KR20080071190A - 델타-９ 일롱가제, 및 다중불포화 지방산 생성에 있어서의이들의 용도 - Google Patents

델타-９ 일롱가제, 및 다중불포화 지방산 생성에 있어서의이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리놀레산 [18:2, LA]을 에이코사디엔산 [20:2, EDA]으로 전환시키는 능력을 갖는 Δ9 일롱가제에 관한 것이다. Δ9 일롱가제를 코딩하는 단리된 핵산 단편 및 이러한 단편을 포함하는 재조합 구축물 및 이들 Δ9 일롱가제를 사용하여 식물 및 유질 효모에서 장쇄 다중불포화 지방산 (PUFA)을 생성하는 방법이 개시되어 있다.
리놀레산, 에이코사디엔산, Δ9 일롱가제, 핵산 단편, 재조합 구축물, 식물, 유질 효모, 장쇄 다중불포화 지방산, PUFA

Description

델타-９ 일롱가제, 및 다중불포화 지방산 생성에 있어서의 이들의 용도 {DELTA-9 ELONGASES AND THEIR USE IN MAKING POLYUNSATURATED FATTY ACIDS}
본 출원은 2005년 11월 23일자로 출원한 미국 가출원 제60/739,989호의 이점을 청구하며, 상기 문헌의 전문은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 생명공학 분야에 속한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 Δ9 지방산 일롱가제(elongase) 효소를 코딩하는 핵산 단편의 동정, 및 장쇄 다중불포화 지방산 (PUFA)의 생성에 있어서 이들 일롱가제의 용도에 관한 것이다.
PUFA의 중요성은 명백하다. 예를 들어, 특정 PUFA는 건강한 세포의 중요한 생물학적 성분으로서, 포유동물에서는 드 노보(de novo) 합성될 수 없고 대신에 먹이로 구하거나 리놀레산 (LA, 18:2 ω-6) 또는 α-리놀렌산 (ALA, 18:3 ω-3)의 추가의 탈포화 및 신장에 의해 얻어야 하는 "필수" 지방산이고; 세포 세포질막의 구성성분으로서, 인지질 또는 트리아실글리세롤과 같은 형태로 존재할 수 있고; 적당한 발생 (특히, 유아(infant) 뇌의 발생) 및 조직 형성 및 복구에 필요하며; 포유동물에서 중요한 여러가지 생물학적 활성 에이코사노이드 (예컨대, 프로스타사이클린, 에이코사노이드, 류코트리엔, 프로스타글란딘)의 전구체로 인식된다. 추가로, 장쇄 ω-3 PUFA의 다량 섭취는 심혈관 보호 효과가 있다 ([Dyerberg, J. et al., Amer. J. Clin. Nutr., 28:958-966 (1975)], [Dyerberg, J. et al., Lancet, 2(8081):117-119 (July 15, 1978)], [Shimokawa, H., World Rev. Nutr. Diet, 88:100-108 (2001)], [von Schacky, C. and Dyerberg, J., World Rev. Nutr. Diet, 88:90-99 (2001)]). 수많은 다른 연구는 다양한 증상 및 질환 (예를 들어, 천식, 건선, 습진, 당뇨병, 암)에 대하여 ω-3 및/또는 ω-6 PUFA 투여가 부여하는 광범위한 범위의 건강상의 이익을 증명한다.
오늘날, 식물, 조류(algae), 진균 및 효모를 비롯한 다양한 각종 숙주가 상업적인 PUFA 생성을 위한 수단으로 조사되고 있다. 숙주 유기체의 천연 PUFA-생성 능력은 때때로 주어진 방법에 특이적이지만, 유전자 조작은 또한 몇가지 숙주의 천연 능력 (심지어는, 천연적으로 LA 및 ALA 지방산 생성으로 한정된 것들까지도 포함됨)이 실질적으로 증대되어 각종 장쇄 ω-3/ω-6 PUFA를 높은 수준으로 생성할 수 있다는 것도 입증하였다. 이러한 효과가 천연적인 능력 때문인지 또는 재조합 기술 때문인지간에, 아라키돈산 (ARA, 20:4 ω-6), 에이코사펜타엔산 (EPA, 20:5 ω-3) 및 도코사헥사엔산 (DHA, 22:6 ω-3)의 생성은 모두가 Δ9 일롱가제/Δ8 데새투라제(desaturase) 경로 (몇가지 유기체, 예컨대 녹색편모충 종에서 작용하며, 에이코사디엔산 [EDA, 20:2 ω-6] 및/또는 에이코사트리엔산 [ETrA, 20:3 ω-3]의 생성을 특징으로 함) 또는 Δ6 데새투라제/Δ6 일롱가제 경로 (주로 조류, 이끼류, 진균류, 선충류 및 인간에서 발견되고, 감마-리놀레산 [GLA, 18:3 ω-6] 및/또는 스테아리돈산 [STA, 18:4 ω-3])의 생성을 특징으로 함)의 발현을 필요로 한다 (도 1).
본원에서의 목적상, 본 출원은 Δ9 일롱가제/Δ8 데새투라제 경로의 용도, 더욱 구체적으로는 Δ9 일롱가제 효소의 용도에 초점을 맞춘다. 지금까지 동정된 대부분의 Δ9 일롱가제 효소는 LA를 EDA로 전환시키는 능력과 ALA를 ETrA로 전환시키는 능력을 둘다 보유한다 (여기서, 이후에 EDA 및 ETrA 각각으로부터 DGLA 및 ETA가 합성된 후에 Δ8 데새투라제에 의한 반응이 진행되고, 이후에는 DGLA 및 ETA 각각으로부터 ARA 및 EPA가 합성된 후에 Δ5데새투라제에 의한 반응이 진행되며, DHA 합성에는 추가의 C20 /22 일롱가제 및 Δ4 데새투라제의 추후 발현이 필요함).
ARA, EPA 및 DHA를 생성하는 새로운 방법이 필요함에도 불구하고, Δ9 일롱가제 효소는 거의 동정된 바 없다. 예를 들어, 유일한 1가지 Δ9 일롱가제가 본 출원인의 발명 이전의 최근에 공지되어 있다. 구체적으로, PCT 공개 제WO 2002/077213호, 동 제WO 2005/083093호, 동 제WO 2005/012316호 및 동 제WO 2004/057001호는 이소크리시스 갈바나(Isochrysis galbana)로부터의 Δ9 일롱가제 및 그의 용도 (또한 진뱅크(GenBank) 관리 번호 AAL37626 참조)에 관하여 기재한다. 따라서, ω-3/ω-6 지방산의 생성에 사용하기 위한 다양한 숙주 유기체에서의 이종 발현에 적합한 Δ9 일롱가제를 코딩하는 추가의 유전자를 동정 및 단리할 필요가 있다.
과거에 동정되었던 일롱가제는 작용하는 기질 면에서 상이하다. 이것들은 동물과 식물 모두에 존재한다. 포유동물에서 발견되는 것은 포화, 모노불포화 및 다중불포화 지방산에 작용할 수 있다. 그러나, 식물에서 발견되는 것은 포화 및 모노불포화 지방산에 특이적이다. 따라서, 식물에서 PUFA를 생성하기 위해서는 PUFA-특이적 일롱가제가 필요하다.
식물에서의 신장 과정은 말로네이트 및 지방산이 축합되면서 이산화탄소 분자가 방출되는 중요한 단계에 의해 개시되는 4-단계 과정을 수반한다. 지방산 신장시의 기질은 CoA-티오에스테르이다. 축합 단계는 3-케토아실 신타제에 의해 매개되며, 일반적으로 4개 반응의 전체 주기에서의 속도-제한 단계이고 약간의 기질 특이성을 제공한다. 1회 신장 주기의 생성물은 2개 탄소 원자 만큼 연장된 지방산을 재생한다 ([Browse et al., Trends in Biochemical Sciences, 27(9):467 473 (September 2002)], [Napier, Trends in Plant Sciences, 7(2):51 54 (February 2002)]).
Δ9 일롱가제와 Δ8 데새투라제를 발현하는 것과 관련한 유용성을 기초로 하여, 다양한 공급원으로부터 Δ8 데새투라를 동정하고 특징규명하려는 상당한 노력이 있었다. 지금까지의 대부분의 노력은 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)로부터 Δ8 데새투라제를 단리하고 특징규명하는 것에 초점을 맞추었고, 이. 그라실리스 Δ8 데새투라제의 여러가지 서열 변이가 보고된 바 있다 (예를 들어, [Wallis et al., Arch. Biochem. and Biophys., 365(2):307-316 (May 1999)], PCT 공개 제WO 2000/34439호, 미국 특허 제6,825,017호, PCT 공개 제WO 2004/057001호, 2005년 6월 24일자로 출원한 미국 출원 제11/166,003호 (PCT 공개 제WO 2006/012325호 및 동 제WO 2006/012326호, 2006년 2월 2일 공개) 참조). 보다 최 근에는, PCT 공개 제WO 2005/103253호 (2005년 4월 22일 공개)가 파블로바 살리나(Pavlova salina)의 Δ8 데새투라제 효소에 대한 아미노산 및 핵산 서열을 개시하였다. 문헌 [Sayanova et al., FEBS Lett., 580:1946-1952 (2006)]은 자유롭게 살아있는 토양 아메바인 아칸트아메바 카스텔라니이(Acanthamoeba castellanii)로부터 아라비돕시스(Arabidopsis)에서 발현되면 C20 Δ8 데새투라제를 코딩하는 cDNA를 단리하고 특징규명한 것에 대하여 기재하였다. 또한, 본원과 공동 명의이고 본원과 동시 계류 중인 출원인 가출원 제60/795810호 (2006년 4월 28일자 출원)는 파블로바 루테리(Pavlova lutheri) (CCMP459)로부터의 Δ8 데새투라제 효소에 대한 아미노산 및 핵산 서열을 개시하였고, 본원과 공동 명의이고 본원과 동시 계류 중인 출원인, 2006년 10월 23일자로 출원한 미국 가출원 제60/853563호는 녹색편모충인 테트루에트레프티아 폼퀘텐시스(Tetruetreptia pomquetensis) CCMP1491, 유트레프티엘라(Eutreptiella) 종 CCMP389 및 유트레프티엘라 짐나스티카(Eutreptiella cf_gymnastica) CCMP1594로부터의 Δ8 데새투라제를 개시하였다.
본원과 공동 명의의 하기 특허 출원서는 유질(oleaginous) 효모 (즉, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)) 중에서의 PUFA 생성에 관한 것이다: PCT 공개 제WO 2004/101757호 및 PCT 공개 제WO 2004/101753호 (둘다 2004년 11월 25일자로 공개됨), 미국 출원 제11/265,761호 (2005년 11월 2일자 출원. PCT 공개 제WO 2006/052870호에 상응함), 미국 출원 제11/264,784호 (2005년 11월 1일자 출원. PCT 공개 제WO 2006/055322호에 상응함), 및 미국 출원 제11/264,737호 (2005년 11 월 1일자 출원. PCT 공개 제WO 2006/052871호에 상응함) 등.
추가로, PCT 공개 제WO 2004/071467호 (2004년 8월 26일자로 공개됨)는 식물에서의 PUFA 생성에 관한 것이며, PCT 공개 제WO 2004/071178호 (2004년 8월 26일자로 공개됨)는 안넥신 프로모터, 및 식물에서의 트랜스진(transgene) 발현에 있어서의 이들의 용도에 관한 것으로, 이들 2가지 모두가 본원과 공동 명의이며 동시 계류 중이다.
본 출원인은 유글레나 그라실리스 및 유트레프티엘라 종 CCMP389로부터 Δ9 일롱가제를 코딩하는 유전자를 단리함으로써 상술한 문제를 해결하였다.
발명의 요약
본 발명은 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 신규한 유전자 구축물, 및 식물, 조류, 박테리아, 효모 및 진균에서의 PUFA 생성을 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은
(a) 클러스탈 브이(Clustal V) 정렬 방법을 기초로 하여 서열 2 또는 서열 5에 기재된 바와 같은 아미노산 서열과 비교할 때 70％ 이상의 아미노산 동일성을 가지며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열,
(b) BLASTN 정렬 방법을 기초로 하여 서열 1, 서열 3, 서열 4 또는 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 비교할 때 70％ 이상의 서열 동일성을 가지며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하 는 단리된 핵산 서열,
(c) 0.1× SSC, 0.1％ SDS 중 65℃에서의 혼성화 및 2× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척 및 이후 0.1× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척의 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 1, 서열 3, 서열 4 또는 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 혼성화하며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열, 또는
(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 뉴클레오티드 서열과 동일한 수의 뉴클레오티드로 이루어지며 100％ 상보적인, 상기 (a), (b) 또는 (c)의 뉴클레오티드 서열의 상보체
로 구성된 군에서 선택된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 아미노산 서열이
(a) 서열 2 또는 서열 5에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 및
(b) 1개 이상의 보존적 아미노산 치환으로 인해 상기 (a)에서의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열
로 구성된 군에서 선택된 Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 핵산 서열로 형질전환된 숙주 세포를 제공하며, 바람직한 숙주 세포는 예를 들어 조류, 박테리아, 효모, 난균 및 진균과 같은 미생물 종이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은
a) i) (1) 클러스탈 브이 정렬 방법을 기초로 하여 서열 2 또는 서열 5에 기재된 바와 같은 아미노산 서열과 비교할 때 70％ 이상의 아미노산 동일성을 가지며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열, 및
(2) 0.1× SSC, 0.1％ SDS 중 65℃에서의 혼성화 및 2× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척 및 이후 0.1× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척의 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 1, 서열 3, 서열 4 또는 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 혼성화하며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열
로 구성된 군에서 선택된, Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열, 및
(ii) 리놀레산의 공급원
을 포함하는 단리된 형질전환된 효모 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 발현되고 리놀레산이 에이코사디엔산으로 전환되는 조건하에서 상기 단계 (a)의 효모 숙주 세포를 성장시키는 단계, 및
c) 임의로, 상기 단계 (b)의 에이코사디엔산을 회수하는 단계
를 포함하는, 에이코사디엔산의 생성 방법을 제공한다.
별법의 실시양태에서, 본 발명은
a) i) (1) 클러스탈 브이 정렬 방법을 기초로 하여 서열 2 또는 서열 5에 기 재된 바와 같은 아미노산 서열과 비교할 때 70％ 이상의 아미노산 동일성을 가지며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열, 및
(2) 0.1× SSC, 0.1％ SDS 중 65℃에서의 혼성화 및 2× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척 및 이후 0.1× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척의 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 1, 서열 3, 서열 4 또는 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 혼성화하며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열
로 구성된 군에서 선택된, Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열, 및
(ii) α-리놀렌산의 공급원
을 포함하는 단리된 형질전환된 효모 숙주 세포를 제공하는 단계,
b) Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 발현되고 α-리놀렌산이 에이코사트리엔산으로 전환되는 조건하에서 상기 단계 (a)의 숙주 세포를 성장시키는 단계, 및
c) 임의로, 상기 단계 (b)의 에이코사트리엔산을 회수하는 단계
를 포함하는, 에이코사트리엔산의 생성 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 형질전환된 숙주에 의해 생성된 미생물 오일을 제공한다.
별개의 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 미생물 오일을 포함하는 식품을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 오일을 포함하는 동물 사료를 제공한다.
생물학적 기탁
하기하는 플라스미드는 미국 20110-2209 버지니아주 만나사스 유니버시티 불러버드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에 기탁되었고, 다음과 같은 명칭, 관리 번호 및 기탁일을 갖는다 (표 1):
ATCC 기탁물
플라스미드 관리 번호 기탁일
pKR72 PTA-6019 2004년 5월 28일
pKR275 PTA-4989 2003년 1월 30일
pKR585 PTA-6279 2004년 11월 4일
pKR578 PTA-6280 2004년 11월 4일
도면의 간단한 설명 및 서열 기재
도 1은 미리스트산이 각종 중간체를 거쳐 DHA로 전환되는 ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로를 예시한다.
도 2는 본 발명의 유글레나 그라실리스 Δ9 일롱가제의 아미노산 서열 (서열 2), 본 발명의 유트레프티엘라 종 CCMP389 Δ9 일롱가제의 아미노산 서열 (서열 5), 및 이소크리시스 갈바나 (NCBI 관리 번호: AAL37626 (GI 17226123))로부터의 장쇄 PUFA 신장 효소의 아미노산 서열 (서열 8)의 클러스탈 브이 정렬 (디폴트 파라미터 포함)을 보여준다.
도 3은 유글레나 그라실리스 세포 추출물의 지질 프로파일 크로마토그램을 보여준다 (실시예 1).
도 4는 본 발명의 유글레나 그라실리스 Δ9 일롱가제의 아미노산 서열 (서열 2), 및 이소크리시스 갈바나 (NCBI 관리 번호: AAL37626 (GI 17226123))로부터의 장쇄 PUFA 신장 효소의 아미노산 서열 (서열 8)의 클러스탈 브이 정렬 (디폴트 파라미터 포함)을 보여준다.
도 5는 플라스미드 pY119의 맵이다.
도 6은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 중 유글레나 그라실리스 Δ9 일롱가제 (EgD9e)의 기능적 분석에 대한 결과이다.
도 7A는 플라스미드 pY5-30의 맵이고, 도 7B는 플라스미드 pDMW263의 맵이며, 도 7C는 pZUF17의 플라스미드 맵이다.
도 8은 플라스미드 pY115의 맵이다.
도 9A는 야로위아 리폴리티카 게이트웨이(Gateway)® 데스티네이션 벡터(destination vector) pBY1의 맵이고, 도 9B는 플라스미드 pBY2의 맵이며, 도 9C는 플라스미드 pBY1-FAE의 맵이다.
도 10은 유글레나 그라실리스 Δ9 일롱가제 유전자의 DNA 서열 (EgD9e, 서열 1)과 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 유전자의 DNA 서열 (EgD9eS, 서열 3) 사이의 비교를 보여준다.
도 11A는 플라스미드 pY120의 맵이며, 도11B는 플라스미드 pKR912의 맵이다.
도 12A는 플라스미드 pKR911의 맵이며, 도 12B는 플라스미드 pKR913의 맵이다.
도 13A는 플라스미드 pKR886의 맵이며, 도 13B는 플라스미드 pKR886r의 맵이다.
도 14A는 플라스미드 pKR669의 맵이며, 도 14B는 플라스미드 pKR873의 맵이다.
도 15A는 pFBAIN-389Elo의 플라스미드 맵이며, 도 15B는 pZUFE389S의 플라스미드 맵이다.
도 16은 유트레프티엘라 종 CCMP389 Δ9 일롱가제 유전자의 DNA 서열 (E389D9e, 서열 4)과 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 유전자의 DNA 서열 (E389D9eS, 서열 6) 사이의 비교를 보여준다.
본 발명은 하기하는 발명의 상세한 설명 및 첨부하는 도면 및 서열 목록으로부터 보다 완벽하게 이해될 수 있으며, 이러한 기재는 본 출원서의 일부를 구성한다.
하기 서열은 37 C.F.R. §1.821 내지 1.825 ("뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열 기재를 포함하는 특허 출원에 대한 요건 - 서열 규칙")에 따르며, 세계 지적 재산권 기구 (WIPO) 기준 ST.25 (1998) 및 EPO 및 PCT의 서열 목록 요건 (규칙 5.2 및 49.5(a-bis), 및 시행세칙의 제208항 및 부록 C)에 부합한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이타에 사용된 부호 및 포맷은 37 C.F.R. §1.822에 기재된 규칙에 따른다.
서열 목록에 대한 언급
서열 1 내지 서열 17, 서열 21, 서열 22, 서열 45 내지 서열 48, 서열 51 내지 서열 61, 서열 68 내지 서열 71, 서열 76 내지 서열 79, 서열 81 내지 서열 93, 서열 96 내지 서열 102 및 서열 118 내지 서열 129는 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 유전자 또는 단백질 (또는 그의 일부)을 코딩하는 ORF 또는 플라스미드이다:
Figure 112008044342784-PCT00001
Figure 112008044342784-PCT00002
Figure 112008044342784-PCT00003
Figure 112008044342784-PCT00004
서열 18은 유글레나 그라실리스 cDNA 라이브러리 eeg1c의 서열분석에 사용된 M13F 범용 프라이머(universal primer)이다.
서열 19 및 서열 20은 클론 eeg1c.pk001.n5.f로부터의 EgD9e 증폭에 사용된 프라이머 oEugEL1-1 및 oEugEL1-2 각각에 상응한다.
서열 23 내지 서열 38은 IgD9eS의 증폭에 사용된 프라이머 IL3-1A, IL3-1B, IL3-2A, IL3-2B, IL3-3A, IL3-3B, IL3-4A, IL3-4B, IL3-5A, IL3-5B, IL3-6A, IL3-6B, IL3-7A, IL3-7B, IL3-8A 및 IL3-8B 각각에 상응한다.
서열 39 내지 서열 42는 IgD9eS의 증폭에 사용된 프라이머 IL3-1F, IL3-4R, IL3-5F 및 IL3-8R 각각에 상응한다.
서열 43은 pT9(1-4)로부터의 417 bp NcoI/PstI 단편이다.
서열 44는 pT9(5-8)로부터의 377 bp PstI/NotI 단편이다.
서열 49 및 서열 50은 벡터 pY115로부터의 IgD9eS 증폭에 사용된 프라이머 프라이머 ig-s 및 ig-as 각각에 상응한다.
서열 62 및 서열 63은 cDNA로부터의 EgD8 증폭에 사용된 프라이머 Eg5-1 및 Eg3-3 각각에 상응한다.
서열 64 내지 서열 67은 EgD8의 서열분석에 사용된 프라이머 T7, M13-28Rev, Eg3-2 및 Eg5-2 각각에 상응한다.
서열 72는 pKR457에 대한 KTi 카세트 5'-말단 다중 클로닝 부위 (MCS)의 서열이다.
서열 73은 콩 알부민 전사 3' 종결자를 포함하는, pKR457에 대한 KTi 카세트 3'-말단 다중 클로닝 부위 (MCS)의 서열이다.
서열 74 및 서열 75는 콩 게놈 DNA로부터의 콩 알부민 전사 종결자 증폭에 사용된 프라이머 oSalb-12 및 oSalb-13 각각에 상응한다.
서열 80은 pKR767 생성을 위해 pKR287에 부가된 제한 부위에 상응한다.
서열 94 및 서열 95는 pKR160의 제작 동안 제한 부위의 생성에 사용된 프라이머 oSAlb-9 및 oSAlb-2 각각에 상응한다.
서열 103 내지 서열 105는 유트레프티엘라 종 CCMP389의 cDNA 합성에 사용된 스마트(SMART)™ IV 올리고뉴클레오티드 프라이머, CDSIII/3' PCR 프라이머 및 5'-PCR 프라이머 각각에 상응한다.
서열 106은 서열 107에 기재된 펩티드를 코딩하는 동의성(degenerate) 프라이머 EuEF3의 뉴클레오티드 서열이다. 유사하게, 서열 108은 서열 109에 기재된 펩티드를 코딩하는 동의성 프라이머 EuER3의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 110 내지 서열 113은 E389D9e를 코딩하는 cDNA의 5'-말단 PCR 증폭에 사용된 프라이머 389Elo-5-1, 389Elo-5-2, DNR CDS 5'-2 및 389Elo-5-4 각각에 상응한다.
서열 114 및 서열 115는 E389D9를 코딩하는 cDNA의 3'-말단 PCR 증폭에 사용된 프라이머 389Elo-3-1 및 389Elo-3-2 각각에 상응한다.
서열 116 및 서열 117은 E389D9e를 코딩하는 전장 cDNA의 증폭에 사용된 프라이머 389ELO-F 및 389ELO-R1 각각에 상응한다.
본원에서 언급한 모든 특허, 특허 출원 및 공개공보는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 구체적으로, 여기에는 하기하는 본원과 동시 명의의 동시 계류 중인 출원들이 포함된다: 미국 특허 출원 제10/840478호, 동 제10/840579호 및 동 제10/840325호 (2004년 5월 6일자 출원), 미국 특허 출원 제10/869630호 (2004년 6월 16일자 출원), 미국 특허 출원 제10/882760호 (2004년 7월 1일자 출원), 미국 특허 출원 제10/985109호 및 동 제10/985691호 (2004년 11월 10일자 출원), 미국 특허 출원 제10/987548호 (2004년 11월 12일자 출원), 미국 특허 출원 제11/024545호 및 동 제11/024544호 (2004년 12월 29일자 출원), 미국 특허 출원 제11/166993호 (2005년 6월 24일자 출원), 미국 특허 출원 제11/183664호 (2005년 7월 18일자 출원), 미국 특허 출원 제11/185301호 (2005년 7월 20일자 출원), 미국 특허 출원 제11/190750호 (2005년 7월 27일자 출원), 미국 특허 출원 제11/198975호 (2005년 8월 8일자 출원), 미국 특허 출원 제11/225354호 (2005년 9월 13일자 출원), 미국 특허 출원 제11/251466호 (2005년 10월 14일자 출원), 미국 특허 출원 제11/254173호 및 동 제11/253882호 (2005년 10월 19일자 출원), 미국 특허 출원 제11/264784호 및 동 제11/264737호 (2005년 11월 1일자 출원), 미국 특허 출원 제11/265761호 (2005년 11월 2일자 출원), 미국 특허 출원 제60/739989호 (2005년 11월 23일자 출원), 미국 특허 출원 제60/795810호 (2006년 4월 28일자 출원), 미국 특허 출원 제60/793575호 (2006년 4월 20일자 출원), 미국 특허 출원 제60/796637호 (2006년 5월 2일자 출원), 미국 특허 출원 제60/801172호 (2006년 5월 17일자 출원), 미국 특허 출원 제60/801119호 (2006년 5월 17일자 출원), 미국 특허 출원 제60/853563호 (2006년 10월 23일자 출원), 미국 특허 출원 제60/855177호 (2006년 10월 30일자 출원). 여기에는 하기하는 본원과 동시 명의의 동시 계류 중인 출원들이 추가로 포함된다: 식물에서의 PUFA 생성에 관한 미국 특허 출원 제10/776311호, 및 안넥신 프로모터 및 식물 중 트랜스진 발현에 있어서의 이들의 용도에 관한 미국 특허 출원 제10/776889호.
본 발명은 건강상 유익한 PUFA의 생성을 위한 생화학적 경로의 조작에 사용될 수 있는 신규한 유글레나 그라실리스 및 유트레프티엘라 종 CCMP389 Δ9 일롱가제 효소, 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본원에 개시한 방법으로 제조된 PUFA 또는 그의 유도체는 식이 대용물(dietary substitute) 또는 보조제, 및 유아용 조제식(infant formula)으로 사용될 수도 있고, 정맥내 영양보급을 받고 있는 환자에게 사용될 수도 있으며, 또는 영양불량의 예방 또는 치료용으로 사용될 수도 있다. 별법으로, 정제된 PUFA (또는 그의 유도체)는 제제화된 식용 오일, 지방 또는 마가린에 혼입되어 정상적인 사용시에는 수용자가 식이 보조용으로 원하는 양만큼 섭취할 수 있다. PUFA는 또한 유아용 조제식, 영양 보조제 또는 다른 식품에도 혼입될 수 있고, 소염제 또는 콜레스테롤 저하제로 사용될 수도 있다. 임의로, 상기 조성물은 제약 용도 (인간 또는 동물)에 사용될 수도 있다.
정의
본 명세서에서는 수많은 용어와 약어가 사용된다. 하기하는 정의가 제공된다.
"오픈 리딩 프레임"은 ORF로 약칭된다.
"폴리머라제 연쇄 반응"은 PCR로 약칭된다.
"아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션"은 ATCC로 약칭된다.
"다중불포화 지방산(들)"은 PUFA(들)로 약칭된다.
"트리아실글리세롤"은 TAG로 약칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 본 발명의 임의의 한 특정 실시양태로 한정되는 것을 의미하는 것이 아니며, 일반적으로 청구의 범위 및 명세서에 기재한 바와 같은 본 발명의 임의의 실시양태 및 모든 실시양태에 적용된다.
용어 "지방산"은 약 C12 내지 C22의 다양한 쇄 길이의 장쇄 지방족 산 (알칸산)을 지칭한다 (그러나, 더 긴 쇄 길이의 산과 더 짧은 쇄 길이의 산도 둘다 공지되어 있음). 주된 쇄 길이는 C16과 C22 사이이다. "포화 지방산" vs. "불포화 지방산", "모노불포화 지방산" vs. "다중불포화 지방산" (또는 "PUFA"), 및 "오메가-6 지방산" (ω-6 또는 n-6) vs. "오메가-3 지방산" (ω-3 또는 n-3) 사이의 구별에 관한 추가의 세부사항은 PCT 공개 제WO 2004/101757호에 기재되어 있다.
본원에서 지방산은 "X:Y" (여기서, X는 특정 지방산 중 탄소 (C) 원자의 수이고, Y는 이중 결합의 수임)의 간단한 표기 시스템으로 기재된다. 지방산 표기 뒤의 수는 해당 지방산에서 카르복실 말단으로부터의 이중 결합의 위치를 나타내고, 이때 "c"는 이중 결합의 시스-배위에 대한 것 [예를 들어, 팔미트산 (16:0), 스테아르산 (18:0), 올레산 (18:1, 9c), 페트로셀린산 (18:1, 6c), LA (18:2, 9c,12c), GLA (18:3, 6c,9c,12c) 및 ALA (18:3, 9c,12c,15c)]이다. 달리 명시하지 않는 한은 18:1, 18:2 및 18:3은 올레산, LA 및 ALA 지방산을 지칭한다. 달리 구체적으로 기재하지 않는다면, 이중 결합은 시스 배위라고 가정한다. 예를 들어, 18:2 (9,12)의 이중 결합은 시스 배위로 존재한다고 가정한다.
본 명세서에서 PUFA를 기재하는데 사용된 명명법을 하기 표 3에 나타낸다. "약칭 표기"라는 제목의 컬럼에서 오메가-시스템은 탄소의 수, 이중 결합의 수, 및 오메가 탄소와 가장 가까운 이중 결합의 위치를 오메가 탄소 (이러한 목적상, 1로 번호를 매김)로부터 세어서 표시하기 위해 사용된 것이다. 표 3의 나머지 부분은 ω-3 및 ω-6 지방산의 일반명 및 이들의 전구체, 본 명세서 전반에서 사용될 약어, 및 각 화합물의 화학적 명칭을 요약한다.
다중불포화 지방산 및 전구체의 명명법
일반명 약어 화학적 명칭 약칭 표기
미리스트산 -- 테트라데칸산 14:0
팔미트산 팔미테이트 헥사데칸산 16:0
팔미톨레산 -- 9-헥사데센산 16:1
스테아르산 -- 옥타데칸산 18:0
올레산 -- 시스-9-옥타데센산 18:1
리놀레산 LA 시스-9,12- 옥타데카디엔산 18:2 ω-6
감마-리놀렌산 GLA 시스-6,9,12- 옥타데카트리엔산 18:3 ω-6
에이코사디엔산 EDA 시스-11,14-에이코사디엔산 20:2 ω-6
디호모-감마- 리놀렌산 DGLA 시스-8,11,14- 에이코사트리엔산 20:3 ω-6
시아돈산 SCI 시스-5,11,14-에이코사트리엔산 20:3b ω-6
아라키돈산 ARA 시스-5,8,11,14- 에이코사테트라엔산 20:4 ω-6
알파-리놀렌산 ALA 시스-9,12,15- 옥타데카트리엔산 18:3 ω-3
스테아리돈산 STA 시스-6,9,12,15- 옥타데카테트라엔산 18:4 ω-3
에이코사트리엔산 ETrA 시스-11,14,17- 에이코사트리엔산 20:3 ω-3
에이코사테트라엔산 ETA 시스-8,11,14,17- 에이코사테트라엔산 20:4 ω-3
주니페론산 JUP 시스-5,11,14,17- 에이코사트리엔산 20:4b ω-3
에이코사펜타엔산 EPA 시스-5,8,11,14,17- 에이코사펜타엔산 20:5 ω-3
도코사펜타엔산 DPA 시스-7,10,13,16,19- 도코사펜타엔산 22:5 ω-3
도코사헥사엔산 DHA 시스-4,7,10,13,16,19- 도코사헥사엔산 22:6 ω-3
용어 "필수 지방산"은 특정 필수 지방산을 드 노보 합성할 수 없는 유기체가 생존을 위해 반드시 섭취해야 하는 상기 특정 PUFA를 지칭한다. 예를 들어, 포유동물은 필수 지방산 LA를 합성할 수 없다. 다른 필수 지방산으로는 GLA, DGLA, ARA, EPA 및 DHA 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
용어 "지방"은 25℃에서 고체이고 통상적으로 포화 상태인 지질 물질을 지칭한다.
용어 "오일"은 25℃에서 액체이고 통상적으로 다중불포화 상태인 지질 물질을 지칭한다. PUFA는 일부 조류, 유질 효모 및 섬유상 진균의 오일에 존재한다. "미생물 오일" 또는 "단일 세포 오일"은 미생물이 살아있는 동안에 천연적으로 생성한 오일이다.
용어 "트리아실글리세롤", "오일" 및 "TAG"는 글리세롤 분자로 에스테르화된 3개의 지방 아실 잔기로 이루어진 중성 지질을 지칭한다 (또한, 상기 용어들은 본원의 개시내용에서 구별없이 사용될 것임). 이러한 오일은 장쇄 PUFA 뿐만이 아니라 더 짧은 포화 및 불포화 지방산 및 더 긴 쇄의 포화 지방산까지도 함유할 수 있다. 따라서, "오일 생합성"은 일반적으로 세포내 TAG의 합성을 지칭한다.
"전체 지질 및 오일 분획 중 PUFA의 백분율(％)"은 그러한 분획 중 전체 지방산에 대한 PUFA의 백분율(％)을 지칭한다. 용어 "전체 지질 분획" 또는 "지질 분획"은 둘다 유질 유기체 내 모든 지질 (즉, 중성 및 극성)의 합을 지칭하며, 따라서 포스파티딜콜린 (PC) 분획, 포스파티딜에탄올아민 (PE) 분획 및 트리아실글리세롤 (TAG 또는 오일) 분획에 존재하는 지질도 포함한다. 그러나, 용어 "지질" 및 "오일"은 본 명세서에서 구별없이 사용될 것이다.
용어 "전환 효율" 및 "기질 전환율(％)"은 특정 효소 (예를 들어, 데새투라제)가 기질을 생성물로 전환시킬 수 있는 효율을 지칭한다. 전환 효율은 식 ([생성물]/[기질+생성물])×100 (여기서의 '생성물'은 그것이 유래된 경로 중의 중간 생성물 및 모든 생성물을 포함함)에 따라 결정된다.
생화학적 의미에서, 대사 경로 또는 생합성 경로는 세포 내에서 발생하는 일련의 화학 반응으로 간주될 수 있으며, 효소에 의해 촉매되어 세포에 의해 사용되거나 저장될 대사 생성물이 형성되거나 또는 또다른 대사 경로를 개시한다 (이후에는 흐름(flux) 생성 단계라 부름). 이들 경로 중 많은 것들이 정교하며, 초기 물질을 단계별로 변형시켜 원하는 정확한 화학 구조를 갖는 생성물이 형성되도록 하는 단계를 포함한다.
용어 "PUFA 생합성 경로"는 올레산을 LA, EDA, GLA, DGLA, ARA, ALA, STA, ETrA, ETA, EPA, DPA 및 DHA로 전환시키는 대사 과정을 지칭한다. 이 과정은 문헌 (예컨대, PCT 공개 제WO 2005/003322호 및 동 제WO 2006/052870호 참조)에 기재되어 있다. 간단하게 설명하자면, 이 과정은 소포체 막에 존재하는 일련의 특별한 탈포화 및 신장 효소 (즉, "PUFA 생합성 경로 효소")에 의한, 탄소 원자의 부가를 통한 탄소 쇄의 신장 및 이중 결합의 부가를 통한 분자의 탈포화를 수반한다. 더욱 구체적으로, "PUFA 생합성 경로 효소"는 PUFA의 생합성과 관련이 있는 하기 효소 (및 이러한 효소를 코딩하는 유전자) 중 임의의 것을 지칭한다: Δ4 데새투라제, Δ5 데새투라제, Δ6 데새투라제, Δ12 데새투라제, Δ15 데새투라제, Δ17 데새투라제, Δ9 데새투라제, Δ8 데새투라제, Δ9 일롱가제, C14 /16 일롱가제, C16 /18 일롱가제, C18 /20 일롱가제 및/또는 C20 /22 일롱가제.
용어 "오메가-3/오메가-6 지방산 생합성 경로"는 적절한 조건하에 발현된 경우에 ω-3 지방산 및 ω-6 지방산 중의 어느 하나 또는 둘다의 생성을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자 세트를 지칭한다. 전형적으로, 상기 유전자는 PUFA 생합성 경로 효소를 코딩하는 ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로에 관여한다. 대표적인 경로가 도 1에 예시되어 있으며, 이는 미리스트산이 여러가지 중간체를 거쳐 DHA로 전환되는 것을 보여주며, ω-3 지방산과 ω-6 지방산 모두가 공통의 공급원으로부터 어떻게 생성될 수 있는지를 입증한다. 상기 경로는 자연적으로 2개 부분으로 나뉘는데, 하나는 ω-3 지방산을 생성하고 다른 것은 ω-6 지방산만을 생성한다.
ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "기능적"은 상기 경로 중의 유전자 일부 (또는 전부)가 활성 효소를 발현하여, 생체내 촉매 또는 기질 전환을 일으킨다는 것을 의미한다. "ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로" 또는 "기능적 ω-3/ω-6 지방산 생합성 경로"는 PUFA 생합성 경로 효소 유전자가 모두 필요하다는 것을 의미하지는 않음을 이해해야 하는데, 이는 수많은 지방산 생성물에는 단지 상기 경로의 유전자 중 서브세트의 발현만이 필요할 것이기 때문이다.
용어 "Δ9 일롱가제/Δ8 데새투라제 경로"는 장쇄 PUFA를 생성하는 생합성 경로를 지칭한다. 상기 경로는 최소한 Δ9 일롱가제 및 Δ8 데새투라제를 포함하여, 이로 인해 LA 및 ALA 각각으로부터 DGLA 및/또는 ETA가 생합성될 수 있다. 다른 데새투라제 및 일롱가제가 발현되면, ARA, EPA, DPA 및 DHA도 합성될 수 있다. 이러한 경로는 GLA 및/또는 STA의 생합성이 배제되는 것과 같은 일부 실시양태에서 유리할 수 있다.
용어 "중간체 지방산"은 지방산 대사 경로 중에 생성되며, 다른 대사 경로 효소의 작용에 의해 그 경로 중의 의도된 지방산 생성물로 추가 전환될 수 있는 임의의 지방산을 지칭한다. 예를 들어, Δ9 일롱가제/Δ8 데새투라제 경로를 이용하여 EPA가 생성되는 경우에는 EDA, ETrA, DGLA, ETA 및 ARA가 생성될 수 있으며, 이들 지방산은 다른 대사 경로 효소의 작용을 통해 EPA로 추가 전환될 수 있기 때문에 "중간체 지방산"으로 간주된다.
용어 "부산물 지방산"은 지방산 대사 경로 중에 생성되며, 그 경로 중의 의도된 지방산 생성물도 아니고 그 경로의 "중간체 지방산"도 아닌 임의의 지방산을 지칭한다. 예를 들어, Δ9 일롱가제/Δ8 데새투라제 경로를 이용하여 EPA가 생성되는 경우에는, EDA 또는 ETrA 각각에 대한 Δ5 데새투라제의 작용으로 시아돈산 (SCI) 및 주니페론산 (JUP)도 생성될 수 있다. 이것들은 "부산물 지방산"으로 간주되는데, 이는 이들 중 어느 것도 다른 대사 경로 효소의 작용에 의해 EPA로 추가로 전환될 수는 없기 때문이다.
"데새투라제"는 1종 이상의 지방산을 탈포화시켜서, 즉 1종 이상의 지방산에 이중 결합을 도입하여 관심 지방산 또는 전구체를 생성할 수 있는 폴리펩티드이다. 본 명세서 전반에 걸쳐서 특정 지방산에 관한 언급시에 오메가-시스템이 사용되고는 있지만, 델타-시스템을 사용하여 기질의 카르복실 말단부터 세어서 데새투라제의 활성을 표시하는 것이 보다 편리하다. 관심 데새투라제는, 예를 들어 (1) 지방산의 카르복실-말단부로부터 번호를 매겨서 8번째 탄소 원자와 9번째 탄소 원자 사이에서 상기 분자를 탈포화시키고, 예를 들어 EDA가 DGLA로 전환되고/되거나 ETrA가 ETA로 전환되는 것을 촉매할 수 있는 Δ8 데새투라제, (2) DGLA가 ARA로 전환되고/되거나 ETA가 EPA로 전환되는 것을 촉매하는 Δ5 데새투라제, (3) LA가 GLA로 전환되고/되거나 ALA가 STA로 전환되는 것을 촉매하는 Δ6 데새투라제, (4) DPA가 DHA로 전환되는 것을 촉매하는 Δ4 데새투라제, (5) 올레산이 LA로 전환되는 것을 촉매하는 Δ12 데새투라제, (6) LA가 ALA로 전환되고/되거나 GLA가 STA로 전환되는 것을 촉매하는 Δ15 데새투라제, (7) ALA가 EPA로 전환되고/되거나 DGLA가 ETA로 전환되는 것을 촉매하는 Δ17 데새투라제, 및 (8) 팔미테이트가 팔미톨레산 (16:1)으로 전환되고/되거나 스테아레이트가 올레산 (18:1)으로 환되는 것을 촉매하는 Δ9 데새투라제를 포함한다. 당업계에서, Δ15 및 Δ17 데새투라제는 이것들이 ω-6 지방산을 이것의 ω-3 대응물로 전환시키는 능력 (예컨대, LA의 ALA로의 전환 및 ARA의 EPA로의 전환 (각각))을 기초로 하여 때때로 "오메가-3 데새투라제", "w-3 데새투라제", 및/또는 "ω-3 데새투라제"라고 지칭되기도 한다. 일부 실시양태에서, 특정 지방산 데새투라제의 특이성은 적합한 숙주를 지방산 데새투라제에 대한 유전자로 형질전환시키고 숙주의 지방산 프로파일에 미치는 효과를 결정하여 실험적으로 결정하는 것이 가장 바람직하다.
본원에서의 목적상, 용어 "EgD8"은 본원의 서열 60에 의해 코딩되는, 유글레나 그라실리스로부터 단리된 Δ8 데새투라제 효소 (서열 61)를 지칭한다. EgD8은 PCT 공개 제WO 2006/012325호 및 동 제WO 2006/012326호에 기재된 바와 같은 "Eg5" [미국 공개 제2005-0287652-A1호의 서열 2]와 100％ 동일하며 기능적으로 동등하다.
유사하게, 용어 "EgD8S"는 본원에서 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 유글레나 그라실리스 유래의 합성 Δ8 데새투라제 (즉, 서열 68 및 서열 69)를 지칭한다. EgD8S는 PCT 공개 제WO 2006/012325호 및 동 제WO 2006/012326호에 기재된 바와 같은 "D8SF"와 100％ 동일하며 기능적으로 동등하다.
용어 "일롱가제 시스템"은 일롱가제 시스템이 작용하는 지방산 기질보다 2개 탄소가 더 긴 지방산을 생성하는, 지방산 탄소 쇄 신장을 담당하는 4가지 효소 군을 지칭한다. 더욱 구체적으로, 신장 과정은 지방산 신타제와 관련되어 일어나는데, 여기서는 CoA가 아실 운반체이다 [Lassner et al., Plant Cell, 8:281-292 (1996)]. 기질-특이적 단계이면서 또한 속도-제한 단계인 것으로 밝혀진 제1 단계에서는 말로닐-CoA가 장쇄 아실-CoA와 축합되어 이산화탄소 (CO2) 및 β-케토아실-CoA (아실 잔기는 2개 탄소 원자만큼 신장되었음)를 생성한다. 이후의 반응은 β-히드록시아실-CoA로의 환원, 에노일-CoA로의 탈수, 및 신장된 아실-CoA를 생성하는 두번째 환원을 포함한다. 일롱가제 시스템에 의해 촉매되는 반응의 예는 GLA의 DGLA로의 전환, STA의 ETA로의 전환, 및 EPA의 DPA로의 전환이다.
본원에서의 목적상, 이러한 제1 축합 반응 (즉, 말로닐-CoA의 β-케토아실-CoA로의 전환)을 촉매하는 효소를 일반적으로 "일롱가제"로 지칭할 것이다. 일반적으로, 일롱가제의 기질 선택성은 약간 광범위하지만, 쇄 길이 및 불포화도 둘다에 의해 나뉜다. 따라서, 일롱가제는 여러가지 특이성을 보유할 수 있다. 예를 들어 C14 /16 일롱가제는 C14 기질 (예컨대, 미리스트산)을 이용할 것이고, C16 /18 일롱가제는 C16 기질 (예컨대, 팔미테이트)을 이용할 것이고, C18 /20 일롱가제 (또한 Δ6 일롱가제로도 알려져 있으며, 이들 용어는 구별없이 사용될 수 있음)는 C18 기질 (예컨대, GLA, STA)을 이용할 것이며, C20 /22 일롱가제는 C20 기질 (예컨대, EPA)을 이용할 것이다. 유사한 방식으로, 또한 본원에서 특별한 관심이 있는 것으로서, "Δ9 일롱가제"는 LA 및 ALA가 각각 EDA 및 ETrA로 전환되는 것을 촉매할 수 있다. 일부 일롱가제는 광범위한 특이성을 보유하기 때문에 단일 효소가 여러 일롱가제 반응을 촉매할 수 있다는 것을 기억하는 것은 중요하다. 따라서, 예를 들어 Δ9 일롱가제는 C16 /18 일롱가제, C18 /20 일롱가제 및/또는 C20 /22 일롱가제로도 작용할 수 있고, Δ5 및 Δ6 지방산, 예를 들어 EPA 및/또는 GLA 각각에 대하여 대안적이지만 선호되지 않는 특이성을 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 지방산 일롱가제의 특이성은 적합한 숙주를 지방산 일롱가제에 대한 유전자로 형질전환시키고 숙주의 지방산 프로파일에 미치는 효과를 결정하여 실험적으로 결정하는 것이 가장 바람직하다.
본원에서의 목적상, 용어 "EgD9e"는 서열 1에 의해 코딩되는, 유글레나 그라실리스로부터 단리된 Δ9 일롱가제 효소 (서열 2)를 지칭한다. 반대로, 용어 "EgD9eS"는 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 유글레나 그라실리스 유래의 합성 Δ9 일롱가제 (즉, 서열 3 및 서열 2)를 지칭한다.
용어 "E389D9e"는 서열 4에 의해 코딩되는, 유트레프티엘라 종 CCMP389로부터 단리된 Δ9 일롱가제 효소 (서열 5)를 지칭한다. 반대로, 용어 "E389D9eS"는 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 유트레프티엘라 종 CCMP389 유래의 합성 Δ9 일롱가제 (즉, 서열 6 및 서열 5)를 지칭한다.
용어 "IgD9e"는 이소크리시스 갈바나로부터 단리된, 서열 7에 의해 코딩되는 Δ9 일롱가제 효소 (서열 8, NCBI 관리 번호: AAL37626 [GI 17226123], 유전자좌 AAL37626, CDS AF390174, 진뱅크 관리 번호: AF390174)를 지칭한다. 반대로, 용어 "IgD9eS"는 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 이소크리시스 갈바나 유래의 합성 Δ9 일롱가제 (즉, 서열 9 및 서열 8)를 지칭한다. IgD9eS의 합성 및 기능적 분석은 PCT 공개 제WO 2006/052870호 (여기서의 IgD9eS는 그에 기재된 서열 51 및 서열 50과 동등함)에 기재되어 있다.
용어 "아미노산"은 단백질 또는 폴리펩티드의 기본적인 화학적 구조 단위를 지칭한다. 아미노산은 아미노산에 대한 1-문자 코드 또는 3-문자 코드로 표기되며, 문헌 ([Nucleic Acids Research, 13:3021-3030 (1985)] 및 [Biochemical Journal, 219 (2):345-373 (1984)])에 기재된 IUPAC-IYUB 기준에 부합되며, 상기 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 주어진 단백질 중의 아미노산 잔기가 또다른 아미노산으로 치환되면서 그 단백질의 화학적 또는 기능적 성질은 변경시키지 않는 치환을 지칭한다. 예를 들어, 주어진 부위에서 화학적으로 동등한 아미노산을 생성 (그러나, 그에 의해 코딩되는 폴딩(folding)된 단백질의 구조적 및 기능적 특성에는 영향을 주지 않음)하는 유전자 변경이 일반적이라는 것은 당업계에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 목적상, "보존적 아미노산 치환"은 하기하는 5개 군 중 하나 내에서의 교환으로 정의된다:
1. 비-극성 또는 약간 극성인 작은 지방족 잔기: Ala [A], Ser [S], Thr [T] (Pro [P], Gly [G]),
2. 음으로 대전된 극성 잔기 및 이들의 아미드: Asp [D], Asn [N], Glu [E], Gln [Q],
3. 양으로 대전된 극성 잔기: His [H], Arg [R], Lys [K],
4. 비-극성인 큰 지방족 잔기: Met [M], Leu [L], Ile [I], Val [V] (Cys [C]), 및
5. 큰 방향족 잔기: Phe [F], Tyr [Y], Trp [W].
보존적 아미노산 치환은 일반적으로 1) 치환 영역에서의 폴리펩티드 주쇄 구조, 2) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 3) 측쇄의 크기(bulk)를 유지한다. 추가로, 많은 경우에서, 단백질 분자의 N-말단부 및 C-말단부의 변경은 그 단백질의 활성을 변경시킬 것으로 예상되지 않는다.
용어 "비-보존적 아미노산 치환"은 일반적으로 단백질 특성에 있어서 가장 큰 변화를 야기할 것으로 예상되는 아미노산 치환을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 비-보존적 아미노산 치환은 1) 친수성 잔기가 소수성 잔기로 치환되거나 그 반대의 경우 (예컨대, Ser 또는 Thr vs . Leu, Ile, Val), 2) Cys 또는 Pro가 임의의 다른 잔기로 치환되거나 그 반대의 경우, 3) 전기양성 측쇄를 갖는 잔기가 전기음성 잔기로 치환되거나 그 반대의 경우 (예컨대, Lys, Arg 또는 His vs . Asp 또는 Glu), 또는 4) 커다란 측쇄를 갖는 잔기가 측쇄를 갖지 않는 것으로 치환되거나 그 반대의 경우 (예컨대, Phe vs. Gly) 중 하나일 것이다. 때때로, 상기 5개 군 중 2개 사이에서의 비-보존적 아미노산 치환은 코딩되는 단백질의 활성에 영향을 주지 않을 것이다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열", "핵산 서열", "핵산 단편" 및 "단리된 핵산 단편"은 본원에서 구별없이 사용된다. 이들 용어는 뉴클레오티드 서열 등을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥의 RNA 또는 DNA 중합체일 수 있고, 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 임의로 함유한다. DNA 중합체 형태의 폴리뉴클레오티드는 1개 이상의 절편의 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, 또는 이들의 혼합물로 이루어질 수 있다. 뉴클레오티드 (통상적으로, 이의 5' 모노포스페이트 형태로 존재함)는 다음과 같은 1-문자 표시로 언급된다: 아데닐레이트 또는 데옥시아데닐레이트 (각각 RNA 또는 DNA에 대한 것)는 "A", 시티딜레이트 또는 데옥시시티딜레이트는 "C", 구아닐레이트 또는 데옥시구아닐레이트는 "G", 유리딜레이트는 "U", 데옥시티미딜레이트는 "T", 퓨린 (A 또는 G)은 "R", 피리미딘 (C 또는 T)은 "Y", G 또는 T는 "K", A 또는 C 또는 T는 "H", 이노신은 "I", 및 임의의 뉴클레오티드는 "N".
용어 "기능적으로 동등한 아단편(subfragment)" 및 "동등하게 기능적인 아단편"은 본원에서 구별없이 사용된다. 이들 용어는 단리된 핵산 단편의 일부 또는 하위서열을 지칭하며, 상기 단편 또는 아단편이 활성 효소를 코딩하든 코딩하지 않든 간에 유전자 발현을 변경시키거나 특정 표현형을 생성하는 능력을 보유한다. 예를 들어, 단편 또는 아단편은 형질전환된 식물에서 원하는 표현형을 생성하기 위한 키메라 유전자를 디자인하는데 사용될 수 있다. 키메라 유전자는 이것이 활성 효소를 코딩하든 코딩하지 않든 간에 핵산 단편 또는 그의 아단편을 식물 프로모터 서열에 대하여 센스 또는 안티센스 배향으로 연결시켜 저해하는데 사용되도록 디자인될 수 있다.
용어 "보존된 도메인" 또는 "모티프"는 진화적으로 관련된 단백질의 정렬된 서열을 따라 특정 위치에서 보존된 아미노산 세트를 의미한다. 다른 위치의 아미노산은 상동성 단백질 사이에서 달라질 수 있지만, 특정 위치에서 고도로 보존된 아미노산은 단백질의 구조, 안정성 또는 활성에 필수적인 아미노산을 나타낸다. 이것들은 단백질 상동체 과의 정렬된 서열에서의 높은 보존도로 확인되기 때문에, 새로 결정된 서열을 갖는 단백질이 이전에 확인된 단백질 과에 속하는지 여부를 결정하기 위한 식별자(identifier) 또는 "표시자(signatures)"로 사용될 수 있다. 본원에서의 목적상, 하기 표 4는 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 단백질을 나타내는 본 발명의 모티프를 기재한다:
Figure 112008044342784-PCT00005
용어 "상동성", "상동성인", "실질적으로 유사한" 및 "실질적으로 상응하는"은 본원에서 구별없이 사용된다. 이것들은 1개 이상의 뉴클레오티드 염기에서의 변화가 핵산 단편이 유전자 발현을 매개하거나 특정 표현형을 생성하는 능력에 영향을 주지 않는 핵산 단편을 지칭한다. 이들 용어는 또한 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변형을 지칭하는데, 이것은 이로써 생성된 핵산 단편의 기능적 특성을 처음의 미변형 단편에 비해 실질적으로 변경시키지 않는다. 따라서, 당업자가 알고 있는 바와 같이, 본 발명이 특정 예시적 서열보다 더 많은 것을 포함한다는 것이 이해된다.
추가로, 당업자는 본 발명에 포함되는 실질적으로 유사한 핵산 서열이 본원에 예시한 서열, 또는 본원에 개시한 뉴클레오티드 서열의 임의의 일부이면서 본원에 개시한 임의의 핵산 서열에 기능적으로 동등한 서열과의 혼성화 (중간 정도의 엄격 조건하에서, 예를 들어, 0.5× SSC, 0.1％ SDS, 60℃) 능력에 의해서도 한정된다는 것을 인식하고 있다. 엄격도 조건은 중간 정도로 유사한 단편, 예컨대 관계가 먼 유기체들로부터의 상동성 서열 내지 고도로 유사한 단편, 예컨대 밀접한 관계가 있는 유기체들로부터의 기능적 효소를 중복복제하는 유전자를 스크리닝하도록 조정될 수 있다. 혼성화후 세척이 엄격도 조건을 결정한다.
용어 "선택적으로 혼성화하다"는 주어진 핵산 서열이 엄격한 혼성화 조건하에서 명시된 핵산 표적 서열과 혼성화하는 것이 비-표적 핵산 서열과의 혼성화보다 검출가능하게 더 높은 정도 (예컨대, 백그라운드(background))보다 2배 이상 더 높음)인 것에 대한 지칭을 포함하며, 비-표적 핵산과의 혼성화는 실질적으로 배제된다. 선택적으로 혼성화하는 서열은 전형적으로 서로와 약 80％ 이상의 서열 동일성 또는 90％의 서열 동일성을 가지며, 최대 100％ 서열 동일성 (즉, 완전 상보적)을 포함한다.
용어 "엄격 조건" 또는 "엄격한 혼성화 조건"은 프로브가 그의 표적 서열과 선택적으로 혼성화하는 조건에 대한 지칭을 포함한다. 엄격 조건은 서열-의존적이고, 여러가지 환경에서 달라질 것이다. 혼성화 및/또는 세척 조건의 엄격도를 제어함으로써, 프로브와 100％ 상보적 (상동성 프로빙(probing))인 표적 서열을 확인할 수 있다. 별법으로, 서열 내에서 약간의 미스매치가 허용되도록 엄격도 조건을 조정하여 더 낮은 정도의 유사성이 검출 (이종 프로빙)되도록 할 수도 있다. 일반적으로, 프로브는 약 1000개 미만의 뉴클레오티드길이, 임의로는 500개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 전형적으로, 엄격 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.5 M 미만의 Na 이온, 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0 M의 Na 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 짧은 프로브 (예컨대, 10개 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우에는 온도가 약 30℃ 이상이고 긴 프로브 (예컨대, 50개 초과의 뉴클레오티드)의 경우에는 온도가 약 60℃ 이상인 조건이다. 엄격 조건은 불안정화제, 예컨대 포름아미드의 첨가로 달성될 수도 있다. 예시적인 낮은 엄격도 조건은 30％ 내지 35％ 포름아미드, 1 M NaCl, 1％ SDS (나트륨 도데실 술페이트)의 완충액을 사용한 37℃에서의 혼성화 및 1× SSC 내지 2× SSC (20× SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산삼나트륨) 중 50℃ 내지 55℃에서의 세척을 포함한다. 예시적인 중간 정도의 엄격도 조건은 40％ 내지 45％ 포름아미드, 1 M NaCl, 1％ SDS 중 37℃에서의 혼성화 및 0.5× SSC 내지 1× SSC 중 55℃ 내지 60℃에서의 세척을 포함한다. 예시적인 높은 엄격도 조건은 50％ 포름아미드, 1 M NaCl, 1％ SDS 중 37℃에서의 혼성화 및 0.1× SSC 중 60℃ 내지 65℃에서의 세척을 포함한다. 다른 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 0.1× SSC, 0.1％ SDS 중 65℃에서의 혼성화 및 2× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척 및 이후에 0.1× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척을 포함한다.
전형적으로, 특이성은 마지막 세척 용액의 이온 강도 및 온도가 중요한 인자인 혼성화후 세척에 대한 함수이다. DNA-DNA 하이브리드의 경우, Tm은 문헌 [Meinkoth et al., Anal. Biochem., 138:267-284 (1984)]의 하기 방정식으로 추정될 수 있다: Tm = 81.5℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (％ GC)- 0.61 (％ 포름아미드)-500/L (여기서, M은 1가 양이온의 몰농도이고, ％ GC는 DNA 중 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 백분율(％)이고, ％ 포름아미드는 혼성화 용액 중 포름아미드의 백분율(％)이며, L은 염기쌍 중 하이브리드의 길이이다. Tm은 상보적 표적 서열 중 50％가 완벽하게 매치된 프로브에 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도 및 pH 하에서)이다. Tm은 미스매치 1％마다 약 1℃씩 줄어들기 때문에, 원하는 동일성의 서열과 혼성화되도록 Tm, 혼성화 및/또는 세척 조건을 조정할 수 있다. 예를 들어, 90％ 이상의 동일성을 갖는 서열을 찾는다면, Tm은 10℃ 감소될 수 있다. 일반적으로, 엄격 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열 및 그의 상보체에 대한 열 용융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. 그러나, 고도의 엄격 조건은 열 용융점 (Tm)보다 1℃, 2℃, 3℃ 또는 4℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고, 중간 정도의 엄격 조건은 열 용융점 (Tm)보다 6℃, 7℃, 8℃, 9℃ 또는 10℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있으며, 낮은 엄격도 조건은 열 용융점 (Tm)보다 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃ 또는 20℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다. 당업자는, 혼성화 및/또는 세척 용액의 엄격도에서의 변동이 본질적으로 상기 방정식, 혼성화 및 세척 조성, 및 원하는 Tm을 이용하여 기재된다는 것을 이해할 것이다. 원하는 정도의 미스매치로 인해서 Tm이 45℃ (수용액) 또는 32℃ (포름아미드 용액) 미만이 된다면, SSC 농도를 증가시켜서 더 높은 온도가 이용될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 핵산 혼성화에 관한 상세한 지침은 문헌 ([Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993)] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995)])에 기재되어 있다. 혼성화 및/또는 세척 조건은 적어도 10분, 30분, 60분, 90분, 120분 또는 240분 동안 적용될 수 있다.
핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련한 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 2개의 서열을 명시된 비교 윈도우에서 최대로 일치하도록 정렬할 때 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기를 지칭한다.
따라서, "서열 동일성(％)"은 최적으로 정렬한 2종의 서열을 비교 윈도우에서 비교하여 결정된 값을 지칭하며, 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 상기 2종 서열을 최적으로 정렬하기 위한 기준 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과의 비교시에 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율(％)은, 양쪽 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 수를 결정하여 매치되는 위치의 수를 산출하고, 매치되는 위치의 수를 비교 윈도우 내 위치의 총수로 나누고 그 결과값에 100을 곱하여 서열 동일성(％)을 산출하여 계산된다. 서열 동일성(％)의 유용한 예로는 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 또는 95％, 또는 50％ 내지 100％ 범위의 임의의 정수 백분율(％) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 동일성은 본원에 기재한 임의의 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다.
서열 정렬 및 동일성(％) 또는 유사성(％) 계산은 LASERGENE 바이오인포매틱스(bioInformatics) 컴퓨팅 수트의 메그얼라인(MegAlign) 프로그램 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 디엔에이스타, 인크.(DNASTAR, Inc.))를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 상동성 서열을 검출하도록 디자인된 다양한 비교 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 본 명세서의 내용에서, 서열 분석 소프트웨어를 분석에 사용한 경우, 달리 명시하지 않는 한은 그 분석 결과가 언급된 프로그램의 "디폴트 값"을 기초로 한다는 것을 이해할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "디폴트 값"은 처음 초기화시에 해당 소프트웨어에 원래 부하된 임의의 세트의 값 또는 파라미터를 의미한다.
"클러스탈 브이 정렬 방법"은 클러스탈 브이 ([Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989)], [Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)]에 기재되어 있음)로 표시되고 LASERGENE 바이오인포매틱스 컴퓨팅 수트 (상기 문헌)의 메그얼라인™ 프로그램에 기재된 정렬 방법에 상응한다. 다중 정렬의 경우, 디폴트 값은 GAP PENALTY = 10 및 GAP LENGTH PENALTY = 10에 상응한다. 클러스탈 방법을 이용한 단백질 서열의 동일성(％) 계산 및 쌍별 정렬을 위한 디폴트 파라미터는 KTUPLE = 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 및 DIAGONALS SAVED = 5이다. 핵산의 경우, 이들 파라미터는 KTUPLE = 2, GAP PENALTY = 5, WINDOW = 4 및 DIAGONALS SAVED = 4이다. 클러스탈 브이 프로그램을 이용한 서열 정렬후, 동일 프로그램 내의 "서열 거리" 표를 참조하여 "동일성(％)"을 구할 수 있다.
"BLASTN 정렬 방법"은 디폴트 파라미터를 사용하여 뉴클레오티드 서열을 비교하는, NCBI (National Center for Biotechnology Information)가 제공하는 알고리즘이다.
당업자는 서열 동일성의 많은 수준이 다른 종으로부터 동일하거나 유사한 기능 또는 활성을 갖는 폴리펩티드를 확인하는데 유용하다는 것을 이해할 것이다. 동일성(％)의 유용한 예로는 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 또는 95％, 또는 50％ 내지 100％ 범위의 임의의 정수 백분율(％) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 사실, 50％ 내지 100％ 범위의 임의의 정수, 예컨대 51％, 52％, 53％, 54％, 55％, 56％, 57％, 58％, 59％, 60％, 61％, 62％, 63％, 64％, 65％, 66％, 67％, 68％, 69％, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 아미노산 동일성은 본 발명을 기재하는데 유용할 수 있다. 또한, 단리된 뉴클레오티드 단편의 임의의 전장 또는 부분적 상보체에도 관심이 있다.
용어 "게놈"이 식물 세포에 적용되는 경우에, 이것은 핵 내에 존재하는 염색체 DNA 뿐만이 아니라 세포의 세포내 성분 (예컨대, 미토콘드리아, 색소체(plastid)) 내에 존재하는 세포소기관 DNA까지도 포함한다.
"유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 지칭하며, 코딩 서열 앞쪽 (5' 비-코딩 서열) 및 뒷쪽 (3' 비-코딩 서열)의 조절 서열을 포함한다. "천연 유전자"는 자연계에서 자신의 고유 조절 서열과 함께 존재하는 유전자를 지칭한다. "키메라 유전자"는 천연 유전자가 아니고, 자연계에서는 함께 존재하지 않는 조절 서열과 코딩 서열을 포함하는 임의의 유전자를 지칭한다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원으로부터 유래되는 조절 서열과 코딩 서열을 포함할 수도 있고, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되지만 자연계에 존재하는 것과는 상이한 방식으로 배열된 조절 서열과 코딩 서열을 포함할 수도 있다. "외래" 유전자는 정상적으로는 숙주 유기체에 존재하지 않지만 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입된 유전자를 지칭한다. 외래 유전자는 비-천연 유기체 내로 삽입된 천연 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "트랜스진"은 형질전환 절차를 통해 게놈 내로 도입된 유전자이다.
"코돈-최적화 유전자"는 숙주 세포에 의해 선호되는 코돈 사용 빈도를 모방하도록 디자인된 코돈 사용 빈도를 갖는 유전자이다.
"대립유전자"는 염색체상의 주어진 유전자좌를 차지하는 여러가지 대안적 형태의 유전자 중 하나이다. 염색체상의 주어진 유전자좌에 존재하는 모든 대립유전자가 동일한 경우, 해당 식물은 그 유전자좌에서 동형접합이다. 염색체상의 주어진 유전자좌에 존재하는 대립유전자들이 상이한 경우, 해당 식물은 그 유전자좌에서 이형접합이다.
"코딩 서열"은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 지칭한다. "조절 서열"은 코딩 서열의 상류 (5' 비-코딩 서열), 코딩 서열 내, 또는 코딩 서열의 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치하고, 관련 코딩 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성 또는 번역에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열로는 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 효과기(effector) 결합 부위 및 스템-루프(stem-loop) 구조 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
"프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 프로모터 서열은 근위 및 보다 원위의 상류 요소로 이루어지며, 후자의 요소는 흔히 인핸서라고 지칭된다. 따라서, "인핸서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열이며, 프로모터 고유의 요소일 수도 있고, 또는 프로모터의 수준 또는 조직-특이성을 증대시키기 위해 삽입된 이종 요소일 수도 있다. 프로모터는 그 전체가 천연 유전자로부터 유래될 수도 있고, 또는 자연계에 존재하는 상이한 프로모터들로부터 유래된 여러가지 요소들로 구성될 수도 있으며, 또는 심지어는 합성 DNA 절편을 포함할 수도 있다. 당업자는 상이한 프로모터가 여러가지 조직 또는 세포 유형에서, 또는 여러 발생 단계에서, 또는 여러가지 환경적 조건에 대한 반응에서 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 것을 이해하고 있다. 대부분의 경우에는 조절 서열의 정확한 경계가 완벽하게 규정되어 있지 않기 때문에, 약간의 차이가 있는 DNA 단편들이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것이 추가로 인식되고 있다. 대부분의 시기에 대부분의 세포 유형에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 통상 "구성적(constitutive) 프로모터"라고 지칭된다. 식물 세포에 유용한 여러 유형의 새로운 프로모터가 계속 발견되고 있다. 많은 예가 문헌 [Okamuro, J. K., and Goldberg, R. B. Biochemistry of Plants, 15:1-82 (1989)]에 기재되어 있다.
"번역 리더 서열"은 유전자의 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 위치한 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 번역 리더 서열은 번역 출발 서열의 완전 프로세싱된 mRNA 상류에 존재한다. 번역 리더 서열은 mRNA로의 1차 전사체의 프로세싱, mRNA 안정성 또는 번역 효율에 영향을 줄 수 있다. 번역 리더 서열의 예는 문헌 [Turner, R. and Foster, G. D., Mol. Biotechnol., 3:225-236 (1995)]에 기재되어 있다.
"3' 비-코딩 서열", "전사 종결자" 또는 "종결 서열"은 코딩 서열의 하류에 위치한 DNA 서열을 지칭하며, 폴리아데닐화 인식 서열, 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 조절 신호를 코딩하는 기타 서열을 포함한다. 통상적으로, 폴리아데닐화 신호는 mRNA 전구체의 3'-말단에 폴리아데닐산 구역을 부가하는 것에 영향을 주는 것을 특징으로 한다. 상이한 3' 비-코딩 서열의 용도는 문헌 [Ingelbrecht, I. L., et al. Plant Cell, 1:671-680 (1989)]에 예시되어 있다.
"RNA 전사체"는 DNA 서열의 RNA 폴리머라제-촉매된 전사로 인한 생성물을 지칭한다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완벽한 상보적 카피인 경우에는 이것을 1차 전사체라고 지칭한다. RNA 전사체가 1차 전사체의 전사후 프로세싱으로 유래된 RNA 서열인 경우에는 성숙 RNA라고 지칭한다. "메신저 RNA" 또는 "mRNA"는 인트론을 갖고 있지 않으며 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 지칭한다. "cDNA"는 mRNA 주형에 상보적이고 역전사효소를 이용하여 이로부터 합성되는 DNA를 지칭한다. cDNA는 단일-가닥일 수도 있고, 또는 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편을 이용하여 이중-가닥 형태로 전환될 수도 있다. "센스" RNA는 mRNA를 포함하며 세포 내에서 또는 시험관내에서 단백질로 번역될 수 있는 RNA 전사체를 지칭한다. "안티센스 RNA"는 표적 1차 전사체 또는 mRNA의 전부 또는 일부에 상보적이고, 표적 유전자의 발현을 차단시키는 RNA 전사체를 지칭한다 (미국 특허 제5,107,065호). 안티센스 RNA는 특정 유전자 전사체의 임의의 일부, 즉 5' 비-코딩 서열, 3' 비-코딩 서열, 인트론, 또는 코딩 서열에서의 임의의 일부에 상보적일 수 있다. "기능적 RNA"는 안티센스 RNA, 리보자임 RNA, 또는 번역되지는 않을 수 있지만 세포내 과정에 소정의 영향을 주는 기타 RNA를 지칭한다. 용어 "상보체" 및 "역 상보체"는 mRNA 전사체와 관련하여 본원에서 구별없이 사용되며, 메세지의 안티센스 RNA를 한정함을 의미한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은, 단일 핵산 단편상에서 한 핵산 서열의 기능이 다른 핵산 서열에 의해 조절되도록 핵산 서열들이 연결된 것을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열의 발현을 조절할 수 있는 경우에 그 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 것이다 (즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 제어하에 있음). 코딩 서열은 조절 서열에 센스 또는 안티센스 배향으로 작동가능하게 연결될 수 있다. 또다른 예에서, 본 발명의 상보적 RNA 영역은 표적 mRNA에 5'로, 또는 표적 mRNA에 3'로, 또는 표적 mRNA 내에 직접 또는 간접적으로 작동가능하게 연결될 수도 있고, 또는 제1 상보적 영역이 표적 mRNA에 5'이고 그의 상보체가 mRNA에 3'이다.
본원에서 사용되는 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989)]에 보다 상세하게 기재되어 있다. 형질전환 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 하기에 기재되어 있다.
"PCR" 또는 "폴리머라제 연쇄 반응"은 특정 DNA 절편을 다량으로 합성하는 기술로서, 일련의 반복적 주기 (미국 코넥티커트주 노르워크 소재의 퍼킨 엘머 세투스 인스트루먼츠(Perkin Elmer Cetus Instruments))로 구성된다. 전형적으로는, 이중-가닥 DNA를 열 변성시키고, 표적 절편의 3' 경계부에 상보적인 2종의 프라이머를 저온에서 어닐링시킨 후에 중간 온도에서 신장시킨다. 이러한 3개의 연속적인 단계로 이루어진 한 세트를 "주기"라고 지칭한다.
용어 "재조합"은 예를 들어 화학적 합성 또는 유전자 조작 기술에 의한 단리된 핵산 절편들의 조작 등을 통해 2종의 상이한 분리된 서열 절편들을 인공 조합하는 것을 지칭한다.
용어 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 세포의 중추 대사의 일부가 아닌 유전자를 흔히 운반하고, 통상적으로 고리형 이중-가닥 DNA 단편 형태인 염색체외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 임의의 공급원으로부터 유래된 선형 또는 고리형의 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA일 수 있는데, 수많은 뉴클레오티드 서열들이 연결 또는 재조합되어, 선별된 유전자 생성물에 대한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 적절한 3' 비-번역 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구축물이다. "형질전환 카세트"는 외래 유전자를 함유하고, 이러한 외래 유전자 이외에도 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 요소를 갖는 특정 벡터를 지칭한다. "발현 카세트"는 외래 유전자를 함유하고, 이러한 외래 유전자 이외에도 외래 숙주 내에서 상기 유전자의 발현이 증대되도록 하는 요소를 갖는 특정 벡터 (즉, 핵산 서열 또는 단편이 이동될 수 있는 별개의 핵산 단편)를 지칭한다.
용어 "재조합 구축물", "발현 구축물", "키메라 구축물", "구축물", 및 "재조합 DNA 구축물"은 본원에서 구별없이 사용된다. 재조합 구축물은 핵산 단편들, 예를 들어 자연계에서는 함께 존재하지 않는 조절 서열 및 코딩 서열의 인공 조합을 포함한다. 예를 들어, 키메라 구축물은 상이한 공급원으로부터 유래되는 조절 서열과 코딩 서열을 포함할 수도 있고, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되지만 자연계에 존재하는 것과는 상이한 방식으로 배열된 조절 서열과 코딩 서열을 포함할 수도 있다. 이러한 구축물은 그 자체로 이용될 수도 있고, 또는 벡터와 함께 이용될 수도 있다. 벡터가 사용되는 경우, 벡터의 선택은 당업자에게 널리 공지된 바와 같이 숙주 세포를 형질전환하는데 사용될 방법에 따라 달라진다. 예를 들어, 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명의 임의의 단리된 핵산 단편을 포함하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환시켜 선별하고 증식시키기 위해서 벡터에 존재해야 하는 유전자 요소를 잘 알고 있다. 당업자는 또한 여러 독립적인 형질전환 사건들이 상이한 수준 및 패턴의 발현을 일으킬 것을 알고 있을 것이므로 ([Jones et al., EMBO J., 4:2411-2418 (1985)], [De Almeida et al., Mol. Gen. Genetics, 218:78-86 (1989)]), 원하는 발현 수준 및 패턴을 디스플레이하는 세포주를 수득하기 위해서는 여러 사건들을 스크리닝하는 것이 바람직하다. 이러한 스크리닝은 특히 DNA의 써던 분석, mRNA 발현의 노던 분석, 단백질 발현의 면역블럿팅 분석 또는 표현형 분석으로 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 기능적 최종-생성물 (예컨대, mRNA 또는 단백질 [전구체 또는 성숙])의 생성을 지칭한다.
용어 "도입된"은 핵산 (예컨대, 발현 구축물) 또는 단백질을 세포에 제공하는 것을 의미한다. "도입된"은 핵산이 세포의 게놈 내로 혼입될 수 있는, 진핵 또는 원핵 세포로의 핵산 혼입에 대한 지칭을 포함하고, 핵산 또는 단백질을 세포에 일시적으로 제공하는 것에 대한 지칭을 포함한다. "도입된"은 안정적 또는 일시적 형질전환 방법 뿐만이 아니라 생식 교배(sexual crossing)에 대한 지칭까지도 포함한다. 따라서, 핵산 단편 (예컨대, 재조합 DNA 구축물/발현 구축물)을 세포 내로 삽입하는 것과 관련한 "도입된"은 "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하며, 핵산 단편이 세포의 게놈 (예컨대, 염색체, 플라스미드, 색소체 또는 미토콘드리아 DNA) 내로 혼입되어 자율 레플리콘(replicon)으로 전환되거나 일시적으로 발현 (예컨대, 형질감염된 mRNA)될 수 있는, 진핵 또는 원핵 세포로의 핵산 단편 혼입에 대한 지칭을 포함한다.
"성숙" 단백질은 번역후 프로세싱된 폴리펩티드 (즉, 1차 번역 생성물에 존재하는 임의의 프리-펩티드(pre-peptide) 또는 프로-펩티드(pro-peptide)가 제거된 폴리펩티드)를 지칭한다. "전구체" 단백질은 mRNA 번역의 1차 생성물 (즉, 프리-펩티드 및 프로-펩티드는 여전히 존재함)을 지칭한다. 프리-펩티드 및 프로-펩티드는 세포내 국소화 신호일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
"안정적인 형질전환"은 핵 및 세포소기관의 게놈을 비롯한 숙주 유기체의 게놈에 핵산 단편을 전달하여 유전적으로 안정적인 유전형질이 생성된 것을 지칭한다. 반대로, "일시적 형질전환"은 숙주 유기체의 핵 또는 DNA-함유 세포소기관으로 핵산 단편을 전달하여 통합 또는 안정적인 유전형질 없이 유전자가 발현되는 것을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 유기체라고 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "트랜스제닉"은 게놈 내에 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 또는 세포를 지칭한다. 상기 이종 폴리뉴클레오티드가 게놈 내에 안정적으로 통합되어 상기 폴리뉴클레오티드가 다음 세대로 전달되는 것이 바람직하다. 이종 폴리뉴클레오티드는 게놈에 단독으로 통합될 수도 있고 발현 구축물의 일부로 통합될 수도 있다. 본원에서 사용된 트랜스제닉은 임의의 세포, 세포주, 칼루스(callus), 조직, 식물 일부 또는 식물을 포함하며, 이의 유전형은 처음부터 그렇게 변경된 트랜스제닉 핵산 뿐만이 아니라 처음의 트랜스제닉 핵산으로부터 생식 교배 또는 무성 증식으로 인해 생성된 핵산까지 포함하는 이종 핵산의 존재로 인해 변경되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스제닉"은 통상적인 식물 교배 방법 또는 천연 사건, 예컨대 무작위 교차-수정, 비-재조합 바이러스 감염, 비-재조합 박테리아 형질전환, 비-재조합 전좌, 또는 자발적 돌연변이에 의한 게놈 (염색체 또는 염색체외)의 변경은 포함하지 않는다.
"안티센스 억제"는 표적 단백질의 발현을 저해할 수 있는 안티센스 RNA 전사체의 생성을 지칭한다. "동시 저해(co-suppression)"는 동일하거나 실질적으로 유사한 외래 또는 내인성 유전자의 발현을 저해할 수 있는 센스 RNA 전사체의 생성을 지칭한다 (미국 특허 제5,231,020호). 식물에서의 동시 저해 구축물은 센스 배향으로 내인성 mRNA에 상동성을 갖는 핵산 서열의 과다발현에 초점을 맞추어 이미 디자인된 바 있으며, 이로 인해 과다발현된 서열에 상동성을 갖는 모든 RNA의 감소가 야기되었다 ([Vaucheret et al., Plant J., 16:651-659 (1998)], [Gura, Nature, 404:804-808 (2000)]). 이러한 현상의 전반적인 효율은 낮으며, RNA 감소 정도는 매우 가변적이다. 보다 최근의 연구는 mRNA 코딩 서열의 전부 또는 일부를 상보적 배향으로 혼입하여 발현된 RNA에 대한 잠재적인 "스템-루프" 구조가 생성되는 "헤어핀" 구조의 사용을 기재하고 있다 (PCT 공개 제WO 99/53050호, PCT 공개 제WO 02/00904호). 이것은 회수된 트랜스제닉 식물에서의 동시 저해 빈도를 증가시킨다. 또다른 연구는 근위 mRNA 코딩 서열의 저해 또는 "침묵(silencing)"을 지시하는 식물 바이러스 서열의 사용을 기재한다 (PCT 공개 제WO 98/36083호). 유전적 증거가 이러한 복잡한 상황을 풀어나가기 시작했지만 [Elmayan et al., Plant Cell, 10:1747-1757 (1998)], 이들 동시 저해 현상은 기계적으로 해명되지 못했다.
용어 "유질"은 자신의 에너지원을 지질 형태로 저장하는 경향이 있는 유기체를 지칭한다 [Weete, In: Fungal Lipid Biochemistry, 2nd Ed., Plenum, 1980]. 유질인 것으로 확인된 식물 부류는 통상적으로 "유량종자(oilseed)" 식물이라 지칭된다. 유량종자 식물의 예로는 대두 (글리신(Glycine) 및 소야(Soja) 종), 아마 (리눔(Linum) 종), 평지씨 (브라씨카(Brassica) 종), 옥수수, 목화, 잇꽃 (카르타무스(Carthamus) 종) 및 해바라기 (헬리안투스(Helianthus) 종) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 유질 미생물의 세포내 오일 또는 TAG 함량은 S자형 곡선에 따르는데, 여기서 지질의 농도는 이것이 후기 대수 성장기 또는 초기 정지 성장기에서 최대에 도달할 때까지 증가하였다가 후기 정지기 및 사멸기 동안에 점차적으로 감소한다 [Yongmanitchai and Ward, Appl. Environ. Microbiol., 57:419-25 (1991)].
용어 "유질 효모"는 오일을 만들 수 있는 효모로 분류되는 이러한 미생물을 지칭한다. 유질 미생물이 자신의 건조 세포 중량의 약 25％ 초과분을 오일로서 축적하는 것은 드문 일이 아니다. 유질 효모의 예에는 야로위아, 칸디다(Candida), 로도토룰라(Rhodotorula), 로도스포리듐(Rhodosporidium), 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 트리코스포론(Trichosporon) 및 리포마이세스(Lipomyces) 속 등이 있지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "유글레노피세애(Euglenophyceae)"는 담수, 해수, 토양 및 기생 환경의 생물에 존재하는, 무색이거나 광합성을 하는 단세포 편모충 ("녹색편모충")의 군을 지칭한다. 상기 부류는 고립 단세포(solitary unicell)임을 특징으로 하고, 대부분은 자유롭게 헤엄쳐다니며 저장고로 알려진 전방 함입부에서 나온 2개의 편모 (이 중 하나는 없을 수도 있음)를 갖는다. 광합성 녹색편모충은 1개 내지 많은 수의 엽록체를 함유하며, 이것은 미세한 디스크로부터 확장된 플레이트 또는 리본까지 다양하다. 무색의 녹색편모충은 영양소 동화에 대한 삼투영양성(osmotrophy) 또는 식영양성(phagotrophy)에 의존한다. 약 1000개 종이 발견되어 약 40개 속 및 6개 목으로 분류된 바 있다. 유글레노피세애의 예로는 하기 속 등이 있으나 이에 제한되지 않는다: 유트레프티엘라, 유글레나 및 테트루에트레프티아.
용어 "식물"은 온전한 식물, 식물 기관, 식물 조직, 종자, 식물 세포, 종자 및 그의 자손을 지칭한다. 식물 세포로는 종자로부터의 세포, 현탁 배양물, 배아, 분열조직 영역, 칼루스 조직, 잎, 뿌리, 새순, 배우체, 포자체, 화분 및 소포자 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
"자손"은 식물의 임의의 후속 세대를 포함한다.
개요: 지방산 및 트리아실글리세롤의 미생물 생합성
일반적으로, 유질 미생물 중에서의 지질 축적은 성장 배지 중에 존재하는 전체 탄소:질소 비율에 대한 반응으로 촉발된다. 이 과정은 유질 미생물 중에서 유리 팔미테이트 (16:0)가 드 노보 합성되도록 하며, PCT 공개 제WO 2004/101757호에 상세하게 기재되어 있다. 팔미테이트는 일롱가제 및 데새투라제의 작용을 통해 형성되는 더 긴 쇄의 포화 및 불포화 지방산 유도체의 전구체이다 (도 1).
TAG (지방산의 주요 저장 단위)는, 1) 아실트랜스퍼라제의 작용에 의해 아실-CoA 1개 분자가 글리세롤-3-포스페이트로 에스테르화되어 리소포스파티드산을 생성하고, 2) 아실트랜스퍼라제의 작용에 의해 2번째 분자의 아실-CoA가 에스테르화되어 1,2-디아실글리세롤 포스페이트 (통상, 포스파티드산으로 표시함)가 생성되고, 3) 포스파티드산 포스파타제에 의해 포스페이트가 제거되어 1,2-디아실글리세롤 (DAG)이 생성되며, 4) 아실트랜스퍼라제의 작용에 의해 3번째 지방산이 부가되어 TAG가 형성되는 것을 포함하는 일련의 반응들로 형성된다. 포화 및 불포화 지방산 및 단쇄 및 장쇄 지방산을 비롯한 광범위한 스펙트럼의 지방산이 TAG로 혼입될 수 있다.
오메가 지방산의 생합성
올레산이 장쇄 ω-3/ω-6 지방산으로 전환되는 대사 과정은 탄소 원자의 부가를 통한 탄소 쇄의 신장 및 이중 결합의 부가를 통한 상기 분자의 탈포화를 포함한다. 여기에는 소포체 막에 존재하는 일련의 특별한 탈포화 및 신장 효소가 필요하다. 그러나, 도 1에 나타나 있고 하기 기재된 바와 같이, 특정 ω-3/ω-6 지방산을 생성하기 위한 여러가지 별법의 경로가 흔히 존재한다.
구체적으로, 모든 경로에는 올레산이 Δ12 데새투라제에 의해 첫번째 ω-6 지방산인 LA로 초기 전환될 것이 요구된다. 이어서, "Δ9 일롱가제/Δ8 데새투라제 경로"를 이용하여, 장쇄 ω-6 지방산이 다음과 같이 형성된다: (1) LA가 Δ9 일롱가제에 의해 EDA로 전환되고, (2) EDA가 Δ8 데새투라제에 의해 DGLA로 전환되며, (3) DGLA가 Δ5 데새투라제에 의해 ARA로 전환된다. 별법으로, "Δ9 일롱가제/Δ8 데새투라제 경로"는 다음과 같이 장쇄 ω-3 지방산의 형성에 이용될 수 있다: (1) LA가 Δ15 데새투라제에 의해 첫번째 ω-3 지방산인 ALA로 전환되고, (2) ALA가 Δ9 일롱가제에 의해 ETrA로 전환되고, (3) ETrA가 Δ8 데새투라제에 의해 ETA로 전환되고, (4) ETA가 Δ5 데새투라제에 의해 EPA로 전환되고, (5) EPA가 C20 /22 일롱가제에 의해 DPA로 전환되며, (6) DPA가 Δ4 데새투라제에 의해 DHA로 전환된다. 임의로, ω-6 지방산은 ω-3 지방산으로 전환될 수 있으며, 예를 들어 Δ17 데새투라제 활성에 의해 DGLA 및 ARA 각각으로부터 ETA 및 EPA가 생성된다.
ω-3/ω-6 지방산의 생합성을 위한 별법의 경로는 Δ6 데새투라제 및 C18 /20 일롱가제를 이용한다 (즉, "Δ6 데새투라제/Δ6 일롱가제 경로"). 더욱 구체적으로, LA 및 ALA는 Δ6 데새투라제에 의해 각각 GLA 및 STA로 전환될 수 있고, 이후에 C18 /20 일롱가제는 GLA를 DGLA로 전환시키고/시키거나 STA를 ETA로 전환시킨다.
ω-3/ω-6 지방산을 생성하기 위해서 특정 숙주 유기체로 도입될 필요가 있는 특별한 기능성은 숙주 세포 (및 그의 천연 PUFA 프로파일 및/또는 데새투라제/일롱가제 프로파일), 기질의 이용가능성, 및 원하는 최종 생성물(들)에 따라 달라질 것이라고 여겨진다. 예를 들어, 일부 실시양태에서는 Δ6 데새투라제/Δ6 일롱가제 경로의 발현이 아니라 Δ9 일롱가제/Δ8 데새투라제 경로의 발현이 바람직할 수 있는데, 이는 Δ9 일롱가제/Δ8 데새투라제 경로에 의해 생성된 PUFA에는 GLA가 없기 때문이다.
당업자는 ω-3/ω-6 지방산 생합성을 위해 원하는 각 효소를 코딩하는 여러가지 후보 유전자를 확인할 수 있다. 유용한 데새투라제 및 일롱가제 서열은 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있고, 예를 들어 천연 공급원 (박테리아, 조류, 진균, 식물, 동물 등)으로부터 단리될 수 있고, 또는 반-합성 경로를 통해 생성되거나 드 노보 합성될 수도 있다. 숙주로 도입되는 데새투라제 및 일롱가제 유전자의 특정 공급원은 중요하지 않지만, 데새투라제 또는 일롱가제 활성을 갖는 특정 폴리펩티드의 선택에 대한 고려사항에는 1) 해당 폴리펩티드의 기질 특이성, 2) 폴리펩티드 또는 그의 성분이 속도-제한 효소인지의 여부, 3) 데새투라제 또는 일롱가제가 원하는 PUFA의 합성에 필수적인지의 여부, 및/또는 4) 해당 폴리펩티드에 필요한 보조인자가 포함된다. 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포 중 그의 위치의 생화학적 환경에 적합한 파라미터를 갖는 것이 바람직하다 (추가의 상세한 사항에 대하여는 PCT 공개 제WO 2004/101757호 참조).
추가의 실시양태에서, 각각의 특정 데새투라제 및/또는 일롱가제의 전환 효율을 고려하는 것도 유용하다. 더욱 구체적으로, 각각의 효소가 기질을 생성물로 전환시키는데 있어서 100％ 효율로 기능하는 경우는 거의 없기 때문에, 숙주 세포 중의 미정제 오일의 최종 지질 프로파일은 전형적으로 원하는 ω-3/ω-6 지방산으로 이루어진 각종 PUFA 뿐만이 아니라 각종 상류 중간 매개 PUFA의 혼합물일 것이다. 따라서, 원하는 지방산의 생합성을 최적화할 때, 최종적으로 원하는 생성물의 지질 프로파일에 비추어 각 효소의 전환 효율 역시 가변적이라는 점을 고려해야 한다.
이러한 고려사항 각각을 염두에 두고, 적절한 데새투라제 및 일롱가제 활성을 갖는 후보 유전자 (예컨대, Δ6 데새투라제, C18 /20 일롱가제, Δ5 데새투라제, Δ17 데새투라제, Δ15 데새투라제, Δ9 데새투라제, Δ12 데새투라제, C14 /16 일롱가제, C16 /18 일롱가제, Δ9 일롱가제, Δ8 데새투라제, Δ4 데새투라제 및 C20 /22 일롱가제)가 공개적으로 입수가능한 문헌 (예컨대, 진뱅크), 특허 문헌, 및 PUFA 생산력을 갖는 유기체의 실험 분석에 따라 확인될 수 있다. 이들 유전자는 특정 숙주 유기체의 PUFA 합성을 가능하게 하거나 증대시키기 위해서 해당 유기체로 도입하기에 적합할 것이다.
신규한 Δ9 일롱가제의 서열 확인
본 발명에서, Δ9 일롱가제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 유글레나 그라실리스 (본원에서는 "EgD9e"라고 지칭함) 및 유트레프티엘라 종 CCMP389 (본원에서는 "E389D9e"라고 지칭함)로부터 단리되었다.
클러스탈 브이 분석을 이용하여 EgD9e 뉴클레오티드 염기 및 추정된 아미노산 서열을 공개 데이타베이스와 비교함으로써, 가장 유사한 공지 서열 (즉, IgD9e)이 본원에서 보고한 EgD9e의 아미노산 서열과 258개 아미노산 길이에 걸쳐 약 31.8％ 동일하다는 것이 밝혀졌다.
클러스탈 브이 분석을 이용하여 E389D9e 뉴클레오티드 염기 및 추정된 아미노산 서열을 공개 데이타베이스와 비교함으로써, 가장 유사한 공지 서열 (즉, IgD9e)이 본원에서 보고한 E389D9e의 아미노산 서열과 263개 아미노산 길이에 걸쳐 약 33.1％ 동일하다는 것이 밝혀졌다.
참고로, 클러스탈 브이 분석을 이용하여 본원에서 서열 2 및 서열 5로 기재한 신규한 EgD9e 및 E389D9e 단백질 서열을 비교해 보니, 이것들은 65.1％ 동일성을 공유하였다.
본 발명의 내용에서, 바람직한 아미노산 단편은 본원에서의 EgD9e 및 E389D9e 서열과 약 70％ 내지 85％ 이상 동일하며, 약 85％ 내지 90％ 이상 동일한 서열이 특히 적합하고, 약 90％ 내지 95％ 이상 동일한 서열이 가장 바람직하다. 본 발명의 ORF에 상응하는 핵산 서열을 코딩하는 바람직한 EgD9e 및 E389D9e는 활성 단백질을 코딩하고 본원에서 보고한 EgD9e 및 E389D9e 각각의 핵산 서열과 약 70％ 내지 85％ 이상 동일한 것들이며, 85％ 내지 90％ 이상 동일한 서열이 특히 적합하고, 약 90％ 내지 95％ 이상 동일한 서열이 가장 바람직하다.
별법의 실시양태에서, 본 발명의 EgD9e 및 E389D9e 서열은 특정 숙주 유기체에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 이것은 대체 숙주 내에서의 상기 효소 발현을 추가로 최적화하는데 유용한 수단일 수 있는데, 이는 숙주에 의해 선호되는 코돈의 사용이 해당 폴리펩티드를 코딩하는 외래 유전자의 발현을 실질적으로 증대시킬 수 있기 때문이다. 일반적으로, 숙주에 의해 선호되는 코돈은, 단백질에서의 코돈 사용을 시험하고 (바람직하게는 가장 다량으로 발현되는 것) 어떤 코돈이 가장 높은 빈도로 사용되는지를 결정하여 특정 관심 숙주 종에서 결정될 수 있다. 이어서, 예를 들어 일롱가제 활성을 갖는 관심 폴리펩티드에 대한 코딩 서열은 숙주 종에서 선호되는 코돈을 사용하여 온전하게 합성될 수도 있고 일부 합성될 수도 있다. DNA 전체 (또는 일부) 역시 임의의 불안정화 서열 또는 전사된 mRNA에 존재하는 2차 구조 영역이 제거되도록 합성될 수 있다. DNA 전체 (또는 일부)는 또한 염기 조성이 원하는 숙주 세포에서 보다 바람직한 것으로 변경되도록 합성될 수 있다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, EgD9e 및 E389D9e는 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화되었다. 이것은 우선 야로위아 리폴리티카의 코돈 사용 프로파일 (PCT 공개 제WO 04/101757호 참조)을 결정하고, 선호되는 상기 코돈을 확인하여 가능하였다. 야로위아 리폴리티카 중 유전자 발현의 추가의 최적화는 'ATG' 개시 코돈 주위의 컨센서스(consensus) 서열을 결정하여 달성되었다.
EgD9e의 최적화는 777 bp 코딩 영역 중 117 bp (15.1％)를 변형시켰고, 106개 코돈을 최적화하였다. 코돈-최적화 유전자 ("EgD9eS", 서열 3)에서의 변형 중 그 어느 것도 코딩되는 단백질의 아미노산 서열 (서열 2)을 변화시키지 않았다. 실시예 8에 기재한 바와 같이, 코돈-최적화 유전자는 야로위아 리폴리티카에서 발현된 경우에 LA를 EDA로 신장시키는데 있어서 야생형 EgD9e 유전자보다 약 16.2％ 더 효율적이었다.
유사하게, E389D9e의 최적화는 792 bp 코딩 영역 중 128 bp (16.2％)를 변형시켰고, 113개 코돈을 최적화하였다. 코돈-최적화 유전자 ("E389D9eS", 서열 6)에서의 변형 중 그 어느 것도 코딩되는 단백질의 아미노산 서열 (서열 5)을 변화시키지 않았다. 실시예 24에 기재한 바와 같이, 코돈-최적화 유전자는 야로위아 리폴리티카에서 발현된 경우에 LA를 EDA로 신장시키는데 있어서 야생형 유전자와 유사한 효율을 가졌다.
따라서, 본 발명은
(a) 클러스탈 브이 정렬 방법을 기초로 하여 서열 2 (EgD9e) 또는 서열 5 (E389D9e)에 기재된 바와 같은 아미노산 서열과 비교할 때 70％ 이상의 아미노산 동일성을 가지며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열,
(b) BLASTN 정렬 방법을 기초로 하여 서열 1 (EgD9e), 서열 3 (EgD9eS), 서열 4 (E389D9e) 또는 서열 6 (E389D9eS)에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 비교할 때 70％ 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열,
(c) 0.1× SSC, 0.1％ SDS 중 65℃에서의 혼성화 및 2× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척 및 이후 0.1× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척의 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 1 (EgD9e), 서열 3 (EgD9eS), 서열 4 (E389D9e) 또는 서열 6 (E389D9eS)에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 혼성화하며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열, 또는
(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 뉴클레오티드 서열과 동일한 수의 뉴클레오티드로 이루어지며 100％ 상보적인, 상기 (a), (b) 또는 (c)의 뉴클레오티드 서열의 상보체
로 구성된 군에서 선택된, Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
당업자는 야생형 EgD9e 및/또는 E389D9e 서열을 기초로 하여 대체 숙주 (즉, 야로위아 리폴리티카 이외의 숙주)에서의 최적의 발현에 적합한 각종 다른 코돈-최적화 Δ9 일롱가제 단백질을 생성하기 위해서 본원에서의 교시를 사용할 수 있다. 이러한 대체 숙주 유기체로는 식물 또는 식물의 일부 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명은 야생형 EgD9e로부터 유래 (즉, 서열 2에 의해 코딩됨)되거나 야생형 E389D9e로부터 유래 (즉, 서열 5에 의해 코딩됨)된 임의의 코돈-최적화 Δ9 일롱가제 단백질에 관한 것이다. 이것으로는 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된, 서열 3에 기재한 뉴클레오티드 서열 (합성 Δ9 일롱가제 단백질 (즉, EgD9eS)을 코딩함) 및 서열 6에 기재한 뉴클레오티드 서열 (합성 Δ9 일롱가제 단백질 (즉, E389D9eS)을 코딩함) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
또다른 측면에서, 본 발명은 서열 8 (즉, "IgD9e", 이소크리시스 갈바나로부터의 Δ9 일롱가제 (NCBI 관리 번호: AAL37626 (GI 17226123))을 제외한 Δ9 일롱가제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 단편에 관한 것이고, 여기서 상기 Δ9 일롱가제를 포함하는 아미노산 서열은
Figure 112008044342784-PCT00006
(여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있음)
로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열 모티프 중 하나 이상을 함유한다.
밑줄로 표시한 아미노산은 Δ9 일롱가제에 독특한 것일 수 있다. 도 2는 클러스탈 브이 정렬 (디폴트 파라미터 포함)을 이용하여 본 발명의 Δ9 일롱가제와 이소크리시스 갈바나로부터의 Δ9 일롱가제를 비교한 것을 보여준다. 구체적으로, 서열 2 (EgD9e), 서열 5 (E389D9e) 및 서열 8 (IgD9e)을 비교하였다. 본 발명의 모티프를 포함하는 영역에는 박스로 표시하였다.
상동체의 동정 및 단리
본 발명의 임의의 일롱가제 서열 (즉, EgD9e, EgD9eS, E389D9e, E389D9eS) 또는 그의 일부를 이용하여, 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 동일하거나 상이한 박테리아, 조류, 진균, 녹색편모충 또는 식물 종에서의 Δ9 일롱가제 상동체에 대하여 조사할 수 있다. 일반적으로, 이러한 컴퓨터 소프트웨어는 상동성 정도를 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 할당하면서 유사한 서열을 매치시킨다.
별법으로, 본 발명의 임의의 일롱가제 서열 또는 그의 일부는 Δ9 일롱가제 상동체의 동정을 위한 혼성화 시약으로 사용될 수도 있다. 핵산 혼성화 시험의 기본 성분은 프로브, 관심 유전자 또는 유전자 단편을 함유할 것으로 추측되는 샘플, 및 구체적인 혼성화 방법을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 프로브는 검출될 핵산 서열에 상보적인 단일-가닥 핵산 서열이다. 프로브는 검출될 핵산 서열에 "혼성화가능"하다. 프로브 길이는 5개 염기 내지 수만개 염기에 이르기까지 다양할 수 있지만, 전형적으로는 약 15개 염기 내지 약 30개 염기의 프로브 길이가 적합하다. 검출될 핵산 서열에는 프로브 분자 중 오직 일부만 상보적일 필요가 있다. 추가로, 프로브와 표적 서열 사이의 상보성이 완벽할 필요는 없다. 혼성화는 불완전하게 상보적인 분자들 사이에서 일어나서, 혼성화된 영역의 염기 중 특정 일부가 적당한 상보적 염기와 쌍을 이루지 않게 된다.
혼성화 방법은 널리 규명되어 있다. 전형적으로, 프로브 및 샘플은 핵산 혼성화를 허용하는 조건하에 혼합되어야 한다. 이것은 무기 또는 유기 염의 존재하에 적당한 농도 및 온도 조건하에서 프로브 및 샘플을 접촉시키는 것을 수반한다. 프로브 및 샘플 핵산은 이러한 프로브와 샘플 핵산 사이에서 임의의 가능한 혼성화가 일어날 수 있을 만큼 충분히 오랜 시간 동안 접촉되어 있어야 한다. 혼합물 중 프로브 또는 표적의 농도가, 혼성화가 일어나는데 필요한 시간을 결정할 것이다. 프로브 또는 표적의 농도가 높을 수록, 필요한 혼성화 인큐베이션 시간이 더 짧다. 임의로는 카오트로프제(chaotropic agent) (예컨대, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 나트륨 티오시아네이트, 리튬 테트라클로로아세테이트, 나트륨 퍼클로레이트, 루비듐 테트라클로로아세테이트, 칼륨 요오다이드, 세슘 트리플루오로아세테이트)가 추가될 수 있다. 원한다면, 상기 혼성화 혼합물에 포름아미드를 전형적으로는 30％ 내지 50％ (v/v)로 첨가할 수 있다.
각종 혼성화 용액을 사용할 수 있다. 전형적으로, 이것들은 극성 유기 용매를 약 20 부피％ 내지 60 부피％, 바람직하게는 30 부피％로 포함한다. 통상의 혼성화 용액은 약 30％ 내지 50％ v/v 포름아미드, 약 0.15 M 내지 1 M 염화나트륨, 약 0.05 M 내지 0.1 M 완충제 (예를 들어, 시트르산나트륨, Tris-HCl, PIPES 또는 HEPES (pH 범위 약 6 내지 9)), 약 0.05％ 내지 0.2％ 디터전트(detergent) (예를 들어, 나트륨 도데실술페이트), 또는 0.5 mM 내지 20 mM EDTA, 피콜(FICOLL) (파마시아 인크(Pharmacia Inc.)) (약 300 내지 500 kdal), 폴리비닐피롤리돈 (약 250 내지 500 kdal), 및 혈청 알부민을 사용한다. 또한, 전형적인 혼성화 용액에는 약 0.1 mg/mL 내지 5 mg/mL의 표지되지 않은 운반체 핵산, 단편화된 핵 DNA (예를 들어, 송아지 흉선 또는 연어 정자 DNA, 또는 효모 RNA), 및 임의로는 약 0.5％ 내지 2％ wt/vol의 글리신이 포함될 것이다. 예를 들어 다양한 극성 수용성 또는 수팽윤성 작용제 (예를 들어, 폴리에틸에틸렌 글리콜), 음이온성 중합체 (예를 들어, 폴리아크릴레이트 또는 폴리메틸아크릴레이트) 및 음이온성 당류 중합체 (예를 들어, 덱스트란 술페이트)를 포함하는 부피 배제제(volume exclusion agent)와 같은 기타 첨가제도 포함될 수 있다.
핵산 혼성화는 각종 검정 포맷에 적용될 수 있다. 가장 적합한 것 중 하나가 샌드위치 검정 포맷이다. 샌드위치 검정은 특히 비-변성 조건하에서의 혼성화에 적용될 수 있다. 샌드위치형 검정의 주성분은 고체 지지체이다. 이러한 고체 지지체에는, 표지되지 않고 서열의 한 부분에 상보적인 고정화 핵산 프로브가 흡착되어 있거나 이와 공유적으로 커플링되어 있다.
추가의 실시양태에서, 본원에 기재한 임의의 Δ9 일롱가제 핵산 단편 (또는 본원에서 동정된 임의의 상동체)은 동일하거나 상이한 박테리아, 조류, 진균, 녹색편모충 또는 식물 종으로부터의 상동성 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하는데 사용될 수 있다. 서열-의존적 프로토콜을 이용하여 상동성 유전자를 단리하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 서열-의존적 프로토콜의 예로는 1) 핵산 혼성화 방법, 2) 핵산 증폭 기술의 다양한 사용으로 예시되는 바와 같은 DNA 및 RNA 증폭 방법 (예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) [Mullis et al., 미국 특허 제4,683,202호], 리가제 연쇄 반응 (LCR) [Tabor, S. et al., Proc. Acad. Sci. USA, 82:1074 (1985)] 또는 가닥 치환 증폭 (SDA) [Walker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:392 (1992)], 및 3) 라이브러리 구축 및 상보성에 의한 스크리닝 방법 등이 있으나 이에 제한되지 않는다
예를 들어, 본원에 기재한 Δ9 일롱가제와 유사한 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는, 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 본 발명의 핵산 단편의 전부 또는 일부를 예를 들어 임의의 원하는 효모 또는 진균 (이 경우, EDA 및/또는 ETrA를 생성하는 유기체가 바람직함)으로부터의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 DNA 혼성화 프로브로서 사용함으로써 직접 단리할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열에 기초한 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 당업계에 공지된 방법으로 디자인하고 합성할 수 있다 [Maniatis, 상기 문헌]. 더우기, 전체 서열을 직접 사용하여, 당업자에게 공지된 방법 (예를 들어, 무작위 프라이머 DNA 표지화, 닉(nick) 번역 또는 말단-표지화 기술)에 의해 DNA 프로브를 합성하거나, 또는 이용가능한 시험관내 전사 시스템을 사용하여 RNA 프로브를 합성할 수 있다. 또한, 특이적 프라이머를 디자인하고 사용하여 본 발명의 서열의 일부 (또는 전장)를 증폭시킬 수 있다. 이로써 생성된 증폭 생성물을 증폭 반응 동안에 직접 표지시킬 수도 있고, 또는 증폭 반응 후에 표지시킬 수도 있으며, 이것을 적절한 엄격도 조건하에 프로브로서 사용하여 전장의 DNA 단편을 단리할 수 있다.
전형적으로, PCR형 증폭 기술에서는 프라이머가 상이한 서열을 갖고 서로에게 상보적이지 않다. 원하는 시험 조건에 따라, 프라이머의 서열은 표적 핵산의 효율적이면서도 신뢰할 만한 복제를 제공하도록 디자인해야 한다. PCR 프라이머 디자인 방법은 통상적이고 당업계에 널리 공지되어 있다 ([Thein and Wallace, "The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders", in Human Genetic Diseases: A Practical Approach, K. E. Davis Ed., (1986) pp 33-50, IRL: Herndon, VA] 및 [Rychlik, W., In Methods in Molecular Biology, White, B. A. Ed., (1993) Vol. 15, pp 31-39, PCR Protocols: Current Methods and Applications. Humania: Totowa, NJ]).
일반적으로, 본 발명의 서열의 2개의 짧은 절편이 PCR 프로토콜에 사용되어 DNA 또는 RNA로부터의 상동성 유전자를 코딩하는 보다 긴 핵산 단편을 증폭시킬 수 있다. 또한, PCR은 클로닝된 핵산 단편들의 라이브러리에 대해 수행될 수 있고, 이때 한 프라이머의 서열은 본 발명의 핵산 단편에서 유래된 것이고, 나머지 다른 프라이머의 서열은 진핵 유전자를 코딩하는 mRNA 전구체의 3' 말단에서의 폴리아데닐산 구역이 존재하는 이점을 갖는다.
별법으로, 제2 프라이머 서열은 클로닝 벡터로부터 유래된 서열을 기초로 할 수 있다. 예를 들어, 전사체 중 한 지점과 3' 또는 5' 말단 사이 영역의 카피를 증폭시키는 PCR을 이용하여 cDNA를 생성하는 RACE 프로토콜 [Frohman et al., PNAS USA, 85:8998 (1988)]에 따를 수 있다. 3' 및 5' 방향으로 배향된 프라이머가 본 발명의 서열로부터 디자인될 수 있다. 시판되는 3' RACE 또는 5' RACE 시스템 (미국 메릴랜드주 가이터스버그 소재의 깁코(Gibco)/BRL)을 사용하여, 특이적 3' 또는 5' cDNA 단편을 단리할 수 있다 ([Ohara et al., PNAS USA, 86:5673 (1989)], [Loh et al., Science, 243:217 (1989)]).
다른 실시양태에서, 본원에 기재한 임의의 Δ9 일롱가제 핵산 단편 (또는 그의 동정된 임의의 상동체)을 이용하여 신규하고 개선된 지방산 일롱가제를 생성할 수 있다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 시험관내 돌연변이유발 및 선별, 화학적 돌연변이유발, "유전자 셔플링(gene shuffling)" 방법 또는 다른 수단을 이용하여 천연 일롱가제 유전자의 돌연변이 (여기서, 이러한 돌연변이는 결실, 삽입 및 점 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있음)를 달성할 수 있다. 이것으로, 숙주 세포에서의 기능에 더욱 바람직한 물리적 및 역학적 파라미터를 갖는 생체내 지방산 일롱가제 활성, 예를 들어 보다 긴 반감기 또는 원하는 PUFA의 보다 높은 생산률을 보유하는 폴리펩티드가 생성될 수 있다. 또는, 원한다면, 통상의 돌연변이유발, 이로써 생성된 돌연변이체 폴리펩티드의 발현 및 이들의 활성 결정을 통해 효소 활성에 중요한 관심 폴리펩티드 영역을 결정할 수 있다. 이러한 기술에 대한 개요는 PCT 공개 제WO 2004/101757호에 기재되어 있다. EgD9e, EgD9eS, E389D9e 및 E389D9eS로부터 유래된 이러한 모든 돌연변이체 단백질 및 이들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 범위에 속한다.
별법으로, 개선된 지방산은 본원에 기재한 임의의 Δ9 일롱가제 핵산 단편의 기능적 도메인이 별법의 일롱가제 유전자 내의 기능적 도메인과 교환되어 신규한 단백질이 생성되는 도메인 스와핑(swapping)으로 합성될 수 있다.
각종 ω-3 및/또는 ω-6 지방산의 생성 방법
본원에 기재한 Δ9 일롱가제 (즉, EgD9e, EgD9eS, E389D9e, E389D9eS 또는 다른 돌연변이체 효소, 코돈-최적화 효소 또는 그의 상동체)를 코딩하는 키메라 유전자를 적절한 프로모터의 제어하에 도입하면 형질전환된 숙주 유기체에서 EDA 및/또는 ETrA 각각의 생성이 증가될 것으로 예상된다. 이와 같이, 본 발명은 지방산 기질 (즉, LA 및/또는 ALA)을 본원에 기재한 일롱가제 효소 (예컨대, EgD9e, EgD9eS, E389D9e, E389D9eS)와 접촉시켜서, 상기 기질이 원하는 지방산 생성물 (즉, EDA 및/또는 ETrA)로 전환되도록 하는 것을 포함하는, PUFA의 직접적인 생성 방법을 포함한다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 목적은
a) (1) 클러스탈 브이 정렬 방법을 기초로 하여 서열 2 (EgD9e) 또는 서열 5 (E389D9e)에 기재된 바와 같은 아미노산 서열과 비교할 때 70％ 이상의 아미노산 동일성을 가지며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열, 및
(2) 0.1× SSC, 0.1％ SDS 중 65℃에서의 혼성화 및 2× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척 및 이후 0.1× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척의 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 1 (EgD9e), 서열 3 (EgD9eS), 서열 4 (E389D9e) 또는 서열 6 (E389D9eS)에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 혼성화하며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열
로 구성된 군에서 선택된, Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열, 및
(ii) LA의 공급원
을 포함하는 숙주 세포 (예컨대, 유질 효모, 대두)에서의 EDA 생성 방법을 제공하는 것이고, 상기 숙주 세포는 Δ9 일롱가제가 발현되고 LA가 EDA로 전환되는 조건하에서 성장시키며, 상기 EDA는 임의로 회수된다.
본 발명의 별법의 실시양태에서, Δ9 일롱가제는 ALA를 ETrA로 전환시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 ETrA의 생성 방법을 제공하고, 여기서의 숙주 세포는
a) (1) 클러스탈 브이 정렬 방법을 기초로 하여 서열 2 (EgD9e) 또는 서열 5 (E389D9e)에 기재된 바와 같은 아미노산 서열과 비교할 때 70％ 이상의 아미노산 동일성을 가지며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열, 및
(2) 0.1× SSC, 0.1％ SDS 중 65℃에서의 혼성화 및 2× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척 및 이후 0.1× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척의 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 1 (EgD9e), 서열 3 (EgD9eS), 서열 4 (E389D9e) 또는 서열 6 (E389D9eS)에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 혼성화하며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열
로 구성된 군에서 선택된, Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열, 및
b) ALA의 공급원
을 포함하고, 상기 숙주 세포는 Δ9 일롱가제가 발현되고 ALA가 ETrA로 전환되는 조건하에서 성장시키며, 상기 ETrA는 임의로 회수된다.
별법으로, 본원에 기재한 각각의 Δ9 일롱가제 유전자 및 그의 상응하는 효소 생성물은 예를 들어 DGLA, ETA, ARA, EPA, DPA 및/또는 DHA를 비롯한 각종 ω-6 및 ω-3 PUFA의 생성에 간접적으로 이용될 수 있다 (도 1, PCT 공개 제WO 2004/101757호 참조). 지방산 기질이 원하는 지방산 생성물로 간접적으로 전환되는 ω-3/ω-6 PUFA의 간접적인 생성은 중간체 단계(들) 또는 경로 중간체(들)을 통해 일어난다. 따라서, 본원에 기재한 Δ9 일롱가제 (예컨대, EgD9e, EgD9eS, E389D9e, E389D9eS 또는 다른 돌연변이체 효소, 코돈-최적화 효소 또는 그의 상동체)는 PUFA 생합성 경로의 효소 (예컨대, Δ6 데새투라제, C18 /20 일롱가제, Δ17 데새투라제, Δ15 데새투라제, Δ9 데새투라제, Δ12 데새투라제, C14 /16 일롱가제, C16 /18 일롱가제, Δ5 데새투라제, Δ8 데새투라제, Δ4 데새투라제, C20 /22 일롱가제)를 코딩하는 추가의 유전자와 함께 발현되어 보다 긴 쇄의 ω-3/ω-6 지방산 (예컨대, ARA, EPA, DPA 및 DHA)의 생성 수준을 증가시킬 수 있다고 여겨진다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 Δ9 일롱가제는 Δ8 데새투라제 (예컨대, 서열 61에 기재한 바와 같은 Δ8 데새투라제 [EgD8] 또는 서열 69에 기재한 바와 같은 코돈-최적화 Δ8 데새투라제 [EgD8S])와 함께 최소로 발현될 것이다. 그러나, 특정 발현 카세트에 포함되는 특정 유전자는 숙주 세포 (및 그의 PUFA 프로파일 및/또는 데새투라제/일롱가제 프로파일), 기질의 이용가능성 및 원하는 최종 생성물(들)에 따라 달라질 것이다.
별법의 실시양태에서, 숙주 유기체의 천연 Δ9 일롱가제를 본원에 기재한 완전 서열, 완전 서열의 상보체, 상기 서열의 상당 부분, 그로부터 유래된 코돈-최적화 일롱가제 및 그와 실질적으로 상동성인 서열을 기초로 하여 파괴하는 것이 유용할 수 있다.
식물 발현 시스템, 카세트 및 벡터, 및 형질전환
한 실시양태에서, 본 발명은 식물에서의 발현에 적합한 1종 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 임의의 한 Δ9 일롱가제 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 구축물에 관한 것이다.
프로모터는 식물의 세포내 기구가 해당 프로모터의 인접 코딩 서열 하류 (3')로부터 RNA를 생산하도록 지시하는 DNA 서열이다. 프로모터 영역은 유전자의 RNA 전사체가 생성되는 속도, 발생 단계 및 세포 유형에 영향을 준다. RNA 전사체는 프로세싱되어 RNA 서열을 코딩 폴리펩티드의 아미노산 서열로 번역하기 위한 주형으로 작용하는 mRNA를 생성한다. 5' 비-번역 리더 서열은 mRNA의 개시 및 번역에 소정의 역할을 할 수 있는 단백질 코딩 영역의 mRNA 상류 영역이다. 3' 전사 종결/폴리아데닐화 신호는 식물 세포에서 RNA 전사가 종결되고 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드가 RNA의 3' 말단에 부가되도록 기능하는 단백질 코딩 영역의 비-번역 영역 하류이다.
Δ9 일롱가제 코딩 서열의 발현을 구동하도록 선택된 프로모터의 기원(origin)은, 그것이 정확한 시기에 원하는 숙주 조직에서 원하는 핵산 단편에 대한 번역가능한 mRNA를 발현함으로써 본 발명을 수행하기에 충분한 전사 활성을 지니는 한은 중요하지 않다. 이종 또는 비-이종 (즉, 내인성) 프로모터를 사용하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어, 적합한 프로모터로는 β-콘글리시닌 프로모터의 α-프라임 서브유닛, 쿠니츠(Kunitz) 트립신 억제제 3 프로모터, 안넥신 프로모터, Gly1 프로모터, 베타-콘글리시닌 프로모터의 베타-서브유닛, P34/Gly Bd m 30K 프로모터, 알부민 프로모터, Leg A1 프로모터 및 Leg A2 프로모터 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
안넥신 또는 P34 프로모터는 PCT 공개 제WO 2004/071178호 (2004년 8월 26일자로 공개됨)에 기재되어 있다. 안넥신 프로모터의 활성 수준은 많은 공지된 강력한 프로모터, 예를 들어 (1) CaMV 35S 프로모터 ([Atanassova et al., Plant Mol. Biol., 37:275-285 (1998)], [Battraw and Hall, Plant Mol. Biol., 15:527-538 (1990)], [Holtorf et al., Plant Mol. Biol., 29:637-646 (1995)], [Jefferson et al., EMBO J., 6:3901-3907 (1987)], [Wilmink et al., Plant Mol. Biol., 28:949-955 (1995)]), (2) 아라비돕시스 올레오신 프로모터 ([Plant et al., Plant Mol. Biol., 25:193-205 (1994)], [Li, Texas A＆M University Ph.D. dissertation, pp. 107-128 (1997)]), (3) 아라비돕시스 유비퀴틴 신장 단백질 프로모터 [Callis et al., J. Biol. Chem., 265(21):12486-93 (1990)], (4) 토마토 유비퀴틴 유전자 프로모터 [Rollfinke et al., Gene, 211(2):267-76 (1998)], (5) 대두 열 충격 단백질 프로모터 [Schoffl et al., Mol. Gen. Genet., 217(2-3):246-53 (1989)], 및 (6) 옥수수 H3 히스톤 유전자 프로모터 [Atanassova et al., Plant Mol. Biol., 37(2):275-85 (1989)]와 유사하다.
안넥신 프로모터의 또다른 유용한 특징은 발생 중인 종자 중에서의 그의 발현 프로파일이다. 안넥신 프로모터는 초기 단계의 발생 중인 종자에서 가장 활성이고 (수분 후 10일 전에), 후기 단계에서는 주로 휴면 상태이다. 안넥신 프로모터의 발현 프로파일은 발생 후기 단계에 흔히 최고의 활성을 나타내는 많은 종자-특이적 프로모터, 예를 들어 종자 저장 단백질 프로모터의 발현 프로파일과 상이하다 ([Chen et al., Dev. Genet., 10:112-122 (1989)], [Ellerstrom et al., Plant Mol. Biol., 32:1019-1027 (1996)], [Keddie et al., Plant Mol. Biol., 24:327-340 (1994)], [Plant et al., (상기 문헌)], [Li, (상기 문헌)]). 안넥신 프로모터는 보다 통상적인 발현 프로파일을 갖지만, 다른 공지된 종자 특이적 프로모터와는 여전히 구별된다. 따라서, 초기 발생 단계의 배아에서 유전자의 과다발현 또는 저해를 원하는 경우에 안넥신 프로모터는 매우 흥미로운 후보이다. 예를 들어, 초기 배아 발생을 조절하는 유전자 또는 종자 성숙 전의 대사에 관여하는 유전자의 과다발현이 바람직할 수 있다.
특정 Δ9 일롱가제 코딩 서열의 발현에 적합한 적절한 프로모터의 동정 후, 상기 프로모터는 당업자에게 널리 공지된 통상적인 수단을 이용하여 센스 배향으로 작동가능하게 연결된다.
본원에서 이용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 문헌 ([Sambrook, J. et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, 1989 (이하 "Sambrook et al., 1989")] 또는 [Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. and Struhl, K., Eds.; In Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley and Sons: New York, 1990 (이하 "Ausubel et al., 1990")])에 보다 상세하게 기재되어 있다.
일단 재조합 구축물이 생성되면, 이후에는 당업자에게 널리 공지된 방법 (예컨대, 형질감염, 형질전환 및 전기천공)에 의해 이것을 선택된 식물 세포로 도입할 수 있다. 유량종자 식물 세포가 바람직한 식물 세포이다. 이어서, 형질전환된 식물 세포를 배양하고, 장쇄 PUFA의 발현을 허용하는 적합한 조건하에 재생시킨 후에 임의로 회수 및 정제한다.
본 발명의 재조합 구축물은 식물 세포로 도입될 수도 있고, 또는 별법으로는 각 구축물이 별개의 식물 세포로 도입될 수도 있다.
식물 세포 중에서의 발현은 상기한 바와 같이 일시적 또는 안정적인 방식으로 달성될 수 있다.
원하는 장쇄 PUFA는 종자에서 발현될 수 있다. 또한, 본 발명의 범위 내에는 이러한 형질전환된 식물로부터 수득된 종자 또는 식물의 일부도 속한다.
식물의 일부는 뿌리, 줄기, 새순, 잎, 화분, 종자, 종양 조직 및 다양한 형태의 세포 및 배양물 (예컨대, 단일 세포, 원형질체, 배아 및 칼루스 조직)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 분화 조직 및 미분화 조직을 포함한다. 식물 조직은 식물에 존재할 수도 있고, 또는 식물 기관, 조직 또는 세포 배양물에 존재할 수도 있다.
용어 "식물 기관"은 식물 조직 또는 식물의 형태적 및 기능적 별개의 부분을 구성하는 조직 군을 지칭한다. 용어 "게놈"은 1) 유기체의 각 세포 또는 바이러스 또는 세포소기관에 존재하는 유전자 물질 (유전자 및 비-코딩 서열)의 전체 상보체, 및/또는 2) 한쪽 부모로부터의 (반수체) 단위로 유전된 완전 세트의 염색체를 지칭한다.
따라서, 본 발명은 또한 세포를 본 발명의 재조합 구축물로 형질전환시키는 단계, 및 상기 재조합 구축물로 형질전환된 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 세포의 형질전환 방법에 관한 것이기도 하다.
또한, 식물 세포를 본 발명의 Δ9 일롱가제 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 단계, 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 재생시키는 단계를 포함하는, 형질전환된 식물의 생성 방법에도 관심이 있다.
쌍떡잎식물 (주로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용함)을 형질전환하고 트랜스제닉 식물을 수득하는 방법은 특히 목화 (미국 특허 제5,004,83호, 미국 특허 제5,159,135호), 대두 (미국 특허 제5,569,834호, 미국 특허 제5,416,011호), 브라씨카 (미국 특허 제5,463,174호), 땅콩 ([Cheng et al., Plant Cell Rep., 15:653-657 (1996)], [McKently et al., Plant Cell Rep., 14:699-703 (1995)]), 파파야 [Ling, K. et al., Bio/technology, 9:752-758 (1991)] 및 완두 [Grant et al., Plant Cell Rep., 15:254-258 (1995)]에 대해 간행된 바 있다. 식물 형질전환에 통상적으로 사용되는 다른 방법을 검토하기 위해서는 문헌 [Newell, C.A. (Mol. Biotechnol., 16:53-65 (2000)]을 참조한다. 이러한 형질전환 방법 중 하나는 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes) [Tepfler, M. and Casse-Delbart, F., Microbiol. Sci., 4:24-28 (1987)]를 이용한다. DNA의 직접 전달을 이용한 대두의 형질전환은 PEG 융합법 (PCT 공개 제WO 92/17598호), 전기천공법 ([Chowrira, G.M. et al., Mol. Biotechnol., 3:17-23 (1995)], [Christou, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3962-3966 (1987)]), 미세주입법 또는 입자 충격법(particle bombardment) ([McCabe, D.E. et al., Bio/Technology, 6:923 (1988)], [Christou et al., Plant Physiol., 87:671-674 (1988)])을 이용한 방법이 간행된 바 있다.
식물 조직으로부터 식물을 재생시키는 방법은 다양하다. 특정 재생 방법은 출발 식물 조직 및 재생시킬 특정 식물 종에 따라 달라질 것이다. 단일 식물 원형질체 형질전환체 또는 각종 형질전환된 외식편으로부터의 식물의 재생, 발생 및 배양은 당업계에 널리 공지되어 있다 [Weissbach and Weissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic: San Diego, CA (1988)]. 전형적으로, 이러한 재생 및 성장 과정은 형질전환된 세포의 선별 단계, 및 뿌리를 내린 묘목 단계를 거치는 통상적인 배아 발생 단계를 통해 상기 개개의 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 트랜스제닉 배아 및 종자는 유사하게 재생된다. 이후, 이로써 생성된 뿌리를 내린 트랜스제닉 새순을 토양과 같은 적절한 식물 성장 매질에 심는다. 바람직하게는, 재생된 식물이 자가-수분되어 동형 트랜스제닉 식물을 제공한다. 또는, 재생된 식물에서 얻은 화분을 작물재배학적으로 중요한 식물류의 종자에서 성장한 식물과 교배시킨다. 반대로, 이들 중요한 식물류에서 얻은 화분을 사용하여 재생된 식물을 수분시킨다. 원하는 폴리펩티드를 함유하는 본 발명의 트랜스제닉 식물은 당업자에게 널리 공지된 방법으로 배양된다.
상기 논의한 절차에 추가하여, 전문인은 거대분자 (예컨대, DNA 분자, 플라스미드 등)의 구축, 조작 및 단리, 재조합 DNA 단편 및 재조합 발현 구축물의 생성, 및 클론의 스크리닝 및 단리를 위한 구체적인 조건 및 절차를 기재한 표준 참고 자료를 알고 있을 것이다. 예를 들어 문헌 ([Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor: NY (1989)], [Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor: NY (1995)], [Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, Vol.1, Cold Spring Harbor: NY (1998)], [Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, Vol.2, Cold Spring Harbor: NY (1998)], [Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer: NY (1997)])을 참조한다.
유량종자 식물의 예로는 대두, 브라씨카 종, 해바라기, 옥수수, 목화, 아마 및 잇꽃 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
20개 이상의 탄소 원자 및 5개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 PUFA의 예로는 ω-3 지방산, 예컨대 EPA, DPA 및 DHA 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 식물로부터 수득한 종자 뿐만이 아니라 이러한 종자로부터 수득한 오일 역시 본 발명의 범위에 속한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은
a) Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 코딩하며 1종 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 재조합 DNA 구축물, 및
b) Δ4 데새투라제, Δ5 데새투라제, Δ6 데새투라제, Δ8 데새투라제, Δ9 데새투라제, Δ12 데새투라제, Δ15 데새투라제, Δ17 데새투라제, C14 /16 일롱가제, C16/18 일롱가제, C18 /20 일롱가제 및 C20 /22 일롱가제로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 코딩하며 1종 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 추가의 재조합 DNA 구축물
을 포함하는 유량종자 식물에 관한 것이다.
이러한 추가의 데새투라제는 예를 들어 미국 특허 제6,075,183호, 동 제5,968,809호, 동 제6,136,574호, 동 제5,972,664호, 동 제6,051,754호, 동 제6,410,288호 및 PCT 공개 제WO 98/46763호, 동 제WO 98/46764호, 동 제WO 00/12720호 및 동 제WO 00/40705호에서 논의되어 있다.
부분적으로는, 사용되는 카세트의 조합 선택이 형질전환될 유량종자 식물 세포의 PUFA 프로파일 및/또는 데새투라제/일롱가제 프로파일 및 발현될 장쇄 PUFA(들)에 따라 달라진다.
또다른 측면에서, 본 발명은
(a) 식물 세포를 본 발명의 재조합 구축물로 형질전환시키는 단계, 및
(b) 장쇄 PUFA를 생성하는 형질전환된 세포를 선별하는 단계
를 포함하는, 식물 세포에서의 장쇄 PUFA 생성 방법에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은
(a) 대두 세포를,
(i) 1종 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및
(ii) Δ4 데새투라제, Δ5 데새투라제, Δ6 데새투라제, Δ8 데새투라제, Δ9 데새투라제, Δ12 데새투라제, Δ15 데새투라제, Δ17 데새투라제, C14 /16 일롱가제, C16 /18 일롱가제, C18 /20 일롱가제 및 C20 /22 일롱가제로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 코딩하며 1종 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 추가의 재조합 DNA 구축물
을 포함하는 제1 재조합 DNA 구축물로 형질전환시키는 단계,
(b) 상기 단계 (a)의 형질전환된 세포로부터 대두 식물을 재생시키는 단계, 및
(c) 상기 단계 (b)의 식물로부터 수득되고, 형질전환되지 않은 대두 식물로부터 수득되는 종자에서의 PUFA 수준과 비교할 때 PUFA 수준이 변경된 종자를 선별하는 단계
를 포함하는, 대두 세포에서의 1종 이상의 PUFA 생성 방법에 관한 것이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 재조합 DNA 구축물은 Δ8 데새투라제 활성, 예를 들어 유글레나 그라실리스로부터 단리되고/되거나 유래된 서열 61 및 서열 69 기재의 Δ8 데새투라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
미생물 발현 시스템, 카세트 및 벡터, 및 형질전환
본원에 기재한 Δ9 일롱가제 유전자 및 유전자 생성물 (즉, EgD9e, EgD9eS, E389D9e, E389D9eS, 또는 다른 돌연변이체 효소, 코돈-최적화 효소 또는 그의 상동체)은 이종 미생물 숙주 세포, 특히 유질 효모 (예컨대, 야로위아 리폴리티카)의 세포에서도 생성될 수 있다. 재조합 미생물 숙주에서의 발현은 각종 PUFA 경로 중간체를 생성하거나, 새로운 생성물의 합성을 위해서 지금까지는 해당 숙주를 이용하여 가능하지 않았던, 숙주에 이미 존재하는 PUFA 경로를 조정하는데 유용할 수 있다.
미생물 발현 시스템 및 외래 단백질의 높은 수준 발현을 지시하는 조절 서열을 함유하는 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이 중 임의의 것이 본 발명의 서열의 유전자 생성물 중 임의의 것의 생성을 위한 키메라 유전자를 구축하는데 사용될 수 있다. 이 경우, 이들 키메라 유전자는 형질전환을 통해 적절한 미생물에 도입되어 그의 코딩 효소의 높은 수준 발현을 제공할 수 있다.
적합한 미생물 숙주 세포의 형질전환에 유용한 벡터 또는 DNA 카세트는 당업계에 널리 공지되어 있다. 구축물에 존재하는 특정 서열의 선택은 원하는 발현 생성물 (상기 문헌), 숙주 세포의 특성, 및 형질전환된 세포 vs. 비-형질전환된 세포를 분리하는 제시된 수단에 따라 달라진다. 그러나, 상기 벡터 또는 카세트는 전형적으로 관련 유전자(들), 선별가능한 마커, 및 자율 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열의 전사 및 번역을 지시하는 서열을 함유한다. 적합한 벡터는 전사 개시를 제어하는 유전자의 5' 영역 (예컨대, 프로모터) 및 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3' 영역 (즉, 종결자)를 포함한다. 2가지 제어 영역 모두가 형질전환된 미생물 숙주 세포의 유전자에서 유래된 것이 가장 바람직하지만, 이러한 제어 영역이 생산 숙주로 선택된 특정 종에 천연인 유전자로부터 유래된 것일 필요는 없다는 것이 이해될 것이다.
원하는 미생물 숙주 세포에서 본 발명의 Δ9 일롱가제 ORF의 발현을 구동하는데 유용한 개시 제어 영역 또는 프로모터는 많으며, 당업자에게 공지되어 있다. 사실, 선택된 숙주 세포에서 이들 유전자의 발현을 지시할 수 있는 임의의 프로모터가 본 발명에 적합하다. 미생물 숙주 세포에서의 발현은 일시적 방식 또는 안정적인 방식으로 달성될 수 있다. 일시적 발현은 관심 유전자에 작동가능하게 연결된 조절가능한 프로모터의 활성을 유도하여 달성될 수 있다. 안정적인 발현은 관심 유전자에 작동가능하게 연결된 구성적 프로모터를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 효모인 경우, 효모 세포에서 기능적이며 특히 해당 숙주 종에서 유래된 전사 및 번역 영역이 제공된다 (예를 들어, 야로위아 리폴리티카에서 사용하기에 바람직한 전사 개시 조절 영역에 대하여는, PCT 공개 제WO 2004/101757호 [미국 공개 2005-0136519-A1] 및 PCT 공개 제WO 2006/052870호 [미국 공개 2006-0115881-A1] 참조). 구성적 전사 또는 유도된 전사를 원하는지, 관심 ORF의 발현에 있어서 해당 프로모터의 효율, 구축의 용이성 등에 따라 수많은 조절 서열 중 임의의 하나가 사용될 수 있다.
번역 개시 코돈 'ATG' 주위의 뉴클레오티드 서열은 효모 세포에서의 발현에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 원하는 폴리펩티드가 효모에서의 발현이 불량하다면, 최적의 유전자 발현이 달성되도록 하는 효율적인 효모 번역 개시 서열이 포함되도록 외인성 유전자의 뉴클레오티드 서열을 변형시킬 수 있다. 효모에서의 발현을 위해, 이것은 비효율적으로 발현된 유전자를 내인성 효모 유전자, 바람직하게는 고도로 발현되는 유전자에 프레임에 맞게(in-frame) 융합시켜서 상기 유전자를 부위-지정 돌연변이유발시켜 수행될 수 있다. 별법으로, 숙주에서의 컨센서스 번역 개시 서열을 결정하고 이 서열을 관심 숙주에서 최적으로 발현되도록 이종 유전자로 조작해 넣을 수 있다.
종결 영역은 개시 영역이 수득된 유전자 또는 다른 유전자의 3' 영역에서 유래될 수 있다. 많은 수의 종결 영역이 공지되어 있으며, 다양한 숙주에서 만족스럽게 기능한다 (이것들이 유래한 것과는 동일한 속과 종에서 이용할 경우와 상이한 속과 종에서 이용할 경우 둘다). 종결 영역은 통상적으로 임의의 특정 특성이 아니라 편의성의 측면에서 선택된다. 바람직하게는, 미생물 숙주가 효모 세포인 경우, 종결 영역은 효모 유전자 (특히 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스, 칸디다, 야로위아 또는 클루베로마이세스(Kluyveromyces))로부터 유래된다. γ-인터페론 및 α-2 인터페론을 코딩하는 포유동물 유전자의 3'-영역도 효모에서 기능하는 것으로 알려져 있다. 종결 제어 영역 역시 바람직한 숙주에 천연인 각종 유전자로부터 유래될 수 있다. 임의로, 종결 부위는 필요하지 않을 수도 있지만, 이것이 포함되는 것이 가장 바람직하다. 제한하려는 것은 아니지만, 본원에서의 개시내용에 유용한 종결 영역으로는 야로위아 리폴리티카 세포외 프로테아제 (XPR, 진뱅크 관리 번호: M17741)의 3' 영역의 약 100 bp, 아실-coA 옥시다제 (Aco3, 진뱅크 관리 번호: AJ001301 및 CAA04661; Pox3, 뱅크 관리 번호: XP_503244) 종결자, Pex20 (진뱅크 관리 번호: AF054613) 종결자, Pex16 (진뱅크 관리 번호: U75433) 종결자, Lip1 (진뱅크 관리 번호: Z50020) 종결자, Lip2 (진뱅크 관리 번호: AJ012632) 종결자, 및 3-옥소아실-coA 티올라제 (OCT, 진뱅크 관리 번호: X69988) 종결자 등이 있다.
당업자가 알고 있는 바와 같이, 유전자를 클로닝 벡터에 단지 삽입하는 것으로는 그것이 필요한 수준만큼 성공적으로 발현될 것이라고 보장하지 못한다. 높은 발현율에 대한 필요에 따라, 전사, 번역, 단백질 안정성, 산소 제한 및 미생물 숙주 세포로부터의 분비 측면을 제어하는 수많은 여러가지 유전자 요소를 조작하여 많은 특수 발현 벡터가 생성되었다. 더욱 구체적으로, 유전자 발현을 제어하도록 조작된 일부 분자적 특성은 1) 관련 전사 프로모터 및 종결자 서열의 특성, 2) 클로닝된 유전자의 카피 수, 상기 유전자가 플라스미드에 보유된 것인지 또는 숙주 세포의 게놈에 통합된 것인지의 여부, 3) 합성된 외래 단백질의 최종적인 세포내 위치, 4) 숙주 유기체에서 단백질의 번역 및 올바른 폴딩의 효율, 5) 숙주 세포 중 클로닝된 유전자의 mRNA 및 단백질의 내재적 안정성, 및 6) 숙주 세포에서 선호되는 코돈 사용 빈도와 근접한, 클로닝된 유전자에서의 코돈 사용을 포함한다. 이러한 각 유형의 변형은 본원에 기재한 Δ9 일롱가제의 발현을 추가로 최적화하는 수단으로서 본 발명에 포함된다.
적절한 미생물 숙주 세포 (예컨대, 유질 효모)에서의 발현에 적합한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 일단 수득되면 (예컨대, 프로모터, ORF 및 종결자를 포함하는 키메라 유전자), 이것을 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있는 플라스미드 벡터 내에 위치시키거나 또는 숙주 세포의 게놈 내로 직접 통합시킨다. 발현 카세트의 통합은 숙주 게놈 내에서 무작위로 일어날 수도 있고, 또는 숙주 유전자좌 내에서의 재조합을 표적화하기에 충분할 만큼 숙주 게놈과 상동성인 영역을 함유하는 구축물을 사용함으로써 표적화할 수도 있다. 구축물이 내인성 유전자좌를 표적화하는 경우에는, 전사 및 번역 조절 영역의 전부 또는 일부가 내인성 유전자좌에 의해 제공될 수 있다.
본 발명에서, 야로위아 리폴리티카에서의 유전자 발현에 바람직한 방법은 선형 DNA를 숙주 게놈으로 통합시키는 것이고, 유전자의 높은 수준 발현을 원하는 경우에는 게놈 내 여러 위치로 통합시키는 것이 특히 유용할 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 게놈 내에서 다중 카피로 존재하는 서열을 동정하는 것이 바람직하다.
문헌 [Schmid-Berger et al., J. Bact., 176(9):2477-2482 (1994)]은 야로위아 리폴리티카에서 제1 레트로트랜스포손-유사 요소를 발견하였다. 이 레트로트랜스포손은 제타 영역이라 불리는 장쇄 말단 반복부 (LTR, 각각이 대략 700 bp 길이임)가 존재하는 것을 특징으로 한다. Ylt1 및 solo 제타 요소는 게놈 내에서 산재된 방식으로 각각 게놈 1개 당 35개 카피 이상 및 게놈 1개 당 50개 내지 60개 카피로 존재하였다. 이들 2가지 요소 모두가 상동성 재조합 부위로 기능하는 것으로 결정되었다. 추가로, 문헌 [Juretzek et al., Yeast, 18:97-113 (2001)]의 연구는, 플라스미드를 효모 게놈의 반복 영역으로 표적화 (양 말단에 LTR 제타 영역을 갖는 선형 DNA를 사용함)하면 유전자 발현이 낮은 카피의 플라스미드 형질전환체를 이용하여 얻은 발현에 비하여 크게 증가될 수 있음을 입증하였다. 따라서, 제타-지시된 통합은 플라스미드 DNA가 야로위아 리폴리티카로 다수 통합되도록 하여 높은 수준의 유전자 발현을 허용하는 수단으로서 이상적일 수 있다. 그러나 불행히도, 야로위아 리폴리티카의 모든 균주가 제타 영역을 보유하는 것은 아니다 (예컨대, ATCC 관리 번호: #20362로 표시된 균주). 균주에 이러한 영역이 없는 경우에는 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 DNA를 별법의 유전자좌에 통합시켜서 발현 카세트에 대하여 원하는 카피 수에 도달하게 하는 것도 가능하다. 예를 들어, 바람직한 별법의 유전자좌로는 Ura3 유전자좌 (진뱅크 관리 번호: AJ306421), Leu2 유전자 유전자좌 (진뱅크 관리 번호: AF260230), Lys5 유전자 (진뱅크 관리 번호: M34929), Aco2 유전자 유전자좌 (진뱅크 관리 번호: AJ001300), Pox3 유전자 유전자좌 (Pox3:진뱅크 관리 번호: XP_503244, 또는 Aco3, 진뱅크 관리 번호: AJ001301), Δ12 데새투라제 유전자 유전자좌 (PCT 공개 제WO 2004/104167호), Lip1 유전자 유전자좌 (진뱅크 관리 번호: Z50020) 및/또는 Lip2 유전자 유전자좌 (진뱅크 관리 번호: AJ012632) 등이 있다.
유리하게는, Ura3 유전자를 5-플루오로오로트산 (5-플루오로우라실-6-카르복실산 일수화물, "5-FOA") 선별 (하기함)과 병행하여 반복적으로 사용하여 유전자 변형체가 야로위아 게놈으로 편한 방식으로 쉽게 통합되도록 할 수 있다.
2종 이상의 유전자를 별개의 복제 벡터로부터 발현시키는 경우에는, 각 벡터가 상이한 선별 수단을 갖는 것이 바람직하며, 안정적인 발현을 유지하고 구축물들 사이에서의 요소의 재배열을 방지하기 위해 다른 구축물(들)과의 상동성은 결여되어야 한다. 조절 영역, 선별 수단 및 도입된 구축물(들)의 증식 방법의 현명한 선택은, 도입된 모든 유전자가 원하는 생성물의 합성을 제공하는데 필요한 수준으로 발현되도록 실험적으로 결정할 수 있다.
관심 유전자를 포함하는 구축물은 임의의 표준 기술에 의해 미생물 숙주 세포로 도입될 수 있다. 이러한 기술로는 형질전환 (예컨대, 아세트산리튬 형질전환 [Methods in Enzymology, 194:186-187 (1991)]), 원형질체 융합, 볼리스트 충격(bolistic impact), 전기천공, 미세주입, 또는 관심 유전자를 숙주 세포 내로 도입하는 임의의 다른 방법 등이 있다. 유질 효모 (즉, 야로위아 리폴리티카)에 적용가능한 보다 구체적인 교시로는 미국 특허 제4,880,741호 및 미국 특허 제5,071,764호, 및 [Chen, D. C. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 48(2):232-235 (1997)] 등이 있다.
편의상, DNA 서열을 취하는 임의의 방법 (예를 들어 발현 카세트)으로 조작하였던 숙주 세포는 본원에서 "형질전환체" 또는 "재조합체"라고 지칭할 것이다. 형질전환된 숙주는 발현 구축물의 1개 이상의 카피를 가질 것이며, 유전자가 게놈내로 통합되는지, 증폭되는지 아니면 다중 카피 수를 갖는 염색체외 요소 상에 존재하는지의 여부에 따라서 2개 이상의 카피를 가질 수 있다.
PCT 공개 제WO 2004/101757호 [미국 공개 2005-0136519-A1] 및 PCT 공개 제WO 2006/052870호 [미국 공개 2006-0115881-A1]에 기재된 바와 같이, 형질전환된 숙주 세포는 다양한 선별 기술로 확인할 수 있다. 본원에서 사용하기에 바람직한 선별 방법은 카나마이신, 하이그로마이신 및 아미노 글리코시드 G418에 대한 내성 뿐만이 아니라 우라실, 루이신, 리신, 트립토판 또는 히스티딘이 결여된 배지 상에서 성장할 수 있는 능력이다. 별법의 실시양태에서, 5-FOA는 효모 Ura- 돌연변이체의 선별에 사용된다. 상기 화합물은 오로티딘 5'-모노포스페이트 데카르복실라제 (OMP 데카르복실라제)를 코딩하는 기능적 URA3 유전자를 보유하는 효모 세포에는 독성이며, 따라서, 5-FOA는 이러한 독성을 기초로 하여 Ura- 돌연변이체 효모 균주를 선별하고 동정하는데 특히 유용하다 [Bartel, P.L. and Fields, S., Yeast 2-Hybrid System, Oxford University: New York, v. 7, pp 109-147, 1997]. 더욱 구체적으로, 천연 Ura3 유전자를 우선 넉아웃(knockout)시켜서 Ura- 표현형을 갖는 균주를 생성할 수 있으며, 이때의 선별은 5-FOA 내성을 기초로 한다. 이후, 다중 키메라 유전자의 클러스터 및 새로운 Ura3 유전자를 야로위아 게놈의 상이한 유전자좌로 통합시켜서 Ura+ 표현형을 갖는 새로운 균주를 생성할 수 있다. 도입된 Ura3 유전자가 넉아웃되는 경우, 이후의 통합은 새로운 Ura3- 균주 (다시, 5-FOA 선별을 이용하여 동정함)를 생성한다. 따라서, Ura3 유전자 (5-FOA 선별 이용)는 여러회의 형질전환에서 선별 마커로 사용될 수 있다.
형질전환 후, 본 발명의 Δ9 일롱가제 (및 임의로는 숙주 세포 내에서 동시 발현되는 다른 PUFA 효소)에 적합한 기질은 천연적 또는 트랜스제닉으로 숙주에 의해 생성될 수도 있고, 또는 이들이 외적으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 유전자 및 핵산 단편의 발현을 위한 미생물 숙주 세포는, 광범위한 범위의 온도 및 pH 값에 걸쳐, 단순 또는 복합 탄수화물, 지방산, 유기 산, 오일 및 알콜, 및/또는 탄화수소를 비롯한 각종 공급원료상에서 성장하는 숙주를 포함할 수 있다. 본 발명에 기재된 유전자가 유질 효모 (및 특히 야로위아 리폴리티카)에서의 발현을 위해 단리되긴 하였지만, 전사, 번역 및 단백질 생합성 기구는 고도로 보존되는 것이기 때문에, 임의의 박테리아, 효모, 조류 및/또는 진균이 본 발명의 핵산 단편을 발현하는데 적합한 미생물 숙주라고 여겨진다.
그러나, 바람직한 미생물 숙주는 유질 효모이다. 이들 유기체는 천연적으로 오일을 합성하고 축적할 수 있는데, 이때의 오일은 세포 건조 중량의 약 25％ 초과, 더욱 바람직하게는 세포 건조 중량의 약 30％ 초과, 가장 바람직하게는 세포 건조 중량의 약 40％ 초과를 차지할 수 있다. 전형적으로 유질 효모로 확인된 속으로는 야로위아, 칸디다, 로도토룰라, 로도스포리듐, 크립토콕쿠스, 트리코스포론 및 리포마이세스 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로, 오일을 합성하는 효모의 예로는 로도스포리듐 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 리포마이세스 스타르케이이(Lipomyces starkeyii), 엘. 리포페루스(L. lipoferus), 칸디다 레브카우피(Candida revkaufi), 씨. 풀케리마(C. pulcherrima), 씨. 트로피칼리스(C. tropicalis), 씨. 우틸리스(C. utilis), 트리코스포론 풀란스(Trichosporon pullans), 티. 쿠타네움(T. cutaneum), 로도토룰라 글루티누스(Rhodotorula glutinus), 알. 그라미니스(R. graminis), 및 야로위아 리폴리티카 (이전에는 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica)로서 분류되었음) 등이 있다.
가장 바람직한 것은 유질 효모 야로위아 리폴리티카이며, 추가의 실시양태에서 가장 바람직한 것은 ATCC #20362, ATCC #8862, ATCC #18944, ATCC #76982 및/또는 LGAM S(7)1로서 표시된 야로위아 리폴리티카 균주이다 [Papanikolaou S., and Aggelis G., Bioresour. Technol., 82(1):43-9 (2002)].
역사적으로, 다양한 균주의 야로위아 리폴리티카가 이소시트레이트 리아제, 리파제, 폴리히드록시알카노에이트, 시트르산, 에리트리톨, 2-옥소글루타르산, γ-데카락톤, γ-도데카락톤, 및 피루브산의 제조 및 생성에 사용되어 왔다. 야로위아 리폴리티카에서 ARA, EPA 및 DHA 생성을 조작하는데 적용가능한 구체적인 교시는 미국 특허 출원 제11/264784호 (PCT 공개 제WO 2006/055322호), 동 제11/265761호 (PCT 공개 제WO 2006/052870호) 및 동 제11/264737호 (PCT 공개 제WO 2006/052871호)에서 각각 제공된다.
다른 바람직한 미생물 숙주는 유질 박테리아, 조류 및 다른 진균을 포함하고, 이러한 광범위한 군의 미생물 숙주 중에서 특별한 관심이 있는 것은 ω-3/ω-6 지방산을 합성하는 미생물 (또는 그러한 목적을 위해서 유전자 조작될 수 있는 미생물 [예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애와 같은 다른 효모])이다. 따라서, 예를 들어, 유도가능하거나 조절되는 프로모터의 제어하에 본 발명의 임의의 Δ9 일롱가제 유전자를 사용하여 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) (ARA의 생성을 위해 상업적으로 사용됨)를 형질전환시키면, 증가된 양의 EDA를 합성할 수 있는 형질전환 유기체가 생성될 수 있고, Δ8 데새투라제 유전자가 동시 발현된다면 이것이 증가된 양의 DGLA로 전환될 수 있다. 모르티에렐라 알피나의 형질전환 방법은 문헌 [Mackenzie et al., Appl. Environ. Microbiol., 66:4655 (2000)]에 기재되어 있다. 유사하게, 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 미생물의 형질전환 방법은 미국 특허 제7,001,772호에 개시되어 있다.
상기한 교시내용을 기초로 하여, 본 발명은 한 실시양태에서
a) (i) Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 코딩하며 1종 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 재조합 DNA 구축물, 및
(ii) LA 또는 ALA 각각으로 구성된 일롱가제 기질의 공급원
을 포함하는 유질 효모를 제공하는 단계,
b) 적합한 발효가능한 탄소원의 존재하에 상기 단계 (a)의 효모를 성장시켜서, Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현시키고 LA를 EDA로 전환시키거나 ALA를 ETrA로 전환시키는 단계, 및
c) 임의로, 상기 단계 (b)의 EDA 또는 ETrA 각각을 회수하는 단계
를 포함하는, EDA 또는 ETrA 각각의 생성 방법에 관한 것이다.
기질 영양보급이 필요할 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, Δ9 일롱가제를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 1 및 서열 4로 구성된 군에서 선택된다. 별법의 바람직한 실시양태에서, Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 3 (여기서, 106개 이상의 코돈이 서열 1에 비해 야로위아 중에서의 발현을 위해 최적화되어 있음)에 기재되어 있다. 또한, 다른 바람직한 실시양태에서, Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 6 (여기서, 113개 이상의 코돈이 서열 4에 비해 야로위아 중에서의 발현을 위해 최적화되어 있음)에 기재되어 있다.
물론, 유질 효모에서 천연적으로 생성된 PUFA는 18:2 지방산 (즉, LA) 및 덜 통상적으로는 18:3 지방산 (즉, ALA)으로 한정되기 때문에, 본 발명의 더욱 바람직한 실시양태에서는 상기 유질 효모가 본원에 기재한 Δ9 일롱가제에 추가하여 장쇄 PUFA 생합성에 필요한 다중 효소를 발현 (이로써, 예를 들어 ARA, EPA, DPA 및 DHA의 생성이 가능해 짐)하도록 유전자 조작될 것이다.
구체적으로, 본 발명은 한 실시양태에서
a) Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 코딩하며 1종 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 재조합 DNA 구축물, 및
b) Δ4 데새투라제, Δ5 데새투라제, Δ6 데새투라제, Δ9 데새투라제, Δ12 데새투라제, Δ15 데새투라제, Δ17 데새투라제, Δ8 데새투라제, C14 /16 일롱가제, C16/18 일롱가제, C18 /20 일롱가제 및 C20 /22 일롱가제로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 코딩하며 1종 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 추가의 재조합 DNA 구축물
을 포함하는 유질 효모에 관한 것이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 재조합 DNA 구축물은 Δ8 데새투라제 활성을 갖는 폴리펩티드, 예를 들어 유글레나 그라실리스로부터 단리되고/되거나 유래된 서열 61 및 서열 69 기재의 Δ8 데새투라제를 코딩한다.
미생물 중 ω-3 및/또는 ω-6 지방산 생합성의 대사 조작
생화학적 경로의 조작 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 유질 효모, 특히 야로위아 리폴리티카에서 ω-3 및/또는 ω-6 지방산 생합성을 최대화하는 수많은 조작이 가능할 것으로 예상된다. 여기에는 PUFA 생합성 경로 내에서 직접 대사를 조작할 필요가 있을 수도 있고, 또는 여러가지 다른 대사 경로의 조작이 추가로 조합될 필요가 있을 수도 있다.
PUFA 생합성 경로 내에서 조작하는 경우, ω-6 및/또는 ω-3 지방산의 생성이 증가될 수 있도록 LA의 생성을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은, Δ9 데새투라제 및/또는 Δ12 데새투라제를 코딩하는 유전자의 도입 및/또는 증폭에 의해 달성될 수 있다. ω-6 불포화 지방산의 생성을 최대화하기 위해서는 ALA가 실질적으로 없는 숙주 미생물에서 생성하는 것이 유리하다는 것은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 따라서 숙주는 LA가 ALA로 전환되는 것을 허용하는 Δ15 또는 ω-3 유형 데새투라제 활성을 없애거나 억제함으로써 선별되거나 수득되는 것이 바람직하다. 내인성 데새투라제 활성은 예를 들어 (1) Δ15 데새투라제 전사 생성물에 안티센스 서열의 전사를 위한 카세트를 제공하거나, (2) 표적 유전자 전체 또는 일부의 삽입, 치환 및/또는 결실을 통해 Δ15 데새투라제 유전자를 파괴하거나, 또는 (3) Δ15 데새투라제 활성이 천연적으로 낮거나 없는 [또는 그러하도록 돌연변이된) 숙주 세포를 사용함으로써 감소시키거나 없앨 수 있다. 원치않는 데새투라제 경로의 억제는 예를 들어 미국 특허 제4,778,630호에 기재된 것과 같은 특정 데새투라제 억제제를 사용하여 달성될 수도 있다.
별법으로, ω-3 지방산의 생성을 최대화 (및 ω-6 지방산의 합성을 최소화)하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 예에서는, 올레산이 LA로 전환되도록 하는 Δ12 데새투라제 활성이 제거되거나 억제된 숙주 미생물을 이용할 수 있고, 이후에는 적절한 발현 카세트를 ALA의 ω-3 지방산 유도체 (예컨대, STA, ETrA, ETA, EPA, DPA, DHA)로 전환시키기에 적절한 기질 (예컨대, ALA)과 함께 숙주에 도입한다.
별법의 실시양태에서, 에너지 또는 탄소에 대하여 ω-3 및/또는 ω-6 지방산 생합성 경로와 경쟁하는 생화학적 경로 또는 특정 PUFA 최종 생성물의 생성을 저해하는 천연 PUFA 생합성 경로 효소는 유전자 파괴에 의해 제거될 수도 있고, 또는 다른 수단 (예컨대, 안티센스 mRNA)을 이용하여 하향조절될 수도 있다.
ARA, EPA 또는 DHA를 증가시키는 수단 (및 그의 관련 기술)으로서 PUFA 생합성 경로 내의 조작에 관한 상세한 논의는 PCT 공개 제WO 2006/055322호 [미국 특허 공개 제2006-0094092-A1호], PCT 공개 제WO 2006/052870호 [미국 특허 공개 제2006-0115881-A1호] 및 PCT 공개 제WO 2006/052871호 [미국 특허 공개 제2006-0110806-A1호] 각각에 TAG 생합성 경로 및 TAG 분해 경로에서의 바람직한 조작 (및 그의 관련 기술)으로 기재되어 있다.
본 발명의 내용에서, 상기한 전략 중 임의의 것을 이용하여 지방산 생합성 경로의 발현을 조정하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 Δ9 일롱가제/Δ8 데새투라제 생합성 경로에서의 핵심 효소를 코딩하는 유전자가 ω-3 및/또는 ω-6 지방산의 생성을 위해서 유질 효모에 도입되는 방법을 제공한다. 천연적으로 ω-3 및/또는 ω-6 지방산 생합성 경로를 보유하지 않고 이들 유전자의 발현을 조화시키지 않는 유질 효모에서 숙주 유기체의 대사 조작을 위한 각종 수단을 이용하여 바람직한 PUFA 생성물의 생성을 최대화하기 위해서 본 발명의 Δ9 일롱가제 유전자를 발현시키는 것이 특히 유용할 것이다.
PUFA 생성을 위한 미생물 발효 공정
형질전환된 미생물 숙주 세포는, 키메라 데새투라제 및 일롱가제 유전자의 발현을 최적화하고 원하는 PUFA를 가장 많이 가장 경제적인 수율로 생성시키는 조건하에 성장시킨다. 일반적으로, 최적화시킬 수 있는 배지 조건에는 탄소원의 유형 및 양, 질소원의 유형 및 양, 탄소:질소의 비율, 산소 수준, 성장 온도, pH, 생물집단(biomass) 생산기의 길이, 오일 축적기의 길이 및 세포 수확 시간 및 방법이 포함된다. 관심 미생물, 예컨대 유질 효모 (예컨대, 야로위아 리폴리티카)를 복합 배지 (예를 들어, 효모 추출물-펩톤-덱스트로스 브로쓰(broth) (YPD)), 또는 성장에 필요한 성분이 결여되어 있어서 원하는 발현 카세트가 선별되도록 하는 규정된 최소 배지 (예를 들어 미국 미시건주 디트로이트 소재의 디프코 래버러토리즈(DIFCO Laboratories))에서 성장시킨다.
본 발명에서의 발효 배지는 적합한 탄소원을 함유해야 한다. 적합한 탄소원으로는 단당류 (예를 들어 글루코스, 프럭토스), 이당류 (예를 들어 락토스, 수크로스), 올리고당류, 다당류 (예를 들어 전분, 셀룰로스 또는 이들의 혼합물), 당 알콜 (예를 들어 글리세롤), 또는 재생가능한 공급원료로부터의 혼합물 (예를 들어 유장 투과물, 옥수수 침유, 사탕무 당밀, 보리 맥아) 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 추가로, 탄소원에는 알칸, 지방산, 지방산의 에스테르, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질, 및 식물성 오일 (예를 들어 대두유) 및 동물 지방을 비롯한 각종 시판 지방산 공급물이 포함될 수 있다. 탄소원에는 핵심적인 생화학적 중간체로의 대사 전환이 입증된 바 있는 1-탄소원 (예를 들어, 이산화탄소, 메탄올, 포름알데히드, 포르메이트 및 탄소-함유 아민)이 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 탄소원은 광범위하게 다양한 탄소-함유 공급원을 포함할 수 있고 숙주 유기체의 선택에 의해서만 제한될 것으로 여겨진다. 바람직한 탄소원은 당, 글리세롤, 및/또는 지방산이다. 가장 바람직한 것은 글루코스 및/또는 10개 내지 22개 탄소를 함유하는 지방산이다.
질소는 무기 공급원 (예를 들어 (NH4)2SO4) 또는 유기 공급원 (예를 들어 우레아 또는 글루타메이트)으로부터 제공될 수 있다. 적절한 탄소원과 질소원 이외에도, 발효 배지는 적합한 광물질, 염, 보조인자, 완충제, 비타민, 및 유질 숙주의 성장과 PUFA 생성에 필요한 효소 경로의 촉진에 적합한 것으로 당업자에게 공지된 기타 성분도 함유해야 한다. 지질과 PUFA의 합성을 촉진시키는 몇가지 금속 이온 (예를 들어 Mn+2, Co+2, Zn+2, Mg+2)에 특히 주목해야 한다 [Nakahara, T. et al., Ind. Appl. Single Cell Oils, D. J. Kyle and R. Colin, eds. pp 61-97 (1992)].
본 발명에서 바람직한 성장 배지는 상업적으로 제조된 통상의 배지, 예를 들어 효모 질소 기재 (미국 미시건주 디트로이트 소재의 디프코 래보러토리즈)이다. 기타 규정된 성장 배지 또는 합성 성장 배지를 사용할 수도 있고, 형질전환체 숙주 세포의 성장에 적절한 배지는 미생물학 또는 발효 과학 분야의 전문가에게 공지되어 있을 것이다. 전형적으로, 발효에 적합한 pH 범위는 약 pH 4.0 내지 pH 8.0이며, pH 5.5 내지 pH 7.5가 초기 성장 조건의 범위로서 바람직하다. 발효는 호기성 또는 혐기성 조건하에 수행할 수 있으며, 미호기성(microaerobic) 조건이 바람직하다.
전형적으로, 높은 수준의 PUFA가 유질 효모 세포에 축적되기 위해서는 2-단계 공정이 필요한데, 이는 대사 상태가 성장과 지방의 합성/저장 사이에서 "균형을 맞춰"야만 하기 때문이다. 따라서, 가장 바람직하게는, 유질 효모 (예컨대, 야로위아 리폴리티카)에서 PUFA를 생성시키기 위해 2-단계 발효 공정이 필요하다. 이러한 접근법은 다양한 적합한 발효 공정 디자인 (즉, 회분식, 유가식(fed-batch) 및 연속식) 및 성장 동안의 고려사항 등에 대하여 PCT 공개 제WO 2004/101757호에 기재되어 있다.
PUFA 오일의 정제 및 가공
PUFA는 숙주 미생물 및 식물에서 유리 지방산으로 존재할 수도 있고, 또는 아실글리세롤, 인지질, 술포지질 또는 당지질과 같은 에스테르화 형태로 존재할 수도 있으며, 당업계에 널리 공지된 각종 수단을 통해 숙주 세포로부터 추출할 수 있다. 효모 지질에 대한 추출 기술, 품질 분석 및 허용 기준에 관한 검토 중 하나가 문헌 [Z Jacobs, Critical Reviews in Biotechnology, 12(5/6):463-491 (1992)]이다. 하류 가공에 관한 간단한 검토는 또한 문헌 [A Singh and O Ward, Adv. Appl. Microbiol., 45:271-312 (1997)]에서도 찾을 수 있다.
일반적으로, PUFA를 정제하기 위한 수단으로는 유기 용매를 사용한 추출, 초음파 처리, 초임계 유체 추출 (예를 들어, 이산화탄소를 사용함), 비누화 및 물리적 수단, 예를 들어 압착, 또는 이들의 조합 등을 들 수 있다. 보다 상세한 사항에 대하여는 PCT 공개 제WO 2004/101757호의 교시내용을 참조한다.
종자 오일의 단리 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다 ([Young et al., Processing of Fats and Oils, In The Lipid Handbook, Gunstone et al., eds., Chapter 5, pp 253-257], [Chapman ＆ Hall: London (1994)]). 예를 들어, 대두유는 오일-함유 종자로부터의 식용 오일 생성물을 추출 및 정제하는 것을 수반하는 일련의 단계들을 이용하여 생성된다. 대두유 및 대두 부산물은 하기 표 5에 나타낸 일반화된 단계를 이용하여 생성된다:
대두유 및 부산물 생성을 위한 일반화된 단계
가공 단계 가공 제거된 불순물 및/또는 수득된 부산물
#1 대두 종자
#2 오일 추출 가루
#3 탈고무화(degumming) 레시틴
#4 알칼리 또는 물리적 정련(refining) 고무, 유리 지방산, 안료
#5 물 세척 비누
#6 표백 착색제, 비누, 금속
#7 (수소화)
#8 (윈터리제이션 (winterization)) 스테아린
#9 탈취 유리 지방산, 토코페롤, 스테롤, 휘발물질
#10 오일 생성물
더욱 구체적으로, 대두 종자를 세정, 조질화, 탈피 및 박편화시켜서 오일 추출 효율을 증가시킨다. 오일 추출은 통상적으로 용매 (예컨대, 헥산) 추출을 통해 달성되지만, 물리적 압력 및/또는 용매 추출의 조합으로 달성될 수도 있다. 이로써 생성된 오일을 조 오일이라고 부른다. 조 오일은, 인지질 및 수화되지 않은 트리글리세리드 분획 (대두유)으로부터의 분리를 용이하게 하는 기타 극성 및 중성 지질 복합체를 수화시켜서 탈고무화될 수 있다. 이로써 생성된 레시틴 고무는 다양한 식품 및 산업품에서 유화제 및 이형제 (즉, 항-고착제)로 사용되는 상업적으로 중요한 레시틴 생성물이 제조되도록 추가로 가공될 수 있다. 탈고무화된 오일은 불순물 (주로 유리 지방산, 안료 및 잔류 고무)을 제거하기 위해 추가로 정련될 수 있다. 정련은 유리 지방산과 반응하여 비누를 형성하고 조 오일 중의 포스파티드 및 단백질을 수화시키는 부식제를 첨가하여 달성된다. 물은 정련 동안 형성된 미량의 비누를 세척해 내는데 사용된다. 비누화물(soapstock) 부산물은 동물 사료에 직접 사용될 수도 있고, 또는 산성화시켜 유리 지방산을 회수할 수도 있다. 착색제는 대부분의 클로로필 및 카르테노이드 화합물을 제거하는 표백토를 사용한 흡착을 통해 제거된다. 정련된 오일은 수소화될 수 있으며, 이로써 다양한 용융 특성 및 텍스쳐(texture)를 갖는 지방이 생성된다. 윈터리제이션 (분획화)은 조심스럽게 제어되는 냉각 조건하에서의 결정화를 통해서 수소화 오일로부터 스테아린을 제거하는데 이용될 수 있다. 탈취 (주로 진공하의 증기 증류를 통해 수행함)는 마지막 단계이며, 오일에 냄새 또는 향을 부과하는 화합물을 제거하기 위해 디자인된 것이다. 다른 가치있는 부산물, 예컨대 토코페롤 및 스테롤은 탈취 공정 동안에 제거될 수 있다. 이러한 부산물을 함유하는 탈취된 증류물질은 천연 비타민 E 및 다른 고가의 제약 생성물 생성을 위해 판매될 수 있다. 정련, 표백 (수소화, 분획화) 및 탈취된 오일 및 지방은 포장되어 바로 판매될 수도 있고, 또는 더 특수한 생성물로 추가 가공될 수도 있다. 대두 종자 가공, 대두유 생성 및 부산물 이용에 관한 보다 상세한 언급은 문헌 [Erickson, Practical Handbook of Soybean Processing and Utilization, The American Oil Chemists' Society and United Soybean Board (1995)]에서 찾을 수 있다. 대두유는 오일, 예컨대 코코넛, 팜, 팜 커넬 및 코코아 버터와 비교할 때 포화 지방산 함량이 비교적 낮아서 실온에서 액체이다.
정련되고/되거나 정제된 PUFA를 함유하는 식물 및 미생물 오일은 수소화될 수 있으며, 이로써 다양한 용융 특성 및 텍스쳐를 갖는 지방이 생성된다. 많은 가공 지방 (스프레드, 제과용 지방, 하드 버터, 마가린, 베이킹 쇼트닝 등)은 실온에서의 고화도 정도가 다양할 것이 요구되며, 공급원 오일의 물리적 성질을 변경시켜야만 생성될 수 있다. 이것은 가장 통상적으로는 촉매적 수소화를 통해 달성된다.
수소화는 니켈과 같은 촉매의 보조하에 수소가 불포화 지방산 이중 결합에 첨가되는 화학 반응이다. 예를 들어, 올레산 고함량 대두유는 불포화 올레산, LA 및 리놀렌산 지방산을 함유하며, 이들 각각은 수소화될 수 있다. 수소화는 2가지 주요 효과를 갖는다. 첫째, 불포화 지방산 함량의 감소로 인해 오일의 산화적 안정성이 증가된다. 둘째, 지방산 변형이 용융점을 증가시켜서 실온에서 반-액체 또는 고체인 지방이 되기 때문에 오일의 물리적 성질이 변화된다.
수소화 반응에 영향을 미치고 따라서 최종 생성물의 조성을 변경시키는 변수는 많이 있다. 압력, 온도, 촉매 유형 및 농도, 교반 및 반응기 디자인 등을 비롯한 작업 조건은 제어될 수 있는 보다 중요한 파라미터이다. 덜 불포화된 지방산보다 더 불포화된 지방산을 수소화하는데에는 선택적인 수소화 조건이 이용될 수 있다. 매우 적은 정도 또는 약간의 수소화는 액체 오일의 안정성을 증가시키는데 흔히 이용된다. 추가의 수소화는 액체 오일을 물리적으로 고체인 지방으로 전환시킨다. 수소화 정도는 특정 최종 생성물을 위해 디자인된 원하는 성능 및 용융 특징에 따라 달라진다. 수소화로 달성될 수 있는 수많은 오일 및 지방 생성물에는 액체 쇼트닝 (베이킹 생성물의 제조에 사용됨. 고체 지방 및 쇼트닝은 상업적으로 튀기고 볶는 작업에 사용됨), 및 마가린 제조를 위한 베이스 스톡(base stock)이 포함된다. 수소화 및 수소화 생성물에 관한 보다 상세한 설명은 문헌 [Patterson, H. B. W., Hydrogenation of Fats and Oils: Theory and Practice. The American Oil Chemists' Society (1994)]에서 찾을 수 있다.
수소화 오일은 수소화 과정으로 인한 트랜스-지방산 이성질체의 존재로 인해 약간 논쟁거리가 되어 왔다. 트랜스-이성질체의 다량 섭취는 혈액 혈장 중 저밀도:고밀도 지단백질의 비율 증가 및 관상 심장 질환의 위험도 증가 등을 비롯하여 건강에 대한 해로운 영향과 관련이 있다.
식품에 사용하기 위한 PUFA -함유 오일
시장은 현재 ω-3 및/또는 ω-6 지방산 (특히 ARA, EPA 및 DHA)을 혼입한 매우 다양한 식품 및 사료 제품을 선호하고 있다. PUFA를 포함하는 본 발명의 식물/종자 오일, 변경된 종자 및 미생물 오일은 식품 및 사료 제품에서 이들 제제의 건강상의 이점을 부여하는 기능을 한다고 여겨진다. 다른 식물성 오일과 비교할 때, 본 발명의 오일은 물리적 관점에서 볼 때 식품에 사용된 다른 오일과 유사하게 기능할 것으로 여겨진다 (예를 들어 대두유와 같은 부분적 수소화 오일은 베이킹하고 튀기기 위한 소프트 스프레드, 마가린 및 쇼트닝의 성분으로 널리 사용됨).
본원에 기재한 ω-3 및/또는 ω-6 지방산을 함유하는 식물/종자 오일, 변경된 종자 및 미생물 오일은 식품 유사물, 육류 제품, 시리얼 제품, 스낵 식품, 베이킹 식품 및 유제품을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 식품 및 사료 제품에 사용하기에 적합할 것이다. 추가로, 본 발명의 식물/종자 오일, 변경된 종자 및 미생물 오일은 의료용 영양제, 식이 보조제, 유아용 조제식 뿐만이 아니라 제약 생성물 등을 비롯한 의료용 식품에 건강상의 이점을 부여하기 위한 제제에 사용될 수 있다. 식품 가공 및 식품 제조 업계의 당업자는 소정량과 소정의 조성을 갖는 식물 및 미생물 오일이 식품 또는 사료 제품에 첨가될 수 있는 방법을 이해할 것이다. 이러한 양을 본원에서는 "유효량"이라 지칭할 것이고, 이것은 해당 생성물이 보충하도록 의도된 음식물인 식품 또는 사료 제품, 또는 해당 의료용 식품 또는 의료용 영양제가 보완하거나 처치되도록 의도된 의학적 상태에 따라 달라질 것이다.
식품 유사물은 당업자에게 널리 공지된 공정을 이용하여 제조될 수 있다. 육류 유사물, 치즈 유사물, 유류 유사물(milk analog) 등을 언급할 수 있다. 대두로 제조된 육류 유사물은 콩 단백질 또는 두부 및 다양한 종류의 육류를 모방하기 위해 한데 혼합된 기타 성분들을 함유한다. 이들 육류 대안물은 냉동 식품, 통조림 식품 또는 건조 식품으로 판매된다. 통상적으로, 이들은 이것들이 대체할 식품과 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 대두로 제조된 육류 대안물은 단백질, 철 및 B 비타민의 우수한 공급원이다. 육류 유사물의 예로는 햄 유사물, 소시지 유사물, 베이컨 유사물 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
식품 유사물은 그의 기능적 특징과 조성적 특징에 따라 모방물(imitiation) 또는 대용물로 분류될 수 있다. 예를 들어, 모방 치즈(imitation cheese)는 그것이 대체하도록 디자인된 치즈와 닮기만 하면 된다. 그러나, 그 생성물이 대체한 치즈와 영양상 동등하고 그 치즈에 대한 최소의 조성 요건을 대신하여 충족시키기만 한다면, 그러한 생성물은 일반적으로 대용 치즈라 불릴 수 있다. 따라서, 대용 치즈는 흔히 모방 치즈보다 단백질 수준이 더 높을 것이고 비타민 및 광물질이 강화되어 있을 것이다.
유류 유사물 또는 비-유제품으로는 모방유(imitation milk) 및 비-유제품의 냉동 디저트 (예컨대, 대두 및/또는 콩 단백질 생성물로부터 제조된 것) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
육류 제품은 매우 다양한 생성물을 포함한다. 미국에서는, "육류"가 소, 돼지 및 양에서 얻은 "살코기"를 포함한다. 살코기에 추가하여, 닭, 칠면조, 거위, 뿔닭, 오리 등을 비롯한 가금류 품목 및 어류와 조개류도 있다. 조미되고 가공된 육류 제품은 광범위하게 분류된다: 날 것, 보존처리되고 튀긴 것, 및 보존처리되고 요리된 것. 소시지 및 핫도그는 가공 육류 제품의 예이다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "육류 제품"은 가공 육류 제품을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
시리얼 식품은 시리얼 곡물을 가공하여 유래된 식품이다. 시리얼 곡물은 식용 곡물 (종자)을 생산하는 목초류(grass family)에 속하는 임의의 식물을 포함한다. 가장 대중적인 곡물은 보리, 옥수수, 기장, 귀리, 키누아(quinoa), 쌀, 호밀, 사탕수수, 라이밀, 밀 및 야생미이다. 시리얼 식품의 예로는 전곡(whole grain), 분쇄 곡물, 그릿, 밀가루, 겨, 배아(germ), 아침식사용 시리얼, 압출 식품, 파스타 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
베이킹 제품은 상기 언급한 임의의 시리얼 식품을 포함하며, 베이킹된 것이거나 베이킹과 유사한 방식으로 가공된 것, 즉 열을 가하여 건조 또는 경화시킨 것이다. 베이킹 제품의 예로는 빵, 케이크, 도넛, 바아(bar), 파스타, 빵가루, 베이킹 스낵, 미니-비스킷, 미니-크래커, 미니-쿠키, 및 미니-프레첼 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 오일이 성분으로 사용될 수 있다.
스낵 식품은 상기하거나 하기한 임의의 식품을 포함한다.
튀긴 식품은 상기하거나 하기한 임의의 튀긴 식품을 포함한다.
건강 식품은 건강상의 이익을 부여하는 임의의 식품이다. 많은 유량종자-유래의 식품이 건강 식품으로 간주될 수 있다.
음료는 액체 또는 건조 분말 형태일 수 있다.
예를 들어, 과일 주스 (신선한 것, 냉동된 것, 캔에 들어 있거나 농축된 것), 향미료가 첨가되거나 첨가되지 않은 유류 드링크 등과 같은 비-탄산 드링크가 언급될 수 있다. 성인 및 유아용 영양 조제식은 당업계에 널리 공지되어 있으며 시판되고 있다 (예컨대, 시밀락(Similac)®, 엔슈어(Ensure)®, 제비티(Jevity)®, 및 알리멘툼(Alimentum)®, 애보트 래버러토리즈(Abbott Laboratories), 로스 프로덕츠 디비전(Ross Products Division)).
유아용 조제식은 유아 및 어린이에게 공급되는 액체 또는 재구성된 분말이다. 본원에서, "유아용 조제식"은 젖먹이 유아에서 인간 모유를 대체할 수 있는 소장 영양 생성물로 정의되며, 전형적으로 수용액 중 원하는 비율(％)의 탄수화물 및 단백질과 혼합된 원하는 비율(％)의 지방으로 이루어진다 (예를 들어 미국 특허 제4,670,285호 참조). 전 세계적인 조성 연구 및 전문가 그룹에 의해 규명된 수준을 기초로 할 때, 평균적인 인간 모유는 전형적으로 전체 지방산을 약 0.20％ 내지 0.40％로 함유하며 (지방 칼로리의 약 50％로 추정됨), DHA:ARA의 비율은 일반적으로 약 1:1 내지 1:2의 범위이다 (예컨대, 엔파밀 리필™(Enfamil LIPIL™) [미드 존슨 앤드 컴파니(Mead Johnson ＆ Company)] 및 시밀락 어드밴스™(Similac Advance™) [애보트 래버러토리즈, 로스 프로덕츠 디비젼]의 제제 참조). 유아용 조제식은 흔히 유아를 위한 유일한 영양 공급원이기 때문에, 유아용 조제식은 유아의 음식에서 특별한 역할을 하며, 유아에게는 모유수유가 여전히 최상의 영양공급책이지만 유아용 조제식은 아기가 생존만 하게 하는 것이 아니라 성장하도록 하는데도 충분한 차선책이다.
유제품은 유류로부터 유래된 생성물이다. 유류 유사물 또는 비-유제품은 유류 이외의 공급원, 예를 들어 앞서 논의한 두유에서 유래된다. 이러한 생성물로는 전유(全乳), 탈지유, 발효유 제품, 예컨대 요구르트 또는 산미유(酸味乳), 크림, 버터, 연유, 탈수유(dehydrated milk), 커피 화이트너, 커피 크리머, 아이스크림, 치즈 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 PUFA-함유 오일이 포함될 수 있는 추가의 식품으로는, 예를 들어 츄잉검, 제과류 및 프로스팅류(frostings), 젤라틴류 및 푸딩류, 경질 및 연질의 캔디, 잼 및 젤리, 과립화된 백설탕, 당 대용물, 달콤한 소스, 토핑류 및 시럽류, 및 건조 배합된 분말 혼합물 등이 있다.
건강 식품 및 의약품에 사용하기 위한 PUFA -함유 오일
건강 식품은 건강상의 이익을 부여하는 임의의 식품이며, 기능성 식품, 의료용 식품, 의료용 영양제, 유아용 조제식 및 식이 보조제 등이 있다. 추가로, 본 발명의 식물/종자 오일, 변경된 종자 및 미생물 오일은 표준 제약 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 오일은 상기 언급한 임의의 식품에 쉽게 혼입되어 예를 들어 기능적 또는 의료용 식품을 생성할 수 있다. PUFA를 포함하는 보다 농축된 제제로는 인간 또는 인간 이외의 동물에서 식이 보조제로 사용될 수 있는 캡슐, 분말, 정제, 소프트겔, 겔캡, 액상 농축물 및 에멀젼 등이 있다.
동물 사료에 사용하기 위한 PUFA -함유 오일
본원에서, 동물 사료는 일반적으로 인간 이외의 동물을 위한 사료로 사용되거나 그러한 사료에 혼합하기 위한 생성물로 정의된다. 본 발명의 식물/종자 오일, 변경된 종자 및 미생물 오일은 다양한 동물 사료 중의 성분으로서 사용될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 오일은 애완동물 사료, 반추 동물 및 가금류 사료, 및 수산양식 사료 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 제품에 사용될 수 있다고 예측된다. 애완동물 사료는 애완동물 (예컨대, 개, 고양이, 새, 파충류, 설치류)에게 공급되도록 의도된 제품이고, 이러한 제품으로는 상기한 시리얼 및 건강 식품 뿐만이 아니라 육류 및 육류 부산물, 콩 단백질 생성물, 목초 및 건초 제품 (예컨대, 자주개자리, 큰조아재비, 귀리 또는 브롬 그래스, 야채) 등이 있다. 반추 동물 및 가금류 사료는 예를 들어 칠면조, 닭, 소 및 돼지에게 공급되도록 의도된 제품이다. 상기한 애완동물 사료와 마찬가지로, 이들 제품은 앞서 언급한 시리얼 및 건강 식품, 콩 단백질 생성물, 육류 및 육류 부산물, 및 목초 및 건초 제품을 포함할 수 있다. 수산양식 사료 (또는 "양식사료")는 담수 또는 해수 중에서 수상 유기체, 동물 및/또는 식물을 증식, 배양 또는 사육하는 양식에 사용되는 제품이다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명되는데, 달리 언급하지 않는 한은 여기서의 부 및 백분율(％)은 중량부 및 중량％이고, 온도는 섭씨 온도이다. 이들 실시예가 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내는 것이긴 하지만 이는 오직 예시하는 것에 불과하다는 점을 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적 특성을 본 발명의 사상과 범위에서 벗어나지 않고 파악할 수 있을 것이고, 본 발명에 각종 변화와 변형을 가하여 여러 용도 및 조건에 적합하게 할 수 있다. 따라서, 본원에 나타내고 기재한 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변형은 전술한 기재로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형 역시 청구의 범위에 포함되는 것으로 한다.
일반적인 방법
실시예에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 공지되어 있으며 하기 문헌에 기재되어 있다:
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미생물 배양물의 유지 및 성장에 적합한 재료 및 방법은 당업계에 공지되어 있다. 하기하는 실시예에서 이용하기에 적합한 기술은 문헌 [Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, Eds), American Society for Microbiology: Washington, D.C. (1994)] 또는 [Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2nd ed., Sinauer Associates: Sunderland, MA (1989)]에 기재된 내용 등에서 찾을 수 있다. 달리 명시하지 않는 한은, 미생물 세포의 성장 및 유지에 이용되는 모든 시약, 제한 효소 및 재료는 알드리치 케미칼스(Aldrich Chemicals) (미국 위스콘신주 밀워키 소재), 디프코 래보러토리즈 (미국 미시건주 디트로이트 소재), 깁코/BRL (미국 메릴랜드주 가이터스버그 소재) 또는 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Company) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재)에서 구하였다. 전형적으로, 이. 콜라이(E. coli) 균주는 루리아 베르타니(Luria Bertani) (LB) 플레이트에서 37℃하에 성장시켰다.
일반적인 분자 클로닝은 표준 방법 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 따라 수 행하였다. 벡터와 삽입물-특이적 프라이머의 조합물을 이용하여, 염료 종결자 기술 (미국 특허 제5,366,860호, 유럽 제272,007호)로 ABI 자동화 서열분석기에서 DNA 서열을 생성시켰다. 서열 교정(editing)은 시켄처(Sequencher) (미국 미시건주 앤 아버 소재의 진 코즈 코포레이션(Gene Codes Corporation)에서 수행하였다. 모든 서열은 양 방향으로 2배 이상의 적용 범위를 나타낸다. 유전자 서열의 비교는 디엔에이스타 소프트웨어 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 디엔에이스타, 인크.)를 사용하여 달성하였다.
사용된 약어의 의미는 하기와 같다: "sec"는 초(들)을 의미하고, "min"은 분(들)을 의미하고, "h"는 시간(들)을 의미하고, "d"는 일(들)을 의미하며, "㎕"는 마이크로리터(들)을 의미하고, "mL"는 밀리리터(들)을 의미하고, "L"는 리터(들)을 의미하고, "μM"은 마이크로몰 농도를 의미하며, "mM"은 밀리몰 농도를 의미하고, "M"은 몰 농도를 의미하며, "mmol"은 밀리몰(들)을 의미하고, "㎛ole"은 마이크로몰(들)을 의미하고, "g"은 그램(들)을 의미하고, "㎍"은 마이크로그램(들)을 의미하고, "ng"은 나노그램(들)을 의미하고, "U"는 유닛(들)을 의미하며, "bp"는 염기 쌍(들)을 의미하고, "kB"는 킬로염기(들)를 의미한다.
야로위아 리폴리티카의 형질전환 및 배양
ATCC 관리 번호 #20362, #76982 및 #90812의 야로위아 리폴리티카 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 메릴랜드주 록크빌 소재)으로부터 구입하였다. 야로위아 리폴리티카 균주를 전형적으로 28℃하에 YPD 한천 (1％ 효모 추출물, 2％ 박토펩톤, 2％ 글루코스, 2％ 한천)에서 성장시켰다.
달리 언급되지 않는다면, 야로위아 리폴리티카의 형질전환은 문헌 [Chen, D. C. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 48(2):232-235 (1997)]의 방법에 따라 수행하였다. 간략하게 설명하면, 야로위아를 YPD 플레이트에 스트리킹(streaking)하고 30℃에서 대략 18시간 동안 성장시켰다. 여러번의 많은 백금이량(loopful)의 세포를 플레이트에서 긁어내어 50％ PEG (평균 MW 3350) 2.25 mL, 2 M 아세트산리튬 (pH 6.0) 0.125 mL, 2 M DTT 0.125 mL, 및 전단 연어 정자 DNA 50 ㎍을 함유하는 형질전환 완충제 1 mL 중에 재현탁하였다. 이어서, 선형화된 플라스미드 DNA 대략 500 ng을 재현탁된 세포 100 ㎕ 중에서 인큐베이션하고, 39℃에서 1시간 동안 15분 간격으로 볼텍스 혼합하며 유지시켰다. 세포를 선별 배지 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2일 내지 3일 동안 유지시켰다.
형질전환체를 선별하기 위해, 일반적으로 최소 배지 ("MM")를 사용하였고, MM의 조성은 다음과 같았다: 황산암모늄 또는 아미노산을 함유하지 않는 0.17％ 효모 질소 기재 (미국 미시건주 디트로이트 소재의 디프코 래보러토리즈), 2％ 글루코스, 0.1％ 프롤린 (pH 6.1). 우라실 보충물을 적절히 가하여 최종 농도가 0.01％가 되도록 하였다 (이로써, 20 g/L 한천으로 제조된 "MMU" 선별 배지 생성).
별법으로, 형질전환체를 황산암모늄 또는 아미노산을 함유하지 않는 0.17％ 효모 질소 기재 (미국 미시건주 디트로이트 소재의 디프코 래보러토리즈), 2％ 글루코스, 0.1％ 프롤린, 75 mg/L 우라실, 75 mg/L 유리딘, 900 mg/L FOA (미국 캘리포니아 오렌지 소재의 지모 리써치 코포레이션(Zymo Research Corp.)) 및 20 g/L 한천을 포함하는 5-플루오로오로트산 ("FOA", 또한 5-플루오로우라실-6-카르복실산 일수화물) 선별 배지에서 선별하였다.
야로위아 리폴리티카의 지방산 분석
지방산 분석을 위해, 세포를 원심분리로 수집하고 지질을 문헌 [Bligh, E. G. ＆ Dyer, W. J. (Can. J. Biochem. Physiol., 37:911-917 (1959)]에 기재된 바와 같이 추출하였다. 상기 지질 추출물을 나트륨 메톡시드로 에스테르교환반응시켜서 지방산 메틸 에스테르를 제조하고 [Roughan, G., and Nishida I., Arch Biochem Biophys., 276(1):38-46 (1990)], 이후에는 30 m×0.25 mm (i.d.) HP-INNOWAX (휴렛-팩커드(Hewlett-Packard)) 컬럼이 장착된 휴렛-팩커드 6890 GC를 이용하여 분석하였다. 오븐 온도는 1분 당 3.5℃의 속도로 170℃ (25분 동안 유지)에서 185℃로 상승시켰다.
직접적인 염기 에스테르교환반응을 위해, 야로위아 배양물 (3 mL)을 수확하여 증류수 중에서 1회 세척하였고, 스피드-백(Speed-Vac)에서 진공하에 5분 내지 10분 동안 건조시켰다. 나트륨 메톡시드 (1％, 100 ㎕)를 샘플에 가한 후에 샘플을 볼텍싱시키고 20분 동안 요동시켰다. 1 M NaCl 3 방울과 헥산 400 ㎕를 가한 후에 샘플을 볼텍싱 및 회전시켰다. 상부 층을 들어내고, 상기 언급된 바와 같이 GC로 분석하였다.
실시예 1: 유글레나 그라실리스 성장 조건, 지질 프로파일 및 mRNA 단리
본 실시예는 유글레나 그라실리스의 성장, 배양물의 지질 분석 및 mRNA 단리에 관하여 기재한다.
성장 및 지질 분석
유글레나 그라실리스를 미시간 주립대학교 (미국 미시건주 이스트 랜싱 소재)의 리차드 트리에머(Richard Triemer) 박사 실험실에서 얻었다. 활력적으로 성장하고 있는 배양물 10 mL로부터의 분취액 1 mL를 500 mL 유리병 중의 유글레나 그라실리스 (Eg) 배지 250 mL에 옮겼다. Eg 배지는 물 970 mL 중에 아세트산나트륨 1 g, 소 추출물 (카탈로그 번호: U126-01, 미국 미시건주 디트로이트 소재의 디프코 래버러토리즈) 1 g, 박토(Bacto)® 트립톤 (카탈로그 번호: 0123-17-3, 디프코 래버러토리즈) 2 g 및 박토® 효모 추출물 (카탈로그 번호: 0127-17-9, 디프코 래버러토리즈) 2 g을 배합하여 제조하였다. 필터 멸균 후에, 토양수 상등액 (카탈로그 번호: 15-3790, 미국 노쓰 캐롤라이나주 벌링톤 소재의 캐롤라이나 바이올로지컬 서플라이 컴파니(Carolina Biological Supply Company)) 30 mL를 무균 첨가하여 최종 Eg 배지를 제조하였다. 유글레나 그라실리스 배양물을 23℃에서 교반 없이 2주 동안 광 주기 16시간, 암 주기 8시간으로 성장시켰다.
2주 후에, 배양물 10 mL을 지질 분석을 위해 들어내고, 1,800×g에서 5분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 물로 1회 세척하고, 재-원심분리하였다. 생성된 펠렛을 5분 동안 진공하에 건조시키고, 트리메틸술포늄 히드록시드 (TMSH) 100 ㎕ 중에 재현탁하여 실온에서 15분 동안 진탕시키며 인큐베이션하였다. 이후, 헥산 0.5 mL를 첨가하고, 바이알을 실온에서 15분 동안 진탕시키며 인큐베이션하였다. 지방산 메틸 에스테르 (헥산층으로부터 5 ㎕ 주입됨)를 분리하고, 오메가왁스(Omegawax) 320 융합 실리카 모세관 컬럼 (카탈로그 번호: 24152, 수펠코 인크.(Supelco Inc.))가 장착된 휴렛-팩커드 6890 기체 크로마토그래피로 정량하였다. 오븐 온도는, 220℃에서 2.7분 동안 유지하고, 20℃/분으로 240℃까지 증가시켰다가 추가의 2.3분 동안 유지하도록 프로그래밍하였다. 운반 기체를 왓트만(Whatman) 수소 발생기로 제공하였다. 체류 시간을 시판되는 표준의 메틸 에스테르 (카탈로그 번호: U-99-A, 누-체크 프렙, 인크.(Nu-Chek Prep, Inc.))와 비교하고, 생성된 크로마토그램을 도 3에 나타냈다.
유글레나 그라실리스로부터의 mRNA 제조
나머지 2주 동안의 배양물 (240 mL)을 1,800×g에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화하고, 물로 1회 세척하고, 재-원심분리하였다. RNA STAT-60™ 시약 (미국 텍사스주 프랜즈우드 소재의 델-테스트, 인크.(TEL-TEST, Inc.))을 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 (물 0.5 mL에 RNA를 용해하고, 시약 5 mL를 사용) 사용하여, 상기 생성된 펠렛으로부터 전체 RNA를 추출하였다. 이러한 방법으로, 전체 RNA (2 mg/mL) 1 mg을 펠렛으로부터 수득하였다. mRNA 정제 키트 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences))를 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 사용하여 전체 RNA 1 mg으로부터 mRNA를 단리하였다. 이런 방식으로, mRNA 85 ㎍을 수득하였다.
실시예 2: 유글레나 그라실리스 cDNA 합성, 라이브러리 구축 및 서열분석
클론마이너(Cloneminer)™ cDNA 라이브러리 구축 키트 (카탈로그 번호: 18249-029, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation))를 제조업체가 제공한 프로토콜 (버전 B, 25-0608)에 따라 사용하여 cDNA 라이브러리를 생성하였다. 비-방사성표지 방법을 이용하여, 바이오틴(Biotin)-attB2-올리고(dT) 프라이머를 사용하여 mRNA 3.2 ㎍ (실시예 1)으로부터 cDNA를 합성하였다. 제1 가닥과 제2 가닥의 합성 후, attB1 어댑터(adapter)를 첨가하여 라이게이션시키고, cDNA를 컬럼 크로마토그래피로 크기별 분획화하였다. 분획 7 및 분획 8의 DNA (크기 범위는 약 800 bp 내지 1500 bp)를 농축시키고, pDONR™ 222로 재조합시켜서 이것으로 이. 콜라이 일렉트로맥스(Electromax)™ DH10B™ T1 파지-내성 세포 (인비트로젠 코포레이션)를 형질전환시켰다. 상기 유글레나 그라실리스 라이브러리를 "eeg1c"라고 명명하였다.
서열분석을 위해, 384웰 동결 배지 플레이트에서 성장/동결시킨 보관된 글리세롤 배양물로부터 클론을 우선 회수하고, LB + 75 ㎍/mL 카나마이신을 함유하는 384웰 미량역가 플레이트 (복제 플레이트)에서 멸균 384 핀(pin) 복제기 (미국 매사추세츠주 보스톤 소재의 제네틱스(Genetix))로 복제하였다. 이어서, 템플리피(Templiphi) DNA 서열분석 주형 증폭 키트 방법 (아머샴 바이오사이언시스)을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 플라스미드를 단리하였다. 간략하게 설명하면, 상기 템플리피 방법은 박테리오파지 φ29 DNA 폴리머라제를 사용하여 등온 롤링 써클(rolling circle) 증폭 ([Dean et al., Genome Res., 11:1095-1099 (2001)], [Nelson et al., Biotechniques, 32:S44-S47 (2002])으로 고리형 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA를 증폭시킨다. 20시간 동안 37℃에서 성장시킨 후에, 복제 플레이트로부터의 세포를 희석 완충제 5 ㎕에 가하고 95℃에서 3분 동안 변성시켜서 세포를 부분적으로 용해시키고 변성된 주형을 유리시킨다. 이어서, 템플리피 사전혼합물 (5 ㎕)을 각 샘플에 가하고, 이로써 생성된 반응 혼합물을 30℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다가 65℃에서 10분 동안 인큐베이션하여, φ29 DNA 폴리머라제 활성을 불활성화시켰다. 증폭된 샘플을 증류수에 1:3으로 희석시킨 후에 피코그린(PicoGreen)® dsDNA 정량화 시약 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))을 이용한 DNA 정량화를 실시하였다.
이어서, 증폭된 생성물을 95℃에서 10분 동안 변성시키고, M13F 범용 프라이머 (서열 18), 및 ABI BigDye 버전 3.1 프리즘 시퀀싱 키트(Prism Sequencing Kit)를 이용하여 384웰 플레이트에서 말단-서열분석을 실시하였다. 서열분석 반응을 위해서, 주형 100 ng 내지 200 ng 및 6.4 pmol의 프라이머를 사용하였고, 하기하는 반응 조건을 25회 반복하였다: 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 및 60℃에서 4분. 에탄올-기재의 세정 후에, 주기 서열분석 반응 생성물을 용해시켜 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) ABI 3730×l 자동화 서열분석기에서 검출하였다.
실시예 3: 유글레나 그라실리스 cDNA 라이브러리 eeg1c 으로부터, Δ9 일롱가제 효소 상동체의 동정
장쇄 다중불포화 지방산 신장 효소 상동체 (즉, LC-PUFA ELO 상동체 또는 Δ9 일롱가제)를 코딩하는 cDNA 클론은, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, [Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993)]) "nr" 데이타베이스 (모든 비-중복성 진뱅크 CDS 번역부, 3차원 구조 브룩하벤 프로테인 데이타 뱅크(Brookhaven Protein Data Bank), 최신 주요 SWISS-PROT 단백질 서열 데이타베이 스, EMBL 및 DDBJ 데이타베이스로부터 유래된 서열을 포함함)에 함유된 서열과의 유사성에 대하여 BLAST 검색을 수행하여 동정하였다. 실시예 2에서 수득한 cDNA 서열을 미국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)가 제공하는 BLASTN 알고리즘을 사용하여 "nr" 데이타베이스 내에 함유된 공개적으로 입수가능한 모든 DNA 서열과의 유사성에 대하여 분석하였다. DNA 서열을 모든 리딩 프레임에서 번역시켰고, NCBI가 제공하는 BLASTX 알고리즘 [Gish and States, Nat. Genet., 3:266-272 (1993)]을 사용하여 "nr" 데이타베이스 내에 함유된 공개적으로 입수가능한 모든 단백질 서열과의 유사성에 대하여 비교하였다. 편의상, 검색한 데이타베이스 내에 함유된 서열에 대한 cDNA 서열의 매치가 단지 우연히 관찰되는 P-값 (확률)을 BLAST로 계산하여 본원에서는 "pLog" 값으로 보고하였고, 이것은 보고된 P-값의 음의 로그값을 나타낸다. 따라서, pLog 값이 높을 수록, cDNA 서열 및 BLAST "hit"가 상동성 단백질을 나타낼 가능성은 높아진다.
클론 eeg1c.pk001.n5.f의 뉴클레오티드 서열을 이용한 BLASTX 검색은 cDNA에 의해 코딩되는 단백질과 IgD9e (즉, 본원에서 서열 8로 기재한 이소크리시스 갈바나의 장쇄 PUFA 신장 효소. NCBI 관리 번호: AAL37626 (GI 17226123), 유전자좌 AAL37626, CDS AF390174. [Qi et al., FEBS Lett. 510(3):159-165 (2002)])와의 유사성을 밝혀냈다. 클론 eeg1c.pk001.n5.f cDNA 삽입물 일부의 서열을 서열 10 (cDNA 삽입물의 5' 말단)에 나타내었다.
상기한 바와 같이 하여 eeg1c.pk001.n5.1 cDNA 삽입물의 3' 말단에서 추가의 서열을 수득하였지만, 여기서는 폴리(A) 테일(tail)-프라이밍된 WobbleT 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 간략하게 설명하면, WobbleT 프라이머는 21-mer 폴리(T)A, 폴리(T)C, 및 폴리(T)G의 등몰 혼합물로서, cDNA 클론의 3' 말단을 서열분석하는데 사용된다. 3' 말단 서열을 서열 11에 나타내었다.
시켄처™ (버전 4.2, 미국 미시건주 앤 아버 소재의 진 코즈 코포레이션)을 사용하여 5' 서열과 3' 서열 둘다를 정렬하고, 이로써 생성된 cDNA 서열을 서열 12에 나타내었다. eeg1c.pk001.n5.f cDNA 코딩 서열의 서열 및 상응하는 추정 아미노산 서열은 서열 1 및 서열 2에 각각 나타내었다. 상기 보고한 상동체를 기초로, eeg1c.pk001.n5.1 cDNA 삽입물의 유글레나 그라실리스 유전자 생성물이 Δ9 일롱가제를 코딩할 것이라고 가정하였고, 이에 따라 "EgD9e"로 지칭하였다.
서열 2에 기재한 아미노산 서열 (즉, EgD9e)을 BLASTP로 평가하여 IgD9e (서열 8)에 대한 pLog 값이 38.70 (E 값 2e-39)으로 산출되었다. 조툰 하인(Jotun Hein) 방법을 이용할 때, EgD9e는 IgD9e와 39.4％ 동일하다. 조툰 하인 방법 [Hein, J. J., Meth. Enz., 183:626-645 (1990)]으로 수행한 서열 동일성(％) 계산은 LASERGENE 바이오인포매틱스 컴퓨팅 수트 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 디엔에이스타, 인크.)의 메그얼라인™ v6.1 프로그램으로 수행하였고, 쌍별 정렬을 위한 디폴트 파라미터 (KTUPLE = 2)를 사용하였다. 클러스탈 브이 방법을 이용할 때, EgD9e (서열 2)는 IgD9e (서열 8)와 31.8％ 동일하였다 (도 4). 클러스탈 브이 방법 ([Higgins, D.G. and Sharp, P.M., Comput. Appl. Biosci., 5:151-153 (1989)], [Higgins et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)])으로 수행 한 서열 동일성(％) 계산은 LASERGENE 바이오인포매틱스 컴퓨팅 수트의 메그얼라인™ v6.1 프로그램으로 수행하였고, 쌍별 정렬을 위한 디폴트 파라미터 (KTUPLE = 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5, DIAGONALS SAVED = 5 및 GAP LENGTH PENALTY = 10)를 사용하였다.
BLAST 스코어 및 확률은 본 발명의 핵산 단편 (서열 12)이 전체 유글레나 그라실리스 Δ9 일롱가제를 코딩함을 나타내었다.
실시예 4: 사카로마이세스 세레비지애 중 유글레나 그라실리스 Δ9 일롱가제 ( EgD9e )의 기능적 분석
본 실시예는 사카로마이세스 세레비지애 중 EgD9e의 기능적 분석을 기재한다. 이를 위해서는, (1) 효모 발현 벡터 pY-75로 EgD9e을 클로닝하여 pY119를 생성하고, (2) 기질 공급 후, pY-75 및 pY119를 포함하는 형질전환 유기체 내에서의 지질 프로파일을 비교하며, (3) 기질 공급 없이 pY-75 및 pY119를 포함하는 형질전환 유기체 내에서의 지질 프로파일을 비교하는 것이 필요하다.
플라스미드 pY -75 (대조군), 및 EgD9e 를 포함하는 플라스미드 pY119 의 구축
효모 에피솜 플라스미드 (YEp)-형 벡터 pRS425 [Christianson et al., Gene, 110:119-122 (1992)]는 사카로마이세스 세레비지애 2μ 내인성 플라스미드로부터의 서열, LEU2 선별가능한 마커 및 다기능적 파지미드 pBluescript II SK(+)의 주쇄에 기초한 서열을 함유한다. 사카로마이세스 세레비지애의 강력한 구성적 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GPD) 프로모터를 pRS425의 SacII와 SpeI 부위 사이에 문헌 [Jia et al., Physiol. Genomics, 3:83-92 (2000)]에 기재된 것과 동일한 방식으로 클로닝하여 pGPD-425를 생산하였다. NotI 부위를 pGPD-425의 BamHI 부위 내에 도입하여 BamHI 부위에 의해 플랭킹(flanking)된 NotI 부위가 생성되었고, 이 플라스미드를 pY-75라고 칭하였다.
VentR® DNA 폴리머라제 (카탈로그 번호: M0254S, 미국 매사추세츠주 베벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인크.(New England Biolabs Inc.))를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여, EgD9e를 올리고뉴클레오티드 프라이머 oEugEL1-1 (서열 19) 및 oEugEL1-2 (서열 20)을 사용하여 eeg1c.pk001.n5.f로부터 증폭시켰다. 이로써 생성된 DNA 단편을 제로 블런트(Zero Blunt)® PCR 클로닝 키트 (인비트로젠 코포레이션)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 pCR-블런트(Blunt)® 클로닝 벡터에 클로닝하여 pKR906을 생성하였다. NotI 소화로 pKR906으로부터 EgD9e를 유리시키고, pY-75의 NotI 부위로 클로닝하여 pY119 (서열 21, 도 5)를 생성하였다. EgD9e는 도 5에서 "eug el1"로 표시하였다.
기질 공급에 의한, EgD9e 일롱가제 활성의 기능적 분석
표준 아세트산리튬 형질전환 절차에 따라 플라스미드 pY119 및 pY-75로 카로마이세스 세레비지애 INVSC1 (인비트로젠 코포레이션)을 형질전환시켰다. 형질전환체는 CSM-leu (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 큐바이오젠(Qbiogene))를 보충한 DOBA 배지 상에서 선별하였다. 각 플레이트로부터의 형질전환체를 CSM-leu (큐바이오젠) 및 0.2％ 테르지톨로 보충한 DOB 배지 2 mL에 접종하였다. 세포를 1일 동안 30℃에서 성장시킨 후에, 0.1 mL를 LA [18:2(9,12)], ALA [18:3(9,12,15)], GLA [18:3(6,9,12)], STA [18:4(6,9,12,15)], ARA [20:4(5,8,11,14)] 또는 EPA [20:5(5,8,11,14,17)]를 0.175 mM로 보충한 동일한 배지 3 mL로 옮겼다. 이들을 16시간 동안 30℃에서 250 rpm으로 인큐베이션한 후에 원심분리로 펠렛을 수득하였다. 세포를 물로 1회 세척하고 원심분리로 펠렛화하여 공기 건조시켰다. 펠렛을 1％ 나트륨 메톡시드 500 ㎕로 30분 동안 50℃에서 에스테르교환반응 [Roughan, G., and Nishida I., Arch Biochem Biophys., 276(1):38-46 (1990)]을 실시하고, 이후에는 1 M 염화나트륨 500 ㎕ 및 헵탄 100 ㎕를 첨가하였다. 철저한 혼합 및 원심분리 후에, 실시예 1에 기재한 바와 같이 GC로 지방산 메틸 에스테르 (FAME)를 분석하였다.
pY75 (벡터 대조군) 또는 pY119 (3개의 독립적 형질전환체. pY119-5, pY119-6 및 pY119-8이라 지칭됨)를 함유하는 영양공급 세포에 대한 결과를 도 6에 나타내었다. 지방산은 16:0 (팔미테이트), 16:1(9) (팔미톨레산), 18:0, 18:1(9) (올레산), LA, GLA, ALA, STA, EDA, DGLA, ARA, ETrA, ETA, EPA, 22:2(13,16) (도코사디엔산), 22:4(7,10,13,16) (아드렌산), DPA 및 24:1 (네르본산)으로 표시하였다. 공급된 각 지방산 ("FA")에 대하여 신장 효율 ("％ Elo")을 계산하였다: [％ FA생성물/(％ FA생성물 + ％ FA기질)×100].
도 6의 데이타는 클로닝된 EgD9e가 LA 및 ALA를 각각 EDA 및 ETrA로 효율적으로 신장된시켰음을 입증하였다.
기질 공급이 없는 상태에서, EgD9e 일롱가제 활성의 기능적 분석
추가로, 지방산이 공급되지 않은 세포의 FAME를 약간 상이한 온도 프로파일을 사용하여 GC 분석하여, 팔미톨레산 [PA-16:1(9)]의 신장 생성물인 올레산 [OA-18:1(9)] 및 박센산 [VA-18:1(11)]을 분리하였다. 지방산 메틸 에스테르 (헥산층으로부터 3 ㎕ 주입됨)를 분리하고, 오메가왁스 320 융합 실리카 모세관 컬럼 (수펠코 인크., 카탈로그 번호: 24152)가 장착된 휴렛-팩커드 6890 기체 크로마토그래피로 정량하였다. 오븐 온도는, 220℃에서 2.7분 동안 유지하고, 20℃/분으로 240℃까지 증가시켰다가 추가의 2.3분 동안 유지하도록 프로그래밍하였다. 결과는 하기 표 6에 나타냈다:
Figure 112008044342784-PCT00008
상기 나타낸 결과를 기초로 할 때, EgD9e는 LA 및 ALA를 각각 EDA 및 ETrA로 신장시킬 수 있는 Δ9 일롱가제로서의 주요 역할 이외에도 C16 /18 일롱가제 및 C18 /20 일롱가제 둘다로서도 작용할 수 있다.
실시예 5: 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 Δ9 일롱가제 유전자 ( IgD9eS , 이소크리시스 갈바나에서 유래됨 )를 포함하는 야로위아 리 폴리티카 발현 벡터 pY115 의 구축
본 실시예는 키메라 FBAINm::IgD9eS::Pex20 유전자를 포함하는 야로위아 리폴리티카 발현 벡터 pY115의 구축에 대하여 기재하며, 여기서의 IgD9eS는 이소크리시스 갈바나에서 유래되고 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 Δ9 일롱가제이다. 하기하는 실시예 6 및 실시예 7에 기재한 바와 같이, 플라스미드 pY115는 IgD9eS의 Δ9 일롱가제 활성이 EgD9e의 Δ9 일롱가제 활성과 간접적으로 비교될 수 있게 하였다.
플라스미드 pY115 (서열 45, 도 8)의 구축에는 (1) pDMW263의 구축, (2) IgD9eS의 합성 및 플라스미드 pDMW237의 생성, 및 (3) 플라스미드 pDMW263 및 pDMW237로부터의 단편의 라이게이션이 필요하다.
pDMW263 의 구축
플라스미드 pY5-30 (도 7A. 이전에는 PCT 공개 제WO 05/003310호에 기재되었음 [상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨])은 이. 콜라이 및 야로위아 리폴리티카 둘다에서 복제될 수 있는 셔틀 플라스미드이다. 플라스미드 pY5-30은 야로위아 자율 복제 서열 (ARS18), ColE1 플라스미드 복제 기점, 이. 콜라이에서의 선별을 위한 암피실린-내성 유전자 (AmpR), 야로위아에서의 선별을 위한 야로위아 LEU2 유전자, 및 키메라 TEF::GUS::XPR 유전자를 함유한다.
플라스미드 pDMW263 (서열 22, 도 7B)은 당업자에게 널리 공지된 기술로 pY5-30에서 TEF 프로모터를 야로위아 리폴리티카 FBAINm 프로모터 (PCT 공개 제WO 05/049805호)로 대체하여 생성하였다. 간략하게 설명하면, 상기 프로모터는 fba1 유전자에 의해 코딩되는 프럭토스-비스포스페이트 알돌라제 효소 (E.C. 4.1.2.13)의 'ATG' 번역 개시 코돈 앞쪽에 위치하고 발현에 필요한 5' 상류 비-번역 영역 및 인트론을 갖는 5' 코딩 영역의 일부에 위치한 변형된 프로모터를 지칭하고, FBAINm은 ATG 번역 개시 코돈과 FBAIN 프로모터의 인트론 사이에 52 bp 결실부를 가지며 (이로써, N-말단의 22개 아미노산만을 포함함) 인트론 뒤에 새로운 번역 컨센서스 모티프를 갖는다. 하기 표 7은 pDMW263의 성분을 요약한다:
플라스미드 pDMW263 (서열 22)의 성분
서열 22 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
4992-4296 ARS18 서열 (진뱅크 관리 번호: A17608)
SalI/SacII (8505-2014) ·FBAINm: FBAINm 프로모터 (PCT 공개 제WO 2005/049805호. 도 7B에서 "Fba1+인트론"으로 표시됨) ·GUS: β-글루쿠로니다제를 코딩하는 이. 콜라이 유전자 [Jefferson, R.A. Nature. 14:342:837-838 (1989)] ·XPR: 야로위아 Xpr 유전자 (진뱅크 관리 번호: M17741) 3' 영역의 약 100 bp 을 포함하는 FBAINm::GUS::XPR
6303-8505 야로위아 Leu2 유전자 (진뱅크 관리 번호: AF260230)
IgD9eS 의 시험관내 합성
PCT 공개 제WO 2004/101753호 (US-2004-0253621-A1) 및 PCT 공개 제WO 2006/052870호 (US-2006-0115881-A1) (이들 문헌 각각은 본원에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 것과 유사한 방식으로, 이소크리시스 갈바나 Δ9 일롱가제 유전자 (IgD9e. 서열 7 및 서열 8)의 코돈 사용을 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 최적화시켰다. 구체적으로, IgD9e (서열 7)의 코딩 서열을 기초로 하여 야로위아 코돈 사용 패턴, ATG 번역 개시 코돈 주위의 컨센서스 서열, 및 RNA 안정성에 관한 일반적 규칙 [Guhaniyogi, G. and J. Brewer, Gene, 265(1-2):11-23 (2001)]에 따라 코돈-최적화 Δ9 일롱가제 유전자 ("IgD9eS"이라 지칭함. 서열 9)를 디자인하였다. 번역 개시 부위의 변형에 추가하여, 792 bp 코딩 영역 중 127 bp (16.0％)를 변형시켰고, 122개 코돈을 최적화하였다. 코돈-최적화 유전자에서의 변형 중 그 어느 것도 코딩되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않았다 (서열 8).
더욱 구체적으로, 8쌍의 올리고뉴클레오티드를 디자인하여 IgD9eS의 전체 길이를 신장시켰다 (예컨대, 서열 23 내지 서열 38에 상응하는 IL3-1A, IL3-1B, IL3-2A, IL3-2B, IL3-3A, IL3-3B, IL3-4A, IL3-4B, IL3-5A, IL3-5B, IL3-6A, IL3-6B, IL3-7A, IL3-7B, IL3-8A 및 IL3-8B). 센스 (A) 및 안티센스 (B) 올리고뉴클레오티드의 각 쌍은 각 5'-말단에서의 4 bp 오버행(overhang) 이외에는 상보적이었다. 추가로, 이후의 서브클로닝을 위해서 프라이머 IL3-1F, IL3-4R, IL3-5F 및 IL3-8R (서열 39 내지 서열 42)에는 또한 NcoI, PstI, PstI 및 NotI 제한 부위를 각각 도입하였다.
각각의 올리고뉴클레오티드 (100 ng)는 37℃에서 1시간 동안 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.5 mM 스페르미딘, 0.5 mM ATP 및 10 U의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 함유하는 부피 20 ㎕에서 인산화하였다. 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각 쌍을 혼합하고, 하기 파라미터를 이용하는 열주기장치(thermocycler)에서 어닐링시켰다: 95℃ (2분), 85℃ (2분), 65℃ (15분), 37℃ (15분), 24℃ (15분) 및 4℃ (15분). 따라서, IL3-1A (서열 23)를 IL3-1B (서열 24)에 어닐링시켜 이중-가닥 생성물 "IL3-1AB"를 생산하였다. 유사하게, IL3-2A (서열 25)를 IL3-2B (서열 26)에 어닐링시켜 이중-가닥 생성물 "IL3-2AB" 등을 생산하였다.
이어서, 어닐링된 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 2개의 개별적 풀(pool)을 하기에 나타내는 바와 같이 함께 라이게이션하였다: 풀 1 (IL3-1AB, IL3-2AB, IL3-3AB 및 IL3-4AB 포함) 및 풀 2 (IL3-5AB, IL3-6AB, IL3-7AB 및 IL3-8AB 포함). 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 각 풀을 10 U의 T4 DNA 리가제를 함유하는 부피 20 ㎕에서 혼합하고, 라이게이션 반응물을 16℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
이어서, 각 라이게이션 반응의 생성물을 주형으로서 사용하여 디자인된 DNA 단편을 PCR로 증폭시켰다. 구체적으로, 라이게이션된 "풀 1" 혼합물 (예컨대, IL3-1AB, IL3-2AB, IL3-3AB 및 IL3-4AB)을 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 IL3-1F 및 IL3-4R (서열 39 및 서열 40)을 프라이머로 사용하여, IgD9eS의 제1 부분을 PCR로 증폭시켰다. 417 bp PCR 단편을 pGEM-T 이지(easy) 벡터 (프로메가(Promega)) 내로 서브클로닝하여 pT9(1-4) (서열 43)을 생성시켰다.
라이게이션된 "풀 2" 혼합물 (예컨대, IL3-5AB, IL3-6AB, IL3-7AB 및 IL3-8AB)을 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 IL3-5F 및 IL3-8R (서열 41 및 서열 42)을 프라이머로서 사용하여, IgD9eS의 제2 부분을 PCR로 유사하게 증폭시키고, pGEM-T-이지(Easy) 벡터 내로 클로닝시켜 pT9(5-8) (서열 44)을 생성시켰다.
이. 콜라이를 pT9(1-4) (서열 43) 및 pT9(5-8) (서열 44)로 따로 형질전환시키고, 암피실린-내성 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 단리하였다. 플라스미드 DNA를 정제하고, 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 pT9(1-4)의 417 bp NcoI/PstI 단편 및 pT9(5-8)의 377 bp PstI/NotI 단편을 유리시켰다. 이어서, 이들 2개의 단편을 합하고, NcoI/NotI 소화 pZUF17 (서열 121, 도 7C)와 함께 정해진 방향으로 라이게이션시켜 pDMW237 (서열 46)을 생성시켰다. 따라서, 합성 방식으로 생성된 IgD9eS 유전자는 발현 벡터 pDMW237 내에서 FBAIN 프로모터 및 야로위아 Pex20 종결자에 의해 플랭킹되었다.
야로위아 리폴리티카 발현 벡터 pY115 의 최종 구축
pDMW263의 NcoI/SalI DNA 단편 (야로위아 리폴리티카 FBAINm 프로모터를 함유함)을 pDMW237의 NcoI/SalI DNA 단편 (IgD9eS를 함유함)에 클로닝하여, 키메라 FBAINm::IgD9eS::Pex20 유전자를 포함하는 pY115 (서열 45, 도 8)를 생성하였다. 도 8에서, FBAINm은 "Fba1+인트론"으로 표시하고, IgD9eS는 "아이. 갈바나 synth D9 일롱가제"로 표시하였다.
실시예 6: 야로위아 리폴리티카 발현 벡터 pBY2 ( EgD9e 를 포함함) 및 pBY1 - FAE ( IgD9eS 를 포함함)의 구축
본 실시예는 야로위아 리폴리티카 발현 벡터 pBY2 (키메라 FBAINm::EgD9e::Pex20 유전자를 포함함) 및 pBY1-FAE (키메라 FBAINm::IgD9eS::Pex20 유전자를 포함함)의 합성을 기재한다. 실시예 7 (하기함)에 기재한 바와 같이 야로위아 리폴리티카에서 발현될 때의 IgD9eS의 델타-9 일롱가제 활성을 EgD9e의 경우와 비교하였다.
야로위아 리폴리티카 발현 벡터 pBY2 의 구축
플라스미드 pY115 (서열 45, 실시예 5)를 NcoI/NotI으로 소화시키고, 이로써 생성된 DNA 말단을 클레나우로 충전하였다. 충전시켜 평활(blunt) 말단을 형성한 후, 상기 DNA 단편을 송아지 장 알칼리성 포스파타제로 처리하고 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 분리하였다. 야로위아 리폴리티카 FBAINm 프로모터를 함유하는 6989 bp 단편을 아가로스 겔에서 잘라내어 QIAquick® 겔 추출 키트 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠 인크.(Qiagen Inc.))를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 정제하였다. 정제된 6989 bp 단편을 게이트웨이 벡터 컨버젼 시스템(Gateway Vector Conversion System) (카탈로그 번호: 11823-029, 인비트로젠 코포레이션)을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 카세트 rfA와 라이게이션시켜서, 야로위아 리폴리티카 게이트웨이® 데스티네이션 벡터 pBY1 (서열 47, 도 9A)을 형성하였다.
QIAprep® 스핀 미니프렙 키트(Spin Miniprep Kit) (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠 인크.)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여, 유글레나 그라실리스 클론 eeg1c.pk001.n5.f (실시예 2 및 실시예 3)로부터 플라스미드를 정제하였다. 게이트웨이® LR 클로나제(Clonase)™ II 효소 혼합물 (카탈로그 번호: 11791-020, 인비트로젠 코포레이션)을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여, eeg1c.pk001.n5.f로부터의 cDNA를 pBY1로 전달하여 pBY2 (서열 48, 도 9B)를 형성하였다. 서열분석이 WobbleT 프라이머를 사용하여 수행되었기 때문에, eeg1c.pk001.n5.f 3' 말단의 전장 서열 (즉, 폴리A 테일을 함유함)은 알려지지 않았다. 제한 소화 및 아가로스 겔 분석을 기초로 할 때, 폴리A 테일은 길이가 100 bp 미만이라고 여겨진다.
야로위아 리폴리티카 발현 벡터 pBY1 - FAE 의 구축
AccuPrime™ Taq 폴리머라제 하이 피델러티(High Fidelity) (카탈로그 번호: 12346-086, 인비트로젠 코포레이션)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머 ig-s (서열 49) 및 ig-as (서열 50)를 사용하여 IgD9eS를 pY115 (서열 45, 실시예 5)로부터 증폭시켰다. pENTR™ 다이렉셔날(Directional) TOPO® 클로닝 키트 (인비트로젠 코포레이션)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여, 상기 생성된 DNA 단편을 pENTR™/D-TOPO®로 클로닝하여 pENTR-FAE를 생성하였다. 상기한 바와 같이 QIAprep® 스핀 미니프렙 키트 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠 인크.)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여, 플라스미드 pENTR-FAE를 정제하였다. 게이트웨이® LR 클로나제™ II 효소 혼합물 (카탈로그 번호: 11791-020, 인비트로젠 코포레이션)을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여, IgD9eS에 대한 CDS를 pBY1로 전달하여 pBY1-FAE (서열 51, 도 9C)를 형성하였다.
에쉐리히아 콜라이( Escherichia coli )로의 벡터 형질전환
pBY2 및 pBY1-FAE의 생성 후에, 각 벡터로 이. 콜라이 DH10B™ (인비트로젠 코포레이션) 세포를 형질전환시켰다. 형질전환체 세포를 성장시키고, QIAprep® 스핀 미니프렙 키트 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠 인크.)를 사용하여 pBY2 및 pBY1-FAE를 단리하였다.
실시예 7: 야로위아 리폴리티카 균주 Y2224 중 EgD9e 의 기능적 분석
본 실시예는 야로위아 리폴리티카 균주 Y2224 중 EgD9e의 기능적 분석을 기재한다. 여기에는 (1) 균주 Y2224 (즉, 야생형 야로위아 균주 ATCC #20362의 Ura3 유전자 자율 돌연변이로부터의 FOA 내성 돌연변이체)의 구축, 및 (2) pBY2 (EgD9e를 발현함) 또는 pBY1-FAE (IgD9eS를 발현함)를 포함하는 야로위아 리폴리티카 균주 Y2224의 형질전환 유기체 내 지질 프로파일의 비교가 필요하다.
야로위아 리폴리티카 균주 Y2224 의 생성
균주 Y2224를 하기하는 방식으로 단리하였다: YPD 한천 플레이트로부터의 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362 세포를 250 mg/L 5-FOA (지모 리써치)를 함유하는 최소 배지 플레이트 (75 mg/L씩의 우라실 및 유리딘, 6.7 g/L YNB (아미노산은 없고 암모니아 술페이트는 함유함), 20 g/L 글루코스)에 스트리킹하였다. 플레이트를 28℃에서 인큐베이션하고, 이로써 생성된 콜로니 중 4개를 200 mg/mL 5-FOA를 함유하는 최소 배지 플레이트, 및 우라실 및 유리딘이 없는 최소 배지 플레이트로 따로 패치(patch)하여 우라실 Ura3 영양요구성을 확인하였다. 이후, 야로위아 리폴리티카 균주 Y2224를 28℃하에 YPD 한천에서 성장시켰다.
pBY1 - FAE 및 pBY2 를 포함하는 야로위아 리폴리티카 형질전환체의 기능적 분석
'일반적인 방법'에 기재한 바와 같이, pBY1-FAE (키메라 FBAINm::IgD9eS::Pex20 유전자를 포함함) 및 pBY2 (키메라 FBAINm::EgD9e::Pex20 유전자를 포함함)로 야로위아 리폴리티카 균주 Y2224를 형질전환시켰다. 상기 세포를 우라실이 없는 최소 배지 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2일 내지 3일 동안 유지시켰다.
이어서, 형질전환체의 단일 콜로니를 우라실이 없는 최소 배지 3 mL 중에서 30℃하에 OD600 약 1.0까지 성장시켰다. 대조군으로서, Y2224는 우라실이 보충된 최소 배지에서 유사한 방식으로 성장시켰다. 이어서, 세포를 물로 세척하여 원심분리로 수거하고, 지질을 상기한 바와 같이 에스테르교환반응시켰다. pBY1-FAE 또는 pBY2를 함유하거나 발현 벡터를 함유하지 않는 세포로부터의 FAME를 실시예 4에 기재한 방법 (즉, pY119를 함유하는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) 세포에 대하여 기재한 방법)을 이용하여 GC 분석하였다. 각각의 3개 복제물의 평균에 대한 결과를 하기 표 8에 나타내었다. 지방산은 16:0 (팔미테이트), 16:1(9) (팔미톨레산), 17:1(9), 18:0, 18:1(9) (올레산), LA 및 EDA로 표시하였다. 신장 효율 ("％ Elo LA")은 실시예 4에 기재한 바와 같이 하여 계산하였다.
Figure 112008044342784-PCT00009
표 8에 나타난 바와 같이, 상기 결과는 EgD9e가 LA를 EDA로 전환시키는데 있어서 IgD9eS보다 더 높은 기질 전환 효율로 기능한다는 것을 입증하였다.
실시예 8: 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 Δ9 일롱가제 유전자 ( EgD9eS , 유글레나 그라실리스에서 유래됨 )를 포함하는 야로위아 리 폴리티카 발현 벡터 pZuFmEgD9ES 의 구축 및 기능적 분석
본 실시예는 키메라 FBAINm::EgD9ES::Pex20 유전자를 포함하는 야로위아 리폴리티카 벡터 pZuFmEgD9ES의 발현을 기재하며, 여기서의 EgD9eS는 유글레나 그라실리스에서 유래되고 야로위아 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 Δ9 일롱가제이다. 따라서, 본 분석에는 (1) EgD9eS의 합성, (2) pZuFmEgD9ES의 구축 및 야로위아 리폴리티카 균주 Y2224로의 형질전환, 및 (3) pZuFmEgD9ES (EgD9eS를 발현함)를 포함하는 야로위아 리폴리티카 균주 Y2224의 형질전환 유기체 내 지질 프로파일의 분석이 필요하다.
EgD9eS 의 합성
실시예 5 및 PCT 공개 제WO 2004/101753호에 기재된 것과 유사한 방식으로, 유글레나 그라실리스의 Δ9 일롱가제 유전자 (EgD9e, 서열 1 및 서열 2)의 코돈 사용을 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 최적화시켰다. 구체적으로, EgD9e (즉, 클론 eeg1c.pk001.n5.f에서 유래함)의 코딩 서열을 기초로 하여 야로위아 코돈 사용 패턴 (PCT 공개 제WO 2004/101753호), 'ATG' 번역 개시 코돈 주위의 컨센서스 서열, 및 RNA 안정성에 관한 일반적 규칙 [Guhaniyogi, G. and J. Brewer, Gene, 265(1-2):11-23 (2001)]에 따라 코돈-최적화 Δ9 일롱가제 유전자 ("EgD9eS"이라 지칭함. 서열 3)를 디자인하였다. 번역 개시 부위의 변형에 추가하여, 777 bp 코딩 영역 중 117 bp (15.1％)를 변형시켰고, 106개 코돈을 최적화하였다. 도 10은 EgD9e 및 EgD9eS의 뉴클레오티드 서열 비교를 보여준다. 코돈-최적화 유전자에서의 변형 중 그 어느 것도 코딩되는 단백질의 아미노산 서열 (서열 2)을 변화시키지 않았다. EgD9eS로 지칭된 유전자는 젠스크립트 코포레이션(GenScript Corporation) (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)이 합성하였고, pUC57 (진뱅크 관리 번호: Y14837)로 클로닝하여 pEgD9S를 생성하였다.
구축물 pZuFmEgD9E ( EgD9E 를 포함함) 및 pZuFmEgD9ES ( EgD9ES 를 포함함)의 생성
pZUF17 (도 7C, 서열 121)의 NcoI/NotI 단편을 EgD9eS를 포함하는 pEgD9S의 NcoI/NotI 단편으로 대체하여, 키메라 FBAINm::EgD9ES::Pex20 유전자를 포함하는 플라스미드 pZuFmEgD9ES (서열 53)를 구축하였다. 상기 라이게이션의 생성물은 자율 복제되는 발현 벡터 pZuFmEgD9ES이었고, 이에 따라 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pZuFmEgD9ES (서열 53)의 성분
서열 53 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
SwaI/BsiWI (6067-318) ·FBAINm: 야로위아 리폴리티카 FBAINm 프로모터 (PCT 공개 제WO 2005/049805호) ·EgD9eS: 유글레나 그라실리스에서 유래된 코돈-최적화 Δ9 일롱가제 (서열 3, 본원에서 EgD9eS로 기재함) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자의 Pex20 종결자 서열 (진뱅크 관리 번호: AF054613) 을 포함하는 FBAINm::EgD9eS::Pex20
1354-474 ColE1 플라스미드 복제 기점
2284-1424 이. 콜라이에서의 선별을 위한 암피실린-내성 유전자 (AmpR)
3183-4487 야로위아 자율 복제 서열 (ARS18, 진뱅크 관리 번호: A17608)
6020-4533 야로위아 Ura 3 유전자 (진뱅크 관리 번호: AJ306421)
키메라 FBAINm::EgD9E::Pex20 유전자를 포함하는 플라스미드 pZuFmEgD9E (서열 52)를 pZUF17 플라스미드 주쇄를 사용하여 유사한 방식으로 합성하였다.
pZuFmEgD9E 및 pZuFmEgD9ES 를 포함하는 야로위아 리폴리티카 형질전환체의 기능적 분석
'일반적인 방법'에 기재한 바와 같이, 플라스미드 pZuFmEgD9E 및 pZuFmEgD9ES (각각, 키메라 FBAINm::EgD9e::Pex20 유전자 및 FBAINm::EgD9eS::Pex20 유전자를 포함함)로 균주 Y2224 (야생형 야로위아 균주 ATCC #20362의 Ura3 유전자 자율 돌연변이로부터의 FOA 내성 돌연변이체, 실시예 7)를 형질전환시켰다. 형질전환체를 MM 플레이트에서 선별하였다. 30℃에서 2일 동안 성장시킨 후에 MM 플레이트에서 성장한 3개의 형질전환체를 골라내어 신선한 MM 플레이트에 재-스트리킹하였다. 일단 성장하면, 이들 균주를 액체 MM 3 mL로 30℃하에 개별적으로 접종하고, 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수거하여 지질을 추출하고, 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 pZuFmEgD9E를 갖는 모든 7개의 형질전환체에서 생성된 전체 지질 중에 EDA (C20:2)가 약 3.2％로 존재함을 보여주었는데, 이들 7개의 균주에서 LA (C18:2)로부터 EDA로의 평균 전환 효율은 약 18.3％ (실시예 4에 기재한 바와 같이 계산한 평균값)인 것으로 결정되었다.
반대로, GC 분석은 pZuFmEgD9ES를 갖는 모든 7개의 형질전환체에서 생성된 전체 지질 중에 EDA (C20:2)가 약 3.6％로 존재함을 보여주었는데, 이들 7개의 균주에서 LA (C18:2)로부터 EDA로의 평균 전환 효율은 약 20.1％ (평균값)인 것으로 결정되었다. 따라서, 상기 실험 데이타는 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 유글레나 그라실리스 Δ9 일롱가제 (즉, EgD9eS. 서열 3)가 LA를 EDA로 신장시키는데 있어서 야생형 EgD9e 유전자 (즉, 서열 1)보다 약 16.2％ 더 효율적임을 입증하였다.
실시예 9: 유글레나 그라실리스 Δ9 일롱가제 ( EgD9e )의 발현을 위한, 야로위아 리 폴리티카 발현 벡터 pY120 의 구축
본 실시예는 EgD9e의 발현을 위한 야로위아 리폴리티카 벡터 pY120의 구축을 기재한다. 구체적으로, pKR906 (EgD9e를 포함함. 실시예 4)로부터의 NcoI/NotI DNA 단편을 pY115 (도 8, 실시예 5, 야로위아 리폴리티카 FBAINm 프로모터를 포함함)로부터의 NcoI/NotI DNA 단편에 클로닝하여 pY120 (서열 54, 도 11A)을 생성하였다. 상기 도면에서, EgD9e는 "eug el1"로 표시하였다.
실시예 10: 유글레나 그라실리스 Δ9 일롱가제 ( EgD9e )의 발현을 위한 대두 발현 벡터 pKR912 의 구축
본 실시예는 EgD9e의 발현을 위한 대두 벡터 pKR912의 구축을 기재한다.
PCT 공개 제WO 02/008269호 (상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 이미 기재되어 있는 pKS12의 유도체인 출발 플라스미드 pKR72 (ATCC 관리 번호: PTA-6019, 서열 55)는 T7 프로모터 및 전사 종결자에 의해 플랭킹되어 있는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자 (HPT) (T7prom/HPT/T7term 카세트) [Gritz, L. and Davies, J., Gene, 25:179-188 (1983)], 및 박테리아 (예컨대, 이. 콜라이)에서의 선별 및 복제를 위한 박테리아 복제 기점 (ori)을 함유한다. 추가로, pKR72는 또한 대두와 같은 식물에서의 선별을 위한, 35S 프로모터 [Odell et al., Nature, 313:810-812 (1985)] 및 NOS 3' 전사 종결자에 의해 플랭킹되어 있는 HPT 유전자 (35S/HPT/NOS3' 카세트) [Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet., 1:561-570 (1982)]를 함유한다. pKR72는 또한 β-콘글리시닌의 α' 서브유닛에 대한 프로모터 ("BCON Pro", [Beachy et al., EMBO J., 4:3047-3053 (1985)]) 및 파세올린 유전자의 3' 전사 종결 영역 [Doyle et al., J. Biol. Chem., 261:9228-9238 (1986)]에 의해 플랭킹되어 있는 NotI 제한 부위를 함유하여, NotI 부위로 클로닝된 유전자가 대두 종자에서 강력한 조직-특이적 발현을 나타내도록 한다.
pKR906 (실시예 4)을 NotI 소화시켜 EgD9e를 유리시키고, pKR72의 NotI 부위로 클로닝하여 pKR912 (서열 56)를 생성하였다. pKR912의 모식도는 도 11B에 나타내었고, 여기서 EgD9e는 "eug el1"로 표시하였다.
실시예 11: 유글레나 그라실리스 Δ9 일롱가제 ( EgD9e )의 발현을 위한 대두 중간체 클로닝 벡터 pKR911 의 구축
본 실시예는 EgD9e의 발현을 위한 대두 벡터 pKR91의 구축에 대해 기재한다.
PCT 공개 제WO 02/00905호 (상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 이미 기재되어 있는 벡터 pKS102 (서열 57)는 T7prom/HPT/T7term 카세트 (실시예 10에 기재되어 있음), 및 박테리아 (예컨대, 이. 콜라이)에서의 선별 및 복제를 위한 박테리아 복제 기점 (ori)을 함유한다.
T7prom/HPT/T7term 카세트 및 박테리아 ori를 함유하는 플라스미드 pKS102 (서열 57)의 AscI 단편을 βcon/NotI/Phas 카세트를 함유하는 플라스미드 pKR72 (실시예 10에 기재되어 있음)의 AscI 단편과 합하여, PCT 공개 제WO 04/071467호 (상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 이미 기재되어 있는 벡터 pKR197 (서열 58)을 구축하였다.
pKR906 (실시예 4)을 NotI 소화시켜 EgD9e를 유리시키고, pKR197의 NotI 부위로 클로닝하여 중간체 클로닝 벡터 pKR911 (서열 59)를 생성하였다. pKR911의 모식도는 도 12A에 나타내었고, 여기서 EgD9e는 "eug el1"로 표시하였다.
실시예 12: 유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 ( EgD8 )의 cDNA 합성 및 PCR
본 실시예는 미국 특허 출원 제11/166003호 및 동 제11/166993호 (PCT 공개 제WO 06/012325호 및 동 제WO 06/012326호 [상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨]에 상응함)에 개시된 바와 같이 유글레나 그라실리스로부터의 Δ8 데새투라제 ("EgD8"이라 지칭함) 단리에 관해 기재한다. 상기 유전자의 단리는, EgD9e 및 EgD8이 동시발현될 수 있게 하여 Δ9 일롱가제/Δ8 데새투라제 경로가 발현되도록 하고, LA 및/또는 ALA로부터 DGLA 및/또는 ETA가 축적될 수 있도록 하는데 바람직하다.
cDNA 합성용 수퍼스크립트™ 초이스 (Superscript™ Choice) 시스템 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠™ 라이프 테크놀로지즈(Invitrogen™ Life Technologies))을 제조업체의 프로토콜에 따라 제공된 올리고(dT) 프라이머와 함께 사용하여, mRNA 765 ng (실시예 1)으로부터 유글레나 그라실리스 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 물 20 ㎕에 용해하였다.
하기 조건을 이용하여, 유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제를 cDNA로부터 증폭시켰다. 구체적으로, cDNA (1 ㎕)를 50 pmol의 Eg5-1 (서열 62), 50 pmol의 Eg3-3 (서열 63), PCR 뉴클레오티드 혼합물 (10 mM, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가) 1 ㎕, 10× PCR 완충제 (인비트로젠 코포레이션) 5 ㎕, MgCl2 (50 mM, 인비트로젠 코포레이션) 1.5 ㎕, Taq 폴리머라제 (인비트로젠 코포레이션) 0.5 ㎕, 및 50 ㎕가 될 때까지의 물과 합하였다. 반응 조건은 94℃에서 3분, 이후 94℃에서 45초, 55℃에서 45초, 및 72℃에서 1분의 35회 주기를 수행하였다. PCR을 72℃에서 7분 동안 종결한 후에 4℃에서 유지시켰다. PCR 반응물 5 ㎕을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였고, 1.3 kB 정도의 분자량을 갖는 DNA 밴드가 관찰되었다. 나머지 45 ㎕의 생성물은 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고, 지모클린(Zymoclean)™ 겔 DNA 리커버리(Recovery) 키트 (미국 캘리포니아 오렌지 소재의 지모 리써치)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 DNA 밴드를 정제하였다. 이로써 생성된 DNA를 pGEM®-T 이지 벡터 (프로메가)에 제조업체의 프로토콜에 따라 클로닝하였다. T7 (서열 64), M13-28Rev (서열 65), Eg3-2 (서열 66) 및 Eg5-2 (서열 67)를 사용하여 여러개의 클론을 서열분석하였다.
이로써, 유글레나 그라실리스 Δ8 데새투라제 (즉, Eg5)에 대한 DNA 서열 (서열 60)이 수득되었다. Eg5를 번역시켜, 서열 61에 기재한 단백질 서열을 수득하였다. 본원에서의 목적상, "Eg5"는 본 명세서의 이하 기재 전반에서 "EgD8"이라고 지칭된다.
본원에서 상술지는 않았지만, 상기 실시예 5에 기재한 방법을 이용하여 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 버전의 EgD8도 생성하였다 (미국 특허 출원 제11/166003호 및 동 제11/166993호 (PCT 공개 제WO 06/012325호 및 동 제WO 06/012326호에 상응함)에 개시된 바와 같음). 상기 유전자를 EgD8S로 지칭하며, 본원에서는 서열 68 및 서열 69로 기재한다.
실시예 13: EgD9e 및 EgD8 의 동시발현을 위한 대두 발현 벡터 pKR913 의 구축
본 실시예는 EgD9e 및 EgD8의 동시발현을 위한 대두 벡터 pKR913의 구축에 관해 기재한다.
PCT 공개 제WO 02/00904호 (상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 이미 기재되어 있는 벡터 pKS121 (서열 70)은 쿠니츠 대두 트립신 억제제 (KTi) 프로모터 [Jofuku et al., Plant Cell, 1:1079-1093 (1989)] 및 KTi 3' 종결 영역에 의해 플랭킹되어 있는 NotI 부위를 함유하며, 이것의 단리는 미국 특허 제6,372,965호에 기재되어 있다 (KTi/NotI/KTi3' 카세트).
PCT 공개 제WO 05/047479호 (상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 이미 기재되어 있는 벡터 pKR457 (서열 71)은 KTi/NotI/KTi3' 카세트의 상류 및 하류 제한 부위가 수많은 서브클로닝 단계를 거치면서 변경되어 있는 pKS121의 유도체이다. 벡터 pKR457은 또한 KTi 종결자의 하류에 전사 종결을 길게 하고 강화시키는, PCT 공개 제WO 04/071467호 (상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 이미 기재되어 있는 콩 알부민 전사 종결자 (GM-ALB TERM)를 함유한다. pKR457에서, KTi/NotI/KTi3' 카세트 중 KTi 프로모터의 상류 BamHI 부위를 제거하고, BsiWI, SalI, SbfI 및 HindIII 부위를 함유하는 새로운 서열 (서열 72)을 BsiWI 부위가 KTi 프로모터의 5' 말단에 가장 가깝게 하여 부가하였다.
추가로, pKS121로부터의 KTi/NotI/KTi3' 카세트 중 KTi 종결자의 하류 SalI 부위를 제거하고, XbaI (KTi 종결자의 3' 말단에 가장 가까움), BamHI 부위, 콩 알부민 전사 종결자 서열, BsiWI 부위 및 또다른 BamHI 부위를 함유하는 새로운 서열 (서열 73)을 부가하였다. 알부민 전사 종결자는 상기 종결자의 3' 말단에 BsiWI 부위를 도입하도록 디자인된 프라이머 oSalb-12 (서열 74) 및 상기 종결자의 5' 말단에 BamHI 부위를 도입하도록 디자인된 프라이머 oSalb-13 (서열 75)을 이용하여 콩 게놈 DNA로부터 이미 증폭시켜 두었다.
실시예 12에 기재된 pGEM®-T 이지 벡터를 NotI 소화시켜 EgD8 (서열 60)을 유리시키고, pKR457의 NotI 부위로 클로닝하여 pKR680 (서열 76)을 생성하였다. 이어서, 플라스미드 pKR680을 BsiWI으로 소화시키고, EgD8을 함유하는 단편을 pKR911 (서열 59, 실시예 11)의 BsiWI 부위로 클로닝하여 pKR913 (서열 77)을 생성하였다. pKR913의 모식도는 도 12B에 나타내었다. 여기서, EgD9e는 "eug el1"로 표시하였고, EgD8은 eug d8-sq5로 표시하였다.
실시예 14: EgD9e 및 EgD8 의 동시발현을 위한 대두 발현 벡터의 구축
본 실시예는 EgD9e 및 EgD8의 동시발현을 위한 대두 벡터의 구축에 관해 기재한다. 구체적으로, 플라스미드 pKR680 (서열 76, 실시예 13)을 BsiWI으로 소화시키고, EgD8 (서열 60)을 함유하는 단편을 pKR912 (서열 56, 실시예 10)의 BsiWI 부위로 클로닝하였다. 이러한 방법으로, EgD8을 강력한 종자-특이적 프로모터하에서 EgD9e와 동시발현시켰다.
실시예 15: EgD9e 와 EgD8 및 모르티에렐라 알피나 Δ5 데새투라제 ( Mad5 )의 동시발현을 위한 벡터의 구축
본 실시예는 EgD9e 및 EgD8 및 다른 PUFA 유전자 (즉, Δ5 데새투라제)의 동시발현을 위한 대두 벡터의 구축에 관해 기재한다.
EgD8 (서열 60), EgD9e (서열 1) 및 모르티에렐라 알피나 Δ5 데새투라제 (서열 78; "Mad5")를 함유하는 대두 발현 벡터는 미국 특허 제6,075,183호 및 PCT 공개 제WO 04/071467호 및 동 제WO 05/0479479호 (상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있고, 모두가 강력한 종자-특이적 프로모터의 제어하에 있으며, 이것을 하기하는 방법으로 구축하였다.
수많은 서브클로닝 단계를 거쳐서, DNA 서열 (서열 80)을 벡터 pKR287 (PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음. 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨)의 SmaI 부위에 효과적으로 부가하여 pKR767 (서열 81)을 생성하였다. 이러한 방법으로, SbfI 제한 부위를 Gy1/Mad5/legA2 카세트의 leg1A 전사 종결자의 3' 말단에 부가하였고, 이것은 PCT 공개 제WO 04/071467호 및 동 제WO 05/0479479호에 기재되어 있다.
pKR767을 SbfI 소화시켜 Gy1/Mad5/legA2 카세트를 유리시키고, 이로써 생성된 단편을 실시예 14에 기재한 벡터의 SbfI 부위로 클로닝하여, 모든 3개의 유전자 (즉, EgD9e, EgD8 및 Mad5)를 강력한 종자-특이적 프로모터의 제어하에 동시 발현하는 새로운 벡터를 생성하였다.
실시예 16: EgD9e , EgD8 및 Mad5 를 포함하는 대두 발현 벡터와 사프롤레그니아 디클리나( Saprolegnia diclina ) Δ17 데새투라제 ( SdD17 )의 동시 발현
본 실시예는 실시예 15에 기재한 대두 발현 벡터 (EgD9e, EgD8 및 Mad5를 발현함)와 여러개의 상이한 종자-특이적 프로모터/장쇄 PUFA-생합성 유전자 조합물을 발현하는 (예컨대, Δ17 데새투라제를 발현함) 다른 벡터의 동시-형질전환 수단에 관해 기재한다. 온전한 플라스미드, 또는 적절한 유전자 조합물을 함유하는 상기 플라스미드로부터의 정제된 AscI 단편을 사용하였다 (플라스미드의 임의의 단편의 임의의 조합일 수 있음).
예를 들어, 실시예 15에 기재한 벡터는 안넥신 프로모터의 제어하에 있는 사프롤레그니아 디클리나 Δ17 데새투라제 (SdD17)를 함유하고 식물에서의 선별을 위한 하이그로마이신 내성 유전자를 갖는 pKR328 (서열 82. PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)과 함께 동시-형질전환될 수 있다.
유사하게, 실시예 15에 기재한 벡터는 pKR886 또는 pKR886r (각각, 도 13A 및 도 13B)과 동시-형질전환될 수 있는데, 이들 2개의 벡터는 pKR328과 유사하지만 식물에서의 선별을 위한 SAMS/ALS/ALS3' 카세트 (PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)를 갖는다. 구체적으로, 벡터 pKR886 (서열 83) 및 pKR886r (서열 84)은 pKR271 (서열 85, PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)로부터의 Ann/Sdd17/BD30 카세트를 함유하는 PstI 단편을 pKR226 (서열 86, PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)의 SbfI 부위로 클로닝하여 제조된 것이다.
실시예 17: EgD9e , EgD8 및 Mad5 를 포함하는 대두 발현 벡터와 SdD17 및 아라비돕 시스 Fad3 의 동시 발현
본 실시예는 실시예 15에 기재한 대두 발현 벡터 (EgD9e, EgD8 및 Mad5를 발현함)와 여러개의 상이한 종자-특이적 프로모터/장쇄 PUFA-생합성 유전자 조합물을 발현하는 (예컨대, Δ17 데새투라제 및 Fad3을 발현함) 다른 벡터의 동시-형질전환 수단에 관해 기재한다.
실시예 15에 기재한 벡터는 pKR275 (서열 87, PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있으며, ATCC 관리 번호는 PTA-4989임) 또는 pKR329 (서열 88, PCT 공개 제WO 04/07146호에 기재되어 있음)와 함께 대두로 동시-형질전환될 수 있었다. 플라스미드 pKR275 및 pKR329는 각각 ALS 또는 하이그로마이신 선별을 가지며, Ann/Sdd17/BD30 카세트에 추가하여 KTi/Fad3/KTi3' 유전자 카세트 (PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)를 함유한다. 이러한 방법으로, 아라비돕시스 Fad3 유전자를 강력한 종자-특이적 프로모터하에서 사프롤레그니아 디클리나 Δ17 데새투라제 (SdD17)와 동시 발현시킬 수 있었다.
실시예 18: EgD9e , EgD8 및 Mad5 를 포함하는 대두 발현 벡터와 SdD17 및 푸사리움 모닐리포르메( Fusarium moniliforme ) Δ15 데새투라제 ( FmD15 )의 동시 발현
본 실시예는 실시예 15에 기재한 대두 발현 벡터 (EgD9e, EgD8 및 Mad5를 발현함)와 여러개의 상이한 종자-특이적 프로모터/장쇄 PUFA-생합성 유전자 조합물을 발현하는 (예컨대, Δ17 데새투라제 및 Δ15 데새투라제를 발현함) 다른 벡터의 동시-형질전환 수단에 관해 기재한다.
실시예 15에 기재한 벡터는 하이그로마이신 선별을 가지며 KTi 프로모터의 제어하의 푸사리움 모닐리포르메 Δ15 데새투라제 (FmD15)를 함유하는 pKR585 (서열 89, PCT 공개 제WO 05/0479479호에 기재되어 있으며 ATCC 관리 번호는 PTA-6019임)와 함께 대두로 동시-형질전환될 수 있었다.
실시예 15에 기재한 벡터는 또한 ALS 선별을 가지며 Ann/Sdd17/BD30 카세트에 추가하여 KTi 프로모터의 제어하의 푸사리움 모닐리포르메 Δ15 데새투라제를 함유하는 pKR669와 함께 대두로 동시-형질전환될 수도 있었다. 플라스미드 pKR669를 하기하는 방법으로 생성하였다. 플라스미드 pKR578 (서열 90, PCT 공개 제WO 05/0479479호에 기재되어 있으며 ATCC 관리 번호는 PTA-6280임)를 BsiWI 소화시켜 KTi 프로모터:FmD15:KTi 종결자 카세트를 유리시키고, 선별을 위한 ALS 유전자, T7prom/HPT/T7term 카세트 및 박테리아 ori 영역을 함유하는 플라스미드 pKR226 (서열 86, PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)의 BsiWI 부위로 클로닝하여 pKR667 (서열 91)을 생성하였다. 플라스미드 pKR271 (서열 85, PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)을 PstI으로 소화시키고, 사프롤레그니아 디클리나 Δ17 데새투라제를 함유하는 단편을 pKR667의 SbfI 부위로 클로닝하여 pKR669를 생성하였다. 이러한 방법으로, 푸사리움 모닐리포르메 Δ15 데새투라제를 강력한 종자-특이적 프로모터하에서 사프롤레그니아 디클리나 Δ17 데새투라제와 동시 발현시킬 수 있었다. pKR669의 모식도는 도 14A에 나타내었다.
실시예 15에 기재한 벡터는 또한 ALS 선별을 가지며 Ann/Sdd17/BD30 카세트에 추가하여 콩 알부민 프로모터 (PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)의 제어하의 푸사리움 모닐리포르메 Δ15 데새투라제 (FmD15)를 함유하는 pKR873 (서열 92)와 함께 대두로 동시-형질전환될 수도 있었다. 구체적으로, 플라스미드 pKR873을 하기하는 방법으로 생성하였다. SA/NotI/SA3' 카세트를 PCR을 이용하여 플라스미드 pKR132 (서열 93, PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)로부터 증폭시켰다. 프라이머 oSAlb-9 (서열 94)는 상기 프로모터의 5' 말단에 XbaI 및 BsiWI 부위를 도입하도록 디자인되었고, 프라이머 oSAlb-2 (서열 95)는 상기 종결자의 3' 말단에 BsiWI 및 XbaI 부위를 도입하도록 디자인되었다. 이후, 이로써 생성된 PCR 단편을 pCR-Script AMP SK(+) (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 스트라타진 컴파니(Stratagene Company))로 클로닝하여 pKR160 (서열 96)을 생성하였다. 이어서, 플라스미드 pKR160을 BsiWI으로 소화시키고, SA/NotI/SA3' 카세트를 pKR124 (서열 97, PCT 공개 제WO 05/0479479호에 기재되어 있음)의 BsiWI 부위로 라이게이션하여 pKR163 (서열 98)을 생성하였다. 푸사리움 모닐리포르메 Δ15 데새투라제를 함유하는 pY34 (서열 99, PCT 공개 제WO 05/0479479호에 기재되어 있음)로부터의 NotI 단편을 pKR163 (서열 98)의 NotI 부위로 클로닝하여 pKR863 (서열 100)을 생성하였다. 플라스미드 pKR863을 BsiWI 소화시켜 SA/FmD15/SA3' 카세트를 유리시키고, 선별을 위한 ALS 유전자, T7prom/HPT/T7term 카세트 및 박테리아 ori 영역을 함유하는 플라스미드 pKR226 (서열 86, PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)의 BsiWI 부위로 클로닝하여 pKR869 (서열 101)를 생성하였다. 플라스미드 pKR271 (서열 85, PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)을 PstI으로 소화시키고, 사프롤레그니아 디클리나 Δ17 데새투라제를 함유하는 단편을 pKR869 (서열 101)의 SbfI 부위로 클로닝하여 pKR873 (서열 92)을 생성하였다. 이러한 방법으로, 푸사리움 모닐리포르메 Δ15 데새투라제를 강력한 종자-특이적 프로모터하에서 사프롤레그니아 디클리나 Δ17 데새투라제와 동시 발현시킬 수 있었다. pKR873의 모식도는 도 14B에 나타내었다.
실시예 19: EgD9e , EgD8 및 Mad5 를 포함하는 대두 발현 벡터와 SdD17 및 모르티에 렐라 알피나 일롱가제 ( MaELO )의 동시 발현
본 실시예는 실시예 15에 기재한 대두 발현 벡터 (EgD9e, EgD8 및 Mad5를 발현함)와 여러개의 상이한 종자-특이적 프로모터/장쇄 PUFA-생합성 유전자 조합물을 발현하는 (예컨대, Δ17 데새투라제 및 일롱가제를 발현함) 다른 벡터의 동시-형질전환 수단에 관해 기재한다.
실시예 15에 기재한 벡터는 또한 ALS 선별을 가지며 Ann/Sdd17/BD30 카세트에 추가하여 콩 알부민 프로모터 (PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)의 제어하의 모르티에렐라 알피나 일롱가제 (PCT 공개 제WO 04/071467호 및 동 제WO 00/12720호에 기재되어 있음)를 함유하는 벡터와 함께 대두로 동시-형질전환될 수도 있었다. 상기 플라스미드는 상기한 것과 유사한 방법으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 모르티에렐라 알피나 일롱가제 ("Maelo")를 함유하는 pKR270 (서열 102, PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)의 NotI 단편을 pKR163 (서열 98)의 NotI 부위에 클로닝하여 SA/Maelo/SA3' 카세트를 갖는 벡터를 생성할 수 있다. 상기 플라스미드를 BsiWI 소화시켜 SA/Maelo/SA3' 카세트를 유리시키고, 선별을 위한 ALS 유전자, T7prom/HPT/T7term 카세트 및 박테리아 ori 영역을 함유하는 플라스미드 pKR226 (서열 86, PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)의 BsiWI 부위로 클로닝하여 새로운 플라스미드를 생성할 수 있다. 이어서, 플라스미드 pKR271 (서열 85, PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)을 PstI으로 소화시킬 수 있었고, 사프롤레그니아 디클리나 Δ17 데새투라제를 함유하는 단편을 SA/Maelo/SA3' 카세트를 함유하는 상기 새로운 플라스미드의 SbfI 부위에 클로닝할 수 있었다. 이러한 방법으로, 모르티에렐라 알피나 일롱가제를 강력한 종자-특이적 프로모터하에서 사프롤레그니아 디클리나 Δ17 데새투라제와 동시 발현시킬 수 있었다.
실시예 20: EgD9e , EgD8 및 Mad5 를 포함하는 대두 발현 벡터와 C 20 /22 일롱가제 및 Δ4 데새투라제의 동시 발현
본 실시예는 실시예 15에 기재한 대두 발현 벡터 (EgD9e, EgD8 및 Mad5를 발현함)와 여러개의 상이한 종자-특이적 프로모터/장쇄 PUFA-생합성 유전자 조합물을 발현하는 (예컨대, C20 /22 일롱가제 및 Δ4 데새투라제를 발현함) 다른 벡터의 동시-형질전환 수단에 관해 기재한다.
C20 /22 일롱가제 (또한 Δ5 일롱가제 및/또는 EPA 일롱가제로 지칭되기도 함) 및/또는 Δ4 데새투라제 역시 본원에 기재한 것과 유사한 대두 발현 벡터에서 동시 발현될 수 있다. 예를 들어, 쉬조키트리움 아그레가툼(Schizochytrium aggregatum)으로부터의 Δ4 데새투라제 (PCT 공개 제WO 02/090493호에 기재되어 있음) 또는 파블로바로부터의 Δ5 일롱가제 (PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있음)는 PCT 공개 제WO 04/071467호에 기재되어 있는 것과 같은 적합한 대두 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. Δ4 데새투라제 또는 Δ5 일롱가제의 5' 및 3' 말단에 NotI 부위를 도입하도록 디자인된 PCR 프라이머를 사용하여 유전자를 증폭시킬 수 있다. 이어서, 이로써 생성된 PCR 생성물을 NotI으로 소화시킬 수 있고, 강력한 종자-특이적 프로모터와 전사 종결자에 의해 플랭킹된 NotI 부위를 함유하는 적합한 대두 발현 벡터로 클로닝할 수 있다. 본원에 기재되거나 PCT 공개 제WO 04/071467호 또는 PCT 공개 제WO 05/047479호 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 문헌에 기재된 것과 같은 다른 벡터로의 추가의 서브클로닝은 대두 중 Δ4 데새투라제 및/또는 Δ5 일롱가제의 발현 및 동시발현에 적합한 벡터를 생성해야만 한다.
실시예 21: 유트레프티엘라 종 CCMP389 게놈 DNA , RNA 및 cDNA 의 제조
본 실시예는 CCMP (The Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton) (미국 메인주 웨스트 부트베이 하버 조새의 비지로우 래버러토리 포 오션 사이언시스(Bigelow Laboratory for Ocean Sciences))로부터 구입한 유트레프티엘라 종 CCMP389로부터의 게놈 DNA, RNA 및 cDNA의 제조에 관해 기재한다.
유트레프티엘라 종 CCMP389 로부터의 RNA 및 게놈 DNA 의 제조
트리졸 시약 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠)을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여, 배양물 1 L로부터 전체 RNA 및 게놈 DNA를 단리하였다. 구체적으로, 세포 펠렛을 0.5 mm 유리 비드 0.5 mL과 혼합한 트리졸 시약 0.75 mL 중에 재현탁하고, 최고치로 설정한 바이오스펙(Biospec) 미니 비드비터 (미국 오클라호마주 바르틀레스빌 소재)에서 3분 동안 균질화시켰다. 상기 혼합물을 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리로 30초 동안 14,000 rpm에서 원심분리하여 부스러기(debris) 및 유리 비드를 제거하였다. 상등액을 24:1 클로로포름:이소아밀 알콜 (인비트로젠) 150 ㎕로 추출하였다. RNA 단리에는 위쪽의 수성 상을 사용하였고, DNA 단리에는 아래쪽의 유기 상을 사용하였다.
RNA 단리를 위해서, 수성 상을 이소프로필 알콜 0.375 mL와 혼합하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 침전된 RNA를 8,000 rpm으로 4℃에서 5분 동안의 원심분리로 수거하였다. 펠렛을 80％ 에탄올 0.7 mL로 1회 세척하고 공기 건조시켰다. 이러한 방법으로, 전체 RNA 360 ㎍을 수득하였다.
게놈 DNA 단리를 위해서, 아래쪽의 유기 상을 에탄올 75 ㎕와 혼합하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 상기 샘플을 5,000 rpm으로 2분 동안 에펜도르프 원심분리로 원심분리하였다. 펠렛을 0.1 M 시트르산나트륨:10％ 에탄올 0.75 mL로 2회 세척하였다. 매번 마다 샘플을 세척 용액 중에 15분 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후에 5,000 rpm으로 5분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 펠렛을 공기 건조시켜 8 mM NaOH 300 ㎕ 중에 재용해하였다. 1 M HEPES를 사용하여 샘플의 pH를 7.5로 조정하였다. 이어서, 퀴아젠 PCR 정제 키트 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 제조업체의 프로토콜에 기재된 대로 정확하게 사용하여 게놈 DNA를 추가로 정제하였다. 이로써, 게놈 DNA 40 ㎍이 단리되었다.
유트레프티엘라 종 CCMP389 로부터의 cDNA 제조
비디 바이오사이언스 클론테크(BD Bioscience Clontech) (미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)의 크리에이터(Creator)™ 스마트™ cDNA 라이브러리 구축 키트를 사용하여 이중-가닥 cDNA를 생성하였다. 구체적으로, 제1 가닥 cDNA 합성을 위해서 전체 RNA 샘플 (1.2 ㎍) 1 ㎕를 스마트™ IV 올리고뉴클레오티드 (서열 103) 1 ㎕, CDSIII/3' PCR 프라이머 (서열 104) 1 ㎕ 및 물 2 ㎕와 개별적으로 혼합하였다. 상기 혼합물을 75℃로 5분 동안 가열하고 빙상에서 5분 동안 냉각시켰다. 상기 샘플에 5× 제1 가닥 완충제 2 ㎕, 20 mM DTT 1 ㎕, dNTP 혼합물 (10 mM씩의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 1 ㎕ 및 파워스크립트(PowerScript) 역전사효소 1 ㎕를 첨가하였다. 상기 샘플을 42℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
상기 제1 가닥 cDNA 합성 혼합물을 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. 구체적으로, 상기 반응 혼합물은 상기 제1 가닥 cDNA 샘플 2 ㎕, 물 80 ㎕, 10× 어드밴티지(Advantage) 2 PCR 완충제 10 ㎕, 50× dNTP 혼합물 (10 mM씩의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 2 ㎕, 5'-PCR 프라이머 (서열 105) 2 ㎕, CDSIII/3'-PCR 프라이머 (서열 104) 2 ㎕ 및 50× 어드밴티지 2 폴리머라제 혼합물 2 ㎕를 함유하였다. 하기 조건을 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다: 95℃에서 1분, 이후 95℃에서 10초 및 68℃에서 6분의 20회 주기. 퀴아젠 PCR 정제 키트를 제조업체의 프로토콜에 따라 정확하게 사용하여 증폭 생성물을 정제하였다. 정제된 생성물을 물 50 ㎕로 용출시켰다.
실시예 22: 유트레프티엘라 종 CCMP389 로부터 전장 Δ9 일롱가제의 단리
본 실시예는 유글레나 그라실리스 Δ9 일롱가제 서열 (EgD9e, 실시예 3) 및 아이. 갈바나 Δ9 일롱가제 서열 (IgD9e)의 보존된 영역에서 유래된 프라이머를 사용하여 유트레프티엘라 종 CCMP389의 Δ9 일롱가제를 코딩하는 부분적 cDNA 단편을 동정하는 것에 관해 기재한다. 이어서, 상기 부분적 cDNA 단편의 서열을 기초로 하여, 상기 유전자의 5' 및 3' 말단을 단리하였다. 이것은, 유트레프티엘라 종 CCMP389 Δ9 일롱가제 번역 개시 'ATG' 코돈의 상류 51개 염기 및 Δ9 일롱가제 종결 코돈 뒤쪽의 662 bp를 신장시키는 콘티그 (서열 17)의 조립을 가능하게 하였다.
유레프티엘라 종 CCMP389 의 부분적 Δ9 일롱가제를 코딩하는 cDNA 단편의 동정
유트레프티엘라 종 CCMP389를 Δ9 일롱가제의 존재에 대하여 분석하였다. 유트레프티엘라 종 CCMP389 Δ9 일롱가제를 단리하는데 적합한 동의성 프라이머의 디자인은, EgD9e (서열 2)와 IgD9e (서열 8)의 정렬을 디엔에이스타 소프트웨어 메그얼라인™ 프로그램의 클러스탈 더블유(Clustal W) (느리고, 정확하며, 곤네트(Gonnet) 옵션. [Thompson et al., Nucleic Acids Res., 22:4673-4680 (1994)]) 방법을 사용하여 생성했을 때 상기 2종의 일롱가제 둘다에 공통적으로 보존된 아미노산 서열의 여러 스트레치에 대한 확인을 기초로 하였다 (도 4로 나타낸 EgD9e 및 IgD9e의 클러스탈 브이 정렬을 대신한 클러스탈 더블유 정렬은 본원에 나타내지 않음).
이러한 정렬을 기초로 하여, 하기 세트의 동의성 올리고뉴클레오티드를 디자인하여, 하기 표 10에 나타낸 바와 같은 유트레프티엘라 종 CCMP389 Δ9 일롱가제 유전자 코딩 영역의 일부를 증폭시켰다:
Figure 112008044342784-PCT00010
[주: 서열 106 및 서열에 사용된 핵산 동의성 코드는 다음과 같다: R = A/G, Y = C/T, D = G/A/T; 및 N = A/C/T/G]
상기 반응 혼합물은 1:20으로 희석된 cDNA 1 ㎕, 전방향 및 역방향 프라이머 (20 μM) 5 ㎕씩, 물 14 ㎕ 및 다까라(TaKaRa) ExTaq 2× 사전혼합물 (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 다까라 바이오(TaKaRa Bio)) 25 ㎕를 함유하였다. 하기 파라미터를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다: 94℃에서 1분, 이후 94℃에서 20초, 55℃에서 20초 및 72℃에서 1분의 35회 주기 및 이후 72℃에서 5분 동안의 최종 신장 주기.
PCR 생성물의 아가로스 겔 분석은 약 200 bp 단편이 수득되었음을 보여주었다. 상기 단편을 퀴아젠 PCR 정제 키트로 정제하여 pCR2.1-TOPO (인비트로젠)로 클로닝하고 서열분석하였다. 생성된 서열 (서열 13)은 번역될 경우에 BLAST 프로그램 분석 (Basic Local Alignment Search Tool, [Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993)], 실시예 3)을 기초로 할 때 이소크리시스 갈바나 유래의 공지된 Δ9 일롱가제 (IgD9e, 서열 8)와의 상동성을 보유하였다.
유트레프티엘라 종 CCMP389 Δ9 일롱가제 5'-말단 서열의 단리
유트레프티엘라 종 CCMP389 (실시예 21)의 이중-가닥 cDNA를 2회의 별도의 PCR 증폭에서 주형으로 사용하였다. 제1회의 PCR 증폭에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 (즉, 389Elo-5-1 [서열 110]) 및 비디-클론테크 크리에이터™ 스마트™ cDNA 라이브러리 키트의 일반적인 올리고뉴클레오티드 5'-PCR 프라이머 (서열 105)로 이루어졌다. PCR 증폭을 1:10으로 희석된 유트레프티엘라 종 CCMP389 cDNA (주형) 1 ㎕, 각 프라이머 (20 μM) 1 ㎕씩, 물 22 ㎕ 및 다까라 ExTaq 2× 사전혼합물 25 ㎕를 포함하는 총 부피 50 ㎕로 수행하였다. 증폭을 94℃에서 90초 동안 수행한 후에 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 30회 주기를 수행하고, 이후에는 72℃에서 7분 동안의 최종 신장 주기를 수행하였다.
제2회의 PCR 증폭은 상기 제1회 PCR 반응의 희석된 생성물 (1:50) 1 ㎕를 주형으로 사용하였다. 프라이머는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 (즉, 389Elo-5-2 (서열 111)) 및 올리고뉴클레오티드 DNR CDS 5'-2 (서열 112)로 이루어졌다. 증폭은 상기한 바와 같이 수행하였다.
제2회 PCR 반응의 생성물을 1％ (w/v) 아가로스에서 전기영동시켰고, 크기 범위 200 bp 내지 800 bp에 걸쳐 있는 넓은 밴드로 나타났다. 퀴아젠 겔 정제 키트를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 400 bp 내지 600 bp 사이의 생성물을 단리하고, pCR2.1-TOPO (인비트로젠)에 클로닝하여 이. 콜라이를 형질전환시켰다. 형질전환체를 암피실린 (100 ㎍/mL)-함유 LB 한천에서 선별하였다.
추정적인 Δ9 일롱가제 cDNA의 5' 영역을 포함하는 1개의 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA의 서열 분석은 406 bp의 단편 (즉, 5'-cDNA 단편 1, 서열 14)을 밝혀냈다. 상기 단편을 유전자의 'ATG' 번역 개시 코돈 근처로 연장시켰지만, 출발 코돈이나 처음 20개 내지 30개 아미노산 그 어느 것도 서열 14에는 포함시키지 않았다.
이어서, 5'-cDNA 단편 1의 서열 (서열 14)을 기초로 하여 추가의 올리고뉴클레오티드 (즉, 389Elo-5-4 (서열 113))를 디자인하여, 상기 유전자의 완전 5' 말단이 PCR로 수득되도록 하였다. 반응 혼합물 및 증폭 조건은 상기한 제2회의 PCR에 대한 것과 동일하였지만, 여기서는 프라이머 389Elo-5-2를 389Elo-5-4로 대체하였다. 아가로스 겔 전기영동으로 분석했을 때, PCR 생성물은 다시 200 bp 내지 800 bp의 넓은 밴드로 나타났고, 200 bp 내지 500 bp 크기의 단편을 상기한 바와 같이 단리하여 클로닝하고 형질전환시켰다.
추정적인 Δ9 일롱가제 cDNA의 5' 영역을 포함하는 1개의 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA의 서열 분석은 197 bp의 단편 (5'-cDNA 단편 2, 서열 15)을 밝혀냈다. 이것은 cDNA의 5'-말단 및 상류 비-번역 영역의 51 bp를 포함하였다.
유트레프티엘라 종 CCMP389 Δ9 일롱가제 3'-말단의 단리
추정적인 Δ9 델타 일롱가제의 3' 말단도 cDNA를 주형으로 사용한 PCR 증폭으로 단리하였다. 상기 방법은 5' 말단의 단리에 대하여 상기한 것과 같았으나, 제1회와 제2회의 PCR 증폭 둘다에 사용한 프라이머는 하기 표 11에 나타낸 바와 같고, 20 μM이 아니라 10 μM이었다. 추가로, 72℃에서의 최종 신장 주기를 7분이 아니라 5분으로 감소시켰다.
3' cDNA 단리에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머
PCR 증폭 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 일반적인 올리고뉴클레오티드
제1회 389Elo-3-1 (서열 114) CDSIII/3' PCR 프라이머 (서열 104)
제2회 389Elo-3-2 (서열 115) CDSIII/3' PCR 프라이머 (서열 104)
* CDSIII/3' PCR 프라이머는 클론테크의 크리에이터™ 스마트™ cDNA 라이브러리 구축 키트에서 제공되었음.
제2회 PCR 증폭으로 약 1 kB의 DNA 단편이 생성되었고, 이것을 퀴아젠 PCR 정제 키트로 정제하여 pCR2.1-TOPO로 클로닝하고 형질전환 및 서열분석을 실시하였다. 여러개 클론의 서열 분석은 약 1 kB의 DNA 단편이 폴리A 테일을 포함하는 추정적인 Δ9 일롱가제 cDNA의 3'-영역을 함유함을 보여주었다. 3'-영역의 920 bp 조립된 콘티그 서열은 서열 16으로 나타내었다.
유트레프티엘라 종 CCMP389 전장 Δ9 일롱가제 서열의 조립
처음의 부분적 cDNA 단편 (서열 13), 2개의 5' cDNA 단편 (서열 14 및 서열 15) 및 3'-cDNA 단편 (서열 16)의 조립으로, 유트레프티엘라 종 CCMP389 Δ9 일롱가제의 완전 서열 및 5' 비-번역 영역 51 bp 및 3' 비-번역 영역 662 bp가 생성되었다 (서열 17, 1504 bp). 코딩 영역은 792 bp 길이였고, 263개 아미노산 (서열 5)의 단백질을 코딩하였다. 서열 4는 유트레프티엘라 종 CCMP389 Δ9 일롱가제 (본원에서 E389D9e라고 지칭됨)의 코딩 서열의 뉴클레오티드 서열이다.
유트레프티엘라 종 CCMP389 ( E389D9e )의 Δ9 일롱가제 서열과 공지의 Δ 9 일롱가 제의 비교
서열 5 (즉, E389D9e)의 동일성은, BLAST "nr" 데이타베이스에 함유된 서열 (실시예 3)과의 유사성에 대하여 BLAST 검색을 수행하여 결정하였다. 서열 5가 최고의 유사성을 나타내는 서열을 요약한 BLAST 비교 결과를 동일성(％),유사성(％), 및 기대값으로 보고하였다. "동일성(％)"은 2종의 단백질 사이에서 동일한 아미노산의 백분율(％)로 정의된다. "유사성(％)"은 2종의 단백질 사이에서 동일하거나 보존된 아미노산의 백분율(％)로 정의된다. "기대값"은 해당 크기의 데이타베이스 검색시에 절대적으로 우연히 예상되는 매치 수를 주어진 스코어로 명시하며 매치의 통계적 유의성을 추정한다.
따라서, 본원에서 서열 5로 기재한 아미노산 단편은 이소크리시스 갈바나의 Δ9 일롱가제 (서열 8)인 IgD9e에 대해 38％ 동일성 및 56％ 유사성을 공유하며, 기대값은 2E-43이다. 유사하게, E389D9e는 클러스탈 브이 방법을 사용할 때 IgD9e에 33.1％ 동일하였고, E389D9e는 클러스탈 브이 방법을 사용할 때 EgD9e에 65.1％ 동일하였다 (도 2). 클러스탈 브이 방법 ([Higgins, D.G. and Sharp, P.M., Comput. Appl. Biosci., 5:151-153 (1989)], [Higgins et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)])으로 수행한 서열 동일성(％) 계산은 LASERGENE 바이오인포매틱스 컴퓨팅 수트의 메그얼라인™ v6.1 프로그램으로 수행하였고, 쌍별 정렬을 위한 디폴트 파라미터 (KTUPLE = 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5, DIAGONALS SAVED = 5 및 GAP LENGTH PENALTY = 10)를 사용하였다.
실시예 23: 야로위아 리폴리티카 균주 Y2224 중 야로위아 리폴리티카 발현 벡터 pFBAIN-389Elo ( 유트레프티엘라 종 CCMP389 Δ9 일롱가제 ( E389D9e )를 포함함)의 구축 및 기능적 분석
본 실시예는 야로위아 리폴리티카 발현 벡터 pFBAIN-389Elo (키메라 FBAINm::E389D9e::Pex20 유전자를 포함함)의 합성에 관해 기재한다. 이후, E389D9e의 델타-9 일롱가제 활성은 야로위아 리폴리티카 균주 Y2224에서 발현되었을 때 결정하였다.
야로위아 리폴리티카 발현 벡터 pFBAIN -389 Elo 의 구축
올리고뉴클레오티드 389Elo-F 및 389Elo-R1 (각각 서열 116 및 서열 117)을 E389D9e (서열 4)의 전장 cDNA를 증폭시키기 위한 프라이머로 사용하였다. 유트레프티엘라 종 CCMP389 cDNA (실시예 21)를 주형으로 사용한 PCR 반응은, 20 μM 전방향 및 역방향 프라이머 1 ㎕씩, cDNA 1 ㎕, 5× PCR 완충제 10 ㎕, dNTP 혼합물 (10 μM씩) 1 ㎕, 물 35 ㎕ 및 퓨젼(Phusion) 폴리머라제 (미국 매사추세츠주 이프스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인크.) 1 ㎕를 포함하는 총 부피 50 ㎕로 개별적으로 수행하였다. 증폭을 98℃에서 1분 동안 수행한 후에 98℃에서 10초, 55℃에서 10초, 및 72℃에서 30초의 30회 주기를 수행하였고, 이후에는 72℃에서 5분 동안의 최종 신장 주기를 수행하였다. PCR 생성물을 NcoI 및 EarI으로 소화시켜 Δ9 일롱가제 cDNA의 5' 영역을 함유하는 약 210 bp 단편을 생성하였다. 또한, 이것을 EarI 및 NotI으로 소화시켜 상기 cDNA의 3' 영역을 함유하는 약 600 bp 단편을 생성하였다. NcoI/EarI 및 EarI/NotI으로 소화시킨 단편들을 1％ (w/v) 아가로스 중에서의 겔 전기영동으로 정제하였다.
NcoI/EarI 및 EarI/NotI Δ9 일롱가제 소화 단편을 NcoI/NotI 소화된 pFBAIN-MOD-1 (서열 118)와 정해진 방향으로 라이게이션시켜셔, E389D9e 유전자가 야로위아 리폴리티카 FBAINm 프로모터 및 PEX20-3' 종결자 영역의 제어를 받도록 하였다. 구체적으로, 상기 라이게이션 반응물은 2× 라이게이션 완충제 10 ㎕, T4 DNA 리가제 (프로메가) 1 ㎕, 약 210 bp 및 약 600 bp의 단편 4 ㎕씩 (각각 약 300 ng씩), 및 pFBAIN-MOD-1 (약 150 ng) 1 ㎕를 함유하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이것을 이용하여 이. 콜라이 Top10 감응성 세포 (인비트로젠)를 형질전환시켰다. 퀴아젠 미니프렙 키트를 사용하여, 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 회수하였다. 제한 맵핑을 통해 올바른 클론을 확인하고, 최종 구축물을 "pFBAIN-389Elo"라고 지칭하였다.
따라서, pFBAIN-389Elo (도 15A, 서열 119)는 이에 따라 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pFBAIN -389 Elo (서열 119)의 성분
서열 119 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
BglII-BsiWI (6040-301) ·FBAINm: 야로위아 리폴리티카 FBAINm 프로모터 (PCT 공개 제WO 2005/049805호) ·E389D9e: 유트레프티엘라 종 CCMP389 Δ9 일롱가제 (본원에서 서열 4로 기재함) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자의 Pex20 종결자 서열 (진뱅크 관리 번호: AF054613) 을 포함하는 FBAINm::E389D9e::Pex20
PacI-BglII (4533-6040) 야로위아 Ura 3 유전자 (진뱅크 관리 번호: AJ306421)
(3123-4487) 야로위아 자율 복제 서열 (ARS18, 진뱅크 관리 번호: A17608)
(2464-2864) f1 기점
(1424-2284) 이. 콜라이에서의 선별을 위한 암피실린-내성 유전자 (AmpR)
(474-1354) ColE1 플라스미드 복제 기점
pFBAIN -389 Elo 를 포함하는 야로위아 리폴리티카 형질전환체의 기능적 분석
'일반적인 방법'에 기재한 바와 같이, pFBAIN-389Elo (E389D9e를 포함함)의 다섯 (5)개 개개의 클론 및 대조군 플라스미드 pFBAIN-MOD-1로 야로위아 리폴리티카 균주 Y2224 (실시예 7)를 형질전환시켰다. 세포를 우라실이 없는 MM 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2일 내지 3일 동안 유지시켰다. 이어서, 각 플레이트에서 세포를 긁어 내어 지질을 추출하고, 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 pFBAIN-389Elo를 포함하는 모든 5개의 형질전환체에서는 EDA가 생성되었지만, 대조군 균주에서는 EDA가 생성되지 않았음을 보여주었다 (표 13). 지방산은 18:2 (LA) 및 20:2 (EDA)로 표시하였고, 각각의 조성은 전체 지방산의 비율(％)로 표시하였다. 전환 효율은 ([생성물]/[기질 + 생성물])×100의 식에 따라 계산하였고, 여기서의 '생성물'은 그것이 유래된 경로 중의 중간 생성물 및 모든 생성물을 포함한다.
Figure 112008044342784-PCT00011
상기 나타낸 결과는 본원에서 서열 4 및 서열 5로 기재한, 유트레프티엘라 종 CCMP389로부터 유래된 클로닝된 cDNA가 LA를 EDA로 효율적으로 탈포화시키며, 따라서 Δ9 일롱가제로 기능한다는 것을 확인시켜 주었다.
실시예 24: 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 Δ9 일 롱가제 유전자 ( 유트레프티엘라 종 CCMP389 에서 유래함) ( E389D9eS )를 포함하는 야 로위아 리폴리티카 발현 벡터 pZUFE389S 의 구축 및 기능적 분석
본 실시예는 키메라 FBAIN::E389D9eS::Pex20 유전자를 포함하는 야로위아 리폴리티카 벡터 pZUFE389S의 기능적 발현에 관해 기재하며, 여기서의 E389D9eS는 유트레프티엘라 종 CCMP389에서 유래되고 야로위아 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 Δ9 일롱가제이다. 따라서, 본 분석에는 (1) E389D9eS의 합성, (2) pZUFE389S의 구축 및 야로위아 리폴리티카 균주 Y2224로의 형질전환, 및 (3) pZUFE389S (E389D9eS를 발현함)를 포함하는 야로위아 리폴리티카 균주 Y2224의 형질전환 유기체 내 지질 프로파일의 분석이 필요하다.
E389D9eS 의 합성
실시예 5, 실시예 8 및 PCT 공개 제WO 2004/101753호에 기재된 것과 유사한 방식으로, 유트레프티엘라 종 CCMP389의 Δ9 일롱가제 유전자 (E389D9e, 서열 4 및 서열 5)의 코돈 사용을 야로위아 리폴리티카 중에서의 발현을 위해 최적화시켰다. 구체적으로, E389D9e (서열 4)의 코딩 서열을 기초로 하여 야로위아 코돈 사용 패턴 (PCT 공개 제WO 2004/101753호), 'ATG' 번역 개시 코돈 주위의 컨센서스 서열, 및 RNA 안정성에 관한 일반적 규칙 [Guhaniyogi, G. and J. Brewer, Gene, 265(1-2):11-23 (2001)]에 따라 코돈-최적화 Δ9 일롱가제 유전자 ("E389D9eS"라 지칭함. 서열 6)를 디자인하였다. 번역 개시 부위의 변형에 추가하여, 792 bp 코딩 영역 (정지 코돈을 포함함) 중 128 bp (16.2％)를 변형시켰고, 113개 코돈을 최적화하였다. GC 함량은 야생형 유전자 (즉, E389D9e) 내에서는 45.7％이었던 것이 합성 유전자 (즉, E389D9eS) 내에서는 50.1％로 증가되었다. NcoI 부위 및 NotI 부위를 각각 E389D9eS의 번역 개시 코돈 주위 및 정지 코돈 뒤에 혼입하였다. 도 16은 E389D9e 및 E389D9eS의 뉴클레오티드 서열 비교를 보여준다. 코돈-최적화 유전자에서의 변형 중 그 어느 것도 코딩되는 단백질의 아미노산 서열 (서열 5)을 변화시키지 않았다.
E389D9eS로 지칭된 유전자 (서열 6)는 젠스크립트 코포레이션 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)이 합성하였고, pUC57 (진뱅크 관리 번호: Y14837)로 클로닝하여 pE389S (서열 120)를 생성하였다.
E389D9eS 를 포함하는 구축물 pZUFE389S 의 생성
pZUF17 (도 7C, 서열 121)의 NcoI/NotI 단편을 E389D9eS를 포함하는 pE389S (서열 120)의 NcoI/NotI 단편으로 대체하여, 플라스미드 pZUFE389S (도 15B, 서열 122)를 구축하였다. 상기 라이게이션의 생성물은 pZUFE389S이었고, 이에 따라 하기 성분을 함유하였다:
플라스미드 pZUFE389S (서열 122)의 성분
서열 122 내의 RE 부위 및 뉴클레오티드 단편 및 키메라 유전자 성분의 기재
EcoRI/BsiWI (6857-1112) ·FBAIN: 야로위아 리폴리티카 FBAIN 프로모터 (PCT 공개 제WO 2005/049805호) ·E389D9eS: 유트레프티엘라 종 CCMP389에서 유래된 코돈-최적화 Δ9 일롱가제 (서열 6) ·Pex20: 야로위아 Pex20 유전자의 Pex20 종결자 서열 (진뱅크 관리 번호: AF054613) 을 포함하는 FBAIN::E389D9eS::Pex20
2148-1268 ColE1 플라스미드 복제 기점
3078-2218 이. 콜라이에서의 선별을 위한 암피실린-내성 유전자 (AmpR)
3977-5281 야로위아 자율 복제 서열 (ARS18, 진뱅크 관리 번호: A17608)
6835-5324 야로위아 Ura 3 유전자 (진뱅크 관리 번호: AJ306421)
pZUFE389S 를 포함하는 야로위아 리폴리티카 형질전환체의 기능적 분석
'일반적인 방법'에 기재한 바와 같이, 플라스미드 pZUFE389S로 균주 Y2224 (야생형 야로위아 균주 ATCC #20362의 Ura3 유전자 자율 돌연변이로부터의 FOA 내성 돌연변이체, 실시예 7)를 형질전환시켰다. 형질전환체를 MM 플레이트에서 선별하였다. 30℃에서 2일 동안 성장시킨 후에 형질전환체를 골라내어 신선한 MM 플레이트에 재-스트리킹하였다. 일단 성장하면, 이들 균주를 액체 MM 3 mL로 30℃하에 개별적으로 접종하고, 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리로 수거하여 지질을 추출하고, 에스테르교환반응으로 지방산 메틸 에스테르를 제조한 후에 휴렛-팩커드 6890 GC로 분석하였다.
GC 분석은 모든 12개의 형질전환체에서 생성된 전체 지질 중에 C20:2 (EDA)가 약 2.2％로 존재함을 보여주었는데, 이들 12개의 균주에서 C18:2로부터 C20:2로의 전환 효율은 약 12％ (실시예 23에 기재한 바와 같이 계산한 평균값)인 것으로 결정되었다.
실시예 25: 유글레나 그라실리스 ( EgD9e 또는 EgD9eS ) 및/또는 유트레프티엘라 종 CCMP389 ( E389D9e 또는 E389D9eS ) Δ9 일롱가제의 발현을 위한 별법의 대두 발현 벡터의 구축
당업자는 상기한 실시예가 예시를 위한 것이지 제한되는 것이 아님을 이해할 것이다. 예를 들어, 상기 실시예 10, 실시예 11 및 실시예 13 내지 실시예 15에서 EgD9e의 발현을 위해 생성된 임의의 대두 발현 벡터는 본원에 기재한 방법과 유사하지만 이에 제한되는 것은 아닌 방법을 이용하여 EgD9eS, E389D9e 및/또는 E389D9eS의 발현 (또는 동시발현)이 대신 가능하도록 쉽게 변형될 수 있다. Δ9 일롱가제의 5' 및 3' 말단에 NotI 부위를 도입하도록 디자인된 PCR 프라이머를 사용하여 유전자를 증폭시킬 수 있다. 이어서, 이로써 생성된 PCR 생성물을 NotI으로 소화시킬 수 있고, 강력한 종자-특이적 프로모터와 전사 종결자에 의해 플랭킹된 NotI 부위를 함유하는 적합한 대두 발현 벡터에 클로닝시킬 수 있다. 본원에 기재되거나 PCT 공개 제WO 2004/071467호 또는 동 제WO 2005/047479호 (그러나, 이들 문헌에 제한되지는 않음)에 기재된 것과 같은 다른 벡터로의 추가의 서브클로닝은 대두 중 Δ9 일롱가제의 발현에 적합한 벡터를 생성할 것이다.
추가로, 본원에 기재한 유전자, 프로모터, 종결자 및 유전자 카세트에 추가하여, 당업자라면 EgD9e, EgD9eS, E389D9e 및/또는 E389D9eS의 발현을 위한 다른 프로모터/유전자/종결자 카세트 조합물이 본원에 기재한 것과 유사하지만 그에 제한되지는 않는 방법으로 합성될 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 임의의 Δ9 일롱가제와의 동시발현을 위한 다른 PUFA 유전자 (예컨대 하기 표 17에 기재한 것)를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다.
예를 들어, PCT 공개 제WO 2004/071467호 및 동 제WO 2004/071178호는 대두에서의 배아-특이적 발현에 사용하기 위한 수많은 프로모터 및 전사 종결자 서열의 단리에 관해 기재한다. 추가로, PCT 공개 제WO 2004/071467호, 동 제WO 2005/047479호 및 동 제WO 2006/012325호는 개개의 프로모터, 유전자 및 전사 종결자를 독특한 조합으로 한데 라이게이션시켜서 다중 프로모터/유전자/종결자 카세트 조합물을 합성하는 것에 관해 기재한다. 일반적으로, 적합한 프로모터 (예컨대 하기 표 15에 기재한 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않음)와 전사 종결자 (예컨대 하기 표 16에 기재한 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않음)에 의해 플랭킹된 NotI 부위를 사용하여 원하는 유전자를 클로닝한다. NotI 부위는, 하기 표 17에 기재한 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 것과 같은 관심 유전자에, 상기 유전자의 5' 및 3' 말단에 NotI 부위를 도입하도록 디자인된 올리고뉴클레오티드를 사용한 PCR 증폭을 이용하여 부가될 수 있다. 이어서, 이로써 생성된 PCR 생성물을 NotI으로 소화시켜서 적합한 프로모터/NotI/종결자 카세트로 클로닝한다.
추가로, PCT 공개 제WO 2004/071467호, 동 제WO 2005/047479호 및 동 제WO 2006/012325호는 개개의 유전자 카세트를 독특한 조합으로 (적합한 선별가능한 마커 카세트와 함께) 추가로 연결시켜서 원하는 표현형의 발현을 달성하는 것에 관해 기재한다. 이것은 주로 여러가지 제한 효소 부위를 이용하여 수행되지만, 당업자라면 원하는 프로모터/유전자/전사 종결자 조합을 달성하기 위해 수많은 기술이 이용될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 같이 하여 임의의 조합의 배아-특이적 프로모터/유전자/전사 종결자 카세트가 달성될 수 있다. 당업자는 또한 이러한 카세트가 개개의 DNA 단편 또는 여러 단편에 위치할 수 있어서 유전자들의 동시 발현이 여러 DNA 단편들의 동시-형질전환 결과인 것을 이해할 수 있다.
종자-특이적 프로모터
프로모터 유기체 프로모터 참조문헌
베타-콘글리시닌 α'-서브유닛 대두 [Beachy et al., EMBO J., 4:3047-3053 (1985)]
쿠니츠 트립신 억제제 대두 [Jofuku et al., Plant Cell, 1:1079-1093 (1989)]
안넥신 대두 WO 2004/071467
글리시닌 Gy1 대두 WO 2004/071467
알부민 2S 대두 미국 특허 제6,177,613호
레구민 A1 완두 [Rerie et al., Mol. Gen. Genet., 225:148-157 (1991)]
β-콘글리시닌 β-서브유닛 대두 WO 2004/071467
BD30 (또한 P34라고도 불림) 대두 WO 2004/071467
레구민 A2 완두 [Rerie et al., Mol. Gen. Genet., 225:148-157 (1991)]
전사 종결자
전사 종결자 유기체 참조문헌
파세올린 3' 강낭콩 WO 2004/071467
쿠니츠 트립신 억제제 3' 대두 WO 2004/071467
BD30 (또한 P34라고도 불림) 3' 대두 WO 2004/071467
레구민 A2 3' 완두 WO 2004/071467
알부민 2S 3' 대두 WO 2004/071467
PUFA 생합성 경로 유전자
유전자 유기체 참조문헌
Δ6 데새투라제 사프롤레그니아 디클리나 WO 2002/081668
Δ6 데새투라제 모르티에렐라 알피나 미국 특허 제5,968,809호
일롱가제 모르티에렐라 알피나 WO 2000/12720, 미국 특허 제6,403,349호
Δ5 데새투라제 모르티에렐라 알피나 미국 특허 제6,075,183호
Δ5 데새투라제 사프롤레그니아 디클리나 WO 2002/081668
Δ15 데새투라제 푸사리움 모닐리포르메 WO 2005/047479
Δ17 데새투라제 사프롤레그니아 디클리나 WO 2002/081668
일롱가제 트라우스토키트리움 아우레움 WO 2002/08401, 미국 특허 제6,677,145호
일롱가제 파블로바 종 [Pereira et al., Biochem. J., 384:357-366 (2004)]
Δ4 데새투라제 쉬조키트리움 아그레가툼 WO 2002/090493
Δ9 일롱가제 이소크리시스 갈바나 WO 2002/077213
Δ8 데새투라제 유글레나 그라실리스 WO 2000/34439, 미국 특허 제6,825,017호, WO 2004/057001, WO 2006/012325
Δ8 데새투라제 아칸트아메바 카스텔라니이 [Sayanova et al., FEBS Lett., 580:1946-1952 (2006)]
Δ8 데새투라제 파블로바 살리나 WO 2005/103253
Δ8 데새투라제 파블로바 루테리 미국 가출원 제60/795810호
Δ8 데새투라제 테트루에트레프티아 폼퀘텐시스 CCMP1491 미국 가출원 제60/853563호
Δ8 데새투라제 유트레프티엘라 종 CCMP389 미국 가출원 제60/853563호
Δ8 데새투라제 유트레프티엘라 짐나스티카 CCMP1594 미국 가출원 제60/853563호
실시예 26: 체세포 대두 배아 배양물의 형질전환
배양 조건:
대두 배아 현탁 배양물 (cv. Jack)은 150 rpm하의 26℃ 회전 진탕기상의 액체 배지 SB196 (하기 제조 방법 참조) 35 mL 중에서 60 내지 85 μE/m2/s의 빛의 강도로 16시간:8시간 낮/밤 광주기의 백색(cool white) 형광등을 이용하여 유지시킬 수 있다. 7일 내지 2주 마다 대략 35 mg의 조직을 신선한 액체 SB196 35 mL에 접종하여 배양물을 계대 배양하였다 (바람직한 계대 배양 간격은 7일마다임).
대두 배아 현탁 배양물을 입자 건 충격법(particle gun bombardment)을 이용하여 앞서 기재한 플라스미드 및 DNA 단편으로 형질전환시킬 수 있다 ([Klein et al., Nature (London), 327:70-73 (1987)], 미국 특허 제4,945,050호). 듀폰(DuPont) 바이올리스틱(Biolistic)™ PDS1000/HE 기기 (헬륨 장비)를 모든 형질전환에 사용하였다.
대두 배아 현탁 배양의 개시:
대두 배양을 매달 2회씩 개시하면서 각 개시일 사이에는 5일 내지 7일의 간격을 두었다. 입수가능한 대두 식물을 심은 후 45일 내지 55일이 지난 후에 상기 식물의 미성숙 종자가 들어 있는 꼬투리를 골라 껍질을 벗기고 멸균된 마젠타 상자에 넣었다. 대두 종자를 15분 동안 1 방울의 아이보리 비누를 함유하는 5％ 클로락스(Clorox) 용액 (즉, 오토클레이브된 증류수 95 mL + 클로락스 5 mL 및 1 방울의 비누를 잘 혼합함) 중에서 진탕시켜서 이 종자를 멸균시켰다. 이들 종자를 멸균 증류수 1-리터 병 2개로 헹구고, 4 mm 미만의 것들을 개개의 현미경 슬라이드에 두었다. 종자의 끝 약간을 잘라내어 떡잎을 종자 껍질 밖으로 당겨 냈다. 떡잎을 SB1 배지를 함유하는 플레이트로 옮겼다 (플레이트 1개 당 25개 내지 30개의 떡잎). 플레이트를 섬유 테이프로 싸서 8주 동안 저장하였다. 이 시간이 지난 후에, 2차 배아를 잘라내어 SB196 액체 배지에 7일 동안 두었다.
충격법을 위한 DNA 의 제조:
관심 유전자 및 선별가능한 마커 유전자를 함유하는 무손상 플라스미드 또는 DNA 플라스미드 단편을 충격법에 사용할 수 있다. pKR274 (ATCC 관리 번호: PTA-4988), pKR685 (ATCC 관리 번호: PTA-6047) 또는 pKR681 (ATCC 관리 번호: PTA-6046)과 같은 플라스미드 및/또는 다른 발현 플라스미드의 단편은 소화된 플라스미드의 겔 단리로 수득할 수 있다. 각 경우에, 플라스미드 DNA 100 ㎍을 하기하는 특정 효소 혼합물 0.5 mL 중에서 사용할 수 있다. 플라스미드는 NEBuffer 4 (20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 아세트산마그네슘, 50 mM 아세트산칼륨, 1 mM 디티오트레이톨, pH 7.9), 100 ㎍/mL BSA, 및 5 mM 베타-메르캅토에탄올 중 37℃에서 1.5시간 동안 AscI (100 유닛)으로 소화시킬 수 있다. 이로써 생성된 DNA 단편은 1％ SeaPlaque® GTG 아가로스 (바이오휘태커 모레큘라 어플리케이션즈(BioWhitaker Molecular Applications))에서의 겔 전기영동으로 분리할 수 있었고, PUFA 생합성 유전자를 함유하는 DNA 단편은 아가로스 겔에서 잘라낼 수 있다. GELase® 소화 효소를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여, 아가로스에서 DNA를 정제할 수 있다. 별법으로, 온전한 플라스미드, 또는 온전한 플라스미드와 단편의 조합물을 사용할 수 있다.
금 입자 3 mg (금 3 mg)을 함유하는 멸균 증류수 50 ㎕ 분취액을 1 ㎍/㎕ DNA 용액 (무손상 플라스미드 또는 DNA 단편 (상기한 바와 같이 제조함)) 5 ㎕, 2.5 M CaCl2 50 ㎕ 및 0.1 M 스페르미딘 20 ㎕에 첨가할 수 있다. 상기 혼합물을 볼텍스 진탕기의 레벨 3에서 3분 동안 진탕시키고, 벤치(bench) 마이크로원심분리로 10초 동안 회전시켰다. 100％ 에탄올 400 ㎕로 세척한 후, 펠렛을 100％ 에탄올 40 ㎕ 중에서의 초음파 처리로 현탁시켰다. DNA 현탁액 5 ㎕를 바이올리스틱 PDS1000/HE 기기 디스크의 플라잉 디스크(flying disk) 각각에 분배하였다. 각각의 5 ㎕ 분취액은 충격기 (예컨대, 디스크) 당 대략 0.375 mg의 금을 함유하였다.
조직 제조 및 DNA 를 사용한 충격:
7일 동안의 배아 현탁 배양물 대략 150 mg 내지 200 mg을 비어있는 멸균 60×15 mm 페트리 접시에 놓고, 상기 접시를 플라스틱 메쉬로 덮었다. 1100 PSI로 설정한 막 파열 압력을 이용하여 플레이트 1개 당 1샷 또는 2샷으로 조직에 충격을 가하고, 챔버를 27 인치 내지 28 인치 수은의 진공으로 배기시켰다. 조직을 보유/정지 스크린에서 대략 3.5 인치 떨어뜨려 두었다.
형질전환된 배아의 선별:
형질전환된 배아는 하이그로마이신 (즉, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 (HPT) 유전자를 선별가능한 마커로 사용하는 경우) 또는 클로르술푸론 (즉, 아세토락테이트 신타제 (ALS) 유전자를 선별가능한 마커로 사용하는 경우)를 사용하여 선별하였다.
하이그로마이신 ( HPT ) 선별:
충격 후, 상기 조직을 신선한 SB196 배지에 넣어 상기한 바와 같이 배양하였다. 충격 후 6일이 지난 후에는 SB196을 30 mg/L 하이그로마이신 선별제를 함유하는 신선한 SB196으로 교체하였다. 선별 배지는 매주 교체해 주었다. 선별 후 4주 내지 6주가 지난 후에는, 형질전환되지 않은 괴사성 배아 클러스터로부터 성장하는 녹색의 형질전환된 조직을 관찰할 수 있었다. 단리된 녹색 조직을 꺼내어 다중 웰 플레이트로 접종하여, 새롭게 클론성 증식하는 형질전환된 배아 현탁 배양물을 생성하였다.
클로르술푸론 ( ALS ) 선별:
충격 후, 상기 조직을 신선한 SB196 배지를 함유하는 2개의 플라스크에 나눠 넣어 상기한 바와 같이 배양하였다. 충격 후 6일 내지 7일이 지난 후에는 SB196을 100 ng/mL 클로르술푸론 선별제를 함유하는 신선한 SB196으로 교체하였다. 선별 배지는 매주 교체해 주었다. 선별 후 4주 내지 6주가 지난 후에는, 형질전환되지 않은 괴사성 배아 클러스터로부터 성장하는 녹색의 형질전환된 조직을 관찰할 수 있었다. 단리된 녹색 조직을 꺼내어 SB196을 함유하는 다중 웰 플레이트로 접종하여, 새롭게 클론성 증식하는 형질전환된 배아 현탁 배양물을 생성하였다.
대두 체세포 배아의 식물로의 재생:
배아 현탁 배양물로부터 온전한 식물을 수득하기 위해서는, 조직을 재생시킬 필요가 있다.
배아 성숙:
생성된 형질전환체로부터의 형질전환된 배아 클러스터를 26℃에서 SB196 중에 상기한 바와 같은 다중웰 플레이트에서 90 내지 120 μE/m2s의 빛의 강도로 16시간:8시간 광주기의 백색 형광등 (필립스 백색 에코노와트(Phillips cool white Econowatt) F40/CW/RS/EW) 및 아그로(Agro) (필립스 F40 아그로) 전구 (40 와트)를 이용하여 4주 내지 6주 (모델 시스템의 경우에는 1주 내지 3주) 동안 배양하였다. 이 시간이 지난 후에, 배아 클러스터를 꺼내어 고체 한천 배지 SB166에 1주 내지 2주 (모델 시스템의 경우에는 1주) 동안 두었다가 3주 내지 4주 동안 SB103 배지로 계대 배양하여 성숙 배아가 되도록 하였다. 플레이트에서 SB103 중에서 성숙시킨 후, 상기 클러스터에서 개개의 배아를 꺼내어 건조시키고, 상기한 바와 같이 이들의 지방산 조성에 있어서의 변경에 대하여 스크리닝하였다. 원한다면, 하기하는 몇가지 사건에서 식물을 얻었다.
별법으로, 일부의 모델 시스템 실험에서는 변형된 절차를 이용하여 대두 조직분화 및 성숙 액체 배지 (SHaM 액체 배지, [Schmidt et al., Cell Biology and Morphogenesis 24:393 (2005)]) 중에서 배아를 성숙시켰다. 간략하게 설명하면, 상기한 바와 같이 SB196 중에서 4주 동안 선별한 후에, 배아 클러스터를 꺼내어 250 mL 에를렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크 중 SB228 (SHaM 액체 배지) 35 mL로 옮겼다. 조직은 130 rpm하의 26℃ 회전 진탕기상의 SHaM 액체 배지 중에서 60 내지 85 μE/m2/s의 빛의 강도로 16시간:8시간 낮/밤 광주기의 백색 형광등을 이용하여 배아가 성숙 됨에 따라 2주 내지 3주 동안 유지시켰다. SHaM 액체 배지 중에서 2주 내지 3주 동안 성장한 배아는 크기 및 지방산 함량이 SB166/SB103에서 5주 내지 8주 동안 배양한 배아와 동등하였다.
SHaM 액체 배지 중에서의 성숙 후에, 클러스터로부터 개개의 배아를 꺼내어 건조시키고, 상기한 바와 같이 이들의 지방산 조성에 있어서의 변경에 대하여 스크리닝하였다. 원한다면, 하기하는 몇가지 사건에서 식물을 얻었다.
배아 건조 및 발아:
성숙된 개개의 배아를 비어 있는 작은 페트리 접시 (35×10 mm)에 대략 4일 내지 7일 동안 두어 건조시킬 수 있었다. 상기 플레이트를 섬유 테이프로 밀봉하였다 (작은 습윤 챔버 생성). 건조시킨 배아를 SB71-4 배지에 심을 수 있고, 여기서 이것들을 상기한 것과 동일한 배양 조건하에 발아되도록 하였다. 발아된 묘목을 발아 배지에서 꺼내어 물로 철저하게 헹군후에 24셀 팩 트레이 중의 레디-어쓰(Redi-Earth)로 심고 투명한 플라스틱 돔으로 덮었다. 2주 후에는 상기 돔을 치우고, 추가의 1주 동안 식물이 튼튼해지게 하였다. 묘목이 튼튼해 보이면, 이것들을 10 인치 포트의 레디-어쓰에 포트 1개 당 최대 3개의 묘목으로 심었다. 10주 내지 16주 후에는 성숙 종자를 수확하여 잘라내고 상기한 바와 같이 지방산에 대해 분석할 수 있었다.
배지 제조 방법 :
SB 196- FN 라이트( Lite ) 액체 증식 배지 (1 L 당)
MS FeEDTA - 100× 스톡 1 10 mL
MS 술페이트 - 100× 스톡 2 10 mL
FN 라이트 할라이드 - 100× 스톡 3 10 mL
FN 라이트 P, B, Mo - 100× 스톡 4 10 mL
B5 비타민 (1 mL/L) 1.0 mL
2,4-D (최종 농도: 10 mg/L) 1.0 mL
KNO3 2.83 g
(NH4)2SO4 0.463 g
아스파라진 1.0 g
수크로스 (1％) 10 g
pH 5.8
FN 라이트 스톡 용액
스톡 번호 1000 mL 500 mL
1- MS Fe EDTA 100× 스톡
Na2 EDTA* 3.724 g 1.862 g
FeSO4 - 7H2O 2.784 g 1.392 g
*먼저 첨가하여 어두운 병에서 교반하며 용해시킴.
2- MS 술페이트 100× 스톡
MgSO4 - 7H2O 37.0 g 18.5 g
MnSO4 - H2O 1.69 g 0.845 g
ZnSO4 - 7H2O 0.86 g 0.43 g
CuSO4 - 5H2O 0.0025 g 0.00125 g
3- FN 라이트 할라이드 100× 스톡
CaCl2 - 2H2O 30.0 g 15.0 g
KI 0.083 g 0.0715 g
CoCl2 - 6H2O 0.0025 g 0.00125 g
4- FN 라이트 P, B, Mo 100× 스톡
KH2PO4 18.5 g 9.25 g
H3BO3 0.62 g 0.31 g
Na2MoO4 - 2H2O 0.025 g 0.0125 g
SB1 고체 배지 (1 L 당) : MS 염 (깁코/BRL - 카탈로그 번호: 11117-066) 1 패키지, 1000× 스톡 B5 비타민 1 mL, 수크로스 31.5 g, 2,4-D (최종 농도: 20 mg/L) 2 mL, pH 5.7, TC 한천 8 g
SB 166 고체 배지 (1 L 당) : MS 염 (깁코/BRL - 카탈로그 번호: 11117-066) 1 패키지, 1000× 스톡 B5 비타민 1 mL, 말토스 60 g, MgCl2 6수화물 750 mg, 활성 목탄 5 g, pH 5.7, 겔라이트 2 g
SB 103 고체 배지 (1 L 당) : MS 염 (깁코/BRL - 카탈로그 번호: 11117-066) 1 패키지, 1000× 스톡 B5 비타민 1 mL, 말토스 60 g, MgCl2 6수화물 750 mg, pH 5.7, 겔라이트 2 g
SB 71-4 고체 배지 (1 L 당) : 수크로스를 함유하는 감보르그(Gamborg's) B5 염 (깁코/BRL - 카탈로그 번호: 21153-036) 1병, pH 5.7, TC 한천 5 g
2,4-D 스톡 : 피토테크(Phytotech) 카탈로그 번호: D 295로부터 미리 제조하여 얻음 - 농도: 1 mg/mL
B5 비타민 스톡 (100 mL 당) : myo-이노시톨 10 g, 니코틴산 100 mg, 피리독신 HCl 100 mg, 티아민 1 g. 분취액은 -20℃에 저장. 상기 용액이 충분히 신속하게 용해되지 않는 경우에는 핫 교반 플레이트를 사용하여 낮은 수준의 열을 가함
클로르술푸론 스톡 : 0.01 N 수산화암모늄 중 1 mg/mL
체세포 배아를 유도하기 위해서, 표면 멸균된 미성숙 대두 종자 품종 A2872로부터 3 mm 내지 5 mm 길이로 절단한 떡잎을 26℃하에 적절한 한천 배지상에서 밝은 곳 또는 어두운 곳에서 6주 내지 10주 동안 배양할 수 있었다. 이어서, 2차 배아를 생성한 체세포 배아를 잘라 내어 적합한 액체 배지에 넣었다. 초기 구형상 단계의 배아로 증식된 체세포 배아 클러스터를 반복적으로 선별한 후, 상기 현탁액을 하기와 같이 유지시켰다.
대두 배아 현탁 배양물은 150 rpm하의 26℃ 회전 진탕기상의 액체 배지 35 mL 중에서 16시간:8시간 낮/밤 스케쥴의 형광등을 이용하여 유지시킬 수 있었다. 2주 마다 대략 35 mg의 조직을 액체 배지 35 mL에 접종하여 배양물을 계대 배양하였다.
이어서, 대두 배아 현탁 배양물을 입자 건 충격법 ([Klein et al., Nature (London), 327:70-73], 미국 특허 제4,945,050호)으로 형질전환시킬 수 있었다. 듀폰 바이올리스틱™ PDS1000/HE 기기 (헬륨 장비)를 이러한 형질전환에 사용할 수 있었다.
대두 형질전환을 용이하게 하는데 사용될 수 있는 선별가능한 마커 유전자는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 [Odell et al., Nature, 313:810-812 (1985)], 플라스미드 pJR225의 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자 (이. 콜라이에서 유래. [Gritz et al., Gene, 25:179-188 (1983)]) 및 아그로박테리움 투메파시엔스 Ti 플라스미드의 T-DNA 유래의 노팔린 신타제 유전자 3' 영역으로 구성된 재조합 DNA 구축물이다. 파세올린 5' 영역, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 단편 및 파세올린 3' 영역을 포함하는 종자 발현 카세트를 제한 단편으로 단리할 수 있었다. 이어서, 상기 단편을 마커 유전자를 보유하는 벡터의 독특한 제한 부위에 삽입할 수 있었다.
60 mg/mL의 1 ㎛ 금 입자 현탁액 50 ㎕에 DNA (1 ㎍/㎕) 5 ㎕, 스페르미딘 (0.1 M) 20 ㎕, 및 CaCl2 (2.5 M) 50 ㎕를 (순서대로) 첨가하였다. 이어서, 상기 입자 제제를 3분 동안 교반하고 마이크로원심분리로 10초 동안 회전시키고, 상등액을 제거하였다. 이어서, DNA-코팅된 입자를 70％ 에탄올 400 ㎕ 중에서 1회 세척하고, 무수 에탄올 40 ㎕ 중에 재현탁시켰다. DNA/입자 현탁액은 1초씩 3회 초음파처리할 수 있다. 이어서, DNA-코팅된 금 입자 5 ㎕를 각각의 마그코 캐리어 디스크에 로딩하였다.
2주간의 현탁 배양물 대략 300 mg 내지 400 mg을 비어 있는 60×15 mm 페트리 접시에 넣고, 피펫을 사용하여 잔류 액체를 조직으로부터 제거하였다. 각 형질전환 실험마다, 대략 5개 내지 10개 플레이트의 조직에 통상적으로 충격을 가하였다. 막 파열 압력은 1100 psi로 설정하였고, 챔버는 28 인치 수은의 진공으로 배기시켰다. 조직을 남아있는 스크린에서 대략 3.5 인치 떨어뜨려 두고 3회 충격을 가하였다. 충격 후, 상기 조직을 절반으로 나누어 다시 액체에 넣고 상기한 바와 같이 배양할 수 있다.
충격 후 5일 내지 7일이 지난 후에는 액체 배지를 신선한 배지로 교체할 수 있고, 충격 후 11일 내지 12일이 지난 후에는 50 mg/mL 하이그로마이신을 함유하는 신선한 배지로 교체할 수 있다. 이러한 선별 배지는 매주 교체할 수 있다. 충격후 7주 내지 8주가 지난 후에는, 형질전환되지 않은 괴사성 배아 클러스터로부터 성장하는 녹색의 형질전환된 조직을 관찰할 수 있었다. 단리된 녹색 조직을 꺼내어 개개의 플라스크에 접종하여, 새롭게 클론성 증식하는 형질전환된 배아 현탁 배양물을 생성하였다. 각각의 새로운 것을 독립적인 형질전환 사건으로 처리할 수 있다. 이어서, 이들 현탁액을 계대 배양하고 미성숙 배아의 클러스터로 유지하거나 개개의 체세포 배아의 성숙 및 발아에 의해 온전한 식물로 재생시킬 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> E.I. duPont de Nemours and Company, Inc. <120> DELTA-9 ELONGASES AND THEIR USE IN MAKING POLYUNSATURATED FATTY ACIDS <130> CL3600 PCT <150> US 60/739989 <151> 2005-11-23 <160> 129 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 777 <212> DNA <213> Euglena gracilis <400> 1 atggaggtgg tgaatgaaat agtctcaatt gggcaggaag ttttacccaa agttgattat 60 gcccaactct ggagtgatgc cagtcactgt gaggtgcttt acttgtccat cgcatttgtc 120 atcttgaagt tcactcttgg cccccttggt ccaaaaggtc agtctcgtat gaagtttgtt 180 ttcaccaatt acaaccttct catgtccatt tattcgttgg gatcattcct ctcaatggca 240 tatgccatgt acaccatcgg tgttatgtct gacaactgcg agaaggcttt tgacaacaac 300 gtcttcagga tcaccacgca gttgttctat ttgagcaagt tcctggagta tattgactcc 360 ttctatttgc cactgatggg caagcctctg acctggttgc aattcttcca tcatttgggg 420 gcaccgatgg atatgtggct gttctataat taccgaaatg aagctgtttg gatttttgtg 480 ctgttgaatg gtttcatcca ctggatcatg tacggttatt attggaccag attgatcaag 540 ctgaagttcc ccatgccaaa atccctgatt acatcaatgc agatcattca attcaatgtt 600 ggtttctaca ttgtctggaa gtacaggaac attccctgtt atcgccaaga tgggatgagg 660 atgtttggct ggttcttcaa ttacttttat gttggcacag tcttgtgttt gttcttgaat 720 ttctatgtgc aaacgtatat cgtcaggaag cacaagggag ccaaaaagat tcagtga 777 <210> 2 <211> 258 <212> PRT <213> Euglena gracilis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(258) <223> delta-9 elongase (EgD9e) <400> 2 Met Glu Val Val Asn Glu Ile Val Ser Ile Gly Gln Glu Val Leu Pro 1 5 10 15 Lys Val Asp Tyr Ala Gln Leu Trp Ser Asp Ala Ser His Cys Glu Val 20 25 30 Leu Tyr Leu Ser Ile Ala Phe Val Ile Leu Lys Phe Thr Leu Gly Pro 35 40 45 Leu Gly Pro Lys Gly Gln Ser Arg Met Lys Phe Val Phe Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Leu Leu Met Ser Ile Tyr Ser Leu Gly Ser Phe Leu Ser Met Ala 65 70 75 80 Tyr Ala Met Tyr Thr Ile Gly Val Met Ser Asp Asn Cys Glu Lys Ala 85 90 95 Phe Asp Asn Asn Val Phe Arg Ile Thr Thr Gln Leu Phe Tyr Leu Ser 100 105 110 Lys Phe Leu Glu Tyr Ile Asp Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Met Gly Lys 115 120 125 Pro Leu Thr Trp Leu Gln Phe Phe His His Leu Gly Ala Pro Met Asp 130 135 140 Met Trp Leu Phe Tyr Asn Tyr Arg Asn Glu Ala Val Trp Ile Phe Val 145 150 155 160 Leu Leu Asn Gly Phe Ile His Trp Ile Met Tyr Gly Tyr Tyr Trp Thr 165 170 175 Arg Leu Ile Lys Leu Lys Phe Pro Met Pro Lys Ser Leu Ile Thr Ser 180 185 190 Met Gln Ile Ile Gln Phe Asn Val Gly Phe Tyr Ile Val Trp Lys Tyr 195 200 205 Arg Asn Ile Pro Cys Tyr Arg Gln Asp Gly Met Arg Met Phe Gly Trp 210 215 220 Phe Phe Asn Tyr Phe Tyr Val Gly Thr Val Leu Cys Leu Phe Leu Asn 225 230 235 240 Phe Tyr Val Gln Thr Tyr Ile Val Arg Lys His Lys Gly Ala Lys Lys 245 250 255 Ile Gln <210> 3 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EgD9eS: synthetic delta-9 elongase derived from Euglena gracilis and codon-optimized for expression in Yarrowia lipolytica <400> 3 atggaggtcg tgaacgaaat cgtctccatt ggccaggagg ttcttcccaa ggtcgactat 60 gctcagctct ggtctgatgc ctcgcactgc gaggtgctgt acctctccat cgccttcgtc 120 atcctgaagt tcacccttgg tcctctcgga cccaagggtc agtctcgaat gaagtttgtg 180 ttcaccaact acaacctgct catgtccatc tactcgctgg gctccttcct ctctatggcc 240 tacgccatgt acaccattgg tgtcatgtcc gacaactgcg agaaggcttt cgacaacaat 300 gtcttccgaa tcaccactca gctgttctac ctcagcaagt tcctcgagta cattgactcc 360 ttctatctgc ccctcatggg caagcctctg acctggttgc agttctttca ccatctcgga 420 gctcctatgg acatgtggct gttctacaac taccgaaacg aagccgtttg gatctttgtg 480 ctgctcaacg gcttcattca ctggatcatg tacggctact attggacccg actgatcaag 540 ctcaagttcc ctatgcccaa gtccctgatt acttctatgc agatcattca gttcaacgtt 600 ggcttctaca tcgtctggaa gtaccggaac attccctgct accgacaaga tggaatgaga 660 atgtttggct ggtttttcaa ctacttctac gttggtactg tcctgtgtct gttcctcaac 720 ttctacgtgc agacctacat cgtccgaaag cacaagggag ccaaaaagat tcagtga 777 <210> 4 <211> 792 <212> DNA <213> Eutreptiella sp. CCMP389 <400> 4 atggctgcgg tgatagaggt cgccaacgag tttgtagcca tcacggcaga aacgctcccc 60 aaagttgact atcaacgact atggcgagac atttacagtt gtgagctact gtatttctcc 120 attgccttcg tgatcttgaa gtttacgttg ggcgagttga gcgacagcgg aaaaaagatt 180 ttgagagtgt tgttcaagtg gtacaatctc ttcatgtccg tgttctcctt ggtgtctttc 240 ctttgcatgg gctatgccat ttataccgtg ggcctatact ctaacgaatg cgacagggct 300 ttcgacaact cgttgttccg ctttgcaaca aaggtgttct actacagtaa gtttttggag 360 tacatcgact ctttttatct tccgctcatg gccaagccgc tgtctttcct gcaattcttc 420 catcacttgg gagcccccat ggacatgtgg ctctttgtcc aatattctgg ggaatctatt 480 tggatctttg tgtttttgaa tgggttcatt cactttgtta tgtacgggta ctactggact 540 cggctgatga agttcaattt cccaatgccc aagcagttga ttaccgcgat gcagatcacg 600 cagttcaacg ttggtttcta cctcgtgtgg tggtacaaag atattccctg ctaccgaaag 660 gatcccatgc gaatgttggc ctggatcttc aattactggt atgttgggac tgtcttgctg 720 ctgttcatta atttcttcgt caaatcctat gtgttcccaa agccgaagac tgcagataaa 780 aaggtccaat ag 792 <210> 5 <211> 263 <212> PRT <213> Eutreptiella sp. CCMP389 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(263) <223> delta-9 elongase (E389D9e) <400> 5 Met Ala Ala Val Ile Glu Val Ala Asn Glu Phe Val Ala Ile Thr Ala 1 5 10 15 Glu Thr Leu Pro Lys Val Asp Tyr Gln Arg Leu Trp Arg Asp Ile Tyr 20 25 30 Ser Cys Glu Leu Leu Tyr Phe Ser Ile Ala Phe Val Ile Leu Lys Phe 35 40 45 Thr Leu Gly Glu Leu Ser Asp Ser Gly Lys Lys Ile Leu Arg Val Leu 50 55 60 Phe Lys Trp Tyr Asn Leu Phe Met Ser Val Phe Ser Leu Val Ser Phe 65 70 75 80 Leu Cys Met Gly Tyr Ala Ile Tyr Thr Val Gly Leu Tyr Ser Asn Glu 85 90 95 Cys Asp Arg Ala Phe Asp Asn Ser Leu Phe Arg Phe Ala Thr Lys Val 100 105 110 Phe Tyr Tyr Ser Lys Phe Leu Glu Tyr Ile Asp Ser Phe Tyr Leu Pro 115 120 125 Leu Met Ala Lys Pro Leu Ser Phe Leu Gln Phe Phe His His Leu Gly 130 135 140 Ala Pro Met Asp Met Trp Leu Phe Val Gln Tyr Ser Gly Glu Ser Ile 145 150 155 160 Trp Ile Phe Val Phe Leu Asn Gly Phe Ile His Phe Val Met Tyr Gly 165 170 175 Tyr Tyr Trp Thr Arg Leu Met Lys Phe Asn Phe Pro Met Pro Lys Gln 180 185 190 Leu Ile Thr Ala Met Gln Ile Thr Gln Phe Asn Val Gly Phe Tyr Leu 195 200 205 Val Trp Trp Tyr Lys Asp Ile Pro Cys Tyr Arg Lys Asp Pro Met Arg 210 215 220 Met Leu Ala Trp Ile Phe Asn Tyr Trp Tyr Val Gly Thr Val Leu Leu 225 230 235 240 Leu Phe Ile Asn Phe Phe Val Lys Ser Tyr Val Phe Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Thr Ala Asp Lys Lys Val Gln 260 <210> 6 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E389D9eS: synthetic delta-9 elongase derived from Eutreptiella sp. CCMP389 and codon-optimized for expression in Yarrowia lipolytica <400> 6 atggctgccg tcatcgaggt ggccaacgag ttcgtcgcta tcactgccga gacccttccc 60 aaggtggact atcagcgact ctggcgagac atctactcct gcgagctcct gtacttctcc 120 attgctttcg tcatcctcaa gtttaccctt ggcgagctct cggattctgg caaaaagatt 180 ctgcgagtgc tgttcaagtg gtacaacctc ttcatgtccg tcttttcgct ggtgtccttc 240 ctctgtatgg gttacgccat ctacaccgtt ggactgtact ccaacgaatg cgacagagct 300 ttcgacaaca gcttgttccg atttgccacc aaggtcttct actattccaa gtttctggag 360 tacatcgact ctttctacct tcccctcatg gccaagcctc tgtcctttct gcagttcttt 420 catcacttgg gagctcctat ggacatgtgg ctcttcgtgc agtactctgg cgaatccatt 480 tggatctttg tgttcctgaa cggattcatt cactttgtca tgtacggcta ctattggaca 540 cggctgatga agttcaactt tcccatgccc aagcagctca ttaccgcaat gcagatcacc 600 cagttcaacg ttggcttcta cctcgtgtgg tggtacaagg acattccctg ttaccgaaag 660 gatcccatgc gaatgctggc ctggatcttc aactactggt acgtcggtac cgttcttctg 720 ctcttcatca acttctttgt caagtcctac gtgtttccca agcctaagac tgccgacaaa 780 aaggtccagt ag 792 <210> 7 <211> 1064 <212> DNA <213> Isochrysis galbana (GenBank Accession No. AF390174) <220> <221> CDS <222> (2)..(793) <223> delta-9 elongase (IgD9e) <400> 7 g atg gcc ctc gca aac gac gcg gga gag cgc atc tgg gcg gct gtg acc 49 Met Ala Leu Ala Asn Asp Ala Gly Glu Arg Ile Trp Ala Ala Val Thr 1 5 10 15 gac ccg gaa atc ctc att ggc acc ttc tcg tac ttg cta ctc aaa ccg 97 Asp Pro Glu Ile Leu Ile Gly Thr Phe Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Pro 20 25 30 ctg ctc cgc aat tcc ggg ctg gtg gat gag aag aag ggc gca tac agg 145 Leu Leu Arg Asn Ser Gly Leu Val Asp Glu Lys Lys Gly Ala Tyr Arg 35 40 45 acg tcc atg atc tgg tac aac gtt ctg ctg gcg ctc ttc tct gcg ctg 193 Thr Ser Met Ile Trp Tyr Asn Val Leu Leu Ala Leu Phe Ser Ala Leu 50 55 60 agc ttc tac gtg acg gcg acc gcc ctc ggc tgg gac tat ggt acg ggc 241 Ser Phe Tyr Val Thr Ala Thr Ala Leu Gly Trp Asp Tyr Gly Thr Gly 65 70 75 80 gcg tgg ctg cgc agg caa acc ggc gac aca ccg cag ccg ctc ttc cag 289 Ala Trp Leu Arg Arg Gln Thr Gly Asp Thr Pro Gln Pro Leu Phe Gln 85 90 95 tgc ccg tcc ccg gtt tgg gac tcg aag ctc ttc aca tgg acc gcc aag 337 Cys Pro Ser Pro Val Trp Asp Ser Lys Leu Phe Thr Trp Thr Ala Lys 100 105 110 gca ttc tat tac tcc aag tac gtg gag tac ctc gac acg gcc tgg ctg 385 Ala Phe Tyr Tyr Ser Lys Tyr Val Glu Tyr Leu Asp Thr Ala Trp Leu 115 120 125 gtg ctc aag ggc aag agg gtc tcc ttt ctc cag gcc ttc cac cac ttt 433 Val Leu Lys Gly Lys Arg Val Ser Phe Leu Gln Ala Phe His His Phe 130 135 140 ggc gcg ccg tgg gat gtg tac ctc ggc att cgg ctg cac aac gag ggc 481 Gly Ala Pro Trp Asp Val Tyr Leu Gly Ile Arg Leu His Asn Glu Gly 145 150 155 160 gta tgg atc ttc atg ttt ttc aac tcg ttc att cac acc atc atg tac 529 Val Trp Ile Phe Met Phe Phe Asn Ser Phe Ile His Thr Ile Met Tyr 165 170 175 acc tac tac ggc ctc acc gcc gcc ggg tat aag ttc aag gcc aag ccg 577 Thr Tyr Tyr Gly Leu Thr Ala Ala Gly Tyr Lys Phe Lys Ala Lys Pro 180 185 190 ctc atc acc gcg atg cag atc tgc cag ttc gtg ggc ggc ttc ctg ttg 625 Leu Ile Thr Ala Met Gln Ile Cys Gln Phe Val Gly Gly Phe Leu Leu 195 200 205 gtc tgg gac tac atc aac gtc ccc tgc ttc aac tcg gac aaa ggg aag 673 Val Trp Asp Tyr Ile Asn Val Pro Cys Phe Asn Ser Asp Lys Gly Lys 210 215 220 ttg ttc agc tgg gct ttc aac tat gca tac gtc ggc tcg gtc ttc ttg 721 Leu Phe Ser Trp Ala Phe Asn Tyr Ala Tyr Val Gly Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 ctc ttc tgc cac ttt ttc tac cag gac aac ttg gca acg aag aaa tcg 769 Leu Phe Cys His Phe Phe Tyr Gln Asp Asn Leu Ala Thr Lys Lys Ser 245 250 255 gcc aag gcg ggc aag cag ctc tag gcctcgagcc ggctcgcggg ttcaaggagg 823 Ala Lys Ala Gly Lys Gln Leu 260 gcgacacggg ggtgggacgt ttgcatggag atggattgtg gatgtcctta cgccttactc 883 atcaatgtcc tcccatctct cccctctaga ccttctacta gccatctaga agggcagctc 943 agagacggat accgttcccc ctccccttcc ttttcgtctt tgctttgcca ttgtttgttt 1003 gtctctattt tttaaactat tgacgctaac gcgttacgct cgcaaaaaaa aaaaaaaaaa 1063 a 1064 <210> 8 <211> 263 <212> PRT <213> Isochrysis galbana (GenBank Accession No. AF390174) <400> 8 Met Ala Leu Ala Asn Asp Ala Gly Glu Arg Ile Trp Ala Ala Val Thr 1 5 10 15 Asp Pro Glu Ile Leu Ile Gly Thr Phe Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Pro 20 25 30 Leu Leu Arg Asn Ser Gly Leu Val Asp Glu Lys Lys Gly Ala Tyr Arg 35 40 45 Thr Ser Met Ile Trp Tyr Asn Val Leu Leu Ala Leu Phe Ser Ala Leu 50 55 60 Ser Phe Tyr Val Thr Ala Thr Ala Leu Gly Trp Asp Tyr Gly Thr Gly 65 70 75 80 Ala Trp Leu Arg Arg Gln Thr Gly Asp Thr Pro Gln Pro Leu Phe Gln 85 90 95 Cys Pro Ser Pro Val Trp Asp Ser Lys Leu Phe Thr Trp Thr Ala Lys 100 105 110 Ala Phe Tyr Tyr Ser Lys Tyr Val Glu Tyr Leu Asp Thr Ala Trp Leu 115 120 125 Val Leu Lys Gly Lys Arg Val Ser Phe Leu Gln Ala Phe His His Phe 130 135 140 Gly Ala Pro Trp Asp Val Tyr Leu Gly Ile Arg Leu His Asn Glu Gly 145 150 155 160 Val Trp Ile Phe Met Phe Phe Asn Ser Phe Ile His Thr Ile Met Tyr 165 170 175 Thr Tyr Tyr Gly Leu Thr Ala Ala Gly Tyr Lys Phe Lys Ala Lys Pro 180 185 190 Leu Ile Thr Ala Met Gln Ile Cys Gln Phe Val Gly Gly Phe Leu Leu 195 200 205 Val Trp Asp Tyr Ile Asn Val Pro Cys Phe Asn Ser Asp Lys Gly Lys 210 215 220 Leu Phe Ser Trp Ala Phe Asn Tyr Ala Tyr Val Gly Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Leu Phe Cys His Phe Phe Tyr Gln Asp Asn Leu Ala Thr Lys Lys Ser 245 250 255 Ala Lys Ala Gly Lys Gln Leu 260 <210> 9 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgD9eS: synthetic delta-9 elongase derived from Isochrysis galbana and codon-optimized for expression in Yarrowia lipolytica <400> 9 atggctctgg ccaacgacgc tggcgagcga atctgggctg ccgtcaccga tcccgaaatc 60 ctcattggca ccttctccta cctgctcctg aagcctctcc tgcgaaactc tggtctcgtg 120 gacgagaaga aaggagccta ccgaacctcc atgatctggt acaacgtcct cctggctctc 180 ttctctgccc tgtccttcta cgtgactgcc accgctctcg gctgggacta cggtactgga 240 gcctggctgc gaagacagac cggtgatact ccccagcctc tctttcagtg tccctctcct 300 gtctgggact ccaagctgtt cacctggact gccaaggcct tctactattc taagtacgtg 360 gagtacctcg acaccgcttg gctggtcctc aagggcaagc gagtgtcctt tctgcaggcc 420 ttccatcact ttggagctcc ctgggacgtc tacctcggca ttcgactgca caacgagggt 480 gtgtggatct tcatgttctt taactcgttc attcacacca tcatgtacac ctactatgga 540 ctgactgccg ctggctacaa gttcaaggcc aagcctctga tcactgccat gcagatttgc 600 cagttcgtcg gtggctttct cctggtctgg gactacatca acgttccctg cttcaactct 660 gacaagggca agctgttctc ctgggctttc aactacgcct acgtcggatc tgtctttctc 720 ctgttctgtc acttctttta ccaggacaac ctggccacca agaaatccgc taaggctggt 780 aagcagcttt ag 792 <210> 10 <211> 757 <212> DNA <213> Euglena gracilis <220> <221> misc_feature <222> (677)..(677) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 ttttttttcg aacacttaat ggaggtggtg aatgaaatag tctcaattgg gcaggaagtt 60 ttacccaaag ttgattatgc ccaactctgg agtgatgcca gtcactgtga ggtgctttac 120 ttgtccatcg catttgtcat cttgaagttc actcttggcc cccttggtcc aaaaggtcag 180 tctcgtatga agtttgtttt caccaattac aaccttctca tgtccattta ttcgttggga 240 tcattcctct caatggcata tgccatgtac accatcggtg ttatgtctga caactgcgag 300 aaggcttttg acaacaacgt cttcaggatc accacgcagt tgttctattt gagcaagttc 360 ctggagtata ttgactcctt ctatttgcca ctgatgggca agcctctgac ctggttgcaa 420 ttcttccatc atttgggggc accgatggat atgtggctgt tctataatta ccgaaatgaa 480 gctgtttgga tttttgtgct gttgaatggt ttcatccact ggatcatgta cggttattat 540 tggaccagat tgatcaagct gaagttcccc atgccaaaat ccctgattac atcaatgcag 600 atcattcaat tcaatgttgg tttctacatt gtctggaagt acaggaacat tccctgttat 660 cgccaagatg ggatgangat gtttggctgg ttcttcaatt acttttatgt tggcacagtc 720 ttgtgtttgt tcttgaattt ctatgtgcaa acgtata 757 <210> 11 <211> 774 <212> DNA <213> Euglena gracilis <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (112)..(112) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (218)..(220) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (707)..(709) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (711)..(711) <223> n is a, c, g, or t <400> 11 tcaggatcac cacgcagttg ttctatttga gcangttcct ggagtatatt gactccttct 60 atttgccant gatgggcaag cntctgacct ggttgcaatt cttccatcat tngggggcac 120 cgatggatat gtggctgttc tataattacc gaaatgaagc tgtttggatt tttgtgctgt 180 tgaatggttt catccactgg atcatgtacg gttattannn gaccagattg atcaagctga 240 agttccccat gccaaaatcc ctgattacat caatgcagat cattcaattc aatgttggtt 300 tctacattgt ctggaagtac aggaacattc cctgttatcg ccaagatggg atgaggatgt 360 ttggctggtt cttcaattac ttttatgttg gcacagtctt gtgtttgttc ttgaatttct 420 atgtgcaaac gtatatcgtc aggaagcaca agggagccaa aaagattcag tgatatttcc 480 tcctctgcgg tggcctcttt tgacctcccc ttgacaccta taatgtggag gtgtcgggct 540 ctctccgtct caccagcact tgactctgca ggtgctcact tttatttttt acccatcttt 600 gcttgttgac cattcacctc tcccacttcc acatagtcca ttctaactgt tgcagactgc 660 ggtccatttt ttccagagct cccaatgacc atacgcgaca ccttgtnnnc ncccagccca 720 ttgtgcacaa ttcatagtgg catcgttttg ccttgatacg tgtgcatcca gcgg 774 <210> 12 <211> 1201 <212> DNA <213> Euglena gracilis <220> <221> misc_feature <222> (1134)..(1136) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1138)..(1138) <223> n is a, c, g, or t <400> 12 gacatggcaa ctatgatttt attttgactg atagtgacct gttcgttgca acaaattgat 60 gagcaatgct tttttataat gccaactttg tacaaaaaag ttggattttt tttcgaacac 120 ttaatggagg tggtgaatga aatagtctca attgggcagg aagttttacc caaagttgat 180 tatgcccaac tctggagtga tgccagtcac tgtgaggtgc tttacttgtc catcgcattt 240 gtcatcttga agttcactct tggccccctt ggtccaaaag gtcagtctcg tatgaagttt 300 gttttcacca attacaacct tctcatgtcc atttattcgt tgggatcatt cctctcaatg 360 gcatatgcca tgtacaccat cggtgttatg tctgacaact gcgagaaggc ttttgacaac 420 aacgtcttca ggatcaccac gcagttgttc tatttgagca agttcctgga gtatattgac 480 tccttctatt tgccactgat gggcaagcct ctgacctggt tgcaattctt ccatcatttg 540 ggggcaccga tggatatgtg gctgttctat aattaccgaa atgaagctgt ttggattttt 600 gtgctgttga atggtttcat ccactggatc atgtacggtt attattggac cagattgatc 660 aagctgaagt tccccatgcc aaaatccctg attacatcaa tgcagatcat tcaattcaat 720 gttggtttct acattgtctg gaagtacagg aacattccct gttatcgcca agatgggatg 780 aggatgtttg gctggttctt caattacttt tatgttggca cagtcttgtg tttgttcttg 840 aatttctatg tgcaaacgta tatcgtcagg aagcacaagg gagccaaaaa gattcagtga 900 tatttcctcc tctgcggtgg cctcttttga cctccccttg acacctataa tgtggaggtg 960 tcgggctctc tccgtctcac cagcacttga ctctgcaggt gctcactttt attttttacc 1020 catctttgct tgttgaccat tcacctctcc cacttccaca tagtccattc taactgttgc 1080 agactgcggt ccattttttc cagagctccc aatgaccata cgcgacacct tgtnnncncc 1140 cagcccattg tgcacaattc atagtggcat cgttttgcct tgatacgtgt gcatccagcg 1200 g 1201 <210> 13 <211> 200 <212> DNA <213> Eutreptiella sp. CCMP389 <400> 13 ttacagttct tccaccactt gggagccccc atggacatgt ggctctttgt ccaatattct 60 ggggaatcta tttggatctt tgtgtttttg aatgggttca ttcactttgt tatgtacggg 120 tactactgga ctcggctgat gaagttcaat ttcccaatgc ccaagcagtt gattaccgcg 180 atgcagatca tccaattcaa 200 <210> 14 <211> 406 <212> DNA <213> Eutreptiella sp. CCMP389 <400> 14 atggcgagac atttacagtt gtgagctact gtatttctcc attgccttcg tgatcttgaa 60 gtttacgttg ggcgagttga gcgacagcgg aaaaaagatt ttgagagtgt tgttcaagtg 120 gtacaatctc ttcatgtccg tgttctcctt ggtgtctttc ctttgcatgg gctatgccat 180 ttataccgtg ggcctatact ctaacgaatg cgacagggct ttcgacaact cgttgttccg 240 ctttgcaaca aaggtgttct actacagtaa gtttttggag tacatcgact ctttttatct 300 tccgctcatg gccaagccgc tgtctttcct gcaattcttc catcacttgg gagcccccat 360 ggacatgtgg ctctttgtcc aatattctgg ggaatctatt tggatc 406 <210> 15 <211> 197 <212> DNA <213> Eutreptiella sp. CCMP389 <400> 15 tccatttcgc ccgtcaagcc agagtggcca ttacggctgg tcggacacaa catggctgcg 60 gtgatagagg tcgccaacga gtttgtagcc atcacggcag aaacgctccc caaagttgac 120 tatcaacgac tatggcgaga catttacagt tgtgagctac tgtatttctc cattgccttc 180 gtgatcttga agtttac 197 <210> 16 <211> 920 <212> DNA <213> Eutreptiella sp. CCMP389 <400> 16 ctggactcgg ctgatgaagt tcaatttccc aatgcccaag cagttgatta ccgcgatgca 60 gatcacgcag ttcaacgttg gtttctacct cgtgtggtgg tacaaagata ttccctgcta 120 ccgaaaggat cccatgcgaa tgttggcctg gatcttcaat tactggtatg ttgggactgt 180 cttgctgctg ttcattaatt tcttcgtcaa atcctatgtg ttcccaaagc cgaagactgc 240 agataaaaag gtccaatagc tgcacacaca caattatgca gctccccacc actttctccc 300 caaaacagcc agccagcccc cttcccatga aacaagaacc taccccctcc ctgctcctct 360 ttttttaatc tcttattcca ccatacactt gatgacaaca gttgccgtgc agtggagcta 420 tgtggtgcat gctgcaatgc actggggcat catattaaga ttattgttat tagtggtgcc 480 cttgcttctc tgctttgtgc ccctggtacc agggtgcacc catgatgcag tacacaagtt 540 gttcaatgtg tgcactgtgg tattctctga attccttgag gagccattta gtttaaccaa 600 gcatgactcg gctggattgg ctcgaggtca ttgcggaagc aaaagttttg cgaggcagct 660 gccgaaggtg ctgctaagtt cggcttcaaa ctggcctttg cacacccagg tacccaggga 720 ttccaagtct catggctggc atattttagg tttcatgcat ccgcagtggc gtttatgcaa 780 ggcacagacg tttatattta tggatatgcg agtgaaggtt ggcttgccag cattggcatc 840 gcctgcctgc atactgagtt ttgttgtaaa agtacaaact cagtatcaac aatacaattt 900 ttktttgaaa aaaaaaaaaa 920 <210> 17 <211> 1504 <212> DNA <213> Eutreptiella sp. CCMP389 <220> <221> misc_feature <222> (1487)..(1487) <223> n is a, c, g, or t <400> 17 tccatttcgc ccgtcaagcc agagtggcca ttacggctgg tcggacacaa catggctgcg 60 gtgatagagg tcgccaacga gtttgtagcc atcacggcag aaacgctccc caaagttgac 120 tatcaacgac tatggcgaga catttacagt tgtgagctac tgtatttctc cattgccttc 180 gtgatcttga agtttacgtt gggcgagttg agcgacagcg gaaaaaagat tttgagagtg 240 ttgttcaagt ggtacaatct cttcatgtcc gtgttctcct tggtgtcttt cctttgcatg 300 ggctatgcca tttataccgt gggcctatac tctaacgaat gcgacagggc tttcgacaac 360 tcgttgttcc gctttgcaac aaaggtgttc tactacagta agtttttgga gtacatcgac 420 tctttttatc ttccgctcat ggccaagccg ctgtctttcc tgcaattctt ccatcacttg 480 ggagccccca tggacatgtg gctctttgtc caatattctg gggaatctat ttggatcttt 540 gtgtttttga atgggttcat tcactttgtt atgtacgggt actactggac tcggctgatg 600 aagttcaatt tcccaatgcc caagcagttg attaccgcga tgcagatcac gcagttcaac 660 gttggtttct acctcgtgtg gtggtacaaa gatattccct gctaccgaaa ggatcccatg 720 cgaatgttgg cctggatctt caattactgg tatgttggga ctgtcttgct gctgttcatt 780 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tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 600 acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 660 gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata 720 ttaacgttta caatttcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 780 accgcatatc gacggtcgag gagaacttct agtatatcca catacctaat attattgcct 840 tattaaaaat ggaatcccaa caattacatc aaaatccaca ttctcttcaa aatcaattgt 900 cctgtacttc cttgttcatg tgtgttcaaa aacgttatat ttataggata attatactct 960 atttctcaac aagtaattgg ttgtttggcc gagcggtcta aggcgcctga ttcaagaaat 1020 atcttgaccg cagttaactg tgggaatact caggtatcgt aagatgcaag agttcgaatc 1080 tcttagcaac cattattttt ttcctcaaca taacgagaac acacaggggc gctatcgcac 1140 agaatcaaat tcgatgactg gaaatttttt gttaatttca gaggtcgcct gacgcatata 1200 cctttttcaa ctgaaaaatt gggagaaaaa ggaaaggtga gaggccggaa ccggcttttc 1260 atatagaata gagaagcgtt catgactaaa tgcttgcatc acaatacttg aagttgacaa 1320 tattatttaa ggacctattg ttttttccaa taggtggtta gcaatcgtct tactttctaa 1380 cttttcttac cttttacatt tcagcaatat atatatatat ttcaaggata taccattcta 1440 atgtctgccc ctatgtctgc ccctaagaag atcgtcgttt tgccaggtga ccacgttggt 1500 caagaaatca cagccgaagc cattaaggtt cttaaagcta tttctgatgt tcgttccaat 1560 gtcaagttcg atttcgaaaa tcatttaatt ggtggtgctg ctatcgatgc tacaggtgtc 1620 ccacttccag atgaggcgct ggaagcctcc aagaaggttg atgccgtttt gttaggtgct 1680 gtggctggtc ctaaatgggg taccggtagt gttagacctg aacaaggttt actaaaaatc 1740 cgtaaagaac ttcaattgta cgccaactta agaccatgta actttgcatc cgactctctt 1800 ttagacttat ctccaatcaa gccacaattt gctaaaggta ctgacttcgt tgttgtcaga 1860 gaattagtgg gaggtattta ctttggtaag agaaaggaag acgatggtga tggtgtcgct 1920 tgggatagtg aacaatacac cgttccagaa gtgcaaagaa tcacaagaat ggccgctttc 1980 atggccctac aacatgagcc accattgcct atttggtcct tggataaagc taatcttttg 2040 gcctcttcaa gattatggag aaaaactgtg gaggaaacca tcaagaacga attccctaca 2100 ttgaaggttc aacatcaatt gattgattct gccgccatga tcctagttaa gaacccaacc 2160 cacctaaatg gtattataat caccagcaac atgtttggtg atatcatctc cgatgaagcc 2220 tccgttatcc caggttcctt gggtttgttg ccatctgcgt ccttggcctc tttgccagac 2280 aagaacaccg catttggttt gtacgaacca tgccacggtt ctgctccaga tttgccaaag 2340 aataaggttg accctatcgc cactatcttg tctgctgcaa tgatgttgaa attgtcattg 2400 aacttgcctg aagaaggtaa ggccattgaa gatgcagtta aaaaggtttt ggatgcaggt 2460 atcagaactg gtgatttagg tggttccaac agtaccaccg aagtcggtga tgctgtcgcc 2520 gaagaagtta agaaaatcct tgcttaaaaa gattctcttt ttttatgata tttgtacata 2580 aactttataa atgaaattca taatagaaac gacacgaaat tacaaaatgg aatatgttca 2640 tagggtagac gaaactatat acgcaatcta catacattta tcaagaagga gaaaaaggag 2700 gatagtaaag gaatacaggt aagcaaattg atactaatgg ctcaacgtga taaggaaaaa 2760 gaattgcact ttaacattaa tattgacaag gaggagggca ccacacaaaa agttaggtgt 2820 aacagaaaat catgaaacta cgattcctaa tttgatattg gaggattttc tctaaaaaaa 2880 aaaaaataca acaaataaaa aacactcaat gacctgacca tttgatggag tttaagtcaa 2940 taccttcttg aagcatttcc cataatggtg aaagttccct caagaatttt actctgtcag 3000 aaacggcctt acgacgtagt cgatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 3060 atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac 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tattcccttt tttgcggcat 4800 tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 4860 agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 4920 gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 4980 cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 5040 agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 5100 taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 5160 tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 5220 taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 5280 acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 5340 ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 5400 cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 5460 agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 5520 tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg 5580 agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga 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gatgccagga ataaactgtt 7320 cacccagaca cctacgatgt tatatattct gtgtaacccg ccccctattt tgggcatgta 7380 cgggttacag cagaattaaa aggctaattt tttgactaaa taaagttagg aaaatcacta 7440 ctattaatta tttacgtatt ctttgaaatg gcagtattga taatgataaa ctcgaaatca 7500 ctagtggatc cgcccagcgg ccgcaccatg gaggtggtga atgaaatagt ctcaattggg 7560 caggaagttt tacccaaagt tgattatgcc caactctgga gtgatgccag tcactgtgag 7620 gtgctttact tgtccatcgc atttgtcatc ttgaagttca ctcttggccc ccttggtcca 7680 aaaggtcagt ctcgtatgaa gtttgttttc accaattaca accttctcat gtccatttat 7740 tcgttgggat cattcctctc aatggcatat gccatgtaca ccatcggtgt tatgtctgac 7800 aactgcgaga aggcttttga caacaacgtc ttcaggatca ccacgcagtt gttctatttg 7860 agcaagttcc tggagtatat tgactccttc tatttgccac tgatgggcaa gcctctgacc 7920 tggttgcaat tcttccatca tttgggggca ccgatggata tgtggctgtt ctataattac 7980 cgaaatgaag ctgtttggat ttttgtgctg ttgaatggtt tcatccactg gatcatgtac 8040 ggttattatt ggaccagatt gatcaagctg aagttcccca tgccaaaatc cctgattaca 8100 tcaatgcaga tcattcaatt caatgttggt ttctacattg 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377 bp PstI/Not1 fragment pT9(5-8) <400> 44 ggccttccat cactttggag ctccctggga cgtctacctc ggcattcgac tgcacaacga 60 gggtgtgtgg atcttcatgt tctttaactc gttcattcac accatcatgt acacctacta 120 tggactgact gccgctggct acaagttcaa ggccaagcct ctgatcactg ccatgcagat 180 ttgccagttc gtcggtggct ttctcctggt ctgggactac atcaacgttc cctgcttcaa 240 ctctgacaag ggcaagctgt tctcctgggc tttcaactac gcctacgtcg gatctgtctt 300 tctcctgttc tgtcacttct tttaccagga caacctggcc accaagaaat ccgctaaggc 360 tggtaagcag ctttagc 377 <210> 45 <211> 7783 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pY115 <400> 45 catggctctg gccaacgacg ctggcgagcg aatctgggct gccgtcaccg atcccgaaat 60 cctcattggc accttctcct acctgctcct gaagcctctc ctgcgaaact ctggtctcgt 120 ggacgagaag aaaggagcct accgaacctc catgatctgg tacaacgtcc tcctggctct 180 cttctctgcc ctgtccttct acgtgactgc caccgctctc ggctgggact acggtactgg 240 agcctggctg cgaagacaga ccggtgatac tccccagcct ctctttcagt gtccctctcc 300 tgtctgggac tccaagctgt tcacctggac tgccaaggcc ttctactatt ctaagtacgt 360 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cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 1800 aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 1860 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 1920 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 1980 actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 2040 caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 2100 gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 2160 ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 2220 caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 2280 tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 2340 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 2400 cccgaaaagt gccacctgac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg 2460 ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct 2520 tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc 2580 ctttagggtt ccgatttagt 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ctgttgatgc atccacaaca gtttgttttg tttttttttg 4320 tttttttttt ttctaatgat tcattaccgc tatgtatacc tacttgtact tgtagtaagc 4380 cgggttattg gcgttcaatt aatcatagac ttatgaatct gcacggtgtg cgctgcgagt 4440 tacttttagc ttatgcatgc tacttgggtg taatattggg atctgttcgg aaatcaacgg 4500 atgctcaatc gatttcgaca gtaattaatt aagtcataca caagtcagct ttcttcgagc 4560 ctcatataag tataagtagt tcaacgtatt agcactgtac ccagcatctc cgtatcgaga 4620 aacacaacaa catgccccat tggacagatc atgcggatac acaggttgtg cagtatcata 4680 catactcgat cagacaggtc gtctgaccat catacaagct gaacaagcgc tccatacttg 4740 cacgctctct atatacacag ttaaattaca tatccatagt ctaacctcta acagttaatc 4800 ttctggtaag cctcccagcc agccttctgg tatcgcttgg cctcctcaat aggatctcgg 4860 ttctggccgt acagacctcg gccgacaatt atgatatccg ttccggtaga catgacatcc 4920 tcaacagttc ggtactgctg tccgagagcg tctcccttgt cgtcaagacc caccccgggg 4980 gtcagaataa gccagtcctc agagtcgccc ttaggtcggt tctgggcaat gaagccaacc 5040 acaaactcgg ggtcggatcg ggcaagctca atggtctgct tggagtactc gccagtggcc 5100 agagagccct tgcaagacag 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gcctctacta 7440 ctatgctcct ctctttgtct ttgcttcgtt cctcgtcatt actaccttct tgcatcacaa 7500 cgacgaagct actccctggt acggtgactc ggagtggacc tacgtcaagg gcaacctgag 7560 ctccgtcgac cgatcgtacg gagctttcgt ggacaacctg tctcaccaca ttggcaccca 7620 ccaggtccat cacttgttcc ctatcattcc ccactacaag ctcaacgaag ccaccaagca 7680 ctttgctgcc gcttaccctc acctcgtgag acgtaacgac gagcccatca ttactgcctt 7740 cttcaagacc gctcacctct ttgtcaacta cggagctgtg cccgagactg ctcagatttt 7800 caccctcaaa gagtctgccg ctgcagccaa ggccaagagc gactaagcgg ccgcaagtgt 7860 ggatggggaa gtgagtgccc ggttctgtgt gcacaattgg caatccaaga tggatggatt 7920 caacacaggg atatagcgag ctacgtggtg gtgcgaggat atagcaacgg atatttatgt 7980 ttgacacttg agaatgtacg atacaagcac tgtccaagta caatactaaa catactgtac 8040 atactcatac tcgtacccgg gcaacggttt cacttgagtg cagtggctag tgctcttact 8100 cgtacagtgt gcaatactgc gtatcatagt ctttgatgta tatcgtattc attcatgtta 8160 gttgc 8165 <210> 122 <211> 7879 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pZUFE389S <400> 122 catggctgcc gtcatcgagg tggccaacga gttcgtcgct atcactgccg agacccttcc 60 caaggtggac tatcagcgac tctggcgaga catctactcc tgcgagctcc tgtacttctc 120 cattgctttc gtcatcctca agtttaccct tggcgagctc tcggattctg gcaaaaagat 180 tctgcgagtg ctgttcaagt ggtacaacct cttcatgtcc gtcttttcgc tggtgtcctt 240 cctctgtatg ggttacgcca tctacaccgt tggactgtac tccaacgaat gcgacagagc 300 tttcgacaac agcttgttcc gatttgccac caaggtcttc tactattcca agtttctgga 360 gtacatcgac tctttctacc ttcccctcat ggccaagcct ctgtcctttc tgcagttctt 420 tcatcacttg ggagctccta tggacatgtg gctcttcgtg cagtactctg gcgaatccat 480 ttggatcttt gtgttcctga acggattcat tcactttgtc atgtacggct actattggac 540 acggctgatg aagttcaact ttcccatgcc caagcagctc attaccgcaa tgcagatcac 600 ccagttcaac gttggcttct acctcgtgtg gtggtacaag gacattccct gttaccgaaa 660 ggatcccatg cgaatgctgg cctggatctt caactactgg tacgtcggta ccgttcttct 720 gctcttcatc aacttctttg tcaagtccta cgtgtttccc aagcctaaga ctgccgacaa 780 aaaggtccag tagcggccgc aagtgtggat ggggaagtga gtgcccggtt ctgtgtgcac 840 aattggcaat ccaagatgga tggattcaac acagggatat agcgagctac gtggtggtgc 900 gaggatatag caacggatat ttatgtttga cacttgagaa tgtacgatac aagcactgtc 960 caagtacaat actaaacata ctgtacatac tcatactcgt acccgggcaa cggtttcact 1020 tgagtgcagt ggctagtgct cttactcgta cagtgtgcaa tactgcgtat catagtcttt 1080 gatgtatatc gtattcattc atgttagttg cgtacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc 1140 ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt 1200 ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 1260 cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 1320 tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 1380 aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 1440 aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 1500 tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 1560 ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 1620 cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 1680 ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 1740 ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 1800 gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 1860 agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg 1920 cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 1980 aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 2040 aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 2100 ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 2160 aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 2220 ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 2280 agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 2340 cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 2400 ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 2460 gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 2520 cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 2580 cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 2640 ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 2700 catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 2760 tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 2820 ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 2880 catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 2940 cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 3000 cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 3060 acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 3120 ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 3180 tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 3240 ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 3300 tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct 3360 aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa 3420 acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc 3480 tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact 3540 caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg 3600 gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct 3660 tacaatttcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc 3720 tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta 3780 acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gtaatacgac 3840 tcactatagg gcgaattggg taccgggccc cccctcgagg tcgatggtgt cgataagctt 3900 gatatcgaat tcatgtcaca caaaccgatc ttcgcctcaa ggaaacctaa ttctacatcc 3960 gagagactgc cgagatccag tctacactga ttaattttcg ggccaataat ttaaaaaaat 4020 cgtgttatat aatattatat gtattatata tatacatcat gatgatactg acagtcatgt 4080 cccattgcta aatagacaga ctccatctgc cgcctccaac tgatgttctc aatatttaag 4140 gggtcatctc gcattgttta ataataaaca gactccatct accgcctcca aatgatgttc 4200 tcaaaatata ttgtatgaac ttatttttat tacttagtat tattagacaa cttacttgct 4260 ttatgaaaaa cacttcctat ttaggaaaca atttataatg gcagttcgtt catttaacaa 4320 tttatgtaga ataaatgtta taaatgcgta tgggaaatct taaatatgga tagcataaat 4380 gatatctgca ttgcctaatt cgaaatcaac agcaacgaaa aaaatccctt gtacaacata 4440 aatagtcatc gagaaatatc aactatcaaa gaacagctat tcacacgtta ctattgagat 4500 tattattgga cgagaatcac acactcaact gtctttctct cttctagaaa tacaggtaca 4560 agtatgtact attctcattg ttcatacttc tagtcatttc atcccacata ttccttggat 4620 ttctctccaa tgaatgacat tctatcttgc aaattcaaca attataataa gatataccaa 4680 agtagcggta tagtggcaat caaaaagctt ctctggtgtg cttctcgtat ttatttttat 4740 tctaatgatc cattaaaggt atatatttat ttcttgttat ataatccttt tgtttattac 4800 atgggctgga tacataaagg tattttgatt taattttttg cttaaattca atcccccctc 4860 gttcagtgtc aactgtaatg gtaggaaatt accatacttt tgaagaagca aaaaaaatga 4920 aagaaaaaaa aaatcgtatt tccaggttag acgttccgca gaatctagaa tgcggtatgc 4980 ggtacattgt tcttcgaacg taaaagttgc gctccctgag atattgtaca tttttgcttt 5040 tacaagtaca agtacatcgt acaactatgt actactgttg atgcatccac aacagtttgt 5100 tttgtttttt tttgtttttt ttttttctaa tgattcatta ccgctatgta tacctacttg 5160 tacttgtagt aagccgggtt attggcgttc aattaatcat agacttatga atctgcacgg 5220 tgtgcgctgc gagttacttt tagcttatgc atgctacttg ggtgtaatat tgggatctgt 5280 tcggaaatca acggatgctc aatcgatttc gacagtaatt aattaagtca tacacaagtc 5340 agctttcttc gagcctcata taagtataag tagttcaacg tattagcact gtacccagca 5400 tctccgtatc gagaaacaca acaacatgcc ccattggaca gatcatgcgg atacacaggt 5460 tgtgcagtat catacatact cgatcagaca ggtcgtctga ccatcataca agctgaacaa 5520 gcgctccata cttgcacgct ctctatatac acagttaaat tacatatcca tagtctaacc 5580 tctaacagtt aatcttctgg taagcctccc agccagcctt ctggtatcgc ttggcctcct 5640 caataggatc tcggttctgg ccgtacagac ctcggccgac aattatgata tccgttccgg 5700 tagacatgac atcctcaaca gttcggtact gctgtccgag agcgtctccc ttgtcgtcaa 5760 gacccacccc gggggtcaga ataagccagt cctcagagtc gcccttaggt cggttctggg 5820 caatgaagcc aaccacaaac tcggggtcgg atcgggcaag ctcaatggtc tgcttggagt 5880 actcgccagt ggccagagag cccttgcaag acagctcggc cagcatgagc agacctctgg 5940 ccagcttctc gttgggagag gggactagga actccttgta ctgggagttc tcgtagtcag 6000 agacgtcctc cttcttctgt tcagagacag tttcctcggc accagctcgc aggccagcaa 6060 tgattccggt tccgggtaca ccgtgggcgt tggtgatatc ggaccactcg gcgattcggt 6120 gacaccggta ctggtgcttg acagtgttgc caatatctgc gaactttctg tcctcgaaca 6180 ggaagaaacc gtgcttaaga gcaagttcct tgagggggag cacagtgccg gcgtaggtga 6240 agtcgtcaat gatgtcgata tgggttttga tcatgcacac ataaggtccg accttatcgg 6300 caagctcaat gagctccttg gtggtggtaa catccagaga agcacacagg ttggttttct 6360 tggctgccac gagcttgagc actcgagcgg caaaggcgga cttgtggacg ttagctcgag 6420 cttcgtagga gggcattttg gtggtgaaga ggagactgaa ataaatttag tctgcagaac 6480 tttttatcgg aaccttatct ggggcagtga agtatatgtt atggtaatag ttacgagtta 6540 gttgaactta tagatagact ggactatacg gctatcggtc caaattagaa agaacgtcaa 6600 tggctctctg ggcgtcgcct ttgccgacaa aaatgtgatc atgatgaaag ccagcaatga 6660 cgttgcagct gatattgttg tcggccaacc gcgccgaaaa cgcagctgtc agacccacag 6720 cctccaacga agaatgtatc gtcaaagtga tccaagcaca ctcatagttg gagtcgtact 6780 ccaaaggcgg caatgacgag tcagacagat actcgtcgac tcaggcgacg acggaattcc 6840 tgcagcccat ctgcagaatt caggagagac cgggttggcg gcgtatttgt gtcccaaaaa 6900 acagccccaa ttgccccgga gaagacggcc aggccgccta gatgacaaat tcaacaactc 6960 acagctgact ttctgccatt gccactaggg gggggccttt ttatatggcc aagccaagct 7020 ctccacgtcg gttgggctgc acccaacaat aaatgggtag ggttgcacca acaaagggat 7080 gggatggggg gtagaagata cgaggataac ggggctcaat ggcacaaata agaacgaata 7140 ctgccattaa gactcgtgat ccagcgactg acaccattgc atcatctaag ggcctcaaaa 7200 ctacctcgga actgctgcgc tgatctggac accacagagg ttccgagcac tttaggttgc 7260 accaaatgtc ccaccaggtg caggcagaaa acgctggaac agcgtgtaca gtttgtctta 7320 acaaaaagtg agggcgctga ggtcgagcag ggtggtgtga cttgttatag cctttagagc 7380 tgcgaaagcg cgtatggatt tggctcatca ggccagattg agggtctgtg gacacatgtc 7440 atgttagtgt acttcaatcg ccccctggat atagccccga caataggccg tggcctcatt 7500 tttttgcctt ccgcacattt ccattgctcg gtacccacac cttgcttctc ctgcacttgc 7560 caaccttaat actggtttac attgaccaac atcttacaag cggggggctt gtctagggta 7620 tatataaaca gtggctctcc caatcggttg ccagtctctt ttttcctttc tttccccaca 7680 gattcgaaat ctaaactaca catcacacaa tgcctgttac tgacgtcctt aagcgaaagt 7740 ccggtgtcat cgtcggcgac gatgtccgag ccgtgagtat ccacgacaag atcagtgtcg 7800 agacgacgcg ttttgtgtaa tgacacaatc cgaaagtcgc tagcaacaca cactctctac 7860 acaaactaac ccagctctc 7879 <210> 123 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> delta-9 elongase motif <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X = L or F <220> <221> misc_feature <222> (5)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 123 Tyr Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Ser Phe 1 5 10 <210> 124 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> delta-9 elongase motif <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X = E or D <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X = T or S <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 124 Phe Tyr Xaa Ser Lys Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> delta-9 elongase motif <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X = Q or H <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 125 Leu Xaa Xaa Phe His His Xaa Gly Ala 1 5 <210> 126 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> delta-9 elongase motif <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X = K or R or N <400> 126 Met Tyr Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe 1 5 10 <210> 127 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> delta-9 elongase motif <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X = I or L or M <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 127 Lys Xaa Leu Xaa Thr Xaa Xaa Gln 1 5 <210> 128 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> delta-9 elongase motif <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 128 Trp Xaa Phe Asn Tyr Xaa Tyr 1 5 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> delta-9 elongase motif <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 129 Tyr Xaa Gly Xaa Val Xaa Xaa Leu Phe 1 5

Claims (21)

  1. (a) 클러스탈 브이(Clustal V) 정렬 방법을 기초로 하여 서열 2 또는 서열 5에 기재된 바와 같은 아미노산 서열과 비교할 때 70％ 이상의 아미노산 동일성을 가지며 Δ9 일롱가제(elongase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열,
    (b) BLASTN 정렬 방법을 기초로 하여 서열 1, 서열 3, 서열 4 또는 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 비교할 때 70％ 이상의 서열 동일성을 가지며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열,
    (c) 0.1× SSC, 0.1％ SDS 중 65℃에서의 혼성화 및 2× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척 및 이후 0.1× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척의 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 1, 서열 3, 서열 4 또는 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 혼성화하며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열, 또는
    (d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 뉴클레오티드 서열과 동일한 수의 뉴클레오티드로 이루어지며 100％ 상보적인, 상기 (a), (b) 또는 (c)의 뉴클레오티드 서열의 상보체
    로 구성된 군에서 선택된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 서열 1, 서열 3, 서열 4 또는 서열 6을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 서열 1, 서열 3, 서열 4 또는 서열 6으로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드.
  4. 아미노산 서열이
    (a) 서열 2 또는 서열 5에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 및
    (b) 1개 이상의 보존적 아미노산 치환으로 인해 상기 (a)에서의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열
    로 구성된 군에서 선택된 것인 Δ9 일롱가제 폴리펩티드.
  5. 제1항의 단리된 핵산 서열을 포함하는 단리된 형질전환된 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서, 조류(algae), 박테리아, 효모, 난균 및 진균으로 구성된 군에서 선택된 형질전환된 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 종, 쉬조키트리움(Schizochytrium) 종 및 모르티에렐라(Mortierella) 종으로 구성된 군에서 선택된 진균인 형질전환된 숙주 세포.
  8. 제6항에 있어서, 효모가 유질(oleaginous) 효모인 형질전환된 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 유질 효모가 야로위아(Yarrowia), 칸디다(Candida), 로도토룰라(Rhodotorula), 로도스포리듐(Rhodosporidium), 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 트리코스포론(Trichosporon) 및 리포마이세스(Lipomyces)로 구성된 군에서 선택된 것인 형질전환된 숙주 세포.
  10. 제9항에 있어서, 효모가 야로위아 종인 형질전환된 숙주 세포.
  11. 제10항에 있어서, 야로위아 종이 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) ATCC #20362, 야로위아 리폴리티카 ATCC #8862, 야로위아 리폴리티카 ATCC #18944, 야로위아 리폴리티카 ATCC #76982 및 야로위아 리폴리티카 LGAM S(7)1로 구성된 군에서 선택된 것인 형질전환된 숙주 세포.
  12. a) i) (1) 클러스탈 브이 정렬 방법을 기초로 하여 서열 2 또는 서열 5에 기재된 바와 같은 아미노산 서열과 비교할 때 70％ 이상의 아미노산 동일성을 가지며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열, 및
    (2) 0.1× SSC, 0.1％ SDS 중 65℃에서의 혼성화 및 2× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척 및 이후 0.1× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척의 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 1, 서열 3, 서열 4 또는 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 혼성화하며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열
    로 구성된 군에서 선택된, Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열, 및
    (ii) 리놀레산의 공급원
    을 포함하는 단리된 형질전환된 효모 숙주 세포를 제공하는 단계,
    b) Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 발현되고 리놀레산이 에이코사디엔산으로 전환되는 조건하에서 상기 단계 (a)의 효모 숙주 세포를 성장시키는 단계, 및
    c) 임의로, 상기 단계 (b)의 에이코사디엔산을 회수하는 단계
    를 포함하는, 에이코사디엔산의 생성 방법.
  13. a) i) (1) 클러스탈 브이 정렬 방법을 기초로 하여 서열 2 또는 서열 5에 기재된 바와 같은 아미노산 서열과 비교할 때 70％ 이상의 아미노산 동일성을 가지며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열, 및
    (2) 0.1× SSC, 0.1％ SDS 중 65℃에서의 혼성화 및 2× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척 및 이후 0.1× SSC, 0.1％ SDS를 사용한 세척의 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 1, 서열 3, 서열 4 또는 서열 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 혼성화하며 Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 서열
    로 구성된 군에서 선택된, Δ9 일롱가제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열, 및
    (ii) α-리놀렌산의 공급원
    을 포함하는 단리된 형질전환된 효모 숙주 세포를 제공하는 단계,
    b) Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 발현되고 α-리놀렌산이 에이코사트리엔산으로 전환되는 조건하에서 상기 단계 (a)의 숙주 세포를 성장시키는 단계, 및
    c) 임의로, 상기 단계 (b)의 에이코사트리엔산을 회수하는 단계
    를 포함하는, 에이코사트리엔산의 생성 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 2 또는 서열 5에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, Δ9 일롱가제 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열이
    a) 113개 이상의 코돈이 야로위아 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 서열 5, 및
    b) 106개 이상의 코돈이 야로위아 중에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 서열 2
    로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  16. 제6항의 숙주 세포에 의해 생성된 미생물 오일.
  17. 제16항의 유효량의 미생물 오일을 포함하는 식품.
  18. 제17항에 있어서, 식품 유사물, 육류 제품, 시리얼 제품, 베이킹 식품, 스낵 식품 및 유제품으로 구성된 군에서 선택된 식품.
  19. 제16항의 유효량의 미생물 오일을 포함하는 의료용 식품, 식이 보조제, 유아용 조제식(infant formula) 및 의약품으로 구성된 군에서 선택된 제품.
  20. 제16항의 유효량의 미생물 오일을 포함하는 동물 사료.
  21. 제20항에 있어서, 애완동물 사료, 반추 동물 사료, 가금류 사료, 및 수산양식 사료로 구성된 군에서 선택된 동물 사료.
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