BRPI0711020A2 - polinucleotìdeo isolado, construto de dna recombinente, célula, método para transformar uma célula, método para produzir uma planta trasfornanda, sementes transgênicas, método para a produção de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa em uma célula vegetal, óleos ou subporudots, método para produzir pelo menos um ácido graxo poliinsaturado em uma célula vegetal de uma semente oleaginosa, plantas de semente oleoginosa, sementes transgênicas, produto alimentìcios, progênies de plantas e molécula de ácido nucléico isolada - Google Patents

polinucleotìdeo isolado, construto de dna recombinente, célula, método para transformar uma célula, método para produzir uma planta trasfornanda, sementes transgênicas, método para a produção de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa em uma célula vegetal, óleos ou subporudots, método para produzir pelo menos um ácido graxo poliinsaturado em uma célula vegetal de uma semente oleaginosa, plantas de semente oleoginosa, sementes transgênicas, produto alimentìcios, progênies de plantas e molécula de ácido nucléico isolada Download PDF

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Abstract

POLINUCLEOTIDEO ISOLADO, CONSTRUTO DE DNA RECOMBINANTE, CéLULA, MéTODO PARA TRANSFORMAR UMA CéLULA, MéTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSFORMADA, SEMENTES TRANSGENICAS, MéTODO PARA A PRODUçãO DE áCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA, óLEOS OU SUBPRODUTOS, MéTODO PARA PRODUZIR PELO MENOS UM áCIDO GRAXO POLIINSATURADO EM UMA CéLULA VEGETAL DE UMA SEMENTE OLEAGINOSA, PLANTAS DE SEMENTE OLEAGINOSA, SEMENTES TRANSGêNICAS, PRODUTOS ALIMENTìCIOS, PROGêNIES DE PLANTAS E MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO ISOLADA A presente invenção refere-se a fragmentos isolados de ácido nuclé ico e a construtos recombinantes que compreendem tais fragmentos que codificam desaturase delta-5, junto com um método para produzir ácidos graxos poliinsaturados AGPs (polyunsaturated fatty acids - PUFAs) de cadeia longa que usam esta desaturase delta-5 em plantas e levedura oleaginosa.

Description

Título
"POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CONSTRUTO DE DNA RECOMBINANTE,CÉLULA, MÉTODO PARA TRANSFORMAR UMA CÉLULA, MÉTODO PARAPRODUZIR UMA PLANTA TRANSFORMADA, SEMENTESTRANSGÊNICAS, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOSPOLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA EM UMA CÉLULA VEGETAL,ÓLEOS OU SUBPRODUTOS, MÉTODO PARA PRODUZIR PELO MENOSUM ÁCIDO GRAXO POLIINSATURADO EM UMA CÉLULA VEGETAL DEUMA SEMENTE OLEAGINOSA, PLANTAS DE SEMENTE OLEAGINOSA,SEMENTES TRANGÊNICAS, PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, PROGÊNIES DEPLANTAS E MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA"
Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisórioUS'"60/801.119, depositado em 17 de maio de 2006, os conteúdos inteiros dosquais estão aqui incorporados, a título de referência.
Campo da Invenção
Esta invenção é do campo da biotecnologia. Maisespecificamente, esta invenção refere-se a identificação de fragmentos deácido nucléico que codificam uma enzima desaturase de ácido graxo delta-5 ea utilização desta desaturase na fabricação de ácidos graxos poliinsaturados -AGPs (polyunsaturated fatty acids - PUFAs) de cadeia longa.
Antecedentes da Invenção
A importância dos AGPs é indiscutível. Por exemplo, certos AGPssão componentes biológicos importantes de células saudáveis e sãoreconhecidos como: ácidos graxos "essenciais" que não podem sersintetizados de novo em mamíferos e ao invés disto precisam ser obtidos ou nadieta ou derivados por adicional desaturação e alongamento do ácido linoléico(LA; 18:2 ômega-6) ou ácido α-linolênico (ALA; 18:3 ômega-3); constituintes demembranas plasmáticas de células, onde eles podem ser encontrados emformas como fosfolipídeos ou triacil glicerol; necessários para odesenvolvimento adequado (particularmente no desenvolvimento do cérebro debebês) e para formação e reparo de tecidos; e precursores de várioseicosanóides biologicamente ativos importantes em mamíferos (por exemplo,prostaciclinas, eicosanóides, leucotrienos, prostaglandinas). Adicionalmente,um alto consumo de AGPs ômega-3 de cadeia longa produz efeitos protetorescardiovasculares (Dyerberg, J. et al., Amer. J. Clin. Nutr., 28:958-966 (1975);Dyerberg, J. et al., Lancet, 2(8081): 117-119 (15 de julho de 1978); Shimokawa,H., World Rev. Nutr. Diet1 88:100-108 (2001); von Schacky, C. and Dyerberg,J., World Rev. Nutr. Diet, 88:90-99 (2001)). E numerosos outros estudosdocumentam benefícios de saúde numa ampla faixa obtidos pela administraçãode AGPs ômega-3 e/ou ômega-6 para uma variedade de sintomas e doenças(por exemplo, asma, psoríase, eczema, diabetes, câncer).
Uma variedade de hospedeiros diferentes incluindo plantas, algas,fungos e levedura estão sendo investigados como meios para produçãocomercial de AGP. A engenharia genética tem demonstrado que as habilidadesnaturais de certos hospedeiros (mesmo aqueles limitados nativamente àprodução de ácido graxo LA e ALA) pode ser substancialmente alterada pararesultar na produção de alto nível de vários AGPs de cadeia longa ômega-3 ouômega-6. Seja o resultado de habilidades naturais ou de tecnologiarecombinante, a produção de ácido araquidônico (ARA; 20:4 ômega-6), ácidoeicosapentaenóico (EPA; 20:5 ômega-3) e ácido docosaexaenóico (DHA; 22:6ômega-3) pode requerer expressão de uma desaturase delta-5.
A maioria das enzimas desaturase delta-5 identificadas até agoratem a habilidade primária de converter ácido diomo-gama-linolênico (DGLA;20:3 ômega-6) em ARA, com atividade secundária convertendo ácidoeicosatetraenóico (ETA; 20:4 ômega-3) em EPA (onde DHA é,subseqüentemente, sintetizado de EPA seguindo a reação com uma adicionalelongase C20/22 e uma desaturase delta-4). A desaturase delta-5 tem um papelem ambas as rotas desaturase delta-6 /elongase delta-6 (que épredominantemente encontrado em algas, musgos, fungos, nematódeos eseres humanos e que é caracterizada pela produção de ácido gama-linolênico(GLA; 18:3 ômega-6) e/ou ácido estearidônico (STA; 18:4 ômega-3)) e as rotaselongase delta-9 /desaturase delta-8 (que opera em alguns organismos, comoespécies euglenóides e que é caracterizada pela produção de ácidoeicosadienóico (EDA; 20:2 ômega-6) e/ou ácido eicosatrienóico (ETrA; 20:3ômega-3)) (figura 1).
Com base na função que as enzimas desaturase delta-5desempenham na síntese de, por exemplo, ARA, EPA e DHA, tem sido feito umesforço considerável por várias fontes para identificar e caracterizar estasenzimas. Como resultado, numerosos desaturase delta-5 têm sido apresentadosem ambas as literaturas abertas (por exemplo, GenBank n° de acesso AF199596,n° AF226273, n° AF320509, n° AB072976, n° AF489588, n° AJ510244, n°AF419297, n° AF07879, n° AF067654 e n° AB022097) e literaturas de patentes(por exemplo, patentes U.S. n° 5.972.664 e 6.075.183). Também, de propriedadecomum, co-pendente pedido tendo pedido provisório 60/915733 (depositado em17 de maio de 2006) apresenta seqüências de aminoácidos e de ácido nucléicospara uma enzima desaturase delta-5 de Peridium sp. CCMP626, enquanto depropriedade comum, co-pendente pedido tendo pedido provisório n° 60/915733(BB1614) (depositado em 3 de maio de 2007) apresenta seqüências deaminoácido e de ácidos nucléicos para uma enzima desaturase delta-5 deEuglena anabaena.
A presente invenção refere-se à identificação e ao isolamento degenes adicionais que codificam desaturases delta-5 a partir de Euglena gracilisque seriam adequados para expressão heteróloga em uma variedade deorganismos hospedeiros para uso na produção de ácidos graxos ômega-3/ômega-6.
Sumário da Invenção
A presente invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado quecompreende:
(a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptídeo com atividade de desaturase delta-5, sendo que o polipeptídeotem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade coma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID n° 2, com base nométodo de alinhamento Clustal W;
(b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptídeo com atividade de desaturase delta-5, sendo que a seqüência denucleotídeos tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% deidentidade com a seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID n° 1 ouSEQ ID n° 3, com base no método de alinhamento BLASTN;
(c) uma seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptídeo com atividade de desaturase delta-5, sendo que a seqüência denucleotídeos hibridiza sob condições estringentes em uma seqüência denucleotídeos como estabelecido na SEQ ID n° 1 ou SEQ ID n° 3; ou
(d) um complemento da seqüência de nucleotídeos de (a), (b)ou (c), sendo que o complemento e as seqüências de nucleotídeos consistemem quantidades iguais de nucleotídeos e são 100% complementares.
Em uma segunda realização, a invenção refere-se a um construtode DNA recombinante de forma que compreende quaisquer dospolinucleotídeos isolados da invenção operacionalmente ligados a pelo menosuma seqüência reguladora.
Em uma terceira realização, a invenção refere-se a uma célulaque compreende em seu genoma o construto de DNA recombinante dainvenção. Tais células podem ser células vegetais ou células de levedura.Em uma quarta realização, a invenção refere-se a um métodopara transformar uma célula, que compreende transformar uma célula com umconstruto recombinante da invenção ou um polinucleotídeo isolado da invençãoe selecionando estas células transformadas com o construto recombinante ou opolinucleotídeo isolado.
Em uma quinta realização, a invenção refere-se a uma sementetransgênica que compreende em seu genoma o construto recombinante dainvenção ou uma semente transgênica obtida a partir de uma planta, feita porum método da invenção. Também é de interesse óleo ou subprodutos obtidos apartir de tais sementes transgênicas.
Na sexta realização, a invenção diz respeito a um método para aprodução de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, em uma célulavegetal compreendendo:
(a) transformar uma célula com o construto recombinante dainvenção, e
(b) selecionar aquelas células transformadas que formamácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa.
Na sétima realização, a invenção refere-se a um método paraproduzir pelo menos um ácido graxo poliinsaturado na célula vegetal dasemente oleaginosa que compreende:
(a) transformar uma célula vegetal de semente oleaginosa comum primeiro construto de um DNA recombinante compreendendo umpolinucleotídeo isolado que codifica pelo menos um polipeptídeo desaturasedelta-5, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora e pelomenos um construto de DNA recombinante adicional compreendendo umpolinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüênciareguladora que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo formado por umadesaturase delta-4, uma desaturase delta-5, uma desaturase delta-6, umadesaturase delta-8, uma desaturase delta-12, uma desaturase delta-15, umadesaturase delta-17, uma desaturase delta-9, uma elongase delta-9, umaelongase C14/16, uma elongase C16/18. uma elongase C18/20e uma elongase C20/22;
(b) regenerar uma planta oleaginosa a partir das célulastransformadas da etapa (a); e
(c) selecionar essas sementes obtidas a partir das plantas daetapa (b) que têm o nível de ácidos graxos poliinsaturados alterado emcomparação com o nível em sementes obtidas a partir de uma planta comsementes oleaginosas não transformadas.
Em uma oitava realização, a invenção diz respeito a uma plantade semente oleaginosa que compreende em seu genoma o construtorecombinante da invenção. As plantas com sementes oleaginosas adequadasincluem, mas não estão limitadas a, soja, espécies Brassica, girassol, milho,algodão, Iinho e cártamo.
Em uma nona realização, a invenção refere-se a uma planta desemente oleaginosa que compreende:
(a) um primeiro construto de DNA recombinante quecompreende um polinucleotídeo isolado que codifica pelo menos umpolipeptídeo desaturase delta-5, operacionalmente ligado a pelo menos umaseqüência reguladora; e
(b) pelo menos um construto de DNA recombinante adicional quecompreende um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelo menosuma seqüência reguladora que codifica um polipeptídeo selecionado do grupoformado por uma desaturase delta-4, uma desaturase delta-5, uma desaturasedelta-6, uma desaturase delta-8, uma desaturase delta-12, uma desaturase delta-15, uma desaturase delta-17, uma desaturase delta-9, uma elongase delta-9, umaelongase C14/16, uma elongase C16/18, uma elongase C18/20 e uma elongase C20/22;
Igualmente interessantes são as sementes transgênicas obtidas apartir de tais plantas de semente oleaginosas, bem como óleo ou subprodutosobtidos a partir dessas sementes transgênicas. Um subproduto preferencial élecitina.
Em uma décima realização, a invenção refere-se a produtosalimentícios incorporando um óleo ou semente da invenção ou produtosalimentícios compreendendo um ingrediente derivado do processamento dassementes.
Em uma décima primeira realização, a invenção diz respeito aprogênies de plantas obtidas a partir de uma planta feita pelo método dainvenção ou uma planta de semente oleaginosa da invenção.
Breve Descrição das Figuras ε Listas de Seqüências
A figura 1 ilustra a via biossintética de ácidos graxos ômega-3/ômega-6.
A figura 2 mostra um cromatograma de um perfil de lipídio de umextrato de célula de Euglena gracilis conforme descrito no exemplo 1.
A figura 3 mostra uma porção de um alinhamento entre proteínasdesaturase delta-5 e proteínas desaturase delta-8 usando uma análise ClustalW (MegAlign™ programa de software DNASTAR).
A figura 4 representa graficamente a relação entre as SEQ ID: 1,2, 4, 5, 6, 8 e 10, sendo que cada uma delas relaciona-se com a desaturasedelta-5 Euglena gracilis.
A figura 5A ilustra a estratégia de clonagem utilizada para aamplificação do gene desaturase delta-5 de Euglena gracilis (EgD5). A figura5B é um mapa do plasmídeo pZUF17, enquanto a figura 5C é um mapa doplasmídeo pDMW367.
A figura 6 fornece mapas de plasmídeo de: (A) pKUNF12T6E, (B)pEgD5S; e (C) pDMW369.
A figura 7 mostra uma comparação entre a seqüência de DNA dogene da delta-5 desaturase de Euglena gracilis (chamada de "EgD5"; SEQ IDn°: 1) e o gene sintético (chamado de "EgD5S"; SEQ ID n°: 3) códon-otimizadopara expressão em Yarrowia lipolytica.
As figuras 8A e 8B mostram um alinhamento Clustal V (com osparâmetros pré-estabelecidos) de uma desaturase delta-8 de Pavlova Iutheri (SEQID n°: 18), uma desaturase delta-8 de Pavlova salina (SEQ ID n°: 64), umadesaturase delta-8 de Euglena gracilis (SEQ ID NO: 16) e duas diferentesdesaturases de ácidos graxos de delta-6 de Rhizopus stolonifer (SEQ ID n°: 51 e63).
A figura 9 fornece mapa do plasmídeo para pY98.
A figura 10A fornece o perfil de ácidos graxos de Yarrowialipolytica expressando pY98 (SEQ ID n°: 76; compreendendo um genedesaturase delta-5 de Mortierella alpina designado como "MaD5") oupDMW367 (SEQ ID n°: 23; compreendendo o gene desaturase delta -5 deEuglena gracilis designado como "EgD5") e alimentados com diferentessubstratos. A figura 10B oferece uma comparação entre a especificidade desubstrato ômega-3 e ômega-6 de MaD5 versus EgD5.
A figura 11 fornece mapas de plasmídeo de: (A) pKR916; (B)pKR1037 e (C) pKR328.
A figura 12A fornece os perfis médios de ácidos graxos durante dezeventos de maior atividade de desaturase delta-5 quando a enzima deMortierella alpina (MaD5) é transformada em embriões de soja. A figura 12Afornece os perfis médios de ácidos graxos durante dez eventos de maioratividade de desaturase delta-5 quando a enzima de Euglena gracilis (EgD5) étransformada em embriões de soja. Os ácidos graxos são identificadas como16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oléico), LA, ALA, EDA, SCI,DGLA, ARA, ERA, JUP, ETA e EPA. Os ácidos graxos mencionados como"outros" incluem: 18:2 (5,9), GLA, STA, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) ou 20:2 (8,11)e DPA. Cada um destes "outros" ácidos graxos está presente em umaabundância relativa de menos de 3,0% do total de ácidos graxos. Ascomposições de ácidos graxos de um embrião individual foram expressas comopercentagem em peso (%) do total de ácidos graxos e a composição média deácidos graxos é uma média de seis embriões individuais para cada evento. Afigura 12B mostra que a atividade de EgD5 em embriões de soja é muito alta,com uma conversão média (% desaturase delta-5 correta) de 77% a 99% nosdez melhores eventos.
A figura 13 fornece a atividade da desaturase delta-5 para ossubstratos "corretos" ("% de desaturase delta-5 correta") está representadagraficamente no eixo χ versus a atividade da desaturase delta-5 para ossubstratos "errados" ("% desaturase delta-5 errada") está representadagraficamente no eixo y para MaD5 (consulte a figura 12A) ou EgD5 (consulte afigura 12B). A especificidade de substrato de EgD5 tem uma preferência pelossubstratos "corretos" sobre os substratos "errados" quando comparada a MaD5.
A invenção pode ser mais plenamente entendida a partir daseguinte descrição detalhada e descrições de seqüências anexas, que fazemparte do presente pedido.
As seqüências a seguir obedecem a C.F.R. 37, 1,821-1,825("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequencesand/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules") e sãoconsistentes com a Organização Mundial de Propriedade Intelectual (OMPI)padrão ST.25 (1998) e os requisitos para seqüência listados pelo EPO e PCT(regras 5,2 e 49,5(a-bis), e seção 208 e anexo C das instruçõesadministrativas). Os símbolos e formato usados para os dados de seqüência deaminoácidos e de nucleotídeos estão de acordo com as regras estabelecidasno 37 CFR § 1,822. §1,822.
As SEQ ID n°1 a 26, 48, 49, 51 a 54, 61 a 64, 67 a 72 e 75 a 76são ORFs que codificam genes ou proteínas (ou porções dos mesmos), ouplasmídeos, como identificado na Tabela 1.
Tabela 1
Sumário de Números de SEQID de Ácido Nucléico ε Proteína
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As SEQ ID n0: 27 a 30 correspondem a iniciadoresoligonucleotídeos degenerados 5-1 A, 5-1B, 5-1C e 5-1 D, respectivamente, quecodificam a Região Conservada 1.
As SEQ ID n°: 31 a 34 correspondem a iniciadoresoligonucleotídeos degenerados 5-5AR, 5-5BR, 5-5CR e 5-5DR,respectivamente, que codificam Região Conservada 2.
As SEQ ID n°: 35 a 40 correspondem a iniciadores ODMW480,CDSIII 5\ ODMW479, DNR CDS 5\ YL791 e YL792, respectivamente, usadospara 5' RACE.
As SEQ ID n°: 41 a 43 correspondem a iniciadores ODMW469,AUAP e ODMW470, respectivamente, usados para 3' RACE.
As SEQ ID n°: 44 a 47 correspondem aos iniciadores YL794,YL797, YL796 e YL795, respectivamente, usados para amplificação docomprimento total de cDNA de EgD5.
A SEQ ID n°: 50 corresponde a iniciador T7, usado paraseqüenciamento da biblioteca de Pavlova lutheri (CCMP459) cDNA.
As SEQ ID n°: 55 e 56 correspondem a iniciadores SeqE eSeqW, respectivamente, usados para seqüenciamento de clones de Pavlovalutheri (CCMP459).
As SEQ ID n°: 57 e 58 correspondem ao iniciador universal AP1 einiciador GSP PvDES, respectivamente, usado para amplificação de DNAgenômico Pavlova lutheri (CCMP459) DNA.
As SEQ ID n°: 59 e 60 correspondem aos iniciadores M13-28Reve PavDES seq, respectivamente, usados para seqüenciamento de elementosde inserção genômicos de Pavlova lutheri (CCMP459).
As SEQ ID n°:65 a 66 correspondem ao iniciador AP e iniciadoroligonucleotídeo Smart IV, respectivamente, usados para síntese de cDNA deEuglena gracilis.
As SEQ ID n° 73 e 74 são iniciadores GPDsenso eGPDantisenso, respectivamente, usado para amplificar o promotor GPD.
As SEQ ID n° 79 e 80 correspondem a iniciadores oEugEL1-1 eoEugEL1-2, respectivamente, usado para amplificar uma elongase delta-9 deEuglena gracilis (EgD9e).Descrição Detalhada da Invenção
Todas as patentes, pedidos de patente e publicações citadas napresente invenção estão aqui incorporados, em sua totalidade, a título dereferência. Estas especificamente incluem os seguintes pedidos co-pendentesdo cessionário requerente: Patente U.S. n° 7.125.672, Patente U.S. n°7.189.559, Patente U.S. n° 7.192.762, Patente U.S. n° 7.198.937, Patente U.S.n° 7.202.356, pedidos de Patente U.S. n° 10/840579 e U.S. n° 10/840325(depositados em 6 de maio de 2004), pedido de Patente U.S. n° 10/869630(depositado em 16 de junho de 2004), pedido de Patente U.S. n° 10/882760(depositado em 1 de julho de 2004), pedidos de Patente U.S. n° 10/985254 eU.S. n° 10/985691 (depositados em 10 de novembro de 2004), pedido dePatente U.S. n° 11/024544 (depositado em 29 de dezembro de 2004), pedidode Patente U.S. n° 11/166993 (depositado em 24 de junho de 2005), pedido dePatente U.S. n° 11/183664 (depositado em 8 de julho de 2005), pedido de15 Patente U.S. n° 11/185301 (depositado em 20 de julho de 2005), pedido dePatente U.S. n° 11/190750 (depositado em 27 de julho de 2005), pedido dePatente U.S. n° 11/198975 (depositado em 8 de agosto de 2005), pedido dePatente U.S. n° 11/225354 (depositado em 13 de setembro de 2005), pedidode Patente U.S. n° 11/253882 (depositado em 19 de outubro de 2005), pedidosde Patente U.S. n° 11/264784 e n° 11/264737 (depositados em 1 de novembrode 2005), pedido de Patente U.S. n° 11/265761 (depositado em 2 de novembrode 2005), pedido de Patente U.S. n° 11/737.772 (depositado em 20 de abril de2007), pedido de Patente U.S. n° 11/787.772 (depositado em 17 de abril de2007), pedido de Patente U.S. n° 11/740.298 (depositado em 26 de abril de2007), pedidos de Patente U.S. n° 60/801172 e U.S. n° 60/801119 (depositadosem 17 de maio de 2006), pedido de Patente U.S. n° 60/853563 (depositado 23de outubro de 2006), pedido de Patente U.S. n° 60/855177 (depositado em 30de outubro de 2006), pedidos de Patente U.S. n° 11/601563 e n° 11/601564(depositados em 16 de novembro de 2006), pedido de Patente U.S. n°11/635258 (depositado 7 de dezembro de 2006), pedido de Patente U.S. n°11/613420 (depositado em 20 de dezembro de 2006), pedido de Patente U.S.n° 60/909790 (depositado em de abril 2007), pedido de Patente U.S. n°60/911925 (depositado em 16 de abril de 2007), pedido de Patente U.S. n°60/910831 (depositado em 10 de abril de 2007) e pedido de Patente U.S. n°60/915733 (BB1614) (depositado em 3 de maio de 2007). Isto também inclui osseguintes pedidos co-pendentes do cessionário requerente: Publicação PCTUS n° 2005/0136519, referente à produção de AGPs em plantas; e Patente U.S. n° 7.129.089, referente a promotores de anexina e seus usos naexpressão de transgenes em plantas.
Para uso na presente invenção e nas reivindicações anexas, asformas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referência plural a menos que ocontexto claramente indique o contrário. Assim, por exemplo, a referência a"uma planta" inclui uma pluralidade de tais plantas, a referência a "uma célula"inclui uma ou mais células e equivalentes das mesmas conhecidas pelosversados na técnica, e assim por diante.
De acordo com a presente invenção, o requerente identificouuma nova enzima desaturase delta-5 de Euglena gracilise e o gene quecodifica a mesma, que pode ser usado para a manipulação de viasbioquímicas para produção de AGPs saudáveis. Dessa forma, a presenteinvenção encontra muitas aplicações.
Os AGPs, ou seus derivados, criados pela metodologiaapresentada neste documento podem ser usados como substitutos dietéticos, ou suplementos, particularmente fórmulas para bebês, em pacientessubmetidos à alimentação intravenosa ou para prevenir ou tratar desnutrição.Alternativamente, os AGPs purificados (ou seus derivados) podem serincorporados em óleos de cozinha, gorduras e margarinas formuladas demodo que em condições normais de uso o destinatário receba a quantiadesejada para suplementação dietética. Os AGPs podem também serincorporados em fórmulas para bebês, suplementos nutricionais ou outrosprodutos alimentícios e pode encontrar uso como antiinflamatório ou agentesredutores de colesterol. Opcionalmente, as composições podem ser usadaspara fins farmacêuticos (humanos ou veterinários).
O fornecimento, a seres humanos ou a animais, de AGPsproduzido por meios recombinantes pode causar o aumento dos níveis de AGPsadicionados, bem como sua progênie metabólica. Por exemplo, o tratamentocom EPA pode resultar não só no aumento dos níveis de EPA, mas também dosprodutos a jusante da EPA, como eicosanóides (ou seja, prostaglandinas,leucotrienos, tromboxanas). Os mecanismos reguladores complexos podemtornar desejável a combinação de várias AGPs ou adicionar vários conjugadosde AGPs a fim de prevenir, controlar ou superar tais mecanismos para atingir osníveis desejados de AGPs específicos em um indivíduo.
Definições
Nesta descrição, uma série de termos e abreviações são usados.As definições a seguir são fornecidas.
"Quadro de leitura aberto" é abreviado como ORF [Open reading frame].
"Reação em cadeia da polimerase" é abreviado como PCR.
"American Type Culture Collection" é abreviado como ATCC.
"Ácido(s) graxo(s) poliinsaturado(s)" é (são) abreviado(s) como AGP(s).
"Triacilgliceróis" são abreviados como TAGs.
O termo "invenção" ou "presente invenção" para uso na presenteinvenção não pretende se referir a uma única realização específica dainvenção, mas abrange quaisquer e todas as realizações da invenção conformedescrito nas reivindicações e no relatório descritivo.
O termo "ácidos graxos" refere-se a cadeias longas de ácidosalifáticos (ácidos alcanóicos) de comprimentos de cadeia variáveis, de C12 aC22 (embora sejam conhecidos comprimentos maiores e menores de cadeiasde ácidos). Os comprimentos de cadeia predominantes estão entre C16 e C22. Aestrutura de um ácido graxo é representada por um simples sistema denotação "X:Y", onde X é o número total de átomos de carbono (C) no ácidograxo particular e Y é o número de ligações duplas. Detalhes adicionaisrelativos à diferenciação entre "ácidos graxos saturados" versus "ácidos graxosinsaturados", "ácidos graxos monoinsaturados" versus "ácidos graxospoliinsaturados" (ou "AGPs"), e "ácidos graxos ômega-6" (ômega-6 ou n-6)versus "ácidos graxos ômega-3" (ômega-3 ou n-3) são fornecidos na PatenteUS de publicação n° 2005/0136519.
Os ácidos graxos são descritos na presente invenção por umsistema de notação simples "X:Y", no qual X é o número de átomos de carbono(C) no ácido graxo particular e Y é o número de ligações duplas O númeroapós a designação dos ácidos graxos indica a posição da ligação dupla a partirda extremidade carboxila dos ácidos graxos com o sufixo "c" para a cis-configuração da ligação dupla (por exemplo, o ácido palmítico (16:0), ácidoesteárico (18:0), ácido oléico (18:1, 9c), ácido petroselinico (18:1, 6c), LA (18:2,9c, 12c), ABL (18:3, 6c, 9c, 12c) e ALA (18:3, 9c, 12c, 15c)). Salvo disposiçãoem contrário, 18:1, 18:2 e 18:3 referem-se a ácidos graxos oléico, LA e ALA,respectivamente. Se não escrito especificamente de outro modo, presume-seque ligações duplas são da configuração c/s. Por exemplo, presume-se que asligações duplas em 18:2 (9,12) têm a configuração eis.
A nomenclatura usada para descrever AGPs na presente descriçãoé mostrada a seguir na tabela 2. Na coluna intitulada "Notação abreviada", osistema de referência ômega é usado para indicar o número de carbonos, onúmero de ligações duplas e a posição da dupla ligação mais próxima docarbono ômega, contando a partir do carbono ômega (que é numerado 1 comesse propósito). O restante da tabela resume os nomes comuns de ácidosgraxos ômega-3 e ômega-6 e seus precursores, as abreviaturas que serãousadas em todo o relatório descritivo e o nome de cada composto químico.
Tabela 2
Nomenclatura de Ácidos Graxos Poliinsaturados ε Precursores
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Os termos "triacilglicerol", "óleo" e "TAGs" referem-se aos lipídiosneutros compostos por três acilas graxas esterificadas com uma molécula deglicerol (e esses termos serão usados de maneira intercambiável em toda adescrição da presente invenção). Tais óleos podem conter AGPs de cadeialonga, bem como ácidos graxos saturados e insaturados mais curtos e ácidosgraxos saturados de cadeia mais longa. Dessa forma, "biossíntese de óleo"refere-se genericamente para a síntese de TAGs na célula."Percentual (%) de AGPs nos lipídios totais e frações de óleo"referem-se à porcentagem de AGPs em relação ao total de ácidos graxosnessas frações. Os termos "fração de lipídios totais" ou "fração lipídica" ambosse referem à soma de todos os lipídeos (ou seja, neutro e polar) dentro de umorganismo oleaginoso, dessa forma incluindo os lipídeos que estão localizadosna fração fosfatidil colina (PC), fosfatidil etanolamina (PE) e fração triacilglicerol(TAG ou óleo). Entretanto, os termos "lipídio" e "óleo" serão usados de maneiraintercambiável por todo o relatório descritivo.
Uma via metabólica, ou via biossintética, no sentido bioquímico podeser considerada como uma série de reações químicas que ocorrem dentro de umacélula, catalisadas por enzimas para atingir, tanto a formação de um produtometabólico para ser usado ou armazenado pela célula quanto o início de outra viametabólica (então chamada de um fluxo gerador de etapa). Muitas destas vias sãoelaboradas e envolvem uma modificação passo a passo da substância inicial paramoldá-la em um produto com a exata estrutura química desejada.
O termo "via biossintética de AGP" refere-se a um processometabólico que converte ácido oléico para LA, EDA, GLA, DGLA, ARA, ALA, STA,ETrA, ETA, EPA, DPA e DHA. Este processo é bem descrito na literatura (porexemplo, consulte Publicação PCT n0 WO 2006/052870). Resumidamente, esteprocesso envolve o alongamento da cadeia de carbono através da adição deátomos de carbono e dessaturação da molécula através da adição de ligaçõesduplas, através de uma série de enzimas para dessaturação especial e elongação(ou seja, "enzimas da via biossintética de AGP") presentes na membrana doretículo endoplasmático. Mais especificamente, as "enzimas da via biossintéticade AGP" referem-se a qualquer uma das seguintes enzimas (e genes quecodificam estas ditas enzimas) associadas com a biossíntese de uma AGP,incluindo: uma desaturase delta-4, uma desaturase delta-5, uma desaturase delta-6, uma desaturase delta-12, uma desaturase delta-15, uma desaturase delta-17,uma desaturase delta-9, uma desaturase delta-8, uma elongase delta-9, umaelongase C14/16, uma elongase C16/18, uma elongase C18/20 e/ou uma elongaseC20/22·
O termo "via biossintética de ácidos graxos ômega-3/ômega-6"refere-se a um conjunto de genes que, quando expressos sob as condiçõesadequadas codificam enzimas que catalisam a produção de um ou ambos ácidosgraxos ômega-3 e ômega-6. Tipicamente os genes envolvidos na via biossintéticade ácidos graxos ômega-3/ômega-6 codificam enzimas da via biossintética deAGP. Uma via representativa é ilustrada na figura 1, que fornece a conversão do ácido mirístico, através de vários intermediários, para DHA, o que demonstracomo ambos ácidos graxos ômega-3 e ômega-6 podem ser produzidos a partir deuma fonte comum. A via é naturalmente dividida em duas porções, onde umaporção irá gerar ácidos graxos ômega-3 e a outra porção somente os ácidosgraxos ômega-6. Essa porção que apenas produz ácidos graxos ômega-3 será aqui referida como a via biossintética de ácido graxo ômega-3, enquanto que aporção que gera apenas ácidos graxos ômega-6 serão mencionados nestedocumento como a via biossintética de ácido graxo ômega-6.
O termo "funcional", como aqui usado em contexto com a viabiossintética de ácidos graxos ômega-3/ômega-6, significa que alguns ou todosos genes da via expressam enzimas ativas, resultando em catálise in vivo ouconversão de substrato. Deve ser entendido que "via biossintética de ácidosgraxos ômega-3/ômega-6" ou "via biossintética de ácidos graxos ômega-3/ômega-6 funcionais" não implica que todos os genes listados no parágrafoacima são necessários, já que uma série de produtos de ácidos graxos iráexigir apenas a expressão de um subconjunto dos genes desta via.
O termo "via desaturase delta-6 /elongase delta-6" irá referir-se auma via biossintética de AGP que inclui minimamente pelo menos umadesaturase delta-6 e pelo menos uma elongase C18/2o, permitindo assim abiossíntese de DGLA e/ou ETA a partir de LA e ALA, respectivamente, comGLA e/ou STA como ácidos graxos intermediários. Com expressão de outrasdesaturases e elongases, ARA, EPA, DPA e DHA podem também sersintetizados.
O termo "via elongase delta-9 /desaturase delta-8" irá referir-se auma via biossintética de AGP que inclui minimamente pelo menos uma elongasedelta-9 e pelo menos uma desaturase delta-8, permitindo assim a biossíntese deDGLA e/ou ETA a partir de LA e ALA, respectivamente, com GLA e/ou STAcomo ácidos graxos intermediários. Com expressão de outras desaturases eelongases, ARA, EPA, DPA e DHA podem também ser sintetizados.
O termo "intermediário de ácidos graxos" refere-se a qualquer dosácidos graxos produzidos em uma via metabólica de ácido graxo que podeainda ser convertido para um desejado produto de ácido graxo nesta via pelaação de outras enzimas da via metabólica. Por exemplo, quando EPA éproduzido usando a via elongase delta-9/desaturase delta-8, EDA, ETrA,DGLA, ETA e ARA podem ser produzidos e são considerados "ácidos graxosintermediários" desde que estes ácidos graxos podem ser ainda convertidospara EPA através da ação de outras enzimas da via metabólica.
O termo "ácidos graxos subprodutos" refere-se a qualquer dosácidos graxos produzidos em uma via metabólica de ácido graxo que não é umproduto desejado de ácido graxo nesta via nem "ácido graxo intermediário" davia metabólica. Por exemplo, quando APE é produzida usando a via elongasedelta-9 /desaturase delta-8, ácido esciadonico (SIC) e ácido juniperônico (JUP)também pode ser produzidos pela ação de uma desaturase delta- -5 emqualquer um dos EDA ou ETrA, respectivamente. Eles são considerados como"ácidos graxos subprodutos", já que nenhum deles pode ser ainda convertidopara APE pela ação de outras enzimas da via metabólica.
O termo "desaturase" refere-se a um polipeptídeo que podedesaturar, ou seja, introduzir uma ligação dupla em um ou mais ácidos graxospara produzir um ácido graxo ou precursor de interesse. Apesar de usar osistema de referência ômega em todo o relatório descritivo ao se referir adeterminados ácidos graxos, é mais conveniente para indicar a atividade deuma desaturase pela contagem a partir da extremidade carboxila do substratousando o sistema delta. De particular interesse neste documento são asdesaturases delta-5 que catalisam a conversão de DGLA para ARA e/ou deETA para EPA. Outras desaturases incluem: 1.) desaturases delta-17 quedesaturam um ácido graxo entre a 17° e 18° átomo de carbono numerados apartir da extremidade terminal carboxila da molécula e que, por exemplo,catalisam a conversão da ARA para EPA e/ou DGLA para ETA; 2.) desaturasesdelta-6 que catalisam a conversão de LA para GLA e/ou ALA para STA; 3.)desaturases delta-12 que catalisam a conversão de ácido oléico para LA; 4.)desaturases delta-15 que catalisam a conversão de LA para ALA e/ou GLApara STA; 5.) desaturases delta-4 que catalisam a conversão de DPA paraDHA; 6.) desaturases delta-8 que catalisam a conversão de EDA para DGLAe/ou ETrA para ETA; e, 7.) desaturases delta-9 que catalisam a conversão depalmitato para ácido palmitoléico (16:1) e/ou estearato para ácido oléico. Natécnica, as desaturases delta-15 e delta-17 são também ocasionalmentereferidas como "desaturases ômega-3", "desaturases w-3", e /ou" desaturasesômega-3", com base em sua capacidade de converter ácidos graxos ômega-6em suas respectivas contrapartidas ômega-3 (por exemplo, a conversão de LAem ALA e ARA em EPA, respectivamente). Em algumas realizações, éaltamente desejável que se determine empiricamente a especificidade de umadeterminada desaturase de ácido graxo pela transformação de um hospedeiroadequado com o gene para a desaturase de ácido graxo e determinando seusefeitos sobre o perfil dos ácidos graxos do hospedeiro.
O termo "desaturase delta-5" refere-se a uma enzima quedesatura um ácido graxo entre o quinto e sexto átomos de carbono numeradosa partir da carboxila da extremidade terminal da molécula. Preferencialmente,uma desaturase delta-5 converte ácido diomo-gama linolênico [20:3, DGLA]para ácido araquidônico [20:4, ARA] ou converte ácido eicosatetraenóico [20:4,ETA] para eicosapentaenóico [20:5, EPA].
Para os propósitos da presente invenção, o termo "EgD5" refere-se à enzima desaturase delta-5 (SEQ ID n°: 2) isolada a partir de Euglenagracilis, codificada pela SEQ ID N0: 1 da presente invenção. De modo similar, otermo "EgD5S" refere-se à desaturase delta-5 sintética derivada de Euglenagracilis que é códon-otimizada para expressão em Yarrowia Iipolytica (isto é,SEQ ID N0: 3 e 2).
Os termos "eficiência da conversão" e "porcentagem deconversão do substrato" referem-se à eficiência com que uma enzimaespecífica (por exemplo, uma desaturase) pode converter substrato emproduto. A eficiência da conversão é medida de acordo com a fórmula a seguir:([produto]/[substrato + produto])*100, onde 'produto' inclui o produto imediato etodos os produtos na via derivados dele.
O termo "elongase" refere-se a um polipeptídeo que pode alongaruma cadeia de carbono de ácido graxo para produzir um ácido que é maislongo 2 carbonos do que o substrato de ácido graxo em contato com aelongase. Este processo de alongamento ocorre em um mecanismo multi-etapa em associação com a ácido graxo sintase, conforme descrito naPublicação de Patente U.S. n° 2005/0132442. Exemplos de reaçõescatalisadas pelos sistemas elongase são as conversão de GLA para DGLA,STA para ETA e EPA para DPA. Em geral, a seletividade de substratoelongases é um pouco amplo, mas segregada pelas duas cadeias decomprimento e do grau e tipo de insaturação. Por exemplo, uma elongaseC14/16 irá utilizar um substrato Ci4 (por exemplo, ácido mirístico), uma elongaseCi6/ie irá utilizar um substrato Ci6 (por exemplo, palmitato), uma elongase C18/20(também conhecida como elongase delta-6 já que os termos podem serutilizados de forma intercambiável) irá utilizar um substrato Cia (por exemplo,GLA, STA) e uma elongase C20/22 irá utilizar um substrato C20 (por exemplo,EPA). Do mesmo modo, uma elongase delta-9 é capaz de catalisar aconversão de LA e ALA para EDA e ETrA, respectivamente. É importante notarque algumas elongases têm ampla especificidade e, portanto, uma únicaenzima pode ser capaz de catalisar reações de elongase diversas (porexemplo, a mesma pode agir como uma elongase C-i6/iee uma elongase C18/20)·
O termo "oleaginoso" refere-se àqueles organismos que tendem aestocar sua fonte de energia sob a forma de lipídio (Weete, In: Fungai LipidBiochemistry, 2nd Ed., Plenum, 1980). O termo "levedura oleaginosa" refere-seàqueles microorganismos classificados como leveduras que podem produziróleo. Geralmente, o óleo celular ou conteúdo TAG de microorganismosoleaginosos seguem uma curva sigmóide, onde a concentração de lipídeosaumenta até atingir um máximo na fase logarítmica tardia ou no começo dafase estacionária de crescimento e, em seguida, diminui gradualmente duranteas fases estacionárias tardias e morte (Yongmanitchai e Ward, App!. Environ.Microbiol., 57:419-25 (1991)). Não é incomum para microorganismosoleaginosos acumular um excesso de cerca de 25% de seu peso seco celularcomo óleo. Exemplos de levedura oleaginosa incluem, mas não estão denenhuma forma limitados a, os seguintes gêneros: Yarrowia, Candida,Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces.
O termo "Euglenophyceae" refere-se ao grupo de flagelados semcor e unicelulares ou fotossintetizantes ("euglenóides") que vivem emambientes de água doce, de água marinha, no solo e em ambientesparasíticos. A classe é caracterizada por unicelulares solitários, sendo que amaioria são nadadores e tem dois flagelos (um dos quais pode ser nãoemergente) decorrentes de uma invaginação anterior conhecida como umreservatório. Os euglenóides fotossintéticos contêm um ou muitos cloroplastos,que variam de discos diminutos a placas ou fitas expandidas. Os euglenóidessem cor dependem da osmotrofia ou da fagotrofia para assimilação denutrientes. Cerca de 1000 espécies foram descritas e classificadas em cerca de40 gêneros e 6 ordens. Exemplos de Euglenophyceae incluem, mas não estãode nenhuma forma limitados a, os seguintes gêneros: Euglena, Eutreptiella eTetruetreptia.
O termo "substituição conservativa de aminoácido" refere-se auma substituição de um resíduo de aminoácido em uma determinada proteínacom um outro aminoácido, sem alterar a natureza química ou funcional daquelaproteína. Por exemplo, é bem conhecido na técnica que alterações em umgene que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalenteem um determinado local (mas isto não afeta as propriedades estruturais efuncionais da proteína dobrada codificada) são comuns. Para os propósitos dapresente invenção, "substituições conservativas de aminoácidos" são definidascomo trocas dentro de um dos cinco grupos a seguir:
1. Resíduos alifáticos pequenos, não-polar ou levemente polar:
Ala [A], Ser [S], Thr [T] (Pro [P], Gly [G]);
2. Resíduos polares, carregados negativamente e suas amidas:
Asp [D], Asn [N], Glu [E], Gln [Q];
3.Resíduos polares, carregados positivamente: His [H], Arg [R],
Lys [K];
4.Resíduos alifáticos grandes, não-polares: Met [M], Leu [L], Ile
[I], Val [V] (Cys [O]); e,
5.Resíduos aromáticos grandes: Phe [F], Tyr [Y], Trp [W],
As substituições conservativas de aminoácidos geralmentemantêm: 1) a estrutura da cadeia principal do polipeptídeo na área dasubstituição; 2) a carga ou capacidade hidrofóbica da molécula no localdesejado; ou 3) o volume da cadeia lateral. Adicionalmente, em muitos casos,não se espera que alterações das porções N-terminal e C-terminal dasmoléculas da proteína alterem a atividade da proteína.
Para uso na presente invenção, "ácido nucléico" significa umpolinucleotídeo e inclui polímeros de bases de desoxirribonucleotídeo ou deribonucleotídeo de fita simples ou dupla. Os ácidos nucléicos podem tambémincluir fragmentos e nucleotídeos modificados. Dessa forma, os termos"polinucleotídeo", "seqüência de ácido nucléico", "seqüência de nucleotídeos"ou "fragmento de ácido nucléico" são usados de maneira intercambiável e sereferem a um polímero de RNA ou DNA que é de fita sim pies ou dupla,opcionalmente contendo bases de nucleotídeo sintéticas, não-naturais oualteradas. Os nucleotídeos (normalmente encontrados em sua forma 5'-monofosfato) são chamados pela designação de uma única letra como segue:"A" para a adenilato ou deoxiadenilato (por RNA ou DNA, respectivamente), "C"para citidilato ou deosicitidilato, "G" para o guanilato ou deoxiguanilato, "U"parauridlate, "T" para deositimidilato, "R" para purinas (A ou G), "Y" para pirimidinas(C ou Τ), "K" para G ou Τ, "H" para A ou C ou Τ, "I" para inosina e "N" paraqualquer nucleotídeo.
Os termos "subfragmento que são funcionalmente equivalentes" e"subfragmentos funcionalmente equivalentes" são usados aqui de maneiraintercambiável. Esses termos referem-se a uma porção ou subseqüência deum fragmento isolado de ácidos nucléicos em que a capacidade de alterarexpressão gênica ou produzir um determinado fenótipo é retido se o fragmentoou subfragmento codifica uma enzima ativa ou não. Por exemplo, o fragmentoou subfragmento podem ser usados no design dos genes quiméricos paraproduzir o fenótipo desejado na planta transformada. Os genes quiméricospodem ser projetados para uso na supressão ao ligar um fragmento ousubfragmento do ácido nucléico, codificando ou não uma enzima ativa, naorientação senso ou antisenso relativa à seqüência promotora da planta.
O termo "domínio conservado" ou "motivo" significa um conjunto deaminoácidos conservados em posições específicas ao longo de uma seqüênciaalinhada de proteínas evolutivamente relacionadas. Enquanto aminoácidos emoutras posições podem variar entre as proteínas homólogas, aminoácidos que sãoaltamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que sãoessenciais na estrutura, estabilidade ou na atividade de uma proteína. Porque elessão identificados pelo seu alto grau de conservação nas seqüências alinhadas deuma família de proteínas homólogas, eles podem ser usados como identificadoresou "assinaturas" para determinar se uma proteína com uma nova seqüênciadeterminada pertence a uma família protéica previamente identificada.
Os termos "homologia", "homólogo", "substancialmente similar" e"substancialmente correspondente" são usados de maneira intercambiável napresente invenção. Eles se referem a fragmentos de ácidos nucléicos em quemudanças em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam a habilidade dofragmento de ácido nucléico de mediar expressão gênica ou produzir umdeterminado fenótipo. Estes termos também se referem às alterações dosfragmentos do ácido nucléico da presente invenção, como a supressão ouinserção de um ou mais nucleotídeos que não alterem substancialmente aspropriedades funcionais do fragmento resultante de ácido nucléico em relaçãoao fragmento inicial sem modificação. É, portanto, entendido, como aquelesversados na técnica irão apreciar, que a invenção abrange mais do que asseqüências exemplificadoras específicas.
Além disso, o versado na técnica reconhece que as seqüênciasde ácidos nucléicos substancialmente similares abrangidas por essa invençãotambém são definidas pela sua capacidade de hibridizar (sob condiçõesmoderadamente estringentes, por exemplo, 0,5 X SSC, 0,1% SDS, 60°C) comas seqüências exemplificadas aqui, ou para qualquer porção das seqüênciasde nucleotídeos apresentadas aqui e que são funcionalmente equivalentes aqualquer uma das seqüências de ácidos nucléicos apresentadas nestedocumento. As condições de estringência podem ser ajustadas para testarpor fragmentos moderadamente semelhantes, como seqüências homólogasde organismos aparentados de forma distante, e até por fragmentos muitosemelhantes, como os genes que duplicam enzimas funcionais deorganismos estreitamente aparentados. As lavagens pós hibridizaçãodeterminam as condições de estringência.
O termo "hibridizar seletivamente" inclui referências àhibridização, sob severas condições de hibridização, de uma seqüência deácido nucléico para uma determinada seqüência alvo de ácido nucléico comum maior grau detectável (por exemplo, pelo menos 2 vezes acima que a base)do que sua hibridização de seqüências de ácidos nucléicos que não são alvo epara a exclusão substancial dos ácidos nucléicos não-alvo. A hibridizaçãoseletiva de seqüências tipicamente tem cerca de pelo menos 80% deidentidade, ou 90% de identidade, ou até e incluindo 100% de identidade, deseqüências (isto é, totalmente complementares) de uma com a outra.
Os termos "condições estrigentes" ou "condições estrigentes dehibridização" incluem referência às condições sob as quais uma sonda iráhibridizar seletivamente para sua seqüência-alvo. As condições estrigentessão dependentes da seqüência e serão diferentes em circunstânciasdiferentes. Ao controlar a estringência da hibridização e/ou das condições delavagem, as seqüências-alvo que são 100% complementares podem seridentificadas para a sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, ascondições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma falta decorrelação nas seqüências de modo que graus mais baixos de similaridadesão detectados (sondagem heteróloga). Genericamente, uma sonda é menosque cerca de 1000 nucleotídeos em comprimento, opcionalmente menos que500 nucleotídeos em comprimento.
Tipicamente, as condições estrigentes serão aquelas em que aconcentração de sal é inferior a cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente cercade 0,01 a 1,0 M concentração de íons Na (ou outros sais) de pH 7,0 a 8,3 e atemperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo,10 a 50 nucleotídeos) e, pelo menos, cerca de 60°C para sondas longas (porexemplo, mais que 50 nucleotídeos). As condições estrigentes podemtambém ser conseguidas com a adição de agentes desestabilizantes comoformamida. As condições de estringência baixa exemplificadoras incluemhibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCI 1 M,SDS 1% (sulfato de sódio dodecila) a 37°C, e uma lavagem em 1X a 2X SSC(20X SSC = NaCI 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) de 50 a 55°C. As condições deestringência moderada exemplificadoras incluem hibridização com formamidade 40 a 45%, NaCI 1 M, SDS 1% a 37°C e uma lavagem em 0,5X SSC de 55a 60°C. As condições de estringência alta exemplificadoras incluemhibridização com formamida a 50%, NaCI 1 M, SDS 1% a 37°C e umalavagem em 0,1 X SSC de 60 a 65°C.
A especificidade é tipicamente a função de lavagens de pós-hibridização, sendo os fatores críticos a força iônica e a temperatura da soluçãofinal de lavagem. Para híbridos de DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada apartir da equação de Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138:267-284 (1984): Tm =81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; Onde M é amolaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeosguanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida nasolução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de base. ATm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de umaseqüência-alvo complementar hibridiza com uma sonda perfeitamentecompatível. A Tm é reduzida por cerca de 1°C para cada 1% de falta decorrelação; dessa forma, Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podemser ajustados para hibridizar para seqüências da identidade desejada. Porexemplo, se forem procuradas seqüências com >90% de identidade, a Tm podeser diminuída em 10°C. Geralmente, as condições estrigentes sãoselecionadas para ter cerca de 5°C menos que o ponto de fusão térmico (Tm)da seqüência específica e de seu complemento numa força iônica e pHdefinidos. Entretanto, condições severamente estrigentes podem utilizar umahibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4°C menor que o ponto de fusãotérmico (Tm); condições moderadamente estrigentes podem utilizar umahibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C menos que o ponto de fusãotérmico (Tm); condições pouco estrigentes podem utilizar uma hibridização e/oulavagem a 11, 12, 13, 14 15 ou 20°C menos que o ponto de fusão térmico (Tm);Usando a equação, hibridização e composições de lavagem, e Tm desejada,aqueles de habilidade comum entenderão que as variações na estrigência dahibridação e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se odesejado grau de falta de correlação resulta em uma T m de menos de 45°C(solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida) é preferível aumentar aconcentração SSC para que uma temperatura mais elevada possa ser usada.Um guia extensivo para a hibridização de ácido nucléicos é encontrado emTijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principiesof hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, NewYork (1993); e Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel etal., Eds., Greene Publishing e Wiley-Interscience, New York (1995). Ahibridização e/ou as condições de lavagem podem ser aplicadas por pelomenos 10, 30, 60, 90, 120 ou 240 minutos.
Uma "parte substancial" de um aminoácido ou seqüência denucleotídeos é a parte que compreende o suficiente da seqüência deaminoácidos de um polipeptídeo ou da seqüência de nucleotídeos de um genepara identificar putativamente que polipeptídeo ou gene, ou por avaliaçãomanual da seqüência por um perito na técnica, ou pelo comparação eidentificação seqüencial automática por computador, utilizando algoritmoscomo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al., J. Mol.Biol., 215:403-410 (1993)). Em geral, uma seqüência de dez ou maisaminoácidos contíguos ou trinta ou mais nucleotídeos é necessária a fim deputativamente identificar uma seqüência de polipeptídeos ou de ácido nucléicocomo homóloga a uma proteína ou um gene conhecido. Além disso, no que dizrespeito às seqüências de nucleotídeos, sondas de oligonucleotídeo de genesespecíficos compreendendo 20 a 30 nucleotídeos contíguos podem serutilizadas nos métodos de identificação dependentes de identificação de geneda seqüência (por exemplo, "Southern hybridization") e de isolamento (porexemplo, hibridização "in situ" de colônias bacterianas ou placasbacteriófagos). Adicionalmente, oligonucleotídeos curtos de 12 a15 basespodem ser utilizados como iniciadores de amplificação da PCR, a fim de obterum determinado fragmento do ácido nucléico compreendendo os iniciadores.
Conseqüentemente, uma "parte substancial" de uma seqüência denucleotídeos compreende bastante da seqüência para identificarespecificamente e/ou isolar um fragmento do ácido nucléico compreendendo aseqüência. O presente relatório descritivo ensina a completa seqüência deaminoácidos e nucleotídeos codificando particulares proteínas euglenóides. Oversado na técnica, tendo o benefício das seqüências como aqui relatadas,podem agora usar a totalidade ou uma parte substancial das seqüênciasdivulgadas, para fins conhecidos pelos qualificados nesta técnica.Conseqüentemente, a presente invenção compreende as completasseqüências como relatado na lista de seqüências anexa, bem como porçõessignificativas dessas seqüências como definido acima.
O termo "complementar" é utilizado para descrever a relaçãoentre as bases de nucleotídeos que são capazes de hibridizar uma à outra. Porexemplo, no que diz respeito ao DNA1 adenosina é complementar à timina ecitosina é complementar à guanina. Conseqüentemente, a invenção nestedocumento também inclui fragmentos isolados de ácidos nucléicos que sãocomplementares às seqüências completas como relatado na lista deseqüências anexa, bem como as seqüências de ácidos nucléicossubstancialmente semelhantes.
Os termos "homologia" e "homólogo" são usados de maneiraintercambiável neste documento. Eles se referem a fragmentos de ácidosnucléicos em que mudanças em uma ou mais bases de nucleotídeos nãoafetam a habilidade do fragmento de ácido nucléico de mediar expressãogênica ou produzir um determinado fenótipo. Estes termos também se referemàs alterações dos fragmentos do ácido nucléico da presente invenção, como asupressão ou inserção de um ou mais nucleotídeos que não alteremsubstancialmente as propriedades funcionais do fragmento resultante de ácidonucléico em relação ao fragmento inicial sem modificação. É, portanto,entendido, como aqueles versados na técnica irão apreciar, que a invençãoabrange mais do que as seqüências exemplificadoras específicas.
Além disso, o versado na técnica reconhece que as seqüênciasde ácidos nucléicos homólogas abrangidas por essa invenção também sãodefinidas pela sua capacidade de hibridizar sob condições moderadamenteseveras (por exemplo, 0,5 X SSC, 0,1% SDS, 60°C) com as seqüênciasexemplificadas aqui, ou para qualquer parte do seqüências de nucleotídeosapresentadas aqui e que são funcionalmente equivalentes a qualquer uma dasseqüências de ácidos nucléicos apresentadas neste documento.
"Degenerescência do códon" refere-se à natureza no códigogenético que permite a variação da seqüência de nucleotídeos sem afetar aseqüência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado. Conseqüentemente, ainvenção refere-se a qualquer fragmento de ácido nucléico que codifica atotalidade ou uma parte substancial da seqüência de aminoácidos que codifica opolipeptídeo euglenóide, conforme estipulado na SEQ ID NO: 2. O versado natécnica está bem consciente da "preferência do códon (codon-bias)" exibida poruma determinada célula hospedeira no uso de códons de nucleotídeos paraespecificar um determinado aminoácido. Por isso, quando sintetizando um genepara a melhoria da expressão gênica em uma célula hospedeira, é desejável queo design do gene seja de tal forma que a sua freqüência de uso do códon sejapróxima da freqüência preferencial de uso do códon da célula hospedeira.
"Quimicamente sintetizado", como relacionado à seqüência deDNA, significa que os nucleotídeos componentes foram montados in vitro. Asíntese química manual de DNA pode ser realizada usando-se procedimentosbem estabelecidos, ou, síntese química automatizada podem ser realizadosusando-se uma da série de máquinas disponíveis comercialmente. "Genessintéticos" podem ser montados a partir de estruturas básicas deoligonucleotídeos que são quimicamente sintetizados usando procedimentosconhecidos pelos versados na técnica. Estas estruturas básicas são ligadas eaneladas para formar segmentos de gene que são então enzimaticamentemontados para construir o gene inteiro. Conseqüentemente, os genes podemser adaptados para otimizar expressão gênica baseada na otimização daseqüência nucleotídica para refletir a preferência do códon da célulahospedeira. O versado na técnica aprecia a possibilidade de expressãogênica bem sucedida se o uso do códon é tendencioso para os códonsfavorecidos pelo hospedeiro. A determinação dos códons preferenciais podeser baseada em um estudo de genes derivados da célula hospedeira, onde ainformação da seqüência está disponível."Gene" refere-se a um fragmento de ácido nucléico que expressauma proteína específica, e que pode se referir à região de codificação sozinhaou pode incluir seqüências reguladoras que precedem (seqüências 5' nãocodificantes) e seguem (seqüências 3' não codificantes) a seqüência decodificação. "Gene nativo" refere-se a um gene como encontrado na naturezacom as suas próprias seqüências reguladoras. "Gene quimérico" refere-se aqualquer gene que não é um gene nativo, compreendendo seqüênciasreguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza.Conseqüentemente, um gene quimérico pode compreender seqüênciasreguladoras e de seqüências de codificação que são derivadas de fontesdiferentes, ou seqüências reguladoras e seqüências de codificação obtidas apartir da mesma fonte, mas organizadas de uma forma diferente do que aquelaencontrada na natureza. "Gene endógeno" refere-se a um gene nativo na suanatural localização no genoma de um organismo. Um gene "estrangeiro" refere-se a um gene que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência degenes. Os genes estrangeiros podem compreender os genes nativos inseridosem um organismo não-nativo, genes nativos introduzidos em um novo localdentro do hospedeiro nativo, ou genes quiméricos. Um "transgene" é um geneque foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação. Um"gene otimizado por códon" é um gene tendo sua freqüência de uso de códonprojetada para imitar a freqüência de uso preferencial de códon da célulahospedeira.
"Seqüência de codificação" refere-se a uma seqüência de DNAque codifica uma específica seqüência de aminoácidos. "Seqüênciasreguladoras adequadas" referem-se a seqüências de nucleotídeos localizadasa montante (uma seqüência 5' não codificante), no interior, ou a jusante (umaseqüência 3' não codificante) de uma seqüência de codificação e queinfluenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou traduçãoda associada seqüência de codificação. As seqüências reguladoras podemincluir promotores, seqüências de iniciação de tradução, íntrons, seqüências dereconhecimento de poliadenilação, sítios de processamento de RNA1 sítios deligação de efetor e estruturas de haste e volta.
O termo "alelo" refere-se a uma de várias formas alternativa deum gene ocupando um dado Iocus em um cromossomo. Quando todos osalelos presentes em um determinado Iocus de um cromossomo são osmesmos, então aquela planta é homozigota naquele locus. Se os alelospresentes em um determinado locus de um cromossomo diferem, então aplanta é heterozigota naquele locus.
"Promotor" refere-se a uma seqüência de DNA capaz de controlara expressão de uma seqüência de codificação ou RNA funcional. Em geral,uma seqüência de codificação está situada a 3' de uma seqüência promotora.Os promotores poderão ser derivados na sua totalidade a partir de um genenativo, ou seja, composto por vários elementos derivados de diferentespromotores encontrados na natureza, ou mesmo compreende segmentos deDNA sintéticos. Entende-se por aqueles versados na técnica que diferentespromotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tipos decélulas ou tecidos, ou em diferentes fases de desenvolvimento, ou em respostaa diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Os promotores que causam aum gene ser expresso na maioria dos tipos de células, na maioria das vezes,são comumente denominados "promotores constitutivos". É ainda reconhecidoque, uma vez que na maioria dos casos os exatos limites das seqüênciasreguladoras não foram completamente definidos, os fragmentos de DNA dediferentes comprimentos podem ter idêntica atividade promotora.
A seqüência promotora pode consistir em elementos a montanteproximal e mais distai, os últimos elementos freqüentemente chamados deintensificadores. Conseqüentemente, um "intensificador" é uma seqüência deDNA que pode estimular a atividade do promotor, e pode ser elemento inato deum promotor ou um elemento heterólogo inserido para acentuar o nível ouespecificidade quanto a tecido de um promotor. Promotores novos de diversostipos úteis em células vegetais estão constantemente sendo descobertos;numerosos exemplos podem ser encontrados na compilação por Okamuro, J.K., e Goldberg, R. B., Biochemistry of Plants, 15:1-82 (1989).
"Seqüência líder de tradução" refere-se à seqüência depolinucleotídeos localizada entre a seqüência promotora de um gene e aseqüência de codificação. A seqüência líder de tradução está presente nortiRNA totalmente processado a montante da seqüência de partida de tradução.A seqüência líder de tradução pode afetar o processamento da transcriçãoprimária para mRNA, estabilidade de mRNA ou eficiência da tradução. Osexemplos de seqüências líderes de tradução têm sido descritos (Turner, R. andFoster, G. D., Mol. Biotechnol., 3:225-236 (1995)).
Os termos "seqüências 3' não-codificantes "e" terminador detranscrição" referem-se a seqüências de DNA localizado a jusante de umaseqüência de codificação. Isso inclui seqüências de reconhecimento depoliadenilação e outras seqüências que codificam sinais reguladores capazesde afetar o processamento de mRNA ou a transformação genética. O sinal depoliadenilação é usualmente caracterizado por afetar a adição de ácidopoliadenilico das regiões na extremidade 3' do precursor de mRNA. A região 3'pode influenciar a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA1 outradução da associada seqüência de codificação.
O "transcrito de RNA" refere-se ao produto resultante datranscrição catalisada da RNA polimerase de uma seqüência de DNA. Quandoo transcrito de RNA é uma cópia complementar perfeita da seqüência de DNA,ele é referido como a principal transcrição ou ele pode ser uma seqüência RNAderivada de processamento pós-transcricional do transcrito primário e échamado de RNA maduro. "RNA mensageiro" ou "mRNA" refere-se ao RNAsem íntrons, e que pode ser traduzido em proteína pela célula. "cDNA" refere-se a um DNA de fita dupla que é complementar ao, e derivado do mRNA. "RNAsenso" refere-se RNA transcrito que inclui o mRNA e, portanto, pode sertraduzido em proteína pela célula. "RNA antisenso" refere-se a uma transcriçãode RNA que é complementar à totalidade ou parte de uma transcrição primáriaalvo ou mRNA e que bloqueia a expressão de um gene alvo (Patente US5.107.065; PCT Publicação N° WO 99 / 28508). A complementaridade de umRNA antisenso pode ser com qualquer parte da transcrição específica do gene,ou seja, na parte da seqüência 5' não-codificante, da seqüência 3' não-codificante, ou da seqüência de codificação. "RNA funcional" refere-se ao RNAantisenso, RNA ribozima, ou outro RNA que não é traduzido e ainda tem umefeito sobre processos celulares.
O termo "operacionalmente ligado" refere-se à associação dasseqüências de ácido nucléico em um único fragmento de ácido nucléico demodo que a função de um é afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor estáoperacionalmente ligado com uma seqüência de codificação quando é capazde viabilizar a expressão da seqüência de codificação (ou seja, a seqüência decodificação está sob o controle transcricional do promotor). As seqüências decodificação podem ser operacionalmente ligadas a seqüências reguladoras naorientação senso ou anti-senso.
O termo "expressão", conforme usado neste documento, refere-seà transcrição e acúmulo estável de RNA senso (mRNA) ou anti-sensoderivados do fragmento de ácido nucléico da invenção. Expressão podetambém referir-se a tradução de mRNA em um polipeptídeo.
Proteína "madura" refere-se a um polipeptídeo pós-traducionalmente processado, isto é, uma a partir da qual qualquer prepeptídeoou propeptideo presentes no produto primário de tradução tenham sidoremovidos. Proteína "precursora" refere-se ao produto primário da tradução domRNA, isto é, com prepeptídeos e propeptideos ainda presentes. Osprepeptídeos e propeptideos podem ser (mas não se limitam a) sinais delocalização intracelular.
"Transformação" refere-se à transferência de uma molécula deácido nucléico em um organismo hospedeiro, resultando em herançageneticamente estável. A molécula de ácido nucléico pode ser um plasmídeoque replica de forma independente, por exemplo, ou pode se integrar nogenoma do organismo hospedeiro. Os organismos hospedeiros que contêm osfragmentos de ácido nucléico transformados são referidos como organismos"transgênicos", "recombinantes" ou "transformados".
Os termos "plasmídeo" "vetor" e "cassete" referem-se a umelemento extra cromossômico muitas vezes transportando genes que nãofazem parte do metabolismo central da célula e, geralmente, sob a forma defitas duplas circulares de fragmentos de DNA. Esses elementos podem serseqüências livremente replicadas, seqüências integradoras de genoma,seqüências de nucleotídeos ou de fagos, circulares ou lineares, de fita deDNA ou RNA simples ou duplo, provenientes de qualquer fonte, na qual umasérie de seqüências de nucleotídeos foram unidas ou recombinadas em umaúnica construção que é capaz de introduzir um fragmento de promotor eseqüência de DNA para um gene produzido juntamente com uma adequadaseqüência 3' não-traduzida em uma célula. "Expressão cassete" se refere aum vetor específico contendo um gene estrangeiro e que tem elementos emadição ao gene estrangeiro que permitem a aprimorada expressão do geneem um hospedeiro estrangeiro.
O termo "porcentagem de identidade", conforme é conhecido natécnica é um a relação entre duas ou mais seqüências de polipeptídeos ouduas ou mais seqüências de polinucleotídeos, conforme determinado porcomparação das seqüências. Na técnica, o termo "identidade" significa tambémo grau de parentesco entre as seqüências de polipeptídeos oupolinucleotídeos, conforme o caso, como determinado pela correspondênciaentre as cadeias de tais seqüências. A "Identidade" e a "similaridade" podemser facilmente calculadas por métodos conhecidos, incluindo, mas nãolimitados a, os descritos em: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M.,Ed.) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing: Informatics and GenomeProiects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analvsis ofSeguence Data. Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ(1994); 4.) Seguence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.)Academic (1987); e, 5.) Seguence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux,J., Eds.) Stockton: NY (1991).
Os métodos preferenciais para determinar a identidade sãoprojetados para proporcionar a melhor comparação entre as seqüênciastestadas. Os métodos para determinar a identidade e a similaridade sãocodificados em programas de computador disponíveis publicamente. Oscálculos de porcentagens de identidade e seqüências de alinhamentos podemser feitos com o programa MegAlign™ da LASERGENE bioinformaticscomputing suite (DNASTAR Inc., Madison, Wl). Os múltiplos alinhamentos dasseqüências são realizados usando-se "método de alinhamento Clustal", queabrange várias variedades do algoritmo incluindo o "método de alinhamentoClustal V" correspondente ao método de alinhamento identificado como ClustalV (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS.5151-153 1989 Higgins, D.G. et al.,Comput. AppL Biosci., 8:189-191 (1992)) e encontrado no programaMegAlign™ do LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc.).Para múltiplos alinhamentos, os valores pré-estabelecidos correspondem aGAP PENALTY=10 e GAP LENGTH PENALTY=10. Os parâmetros pré-estabelecidos para alinhamento em pares e cálculos de porcentagem deidentidade de seqüências de proteína usando o método Clustal sãoKTUPLE=I, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5. Paraácidos nucléicos esses parâmetros são KTUPLE=2, GAP PENALTY=5,WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4. Após o alinhamento das seqüências usando o programa Clustal V, pode-se obter uma "porcentagem de identidade"usando-se a tabela "distâncias da seqüência" no mesmo programa.Adicionalmente o "método de alinhamento Clustal W" está disponível ecorresponde ao método de alinhamento identificado como Clustal W (descritopor Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput.Appl. 8:189-191(1992)) e encontrado no programa MegAIign™ v6.1 deLASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc.). Os parâmetrospré-estabelecidos para múltiplos alinhamentos correspondem a (GAPPENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0,2, Delay Divergen Seqs(%)=30,DNA Transition Weight=O,5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA WeightMatrix=IUB). Após o alinhamento das seqüências usando o programa ClustalW, é possível obter uma "porcentagem de identidade" usando-se a tabela"distâncias da seqüência" no mesmo programa.
"Método de alinhamento BLASTN" é um algoritmo fornecido peloNational Center for Biotechnology Information (NCBI) para comparar seqüências de nucleotídeos usando parâmetros pré-estabelecidos.
É bem entendido pelo versado na técnica que muitos níveis deidentidade de seqüências são úteis na identificação de polipeptídeos, a partirde outras espécies, onde tais polipeptídeos têm funções ou atividadessimilares. Os fragmentos de ácido nucléico adequados (polinucleotídeos isolados da presente invenção) codificam polipeptídeos que são pelo menoscerca de 70% idênticos, de preferência pelo menos cerca de 75% idênticos, ecom mais preferência pelo menos cerca de 80% idênticos às seqüência deaminoácidos aqui relatadas. Os fragmentos de ácido nucléico preferenciaiscodificam seqüência de aminoácidos que são pelo menos cerca de 85%idênticos às seqüências de aminoácidos aqui relatadas. Os fragmentos deácido nucléico mais preferenciais codificam seqüência de aminoácidos que sãopelo menos cerca de 90% idênticas às seqüências de aminoácidos aquirelatadas. Os fragmentos de ácido nucléico de máxima preferência codificamseqüência de aminoácidos que são pelo menos cerca de 95% idênticas àsseqüências de aminoácidos aqui relatadas. Embora faixas preferenciais estãodescritas acima, qualquer número inteiro de identidade de aminoácidos a partirde 39% até 100% pode ser útil ao descrever a presente invenção, como 40%,41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%,54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%,67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%,80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
Os fragmentos de ácido nucléico adequados não somente têm ashomologias acima, mas tipicamente codificam um polipeptídeo que tem pelomenos 50 aminoácidos, de preferência pelo menos 100 aminoácidos, com maispreferência pelo menos 150 aminoácidos, ainda com mais preferência pelomenos 200 aminoácidos, e de máxima preferência pelo menos 250 aminoácidos.
O termo "domínio conservado" ou "motivo" significa um conjunto deaminoácidos conservados em posições específicas ao longo de uma seqüênciaalinhada de proteínas evolutivamente relacionadas. Enquanto aminoácidos emoutras posições podem variar entre as proteínas homólogas, aminoácidos que sãoaltamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que sãoessenciais na estrutura, estabilidade, ou na atividade de uma proteína. Porqueeles são identificados pelo seu alto grau de conservação nas seqüênciasalinhadas de uma família de proteínas homólogas, eles podem ser usados comoidentificadores, ou "assinaturas", para determinar se uma proteína com uma novaseqüência determinada pertence a uma família protéica previamente identificada.
O termo "software de análise de seqüências" refere-se a qualqueralgoritmo computadorizado ou programa de software que é útil para a análise deseqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos. "Software de análise deseqüências" pode estar disponível comercialmente ou desenvolvidoindependentemente. Típicos Softwares de análise de seqüências, incluem, masnão estão limitados a: 1.) Software integrado de programas GCG (WisconsinPackage Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG)1 Madison1 Wl); 2.)BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al„ J. Moi Biol., 215:403-410 (1990));3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison, Wl); 4.) Sequencher (Gene CodesCorporation, Ann Arbor, Ml); e 5.) O programa FASTA incorporando o algoritmoSmith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int.Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Plenum:New York, NY). No contexto deste pedido, será entendido que onde o softwarede análise seqüencial é utilizado para a análise, os resultados da análise serãobaseados nos "valores pré-determinados" do programa referenciado, salvodisposição em contrário. Para uso na presente invenção, "valores pré-determinados" significarão qualquer conjuntos de valores ou parâmetros quevem com o software quando o mesmo é inicializado pela primeira vez. No quediz respeito ao algoritmo BLASTP usado aqui, os parâmetros pré-estabelecidosincluirão as freqüências de aminoácido Robinson e Robinson (Robinson A. B.,Robinson L.R., Proc. Natl Acad. Sei. U.S.A., 88:8880-8884 (1991)), a matriz depontuação BLOSUM62 e o "gap cost" Δ (g) = 11 + g.
O termo "partes da planta", inclui tecidos diferenciados e nãodiferenciados, incluindo, mas não limitados aos seguintes: raízes, caule, brotos,folhas, pólen, sementes, tecidos tumorais e diferentes formas de cultura e células(por exemplo, só as células, protoplastos, embriões e tecido de calos). O tecidovegetal pode ser na planta ou em um órgão, tecido ou cultura celular da planta.O termo "órgão da planta" refere-se ao tecido vegetal ou grupode tecidos que constituem uma parte morfologicamente e funcionalmentedistinta de uma planta.
O termo "genoma" refere-se aos seguintes: (1) o inteirocomplemento do material genético (genes e seqüências não-codificantes)presente em cada célula de um organismo, ou vírus ou organela; (2) umconjunto completo de cromossomos herdado como uma unidade (haplóide) apartir de um progenitor.
As técnicas padrão de DNA recombinante e clonagem molecularusadas na presente invenção são bem conhecidas na técnica e são descritaspor Sambrook, J., Fritsch, E. F. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: ALaboratorv Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor1NY (1989) (mais adiante neste documento "Maniatis"); e por Silhavy1 T. J.,Bennan, M. L. e Enquist1 L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold SpringHarbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); e por Ausubel1 F. M. et al.,Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc.e Wiley-Interscience1 Hoboken1 NJ (1987).
Os termos "construto recombinante", "construto de expressão","construto quimérico, "construto" e "construto de DNA recombinante" sãousados de maneira intercambiável na presente invenção. Um construtorecombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácidonucléico, por exemplo, seqüências reguladoras e de codificação que não sãoencontradas juntas na natureza. Por exemplo, um construto quimérico podecompreender seqüências reguladoras e seqüências de codificação que sãoderivadas de fontes diferentes, ou seqüências reguladoras e seqüências decodificação obtidas a partir da mesma fonte, mas organizadas de uma formadiferente do que aquela encontrada na natureza. Tal construto pode ser usadopor si mesmo ou pode ser usado em conjunto com um vetor. Se um vetor forusado, a escolha do vetor é dependente do método que será usado paratransformar células hospedeiras, como é bem conhecido pelos versados natécnica. Por exemplo, um vetor plasmídeo pode ser usado. O versado natécnica está perfeitamente consciente dos elementos genéticos que precisamestar presentes no vetor, a fim de transformar com sucesso, selecionar epropagar células hospedeiras que compreendem todos os fragmentos de ácidonucléico isolados da invenção. O versado na técnica irá também reconhecerque os diferentes eventos independentes de transformação resultarão emdiferentes níveis e padrões de expressão (Jones etal., EMBO J. 4:2411-2418(1985); DeAImeida et al., Mol. Geri. Genetics 218:78-86 (1989)) e, portanto,aqueles vários eventos precisam ser rastreados para obter linhas que mostramo nível de expressão e o padrão desejados. Tal triagem pode ser conseguidapela análise Southern de DNA, análise Southern de mRNA, análise daexpressão protéica imunobloting ou análise fenotípica, entre outros.
O termo "expressão", conforme usado neste documento, refere-seà produção de um produto final funcional (por exemplo, um mRNA ou umaproteína [precursora ou madura]).
O termo "introduzido" significa fornecer um ácido nucléico (porexemplo, construto de expressão) ou proteína em uma célula. O termo"introduzido" inclui referência a incorporação de um ácido nucléico em célulasprocarióticas ou eucarióticas, sendo que o ácido nucléico pode serincorporado no genoma da célula, e inclui referências à provisão transitória deum ácido nucléico ou proteína para a célula. Introduzido inclui referência paraos métodos de transformação estável ou transitória, bem como paracruzamentos sexuados. Dessa forma, "introduzido" no contexto da inserçãode um fragmento do ácido nucléico (por exemplo, um construto de DNArecombinante /construto de expressão) em uma célula, significa "transfecção"ou "transformação" ou "transdução" e inclui referências à incorporação de umfragmento de ácido nucléico em uma célula eucariótica ou procariótica, sendoque o fragmento de ácido nucléico pode ser incorporado no genoma da célula(por exemplo, cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou DNA mitocondrial),convertido em uma replicação autônoma, ou transitoriamente expresso (porexemplo, mRNA transfectada).
Proteína "madura" refere-se a um polipeptídio pós-traducionalmente processado (ou seja, do qual quaisquer prepeptídeos oupropeptideos presentes no produto primário de tradução foram removidos).Proteína "precursora" refere-se ao produto primário da tradução do mRNA, istoé, com prepeptídeos e propeptideos ainda presentes. Os prepeptídeos epropeptideos podem ser mas não se limitam a sinais de localização intracelular.
"Transformação estável" refere-se à transferência de um fragmentode ácido nucléico em um genoma de um organismo hospedeiro, incluindo ambosos genomas nuclear e organelar, resultando em herança geneticamente estável.Em contraste, "transformação transitória" refere-se à transferência de umfragmento de ácido nucléico para o núcleo, ou organela contendo DNA, de umorganismo hospedeiro resultando na expressão gênica sem integração ouherança estável. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos deácido nucléico transformados são referidos como organismos "transgênicos".
Para uso na presente invenção, "transgênico" refere-se a uma plantaou uma célula que compreende em seu genoma uma polinucleotídeo heterólogo.Preferencialmente, o polinucleotídeo heterólogo é integrado de maneira estável nogenoma de forma que o polinucleotídeo é passado para gerações sucessivas. Opolinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como partede um construto de expressão. O termo "transgênico" é usado aqui para incluirqualquer célula, linhagem de células, calos, tecido, parte da planta ou planta, ogenótipo da qual tem sido alterado pela presença de ácidos nucléicos heterólogosincluindo aqueles transgênicos inicialmente alterados, bem como aqueles criadospelos cruzamentos sexuados ou propagação assexuada a partir do primeirotransgênico. O termo "transgênico", conforme usado neste documento, nãoabrange a alteração do genoma (cromossômica ou extra-cromossômica) pormétodos convencionais de reprodução de plantas ou por eventos que ocorremnaturalmente como a fecundação cruzada aleatória, infecção viral não-recombinante, transformação bacteriana não-recombinante, transposição não-recombinante ou mutação espontânea.
"Inibição antisenso" refere-se à produção de transcrições de RNAantisenso capaz de suprimir a expressão da proteína alvo. O termo "co-supressão" refere-se à produção de transcritos de RNA senso capazes desuprimir a expressão de genes endógenos ou estrangeiros idênticos ousubstancialmente similares (patente U.S. n° 5.231.020). A co-supressão deconstrutos em plantas previamente tinha sido projetada através do foco naexpressão excessiva de uma seqüência de ácido nucléico que tem homologiacom um mRNA endógeno, na orientação senso, o que resulta na redução detodos os RNA que tem homologia com as seqüências superexpressas(Vaucheret etal., Plant J. 16:651-659 (1998); Gura1 Nature 404:804-808(2000)). A eficiência global do fenômeno é baixa, e a extensão de redução doRNA é muito variável. Os trabalhos mais recentes têm descrito o uso deestruturas em grampo (hairpin) que incorporam toda, ou parte, de umaseqüência de codificação mRNA em uma orientação complementar que resultaem uma estrutura potencial "stem-loop" para o RNA expresso (Publicação PCTn0 WO 99/53050, publicada em 21 de outubro de 1999; Publicação PCT n°WO 02/00904, publicada em 3 de janeiro de 2002). Isto aumenta a freqüênciade co-supressão nas plantas transgênicas recuperadas. Outra variaçãodescreve o uso de seqüências virais de plantas para dirigir a supressão, ou"silenciamento", do mRNA proximal que codifica as seqüências (PublicaçãoPCT n0 WO 98/36083, publicada em 20 de agosto de 1998). Ambos osfenômenos co-supressores ainda não foram elucidados mecanicamente,embora evidência genética tenha começado a desvendar esta complexasituação (Elmayan et al„ Plant Cell 10:1747-1757 (1998)).
Uma Visão Geral: Biossíntese Microbiana de Ácidos Graxos ε TriacilGliceróis
Em geral, o acúmulo de lipídios em microorganismos oleaginososé desencadeado em resposta à razão global de carbono para nitrogêniopresentes no meio de crescimento. Este processo, levando à síntese de novode palmitato livre (16:0) em microorganismos oleaginosos, é descrito emdetalhes na Publicação PCT n0 WO 2004/101757. O palmitato é o precursor damaior cadeia de ácidos graxos saturados e insaturados derivados, que sãoformadas através da ação de elongases e desaturases (figura 1).
TAGs (a principal unidade de armazenamento para ácidosgraxos) são formados por uma série de reações que envolvem: 1.) aesterificação de uma molécula de acil-CoA para glicerol-3-fosfato através deum aciltransferase para produzir ácido lisofosfatídico; 2.) a esterificação deuma segunda molécula de acil-CoA através de um aciltransferase paraproduzir 1,2-diacilglicerol fosfato (comumente identificado como ácidofosfatídico); 3.) a remoção de um fosfato por ácido fosfatídico fosfatase paraproduzir 1,2 -diacilglicerol (DAG) e 4.) a adição de um terceiro ácido graxopela ação de uma aciltransferase para formar TAG. Um amplo espectro deácidos graxos pode ser incorporado nos TAGs, incluindo ácidos graxossaturados e insaturados e ácidos graxos de cadeia curta e de cadeia longa.
Biossíntese de Ácidos Graxos Ômega
O processo metabólico onde ácido oléico é convertido em ácidosgraxos ômega-3/ômega-6 envolve alongamento da cadeia de carbono atravésda adição de átomos de carbono e dessaturação da molécula através daadição de ligações duplas. Isto exige uma série de dessaturações eelongações especiais das enzimas presentes na membrana do retículoendoplasmático. Entretanto, como pode ser visto na figura 1 e como descritoabaixo, existem muitas vezes várias vias alternativas para a produção de umdeterminado ácido graxo ômega-3/ômega-6.
Especificamente, todas as vias exigem a conversão inicial de ácidooléico para LA o primeiro dos ácidos graxos ômega-6, por uma desaturase delta-12. Então, usando a "via desaturase delta-6 /elongase delta-6", ácidos graxosômega-6 são formados da seguinte forma: (1) LA é convertido para GLA poruma desaturase delta-6; (2) GLA é convertido para DGLA por uma elongaseC18Z20; e, (3) DGLA é convertido para ARA por uma desaturase delta-5.Alternativamente, a "via desaturase delta-6 /elongase delta-6" pode ser utilizadapara formação de ácidos graxos ômega-3 da seguinte forma: (1) LA é convertidopara ALA, o primeiro dos ácidos graxos ômega-3, por uma desaturase delta-15;(2) ALA é convertido para STA por uma desaturase delta-6; (3) STA é convertidopara ETA por uma elongase C18/20; (4) ETA é convertido para EPA por umadesaturase delta-5; (5) EPA é convertido para DPA por uma elongase C20/22; e,(6) DPA é convertido para DHA por uma desaturase delta-4. Opcionalmente,ácidos graxos ômega-6 podem ser convertidos para ácidos graxos ômega-3; porexemplo, ETA e EPA são produzidos a partir de DGLA e ARA, respectivamente,por atividade de desaturase delta-17.
As vias alternativas para a biossíntese de ácidos graxos ômega-3/ômega-6 utilizam uma elongase delta-9 e desaturase delta-8. Maisespecificamente, LA e ALA podem ser convertidos para EDA e ETrA,respectivamente, por uma elongase delta-9; então, um delta-8 desaturaseconverte a EDA para DGLA e/ou ETrA para ETA.
É contemplado que as funcionalidades particulares exigidas paraserem expressas em um determinado organismo hospedeiro para a produçãode ácidos graxos ômega-3/ômega-6 dependerão da célula hospedeira (e osseus perfis AGP e/ou perfis desaturase/elongase nativos), a disponibilidade desubstrato e o(s) produto(s) final(is) desejado(s). O versado na técnica serácapaz de identificar vários genes candidatos, codificando cada uma dasenzimas desejadas para biossíntese dos ácidos graxos ômega-3/ômega-6. Asseqüências de desaturase e elongase úteis podem ser derivadas a partir dequalquer fonte, por exemplo, isolada de uma fonte natural (a partir de bactérias,algas, fungos, plantas, animais, etc), produzidas através de uma via semi-sintética ou sintetizadas de novo. Embora a fonte particular dos genesdesaturase e elongase introduzidos no hospedeiro não é crítica, consideraçõespara a escolha de um polipeptídeo específico que tem atividade de desaturaseou elongase incluem: 1.) A especificidade de substrato do polipeptídeo; 2.) se opolipeptídeo ou um componente do mesmo é um limitador de taxa de enzima;3.) Se a desaturase ou elongase é essencial para a síntese de uma desejadaAGP; e/ou, 4.) cofatores exigidos pelo polipeptídeo. O polipeptídeo expressotem, de preferência, parâmetros compatíveis com o ambiente bioquímico dasua localização na célula hospedeira (consulte Publicação PCT n0 WO2004/101757 para detalhes adicionais).
Em realizações adicionais, ele também será útil para analisar aeficiência da conversão de cada desaturase e/ou elongase particular. Maisespecificamente, uma vez que cada enzima raramente funciona com 100% deeficiência para converter substrato para produto, o perfil final do lipídio de óleosnão purificados produzidos em uma célula hospedeira vai ser tipicamente umamistura de vários AGPs que consiste nos desejado ácidos graxos ômega-3/ômega-6, bem como vários intermediários AGPs a montante. Assim, cadaeficiência de conversão de enzima é também uma variável a considerar,quando se otimiza a biossíntese de um ácido graxo desejado.
Com cada uma das considerações acima em mente, os genescandidatos com as adequadas atividades de desaturase e elongase (por exemplo,desaturases delta-6, elongases C18/20, desaturases delta-5, desaturases delta-17,desaturases delta-15, desaturases delta-9, desaturases delta-12, elongases Cum,elongases C16/18> elongases delta-9, desaturases delta - 8, desaturases delta-4 eelongases C20/22) podem ser identificados de acordo com a literatura disponívelpublicamente (por exemplo, GenBank), a literatura de patentes, e análisesexperimentais de organismos que tenham a capacidade de produzir AGPs. Estesgenes serão adequados para serem introduzidos em um determinado organismohospedeiro, para ativar ou reforçar a síntese de AGPs do organismo.
Identificação da Seqüência de uma Nova Desaturase delta-5 de Euglenagracilus.
Na presente invenção, uma seqüência de nucleotídeos (SEQ IDn°: 1) tem sido isolada a partir de Euglena gracilis que codifica uma desaturasedelta-5 (SEQ ID n°: 2), chamada na presente invenção de "EgD5".
Comparação da base de nucleotídeos EgD5 e seqüências deaminoácidos deduzidas das bases de dados públicas revela que as seqüênciassimilares mais conhecidas são cerca de 39% idênticas às seqüências deaminoácidos EgD5 aqui relatadas, ao longo de um comprimento de 449aminoácidos usando um método de alinhamento Clustal W. Os fragmentos deaminoácidos mais preferenciais são pelo menos cerca de 70% a 80% idênticosàs seqüências do presente documento, onde aquelas seqüências que são -pelo menos cerca de 80% a 90% idênticas são especialmente adequadas eaquelas seqüências que são pelo menos cerca de 90% a 95% idênticas são demáxima preferência. Do mesmo modo, os EgD5 preferenciais que codificamseqüências de ácidos nucléicos correspondentes ao ORF instantâneo são osque codificam proteínas ativas e são cerca de 70% a 80% idênticas àsseqüências de ácidos nucléicos EgD5 aqui relatadas, onde aquelas seqüênciasque são pelo menos cerca de 80% a 90% idênticas são particularmenteadequadas e aquelas seqüências que são pelo menos cerca de 90% a 95%idênticas são de máxima preferência.
Em realizações alternativas, a seqüência desaturase EgD5presente pode ser códon-otimizada para uma expressão no organismohospedeiro particular. Como é bem conhecido na técnica, isto pode ser um meioútil para otimizar ainda mais a expressão da enzima no hospedeiro alternativo,desde que o uso de códons preferenciais pelo hospedeiro possa aumentarsubstancialmente a expressão do gene estrangeiro que codifica o polipeptídeo.
Em geral, códons preferenciais pelo hospedeiro podem ser determinados dentrode uma determinada espécie de hospedeiro de interesse por meio de um examedo uso de códon em proteínas (de preferência aquelas expressas na maiorquantidade) e determinar quais os códons que são usados com maiorfreqüência. Em seguida, a seqüência de codificação de um polipeptídeo deinteresse que tem, por exemplo, atividade de desaturase pode ser sintetizada notodo ou em parte, usando os códons preferenciais nas espécies de hospedeiros.
Em uma realização preferencial da presente invenção, EgD5 foicódon-otimizado para expressão em Yarrowia lipolytica. Isto foi possível peladeterminação primeiro do perfil de utilização do códon Y. lipolytica (verPublicações PCT n0 WO 04/101757 e Patente US 7.125.672) e identificaçãodaqueles códons que são preferenciais. Em seguida, para uma maior otimizaçãoda expressão gênica em Y. lipolytica, a seqüência consenso em torno do códonde iniciação "ATG" foi determinada. Esta otimização resultou em modificação de196 bp da região codificante 1350 bp (14,5%) e de otimização de 189 códons dototal de 449 códons (42%). Nenhuma dessas alterações no gene códon-otimizado ("EgD5S"; SEQ ID n°: 3) alterou a seqüência de aminoácidos daproteína codificada (SEQ ID n°: 2). Conforme descrito no exemplo 11, o genecódon-otimizado foi 36% mais eficiente desaturando DGLA para ARA do que ogene de ocorrência natural, quando expressos em Y. lipolytica.
Um versado na técnica seria capaz de utilizar os ensinamentosaqui para criar diversos outras proteínas desaturase delta-5 códon otimizadasadequadas para otimizada expressão em hospedeiros alternativos (isto é,excluindo Yarrowia lipolytica), com base na seqüência EgD5 de ocorrêncianatural. Assim, a invenção refere-se a qualquer proteína desaturase delta-5códon otimizada que é derivada do EgD5 de ocorrência natural (ou seja,codificados por SEQ ID n°: 2). Isto inclui, mas não se limita a, a seqüência denucleotídeos estabelecida na SEQ ID n°: 3, que codifica uma síntese protéicade desaturase delta-5 (ou seja, EgD5S), que foi códon otimizada para aexpressão em Yarrowia lipolytica.
IDENTIFICACAO E ISOLAMENTO DE HOMOLOGOS
Qualquer uma das seqüências desaturase instantâneas (ou seja,EgD5, EgD5S) ou partes das mesmas, podem ser usadas para procurarhomólogos de desaturase delta-5 na mesma ou outras bactérias, algas, fungos,euglenóides ou espécies vegetais utilizando análise de seqüência por software.Em geral, essas seqüências semelhantes encontradas por software decomputador, que atribui diferentes graus de homología para váriassubstituições, supressões e outras modificações.
Alternativamente, qualquer uma das seqüências desaturaseinstantâneas ou partes das mesmas também podem ser empregadas comoreagentes de hibridização para a identificação de homólogos delta-5. Oscomponentes básicos de um teste de hibridização de ácido nucléico incluemuma sonda, uma amostra supostamente contendo o gene ou fragmento do genede interesse e um específico método de hibridização. As sondas da presenteinvenção são tipicamente seqüências de ácidos nucléicos de fita simples quesão complementares às seqüências de ácidos nucléicos que serão detectadas.As sondas são "hibridizáveis" para a seqüência do ácido nucléico a serdetectada. Embora o comprimento sonda possa variar de 5 bases para dezenasde milhares de bases, tipicamente um comprimento de sonda adequado é decerca de 15 bases a cerca de 30 bases. Apenas parte da molécula de sondaprecisa ser complementar à seqüência de ácidos nucléicos a ser detectada.Além disso, a complementaridade entre a sonda e a seqüência alvo nãonecessita ser perfeita. A hibridização ocorre entre moléculas imperfeitamentecomplementares com o resultado que uma determinada fração das bases naregião hibridizada não é emparelhada com a base complementar própria.
Os métodos de hibridização são bem definidos. Tipicamente, asonda e a amostra precisam ser misturadas sob condições que permitirão ahibridização do ácido nucléico. Isso envolve fazendo o contato da sonda e daamostra, na presença de um sal orgânico ou inorgânico sob condições própriasde concentração e temperatura. A sonda e a amostra de ácidos nucléicosprecisam ficar em contato por um tempo longo o suficiente para que qualquerpossível hibridização entre a sonda e a amostra de ácidos nucléicos possaocorrer. A concentração da sonda ou alvo na mistura vai determinar o temponecessário para que ocorra a hibridização. Quanto mais alta a concentração dasonda ou alvo, menor o tempo de incubação necessário para a hibridização.Opcionalmente, um agente caotrópico pode ser adicionado (por exemplo,cloreto guanidínio, tiocianato guanidínio, tiocianato de sódio, tetracloroacetatode lítio, perclorato de sódio, rubídio tetracloroacetato, iodeto de potássio,trifluoroacetato de césio). Se desejado, pode-se adicionar formamida à misturade hibridização, tipicamente 30 a 50% em volume.
Várias soluções de hibridização podem ser empregadas.Tipicamente, estas compreendem cerca de 20 a 60% do volume, depreferência 30%, de um solvente orgânico polar. Uma solução comum dehibridização emprega cerca de 30 a 50% v/v de formamida, cloreto de sódiocerca de 0,15 a 1 M, tampão (por exemplo, citrato de sódio, Tris-HCI, tubagensou HEPES (pH intervalo de cerca de 6 a 9))cerca de 0,05 a 0,1 M, cerca de0,05 a 0,2% de detergente (por exemplo, dodecil sulfato de sódio), ou entre 0,5a 20 mM EDTA1 Ficoll (Pharmacia Inc.) (cerca de 300 a 500 kdal),polivinilpirrolidona (cerca de 250 a 500 kdal), e albumina de soro. Tambémserão incluídos na solução típica de hibridização os ácidos nucléicostransportadores não marcados a partir de cerca de 0,1 a 5 mg/mL, DNA nucléicos fragmentados (por exemplo, DNA de timos de novilho ou esperma desalmão, ou RNA de levedura) e, facultativamente, a partir de cerca de 0,5 a 2%peso/vol de glicina. Outros aditivos podem também ser incluídos, tais comoagentes de exclusão de volume que incluem uma variedade de agentes polaressolúveis em água ou de intumescimento (por exemplo: polietileno glicol),polímeros aniônicos (por exemplo, poliacrilato ou polimetil acrilato) e polímerossacarídicos aniônicas (por exemplo, sulfato de dextrano).
A hibridização de ácido nucléico é adaptável a uma variedade deformatos de ensaio. Um dos mais adequados é o formato de ensaio sanduíche.O ensaio sanduíche é particularmente adaptável a hibridização sob condiçõesde não-desnaturação. O principal componente de um ensaio do tipo sanduícheé um suporte sólido. O suporte sólido tem, adsorvido nele ou covalentementeacoplado a ele, uma sonda de ácidos nucléicos imobilizada não marcada ecomplementar a uma porção da seqüência.
Em realizações adicionais, nenhum dos fragmentos de ácidonucléico de desaturase delta-5 descritos neste documento (ou qualquerhomólogos identificados dos mesmos) podem ser usados para isolar genes quecodificam proteínas homólogas a partir da mesma ou de outras espécies debactérias, algas, fungos, euglenóides ou plantas. O isolamento de geneshomólogos utilizando protocolos dependentes de seqüência é bem conhecido natécnica. Exemplos de protocolos dependentes de seqüência incluem, mas nãoestão limitados a: 1.) métodos de hibridização de ácidos nucléicos; 2.) métodosde amplificação de DNA e RNA, como exemplificado para vários usos detecnologias de amplificação de ácido nucléico [por exemplo, reação em cadeiada polimerase (PCR)1 Mullis et al., Patentes U.S. n°4.683.202; reação em cadeiade ligase (LCR)1 Tabor1 S. et al., Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A., 82:1074 (1985);ou amplificação de deslocamento da fita (SDA - strand displacementamplification), Walker1 et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992)]; e3.) métodos de construção de biblioteca e triagem por complementação.
Por exemplo, genes que codificam proteínas ou polipeptídeossemelhantes para as desaturases delta-5 descritas neste documento poderãoser isolados diretamente usando a totalidade ou uma parte dos fragmentos deácido nucléico instantâneos como sondas de hibridização de DNA parabibliotecas de triagem, por exemplo, ou qualquer desejado levedura ou fungousando metodologia bem conhecida dos versados na técnica (sendo que osorganismos que produzem ARA [ou seus derivados] seriam preferíveis). Assondas de oligonucleotídeos específicas baseadas nas seqüênciasinstantâneas de ácidos nucléicos podem ser projetadas e sintetizadas pormétodos conhecidos na técnica (Maniatis, acima). Além disso, a seqüênciainteira pode ser usada diretamente para sintetizar sondas de DNA através demétodos conhecidos pelo versado na técnica (por exemplo, iniciadoresaleatórios de marcação de DNA, tradução "nick" ou técnicas de marcação deextremidade), ou RNA usando sondas disponíveis em sistemas de transcriçãoin vitro. Além disso, iniciadores específicos podem ser projetados e usadospara amplificar parte de uma (ou todo o comprimento), de seqüênciasinstantâneas. Os produtos resultantes da amplificação podem ser marcadosdiretamente durante as reações de amplificação ou marcados após asreações de amplificação, e usados como sondas para isolar todo ocomprimento de fragmentos de DNA em condições adequadas de estrigência.
Tipicamente, nas técnicas de amplificação do tipo PCR, osiniciadores têm seqüências diferentes e não são complementares entre si.Dependendo das condições de teste desejada, as seqüências dos iniciadoresdevem ser projetadas para proporcionar a replicação eficiente e fiel do ácidonucléico alvo. Os métodos de design de iniciador PCR são comuns e bemconhecidas na técnica (Thein e Wallace, "The use of oligonucleotides asspecific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders", emHuman Genetic Diseases: A Practical Approach, Κ. E. Davis Ed., (1986)pp 33-50, IRL: Herndon1 VA; e Rychlik, W., em Methods in Molecular Biology,White1 B. A. Ed., (1993) Vol. 15, pp 31-39, PCR Protocols: Current Methodsand Applications. Humania: Totowa, NJ).
Geralmente dois segmentos curtos das seqüências instantâneaspodem ser usados em protocolos PCR para amplificar fragmentos maislongos do ácido nucléico que codificam genes homólogos de DNA ou RNA. OPCR também pode ser realizado em uma biblioteca de fragmentos clonadosde ácido nucléico onde a seqüência de um iniciador é derivada dosfragmentos de ácido nucléico instantâneos, e a seqüência do outro iniciadortira proveito da presença dos tratos de ácido poliadenilico na extremidade 3'do precursor de mRNA que codifica genes eucarióticos.
Alternativamente, a segunda seqüência iniciadora poderá basear-se em seqüências obtidas a partir do vetor de clonagem. Por exemplo, o versadona técnica pode seguir o protocolo RACE (Frohman etal., Proc. Natl Acad. Sei.U.S.A., 85:8998 (1988)) para gerar cDNAs usando de PCR para amplificarcópias da região entre um ponto único na transcrição e as extremidades 3'ou 5'.Os iniciadores orientados nas direções 3'e 5' podem ser concebidos a partir dasseqüências instantâneas. Usando os sistemas 3'RACE ou 5' RACE disponíveiscomercialmente (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), fragmentos específicos decDNA 3'ou 5' podem ser isolados (Ohara et al., Proc. Natl Acad Natl Acad. Sei.U.S.A., 86:5673 (1989); Loh et al., Science, 243:217 (1989)).
Em outras realizações, nenhum dos fragmentos de ácido nucléicode desaturase delta-5 descritos neste documento (ou qualquer homólogosidentificados no mesmo) podem ser usados para criação de novas emelhoradas desaturases de ácidos graxos. Como é bem conhecido na técnica,mutagênese "in vitro" e seleção, mutagênese química, métodos deembaralhamento de gene ou outros meios podem ser empregados paraobtenção das mutações de genes desaturase de ocorrência natural.Alternativamente, os ácidos graxos aprimorados poderão ser sintetizados portroca de domínio, sendo que um domínio funcional de qualquer dos fragmentosde ácido nucléico de desaturase delta-5 descritos a seguir são trocadas comum domínio funcional em um gene desaturase alternativo para, assim, obteruma nova proteína.
Métodos para Produção de Diversos Ácidos graxos Ômega-3 e/ou ômega-6
Espera-se que a introdução de genes quiméricos que codificamas desaturases delta-5 aqui descritas (ou seja, EgD5, EgD5S ou outrasenzimas mutantes, enzimas códon-otimizadas ou homólogos das mesmas),sob o controle de promotores adequados irá resultar em aumento da produçãode ARA e/ou EPA no organismo hospedeiro transformado, respectivamente.Como tal, a presente invenção abrange um método para a produção direta deAGPs que compreendem um substrato de ácido graxo (ou seja, DGLA ou ETA)para as enzimas desaturase descritas neste documento (por exemplo, EgD5,EgD5S), de tal forma que o substrato é convertido para o produto ácido graxodesejado (ou seja, ARA ou EPA, respectivamente).
Mais especificamente, é um objetivo do presente invenção fornecerum método para a produção da ARA, em uma célula hospedeira (por exemplo,levedura oleaginosa, soja), sendo que a célula hospedeira compreende:
(i) uma molécula de nucleotídeo isolada que codifica umpolipeptídeo desaturase delta-5 que tem pelo menos 39% de identidade comum polipeptídeo que tem a seqüência de aminoácidos da SEQ ID n° 2, combase em algoritmos BLASTP ou em métodos de alinhamento Clustal W; e,(ii) uma fonte de diomo-Y-ácido linoleico;
sendo que a célula hospedeira é cultivada em condições tais quea desaturase delta-5 é expressa e o DGLA é convertido para o ARA, e onde oARA é opcionalmente recuperado.
O versado na técnica irá reconhecer que a ampla gama desubstratos da desaturase delta-5 pode adicionalmente permitir a utilização daenzima de conversão da ETA para EPA. Conseqüentemente, o inventoproporciona um método para a produção de EPA, sendo que a célulahospedeira compreende:
(i) uma molécula de nucleotídeo isolada que codifica umpolipeptídeo desaturase delta-5 que tem pelo menos 39% de identidadequando comparado com um polipeptídeo que tem uma seqüência deaminoácidos, conforme estipulado na SEQ ID NO: 2, com base em algoritmosBLASTP ou métodos de alinhamento Clustal W; e,
(ii) uma fonte de ácido eicosatetraenóico;sendo que a célula hospedeira é cultivada em condições tais quea desaturase delta-5 é expressa e o ETA é convertido para o EPA, e onde oEPA é opcionalmente recuperado.
Alternativamente, cada gene de desaturase delta-5 e suacorrespondente enzima produto aqui descritos podem ser usados indiretamentepara a produção de ácidos graxos ômega-3 (ver Publicação de Patente U.S. N02005/0136519). A produção indireta de AGPs ômega-3/ômega-6 ocorre onde osubstrato de ácido graxo é convertido indiretamente no produto desejado deácido graxo, por meio de etapa(s) ou via(s) intermediária(s). Dessa forma, éobservado que as desaturases delta-5 aqui descritas (por exemplo, EgD5,EgD5S ou outras enzimas mutantes, enzimas códon-otimizadas ou homólogosdas mesmas) podem ser expressa em conjugação com outros genes quecodificam enzimas da via biossintética de AGPs (por exemplo:desaturasesdelta-6, elongases C18/20, desaturases delta-17, desaturases delta-15,desaturases delta-9, desaturases delta-12, elongases C14/16. elongases C16/18,elongases delta-9, desaturases delta-8, desaturases delta-4, elongases C20/22)para resultar em níveis mais elevados de produção de ácidos graxos ômega-3de cadeia mais longa (por exemplo, EPA, DPA e DHA). Os genes particularesincluídos em um particular cassete de expressão dependerão da célulahospedeira (e seu perfil AGP e /ou perfil desaturase/elongase), dadisponibilidade de substrato e do produto(s) final(is) desejado(s).
Em realizações alternativas, pode ser útil perturbar a desaturasedelta-5 nativa de um organismo hospedeiro, baseado nas seqüênciascompletas aqui descrito, o complemento dessas seqüências completas,porções substanciais dessas seqüências, desaturases códon-otimizadasderivadas deles e as seqüências que são substancialmente homólogas a isso.Sistemas de Expressão. Cassetes ε Vetores ε Transformação da Planta
Em uma realização, esta invenção diz respeito a um construtorecombinante que compreende qualquer um dos polinucleotídeos da desaturasedelta-5 da invenção, operacionalmente ligados a pelo menos uma seqüênciareguladora adequada para expressão em uma planta. O promotor é umaseqüência de DNA que direciona a maquinaria celular de uma planta para aprodução de RNA a partir da contígua seqüência de codificação à jusante (3') dopromotor. A região promotora influencia a taxa, estágio do desenvolvimento, etipo de célula na qual a transcrição de RNA do gene é feita. O RNA transcrito éprocessado para produzir mRNA que serve como modelo para a tradução daseqüência de RNA em seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. Aseqüência líder 5' não traduzida é uma região do mRNA a montante da região decodificação da proteína que pode desempenhar um papel na iniciação etradução do mRNA. A terminação de transcrição/sinal de poliadenilação 3' é umaregião não-traduzida a jusante da região codificação da proteína que funciona nacélula vegetal para provocar a terminação do RNA transcrito e a adição denucleotídeos de poliadenalato à extremidade 3' do RNA.
A origem do promotor escolhido para dirigir a expressão daseqüência de codificação da desaturase delta-5 não é importante, desde quehaja suficiente atividade transcricional para realizar a invenção, ao expressarmRNA traduzível para os fragmentos de ácidos nucléicos no tecido dohospedeiro desejado e no tempo certo. Os promotores heterólogos ou nãoheterólogos (ou seja, endógenos) podem ser usados na prática da invenção.Por exemplo, promotores adequados incluem, mas não estão limitados a: opromotor da subunidade alfa prime da beta de conglicinina, o promotor deKunitz inibidor 3 da tripsina, o promotor de anexina, o promotor de glicininaGY1, o promotor de subunidade beta da beta conglicinina, o promotor P34 / GlyBd m 30k, o promotor de albumina, o promotor de Leg A1 e o promotor de LegA2.
O promotor de anexina, ou P34, é descrito em PCT Publicação N 0WO 2004/071178 (publicada em 26 de agosto de 2004). O nível de atividade dopromotor de anexina é comparável ao de muitos promotores de conhecida força,tais como: (1) o promotor CaMV 35S (Atanassova et al., Plant Mol. Biol.37:275-285 (1998); Battrawand Hall1 Plant Mol. Biol. 15:527-538 (1990); Holtorfetal., Plant Mol. Biol. 29:637-646 (1995); Jefferson et al., EMBO J. 6:3901-3907(1987); Wilmink et al., Plant Mol. Biol. 28:949-955 (1995)); (2) Os promotores deArabidopsis oleosin (Plant et al., Plant Mol. Biol. 25:193-205 (1994); Li, Texas A&MUniversity Ph.D. dissertation, pp. 107-128 (1997)); (3) Os promotores de extensãode proteína ubiquitina de Arabidopsis (Callis et al., J Biol. Chem. 265(21): 12486-93(1990)); (4) Um promotor do gene de ubiquitina de tomate (Rollfinke et al., Gene.211(2):267-76 (1998)); (5) um promotor de proteína de soja "heat shocK' (Schofflet al., Mol Gen Genet. 217(2-3):246-53 (1989)); e (6) um promotor do gene dehistona H3 de milho (Atanassova et al., Plant Mol Biol. 37(2):275-85 (1989)).Outra característica útil do promotor de anexina é o seu perfil deexpressão nas sementes em desenvolvimento. O promotor de anexina estámais ativo nas sementes em desenvolvimento nas primeiras etapas (antes de10 dias após a polinização) e é largamente quiescente em etapas posteriores.
O perfil de expressão do promotor de anexina é diferente do de muitospromotores específicos de sementes, por exemplo, promotores quearmazenam proteína em sementes, que muitas vezes fornecem maior atividadenas fases posteriores de desenvolvimento (Chen et al., Dev. Genet. 10:112-122(1989); Ellerstrom et al., Plant Mol. Bioi 32:1019-1027 (1996); Keddie et al.,Plant Mol. Biol. 24:327-340 (1994); Plant et al., (acima); Li, (acima)). Opromotor de anexina tem um perfil de expressão mais convencional, maspermanece distinto de outros promotores específicos para sementesconhecidos. Assim, o promotor de anexina será um candidato muito atraentequando superexpressão, ou supressão, de um gene em embriões é desejadaem um estágio precoce de desenvolvimento. Por exemplo, pode ser desejávelexpressar excessivamente um gene que regula desenvolvimento embrionárioprecoce ou um gene envolvido no metabolismo antes da maturação dassementes.
Depois da identificação apropriada de um promotor adequado àexpressão de uma seqüência de codificação de uma determinada desaturasedelta-5, o promotor é então operacionalmente ligado em uma orientação sensousando meios convencionais bem conhecidos pelos versados na técnica.
As técnicas padrão de DNA recombinante e clonagem molecularusadas aqui são bem conhecidas na técnica e são descritas maisdetalhadamente em Sambrook, J. et al., In Molecular Cloning: A LaboratoryManual; 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NewYork, 1989 (mais adiante neste documento "Sambrook et al., 1989") ou Ausubel,F. M., Brent, R., Kingston1 R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. eStruhl, K., Eds.; In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons:New York, 1990 (mais adiante neste documento "Ausubel et al., 1990").
Depois que o construto recombinante foi feito, ele pode então serintroduzido em uma célula vegetal de escolha por métodos bem conhecidospelos versados na técnica (por exemplo, transfecção, transformação eeletroporação). As células vegetais de uma semente oleaginosa são as célulasvegetais preferenciais. A célula vegetal transformada é, em seguida, cultivada eregenerada e m condições adequadas, permitindo a expressão de AGP decadeia longa, que é então opcionalmente recuperado e purificado.
Os construtos recombinantes da invenção podem ser introduzidosem uma célula vegetal; ou alternativamente, cada construto pode serintroduzido em células vegetais separadas.
Expressão em uma célula vegetal pode ser realizada de um modotemporário ou estável como é descrito acima.
Os desejados AGPs de cadeia longa podem ser expressos emsementes. Também, no âmbito da presente invenção são as sementes oupartes de plantas obtidas a partir dessas plantas transformadas.
As partes da planta incluem tecidos diferenciados e nãodiferenciados, incluindo, mas não limitados aos seguintes: raízes, caule, brotos,folhas, pólen, sementes, tecidos tumorais e diferentes formas de cultura e células(por exemplo, só as células, protoplastos, calos e embriões tecido). O tecidovegetal pode ser na planta ou em um órgão, tecido ou cultura celular da planta.
O termo "órgão da planta" refere-se ao tecido vegetal ou grupo detecidos que constituem uma parte morfologicamente e funcionalmente distintade uma planta. O termo "genoma" refere-se aos seguintes: (1) o inteirocomplemento do material genético (genes e seqüências não-codificantes) queestá presente em cada célula de um organismo, ou vírus ou organela; e/ou (2)um conjunto completo de cromossomos herdado como uma unidade (haplóide)a partir de um progenitor.
Assim, esta invenção também diz respeito a um método paratransformar uma célula, que compreende transformar uma célula com oconstruto recombinante da invenção e selecionar as células transformadas como construto recombinante da invenção.
De igual interesse é o método para produzir uma plantatransformada que compreende transformar uma célula vegetal com ospolinucleotídeos desaturase delta-5 da presente invenção e regenerar a plantaa partir de uma célula vegetal transformada.
Métodos para transformar dicotiledôneas (principalmente pelo usode Agrobacterium tumefaciens) e obter plantas transgênicas têm sidopublicados, entre outros, para: algodão (patente U.S. n° 5.004.863; patenteU.S. n° 5.159.135); soja (patente U.S. n° 5.569.834; patente U.S. n° 5.416.011);Brassica (Patent US n° 5.463.174); amendoim (Cheng et al. Plant Cell Rep.15:653-657 (1996); McKentIy et al. Plant Cell Rep. 14:699-703 (1995)); papaia(Ling, K. et al. Bio/technology 9:752-758 (1991)); e ervilha (Grant et al. PlantCell Rep. 15:254-258 (1995)). Para a análise de outros métodos comumenteusados para transformação de plantas consulte Newell, C.A. (Mol. Biotechnol.16:53-65 (2000)). Um desses métodos de transformação usa Agrobacteriumrhizogenes (Tepfler, M. e Casse-Delbart, F. Microbiol. Sei. 4:24-28 (1987)). Atransformação de soja, usando métodos de entrega direta de DNA utilizandoPEG fusão (PCT Publicação n0 WO 92/17598), eletroporação tem sidopublicados (Chowrira, GM et al., Moi Biotechnol. 3:17-23 (1995); Christou, P. etal., Proc. Nati Acad. Sei. U.S.A. U.S.A. 84:3962-3966 (1987)), microinjeção ebombardeamento de partículas (McCabe, D.E. et. al., Bio/Technology 6:923(1988); Christou et al., PIantPhysioi 87:671-674 (1988)).
Há uma variedade de métodos para a regeneração de plantas apartir de tecidos vegetais. O método específico de regeneração dependerá dotecido vegetal de partida e das espécies vegetais específicas a seremregeneradas. A regeneração, o desenvolvimento e o cultivo de plantas a partirde transformantes protoplastos de uma única planta ou de váriostransformantes explantes é bem conhecido na técnica (Weissbach eWeissbach, em: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic: SanDiego, CA (1988)). Esse processo de regeneração e crescimento tipicamenteinclui as etapas de seleção de células transformadas e cultivo dessas célulasindividualizadas através dos habituais estágios de desenvolvimentoembrionário através de estágio de enraizamento da muda. Embriões esementes transgênicos são regeneradas de modo similar. Os brotostransgênicos resultantes enraizados são posteriormente plantados em um meioadequado para crescimento das plantas, como solo. Preferencialmente, asplantas regeneradas são auto-polinizáveis para fornecer plantas transgênicashomozigotas. Caso contrário, o pólen obtido das plantas regeneradas é usadopara polinizar plantas de linhas agronomicamente importantes e cultivadas apartir de semente. Inversamente, o pólen de plantas destas linhas importantesé utilizado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica dapresente invenção contendo um polipeptídeo desejado é cultivada por meio demétodos bem conhecidos pelo versado na técnica.
Em adição aos procedimentos acima discutidos, os praticantesestão familiarizados com os materiais de recurso padrão que descrevem ascondições e procedimentos específicos para: a construção, manipulação eisolamento de macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídeos,etc); a geração de fragmentos de DNA recombinantes e construtos deexpressão recombinantes; e, a triagem e isolamento de clones. Consulte, porexemplo: Sambrook etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor: NY (1989); Maliga etal., Methods in Plant Molecular Biology,Cold Spring Harbor: NY (1995); Birren etal., Genome Analysis: DetectingGenes, Vol.1, Cold Spring Harbor: NY (1998); Birren etal., Genome Analysis:Analyzing DNA, Vol.2, Cold Spring Harbor: NY (1998); Plant Molecular Biology:A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer: NY (1997).
Exemplos de plantas de semente oleaginosa incluem, mas nãoestão limitados a: soja, espécies de Brassica, girassol, milho, algodão, Iinho ecártamo.
Exemplos de AGPs que têm pelo menos vinte átomos de carbonoe quatro ou mais ligações duplas carbono-carbono incluem, mas não estãolimitados a, ácidos graxos ômega-3 como o EPA, DPA e DHA e os ácidos graxosômega-6 ARA. As sementes obtidas a partir de tais plantas também estão dentrodo âmbito desta invenção, bem como os óleos obtidos a partir dessas sementes.
Dessa forma, em uma realização, essa invenção refere-se a umaplanta com semente oleaginosa que compreende:
(a) um primeiro DNA construto recombinante que compreendeum polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo desaturase delta-5,operacionalmente ligada a pelo menos uma seqüência reguladora; e,
(b) pelo menos um DNA construto recombinante adicional quecompreende um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelomenos uma seqüência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionadoa partir do grupo que consiste em uma desaturase delta-4, uma desaturasedelta-5, uma desaturase delta-6, uma desaturase delta-8, uma desaturasedelta-9, uma elongase delta-9, uma desaturase delta-12, uma desaturasedelta-15, uma desaturase delta-17, uma elongase C 14/16, uma elongase Ci6/is>uma elongase C18/20 e uma elongase C20/22;
Desaturases adicionais são discutidas, por exemplo, nas patentesU.S. n° 6.075.183, U.S.5.968.809, U.S.6.136.574, U.S.5.972.664, U.S.6.051.754,U.S.6.410.288 e PCT Publicações Nos. WO 98/46763, WO 98/46764,WO 00/12720 e WO 00/40705.A escolha da combinação de cassetes usados depende em partedo perfil do AGP e/ou do perfil da desaturase/elongase das células vegetaisoleaginosas a serem transformadas e da AGP de cadeia longa que deve serexpressa.
Em outro aspecto, esta invenção diz respeito a um método paraprodução de AGPs de cadeia longa em uma célula vegetal que compreende:
(a) transformar uma célula com o construto recombinante dainvenção, e,
(b) selecionar aquelas células transformadas que formamAGPs de cadeias longas.
Em ainda um outro aspecto, esta invenção diz respeito a ummétodo para produzir pelo menos um AGP em uma célula de soja quecompreende:
(a) transformar uma célula de soja com um primeiro construtode DNA recombinante que compreende:
(i) um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeodesaturase delta-5 operacionalmente ligado a ao menos uma seqüênciareguladora e,
(ii) pelo menos um DNA construto recombinante adicional quecompreende um polinucleotídeo isolado, ligado de maneira funcional a pelomenos uma seqüência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionadoa partir do grupo que consiste em uma desaturase delta-4, uma desaturasedelta-5, uma desaturase delta-6, uma desaturase delta-8, uma desaturasedelta-9, uma elongase delta-9, uma desaturase delta-12, uma desaturasedelta-15, uma desaturase delta-17, uma elongase C14/16. uma elongase C16/18.uma elongase C18/20 e uma elongase C20/22;
(b) regenerar uma planta de soja a partir das célulastransformadas da etapa (a); e,(c) selecionar as sementes obtidas a partir das plantas daetapa (b), com uma alteração no nível de AGPs em comparação com o nívelnas sementes obtidas a partir de uma planta de soja não transformada.
Em outras realizações preferenciais, o pelo menos um construtode DNA recombinante adicional codifica um polipeptídeo que tem atividade deelongase delta-9, por exemplo, a elongase delta-9 isolada ou derivada deIsochrysis galbana (GenBank acesso N0 AF390174; lgD9e) ou a elongasedelta-9 isolada ou derivada de Euglena gracilis.
Em outras realizações preferenciais, o pelo menos um construtode DNA recombinante adicional codifica um polipeptídeo que tem atividade dedesaturase delta-8. Por exemplo, PCT Publicação N° WO 2005/103253(publicada em 22 de abril de 2005) divulga seqüências de aminoácidos e deácidos nucléicos para uma enzima desaturase delta-8 a partir de Pavlova salina(ver também Publicação U.S. N° 2005/0273885). Sayanova et al. (FEBS Lett.580:1946-1952 (2006)) descreve o isolamento e caracterização de uma cDNAa partir de uma ameba Acanthamoeba castellanii viva e livre que, quandoexpresso em Arabidopsis, codifica uma desaturase C20 delta-8. Também, Opedido co-pendente do cessionário de Pedido Provisório n° 60/795810depositado em 28 de abril de 2006 (Súmula do advogado n° APA-1566) divulgaaminoácidos e seqüências de ácidos nucléicos para uma enzima desaturasedelta-8 a partir de Pavlova Iutheri (CCMP459). O Pedido Provisório U.S. n°60/853563 (depositada em 23 de outubro de 2006; súmula do advogado N°.APA-1574) divulga seqüências de aminoácidos e de ácidos nucléicos para umaenzima desaturase delta-8 a partir de Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491,Eutreptiella sp. CCMP389 e Eutreptiella cfjgymnastica CCMP1594.
Sistemas de Expressão Microbiana, Cassetes E Vetores, ε Transformação
Os genes e produtos de desaturase delta-5 descritos nestedocumento (ou seja, EgD5 ou outras enzimas mutantes, enzimas códon-otimizadas ou homólogos das mesmas) também podem ser produzidos emcélulas hospedeiras microbianas heterólogas, particularmente nas células deleveduras oleaginosas (por exemplo, Yarrowia lipolytica).
Os sistemas de expressão microbiana e vetores de expressãocontendo seqüências reguladoras que dirigem expressão de alto nível deproteínas estrangeiras são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.Qualquer um destes poderia ser utilizado para construir genes quiméricospara a produção de qualquer dos produtos do gene das seqüênciasinstantâneas. Estes genes quiméricos poderiam então ser introduzidos em microorganismos apropriados por meio de transformação para proporcionarexpressão de alto nível das enzimas codificadas.
Os vetores ou cassetes de DNA úteis para a transformação dascélulas hospedeiras microbianas adequadas são bem conhecidos na técnica. Aescolha de seqüências específicas presentes no construto é dependente dos produtos de expressão desejados (acima), da natureza das célulashospedeiras e os meios propostos para a separação de células transformadasversus células não-transformadas. Tipicamente, no entanto, o vetor ou cassetecontém seqüências direcionando transcrição e tradução do(s) gene(s)relevante(s), um marcador selecionável e seqüências que permitam areplicação autônoma ou integração cromossômica. Os vetores adequadoscompreendem uma região 5' do gene que controla a iniciação transcricional(por exemplo, um promotor) e uma região 3' do fragmento de DNA que controlaterminação transcricional (ou seja, um terminador). É da máxima preferênciaquando as duas regiões de controle são derivadas de genes a partir da célulahospedeira microbiana transformada, embora deva ser entendido que taisregiões de controle não precisam ser derivadas de genes nativos das espéciesespecíficas escolhidas como um hospedeiro para produção.
As regiões de controle de início ou promotores que são úteis paradirigir a expressão da instantânea dos ORFs de desaturase delta-5 na célulahospedeira microbiana desejada são numerosos e familiares para os versadosna técnica. Virtualmente qualquer promotor capaz de dirigir a expressão dessesgenes na célula hospedeira selecionada é adequado para a presente invenção.
A expressão em uma célula hospedeira microbiana pode ser realizada de ummodo temporário ou estável. A expressão transiente pode ser obtida pelaindução da atividade de um promotor regulável operacionalmente ligado aogene de interesse. A expressão estável pode ser obtida pelo uso de umpromotor constitutivo operacionalmente ligado ao gene de interesse. Como umexemplo, quando a célula hospedeira é levedura, regiões funcionaistranscricionais e de tradução em células de levedura são fornecidas,especialmente a partir de espécies hospedeiras (por exemplo, ver PCTPublicação N 0 WO 2004/101757 e WO 2006/052870 para regiões reguladorasde iniciação transcricional preferenciais para uso em Yarrowia lipolytica).Qualquer uma de uma série de seqüências reguladoras pode ser usada,dependendo se transcrição constitutiva ou induzida é desejável, da eficiênciado promotor ao manifestar o ORF de interesse, da facilidade de construção esimilares.
As seqüências de nucleotídeos em torno do códon de iniciação detradução "ATG" foram consideradas susceptíveis de afetar expressão emcélulas de levedura. Se o desejado polipeptídeo é pouco expresso emleveduras, as seqüências de nucleotídeos de genes exógenos podem sermodificadas para incluir uma seqüência de iniciação de tradução eficiente paralevedura, para obter expressão gênica ótima. Para expressão em levedura, istopode ser feito pela mutagênese sítio-direcionada de um gene expressoineficientemente pela fusão deste a um gene de levedura endógeno, depreferência um gene altamente expresso. Alternativamente, pode-sedeterminar a seqüência de iniciação de tradução consenso no hospedeiro eplanejar essa seqüência em genes heterólogos para sua expressão ótima nohospedeiro de interesse.
A região de terminação pode ser derivada a partir da região 3' dogene a partir da qual a região de iniciação foi obtida ou de gene diferente. Umgrande número de regiões de terminação é conhecido e funcionamsatisfatoriamente em uma variedade de hospedeiros (quando utilizadas nosmesmos e em diferentes gêneros e espécies de onde foram derivados). A regiãode terminação é normalmente selecionada mais como uma questão deconveniência, e não em virtude de qualquer propriedade particular.
Preferencialmente, quando o hospedeiro microbiano é uma célula de levedura, aregião de terminação é derivada de um gene de levedura (Saccharomycesparticularmente, Schizosaccharomyces, Candida, Yarrowia ou Kluyveromyces).
As regiões 3' de genes de mamíferos que codificam γ-interferon e y-2 interferontambém são conhecidos por funcionar em levedura. As regiões de controle determinação podem, também, ser derivadas de vários genes nativos para oshospedeiros preferenciais. Opcionalmente, um sítio de terminação pode serdesnecessário; entretanto, ele é da máxima preferência se incluído. Embora nãose destina a limitar, as regiões de terminação úteis nesta descrição incluem: ~100 bp da região 3' da protease extracelular de Yarrowia Iipolytica (XPR;GenBank n° de acesso M17741); Os terminadores da acil-CoA oxidase (Aco3:GenBank n° de acesso AJ001301 e N0 CAA04661; Pox3: GenBank n° de acessoXP_503244); o terminador Pex20 (GenBank n° de acesso AF054613); oterminador Pex16 (GenBank n° de acesso U75433); o terminador Lipl (GenBankn° de acesso Z50020); o terminador Lip2 (GenBank n° de acesso AJ012632); e oterminador da 3-oxoacil-coA tiolase (OCT; GenBank n° de acesso X69988).
Como o versado na técnica está consciente, somente a inserçãode um gene em um vetor de clonagem não garante que ele será expresso comêxito ao nível necessário. Em resposta à necessidade de uma elevada taxa deexpressão, muitos vetores de expressão especializados foram criados atravésda manipulação de uma série de elementos genéticos que controlam diferentesaspectos da transcrição, tradução, estabilidade da proteína, limitação deoxigênio e secreção da célula hospedeira microbiana. Mais especificamente, algumas das características moleculares que tem sido manipulada paracontrolar a expressão gênica incluem: (1) a natureza das seqüênciaspromotoras e terminadoras transcricionais relevantes; (2) o número de cópiasdo gene clonado e se o gene é transportado por plasmídeo ou integrado nogenoma da célula hospedeira; (3) a localização celular final da proteínaestrangeira sintetizada; (4) a eficiência da tradução e dobramento correto daproteína no organismo hospedeiro; (5) a estabilidade intrínseca do mRNA e daproteína do gene clonado no interior da célula hospedeira; e (6) o uso de códondentro do gene clonado, de tal forma que a sua freqüência se aproxima dafreqüência de uso preferencial de códon da célula hospedeira. Cada um destes tipos de modificações são englobados na presente invenção, como meio paraotimizar ainda mais a expressão d desaturase delta-5 aqui descrita.
Depois que o DNA codifica um polipeptídeo adequado para umaexpressão na célula hospedeira microbiana adequada (por exemplo, leveduraoleaginosa) foi obtido (por exemplo, um gene quimérico que compreende umpromotor, ORF e terminador), ele é colocado em um vetor plasmídeo capazde repiicação autônoma em uma célula hospedeira ou ele é diretamenteintegrado no genoma da célula hospedeira. A integração de cassetes deexpressão pode ocorrer aleatoriamente dentro do genoma hospedeiro oupode ser direcionada através do uso de construtos contendo regiões de homologia com o genoma hospedeiro suficientes para alcançar arecombinação no Iocus do hospedeiro. Quando construtos são direcionadospara um Iocus endógeno, todas ou algumas das regiões reguladorastranscricionais e de translação podem ser fornecidas ao Iocus endógeno.Na presente invenção, o método preferencial de expressar emYarrowia Iipolytica é através da integração do DNA linear com o genoma dohospedeiro; e, a integração em vários sítios dentro do genoma pode serparticularmente útil quando alto nível de expressão de genes é desejado [porexemplo, no Iocus Ura3 (GenBank n° de acesso AJ306421), no lócus do geneLeu2 (GenBank n° de acesso AF260230), no gene Lys5 (GenBank n° deacesso M34929), no Iocus do gene Aco2 (GenBank n° de acesso AJ001300),no Iocus do gene Pox3 (Pox3: GenBank n° de acesso XP_ 503244; ou, Aco3:GenBank n° de acesso AJ001301), no Iocus do gene delta-12 desaturase(Publicação PCT n0 WO 2004/104167), no Iocus do gene Lipl (GenBank n° deacesso Z50020) e/ou no Iocus do gene Lip2 (GenBank n° de acessoAJ012632)].
Vantajosamente, o gene Ura3 pode ser usado várias vezes emcombinação com ácido 5-Fluororotico (5-fluorouracil-6-carboxílico monoidrato; "δ-FOA") seleção (infra), para permitir facilmente as modificações genéticas e paraser integrado no genoma de Yarrowia de uma forma fácil.
Quando dois ou mais genes são expressos a partir de vetores dereplicação separados, é desejável que cada vetor tenha um meio diferente deseleção e deve também faltar homologia com o(s) outro(s) construto(s) paramanter a expressão estável e impedir reagrupamento dos elementos entreconstrutos. A escolha judiciosa das regiões reguladoras, meios de seleção emétodo de propagação do(s) construtos(s) introduzido(s) podem serdeterminados experimentalmente, de modo que todos os genes introduzidossão expressos em níveis necessários para a síntese dos produtos desejados.
Os construtos que compreendem o gene de interesse podem serintroduzidos em uma célula hospedeira microbiana por qualquer técnicapadrão. Estas técnicas incluem transformação (por exemplo, transformação deacetato de lítio [Methods in Enzymology, 194:186 - 187 (1991)]), fusãoprotoplástica, impacto bolístico, eletroporação, microinjecção, ou qualquer outrométodo que introduz o gene de interesse na célula hospedeira. Maisensinamentos específicos aplicáveis para leveduras oleaginosas (ou seja,Yarrowia Iipolytica) incluem U.S. 4.880.741 e U.S. 5.071.764 e Chen1 D. C. etal. (Appl. Microbioi Biotechnol., 48(2):232-235 (1997)).
Por conveniência, uma célula hospedeira que tenha sidomanipulada por qualquer método para ocupar uma seqüência de DNA (porexemplo, um cassete de expressão) será chamado de "transformado" ou"recombinante" neste documento. Assim, o termo "transformado" e"recombinante" são usados de maneira intercambiável aqui. O hospedeirotransformado terá pelo menos uma cópia do construto de expressão e pode terduas ou mais, dependendo se o gene está integrado no genoma, amplificado ouestá presente em um elemento extracromossômico que tem múltiplos númerosde cópias.
A célula hospedeira transformada pode ser identificada pordiferentes técnicas de seleção, como descrito na PCT Publicação N 0 WO2004/101757 WO 2006/052870. Os métodos de seleção preferenciais parautilização neste documento são resistência à canamicina, higromicina e aminoglicosídeo G418, bem como a capacidade de crescer em meios onde faltamuracila, leucina, lisina, histidina e triptofano. Em realizações alternativas, 5-FOA éutilizado para a seleção de leveduras mutantes de Ura. O composto é tóxicopara células de levedura que têm um gene URA3 em funcionamento que codificaorotidina 5 '-monofosfato descarboxilase (OMP descarboxilase); Dessa forma,com base nesta toxicidade, 5-FOA é especialmente útil para a seleção eidentificação de cepas mutantes de levedura Ura" (Bartel, PL e Fields, S., Yeast2-Hybrid System, Oxford University: New York, v. 7, pp 109-147, 1997). Maisespecificamente, um pode primeiro neutralizar o gene nativo Ura3 para produziruma cepa com um fenótipo Ura-, sendo que a seleção ocorre baseada emresistência a 5-FOA. Em seguida, um aglomerado de múltiplos genes quiméricose um novo gene Ura3 podem ser integrados em um Iocus diferente do genomade Yarrowia para assim produzir uma nova cepa que tem um fenótipo Ura+. Aintegração subseqüente produz uma nova cepa Ura3 (novamente identificadausando seleção 5-FOA), quando o gene introduzido Ura3 está neutralizado.Assim, o gene Ura3 (em combinação com a seleção 5-FOA) pode ser usadocomo um marcador de seleção nas múltiplas sessões de transformação.
Seguindo a transformação, substratos adequados para adesaturase delta-5 instantânea (e, opcionalmente outras enzimas AGP quesão co-expressas no interior da célula hospedeira) podem ser produzidos pelohospedeiro quer naturalmente quer transgenicamente, ou eles podem serfornecidos de maneira exógena.
As células hospedeiras microbianas para a expressão dos genesinstantâneas e fragmentos de ácidos nucléicos podem incluir hospedeiros quecrescem em uma variedade de matérias primas, incluindo carboidratos simplesou complexos, ácidos graxos, ácidos orgânicos, alcoóis e óleos e/ouhidrocarbonetos ao longo de uma vasta faixa de temperatura e pH. Com basenas necessidades do requerente cessionário, os genes descritos na presenteinvenção serão expressos em uma levedura oleaginosa (e em particularYarrowia Iipolytica); Entretanto, é entendido que porque transcrição, tradução eo aparato biossintético da proteína são altamente conservados, qualquerbactéria, levedura, alga e/ou fungo será um hospedeiro microbiano adequadopara a expressão dos fragmentos do ácido nucléico presentes.
Os hospedeiros microbianos preferenciais, no entanto, sãoleveduras oleaginosas. Estes organismos são naturalmente capazes de síntese eacúmulo de óleo, sendo que o óleo pode compreender mais do que cerca de 25%do peso seco da célula, com mais preferência mais de que cerca de 30% do pesoseco da célula, com a máxima preferência, mais do que 40% do o peso seco dacélula. Os gêneros tipicamente identificados como leveduras oleaginosas incluem,mas não estão limitados a: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium,Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces. Mais especificamente, levedurasilustrativas de síntese de óleo incluem: Rhodosporidium toruloides, Lipomycesstarkeyii, L. iipoferus, Candida revkaufi, C. puicherrima, C. tropicalis, C. utilis,Trichosporon pullans, T. cutaneum, Rhodotorula glutinus, R. graminis e YarrowiaIipolytica (anteriormente classificada como Candida lipolytica).
De máxima preferência é a levedura oleaginosa Yarrowialipolytica-, e, em outra realização, da máxima preferência são a cepas de Y. lipolytica chamadas de ATCC n° 20362, ATCC n° 8862, n0 ATCC 18944,ATCC n° 76982 e /ou LGAM S (7) 1 (Papanikolaou S., e Aggelis G.,Bioresour. Technoi 82(1):43-9 (2002)).
Historicamente, várias cepas de Y. lipolytica têm sido usadas para afabricação e produção de: isocitrato liase; lipases; poliidroxialcanoato; ácido cítrico; eritritol; 2-ácido oxoglutarico; γ-decalactona; γ-dodecalatona; e ácido pirúvico. Osensinamentos específicos aplicáveis para projetar a produção de ARA, EPA eDHA em Y. lipolytica são fornecidos no pedido de Patente U.S. n° 11/264784 (WO2006/055322), pedido de Patente U.S. n° 11/265761 (WO 2006/052870) e pedidode Patente U.S. n° 11/264737 (WO 2006/052871), respectivamente.
Outros hospedeiros microbianos preferenciais incluem bactérias,algas e outros fungos oleaginosos; e, dentro deste amplo grupo de hospedeirosmicrobianos, de particular interesse são os microorganismos que sintetizamácidos graxos ômega-3/ômega-6 (ou aqueles que podem ser geneticamenteprojetados para este propósito [por exemplo, outras leveduras, como a Saccharomyces cerevisiae]). Assim, por exemplo, a transformação deMortierella alpina (que é utilizado comercialmente para a produção da ARA)com qualquer um dos presentes genes desaturase delta-5 sob o controle depromotores induzíveis ou regulados poderiam produzir um organismotransformante capaz de sintetizar quantidades crescentes de DGLA O métodode transformação de M. alpina é descrita por Mackenzie et al. (Appl. Environ.Microbiol., 66:4655 (2000)). Do mesmo modo, métodos para a transformaçãode microorganismos Thraustochytriales são apresentado na US 7.001.772.
Com base nos ensinamentos acima descritos, em uma realizaçãoesta invenção é atraída para um método de produção, quer ARA ou ΑΡΕ,respectivamente, que compreende:
(a) proporcionar uma levedura oleaginosa que compreende:
(i) um primeiro DNA construto recombinante que compreendeum polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo desaturase delta-5,operacionalmente ligados a pelo menos uma seqüência reguladora.; e,
(ii) uma fonte de substrato desaturase que consiste em DGLA oude ETA, respectivamente, e,
(b) cultivo da levedura da etapa (a) na presença de uma fontede carbono fermentável adequada, sendo que o gene que codifica opolipeptídeo desaturase delta-5 é expresso e DGLA é convertido para ARA ouETA é convertido para EPA, respectivamente, e,
(c) opcionalmente recuperar o ARA ou ΑΡΕ, respectivamente,da etapa (b).
Alimentação de substrato pode ser necessária.
Evidentemente, uma vez que AGPs produzidos naturalmente emlevedura oleaginosa são limitados a ácidos graxos 18:2 (isto é, LA), e menoscomumente, ácidos graxos 18:3 (ou seja, ALA), em realizações maispreferenciais da presente invenção a levedura oleaginosa será geneticamenteprojetada para expressar várias enzimas necessárias para a biossíntese deAGP de cadeia longa (por meio disso, permitindo a produção de, por exemplo,ARA, EPA, DPA e DHA), em adição às desaturases delta- -5 aqui descritas.
Especificamente, em uma realização, a presente invenção dizrespeito a uma levedura oleaginosa que compreende:
(a) um primeiro DNA construto recombinante que compreende umpolinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo desaturase delta-5,operacionalmente ligada a pelo menos uma seqüência reguladora; e,
(b) pelo menos um DNA construto recombinante adicional quecompreende um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelo menosuma seqüência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionado do grupoque consiste em: uma desaturase delta-4, uma desaturase delta-5, umadesaturase delta-6, uma desaturase delta-9, uma desaturase delta-12, uma desaturase delta-15, uma desaturase delta-17, uma elongase delta-9, umaelongase C14/16, uma elongase C16/18. uma elongase C18/20 e/ou uma elongaseC20/22·
Em realizações particularmente preferenciais, o pelo menos umconstruto de DNA recombinante adicional codifica um polipeptídeo que tematividade de elongase delta-9, por exemplo, a elongase delta- -9 isolada ouderivada de Isochrysis galbana (GenBank acesso N0AF 390174; lgD9e oulgD9eS) ou a elongase delta-9 isolada ou derivada de Euglena gracilis.
Engenharia Metabólica de Biossíntese de Ácidos Graxos ômega-3 e/ou
Ômega-6 em MicróbiosOs métodos para manipulação de vias bioquímicas são bemconhecidos para os versados na técnica; e, espera-se que muitasmanipulações serão possíveis para maximizar a biossíntese do ácido graxoômega-3 e/ou ômega-6 em leveduras oleaginosas e, particularmente, emYarrowia lipolytica. Esta manipulação pode exigir engenharia metabólica diretamente dentro da via biossintética AGP ou manipulação coordenadaadicional de várias outras vias metabólicas.
No caso de manipulações dentro da via biossintética AGP, podeser desejável, para aumentar a produção de LA, que se permita um aumento daprodução de ácidos graxos ômega-6 e/ou ômega-3. Os genes de introduçãoe/ou ampliação que codificam desaturases delta-9 e / ou delta-12 podemconseguir isso. Para maximizar a produção de ácidos graxos ômega-6insaturados, é bem conhecido pelo versado na técnica que a produção é favorecida em um microorganismo hospedeiro que é substancialmente isento deALA; dessa forma, preferencialmente, o hospedeiro é selecionado ou obtido porremoção ou inibição de atividade de desaturase tipo delta-15 ou ômega-3 quepermitem a conversão de LA para ALA. Alternativamente, pode ser desejávelmaximizar a produção de ácidos graxos ômega-3 (e minimizar síntese de ácidos graxos ômega-6). Nesse exemplo, pode-se utilizar um microrganismohospedeiro onde a atividade desaturase delta-12 que permite a conversão deácido oléico para LA é removido ou inibido; subseqüentemente, cassetes deexpressão adequados seriam introduzidos no hospedeiro, juntamente comsubstratos apropriados (por exemplo, ALA) para a conversão de ácidos graxosômega-3 derivados de ALA (por exemplo, STA, ETrA, ETA, EPA, DPA, DHA).
Em realizações alternativas, as vias bioquímicas que concorremcom a via biossintética de ácidos graxos ômega-3 e/ou ômega-6 por energiaou carbono, ou enzimas da via biossintética nativa AGP que interferem com aprodução de um determinado produto final, AGP, podem ser eliminadas por divisão de gene ou regulados para baixo por outros meios (por exemplo,mRNA antisenso).
Discussão detalhada das manipulações dentro da viabiossintética AGP como um meio para aumentar ARA, EPA ou DHA (etécnicas associadas das mesmas) são apresentados na publicação PCT η 0WO 2006/055322, WO 2006/052870 e WO 2006/052871, respectivamente,como o são manipulações desejáveis na via biossintética TAG e via dedegradação TAG (e técnicas associadas das mesmas).
Dentro do contexto da presente invenção, pode ser útil para modulara expressão da via biossintética de ácido graxo por qualquer uma das estratégiasacima descritas. Por exemplo, a invenção fornece métodos onde genes quecodificam enzimas fundamentais na via biossintética elongase delta-9 /desaturasedelta-8 são introduzidos em leveduras oleaginosas para produção de ácidosgraxos ômega-3 e/ou ômega-6. Será particularmente útil expressar os genesdesaturase delta-5 em leveduras oleaginosa que não têm naturalmente viasbiossintética de ácidos graxos ômega-3 e/ou ômega-6 e coordenar a expressãodesses genes, para maximizar a produção dos produtos AGPs preferenciaisusando vários meios para a engenharia metabólica do organismo hospedeiro.
Processos de Fermentação Microbiana para Produção de AGPA célula hospedeira transformada é cultivada em condições queotimizam expressão de genes desaturase quiméricos e produzir os maiores eos mais econômicos dos AGPs desejados. Em geral, condições do meio quepodem ser otimizadas incluem o tipo e a quantidade da fonte de carbono, o tipoe a quantidade da fonte de nitrogênio, a razão carbono-nitrogênio, a quantidadede íons minerais diferentes, o nível de oxigênio, aumento de temperatura, pH,comprimento da fase de produção da biomassa, comprimento da fase deacumulação de óleo e o tempo e método de colheita de célula. As YarrowiaLipolytica geralmente são cultivadas em meios complexos (por exemplo, extratode levedura, caldo de peptona-dextrose (YPD)) ou um meio mínimo definidoque carece de um componente necessário para o crescimento e, assim, força aseleção dos desejados cassetes de expressão (por exemplo, Levedura AzotoBásica (DIFCO Laboratories, Detroit, Ml)).
O meio de fermentação na presente invenção precisa conter uma adequada fonte de carbono. As fontes de carbono adequadas são ensinadasna Publicação PCT N 0 WO 2004/101757. Embora seja esperado que a fontede carbono utilizada na presente invenção possa abranger uma grandevariedade de fontes de carbono, as fontes de carbono preferenciais sãoaçúcares, glicerol e / ou ácidos graxos. As de máxima preferência são glicosee/ou ácidos graxos contendo entre 10 e 22 carbonos.
O nitrogênio pode ser fornecido a partir de uma fonteinorgânica (por exemplo, (NH4)2 SO4) ou orgânica (por exemplo, uréia ou glutamato). Em adição às fontes adequadas de carbono e nitrogênio, omeio de fermentação adequado precisa conter minerais, sais, cofatores,tampões e outros componentes conhecidos por aqueles versados natécnica, adequados para o crescimento das culturas e na promoção deuma via enzimática necessária para produção de AGP. Particular atenção édada aos vários íons metálicos (por exemplo, Mn+2, Co+2, Zn+2, Mg+2) quepromovem a síntese de lipídios e AGPs (Nakahara, T. et al., Appi SingleCell Oils, D. J. Kyle and R. Colin, eds. pp 61-97 (1992)).
Os meios de crescimento preferenciais na presente invençãosão meios preparados comercialmente comuns, como levedura a base de nitrogênio (DIFCO Laboratories, Detroit, Ml). Outros meios de crescimentodefinidos ou sintéticos podem também ser utilizados, bem como o meioadequado para o crescimento das células do hospedeiro transformantesserá conhecido por um perito na matéria de microbiologia ou ciência dafermentação. A faixa de pH adequada para a fermentação é normalmente entre cerca de pH 4,0 a pH 8,0, onde pH 5,5 a pH 7,5 é preferencial comoa faixa para as condições iniciais do crescimento. A fermentação pode serconduzida sob condições aeróbicas e anaeróbicas, sendo que ascondições microaeróbicas são preferenciais.
Tipicamente, o acúmulo de níveis elevados de AGPs em células de levedura oleaginosa exige um processo em dois estágios, umavez que o estado metabólico precisa ser "equilibrado" entre o crescimentoe a síntese/armazenamento de gorduras. Dessa forma, com a máximapreferência, um processo de fermentação em dois estágios é necessáriopara a produção de AGPs em leveduras oleaginosas Ce.gr., Yarrowialipolytica). Esta abordagem é descrita na Publicação PCT N 0 WO2004/101757, como são vários projetos de processos de fermentaçãoadequados (ou seja, por batelada, por batelada com alimentação econtínuo) e considerações durante o crescimento.
Purificação ε Processamento de Óleos AGP
Os AGPs podem ser encontrados em plantas emicroorganismos hospedeiros como ácidos graxos livres ou em formasesterificadas como acil gliceróis, fosfolipídios, sulfolipídios ou glicolipídieos,e podem ser extraídos das células hospedeiras através de uma variedadede meios bem conhecidos na técnica. Uma revisão de técnicas deextração, qualidade de análise e padrões de aceitabilidade para lipídios delevedura é o de Z. Jacobs (Criticai Reviews in Biotechnology,12(5/6):463-491 (1992)). Uma breve revisão do processamento a jusantetambém está disponível em A. Singh e O. Ward (Adv. Appi Microbiol.,45:271-312 (1997)).
Em geral, os meios para a purificação de AGPs podem incluirextração com solventes orgânicos, sonicação, extração de fluido supercrítica(por exemplo, usando o dióxido de carbono), saponificação e meios físicos,como prensas, ou combinações dos mesmos. Consulte a Publicação PCT N0WO 2004/101757 para obter detalhes adicionais. Métodos para isolamento deóleos de sementes são bem conhecidos na técnica: (Young et al., Processingof Fats and Oils, In the Lipid Handbook, Gunstone et al., eds., Chapter 5pp 253-257; Chapman & Hall: London (1994)). Por exemplo, óleo de soja éproduzido usando uma série de etapas que envolvem a extração e purificaçãode um produto de óleo comestível a partir de sementes oleaginosas. Os óleose subprodutos de soja são produzidos usando as etapas generalizadasmostradas na tabela 3.Tabela 3
Etapas Generalizadas para Produção de óleo de Soja ε Subprodutos
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Mais especificamente, as sementes de soja são limpas,
temperadas, descascadas e floculadas, aumentando assim a eficiência daextração de óleo. A extração de óleo é normalmente realizada por extração porsolvente (por exemplo, hexano), mas também pode ser conseguida por umacombinação de pressão física e/ou extração por solvente. O óleo resultante échamado de óleo bruto. O óleo bruto pode ser degomado por hidratantesfosfolipídios e outros complexos lipídicos polares e neutros que facilitam a suaseparação da fração triglicerídeos não hidratantes (óleo de soja). As gomasIecitina resultantes podem ser tratados posteriormente para produzircomercialmente importantes produtos de Iecitina usados em uma variedade dealimentos e produtos industriais, como agentes de emulsificação e liberação(ou seja, não adesivos). O óleo degomado pode ser aperfeiçoado para aremoção de impurezas (principalmente ácidos graxos livres, gomas epigmentos residuais). O refino é realizado através da adição de um agentecáustico que reage com ácidos graxos livres para formar sabão, hidratosfosfatídeo e proteínas no óleo bruto. A água é usada para remover vestígios desabão formados durante o refino. A "borra" (soapstock), um subproduto, podeser usada diretamente na alimentação animal ou acidulada para recuperar osácidos graxos livres. A cor é removida através de adsorção com terradescolorante que remove a maioria dos compostos de clorofila e carotenóides.
O óleo refinado pode ser hidrogenado, resultando assim em gorduras comvárias propriedades de fusão e texturas. A "winterização" (fracionamento) podeser usada para remover a estearina do óleo hidrogenado através decristalização sob condições cuidadosamente controladas de resfriamento. Adesodorização (principalmente através de destilação a vácuo) é o último passoe é projetado para remover compostos que conferem odor ou sabor ao óleo.Outros valiosos subprodutos, como esteróis e tocoferóis podem ser removidosdurante o processo de desodorização. Os destilados desodorizados quecontém esses subprodutos podem ser vendidos para a produção de vitamina Enatural e outros produtos de alto valor farmacêutico. Os óleos e gordurasrefinados, alvejados, (hidrogenado, fracionado) e desodorizados podem serembalados e vendidos diretamente ou ainda processados em produtos maisespecializados. Uma análise mais pormenorizada referente ao processamentode sementes de soja, produção e utilização de óleo de soja e seus derivadospode ser encontrada em Erickson, Practical Handbook of Soybean Processingand Utilization, the American Oil Chemists' Society and United Soybean Board(1995). O óleo de soja é um líquido à temperatura ambiente, porque ele temteores relativamente baixos de ácidos graxos saturados, em comparação comóleos como o de coco, de palma, de caroço de palma e de manteiga de cacau.Óleos vegetais e microbianos contendo AGPs que foram refinadase/ou purificados podem ser hidrogenados, para assim resultar em gorduras comdiversas propriedades de fusão e texturas. Muitas gorduras processadas(incluindo coberturas, gorduras de confeitaria, manteigas, margarinas, gordura vegetal, etc) exigem diferentes graus de solidez à temperatura ambiente e sópodem ser produzidos através da alteração das propriedades físicas da fonte doóleo. Isto é mais comumente realizado através de hidrogenação catalítica.
A hidrogenação é uma reação química na qual hidrogênio éadicionado às ligações duplas de ácido graxo insaturado com o auxílio de um catalisador como níquel. Por exemplo, o óleo de soja alto oléico contéminsaturados oléico, LA e ácidos graxos linolênicos e cada um destes pode serhidrogenado. A hidrogenação tem dois efeitos primários. Primeiro, a estabilidadeoxidativa do óleo é aumentada como conseqüência da redução do teor de ácidosgraxos insaturados. Em segundo lugar, as propriedades físicas do óleo sãoalteradas porque as alterações dos ácidos graxos aumentam o ponto de fusão,resultando em uma gordura semilíquida ou sólida em temperatura ambiente.
Existem muitas variáveis que afetam a reação de hidrogenaçãoque, por sua vez, altera a composição do produto final. As condições deoperação, incluindo pressão, temperatura, tipo de catalisador e concentração,agitação e design do reator estão entre os mais importantes parâmetros quepodem ser controlados. As condições de hidrogenação seletivas podem serusadas para hidrogenar os ácidos graxos mais insaturados, em detrimento dosmenos insaturados. Muito pouca ou hidrogenação de "pincelada" éfreqüentemente empregada para aumentar a estabilidade de óleos líquidos.Adicional hidrogenação converte um óleo líquido para uma gordura fisicamentesólida. O grau de hidrogenação depende do desempenho desejado ecaracterísticas de fusão projetadas para um produto final específico. A gorduravegetal líquida (usada na fabricação de produtos de panificação, gordurassólidas e gorduras vegetais usadas para operações comerciais de fritar e assar)e o estoque básico para fabricação de margarinas estão entre as miríades depossíveis produtos de óleos e gorduras obtidos através de hidrogenação. Umadescrição mais detalhada da hidrogenação e produtos hidrogenados podem ser encontrados em Patterson1 Η. B. W., Hydrogenation ofFats and Oils: Theory andPractice. the American Oil Chemists' Society (1994).
Os óleos hidrogenados tornaram-se um tanto controversos,devido à presença isômeros de ácidos graxos trans que resultam do processode hidrogenação. A ingestão de grandes quantidades de isômeros trans temsido associada com efeitos nocivos a saúde, incluindo um aumento das razõesde lipoproteínas de baixa densidade para alta densidade no plasma sangüíneoe aumento do risco de doença coronária.
Os Óleos Contendo AGP para uso em Gêneros Alimentícios
O mercado atualmente suporta uma grande variedade de produtos alimentícios para consumo humano e animal, incorporando ácidos graxosômega-3 e/ou ômega-6 (particularmente ARA, EPA e DHA). É observado que osóleos vegetais ou de sementes, as sementes modificadas e óleos microbianosda invenção que compreendem AGPs irão funcionar em produtos alimentíciospara consumo humano e animal para transmitir os benefícios de saúde das atuais formulações. Comparado com outros óleos vegetais, acredita-se que osóleos da invenção funcionam de forma semelhante a outros óleos em aplicaçõesalimentícias a partir de um ponto de vista físico (por exemplo, óleos parcialmentehidrogenados, como óleo de soja são amplamente usados como ingredientespara coberturas, margarina e gordura vegetal para fritar e assar).
Os óleos vegetais e os de sementes, as sementes modificadas eóleos microbianos contendo ácidos graxos ômega-3 e/ou ômega-6, conformedescritos a seguir serão adequados para uso em uma variedade de alimentos eprodutos para alimentação animal, incluindo, mas não limitados a: alimentosanálogos, produtos à base de carne, produtos à base de cereais, alimentosassados, biscoitos e salgadinhos e produtos lácteos. Adicionalmente, ospresentes óleos vegetais e os de sementes, as sementes modificadas e óleosmicrobianos podem ser usados em formulações para conferir benefício à saúde, incluindo nutricionais médicos, suplementos dietéticos, fórmulas para bebês,bem como os produtos farmacêuticos. O versado na técnica de processamento eformulação de alimentos irá compreender que quantidade e em qual composiçãoos óleos vegetais e microbianos podem ser acrescentados aos produtos dealimentação humana ou animal. Esta quantidade será mencionada neste documento como uma quantidade "eficaz" e dependerá do tipo de produto, dadieta que o produto se destina a complementar ou a condição médica que omédico ou nutricionista se destina a corrigir ou tratar.
Os análogos de alimentos podem ser produzidos usandoprocessos bem conhecidos pelos versados na técnica. Podem ser mencionados os análogos de carne, análogos de queijo, análogos de leite esimilares. Os análogos de carne produzidos a partir de soja contêm proteína desoja e tofu ou outros ingredientes misturados entre si para simular diversostipos de carnes. Essas carnes alternativas são vendidas como carnescongeladas, secas ou alimentos enlatados. Geralmente, elas podem ser usadas da mesma forma que os alimentos que substituem. As carnesalternativas feitas a partir de soja são excelentes fontes de proteínas, ferro evitaminas B. Exemplos de análogos de carne incluem, mas não estão limitadosa: análogos de presunto, análogos de salsicha, análogos de toucinho esimilares.
Os análogos de alimentos podem ser classificados como imitaçãoou substitutos, dependendo de suas características funcionais e de composição.Por exemplo, uma imitação de queijo só precisa parecer com o queijo a que sedestina a substituir. Entretanto, um produto pode geralmente ser chamado umsubstituto de queijo só se for nutricionalmente equivalente ao queijo que estásubstituindo e cumpre os requisitos mínimos de composição para aquele queijo.Assim, o substituto de queijo vai muitas vezes ter maiores níveis protéicos doque a imitação de queijo e ser enriquecido com vitaminas e minerais.
Os produtos alimentícios análogos de lácteos ou de não lácteosincluem, mas não estão limitados a, imitações de sobremesas congeladaslácteas e não lácteas (por exemplo, aquelas feitas a partir de produtos de sojae/ou proteína de soja).
Os produtos de carne abrangem uma grande variedade de produtos. Nos Estados Unidos "carne" inclui "carnes vermelhas" produzida apartir de bovinos, porcos e ovelhas. Além das carnes vermelhas, existemaves, que incluem frangos, perus, gansos, guineas, os patos e tambémexistem os peixes e crustáceos. Existe um amplo sortimento de produtos decarne processada e temperada: fresca, curada e frita, e curada e cozida. Salsichas e cachorros quentes são exemplos de produtos de carneprocessada. Assim, o termo "carne", conforme usado neste documento inclui,mas não está limitado a produtos de carne processada.
Um produto alimentício a base de cereal é um produto alimentícioresultante do processamento de um grão de cereal. Um grão de cereal incluitodas as plantas da família das gramíneas que produzem grãos comestíveis(sementes). Os mais populares grãos são cevada, milho, milheto, aveia,quinoa, arroz, centeio, sorgo, triticale, trigo e arroz selvagem. Exemplos de umproduto alimentício a base de cereal incluem, mas não estão limitados a: grãosinteiros, grãos esmagados, farinha grosseira, farinha, farelo, germe, cereaispara desjejum, alimentos extrudados, massas e similares.
Um produto "assado" compreende qualquer dos produtos a basede cereal mencionados acima que tem sido cozido ou processado em umaforma comparável à cozedura (ou seja, seco ou endurecido ao ser submetido acalor). Exemplos de um produto assado incluem, mas não estão limitados a:pães, bolos, sonhos, massas, migalhas de pão, salgadinhos fritos, mini-biscoitos, mini-crackers, mini-cookies, e mini-pretzels. Como foi mencionadoanteriormente, o óleo da invenção pode ser usada como ingrediente.
Um produto alimentício compreende qualquer um dos produtosalimentícios descritos acima ou abaixo.
Um produto alimentício frito compreende qualquer um dosprodutos alimentícios descritos acima ou abaixo que tenha sido frito.
Um produto alimentício saudável é qualquer produto alimentício que transmite um benefício de saúde. Muitos produtos alimentícios derivadosde oleaginosas podem ser considerados saudáveis.
A bebida pode estar em forma líquida ou como um pó seco.
Por exemplo, podem ser mencionados bebidas não-carbonatadas,como sucos de frutas frescos, congelados, enlatados ou concentrado; leite puro ou aromatizado, etc As fórmulas nutricionais para adultos e bebês são bemconhecidas na técnica e comercialmente disponíveis (por exemplo, Similac®,Ensure®, Jevity®, e Alimentum® de Ross Products Division, Abbott Laboratories).
As fórmulas para bebês são líquidos ou pó reconstituídos paraalimentar Iactentes e crianças jovens. A "fórmula para bebês" é definida aqui como um produto nutricional enteral, que pode ser substituído por leite humanona alimentação infantil e normalmente é composta de um percentual degordura desejado misturada com percentuais de carboidratos e proteínasdesejados em uma solução aquosa (por exemplo, ver Patente U.S. N04.670.285). Baseado em estudos de composição no mundo inteiro, bem como níveis especificados por grupos de peritos, o leite humano médio contémnormalmente cerca de 0,20% a 0,40% de ácidos graxos total (assumindo cercade 50% de calorias a partir de gordura); e, em geral, a razão de DHA para ARAse situa entre cerca de 1:1 para 1:2 (ver, por exemplo, formulações de EnfamilLIPIL™ (Mead Johnson & Company) e Similac Advance™ (Ross ProductsDivision1 Abbott Laboratories)). As fórmulas para bebês têm um papel especiala desempenhar na dieta das crianças porque elas são muitas vezes a únicafonte de nutrientes para lactentes; e, apesar do aleitamento materno ainda sero melhor alimento para lactentes, a fórmula infantil é como segunda opçãosuficiente não só para que os bebês sobrevivam, mas que também prosperem.
Um produto lácteo é um produto derivado do leite. Um produtoanálogo lácteo ou não lácteo é obtido a partir de uma fonte diferente do leite, porexemplo, leite de soja, como discutido acima. Esses produtos incluem, mas não estão limitados a: leite integral, leite desnatado, produtos de leite fermentadocomo iogurte ou leite azedo, nata, manteiga, leite condensado, leite desidratado,branqueador de café, formador de cremosidade para café, sorvete, queijo, etc.
Os produtos alimentícios adicionais em que os óleos contendoAGPs da invenção podem ser incluídos são, por exemplo, gomas de mascar, confeitos e coberturas, gelatinas e pudins, balas macias e duras, compotas egeléias, açúcar branco granulado, açúcar substitutos, molhos doces, coberturase xaropes e misturas em pó.
óleos contendo AGP para uso em produtos alimentícios saudáveis e
Farmacêuticos
Um produto alimentício saudável é qualquer produto alimentícioque transmite um benefício de saúde e inclui alimentos funcionais, alimentosmedicinais, nutricionais e suplementos medicinais dietéticos. Adicionalmente, osóleos vegetais e de sementes, as sementes modificadas e óleos microbianos dainvenção pode ser usados em composições farmacêuticas padrão (por exemplo,o AGP de cadeia longa contendo óleos poderia facilmente ser incorporado emqualquer um dos produtos alimentícios acima mencionados, para assim produzirum alimento funcional ou médico). As formulações mais concentradascompreendendo AGPs incluem cápsulas, pós, comprimidos, pílulas, cápsula degel, líquidos concentrados e emulsões, que podem ser usados como umsuplemento dietético em seres humanos ou animais.
Os Óleos Contendo AGP para uso na Alimentação Animal
As rações para animais são genericamente aqui definidas como produtos destinados à alimentação ou a mistura na alimentação de animaisnão humanos. Os óleos vegetais e de sementes, as sementes modificadas eóleos microbianos da invenção pode ser usados como ingredientes emdiversos alimentos para animais.
Mais especificamente, embora não se limitando a isso, espera-seque os óleos da invenção possam ser usados dentro de produtos alimentíciospara animais de estimação, ruminantes, aves e em produtos alimentíciosdestinados a aquacultura. Os produtos alimentícios para animais de estimaçãosão os produtos destinados à alimentação de um animal de estimação (porexemplo, cães, gatos, pássaros, répteis, roedores). Estes produtos podem incluir15 o cereal e produtos alimentícios saudáveis acima, bem como carnes esubprodutos de carnes, produtos de proteína de soja, produtos de feno e capim(por exemplo, alfafa, aveia ou legumes). Os produtos alimentícios pararuminantes e aves são aqueles onde o produto é destinado à alimentação de umanimal (por exemplo, perus, galinhas, gado bovino e suínos). Tal como acontece20 com os alimentos para animais de estimação acima, estes produtos podemincluir cereais e produtos alimentícios saudáveis, produtos de proteína de soja,carnes e subprodutos de carne, e produtos de feno e capim conforme listadoacima. Os produtos alimentícios de aquacultura são os produtos destinados aserem utilizados em fazendas aquáticas, ou seja, que diz respeito à propagação,25 cultivo ou criação de organismos aquáticos e/ou animais em água doce ousalgada.
Exemplos
A presente invenção está adicionalmente definida nos exemplos aseguir. Deve ficar entendido que estes exemplos, apesar de indicaremrealizações preferenciais da invenção, são dados apenas a título de ilustração. Apartir da discussão acima e destes exemplos, um versado na técnica podeconhecer as características essenciais desta invenção e, sem que se desvie docaráter e âmbito da mesma, podemos fazer várias alterações e modificações nainvenção para adaptá-la às suas diferentes utilizações e condições.
Métodos GeraisAs técnicas padrão de DNA recombinante e clonagem molecularusadas nos exemplos são bem conhecidas na técnica e são descritas por Sambrook, J., Fritsch, E. F. 1.) Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: ColdSpring Harbor, NY (1989) (Maniatis); 2.) T. J. Silhavy, M. L. Bennan, e L. W.Enquist, Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: ColdSpring Harbor, NY (1984); e 3.) Ausubel, F. M. et al., Current Protocols inMolecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. e Wiley-lnterscience, Hoboken, NJ (1987).
Os materiais e métodos adequados para a manutenção e ocrescimento de culturas microbianas são bem conhecidos na técnica. As técnicasadequadas para utilização nos seguintes exemplos podem ser encontradas de acordo com o Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R.G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Kriege G. Briggs Phillips, eds), American Society for Microbiology: Washington, D.C.(1994)); ou por Thomas D. Brock em Biotechnology: A Textbook of IndustrialMicrobiology, 2nd ed., Sinauer Associates: Sunderland, MA (1989). Todos osreagentes, enzimas de restrição e materiais usados para o crescimento emanutenção de células microbianas foram obtidas a partir de Aldrich Chemicals(Milwaukee, Wl), DIFCO Laboratories (Detroit, Ml), GIBCO/BRL (Gaithersburg,MD), ou Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a não ser que indicado deoutra forma. Células de E. coli (XLI-AzuI) competentes foram compradas daStratagene Company (San Diego, CA). As cepas de E. coli foram cultivadostipicamente a 37°C em placas Luria Bertani (LB).
A clonagem molecular geral foi realizada de acordo commétodos padrão (Sambrook et al., acima). A seqüência de DNA foi gerada emum seqüenciador automático ABI usando tecnologia corante terminador(Patente U.S. 5.366.860; PE 272.007) usando uma combinação de vetor einiciadores específicos de inserção. A edição da seqüência foi realizada emSequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml). Todas as seqüênciasrepresentam cobertura de pelo menos duas vezes nos dois sentidos. Ascomparações de seqüências genéticas foram realizadas usando softwareDNASTAR (DNASTAR Inc., Madison, Wl).
O significado das siglas é o seguinte: "sec" significa segundo(s),"min" significa minuto(s), "h" significa hora(s), "d" significa dia(s), "μΙ_" significamicrolitro(s), "ml_" significa millilitro(s), "L" significa litro(s), "μΜ" significamicromolar, "mM" significa millimolar, "M" significa molar, "mmol" significamillimole(s), "pmole" significa micromole(s), "g" significa grama(s), "pg" significamicrograma(s), "ng" significa nanograma(s), "U" significa unidade(s), "bp"significa pares(s) de base(s) e "kB" significa kilobase(s).
Transformação ε Cultivacão de Yarrowia LipolyticaYarrowia Iipolytica cepa ATCC # 20362 foi adquirido da AmericanType Culture Collection (Rockville, MD). Cepas de Y. Iipolytica eramnormalmente cultivadas a 28°C em YPD ágar (1% de extrato levedura, 2% debactopeptona, 2% de glicose, 2% de ágar).
A transformação de Y. Iipolytica foi realizada de acordo com ométodo de Chen, D. C. et al. (Appl. Microbiol Biotechnol., 48(2):232-235 (1997)),exceto onde especificado em contrário. Resumidamente, Yarrowia foi aplicadapor esfregaço em uma placa YPD e cultivada a 30°C por aproximadamente 18horas. Várias "loopfuls" grandes de células foram raspadas da placa e postas emressuspensão em 1 ml_ de tampão de transformação contendo: 2,25 mL de PEG50%, peso molecular médio 3350; 0,125 mL de acetato de Li 2 M1 pH 6,0;0,125 mL de TDT 2 M; e 50 mg de DNA de esperma de salmão cisalhado.
Depois, aproximadamente 500 ng de DNA plasmidial linear foi incubado em100pL de células em ressuspensão, e mantidos a 39°C durante 1 hora commistura por vórtice em intervalos de 15 minutos. As células foram colocadas emplacas com o meio selecionado e mantidas a 30°C durante 2 a 3 dias.
Para seleção de transformantes, meio mínimo ("MM") foi geralmente usado; a composição de MM é a seguinte: 0,17% de basenitrogenada de levedura (DlFCO Laboratories, Detroit, Ml) sem sulfato deamônio ou aminoácidos, 2% de glicose, 0,1% prolina, pH 6,1). Suplementos deuracil foram adicionados como adequado para uma concentração final de0,01% (produzindo assim meio de seleção "MMU", preparado com ágar 20 g/L).
Alternativamente, transformantes foram selecionados em meiosde seleção de ácido 5-ácido fluororotico ("FOA"; também ácido 5-fluorouracil-6-carboxílico monoidrato), compreendendo: 0,17% de base nitrogenada delevedura (DIFCO Laboratories) sem sulfato de amônio ou aminoácidos, 2% glicose, 0,1% prolina, uracil 75 mg/L, uridina 75 mg/L, FOA 900 mg/L (ZymoResearch Corp, Orange, CA) e ágar 20 g/L.
Análise de Ácidos Graxos de Yarrowia LipolyticaPara análise dos ácidos graxos, as células foram coletadas porcentrifugação e lipídios foram extraídos como descrito no Bligh, EG & Dyer, W. J. (Can. J. Biochem. Physiol., 37:911-917 (1959)). Os metil ésteres ácidos graxosforam preparados por transesterificação do extrato lipídico com metóxido de sódio(Roughan, G., I. e Nishida, Arch Biochem Biophys., 276 (1):38-46 (1990)) eposteriormente analisados com um cromatógrafo Hewlett GC-Packard 6890equipado com uma coluna 30-m X 0,25 mm (id) INNOWAX-HP (Hewlett-Packard).A temperatura do forno era de 170°C (25 min no início) a 185°C a 3,5°C/min.
Para transesterificação de base direta, cultura de Yarrowia (3 mL)foi colhida, lavada uma vez em água destilada, e seca sob vácuo em umaSpeed-Vac por 5 a 10 minutos. Metóxido de sódio (100 pL de 1%) foiacrescentado à amostra e, em seguida, a amostra foi misturada por vórtice eagitada por 20 minutos. Depois de adicionar 3 gotas de NaCI 1 M e 400 pL dehexano, a amostra foi misturada por vórtice e agitada. A camada superior foiretirada e analisada por cromatografia gasosa, conforme descrito acima.
Exemplo 1
Condições de Crescimento, perfil de Lipídio ε Isolamento de mRNA em
Euglena GracilisEuglena gracilis foi obtido a partir d laboratório de Dr. RichardTriemer na Michigan State University (East Lansing, Ml). De 10 mL de culturacrescendo ativamente, uma alíquota de 1 mL foi transferida em 250 mL demeio Euglena gracilis (Eg) em uma garrafa de vidro de 500 mL. O meio Eg foiproduzido pela combinação de 1 g de acetato de sódio, 1 g de extrato decarne bovina (Catálogo #U126-01, Laboratórios Difco, Detroit, Ml), 2 g detriptona Bacto® (Catálogo #0123-17-3, Laboratórios Difco) e 2 g de extrato delevedura Bacto® (Catálogo #0127-17-9, Laboratórios Difco) em 970 mL deágua. Depois de esterilizar o filtro, 30 mL de sobrenadante de terra-água (N°de catálogo 15-3790, Carolina Biological Supply Co., Burlington, NC) foiassepticamente adicionado para produzir o meio final Eg. As culturas deEuglena gracilis foram cultivadas a 23°C com um ciclo de 16 h de luz e 8 h deescuridão por 2 semanas, sem agitação.
Depois de 2 semanas, 10 mL de cultura foi removido para análisede lipídio e centrifugado a 1.800 χ g durante 5 minutos. O pellet foi lavado umavez com água e recentrifugado. Os pellets resultantes foram secos durante 5 mina vácuo, ressuspendidos em IOOpL de hidróxido trimetilsulfonio (TMSH) eincubados em temperatura ambiente por 15 min com agitação. Após isto, 0,5 mLde hexano foi adicionado e os frascos foram incubados durante 15 minutos emtemperatura ambiente com agitação. Os ésteres metílicos de ácidos graxos (5 μΙ_injetados da camada de hexano) foram separados e quantificados usando umcromatógrafo gasoso H ewlett-Packard 6890 equipado com uma com colunacapilar Omegawax 320 sílica fundida (Catálogo # 24152, Supelco Inc.,Bellefonte, PA). A temperatura do forno foi programada para permanecer a220°C por 2 a 7 min, aumentar para 240°C a 20°C/min, e depois permanecer a240°C por 2,3 min. O gás de arraste foi fornecido por um gerador de hidrogênioWhatman. Os tempos de retenção foram comparados aos de ésteres metílicosde padrões disponíveis comercialmente (Catálogo # U-99-A, Nu-Chek Prep, Inc.,Elysian, MN) e o cromatograma resultante é apresentado na figura 2.
O restante da cultura após 2 semanas (240 mL) foi transformadoem pellet por centrifugação a 1.800 χ g para 10 minutos, lavado uma vez comágua e recentrifugado. O RNA total foi extraído do pellet resultante usando oreagente RNA STAT-60™ (TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX) e seguindo oprotocolo fornecido do fabricante (utilização de 5 mL de RNA reagente,dissolvido em 0,5 mL de água). Desta forma, 1 mg de RNA total foi obtido apartir do pellet. O mRNA foi isolado de 1 mg de RNA total usando o kit depurificação de mRNA (Amersham Biosciences, Piscataway1 NJ) seguindo oprotocolo fornecido do fabricante. Desta forma, 85 pg de mRNA foram obtidas.
Exemplo 2
Síntese de cDNA de Euglena Gracilis
O cDNA foi sintetizado diretamente a partir do mRNA de Euglenagracilis da seguinte forma. Especificamente, o mRNA foi inicializado cominiciador AP (SEQ ID n°: 65) adaptado a partir do kit Invitrogen 3'-RACE(Carlsbad, Califórnia), na presença do oligonucleotídeo Smart IV (SEQ ID n°:66) a partir do kit da biblioteca de cDNA BD-CIontech creator™ Smart™(Mississauga, ON1 Canadá). A transcrição reversa foi feita com transcriptasereversa sobrescrito Il a partir do kit 3'-RACE de acordo com o protocolo do kitda biblioteca de cDNA Creator™ Smart™.
A 1 a síntese de mistura de cepa de cDNA foi usada como modelopara a amplificação de PCR1 usando o AP como o iniciador 3' e iniciador CDSIII5' (SEQ ID n°: 36) como o iniciador 5' (fornecido com o kit da biblioteca decDNA BD-CIontech creator™ Smart™). A amplificação foi realizada commistura de polimerase de cDNA Clontech Advantage a 94°C durante 30 segundos, seguidos por 20 ciclos de 94°C por 10 segundos e 68°C por 6minutos. Foi realizada uma extensão final a 68°C por 7 min.
Exemplo 3
Isolamento de uma Porção da Região de Codificação do Gene Desaturasedelta-5 de Euglena gracilisO presente exemplo descreve a identificação de uma porção dogene de Euglena gracilis que codifica desaturase delta-5 (aqui designadacomo "EgD5" (SEQ ID η 0 s: 1 e 2), pela utilização de oligonucleotídeosderivados de regiões conservadas de outra conhecidas seqüências dedesaturase delta -5 e delta-8.
Foram feitas várias considerações ao avaliar quais desaturasespodem capacitar designs de iniciadores degenerados adequados para isolar adesaturase delta-5 Euglena gracilis. Especificamente, os requerentes sabiamque só seqüências de desaturases delta-5, delta-6 e delta-8 compreendem ummotivo conservado 1HPGG' em seu N-terminal (onde o domínio 'HPGG' é partedo bem conhecido domínio do citocromo B5); em contraste, desaturases delta-9 têm um motivo 'HPGG' do domínio do citocromo B5 em seu C-terminal,enquanto as duas desaturases delta-17 e delta-12 não têm o domínio docitocromo B5. Pensava-se que uma via elongase delta-9 /desaturase delta-8operava em Euglena gracilis; assim, entre as desaturases que partilham omotivo conservado 'HPGG' N-terminal, só desaturases delta-5 e delta-8 eramesperadas no organismo. Finalmente, embora só algumas seqüências dedesaturase delta-8 são conhecidas, numerosas desaturases delta-5 estãodisponíveis publicamente. Os requerentes selecionaram aquelas seqüências dedesaturase delta-5 que tinham menor homologia com genes "tradicionais" dedesaturase delta-5 e que também partilhavam alta homologia entre si.
Com base no exposto acima, as quatro desaturase delta-5 eduas desaturases delta-8 mostrado a seguir na tabela 3 foram alinhadas, usando o método de Clustal W (opções Gonnet lenta, precisa; Thompson etal., Nucleic Acids Res., 22:4673-4680 (1994)) do MegAlign™ programa desoftware DNASTAR.
Tabela 3
Desaturases delta-5 E delta-8 Alinhadas para Identificar Regiões
Conservadas de Aminoácidos
<table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 103</column></row><table>
A Figura 3 mostra uma porção do alinhamento resultante, quecontém vários trechos da seqüência de aminoácidos conservada entre os seisdiferentes organismos. Com base neste alinhamento, dois conjuntos deoligonucleotídeos degenerados foram projetados para amplificar uma porçãoda região de codificação do gene da desaturase delta-5 a partir de Euglenagracilis, correspondendo às regiões da figura 3 que são identificadas como"Região Conservada 1" e "Região Conservada 2". Especificamente, aseqüência de aminoácidos conservada GHH(I/V)YTN (SEQ ID n°: 19) foiprojetada para corresponder à Região Conservada 1,enquanto a seqüência deaminoácidos conservada N(Y/F)Q(V/I)EHH (SEQ ID N°:20) foi projetado paracorresponder à Região Conservada 2. Para reduzir a degeneração dosoligonucleotídeos, quatro conjuntos de oligonucleotídeos (ou seja, 5-1 A, 5-1B,5-1C e 5-1 D) foram projetados para codificar a Região conservada 1, e 4conjuntos de oligonucleotídeos (ou seja, 5-5AR, 5-5BR, 5-5CR e 5-5DR) foramprojetados para codificar as fitas anti-senso da Região conservada 2.
Tabela 4
Oligonucleotídeos Degenerado usados para Amplificar o GeneDesaturase Delta-5 de Euglena gracilis
<table>table see original document page 103</column></row><table><table>table see original document page 104</column></row><table>
[Note: O código de degenerescência de ácido nucléico usado para as SEQ ID n°: 27 a 34 é daseguinte forma: R= A/G; Y=C/T; W=A/T; B=G/T/C; V=G/A/C;. e H=A/C/T.]
Baseada no comprimento total de seqüência das seqüênciasdelta-5 da figura 3 foi hipotetizado que o fragmento de gene delta-5 de Euglenagracilis amplificado conforme descrito acima seria de cerca de 600 bp d ecomprimento (faltam cerca de 210 aminoácidos na sua N-terminal e 70aminoácidos na sua C-terminal).
Um total de dezesseis diferentes amplificações PCR foramrealizadas, como todas as combinações de iniciadores foram testadas (ou seja,iniciador 5-1A foi usado com cada um dos 5-5AR, 5-5BR, 5-5CR e 5-5DR,individualmente, Semelhantemente, iniciador 5-1B foi usado com cada 5-5AR, 5-5BR, 5-5CR e 5-5DR; etc.). As amplificações de PCR foram executadas em umvolume total de 50 pL que compreende: tampão PCR (contendo KCI 10 mM,(NH4)2SO4IO mM, Tris-HCI 20 mM (pH 8,75), MgSO4 2 mM, Triton X-100 0,1%),BSA 100 pg/mL(concentração final), 200 μΜ cada desoxirribonucleotídeotrifosfato, 10 pmole de cada iniciador, e 10 ng cDNA de E. gracilis e 1 μΙ de TaqDNA polimerase (Epicentre Technologies, Madison, Wl). As condições dotermociclador foram estabelecidas para 35 ciclos de 95°C por 1 min, 56°C por 30seg e 72°C por 1 min, seguido de uma extensão final a 72°C por 10 min.
Os produtos do PCR foram purificados usando um kit Qiagen depurificação de PCR (Valencia, CA). Um fragmento do tamanho esperadoaproximado foi então mais purificado, após eletroforese em gel de agarose 1%(peso por volume) e então clonado no vetor pGEM-T-easy (Promega, Madison1Wl). O DNA ligado foi usado para transformar células de E. coli DH10B etransformantes foram selecionados em LB (1% Bacto-Triptona1 0,5% Bacto-extrato de levedura e 1% NaCI) ágar contendo ampicilina (100 pg/mL). A análise do DNA plasmidial a partir de um grupo de 12 transformantes confirmoua presença da inserção com o tamanho esperado (plasmídeos foramdesignados como "pT-FIO-1", "pT-FIO-2", "pT-F10-3M, etc. até "pT-FIO-12").
As seqüência de análises mostraram que pT-F10-1 continha umfragmento de 590 bp (SEQ ID n°: 4), que codifica 196 aminoácidos (SEQ ID n°: 5) (incluindo aminoácidos que correspondem as regiões conservadas 1 e2). A identidade da seqüência Euglena foi determinada através do uso deBLAST (Basic Local Alignment Search Tool [Ferramenta de Pesquisa deAlinhamento Local Básico]; Altschul, S. F., et al., J. Moi Biol., 215:403-410(1993)) buscas de similaridade para seqüências contidas na base de dados BLAST "nr" (incluindo todas as não-redundante GenBank CDS traduções,seqüências obtidas a partir da estrutura 3 - dimensional base de dados deproteínas Brookhaven, base de dados de seqüência de proteína SWISS-PROT1 bases de dados EMBL DDBJ e). A seqüência foi analisada porsimilaridade com todas as seqüências de DNA publicamente disponíveiscontidas na base de dados "nr" usando o algoritmo BLASTN fornecidos pelaNational Center for Biotechnology Information (NCBI). A SEQ ID n°: 4 foicomparada por similaridade para todas as seqüências protéicas publicamentedisponíveis incluídas na base de dados "nr", usando o algoritmo BLASTX(Gish, W. e Estados, DJ, Nature Genetics, 3:266 - 272 (1993)) fornecido pela NCBI.
Os resultados da comparação BLASTX resumindo a seqüência coma qual a SEQ ID n° 4 tem a maior similaridade são reportados de acordo com apercentagem de identidade, a percentagem de similaridade e o valor deexpectância. "Percentagem de identidade" é definido como o percentual deaminoácidos idênticos entre as duas proteínas. "Porcentual de semelhança" édefinido como o percentual de aminoácidos que são idênticos ou conservadosentre as duas proteínas. O "valor de expectância" estima a importância estatísticada semelhança, especificando o número de aminoácidos idênticos, com umadeterminada pontuação, que são esperados em uma pesquisa de uma base dedados desta dimensão, absolutamente por acaso. Dessa forma, a seqüência deaminoácidos traduzida SEQ ID n°: 4 (isto é, SEQ ID n°: 5) tinha 38% de identidadee 53% de semelhança com a seqüência de aminoácidos da desaturase delta-8-esfingolipídeo de Thalassiosira pseudonana (GenBank n° de acesso AAX14502;SEQ ID n°: 21), com um valor de expectância de 5E-28; adicionalmente, ofragmento parcial da SEQ ID n°: 4 teve 37% de identidade e 52% de semelhançacom a desaturase delta-5 ácido graxo de Phaeodactylum tricomutum (GenBank n°de acesso AAL92562; SEQ ID n°: 14), com um valor de expectância de 7E-28.
Exemplo 4
Isolamento da Região de Codificação 5' do gene Desaturase delta-5Euglena Gracilis
Para isolar a porção N-terminal da desaturase delta-5 putativaidentificada no Exemplo 3, uma técnica 5' RACE modificada baseada emprotocolos RACE de duas diferentes empresas (isto é, Invitrogen e BD-Clontech) foi utilizada.
Resumidamente, o cDNA de fita dupla de Euglena gracilis(exemplo 2) foi usado como um modelo em um experimento 5' RACE, quecompreende duas sessões separadas de amplificação de PCR. Na primeirasessão de PCR, os iniciadores oligonucleotídeos que consistem em um geneespecífico oligonucleotídeo (isto é, ODMW480; SEQ ID n°: 35) e o iniciadorgenérico de oligonucleotídeo CDSIII 5' (SEQ ID n°: 36) a partir do kit dabiblioteca de cDNA BD-CIontech creator™ Smart™ As amplificações de PCRforam executadas em um volume total de 50 μΙ_ que compreende: 25 μΙ_ deTaq LA™ pré-mistura (Takara Bio Inc., Otsu1 Shiga, 520-2193, Japão), 10pmole de cada iniciador e 1 μί de Taq DNA polimerase (EpicenterTechnologies, Madison, Wl). As condições do termociclador foram estabelecidas para 35 ciclos de 95°C por 1 min, 56°C por 30 seg e 72°C por1 min, seguido de uma extensão final a 72°C por 10 min.
A segunda sessão de amplificação PCR usou 1 μΙ_ do produtotendo a primeira sessão de reação de PCR como modelo. Os iniciadoresconsistem em um gene específico oligonucleotídeo (ou seja, ODMW479; SEQ ID n°: 37) e do oligonucleotídeo genérico DNR CDS 5" (SEQ ID n°: 38),fornecidos com o kit da biblioteca de cDNA BD-CIontech Creator™ Smart1SA amplificação foi conduzida conforme descrito acima.
Os produtos da segunda sessão da reação de PCR passarampor eletroforese em agarose 1% (peso por volume). Os produtos entre 400 bp e 800 bp foram em seguida purificados a partir de gel e clonados novetor pGEM-T-easy (Promega, Madison, Wl). O DNA ligado foi usado paratransformar E. coli DH10B e os transformantes foram selecionados em ágarLB contendo ampicilina (100 pg/mL).
A análise do DNA de um plasmídeo de um transformante compreendendo a região 5' do gene desaturase delta-5 putativo confirmoua presença do esperado plasmídeo, chamado pT-EgD5-5'C2. A análise daseqüência mostrou que pT-EgD5-5'C2 contém um fragmento de 797 bp(SEQ ID n°: 6), que se sobrepõe com 238 bp do fragmento e 590 bp daextremidade 5' do dpT-1-D5 (exemplo 3; SEQ ID n°: 4) e forneceadicionalmente 559 bp de seqüência 5' a montante (SEQ ID n°: 7) (figura4). A seqüência de pT-EgD5-5'C2 também corrige a seqüênciacorrespondente a região conservada 1, resultante da utilização de umoligonucleotídeo degenerado para a amplificação PCR inicial do fragmentode 590 bp em pT-F10-1 (exemplo 3). Entretanto, não havia códon deiniciação de tradução no fragmento prolongado de 797 bp da SEQ ID n°: 6.
Uma segunda sessão da 5'RACE modificada foi realizadaconforme descrito acima, exceto que os oligonucleotídeos YL791 (SEQ IDn°: 39) e YL792 (SEQ ID n°: 40) foram usados como iniciadores específicospara o gene. Os produtos entre 200 bp e 400 bp foram em seguidapurificados a partir de gel e clonados no vetor pGEM-T-easy (Promega,Madison, Wl). O DNA ligado foi transformado em E. coli DH10B etransformantes foram selecionados em ágar LB contendo ampicilina(100 Mg / mL).
A análise do DNA de um plasmídeo de um transformantecompreendendo a região 5' do gene desaturase delta-5 putativo confirmoua presença do esperado plasmídeo, chamado pT EgD5-5' 2nd A análise daseqüência mostrou que pT-EgD5-5' 2a contém um fragmento de 273 bp(SEQ ID n°: 8), que se sobrepõe com 253 bp do fragmento de DNA daextremidade 5' em pT-EgD5-5'C2 descrito acima e fornece adicionalmente20 bp da seqüência 5' a montante (SEQ ID n°: 9). Dezessete (17) bp dos20 bp codifica a porção N-terminal do gene putativo desaturase delta-5,incluindo códon de iniciação da tradução, proporcionando, assim, acompleta seqüência 5' do gene.
Exemplo 5
Isolamento da Região de Codificação 3' do gene Desaturase delta-5Euglena Gracilis
Para isolar a porção C-terminal da desaturase delta-5 putativaidentificadas no exemplo 3, uma técnica RACE 3' foi utilizada. A metodologia foidescrita acima no exemplo 4; entretanto, os iniciadores usados em ambasprimeira e a segunda sessão de amplificação de PCR foram conformemostrado abaixo na tabela 5.Tabela 5
Iniciadores Oligonucleotídeos Usados para 3' RACE
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* Iniciador AUAP foi fornecido em kit 3'-RACE Invitrogen (Carlsbad, Califórnia).
Após o isolamento e purificação de produtos (ou seja, 400 a 800bp), os fragmentos foram clonados no vetor pGEM-T-easy (Promega) etransformados em E. coli DH10B1 como no exemplo 4.
A análise do plasmídeo de DNA de um transformantecompreendendo a região 3' do gene desaturase delta-5 confirmou a presença doesperado plasmídeo, designado pT EgD5-3\ A análise da seqüência mostrouque pT-EgD5-3' continha um fragmento de 728 bp (SEQ ID n°: 10), quesobrepõe 264 bp a partir da extremidade 3' do fragmento de 590 bp de pT-1-D5(exemplo 3, SEQ ID n°: 4) e fornece 464 bp de seqüência adicional de 3' ajusante (SEQ ID n°: 11). Os primeiros 184 bp do fragmento com 464 bp incluídodentro de pT-EgD5-3' codifica a região de codificação C-terminal (incluindo ocódon de parada de tradução) do gene desaturase delta-5 putativo. A seqüênciade pT-EgD5-3' também corrige a seqüência correspondente a região conservada2, resultante da utilização de um oligonucleotídeo degenerado para aamplificação PCR inicial do fragmento de 590 bp em pT-F10-1 (exemplo 3).
Depois de 2 sessões de 5'RACE e uma sessão de 3' RACE1 aseqüência de DNA de toda a região de codificação Euglena gracilis desaturasedelta-5 (EgD5) putativa foi determinada. Conforme mostrado na figura 4, o CDSEgD5 foi 1350 bp em comprimento (SEQ ID n°: 1) e codificou um polipeptídeocom 449 aminoácidos (SEQ ID n°: 2), com base no alinhamento das SEQ ID η 0s: 4, 6, 8 e 10. Os resultados das pesquisas BLASTP usando o comprimentototal do gene EgD5 como a seqüência de consulta mostrou que 39% deidentidade e 56% de similaridade são partilhadas com o ácido graxo desaturasedelta-5 de Phaeodactylum tricornutum (GenBank n° de acesso AAL92562; SEQID n°: 14), com um valor de expectância de 1E-80. Adicionalmente, o gene decomprimento total EgD5 partilhou 37% de identidade e 55% de similaridade com
O desaturase delta-8 esfingolipídeo de Thalassiosira pseudonana (GenBank n°de acesso AAX14502; SEQ ID n°: 21), com um valor de expectância de 3E-75.
Exemplo 6
Geração de Construto PDMW367, que Compreende EgD5
O presente exemplo descreve a geração de pDMW367,compreendendo um gene quimérico FBAIN:: EgD5:: Pex20-3' (figura 5C). Este foiprojetado para integrar o gene quimérico no genoma de Yarrowia Iipolytica e então,estudar a função da desaturase delta-5 Euglena gracilis em Yarrowia lipolytica.
Com base no comprimento total do cDNA de EgD5 (SEQ ID n°: 1),oligonucleotídeos YL794 e YL797 (SEQ ID η 0 s: 44 e 45, respectivamente) foramusados como iniciadores para amplificar a primeira porção do EgD5 (figura 5A). Oiniciador YL794 contendo um sítio Nco\ e o iniciador YL797 contendo um sítioH/ndlll. Em seguida, iniciadores YL796 e YL795 (SEQ ID n° s: 46 e 47, respectivamente) foram usados como iniciadores para amplificar a segunda porçãodo EgD5. O iniciador YL796 contendo um sítio H/ndlll, enquanto o iniciador YL797contém um sítio Noti. As reações PCR, usando os pares de iniciadoresYL794/YL797 ou YL796/YL795, com Euglena gracilis cDNA (exemplo 2) comomodelo, foram realizadas individualmente em um volume total de 50 μΙ quecompreende: tampão PCR (contendo KCI 10 mM, (NH4)2SO4IOmM, Tris-HCI20 mM (pH 8,75), MgSO4 2 mM, Triton X-100 0,1%), BSA 100 pg/mL (concentraçãofinal), 200 μΜ cada desoxirribonucleotídeo trifosfato, 10 pmole de cada iniciador, e1 μl de Pfu DNA polimerase (Stratagene, San Diego, CA). As condições dotermociclador foram estabelecidas para 35 ciclos de 95°C por 1 min, 56°C por 30seg e 72°C por 1 min, seguido de uma extensão final a 72°C por 10 min.
Os produtos PCR individuais foram purificados usando um kitQiagen de purificação de PCR (Valencia, CA). Os produtos PCR amplificados a partir da reação com iniciadores YL794/YL797 foram digeridos com Ncol eHind\\\, enquanto os produtos PCR amplificados a partir da reação cominiciadores YL796/YL795 foram digeridos com HindlW e Notl. Os fragmentosde Ncol/Hindll\-Hindlll/Notl-d\ger\dos foram purificados após eletroforese emgel em agarose 1% (peso por volume) e, em seguida, ligados direcionalmentecom A/col/A/ofl-digeridos pZUF17 (figura 5B; SEQ ID NO: 22; compreendendoum gene sintético desaturase delta-17 [ "D17st"] derivado de Saprolegniadiciina (Publicação de Patente U.S. N 0 2003/0196217 A1), códon-otimizadospara expressão em Yarrowia Iipoiytica (Publicação PCT N 0 WO2004/101757)). O produto desta ligação foi pDMW367 (figura 5C; SEQ ID n°:23), que contém, assim, os seguintes componentes:
Tabela 6
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Os termos "promotor FBAIN" ou "região de promotor FBAIN"referem-se à região 5' a montante não-traduzida em frente ao "ATG" códon deiniciação de tradução da enzima aldolase frutose bisfosfato de Yarrowialipolytica(CE 4.1.2.13) codificada pelo gene fbal e que é necessário para aexpressão, mais uma porção de região de codificação 5' que possui um íntron dogene fbal.
Exemplo 7
A geração de cepas M4 de YARROWIA LIPOLYTICA para produzir cerca de 8%DGLA de Lipídios Totais
O presente exemplo descreve a construção da cepa M4,derivada de Yarrowia Iipolytica ATCC # 20362, capaz de produzir 8% DGLAem relação aos lipídios totais. Esta cepa foi projetada para expressar a viadesaturase delta-6 /elongase delta-6, através de introdução do construtopKUNF12T6E (figura 6A; SEQ ID n° 24). Este construto foi gerado paraintegrar quatro genes quiméricos (compreendendo uma desaturase delta-12,uma desaturase delta-6 e duas elongases C18/2o) para os Ioci Ura3 deocorrência natural de Yarrowia cepa ATCC # 20362, para por meio distopermitir a produção de DGLA. Dessa forma, pKUNF12T6E contém oscomponentes a seguir:Tabela 7
Descrição de Plasmídeo PKUNF12T6E (SEQID n° 24)
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O plasmídeo pKUNF12T6E foi digerido com ASCI / Sphl e, emseguida, usado para transformação Y. Iipolytica ATCC n° 20362 de ocorrêncianatural, de acordo com os métodos gerais. As células transformantes foramcolocadas em placas com o meio selecionado FOA e mantidas a 30°Cdurante 2 a 3 dias. As colônias resistentes a FOA foram colhidas e aplicadaspor esfregaço para placas de seleção MM e MMU. As colônias que poderiamcrescer em placas MMU mas não sobre placas MM, foram selecionadas comocepas Ura-, As colônias únicas de cepas Ura- foram então inoculadas emMMU líquido a 30°C e agitadas a 250 rpm/min por 2 dias. As células foramcoletadas por centrifugação, os lipídeos foram extraídos e ésteres metílicosde ácidos graxos foram preparados pela trans-esterificação, e posteriormenteanalisados com um cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6890.
As análises cromatográficas mostraram a presença de DGLAnos transformantes contendo os 4 genes quiméricos de pKUNF12T6E, masnão na cepa de controle Yarrowia de ocorrência natural. A maioria das 32cepas selecionadas Ura- produziram cerca de 6% DGLA de lipídios totais.Houve 2 cepas (ou seja, cepas M4 e 13-8) que produziram cerca de 8%DGLA de lipídios totais.
Exemplo 8
Análise funcional de Genes EgD5 em cepa M4 de Yarrowia Lipolytica
O plasmídeo pDMW367 (exemplo 6; que compreende um genequimérico FBAIN:: EgD5S:: Pex20), foi transformado em cepa M4 (Exemplo 7),conforme descrito nos métodos gerais. Os transformantes foram selecionadosem placas MM. Após 2 dias de crescimento em 30°C, 3 transformantes quecresceram nas placas MM foram colhidas e reaplicadas por esfregaço em novasplacas MM. Depois que cresceram, estas cepas foram inoculadasindividualmente em 3 mL líquido MM a 30°C e agitados a 250 rpm/min durante 2dias. As células foram coletadas por centrifugação, os lipídeos foram extraídos eésteres metílicos de ácidos graxos foram preparados pela trans-esterificação, eposteriormente analisados com um cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6890.
As análises cromatográficas mostraram que houve cerca de 5,6%de DGLA e 2,8% de ARA de lipídios totais produzidos em todos os trêstransformantes, onde a eficiência da conversão de DGLA à ARA nestas trêscepas foi determinada como sendo de cerca de 33% (em média). A eficiênciada conversão é medida de acordo com a fórmula a seguir: ([produto]/[substrato+ produto])*100, onde 'produto' inclui o produto imediato e todos os produtos navia derivados dele. Assim, os dados do presente experimento demonstraramque os Euglena gracilis desaturases delta-5 clonados, aqui descritos comoSEQ ID η 0 s: 1 e 2, de forma eficiente dessaturaram DGLA à ARA.
Exemplo 9
Síntese de um Gene códon-Otimizado de Desaturase delta-5 ("EgD5S")para Expressão em Yarrowia Lipolytica
O uso de códon do gene desaturase delta-5 de Euglena gracilis(SEQ ID n°: 1 e 2; EgD5) foi otimizado para expressão em Yarrowia lipolytica,de uma maneira similar àquela descrita na Publicação PCT n0 WO2004/101753 e patente U.S. n° 7.125.672. Especificamente, um gene códonotimizado desaturase delta-5 (chamado "EgD5S", SEQ ID n°: 3) foi projetadobaseado na seqüência de codificação do gene desaturase delta-5 de EgD5(SEQ ID n0:), de acordo ao padrão de uso de códon da Yarrowia (PublicaçãoPCT N 0 WO 2004/101753), a seqüência de consenso em torno do códon deiniciação de tradução "ATG", e as regras gerais de estabilidade de RNA(Guhaniyogi, G. e J. Brewer, Gene, 265 (1 -2):11-23 (2001)). Em adição amodificação do sítio de iniciação da tradução, 196 bp dos 1350 bp da região decodificação foram modificados (14,5%, figura 7A) e 189 códons foramotimizados (42%). O conteúdo cromatográfico foi aumentado de 49,3% dentrodo gene de ocorrência natural (ou seja, EgD5) para 54,2% no interior do genesintético (isto é, EgD5S). Os sítios Ncol e Notl foram incorporadas ao redor docódon de iniciação de tradução e após o códon de parada do EgD5S (SEQ ID n0:), respectivamente. Nenhuma modificação no gene otimizado mudou aseqüência de aminoácidos da proteína codificada (SEQ ID n° 2). O geneEgD5S projetado (SEQ ID n°: 3) foi sintetizado por GenScript Corporation(Piscataway, NJ) e clonado em pUC57 (GenBank n° de acesso Y14837) paragerar pEgD5S (figura 6B; SEQ ID n°: 48).
Exemplo 10
Geração de Construto PDMW369, que compreende EgD5S
O presente exemplo descreve a construção de um plasmídeopDMW369 compreendendo um gene quimérico FBAIN::egD5S::pex20. PlasmídeopDMW369 (figura 6C; SEQ ID n°: 49) foi construído pela substituição do fragmentoNco I/Not I de pZUF17 (figura 5B; SEQ ID n°: 22) com o fragmento de Nco MNot IEgD5S a partir de pEgD5S (figura 6B; SEQ ID n°: 48). O produto desta ligação foipDMW369, o qual por meio disso continha os componentes a seguir:
Tabela 8
<table>table see original document page 117</column></row><table><table>table see original document page 118</column></row><table>
Exemplo 11
Expressão da Desaturase delta-5 ("EgD5S") códon-otimizada em YarrowiaLipolytica cepa M4
O plasmídeo pDMW369 (exemplo 10; que compreende um genequimérico FBAIN:: EgD5S:: Pex20), foi transformado em cepa M4 (Exemplo 7),conforme descrito nos métodos gerais. Os transformantes foram selecionadosem placas MM. Após 2 dias de crescimento em 30°C, 3 transformantes quecresceram nas placas MM foram colhidos e reaplicados por esfregaço em novasplacas MM. Depois que cresceram, estas cepas foram inoculadasindividualmente em 3 mL líquido MM a 30°C e agitados a 250 rpm/min durante 2dias. As células foram coletadas por centrifugação, os lipídeos foram extraídos eésteres metílicos de ácidos graxos foram preparados pela trans-esterificação, eposteriormente analisados com um cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6890.
As análises cromatográficas mostraram que houve cerca de3,3% de DGLA e 2,7% de ARA de lipídios totais produzidos em todos ostrês transformantes, onde a eficiência da conversão de DGLA à ARAnestas três cepas foi determinada como sendo de cerca de 45% (emmédia, calculado conforme descrito no exemplo 8). Dessa forma, essesdados experimentais demonstraram que a desaturase delta-5 sintéticacódon-otimizada de Euglena gracilis para expressão em Yarrowia Iipolytica(EgD5S, como apresentado na SEQ ID n°: 3) é cerca de 36% mais eficientedessaturando DGLA para ARA que o gene de ocorrência natural EgD5(SEQ ID N°:1).Exemplo 12
Isolamento de um Pavlova Lutheri (CCMP459) desaturase Delta -8
O presente exemplo descreve o isolamento da Pavlova Iutheri(CCMP459) desaturase delta-8 usada no exemplo 3 e na figura 3 (tambémdescrito no pedido de Patente U.S. n° 11/737772, depositado em 20 de abrilde 2007). Isto exigia: síntese de Pavlova Iutheri (CCMP459) cDNA; bibliotecade construção e seqüenciamento; identificação de homólogos de desaturasedelta-8; e a clonagem de uma desaturase delta-8 de comprimento total apartir de DNA genômico.
Síntese de cDNA de Pavlova lutheri (CCMP459). Construção de
Biblioteca ε Seqüenciamento
Uma biblioteca de cDNA de Pavlova lutheri (CCMP459) foisintetizada conforme descrito na Publicação PCT n0 WO 2004/071467 (publicadaem 26 de agosto de 2004). Resumidamente, pellets congelados de Pav459 foram obtidos do Provasoli-Guillard National Center for Culture of MarinePhytoplankton (CCMP, West Boothbay Harbor, ME). Estes pellets foramesmagados em nitrogênio líquido e o RNA total foi extraído de Pav459 com o kitQiagen RNeasy® Maxi (Qiagen, Valencia, CA), seguindo as instruções dofabricante. A partir do RNA total, mRNA foi isolado usando resina de celuloseoligo dT, e foi então usado para a construção de uma biblioteca de cDNA usandoo vetor pSportl (Invitrogen, Carlsbad1 CA). O cDNA produzido dessa forma foiclonado direcionalmente (5' Sa/l/3' Not\) no vetor pSportl A biblioteca Pav459contém aproximadamente 6,1 χ 105 clones pormL, com um tamanho médio deinserção de aproximadamente 1200 bp. A biblioteca Pavlova lutheri foi chamadaepslc.
Para o seqüenciamento, os clones foram primeiro recuperados apartir culturas arquivadas em glicerol cultivadas ou congelados em placas de 284poços com meio de congelamento, e inoculadas com uma automáticaescolhedora de colônia (Genetix) QPix® em placas fundas de 96 poçoscontendo LB + 100 mg /mL de ampicilina. Depois de crescer por 20 horas a37°C, as células foram revestidas por centrifugação e armazenadas a -20°C. Osplasmídeos, em seguida, foram isolados em um robô Eppendorf 5Prime, usandoum método miniprep de Iise alcalina com formato modificado com 96 poços(Eppendorf PerfectPrep®). Resumidamente, um filtro e tubulação de vácuoforam usados para facilitar a remoção dos fragmentos celulares após aprecipitação de acetato. O DNA plasmidial foi, então, ligado a uma segundaplaca de filtro diretamente do filtrado, lavado, seco e eluído.
Os plasmídeos foram seqüenciados pela extremidade em placasde 384 poços, usando iniciador de vetor T7 (SEQ ID n°: 50) e a versão 3 do kitde seqüenciamento Prism ABI BigDye. Para o seqüenciamento da reação, 100a 200 ng do modelo e 6,4 pmol de iniciadores foram usados, e as seguintescondições de reação foram repetidas 25 vezes: 96°C por 10 sec, 50°C por 5sec e 60°C por 4 min. Depois de limpeza à base de etanol, produtos do ciclo deseqüenciamento de reação foram detectados e resolvidos em sequenciadoresautomáticos Perkin Elmer ABI-3700.
A identificação de enzimas homólogas de pesaturase delta-8 a partir decDNA de Pavlova Lutheri da Biblioteca de Clones de eps1c
Os clones de cDNA que codificam homólogos de desaturasedelta-8 de Pavlova Iutheri (aqui chamadas desaturases delta-8) foi feita atravésda realização de pesquisas BLAST para similaridade com seqüências contidasna base de dados BLAST "nr" (como descrito no exemplo 3). O P - valor(probabilidade) de se observar uma compatibilidade de uma seqüência decDNA com uma seqüência contida na base de dados procuradas apenas poracaso, como calculado pelo BLAST, estão aqui relatados como valores "pLog",que representam o negativo do Iogaritmo do P - valor relatado. Assim sendo,quanto maior o valor pLog, maior a probabilidade de que o cDNA da seqüênciae o BLAST "encontrado" representam proteínas homólogas.
A pesquisa BLASTX usando a seqüência de nucleotídeos do cloneeps1c.pk002.f22 revelou similaridade das proteínas codificadas pelo DNA com adesaturase delta-6 de Rhizopus stolonifer (SEQ ID n°: 51) (NCBI n° de acessoAAX22052 (Gl 60499699), Iocus AAX22052, CDS AY795076; Lu et al„ nãopublicados). A seqüência de uma porção de elemento de inserção de cDNA doclone eps1c.pk002.f22 é mostrada em SEQ ID n°: 52 (extremidade 5' doelemento de inserção de cDNA). Posteriormente, a seqüência de inserção plena(eps1c.pk002.f22:fis) foi obtida e é mostrada em SEQ ID n°: 53. A seqüência para a seqüência de aminoácidos deduzida (a partir de nucleotídeo 1 de SEQ IDn°: 53 até o primeiro códon de parada no nucleotídeo 864 da SEQ ID n°: 53) émostrada em SEQ ID n°: 54. O seqüenciamento do elemento de inserçãocompleto foi realizado usando um protocolo de transposição modificado. Osclones identificados para seqüenciamento do elemento de inserção completo foram recuperados a partir de estoques de glicerol arquivados como únicacolônias, e plasmídeos de DNA foram isolados através de Iise alcalina. Osmodelos de plasmídeos foram transpostos por intermédio do kit de transposiçãoSistema de Geração de Modelo [Template Generation System] (TGS II)(Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), seguindo o protocolo do fabricante. O DNAtransposto foi transformado em células eletro-competentes de EH10B (EdgeBioSystems, Gaithersburg, MD), através de eletroporação. Os transformantesmúltiplos foram selecionados aleatoriamente a partir de cada reação detransposição, DNA plasmídeo foi elaborado, modelos foram seqüenciados comoacima (ABI BigDye v3.1) para fora do sítio do evento da transposição, usandoiniciadores únicos SeqE (SEQ ID n°: 55) e SeqW (SEQ ID n°: 56).
Os dados da seqüência foram coletados (ABI software "PrismCollections") e montados usando o programa de montagem de seqüênciaPhrap (P. Green, University of Washington, Seattle). As montagens foramvistas pelo editor de seqüência "Consed" (D. Gordon, University of Washington,Seattle) para a edição final.
A seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID n°: 54 foiavaliada por BLASTP1 produzindo um valor pLog de 19,52 (valor E de 3e-20)versus a desaturase delta-6 de Mortierella alpina (NCBI n° de acessoBAC82361 (Gl 34221934), Locus BAC82361, CDS AB070557; Sakuradani eShimizu, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67:704-711 (2003)). Com base nosresultados obtidos a partir da comparação BLASTP da Mortierella alpina eoutras desaturases de ácidos graxos, a desaturase delta -8 de Pavlova Iutherinão estava completa e faltavam seqüência na extremidade de 5'.
Clonando uma desaturase delta-8 de Comprimento total a partir de DNAgenõmico de PAVLOVA LUTHERIO DNA genômico foi isolado de Pavlova Iutheri (CCMP459)usando o Kit Plant Maxi Prep de Qiagen DNeasy® de acordo com o protocolo do fabricante. Usando uma coluna maxi por 1 grama de pellets de célulascongeladas, um total de 122 microgramas de DNA genômico foi isolado a partirde 4 de gramas de cultura de Pavlova lutheri. A concentração final de DNAgenômico foi 22,8 ng/pL. As bibliotecas GenomeWaIker foram sintetizadosusando o kit Universal GenomeWaIker ™ (BD Biosciences Clonetech, Palo Alto, Califórnia), seguindo o protocolo do fabricante (Prot # PT3042-1, versãoPR03300). Resumidamente, quatro digestões de restrição foram criadasusando como protocolo 300 ng de DNA genômico por reação. Após a limpezacom fenol, os pellets foram dissolvidos em 4 pL de água e adaptadores foramligados como no protocolo.
Para os PCR primários, o kit PCR Advantage®-GC Genomic (BDBiosciences Clonetech) foi usado seguindo o protocolo do fabricante (Prot #PT3090-1, versão PR1X433). Para cada digestão de restrição, 1 pL dabiblioteca foi combinado com 22,8 pL de água grau PCR, 10 pL de tampão dereação 5X GC genômico PCR1 2,2 μΙ_ de 25 mM Mg(CH 3 0Ο2)2, 10 μL de GC-Melt (5 Μ), 1 μΙ_ de 50x dNTP mix (10 mM cada), 1 μΙ_ de Vantagem GenomicPol-GC. Mix (50 X), 1 μΙ_ de iniciador Universal GenomeWalker™ AP1 (10 M,SEQ ID n°: 57) e 1 μΙ_ de SPG PvDES (10 M, SEQ ID n°: 58). Depois dedesnaturação a 95°C, as seguintes condições de reação foram repetidas 35vezes: 94°C por 30 sec, 68°C por 6 min. depois destas condições de reação,uma prorrogação adicional a 68°C foi realizada por 6 min seguida deresfriamento a 15°C até serem removidos.
A principal reação de PCR para cada biblioteca foi analisado poreletroforese em gel de agarose e as bandas de DNA com pesos molecularesde aproximadamente 6 kB, 3,5 kB, 2,5 kB e 1,2 kB foram observadas. Asbandas de DNA para cada biblioteca foram purificadas usando o kit derecuperação gel DNA Zymoclean™ (Zymo Research, Orange, CA), seguindo oprotocolo do fabricante. O DNA resultante foi clonado no vetor pGEM®-T Easy(Promega), seguindo o protocolo do fabricante e os elemento de inserçãoforam seqüenciados usando os iniciadores T7 (SEQ ID n°: 50) e M13 -28Rev(SEQ ID n°: 59), como descrito acima. A seqüência adicional foi então obtidautilizando um iniciador de seqüenciamento específico para gene PavDES seq(SEQ ID n°: 60) que foi derivada dos recém-adquiridos dados de seqüência. Acompleta extremidade 5' da seqüência obtida pelo genoma "walking" émostrado na SEQ ID n°: 61. A seqüência das regiões sobrepostas daseqüência genômica (SEQ ID n°: 61) e as EST eps1c.pk002.f22:fis totalmenteseqüenciadas (SEQ ID n°: 53) foram alinhadas usando Sequencher™ (Versão4.2, Gene Códigos Corporation, Ann Arbor, Ml), utilizando o algoritmo "LargeGap assembly". Curiosamente, a comparação mostrou que o EST que estavaoriginalmente seqüenciado (SEQ ID n°: 53) faltava 459 bp, quando comparadocom a seqüência genômica (SEQ ID n°: 61). Essa seqüência ausente no ESTparecia ser uma deleção em vez de um íntron, já que nenhum sítio claro dejunção de íntron foi identificado no DNA genômico, na extremidade 5' do gene.A seqüência genômica para a extremidade 5' (SEQ ID n°: 61) foi combinadacom a extremidade 3' da seqüência EST (SEQ ID n°: 53) para produzir a SEQID n°: 62. Usando o software nEditSeq™ 6.1 para análise de seqüência(DNASTAR Inc., Madison, Wl), foi identificado uma ORF (SEQ ID n° 17). Aseqüência de aminoácidos codificadas pelo SEQ ID n° 17 é mostrada na SEQID n° 18.
A seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID n°: 18 foiavaliada por BLASTP, produzindo um valor pLog de 35,10 (valor E de 8e-36) versus a desaturase delta-6 de Rhizopus stolonifer (SEQ ID NO: 63) (NCBI n° deacesso ABB96724 (Gl 83027409), Iocus ABB96724, CDS DQ291156; Zhang etal., não publicados). Além disso, a desaturase delta-8 de Pavlova lutherí é 78,0%idêntica a seqüência da desaturase delta -8 de Pavlova salina (SEQ ID n°: 64)apresentada na Publicação PCT WO 2005/103253 n° (publicada em 22 de abril de 2005) usando o método Jotun Hein. Os cálculos de porcentagem de identidade deseqüências foram efetuados pelo método Jotun Hein (Hein, JJ, Meth.Enz., 183:626-645 (1990)) foi feita usando o programa de computação MegAlign™v6.1 LASERGENE bioinformática suite (DNASTAR Inc., Madison, Wl) com osparâmetros padrão para o alinhamento de pares (KTUPLE = 2). A desaturase delta -8 de Pavlova Iutheri é 76,4% idêntica a seqüência da desaturase delta-8 dePavlova salina u sando o método Clustal V. Os cálculos de porcentagem deidentidade de seqüências foram efetuados pelo método Clustal V (Higgins, DG eSharp, PM, Comput. Appi Biosci., 5:151-153 (1989); Higgins et al., Comput. Appl.Biosci., 8:189-191 (1992)) foram feitos usando o programa de computaçãoMegAlign™ v6.1 LASERGENE bioinformática suite (DNASTAR Inc.) com osparâmetros predefinidos para o alinhamento de pares (KTUPLE = 1, GAPSANÇÃO = 3,5 = WlNDOW, diagonais SAVED = 5 e GAP COMPRIMENTOSANÇÃO = 10). As pontuações e probabilidades BLAST indicam que o fragmentoda SEQ ID n0: 17 codifica uma inteira desaturase delta-8 de Pavlova lutheri.
As figuras 8A e 8B mostram um alinhamento Clustal V (com osparâmetros padrão) de SEQ ID n°: 18 (seqüência de aminoácidos dadesaturase delta-8 de Pavlova lutheri), SEQ ID n°: 64 (a seqüência de aminoácidos da seqüência da desaturase delta-8 de Pavlova salina, acima),SEQ ID n°: 16 (seqüência de aminoácidos da desaturase delta-8 de Euglenagracilis seqüência divulgada como SEQ ID n°: 2 em Publicação PCT N 0 WO2006/012325; publicado em 2 de fevereiro de 2006), SEQ ID n°: 63 (seqüênciade aminoácidos para a desaturase delta-6 de ácidos graxos de Rhizopusstolonifer (NCBI n° de acesso ABB96724, supra)) e SEQ ID n°: 51 (seqüênciade aminoácidos para a desaturase delta-6 de ácidos graxos de Rhizopusstolonifer (NCBI n° de acesso AAX22052, acima)). Os resultados doalinhamento Clustal V mostram que as SEQ ID n°: 18 é 76,4%, 22,6%, 22,2% e22,2% idênticas às SEQ ID n°: 64, SEQ ID n°: 16, SEQ ID n°: 63 e SEQ ID n°:51, respectivamente.
Exemplo 13
Transformação de Culturas de Embriões somáticos de Soja
Condições da Cultura
As culturas de suspensões embriogênicas de soja (cv. Jack) sãomantidas em 35 ml_ de meio líquido SB196 (infra) em um agitador rotativo, a150 rpm, 26°C com luz fluorescente branca fria em 16:8 h dia/noitefotoperíodo com intensidade de luz de 60-85 pE/m2/s. As culturas sãosubculturadas a cada 7 dias ou até 2 semanas por inoculação deaproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml de líquido SB196 novos (depreferência o intervalo da subcultura é a cada 7 dias).
As suspensões celulares embriogênicas de soja sãotransformados com plasmídeos de expressão de soja pelo método de arma debombardeamento de partículas [particle gun bombardment] (Klein et al., Nature,327:70 (1987)) usando um instrumento DuPont Biolistic PDS1000/HE(retroajuste de hélio) para todas as transformações.
Iniciação da Cultura de Suspensão Embriogênica da Soja:
As culturas de soja são iniciadas duas vezes cada mês, com 5 a 7dias entre cada início. As vagens com sementes imaturas de plantas de sojadisponíveis 45 a 55 dias após o plantio são colhidas, removidas de suas cascas ecolocadas em uma caixa esterilizada magenta. As sementes de soja sãoesterilizadas por agitação durante 15 min em uma solução com 5% de Clorox comuma gota de sabão (ou seja, 95 ml_ de água destilada autoclavada acrescida de5 mL de Clorox e uma gota de sabão, bem misturados). As sementes são lavadasusando duas garrafas de 1 litro de água destilada estéril e aquelas com menos de4 mm são colocadas nas lâminas para microscópio individuais. A pequenaextremidade da semente é cortada e os cotilédones são prensados para fora dorevestimento das sementes. Os cotilédones são transferidos para placas contendomeio SB1 (25 a 30 cotilédones por placa). As placas são envoltas com fita de fibrae armazenadas durante 8 semanas. Depois deste tempo os embriões secundáriossão cortados e colocados em meio líquido SB196 por 7 dias.
Preparação de DNA para Bombardeamento:Quer um plasmídeo intacto ou um fragmento de DNA plasmidialcontendo os genes desaturase delta-5 de interesse e o gene marcadorselecionável são usados para bombardeamento. Os fragmentos deplasmídeos de expressão de soja compreendendo a desaturase delta-5 dapresente invenção são obtidos por isolamento de gel de plasmídeos digeridos.Os fragmentos de DNA resultantes são separados por eletroforese em gel deagarose 1% SeaPIaque GTG (BioWhitaker Molecular Applications) e osfragmentos de DNA contendo cassetes de genes são cortadas do gelagarose. O DNA é purificado a partir de agarose usando a enzima digerindoGELase seguindo o protocolo do fabricante.Uma alíquota de 50 μL de água destilada estéril contendo 3 mgde partículas de ouro é adicionado a 5 μL de um solução de DNA 1 g/ μL (ouplasmídeo intacto ou fragmento de DNA preparado como descrito acima),50 μL de CaCI 2,5 M 2 e 20 μL de espermidina 0,1 Μ. A mistura é agitadadurante 3 min no nível 3 de um agitador de vórtice e agitadas 10 segundosnuma microcentrífuga. Depois de uma lavagem com 400 μΙ_ de etanol a 100%,o pellet é suspenso por sonicação em 40 pL de etanol a 100%. A suspensão deDNA (5 μ) é dispensada em cada disco "flying" do instrumento BiolisticPDS1000/HE. Cada 5 μL da alíquota contém aproximadamente 0,375 mg departículas de ouro por bombardeamento (ou seja, por disco).
Preparação do Tecido ε Bombardeio com DNA:
Cerca de 150 a 200 mg de culturas de suspensão embrionáriascom 7 dias é colocado em uma placa de petri vazia e estéril de 60 χ 15 mm e aplaca é coberta com rede de plástico. O tecido é bombardeado 1 ou 2 vezespor placa com pressão de ruptura de membrana ajustada em 1100 psi e acâmara é evacuada a um vácuo de 9,14 kPa a 9,48 kPa (27 polegadas a28 polegadas de mercúrio). O tecido é colocado aproximadamente 8,9centímetros (3,5 polegadas) a partir da tela de retenção ou parada.
Seleção de Embriões Transformados:
Os embriões transformados são selecionados usando higromicinacomo o marcador selecionável. Especificamente, após o bombardeio, o tecido écolocado em meio SB196 limpo e cultivado como descrito acima. Seis dias apóso bombardeamento, o SB196 é trocado por SB196 limpo contendo higromicina30 mg/L. O meio de seleção é atualizado semanalmente. Quatro a seis semanasapós a seleção o tecido verde, transformado é observado crescendo deagrupamentos embriogênicos necróticos não transformados. O tecido verdeisolado é removido e inoculado em placas com multipoços para gerar novassuspensões de culturas de transformadas embriogenicamente propagadas porclone.
Maturação do Embrião:
Os embriões são cultivados por 4 a 6 semanas a 26°C no SB196com lâmpadas fluorescentes brancas frias (Phillips branca fria EconowattF40/CW/RS/EW) e Agro (Phillips Agro F40) (40 Watt) em um fotoperíodo 16:8horas com intensidade de luz de 90 a 120 μΕ/m2 s. Depois deste tempo osagrupamentos de embriões são removidas para um meio sólido de ágar,SB166, por 1 a 2 semanas. Os aglomerados são então subculturados emmeio SB103 por 3 semanas. Durante este período, os embriões individuaissão retirados dos aglomerados e testados por alterações na sua composiçãodos ácidos graxos, como descrito acima.
Receitas de meios:
SB 196 - FN Lite Meio de Proliferação Líquido ípor litro)
<table>table see original document page 128</column></row><table>
FN LlTE SOLUÇÕES DE ESTOQUE
Númerodeestoque IOOOmL 500 mL<table>table see original document page 129</column></row><table>
"adicionar primeiro, dissolver em garrafa escura com agitação
<table>table see original document page 129</column></row><table>PH 5,78 g TC ágar
SB 166 MEIO SÓLIDO (POR LITRO)
1 embalagem MS sais (Gibco/ BRL- Cat. n° 11117-066)
1 mL vitaminas B5 1000X estoque60 g maltose
750 mg MgCI2 hexaidrato5 g carvão vegetal ativadopH 5,7
2 g gelrite
SB 103 MEIO SÓLIDO (POR LITRO)
1 embalagem MS sais (Gibco/ BRL - Cat. n° 11117-066)
1 mL vitaminas B5 1000X estoque60 g maltose
750 mg MgCI2 hexaidratoPH 5,7
2 g gelrite
SB 71 -4 MEIO SÓLIDO (POR LITRO)
1 garrafa Gamborg's B5 sais com sacarose (Gibco/ BRL- Cat. n° 21153-036)
PH 5,75 g TC ágar
2.4-D ESTOQUE
Obtido pré-produzido a partir de Phytotech Cat. n0 D 295 - concentração 1 mg/mLVitaminas B5 estoque (por 100 mL)
Alíquotas estocadas a -20°C
10 g mio-inositol
100 mg ácido nicotínico
100 mg piridoxina HCI
1 g tiamina
Se a solução não se dissolver com rapidez suficiente, aplicar umbaixo nível de calor através da placa de agitação quente.
Exemplo 14
Análise funcional da Desaturase delta-5 (SEQID ν 0 s: 1 ε 2) em embriõesSomáticos de soja
Os embriões somáticos de soja maduros são um bom modelopara embriões zigóticos. Enquanto no estado globular em cultura líquida, osembriões somáticos de soja contêm quantidades muito baixas de triacilglicerol(TAG) ou proteínas de armazenamento típicas de embriões de soja zigóticosmaduros. Nesse estágio de desenvolvimento, a razão entre triacilglicerido totale lipídios polares totais (fosfolipídios e glicolipídeo) é de cerca de 1:4, como étípico de embriões zigóticos de soja no estágio de desenvolvimento a partir doqual a cultura somática de embrião foi iniciada. No estágio globular também, osmRNAs para as sementes de proteínas proeminentes, α'-subunidade de β-conglicinina, inibidor Kunitz 3 da tripsina, e uma Iectina da semente estãoessencialmente ausentes. Após a transferência para meio livre de hormôniopara permitir diferenciação ao estágio de maturação somática do embrião, TAGtorna-se a classe de lipídios mais abundante. Igualmente, os mRNAs parasubunidade-α de β-conglicinina, inibidor Kunitz 3 da tripsina, e a Iectina dasemente tornam-se mensagens muito abundantes na população total demRNA. Nestas bases, o sistema de embrião somático de soja comporta-semuito semelhantemente a embriões zigóticos em maturação de soja in vivo, eé, assim, um bom e rápido sistema modelo de análise de efeitos fenotípicos demodificação da expressão dos genes na via biossintética de ácido graxo (verPublicação PCT N0 WO 2002/00904, exemplo 3). Sobretudo, o sistema modelotambém é preditivo da composição de ácidos graxos de sementes de plantasderivadas de embriões transgênicos.
Os embriões somáticos transgênicos de soja contendo a desaturasedelta-5 da presente invenção são analisadas da seguinte forma. Os ésteresmetílicos de ácidos graxos são preparados a partir de embriões somáticos de sojaúnicos e maduros por transesterificação. Os embriões individuais são colocadosem um frasco contendo 50 μL de hidróxido trimetilsulfônio (TMSH) e 0,5 mL dehexano e incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação. Osésteres metílicos de ácidos graxos (5 pL injetados da camada de hexano) foramseparados e quantificados usando um cromatógrafo de fase gasosa Hewlett-Packard 6890 equipado com uma com coluna capilar Omegawax 320 sílicafundida (Catálogo n° 24152, Supelco Inc.). A temperatura do forno foi programadapara permanecer a 220°C por 2,6 minutos, aumentar para 240°C a 20°C /min, edepois permanecer a 240°C por mais 2,4 min. O gás de arraste foi fornecido porum gerador de hidrogênio Whatman. Os tempos de retenção foram comparadosaos de ésteres metílicos de padrões disponíveis comercialmente (Nu-Chek Prep,Inc.). Freqüentemente, 5 a 10 embriões por evento são analisadas porcromatografia gasosa, usando a metodologia descrita acima.
Exemplo 15
Co-Expressando Outras Combinações de Cassete Promotor/Gene/Terminador em embriões somáticos de Soja
Além dos genes, promotores, terminadores e cassetes de genesdescrito aqui, um perito na matéria percebe que outras combinações cassetepromotor / gene / terminador podem ser sintetizados em uma via semelhante,mas não limitado a, aquela descrita neste documento. Por exemplo,Publicações PCT n0 WO 2004/071467 e n0 WO 2004/071178 descrevem oisolamento de uma série de promotores e seqüências terminadoras detranscrição para uso em expressão específicas para embrião de soja. Alémdisso, Publicações PCT n0 WO 2004/071467, WO 2005/047479 e WO2006/012325 descrevem a síntese de múltiplas combinações de cassetepromotor/gene/terminador pela ligação de promotores individuais, terminadoresde transcrição e de genes juntos em combinações únicas. Geralmente, um sítioNotl ladeado pelo promotor adequado (por exemplo, que figuram na, mas nãolimitado a, tabela 9) e um terminador de transcrição (por exemplo, que figuramnas listas, mas não limitado a, tabela 10) é usado para clonar o gene desejado.Os sítios Notl podem ser adicionados a um gene de interesse, como os quefiguram na, mas não limitado a, tabela 11 usando amplificação PCR comoligonucleotídeos projetados para introduzir sítios Notl nas extremidades 5' e 3'do gene. O produto PCR resultante é então digerido com Notl e clonado em umadequado cassete promotor/ Notl/ terminador.
Além disso, Publicações PCT n0 WO 2004/071467, WO2005/047479. e WO 2006/012325 descrevem os adicionais ajuntamentos decassetes de gene individuais em combinações únicas, junto com cassetesmarcadores selecionáveis adequados, a fim de obter a expressão fenotípicadesejada. Embora isso seja feito principalmente usando diferentes sítios deenzimas de restrição, um versado na técnica pode apreciar que uma série detécnicas podem ser utilizadas para alcançar a desejada combinação determinador de promotor/gene/transcrição. Ao se fazer isso, qualquercombinação promotor/gene/transcrição de cassetes terminador específica paraembrião poderá ser alcançada. O versado na técnica também pode apreciar ofato de que estes cassetes podem ser localizados em fragmentos individuais deDNA ou em múltiplos fragmentos onde a co-expressão dos genes é o resultadode co-transformação dos múltiplos fragmentos de DNA.
Tabela 9
Promotores específicos para Semente
<table>table see original document page 134</column></row><table>
Tabela 10 Terminadores de Transcricão
<table>table see original document page 134</column></row><table><table>table see original document page 135</column></row><table>
Tabela 11Genes da Via Biossintética de AGP
<table>table see original document page 135</column></row><table><table>table see original document page 136</column></row><table>
Seleção de Clorsulfuron (ALS):
Seguindo no bombardeamento, o tecido vegetal é dividido entre 2frascos com meio SB196 limpo e cultivado conforme descrito no exemplo 13.Seis a sete dias após o bombardeamento, o SB196 é trocado por SB196 limpocontendo agente de seleção Clorsulfuron 100ng/mL. O meio de seleção éatualizado semanalmente. Quatro a seis semanas após a seleção, um tecidotransformado verde é observado crescendo sobre agrupamentos embriogênicosnecróticos não transformados. O verde tecido Isolado é removido e inoculado emplacas com multipoços contendo SB196 para gerar suspensões de culturasembriogênicas transformadas novas, propagadas clonalmente.
Regeneração de Embriões Somáticos de Soja em Plantas:
Para obter a planta inteira, a partir de culturas de suspensõesembriogênicas, o tecido precisa ser regenerado. Os embriões são amadurecidoscomo descrito no exemplo 13. Depois de subcultura em meio SB103 durante 3semanas, vários embriões são retirados dos aglomerados e testados paraalterações na sua composição dos ácidos graxos, como descrito no exemplo 14.
Deve ser observado que qualquer fenótipo detectável, que resultam daexpressão dos genes de interesse, pode ser rastreado neste estágio. Isso podeincluir, mas não se limitar a: alterações no perfil de ácidos graxos, perfil protéicoe conteúdo, conteúdo de carboidratos, taxa de crescimento, viabilidade, ou ahabilidade de se desenvolver normalmente em uma planta de soja.
Os embriões individuais amadurecidos são desidratados ao seremcolocados em uma placa de petri vazia e pequena (35 χ 10 mm) por cerca de 4a 7 dias. As placas são seladas com fita de fibra (criando uma pequena câmarade umidade). Os embriões desidratados são plantados em meio SB71-4 ondesão deixados para germinar sob as mesmas condições de cultivo descritasacima. As mudas germinadas são removidas do meio de germinação e lavadascuidadosamente com água e, em seguida, são plantadas em Redi-Earth emuma célula de uma bandeja com 24 células, coberta por uma redoma deplástico claro. Depois de 2 semanas a redoma é removida e as plantasaclimatadas por mais uma semana. Se as mudas parecem resistentes, sãotransplantadas para potes de 25,4 cm (10") da Redi-Earth1 com até 3 plantaspor vaso. Depois de 10 a 16 semanas, as sementes maduras são colhidas,retalhadas e analisadas por ácidos graxos como descrito no exemplo 14.
As receitas dos meios podem ser encontradas no exemplo 13 eestoque de Clorsulfuron é de 1 mg/ml em hidróxido de amônio 0,01 N.
Exemplo 17
Comparando a Especificidade do Substrato da Desaturase delta- -5 deMortierella Alpina (MaD5) com a Desaturase delta-5 de Euglena Gracilis(EgD5) em Yarrowia Lipolytica
O presente exemplo descreve a comparação de especificidade dosubstrato de uma desaturase delta-5 de Mortierella alpina (MaD5; SEQ ID η 0 s:67 e 68), que é descrito na Patente U.S. 6.075.183 e Publicação PCT N 0 WO2004/071467, e n. 0 WO 2005/047479) a de EgD5 (SEQ ID n°: 2) em Yarrowialipolytica.
Este trabalho incluiu as seguintes etapas: (1) construção de vetorde expressão Yarrowia pY98 que compreende MaD5; (2) transformação depY98 e pDMW367 em Yarrowia cepa Y2224; e 3.) comparação entre perfis delipídios em organismos transformantes que compreendem pY98 ou pDMW367depois de alimentar substratos de ácido graxo.
Construção de Vetor de Expressão de Yarrowia pY98 compreendendo MaD5;
O plasmídeo pY5-22 (SEQ ID n°: 69) é um plasmídeo bifuncional(shuttle) que pode se replicar tanto em E. coli como em Yarrowia lipolytica,contendo a seguinte: uma seqüência de replicação autônoma de Yarrowia(ARS18; GenBank n° de acesso M91600); um CoIEI origem de replicação deplasmídeo um gene resistente a ampicilina (AmpR) para seleção em E. coli; umgene URA3 de Yarrowia (GenBank n° de acesso AJ306421) para seleção emYarrowia; e, um quimérico TEF:: Ncol / Notl:: XPR cassete, sendo que "XPR"foi ~ 100 bp da região de 3' do gene Yarrowia Xpr (GenBank n° de acessoM17741). Embora a construção de plasmídeo pY5-22 não está aqui descritaem detalhes, ela foi derivada a partir pY5 (anteriormente descrito na PublicaçãoPCT N 0 WO 2004/101757).
O Plasmídeo pY5-22GPD (SEQ ID n°: 70) foi criado a partir de pY5-22 (SEQ ID n°: 69), substituindo o promotor TEF com o promotor GPD deYarrowia Iipoiytica (SEQ ID n°: 71) usando técnicas bem conhecidas pelo versadona técnica. O "promotor GPD" de Yarrowia refere-se à região 5' a montante não-traduzida em frente do códon "ATG" de iniciação de tradução de uma proteínacodificada pelo gene da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD) de YarrowiaIipolytica e que é necessário para a expressão (Publicação PCT N 0 WO2005/003310). Mais especificamente, o promotor GPD de Yarrowia Iipolytica foiamplificado a partir do plasmídeo pYZDE2-S (SEQ ID n°: 72; que foi anteriormentedescrita no pedido de Patente U.S. n° 11/737772 (o conteúdo da qual está aquiincorporada, por referência)) usando oligonucleotídeos GPDsenso (SEQ ID n°: 73)e GPDantisenso (SEQ ID n°: 74). O fragmento de DNA resultante foi digerido comSall/Notl e clonado no fragmento Sall/Notl de pY5-22 (SEQ ID n°: 69), dessaforma substituindo o promotor e sítio Ncol/Notl com o promotor GPD e um únicosítio Notl, e produzindo assim pY5-22GPD (SEQ ID n°: 70).
O gene desaturase delta-5 de Mortierella alpina (SEQ ID n°: 67)foi liberado da pKR136 (SEQ ID n°: 75; que foi previamente descrito naPublicação PCT N 0 WO 2004/071467 (o conteúdo da qual está aquiincorporada, por referência)) pela digestão com Notl e clonado no sítio Notl depY5-22GPD para produzir pY98 (SEQ ID n°: 76; figura 9).
TRANSFORMAÇÃO DO PY98 (COMPREENDENDO MAD5) Ε PDMW367(COMPREENDENDO EGD5) EM YARROWIA CEPA Y2224 E COMPARAÇÃO DE PERFISDE LlPÍPIOS
Cepa Y2224 foi isolada da seguinte maneira: As células deYarrowia Iipolytica ATCC # 20362 a partir de uma placa de ágar YPD (1% deextrato levedura, 2% de bactopeptona, 2% de glicose, 2% de agar) aplicadaspor esfregaço em uma chapa MM (75 mg/L de cada um uracil e uridina, 6,7 g/Lde YNB com sulfato de amônia, sem aminoácidos, e 20 g/L de glicose),contendo 250 mg/L 5-FOA (Zymo Research). As placas foram incubadas a28°C e quatro das colônias resultantes foram corrigidos separadamente emMM placas contendo 200 mg/mL de 5-FOA e placas MM sem uracil e uridinapara confirmar uracil Ura3 auxotrófica.
A cepa Y2224 foi transformada com pY98 (SEQ ID n°: 76, figura9) e pDMW367 (SEQ ID n°: 23; figura 5C; exemplo 6), conforme descrito nométodos gerais.
As únicas colônias de transformantes Yarrowia Iipolytica contendopY98 (SEQ ID n°: 76) ou pDMW367 (SEQ ID n°: 23) foram cultivadas em 3 mLde MM sem uracil suplementado com tergitol 0,2% a 30°C por 1 dia. Depoisdisso, 0,1 mL foi transferido para 3 mL do mesmo meio suplementado comqualquer uma das EDA, ETrA, DGLA, a ETA ou sem ácidos graxos. Estasforam incubadas por 16 horas a 30°C, 250 rpm e, em seguida, pellets foramobtidos por centrifugação. As células foram lavadas com água uma vez,revestidas por centrifugação e secas ao ar. Os pellets foram transesterificados(Roughan, G. and Nishida, I., Arch. Biophys., 276 (1):38-46 (1990)) com 500 pLde metóxido de sódio 1% por 30 minutos a 50°C depois dos quais 500 pL deNaCI 1M e 100pL de heptano foram adicionados. Depois de uma boahomogeneização e centrifugação, ésteres metílicos de ácidos graxos (FAMEs)foram analisados por cromatografia gasosa.
Os FAMEs (5 pL injetados da camada de hexano) foram separadose quantificados utilizando um cromatógrafo de fase gasosa Hewlett-Packard 6890equipado com uma coluna capilar Omegawax 320 de sílica fundida (Catálogo n. 024152, Supelco Inc.). A temperatura do forno foi programada para permanecer a220°C por 2,6 minutos, aumentar para 240°C a 20°C /min, e depois permanecer a240°C por mais 2,4 min. O gás de arraste foi fornecido por um gerador dehidrogênio Whatman. Os tempos de retenção foram comparados aos de ésteresmetílicos de padrões disponíveis comercialmente (Nu-Chek Prep, Inc.).
O perfil de ácidos graxos para Yarrowia Iipolytica expressando pY98(SEQ ID n°: 76) ou pDMW367 (SEQ ID n°: 23) e alimentando diferentes substratosestão representados na figura 10A. O sombreamento na figura 10A indicasubstratos alimentados e produtos produzidos; Os ácidos graxos são identificadoscomo 16:0 (palmitato), 16:1, 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oléico), LA, GLA,ALA, STA, EDA, SCI (ácido esciadônico ou ácido cis-5,11,14-eicosatrienóico; 20:3ômega-6), DGLA, ARA, ETrA, JUP (ácido juniperônico ou ácido cis-5,11,14,17-eicosatrienóico; 20:4 ômega-3), ETA e EPA. As composições de ácidos graxosforam expressas como percentagem de peso (%) do total de ácidos graxos.
O percentual de dessaturação de delta-5 ("% desaturase delta-5")de EgD5 e MaD5 para cada substrato é mostrado na figura 10B e foi calculadopela divisão da % peso por produto (quer SCI, JUP, ARA ou ΑΡΕ) pela somada % de peso do substrato e do produto (quer EDA e SCI, ETrA e JUP, DGLAe ARA, ou ETA e EPA, respectivamente) e multiplicando por 100, paraexpressar como uma %, dependendo do substrato que foi alimentado.
As atividades de EgD5 e MaD5 são comparadas através da razãoentre a percentagem de dessaturação do delta-5 ("Razão dessat. Eg/Ma") nafigura 10B e são calculadas dividindo a percentagem de dessaturação de delta-5 por EgD5 em um determinado substrato pela porcentagem de dessaturaçãodo delta-5 por MaD5 no mesmo substrato.
A especificidade do substrato EgD5 e MaD5 para o substrato deácido graxo ômega-6 correto (ou seja, DGLA) versus o subproduto de ácidosgraxos (ou seja, SCI) ou o substrato de ácido graxo ômega-3 correto (ou seja,ETA) versus o subproduto de ácidos graxos (ou seja, JUP) também estámostrada na figura 10B. Especificamente, a especificidade do substrato ("razãoProd/Subprod.") para os substratos ômega-6 foi calculada dividindo-se apercentagem de dessaturação de delta-5 (% dessat. delta-5) por DGLA pelapercentagem de dessaturação de delta-5 (% dessat. delta-5) por EDA e émostrado nos mesmos termos que os resultados para DGLA. A especificidadedo substrato ("razão Prod/Subprod.") para os substratos ômega-3 foi calculadadividindo-se a percentagem de dessaturação de delta-5 (% dessat. delta-5) porETA pela percentagem de dessaturação de delta-5 (% dessat. delta-5) por ETrAe é mostrado nos mesmos termos que os resultados para DGLA. Além disso, arazão da especificidade de substrato ("razão Prod/Subprod Eg/Ma") para ossubstratos ômega-6 foi determinada dividindo-se a especificidade do substratopor EgD5 nos substratos ômega-6 (isto é, DGLA/EDA) por aquela de MaD5. Arazão da especificidade de substrato ("razão Prod/Subprod Eg/Ma") para ossubstratos ômega-3 foi determinada dividindo-se a especificidade do substratopor EgD5 nos substratos ômega-3 (isto é, ETA/ETrA) por aquela de MaD5.
A preferência dos EgD5 e MaD5 por substratos ômega-6 ouômega-3 é comparada usando a razão das percentagens de dessaturação dedelta-5 ("razão n-6/n-3") na figura 10B e é calculada dividindo-se a percentagemde dessaturação de delta-5 por EgD5 e MaD5 sobre um determinado substratoômega-6 (quer DGLA ou EDA) pela percentagem de dessaturação de delta-5 nosubstrato correspondente ômega-3 (ou ETA ou ETrA1 respectivamente).
A partir dos resultados da figura 10B, é claro que EgD5 é deaproximadamente 2,6 a 2,9-vezes mais ativo em Yarrowia do que MaD5 quandoDGLA, EDA e ETA são usados como substratos. A exceção é a atividade paraETrA que é aproximadamente a mesma para ambas enzimas. A especificidadedo substrato EgD5 e MaD5 para o substrato ômega-6 correto (ou seja, DGLAversus EDA) é aproximadamente a mesma em Yarrowia mas há um preferênciade aproximadamente 2,5-vezes de EgD5 para ETA (versus ETrA) sobre MaD5.A alta atividade e especificidade de substrato preferencial para ETA sobre ETrAde EgD5 pode ser útil na produção de AGPs de cadeia longa. O EgD5 tem,também, uma preferência para substratos de ômega-6 (isto é, EDA e DGLA)sobre os substratos de ômega-3 (isto é, ETrA e ETA), respectivamente.
Exemplo 18
A construção de vetores de expressão de soja PKR916 para CO-Expressão da desaturase Delta -5 de Mortierella alpina (MaD5) Com umaElongase delta-9 derivada a partir de Euglena gracilis (EgD9e) ε umadesaturase Delta-8 derivada de Euglena gracilis (EgD8)
O presente exemplo descreve a construção de um vetor de sojapara a co-expressão de MaD5 (SEQ ID n°: 67; exemplo 17) com EgD9e (SEQID n°: 77; que é descrita no pedido U.S. n° 11/601563 (depositado em 16 denovembro de 2006; Súmula de advogado n° APA-1562) e EgD8 (SEQ ID n°:78; descrito como Eg5 na Publicação PCT N 0WO 2006/012325).
Elongase delta-9 de Euglena Gracilis ("EgD9e")
Um clone da biblioteca de cDNA de Euglena (eeglc), chamado deeeg1c.pk001.n5f, contendo a elongase delta-9 de Euglena gracilis (EgD9e;SEQ ID n°: 77) foi usado como modelo para amplificar EgD9e com iniciadoresde oligonucleotídeos oEugEL1-1 (SEQ ID n°: 79) e oEugEL1-2 (SEQ ID n°: 80)usando DNA polimerase VentR® (Catálogo N0 M0254S, New England BiolabsInc., Beverly, MA), seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de DNAresultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Blun t® usando o kit declonagem PCR da Zero Blunt® (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolodo fabricante, para produzir pKR906 (SEQ ID n° 81).
Um plasmídeo de partida pKR72 (ATCC n° de acesso PTA-6019;SEQ ID n°: 82, seqüência de 7085 bp), um derivado do pKS123 que foipreviamente descrito na Publicação PCT N 0 WO 02/008269 (o conteúdo daqual está aqui incorporada por referência), contém o gene hgromicina Bfosfotransferase (HPT) (Gritz, L. e Davies, J., Gene, 25:179-188 (1983)),ladeado pelo promotor T7 e terminador de transcrição (ou seja, um casseteT7prom/HPT/T7term), e uma origem de replicação de bactérias (ORI) paraseleção e replicação em bactérias (por exemplo, E. coli). Além disso, pKR72também contém HPT, ladeado pelo promotor 35S (Odell et al., Nature,313:810-812 (1985)) e terminador de transcrição NOS 3' (Depicker et al., J.Mol. Appi Genet., 1:561-570 (1982)) (isto é, um cassete 35S/HPT/NOS3') paraseleção em plantas como a soja. O pKR72 também contém um sítio derestrição Notl, ladeado pelo promotor para a subunidade a' da β-conglicinina(Beachy et al., EMBO J., 4:3047 - 3053 (1985)) e a região 3' de terminação detranscrição do gene faseolina (Doyle et al., J. Bioi Chem., 261:9228-9238(1986)), permitindo assim uma forte expressão específica nos tecidos dassementes de soja de genes clonados no sítio Notl.
O fragmento ASCI do plasmídio pKS102 (SEQ ID n°: 83),anteriormente descrito na Publicação PCT N 0 WO 02 / 00905 (o conteúdo daqual está aqui incorporada por referência), contendo um casseteT7prom/hpt/T7term e ori bacteriana, foi combinado com o fragmento ASCI deplasmídeo pKR72 (SEQ ID n°: 82), contendo um cassete pcon/Notl/Phas paraproduzir pKR197 (SEQ ID n°: 84), anteriormente descrito na Publicação PCT n°WO 04/071467 (o conteúdo da qual está aqui incorporada por referência).
O gene para a elongase delta-9 de Euglena gracilis foi liberado depKR906 (SEQ ID n°: 81) por digestão com Notl e clonado no sítio de Notl depKR197 (SEQ ID n°: 84) para produzir o vetor de clonagem intermediáriopKR911 (SEQ ID n°: 85).
Desaturase Delta-8 de Euglena Gracius ("EgD8")
Um Plasmídeo pKR680 (SEQ ID n°: 86), que foi anteriormentedescrito na Publicação PCT N 0 WO 2006/012325 (o conteúdo da qual estáaqui incorporada por referência), contém a desaturase delta-8 de Euglenagracilis (EgD8; SEQ ID n0: 78; descrito como Eg5 em WO 2006/012325)ladeada pelo promotor inibidor Kunitz de tripsina em soja (KTI) (Jofuku etal., Plant Cell, 1:1079 - 1093 (1989)) e a região de terminação KTI 3', oisolamento da qual é descrito na Patente U.S. 6.372.965, seguido peloterminador de transcrição albumina de soja, que foi anteriormente descritona Publicação PCT N0 WO 2004/071467 (ou seja, um casseteKti/Notl/Kti3'Salb3').
O plasmídeo pKR680 (SEQ ID n°: 86) foi digerido com BsiWI e ofragmento contendo EgD8 foi clonado no sítio BsiWI de pKR911 (SEQ ID n°:85) para produzir pKR913 (SEQ ID n°: 87).
Desaturase Delta -5 de Mortierella Alpina (MaD5):
O plasmídeo pKR767 (SEQ ID n°: 88), que foi anteriormentedescrito na Publicação PCT N 0 WO 2006/012325 (o conteúdo da qual estáaqui incorporada, por referência), contém a desaturase delta-5 de Mortierellaalpina (MaD5; SEQ ID n°: 67) ladeado pelo promotor para o gene GY1glicinina de soja e região de terminação de transcrição A2 3' da Ieguminosaervilha (ou seja, um cassete Gy1/MaD5/legA2; a construção da qual édescrita no WO 2006/012325).
O cassete Gy1/Mad5/legA2 foi liberado da pKR767 (SEQ IDn°: 88) por digestão com Sbfl e o fragmento resultante foi clonado no sítioSbfl de pKR913 (SEQ ID n°: 87) para produzir pKR916 (SEQ ID n°: 89). Arepresentação esquemática de pKR916 é mostrado na figura 11A. Destaforma, a elongase delta-9 de Euglena gracilis (identificada como "EUG el1"na figura 11A) foi co-expressa com a desaturase delta-8 de Euglenagracilis (identificada como "EUG d8-sq5" na figura 11A) e a desaturasedelta-5 de Mortierella alpina (identificada como "DESATURASE DELTA 5 MALPINA" na figura 11 A) e são promotores fortes específicos parasementes.Exemplo 19
A construção de vetores de expressão de soja PKR1037 para co-Expressão da desaturase Delta -5 de Euglena gracilis (EgD5) com umaElongase delta-9 Derivada a partir de Euglena Gracilis (EgD9e) ε uma
Desaturase Delta-8 derivada da Euglena Gracilis (EgD8)
O presente exemplo descreve a construção de um vetor de sojapara a co-expressão de EgD5 (SEQ ID n°: 1, exemplo 5) com EgD9e (SEQ IDn°: 77, Exemplo 18) e EgD8 (SEQ ID n°: 78, exemplo 18).
O plasmídeo de partida pKR974 (SEQ ID n°: 90) é idêntico aopKR767 (SEQ ID n°: 88, exemplo 18), exceto que o fragmento Notl contendoMaD5 foi substituído por um fragmento Notl contendo a desaturase delta-5 deSaprolegnia diclina (SdD5; SEQ ID n°: 94, que é descrita na Publicação PCTN0 WO 2004/071467). Além disso, um sítio Mfel no terminador legA2 depKR767 (SEQ ID n°: 88), foi removido por digestão com Mfel, enche o sítio Mfel e é religado (ou seja, CAATTG convertido para CAATTAATTG) e,portanto, o terminador legA2 de pKR974 (SEQ ID n°: 90) é 770 bp versus 766bp por pKR767 (SEQ ID n°: 88).
Para clonar EgD5 em vetor de expressão de soja, um sítio derestrição Notl precisava ser introduzido na extremidade 5' do gene. O versadona técnica irá perceber que há muitas maneiras de introduzir sítios de restriçãoem genes como, mas não se limitando a PCR ou por subclonagem em vetorescontendo os sítios apropriados. Neste caso, para introduzir um sítio Notl naextremidade 5' de EgD5 (SEQ ID n°: 1), pDMW367 (SEQ ID n°: 23) foi digeridocom Mfel e, em seguida, parcialmente digerido com Ncol. O fragmento de Ncol/Mfel contendo um EgD5 de comprimento total (SEQ ID n°: 1) foi clonadono sítio Ncol/Mfel de um vetor de clonagem intermediário com um sítio Notldiretamente a montante do sítio Ncol (ou seja, GCGGCCGCAAACCATGG). Oplasmídio resultante, em seguida, foi digerido com Notl e o fragmento contendoEgD5 (SEQ ID n0: 1) foi clonado no sítio de Notl de pKR974 (SEQ ID n°: 90)para produzir pKR1032 (SEQ ID n°: 91).
O cassete Gy1/EgD5/legA2 foi liberado da pKR1032 (SEQ ID n°: 91)por digestão com Sbfl e o fragmento resultante foi clonado no sítio Sbfl de pKR913(SEQ ID n°: 87) para produzir pKR1037 (SEQ ID n°: 92). A representaçãoesquemática de pKR1037 (SEQ ID n°: 92) é mostrada na figura 11B. Desta forma,a elongase delta-9 de Euglena gracilis (identificada como "EUG el1" na figura 11B)foi co-expressa com a desaturase delta-8 de Euglena gracilis (identificada como"eug d8-sq5" na figura 11B) e a desaturase delta-5 de Euglena gracilis(identificada como "eug d5 DS" na figura 11A) e são promotores fortes específicospara sementes.
Exemplo 20
A co-Expressão da Elongase Delta -9 de Euglena Gracilis, a Desaturasedelta-8 de Euglena Gracilis ε a Desaturase Delta -17 de SaprolegniaDiclina com ou a desaturase Delta-5 de Mortierella alpina (pKR916 εPKR328) ou a desaturase delta-5 de Euglena gracilis (PKR1038 ε PKR328)em Embriões somáticos de Soja
Os presentes exemplos descrevem a transformação e expressãoem embriões somáticos de soja pKR916 (SEQ ID n°: 89, exemplo 18; contendoEgD9e, EgD8 e MaD5) com pKR328 (SEQ ID n°: 93, figura 11C, anteriormentedescrito na publicação PCT WO 04/071467), contendo a desaturase delta-17 deSaprolegnia diclina (SdD17) e o gene higromicina fosfotransferase para a seleçãoem higromicina. Os presentes exemplos descrevem ainda a transformação eexpressão em embriões somáticos de soja pKR1037 (SEQ ID n°: 92, exemplo 19;contendo EgD9e, EgD8 e EGD5) com pKR328 (SEQ ID n°: 93, figura 11C).
A cultura de suspensões embriogênicas de soja (cv. Jack) foitransformada com o fragmento ASCI contendo o cassete de expressão pKR916(SEQ ID n°: 89) e plasmídeo intacto pKR328 (SEQ ID n°: 93), ou com ofragmento ASCI contendo o cassete de expressão pK1037 (SEQ ID n°: 92) eplasmídeo intacto pKR328 (SEQ ID n°: 93), conforme descrito no exemplo 13.
Os embriões foram maturados em histodiferenciação de soja emeio líquido de maturação (meio líquido sham; Schmidt et al., Cell Biologyand Morphogenesis, 24:393 (2005)) usando um procedimento modificado.Resumidamente, após 4 semanas de seleção em SB196 conforme descrito noexemplo 13, agrupamentos de embrião foram removidas em 35 mL de SB228(meio líquido SHaM) em um frasco Erlenmeyer de 250 mL. O tecido foimantido em meio líquido SHaM sobre um agitador rotativo a 130 rpm e 26°Ccom luz fluorescente branca fria em um fotoperíodo de 16:8 h dia/noite, a umaintensidade de luz de 60 a 85 ME/m2/s durante 2 semanas, enquanto osembriões amadureceram. Os embriões crescidos por 2 semanas em meiolíquido SHaM foram equivalentes em termos de tamanho e teor de ácidosgraxos aos embriões cultivados em SB166/SB103 por 5 a 8 semanas,conforme descrito no exemplo 13.
Receitas de meios:SB 228- Histodiferenciação ε Maturação de Soja (SHaM) (por litro)
<table>table see original document page 148</column></row><table><formula>formula see original document page 149</formula>
*Nota: Volume final será 1010 mL depois da adição de glutamina.
Já que glutamina se degrada relativamente rápido, pode serpreferível adicioná-la imediatamente antes de usar o meio. Expiração 2 semanasapós a adição de glutamina; O meio básico pode ser mantido sem glutamina.
FN-lite Macro para SHAM 10X- estoque #1 (por litro)
<table>table see original document page 149</column></row><table>
MS Micro 10OOX- estoque #2 (por 1 litro)
<table>table see original document page 149</column></row><table>Completar o volume
Autoclave
FeEDTA 100X- estoque #3 (por litro)
Na2EDTA* (EDTA sódico) 3,73 g
FeSO4VH2O (sulfato de ferro heptaidrato) 2,78 g
O *EDTA precisa ser completamente dissolvido antes da adição do ferro.
Completar o volume
A solução é fotossensível. Garrafas(s) devem ser revestidas m folhasmetálicas para omitir a luz.
Autoclave
Ca 100X- estoque #4 (por litro)
CaCI2*2H20 (cloreto de cálcio diidrato) 44 g
Completar o volume
Autoclave
Vitamina B510OOX- estoque #5 (por litro)
tiamina*HCI 10 g
ácido nicotínico 1 g
piridoxina*HCI 1 g
Mio-inositol 100 g
Completar o volume
Estocar congelado
4% glutamina- estoque #6 ípor litro)
DDI água aquecida para 30°C 900 mLL-glutamina 40 g
Gradualmente adicionar durante agitação e com pouco aquecimento.Não exceder 35°C.
Completar o volumeFiltro esterilizadoEstocar congelado
* Nota: Aquecer estoque descongelado em banho a 310C para dissolver oscristais completamente.
Após a maturação em meio líquido SHAM, embriões individuaisforam retirados dos agrupamentos, secos e testados para alterações na suacomposição dos ácidos graxos, como descrito acima.
Um subconjunto de embriões de soja (ou seja, seis embriões porevento) transformado com pKR916 ou (SEQ ID n°: 89) e pKR328 (SEQ ID n°:92), ou com pKR1037 (SEQ ID n°: 93) e pKR328 (SEQ ID n°: 93), foi colhido ecolocado em frascos de vidro GC e ésteres metílicos de ácidos graxos foram preparados pela transesterificação. Para transesterificação, 50 μΙ_ de hidróxidotrimetilsulfónio (TMSH) e 0,5 mL de hexano foram adicionados aos embriõesnos frascos de vidro e incubados por 30 minutos em temperatura ambiente comagitação. Os ésteres metílicos de ácidos graxos (5 pL injetados da camada dehexano) foram separados e quantificados usando um cromatógrafo de fase gasosa Hewlett-Packard 6890 equipado com uma com coluna capilarOmegawax 320 sílica fundida (Catálogo # 24152, Supelco Inc.). A temperaturado forno foi programada para permanecer a 220°C por 2,6 minutos, aumentarpara 240°C a 20°C /min, e depois permanecer a 240°C por mais 2,4 min. O gásde arraste foi fornecido por um gerador de hidrogênio Whatman. Os tempos deretenção foram comparados aos de ésteres metílicos de padrões disponíveiscomercialmente (Nu-Chek Prep1 Inc.).
Desta forma, 60 eventos transformados com pKR916 (SEQ ID n°:89) e pKR328 (SEQ ID n°: 93) e 45 eventos transformados com pKR1037 (SEQID n°: 93) e pKR328 (SEQ ID n°: 93) foram analisados. Os perfis médios de ácidos graxos para os dez eventos de maior atividade de desaturase delta-5para cada transformação (pKR916 e pKR328, pKR1037 e pKR328) sãomostrados nas figuras 2A e 12B, respectivamente.
Nas figuras 12A e 12B, ácidos graxos são identificados como 16:0(palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oléico), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUP, ETA e EPA. Os ácidos graxos mencionados como"outros" incluem: 18:2 (5,9), GLA, STA, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) ou 20:2 (8,11)e DPA. Cada um destes "outros" ácidos graxos estão presentes em umaabundância relativa de menos de 3,0% do total de ácidos graxos. Ascomposições de ácidos graxos de um embrião individual foram expressas comopercentagem em peso (%) do total de ácidos graxos e a composição média deácidos graxos é uma média de seis embriões individuais para cada evento.
A atividade da desaturase delta-5 para os "corretos" substratos(ou seja, DGLA e ETA) é expressa em porcentagem de dessaturação de delta-5 ("% correta delta-5 desat."), calculado segundo a seguinte fórmula:([produto]/[substrato + produto])*100. Mais especificamente, a percentagem dedelta-5 dessaturação para os substratos "corretos" foi determinada como:([ARA + EPA]/[DGLA + ETA + ARA + EPA])*100.
A atividade da desaturase delta-5 para os substratos "errados"(ie, EDA e ERA) também é expresso em porcentagem de delta-5dessaturação ("% errada delta-5 desat."), calculada da seguinte forma: ([SCI+ JUP]/[EDA + ERA + SCI + JUP])*100.
As especificidades do substrato MaD5 e EgD5 para os substratos"corretos" (isto é, DGLA e ETA) versus os substratos "errados" (isto é, EDA eERA) foram comparados e a comparação é mostrada na figura 13. Na figura13, a atividade da desaturase delta-5 para os substratos "corretos" ("%desaturase delta-5 correta") está representada graficamente no eixo χ e aatividade da desaturase delta-5 para os substratos "errados" ("% desaturasedelta-5 errada") está representada graficamente no eixo y para MaD5 (dadosda figura 12A) ou EgD5 (dados da figura 12B).
A figura 12B mostra que a atividade de EgD5 em embriões desoja é muito alta com uma conversão média (% de desaturase delta-5 correta)de 77% a 99% nos dez melhores eventos. A especificidade de substrato deEgD5 (figura 13) tem uma preferência pelos substratos "corretos" sobre ossubstratos "errados" em compraração com a MaD5. Dadas a alta atividade e aespecificidade de substrato, EgD5 pode ser útil para produção de AGPs como,mas não se limitando a, EPA e DHA em uma célula hospedeira.Listagem de Seqüências
<110> Ε. I. du Pont de Nemours & Company
<120> Desaturase delta-5 e seu uso na produção de ácidos graxospoliinsaturados
<130> BB1629
<150> US 60/801,172
<151> 17-05-2006
<160> 94
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 1350
<212> DNA
<213> Euglena gracilis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1350)
<223> desaturase delta-5
<400> 1 atggctctca gtcttaccac agaacagctg ttagaacgcc ctgatttggt tgcgattgat 60ggcatcctct acgaccttga agggcttgcc aaagttcatc caggaggaga tttgattctc 120gcttctggtg cctctgatgc ctcccctctc ttttattcaa tgcatccata cgtcaaaccg 180gagaattcca aattgcttca acagttcgtc cgagggaagc atgaccgcac ctcgaaggac 240attgtctaca cgtatgattc tcccttcgca caagacgtta agcggacaat gcgcgaggtg 300atgaaaggga ggaactggta cgcaacccct ggcttctggc tgcgcaccgt tgggatcatc 360gccgtgacgg ccttttgcga gtggcactgg gctaccacgg ggatggtgct gtggggcctg 420ttgactggat tcatgcacat gcagatcggc ttatccatcc agcatgatgc gtcccacggg 480gccatcagca agaagccttg ggtcaacgcc ctcttcgcct acggcattga cgtcatcgga 540tcgtcccggt ggatttggct gcagtcgcac atcatgcggc accacaccta caccaaccag 600cacggcctcg acctggatgc ggagtcggca gagccgttcc tggtgttcca caactacccc 660gccgcaaaca ccgcccgaaa gtggttccac cgcttccaag cttggtacat gtaccttgtg 720ctgggggcat acggggtatc gctggtgtac aacccgctct acattttccg gatgcagcac 780aatgacacca tcccagagtc tgtcacggcc atgcgggaga atggctttct gcggcgctac 840cgcacacttg cattcgtgat gcgagctttc ttcatcttcc ggaccgcatt cttgccctgg 900tacctcactg ggacctcatt gctgatcacc attcctctgg tgcccactgc aactggtgcc 960ttcttgacgt tcttcttcat tttgtcccac aattttgatg gctccgaacg gatccccgac 1020aagaactgca aggttaagag ctctgagaag gacgttgagg ctgaccaaat tgactggtat 1080
cgggcgcagg tggagacgtc ctccacatac ggtggcccca tcgccatgtt cttcactggc 1140
ggtctcaatt tccagatcga gcaccacctc tttccccgga tgtcgtcttg gcactacccc 1200
ttcgtccagc aggcggtccg ggagtgttgc gaacgccatg gagtgcgata tgttttctac 1260
cctaccatcg tcggcaacat catctccacc ctgaagtaca tgcataaggt gggtgtcgtc 1320
cactgcgtga aggacgcaca ggattcctga 1350
<210> 2<211> 449<212> PRT
<213> Euglena gracilis<400> 2
Met Ala Leu Ser Leu Thr Thr Glu Gln Leu Leu Glu Arg Pro Asp Leu1 5 10 15
Val Ala Ile Asp Gly Ile Leu Tyr Asp Leu Glu Gly Leu Ala Lys Val20 25 30
His Pro Gly Gly Asp Leu Ile Leu Ala Ser Gly Ala Ser Asp Ala Ser35 40 45
Pro Leu Phe Tyr Ser Met His Pro Tyr Val Lys Pro Glu Asn Ser Lys50 55 60
Leu Leu Gln Gln Phe Val Arg Gly Lys His Asp Arg Thr Ser Lys Asp65 70 75 80
Ile Val Tyr Thr Tyr Asp Ser Pro Phe Ala Gln Asp Val Lys Arg Thr85 90 95
Met Arg Glu Val Met Lys Gly Arg Asn Trp Tyr Ala Thr Pro Gly Phe100 105 110
Trp Leu Arg Thr Val Gly Ile Ile Ala Val Thr Ala Phe Cys Glu Trp115 120 125
His Trp Ala Thr Thr Gly Met Val Leu Trp Gly Leu Leu Thr Gly Phe130 135 140
Met His Met Gln Ile Gly Leu Ser Ile Gln His Asp Ala Ser His Gly145 150 155 160
Ala Ile Ser Lys Lys Pro Trp Val Asn Ala Leu Phe Ala Tyr Gly Ile165 170 175Asp Val Ile Gly Ser Ser Arg Trp Ile Trp Leu Gln Ser His Ile Met180 185 190
Arg His His Thr Tyr Thr Asn Gln His Gly Leu Asp Leu Asp Ala Glu195 200 205
Ser Ala Glu Pro Phe Leu Val Phe His Asn Tyr Pro Ala Ala Asn Thr210 215 220
Ala Arg Lys Trp Phe His Arg Phe Gln Ala Trp Tyr Met Tyr Leu Val225 230 235 240
Leu Gly Ala Tyr Gly Val Ser Leu Val Tyr Asn Pro Leu Tyr Ile Phe245 250 255
Arg Met Gln His Asn Asp Thr Ile Pro Glu Ser Val Thr Ala Met Arg260 265 270
Glu Asn Gly Phe Leu Arg Arg Tyr Arg Thr Leu Ala Phe Val Met Arg275 280 285
Ala Phe Phe Ile Phe Arg Thr Ala Phe Leu Pro Trp Tyr Leu Thr Gly290 295 300
Thr Ser Leu Leu Ile Thr Ile Pro Leu Val Pro Thr Ala Thr Gly Ala305 310 315 320
Phe Leu Thr Phe Phe Phe Ile Leu Ser His Asn Phe Asp Gly Ser Glu325 330 335
Arg Ile Pro Asp Lys Asn Cys Lys Val Lys Ser Ser Glu Lys Asp Val340 345 350
Glu Ala Asp Gln Ile Asp Trp Tyr Arg Ala Gln Val Glu Thr Ser Ser355 360 365
Thr Tyr Gly Gly Pro Ile Ala Met Phe Phe Thr Gly Gly Leu Asn Phe370 375 380
Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Arg Met Ser Ser Trp His Tyr Pro385 390 395 400
Phe Val Gln Gln Ala Val Arg Glu Cys Cys Glu Arg His Gly Val Arg405 410 415Tyr Val Phe Tyr Pro Thr Ile Val Gly Asn Ile Ile Ser Thr Leu Lys420 425 430
Tyr Met His Lys Val Gly Val Val His Cys Val Lys Asp Ala Gln Asp435 440 445
Ser
<210> 3
<211> 1350
<212> DNA
<213> Euglena gracilis<220>
<221> misc_feature
<223> desaturase delta-5 sintética (códon otimizada) para Yarrowialipolytica
<400> 3
atggctctct cccttactac cgagcagctg ctcgagcgac ccgacctggt tgccatcgac 60ggcattctct acgatctgga aggtcttgcc aaggtccatc ccggaggcga cttgatcctc 120gcttctggtg cctccgatgc ttctcctctg ttctactcca tgcaccctta cgtcaagccc 180gagaactcga agctgcttca acagttcgtg cgaggcaagc acgaccgaac ctccaaggac 240attgtctaca cctacgactc tccctttgca caggacgtca agcgaactat gcgagaggtc 300atgaaaggtc ggaactggta tgccacacct ggattctggc tgcgaaccgt tggcatcatt 360gctgtcaccg ccttttgcga gtggcactgg gctactaccg gaatggtgct gtggggtctc 420ttgactggat tcatgcacat gcagatcggc ctgtccattc agcacgatgc ctctcatggt 480gccatcagca aaaagccctg ggtcaacgct ctctttgcct acggcatcga cgtcattgga 540tcgtccagat ggatctggct gcagtctcac atcatgcgac atcacaccta caccaatcag 600catggtctcg acctggatgc cgagtccgca gaaccattcc ttgtgttcca caactaccct 660gctgccaaca ctgctcgaaa gtggtttcac cgattccagg cctggtacat gtacctcgtg 720cttggagcct acggcgtttc gctggtgtac aaccctctct acatcttccg aatgcagcac 780aacgacacca ttcccgagtc tgtcacagcc atgcgagaga acggctttct gcgacggtac 840cgaacccttg cattcgttat gcgagctttc ttcatctttc gaaccgcctt cttgccctgg 900tatctcactg gaacctccct gctcatcacc attcctctgg tgcccactgc taccggtgcc 960ttcctcacct tctttttcat cttgtctcac aacttcgatg gctcggagcg aatccccgac 1020aagaactgca aggtcaagag ctccgagaag gacgttgaag ccgatcagat cgactggtac 1080agagctcagg tggagacctc ttccacctac ggtggaccca ttgccatgtt ctttactggc 1140ggtctcaact tccagatcga gcatcacctc tttcctcgaa tgtcgtcttg gcactatccc 1200ttcgtgcagc aagctgtccg agagtgttgc gaacgacacg gagttcggta cgtcttctac 1260cctaccattg tgggcaacat catttccacc ctcaagtaca tgcacaaagt cggtgtggtt 1320
cactgtgtca aggacgctca ggattcctaa 1350
<210> 4
<211> 590
<212> DNA
<213> Euglena gracilis
<400>
ggccaccaca tctacaccaa ccagcacggc ctcgacctgg atgcggagtc ggcagagccgttcctggtgt tccacaacta ccccgccgca aacaccgccc gaaagtggtt ccaccgcttccaagcttggt acatgtacct tgtgctgggg gcatacgggg tatcgctggt gtacaacccgctctacattt tccggatgca gcacaatgac accatcccag agtctgtcac ggccatgcgggaaaatggct ttctgcggcg ctaccgcaca cttgcattcg tgatgcgagc tttcttcatcttccggaccg cattcttgcc ctggtacctc actgggacct cattgctgat caccattcctctggtgccca ccgcaactgg tgccttcttg acgttcttct tcattttgtc ccacaattttgatggctccg aacggatccc cgacaagaac tgcaaggtta agagctctga gaaggacgttgaggctgacc aaattgactg gtatcgggcg caggtggaga cgtcctccac atacggtggccccatcgcca tgttcttcac tggcggtctc aactaccaaa tcgtccacca
<210> 5<211> 196<212> PRT
<213> Euglena gracilis<4 00> 5
Gly His His Ile Tyr Thr Asn Gln His Gly Leu Asp Leu Asp Ala Glu1 5 10 15
Ser Ala Glu Pro Phe Leu Val Phe His Asn Tyr Pro Ala Ala Asn Thr20 25 30
Ala Arg Lys Trp Phe His Arg Phe Gln Ala Trp Tyr Met Tyr Leu Val35 40 45
Leu Gly Ala Tyr Gly Val Ser Leu Val Tyr Asn Pro Leu Tyr Ile Phe50 55 60
Arg Met Gln His Asn Asp Thr Ile Pro Glu Ser Val Thr Ala Met Arg65 70 75 80
60120180240300360420480540590Glu Asn Gly Phe Leu Arg Arg Tyr Arg Thr Leu Ala Phe Val Met Arg85 90 95
Ala Phe Phe Ile Phe Arg Thr Ala Phe Leu Pro Trp Tyr Leu Thr Gly100 105 110
Thr Ser Leu Leu Ile Thr Ile Pro Leu Val Pro Thr Ala Thr Gly Ala115 120 125
Phe Leu Thr Phe Phe Phe Ile Leu Ser His Asn Phe Asp Gly Ser Glu130 135 140
Arg Ile Pro Asp Lys Asn Cys Lys Val Lys Ser Ser Glu Lys Asp Val145 150 155 160
Glu Ala Asp Gln Ile Asp Trp Tyr Arg Ala Gln Val Glu Thr Ser Ser165 170 175
Thr Tyr Gly Gly Pro Ile Ala Met Phe Phe Thr Gly Gly Leu Asn Tyr180 185 190
Gln Ile Val His195
<210> 6<211> 797<212> DNA
<213> Euglena gracilis<4 00> 6
cacagaacag ctgttagaac gccctgattt ggttgcgatt gatggcatcc tctacgacct 60
tgaagggctt gccaaagttc atccaggagg agatttgatt ctcgcttctg gtgcctctga 120
tgcctcccct ctcttttatt caatgcatcc atacgtcaaa ccggagaatt ccaaattgct 180
tcaacagttc gtccgaggga agcatgaccg cacctcgaag gacattgtct acacgtatga 240
ttctcccttc gcacaagacg ttaagcggac aatgcgcgag gtgatgaaag ggaggaactg 300
gtacgcaacc cctggcttct ggctgcgcac cgttgggatc atcgccgtga cggccttttg 360
cgagtggcac tgggctacca cggggatggt gctgtggggc ctgttgactg gattcatgca 420
catgcagatc ggcttatcca tccagcatga tgcgtcccac ggggccatca gcaaggagcc 480
ttgggtcaac gccctcttcg cctacggcat tgacgtcatc ggatcgtccc ggtggatttg 540
gctgcagtca cacatcatgc ggcaccacac ctacaccaac cagcacggcc tcgacctgga 600
tgcggagtcg gcagagccgt tcctggtgtt ccacagctac cccgccgcaa acaccgcccg 660aaagtggttc caccgcttcc aagcttggta 7 catgtacctt gcgctggggg catacggggt 720atcgctggtg tacaacccgc tctacatttt ccggatgcag cacaatgaca ccatcccaga 780gtctgtcacg gccatgc 797<210> 7 <211> 559 <212> DNA <213> Euglena gracilis <400> 7 cacagaacag ctgttagaac gccctgattt ggttgcgatt gatggcatcc tctacgacct 60tgaagggctt gccaaagttc atccaggagg agatttgatt ctcgcttctg gtgcctctga 120tgcctcccct ctcttttatt caatgcatcc atacgtcaaa ccggagaatt ccaaattgct 180tcaacagttc gtccgaggga agcatgaccg cacctcgaag gacattgtct acacgtatga 240ttctcccttc gcacaagacg ttaagcggac aatgcgcgag gtgatgaaag ggaggaactg 300gtacgcaacc cctggcttct ggctgcgcac cgttgggatc atcgccgtga cggccttttg 360cgagtggcac tgggctacca cggggatggt gctgtggggc ctgttgactg gattcatgca 420catgcagatc ggcttatcca tccagcatga tgcgtcccac ggggccatca gcaaggagcc 480ttgggtcaac gccctcttcg cctacggcat tgacgtcatc ggatcgtccc ggtggatttg 540gctgcagtca cacatcatg 559<210> 8 <211> 273 <212> DNA <213> Euglena gracilis <400> 8 ggaatggctc tcagtcttac cacagaacag ctgttagaac gccctgattt ggttgcgatt 60gatggcatcc tctacgacct tgaagggctt gccaaagttc atccaggagg agatttgatt 120ctcgcttctg gtgcctctga tgcctcccct ctcttttatt caatgcatcc atacgtcaaa 180ccggagaatt ccaaattgct tcaacagttc gtccgaggga agcatgaccg cacctcgaag 240gacattgtct acacgtatga ttctcccttc gca 273<210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Euglena gracilis <400> 9 ggaatggctc tcagtcttac 20<210> 10 <211> 728<212> DNA <213> Euglena gracilis <400> 10 cctcactggg acctcattgc tgatcaccat tcctctggtg cccacygcaa ctggtgcctt 60cttgacgttc ttcttcattt tgtcccacaa ttttgatggc tccgaacgga tccccgacaa 120gaactgcaag gttaagagct ctgagaagga cgttgaggct gaccaaattg actggtatcg 180ggcgcaggtg gagacgtcct ccacatacgg tggccccatc gccatgttct tcactggcgg 240tctcaatttc cagatcgagc accacctctt tccccggatg tcgtcttggc actacccctt 300cgtccagcag gcggtccggg agtgttgcga acgccatgga gtgcgatatg ttttctaccc 360taccatcgtc ggcaacatca tctccaccct gaagtacatg cataaggtgg gtgtcgtcca 420ctgcgtgaag gacgcacagg attcctgagg ggcagggtga ccaagaacga tcatcgatgt 480gttcttctgg ccctttggtg gggtactcgc cagattgctc cactgaaccg tatcctaact 540ctgaccctct ccaaccctgt gttgagtgtt tgctttatgc tccaaagtgg cttcttattt 600ggtgacccgt ggggcagcgg cacctgtgcc atgcagctga taacccaggc tgctactcta 660agttggatgg ccaatcgtct ggcattgata tccctgctca gcgttgcatt ccaatggttt 720gcttatcc 728<210> 11 <211> 464 <212> DNA <213> Euglena gracilis <400> 11 cctctttccc cggatgtcgt cttggcacta ccccttcgtc cagcaggcgg tccgggagtg 60ttgcgaacgc catggagtgc gatatgtttt ctaccctacc atcgtcggca acatcatctc 120caccctgaag tacatgcata aggtgggtgt cgtccactgc gtgaaggacg cacaggattc 180ctgaggggca gggtgaccaa gaacgatcat cgatgtgttc ttctggccct ttggtggggt 240actcgccaga ttgctccact gaaccgtatc ctaactctga ccctctccaa ccctgtgttg 300agtgtttgct ttatgctcca aagtggcttc ttatttggtg acccgtgggg cagcggcacc 360tgtgccatgc agctgataac ccaggctgct actctaagtt ggatggccaa tcgtctggca 420ttgatatccc tgctcagcgt tgcattccaa tggtttgctt atcc 464
<210> 12<211> 456<212> PRT
<213> Pythium irregulare (GenBank Accession η° AAL13311)<220>
<221> MISC FEATURE<223> desaturase delta-5<4 00> 12
Met Gly Thr Asp Gln Gly Lys Thr Phe Thr Trp Gln Glu Val Ala Lys1 5 10 15
His Asn Thr Ala Lys Ser Ala Trp Val Ile Ile Arg Gly Glu Val Tyr20 25 30
Asp Val Thr Glu Trp Ala Asp Lys His Pro Gly Gly Ser Glu Leu Ile35 40 45
Val Leu His Ser Gly Arg Glu Cys Thr Asp Thr Phe Tyr Ser Tyr His50 55 60
Pro Phe Ser Asn Arg Ala Asp Lys Ile Leu Ala Lys Tyr Lys Ile Gly65 70 75 80
Lys Leu Val Gly Gly Tyr Glu Phe Pro Val Phe Lys Pro Asp Ser Gly85 90 95
Phe Tyr Lys Glu Cys Ser Glu Arg Val Ala Glu Tyr Phe Lys Thr Asn100 105 110
Asn Leu Asp Pro Lys Ala Ala Phe Ala Gly Leu Trp Arg Met Val Phe115 120 125
Val Phe Ala Val Ala Ala Leu Ala Tyr Met Gly Met Asn Glu Leu Ile130 135 140
Pro Gly Asn Val Tyr Ala Gln Tyr Ala Trp Gly Val Val Phe Gly Val145 150 155 160
Phe Gln Ala Leu Pro Leu Leu His Val Met His Asp Ser Ser His Ala165 170 175
Ala Cys Ser Ser Ser Pro Ala Met Trp Gln Ile Ile Gly Arg Gly Val180 185 190
Met Asp Trp Phe Ala Gly Ala Ser Met Val Ser Trp Leu Asn Gln His195 200 205
Val Val Gly His His Ile Tyr Thr Asn Val Ala Gly Ala Asp Pro Asp210 215 220
Leu Pro Val Asp Phe Glu Ser Asp Val Arg Arg Ile Val His Arg Gln225 230 235 240Val Leu Leu Pro Ile Tyr Lys Phe Gln His Ile Tyr Leu Pro Pro Leu245 250 255
Tyr Gly Val Leu Gly Leu Lys Phe Arg Ile Gln Asp Val Phe Glu Thr260 265 270
Phe Val Ser Leu Thr Asn Gly Pro Val Arg Val Asn Pro His Pro Val275 280 285
Ser Asp Trp Val Gln Met Ile Phe Ala Lys Ala Phe Trp Thr Phe Tyr290 295 300
Arg Ile Tyr Ile Pro Leu Val Trp Leu Lys Ile Thr Pro Ser Thr Phe305 310 315 320
Trp Gly Val Phe Phe Leu Ala Glu Phe Thr Thr Gly Trp Tyr Leu Ala325 330 335
Phe Asn Phe Gln Val Ser His Val Ser Thr Glu Cys Glu Tyr Pro Cys340 345 350
Gly Asp Ala Pro Ser Ala Glu Val Gly Asp Glu Trp Ala Ile Ser Gln355 360 365
Val Lys Ser Ser Val Asp Tyr Ala His Gly Ser Pro Leu Ala Ala Phe370 375 380
Leu Cys Gly Ala Leu Asn Tyr Gln Val Thr His His Leu Tyr Pro Gly385 390 395 400
Ile Ser Gln Tyr His Tyr Pro Ala Ile Ala Pro Ile Ile Ile Asp Val405 410 415
Cys Lys Lys Tyr Asn Ile Lys Tyr Thr Val Leu Pro Thr Phe Thr Glu420 425 430
Ala Leu Leu Ala His Phe Lys His Leu Lys Asn Met Gly Glu Leu Gly435 440 445
Lys Pro Val Glu Ile His Met Gly450 455
<210> 13<211> 477<212> PRT
<213> Phytophthora megasperma (GenBank Accession n° CAD53323)<220>
<221> MISC_FEATURE<223> desaturase delta-5
<400> 13
Met Ala Pro Ile Glu Thr Val Lys Asp Ala Asn Glu Gly Leu His Gln1 5 10 15
Arg Lys Gly Ala Ala Ala Ala Ser Lys Asp Thr Thr Thr Phe Thr Trp20 25 30
Gln Asp Val Ala Lys His Asn Thr Ala Lys Ser Ala Trp Val Thr Ile35 40 45
Arg Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Glu Trp Ala Asp Arg His Pro Gly50 55 60
Gly Arg Glu Leu Val Leu Leu His Ser Gly Arg Glu Cys Thr Asp Thr65 70 75 80
Phe Asp Ser Tyr His Pro Phe Ser Asp Arg Ala Asp Lys Ile Leu Ala85 90 95
Lys Tyr Ala Ile Gly Lys Leu Val Gly Gly Ser Glu Phe Pro Thr Tyr100 105 110
Lys Pro Asp Thr Gly Phe Tyr Lys Glu Cys Cys Asp Arg Val Asn Gln115 120 125
Tyr Phe Lys Asp Asn Lys Leu Asp Pro Arg Ser Pro Tyr Ser Gly Leu130 135 140
Trp Arg Met Ile Leu Val Ala Ile Val Gly Ala Val Ala Tyr Met Gly145 150 155 160
Met Asn Gln Leu Leu Pro Gly Asn Ile Tyr Ala His Tyr Ala Trp Gly165 170 175
Ala Leu Phe Gly Val Cys Gln Ala Leu Pro Leu Leu His Val Met His180 185 190
Asp Ala Ser His Ala Ala Ile Thr Ser Ser Pro Thr Gly Trp Arg Leu195 200 205
Ile Gly Arg Leu Ala Met Asp Trp Val Ala Gly Ala Asn Met Val Ser210 215 220Trp Leu Asn Gln His Val Val Gly His His Ile Tyr Thr Asn Val Ala225 230 235 240
Gly Ala Asp Pro Asp Leu Pro Val Asp Phe Lys Ser Asp Val Arg Arg245 250 255
Ile Val Tyr Arg Gln Val Leu Leu Pro Ile Tyr Lys Tyr Gln His Leu260 265 270
Tyr Leu Pro Pro Leu Tyr Gly Val Leu Gly Leu Lys Phe Arg Val Gln275 280 285
Asp Val Phe Glu Thr Phe Val Thr Leu Thr Asn Gly Pro Leu Arg Val290 295 300
Asn Pro Leu Ser Val Gly Asp Trp Ala Glu Met Ile Leu Ser Lys Ala305 310 315 320
Phe Trp Val Phe Tyr Arg Ile Tyr Leu Pro Leu Ala Val Leu Gln Val325 330 335
Asp Pro Ala Arg Phe Trp Gly Val Phe Phe Leu Ala Glu Phe Ser Thr340 345 350
Gly Trp Tyr Leu Ala Phe Asn Phe Gln Val Ser His Val Ser Thr Ala355 360 365
Cys Glu Tyr Pro Gly Gly Asp Glu Glu Val Thr Ser Ile Asp Asp Glu370 375 380
Trp Ala Ile Ser Gln Val Lys Ser Ser Val Asp Tyr Gly His Gly Ser385 390 395 400
Phe Ile Thr Thr Phe Leu Thr Gly Ala Leu Asn Tyr Gln Val Thr His405 410 415
His Leu Phe Pro Gly Val Ser Gln Tyr His Tyr Pro Ala Ile Ala Pro420 425 430
Leu Ile Leu Asp Val Cys His Lys Tyr Lys Val Lys Tyr Asn Val Leu435 440 445
Pro Asp Phe Thr Ala Ala Met Ala Gly His Phe Asp His Leu Val Ile450 455 460Met Gly Lys Met Gly Lys Arg Val Thr Ile His Met Gly465 470 475
<210> 14
<211> 469
<212> PRT
<213> Phaeodactylum tricornutum (GenBank Accession η° AAL92562)
<220>
<221> MISC_FEATURE<223> desaturase delta-5
<4 00> 14
Met Ala Pro Asp Ala Asp Lys Leu Arg Gln Arg Gln Thr Thr Ala Val1 5 10 15
Ala Lys His Asn Ala Ala Thr Ile Ser Thr Gln Glu Arg Leu Cys Ser20 25 30
Leu Ser Ser Leu Lys Gly Glu Glu Val Cys Ile Asp Gly Ile Ile Tyr35 40 45
Asp Leu Gln Ser Phe Asp His Pro Gly Gly Glu Thr Ile Lys Met Phe50 55 60
Gly Gly Asn Asp Val Thr Val Gln Tyr Lys Met Ile His Pro Tyr His65 70 75 80
Thr Glu Lys His Leu Glu Lys Met Lys Arg Val Gly Lys Val Thr Asp85 90 95
Phe Val Cys Glu Tyr Lys Phe Asp Thr Glu Phe Glu Arg Glu Ile Lys100 105 110
Arg Glu Val Phe Lys Ile Val Arg Arg Gly Lys Asp Phe Gly Thr Leu115 120 125
Gly Trp Phe Phe Arg Ala Phe Cys Tyr Ile Ala Ile Phe Phe Tyr Leu130 135 140
Gln Tyr His Trp Val Thr Thr Gly Thr Ser Trp Leu Leu Ala Val Ala145 150 155 160
Tyr Gly Ile Ser Gln Ala Met Ile Gly Met Asn Val Gln His Asp Ala165 170 175
Asn His Gly Ala Thr Ser Lys Arg Pro Trp Val Asn Asp Met Leu Gly180 185 190Leu Gly Ala Asp Phe Ile Gly Gly Ser Lys Trp Leu Trp Gln Glu Gln195 200 205
His Trp Thr His His Ala Tyr Thr Asn His Ala Glu Met Asp Pro Asp210 215 220
Ser Phe Gly Ala Glu Pro Met Leu Leu Phe Asn Asp Tyr Pro Leu Asp225 230 235 240
His Pro Ala Arg Thr Trp Leu His Arg Phe Gln Ala Phe Phe Tyr Met245 250 255
Pro Val Leu Ala Gly Tyr Trp Leu Ser Ala Val Phe Asn Pro Gln Ile260 265 270
Leu Asp Leu Gln Gln Arg Gly Ala Leu Ser Val Gly Ile Arg Leu Asp275 280 285
Asn Ala Phe Ile His Ser Arg Arg Lys Tyr Ala Val Phe Trp Arg Ala290 295 300
Val Tyr Ile Ala Val Asn Val Ile Ala Pro Phe Tyr Thr Asn Ser Gly305 310 315 320
Leu Glu Trp Ser Trp Arg Val Phe Gly Asn Ile Met Leu Met Gly Val325 330 335
Ala Glu Ser Leu Ala Leu Ala Val Leu Phe Ser Leu Ser His Asn Phe340 345 350
Glu Ser Ala Asp Arg Asp Pro Thr Ala Pro Leu Lys Lys Thr Gly Glu355 360 365
Pro Val Asp Trp Phe Lys Thr Gln Val Glu Thr Ser Cys Thr Tyr Gly370 375 380
Gly Phe Leu Ser Gly Cys Phe Thr Gly Gly Leu Asn Phe Gln Val Glu385 390 395 400
His His Leu Phe Pro Arg Met Ser Ser Ala Trp Tyr Pro Tyr Ile Ala405 410 415
Pro Lys Val Arg Glu Ile Cys Ala Lys His Gly Val His Tyr Ala Tyr420 425 430Tyr Pro Trp Ile His Gln Asn Phe Leu Ser Thr Val Arg Tyr Met His435 440 445
Ala Ala Gly Thr Gly Ala Asn Trp Arg Gln Met Ala Arg Glu Asn Pro450 455 460
Leu Thr Gly Arg Ala465
<210> 15
<211> 467
<212> PRT
<213> Dictyostelium discoideum (GenBank Accession n° XP_640331)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> desaturase delta-5
<4 00> 15
Met Met Glu Thr Asn Asn Glu Asn Lys Glu Lys Leu Lys Leu Tyr Thr15 10 15
Trp Asp Glu Val Ser Lys His Asn Gln Lys Asn Asp Leu Trp Ile Ile20 25 30
Val Asp Gly Lys Val Tyr Asn Ile Thr Lys Trp Val Pro Leu His Pro35 40 45
Gly Gly Glu Asp Ile Leu Leu Leu Ser Ala Gly Arg Asp Ala Thr Asn50 55 60
Leu Phe Glu Ser Tyr His Pro Met Thr Asp Lys His Tyr Ser Leu Ile65 70 75 80
Lys Gln Tyr Glu Ile Gly Tyr Ile Ser Ser Tyr Glu His Pro Lys Tyr85 90 95
Val Glu Lys Ser Glu Phe Tyr Ser Thr Leu Lys Gln Arg Val Arg Lys100 105 110
His Phe Gln Thr Ser Ser Gln Asp Pro Lys Val Ser Val Gly Val Phe115 120 125
Thr Arg Met Val Leu Ile Tyr Leu Phe Leu Phe Val Thr Tyr Tyr Leu130 135 140
Ser Gln Phe Ser Thr Asp Arg Phe Trp Leu Asn Cys Ile Phe Ala Val145 150 155 160Leu Tyr Gly Val Ala Asn Ser Leu Phe Gly Leu His Thr Met His Asp165 170 175
Ala Cys His Thr Ala Ile Thr His Asn Pro Met Thr Trp Lys Ile Leu180 185 190
Gly Ala Thr Phe Asp Leu Phe Ala Gly Ala Ser Phe Tyr Ala Trp Cys195 200 205
His Gln His Val Ile Gly His His Leu Tyr Thr Asn Val Arg Asn Ala210 215 220
Asp Pro Asp Leu Gly Gln Gly Glu Ile Asp Phe Arg Val Val Thr Pro225 230 235 240
Tyr Gln Ala Arg Ser Trp Tyr His Lys Tyr Gln His Ile Tyr Ala Pro245 250 255
Ile Leu Tyr Gly Val Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg Ile Gln Asp His Glu260 265 270
Ile Phe Thr Lys Lys Ser Asn Gly Ala Ile Arg Tyr Ser Pro Ile Ser275 280 285
Thr Ile Asp Thr Ala Ile Phe Ile Leu Gly Lys Leu Val Phe Ile Ile290 295 300
Ser Arg Phe Ile Leu Pro Leu Ile Tyr Asn His Ser Phe Ser His Leu305 310 315 320
Ile Cys Phe Phe Leu Ile Ser Glu Leu Val Leu Gly Trp Tyr Leu Ala325 330 335
Ile Ser Phe Gln Val Ser His Val Val Glu Asp Leu Gln Phe Met Ala340 345 350
Thr Pro Glu Ile Phe Asp Gly Ala Asp His Pro Leu Pro Thr Thr Phe355 360 365
Asn Gln Asp Trp Ala Ile Leu Gln Val Lys Thr Thr Gln Asp Tyr Ala370 375 380
Gln Asp Ser Val Leu Ser Thr Phe Phe Ser Gly Gly Leu Asn Leu Gln385 390 395 400Val Ile His His Cys Phe Pro Thr Ile Ala Gln Asp Tyr Tyr Pro Gln405 410 415
Ile Val Pro Ile Leu Lys Glu Val Cys Lys Glu Tyr Asn Val Thr Tyr420 425 430
His Tyr Lys Pro Thr Phe Thr Glu Ala Ile Lys Ser His Ile Asn Tyr435 440 445
Leu Tyr Lys Met Gly Asn Asp Pro Asp Tyr Val Arg Lys Pro Val Asn450 455 460
Lys Asn Asp465
<210> 16<211> 421<212> PRT
<213> Euglena gracilis
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> desaturase delta-8
<300>
<302> DESATURASE DELTA-8 E SEU USO NA PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS
POLIINSATURADOS
<310> W02006012325
<311> 2005-06-24
<312> 2006-02-02
<313> (1)..(421)
<300>
<302> DESATURASE DELTA-8 E SEU USO NA PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS
POLIINSATURADOS
<310> W02006012326
<311> 2005-06-24
<312> 2006-02-02
<313> (1)..(421)
<400> 16
Met Lys Ser Lys Arg Gln Ala Leu Pro Leu Thr Ile Asp Gly Thr Thr15 10 15
Tyr Asp Val Ser Ala Trp Val Asn Phe His Pro Gly Gly Ala Glu Ile20 25 30
Ile Glu Asn Tyr Gln Gly Arg Asp Ala Thr Asp Ala Phe Met Val Met35 40 45
His Ser Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Lys Arg Met Pro Lys Ile Asn50 55 60Pro Ser Ser Glu Leu Pro Pro Gln Ala Ala Val Asn Glu Ala Gln Glu65 70 75 80
Asp Phe Arg Lys Leu Arg Glu Glu Leu Ile Ala Thr Gly Met Phe Asp85 90 95
Ala Ser Pro Leu Trp Tyr Ser Tyr Lys Ile Ser Thr Thr Leu Gly Leu100 105 110
Gly Val Leu Gly Tyr Phe Leu Met Val Gln Tyr Gln Met Tyr Phe Ile115 120 125
Gly Ala Val Leu Leu Gly Met His Tyr Gln Gln Met Gly Trp Leu Ser130 135 140
His Asp Ile Cys His His Gln Thr Phe Lys Asn Arg Asn Trp Asn Asn145 150 155 160
Leu Val Gly Leu Val Phe Gly Asn Gly Leu Gln Gly Phe Ser Val Thr165 170 175
Trp Trp Lys Asp Arg His Asn Ala His His Ser Ala Thr Asn Val Gln180 185 190
Gly His Asp Pro Asp Ile Asp Asn Leu Pro Leu Leu Ala Trp Ser Glu195 200 205
Asp Asp Val Thr Arg Ala Ser Pro Ile Ser Arg Lys Leu Ile Gln Phe210 215 220
Gln Gln Tyr Tyr Phe Leu Val Ile Cys Ile Leu Leu Arg Phe Ile Trp225 230 235 240
Cys Phe Gln Ser Val Leu Thr Val Arg Ser Leu Lys Asp Arg Asp Asn245 250 255
Gln Phe Tyr Arg Ser Gln Tyr Lys Lys Glu Ala Ile Gly Leu Ala Leu260 265 270
His Trp Thr Leu Lys Thr Leu Phe His Leu Phe Phe Met Pro Ser Ile275 280 285
Leu Thr Ser Leu Leu Val Phe Phe Val Ser Glu Leu Val Gly Gly Phe290 295 300Gly Ile Ala Ile Val Val Phe Met Asn His Tyr Pro Leu Glu Lys Ile305 310 315 320
Gly Asp Ser Val Trp Asp Gly His Gly Phe Ser Val Gly Gln Ile His325 330 335
Glu Thr Met Asn Ile Arg Arg Gly Ile Ile Thr Asp Trp Phe Phe Gly340 345 350
Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu Trp Pro Thr Leu Pro Arg355 360 365
His Asn Leu Thr Ala Val Ser Tyr Gln Val Glu Gln Leu Cys Gln Lys370 375 380
His Asn Leu Pro Tyr Arg Asn Pro Leu Pro His Glu Gly Leu Val Ile385 390 395 400
Leu Leu Arg Tyr Leu Ala Val Phe Ala Arg Met Ala Glu Lys Gln Pro405 410 415
Ala Gly Lys Ala Leu420
<210> 17
<211> 1269
<212> DNA
<213> Pavlova lutheri
<220> <221> misc feature <223> desaturase delta-8 <4 00> 17 atgggcaagg gtggagacgg cggcgcgcag gcggtgagcg ggaccgacgc gtctctcgct 60gaggtgagct ccgtcgatag caagagcgtg cacgtcgtgc tctacggcaa gcgcgtggat 120gtcacaaagt tccagaaggc acacccgggc gggagcaagg tgttccgcat cttccaggag 180cgcgacgcga cggagcagtt cgagtcttac cactcgccca aggccatcaa gatgatggag 240ggcatgctca agaagtcgga ggatgcgccc gcttccgtgc ccctgccctc gcggtccacc 300atgggcacgg agttcaagga gatgattgag cgccacaaga gggctggtct ctacgaccct 360tgcccgttgg acgagctgtt caagctcacc atcgtccttg cgcccatctt cgtgggcgcc 420tatctcgtgc ggagcggcgt ctcgcccctc gcgggcgcgc tctccatggg ctttggcttc 480tacctcgacg gctggcttgc tcacgactac ctgcatcacg cagtcttcaa gggctcggtc 540aacacgctcg tcaaggcgaa caacgccatg ggatacgccc tcggcttcct ccagggctac 600
gacgtggcct ggtggcgcgc gcgccataac acgcaccacg tgtgcaccaa cgaggatggt 660
tcggacccgg acatcaagac ggcgcccctg ctcatctacg tgcgagagaa cccgtccatt 720
gccaagcggc tcaacttctt ccagcgctgg cagcagtact actatgtgcc gaccatggcc 780
atcctcgacc tctactggcg cctggagtcc atcgcgtacg tggctgtgcg cctgcctaag 840
atgtggatgc aggccgccgc tcttgccgct cactacgcgc tcctgtgctg ggtcttcgca 900
gcgcatctca acctcatccc tctcatgatg gttgcacgcg gcttcgcgac gggcatcgtt 960
gtctttgcaa cccactatgg tgaggacatc ctcgaccgcg agcacgtcga gggcatgacg 1020
ctcgtcgagc agaccgccaa gacctcccgt aacatcacgg gcggctggct agtgaacgtg 1080
ctcacgggct tcatctccct gcagaccgag catcacctct tccccatgat gcccaccggc 1140
aacctaatga ctatccagcc cgaggtacgc gacttcttca agaagcatgg cctcgagtac 1200
cgcgagggca acctcttcca gtgcgtgcac cagaacatca aggctctcgc cttcgagcac 1260
ctcctccac 1269
<210> 18<211> 423<212> PRT
<213> Pavlova Iutheri<400> 18
Met Gly Lys Gly Gly Asp Gly Gly Ala Gln Ala Val Ser Gly Thr Asp
Gly Met Leu Lys Lys Ser Glu Asp Ala Pro Ala Ser Val Pro Leu Pro
Ala Ser Leu Ala Glu Val Ser Ser Val Asp Ser Lys Ser Val His Val20 25 30
Val Leu Tyr Gly Lys Arg Val Asp Val Thr Lys Phe Gln Lys Ala His35 40 45
Pro Gly Gly Ser Lys Val Phe Arg Ile Phe Gln Glu Arg Asp Ala Thr50 55 60
Glu Gln Phe Glu Ser Tyr His Ser Pro Lys Ala Ile Lys Met Met Glu
Ser Arg Ser Thr Met Gly Thr Glu Phe Lys Glu Met Ile Glu Arg His100 105 110Lys Arg Ala Gly Leu Tyr Asp Pro Cys Pro Leu Asp Glu Leu Phe Lys115 120 125
Leu Thr Ile Val Leu Ala Pro Ile Phe Val Gly Ala Tyr Leu Val Arg130 135 140
Ser Gly Val Ser Pro Leu Ala Gly Ala Leu Ser Met Gly Phe Gly Phe145 150 155 160
Tyr Leu Asp Gly Trp Leu Ala His Asp Tyr Leu His His Ala Val Phe165 170 175
Lys Gly Ser Val Asn Thr Leu Val Lys Ala Asn Asn Ala Met Gly Tyr180 185 190
Ala Leu Gly Phe Leu Gln Gly Tyr Asp Val Ala Trp Trp Arg Ala Arg195 200 205
His Asn Thr His His Val Cys Thr Asn Glu Asp Gly Ser Asp Pro Asp210 215 220
Ile Lys Thr Ala Pro Leu Leu Ile Tyr Val Arg Glu Asn Pro Ser Ile225 230 235 240
Ala Lys Arg Leu Asn Phe Phe Gln Arg Trp Gln Gln Tyr Tyr Tyr Val245 250 255
Pro Thr Met Ala Ile Leu Asp Leu Tyr Trp Arg Leu Glu Ser Ile Ala260 265 270
Tyr Val Ala Val Arg Leu Pro Lys Met Trp Met Gln Ala Ala Ala Leu275 280 285
Ala Ala His Tyr Ala Leu Leu Cys Trp Val Phe Ala Ala His Leu Asn290 295 300
Leu Ile Pro Leu Met Met Val Ala Arg Gly Phe Ala Thr Gly Ile Val305 310 315 320
Val Phe Ala Thr His Tyr Gly Glu Asp Ile Leu Asp Arg Glu His Val325 330 335
Glu Gly Met Thr Leu Val Glu Gln Thr Ala Lys Thr Ser Arg Asn Ile340 345 350
Thr Gly Gly Trp Leu Val Asn Val Leu Thr Gly Phe Ile Ser Leu Gln355 360 365Thr Glu His His Leu Phe Pro Met Met Pro Thr Gly Asn Leu Met Thr370 375 380
Ile Gln Pro Glu Val Arg Asp Phe Phe Lys Lys His Gly Leu Glu Tyr385 390 395 400
Arg Glu Gly Asn Leu Phe Gln Cys Val His Gln Asn Ile Lys Ala Leu405 410 415
Ala Phe Glu His Leu Leu His420
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Região conservada 1 nas desaturases delta-5 e delta-8
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4) .. (4)
<223> X = Ile ou Val
<4 00> 19
Gly His His Xaa Tyr Thr Asn
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Região conservada 2 nas desaturases delta-5 e delta-8
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2) .. (2)
<223> X = Y ou F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4) . . (4)
<223> X = Val ou Ile
<400> 20
Asn Xaa Gln Xaa Glu His His
1 5<210> 21
<211> 476
<212> PRT
<213> Thalassiosira pseudonana (GenBank Accession η° ΑΑΧ14502)
<220>
<221> MISC_FEATURE<223> desaturase delta-8
<400> 21
Met Pro Pro Asn Ala Asp Ile Ser Arg Ile Arg Asn Arg Ile Pro Thr15 10 15
Lys Thr Gly Thr Val Ala Ser Ala Asp Asn Asn Asp Pro Ala Thr Gln20 25 30
Ser Val Arg Thr Leu Lys Ser Leu Lys Gly Asn Glu Val Val Ile Asn35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Asp Ile Ala Asp Phe Val His Pro Gly Gly Glu Val50 55 60
Val Lys Phe Phe Gly Gly Asn Asp Val Thr Ile Gln Tyr Asn Met Ile65 70 75 80
His Pro Tyr His Thr Gly Lys His Leu Glu Lys Met Lys Ala Val Gly85 90 95
Lys Val Val Asp Trp Gln Ser Asp Tyr Lys Phe Asp Thr Pro Phe Glu100 105 110
Arg Glu Ile Lys Ser Glu Val Phe Lys Ile Val Arg Arg Gly Arg Glu115 120 125
Phe Gly Thr Thr Gly Tyr Phe Leu Arg Ala Phe Phe Tyr Ile Ala Leu130 135 140
Phe Phe Thr Met Gln Tyr Thr Phe Ala Thr Cys Thr Thr Phe Thr Thr145 150 155 160
Tyr Asp His Trp Tyr Gln Ser Gly Val Phe Ile Ala Ile Val Phe Gly165 170 175
Ile Ser Gln Ala Phe Ile Gly Leu Asn Val Gln His Asp Ala Asn His180 185 190
Gly Ala Ala Ser Lys Arg Pro Trp Val Asn Asp Leu Leu Gly Phe Gly195 200 205Thr Asp Leu Ile Gly Ser Asn Lys Trp Asn Trp Met Ala Gln His Trp210 215 220
Thr His His Ala Tyr Thr Asn His Ser Glu Lys Asp Pro Asp Ser Phe225 230 235 240
Ser Ser Glu Pro Met Phe Ala Phe Asn Asp Tyr Pro Ile Gly His Pro245 250 255
Lys Arg Lys Trp Trp His Arg Phe Gln Gly Gly Tyr Phe Leu Phe Met,260 265 270
Leu Gly Leu Tyr Trp Leu Pro Thr Val Phe Asn Pro Gln Phe Ile Asp275 280 285
Leu Arg Gln Arg Gly Ala Gln Tyr Val Gly Ile Gln Met Glu Asn Asp290 295 300
Phe Ile Val Lys Arg Arg Lys Tyr Ala Val Ala Leu Arg Met Met Tyr305 310 315 320
Ile Tyr Leu Asn Ile Val Ser Pro Phe Met Asn Asn Gly Leu Ser Trp325 330 335
Ser Thr Phe Gly Ile Ile Met Leu Met Gly Ile Ser Glu Ser Leu Thr340 345 350
Leu Ser Val Leu Phe Ser Leu Ser His Asn Phe Ile Asn Ser Asp Arg355 360 365
Asp Pro Thr Ala Asp Phe Lys Lys Thr Gly Glu Gln Val Cys Trp Phe370 375 380
Lys Ser Gln Val Glu Thr Ser Ser Thr Tyr Gly Gly Phe Ile Ser Gly385 390 395 400
Cys Leu Thr Gly Gly Leu Asn Phe Gln Val Glu His His Leu Phe Pro405 410 415
Arg Met Ser Ser Ala Trp Tyr Pro Tyr Ile Ala Pro Thr Val Arg Glu420 425 430
Val Cys Lys Lys His Gly Met Ser Tyr Ala Tyr Tyr Pro Trp Ile Gly435 440 445Gln Asn Leu Val Ser Thr Phe Lys Tyr Met His Arg Ala Gly Ser Gly
450 455 460
Ala Asn Trp Glu Leu Lys Pro Leu
Ser Gly.Ser Ala475
465
470
<210> 22<211> 8165<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Plasmideo pZUF17<400> 22
gtacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 60
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 120
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 180
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 240
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 300
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 360
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 420
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 480
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 540
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 600
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 660
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 720
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 780
tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 840
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 900
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 960
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1020
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1080
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1140
tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 1200
acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 1260
tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 1320ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 1380
agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 1440
tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 1500
acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 1560
agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 1620
actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 1680
tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 1740
gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 1800
ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 1860
tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 1920
aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 1980
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2040
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2100
gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 2160
gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 2220
acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 2280
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 2340
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 2400
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 2460
taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 2520
aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttcca ttcgccattc aggctgcgca 2580
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg 2640
gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta 2700
aaacgacggc cagtgaattg taatacgact cactataggg cgaattgggt accgggcccc 2760
ccctcgaggt cgatggtgtc gataagcttg atatcgaatt catgtcacac aaaccgatct 2820
tcgcctcaag gaaacctaat tctacatccg agagactgcc gagatccagt ctacactgat 2880
taattttcgg gccaataatt taaaaaaatc gtgttatata atattatatg tattatatat 2940
atacatcatg atgatactga cagtcatgtc ccattgctaa atagacagac tccatctgcc 3000
gcctccaact gatgttctca atatttaagg ggtcatctcg cattgtttaa taataaacag 3060
actccatcta ccgcctccaa atgatgttct caaaatatat tgtatgaact tatttttatt 3120
acttagtatt attagacaac ttacttgctt tatgaaaaac acttcctatt taggaaacaa 3180tttataatgg cagttcgttc atttaacaat ttatgtagaa taaatgttat aaatgcgtat 3240gggaaatctt aaatatggat agcataaatg atatctgcat tgcctaattc gaaatcaaca 3300gcaacgaaaa aaatcccttg tacaacataa atagtcatcg agaaatatca actatcaaag 3360aacagctatt cacacgttac tattgagatt attattggac gagaatcaca cactcaactg 3420tctttctctc ttctagaaat acaggtacaa gtatgtacta ttctcattgt tcatacttct 3480agtcatttca tcccacatat tccttggatt tctctccaat gaatgacatt ctatcttgca 3540aattcaacaa ttataataag atataccaaa gtagcggtat agtggcaatc aaaaagcttc 3600tctggtgtgc ttctcgtatt tatttttatt ctaatgatcc attaaaggta tatatttatt 3660tcttgttata taatcctttt gtttattaca tgggctggat acataaaggt attttgattt 3720aattttttgc ttaaattcaa tcccccctcg ttcagtgtca actgtaatgg taggaaatta 3780ccatactttt gaagaagcaa aaaaaatgaa agaaaaaaaa aatcgtattt ccaggttaga 3840cgttccgcag aatctagaat gcggtatgcg gtacattgtt cttcgaacgt aaaagttgcg 3900ctccctgaga tattgtacat ttttgctttt acaagtacaa gtacatcgta caactatgta 3960ctactgttga tgcatccaca acagtttgtt ttgttttttt ttgttttttt tttttctaat 4020gattcattac cgctatgtat acctacttgt acttgtagta agccgggtta ttggcgttca 4080attaatcata gacttatgaa tctgcacggt gtgcgctgcg agttactttt agcttatgca 4140tgctacttgg gtgtaatatt gggatctgtt cggaaatcaa cggatgctca atcgatttcg 4200acagtaatta attaagtcat acacaagtca gctttcttcg agcctcatat aagtataagt 4260agttcaacgt attagcactg tacccagcat ctccgtatcg agaaacacaa caacatgccc 4320cattggacag atcatgcgga tacacaggtt gtgcagtatc atacatactc gatcagacag 4380gtcgtctgac catcatacaa gctgaacaag cgctccatac ttgcacgctc tctatataca 4440cagttaaatt acatatccat agtctaacct ctaacagtta atcttctggt aagcctccca 4500gccagccttc tggtatcgct tggcctcctc aataggatct cggttctggc cgtacagacc 4560tcggccgaca attatgatat ccgttccggt agacatgaca tcctcaacag ttcggtactg 4620ctgtccgaga gcgtctccct tgtcgtcaag acccaccccg ggggtcagaa taagccagtc 4680ctcagagtcg cccttaggtc ggttctgggc aatgaagcca accacaaact cggggtcgga 4740tcgggcaagc tcaatggtct gcttggagta ctcgccagtg gccagagagc ccttgcaaga 4800cagctcggcc agcatgagca gacctctggc cagcttctcg ttgggagagg ggactaggaa 4860ctccttgtac tgggagttct cgtagtcaga gacgtcctcc ttcttctgtt cagagacagt 4920ttcctcggca ccagctcgca ggccagcaat gattccggtt ccgggtacac cgtgggcgtt 4980ggtgatatcg gaccactcgg cgattcggtg acaccggtac tggtgcttga cagtgttgcc 5040aatatctgcg aactttctgt cctcgaacag gaagaaaccg tgcttaagag caagttcctt 5100
gagggggagc acagtgccgg cgtaggtgaa gtcgtcaatg atgtcgatat gggttttgat 5160
catgcacaca taaggtccga ccttatcggc aagctcaatg agctccttgg tggtggtaac 5220
atccagagaa gcacacaggt tggttttctt ggctgccacg agcttgagca ctcgagcggc 5280
aaaggcggac ttgtggacgt tagctcgagc ttcgtaggag ggcattttgg tggtgaagag 5340
gagactgaaa taaatttagt ctgcagaact ttttatcgga accttatctg gggcagtgaa 5400
gtatatgtta tggtaatagt tacgagttag ttgaacttat agatagactg gactatacgg 5460
ctatcggtcc aaattagaaa gaacgtcaat ggctctctgg gcgtcgcctt tgccgacaaa 5520
aatgtgatca tgatgaaagc cagcaatgac gttgcagctg atattgttgt cggccaaccg 5580
cgccgaaaac gcagctgtca gacccacagc ctccaacgaa gaatgtatcg tcaaagtgat 5640
ccaagcacac tcatagttgg agtcgtactc caaaggcggc aatgacgagt cagacagata 5700
ctcgtcgact caggcgacga cggaattcct gcagcccatc tgcagaattc aggagagacc 5760
gggttggcgg cgtatttgtg tcccaaaaaa cagccccaat tgccccggag aagacggcca 5820
ggccgcctag atgacaaatt caacaactca cagctgactt tctgccattg ccactagggg 5880
ggggcctttt tatatggcca agccaagctc tccacgtcgg ttgggctgca cccaacaata 5940
aatgggtagg gttgcaccaa caaagggatg ggatgggggg tagaagatac gaggataacg 6000
gggctcaatg gcacaaataa gaacgaatac tgccattaag actcgtgatc cagcgactga 6060
caccattgca tcatctaagg gcctcaaaac tacctcggaa ctgctgcgct gatctggaca 6120
ccacagaggt tccgagcact ttaggttgca ccaaatgtcc caccaggtgc aggcagaaaa 6180
cgctggaaca gcgtgtacag tttgtcttaa caaaaagtga gggcgctgag gtcgagcagg 6240
gtggtgtgac ttgttatagc ctttagagct gcgaaagcgc gtatggattt ggctcatcag 6300
gccagattga gggtctgtgg acacatgtca tgttagtgta cttcaatcgc cccctggata 6360
tagccccgac aataggccgt ggcctcattt ttttgccttc cgcacatttc cattgctcgg 6420
tacccacacc ttgcttctcc tgcacttgcc aaccttaata ctggtttaca ttgaccaaca 6480
tcttacaagc ggggggcttg tctagggtat atataaacag tggctctccc aatcggttgc 654 0
cagtctcttt tttcctttct ttccccacag attcgaaatc taaactacac atcacacaat 6600
gcctgttact gacgtcctta agcgaaagtc cggtgtcatc gtcggcgacg atgtccgagc 6660
cgtgagtatc cacgacaaga tcagtgtcga gacgacgcgt tttgtgtaat gacacaatcc 6720
gaaagtcgct agcaacacac actctctaca caaactaacc cagctctcca tggctgagga 6780
taagaccaag gtcgagttcc ctaccctgac tgagctgaag cactctatcc ctaacgcttg 6840
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tcatctaggc ggcctggccg tcttctccgg ggcaattgtt cctctatagt actgcgtaca 4200ctgtttaaac agtgtacgca gatctgcgac gacggaattc ctgcagccca tctgcagaat 4260tcaggagaga ccgggttggc ggcgtatttg tgtcccaaaa aacagcccca attgccccaa 4320ttgaccccaa attgacccag tagcgggccc aaccccggcg agagccccct tcaccccaca 4380tatcaaacct cccccggttc ccacacttgc cgttaagggc gtagggtact gcagtctgga 4440atctacgctt gttcagactt tgtactagtt tctttgtctg gccatccggg taacccatgc 4500cggacgcaaa atagactact gaaaattttt ttgctttgtg gttgggactt tagccaaggg 4560tataaaagac caccgtcccc gaattacctt tcctcttctt ttctctctct ccttgtcaac 4620tcacacccga aatcgttaag catttccttc tgagtataag aatcattcac catggctgcc 4680gctccctctg tgcgaacctt tacccgagcc gaggttctga acgctgaggc tctgaacgag 4740ggcaagaagg acgctgaggc tcccttcctg atgatcatcg acaacaaggt gtacgacgtc 4800cgagagttcg tccctgacca tcctggaggc tccgtgattc tcacccacgt tggcaaggac 4860ggcaccgacg tctttgacac ctttcatccc gaggctgctt gggagactct cgccaacttc 4920tacgttggag acattgacga gtccgaccga gacatcaaga acgatgactt tgccgctgag 4980gtccgaaagc tgcgaaccct gttccagtct ctcggctact acgactcctc taaggcctac 5040tacgccttca aggtctcctt caacctctgc atctggggac tgtccaccgt cattgtggcc 5100aagtggggtc agacctccac cctcgccaac gtgctctctg ctgccctgct cggcctgttc 5160tggcagcagt gcggatggct ggctcacgac tttctgcacc accaggtctt ccaggaccga 5220ttctggggtg atctcttcgg agccttcctg ggaggtgtct gccagggctt ctcctcttcc 5280tggtggaagg acaagcacaa cactcaccat gccgctccca acgtgcatgg cgaggatcct 5340gacattgaca cccaccctct cctgacctgg tccgagcacg ctctggagat gttctccgac 5400gtccccgatg aggagctgac ccgaatgtgg tctcgattca tggtcctgaa ccagacctgg 5460ttctacttcc ccattctctc cttcgctcga ctgtcttggt gcctccagtc cattctcttt 5520gtgctgccca acggtcaggc tcacaagccc tccggagctc gagtgcccat ctccctggtc 5580gagcagctgt ccctcgccat gcactggacc tggtacctcg ctaccatgtt cctgttcatc 5640aaggatcctg tcaacatgct cgtgtacttc ctggtgtctc aggctgtgtg cggaaacctg 5700ctcgccatcg tgttctccct caaccacaac ggtatgcctg tgatctccaa ggaggaggct 5760gtcgacatgg atttctttac caagcagatc atcactggtc gagatgtcca tcctggactg 5820ttcgccaact ggttcaccgg tggcctgaac taccagatcg agcatcacct gttcccttcc 5880atgcctcgac acaacttctc caagatccag cctgccgtcg agaccctgtg caagaagtac 5940aacgtccgat accacaccac tggtatgatc gagggaactg ccgaggtctt ctcccgactg 6000aacgaggtct ccaaggccac ctccaagatg ggcaaggctc agtaagcggc cgcatgagaa 6060gataaatata taaatacatt gagatattaa atgcgctaga ttagagagcc tcatactgct 6120cggagagaag ccaagacgag tactcaaagg ggattacacc atccatatcc acagacacaa 6180gctggggaaa ggttctatat acactttccg gaataccgta gtttccgatg ttatcaatgg 6240gggcagccag gatttcaggc acttcggtgt ctcggggtga aatggcgttc ttggcctcca 6300tcaagtcgta ccatgtcttc atttgcctgt caaagtaaaa cagaagcaga tgaagaatga 6360acttgaagtg aaggaattta aattgccccg gagaagacgg ccaggccgcc tagatgacaa 6420attcaacaac tcacagctga ctttctgcca ttgccactag gggggggcct ttttatatgg 6480ccaagccaag ctctccacgt cggttgggct gcacccaaca ataaatgggt agggttgcac 6540caacaaaggg atgggatggg gggtagaaga tacgaggata acggggctca atggcacaaa 6600taagaacgaa tactgccatt aagactcgtg atccagcgac tgacaccatt gcatcatcta 6660agggcctcaa aactacctcg gaactgctgc gctgatctgg acaccacaga ggttccgagc 6720actttaggtt gcaccaaatg tcccaccagg tgcaggcaga aaacgctgga acagcgtgta 6780cagtttgtct taacaaaaag tgagggcgct gaggtcgagc agggtggtgt gacttgttat 6840agcctttaga gctgcgaaag cgcgtatgga tttggctcat caggccagat tgagggtctg 6900tggacacatg tcatgttagt gtacttcaat cgccccctgg atatagcccc gacaataggc 6960cgtggcctca tttttttgcc ttccgcacat ttccattgct cggtacccac accttgcttc 7020tcctgcactt gccaacctta atactggttt acattgacca acatcttaca agcggggggc 7080ttgtctaggg tatatataaa cagtggctct cccaatcggt tgccagtctc ttttttcctt 7140tctttcccca cagattcgaa atctaaacta cacatcacac aatgcctgtt actgacgtcc 7200ttaagcgaaa gtccggtgtc atcgtcggcg acgatgtccg agccgtgagt atccacgaca 7260agatcagtgt cgagacgacg cgttttgtgt aatgacacaa tccgaaagtc gctagcaaca 7320cacactctct acacaaacta acccagctct ccatggagtc cattgctccc ttcctgccct 7380ccaagatgcc tcaggacctg ttcatggacc tcgccagcgc tatcggtgtc cgagctgctc 7440cctacgtcga tcccctggag gctgccctgg ttgcccaggc cgagaagtac attcccacca 7500ttgtccatca cactcgaggc ttcctggttg ccgtggagtc tcccctggct cgagagctgc 7560ctctgatgaa ccccttccac gtgctcctga tcgtgctcgc ctacctggtc accgtgtttg 7620tgggtatgca gatcatgaag aactttgaac gattcgaggt caagaccttc tccctcctgc 7680acaacttctg tctggtctcc atctccgcct acatgtgcgg tggcatcctg tacgaggctt 7740atcaggccaa ctatggactg tttgagaacg ctgccgatca caccttcaag ggtctcccta 7800tggctaagat gatctggctc ttctacttct ccaagatcat ggagtttgtc gacaccatga 7860tcatggtcct caagaagaac aaccgacaga tttcctttct gcacgtgtac caccactctt 7920ccatcttcac catctggtgg ctggtcacct tcgttgctcc caacggtgaa gcctacttct 7980
ctgctgccct gaactccttc atccacgtca tcatgtacgg ctactacttt ctgtctgccc 8040
tgggcttcaa gcaggtgtcg ttcatcaagt tctacatcac tcgatcccag atgacccagt 8100
tctgcatgat gtctgtccag tcttcctggg acatgtacgc catgaaggtc cttggccgac 8160
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tcttctacaa cttttaccga aagaacgcca agctcgccaa gcaggccaag gctgacgctg 8280
ccaaggagaa ggccagaaag ctccagtaag cggccgcaag tgtggatggg gaagtgagtg 8340
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tgcgtatcat agtctttgat gtatatcgta ttcattcatg ttagttgcgt acgaagtcgt 8640
caatgatgtc gatatgggtt ttgatcatgc acacataagg tccgacctta tcggcaagct 8700
caatgagctc cttggtggtg gtaacatcca gagaagcaca caggttggtt ttcttggctg 8760
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aggagggcat tttggtggtg aagaggagac tgaaataaat ttagtctgca gaacttttta 8880
tcggaacctt atctggggca gtgaagtata tgttatggta atagttacga gttagttgaa 8940
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acgaagaatg tatcgtcaaa gtgatccaag cacactcata gttggagtcg tactccaaag 9180
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gcgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 9480
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gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 9660
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gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 9780gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 9840
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ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 9960
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 10020
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 10080
gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 10140
taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 10200
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tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 10320
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 10380
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 10440
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cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 10560
gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 10620
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ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 10740
aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 10800
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aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 11040
acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 11100
ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 11160
tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 11220
aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 11280
catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 11340
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tcaggaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 11520
ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 11580
cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 11640ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 11700accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 11760gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa 11820gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac 11880caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tccattcgcc attcaggctg 11940cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa 12000gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt 12060tgtaaaacga cggccagtga attgtaatac gactcactat agggcgaatt gggcccgacg 12120tcgcatgcag tggtggtatt gtgactgggg atgtagttga gaataagtca tacacaagtc 12180agctttcttc gagcctcata taagtataag tagttcaacg tattagcact gtãcccagca 12240tctccgtatc gagaaacaca acaacatgcc ccattggaca gatcatgcgg atacacaggt 12300tgtgcagtat catacatact cgatcagaca ggtcgtctga ccatcataca agctgaacaa 12360gcgctccata cttgcacgct ctctatatac acagttaaat tacatatcca tagtctaacc 12420tctaacagtt aatcttctgg taagcctccc agccagcctt ctggtatcgc ttggcctcct 12480caataggatc tcggttctgg ccgtacagac ctcggccgac aattatgata tccgttccgg 12540tagacatgac atcctcaaca gttcggtact gctgtccgag agcgtctccc ttgtcgtcaa 12600gacccacccc gggggtcaga ataagccagt cctcagagtc gcccttaat 12649<210> 25 <211> 819 <212> DNA <213> Thraustochytri um aureum
<220>
<221> misc_feature
<223> elongase sintética (códon otimizada) de Yarrowia lipolytica<400> 25
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accatgctcg ccttcgaggt cggctacatg gccatgctgc tcttcggcat tcccatcatg 180
aagcagatgg agaagccctt cgagctgaag accatcaagc tgctccacaa cctgttcctc 240
ttcggactgt ccctctacat gtgcgtcgag accatccgac aggctatcct gggtggctac 300
aaggtcttcg gcaacgacat ggagaagggc aacgagtccc acgctcaggg catgtcccga 360
atcgtctacg tgttctacgt ctccaaggcc tacgagttcc tggacaccgc tatcatgatc 420
ctgtgcaaga agttcaacca ggtctccttc ctgcacgtgt accaccatgc caccatcttc 480gccatctggt gggctattgc caagtacgct cctggtggcg acgcctactt ctccgtcatc 540ctcaactcct tcgtccacac cgtcatgtac gcctactact tcttttcctc tcagggcttc 600ggcttcgtca agcccatcaa gccctacatc accactctgc agatgaccca gttcatggct 660atgctggtgc agtccctgta cgactacctc ttcccctgcg actaccctca ggctctggtc 720cagctgctcg gcgtgtacat gatcaccctg ctcgctctgt tcggcaactt ctttgtccag 780tcctacctga agaagcccaa gaagtccaag accaactaa 819
<210> 26<211> 272<212> PRT
<213> Thraustochytríum aureum<4 00> 26
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Gly Val Asp Gln Trp Met Asp Gly Ala Lys Pro Tyr Ala Leu Thr Asp20 25 30
Gly Leu Pro Met Met Asp Val Ser Thr Met Leu Ala Phe Glu Val Gly35 40 45
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Lys Pro Phe Glu Leu Lys Thr Ile Lys Leu Leu His Asn Leu Phe Leu65 70 75 80
Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Met Cys Val Glu Thr Ile Arg Gln Ala Ile85 90 95
Leu Gly Gly Tyr Lys Val Phe Gly Asn Asp Met Glu Lys Gly Asn Glu100 105 110
Ser His Ala Gln Gly Met Ser Arg Ile Val Tyr Val Phe Tyr Val Ser115 120 125
Lys Ala Tyr Glu Phe Leu Asp Thr Ala Ile Met Ile Leu Cys Lys Lys130 135 140
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Ala Ile Trp Trp Ala Ile Ala Lys Tyr Ala Pro Gly Gly Asp Ala Tyr165 170 175Phe Ser Val Ile Leu Asn Ser Phe Val His Thr Val Met Tyr Ala Tyr180 185 190
Tyr Phe Phe Ser Ser Gln Gly Phe Gly Phe Val Lys Pro Ile Lys Pro195 200 205
Tyr Ile Thr Thr Leu Gln Met Thr Gln Phe Met Ala Met Leu Val Gln210 215 220
Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Phe Pro Cys Asp Tyr Pro Gln Ala Leu Val225 230 235 240
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Phe Phe Val Gln Ser Tyr Leu Lys Lys Pro Lys Lys Ser Lys Thr Asn260 265 270
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador 5-1A
<400> 27
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gghcaycayr tbtayaccaa 20
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gghcaycayr tbtayacgaa
20<210> 30
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<212> DNA
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<220>
<223> Iniciador
artificial 5-1D
<400> 30
gghcaycayr tbtayactaa
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<212> DNA
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<220>
<223> Iniciador
artificial 5-5AR
<4 00> 31
tgrtgvacaa yytgrwartt
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<212> DNA
<213> Seqüência
<220>
<223> Iniciador
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<400> 32
tgrtgvacta yytgrwartt
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<213> Seqüência artificial<220>
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tgrtgvacca yytgrwartt
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
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tgrtgvacga yytgrwartt
<210> 35<211> 27<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador ODMW480<400> 35
ccgataccag tcaatttggt cagcctc
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador CDSIII 5'
<400> 36
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<210> 37
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<212> DNA
<213> Seqüência
<220>
<223> Iniciador
artificialODMW4 7 9
<400> 37
cttaaccttg cagttcttgt cggggatc
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador DNR CDS 5'<400> 38
caacgcagag tggccattac gg
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
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cacctcgcgc attgtccgct taacgtc
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artificial<220>
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<400> 40
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27
<210> 41
<211> 26<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador ODMW469<400> 41
cttcatcttc cggaccgcat tcttgc 26
<210> 42
<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador AUAP
<210> 43
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<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador C1DMW470
<400> 43
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<210> 44
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
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tttccatggc tctcagtctt accacagaac ag
32
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<213> Seqüência artificial
<220><223> Iniciador YL797<400> 45
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<210> 46
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<212> DNA
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<213> Seqüência artificial<220>
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Plasmideo pEgD5S
60120180240300360420480540600660720
<400> 48 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtcacagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtgttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgcaccatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgccattcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctattacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggttttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaatgcatctaga tccatggctc tctcccttac taccgagcag ctgctcgagc gacccgacctggttgccatc gacggcattc tctacgatct ggaaggtctt gccaaggtcc atcccggaggcgacttgatc ctcgcttctg gtgcctccga tgcttctcct ctgttctact ccatgcacccttacgtcaag cccgagaact cgaagctgct tcaacagttc gtgcgaggca agcacgaccgaacctccaag gacattgtct acacctacga ctctcccttt gcacaggacg tcaagcgaactatgcgagag gtcatgaaag gtcggaactg gtatgccaca cctggattct ggctgcgaac 780
cgttggcatc attgctgtca ccgccttttg cgagtggcac tgggctacta ccggaatggt 840
gctgtggggt ctcttgactg gattcatgca catgcagatc ggcctgtcca ttcagcacga 900
tgcctctcat ggtgccatca gcaaaaagcc ctgggtcaac gctctctttg cctacggcat 960
cgacgtcatt ggatcgtcca gatggatctg gctgcagtct cacatcatgc gacatcacac 1020
ctacaccaat cagcatggtc tcgacctgga tgccgagtcc gcagaaccat tccttgtgtt 1080
ccacaactac cctgctgcca acactgctcg aaagtggttt caccgattcc aggcctggta 1140
catgtacctc gtgcttggag cctacggcgt ttcgctggtg tacaaccctc tctacatctt 1200
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actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 2040
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tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 2340
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ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattgtaa tacgactcac tatagggcga 3060
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gtcacacaaa ccgatcttcg cctcaaggaa acctaattct acatccgaga gactgccgag 3180
atccagtcta cactgattaa ttttcgggcc aataatttaa aaaaatcgtg ttatataata 3240
ttatatgtat tatatatata catcatgatg atactgacag tcatgtccca ttgctaaata 3300
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atgaacttat ttttattact tagtattatt agacaactta cttgctttat gaaaaacact 3480
tcctatttag gaaacaattt ataatggcag ttcgttcatt taacaattta tgtagaataa 3540
atgttataaa tgcgtatggg aaatcttaaa tatggatagc ataaatgata tctgcattgc 3600
ctaattcgaa atcaacagca acgaaaaaaa tcccttgtac aacataaata gtcatcgaga 3660
aatatcaact atcaaagaac agctattcac acgttactat tgagattatt attggacgag 3720
aatcacacac tcaactgtct ttctctcttc tagaaataca ggtacaagta tgtactattc 3780tcattgttca tacttctagt catttcatcc cacatattcc ttggatttct ctccaatgaa 3840tgacattcta tcttgcaaat tcaacaatta taataagata taccaaagta gcggtatagt 3900ggcaatcaaa aagcttctct ggtgtgcttc tcgtatttat ttttattcta atgatccatt 3960aaaggtatat atttatttct tgttatataa tccttttgtt tattacatgg gctggataca 4020taaaggtatt ttgatttaat tttttgctta aattcaatcc cccctcgttc agtgtcaact 4080gtaatggtag gaaattacca tacttttgaa gaagcaaaaa aaatgaaaga aaaaaaaaat 4140cgtatttcca ggttagacgt tccgcagaat ctagaatgcg gtatgcggta cattgttctt 4200cgaacgtaaa agttgcgctc cctgagatat tgtacatttt tgcttttaca agtacaagta 4260catcgtacaa ctatgtacta ctgttgatgc atccacaaca gtttgttttg tttttttttg 4320tttttttttt ttctaatgat tcattaccgc tatgtatacc tacttgtact tgtagtaagc 4380cgggttattg gcgttcaatt aatcatagac ttatgaatct gcacggtgtg cgctgcgagt 4440tacttttagc ttatgcatgc tacttgggtg taatattggg atctgttcgg aaatcaacgg 4500atgctcaatc gatttcgaca gtaattaatt aagtcataca caagtcagct ttcttcgagc 4560ctcatataag tataagtagt tcaacgtatt agcactgtac ccagcatctc cgtatcgaga 4620aacacaacaa catgccccat tggacagatc atgcggatac acaggttgtg cagtatcata 4680catactcgat cagacaggtc gtctgaccat catacaagct gaacaagcgc tccatacttg 4740cacgctctct atatacacag ttaaattaca tatccatagt ctaacctcta acagttaatc 4800ttctggtaag cctcccagcc agccttctgg tatcgcttgg cctcctcaat aggatctcgg 4860ttctggccgt acagacctcg gccgacaatt atgatatccg ttccggtaga catgacatcc 4920tcaacagttc ggtactgctg tccgagagcg tctcccttgt cgtcaagacc caccccgggg 4980gtcagaataa gccagtcctc agagtcgccc ttaggtcggt tctgggcaat gaagccaacc 5040acaaactcgg ggtcggatcg ggcaagctca atggtctgct tggagtactc gccagtggcc 5100agagagccct tgcaagacag ctcggccagc atgagcagac ctctggccag cttctcgttg 5160ggagagggga ctaggaactc cttgtactgg gagttctcgt agtcagagac gtcctccttc 5220ttctgttcag agacagtttc ctcggcacca gctcgcaggc cagcaatgat tccggttccg 5280ggtacaccgt gggcgttggt gatatcggac cactcggcga ttcggtgaca ccggtactgg 5340tgcttgacag tgttgccaat atctgcgaac tttctgtcct cgaacaggaa gaaaccgtgc 5400ttaagagcaa gttccttgag ggggagcaca gtgccggcgt aggtgaagtc gtcaatgatg 5460tcgatatggg ttttgatcat gcacacataa ggtccgacct tatcggcaag ctcaatgagc 5520tccttggtgg tggtaacatc cagagaagca cacaggttgg ttttcttggc tgccacgagc 5580ttgagcactc gagcggcaaa ggcggacttg tggacgttag ctcgagcttc gtaggagggc 5640attttggtgg tgaagaggag actgaaataa atttagtctg cagaactttt tatcggaacc 5700ttatctgggg cagtgaagta tatgttatgg taatagttac gagttagttg aacttataga 5760tagactggac tatacggcta tcggtccaaa ttagaaagaa cgtcaatggc tctctgggcg 5820tcgcctttgc cgacaaaaat gtgatcatga tgaaagccag caatgacgtt gcagctgata 5880ttgttgtcgg ccaaccgcgc cgaaaacgca gctgtcagac ccacagcctc caacgaagaa 5940tgtatcgtca aagtgatcca agcacactca tagttggagt cgtactccaa aggcggcaat 6000gacgagtcag acagatactc gtcgactcag gcgacgacgg aattcctgca gcccatctgc 6060agaattcagg agagaccggg ttggcggcgt atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc 6120cccggagaag acggccaggc cgcctagatg acaaattcaa caactcacag ctgactttct 6180gccattgcca ctaggggggg gcctttttat atggccaagc caagctctcc acgtcggttg 6240ggctgcaccc aacaataaat gggtagggtt gcaccaacaa agggatggga tggggggtag 6300aagatacgag gataacgggg ctcaatggca caaataagaa cgaatactgc cattaagact 6360cgtgatccag cgactgacac cattgcatca tctaagggcc tcaaaactac ctcggaactg 6420ctgcgctgat ctggacacca cagaggttcc gagcacttta ggttgcacca aatgtcccac 6480caggtgcagg cagaaaacgc tggaacagcg tgtacagttt gtcttaacaa aaagtgaggg 6540cgctgaggtc gagcagggtg gtgtgacttg ttatagcctt tagagctgcg aaagcgcgta 6600tggatttggc tcatcaggcc agattgaggg tctgtggaca catgtcatgt tagtgtactt 6660caatcgcccc ctggatatag ccccgacaat aggccgtggc ctcatttttt tgccttccgc 6720acatttccat tgctcggtac ccacaccttg cttctcctgc acttgccaac cttaatactg 6780gtttacattg accaacatct tacaagcggg gggcttgtct agggtatata taaacagtgg 6840ctctcccaat cggttgccag tctctttttt cctttctttc cccacagatt cgaaatctaa 6900actacacatc acacaatgcc tgttactgac gtccttaagc gaaagtccgg tgtcatcgtc 6960ggcgacgatg tccgagccgt gagtatccac gacaagatca gtgtcgagac gacgcgtttt 7020gtgtaatgac acaatccgaa agtcgctagc aacacacact ctctacacaa actaacccag 7080ctctccatgg ctctctccct tactaccgag cagctgctcg agcgacccga cctggttgcc 7140atcgacggca ttctctacga tctggaaggt cttgccaagg tccatcccgg aggcgacttg 7200atcctcgctt ctggtgcctc cgatgcttct cctctgttct actccatgca cccttacgtc 7260aagcccgaga actcgaagct gcttcaacag ttcgtgcgag gcaagcacga ccgaacctcc 7320aaggacattg tctacaccta cgactctccc tttgcacagg acgtcaagcg aactatgcga 7380gaggtcatga aaggtcggaa ctggtatgcc acacctggat tctggctgcg aaccgttggc 7440atcattgctg tcaccgcctt ttgcgagtgg cactgggcta ctaccggaat ggtgctgtgg 7500ggtctcttga ctggattcat gcacatgcag atcggcctgt ccattcagca cgatgcctctcatggtgcca tcagcaaaaa gccctgggtc aacgctctct ttgcctacgg catcgacgtcattggatcgt ccagatggat ctggctgcag tctcacatca tgcgacatca cacctacaccaatcagcatg gtctcgacct ggatgccgag tccgcagaac cattccttgt gttccacaactaccctgctg ccaacactgc tcgaaagtgg tttcaccgat tccaggcctg gtacatgtacctcgtgcttg gagcctacgg cgtttcgctg gtgtacaacc ctctctacat cttccgaatgcagcacaacg acaccattcc cgagtctgtc acagccatgc gagagaacgg ctttctgcgacggtaccgaa cccttgcatt cgttatgcga gctttcttca tctttcgaac cgccttcttgccctggtatc tcactggaac ctccctgctc atcaccattc ctctggtgcc cactgctaccggtgccttcc tcaccttctt tttcatcttg tctcacaact tcgatggctc ggagcgaatccccgacaaga actgcaaggt caagagctcc gagaaggacg ttgaagccga tcagatcgactggtacagag ctcaggtgga gacctcttcc acctacggtg gacccattgc catgttctttactggcggtc tcaacttcca gatcgagcat cacctctttc ctcgaatgtc gtcttggcactatcccttcg tgcagcaagc tgtccgagag tgttgcgaac gacacggagt tcggtacgtcttctacccta ccattgtggg caacatcatt tccaccctca agtacatgca caaagtcggtgtggttcact gtgtcaagga cgctcaggat tcctaagc <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Seqüência artificial
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<220>
<223> Iniciador Τ7<400> 50
ggaaacagct atgaccatg 19
<210> 51<211> 459<212> PRT
<213> Rhizopus stolonifer (GenBank Accession η° ΑΑΧ22052)<400> 51
Met Ser Thr Leu Asp Arg Gln Ser Ile Phe Thr Ile Lys Glu Leu Glu1 5 10 15
Ser Ile Ser Gln Arg Ile His Asp Gly Asp Glu Glu Ala Met Lys Phe20 25 30
Ile Ile Ile Asp Lys Lys Val Tyr Asp Val Thr Glu Phe Ile Glu Asp35 40 45His Pro Gly Gly Ala Gln Val Leu Leu Thr His Val Gly Lys Asp Ala50 55 60
Ser Asp Val Phe His Ala Met His Pro Glu Ser Ala Tyr Glu Val Leu65 70 75 80
Asn Asn Tyr Phe Val Gly Asp Val Gln Glu Thr Val Val Thr Glu Lys85 90 95
Ser Ser Ser Ala Gln Phe Ala Val Glu Met Arg Gln Leu Arg Asp Gln100 105 110
Leu Lys Lys Glu Gly Tyr Phe His Ser Ser Lys Leu Phe Tyr Ala Tyr115 120 125
Lys Val Leu Ser Thr Leu Ala Ile Cys Ile Ala Gly Leu Ser Leu Leu130 135 140
Tyr Ala Tyr Gly Arg Thr Ser Thr Leu Ala Val Val Ala Ser Ala Ile145 150 155 160
Thr Val Gly Ile Phe Trp Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe165 170 175
Gly His His Gln Cys Phe Glu Asp Arg Thr Trp Asn Asp Val Leu Val180 185 190
Val Phe Leu Gly Asn Phe Cys Gln Gly Phe Ser Leu Ser Trp Trp Lys195 200 205
Asn Lys His Asn Thr His His Ala Ser Thr Asn Val His Gly Gln Asp210 215 220
Pro Asp Ile Asp Thr Ala Pro Val Leu Leu Trp Asp Glu Tyr Ala Ser225 230 235 240
Ala Ala Tyr Tyr Ala Ser Leu Asp Gln Glu Pro Thr Met Val Ser Arg245 250 255
Phe Leu Ala Glu Gln Val Leu Pro His Gln Thr Arg Tyr Phe Phe Phe260 265 270
Ile Leu Ala Phe Ala Arg Leu Ser Trp Ala Leu Gln Ser Leu Ser Tyr275 280 285Ser Phe Lys Lys Glu Ser Ile Asn Lys Ser Arg Gln Leu Asn Leu Phe290 295 300
Glu Arg Val Cys Ile Val Gly His Trp Ala Leu Phe Ala Phe Cys Ile305 310 315 320
Tyr Ser Trp Cys Ser Asn Val Tyr His Met Val Leu Phe Phe Leu Val325 330 335
Ser Gln Ala Thr Thr Gly Tyr Thr Leu Ala Leu Val Phe Ala Leu Asn340 345 350
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Leu Gly Asp Trp Phe Met Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His385 390 395 400
Val Phe Pro Asn Met Pro Arg His Asn Leu Pro Thr Val Lys Pro Met405 410 415
Val Lys Ser Leu Cys Gln Lys Tyr Asp Ile Asn Tyr His Asp Thr Gly420 425 430
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Lys Leu Ser Leu Gln Leu Ser Lys Lys Ser Phe450 455
<210> 52<211> 695<212> DNA
<213> Pavlova lutherl<400> 52
agggccaagg gtgccaacca ccttccacgt gagactacac accgtaggcc gatgggcaag 60
ggtggagacg gcggcgcgca ggcggtgagc gggaccgacg cgtctctcgc tgaggtgagc 120tccgtcgata gcaagagcgt gcacgtcgtg ctctacggca agcgcgtgga tgtcacaaag 180ttccagggct acgacgtggc ctggtggcgc gcgcgccata acacgcacca cgtgtgcacc 240aacgaggatg gttcggaccc ggacatcaag acggcgcccc tgctcatcta cgtgcgagag 300aacccgtcca ttgccaagcg gctcaacttc ttccagcgct ggcagcagta ctactatgtg 360ccgaccatgg ccatcctcga cctctactggcgcctgccta agatgtggat gcaggccgcctgggtcttcg cagcgcatct caacctcatcacgggcatcg ttgtctttgc aacccactatgagggcatga cgctcgtcga gcagaccgccctagtgaacg tgctcacggg cttcatctcc
<210> 53
<211> 1106
<212> DNA
<213> Pavlova Iutheri
<400> 53 agggccaagg gtgccaacca ccttccacgtggtggagacg gcggcgcgca ggcggtgagctccgtcgata gcaagagcgt gcacgtcgtgttccagggct acgacgtggc ctggtggcgcaacgaggatg gttcggaccc ggacatcaagaacccgtcca ttgccaagcg gctcaacttcccgaccatgg ccatcctcga cctctactggcgcctgccta agatgtggat gcaggccgcctgggtcttcg cagcgcatct caacctcatcacgggcatcg ttgtctttgc aacccactatgagggcatga cgctcgtcga gcagaccgccctagtgaacg tgctcacggg cttcatctccatgcccaccg gcaacctaat gactatccagggcctcgagt accgcgaggg caacctcttcgccttcgagc acctcctcca ctgagcgtcagtcttctgac cgatggccgc gcggctccctgcgggatcgg gcacgatcgg gcctccatgactccgcatcg tgagaaatct tttaaagcagtaacattacc caaaaaaaaa aaaaaa
<210> 54<211> 287<212> PRT
<213> Pavlova Iutheri
57
cgcctggagt ccatcgcgta cgtggctgtg 420gctcttgccg ctcactacgc gctcctgtgc 480cctctcatga tggttgcacg cggcttcgcg 540ggtgaggaca tcctcgaccg cgagcacgtc 600aagacctccc gtaacatcac gggcggctgg 660ctgca 695gagactacac accgtaggcc gatgggcaag 60gggaccgacg cgtctctcgc tgaggtgagc 120ctctacggca agcgcgtgga tgtcacaaag 180gcgcgccata acacgcacca cgtgtgcacc 240acggcgcccc tgctcatcta cgtgcgagag 300ttccagcgct ggcagcagta ctactatgtg 360cgcctggagt ccatcgcgta cgtggctgtg 420gctcttgccg ctcactacgc gctcctgtgc 480cctctcatga tggttgcacg cggcttcgcg 540ggtgaggaca tcctcgaccg cgagcacgtc 600aagacctccc gtaacatcac gggcggctgg 660ctgcagaccg agcatcacct cttccccatg 720cccgaggtac gcgacttctt caagaagcat 780cagtgcgtgc accagaacat caaggctctc 840ccactcaagc gtcctaagtg cacaggtact 900cggctggcag tggggccaac gagtggcctc 960aacttcagtg ttcagagaca agccgacaac 1020tatgttccat cacgccgctt ttgcagtcaa 1080
1106<400> 54
Arg Ala Lys Gly Ala Asn His Leu Pro Arg Glu Thr Thr His Arg Arg1 5 10 15
Pro Met Gly Lys Gly Gly Asp Gly Gly Ala Gln Ala Val Ser Gly Thr20 25 30
Asp Ala Ser Leu Ala Glu Val Ser Ser Val Asp Ser Lys Ser Val His35 40 45
Val Val Leu Tyr Gly Lys Arg Val Asp Val Thr Lys Phe Gln Gly Tyr50 55 60
Asp Val Ala Trp Trp Arg Ala Arg His Asn Thr His His Val Cys Thr65 70 75 80
Asn Glu Asp Gly Ser Asp Pro Asp Ile Lys Thr Ala Pro. Leu Leu Ile85 90 95
Tyr Val Arg Glu Asn Pro Ser Ile Ala Lys Arg Leu Asn Phe Phe Gln100 105 110
Arg Trp Gln Gln Tyr Tyr Tyr Val Pro Thr Met Ala Ile Leu Asp Leu115 120 125
Tyr Trp Arg Leu Glu Ser Ile Ala Tyr Val Ala Val Arg Leu Pro Lys130 135 140
Met Trp Met Gln Ala Ala Ala Leu Ala Ala His Tyr Ala Leu Leu Cys145 150 155 160
Trp Val Phe Ala Ala His Leu Asn Leu Ile Pro Leu Met Met Val Ala165 170 175
Arg Gly Phe Ala Thr Gly Ile Val Val Phe Ala Thr His Tyr Gly Glu180 185 190
Asp Ile Leu Asp Arg Glu His Val Glu Gly Met Thr Leu Val Glu Gln195 200 205
Thr Ala Lys Thr Ser Arg Asn Ile Thr Gly Gly Trp Leu Val Asn Val210 215 220
Leu Thr Gly Phe Ile Ser Leu Gln Thr Glu His His Leu Phe Pro Met225 230 235 240Met Pro Thr Gly Asn Leu245
Met Thr Ile Gln Pro Glu Val250
Arg Asp Phe255
Phe Lys Lys His260
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Phe Gln Cys270
Val His Gln Asn Ile Lys Ala Leu Ala Phe Glu His Leu Leu His
275
280
285
<210> 55<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador SeqE<400> 55
cgacacactc caatctttcc 20
<210> 56<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador SeqW
<210> 57<211> 22<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador APl<4 00> 57
gtaatacgac tcactatagg gc 22
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador GSP PvDES
<4 00> 56
ggtggctgga gttagacatc
20
<4 00> 58
ctgcgaagac ccagcacagg
20
<210> 59<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador M13-28Rev
<4 00> 59
gtaatacgac tcactatagg gc 22
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador PavDes seq
<400> 60
ttgtggcgct caatcatctc c 21
<210> 61<211> 1294<212> DNA
<213> Pavlova Iutheri<4 00> 61
ctttgcgagc gcggcgcaga cgattgcggc ccgtagtgat cgcggtgcgc attgctgtgt 60
ttctagtttt gctgacgccc ggcccgataa tgacaccttc tcccgtttga aatactaata 120
agtaactata ttataatatt caaaggtggc gactatggat ctccttttct aaagttcagc 180
ggaattggga atcggagaaa tttcgagata tgtcataatc acgtgctcta tctcgaatga 240
accgcggccg gtgagcgatt actcgggaag ccaattccta ttaacgagtc aggggggatc 300
tttgaggtga gtcggccacg cagagagagc aaggaatcat cctcatccgc cgttctcgag 360
aaagagccaa gggtgccaac caccttccac gtgagactac acaccgtagg ccgatgggca 420
agggtggaga cggcggcgcg caggcggcga gcgggaccga cgcatctctc gctgaggtga 480
gctccgtcga tagcaagagc gtgcgcgtcg tgctctacgg caagcgcgtg gatgtcacaa 540
agttccagag ggcacacccg ggcgggagca aggtgttccg catcttccag gagcgcgacg 600
cgacggagca gttcgagtct taccactcgc ccaaggccat caagatgatg gagggcatgc 660
tcaagaagtc ggaggatgcg cccgcttccg tgcccctgcc ctcgcggtcc accatgggca 720
cggagttcaa ggagatgatt gagcgccaca agagggctgg tctctacgac ccttgcccgt 780
tggacgagct gttcaagctc accatcgtcc ttgcgcccat cttcgtgggc gcctatctcg 840
tgcggagcgg cgtctcgccc ctcgcgggcg cgctctccat gggctttggc ttctacctcg 900
acggctggct tgctcacrac tacctgcatc acgcagtctt caagggctcg gtcaacacgc 960
tcgtcaaggc gaacaacgcc atgggatacg ccctcggctt cctccagggc tacgacgtgg 1020cctggtggcg cgcgcgccat aacacgcacc acgtgtgcac caacgaggat ggttcggacc 1080cggacatcaa gacggcgccc ctgctcatct acgtgcgaga gaacccgtcc attgccaagc 1140ggctcaactt cttccagcgc tggcagcagt actactatgt gccgaccatg gccatcctcg 1200acctctactg gcgcctggag tccatcgcgt acgtggctgt gcgcctgcct aagatgtgga 1260tgcaggccgc cgctcttgcc gctcactacg cgct 1294<210> 62 <211> 1927 <212> DNA <213> Pavlova lutheri <400> 62 ctttgcgagc gcggcgcaga cgattgcggc ccgtagtgat cgcggtgcgc attgctgtgt 60ttctagtttt gctgacgccc ggcccgataa tgacaccttc tcccgtttga aatactaata 120agtaactata ttataatatt caaaggtggc gactatggat ctccttttct aaagttcagc 180ggaattggga atcggagaaa tttcgagata tgtcataatc acgtgctcta tctcgaatga 240accgcggccg gtgagcgatt actcgggaag ccaattccta ttaacgagtc aggggggatc 300tttgaggtga gtcggccacg cagagagagc aaggaatcat cctcatccgc cgttctcgag 360aaagagccaa gggtgccaac caccttccac gtgagactac acaccgtagg ccgatgggca 420agggtggaga cggcggcgcg caggcggtga gcgggaccga cgcgtctctc gctgaggtga 480gctccgtcga tagcaagagc gtgcacgtcg tgctctacgg caagcgcgtg gatgtcacaa 540agttccagaa ggcacacccg ggcgggagca aggtgttccg catcttccag gagcgcgacg 600cgacggagca gttcgagtct taccactcgc ccaaggccat caagatgatg gagggcatgc 660tcaagaagtc ggaggatgcg cccgcttccg tgcccctgcc ctcgcggtcc accatgggca 720cggagttcaa ggagatgatt gagcgccaca agagggctgg tctctacgac ccttgcccgt 780tggacgagct gttcaagctc accatcgtcc ttgcgcccat cttcgtgggc gcctatctcg 840tgcggagcgg cgtctcgccc ctcgcgggcg cgctctccat gggctttggc ttctacctcg 900acggctggct tgctcacgac tacctgcatc acgcagtctt caagggctcg gtcaacacgc 960tcgtcaaggc gaacaacgcc atgggatacg ccctcggctt cctccagggc tacgacgtgg 1020cctggtggcg cgcgcgccat aacacgcacc acgtgtgcac caacgaggat ggttcggacc 1080cggacatcaa gacggcgccc ctgctcatct acgtgcgaga gaacccgtcc attgccaagc 1140ggctcaactt cttccagcgc tggcagcagt actactatgt gccgaccatg gccatcctcg 1200acctctactg gcgcctggag tccatcgcgt acgtggctgt gcgcctgcct aagatgtgga 1260tgcaggccgc cgctcttgcc gctcactacg cgctcctgtg ctgggtcttc gcagcgcatc 1320tcaacctcat ccctctcatg atggttgcac gcggcttcgc gacgggcatc gttgtctttgcaacccacta tggtgaggac atcctcgacc gcgagcacgt cgagggcatg acgctcgtcgagcagaccgc caagacctcc cgtaacatca cgggcggctg gctagtgaac gtgctcacgggcttcatctc cctgcagacc gagcatcacc tcttccccat gatgcccacc ggcaacctaatgactatcca gcccgaggta cgcgacttct tcaagaagca tggcctcgag taccgcgagggcaacctctt ccagtgcgtg caccagaaca tcaaggctct cgccttcgag cacctcctccactgagcgtc accactcaag cgtcctaagt gcacaggtac tgtcttctga ccgatggccgcgcggctccc tcggctggca gtggggccaa cgagtggcct cgcgggatcg ggcacgatcgggcctccatg aaacttcagt gttcagagac aagccgacaa cctccgcatc gtgagaaatcttttaaagca gtatgttcca tcacgccgct tttgcagtca ataacattac ccaaaaaaaa
1380144015001560162016801740180018601920
aaaaaaa 1927
<210> 63<211> 459<212> PRT
<213> Rhizopus stolonifer (GenBank Accession η° ΑΒΒ96724)<400> 63
Met Ser Thr Leu Asp Arg Gln Ser Ile Phe Thr Ile Lys Glu Leu Glu15 10 15
Ser Ile Ser Gln Arg Ile His Asp Gly Asp Glu Glu Ala Met Lys Phe20 25 30
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His Pro Gly Gly Ala Gln Val Leu Leu Thr His Val Gly Lys Asp Ala50 55 60
Ser Asp Val Phe His Ala Met His Pro Glu Ser Ala Tyr Glu Val Leu65 70 75 80
Asn Asn Tyr Phe Val Gly Asp Val Gln Glu Thr Val Val Thr Glu Lys85 90 95
Ser Ser Ser Ala Gln Phe Ala Val Glu Met Arg Gln Leu Arg Asp Gln100 105 110
Leu Lys Lys Glu Gly Tyr Phe His Ser Ser Lys Leu Phe Tyr Ala Tyr115 120 125Lys Val Leu Ser Thr Leu Ala Ile Cys Ile Ala Gly Leu Ser Pro Leu130 135 140
Tyr Ala Tyr Gly Arg Thr Ser Thr Leu Ala Val Val Ala Ser Ala Ile145 150 155 160
Thr Val Gly Ile Phe Trp Gln Gln Cys Gly Trp Leu Ala His Asp Phe165 170 175
Gly His His Gln Cys Phe Glu Asp Arg Thr Trp Asn Asp Val Leu Val180 185 190
Val Phe Leu Gly Asn Phe Cys Gln Gly Phe Ser Leu Ser Trp Trp Lys195 200 205
Asn Lys His Asn Thr His His Ala Ser Thr Asn Val His Gly Gln Asp210 215 220
Pro Asp Ile Asp Thr Ala Pro Val Leu Leu Trp Asp Glu Tyr Ala Ser225 230 235 240
Ala Ala Tyr Tyr Ala Ser Leu Asp Gln Glu Pro Thr Met Val Ser Arg245 250 255
Phe Leu Ala Glu Gln Val Leu Pro His Gln Thr Arg Tyr Phe Phe Phe260 265 270
Ile Leu Ala Phe Ala Arg Leu Ser Trp Ala Leu Gln Ser Leu Ser Tyr275 280 285
Ser Phe Lys Lys Glu Ser Ile Asn Lys Ser Arg Gln Leu Asn Leu Phe290 295 300
Glu Arg Val Cys Ile Val Gly His Trp Ala Leu Ser Ala Phe Cys Ile305 310 315 320
Tyr Ser Trp Cys Ser Asn Val Tyr His Met Val Leu Phe Phe Leu Val325 330 335
Ser Gln Ala Thr Thr Gly Tyr Thr Leu Ala Leu Val Phe Ala Leu Asn340 345 350
His Asn Gly Met Pro Val Ile Thr Glu Glu Lys Ala Glu Ser Met Glu355 360 365
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Val Phe Pro Asn Met Pro Arg His Asn Leu Pro Thr Val Lys Pro Met405 410 415
Val Lys Ser Leu Cys Gln Lys Tyr Asp Ile Asn Tyr His Asp Thr Gly420 425 430
Phe Leu Lys Gly Thr Leu Glu Val Leu Gln Thr Leu Asp Ile Thr Ser435 440 445
Lys Leu Ser Leu Gln Leu Ser Lys Lys Ser Phe450 455
<210> 64
<211> 427
<212> PRT
<213> Pavlova salina
<300>
<302> SÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA POR
CÉLULAS RECOMBINANTES
<310> WO 2005/103253
<311> 2005-04-22
<312> 2005-11-03
<313> (1) .. (427)
<400> 64
Met Gly Arg Gly Gly Asp Ser Ser Gly Gln Ala His Pro Ala Ala Glu15 10 15
Leu Ala Val Pro Ser Asp Arg Ala Glu Val Ser Asn Ala Asp Ser Lys20 25 30
Ala Leu His Ile Val Leu Tyr Gly Lys Arg Val Asp Val Thr Lys Phe35 40 45
Gln Arg Thr His Pro Gly Gly Ser Lys Val Phe Arg Ile Phe Gln Asp50 55 60
Arg Asp Ala Thr Glu Gln Phe Glu Ser Tyr His Ser Lys Arg Ala Ile65 70 75 80
Lys Met Met Glu Gly Met Leu Lys Lys Ser Glu Asp Ala Pro Ala Asp85 90 95
Thr Pro Leu Pro Ser Gln Ser Pro Met Gly Lys Asp Phe Lys Ala Met100 105 110Ile Glu Arg His Val Ala Ala Gly Tyr Tyr Asp Pro Cys Pro Leu Asp115 120 125
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Val Ser Phe Gly Trp Tyr Leu Asp Gly Trp Leu Ala His Asp Tyr Leu165 170 175
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Asn Ala Ala Gly Tyr Phe Leu Gly Phe Val Gln Gly Tyr Ala Val Glu195 200 205
Trp Trp Arg Ala Arg His Asn Thr His His Val Cys Thr Asn Glu Asp210 215 220
Gly Ser Asp Pro Asp Ile Lys Thr Ala Pro Leu Leu Ile Tyr Val Arg225 230 235 240
Asn Lys Pro Ser Ile Ala Lys Arg Leu Asn Ala Phe Gln Arg Tyr Gln245 250 255
Gln Tyr Tyr Tyr Val Pro Val Met Ala Ile Leu Asp Leu Tyr Trp Arg260 265 270
Leu Glu Ser Ile Ala Tyr Val Ala Met Arg Leu Pro Lys Met Leu Pro275 280 285
Gln Ala Leu Ala Leu Val Ala His Tyr Ala Ile Val Ala Trp Val Phe290 295 300
Ala Gly Asn Tyr His Leu Leu Pro Leu Val Thr Val Leu Arg Gly Phe305 310 315 320
Gly Thr Gly Ile Thr Val Phe Ala Thr His Tyr Gly Glu Asp Ile Leu325 330 335
Asp Ala Asp Gln Val Arg His Met Thr Leu Val Glu Gln Thr Ala Leu340 345 350Thr Ser Arg Asn Ile Ser Gly Gly Trp Leu Val Asn Val Leu Thr Gly355 360 365
Phe Ile Ser Leu Gln Thr Glu His His Leu Phe Pro Met Met Pro Thr370 375 380
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Asn Ile Arg Ala Leu Ala Phe Glu His Leu Leu420 425
<210> 65
<211> 37
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador AP
<400> 65
ggccacgcgt cgactagtac tttttttttt ttttttt 37
<210> 66
<211> 39
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador oligonucleotideo Smart IV
<4 00> 66
aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccggg 39
<210> 67
<211> 1338
<212> DNA
<213> Mortierella alpina
<4 00> 67 atgggaacgg accaaggaaa aaccttcacc tgggaagagc tggcggccca taacaccaag 60gacgacctac tcttggccat ccgcggcagg gtgtacgatg tcacaaagtt cttgagccgc 120catcctggtg gagtggacac tctcctgctc ggagctggcc gagatgttac tccggtcttt 180gagatgtatc acgcgtttgg ggctgcagat gccattatga agaagtacta tgtcggtaca 240ctggtctcga atgagctgcc catcttcccg gagccaacgg tgttccacaa aaccatcaag 300acgagagtcg agggctactt tacggatcgg aacattgatc ccaagaatag accagagatc 360tggggacgat acgctcttat ctttggatcc ttgatcgctt cctactacgc gcagctcttt 420gtgcctttcg ttgtcgaacg cacatggctt caggtggtgt ttgcaatcat catgggattt 480gcgtgcgcac aagtcggact caaccctctt catgatgcgt ctcacttttc agtgacccac 540aaccccactg tctggaagat tctgggagcc acgcacgact ttttcaacgg agcatcgtac 600ctggtgtgga tgtaccaaca tatgctcggc catcacccct acaccaacat tgctggagca 660gatcccgacg tgtcgacgtc tgagcccgat gttcgtcgta tcaagcccaa ccaaaagtgg 720tttgtcaacc acatcaacca gcacatgttt gttcctttcc tgtacggact gctggcgttc 780aaggtgcgca ttcaggacat caacattttg tactttgtca agaccaatga cgctattcgt 840gtcaatccca tctcgacatg gcacactgtg atgttctggg gcggcaaggc tttctttgtc 900tggtatcgcc tgattgttcc cctgcagtat ctgcccctgg gcaaggtgct gctcttgttc 960acggtcgcgg acatggtgtc gtcttactgg ctggcgctga ccttccaggc gaaccacgtt 1020gttgaggaag ttcagtggcc gttgcctgac gagaacggga tcatccaaaa ggactgggca 1080gctatgcagg tcgagactac gcaggattac gcacacgatt cgcacctctg gaccagcatc 1140actggcagct tgaactacca ggctgtgcac catctgttcc ccaacgtgtc gcagcaccat 1200tatcccgata ttctggccat catcaagaac acctgcagcg agtacaaggt tccatacctt 1260gtcaaggata cgttttggca agcatttgct tcacatttgg agcacttgcg tgttcttgga 1320ctccgtccca aggaagag 1338
<210> 68<211> 446<212> PRT
<213> Mortierella alpina<400> 68
Met Gly Thr Asp Gln Gly Lys Thr Phe Thr Trp Glu Glu Leu Ala Ala1 5 10 15
His Asn Thr Lys Asp Asp Leu Leu Leu Ala Ile Arg Gly Arg Val Tyr20 25 30
Asp Val Thr Lys Phe Leu Ser Arg His Pro Gly Gly Val Asp Thr Leu35 40 45
Leu Leu Gly Ala Gly Arg Asp Val Thr Pro Val Phe Glu Met Tyr His50 55 60
Ala Phe Gly Ala Ala Asp Ala Ile Met Lys Lys Tyr Tyr Val Gly Thr65 70 75 80Leu Val Ser Asn Glu Leu Pro Ile Phe Pro Glu Pro Thr Val Phe His85 90 95
Lys Thr Ile Lys Thr Arg Val Glu Gly Tyr Phe Thr Asp Arg Asn Ile100 105 110
Asp Pro Lys Asn Arg Pro Glu Ile Trp Gly Arg Tyr Ala Leu Ile Phe115 120 125
Gly Ser Leu Ile Ala Ser Tyr Tyr Ala Gln Leu Phe Val Pro Phe Val130 135 140
Val Glu Arg Thr Trp Leu Gln Val Val Phe Ala Ile Ile Met Gly Phe145 150 155 160
Ala Cys Ala Gln Val Gly Leu Asn Pro Leu His Asp Ala Ser His Phe165 170 175
Ser Val Thr His Asn Pro Thr Val Trp Lys Ile Leu Gly Ala Thr His180 185 190
Asp Phe Phe Asn Gly Ala Ser Tyr Leu Val Trp Met Tyr Gln His Met195 200 205
Leu Gly His His Pro Tyr Thr Asn Ile Ala Gly Ala Asp Pro Asp Val210 215 220
Ser Thr Ser Glu Pro Asp Val Arg Arg Ile Lys Pro Asn Gln Lys Trp225 230 235 240
Phe Val Asn His Ile Asn Gln His Met Phe Val Pro Phe Leu Tyr Gly245 250 255
Leu Leu Ala Phe Lys Val Arg Ile Gln Asp Ile Asn Ile Leu Tyr Phe260 265 270
Val Lys Thr Asn Asp Ala Ile Arg Val Asn Pro Ile Ser Thr Trp His275 280 285
Thr Val Met Phe Trp Gly Gly Lys Ala Phe Phe Val Trp Tyr Arg Leu290 295 300
Ile Val Pro Leu Gln Tyr Leu Pro Leu Gly Lys Val Leu Leu Leu Phe305 310 315 320
Thr Val Ala Asp Met Val Ser Ser Tyr Trp Leu Ala Leu Thr Phe Gln325 330 335Ala Asn His Val Val Glu Glu Val Gln Trp Pro Leu Pro Asp Glu Asn
Gly Ile Ile Gln Lys Asp Trp Ala Ala Met Gln Val Glu Thr Thr Gln
Asp Tyr Ala His Asp Ser His Leu Trp Thr Ser Ile Thr Gly Ser Leu
Asn Tyr Gln Ala Val His His Leu Phe Pro Asn Val Ser Gln His His
Tyr Pro Asp Ile Leu Ala Ile Ile Lys Asn Thr Cys Ser Glu Tyr Lys
Val Pro Tyr Leu Val Lys Asp Thr Phe Trp Gln Ala Phe Ala Ser His
Leu Glu His Leu Arg Val Leu Gly Leu Arg Pro Lys Glu Glu
<210> 69<211> 6473<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Plasmideo pY5-22<4 00> 69
ggtggagctc cagcttttgt tccctttagt gagggttaat ttcgagcttg gcgtaatcat 60
ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacgtacgag 120ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg 180cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 240tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 300ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 360taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 420agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 480cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 540tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 600tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 660gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 720acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 780acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 840cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 900gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 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<302> PROMOTORES DA MUTASE DE GLICERALDEίDO-3-FOSFATO DESIDROGENASE E
FOSFOGLICERATO PARA EXPRESSÃO GÊNICA EM LEVEDURA OLEAGINOSA
<310> US-2005-001427O-Al
<311> 2004-06-16
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Plasmideo pYZDE2-S
<400> 72ggtggagctc cagcttttgt tccctttagt gagggttaat ttcgagcttg gcgtaatcat 60ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacgtacgag 120ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactç acattaattg 180cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 240tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 300ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 360taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 420agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 480cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 540tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 600tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 660gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 720acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 780acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 840cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 900gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 960gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 1020agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 1080ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 1140ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 1200atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 1260tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 1320gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 1380ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 1440caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 1500cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct 1560cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 1620cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta 1680agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca 1740tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat 1800agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 1860atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa 1920ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt 1980cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 2040caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat 2100attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 2160agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgcgc 2220cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 2280ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 2340ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 2400tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 2460cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 2520tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga 2580ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga 2640attttaacaa aatattaacg cttacaattt ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg 2700ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc 2760tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac 2820ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggtaccgggc cccccctcga 2880ggtcgatggt gtcgataagc ttgatatcga attcatgtca cacaaaccga tcttcgcctc 2940aaggaaacct aattctacat ccgagagact gccgagatcc agtctacact gattaatttt 3000cgggccaata atttaaaaaa atcgtgttat ataatattat atgtattata tatatacatc 3060atgatgatac tgacagtcat gtcccattgc taaatagaca gactccatct gccgcctcca 3120actgatgttc tcaatattta aggggtcatc tcgcattgtt taataataaa cagactccat 3180ctaccgcctc caaatgatgt tctcaaaata tattgtatga acttattttt attacttagt 3240attattagac aacttacttg ctttatgaaa aacacttcct atttaggaaa caatttataa 3300tggcagttcg ttcatttaac aatttatgta gaataaatgt tataaatgcg tatgggaaat 3360cttaaatatg gatagcataa atgatatctg cattgcctaa ttcgaaatca acagcaacga 3420aaaaaatccc ttgtacaaca taaatagtca tcgagaaata tcaactatca aagaacagct 3480attcacacgt tactattgag attattattg gacgagaatc acacactcaa ctgtctttct 3540ctcttctaga aatacaggta caagtatgta ctattctcat tgttcatact tctagtcatt 3600tcatcccaca tattccttgg atttctctcc aatgaatgac attctatctt gcaaattcaa 3660caattataat aagatatacc aaagtagcgg tatagtggca atcaaaaagc ttctctggtg 3720tgcttctcgt atttattttt attctaatga tccattaaag gtatatattt atttcttgtt 3780
atataatcct tttgtttatt acatgggctg gatacataaa ggtattttga tttaattttt 3840
tgcttaaatt caatcccccc tcgttcagtg tcaactgtaa tggtaggaaa ttaccatact 3900
tttgaagaag caaaaaaaat gaaagaaaaa aaaaatcgta tttccaggtt agacgttccg 3960
cagaatctag aatgcggtat gcggtacatt gttcttcgaa cgtaaaagtt gcgctccctg 4020
agatattgta catttttgct tttacaagta caagtacatc gtacaactat gtactactgt 4080
tgatgcatcc acaacagttt gttttgtttt tttttgtttt ttttttttct aatgattcat 4140
taccgctatg tatacctact tgtacttgta gtaagccggg ttattggcgt tcaattaatc 4200
atagacttat gaatctgcac ggtgtgcgct gcgagttact tttagcttat gcatgctact 4260
tgggtgtaat attgggatct gttcggaaat caacggatgc tcaaccgatt tcgacagtaa 4320
taatttgaat cgaatcggag cctaaaatga acccgagtat atctcataaa attctcggtg 4380
agaggtctgt gactgtcagt acaaggtgcc ttcattatgc cctcaacctt accatacctc 4440
actgaatgta gtgtacctct aaaaatgaaa tacagtgcca aaagccaagg cactgagctc 4500
gtctaacgga cttgatatac aaccaattaa aacaaatgaa aagaaataca gttctttgta 4560
tcatttgtaa caattaccct gtacaaacta aggtattgaa atcccacaat attcccaaag 4620
tccacccctt tccaaattgt catgcctaca actcatatac caagcactaa cctaccaaac 4680
accactaaaa ccccacaaaa tatatcttac cgaatataca gtaacaagct accaccacac 4740
tcgttgggtg cagtcgccag cttaaagata tctatccaca tcagccacaa ctcccttcct 4800
ttaataaacc gactacaccc ttggctattg aggttatgag tgaatatact gtagacaaga 4860
cactttcaag aagactgttt ccaaaacgta ccactgtcct ccactacaaa cacacccaat 4920
ctgcttcttc tagtcaaggt tgctacaccg gtaaattata aatcatcatt tcattagcag 4980
ggcagggccc tttttataga gtcttataca ctagcggacc ctgccggtag accaacccgc 5040
aggcgcgtca gtttgctcct tccatcaatg cgtcgtagaa acgacttact ccttcttgag 5100
cagctccttg accttgttgg caacaagtct ccgacctcgg aggtggagga agagcctccg 5160
atatcggcgg tagtgatacc agcctcgacg gactccttga cggcagcctc aacagcgtca 5220
ccggcgggct tcatgttaag agagaacttg agcatcatgg cggcagacag aatggtggca 5280
atggggttga ccttctgctt gccgagatcg ggggcagatc cgtgacaggg ctcgtacaga 5340
ccgaacgcct cgttggtgtc gggcagagaa gccagagagg cggagggcag cagacccaga 5400
gaaccgggga tgacggaggc ctcgtcggag atgatatcgc caaacatgtt ggtggtgatg 54 60
atgataccat tcatcttgga gggctgcttg atgaggatca tggcggccga gtcgatcagc 5520
tggtggttga gctcgagctg ggggaattcg tccttgagga ctcgagtgac agtctttcgc 5580caaagtcgag aggaggccag cacgttggcc ttgtcaagag accacacggg aagagggggg 5640ttgtgctgaa gggccaggaa ggcggccatt cgggcaattc gctcaacctc aggaacggag 5700taggtctcgg tgtcggaagc gacgccagat ccgtcatcct cctttcgctc tccaaagtag 5760atacctccga cgagctctcg gacaatgatg aagtcggtgc cctcaacgtt tcggatgggg 5820gagagatcgg cgagcttggg cgacagcagc tggcagggtc gcaggttggc gtacaggttc 5880aggtcctttc gcagcttgag gagaccctgc tcgggtcgca cgtcggttcg tccgtcggga 5940gtggtccata cggtgttggc agcgcctccg acagcaccga gcataataga gtcagccttt 6000cggcagatgt cgagagtagc gtcggtgatg ggctcgccct ccttctcaat ggcagctcct 6060ccaatgagtc ggtcctcaaa cacaaactcg gtgccggagg cctcagcaac agacttgagc 6120accttgacgg cctcggcaat cacctcgggg ccacagaagt cgccgccgag aagaacaatc 6180ttcttggagt cagtcttggt cttcttagtt tcgggttcca ttgtggatgt gtgtggttgt 6240atgtgtgatg tggtgtgtgg agtgaaaatc tgtggctggc aaacgctctt gtatatatac 63 00gcacttttgc ccgtgctatg tggaagacta aacctccgaa gattgtgact caggtagtgc 6360ggtatcggct agggacccaa accttgtcga tgccgatagc gctatcgaac gtaccccagc 6420cggccgggag tatgtcggag gggacatacg agatcgtcaa gggtttgtgg ccaactggta 6480aatttaaatg atgtcgacgc agtaggatgt cctgcacggg tctttttgtg gggtgtggag 6540aaaggggtgc ttggagatgg aagccggtag aaccgggctg cttgtgcttg gagatggaag 6600ccggtagaac cgggctgctt ggggggattt ggggccgctg ggctccaaag aggggtaggc 6660atttcgttgg ggttacgtaa ttgcggcatt tgggtcctgc gcgcatgtcc cattggtcag 6720aattagtccg gataggagac ttatcagcca atcacagcgc cggatccacc tgtaggttgg 6780gttgggtggg agcacccctc cacagagtag agtcaaacag cagcagcaac atgatagttg 6840ggggtgtgcg tgttaaagga aaaaaaagaa gcttgggtta tattcccgct ctatttagag 6900gttgcgggat agacgccgac ggagggcaat ggcgccatgg aaccttgcgg atatcgatac 6960gccgcggcgg actgcgtccg aaccagctcc agcagcgttt tttccgggcc attgagccga 7020ctgcgacccc gccaacgtgt cttggcccac gcactcatgt catgttggtg ttgggaggcc 7080actttttaag tagcacaagg cacctagctc gcagcaaggt gtccgaacca aagaagcggc 7140tgcagtggtg caaacggggc ggaaacggcg ggaaaaagcc acgggggcac gaattgaggc 7200acgccctcga atttgagacg agtcacggcc ccattcgccc gcgcaatggc tcgccaacgc 7260ccggtctttt gcaccacatc aggttacccc aagccaaacc tttgtgttaa aaagcttaac 7320atattatacc gaacgtaggt ttgggcgggc ttgctccgtc tgtccaaggc aacatttata 7380taagggtctg catcgccggc tcaattgaat CttttttCtt cttctcttct ctatattcat 7440tcttgaatta aacacacatc aatccatggc aaacagcagc gtgtgggatg atgtggtggg 7500ccgcgtggag accggcgtgg accagtggat ggatggcgcc aagccgtacg cactcaccga 7560tgggctcccg atgatggacg tgtccaccat gctggcattc gaggtgggat acatggccat 7620gctgctcttc ggcatcccga tcatgaagca gatggagaag ccttttgagc tcaagaccat 7680caagctcttg cacaacttgt ttctcttcgg actttccttg tacatgtgcg tggagaccat 7740ccgccaggct atcctcggag gctacaaagt gtttggaaac gacatggaga agggcaacga 7800gtctcatgct cagggcatgt ctcgcatcgt gtacgtgttc tacgtgtcca aggcatacga 7860gttcttggat accgccatca tgatcctttg caagaagttc aaccaggttt ccttcttgca 7920tgtgtaccac catgccactc atttttgcca tctggtgggc tatccgccaa gtacgctcca 7980ggaggtgatg cgtacttttt cagtgatcct caactctttc gtgcacaccg tcatgtacgg 8040catactactt cttctcctcc caagggttcg ggttcgtgaa gccaatcaag ccgtacatca 8100ccacccttca gatgacccag ttcatggcaa tgcttgtgca gtccttgtac gactacctct 8160tcccatgcga ctacccacag gctcttgtgc agctccttgg agtgtacatg atcaccttgc 8220ttgccctctt cggcaacttt tttgtgcaga gctatcttaa aaagccaaaa aagagcaaga 8280ccaactaaaa ctgcctgcat gatatgccgc tcgccggcgt tcgaattgac tcagaaagcg 8340agttaaggcg acacgcaaac tctatatttt ttcaaacgtg ttgccgtcac tcattcgcca 8400tctgtttact acgtgtctgt tcaatgagca tgttcttgaa tctaaagaat ctcgaatgtt 8460ttttaaaaaa agaattcgat atcaagctta cgcgtcgacc cgggtggacg tctagaggta 8520cctagcaatt aacagatagt ttgccggtga taattctctt aacctcccac actcctttga 8580cataacgatt tatgtaacga aactgaaatt tgaccagata ttgtgtccgc 8630
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<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador GPDsense
<400> 73
atacgagatc gtcaaggg 18
<210> 74
<211> 26
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Iniciador GPDantisense
<400> 74gcggccgcgg attgatgtgt gtttaa 26
<210> 75<211> 6339<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Plasmideo pKR136
<220>
<221> misc_feature<222> (4078)..(4078)<223> η é a, c, g, ou t
<4 00> 75
ggccgcgaca caagtgtgag agtactaaat aaatgctttg gttgtacgaa atcattacac 60
taaataaaat aatcaaagct tatatatgcc ttccgctaag gccgaatgca aagaaattgg 120
ttctttctcg ttatcttttg ccacttttac tagtacgtat taattactac ttaatcatct 180
ttgtttacgg ctcattatat ccgtacgtcg agtcgacctg caggcatgca agcttggcgt 240
aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 300
tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 360
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 420
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cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 540
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 600
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tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 720
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 780
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 840
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agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 1020
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 1080
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 1140
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 1200
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 1260
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 1320caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 1380
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 1440
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gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 1680
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 1740
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 1800
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gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 2040
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gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 2400
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tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 2700
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cccggggatc ctctagacgt acgtcctcga agagaagggt taataacaca ttttttaaca 2940
tttttaacac aaattttagt tatttaaaaa tttattaaaa aatttaaaat aagaagagga 3000
actctttaaa taaatctaac ttacaaaatt tatgattttt aataagtttt caccaataaa 3060
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<222> (7810)..(7810)
<223> η é a, c, g, ou t
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gtctctaaaa aggtagttcc tactgaatct aaggccatgc atggagtcta agattcaaat 2160
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cattcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat 2520
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cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata 2640aggaagttca tttcatttgg agaggacacg ctcgagctca tttctctatt acttcagcca 2700taacaaaaga actcttttct cttcttatta aaccatgaaa aagcctgaac tcaccgcgac 2760gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc tccgacctga tgcagctctc 2820ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga gggcgtggat atgtcctgcg 2880ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat gtttatcggc actttgcatc 2940ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa ttcagcgaga gcctgaccta 3000ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac ctgcctgaaa ccgaactgcc 3060cgctgttctg cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc gctgcggccg atcttagcca 3120gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt caatacacta catggcgtga 3180tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg caaactgtga tggacgacac 3240cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg ctttgggccg aggactgccc 3300cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac aatgtcctga cggacaatgg 3360ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc ggggattccc aatacgaggt 3420cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg gagcagcaga cgcgctactt 3480cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc gccgcggctc cgggcgtata tgctccgcat 3540tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat ttcgatgatg cagcttgggc 3600gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc cggagccggg actgtcgggc gtacacaaat 3660cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga tggctgtgta gaagtactcg ccgatagtgg 3720aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc aaaggaatag tgaggtacct aaagaaggag 3780tgcgtcgaag cagatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 3840gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt 3900aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta 3,960tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 4020gcggtgtcat ctatgttact agatcgatgt cgaatcgatc aacctgcatt aatgaatcgg 4080ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 4140ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 4200acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 4260aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 4320tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 4380aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 4440gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc 4500acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 4560
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 4620
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 4680
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 4740
gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 4800
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 4860
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 4920
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgacattaa cctataaaaa 4980
taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 5040
acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 5100
agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc 5160
atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatggacata ttgtcgttag aacgcggcta 5220
caattaatac ataaccttat gtatcataca catacgattt aggtgacact atagaacggc 5280
gcgccaagct tggatctcct gcagcccggg ggatccgccc acgtacggta ccatctgcta 5340
atattttaaa tcacatgcaa gagaggaggc atggttccat tttctacctt cacattattt 5400
gagaaaaacg aacttgttct gtgttttatt tttgcccttc acattagtac aacgtggaag 5460
actcatggtt acacagaatc atacataagt acaatgcttg tccctaagaa aacaagcact 5520
cgttgtattg aacctttacg gctcatgcgg ccgcgaattc actagtgatt gaattcgcgg 5580
ccgcttagtc cgacttggcc ttggcggccg cggccgactc tttgagcgtg aagatctgcg 5640
ccgtctcggg cacagcgccg tagttgacaa agaggtgcgc ggtcttgaag aaggccgtga 5700
tgatgggctc gtcgttcctg cgcacgaggt gcgggtacgc ggccgcaaag tgcttggtgg 5760
cttcgttgag cttgtagtgc ggaatgatcg ggaacaagtg gtggacctgg tgcgtgccaa 5820
tgtggtggct caggttgtcc acgaacgcgc cgtacgagcg gtcgacgctc gagaggttgc 5880
ccttgacgta cgtccactcc gagtcgccgt accacggcgt cgcttcgtcg ttgtggtgca 5940
agaaggtcgt aatgacgagg aacgaagcaa agacaaagag cggcgcatag tagtagaggc 6000
ccatgacggc aaagccgagc gagtatgtga ggtacgcgta cgcggcgaag aaggcggccc 6060
agacgccgag cgacacgatg acggccgacg cgcggcgaag gaggagcggg tcccacgggt 6120
caaagtggct catcgtgcgc ggggcatacc cgaccttcaa gtagacaaac cacgcaccgc 6180
cgagcgtgta gacccattgg cgcacgtcct ggaggtcctt gaccgaccgg tgcgggtaaa 6240
agatctcgtc cttatcaatg ttgcccgtgt tcttgtggtg gtggcggtgc gtcacgcgcc 6300
agctctcgaa cggcgtcaaa atcgcagagt gcatgatgca gccgatgata aagttgacgc 6360
Ltgtggtagcg cgagaaggcc gagtggccgc agtcgtggcc gaccgtgaag aagccccaga 6420
agatgacgcc ctgcacgtag atgtaggtgg cgcaaacgag cgcgtggagc agaacgttat 6480
cggcaatgaa cggcgtcgag cgcgccgcgt agagcagcgc cgccgaggcc gacgcgttga 654 0
agatcgcgcg ggccgtgtag tagagcgaga ggccgaggtt cgactcaaag cacgcgttcg 6600
ggatcgagtg cttgagctcc gtgagcgtcg ggaactcgac cttcgtctta tcctcagtca 6660
tgcggccgct gaagtattgc ttcttagtta acctttcctt tctctctcag ctatgtgaat 6720
tcattttgct ttcgtcacaa tttatatagt gaaattggat ctttggagtt aacgccttca 6780
caggattatc gtgttagaac aatgcttttt catgttctaa ttagtagtac attacaaatg 6840
tgcactctat tcaataagca tcttttggca cgttaataaa tcatgtgaaa aaaaaatact 6900
actatttcaa agaaagtgtt gtaaaaagaa acggaaagag agctggcttc agttgttgag 6960
acttgtttgc tagtaaaaat ggtgtgaaga gtgattcatg gtgaggtggt ttttcgtccc 7020
tttctgtttg catgaaaaac aaatggcaag agatgacgta ggattccttc ccttaacgat 7080
tatctgtttt taatttcaaa tatacatata ggaatttatg aattactaag gttgtaaaat 7140
atgctggtca tttatttatg gctaaaatat ttttttttct cgtaaatata aaaatattta 7200
aaatttattt ttatcatatt ttttatcctt ataaaattat gtgtacaacc tatataaaaa 7260
aatatcatat ttaatattga ttatatgttt aatcaatata aaaaatcatt atcatatatt 7320
tagatttatt cgaatataca tctaaacaaa aaataacata ttttaatttt atgaagaaaa 7380
aaaaatattt tatcctttat ttatttaaga ttaattaata gttatgtatt gtggaaagac 7440
ttttacacat gcaatagata tactgaatca attagatgcc aatgctgagt tggaaatcac 7500
ttgaggaggg gaggagactt gccaatgctt ttcagtttca tttaaatgat ttagtggagg 7560
agatagagta gtgataaagg catgccccaa ttttggagtg tatatatgag tggaaataag 7620
agagggatag agagaaaaaa taaagagagt aaaaataatt aatgtgaaat gatatgataa 7680
aaaaataaag aaagagataa agagaaaaat gaaatgagag atagatgaaa tagagagtag 7740
atacatgttt gtttaggttt tttttaggaa ataacacatt tttttctcat cacttattac 7800
tcactgtcaa tttcctctct ttcaatcata atgatatgat ttgtttaaca aaaatgtgaa 7860
aaaacatata aagtaaaata tttttataaa ttgataaata aaaatttaca aaatttattt 7920
cttattaaat tgaatagaaa atgaaagaaa agaaaagaaa aagtatatat aaaatgatat 7980
agctttaaaa agaataaatt tttcatatca gtcttttttt aataatttag aaatatttaa 8040
gtatatagca aaaatataat gtactttaca tatgcataaa taataatttg aaaatagaac 8100
taatagaata gagaaaaaag taatataata attaactata tgaaaattta gaagggacaa 8160
tatttttaat taagaatata aacaatattt cttttcatgt aatgagggac ggatgtacgg 82201 ggccagtgtt ggagtcaaag ccaaaatagt cacggggaaa ttaatgcact gcatgactat 8280tcgaaaaaat tcactagcct tacttagatg ttagattaat agctaggggg tgcagataat 8340tttgaaaggc atgaaaaaca ttaatttgta cattgcaagc ttttgatgac aagctttgca 8400attgttcaca ctaccttatg ccatttataa atagagtgat tggcatatga aggaaatcat 8460gagagtcgaa gcgaaaaaca aagcttgaga gtgtaggaaa aatacagttt ttttggtaaa 8520aatacagtat ttgaatagga gcgaaaaata tcctttcaaa atgatccttt tctttttttt 8580tttttttctt gttgttcttg gtcagttatt caaaggaaaa gggattgaaa taaaaacttg 8640catgtgggat cgtacgtcga gtcgacctgc a 8671<210> 94 <211> 1413 <212> DNA <213> Saprolegnia diclina <400> 94 atggccccgc agacggagct ccgccagcgc cacgccgccg tcgccgagac gccggtggcc 60ggcaagaagg cctttacatg gcaggaggtc gcgcagcaca acacggcggc ctcggcctgg 120atcattatcc gcggcaaggt ctacgacgtg accgagtggg ccaacaagca ccccggcggc 180cgcgagatgg tgctgctgca cgccggtcgc gaggccaccg acacgttcga ctcgtaccac 240ccgttcagcg acaaggccga gtcgatcttg aacaagtatg agattggcac gttcacgggc 300ccgtccgagt ttccgacctt caagccggac acgggcttct acaaggagtg ccgcaagcgc 360gttggcgagt acttcaagaa gaacaacctc catccgcagg acggcttccc gggcctctgg 420cgcatgatgg tcgtgtttgc ggtcgccggc ctcgccttgt acggcatgca cttttcgact 480atctttgcgc tgcagctcgc ggccgcggcg ctctttggcg tctgccaggc gctgccgctg 540ctccacgtca tgcacgactc gtcgcacgcg tcgtacacca acatgccgtt cttccattac 600gtcgtcggcc gctttgccat ggactggttt gccggcggct cgatggtgtc atggctcaac 660cagcacgtcg tgggccacca catctacacg aacgtcgcgg gctcggaccc ggatcttccg 720gtcaacatgg acggcgacat ccgccgcatc gtgaaccgcc aggtgttcca gcccatgtac 780gcattccagc acatctacct tccgccgctc tatggcgtgc ttggcctcaa gttccgcatc 840caggacttca ccgacacgtt cggctcgcac acgaacggcc cgatccgcgt caacccgcac 900gcgctctcga cgtggatggc catgatcagc tccaagtcgt tctgggcctt ctaccgcgtg 960taccttccgc ttgccgtgct ccagatgccc atcaagacgt accttgcgat cttcttcctc 1020gccgagtttg tcacgggctg gtacctcgcg ttcaacttcc aagtaagcca tgtctcgacc 1080gagtgcggct acccatgcgg cgacgaggcc aagatggcgc tccaggacga gtgggcagtc 1140tcgcaggtca agacgtcggt cgactacgcc catggctcgt ggatgacgac gttccttgcc 1200ggcgcgctca actaccaggt cgtgcaccac ttgttcccca gcgtgtcgca gtaccactac 1260
ccggcgatcg cgcccatcat cgtcgacgtc tgcaaggagt acaacatcaa gtacgccatc 1320
ttgccggact ttacggcggc gttcgttgcc cacttgaagc acctccgcaa catgggccag 1380
cagggcatcg ccgccacgat ccacatgggc taa 1413

Claims (36)

1. POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato deque compreende:(a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptídeo que tem atividade de desaturase delta-5, sendo que o polipeptídeotem pelo menos 80% de identidade, de acordo com o método de alinhamentoClustal W, com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID n° 2;(b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptídeo com atividade de desaturase delta-5, sendo que a seqüência denucleotídeos tem pelo menos 80% de identidade, com base no método dealinhamento BLASTN, com a seqüência de nucleotídeos apresentada na SEQID n° 1 ou na SEQ ID n° 3;(c) uma seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptídeo com atividade de desaturase delta-5, sendo que a seqüência denucleotídeos hibridiza sob condições estringentes em uma seqüência denucleotídeos como estabelecido na SEQ ID n° 1 ou SEQ ID n° 3; ou(d) um complemento da seqüência de nucleotídeos de (a), (b)ou (c), sendo que o complemento e as seqüências de nucleotídeos consistemem quantidades iguais de nucleotídeos e são 100% complementares.
2. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeos compreende aSEQ ID n° 1 ou a SEQ ID n° 3.
3. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos do polipeptídeocompreende:(a) SEQ IDn0 2; ou(b) uma seqüência de aminoácidos que difere da seqüência deaminoácidos em (a) em pelo menos uma substituição conservativa deaminoácidos.
4. CONSTRUTO DE DNA RECOMBINANTE, caracterizadopelo fato de que compreende o polinucleotídeo conforme definido em uma dasreivindicações 1, 2 ou 3 operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüênciareguladora.
5. CÉLULA, caracterizada pelo fato de que compreende emseu genoma o construto de DNA recombinante conforme definido nareivindicação 4.
6. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de ser selecionada do grupo que consiste em plantas e levedura.
7. MÉTODO PARA TRANSFORMAR UMA CÉLULA,caracterizado pelo fato de que compreende transformar uma célula com oconstruto recombinante conforme definido na reivindicação 4 e selecionaressas células transformadas com o construto recombinante conforme definidona reivindicação 4.
8. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTATRANSFORMADA, caracterizado pelo fato de que compreende transformaruma célula vegetal com o polinucleotídeo conforme definido em uma dasreivindicações 1, 2 ou 3 e regenerar a planta a partir da célula vegetaltransformada.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a planta é soja.
10. SEMENTE TRANSGÊNICA, caracterizada pelo fato deque compreende em seu genoma o construto recombinante conforme definidona reivindicação 4.
11. SEMENTE TRANSGÊNICA, caracterizada pelo fato de que éobtida a partir da planta produzida pelo método conforme definido em uma dasreivindicações 8 ou 9.
12. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOSPOLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA em uma célula vegetal,caracterizado por compreender:(a) transformar uma célula com o construto recombinanteconforme definido na reivindicação 4;(b) selecionar essas células transformadas que fazem ácidosgraxos poliinsaturados de cadeia longa.
13. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, caracterizados pelo fato deque são obtidos a partir da semente conforme definida na reivindicação 10.
14. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, caracterizados pelo fato deque são obtidos a partir da semente conforme definida na reivindicação 11.
15. MÉTODO PARA PRODUZIR PELO MENOS UM ÁCIDOGRAXO POLIINSATURADO EM UMA CÉLULA VEGETAL DE UMA SEMENTEOLEAGINOSA, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) transformar uma célula vegetal de semente oleaginosa comum primeiro construto de um DNA recombinante compreendendo umpolinucleotídeo isolado que codifica pelo menos um polipeptídeo desaturasedelta-5, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüência reguladora e pelomenos um construto de DNA recombinante adicional compreendendo um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelo menos uma seqüênciareguladora que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo formado por umadesaturase delta-4, uma desaturase delta-5, uma desaturase delta-6, umadesaturase delta-8, uma desaturase delta-12, uma desaturase delta-15, umadesaturase delta-17, uma desaturase delta-9, uma elongase delta-9, umaelongase C14/16, uma elongase Cie/18, uma elongase Cie/2oe uma elongase C20/22;(b) regenerar uma planta oleaginosa a partir das célulastransformadas da etapa (a); e(c) selecionar essas sementes obtidas a partir das plantas daetapa (b) que têm o nível de ácidos graxos poliinsaturados alterado emcomparação com o nível em sementes obtidas a partir de uma planta comsementes oleaginosas não transformadas.
16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que a planta de semente oleaginosa é selecionada do grupo formadopor soja, espécies de Brassica, girassol, milho, algodão, Iinho e cártamo.
17. PLANTA DE SEMENTE OLEAGINOSA, caracterizada pelofato de que compreende em seu genoma o construto de DNA recombinanteconforme definido na reivindicação 4.
18. PLANTA DE SEMENTE OLEAGINOSA, caracterizada pelofato de que compreende:(a) um primeiro construto de DNA recombinante quecompreende um polinucleotídeo isolado que codifica pelo menos umpolipeptídeo desaturase delta-5 operacionalmente ligado a pelo menos umaseqüência reguladora; e(b) pelo menos um construto adicional de DNA recombinanteque compreende um polinucleotídeo isolado, operacionalmente ligado a pelomenos uma seqüência reguladora que codifica um polipeptídeo selecionadodo grupo consistindo em uma desaturase delta-4, uma desaturase delta-5,uma desaturase delta-6, uma desaturase delta-8, uma desaturase delta-9,uma elongase delta-9, uma desaturase delta-12, uma desaturase delta-15,uma desaturase delta-17, uma elongase C14/16. uma elongase C16/18. umaelongase C18/20 e uma elongase C20/22·
19. PLANTA DE SEMENTE OLEAGINOSA, de acordo com asreivindicações 17 ou 18, caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupoformado por soja, espécies de Brassica, girassol, milho, algodão, Iinho e cártamo.
20. SEMENTE TRANSGÊNICA, caracterizada pelo fato de queé obtida a partir da planta de semente oleaginosa conforme definida nareivindicação 15.
21. SEMENTE TRANSGÊNICA, caracterizada pelo fato de queé obtida a partir da planta de semente oleaginosa conforme definida nareivindicação 16.
22. ÓLEO OU SUBPRODUTOS caracterizados pelo fato deque são obtidos a partir da semente conforme definida na reivindicação 20.
23. ÓLEO OU SUBPRODUTOS caracterizados pelo fato deque são obtidos a partir da semente conforme definida na reivindicação 21.
24. ÓLEO, caracterizado pelo fato de que é obtido pelo métodoconforme definido em uma das reivindicações 12 ou 15.
25. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato deque incorporam o óleo conforme definido na reivindicação 22.
26. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato deque incorporam o óleo conforme definido na reivindicação 23
27. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato deque incorporam o óleo conforme definido na reivindicação 24.
28. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato deque compreendem a semente conforme definida na reivindicação 20.
29. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato deque compreendem a semente conforme definida na reivindicação 21.
30. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato deque compreendem um ingrediente derivado do processamento das sementesconforme definidas na reivindicação 20.
31. PRODUTOS ALIMENTÍCIOS, caracterizados pelo fato deque compreendem um ingrediente derivado do processamento da sementeconforme definida na reivindicação 21.
32. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, de acordo com areivindicação 22, caracterizados pelo fato de que o subproduto é lecitina.
33. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, de acordo com areivindicação 23, caracterizados pelo fato de que o subproduto é lecitina.
34. PROGÊNIE DE PLANTAS, caracterizada pelo fato de queé obtida a partir da planta criada pelo método conforme definido em uma dasreivindicações 8 ou 9.
35. PROGÊNIE DE PLANTAS, caracterizada pelo fato de queé obtida a partir da planta de semente oleaginosa conforme definida em umadas reivindicações 20 ou 30.
36. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, caracterizada pelo fato de que codifica uma desaturase delta-5 conformeapresentado na SEQ ID n° 3, sendo que pelo menos um códon é otimizadopara expressão em Yarrowia sp.
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