番号１２６）を使用して、２個のキメラΔ５デサチュラーゼ遺伝子のクラスターをヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ２１７３およびＹ２１７５株のＬｅｕ２遺伝子部位中に組み込み、それによってＡＲＡの生成を可能にした。プラスミドｐＤＭＷ３２２は、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
プラスミドｐＤＭＷ３２２をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＹ２１７３およびＹ２１７５株を別々に形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭＬｅプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。各形質転換体からＭＭＬｅプレートに生育する個々のコロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＬｅプレート上に画線培養した。ＭＭＬｅプレート上で生育できるが、ＭＭプレート上で生育できないコロニーをＬｅｕ２−株として選択した。次にＬｅｕ２−株の単一コロニーを３０℃の液体ＭＭＬｅ培地中に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ｐＤＭＷ３２２形質転換体中にＡＲＡの存在を示したが、親Ｙ２１７３およびＹ２１７５株中には示さなかった。具体的には４８個の選択されたｐＤＭＷ３２２によるＹ２１７３のＬｅｕ２−形質転換体の内、ほとんどの株が全脂質の４．４％未満のＡＲＡを生成した。しかし、それぞれ全脂質の約４．５％および５．８％のＡＲＡを生成した２つの株（すなわち＃１および＃４２、本明細書で「Ｙ２１８１」および「Ｙ２１８２」と命名される）があった。
並行して、４８個の選択されたｐＤＭＷ３２２によるＹ２１７５のＬｅｕ２−形質転換体の内、ほとんどの株が全脂質の４．５％未満のＡＲＡを生成した。遺伝子操作されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）において、それぞれ全脂質の約４．９％、４．６％および４．７％のＡＲＡを生成した３つの株（すなわち＃２２、＃４２および＃４７、ここで「Ｙ２１８３」、「Ｙ２１８４」および「Ｙ２１８５」と命名される）があった。
全脂質の約１４％のＡＲＡを生成するＹ２２１４株の創出
コンストラクトｐＺＫＳＬ５５９８（図１２Ｄ、配列番号１２７）を使用して、４個のキメラ遺伝子のクラスター（Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、および２つのΔ５デサチュラーゼを含んでなる）をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ２１８３およびＹ２１８５株のＬｙｓ５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９）部位に組み込み、それによってＡＲＡ生成を増強した。プラスミドｐＺＫＳＬ５５９８は、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
プラスミドｐＺＫＳＬ５５９８をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＹ２１８３およびＹ２１８４株を別々に形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭＬｙｓプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。各形質転換からＭＭＬｙｓプレート上に生育した個々のコロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＬｙｓプレート上に画線培養した。ＭＭＬｙｓプレート上で生育できたが、ＭＭプレート上では生育できないコロニーをＬｙｓ−株として選択した。次にＬｙｓ−株の単一コロニーを液体ＭＭＬｙｓ培地中に接種して、３０℃および２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ｐＺＫＳＬ５５９８形質転換体におけるＡＲＡの生成増大を示した。４８個の選択されたｐＺＫＳＬ５５９８によるＹ２１８３のＬｙｓ−形質転換体の内、ほとんどの株は全脂質の４〜９．５％のＡＲＡを生成した。全脂質の約９．９％、１０．３％および９．６％のＡＲＡをそれぞれ生成した３つの株（すなわち＃７、＃１２および＃３７、本明細書で「Ｙ２２０９」、「Ｙ２２１０」および「Ｙ２２１１」と命名される）があった。
４８個の選択されたｐＺＫＳＬ５５９８によるＹ２１８４のＬｙｓ−形質転換体の内、ほとんどの株は全脂質の４〜１１％のＡＲＡを生成した。全脂質の約１１．９％および１４％のＡＲＡをそれぞれ生成した３つの株（すなわち＃３および＃２２、本明細書で「Ｙ２２１３」および「Ｙ２２１４」と命名される）があった。
実施例１０
全脂質の約１４％のＥＰＡを生成する中間体株Ｙ２０６７Ｕの創出
本実施例は、全脂質に対して顕著な濃度のＥＰＡを生成できるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２由来のＹ２０６７Ｕ株の構築について述べる（図４）。実施例１４、１５、１６、および２１（下記）でそれぞれ述べられるようにして、ＴＡＧ含量および／または組成の分析に基づいて、このＥＰＡ生成株でＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ１、ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２遺伝子過剰発現、およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＣＰＴ１遺伝子の過剰発現の効果を調べた。
Ｙ２０６７Ｕ株（１４％のＥＰＡを生成する）の開発は、本明細書でＭ４株（８％のＤＧＬＡを生成し、実施例４で述べられている）、Ｙ２０３４株（１０％のＡＲＡを生成し、実施例４で述べられている）、Ｅ株（１０％のＥＰＡを生成する）、ＥＵ株（１０％のＥＰＡを生成する）、およびＹ２０６７株（１５％のＥＰＡを生成する）の構築を要した。
遺伝子操作されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）において全脂質の約１０％のＥＰＡを生成するＥ株の創出
コンストラクトｐＺＰ３Ｌ３７（図１３Ａ、配列番号１２８）を作り出して、３個の合成Δ１７デサチュラーゼキメラ遺伝子を、実施例４で述べられたＹ２０３４株のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ３遺伝子中に組み込んだ。プラスミドｐＺＰ３Ｌ３７は、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
プラスミドｐＺＰ３Ｌ３７をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＹ２０３４株を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。ＭＭプレート上に生育した全部で４８個の形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。生育したらこれらの株を３０℃の液体ＭＭ中に個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ＥＰＡの存在をｐＺＰ３Ｌ３７によるほとんどの形質転換体中に示したが、親株（すなわちＹ２０３４）中には示さなかった。４８個の選択されたｐＺＰ３Ｌ３７による形質転換体中に、組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の全脂質の２％未満のＥＰＡを生成した１８株、２〜３％のＥＰＡを生成した１４株、約７％のＥＰＡを生成した１株があった。
一般方法で述べられるように「二段階生育条件」（すなわち４８時間のＭＭ、７２時間のＨＧＭ）を使用して株を培養した後に、７％のＥＰＡを生成した株をさらに分析した。ＧＣ分析は遺伝子操作された株が二段階生育後に全脂質の約１０％のＥＰＡを生成したことを示した。株を「Ｅ」株と命名した。
Ｕｒａ−表現型による全脂質の約１０％のＥＰＡを生成するＥＵ株の創出
５−ＦＯＡ抵抗性であるＥ株の突然変異細胞を同定して、ＥＵ（Ｕｒａ−）株を作り出した。具体的にはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｅ株細胞の１ループを３ｍＬのＹＰＤ培地中に接種して、２５０ｒｐｍ／分で振盪しながら３０℃で２４時間生育させた。培養をＹＰＤでＯＤ６０００．４に希釈して、次にさらに４時間インキュベートした。培養をＭＭ＋ＦＯＡプレート上に播種（１００μｌ／プレート）して、３０℃に２〜３日間保った。全部で１６個のＦＯＡ抵抗性コロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭ＋ＦＯＡ選択プレート上に画線培養した。これらから、ＦＯＡ選択プレート上で生育したが、ＭＭプレートでは生育しない１０個のコロニーが、可能なＵｒａ−株として選択された。
これらの株の１つをキメラＧＰＤ：：フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５：：ＸＰＲ２遺伝子、および選択マーカーとしてＵｒａ３遺伝子を含んでなるｐＹ３７／Ｆ１５での形質転換のための宿主として使用した（図１３Ｂ、配列番号１２９）。ＭＭプレート上での３日間の選択後、数百のコロニーがプレート上に生育し、プラスミドを持たない形質転換対照のコロニーの生育はなかった。この実験によって、５−ＦＯＡ抵抗性宿主株がＵｒａ−であることが実証され、この株を「ＥＵ」株と命名した。次にＥＵ株の単一コロニーを０．１ｇ／Ｌのウリジンをさらに含有する液体ＭＭＵ中に接種して、２５０ｒｐｍ／分で振盪しながら３０℃で２日間培養した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。ＧＣ分析は、ＥＵ株が全脂質の約１０％のＥＰＡを生成したことを示した。
全脂質の約１５％のＥＰＡを生成するＹ２０６７株の創出
プラスミドｐＫＯ２ＵＦ２ＰＥ（図１３Ｃ、配列番号１３０）を作り出して、（異種性Δ１２デサチュラーゼおよびＣ１８／２０エロンガーゼを含んでなる）２つのキメラ遺伝子を含有するクラスターおよびＵｒａ３遺伝子をＥＵ株の天然ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子に組み込んだ。プラスミドｐＫＯ２ＵＦ２ＰＥは、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
プラスミドｐＫＯ２ＵＦ２ＰＥをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＥＵ株を形質転換した（ただしＥＵ株はＹＰＤプレート上に画線培養し、形質転換緩衝液中への懸濁に先だって［１８時間に対して］およそ３６時間生育させた）。形質転換に続いて細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。ＭＭプレート上に生育した全部で７２個の形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。生育したらこれらの株を３０℃の液体ＭＭ中に個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ｐＫＯ２ＵＦ２ＰＥによるほとんど全ての形質転換体においてＥＰＡの存在を示した。より具体的には７２個の選択された形質転換体中に、遺伝子操作されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の全脂質の８〜９．９％のＥＰＡを生成した１７株、１０〜１０．９％のＥＰＡを生成した２７株、１１〜１１．９％のＥＰＡを生成した１６株、１２〜１２．７％のＥＰＡを生成した７株があった。１２．７％のＥＰＡを生成した株を一般方法で述べられるように（すなわち４８時間のＭＭ、７２時間のＨＧＭ）二段階生育条件を使用してさらに分析した。ＧＣ分析は、遺伝子操作された株が二段階生育後、全脂質の約１５％のＥＰＡを生成したことを示した。株を「Ｙ２０６７」株と命名した。
Ｕｒａ−表現型による全脂質の約１４％のＥＰＡを生成するＹ２０６７Ｕ株の創出
Ｙ２０６７株中のＵｒａ３遺伝子を中断するために、コンストラクトｐＺＫＵＴ１６（図１３Ｄ、配列番号１３１）を作り出して、ＴＥＦ：：ｒＥＬＯ２Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子をＹ２０６７株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。ｒＥＬＯ２Ｓは、１６：０を１８：０に延長するラット肝酵素（すなわちＣ１６／１８エロンガーゼ）をコードする、コドン最適化ｒＥＬＯ遺伝子である。プラスミドｐＺＫＵＴ１６は、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
プラスミドｐＺＫＵＴ１６をＳａｌＩ／ＰａｃＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＹ２０６７株を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。
ＭＭ＋５−ＦＯＡプレートプレート上に生育した全部で２４個の形質転換体を拾って、ＭＭプレートおよびＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に別個に再度画線培養した。ＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレート上で生育できるが、ＭＭプレートでは生育できない株をＵｒａ−株として選択した。全部で１０個のＵｒａ−株を個別に３０℃の液体ＭＭＵ中に接種して、２５０ｒｐｍ／分で振盪しながら１日間生育させた。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ＭＭＵ培地中での１日間の生育後に、ｐＺＫＵＴ１６による全ての形質転換体中に５〜７％のＥＰＡの存在を示した。６．２％のＥＰＡを生成した株を二段階生育条件（すなわち４８時間のＭＭ、９６時間のＨＧＭ）を使用してさらに分析した。ＧＣ分析は、遺伝子操作された株が全脂質の約１４％のＥＰＡを生成したことを示した。株を「Ｙ２０６７Ｕ」株と命名した。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に関するこの株の最終遺伝子型は以下のとおりであった。Ｕｒａ３−、Ｐｏｘ３−、Ｙ．Δ１２−、ＦＢＡ：：Ｆ．Δ１２：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：Ｆ．Δ１２：：Ｐｅｘ２０、ＴＥＦ：：Δ６Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮ：：Ｅ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＡＴ：：Ｅ１Ｓ：：Ｏｃｔ、ＴＥＦ：：Ｅ２Ｓ：：Ｘｐｒ、ＦＢＡＩＮ：：Δ５：：Ｐｅｘ２０、ＴＥＦ：：Δ５：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮ：：Δ１７Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：Δ１７Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＴＥＦ：：Δ１７Ｓ、およびＴＥＦ：：ｒＥＬＯ２Ｓ：：Ｐｅｘ２０。
実施例１１
全脂質の１６％のＥＰＡを生成する中間体株Ｙ２１０７Ｕ１の創出
本実施例は、全脂質に対して顕著な濃度のＥＰＡ生成できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２由来のＹ２１０７Ｕ１株の構築について述べる（図４）。実施例１７（下記）で述べられるようにして、ＴＡＧ含量および／または組成の分析に基づいて、このＥＰＡ生成株でＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴ遺伝子過剰発現の効果を調べた。
Ｙ２１０７Ｕ１株（１６％のＥＰＡを生成し、Ｕｒａ−表現型を有する）の開発は、Ｍ４株（８％のＤＧＬＡを生成し、実施例４で述べられる）、Ｙ２０４７株（１１％のＡＲＡを生成し、実施例４で述べられる）、Ｙ２０４８株（１１％のＥＰＡを生成する）、Ｙ２０６０株（１３％のＥＰＡを生成する）、Ｙ２０７２株（１５％のＥＰＡを生成する）、Ｙ２０７２Ｕ１株（１４％のＥＰＡを生成する）、およびＹ２０８９（１８％のＥＰＡを生成する）の構築を本明細書では要した。
全脂質の約１１％のＥＰＡ生成するＹ２０４８株の創出
コンストラクトｐＺＰ３Ｌ３７（図１３Ａ、配列番号１２８、実施例１０）を利用して、３つの合成Δ１７デサチュラーゼキメラ遺伝子をＹ２０４７株のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ３遺伝子に組み込んだ（実施例４）。具体的には、プラスミドｐＺＰ３Ｌ３７をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＹ２０４７株を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。ＭＭプレート上で生育した全部で９６個の形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。生育したらこれらの株を３０℃の液体ＭＭ中に個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ＥＰＡの存在をｐＺＰ３Ｌ３７による形質転換体のほとんどで示したが、親株（すなわち、Ｙ２０４７株）中には示さなかった。９６個の選択されたｐＺＰ３Ｌ３７による形質転換体中に、組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の全脂質の２％未満のＥＰＡを生成した２０株、２〜３％のＥＰＡを生成した２３株、３〜４％のＥＰＡを生成した５株、約６％のＥＰＡを生成した２株（すなわち株＃７１および株＃９４）があった。
株＃７１（６％のＥＰＡを生成した）を二段階生育条件（すなわち４８時間のＭＭ、７２時間のＨＭＧ）で培養して、さらに分析した。ＧＣ分析は、株＃７１が全脂質の約１１％のＥＰＡを生成したことを示した。株を「Ｙ２０４８」と命名した。
Ｕｒａ−表現型による全脂質の約１３％のＥＰＡを生成するＹ２０６０株の創出
Ｙ２０４８株中のＵｒａ３遺伝子を中断するために、コンストラクトｐＺＫＵＴ１６（図１３Ｄ、配列番号１３１、実施例１０）を利用して、ＴＥＦ：：ｒＥＬＯ２Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子をＹ２０４８株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。具体的にはプラスミドｐＺＫＵＴ１６をＳａｌＩ／ＰａｃＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＹ２０４８株を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレート上に播種し、３０℃に２〜３日間保った。
ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に生育した全ての４０形質転換体を拾って、ＭＭプレートおよびＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上にそれぞれ再度画線培養した。ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で生育できるが、ＭＭプレート上では生育できない株をＵｒａ−株として選択した。これらの４０個の各Ｕｒａ−株を液体ＭＭＵ中に個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分間で振盪しながら３０℃で２日間生育させた。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ＭＭＵ培地中での２日間の生育後に、全脂質の５％未満のＥＰＡを生成した１４株、５〜５．９％のＥＰＡを生成した９株、６〜６．９％のＥＰＡを生成した１５株、７〜８％のＥＰＡを生成した７株があったことを示した。７〜８％のＥＰＡを生成した株を二段階生育条件（すなわち４８時間のＭＭ、９６時間のＨＧＭ）を使用して、さらに分析した。ＧＣ分析は、これらの全ての株が１０％を超えるＥＰＡを生成したことを示し、それらの１つは総脂質の約１３％のＥＰＡを生成した。この株を「Ｙ２０６０」株と命名した。
全脂質の約１５％のＥＰＡを生成するＹ２０７２株の創出
コンストラクトｐＫＯ２ＵＭ２５Ｅ（図１４Ａ、配列番号１３２）を使用して、３個のキメラ遺伝子のクラスター（Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、およびΔ５デサチュラーゼを含んでなる）およびＵｒａ３遺伝子をＹ２０６０株の天然ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子部位に組み込んだ。プラスミドｐＫＯ２ＵＭ２５Ｅは、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
プラスミドｐＫＯ２ＵＭ２５ＥをＳｐｈＩ／ＡｓｃＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＹ２０６０を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。
ＭＭプレート上に生育した全部で６３個の形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。生育したら、これらの株を３０℃の液体ＭＭ中に個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分間で振盪しながら２日間培養した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ＭＭ培地中での１日間の生育後に、ｐＫＯ２ＵＭ２５Ｅによる形質転換体のほとんど全てでＥＰＡの存在を示した。６３個の選択された形質転換体中に、６〜８．９％のＥＰＡを生成した２６株、９％を超えるＥＰＡを生成した４６株があった。二段階生育条件（すなわち４８時間のＭＭ、９６時間のＨＧＭ）を使用したさらなる分析のために、９％を超えるＥＰＡを生成した株を選択した。ＧＣ分析は二段階生育後に、４６個の選択された株の内４５個が全脂質の１１〜１４．５％のＥＰＡを生成し、一方培養＃２は１５．１％のＥＰＡを生成したことを示した。この株（すなわち＃２）を「Ｙ２０７２」株と命名した。
Ｕｒａ−表現型による全脂質の約１４％のＥＰＡを生成するＹ２０７２Ｕ１株の創出
コンストラクトｐＺＫＵＧＰＩ５Ｓ（図１４Ｂ、配列番号１３３）を作り出し、ＧＰＡＴ：：Ｉ．Δ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子をＹ２０７２株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。より具体的にはプラスミドｐＺＫＵＧＰＩ５Ｓは、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
プラスミドｐＺＫＵＧＰＩ５ＳをＳａｌＩ／ＰａｃＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＹ２０７２株を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレート上に播種し、３０℃に３〜４日間保った。
ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に生育した全部で２４個の形質転換体を拾って、ＭＭプレートおよびＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に別々に再度画線培養した。ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で生育できるがＭＭプレート上では生育できない株をＵｒａ−株として選択した。これらの２４個の各Ｕｒａ−株を液体ＭＭＵ中に個別に接種し、２５０ｒｐｍ／分間で振盪しながら３０℃で２日間生育させた。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ＭＭＵ中での２日間の生育後に、全脂質の７．３〜８．９％のＥＰＡを生成した８株、９〜９．９％のＥＰＡを生成した１４株、１０．５％のＥＰＡを生成した１株（すなわち＃１）、１０．７％のＥＰＡを生成した１株（すなわち＃２３）があったことを示した。二段階生育条件（すなわち４８時間のＭＭ、９６時間のＨＧＭ）を使用して、株＃１および＃２３をさらに分析した。ＧＣ分析は、これらの２つの株が二段階生育後に全脂質の約１４％のＥＰＡを生成したことを示した。株＃１を株「Ｙ２０７２Ｕ１」と命名した。
全脂質の約１８％のＥＰＡを生成するＹ２０８９株の創出
コンストラクトｐＤＭＷ３０２Ｔ１６（図１４Ｃ、配列番号１３４）を作り出して、４個のキメラ遺伝子のクラスター（Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ６デサチュラーゼ、およびΔ１２デサチュラーゼを含んでなる）およびＵｒａ３遺伝子をＹ２０７２Ｕ１株のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）リパーゼ１遺伝子部位に組み込んだ。プラスミドｐＤＭＷ３０２Ｔ１６は、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
プラスミドｐＤＭＷ３０２Ｔ１６をＳｐｈＩ／ＡｓｃＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＹ２０７２Ｕ１株を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭプレート上に播種し、３０℃に３〜４日間保った。ＭＭプレート上に生育した全部で４８個の形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。生育したらこれらの株を液体ＭＭ中に個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分で振盪しながら３０℃で２日間生育させた。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ＭＭ培地中での２日間の生育後に、ｐＤＭＷ３０２Ｔ１６によるＹ２０７２Ｕ１の形質転換体のほとんど全てでＥＰＡが生成されたことを示した。４８個の選択された形質転換体中に、１０％未満のＥＰＡを生成した２７株、１０〜１２．９％のＥＰＡを生成した１４株、１３〜１３．９％のＥＰＡを生成した５株があった。二段階生育手順（すなわち４８時間のＭＭ、９６時間のＨＧＭ）を使用したさらになる分析のために、株＃３４（１３．９％のＥＰＡを生成する）を選択した。ＧＣ分析は、株＃３４が全脂質の約１８％のＥＰＡを生成したことを示した。株＃３４を「Ｙ２０８９」株と命名した。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対するＹ２０８９株の遺伝子型は、次のとおりであった。Ｐｏｘ３−、ＬＩＰ１−、Ｙ．Δ１２−、ＦＢＡ：：Ｆ．Δ１２：：Ｌｉｐ２、ＴＥＦ：：Ｆ．Δ１２：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＭΔ１２：：Ｐｅｘ２０、ＴＥＦ：：Δ６Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮ：：Δ６Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮ：：Ｅ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＡＴ：：Ｅ１Ｓ：：Ｏｃｔ、ＧＰＤＩＮ：：Ｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＴＥＦ：：Ｅ２Ｓ：：Ｘｐｒ、ＦＢＡＩＮ：：ＭＡΔ５：：Ｐｅｘ２０、ＴＥＦ：：ＭＡΔ５：：Ｌｉｐ１、ＴＥＦ：：ＨΔ５Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＴＥＦ：：ＩΔ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＡＴ：：ＩΔ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：Δ１７Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：Δ１７Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＴＥＦ：：Δ１７Ｓ：：Ｐｅｘ１６、および２Ｘ ＴＥＦ：：ｒＥＬＯ２Ｓ：：Ｐｅｘ２０。
Ｕｒａ−表現型による全脂質の約１６％のＥＰＡ生成するＹ２１０７Ｕ１株の創出
コンストラクトｐＺＫＵＧＰＥ１Ｓ（図１４Ｄ、配列番号１３５）を作り出して、ＧＰＡＴ：：ＥＬ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子をＹ２０８９株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。より具体的にはプラスミドｐＺＫＵＧＰＥ１Ｓは、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
プラスミドｐＺＫＵＧＰＥ１ＳをＰｓｔＩ／ＰａｃＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＹ２０８９株を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレート上に播種し、３０℃に３〜４日間保った。
ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に生育した全部で８個の形質転換体を拾って、ＭＭプレートおよびＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に別々に再度画線培養した。ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で生育できるがＭＭプレート上では生育できない株をＵｒａ−株として選択した。これらの８個の各Ｕｒａ−株を液体ＭＭＵ中に個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分間で振盪しながら３０℃で２日間生育させた。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ＭＭＵ中での２日間の生育後に全脂質の６．６〜８．７％のＥＰＡを生成する６株、および９．４〜１０％のＥＰＡ（すなわち＃４および＃５）を生成する２株があったことを示した。二段階生育条件（すなわち４８時間のＭＭ、９６時間のＨＧＭ）を使用して、株＃４および＃５をさらに分析した。ＧＣ分析はこれらの２つの株が二段階生育後、全脂質の約１６％のＥＰＡを生成したことを示した。株＃４を「Ｙ２１０７Ｕ１」株と命名し、株＃５を「Ｙ２１０７Ｕ２」株と命名した。
実施例１２
全脂質の約９〜１２％のＥＰＡを生成する中間体株ＭＵの創出
本実施例は、全脂質に対して顕著な濃度のＥＰＡを生成できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２由来のＭＵ株の構築について述べる（図４）。実施例２４（下記）で述べられるようにして、ＴＡＧ含量および／または組成分析に基づいて、このＥＰＡ生成株中で、様々な天然Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）アシルトランスフェラーゼノックアウトの効果を調べた。
ＭＵ株の開発（ここで９−１２％のＥＰＡを生成）は、Ｍ４株（８％のＤＧＬＡを生成し、実施例１０で述べられる）、Ｙ２０３４株（１０％のＡＲＡを生成し、実施例４で述べられる）、Ｅ株（１０％のＥＰＡを生成し、実施例４で述べられる）、ＥＵ株（１０％のＥＰＡを生成し、実施例１０で述べられる）、および株Ｍ２６（１４％のＥＰＡを生成する）の構築を要した。
全脂質の１４％のＥＰＡを生成するＭ２６株の創出
コンストラクトｐＫＯ２ＵＭ２６Ｅ（配列番号１３６、図１５Ａ）を使用して、３個のキメラ遺伝子のクラスター（Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ６デサチュラーゼ、およびΔ１２デサチュラーゼを含んでなる）およびＵｒａ３遺伝子をＥＵ株（実施例１０）のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子部位に組み込んだ。プラスミドｐＫＯ２ＵＭ２６Ｅは、以下の構成要素を含有した。
Figure 0005139806
プラスミドｐＫＯ２ＵＭ２６ＥをＳｐｈＩ／ＡｓｃＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＥＵ株（実施例１０）を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。
ＭＭプレート上に生育した全部で４８個の形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。生育したらこれらの株を３０℃の液体ＭＭ中に個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分で振盪しながら１日間生育させた。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ＭＭ培地中での１日間の生育後に、ｐＫＯ２ＵＭ２６Ｅでの形質転換体のほとんど全てでＥＰＡが生成されたことを示した。４８個の選択された形質転換体中では、遺伝子操作されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中で５株が全脂質の４％未満のＥＰＡを生成し、２３株が４〜５．９％のＥＰＡを生成し、９株が６〜６．９％のＥＰＡを生成し、１１株が７〜８．２％のＥＰＡを生成した。二段階生育手順（すなわち４８時間のＭＭ、９６時間のＨＧＭ）を使用したさらなる分析のために、８．２％のＥＰＡを生成した株を選択した。ＧＣ分析は、遺伝子操作された株が全脂質の約１４％のＥＰＡを生成したことを示した。株を「Ｍ２６」株と命名した。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対するＭ２６株の遺伝子型は次のとおり。Ｐｏｘ３−、Ｙ．Δ１２−、ＦＢＡ：：Ｆ．Δ１２：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮ：：ＭΔ１２：：Ｐｅｘ２０、ＴＥＦ：：Δ６Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮ：：Δ６Ｂ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：Ｅ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＡＴ：：Ｅ１Ｓ：：Ｘｐｒ、ＴＥＦ：：Ｅ２Ｓ：：Ｘｐｒ、ＦＢＡＩＮ：：ＭＡΔ５：：Ｐｅｘ２０、ＴＥＦ：：ＭＡΔ５：：Ｌｉｐ１、ＴＥＦ：：ＨΔ５Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：Δ１７Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：Δ１７Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＴＥＦ：：Δ１７Ｓ：：Ｐｅｘ１６、およびＴＥＦ：：ｒＥＬＯ２Ｓ：：Ｐｅｘ２０。
全脂質の１４％のＥＰＡを生成するＭＵ株の創出
ＭＵ株は、株Ｍ２６のＵｒａ栄養要求株である。この株は、ＰａｃＩおよびＨｉｎｃＩＩで消化された５μｇのプラスミドｐＺＫＵＭ（配列番号１３７）で、Ｍ２６株を形質転換して作られた。カリフォルニア州オレンジのザイモリサーチ社（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））からのフローズン（Ｆｒｏｚｅｎ）−ＥＺ酵母形質転換キットを使用して形質転換を実施し、以下の培地を含む寒天プレート上に１００μＬの形質転換された細胞ミクスを播種して、形質転換体を選択した。６．７ｇ／Ｌのミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの酵母菌窒素ベース、２０ｇ／Ｌのデキストロース、５０ｍｇ／Ｌのウラシル、および８００ｍｇ／ＬのＦＯＡ。７日後に小型コロニーが出現し、それをＭＭおよびＭＭＵ寒天プレート上に播種した。全てＵＲＡ栄養要求株であった。株の１つを「ＭＵ」と命名した。
実施例１３
モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製
本実施例は、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）（ＡＴＣＣ＃１６２６６）からのゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製について述べる。これは実施例１４、１５、１６、１７、および１８でそれぞれ述べられるように、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ２、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、ＧＰＡＴ、およびＥＬＯ３の単離を可能にする。
モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）からのゲノムＤＮＡの調製
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのキアプレップ（ＱｉａＰｒｅｐ）スピンミニプレップキット（カタログ番号６２７１０６）を使用してモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）（ＡＴＣＣ＃１６２６６）からゲノムＤＮＡを単離した。ＹＰＤ寒天プレート（２％バクトイースト抽出物、３％バクトペプトン、２％グルコース、２．５％バクト寒天）上に生育した細胞をこすり取り１．２ｍＬのキット緩衝液Ｐ１に再懸濁した。再懸濁した細胞をそれぞれ０．６ｍＬのガラスビーズ（０．５ｍｍ径）を含有する２本の２．０ｍＬネジ蓋管に入れた。オクラホマ州バートルズビルのバイオスペック（Ｂｉｏｓｐｅｃ（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ））からのミニビーズビーターの均質化（ＨＯＭＯＧＥＮＩＺＥ）設定において、細胞を２分間均質化した。次に管をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）微量遠心管内で１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清（０．７５ｍＬ）を３本の１．５ｍＬ微量遠心管に移した。各管に等容積のキット緩衝液Ｐ２を添加した。管を３回反転して混合した後、０．３５ｍＬの緩衝液Ｎ３を各管に添加した。各管の内容物を全部で５回反転させて、再度混合した。混合物をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）微量遠心管中で１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。各管からの上清を３本の別々のキットスピンカラムに個別に移した。次にカラムに以下の処理を行った。遠心分離（１４，０００ｒｐｍで１分間）、緩衝液ＰＥで１回洗浄、遠心分離（１４，０００ｒｐｍで１分間）、次に最終遠心分離（１４，０００ｒｐｍで１分間）。各カラムに緩衝液ＥＢ（５０μＬ）を添加して、１分間静置した。次にゲノムＤＮＡを１４，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によって溶出した。
モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）からのｃＤＮＡの調製
カナダ国オンタリオ州ミシサーガのＢＤクローンテック（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）からのクリエーター・スマート（Ｃｒｅａｔｏｒ Ｓｍａｒｔ）（登録商標）ｃＤＮＡライブラリーキットを使用して、製造業者のプロトコルに従ってモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡを調製した。
具体的にはＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＡＴＣＣ＃１６２６６株を６０ｍＬのＹＰＤ培地（２％バクトイースト抽出物、３％バクトペプトン、２％グルコース）中で３日間２３℃で生育させた。ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＧＨ３．８ローター内での３７５０ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細胞をペレット化し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの６×０．６ｍＬのトリゾール試薬中に再懸濁した。再懸濁した細胞をそれぞれ０．６ｍＬの０．５ｍｍガラスビーズを含有する６本の２ｍＬネジ蓋管に移した。バイオスペック（Ｂｉｏｓｐｅｃ）ミニビーズビーターの均質化設定において、細胞を２分間均質化した。管を短時間遠沈して、ビーズを沈下させた。液体を４本の新鮮な１．５ｍＬ微量遠心管に移して、各管に０．２ｍＬのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を添加した。管を手で１分間振盪し、３分間静置した。次に管を４℃において１４，０００ｒｐｍで１０分間遠沈した。上層を４本の新しい管に移した。各管にイソプロピルアルコール（０．５ｍＬ）を添加した。管を室温で１５分インキュベートし、続いて４℃において１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレットをＲＮＡ分解酵素を含まない水で作った７５％エタノール各１ｍＬで洗浄し風乾した。次に全ＲＮＡサンプルを５００μＬの水に再溶解し１：５０希釈ＲＮＡサンプルを使用して、Ａ２６０ｎｍでＲＮＡ量を測定した。全部で３．１４ｍｇのＲＮＡが得られた。
この全ＲＮＡサンプルをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮｅａｓｙ全ＲＮＡミディ（Ｍｉｄｉ）キットで、製造業者のプロトコルに従ってさらに精製した。このようにして全ＲＮＡサンプルを２ｍＬに希釈して、８０μＬのβ−メルカプトエタノールおよび５．６ｍＬの１００％エタノールを添加した８ｍＬのＲＬＴ緩衝液と混合した。サンプルを４つの部分に分割し、４本のＲＮｅａｓｙミディ（Ｍｉｄｉ）カラムに装入した。次にカラムを５分間４５００×ｇで遠心分離した。カラムを洗浄するために２ｍＬのＲＰＥ緩衝液を装入し、カラムを２分間４５００×ｇで遠心分離した。洗浄ステップを１回繰り返したが、遠心分離時間は５分間に延長した。各カラムに２５０μＬのＲＮＡ分解酵素を含まない水を添加して全ＲＮＡを溶出し、１分間待って４５００×ｇで３分間遠心処理した。
次にアマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のｍＲＮＡ精製キットのプロトコルに従って、上の全ＲＮＡサンプルからＰｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを単離した。簡単に述べると、２オリゴ−ｄＴ−セルロースカラムを使用した。カラムを各１ｍＬの高塩濃度緩衝液で２回洗浄した。前段階からの全ＲＮＡサンプルを２ｍＬの全容積に希釈して、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡに調節した。サンプルを６５℃で５分間加熱し、次に氷上にのせた。サンプル緩衝液（０．４ｍＬ）を添加して、次にサンプルを重力供給法下で２本のオリゴ−ｄＴ−セルロースカラムに装入した。カラムを３５０×ｇで２分間遠心分離し、各０．２５ｍＬの高塩濃度緩衝液で２回洗浄し、毎回それに３５０×ｇで２分間の遠心分離が続いた。同一の遠心分離ルーチンに従って、カラムを低塩濃度緩衝液でさらに３回洗浄した。カラムを６５℃に予熱された溶出緩衝液各０．２５ｍＬで４回洗浄して、Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを溶出し、同一の遠心分離手順がそれに続いた。精製プロセス全体をもう１回繰り返した。精製ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを３０．４ｎｇ／μＬの濃度で得た。
ＢＤクローンテック（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって規定されるＬＤ−ＰＣＲ法、および０．１μｇのｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡサンプルを使用して、ｃＤＮＡを発生させた。具体的には第１ストランドｃＤＮＡ合成のために、３μＬのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルと、１μＬのＳＭＡＲＴ ＩＶオリゴヌクレオチド（配列番号２８１）および１μＬのＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号２８２）とを混合した。混合物を７２℃に２分間加熱して、氷上で２分間冷却した。２μＬの第１ストランド緩衝液、１μＬの２０ｍＭ ＤＴＴ、１μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰミクス、および１μＬのパワースクリプト（Ｐｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素を管に添加した。混合物を４２℃で１時間インキュベートし、氷上で冷却した。
第１ストランドｃＤＮＡ合成混合物をＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。具体的には反応混合物は次を含有した。２μＬの第１ストランドｃＤＮＡ混合物、２μＬの５’−ＰＣＲプライマー（配列番号２８３）、２μＬのＣＤＳＩＩＩ／３’−ＰＣＲプライマー（配列番号２８２）、８０μＬの水、１０μＬの１０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）２ＰＣＲ緩衝液、２μＬの５０×ｄＮＴＰミクス、および２μＬの５０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）２ポリメラーゼミクス。サーモサイクラー条件をＧｅｎＡｍｐ９６００装置上において次のように設定した。９５℃で２０秒間と、それに続く９５℃で５秒間および６８℃で６分間を１４〜２０サイクル。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動法および臭化エチジウム染色によって定量した。
上の７５μＬのＰＣＲ生成物（ｃＤＮＡ）と、キットで提供される３μＬの２０μｇ／μＬタンパク質分解酵素Ｋとを混合した。混合物を４５℃で２０分間インキュベートし、次に７５μＬの水を添加して、混合物を１５０μＬのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合物（２５：２４：１）で抽出した。水相を１５０μＬのクロロホルム：イソアミルアルコール（２５：１）でさらに抽出した。次に水相を１５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、２μＬの２０μｇ／μＬのグリコーゲン、および４００μＬの１００％エタノールと混合した。混合物を即座に微量遠心管中で、室温において１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを１５０μＬの８０％エタノールで１回洗浄し、風乾させて７９μＬの水に溶解した。
溶解したｃＤＮＡを引き続いてＳｆｉＩで消化した（７９μＬのｃＤＮＡと、１０μＬの１０×ＳｆｉＩ緩衝液、１０μＬのＳｆｉＩ酵素、および１μＬの１００×ＢＳＡとを混合し、混合物を５０℃で２時間インキュベートした）。キシレンシアノール染料（２μＬの１％）を添加した。次に製造業者の手順に正確に従って、混合物をキットで提供されるクロマスピン（Ｃｈｒｏｍａ Ｓｐｉｎ）４００カラム上で分画した。画分をカラムから収集し、アガロースゲル電気泳動法で分析した。ｃＤＮＡを含有する第１の３つの画分をプールして、ｃＤＮＡをエタノールで沈殿した。沈殿したｃＤＮＡを７μＬの水に再溶解して、キットで提供されるｐＤＮＲ−ＬＩＢにライゲートした。
ライブラリー配列決定
ライゲーション生成物を使用して、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＸＬ−１ブルー電気穿孔コンピテント細胞を形質転換した。推定総数２×１０６個のコロニーが得られた。マサチューセッツ州ベバリーのアージンコート・バイオサイエンス社（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））によってＭ１３順方向プライマー（配列番号２８４）を使用して、ｃＤＮＡライブラリーの配列決定を実施した。
実施例１４
モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ２の発現はパーセントＰＵＦＡを増大させる
本実施例は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ２（配列番号６９および７０）を同時発現するように形質転換された、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０６７Ｕ株（実施例１０）における増大するＥＰＡ生合成および蓄積について述べる。Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路のどちらかを通じてＡＲＡを生成するように遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主株は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ２がそこで（例えばＹ２０３４、Ｙ２０４７、および／またはＹ２２１４株）同様に同時発現されれば、増大するＡＲＡ生合成および蓄積を実証できることが考察される。
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ２ ＯＲＦを次のようにしてローンした。プライマーＭＬＰＡＴ−ＦおよびＭＬＰＡＴ−Ｒ（配列番号２８５および２８６）を使用して、ＰＣＲによってＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡ（実施例１３）からＬＰＡＡＴ２ＯＲＦを増幅した。反応混合物は、１μＬのｃＤＮＡ、各１μＬのプライマー、２２μＬの水、および日本国滋賀県大津市５２０−２１９３のタカラバイオからの２５μＬのＥｘＴａｑプレミクス２×Ｔａｑ ＰＣＲ溶液を含有した。増幅を次のようにして実施した。９４℃で１５０秒間の初期変性、続いて９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で９０秒間の延長を３０サイクル。７２℃で１０分間の最終延長サイクルを実施し、続いて４℃での反応終結。約９５０ｂｐのＤＮＡ断片がＰＣＲ反応から得られた。これをカリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））のＰＣＲ精製キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って精製した。精製されたＰＣＲ生成物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために、遺伝子が、自律複製ベクター中のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮプロモーターおよびＰＥＸ２０−３’ターミネーター領域の制御下にあるようにして、Ｎｃｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ切断ｐＺＵＦ１７ベクター（配列番号１１８、図８Ｂ）中にクローンした。正確な形質転換体をミニプレップＤＮＡの制限酵素分析によって確認し、得られたプラスミドを「ｐＭＬＰＡＴ−１７」（配列番号１３８）と命名した。
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ２をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノム中に組み込むために、プラスミドｐＭＬＰＡＴ−Ｉｎｔを作り出した。プライマーＬＰＡＴ−Ｒｅ−５−１およびＬＰＡＴ−Ｒｅ−５−２（配列番号２８７および２８８）を使用して、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１（配列番号７１）のＡＵＧのすぐ上流にあるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムの１１０３ｂｐの断片を含有する、１１２９ｂｐのＤＮＡ断片であるＹＬＰＡＴ−５’（配列番号２８９）を増幅した。反応混合物は、１μＬのＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡ、各１μＬのプライマー、２２μＬの水、およびタカラ（ＴａＫａＲａ）からの２５μＬのＥｘＴａｑプレミクス２×Ｔａｑ ＰＣＲ溶液を含有した。増幅を上述のように実施した。ＰＣＲ反応から約１１３０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。それをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のＰＣＲ精製キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って精製した。精製されたＰＣＲ生成物をＳａｌＩおよびＣｌａＩで消化し、ＳａｌＩ−ＣｌａＩ切断ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）ベクター中にクローンして、プラスミド「ｐＹＬＰＡＴ−５」をもたらした。
次に上と同じ条件を使用して、プライマーＬＰＡＴ−Ｒｅ−３−１およびＬＰＡＴ−Ｒｅ−３−２（配列番号２９０および２９１）を使用して、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１の停止コドンのすぐ後ろにあるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムの９０３ｂｐの断片を含有する９３８ｂｐの断片であるＹＬＰＡＴ−３’（配列番号２９２）を増幅した。精製されたＰＣＲ生成物をＣｌａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＣｌａＩ−ＸｈｏＩ消化ｐＹＬＰＡＴ−５’中にクローンした。正確な形質転換体をミニプレップ分析で確認し、得られたプラスミドを「ｐＹＬＰＡＴ−５’−３’」と命名した。
次にｐＭＬＰＡＴ−１７（配列番号１３８）をＣｌａＩおよびＮｏｔＩで消化し、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＱｉａｅｘＩＩゲル精製キットを使用して製造業者のプロトコルに従って、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＵＲＡ３遺伝子、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮプロモーター、およびＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ２遺伝子を含有する約３．５ｋｂの断片を単離した。この断片をＣｌａＩ−ＮｏｔＩ消化ｐＹＬＰＡＴ−５’−３’中にクローンした。正確な形質転換体をミニプレップおよび制限酵素分析によって確認した。得られたプラスミドを「ｐＭＬＰＡＴ−Ｉｎｔ」（配列番号１３９）と命名した。
「対照」ベクターｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１（配列番号１４０、図１５Ｂ）を次のようにして調製した。最初にプライマーｐｚｕｆ−ｍｏｄ１およびｐｚｕｆ−ｍｏｄ２（配列番号２９３および２９４）を使用し、カリフォルニア州パロアルトのクローンテック（ＣｌｏｎＴｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ））からのｐＤＮＲ−ＬＩＢをテンプレートとして使用して、２５２ｂｐの「スタッファー」ＤＮＡ断片を増幅した。増幅された断片をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットによって精製し、標準条件を使用してＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化して、次にキアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットによって再度精製した。この断片を同様に消化されたＮｃｏＩ−／ＮｏｔＩ切断ｐＺＵＦ１７ベクター（配列番号１１８、図８Ｂ）にライゲートして、得られたライゲーション混合物を使用してインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞を形質転換した。得られた４個のコロニーからキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キアプレップ（ＱｉａＰｒｅｐ）スピンミニプレップキットを使用して、プラスミドＤＮＡを精製した。精製プラスミドをＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化して、約２５０ｂｐの断片の存在を確認した。得られたプラスミドを「ｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１」と命名した（配列番号１４０）。
一般方法に従って、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０６７Ｕ株（実施例１０、全脂質の１４％のＥＰＡを生成する）をプラスミドｐＭＬＰＡＴ−１７、プラスミドｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１（対照）、およびＳｐｅＩ／ＸｂａＩ消化プラスミドｐＭＬＰＡＴ−Ｉｎｔで個々に形質転換した。形質転換体をアミノ酸強化した合成ＭＭ中で２日間生育させ、ＨＧＭ中での４日間がそれに続いた。（一般方法で述べられるような）ＧＣ分析に基づく、ｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１を含有する２つの形質転換体、ｐＭＬＰＡＴ−１７を含有する２つの形質転換体、およびゲノムに組み込まれたｐＭＬＰＡＴ−Ｉｎｔを有する２つの形質転換体の脂肪酸プロフィールを下の表に示す。脂肪酸は１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定され、それぞれの組成は、全脂肪酸の％で表される。
Figure 0005139806
上で実証されたように、ｐＭＬＰＡＴ−１７からのＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ２の発現は、％ＥＰＡを「対照」株中の約１４％から１５．５〜１６％に増大させた。１６．６〜１７．３％へのＥＰＡの追加的増大は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ２をｐＭＬＰＡＴ−Ｉｎｔがあるゲノムに組み込むと達成された。例えばＹ２０６７Ｕ株＋ｐＭＬＰＡＴ−Ｉｎｔにおいて、天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１（配列番号７１および７２）および／またはＬＰＡＡＴ２（配列番号７４および７５）をノックアウトすれば、追加的増大が期待される。
実施例１５
モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１の発現はパーセントＰＵＦＡを増大させる
本実施例は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１ ｃＤＮＡ（配列番号８３）を同時発現するように形質転換された、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０６７Ｕ株（実施例１０）における増大するＥＰＡ生合成および蓄積について述べる。Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路のどちらかを通じてＡＲＡを生成するように遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主株は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１がそこで（例えばＹ２０３４、Ｙ２０４７および／またはＹ２２１４株）同様に同時発現されれば、増大するＡＲＡ生合成および蓄積を実証できることが考察される。
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１ ＯＲＦを次のようにしてクローンした。最初にｃＤＮＡのクローニングを助けるために、ＤＧＡＴ１の第２のコドン配列を「ＡＣＡ」から「ＧＣＡ」に変化させ、スレオニンからアラニンへのアミノ酸変化がもたらされた。これは、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１ ＯＲＦの完全なコード領域をプライマーＭＡＣＡＴ−Ｆ１およびＭＡＣＡＴ−Ｒ（それぞれ配列番号２９５および２９６）で増幅して達成された。具体的にはＰＣＲ反応混合物は、２０μＭのプライマーＭＡＣＡＴ−Ｆ１およびＭＡＣＡＴ−Ｒ溶液各１μＬ、１μＬのＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡ（前出、実施例１３）、２２μＬの水、および日本国滋賀県大津市５２０−２１９３のタカラバイオからの２５μＬのＥｘＴａｑプレミクス２×Ｔａｑ ＰＣＲ溶液を含有した。増幅を次のようにして実施した。９４℃で１５０秒間の初期変性、続いて９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で９０秒間の延長を３０サイクル。７２℃で１０分間の最終延長サイクルを実施し、続いて４℃での反応終結。約１６００ｂｐのＤＮＡ断片がＰＣＲ反応から得られた。これをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のＰＣＲ精製キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って精製した。
ＦＢＡＩＮプロモーターおよびＰＥＸ２０−３’ターミネーター領域の制御下でＯＲＦがクローンされるように、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１ ＯＲＦをＮｃｏ Ｉ−およびＮｏｔ Ｉ−消化プラスミドｐＺＵＦ１７（配列番号１１８、図８Ｂ）に挿入した。しかしＤＧＡＴ１ ＯＲＦは内部ＮｃｏＩ部位を含有したので、クローニングのために２つの別々の制限酵素消化を実施することが必要であった。最初に約２μｇの精製ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＮｃｏ Ｉで消化した。反応混合物は全容積６０μＬ中に、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの各２０Ｕの酵素、および６μＬの制限緩衝液Ｄを含有した。混合物を３７℃で２時間インキュベートした。約３２０ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動法によって分離し、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キアエクス（Ｑｉａｅｘ）ＩＩゲル精製キットを使用して精製した。Ｎｃｏ ＩをＮｏｔ Ｉで置換したこと以外は、上と同一の反応条件を使用して、別々に約２μｇの精製ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＮｏｔ Ｉで消化した。上記のように約１２８０ｂｐの断片が単離され、精製された。最後に約３μｇのｐＺＵＦ１７を上述のようにＮｃｏ ＩおよびＮｏｔ Ｉで消化し精製して、約７ｋＢの断片を生じさせた。
約７ｋＢのＮｃｏ Ｉ／Ｎｏｔ ＩｐＺＵＦ１７断片、約３２０ｂｐのＮｃｏ Ｉ／ＢａｍＨＩ ＤＧＡＴ１断片、および約１２８０ｂｐのＢａｍＨＩ／Ｎｏｔ Ｉ ＤＧＡＴ１断片を三元ライゲーションで共にライゲートし、室温で一晩インキュベートした。ライゲーション混合物は全容積２０μＬ中に、１００ｎｇの７ｋＢの断片、各２００ｎｇの３２０ｂｐおよび１２８０ｂｐの断片、２μＬのリガーゼ緩衝液、およびプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの２Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを含有した。ライゲーション生成物を使用して、製造業者のプロトコルに従ってインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０化学コンピテント細胞を形質転換した。
ミニプレップ分析のために、形質転換からの個々のコロニー（総計１２個）を使用して培養を接種した。制限酵素地図および配列決定は、１２個のコロニー中５個が「ｐＭＤＧＡＴ１−１７」と命名された所望のプラスミドを持つことを示した（図１５Ｃ、配列番号１４１）。
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０６７Ｕ株（実施例１０）を一般方法に従って、それぞれｐＭＤＧＡＴ１−１７およびｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１（前出、実施例１４）で形質転換した。形質転換体をアミノ酸強化した合成ＭＭ中で２日間生育させ、ＨＧＭ中での４日間がそれに続いた。（一般方法で述べられるような）ＧＣ分析に基づく、ｐＭＤＧＡＴ１−１７を含有する２つの形質転換体、およびｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１を含有する２つの形質転換体の脂肪酸プロフィールを下の表３５に示す。脂肪酸は１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定され、それぞれの組成は、全脂肪酸の％で表される。
Figure 0005139806
上で実証されたように、プラスミドｐＭＤＧＡＴ１−１７からのＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１の発現は、％ＥＰＡを「対照」株中での約１３．３％から、約１４．１％（「Ｙ２０６７Ｕ＋ｐＭＤＧＡＴ１−１７＃１」）および約１５．１％（「Ｙ２０６７Ｕ＋ｐＭＤＧＡＴ１−１７＃２」）にそれぞれを増大させた。例えばＹ２０６７Ｕ株＋ｐＭＤＧＡＴ１−１７において、天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１（配列番号８１および８２）をノックアウトすれば、ＥＰＡの追加的増大が期待される。
実施例１６
モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ２はパーセントＰＵＦＡを増大させる
本実施例は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ２ｃＤＮＡ（配列番号９５）を同時発現するように形質転換された、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０６７Ｕ株（実施例１０）における増大するＥＰＡ生合成および蓄積について述べる。Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路のどちらかを通じてＡＲＡを生成するように遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主株は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ２がそこで（例えばＹ２０３４、Ｙ２０４７および／またはＹ２２１４株）同様に同時発現されれば、増大するＡＲＡ生合成および蓄積を実証できることが考察される。
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ２ＯＲＦを次のようにしてプラスミドｐＺＵＦ１７中にクローンした。最初にＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡ（前出、実施例１９３からのプライマーＭＤＧＡＴ−ＦおよびＭＤＧＡＴ−Ｒ１（配列番号２９７および２９８）を使用して、ＯＲＦをＰＣＲ増幅した。予測された１０１５ｂｐの断片を単離して精製し、Ｎｃｏ ＩおよびＮｏｔ Ｉで消化して、遺伝子がＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮプロモーターおよびＰＥＸ２０−３’ターミネーター領域の制御下にあるように、Ｎｃｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ切断ｐＺＵＦ１７ベクター（配列番号１１８；図８Ｂ）中にクローンした。正確な形質転換体をミニプレップＤＮＡの制限酵素分析によて確認し、得られたプラスミドを「ｐＭＤＧＡＴ２−１７」（配列番号１４２）と命名した。
一般方法に従って、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０６７Ｕ株（実施例１０）をそれぞれｐＭＤＧＡＴ２−１７およびｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１（前出、実施例１４）で形質転換した。形質転換体をアミノ酸強化合成ＭＭ中で２日間生育させ、ＨＧＭ中での４日間がそれに続いた。（一般方法で述べられるような）ＧＣ分析に基づく、ｐＭＤＧＡＴ２−１７を含有する２つの形質転換体、およびｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１を含有する２つの形質転換体の脂肪酸プロフィールを下に示す。脂肪酸は１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定され、それぞれの組成は、全脂肪酸の％で表される。
Figure 0005139806
プラスミドｐＭＤＧＡＴ２−１７からのＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ２の発現は、％ＥＰＡを「対照」株中の約１３．３％から約１５．２５％（「Ｙ２０６７Ｕ＋ｐＭＤＧＡＴ２−１７」）に増大させた。例えばＹ２０６７Ｕ株＋ｐＭＤＧＡＴ２−１７中で天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２（配列番号８９−９４）をノックアウトすれば、ＥＰＡの追加的増大が期待される。
実施例１７
モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴはパーセントＰＵＦＡを増大させる
本実施例は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴ ＯＲＦ（配列番号９７）を同時発現するように形質転換された、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２１０７Ｕ１株（実施例１１）における増大したＤＧＬＡ生合成および蓄積（および１８：１の減少量）について述べる。Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路のどちらかを通じてＡＲＡを生成するように遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主株は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴがそこで（例えばＹ２０３４、Ｙ２０４７および／またはＹ２２１４株）同様に同時発現されれば、増大するＡＲＡ生合成および蓄積を実証できることが考察される。
縮重ＰＣＲプライマーを使用したＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴの同定
アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＡＡ６２２４２）、およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿３２５８４０）からのＧＰＡＴ配列に基づいて、縮重ＰＣＲのために以下のプライマーをデザインした。
ＭＧＰＡＴ−Ｎ１（配列番号２９９） ＣＣＮＣＡＹＧＣＮＡＡＹＣＡＲＴＴＹＧＴ
ＭＧＰＡＴ−ＮＲ５（配列番号３００） ＴＴＣＣＡＮＧＴＮＧＣＣＡＴＮＴＣＲＴＣ
［注記：配列番号２９９および３００のために使用される核酸縮重コードは次のとおり。Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、およびＮ＝Ａ／Ｃ／Ｔ／Ｇ］
日本国滋賀県大津市のタカラバイオからのタカラ（ＴａＫａＲａ）ＥｘＴａｑプレミクスＴａｑポリメラーゼを使用して、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡｍｐ ９６００ ＰＣＲマシン内でＰＣＲ増幅を実施した。増幅を次のように実施した。９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で９０秒間の延長を３０サイクルと、それに続く７２℃で７分間の最終延長サイクル。
約１．２ｋＢの断片（配列番号９９）が得られた。この断片をキアゲン・キアクイック（Ｑｉａｇｅｎ ＱｉａＱｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットで精製し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローンして配列決定した。翻訳すると得られた配列は、ＢＬＡＳＴプログラム分析に基づいて既知のＧＰＡＴと相同性を有した。
１２１２ｂｐのｃＤＮＡ断片配列に基づいて、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴの５’および３’末端領域をＰＣＲ増幅およびゲノム歩行技術によってクローンした。これによってＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴ（配列番号１００）の−１０５０ｂｐ〜＋２８８５ｂｐ領域に対応するコンティグのアセンブリーが可能になった。このコンティグはＧＰＡＴのコード領域全体、および４個のイントロン（配列番号１０４、１０５、１０６、および１０７）を含んだ。
具体的にはＧＰＡＴの３’−末端増幅のためのテンプレートとして、実施例１３で述べられるＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡサンプル（１μＬ）を使用した。ＭＧＰＡＴ−５Ｎ１（配列番号３０１）およびＣＤＳＩＩＩ／３’（配列番号２８２）をプライマーとして使用した。日本国滋賀県大津市のタカラバイオからのタカラ（ＴａＫａＲａ）ＥｘＴａｑプレミクスＴａｑポリメラーゼを使用して、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡｍｐ ９６００ ＰＣＲマシン内でＰＣＲ増幅を実施した。増幅を次のように実施した。９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１２０秒間の延長を３０サイクルと、それに続く７２℃で７分間の最終延長サイクル。
ＰＣＲ生成物を１：１０に希釈し、ＭＧＰＡＴ−５Ｎ２（配列番号３０２）およびＣＤＳＩＩＩ／３’をプライマーとして使用した第２回目の増幅のテンプレートとして、１μＬの希釈ＰＣＲ生成物を使用した。条件は上で述べたのと全く同じであった。第２回目のＰＣＲ生成物を１：１０に再度希釈し、ＭＧＰＡＴ−５Ｎ３（配列番号３０３）およびＣＤＳＩＩＩ／３’をプライマーとして使用した第３回目のＰＣＲのテンプレートとして、１μＬの希釈ＰＣＲ生成物を使用した。ＰＣＲ条件条件はここでも上で述べたのと全く同じであった。
第３回目のＰＣＲにおいて約１ｋＢの断片が生じた。この断片をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットで精製し、配列分析のためにｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター中にクローンした。配列分析からの結果は、この９６５ｂｐの断片（配列番号１０１）がＧＰＡＴ遺伝子の３’−末端に相当したことを示した。
クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのユニバーサル・ゲノム歩行（商標）キットを利用して、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴの５’末端領域に対応する１片のゲノムＤＮＡを得た。簡単に述べると、各２．５μｇのＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ゲノムＤＮＡをＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩまたはＳｔｕＩで個別に消化し、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットを使用して、消化ＤＮＡサンプルを精製して各３０μＬのキット緩衝液ＥＢで溶出し、次に精製サンプルを下に示すようなゲノム歩行アダプター（配列番号３０４［上のストランド］および３０５［下のストランド］）にライゲートした。
Figure 0005139806
各ライゲーション反応混合物は、１．９μＬの２５μＭゲノム歩行アダプター、１．６μＬの１０×ライゲーション緩衝液、０．５μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ、および４μＬの精製消化ゲノムＤＮＡサンプルの１つを含有した。反応混合物を１６℃で一晩インキュベートした。反応を７０℃で５分間のインキュベーションによって終結した。次に７２μＬの１０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の緩衝液を各ライゲーション反応ミクスに添加した。
それぞれ４つのライゲーション混合物の１つをテンプレートとして使用して、４つの別々のＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応混合物は、１μＬのライゲーション混合物、０．５μＬの２０μＭ ＭＧＰＡＴ−５−１Ａ（配列番号３０６）、１μＬの１０μＭキットプライマーＡＰ１（配列番号３０７）、２２．５μＬの水、およびタカラからの２５μＬのＥｘＴａｑプレミクスＴａｑ ２×ＰＣＲ溶液を含有した。ＰＣＲ反応を以下の条件を使用して３２サイクル実施した。９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１８０秒間の延長。７２℃で７分間の最終延長サイクルを実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。
各ＰＣＲ反応の生成物を個々に１：５０に希釈し、第２の回目のＰＣＲテンプレートとして使用した。各反応混合物は、テンプレートとしての１μＬの希釈ＰＣＲ生成物の１つ、０．５μＬの２０μＭ ＭＧＰＡＴ−３Ｎ１（配列番号３０８）、２１μＬの１０μＭキットプライマーＡＰ２（配列番号３０９）、２２．５μＬの水、およびタカラ（ＴａＫａＲａ）からの２５μＬのＥｘＴａｑプレミクスＴａｑ ２×ＰＣＲ溶液を含有した。上述したのと同じサーモサイクラー条件を使用して、ＰＣＲ反応を３２サイクル実施した。
第２回目のＰＣＲからＤＮＡ断片を得た。この断片を精製してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローンして配列決定した。配列分析は、１９０８ｂｐの断片（配列番号１０２）がＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴ遺伝子の５’−末端であったことを示した。
同様に、プライマーＭＧＰＡＴ−５Ｎ１を第１回目のＰＣＲのための遺伝子特異的プライマーとして、およびプライマーＭＧＰＡＴ−５Ｎ２を第２回目のための遺伝子特異的プライマーとして使用したこと以外は、上述のような２回のゲノム歩行から９６６ｂｐの断片（配列番号１０３）が得られた。この断片もまた精製してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローンし、配列決定した。配列分析は、これがＧＰＡＴ遺伝子の一部を含有したことを示した。しかし断片は、遺伝子のどちらの端を延長するのにも、長さが足りなかった。３’ｃＤＮＡ配列（配列番号１０１）との比較は、ＯＲＦの最後の１７１ｂｐが含まれていなかったことを示した。
モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）からの全長ＧＰＡＴ配列のアセンブリー
オリジナルの部分的ｃＤＮＡ断片（配列番号９９）、３’ｃＤＮＡ断片（配列番号１０１）、内部ゲノムの断片（配列番号１０３）、および上述の５’ゲノムの断片（配列番号１０２）（図１６に図表で示される）配列から、完全なＧＰＡＴ遺伝子（ＧＰＡＴ翻訳開始「ＡＴＧ」コドン上流に１０５０個の塩基延びる領域、およびＧＰＡＴ終止コドンを超えて２２個の塩基延びる領域を含んでなる）を含有する３９３５ｂｐの配列（配列番号１００）をアセンブルした。この領域には２１５１ｂｐのＧＰＡＴ ＯＲＦが含まれる。「ＡＴＧ」から停止コドン「ＴＡＧ」までのＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴ ＯＲＦの完全なヌクレオチド配列は、配列番号９７として提供される（配列番号１００の塩基１０５０〜２８６３に対応し、４個のイントロン（すなわち配列番号１００の塩基１１９５〜１４６９に対応するイントロン１［配列番号１０４］、配列番号１００の塩基１５８５〜１８３９に対応するイントロン２［配列番号１０５］、配列番号１００の塩基２７９５〜２８７７に対応するイントロン３［配列番号１０６］、および配列番号１００の塩基２９４０〜３０３８に対応するイントロン４［配列番号１０７］を除く）。翻訳されたアミノ酸配列（配列番号９８）は、多くの真菌、植物、および動物ＧＰＡＴと相同性を示した。
より具体的には、ＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍａｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）」アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））検索を実施して、配列の同一性を判定した。ここで配列番号９８として述べられるアミノ酸断片は、トウモロコシ黒穂菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）の推定上のＧＰＡＴのタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＡＫ８４２３７）と期待値１ｅ−１５２で４７％の同一性および６５％の類似性を有し、さらに配列番号９８は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のＧＰＡＴ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＡＬ２００８９）と期待値１ｅ−１４２で４７％の同一性および６２％の類似性を有した。
ＦＢＡＩＮ：：ＭＧＰＡＴ：：ＰＥＸ２０−３’キメラ遺伝子を含んでなるプラスミドｐＭＧＰＡＴ−１７の構築
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴ ＯＲＦを次のようにしてクローンした。プライマーｍｇｐａｔ−ｃｄｎａ−５およびｍｇｐａｔ−ｃｄｎａ−Ｒ（配列番号３１０および３１１）を使用して、ＰＣＲによってＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）のｃＤＮＡからのＧＰＡＴ ＯＲＦを増幅した。反応混合物は、１μＬのｃＤＮＡ、各１μＬのプライマー、２２μＬの水、および日本国滋賀県大津市５２０−２１９３のタカラバイオからの２５μＬのＥｘＴａｑプレミクス２×Ｔａｑ ＰＣＲ溶液を含有した。増幅を次のように実施した。９４℃で１５０秒間の初期変性と、それに続く９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１２０秒間の延長を３０サイクル。７２℃で１０分間の最終延長サイクルを実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。ＰＣＲ反応から約２．２ｋＢのＤＮＡ断片を得た。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットを使用して製造業者のプロトコルに従って、それを精製した。
精製されたＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、ゲルアガロース電気泳動法によって約４７０ｂｐの断片を単離し、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル精製キットを使用して精製した。別に、ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩでも切断し、上と同様にして１．６９ｋＢの断片を単離して精製した。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために、遺伝子が自律複製ベクター中のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮプロモーターおよびＰＥＸ２０−３’ターミネーター領域の制御下にあるようにして、２つの断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ切断ｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１ベクター（配列番号１４０、図１５Ｂ）中にライゲートした。正確な形質転換体をミニプレップＤＮＡの制限酵素分析によって確認し、得られたプラスミドを「ｐＭＧＰＡＴ−１７」（配列番号１４３、図１５Ｄ）と命名した。
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴを過剰発現する形質転換体Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の脂質組成分析
一般方法に従って、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２１０７Ｕ１株（実施例１１からの）をプラスミドｐＭＧＰＡＴ−１７およびプラスミドｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１（前出、実施例１４）でそれぞれ形質転換した。形質転換体をアミノ酸で栄養強化された合成ＭＭ中で２日間、続いてＨＧＭ中で４日間生育させた。（一般方法で述べられるような）ＧＣ分析に基づいた、ｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１を含有する２つの形質転換体およびｐＭＧＰＡＴ−１７を含有する４つの形質転換体の脂肪酸プロフィールを下の表に示す。脂肪酸は１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定され、それぞれの組成は全脂肪酸の％として表される。
Figure 0005139806
上で実証されたように、ｐＭＧＰＡＴ−１７からのＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＧＰＡＴの発現は％ＤＧＬＡを中の「対照」株約２．５％から６．５％に増大させた。１８：１のレベルは約２３％から約１６％に低下した。ｐＭＧＰＡＴ−１７を発現する形質転換株において天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＡＴがノックアウトされれば、ＤＧＬＡ（またはその他のいずれかの下流ＰＵＦＡ）の追加的増大が期待される。
実施例１８
モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）脂肪酸エロンガーゼ「ＥＬＯ３」はパーセントＰＵＦＡ含量を増大させる
本実施例は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ（「ＥＬＯ３」、配列番号５３および５４）を同時発現するように形質転換されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０３１株（実施例５）における、対照株と比べて３５％多いＣ１８脂肪酸（１８：０、１８：１、１８：２、およびＧＬＡ）および３１％少ないＣ１６脂肪酸について述べる。ＥＬＯ３（場合により発現増大のためにコドン最適化できる）は、所望のＰＵＦＡ、すなわちＡＲＡ生成を増大する手段として、炭素フラックスを遺伝子操作されたΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路のどちらかに進めることができ得ると考察される。例えばこのＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼを含んでなるキメラ遺伝子を例えばＹ２０３４、Ｙ２０４７および／またはＹ２２１４株に容易に導入でき得る。
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼの配列の同定
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）脂肪酸エロンガーゼ一部をコードするｃＤＮＡ断片（配列番号５５）を９，９８４個のＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡ配列（実施例１３）から同定した。このｃＤＮＡ断片はいくつかの脂肪酸エロンガーゼと顕著な相同性を持ち、したがってエロンガーゼと仮に同定された。
それに対して配列番号５５が最も高い類似性を有する配列を要約するＢＬＡＳＴ比較の結果を、％同一性、％類似性、および期待値に従って報告する。具体的には翻訳された配列番号５５のアミノ酸配列が、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）ＳＣ５３１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＡＬ０４５１０．１、そこでＳ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＵＲ４、ＦＥＮ１、およびＥＬＯ１と類似した３つの有望な脂肪酸エロンガーゼ遺伝子の１つとして注釈される）からの有望な脂肪酸エロンガーゼのタンパク質配列と、期待値４ｅ−１３で３２％の同一性および４６％の類似性を有した。さらに配列番号５５は、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１１４２、染色体Ｘの塩基６７８４９〜６８７８１）からのＥＬＯ１と３５％の同一性および５３％の類似性を有した。Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＯ１は、不飽和Ｃ１２〜Ｃ１６脂肪酸アシルＣｏＡｓからＣ１６〜Ｃ１８脂肪酸へのカルボキシ終末延長を触媒する、中鎖アシルエロンガーゼとして述べられる。
上で報告される相同性に基づいて、配列番号５５のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子産物をここで「エロンガーゼ３」または「ＥＬＯ３」と命名する。
部分的脂肪酸エロンガーゼｃＤＮＡ配列（配列番号５５）の分析は、５’および３’−末端がどちらも不完全であることを示唆した。Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＥＬＯ３の失われた３’領域を得るために、（実施例１７で述べられるようにして）クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ユニバーサル・ゲノムウォーカー（商標）キットを使用した。具体的には、プライマーとしてＭＡ Ｅｌｏｎｇ ３’１（配列番号３１２）およびＡＰ１を使用した（すなわちプライマーＭＧＰＡＴ−５−１ＡおよびＡＰ１の代わりに）こと以外は、前述したのと同じ構成要素および条件を使用して、同一の４つのライゲーション混合物セットを第１回目のＰＣＲのために使用した。第２回目のＰＣＲは、プライマーとしてＭＡ Ｅｌｏｎｇ ３’２（配列番号３１３）およびＡＰ２を使用した。第２回目のＰＣＲから１０４２ｂｐのＤＮＡ断片が得られた（配列番号５６）。この断片を精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローンして配列決定した。配列分析は、断片が遺伝子の「ＴＡＡ」停止コドンの約６４０ｂｐの下流を含むＥＬＯ３の３’−末端を含有したことを示した。
クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）３’−末端ＲＡＣＥ（前出）で使用したのと同一の４つのライゲーション混合物セットをＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＥＬＯ３の５’−末端領域を得るためにも使用した。具体的には、プライマーとしてＭＡ Ｅｌｏｎｇ ５’１（配列番号３１４、５’末端で入れ子）およびＡＰ１を使用した（すなわちプライマーＭＡ Ｅｌｏｎｇ ３’１およびＡＰ１の代わりに）こと以外は、上述したのと同じ構成要素および条件を使用して、第１回目のＰＣＲを実施した。第２回目のＰＣＲは、プライマーとしてＭＡ Ｅｌｏｎｇ ５’２（配列番号３１５、５’末端で入れ子）およびＡＰ２を使用した。２２２３ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号５７）を得た。これを精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローンして配列決定した。配列分析は、これがＥＬＯ３遺伝子の５’−領域を含有したことを示した。
したがってオリジナルの部分的ｃＤＮＡ配列（配列番号５５）と、ゲノムウォーキングによって得られた重複５’および３’配列（それぞれ配列番号５７および５６、図１７に図表で示す）とを組み合わせて、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＥＬＯ３（配列番号５３）のｃＤＮＡ配列全体を得た。これはＥＬＯ３の推定上の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの２０９１ｂｐ上流、８２８ｂｐのＥＬＯ３ ＯＲＦ（すなわち配列番号５３、配列番号５８の塩基２０９２〜２９１９に対応する）、およびＥＬＯ３停止コドンの６３８ｂｐ下流（配列番号５８の塩基２９２０〜３５５７に対応する）を含んでなる、本明細書で配列番号５８として同定された３５５７ｂｐの配列を生じた。
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＥＬＯ３の対応ゲノムの配列は、配列番号５８として提供されるｃＤＮＡ断片よりも長い。具体的にはＯＲＦの３１８ｂｐにＥＬＯ３遺伝子を含有するゲノムＤＮＡ中に、５４２ｂｐのイントロン（配列番号５９）が見いだされた。したがってここで配列番号６０として提供されるゲノムＤＮＡ断片は４，０９９ｂｐである（図１７）。
翻訳されたＥＬＯ３タンパク質配列（配列番号６７）は、ＢＬＡＳＴプログラム分析に基づいて以下の相同性を有した。カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）ＳＣ５３１４からの有望な脂肪酸エロンガーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＡＬ０４５１０．１）と、期待値４ｅ−４３で３７％の同一性および５１％の類似性。さらに翻訳されたＥＬＯ３は、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）からのタンパク質配列ＸＰ＿３３１３６８（そこで「仮説的タンパク質」として注釈される）と、期待値３ｅ−４４で、３３％の同一性および４４％の類似性を共有した。
ＦＢＡＩＮ：：ＥＬＯ３：：ＰＥＸ１６−３’キメラ遺伝子を含んでなるプラスミドｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴの構築
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）脂肪酸ＥＬＯ３ ＯＲＦを次のようにしてクローンした。プライマーＭＡ Ｅｌｏｎｇ ５’ ＮｃｏＩ ３およびＭＡ Ｅｌｏｎｇ ３’ ＮｏｔＩ（配列番号３１６および３１７）を使用して、ＰＣＲによってＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）のｃＤＮＡ（実施例１３）からＥＬＯ３ ＯＲＦを増幅した。反応混合物は、１μＬのｃＤＮＡ、各１μＬのプライマー、２２μＬの水、およびタカラ（ＴａＫａＲａ）からの２５μＬのＥｘＴａｑプレミクス２×Ｔａｑ ＰＣＲ溶液を含有した。増幅を次のように実施した。９４℃で３０秒間の初期変性と、それに続く９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１２０秒間の延長を３２サイクル。７２℃で７分間の最終延長サイクルを実施して、それに４℃での反応終結が続いた。ＰＣＲ反応から約８３０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。それをカリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））からのＰＣＲ精製キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って精製した。精製されたＰＣＲ生成物を２つのアリコートに分割し、１つをＮｃｏＩおよびＮｓｐＩで、もう１つをＮｓｐＩおよびＮｏｔＩで消化した。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために、遺伝子が自律複製ベクター中でＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮプロモーターおよびＰＥＸ１６−３’ターミネーター領域（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７５４３３）の制御下にあるようにして、三点ライゲーションによって、約２７０ｂｐのＮｃｏＩ−ＮｓｐＩおよび約５６０ｂｐのＮｓｐＩ−ＮｏｔＩ断片をＮｃｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ切断ｐＺＦ５Ｔ−ＰＰＣベクター中にクローンした（図１１Ｃ、配列番号１２２）。正確な形質転換体をミニプレップ分析によって確認し、得られたプラスミドを「ｐＺＦ５Ｔ−ＰＰＣ−Ｅ３」（配列番号１４４）と命名した。
プラスミドｐＺＦ５Ｔ−ＰＰＣ−Ｅ３をＣｌａＩおよびＰａｃＩで消化し、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キット使用して、アガロースゲルから約２．２ｋＢのバンド（すなわちＦＢＡＩＮ：：ＥＬＯ３：：ＰＥＸ１６−３’断片）を精製した。断片をＦＢＡＩＮプロモーター制御下にあるモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼＯＲＦ（「Ｄ６Ｓ」、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４６５２８１）を含有する自律複製プラスミドであるＣｌａＩ−ＰａｃＩ切断ｐＺＵＦ６Ｓ中に、Ｐｅｘ２０−３’ターミネーター（すなわちＦＢＡＩＮ：：Ｄ６Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子）およびＵｒａ３遺伝子と共にクローンした（図１８Ａ、配列番号１４５）。正確な形質転換体をミニプレップ分析によって確認し、得られたプラスミドを「ｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴ」（図１８Ｂ、配列番号１４６）と命名した。
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＥＬＯ３を過剰発現する形質転換Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の脂質組成の分析
一般方法に従って、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０３１株（実施例５）をプラスミドｐＺＵＦ６Ｓ（対照、ＦＢＡＩＮ：：Ｄ６Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子を含んでなる）およびプラスミドｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴ（ＦＢＡＩＮ：：Ｄ６Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子およびＦＢＡＩＮ：：ＥＬＯ３：：ＰＥＸ１６キメラ遺伝子を含んでなる）で形質転換した。形質転換体をアミノ酸で栄養強化された合成ＭＭ中で２日間、続いてＨＧＭ中で４日間生育させた。（一般方法で述べられるような）ＧＣ分析に基づいて、ｐＺＵＦ６Ｓを含有する６個のクローン（単一形質転換からのクローン＃１〜６）、およびｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴを含有する２２個のクローン（４つの異なる形質転換［すなわち＃３、５、６、および７］からの）の脂肪酸プロフィールを下の表３８に示す。脂肪酸を１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、およびＧＬＡとして同定し、それぞれの組成は全脂肪酸の％として表される。
Figure 0005139806
サンプルのいくつか（斜体の太字でラベルした）は、期待される読み取りから外れていた。具体的にはＹ２０３１＋ｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴ＃３−３またはＹ２０３１＋ｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴ＃５−６のいずれもＧＬＡを生成しなかった。同様にＹ２０３１＋ｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴ＃７−１、＃７−３、および＃７−４はＧＣエラーを有し、１６：０および１６：１のピークがＧＣによって単一ピークとして読み取られた。これらの様々な結果を受けて、表３９は、対照およびＥＬＯ３を発現する形質転換体株中の平均脂質を報告する。具体的には表３９は表３８中の脂肪酸プロフィールからの平均を示すが、表３８中で不正確であるとして斜体の太字で示唆した行は、これらの平均を計算する際に含めなかった。「全Ｃ１６」が１６：０および１６：１の平均面積の合計を表すのに対し、「全Ｃ１８」は１８：０、１８：１、１８：２、およびＧＬＡの平均面積の合計を反映する。
Figure 0005139806
上で報告されるデータに基づいて、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＥＬＯ３の過剰発現は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０３１株中でＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼと同時発現すると、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼのみを過剰発現するＹ２０３１対照株と比べて、Ｃ１８の百分率増大およびＣ１６の百分率低下をもたらした。これはＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＥＬＯ３が、確かにＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼであったことを示唆した。
実施例１９
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ「ＹＥ２」はパーセントＰＵＦＡを増大させる
本実施例は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ（「ＹＥ２」、配列番号６２）を同時発現するように形質転換されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０３１株（実施例５）における、増大するＧＬＡ生合成および蓄積について述べる。ＹＥ２エロンガーゼは、所望のＰＵＦＡ、すなわちＡＲＡ生成を増大する手段として、炭素フラックスを遺伝子操作されたΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路のどちらかに進めることができると考察される。例えばこのＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼを含んでなるキメラ遺伝子は、例えばＹ２０３４、Ｙ２０４７またはＹ２２１４株中に容易に導入される。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ配列の同定
クエリー配列としてラットＥｌｏ２Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０７１９８６、配列番号５１）を使用して、アラインメントによってＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの新規脂肪酸エロンガーゼ候補を同定した。具体的にはこのｒＥｌｏ２クエリー配列を使用して、ＧｅｎＢａｎｋおよび「酵母菌プロジェクト・ジェノレビュール（Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ）」（バイオインフォマティクス・センター、ＬａＢＲＩ、フランス国タランスセデックス（Ｔａｌｅｎｃｅ Ｃｅｄｅｘ））の公共Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベースを検索した（ドゥジョン（Ｄｕｊｏｎ），Ｂ．ら著、Ｎａｔｕｒｅ ４３０（６９９５）：３５〜４４頁（２００４年）も参照されたい）。これは相同配列であるＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７７９０１（配列番号６１および６２、「無名タンパク質生成物」と注釈される）の同定をもたらした。この遺伝子をＹＥ２と命名した。
ＢＬＡＳＴアルゴリズム（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７年））を使用した、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＥ２アミノ酸配列と公共データベースとの比較は、最もよく似ている既知のアミノ酸配列が、有望な脂肪酸エロンガーゼとして注釈されるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）ＳＣ５３１４（配列番号６３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＡＬ０４５１０）からのものであることを明らかにした。タンパク質は約４０％の同一性を共有し、７ｅ−６１のＥ値で２３６をスコアした。
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＥ２遺伝子の単離
テンプレートとしてヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡを、およびプライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ５９７およびＹＬ５９８（配列番号３１８および３１９）を使用して、ＹＥ２遺伝子のコード領域をＰＣＲによって増幅した。一般方法で述べられるようにして、ＰＣＲ反応を５０μＬの全容積で実施した。サーモサイクラー条件を次のように設定した。９５℃で１分間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５サイクルと、それに続く７２℃で１０分間の最終延長。ＹＥ２コード領域のＰＣＲ生成物を精製してＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化し、次にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＺＫＵＧＰＹＥ１−Ｎとライゲートして（下記の実施例２０、図１８Ｃの配列番号１４７も参照されたい）、ｐＺＫＵＧＰＹＥ２（図１８Ｄ、配列番号１４８）を生じさせた。「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺へのＮｃｏＩ部位の添加は、ＹＥ２の第２のアミノ酸をＬからＶに変化させた。
ｐＺＫＵＧＰＹＥ２のＣｌａＩ／ＮｏｔＩ断片（ＧＰＡＴプロモーターおよびＹＥ２コード領域を含有する）およびＡｃｏターミネーターを含有するＮｏｔＩ／ＰａｃＩ断片（ＡＣＯ３’ターミネーターをプライマーＹＬ３２５およびＹＬ３２６［配列番号３７１および３７２］で増幅し次にＮｏｔＩ／ＰａｃＩで消化して、ＰＣＲによって調製された）をＣｌａＩ／ＰａｃＩ消化ベクターｐＺＵＦ６Ｓと一方向性にライゲートし、ｐＺＵＦ６ＹＥ２を生成した。ｐＺＫＵＴ１６のＣｌａＩ／ＮｃｏＩ断片（ＴＥＦプロモーターを含有する）およびｐＺＵＦ６ＹＥ２のＮｃｏＩ／ＰａｃＩ断片（ＹＥ２のコード領域およびＡｃｏターミネーターを含有する）を引き続いてＣｌａＩ／ＰａｃＩ消化ベクターｐＺＵＦ６Ｓと一方向性にライゲートし、ｐＺＵＦ６ＴＹＥ２（配列番号１４９）を生成した。
ＹＥ２を過剰発現する形質転換Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の脂質組成の分析
プラスミドｐＺＵＦ６Ｓ（図１８Ａ、配列番号１４５）およびｐＺＵＦ６ＴＹＥ２（配列番号１４９）を使用して、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ２０３１株を別々に形質転換した。これらの２つのプラスミドの構成要素については、表４０および４１で述べられる。
Figure 0005139806
Figure 0005139806
一般方法に従って、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０３１株（実施例１３）をプラスミドｐＺＵＦ６Ｓ（対照）およびプラスミドｐＺＵＦ６ＴＹＥ２で形質転換した。形質転換体を液体ＭＭ中で２日間生育させた。（一般方法で述べられるような）ＧＣ分析に基づいた、ｐＺＵＦ６ＳまたはｐＺＵＦ６ＹＥ２をそれぞれ含有する８個のコロニーの脂肪酸プロフィールを下の表５３に示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、およびＧＬＡと同定され、それぞれの組成は全脂肪酸の％として表される。
Figure 0005139806
ＧＣ分析は、ｐＺＵＦ６ＳによるＹ２０３１形質転換体中で、全脂質の約２７．１％のＣ１６（Ｃ１６：０およびＣ１６：１）および６２．２％のＣ１８（Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２およびＧＬＡ）が生成し、ｐＺＵＦ６ＴＹＥ２によるＹ２０３１形質転換体中で、約２１．３％のＣ１６および７３．６％のＣ１８が生成したことを示した。したがってｐＺＵＦ６ＴＹＥ２形質転換体中ではＣ１６の総量が約２１．４％低下し、Ｃ１８の総量は約１８％増大した（ｐＺＵＦ６Ｓでの形質転換体と比較して）。これらのデータは、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中でＹＥ２がＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼとして機能して、Ｃ１８脂肪酸を生成することを実証した。さらにｐＺＵＦ６Ｓ形質転換体中で生成したＧＬＡに比べて、ｐＺＵＦ６ＴＹＥ２形質転換体中では約１２．８％より多くのＧＬＡが生成した。これらのデータは、ＹＥ２エロンガーゼが炭素流動を遺伝子操作されたＰＵＦＡ経路に進めて、より多くの最終生成物（すなわちＧＬＡ）を生成できることを提案した。
実施例２０
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｃ１４／１６脂肪酸エロンガーゼ「ＹＥ１」はパーセントＰＵＦＡを増大させる
本実施例は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｃ１４／１６脂肪酸エロンガーゼ（「ＹＥ１」、配列番号６５）を同時発現するように形質転換された、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０３１株（実施例５）中の増大するＧＬＡ生合成および蓄積について述べる。ＹＥ１エロンガーゼは、所望のＰＵＦＡ、すなわちＡＲＡ生成を増大する手段として、炭素フラックスを遺伝子操作されたΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路のどちらかに進めることができると考察される。具体的には、このＣ１４／１６脂肪酸エロンガーゼ含んでなるキメラ遺伝子を例えばＹ２０３４、Ｙ２０４７またはＹ２２１４株中に容易に導入できる。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｃ１４／１６脂肪酸エロンガーゼ配列の同定
実施例１９で使用したと同様の様式で、クエリー配列としてラットＥｌｏ２Ｃ１６／１８脂肪酸エロンガーゼタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０７１９８６、配列番号５１）を使用して、アラインメントによって、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの新規脂肪酸エロンガーゼ候補を同定した。これは相同配列であるＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８３３７８（配列番号６４および６５、「無名タンパク質生成物」と注釈される）の同定をもたらした。この遺伝子を「ＹＥ１」と命名した。
ＢＬＡＳＴアルゴリズム（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７年））を使用した、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＥ１アミノ酸配列と公共データベースとの比較は、最もよく似ている既知の配列が、有望な脂肪酸エロンガーゼであり、ＹＥ１と約６０％の同一性を共有するニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＤ７０９１８、配列番号６６）からのＦＥＮ１であることを明らかにした。
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＥ１遺伝子の単離
ＹＥ１遺伝子（配列番号６４）のＤＮＡ配列は、内部ＮｃｏＩ部位を有する。ＹＥ１遺伝子の「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺にヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）翻訳モチーフを組み込むために、二段階ストラテジーを用いて、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からのＹＥ１遺伝子全体をＰＣＲした。具体的にはテンプレートとしてヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡを使用して、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ５６７およびＹＬ５６８（配列番号３２０および３２１）を使用して、ＹＥ１の最初の半分をＰＣＲによって増幅する一方、ＹＥ１遺伝子の残り半分は、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ５６９およびＹＬ５７０（配列番号３２２および３２３）を使用して、同様に増幅した。一般方法で述べられるようにして、ＰＣＲ反応を５０μＬの全容積で実施した。サーモサイクラー条件を次のように設定した。９５℃で１分間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５サイクルと、それに続く７２℃で１０分間の最終延長。ＹＥ１の５’部分に対応するＰＣＲ生成物を精製し、次にＮｃｏＩおよびＳａｃＩで消化してＹＥ１−１断片を生じさせる一方、ＹＥ１の３’部分のＰＣＲ生成物を精製し、ＳａｃＩおよびＮｏｔＩで消化してＹＥ１−２断片を生じさせた。ＹＥ１−１およびＹＥ１−２断片をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＺＫＵＧＰＥ１Ｓ（前出、実施例１１）と直接ライゲートして、ｐＺＫＵＧＰＹＥ１（図１９Ａ、配列番号１５０）を生じさせた。次にテンプレートとしてｐＺＫＵＧＰＹＥ１、およびプライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ５７１およびＹＬ５７２（配列番号３２４および３２５）を使用して、ＹＥ１の内部ＮｃｏＩ部位を部位特異的変異誘発によって変異させ、ｐＺＫＵＧＰＹＥ１−Ｎ（配列番号１４７）を生じさせた。配列分析は、突然変異がＹＥ１のアミノ酸配列を変化させなかったことを示した。ＡＴＧ翻訳開始コドン周辺へのＮｃｏＩ部位の添加は、ＹＥ１の第２のアミノ酸をＳからＡに変化させた。
ｐＺＦ５Ｔ−ＰＰＣのＣｌａＩ／ＮｃｏＩ断片（ＦＢＡＩＮプロモーターを含有する）およびｐＺＫＵＧＰＹＥ１−ＮのＮｃｏＩ／ＰａｃＩ断片（ＹＥ１のコード領域およびＡｃｏターミネーターを含有する）をＣｌａＩ／ＰａｃＩ消化ベクターｐＺＵＦ６Ｓと一方向性にライゲートして、ｐＺＵＦ６ＦＹＥ１（配列番号１５１）を生成した。
ＹＥ１を過剰発現する形質転換体Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の脂質組成の分析
遺伝子の過剰発現の効果が形質転換ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株における脂肪酸組成のＧＣ分析によって判定され得るように、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｐｙｔｉｃａ）ＹＥ１ ＯＲＦを含んでなるキメラ遺伝子をプラスミドｐＺＵＦ６にクローニングした。具体的には、対照プラスミドｐＺＵＦ６Ｓ（図１８Ａ、配列番号１４５、ＦＢＡＩＮ：：Ｄ６Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子を含んでなる）の構成要素については実施例１９で述べられる。ｐＺＵＦ６ＦＹＥ１の構成要素（図１９Ｂ、配列番号１５１、ＦＢＡＩＮ：：Ｄ６Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子およびＦＢＡＩＮ：：ＹＥ１：：Ａｃｏキメラ遺伝子を含んでなる）については、下の表４３で述べられる。
Figure 0005139806
形質転換に続いて、形質転換体をアミノ酸で栄養強化された合成ＭＭ中で２日間、続いてＨＧＭ中で４日間生育させた。（一般方法で述べられるような）ＧＣ分析に基づいた、ｐＺＵＦ６Ｓを含有する６個のクローン、およびｐＺＵＦ６ＦＹＥ１を含有する５個のクローンの脂肪酸プロフィールを下の表４４に示す。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、およびＧＬＡとして同定され、それぞれの組成は全脂肪酸の％として表される。
Figure 0005139806
ＧＣ分析は、ｐＺＵＦ６ＳによるＹ２０３１形質転換体中で全脂質の約３１．１％のＣ１６（Ｃ１６：０＋Ｃ１６：１）が生成した一方、ｐＺＵＦ６ＦＹＥ１によるＹ２０３１形質転換体中では約３９．６％のＣ１６が生成したことを測定した。ｐＺＵＦ６Ｓによる形質転換体と比べて、ｐＺＵＦ６ＦＹＥ１形質転換体中ではＣ１６の総量が約２６．７％増大した。したがってこれらのデータはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中でＹＥ１がＣ１４／１６脂肪酸エロンガーゼとして機能し、Ｃ１６脂肪酸を生成することを実証した。さらにｐＺＵＦ６ＦＹＥ１形質転換体中ではｐＺＵＦ６Ｓ形質転換体中よりも５７％より多くのＧＬＡが生成し、ＹＥ１エロンガーゼが、炭素流動を遺伝子操作された経路に進めて、より多くの最終生成物（すなわちＧＬＡ）を生成することを提案した。
実施例２１
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＣＰＴ１過剰発現はパーセントＰＵＦＡを増大させる
本実施例は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＣＰＴ１ ｃＤＮＡ（配列番号１０９）を過剰発現するように形質転換された、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０６７Ｕ株（実施例１０）における増大するＥＰＡ生合成および蓄積について述べる。ＥＰＡ合成をもたらすＰＵＦＡもまた増大した。Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路のどちらかを通じてＡＲＡを生成するように遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主株は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＣＰＴ１が、（例えばＹ２０３４、Ｙ２０４７またはＹ２２１４株中で）同様に同時発現されれば、増大するＡＲＡ生合成および蓄積を実証できることが考察される。
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ＃２０３２６ ｃＤＮＡを以下の手順を使用して調製した。細胞を２００ｍＬのＹＰＤ培地（２％バクトイースト抽出物、３％バクトペプトン、２％グルコース）中で１日間３０℃で生育させ、次にベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＧＨ３．８ローター内で３７５０ｒｐｍで１０分間の遠心分離によってペレット化し、ＨＧＭで２回洗浄した。洗浄した細胞を２００ｍＬのＨＧＭに再懸濁し、さらに４時間３０℃で生育させた。次に細胞を３７５０ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって４×５０ｍＬ試験管内に採取した。
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮｅａｓｙ全ＲＮＡミディ（Ｍｉｄｉ）キットを使用して全ＲＮＡを単離した。細胞を破壊するために、採取した細胞を４×６００μＬのキット緩衝液ＲＬＴ（製造業者の指定通りにβ−メルカプトエタノールで栄養強化した）に再懸濁し、４本の２ｍＬネジ口試験管内で、等容積の０．５ｍｍガラスビーズと混合した。バイオスペック（Ｂｉｏｓｐｅｃ）ミニビーズビーターを使用して、均質化設定で細胞を２分間破壊した。追加的な４×６００μＬの緩衝液ＲＬＴを添加した。ガラスビーズおよび細胞残骸を遠心分離によって除去し、製造業者のプロトコルに従って、上清を使用して全ＲＮＡを単離した。
キアゲンオリゴテックス（Ｑｉａｇｅｎ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）ｍＲＮＡ精製キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って、上の全ＲＮＡサンプルからポリＡ（＋）ＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡサンプルの純度を確証するために、単離されたポリＡ（＋）ＲＮＡを同一キットでさらにもう１回精製した。最終精製ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは３０．４ｎｇ／μＬの濃度を有した。
第１のｃＤＮＡ鎖合成のために使用されるＰＣＲサーモサイクラー条件が、９５℃で２０秒間と、それに続く９５℃で５秒間および６８℃で６分間を２０サイクルに設定されたこと以外は、実施例１３で述べられるようにして、ＢＤクローンテック（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が指定するＬＤ−ＰＣＲ法、および０．１μｇのポリＡ（＋）ＲＮＡサンプルを使用してｃＤＮＡを生じさせた。ＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動法および臭化エチジウム染色によって定量化した。
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＣＰＴ１ ｃＤＮＡを次のようにしてクローンした。プライマーＣＰＴ１−５’−ＮｃｏＩおよびＣＰＴ１−３’−ＮｏｔＩ（配列番号３２６および３２７）を使用して、ＰＣＲによって、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のｃＤＮＡからＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＯＲＦを増幅した。反応混合物は、０．５μＬのｃＤＮＡ、各０．５μＬのプライマー、１１μＬの水、および日本国滋賀県大津市５２０−２１９３のタカラバイオからの１２．５μＬのＥｘＴａｑプレミクス２×Ｔａｑ ＰＣＲ溶液を含有した。増幅を次のように実施した。９４℃で３００秒間の初期変性と、それに続く９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で６０秒間の延長を３０サイクル。最終延長サイクルを７２℃で１０分間実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。約１１９０ｂｐのＤＮＡ断片がＰＣＲ反応から得られた。それをキアゲン（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））のＰＣＲ精製キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って精製した。精製されたＰＣＲ生成物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ消化し、遺伝子がＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮプロモーターおよびＰＥＸ２０−３’ターミネーター領域の制御下にあるように、Ｎｃｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ切断ｐＺＵＦ１７ベクター（配列番号１１８；図８Ｂ）中にクローンした。正確な形質転換体をミニプレップ分析によって確認し、得られたプラスミドを「ｐＹＣＰＴ１−１７」（配列番号１５２）と命名した。
キメラＦＢＡＩＮ：：ＣＰＴ１：：ＰＥＸ２０遺伝子をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のゲノム中に組み込むために、ｐＹＣＰＴ１−１７をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化してプラスミドｐＹＣＰＴ１−ＺＰ２ｌ７を作り出し、ＣＰＴ１ ＯＲＦを含有する約１１９０ｂｐの断片を単離した。次にこの断片をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＺＰ２ｌ７＋Ｕｒａ（配列番号１５３）中にクローンした。図１９Ｃに示すように、プラスミドｐＺＰ２ｌ７＋Ｕｒａは、キメラＴＥＦ：：合成Δ１７デサチュラーゼ（Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のためにコドン最適化された）：：Ｐｅｘ２０−３’遺伝子、および選択マーカーとして使用するためのＵｒａ３遺伝子を含んでなる、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）組み込みプラスミドである。正確な形質転換体をミニプレップ分析によって確認し、得られたプラスミドを「ｐＹＣＰＴ１−ＺＰ２ｌ７」（配列番号１５４）と命名した。
一般方法に従って、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０６７Ｕ株（実施例１０から）をＢｓｓＨＩＩ／ＢｂｕＩ消化ｐＹＣＰＴ１−ＺＰ２ｌ７およびｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１（前出、実施例１４）によってそれぞれ形質転換した。形質転換体をアミノ酸で栄養強化された合成ＭＭ中で２日間、続いてＨＧＭ中で４日間生育させた。（一般方法で述べられるような）ＧＣ分析に基づいた、ｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１を含有する２つの形質転換体、およびゲノム中にｐＹＣＰＴ１−ＺＰ２ｌ７が組み込まれた４つの形質転換体の脂肪酸プロフィールを下の表に示す。脂肪酸は１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定され、それぞれの組成は全脂肪酸の％として表される。
Figure 0005139806
上に示されるように、ゲノム組み込みによる、強力なＦＢＡＩＮプロモーター制御下にあるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＣＰＴ１の発現は、％ＥＰＡを「対照」株中の１３．４％から１５．７〜１６％に増大させた。さらにＧＬＡ、ＤＧＬＡ、およびＡＲＡレベルもまた増大した。
実施例２２
サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＳＣ１はパーセントＰＵＦＡを増大させる
本実施例は、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＳＣ１遺伝子（配列番号１１１）を同時発現するように形質転換された、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｍ４株（実施例４）における増大するＥＰＡ生合成および蓄積について述べる。Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路のどちらかを通じてＡＲＡを生成するように遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主株は、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＳＣ１が（例えばＹ２０３４、Ｙ２０４７またはＹ２２１４株中で）同様に同時発現されれば、増大するＡＲＡ生合成および蓄積を実証できることが考察される。
Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＳＣ１ ＯＲＦを次のようにしてプラスミドｐＺＰ２ｌ７＋Ｕｒａ中にクローンした。最初にウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＳ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｓ２８８ＣからのゲノムＤＮＡ、およびプライマーペアＩｓｃ１ＦおよびＩｓｃ１Ｒ（配列番号３２８および３２９）を使用して、ＯＲＦをＰＣＲ増幅した。ＮｃｏＩ部位を組み込み、それによってＩＳＣ１をフレーム内に留めることが必要であったために、プライマーＩｓｃ１Ｆは、増幅されたＯＲＦ中でＩＳＣ１の野生型５’配列を「ＡＴＧＴＡＣＡＡ」から「ＡＴＧＧＡＣＡＡ」に変性した。増幅を次のように実施した。９４℃で１２０秒間の初期変性と、それに続く９４℃で３０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、および６８℃で１２０秒間の延長を３５サイクル。最終延長サイクルを６８℃で１０分間実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。１４５５ｂｐのＤＮＡ断片がＩＳＣ１のＰＣＲ反応から得られ、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からの１％アガロースゲル（１２０Ｖで３０分間）および１ｋＢのＤＮＡ標準ラダーを使用した電気泳動法によって、ＰＣＲ生成物サイズを確認した。
カリフォルニア州オレンジのザイモ・リサーチ社（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））からのＤＮＡクリーン＆コンセントレーター−５（Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５）キットを使用して、製造業者の使用説明書に従ってＤＮＡを精製し、次にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化した。次にＩＳＣ１断片を個別にｐＺＰ２ｌ７＋Ｕｒａ（配列番号１５３、図１９Ｃ）中にクローンし、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化した。正確な形質転換体をゲル電気泳動法によって確認し、得られたプラスミドを「ｐＴＥＦ：：ＩＳＣ１」（配列番号１５５）と命名した。したがってこのプラスミドは、３’−ＰＯＸ２、ＵＲＡ３、ＴＥＦ：：ＩＳＣ１：：Ｐｅｘ２０、およびＰＯＸ２プロモーター領域を含んでなるＤＮＡカセットを含有した。
「対照」ベクターを次のようにして調製した。最初にＳ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８Ｃ株からのゲノムＤＮＡ、およびプライマーペアＰｃｌ１ＦおよびＰｃｌ１Ｒ（配列番号３３０および３３１）を使用して、Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｐｃｌ１ ＯＲＦ（有糸分裂細胞サイクルへの侵入および形態形成制御に関与するタンパク質をコードする）をＰＣＲ増幅した。上述のように増幅を実施した。ｐｃｌ１のＰＣＲ反応から８６１ｂｐのＤＮＡ断片が得られた（電気泳動法によって確認された、前出）。ＤＮＡクリーン＆コンセントレーター−５（Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５）キットを使用してＤＮＡを精製し、次にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化した。次に断片を同様に消化されたｐＺＰ２ｌ７＋Ｕｒａ中にクローンした。正確な形質転換体をゲル電気泳動法によって確認し、得られたプラスミドを「ｐＴＥＦ：：ｐｃｌ１」と命名した。次にプラスミドｐＴＥＦ：：ｐｌｃ１をＨｉｎｃＩＩで消化して、ｐｃｌ１ ＯＲＦを除去した。残りのプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩでの消化に際して、３’−ＰＯＸ２、ＵＲＡ３、ＴＥＦ：：Ｐｅｘ２０およびＰＯＸ２プロモーター領域を含んでなる直鎖ＤＮＡカセットがもたらされるように、再度ライゲートした。
コンピテントＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｍ４株細胞（実施例４から）をＡｓｃ１／Ｓｐｈ１消化ｐＴＥＦ：：ＩＳＣ１および「対照」でそれぞれ形質転換した（各５μｇのプラスミドが消化された）。ザイモ・リサーチ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）からのフローズン（Ｆｒｏｚｅｎ）ＥＺ酵母形質転換ＩＩキットを使用して形質転換を達成し、アミノ酸なしのＹＮＢ（６．７ｇ／Ｌ、メリーランド州スパークスのベクトン・ディキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ））［カタログ番号２９１９４０］）、グルコース（２０ｇ／Ｌ）、および寒天（２０ｇ／Ｌ）を含んでなるプレート上で形質転換体を選択した。数百個の形質転換体コロニーが得られた。５個の独立したＩＳＣ１の形質転換体からのゲノムＤＮＡを使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯＸ２遺伝子座中への各ＤＮＡカセットの組み込みをＰＣＲによって確認した。
形質転換体を２％グルコースを含有するアミノ酸非含有ＹＮＢ中で２日間生育させた。細胞を遠心分離によって採取し、１００ｇ／Ｌデキストロース、２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、およびｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸緩衝液を含んでなる培地に再懸濁して、さらに５日間生育させた。０．７５ｍＬの各培養からの細胞を遠心分離によって採取して、それらの脂肪酸組成を分析した。（一般方法で述べられるような）ＧＣ分析に基づいた、「対照」ベクターを含んでなる３つの形質転換体およびｐＴＥＦ：：ＩＳＣ１を含んでなる５つの形質転換体の脂肪酸プロフィールを下に示す。脂肪酸は、１６：０、１６：１、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定され、それぞれの組成は全脂肪酸の％として表される。
Figure 0005139806
Ｓ．セレヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＳＣ１遺伝子の発現は、パーセントＥＰＡを「対照」株中の９．３％から１０．７％（「Ｍ４＋ｐＴＥＦ：：ＩＳＣ１」）に改善し、１４．５％の増大を示した。
実施例２３
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）アシルトランスフェラーゼノックアウトの創出
本実施例は、ＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ２、ＤＧＡＴ１、ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２、ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２、またはＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２遺伝子のいずれかで中断された、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の単一、二重、および三重ノックアウト株の創生について述べる。各ノックアウト株の遺伝子の中断が確認され、実施例２４の全脂質のＧＣ分析によって、脂肪酸含量および組成に対する各中断の分析が判定された。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２遺伝子の標的を定めた中断
プラスミドｐＹ２１ＤＧＡＴ２と称される標的カセットによる内在性ＤＧＡＴ２遺伝子の相同的遺伝子組換え媒介置換によって、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））ＡＴＣＣ＃９０８１２中のＤＧＡＴ２遺伝子の標的を定めた中断を実施した。ｐＹ２１ＤＧＡＴ２は、プラスミドｐＹ２０から誘導された（図１９Ｄ、配列番号１５６）。具体的にはｐＹ２１ＤＧＡＴ２は、５７０ｂｐのＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｅｃｏ ＲＩ断片を同様に直線化されたｐＹ２０中に挿入して作り出された。この５７０ｂｐのＤＮＡ断片は（５’から３’に向けて）次を含有した。（配列番号８９中のコード配列（ＯＲＦ）の）位置＋１０９０〜＋１４６４の３’相同配列、（配列番号８９中のコード配列（ＯＲＦ）の）位置＋９０６から＋１０８９のＢｇｌＩＩ制限部位および５’相同配列。２組のＰＣＲプライマーＰ９５およびＰ９６（配列番号３３２および３３３）、そしてＰ９７およびＰ９８（配列番号３３４および３３５）をそれぞれ使用して、ＰＣＲ増幅によって断片を調製した。
ｐＹ２１ＤＧＡＴ２をＢｇｌ ＩＩ制限酵素消化によって直線化し、一般方法に従って対数増殖中期のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２細胞中に形質転換した。ＹＰＤハイグロマイシン選択プレート上に細胞を播種して、３０℃に２〜３日間保った。
１４個のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２ハイグロマイシン抵抗性コロニーが単離され、ＰＣＲによって標的を定めた中断についてスクリーニングした。１対のＰＣＲプライマー（Ｐ１１５およびＰ１１６［配列番号３３６および３３７］）をデザインし、相同的組換えに続いて特定の接合部断片を増幅した。別の１対のＰＣＲプライマー（Ｐ１１５およびＰ１１２［配列番号３３８］）をデザインして、天然遺伝子を検出した。
ＡＴＣＣ＃９０８１２株の１４個のハイグロマイシン抵抗性コロニー中の２個が、接合部断片について陽性であり、天然断片について陰性であった。したがってこれらの２菌株において標的を定めた組み込みが確認され、その１つを「Ｓ−Ｄ２」と命名した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴ遺伝子の標的を定めた中断
ｐＬＶ１３（図１９Ｅ、配列番号１５７）と称される標的カセットによる、内在性ＰＤＡＴ遺伝子の相同的組換え媒介置換によって、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２におけるＰＤＡＴ遺伝子の標的を定めた中断を実施した。ｐＬＶ１３はプラスミドｐＹ２０（図１９Ｄ、配列番号１５６）から誘導された。具体的にはｐＹ２０のハイグロマイシン抵抗性遺伝子をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｕｒａ３遺伝子で置き換えて、プラスミドｐＬＶ５を作り出した。次に，９９２ｂｐのＢａｍ ＨＩ／Ｅｃｏ ＲＩ断片を同様に直線化されたｐＬＶ５に挿入して、ｐＬＶ１３を作り出した。９９２ｂｐのＤＮＡ断片は、（５’から３’に向けて）次を含有した。（配列番号７６中のコード配列（ＯＲＦ）の）位置＋８７７〜＋１３７１の３’相同配列、Ｂｇｌ ＩＩ制限部位、および（配列番号７６中のコーディング配列（ＯＲＦ）の）位置＋３９０〜＋８７６の５’相同配列。ＰＣＲプライマーＰ３９およびＰ４１（配列番号３３９および３４０）、そしてＰ４０およびＰ４２（配列番号３４１および３４２）をそれぞれ使用して、ＰＣＲ増幅によって断片を調製した。
ｐＬＶ１３をＢｇｌ ＩＩ制限消化によって直線化し、一般方法に従って対数増殖中期のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２細胞中に形質転換した。細胞をＢｉｏ１０１ ＤＯＢ／ＣＳＭ−Ｕｒａ選択プレート上に播いて、２〜３日間３０℃に保った。
１０個のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２コロニーが単離され、ＰＣＲによって標的を定めた中断についてスクリーニングした。１対のＰＣＲプライマー（Ｐ５１およびＰ５２［配列番号３４３および３４４］）をデザインし、標的カセットを増幅した。別の１対のＰＣＲプライマー（Ｐ３７およびＰ３８［配列番号３４５および３４６］）をデザインし、天然遺伝子を検出した。１０菌株中の１０菌株が接合部断片について陽性であり、１０菌株中の３菌株が天然断片について陰性であったので、これらの３菌株における標的を定めた組み込みの成功が確認された。これらの菌株の１つを「Ｓ−Ｐ」と命名した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１遺伝子の標的を定めた中断
縮重ＰＣＲプライマーＰ２０１およびＰ２０３（それぞれ配列番号３４７および３４８）、およびテンプレートとしてＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２ゲノムＤＮＡを使用して、ＰＣＲによって全長Ｙｌ ＤＧＡＴ１ ＯＲＦをクローンした。Ｙｌ ＤＧＡＴ１をコードするヌクレオチド配列が分かっていなかったので、縮重プライマーが必要であった。
ロボサイクラー・グラディエント（ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）４０ＰＣＲマシン内でＰＣＲを実施し、増幅を次のように実施した。９５℃で１分間の初期変性と、それに続く９５℃で３０秒間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、および７２℃で１分間の延長を３０サイクル。最終延長サイクルを７２℃で１０分間実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。アガロースゲル電気泳動法によって予期されたＰＣＲ生成物（約１．６ｋＢ）を検出し、単離して精製し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクター中にクローンして、部分的に配列決定してその同一性を確認した。
（上でＤＧＡＴ２について述べられる方法を使用して）内在性ＤＧＡＴ１遺伝子の標的カセットとの相同的組換え媒介置換によって、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２中の推定上のＤＧＡＴ１遺伝子の標的を定めた中断を実施した。具体的には１．６ｋＢの単離されたＹｌ ＤＧＡＴ１ ＯＲＦ（配列番号８１）をＰＣＲテンプレート分子として使用し、５’相同的Ｙｌ ＤＧＡＴ１配列（プライマーＰ２１４およびＰ２１５（配列番号３４９および３５０）によって増幅された）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ロイシン２（Ｌｅｕ２、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ３５２４４）遺伝子、および３’相同的Ｙｌ ＤＧＡＴ１配列（プライマーＰ２１６およびＰ２１７（配列番号３５１および３５２）で増幅された）からなるＹｌ ＤＧＡＴ１標的カセットを構築した。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのＰｆｕウルトラポリメラーゼ（カタログ番号６００６３０）および上述のサーモサイクラー条件による標的カセットの個々の各部分の増幅に続いて、各断片を精製した。ＰＣＲプライマーＰ２１４およびＰ２１９（配列番号３５３）を使用した２回目のＰＣＲ反応のためのテンプレート分子として、３個の正確なサイズの精製断片を共に混合して、Ｙｌ ＤＧＡＴ１中断カセットを得た。
標的カセットをゲル精製して使用し、対数増殖中期の野生型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ＃９０８１２）を形質転換した。一般方法で述べられるようにして形質転換を実施した。形質転換体をＢｉｏ１０１ ＤＯＢ／ＣＳＭ−Ｌｅｕ選択プレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。いくつかのロイシン原栄養株をＰＣＲによってスクリーンし、標的を定めたＤＧＡＴ１中断を確認した。具体的には１対のＰＣＲプライマー（Ｐ２２６およびＰ２２７［配列番号３５４および３５５］）をデザインして、中断カセットと天然標的遺伝子間の接合部を増幅した。別の１対のＰＣＲプライマー（Ｐ２１４およびＰ２１７［それぞれ配列番号３４９および３５２］）をデザインして、天然遺伝子を検出した。
全てのロイシン原栄養株コロニーは、接合部断片について陽性であり、天然断片について陰性であった。したがってこれらの株において、標的を定めた組み込みが確認され、その１つを「Ｓ−Ｄ１」と命名した。
ＰＤＡＴおよび／またはＤＧＡＴ２および／またはＤＧＡＴ１遺伝子の中断を含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）二重および三重ノックアウト株の創生
単一ＰＤＡＴ中断について述べられたようにして、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２ハイグロマイシン抵抗性「Ｓ−Ｄ２」突然変異体（ＤＧＡＴ２中断を含有する）をプラスミドｐＬＶ１３（ＰＤＡＴ中断を含有する）で形質転換し、ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングした。１２個の形質転換体の内２つは、ＤＧＡＴ２およびＰＤＡＴ遺伝子の双方が中断されていることが確認された。これらの株の１つを「Ｓ−Ｄ２−Ｐ」と命名した。
同様にして、ＤＧＡＴ１およびＰＤＡＴ（「Ｓ−Ｄ１−Ｐ」）、ＤＧＡＴ２およびＤＧＡＴ１（「Ｓ−Ｄ２−Ｄ１」）に二重ノックアウトがある株、ＤＧＡＴ２、ＤＧＡＴ１、およびＰＤＡＴ（「Ｓ−Ｄ２−Ｄ１−Ｐ」）に三重ノックアウトがある株を作った。
実施例２４
脂質含量を減少させパーセントＰＵＦＡを増大させるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）アシルトランスフェラーゼノックアウト
本実施例は、脂肪酸含量および組成の変化によって測定される、野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびＡＲＡを生成するようにあらかじめ遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株における、単一および／または二重および／または三重アシルトランスフェラーゼノックアウトの効果を分析する。Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路のどちらかを通じてＡＲＡを生成するように遺伝子操作されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主株は、宿主の天然アシルトランスフェラーゼに対する同様の操作が行われれば（例えばＹ２０３４、Ｙ２０４７、またはＹ２２１４株内で）、増大するＥＰＡ生合成および蓄積を実証できることが考察される。
アシルトランスフェラーゼ中断があるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２におけるＴＡＧ含量減少
最初に、野生型および次を含有する突然変異Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２中のＴＡＧ含量を比較した。（１）ＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ２、およびＤＧＡＴ１中の単一中断、（２）ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２、ＤＧＡＴ１およびＰＤＡＴ、およびＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２中の二重中断、および（３）ＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ２、およびＤＧＡＴ１中の三重中断。
具体的には、野生型および突然変異Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２（すなわちＳ−Ｄ１、Ｓ−Ｄ２、Ｓ−Ｐ、Ｓ−Ｄ１−Ｄ２、Ｓ−Ｄ１−Ｐ、Ｓ−Ｄ２−Ｐ、およびＳ−Ｄ１−Ｄ２−Ｐ株）を含有するプレートからのループ１つ分の細胞を３ｍＬのＹＰＤ培地中にそれぞれ別々に接種して、振盪機（３００ｒｐｍ）上で一晩３０℃で生育させた。細胞を採取して０．９％ＮａＣｌで１回洗浄し、５０ｍＬのＨＧＭに再懸濁した。次に振盪機上で細胞を４８時間生育させた。細胞を水で洗浄し、細胞ペレットを凍結乾燥した。ＴＬＣ（下記）およびＧＣ分析に続く、ＧＣ分析による全脂肪酸および油分画のために、２０ｍｇの乾燥細胞重量を使用した。
ＴＬＣのために使用される方法は、以下の５段階で述べられる。１）内部標準１５：０脂肪酸（１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ）を２〜３ｍｇの乾燥細胞塊に添加し、メタノール／クロロホルム法を使用した総脂質の抽出がそれに続いた。２）２５〜５０μＬの微量ピペットを使用して、５×２０ｃｍシリカゲル６０プレートの下端からおよそ１インチのところに鉛筆で薄く描いた線を横切って、抽出した脂質（５０μＬ）をブロットした。３）次にＴＬＣプレートをＮ２下で乾燥させ、約１００ｍＬの８０：２０：１のヘキサン：エチルエーテル：酢酸溶剤を含有するタンクに挿入した。４）バンドの分離後、プレートの片面にヨウ素蒸気を吹き付けてバンドを同定した。これによってさらなる分析のために、カミソリの刃を使用してプレートのもう一方の面のサンプルがこすり取れるようになった。５）こすり取ったサンプルの塩基性エステル交換反応、およびＧＣ分析を一般方法で述べられるようにして実施した。
ＧＣ結果を下の表４７に示す。培養は次のように記述される。「Ｓ」株（野生型）、「Ｓ−Ｐ」（ＰＤＡＴノックアウト）、「Ｓ−Ｄ１」（ＤＧＡＴ１ノックアウト）、「Ｓ−Ｄ２」（ＤＧＡＴ２ノックアウト）、「Ｓ−Ｄ１−Ｄ２」（ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２ノックアウト）、「Ｓ−Ｐ−Ｄ１」（ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ１ノックアウト）、「Ｓ−Ｐ−Ｄ２」（ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２ノックアウト）、および「Ｓ−Ｐ−Ｄ１−Ｄ２」（ＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２ノックアウト）。使用した略語は次の通り。「ＷＴ」＝野生型、「ＦＡ」＝脂肪酸、「ｄｃｗ」＝乾燥細胞重量、および「ＦＡ％ｄｃｗ、％ＷＴ」＝野生型中の％に対するＦＡ％、「Ｓ」株は野生型である。
Figure 0005139806
表４７の結果は、３つのＤＡＧ ＡＴの油生合成に対する相対的貢献度を示唆する。ＤＧＡＴ２の貢献度が最も高いのに対し、ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ１は貢献度は等しいがＤＧＡＴ２よりも少ない。三重ノックアウト株中の約３％の残留含油量は、ＡＲＥ２（配列番号７８および７９）によってコードされるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のアシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼ酵素の貢献によるものかもしれない。
ＤＧＡＴ２遺伝子中断があるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＥＵ株におけるＴＡＧ含量減少およびパーセントＥＰＡ増大
野生型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２（前出）における様々なアシルトランスフェラーゼノックアウトの効果を調べた後、次にＥＵ株のＤＧＡＴ２ノックアウト株（すなわち１０％のＥＰＡを生成するように遺伝子操作された、実施例１０）においてＴＡＧ含量および脂肪酸組成物を調べた。
具体的には、実施例２３でＳ株（ＡＴＣＣ＃９０８１２）について述べられたように、ＥＵ株中のＤＧＡＴ２遺伝子を中断した。ＤＧＡＴ２中断株をＥＵ−Ｄ２と命名した。２つの異なる条件に従った生育に続いて、ＥＵおよびＥＵ−Ｄ２株を採取し分析した。下の表で「３ｍＬ」と称される条件では、細胞を３ｍＬのＭＭ培地中で１日間生育させ、洗浄して、次に３ｍＬのＨＧＭ中で３日間生育させた。代案としては、下の表で「５１ｍＬ」と称される条件では、細胞を５１ｍＬのＭＭ培地中で１日間生育させ、洗浄して、次に５１ｍＬのＨＧＭ中で３日間生育させた。ＴＬＣ分離（「分画」）に続いて、５１ｍＬ培養の抽出物中でホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧまたは油）の脂肪酸組成を判定した。
ＧＣ結果を下の表４８に示す。培養は「ＥＵ」株（野生型）および「ＥＵ−Ｄ２」株（ＤＧＡＴ２ノックアウト）として記述される。脂肪酸は１６：０、１６：１、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定され、それぞれの組成は全脂肪酸の％として表される。
Figure 0005139806
結果は、ＤＧＡＴ２ノックアウトが、％ＥＰＡ（全脂肪酸の）の倍増および脂質含量（％ｄｃｗとして）の半減をもたらすことを示す。さらに脂質含量に観察されたほとんど全ての変化は、ＴＡＧ画分中の変化によるものである。ＥＵ株の５１ｍＬ培養中の期待されたよりも低い％ＥＰＡは、おそらく不安定性によるものであろう。
アシルトランスフェラーゼ遺伝子中断があるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＭＵ株におけるＴＡＧ含量低下およびパーセントＥＰＡ増大
最後に、ＥＵ株−Ｄ２中の単一ＤＧＡＴ２ノックアウトからもたらされる％ＥＰＡ増大および脂質含量低下に基づいて、次にＭＵ株（１４％のＥＰＡを生成するように遺伝子操作された、実施例１２参照）の様々なアシルトランスフェラーゼノックアウト株において、ＴＡＧ含量および脂肪酸組成を調べた。具体的にはＭＵ株において、ＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ２、およびＤＧＡＴ１中の単一中断、ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２中の二重中断が作り出された。４つの異なる生育条件での生育に続いて、これらの各株中で脂質含量および組成物を比較した。
より具体的には（ＤＧＡＴ１中断の選択がＵＲＡ３遺伝子に依存したこと以外は）実施例２３で述べられる方法を使用して、ＭＵ株において、ＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ２、ＤＧＡＴ１中の単一中断を作り出した。これは「ＭＵ−Ｄ１」（ＤＧＡＴ１中断）、「ＭＵ−Ｄ２」（ＤＧＡＴ２中断）、および「ＭＵ−Ｐ」（ＰＤＡＴ中断）として同定された単一ノックアウト株をもたらした。個々のノックアウト株は、ＰＣＲによって確認された。さらにＭＵ−Ｄ２株を同じ方法でＰＤＡＴ遺伝子について中断し、中断をＰＣＲによって確認した。得られた二重ノックアウト株を「ＭＵ−Ｄ２−Ｐ」と命名した。
下で述べるように、ＭＵ−Ｄ１、ＭＵ−Ｄ２、ＭＵ−Ｐ、およびＭ−Ｄ２−Ｐノックアウト株を分析して、脂質含量および組成物に対する各ノックアウトの効果を判定した。さらに油脂生成を促進する生育条件もまた考察して、全脂質含量に対するそれらの効果を判定した。したがって「実験Ａ」、「実験Ｂ」、「実験Ｃ」、および「実験Ｅ」と同定される全部で４つの異なる実験を行った。具体的には上の各株を含有するプレートからループ３つ分の細胞をＭＭＵ培地［実験ＢおよびＣでは３ｍＬ、実験ＡおよびＥでは５０ｍＬ］中に接種して、２４時間（実験Ａ、Ｂ、およびＣ）または４８時間（実験Ｅ）振盪しながら３０℃で生育させた。細胞を採取してＨＧＭ中で１回洗浄し、ＨＧＭ培地（実験ＡおよびＥでは５０ｍＬ、実験Ｂでは３ｍＬ）またはウラシル添加ＨＧＭ培地（「ＨＧＭＵ」）（実験Ｃでは３ｍＬ）のいずれかに再懸濁し、上記のように４日間培養した。一般方法で述べられたように、１つのアリコート（１ｍＬ）をＧＣによる脂質分析のために使用する一方、第２のアリコートを６００ｎｍで培養ＯＤを測定するために使用した。実験ＡおよびＥの残る培養物を採取して水で１回洗浄し、乾燥細胞重量（ｄｃｗ）測定のために凍結乾燥した。対照的に実験ＢおよびＣのｄｃｗは、それらの関係を示す式を使用してそれらのＯＤ６００から判定された。実験Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥの異なる各株の脂肪酸組成もまた判定した。
結果を下の表４９に示す。培養物は、「ＭＵ」株（親ＥＰＡ生成株）、「ＭＵ−Ｐ」（ＰＤＡＴノックアウト）、「ＭＵ−Ｄ１」（ＤＧＡＴ１ノックアウト）、「ＭＵ−Ｄ２」（ＤＧＡＴ２ノックアウト）、および「ＭＵ−Ｄ２−Ｐ」（ＤＧＡＴ２およびＰＤＡＴノックアウト）として表現される。使用した略語は以下のとおり。「ＷＴ」＝野生型（すなわちＭＵ）、「ＯＤ」＝光学濃度、「ｄｃｗ」＝乾燥細胞重量、「ＴＦＡ」＝全脂肪酸、および「ＴＦＡ％ｄｃｗ、重量％」＝野生型（「ＭＵ」）株と比較したＴＦＡ％ｄｃｗ。脂肪酸は１６：０、１６：１、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定される。各組成は全脂肪酸の％として表される。
Figure 0005139806
データは形質転換した細胞内の脂質含量が、生育条件次第で変動することを示した。さらに脂質含量に対する各アシルトランスフェラーゼの貢献もまた、変動した。具体的には実験Ｂ、Ｃ、およびＥでは、ＤＧＡＴ２が、ＰＤＡＴまたはＤＧＡＴ１のどちらよりも油生合成により大きく貢献した。対照的に実験Ａで実証されたように、ＤＧＡＴ２、ＤＧＡＴ１、およびＰＤＡＴ中の単一ノックアウトは、脂質含量にほぼ同等の損失をもたらした（すなわちそれぞれ４８％、４９％、および４２％の損失［「ＴＦＡ％ｄｃｗ、重量％」を参照されたい］）。
脂肪酸組成については、データは、個々の各ＤＡＧ ＡＴ遺伝子のノックアウトが含油量低下および％ＥＰＡ増大をもたらすことを示す。例えばＤＧＡＴ２ノックアウトは脂質含量のほぼ半減、全脂肪酸中の％ＥＰＡのほぼ倍増をもたらす（ＥＵ株−Ｄ２で観察された結果に類似、前出）。ＤＡＧＡＴ２およびＰＤＡＴの双方のノックアウトは、最少の油と最多の％ＥＰＡをもたらす。
本明細書で報告された結果に基づいて、天然ＤＧＡＴ２および／またはＤＧＡＴ１および／またはＰＤＡＴの中断は、ＡＲＡをはじめとする高濃度のＰＵＦＡを生成するように遺伝子操作されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株において（例えばＹ２０３４、Ｙ２０４７、Ｙ２２１４株）、％ＰＵＦＡを実質的に増大させる有用な手段であることが考察される。事実、Ｙ２２１４株中の天然ＤＧＡＴ２遺伝子の中断は、パーセントＡＲＡの１．７倍の増大をもたらす（データ示さず）。本発明の主な特徴または態様を以下に記載する。
態様１． ａ）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Ｃ 18/20 エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなるアラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞。
態様２． ａ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞。
態様３． 遺伝子プールが、場合によりΔ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる態様１または２のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。
態様４． 背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている態様３に記載の組換え生産宿主。
態様５． 前記ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子の少なくとも１つが、配列番号１５８〜１６８および３６４よりなる群から選択される核酸配列を有するプロモーター配列の制御下にある態様１または２のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。
態様６． 前記Δ１２デサチュラーゼが、配列番号２４、２６、２８、３０、３１、３２、３４、３６、３８、３５８、３５９、３６１、３６２および３６３よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する態様３に記載の組換え生産宿主。
態様７． 前記Δ６デサチュラーゼが配列番号２および５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記Ｃ 18/20 エロンガーゼが配列番号１８および２１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する態様１に記載の組換え生産宿主細胞。
態様８．
前記Δ９エロンガーゼが配列番号４０および１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記Δ８デサチュラーゼが配列番号４５、４７、および４９よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する態様２に記載の組換え生産宿主細胞。
態様９． 前記Δ５デサチュラーゼが、配列番号７、９、および１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する態様１または２のいずれかに記載の組換え生産宿主細胞。
態様１０． 遺伝子プールが、場合により
ａ）Δ９デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Ｃ 16/18 エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Ｃ 14/16 エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
よりなる群から選択されるω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる態様１または２のいずれかに記載の組換え生産宿主。
態様１１． 前記Ｃ 16/18 エロンガーゼが配列番号５１、５４および６２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記Ｃ 14/16 エロンガーゼが配列番号６５に記載のアミノ酸配列を有する態様１０に記載の組換え生産宿主。
態様１２． 遺伝子プールが、場合により
ａ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）、
ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）、
ｃ）リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）、
ｄ）アシル−ＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、
ｅ）グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、および
ｆ）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
よりなる群から選択されるアシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる態様１または２のいずれかに記載の組換え生産宿主。
態様１３． 前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）が配列番号８２および８４〜８８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）が配列番号９０、９２、９４、および９６よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）が配列番号７７に記載のアミノ酸配列を有し、前記グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）が配列番号９８に記載のアミノ酸配列を有し、前記リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）が配列番号６８、７０、７２、および７５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記アシル−ＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）が配列番号８０に記載のアミノ酸配列を有する態様１２に記載の組換え生産宿主。
態様１４． ｅ）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｆ）Ｃ 18/20 エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｇ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｈ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなるアラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞であって、
イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕ２−）酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている組換え生産宿主細胞。
態様１５． ｆ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｇ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｈ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｉ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｊ）Ｃ 16/18 エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞であって、
サッカロピンデヒドロゲナーゼ（Ｌｙｓ５−）酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている組換え生産宿主細胞。
態様１６． ａ）（１）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびＣ 18/20 エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびΔ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
（２）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびΔ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびΔ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
よりなる群から選択される少なくとも一組の遺伝子
ｂ）（１）Δ１２デサチュラーゼ、
（２）Δ９デサチュラーゼ、
（３）Ｃ 14/16 エロンガーゼ、
（４）Ｃ 16/18 エロンガーゼ
よりなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）ｉ．）ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＰＤＡＴよりなる群から選択されるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、
ｉｉ．）アシル−ＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、
ｉｉｉ．）グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、
ｉｖ．）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、
ｖ．）ホスホリパーゼＣ、および
ｖｉ．）ホスホリパーゼＡ 2
よりなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞であって、
（１）背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするあらゆる天然遺伝子を欠いており、
（２）背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が、リパーゼ１（Ｌｉｐ１−）、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼＡＣＯ３（Ｐｏｘ３−）、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ２（Ｐｏｘ２−）、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（Ｕｒａ３−）、サッカロピンデヒドロゲナーゼ（Ｌｙｓ５−）、リパーゼ２（Ｌｉｐ２−）、およびイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕ２−）よりなる群から選択される酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている、組換え生産宿主細胞。
態様１７． 宿主が全脂肪酸の％として少なくとも約５％のアラキドン酸を含んでなる微生物油を生成する態様１または２のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。
態様１８． 宿主がアラキドン酸を含んでなる微生物油を生成し、微生物油があらゆるγ−リノール酸を欠いている態様１または２のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。
態様１９． ａ）請求項１または２のいずれかに記載の生産宿主を培養して、アラキドン酸を含んでなる微生物油が生成され、そして、
ｂ）場合によりステップ（ａ）の微生物油を回収すること
を含んでなるアラキドン酸を含んでなる微生物油の生成方法。
態様２０． 態様１９に記載の方法によって生成される微生物油。
態様２１． 油が少なくとも約５％のアラキドン酸を含有する態様２０に記載の微生物油。
態様２２． 油がリノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノール酸、アラキドン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選択される脂肪酸を含んでなる態様２０に記載の混合油。
態様２３． 態様１９に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる食品。
態様２４． 類似食品、肉製品、穀物製品、ベーカリー食品、スナック食品、および乳製品よりなる群から選択される態様２３に記載の食品。
態様２５． 態様１９に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる、メディカルフード、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品。
態様２６． 態様１９に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる動物飼料。
態様２７． ペットフード、反芻動物飼料、家禽飼料、および水産養殖飼料よりなる群から選択される態様２６に記載の動物飼料。
態様２８． 有効量の微生物油を含んでなり、場合により請求項１または２のいずれか一項に記載の組換え宿主を含んでなる、酵母バイオマスを含んでなる動物飼料。
態様２９． 酵母バイオマスが、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、および核酸よりなる群から選択される飼料栄養素を含んでなる態様２８に記載の動物飼料。
態様３０． 態様１９に記載の方法によって生成される微生物油と食品とを組み合わせることを含んでなる、アラキドン酸で栄養強化された食品の製造方法。
態様３１． メディカルフード、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品の製造方法であって、態様１９に記載の方法によって生成される微生物油と製品とを組み合わせることを含んでなる、アラキドン酸で製品が栄養強化される方法。
態様３１． 態様１９に記載の方法によって生成される微生物油と動物飼料とを組み合わせることを含んでなる、アラキドン酸で栄養強化された動物飼料の製造方法。
態様３３． 態様２６に記載の動物飼料と飼料栄養素を含んでなる酵母バイオマスとを組み合わせることを含んでなる、アラキドン酸を含んでなる動物飼料を飼料栄養素で栄養強化する方法。
態様３４． 飼料栄養素が、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、および核酸よりなる群から選択される態様３３に記載の方法。
態様３５． ヒトまたは動物によって消費可能または使用可能な形態でアラキドン酸を含有する態様１９に記載の方法によって生成される微生物油を提供することを含んでなる、アラキドン酸で強化された栄養補助食品をヒト、動物または水産養殖生物に提供する方法。
態様３６． ＡＴＣＣ名称ＡＴＣＣ を有する、アラキドン酸生成に有用な組換え生産宿主ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７。
ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を図示する。 油性酵母における脂質蓄積のための生化学的機序の概略図である。 油性酵母中の脂質蓄積における様々なアシルトランスフェラーゼの役割を示す概略図である。 総脂質画分中に（ＡＲＡをはじめとする）様々な脂肪酸を生成する、本発明のいくつかのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の開発を図示する。 ｐＹ５−３０のプラスミドマップを提供する。 組織化学的染色によって判定された、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２株中のＴＥＦ、ＧＰＤ、ＧＰＭ、ＦＢＡ、およびＦＢＡＩＮの相対プロモーター活性を図示する。 組織化学的染色によって判定された、様々な培地中で生育させたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のＹＡＴ１、ＴＥＦ、ＧＰＡＴ、およびＦＢＡＩＮの相対プロモーター活性を図示する。 蛍光定量的に判定されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２株中のＧＰＤ、ＧＰＭ、ＦＢＡ、およびＦＢＡＩＮのプロモーター活性を比較するグラフである。 Ｙ．リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２株中のＧＵＳ ｍＲＮＡ（すなわちＧＰＤ：：ＧＵＳ、ＧＰＤＩＮ：：ＧＵＳ、ＦＢＡ：：ＧＵＳまたはＦＢＡＩＮ：：ＧＵＳキメラ遺伝子を発現する）をｐＹ５−３０（すなわちキメラＴＥＦ：：ＧＵＳ遺伝子）を発現するＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株のｍＲＮＡレベルと比べて定量化する、リアルタイムＰＣＲ相対計量の結果を図表を用いて要約する。 ｐＹ５７．ＹＩ．ＡＨＡＳ．ｗ４９７１のプラスミドマップを提供する。 ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅのプラスミドマップを提供する。 ｐＤＭＷ２３２のプラスミドマップを提供する。 ｐＤＭＷ２７１のプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＫＵＮＴ２、（Ｂ）ｐＺＵＦ１７、（Ｃ）ｐＤＭＷ２３７、（Ｄ）ｐＤＭＷ２４０および（Ｅ）酵母発現ベクターｐＹ８９−５のプラスミドマップを提供する。 ｐＫＵＮＴ２のプラスミドマップを提供する。 ｐＺＵＦ１７のプラスミドマップを提供する。 ｐＤＭＷ２３７のプラスミドマップを提供する。 ｐＤＭＷ２４０のプラスミドマップを提供する。 酵母発現ベクターｐＹ８９−５のプラスミドマップを提供する。 ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）細胞抽出物の脂質プロフィールのクロマトグラムを示す。 様々なミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼポリペプチド配列のアラインメントを示す。使用したアラインメント法は「クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｖアラインメント法」に相当する。 ｐＫＵＮＦｍＫＦ２のプラスミドマップを提供する。 ｐＤＭＷ２７７のプラスミドマップを提供する。 ｐＺＦ５Ｔ−ＰＰＣのプラスミドマップを提供する。 ｐＤＭＷ２８７Ｆのプラスミドマップを提供する。 ｐＤＭＷ２９７のプラスミドマップを提供する。 ｐＺＰ２Ｃ１６Ｍ８９９のプラスミドマップを提供する。 ｐＤＭＷ３１４のプラスミドマップを提供する。 ｐＤＭ３２２のプラスミドマップを提供する。 ｐＺＫＬ５５９８のプラスミドマップを提供する。 ｐＺＰ３Ｌ３７のプラスミドマップを提供する。 ｐＹ３７／Ｆ１５のプラスミドマップを提供する。 ｐＫＯ２ＵＦ２ＰＥのプラスミドマップを提供する。 ｐＺＫＵＴ１６のプラスミドマップを提供する。 ｐＫＯ２ＵＭ２５Ｅのプラスミドマップを提供する。 ｐＺＫＵＧＰＩ５Ｓのプラスミドマップを提供する。 ｐＤＭＷ３０２Ｔ１６のプラスミドマップを提供する。 ｐＺＫＵＧＰＥ１Ｓのプラスミドマップを提供する。 ｐＫＯ２ＵＭ２６Ｅのプラスミドマップを提供する。 ｐＺＵＦ−Ｍｏｄ−１のプラスミドマップを提供する。 ｐＭＤＡＧＡＴ１−１７のプラスミドマップを提供する。 ｐＭＧＰＡＴ−１７のプラスミドマップを提供する。 それぞれモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）中のグリセロール−３−リン酸−ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）に関与する、配列番号９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、および１０７の間の関係を図表を用いて表す。 それぞれモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）中のＣ１６／１８脂肪酸エロンガーゼ酵素（ＥＬＯ３）に関わる、配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０の間の関係を図表を用いて表す。 ｐＺＵＦ６Ｓのプラスミドマップを提供する。 ｐＺＵＦ６Ｓ−Ｅ３ＷＴのプラスミドマップを提供する。 ｐＺＫＵＧＰＹＥ１−Ｎのプラスミドマップを提供する。 ｐＺＫＵＧＰＹＥ２のプラスミドマップを提供する。 ｐＺＫＵＧＰＹＥ１のプラスミドマップを提供する。 ｐＺＵＦ６ＦＹＥ１のプラスミドマップを提供する。 ｐＺＰ２ｌ７＋Ｕｒａのプラスミドマップを提供する。 ｐＹ２０のプラスミドマップを提供する。 ｐＬＶ１３のプラスミドマップを提供する。

Claims (7)

  1. ａ）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および、Ｃ18/20エロ
    ンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
    ｂ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、ならびに、
    ｃ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、ここで、当該Δ１２デサチュラーゼ遺伝子は配列番号２８のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
    のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子を油性のヤロウィア・リポリティカ酵母に導入することにより得られる、アラキドン酸（ＡＲＡ）生成のための組換え生産宿主細胞であって、
    ここで、当該油性ヤロウィア・リポリティカ酵母はその細胞乾燥重量の２５％を超える量を油として蓄積するものであり、また、当該組換え生産宿主細胞は細胞の総脂質中少なくとも５％のアラキドン酸を生産することができることを特徴とする、組換え生産宿主細胞。
  2. ａ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および、Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
    ｂ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、ならびに、
    ｃ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、ここで、当該Δ１２デサチュラーゼ遺伝子は配列番号２８のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、
    のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を油性のヤロウィア・リポリティカ酵母に導入することにより得られる、アラキドン酸（ＡＲＡ）生成のための組換え生産宿主細胞であって、
    ここで、当該油性ヤロウィア・リポリティカ酵母はその細胞乾燥重量の２５％を超える量を油として蓄積するものであり、また、当該組換え生産宿主細胞は細胞の総脂質中少なくとも５％のアラキドン酸を生産することができることを特徴とする、組換え生産宿主細胞。
  3. 油性ヤロウィア・リポリティカ酵母がイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕ２）酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いていることを特徴とする、請求項１に記
    載の組換え生産宿主細胞。
  4. Ｃ16/18エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子がさらに油性ヤロウィア・リポリティカ酵母に導入され、また、当該油性ヤロウィア・リポリティカ酵母がサッカロピンデヒドロゲナーゼ（Ｌｙｓ５）酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いていることを特徴とする、請求項２に記載の組換え生産宿主細胞。
  5. （１）Δ９デサチュラーゼ、
    （２）Ｃ14/16エロンガーゼ、および、
    （３）Ｃ16/18エロンガーゼ、
    よりなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子がさらに油性ヤロウィア・リポリティカ酵母に導入されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の組換え生産宿主細胞。
  6. ｉ）ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＰＤＡＴよりなる群から選択されるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、
    ii）アシル−ＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、
    iii）グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、および
    iv）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、
    よりなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子がさらに油性ヤロウィア・リポリティカ酵母に導入されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の組換え生産宿主細胞。
  7. ａ）請求項１または２に記載の組換え生産宿主細胞を培養して、アラキドン酸を含んでなる微生物油が生成され、そして、
    ｂ）ステップ（ａ）の微生物油を回収すること
    を含んでなるアラキドン酸を含んでなる微生物油の生成方法。
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