ES2474840T3

ES2474840T3 - Delta-5 desaturasa y su uso para fabricar ácidos grasos poliinsaturados

Info

Publication number: ES2474840T3
Application number: ES07809152.7T
Authority: ES
Inventors: Howard G. Damude; Quinn Qun Zhu
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2006-05-17
Filing date: 2007-05-17
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2027-05-17
Also published as: WO2007136877A3; DK2021478T3; RU2008149701A; WO2007136671A2; UA102668C2; WO2007136877A2; US20070277266A1; US20150216210A1; US7678560B2; ZA200807831B; US20070292924A1; BRPI0711020A2; EP2021478B1; WO2007136671A3; EP2021478A2; US8962917B2; CA2647215C; CA2647215A1; ATE545702T1; EP2035560B1

Abstract

Un polinucleótido aislado, que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad delta-5 desaturasa, en el que el polipéptido tiene al menos 90% de identidad de aminoácidos, basada en el método de alineamiento Clustal W, cuando se compara con una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad delta-5 desaturasa, en el que la secuencia de nucleótidos tiene al menos 90% de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento BLASTN, cuando se compara con una secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3; o (c) un complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) o (b), en el que el complemento y la secuencia de nucleótidos están formados por el mismo número de nucleótidos y son 100% complementarios.

Description

Delta-5 desaturasa y su uso para fabricar ácidos grasos poliinsaturados

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la biotecnolog�a. De modo más específico, esta invención se refiere a 5 la identificación de fragmentos de ácidos nucleicos que codifican una enzima delta-5 ácido graso desaturasa y al uso de esta desaturasa para fabricar ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFA).

Antecedentes de la invención

La importancia de los PUFA es indiscutible. Por ejemplo, ciertos PUFA son importantes componentes biológicos de las células sanas y son reconocidos como ácidos grasos “esenciales” que no pueden ser sintetizados de novo en 10 mamíferos, sino que deben obtenerse de la dieta o derivarse por la posterior desaturaci�n y alargamiento del ácido linoleico (LA; 18:2 omega-6) o del ácido alfa-linol�nico (ALA; 18:3 omega-3); son constituyentes de las membranas plasm�ticas de las células, en las que pueden econtrarse en formas tales como fosfol�pidos o triacilgliceroles; son necesarios para el desarrollo correcto (en particular, en el cerebro de los niños en desarrollo) y para la formación y reparación de los tejidos; y son precursores para varios eicosanoides biol�gicamente activos de importancia en 15 mamíferos (por ejemplo, prostaciclinas, eicosanoides, leucotrienos, prostaglandinas). Además, una alta ingesta de PUFA omega-3 de cadena larga produce efectos protectores cardiosvasculares (Dyerberg, J. et al., Amer. J. Chin. Nutr., 28:958-966 (1975); Dyerberg, J. et al., Lancet, 2(8081):117-119 (15 de julio, 1978); Shimokawa, H., World Rev. Nutr. Diet, 88:100-108 (2001); von Schacky, C. y Dyerberg, J., World Rev. Nutr. Diet, 88:90-99 (2001)). Además, numerosos estudios diferentes documentan beneficios para la salud muy diversos conferidos por la

20 administración de PUFA omega-3 y/u omega-6 contra una diversidad de síntomas y enfermedades (por ejemplo, asma, psoriasis, eccema, diabetes, cáncer).

Se est�n investigando una diversidad de diferentes hospedantes, que incluyen plantas, algas, hongos y levaduras, como medio para la producción comercial de PUFA. La ingeniería genética ha demostrado que las capacidades naturales de algunos hospedantes (incluso los que est�n limitados nativamente a la producción de ácidos grasos LA

25 y ALA) pueden ser sustancialmente alteradas para conseguir una producción de alto nivel de diversos PUFA omega3/omega-6 de cadena larga. Tanto si esto es el resultado de las capacidades naturales como de la tecnología recombinante, la producción de ácido araquid�nico (ARA; 20:4 omega-6), ácido eicosapentaenoico (EPA; 20:5 omega-3) y ácido docosahexaenoico (DHA; 22:6 omega-3) puede requerir la expresión de una delta-5 desaturasa.

La mayoría de las enzimas delta-5 desaturasa identificadas hasta la fecha tienen la capacidad principal de convertir

30 el ácido dihomo-gamma-linol�nico (DGLA; 20:3 omega-6) en ARA, con una actividad secundaria para convertir el ácido eicosatetraenoico (ETA; 20:4 omega-3) en EPA (siendo el DHA posteriormente sintetizado a partir de EPA después de una reacción con otra C20/22 elongasa y una delta-4 desaturasa). La delta-5 desaturasa desempeña un papel en la vía de la delta-6 desaturasa/delta-6 elongasa (que se encuentra predominantemente en algas, musgos, hongos, nem�todos y seres humanos, y que se caracteriza por la producción de ácido gamma-linol�nico (GLA; 18:3

35 omega-6) y/o ácido estearid�nico (STA; 18:4 omega-3)) y la vía de delta-9 elongasa/delta-8 desaturasa (que actúa en algunos organismos, tales como especies euglenoides, y que se caracteriza por la producción de ácido eicosadienoico (EDA; 20:2 omega-6) y/o ácido eicosatrienoico (ETrA; 20:30 omega-3)) (figura 1).

Bas�ndose en el papel que desempeñan las enzimas delta-5 desaturasas en la síntesis, por ejemplo, de ARA, EPA y DHA, se ha realizado un consiferable esfuerzo para identificar y caracterizar estas enzimas a partir de diversas 40 fuentes. Como tales, se han describo numerosas delta-5 desaturasas en la bibliografía pública (por ejemplo, n.� de registro de GenBank AF199596, AF226273, AF320509, AB072976, AF489588, AJ510244, AF419297, AF07879, AF067654 y AB022097) y la bibliografía de patentes (por ejemplo, patentes de EEUU 5.972.664 y 6.075.183). Además, la solicitud provisional en tramitación junto con la presente de propiedad de los solicitantes n.� 60/801119 (presentada el 17 de mayo, 2006) describe secuencias de amino�cidos y de ácidos nucleicos para una enzima delta

45 5 desaturasa de Peridium sp. CCMP626, mientras que la solicitud provisional en tramitación junto con la presente de propiedad de los solicitantes n.� 60/915733 (BB1614) (presentada el 3 de mayo, 2007) describe secuencias de amino�cidos y de ácidos nucleicos para una enzima delta-5 desaturasa de Euglena anabaena.

Abbadi et al. (The Plant Cell, vol. 16, 2734-2748) describen la expresión en plantas transg�nicas de !6 y !5 desaturasas y una !6 elongasa.

50 La presente invención se refiere a la identificación y el aislamiento de otros genes que codifican delta-5 desaturasas de Euglena gracilis que serían adecuados para la expresión heter�loga en una diversidad de organismos hospedantes para su uso en la producción de ácidos grasos omega-3/omega-6.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un polinucle�tido aislado, que comprende:

55 (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polip�ptido que tiene actividad delta-5 desaturasa, en el que el

polip�ptido tiene al menos 90%, 95% o 100% de identidad de amino�cidos, basada en el método de alineamiento Clustal W, cuando se compara con una secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica un polip�ptido que tiene actividad delta-5 desaturasa, en el que la secuencia de nucleótidos tiene al menos 90%, 95% o 100% de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento BLASTN, cuando se compara con una secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3;

(c): un complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) o (b), en el que el complemento y la secuencia de nucleótidos est�n formados por el mismo número de nucleótidos y son 100% complementarios.

En una segunda realización, la invención se refiere a un gen quimérico que comprende cualquiera de los polinucle�tidos de la invención aislados unidos operablemente al menos a una secuencia reguladora.

En una tercera realización, la invención se refiere a una célula que comprende, en su genoma, el gen quimérico de la invención. Estas células pueden ser células vegetales o células de levadura.

En una cuarta realización, la invención se refiere a un método para transformar una célula, que comprende transformar una célula con un gen quimérico de la invención o un polinucle�tido de la invención aislado, y seleccionar las células transformadas con el gen quimérico o el polinucle�tido aislado.

En una quinta realización, la invención se refiere a una semilla transg�nica que comprende, en su genoma, el gen quimérico de la invención o una semilla transg�nica obtenida a partir de una planta fabricada mediante un método de la invención. En la presente se describen aceites o subproductos obtenidos a partir de dichas semillas transg�nicas.

En una sexta realización, la invención se refiere a un método para fabricar ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en una célula, que comprende:

(a): transformar una célula con el gen quimérico de la invención; y

(b): seleccionar las células transformadas que fabrican ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga.

En una séptima realización, la invención se refierea a un método para producir al menos un ácido graso poliinsaturado en una célula de una planta de semillas oleaginosas, que comprende:

(a): transformar una célula de una planta de semillas oleaginosas con un gen quimérico de la invención y al menos una construcción de ADN recombinante adicional que comprende un polinucle�tido aislado unido operablemente al menos a una secuencia reguladora, que codifica un polip�ptido seleccionado del grupo que consiste en una delta-4 desaturasa, una delta-5 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-8 desaturasa, una delta-12 desaturasa, una delta-15 desaturasa, una delta-17 desaturasa, una delta-9 desaturasa, una delta-9 elongasa, una C14/16 elongasa, una C16/18 elongasa, una C18/20 elongasa y una C20/22 elongasa;

(b): regenerar una planta de semillas oleaginosas a partir de la célula transformada de la etapa (a); y

(c): seleccionar las semillas obtenidas a partir de las plantas de la etapa (b) que tienen un nivel alterado de ácidos grados poliinsaturados, cuando se compara con el nivel en semillas obtenidas a partir de una planta de semillas oleaginosas no transformada.

Tambi�n se describe un método para producir al menos un ácido graso poliinsaturado en una célula de una planta de semillas oleaginosas, que comprende:

(a): transformar una célula de una planta de semillas oleaginosas con una primera construcción de ADN recombinante que comprende un polinucl�otido aislado que codifica al menos un polip�ptido de delta-5 desaturasa, unido operablemente al menos a una secuencia reguladora y al menos una construcción de ADN recombinante adicional que comprende un polinucle�tido aislado unido operablemente al menos a una secuencia reguladora, que codifica un polip�ptido seleccionado del grupo que consiste en una delta-4 desaturasa, una delta-5 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-8 desaturasa, una delta-12 desaturasa, una delta-15 desaturasa, una delta-17 desaturasa, una delta-9 desaturasa, una delta-9 elongasa, una C14/16 elongasa, una C16/18 elongasa, una C18/20 elongasa y una C20/22 elongasa;

En una octava realización, la invención se refiere a una planta, preferiblemente una planta de semillas oleaginosas, que comprende la construcción recombinante de la invención. Las plantas de semillas oleaginosas adecuadas incluyen, pero no se limitan a soja, especies de Brassica, girasol, maíz, algodón, lino y c�rtamo.

En una novena realización, la invención se refiere a una planta de semillas oleaginosas que comprende el gen quimérico de la invención, y:

(b): al menos una construcción de ADN recombinante adicional que comprende un polinucle�tido aislado unido operablemente al menos a una secuencia reguladora, que codifica un polip�ptido seleccionado del grupo que consiste en una delta-4 desaturasa, una delta-5 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-8 desaturasa, una delta-12 desaturasa, una delta-15 desaturasa, una delta-17 desaturasa, una delta-9 desaturasa, una delta-9 elongasa, una C14/16 elongasa, una C16/18 elongasa, una C18/20 elongasa y una C20/22 elongasa.

Tambien se describe una planta de semillas oleaginosas, que comprende:

(a): una primera construcción de ADN recombinante que comprende un polinucle�tido aislado que codifica al menos un polip�ptido de delta-5 desaturasa, unido operablemente al menos a una secuencia reguladora; y

Tambi�n son de interés las semillas transg�nicas obtenidas a partir de dichas plantas de semillas oleaginosas. Se describe el aceite o los subproductos obtenidos a partir de estas semillas transg�nicas, as� como alimentos o piensos que incorporan dicho aceite. Un subproducto preferido es la lecitina.

En una décima realización, la invención se refiere a un alimento o un pienso que incorpora una semilla de la invención. También se describe un alimento o un pienso que comprende un ingrediente derivado del procesamiento de las semillas.

La invención se refiere también a un método para fabricar un alimento o un pienso para animales, que comprende:

(a) procesar la semilla transg�nica de la invención para obener aceite, e incluir dicho aceite en dicho alimento o pienso; o (b) incluir la semilla transg�nica de la invención en dicho alimento o pienso.

Tamb�n se describen las plantas de la progenie obtenidas a partir de una planta fabricada mediante el método de la invención o una planta de semillas oleaginosas de la invención.

Breve descripción de los dibujos y las listas de secuencias

La figura 1 ilustra la vía biosint�tica de ácidos grasos omega-3/omega-6.

La figura 2 muestra un cromatograma del perfil de lípidos de un extracto de células de Euglena gracilis según se describe en el ejemplo 1.

La figura 3 muestra una porción de un alineamiento entre proteínas de delta-5 desaturasa y proteínas de delta-8 desaturasa utilizando un análisis Clustal W (programa MegAlign™ del software de DNASTAR).

La figura 4 representa gráficamente la relación entre SEQ ID NO:1, 2, 4, 5, 6, 8 y 10, cada una de las cuales se relaciona con la delta-5 desaturasa de Euglena gracilis.

La figura 5A ilustra la estrategia de clonaci�n utilizada para la amplificación del gen de la delta-5 desaturasa de Euglena gracilis (EgD5). La figura 5B es un mapa del pl�smido pZUF17, mientras que la figura 5C es un mapa del pl�smido pDMW367. La figura 6 proporciona mapas de pl�smidos para los siguientes: (A) pKUNF12T6E; (B) pEgD5S; y (C) pDMW369.

La figura 7 muestra una comparación de la secuencia de ADN del gen de la delta-5 desaturasa de Euglena gracilis (denominado “EgD5”, SEQ ID NO:1) y el gen sintético (denominado “EgD5S”, SEQ ID NO:3) con codones optimizados para la expresión en Yarrowia lipolytica.

La figura 8A y 8B muestra un alineamiento Clustal V (con parámetros por defecto) de una delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri (SEQ ID NO:18), una delta-8 desaturasa de Pavlova salina (SEQ ID NO:64), una delta-8 desaturasa de Euglena gracilis (SEQ ID NO:16), y dos delta-6 ácido graso desaturasas diferentes de Rhizopus stolonifer (SEQ ID NO:51 y 63).

La figura 9 proporciona una map del pl�smido pY98.

La figura 10A proporciona los perfiles de ácidos grasos para Yarrowia lipolytica que expresa pY98 (SEQ ID NO:76, que comprende un gen de delta-5 desaturasa de Mortierella alpina denominado “MaD5”) o pDMW367 (SEQ ID NO:23, que comprende el gen de delta-5 desaturasa de Euglena gracilis denominado “EgD5”) y alimentada con diversos sustratos. La figura 10B proporciona una comparación de la especificidad de sustrato de omega-3 y omega6 de MaD5 fente a EgD5.

La figura 11 proporciona mapas de los siguientes pl�smidos: (A) pKR916; (B) pKR1037; y (C) pKR328.

La figura 12A proporciona la media de los perfiles de ácidos grasos para diez acontecimientos que tienen la mayor actividad delta-5 desaturasa cuando la enzima de Mortierella alpina (MaD5) se transforma en embriones de soja. La figura 12B poporciona la media de los perfiles de ácidos grasos para diez acontecimientos que tienen la mayor 5 actividad delta-5 desaturasa cuando la enzima de Euglena gracilis (EgD5) se transforma en embriones de soja. Los ácidos grasos se identifican como 16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUP, ETA y EPA. Los ácidos grasos listados como “otros” incluyen: 18:2 (5,9), GLA, STA, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) o 20:2 (8,11) y DPA. Cada uno de estos “otros” ácidos grasos est� presente con una abundancia relativa menor que 3,0% de los ácidos grasos totales. Las composiciones de ácidos grasos para un

10 embrión individual se expresan como porcentaje en peso (% en p) de los ácidos grasos totales, y la media de la composición de ácidos grasos es la media de seis embriones individuales para cada acontecimiento. La figura 12B demuestra que la actividad de EgD5 en embriones de soja es muy alta, con una conversión media (Correcto % delta-5 desat.) del 77% al 99% en los diez acontecimientos de mayor puntuación.

La figura 13 proporciona la actividad de la delta-5 desaturasa para los sustratos “correctos” (“Correcto % delta-5

15 desat.”) representada gráficamente en el eje de abscisas frente a la actividad de la delta-5 desaturasa para los sustratos “incorrectos” (“Incorrecto % delta-5 desat.”) representada gráficamente en el eje de ordenadas para MaD5 (véase la figura 12A) y EgD5 (véase la figura 12B). La especifidad de sustrato de EgD5 presenta una preferencia por los sustratos “correctos” frente a los sustratos “incorrectos” cuando se compara con MaD5.

La invención puede entenderse mejor a partir de la siguiente descripción detallada y las descripciones de las 20 secuencias adjuntas, que forman parte de esta solicitud.

Las siguientes secuencias cumplen con 37 C.F.R. �1.821-1.825 ("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures -the Sequence Rules") y son coherentes con the World Intellectual Property Organization (WIPO) Standard ST.25 (1998) y los requisitos de listado de secuencias de EPO y PCT (normas 5.2 y 49.5(a-bis), y sección 208 y anexo C de las instrucciones administrativas). Los símbolos y

25 el formato utilizado para los datos de las secuencias de nucleótidos y de amino�cidos se ajustan a las normas indicadas en 37 C.F.R. �1.822.

Las SEQ ID NO:1-26, 48, 49, 51-54, 61-64, 67-72 y 75-76 son ORF que codifican genes o proteínas (o porciones de estos), o pl�smidos, según se identifica en al tabla 1.

Tabla 1

Resumen de los números de SEQ ID de ácidos nucleicos y proteínas

Descripci�n y abreviatura: SEQ ID NO: de ácido nucleico SEQ ID NO: de proteína

delta-5 desaturasa de Euglena gracilis (“EgD5”): 1 (1350 pb) 2 (449 AA)

delta-5 desaturasa sintética, derivada de Euglena gracilis, con codones optimizados para la expresión en Yarrowia lipolytica (“EgD5S”): 3 (1350 pb) 2 (449 AA)

EgD5 de Egulena gracilis - fragmento de pT-F10-1: 4 (590 pb) 5 (196 AA)

EgD5 de Egulena gracilis - fragmento de pT-EgD5-5’Cs: 6 (797 pb) -

EgD5 de Egulena gracilis - secuencia 5’ con relación a SEQ ID NO:4: 7 (559 pb) -

EgD5 de Egulena gracilis - fragmento de pT-EgD5-5’2nd: 8 (273 pb) -

EgD5 de Egulena gracilis - secuencia 5’ con relación a SEQ ID NO:6: 9 (20 pb) -

EgD5 de Egulena gracilis - fragmento de pT-EgD5-3’: 10 728 pb) -

EgD5 de Egulena gracilis - secuencia 3’ con relación a SEQ ID NO:4: 11 (464 pb) -

delta-5 desaturasa de Pythium irregulare (n.� de registro de GenBank AAL13311): - 12 (456 AA)

delta-5 desaturasa de Phytophthora megasperma (n.� de registro de GenBank CAD53323): - 13 (477 AA)

delta-5 desaturasa de Phaeodactylum tricornutum (n.� de registro de GenBank AAL92562): - 14 (469 AA)

delta-5 desaturasa de Dictyostelium discoideum (n.� de registro de GenBank XP640331): - 15 (467 AA)

Resumen de los números de SEQ ID de ácidos nucleicos y proteínas

delta-8 desaturasa de Euglena gracilis (publicaciones PCT n.� WO 2006/012325 y WO 2006/012326): - 16 (421 AA)

delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri (CCMP459): 17 (1269 pb) 18 (423 AA)

regi�n conservada 1: - 19 (7 AA)

regi�n conservada 2: - 20 (7 AA)

delta-8 esfingol�pido desaturasa de Thalassiosira pseudonana (n.� de registro de GenBank AAX14502): - 21 (476 AA)

pl�smido pZUF17: 22 (8165 pb) -

pl�smido pDMV367: 23 (8638 pb) -

pl�smido pKUNF12T6E: 24 (12.649 pb) -

gen de C18/20 elongasa sintético derivado de Thraustochytrium aureum (patente de EEUU 6.677.145), con codones optimizados para la expresión en Yarrowia lipolytica (“EL2S”): 25 (819 pb) 26 (272 AA)

pl�smido pEgD5S: 48 (4070 pb) -

pl�smido pDMV369: 49 (8438 pb) -

delta-6 ácido graso desaturasa de Rhizopus stolonifer (n.� de registro de NCBI AAX22052): - 51 (459 AA)

delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri porción de inserción de ADNc del clon eps1c.pk002.f22 (extremo 5’ de la inserción de ADNc): 52 (695 pb) -

delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri -EST completamente secuenciado eps1c.pk002.f22:fis (secuencia completa de la inserción): 53 (1106 pb) -

delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri - traducción de los nucleótidos 1864 de EST totalmente secuenciado eps1c.pk002.f22:fis (secuencia completa de la inserción; SEQ ID NO:53): - 54 (287 AA)

delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri - secuencia completa del extremo 5’ de paseo gen�mico: 61 (1294 pb) -

delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri - secuencia ensamblada: 62 (1927 pb) -

delta-6 ácido graso desaturasa de Rhizopus stolonifer (n.� de registro de NCBI ABB96724): - 63 (459 AA)

delta-8 desaturasa de Pavlova salina: - 64 (427 AA)

delta-5 desaturasa de Mortierella alpina: 67 (1338 pb) 68 (446 AA)

pl�smido pY5-22: 69 (6473 pb) -

pl�smido pY5-22GPD: 70 (6970 pb) -

promotor de la gliceraldeh�do-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) de Yarrowia lipolytica: 71 (968 pb) -

pl�smido pYZDE2-S: 72 (8630 pb) -

pl�smido pKR136: 75 (6339 pb) -

pl�smido pY98: 76 (8319 pb) -

delta-9 elongasa de Euglena gracilis (“EgD9e”): 77 (774 pb) -

delta-8 desaturasa de Euglena gracilis (“EgD8”): 78 (1263 pb) -

pl�smido pKR906: 81 (4311 pb) -

pl�smido pKR72: 82 (7085 pb) -

Resumen de los números de SEQ ID de ácidos nucleicos y proteínas

pl�smido pKS102: 83 (2540 pb) -

pl�smido pKR197: 84 (4359 pb) -

pl�smido pKR911: 85 (5147 pb) -

pl�smido pKR680: 86 (6559 pb) -

pl�smido pKR913: 87 (9014 pb) -

pl�smido pKR767: 88 (5561 pb) -

pl�smido pKR916: 89 (11.889 pb) -

pl�smido pKR974: 90 (5661 pb) -

pl�smido pKR1032: 91 (5578 pb) -

pl�smido pKR1037: 92 (11.907 pb) -

pl�smido pKR328: 93 (8671 pb) -

delta-5 desaturasa de Saprolegnia diclina (“SdD5”): 94 (1413 pb) -

SEQ ID NO:27-30 se corresponden con los cebadores oligonucleot�dicos degenerados 5-1A, 5-1B, 5-1C y 5-1D, respectivamente, que codifican la región conservada 1.

SEQ ID NO:31-34 se corresponden con los cebadores oligonucleot�dicos degenerados 5-5AR, 5-5BR, 5-5CR y 55DR, respectivamente, que codifican la región conservada 2.

5 SEQ ID NO:35-40 se corresponden con los cebadores ODMW480, cebador CDSIII 5’, ODMW479, DNR CDS 5’, YL791 y YL792, respectivamente, utilizados para 5’ RACE.

SEQ ID NO:41-43 se corresponden con los cebadores ODMW469, AUAP y ODMW470, respectivamente, utilizados para 3’ RACE.

SEQ ID NO:44-47 se corresponden con los cebadores YL794, YL797, YL796 e YL795, respectivamente, utilizados 10 para la amplificación del ADNc de longitud completa de EgD5.

SEQ ID NO:50 se corresponde con el cebador T7, utilizado para secuenciar el banco de ADNc de Pavlova lutheri (CCMP459).

SEQ ID NO:55 y 56 se corresponden con los cebadores SeqE y SeqW, respectivamente, utilizados para la secuenciaci�n de clones de Pavlova lutheri (CCMP459).

15 SEQ ID NO:57 y 58 se corresponden con el cebador universal AP1 y el cebador GSP PvDES, respectivamente, utilizados para la amplificación del ADN gen�mico de Pavlova lutheri (CCMP459).

SEQ ID NO:59 y 60 se corresponden con los cebadores M12-28Rev y PavDES seq, respectivamente, utilizados para la secuenciaci�n de inserciones gen�micas de Pavlova lutheri (CCMP459).

SEQ ID NO:65 y 66 se corresponden con el cebador AP y el cebador oligonucleot�dico Smart IV, respectivamente, 20 utilizados para la síntesis de ADNc de Euglena gracilis.

SEQ ID NO:73 y 74 son los cebadores GPDsense y GPDantisense, respectivamente, utilizados para amplificar el promotor de GPD.

SEQ ID NO:79 y 80 se corresponden con los cebadores oEugEL1-1 y oEugEL1-2, respectivamente, utilizados para amplificar una delta-9 elongasa de Euglena gracilis (EgD9e).

25 Descripción detallada de la invención

En la presente se citan la patente de EEUU 7.125.672, patente de EEUU 7.189.559, patente de EEUU 7.192.762, patente de EEUU 7.198.937, patente de EEUU 7.202.356, solicitudes de patente de EEUU n.� 10/840579 y n.� 10/840325 (presentadas el 6 de mayo, 2004), solicitud de patente de EEUU n.� 10/869630 (presentada el 16 de junio, 2004), solicitud de patente de EEUU n.� 10/882760 (presentada el 1 de julio, 2004), solicitudes de patente de 30 EEUU n.� 10/985254 y n.� 10/985691 (presentadas el 10 de noviembre, 2004), solicitud de patente de EEUU n.� 11/024544 (presentada el 29 de diciembre, 2004), solicitud de patente de EEUU n.� 11/166993 (presentada el 24 de junio, 2005), solicitud de patente de EEUU n.� 11/183664 (presentada el 18 de julio, 2005), solicitud de patente de EEUU n.� 11/185301 (presentada el 20 de julio, 2005), solicitud de patente de EEUU n.� 11/190750 (presentada el 27 de julio, 2005), solicitud de patente de EEUU n.� 11/198975 (presentada el 8 de agosto, 2005), solicitud de patente de EEUU n.� 11/225354 (presentada el 13 de septiembre, 2005), solicitud de patente de EEUU n.� 5 11/253882 (presentada el 19 de octubre, 2005), solicitudes de patente de EEUU n.� 11/264784 y n.� 11/264737 (presentadas el 1 de noviembre, 2005), solicitud de patente de EEUU n.� 11/265761 (presentada el 2 de noviembre, 2005), solicitud de patente de EEUU n.� 11/737.772 (presentada el 20 de abril, 2007), solicitud de patente de EEUU n.� 11/787.772 (presentada el 17 de abril, 2007), solicitud de patente de EEUU n.� 11/740.298 (presentada el 26 de abril, 2007), solicitudes de patente de EEUU n.� 60/801172 y n.� 60/801119 (presentadas el 17 de mayo, 2006), solicitud de patente de EEUU n.� 60/853563 (presentada el 23 de octubre, 2006), solicitud de patente de EEUU n.� 60/855177 (presentada el 30 de octubre, 2006), solicitudes de patente de EEUU n.� 11/601563 y n.� 11/601564 (presentadas el 16 de noviembre, 2006), solicitud de patente de EEUU n.� 11/635258 (presentada el 7 de diciembre, 2006), solicitud de patente de EEUU n.� 11/613420 (presentada el 20 de diciembre, 2006), solicitud de patente de EEUU n.� 60/909790 (presentada el 3 de abril, 2007), solicitud de patente de EEUU n.� 60/911925 (presentada el 16

15 de abril, 2007), solicitud de patente de EEUU n.� 60/910831 (presentada el 10 de abril, 2007) y solicitud de patente de EEUU n.� 60/915733 (BB1614) (presentada el 3 de mayo, 2007). La patente de EEUU n.� de publicación 2005/0136519, que se refiere a la producción de PUFA en plantas, y la patente de EEUU n.� 7.129.089, que se refiere a promotores de anexina y su uso en la expresión de transgenes en plantas son solicitudes en tramitación junto con la presente.

Tal como se emplea en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un/una” y “el/la” incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. As�, por ejemplo, la referencia a “una planta” incluye una pluralidad de dichas plantas, la referencia a “una célula” incluye una o más células y sus equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, etc.

Seg�n la presente invención, los solicitantes han identificado una nueva enzima delta-5 desaturasa de Euglena

25 gracilis y el gen que la codifica, que puede utilizarse para la manipulación de vías bioquímicas para la producción de PUFA saludables. As�, la presente invención tiene muchas aplicaciones.

Los PUFA, o sus derivados, preparados mediante la metodología descrita en la presente, pueden utilizarse como sustitutos dietéticos, o suplementos, en particular en leches maternizadas, para pacientes que est�n sometidos a una alimentación intravenosa o para prevenir o tratar la malnutrici�n. Como alternativa, los PUFA purificados (o sus derivados) pueden incorporarse en aceites para cocinar, grasas o margarinas formuladas para que, en el uso normal, el receptor reciba la cantidad deseada para la suplementaci�n dietética. Los PUFA también pueden incorporarse en leches maternizadas, suplementos nutricionales u otros productos alimentarios, y puede ser útiles como antiinflamatorios o agentes para disminuir el colesterol. Opcionalmente, las composiciones pueden utilizarse para un uso farmacéutico (humano o veterinario).

35 La suplementaci�n de seres humanos o animales con PUFA producidos por medios recombinantes puede dar como resultado unos mayores niveles de los PUFA añadidos, as� como de su progenie metabólica. Por ejemplo, un tratamiento con EPA puede producir no solo unos mayoers niveles de EPA, sino también de productos corriente abajo de EPA, tales como eicosanoides (es decir, prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos). Los complejos mecanismos reguladores pueden hacer que resulte deseable combinar diversos PUFA, o añadir diferentes conjugados de PUFA, para prevenir, controlar o superar dichos mecanismos para lograr los niveles deseados de PUFA específicos en un individuo.

Definiciones

En esta descripción se emplea una serie de términos, expresiones y abreviaturas. Se proporcionan las siguientes definiciones.

45 Un “marco de lectura abierto” se abrevia como ORF.

La “reacción en cadena de polimerasa” se abrevia como PCR.

“American Type Culture Collection” se abrevia como ATCC.

Un “ácido o ácidos grasos poliinsaturados” se abrevia como PUFA.

Los “triacilgliceroles” se abrevian como TAG.

El término “invención” o la expresión “presente invención”, tal como se emplea en la presente, no pretende la limitación a cualquier realización específica de la invención, sino que se aplica en general a cualquiera y a todas las realizaciones de la invención, según se describe en las reivindicaciones y en la memoria descriptiva.

La expresión “ácidos grasos” se refiere a ácidos alif�ticos de cadena larga (ácidos alcanoicos) de longitud de cadena variable, de aproximadamente C12 a C22 (aunque se conocen ácidos con una longitud de cadena mayor o menor). 55 Las longitudes de cadena predominantes est�n entre C16 y C22. La estructura de un ácido graso se representa

mediante un sistema de notación sencillo de “X:Y”, en el que X es el número total de átomos de carbono (C) en el ácido graso concreto, e Y es el número de enlaces dobles. Otros detalles referidos a la diferenciación entre “ácidos grasos saturados” frente a “ácidos grasos insaturados”, “ácidos grasos monoinsaturados” frente a “ácidos grasos poliinsaturados” (o “PUFA”), y “ácidos grasos omega-6” (omega-6 o n-6) frente a “ácidos grasos omega-3” (omega-3

5 o n-3) se proporcionan en la publicación de patente de EEUU n.� 2005/0136519.

En la presente, los ácidos grasos se describen mediante un sistema de notación sencillo de “X:Y”, en el que X es el número total de átomos de carbono (C) en el ácido graso concreto, e Y es el número de enlaces dobles. El número que sigue a la denominación del ácido graso indica la posición del doble enlace desde el extremo carboxilo del ácido graso, indicando el afijo “c” la configuración cis del doble enlace (por ejemplo, ácido palm�tico (16:0), ácido esteárico

10 (18:0), ácido oleico (18:1, 9c), ácido petrosel�nico (18:1, 6c), LA (18:2, 9c,12c), GLA (18:3, 6c,9c,12c) y ALA (18:3, 9c,12c,15c)). A menos que se indique lo contrario, 18:1, 18:2 y 18:3 se refieren a los ácidos grasos oleico, LA y ALA, respectivamente. Si no se indica específicamente lo contrario, se supone que los dobles enlaces est�n en la configuración cis. Por ejemplo, se supone que los dobles enlaces en 18:2 (9,12) est�n en la configuración cis.

La nomenclatura utilizada para describir los PUFA en la presente descripción se muestra a continuación en la tabla

15 2. En la columna titulada “Notación abreviada”, se emplea el sistema de referencia con omega para indicar el número de carbonos, el número de dobles enlaces y la posición del doble enlace más cercano al carbono omega, contando desde el carbono omega (que se numera como 1 para este fin). El resto de la tabla resume los nombres comunes de los ácidos grasos omega-3 y omega-6 y sus precursores, las abreviaturas que se utilizan a lo largo de la memoria descriptiva y el nombre químico de cada compuesto.

20 Tabla 2

Nomenclatura de ácidos grasos poliinsaturados y sus precursores

Nombre común: Abreviatura Nombre químico Notación abreviada

mir�stico: - tetradecanoico 14:0

palm�tico: palmitato hexadecanoico 16:0

palmitoleico: - 9-hexadecenoico 16:1

este�rico: - octadecanoico 18:0

oleico: - cis-9-octadecenoico 18:1

linoleico: LA cis-9,12-octadecadienoico 18:2 omega-6

∀-linoleico: GLA cis-6,9,12-octadecatrienoico 18:3 omega-6

eicosadienoico: EDA cis-11,14-eicosadienoico 20:2 omega-6

dihomo-∀-linoleico: DGLA cis-8,11,14-eicosatrienoico 20:3 omega-6

araquid�nico: ARA cis-5,8,11,14-eicosatetraenoico 20:4 omega-6

#-linol�nico: ALA cis-9,12,15-octadecatrienoico 18:3 omega-3

estearid�nico: STA cis-6,9,12,15-octadecatetraenoico 18:4 omega-3

eicosatrienoico: ETrA o ERA cis-11,14,17-eicosatrienoico 20:3 omega-3

esciad�nico: SCI cis-5,11-14-eicosatrienoico 20:3b omega-6

juniper�nico: JUP cis-5,11,14,17-eicosatetraenoico 20:4b omega-3

eicosatetraenoico: ETA cis-8,11,14,17-eicosatetraenoico 20:4 omega-3

eicosapentaenoico: EPA cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoico 20:5 omega-3

docosapentaenoico: DPA cis-7,10,13,16,19-docosapentaenoico 22:5 omega-3

docosahexaenoico: DHA cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico 22:6 omega-3

Los términos “triacilglicerol”, “aceite” y “TAG” se refieren a lípidos neutros compuestos por tres restos acilo graso esterificados a una molécula de glicerol (y estos términos se emplean de modo intercambiable a lo largo de la presente memoria descriptiva). Estos aceites pueden contener PUFA de cadena larga, as� como ácidos grasos saturados e insaturados más cortos y ácidos grasos saturados de cadena más larga. As�, la “biosíntesis de aceites”

25 se refiere genéricamente a la síntesis de TAG en la célula.

El “porcentaje (%) de PUFA en las fracciones de aceite y lípidos totales” se refiere al porcentaje de PUFA con

relaci�n a los ácidos grasos totales en estas fracciones. Las expresiones “fracción de lípidos totales” o “fracción de lípidos” se refieren ambas a la suma de todos los lípidos (es decir, neutros y polares) dentro de un organismo oleaginoso, lo cual indica que estos lípidos est�n localizados en la fracción de fosfatidilcolina (PC), la fracción de fosfatidiletanolamina (PE) y la fracción de triacilglicerol (TAG o aceite). Sin embargo, los términos “lípido” y “aceite” se emplearán de modo intercambiable a lo largo de la memoria descriptiva.

Una vía metabólica, o una vía biosint�tica, en un sentido bioquímico, puede considerarse como una serie de reacciones químicas que se producen dentro de una célula, catalizadas por enzimas, para lograr la formación de un producto metabólico que va a ser utilizado o almacenado por la célula, o el inicio de otra vía metabólica (entonces se denomina una etapa generadora de flujo). Muchas de estas vías son complejas, e implica una modificación etapa a etapa de la sustancia inicial para generar un producto que tenga la estructura química exacta deseada.

La expresión “vía biosint�tica de PUFA” se refiere a un proceso metabólico que convierte el ácido oleico en LA, EDA, GLA, DGLA, ARA, ALA, STA, ETrA, ETA, EPA, DPA y DHA. Este proceso est� bien descrito en la bibliografía (por ejemplo, véase la publicación PCT n.� WO 2006/052870). Brevemente, este proceso implica el alargamiento de la cadena carbonada mediante la adición de átomos de carbono y la desaturaci�n de la molécula mediante la adición de dobles enlaces, a través de una serie de enzimas de desaturaci�n y alargamiento especiales (es decir, “enzimas de la vía biosint�tica de PUFA”) presentes en la membrana del retículo endopl�smico. De modo más específico, las “enzimas de la vía biosint�tica de PUFA” se refieren a cualquiera de la siguientes enzimas (y los genes que codifican dichas enzimas) asociadas con la biosíntesis de un PUFA, que incluyen: una delta-4 desaturasa, una delta-5 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-12 desaturasa, una delta-15 desaturasa, una delta-17 desaturasa, una delta-9 desaturasa, una delta-8 desaturasa, una delta-9 elongasa, una C14/16 elongasa, una C16/18 elongasa, una C18/20 elongasa y/o una C20/22 elongasa.

La expresión “vía biosint�tica de ácidos grasos omega-3/omega-6” se refiere a un conjunto de genes que, cuando se expresan bajo las condiciones apropiadas, codifican enzimas que catalizan la producción de ácidos grasos omega-3 u omega-6 o ambos. Generalmente, los genes implicados en la vía biosint�tica de ácidos grasos omega-3/omega-6 codifican enzimas de la vía biosint�tica de PUFA. Una vía representativa se ilustra en la figura 1, que proporciona la conversión del ácido mir�stico a través de diversos intermedios en DHA, lo cual demuestra cómo pueden producirse ácidos grasos omega-3 y omega-6 a partir de una fuente común. La vía est� dividida en la naturaleza en dos porciones, y una porción genera ácidos grasos omega-3 y la otra porción solo ácidos grasos omega-6. La porción que solo genera ácidos grasos omega-3 se denomina en la presente la vía biosint�tica de ácidos grasos omega-3, mientras que la porción que solo genera ácidos grasos omega-6 se denomina en la presente la vía biosint�tica de ácidos grasos omega-6.

El término “funcional”, tal como se emplea en la presente en el contexto de la vía biosint�tica de ácidos grasos omega-3/omega-6, significa que algunos (o todos) los genes en la vía expresan enzimas activas, dando como resultado la catálisis o la conversión del sustrato in vivo. Debe entenderse que la “vía biosint�tica de ácidos grasos omega-3/omega-6” o la “vía biosint�tica de ácidos grasos omega-3/omega-6 funcional” no implica que todos los genes listados en el anterior párrafo son necesarios, puesto que una serie de productos de ácidos grasos solo requieren la expresión de un subconjunto de los genes en esta vía.

La expresión “vía de la delta-6 desaturasa/delta-6 elongasa” se refiere a una vía biosint�tica de PUFA que incluye m�nimamente al menos una delta-6 desaturasa y al menos una C18/20 elongasa, permitiendo as� la biosíntesis de DGLA y/o ETA a partir de LA y ALA, respectivamente, con GLA y/o STA como intermedios de ácidos grasos. Con la expresión de otras desaturasas y elongasas también pueden sintetizarse ARA, EPA, DPA y DHA.

La expresión “vía de la delta-9 elongasa/delta-8 desaturasa” se refiere a una vía biosint�tica de PUFA que incluye m�nimamente al menos una delta-9 elongasa y al menos una delta-8 desaturasa, permitiendo as� la biosíntesis de DGLA y/o ETA a partir de LA y ALA, respectivamente, con EDA y/o ETrA como intermedios de ácidos grasos. Con la expresión de otras desaturasas y elongasas también pueden sintetizarse ARA, EPA, DPA y DHA.

La expresión “intermedio de ácido graso” se refiere a cualquier ácido graso producido en una vía metabólica de ácidos grasos que después puede convertirse en el producto de acido graso previsto en esta vía mediante la acción de otras enzimas de la vía metabólica. Por ejemplo, cuando se produce EPA utilizando la vía de la delta-9 elongasa/delta-8 desaturasa, pueden producirse EDA, ETrA, GDLA, ETA y ARA y se consideran “intermedios de ácidos grasos”, puesto que estos ácidos grasos pueden convertirse después en EPA a través de la acción de otras enzimas de la vía metabólica.

La expresión “subproducto de ácido graso” se refiere a cualquier ácido graso producido en una vía metabólica de ácidos grasos que no es el producto de ácido graso previsto ni un “intermedio de ácido graso” de la vía. Por ejemplo, cuando se produce EPA utilizando la vía de la delta-9 elongasa/delta-8 desaturasa, también pueden producirse ácido esciad�nico (SCI) y ácido juniper�nico (JUP) mediante la acción de una delta-5 desaturasa sobre EDA o ETrA, respectivamente. Los primeros se consideran “subproductos de ácidos grasos”, puesto que ninguno de ellos puede convertirse después en EPA a través de la acción de otras enzimas de la vía metabólica.

El término “desaturasa” se refiere a un polip�ptido que puede desaturar, es decir, introducir un doble enlace, en uno

o más ácidos grasos para producir un ácido graso o un precursor de interés. A pesar del uso del sistema de referencia con omega a lo largo de la memoria descriptiva para nombrar ácidos grasos específicos, es más conveniente indicar la actividad de una desaturasa contando desde el extremo carboxilo del sustrato utilizando el sistema delta. De particular interés en la presente son las delta-5 desaturasas que catalizan la conversión de DGLA a ARA y/o de ETA a EPA. Otras desaturasas incluyen: 1) delta-17 desaturasas que desaturan un ácido graso entre el 17� y el 18� átomo de carbono, numerados desde el extremo carboxilo-terminal de la molécula y que, por ejemplo, catalizan la conversión de ARA a EPA y/o DGLA a ETA; 2) delta-6 desaturasas que catalizan la conversión de LA a GLA y/o de ALA a STA; 3) delta-12 desaturasas que catalizan la conversión del ácido oleico a LA; 4) delta-15 desaturasas que catalizan la conversión de LA a ALA y/o de GLA a STA; 5) delta-4 desaturasas que catalizan la conversión de DPA a DHA; 6) delta-8 desaturasas que catalizan la conversión de EDA a DGLA y/o de ETrA a ETA; y 7) delta-9 desaturasas que catalizan la conversión de palmitato a ácido palmitoleico (16:1) y/o de estearato a ácido oleico. En la técnica, las delta-15 y delta-17 desaturasas también se denominan a veces “omega-3 desaturasas”, “w3 desaturasas” y/o “omega-3 desaturasas”, basándose en su capacidad para convertir ácidos grasos omega-6 en sus homólogos de omega-3 (por ejemplo, la conversión de LA en ALA y de ARA en EPA, respectivamente). En algunas realizaciones, lo más deseable es determinar de forma empírica la especificidad de una ácido graso desaturasa concreta transformando un hospedante adecuado con el gen para la ácido graso desaturasa y determinando su efecto sobre el perfil de ácidos grasos del hospedante.

La expresión “delta-5 desaturasa” se refiere a una enzima que desatura un ácido graso entre el quinto y el sexto átomo de carbono numerados desde el extremo carboxilo-terminal de la molécula. Preferiblemente, una delta-5 desaturasa convierte el ácido dihomo-gamma-linol�nico (20:3, DGLA) en ácido araquid�nico (20:4, ARA) o convierte el ácido eicosatetraenoico (20:4, ETA) en ácido eicosapentaenoico (20:5, EPA).

Para los objetivos de la presente, el término “EgD5” se refiere a una enzima delta-5 desaturasa (SEQ ID NO:2) aislada a partir de Euglena gracilis, codificada por SEQ ID NO:1 de la presente. De modo similar, el término “EgD5S” se refiere a una delta-5 desaturasa sintética derivada de Euglena gracilis que tiene codones optimizados para la expresión en Yarrowia lipolytica (es decir, SEQ ID NO:3 y 2).

Las expresiones “eficacia de conversión” y “porcentaje de conversión del sustrato” se refieren a la eficacia con la cual una enzima concreta (por ejemplo, una desaturasa) puede convertir el sustrato en producto. La eficacia de conversión se mide según la siguiente fórmula: ([producto]/[sustrato + producto])*100, en la que “producto” incluye el producto intermedio y todos los productos en la vía derivados de él.

El término “elongasa” se refiere a un polip�ptido que puede alargar una cadena carbonada de un ácido graso para producir un ácido que es 2 carbonos más largo que el sustrato de ácido graso sobre el cual actúa la elongasa. Este proceso de alargamiento se produce a través de un mecanismo de múltiples etapas en asociación con la ácido graso sintasa, según se describe en la publicación de patente de EEUU n.� 2005/0132442. Los ejemplos de reacciones catalizadas por sistemas de elongasa son la conversión de GLA a DGLA, de STA a ETA y de ETA a DPA. En general, la selectividad de sustrato de las elongasas es bastante amplio, pero est� segregado por la longitud de la cadena y el grado y tipo de insaturaci�n. Por ejemplo, una C14/16 elongasa utilizar� un sustrato C14 (por ejemplo, ácido mir�stico), un C16/18 elongasa utilizar� un sustrato C16 (por ejemplo, palmitato), una C18/20 elongasa (también conocida como delta-6 elongasa, puesto que las expresiones pueden utilizarse de modo intercambiable) utilizar� un sustrato C18 (por ejemplo, GLA, STA), y una C20/22 elongasa utilizar� un sustrato C20 (por ejemplo, EPA). De manera similar, una delta-9 elongasa es capaz de catalizar la conversión de LA y ALA a EDA y ETrA, respectivamente. Es importante advertir que algunas elongasas tienen una amplia especificidad y, as�, una única enzima puede ser capaz de catalizar varias reacciones de elongasa (por ejemplo, actuando as� como una C16/18 elongasa y una a C18/20elongasa).

El término “oleaginoso” se referie a los organismos que tienden a almacenar su fuente de energía en forma de lípidos (Weete, en: Fungal Lipid Biochemistry, 2� ed., Plenum, 1980). La expresión “levadura oleaginosa” se refiere a los microorganismos clasificados como levaduras que pueden fabricar aceites. En general, el contenido en aceite celular o TAG de los microorganismos oleaginosos se ajusta a una curva sigmoidea, en la que la concentración de lípido aumenta hasta que alcanza un máximo en la fase logarítmica tardía o en la fase de crecimiento estacionario temprana, y después disminuye gradualmente durante las fases estacionaria tardía y de muerte (Yongmanitchai y Ward, Appl. Environ. Microbiol., 57:419-425 (1991)). No es raro que los microorganismos oleaginosos acumulen un exceso de aproximadamente 25% de su peso seco celular en forma de aceite. Los ejemplos de levaduras oleginosas incluyen, pero no se limitan a los siguientes géneros: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon y Lipomyces.

El término “Euglenophyceae” se refiere a un grupo de flagelados fotosint�ticos o incolores unicelulares (“euglenoides”) que viven en entornos de agua dulce, marina, en el suelo y en entornos parasitarios. La clase se caracteriza por ser células individuales solitarias, siendo la mayoría natatorias libres, y tienen dos flagelos (uno de los cuales puede ser no emergente) que surgen de una invaginaci�n anterior, conocida como reservorio. Los euglenoides fotosint�ticos contienen de uno o muchos cloroplastos, que varían desde discos diminutos a placas expandidas o cintas. Los euglenoides incoloros depende de la osmotrof�a o la fagotrof�a para la asimilación de nutrientes. Se han descrito aproximadamente 1000 especies y se clasifican en aproximadamente 40 géneros y 6 órdenes. Los ejemplos de Euglenophyceae incluyen, pero no se limitan a los siguientes géneros: Euglena,

Eutreptiella y Tetruetreptia.

La expresión “sustitución de amino�cidos conservativa” se refiere a una sustitución de un resto amino�cido en una proteína concreta por otro amino�cido, sin alterar la naturaleza química o funcional de esa proteína. Por ejemplo, en la técnica se sabe que son habituales las alteraciones en un gen que dan como resultado la producción de un

5 amino�cido equivalente desde el punto de vista químico en un sitio concreto (pero que no afecta a las propiedades estructurales y funcionales de la proteína codificada y plegada). Para los fines de la presente invención, las “sustituciones de amino�cidos conservativas” se definen como intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos:

1. restos alif�ticos pequeños, ligeramente polares o no polares: Ala [A], Ser [S], Thr [T] (Pro [P], Gly [G]);

10 2. restos polares con carga negativa y sus amidas: Asp [D], Asn [N], Glu [E], Gln [Q];

3.: restos polares con carga positiva: His [H], Arg [R], Lys [K];

4.: restos alif�ticos grandes, no polares: Met [M], Leu [L], Ile [I], Val [V] (Cys [C]); y,

5.: restos aromáticos grandes: Phe [F], Tyr [Y], Trp [W].

Las sustituciones de amino�cidos conservativas en general mantienen: 1) la estructura del esqueleto polipept�dico

15 en el área de la sustitución; 2) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana; o 3) la voluminosidad de la cadena lateral. Además, en muchos casos, tampoco no se espera que alteraciones en las porciones N-terminal y Cterminal de la molécula de proteína alteren la actividad de la proteína.

Tal como se emplea en la presente, un “ácido nucleico” significa un polinucle�tido e incluye un pol�mero mono-o bicatenario de bases desoxirribonucleot�dicas o ribonucleot�dicas. Los ácidos nucleicos también pueden incluir 20 fragmentos y nucleótidos modificados. As�, el término “polinucle�tido” y las expresiones “secuencia de ácido nucleico”, “secuencia de nucleótidos” o “fragmento de ácido nucleico” se emplean de modo intercambiable y son un pol�mero de ARN o ADN que es mono- o bicatenario, que contiene opcionalmente bases nucleot�dicas sintéticas, no naturales o alteradas. Los nucleótidos (que habitualmente se encuentran en su forma 5’-monofosfato) pueden indicarse mediante su denominación de una sola letra como sigue: “A” para adenilato o desoxiadenilato (para el ARN 25 o el ADN, respectivamente), “C” para citidilato o desoxicitidilato, “G” para guanilato o desoxiguanilato, “U” para uridilato, “T” para desoxitimidilato, “R” para purinas (A o G), “Y” para pirimidienos (C o T), “K” para G o T, “H” para A

o C o T, “I” para inosina, y “N” para cualquier nucleótido.

Las expresiones “subfragmento que es funcionalmente equivalente” y “subfragmento funcionalmente equivalente” se emplean de modo intercambiable en la presente. Estas expresiones se referien a una porción o subsecuencia de un 30 fragmento de ácido nucleico aislado en el que la capacidad para alterar la expresión de genes o de producir cierto fenotipo se mantiene, tanto como si el fragmento o subfragmento codifica una enzima activa como si no. Por ejemplo, el fragmento o subfragmento puede utilizarse para diseñar genes quiméricos para producir el fenotipo deseado en una planta transformada. Pueden diseñarse genes quiméricos para su uso en la supresión mediante la unión de un fragmento de ácido nucleico o uno de sus subfragmentos, tanto como si codifica una enzima activa

35 como si no, en la orientación sentido o antisentido con relación a una secuencia de promotor vegetal.

La expresión “dominio conservado” o el término “motivo” significa un conjunto de amino�cidos conservados en posiciones específicas a lo largo de una secuencia alineada de proteínas relacionadas desde el punto de vista evolutivo. Aunque los amino�cidos en otras posiciones pueden var�ar entre proteínas homólogas, los amino�cidos que est�n altamente conservados en posiciones específicas indican los amino�cidos que son fundamentales para la

40 estructura, la estabilidad o la actividad de una proteína. Debido a que se identifican por su alto grado de conservación en las secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteínas, pueden utilizarse como identificadores, o “firmas”, para determinar si una proteína con un secuencia recién determinada pertenece a una familia de proteínas previamente identificada.

Los términos y las expresiones “homología”, “homólogo”, “sustancialmente similar” y “sustancialmente

45 correspondiente” se emplean de modo intercambiable en la presente. Se refieren a fragmentos de ácidos nucleicos en los que los cambios en una o más bases nucleot�dicas no afectan a la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar en la expresión de genes o producir cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a modificaciones de los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención, tales como deleciones o inserciones de uno o más nucleótidos que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante

50 con relación al fragmento inicial no modificado. Por tanto se entiende, tal como apreciarán los expertos en la técnica, que la invención incluye más de las secuencias específicas ejemplares.

Las secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente similares a las secuencias ejemplificadas en la presente pueden hibridarse (bajo condiciones moderadamente rigurosas, por ejemplo, 0,5x SSC, SDS al 0,1%, 60 �C) con las secuencias ejemplificadas en la presente, o con cualquier porción de las secuencias de nucleótidos descritas en la 55 presente, y pueden ser funcionalmente equivalentes a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente. Las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para seleccionar fragmentos moderadamente

similares, tales como secuencias homólogas de organismos con relación distante, hasta fragmentos muy similares, tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos muy relacionados. Los lavados después de la hibridac�n determinan las condiciones de rigurosidad.

La expresión “se hibrida selectivamente” incluye la referencia a la hibridación, bajo condiciones de hibridación

5 rigurosas, de una secuencia de ácido nucleico con una secuencia diana de ácido nucleico especificada hasta un grado detectablemente mayor (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el fondo) que su hibridación con secuencias de ácidos nucleicos que no son la diana y con la sustancial exclusión de ácidos nucleicos que no son la diana. Las secuencias que se hibridan selectivamente en general presentan aproximadamente al menos 80% de identidad de secuencia, o 90% de identidad de secuencia, hasta e inclusive 100% de identidad de secuencia (es decir, totalmente

10 complementarias) entre s�.

Las expresiones “condiciones rigurosas” o “condiciones de hibridación rigurosas” incluyen la referencia a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridar� selectivamente con su secuencia diana. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y ser�n diferentes en circunstancias diferentes. Mediante el control de la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado pueden identificarse secuencias diana que sean 100%

15 complementarias con la sonda (sondado homólogo). Como alternativa, las condiciones de rigurosidad pueden ajustarse para permitir un pequeño grado de desapareamiento en las secuencias, de modo que unos grados menores de similitud puedan detectarse (sondado heter�logo). En general, una sonda tiene una longitud menor que aproximadamente 1000 nucleótidos, opcionalmente tiene una longitud menor que 500 nucleótidos.

Generalmente, las condiciones rigurosas ser�n las condiciones en las que la concentración salina sea menor que

20 aproximadamente 1,5 M de iones Na, generalmente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de iones Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 �C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos de aproximadamente 60 �C para sondas largas (por ejemplo, mayores que 50 nucleótidos). Las condiciones de rigurosidad también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida. Un ejemplo de condiciones de baja rigurosidad incluye la hibridación con

25 una disolución tampón de formamida del 30% al 35%, NaCl 1 M, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 1% a 37 �C, y un lavado en 1x a 2x SSC (20x SSC = NaCl 3,0 M/citrato de trisodio 0,3 M) de 50 a 55 �C. Un ejemplo de condiciones de rigurosidad moderada incluye la hibridación en formamida del 40% al 45%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37 �C, y un lavado en 0,5x a 1x SSC de 55 a 60 �C. Un ejemplo de condiciones de rigurosidad alta incluye la hibridación en formamida del 50% al 45%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37 �C, y un lavado en 0,1x SSC de 60 a 65 �C.

30 La especificidad generalmente est� en función de los lavados después de la hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la disolución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, la Tm puede aproximarse mediante la ecuación de Meinkoth et al., Anal. Biochem., 138:267-284 (1984): Tm = 81,5 �C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form.) - 500/l; en la que M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, %. form. es el porcentaje de formamida en la

35 disolución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) a la cual 50% de la secuencia diana complementaria se hibrida con una sonda perfectamente apareada. La Tm se reduce en aproximadamente 1 �C por cada 1% de desapareamiento; as�, la Tm, las condiciones de hibridación y/o de lavado pueden ajustarse para la hibridación con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con ≥90% de identidad, la Tm puede disminuirse 10 �C. En general, se seleccionan

40 condiciones rigurosas para que sean aproximadamente 5 �C menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones muy rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4 �C menor que el punto de fusión térmico (Tm); unas condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 �C menor que el punto de fusión térmico (Tm); unas condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11,

45 12, 13, 14, 15 o 20 �C menor que el punto de fusión térmico (Tm). Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, los expertos en la técnica entenderán que se describen inherentemente variaciones en la rigurosidad de las disoluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado deseado de desapareamiento produce una Tm menor que 45 �C (disolución acuosa) o 32 �C (disolución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC de modo que pueda utilizarse una temperatura más alta. Una guía extensa sobre la

50 hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier, Nueva York (1993); y Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2, Ausubel et al., eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1995). Las condiciones de hibridación y/o lavado pueden aplicarse durante al menos 10, 30, 60, 90,120, o 240 minutos. Los polinucle�tidos de

55 la invención aislados son como se definen en las reivindicaciones 1 y 2.

Una “porción sustancial” de una secuencia de amino�cidos o nucleótidos es la porción que comprende el suficiente tramo de la secuencia de amino�cidos de un polip�ptido o de la secuencia de nucleótidos de un gen como para identificar putativamente el polip�ptido o el gen, mediante evaluación manual de la secuencia por un experto en la técnica, o mediante comparación de secuencias automática por ordenador e identificación utilizando algoritmos, 60 tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993)). En general, una secuencia de diez o más amino�cidos continuos o de treinta o más nucleótidos es necesaria para identificar putativamente una secuencia de un polip�ptido o de un ácido nucleico como homóloga con una proteína o

gen conocido. Además, con respecto a las secuencias de nucleótidos, pueden utilizarse sondas oligonucle�tidicas específicas de gen que comprenden 20-30 nucleótidos contiguos en métodos de identificación de genes dependientes de secuencia (por ejemplo, hibridación Southern) y aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteri�fagos). Además, pueden utilizarse oligonucle�ticos cortos de 12-15 bases

5 como cebadores de amplificación en la PCR, para obtener un fragmento de ácido nucleico concreto que comprenda los cebadores. Por consiguiente, una “porción sustancial” de una secuencia de nucleótidos comprende el suficiente tramo de la secuencia para identificar específicamente y/o aislar un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La presente memoria descriptiva describe las secuencias de amino�cidos y de nucleótidos completas que codifican proteínas euglenoides concretas. Los expertos en la técnica, utilizando las secuencias indicadas en la presente, ahora pueden utilizar una porción sustancial o completa de las secuencias descritas para los fines conocidos para los expertos en la técnica. Por consiguiente, la presente invención comprende las secuencias completas según se indica en la lista de secuencias adjunta. En la presente se describen porciones sustanciales de estas secuencias, según se definió anteriormente.

El término “complementario” se emplea para describir la relación entre las bases de nucl�otidos que son capaces de

15 hibridarse entre s�. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria con la timina, y la citosina es complementaria con la guanina. Por consiguiente, la presente invención también incluye fragmentos de ácidos nucleicos aislados que son complementarios con las secuencias completas según se indican en el listado de secuencias adjunto, as� como las secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente similares.

Los términos “homología” y “homólogo” se emplean de modo intercambiable en la presente. Se refieren a fragmentos de ácidos nucleicos en los que cambios en una o más bases nucleot�dicas no afectan a la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar en la expresión del gen o producir un cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a modificaciones de los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención, tales como deleciones o inserciones de uno o más nucleótidos, que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante con relación al fragmento inicial no modificado. Por tanto, se entiende, según

25 apreciarán los expertos en la técnica, que la invención incluye más de las secuencias ejemplares específicas.

Las secuencias de ácidos nucleicos que son homólogas con las secuencias ejemplificadas en la presente, o con cualquier porción de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente y que son funcionalmente equivalentes con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente, pueden hibridarse, bajo condiciones moderadamente rigurosas (por ejemplo, 0,5x SSC, SDS al 0,1%, 60 �C) con las secuencias ejemplificadas en la presente, o con cualquier porción de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente y que sean funcionalmente equivalentes a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente.

La “degeneración de codones” se refiere a la naturaleza del código genético, que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar a la secuencia de amino�cidos de un polip�ptido codificado. Por consiguiente, la presente invención se refiere a cualquier fragmento de ácido nucleico que codifica toda la secuencia de

35 amino�cidos que codifica el presente polip�ptido euglenoide, según se indica en SEQ ID NO:2. Los expertos en la técnica conocen el “sesgo de codones” que muestra una célula hospedante específica en la utilización de codones de nucleótidos para especificar un amino�cido concreto. Por tanto, cuando se sintetiza un gen para una mayor expresión en una célula hospedante, resulta deseable diseñar el gen de forma que su frecuencia de utilización de codones se aproxime a la frecuencia de la utilización de codones preferida de la célula hospedante.

“Sintetizado de modo químico”, con relación a una secuencia de ADN, significa que los componentes nucleot�dicos se ensamblaron in vitro. La síntesis química manual del ADN puede realizarse utilizando procedimientos bien establecidos, o la síntesis química automática puede realizarse utilizando una de una serie de máquinas disponibles en el mercado. Pueden sintetizarse “genes sintéticos” a partir de bloques básicos de oligonucle�tidos que se sintetizan de modo químico utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos bloques

45 básicos se acoplan y aparean para formar segmentos de genes que después se ensamblan enzim�ticamente para construir el gen completo. Por consiguiente, los genes pueden adaptarse para una expresión óptima de los genes basándose en la optimización de secuencias de nucleótidos para reflejar el sesgo de codones de la célula hospedante. Los expertos en la técnica apreciarán la probabilidad de que se produzca con éxito la expresión del gen si la utilización de los codones est� sesgada hacia los codones preferidos por el hospedante. La determinación de los codones preferidos puede basarse en una investigación de los genes derivados de la célula hospedante, cuando est� disponible la información de la secuencia.

Un “gen” se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, y puede referirse a la región codificadora sola o puede incluir secuencias reguladoras que preceden (secuencias 5’ no codificadoras) y suceden (secuencias 3’ no codificadoras) a la secuencia codificadora. Un “gen nativo” se refiere a un gen según se 55 encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. Un “gen quimérico” se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificadoras que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. Un “gen end�geno” se refiere al gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un gen “extraño” se refiere a un gen que es introducido en el organismo hospedante mediante transferencia de genes. Los genes

extra�os pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, genes nativos introducidos en una nueva localización dentro del hospedante nativo, o genes quiméricos. Un “transg�n” es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación. Un “gen con codones optimizados” es un gen cuya frecuencia de utilización de codones se ha diseñado para que imite la frecuencia de la utilización de

5 codones preferida de la célula hospedante.

Una “secuencia codificadora” se refiere a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de amino�cidos específica. Las “secuencias reguladoras adecuadas” se refieren a secuencias de nucleótidos localizadas cadena arriba (secuencias 5’ no codificadoras), dentro, o cadena abajo (secuencias 3’ no codificadoras) de una secuencia codificadora, y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o la traducción de la

10 secuencia codificadora asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias conductoras de la traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de la poliadenilaci�n, sitios de procesamiento del ARN, sitios de unión a efectores y estructuras de tallo-bucle.

El término “alelo” se refiere a una de varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus concreto sobre un cromosoma. Cuando todos los alelos presentes en un locus concreto sobre un cromosoma son iguales, entonces la

15 planta es homocig�tica en ese locus. Si los alelos presentes en un locus concreto sobre un cromosoma son diferentes, entonces esa planta es heterocig�tica en ese locus.

Un “promotor” se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificadora o ARN funcional. En general, una secuencia codificadora se localiza 3’ con respecto a una secuencia de promotor. Los promotores pueden proceder en su totalidad de un gen nativo, o pueden estar compuestos de diferentes elementos 20 derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintéticos. Los expertos en la técnica entenderán que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas del desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales o fisiológicas. Los promotores que provocan que un gen se exprese en la mayoría de los tipos celulares la mayoría de las veces se denominan habitualmente “promotores constitutivos”. También se reconoce que, puesto

25 que en la mayoría de los casos, los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido por completo, fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener idéntica actividad promotora.

Una secuencia de promotor puede consistir en elementos proximales y elementos cadena arriba más distales, denominándose a menudo estos últimos potenciadores. Por consiguiente, un “potenciador” es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad de promotores, y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento

30 heter�logo insertado para potenciar el nivel o la especificidad de tejido de un promotor. Constantemente se est�n descubriendo nuevos promotores de diversos tipos útiles en células vegetales, pudiéndose encontrar numerosos ejemplos en la compilación por Okamuro, J.K., y Goldberg, R.B., Biochemistry of Plants, 15:1-82 (1989).

Una “secuencia conductora de la traducción” se refiere a una secuencia polinucleot�dica localizada entre la secuencia del promotor de un gen y la secuencia codificadora. La secuencia conductora de la traducción est�

35 presente en el ARMm totalmente procesado cadena arriba de la secuencia de inicio de la traducción. La secuencia conductora de la traducción puede afectar al procesamiento del transcrito primario a ARNm, a la estabilidad del ARNm o a la eficacia de la transcripción. Se han descrito ejemplos de secuencias conductoras de la traducción (Turner, R. y Foster, G.D., Mol. Biotechnol., 3:225-236 (1995)).

Las expresiones “secuencias 3’ no codificadoras” y “terminador de la transcripción” se refieren a secuencias de ADN

40 localizadas cadena abajo de una secuencia codificadora. Estas incluyen secuencia de reconocimiento de la polinadenilaci�n y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar al procesamiento del ARNm o la expresión de genes. La señal de poliadenilaci�n habitualmente se caracteriza por afectar a la adición de tramos de poli(ácido aden�lico) al extremo 3’ del precursor de ARNm. La región 3’ puede influir en la transcripción, el procesamiento del ARN o la estabilidad, o la traducción de la secuencia codificadora asociada.

45 Un “transcrito de ARN” se refiere al producto que resulta de la transcripción catalizada por ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el transcrito de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se denomina el transcrito primario, o puede ser una secuencia de ARN derivada del procesamiento postranscripcional del transcrito primario y se denomina ARN maduro. “ARN mensajero” o “ARNm” se refiere al ARN que no tiene intrones y que puede ser traducido a una proteína por la célula. “ADNc” se refiere a un ADN bicatenario que es

50 complementario y se deriva de ARNm. Un ARN “sentido” se refiere a un transcrito de ARN que incluye el ARNm y as� también puede ser traducido a una proteína por la célula. “ARN antisentido” se refiere a un transcrito de ARN que es complementario con todo o una parte de un transcrito primario diana o ARNm y que bloquea la expresión de un gen diana (patente de EEUU 5.107.065; publicación PCT n.� WO 99/28508). La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito del gen específico, es decir, en la secuencia 5’ no

55 codificadora, la secuencia 3’ no codificadora, o la secuencia codificadora. “ARN funcional” se refiere a ARN antisentido, ARN de ribozimas, u otro ARN que no sea traducido y siga teniendo un efecto sobre los procesos celulares.

La expresión “unido operablemente” se refiere a la asociación de secuencias de ácidos nucleicos sobre un único fragmento de ácido nucleico de forma que la función de una es afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor est� unido operablemente con una secuencia codificadora cuando es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia codificadora (es decir, la secuencia codificadora est� bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificadoras pueden estar unidas operablemente a secuencias reguladoras en la orientación sentido o antisentido.

El término “expresión”, tal como se emplea en la presente, se refiere a la transcripción y la acumulación estable de 5 ARN sentido (ARNm) o antisentido derivado de los fragmentos de ácidos nucleicos de la invención. La expresión también puede referirse a la traducción de ARNm en un polip�ptido.

Una proteína “madura” se refiere a un polip�ptido procesado de modo postraduccional, es decir, un polip�ptido del que se ha retirado cualquier pre- o prop�ptido presente en el producto de la traducción primario. Una proteína “precursora” se refiere al producto primario de la traducción de ARNm, es decir, con los pre- y prop�ptidos aún

10 presentes. Los pre- y prop�ptidos pueden ser señales de localización intracelular (pero no se limitan a estas).

Una “transformación” se refiere a la transferencia de una molécula de ácido nucleico hacia un organismo hospedante, que resulta en una herencia genéticamente estable. La molécula de ácido nucleico puede ser un pl�smido que se replica de forma autónoma, por ejemplo, o puede integrarse en el genoma del organismo hospedante. Los organismos hospedantes que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformado se

15 denominan organismos “transg�nicos”, “recombinantes” o “transformados”.

Los términos “pl�smido”, “vector” y “módulo” se refieren a un elemento extracromos�mico que a menudo porta genes que no son parte del metabolismo central de la célula, y habitualmente est�n en forma de fragmentos de ADN bicatenario circular. Estos elementos pueden ser secuencias de replicaci�n autónoma, secuencias de integración en el genoma, secuencias de fagos o nucleótidos, lineales o circulares, de un ADN o ARN monocatenario o bicatenario,

20 derivado de cualquier fuente, en las que una serie de secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado para producir una construcción exclusiva que es capaz de introducir un fragmento de promotor y una secuencia de ADN para un producto g�nico seleccionado, junto con la secuencia 3’ no traducida apropiada, en una célula. Un “módulo de expresión” se refiere a un vector específico que contiene un gen extraño y que tiene elementos, además del gen extraño, que permiten una expresión potenciada de este gen en un hospedante extraño.

25 La expresión “porcentaje de identidad”, tal como se conoce en el técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipept�dicas o dos o más secuencias polinucleot�dicas, según se determina comparando las secuencias. En la técnica, “identidad” también significa el grado de relación de secuencia entre las secuencias polipept�dicas o polinucleot�dicas, según sea el caso, según se determina mediante el apareamiento entre las hebras de dichas secuencias. La “identidad” y la “similitud” pueden ser calculadas con facilidad mediante métodos

30 conocidos, que incluyen pero no se limitan a los descritos en: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A.M., ed.), Oxford University, NY (1988); 2.) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D.W., ed.), Academic, NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, parte I (Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds.), Humania, NJ (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.), Academic (1987); y, 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J., eds.), Stockton, NY (1991).

35 Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para producir el mejor apareamiento entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud est�n codificados en programas inform�ticos disponibles al público. Los alineamientos de secuencias y los cálculos del porcentaje de identidad pueden realizarse utilizando el programa MegAlign™ del paquete bioinform�tico de LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Se realizan múltiples alineamientos de las secuencias utilizando el "método de alineamiento Clustal",

40 que incluye varias variedades del algoritmo, que incluyen el "método de alineamiento Clustal V ", que se corresponde con el método de alineamiento denominado Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS, 5:151153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appi. Biosci., 8:189-191 (1992)) y que se encuentra en el programa MegAlign™ del paquete bioinform�tico de LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para múltiples alineamientos, los valores por defecto se corresponden con una PENALIZACI�N DE HUECO = 10 y una PENALIZACI�N DE LONGITUD DE

45 HUECO = 10. Los parámetros por defecto para alineamientos apareados y el cálculo del porcentaje de identidad de secuencias de proteínas utilizando el método Clustal V son KTUPLE = 1, PENALIZACI�N DE HUECO = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5. Para ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE = 2, PENALIZACI�N DE HUECO = 5, VENTANA = 4 y DIAGONALES GUARDADAS = 4. Después del alineamiento de las secuencias utilizando el programa Clustal V, es posible obtener un “porcentaje de identidad” visualizando la tabla

50 de “distancias de secuencias” en el mismo programa. Además, el "método de alineamiento Clustal W " est� disponible y se corresponde con el método de alineamiento denominado Clustal W (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput Appi. Biosci., 8:189-191(1992)) y que se encuentra en el programa MegAlign™ v6.1 del paquete bioinform�tico de LASERGENE (DNASTAR Inc.). Los parámetros por defecto para múltiples alineamientos se corresponden con una PENALIZACI�N DE HUECO = 10, PENALIZACI�N

55 DE LONGITUD DE HUECO = 0,2, retraso de secs. divergentes (%) = 30, peso de transición de ADN = 0,5, matriz de peso de proteínas = serie Gonnet, matriz de peso del ADN = IUB. Después del alineamiento de las secuencias utilizando el programa Clustal W, es posible obtener un “porcentaje de identidad” visualizando la tabla de “distancias de secuencias” en el mismo programa.

El “método de alineamiento BLASTN” es un algoritmo proporcionado por the National Center for Biotechnology 60 Information (NCBI) para comparar secuencias de nucleótidos utilizando parámetros por defecto.

Los expertos en la técnica entienden bien que muchos niveles de identidad de secuencia son útiles para identificar polip�ptidos de otras especies, en los que dichos polip�ptidos tienen una función o actividad idéntica o similar. Fragmentos de ácidos nucleicos adecuados codifican polip�ptidos que son al menos aproximadamente 70% idénticos, preferiblemente al menos aproximadamente 75% idénticos, y más preferiblemente al menos 5 aproximadamente 80% idénticos a las secuencias de amino�cidos indicadas en la presente. Los fragmentos de ácidos nucleicos preferidos codifican secuencias de amino�cidos que son al menos aproximadamente 85% idénticos a las secuencias de amino�cidos indicadas en la presente. Los fragmentos de ácidos nucleicos más preferidos codifican secuencias de amino�cidos que son al menos aproximadamente 90% idénticas a las secuencias de amino�cidos indicadas en la presente. Los fragmentos de ácidos nucleicos aún más preferidos codifican secuencias de amino�cidos que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las secuencias de amino�cidos indicadas en la presente. Aunque los intervalos preferidos se han descrito anteriormente, cualquier número entero que represente la identidad de amino�cidos desde 39% al 100% puede ser útil en la descripción de la invención, tal como 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%,

15 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.

Los fragmentos de ácidos nucleicos adecuados no solo tienen las anteriores homologías sino que generalmente codifican un polip�ptido que tiene al menos 50 amino�cidos, preferiblemente al menos 100 amino�cidos, más preferiblemente al menos 150 amino�cidos, aún más preferiblemente al menos 200 amino�cidos, y lo más preferiblemente al menos 250 amino�cidos. Los polinucle�tidos de la invención son como se define en las reivindicaciones 1 y 2.

La expresión “dominio conservado” o el término “motivo” significa un conjunto de amino�cidos conservados en posiciones específicas a lo largo de una secuencia alineada de proteínas relacionadas desde el punto de vista evolutivo. Aunque los amino�cidos en otras posiciones pueden variar entre proteínas homólogas, los amino�cidos que est�n muy conservados en posiciones específicas indican amino�cidos que son fundamentales para la

25 estructura, la estabilidad o la actividad de una proteína. Debido a que se identifican por su alto grado de conservación en las secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteínas, pueden utilizarse como identificadores, o “firmas”, para determinar si una proteína con una secuencia recién determinada pertenece a una familia de proteínas previamente identificada.

La expresión “software de análisis de secuencia” se refiere a cualquier algoritmo o programa de software inform�tico que es útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o de amino�cidos. El “software de análisis de secuencia” puede estar disponible en el mercado o desarrollarse de modo independiente. El software de análisis de secuencia t�pico incluir�, aunque no se limita a: 1.) el paquete de programas GCG (Wisconsin Package versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI); 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)); 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison, WI); 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI); y;

35 5.) el programa FASTA que incorpora el algoritmo de Smith-Waterman (W.R. Pearson, Comput. Methods Genome Res. [Proc. Int. Symp.] (1994), fecha de la convocatoria 1992, 111-120, editor(es): Suhai, Sandor, Plenum, Nueva York, NY). Dentro del contexto de esta solicitud, se entender� que cuando se emplea un software de análisis de secuencias para un análisis, los resultados del análisis se basarán en los “valores por defecto” del programa indicado, a menos que se indique lo contrario. Tal como se emplean en la presente, los “valores por defecto” significan cualquier conjunto de valores de parámetros que se cargan originariamente con el software cuando se inicia por primera vez. Con respectol al algoritmo BLASTP utilizado en la presente, los parámetros por defecto incluirán las frecuencias de amino�cidos de Robinson y Robinson (Robinson A.B., Robinson L.R., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 88:8880-8884 (1991)), la matriz de puntuación BLOSUM62 y el coste de hueco !(g) = 11 + g.

La expresión “partes de plantas” incluye tejidos diferenciados y no diferenciados que incluyen, pero no se limitan a

45 los siguientes: raíces, tallos, brotes, hojas, polen, semillas, tejido tumoral y diversas formas de células y cultivos (por ejemplo, células individuales, protoplastos, embriones y tejido de callo). El tejido vegetal puede estar en la planta o en un cultivo de órganos, tejidos o células vegetales.

La expresión “órgano de la planta” se refiere a un tejido o grupo de tejidos vegetales que constituyen una parte morfológica y funcionalmente diferenciada de una planta.

El término “genoma” se refiere a lo siguiente: (1) el complemento completo de material genético (genes y secuencias no codificadoras) presente en cada célula de un organismo, o virus u org�nulo; (2) un conjunto completo de cromosomas heredado como una unidad (haploide) de un progenitor.

Las técnicas de ADN recombinante y de clonaci�n molecular convencionales utilizadas en la presente son muy conocidas en la técnica y se describen en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory

55 Manual, 2� ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) (en lo sucesivo ”Maniatis”); en Silhavy, T.J., Bennan, M.L. y Enquist, L.W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984); y en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, Hoboken, NJ (1987).

Las expresiones “construcción recombinante”, “construcción de expresión”, “construcción quimérica”, “construcción”

y “construcción de ADN recombinante” se emplean de modo intercambiable en la presente. Una construcción recombinante comprende una combinación artificial de fragmentos de ácidos nucleicos, por ejemplo, secuencias reguladoras y codificadoras que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por ejemplo, una construcción quimérica puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que se derivan de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente de la que se encuentra en la naturaleza. Esta construcción puede utilizarse por s� misma o puede utilizarse junto con un vector. Si se emplea un vector, entonces la elección del vector depende del procedimiento que se va a utilizar para transformar células hospedantes, tal como saben los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse un vector plasm�dico. Los expertos en la técnica son conscientes de los elementos genéticos que deben estar presentes sobre el vector para transformar, seleccionar y propagar con éxito células hospedantes que comprenden cualquiera de los fragmentos de ácidos nucleicos aislados de la invención. Los expertos en la técnica también reconocerán que diferentes acontecimientos de transformación independientes producirán diferentes niveles y patrones de expresión (Jones et al., EMBO J., 4:2411-2418 (1985); De Almeida et al., Mol. Gen. Genetics, 218:7886 (1989)), y as� deben seleccionarse múltiples acontecimientos para obtener líneas que muestren el nivel de expresión y el patrón deseados. Esta selección puede realizarse mediante un análisis Southern del ADN, un análisis Northern de la expresión de ARNm, un análisis de inmunotransferencia de la expresión de proteínas, o un análisis fenot�pico, entre otros.

El término “expresión”, tal como se emplea en la presente, se refiere a la producción de un producto final funcional (por ejemplo, un ARNm o una proteína (precursora o madura)).

El término “introducido” significa proporcionar un ácido nucleico (por ejemplo, una construcción de expresión) o una proteína a una célula. Introducido incluye la referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, en el que el ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula, e incluye la referencia al suministro transitorio de un ácido nucleico o una proteína a la célula. Introducido incluye la referencia a métodos de transformación estable o transitoria, as� como a la reproducción sexual. As�, “introducido”, en el contexto de insertar un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, una construcción de ADN recombinante/construcción de expresión) en una célula significa la “transfecci�n” o “transformación”o “transducci�n”, e incluye la referencia a la incorporación de un fragmento de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, en la que el fragmento de ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, pl�smido, pl�stido o ADN mitocondrial), convertirse en un replic�n autónomo, o expresarse de modo transitorio (por ejemplo, ARNm transfectado).

Una proteína “madura” se refiere a un polip�ptido procesado de modo postraduccional (es decir, un polip�ptido en el que se ha retirado cualquier pre- o prop�ptido presente en el producto de la traducción primaria). Una proteína “precursora” se refiere al producto primario de la traducción a ARNm (es decir, con los pre-y prop�ptidos aún presentes). Los pre- y prop�ptidos pueden ser, aunque no se limitan a señales de localización intracelulares.

La “transformación estable” se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un genoma de un organismo hospedante, que incluyen los genomas nuclear y organular, que da como resultado una herencia genéticamente estable. Por contraste, una “transformación transitoria” se refiere a la tranferencia de un fragmento de ácido nucleico al núcleo o a un org�nulo que contienen ADN de un organismo hospedante, dando como resultado la expresión g�nica sin integración ni herencia estable. Los organismos hospedantes que contienen los fragmentos de ácidos nucleicos transformados se denominan organismos “transg�nicos”.

Tal como se emplea en la presente, “transg�nico” se refiere a una planta o una célula que comprende, en su genoma, un polinucle�tido heter�logo. Preferiblemente, el polinucle�tido heter�logo est� integrado de modo estable en el genoma, de modo que el polinucle�tido se transmite a las generaciones sucesivas. El polinucle�tido heter�logo puede estar integrado en el genoma por s� solo o como parte de una construcción de expresión. Transg�nico, tal como se emplea en la presente, incluye cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de una planta, o planta, cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia de un ácido nucleico heter�logo que incluye estos transg�nicos inicialmente alterados de este modo, as� como los creados mediante cruzamientos sexuales o propagación asexual a partir del transg�nico inicial. El término “transg�nico”, tal como se emplea en la presente, no incluye la alteración del genoma (cromos�mico o extracromos�mico) mediante métodos de cruzamiento de plantas convencionales o mediante acontecimientos naturales, tales como fertilización cruzada aleatoria, infección v�rica no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante, o mutación espontánea.

La “inhibición antisentido” se refiere a la producción de transcritos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína diana. La “cosupresi�n” se refiere a la producción de transcritos de ARN sentido capaces de suprimir la expresión de genes end�genos o extraños sustancialmente similares o idénticos (patente de EEUU n.� 5.231.020). Las construcciones de cosupresi�n en plantas han sido previamente diseñadas enfoc�ndose en la sobreexpresi�n de una secuencia de ácido nucleico que tiene homología con un ARNm end�geno, en la orientación sentido, que da como resultado la reducción de todo el ARN que presenta homología con la secuencia sobreexpresada (Vaucheret et al., Plant J., 16:651-659 (1998); Gura, Nature, 404:804-808 (2000)). La eficacia global de este fenómeno es baja, y el grado de reducción del ARN varía mucho. Un trabajo más reciente ha descrito el uso de estructuras de “horquilla” que incorporan todo o parte de una secuencia codificadora de ARNm en una orientación complementaria que produce una estructura de “tallo-bucle” potencial para el ARN expresado (publicación PCT n.�

WO 99/53050, publicada el 21 de octubre, 1999; publicación PCT n.� WO 02/00904, publicada el 3 de enero, 2002). Esto aumenta la frecuencia de la cosupresi�n en las plantas transg�nicas recuperadas. Otra variación describe el uso de secuencias v�ricas vegetales para dirigir la supresión, o “silenciamiento”, de secuencias que codifican ARNm proximales (publicación PCT n.� WO 98/36083, publicada el 20 de agosto, 1998). Aún no se ha aclarado el

5 mecanismo de estos dos fenómenos de cosupresi�n, aunque algunas pruebas genéticas han empezado a desentrañar esta compleja situación (Elmayan et al., Plant Cell, 10:1747-1757 (1998)).

Bios�ntesis microbiana de ácidos grasos y triacilglic�ridos: una vision general

En general, la acumulación de lípidos en microorganismos oleaginosos se activa en respuesta a la proporción global de carbono a nitrógeno en el medio de crecimiento. Este proceso, que conduce a la síntesis de novo de palmitato

10 libre (16:0) en microorgranismos oleaginosos, se describe en detalle en la publicación PCT n.� WO 2004/101757. El palmitato es el precursor de derivados de ácidos grasos saturados e insaturados de cadena más larga, que se forman a través de la acción de elongasdas y desaturasas (figura 1).

Los TAG (la principal unidad de almacenamiento de ácidos grasos) se forman mediante una serie de reacciones que implican: 1.) la esterificaci�n de una molécula de acil-CoA a glicerol-3-fosfato a través de una aciltransferasa para 15 producir ácido lisofosfat�dico; 2.) la esterificaci�n de una segunda molécula de acil-CoA a través de una aciltransferasa para producir 1,2-diacilglicerol fosfato (denominado habitualmente ácido fosfat�dico); 3.) la eliminación de un fosfato mediante la ácido fosfat�dico fosfatasa para producir 1,2-diacilglicerol (DAG); y 4.) la adición de un tercer ácido graso mediante la acción de una aciltransferasa para formar TAG. Puede incorporarse un amplio espectro de ácido grasos a los TAG, que incluyen ácidos grasos saturados e insaturados y ácidos grasos de

20 cadena corta y de cadena larga.

Bios�ntesis de ácidos grasos omega

El proceso metabólico en el que ácido oleico se convierte en ácidos grasos omega-3/omega-6 implica el alargamiento de la cadena carbonada mediante la adición de átomos de carbono y la desaturaci�n de la molécula a través de la adición de dobles enlaces. Esto requiere una serie de enzimas de desaturaci�n y alargamiento

25 especiales presentes en la membrana del retículo endopl�smico. Sin embargo, tal como se muestra en la figura 1 y se describe a continuación, a menudo existen múltiples vías alternativas para la producción de un ácido graso omega-3/omega-6 específico.

De modo específico, todas las vías requieren la conversión inicial del ácido oleico en LA, el primero de los ácidos grasos omega-6, por medio de una delta-12 desaturasa. Después, utilizando la vía de “delta-6 desaturasa/delta-6 30 elongasa”, los ácidos grasos omega-6 se forman como sigue: (1) el LA se convierte en GLA por medio de una delta6 desaturasa; (2) el GLA se convierte en DGLA por medio de una C18/20 elongasa; y (3) el DGLA se convierte en ARA por medio de una delta-6 desaturasa. Como alternativa, la “vía de delta-6 desaturasa/delta-6 elongasa” puede utilizarse para la formación de ácidos grasos omega-3 como sigue: (1) el LA se convierte en ALA, el primero de los ácidos grasos omega-3, por medio de una delta-15 desaturasa; (2) el ALA se convierte en STA por medio de una

35 delta-6 desaturasa; (3) el STA se convierte en ETA por medio de una C18/20 elongasa; (4) el ETA se convierte en EPA por medio de una delta-5 desaturasa; (5) el EPA se convierte en DPA por medio de una C20/22 elongasa; y (6) el DPA se convierte en DHA por medio de una delta-4 desaturasa. Opcionalmente, los ácidos grasos omega-6 pueden convertirse en ácidos grasos omega-3; por ejemplo, se producen ETA y EPA a partir de DGLA y ARA, respectivamente, por medio de la actividad delta-17 desaturasa.

40 Otras vías para la biosíntesis de ácidos grasos omega-3/omega-6 utilizan una delta-9 elongasa y una delta-8 desaturasa. De modo más específico, LA y ALA pueden convertirse en EDA y ETrA, respectivamente, por medio de una delta-9 elongasa; después, una delta-8 desaturasa convierte EDA a DGLA y/o ETrA a ETA.

Se contempla que las funcionalidades concretas requeridas para ser expresadas en un organismo hospedante específico para la producción de ácidos grasos omega-3/omega-6 dependerán de la célula hospedante (y su perfil 45 de PUFA nativo y/o perfil de desaturasa/elongasa), la disponibilidad del sustrato, y el producto o productos finales deseados. Los expertos en la técnica ser�n capaces de identificar diversos genes candidatos que codifican cada una de las enzimas deseadas para la biosíntesis de ácidos grasos omega-3/omega-6. Las secuencias de desaturasas y elongasas útiles pueden obtenerse de cualquier fuente, por ejemplo, pueden aislarse a partir de una fuente natural (de bacterias, algas, hongos, plantas, animales, etc.), pueden producirse a través de una vía semisint�tica, o pueden 50 sintetizarse de novo. Aunque la fuente concreta de los genes de desaturasa y elongasa introducidos en el hospedante no es crítica, las consideraciones para elegir un polip�ptido específico que tenga actividad desaturasa o elongasa incluyen: 1.) la especificidad de sustrato del polip�ptido; 2.) si el polip�ptido, o uno de sus componentes, es una enzima limitante de la velocidad; 3.) si la desaturasa o elongasa es fundamental para la síntesis de un PUFA deseado; y/o 4.) los cofactores requeridos por el polip�ptido. El polip�ptido expresado preferiblemente tiene unos

55 parámetros compatibles con el entorno bioquímico de su localización en la célula hospedante (véase la publicación PCT n.� WO 2004/101757 para más detalles).

En otras realizaciones, también ser� útil consderar la eficacia de conversión de cada desaturasa y/o elongasa concreta. De modo más específico, puesto que cada enzima raramente actúa con 100% de eficacia para convertir el sustrato en producto, el perfil final de lípidos de los aceites no purificados producidos en una célula hospedante generalmente ser� una mezcla de diversos PUFA, formada por el ácido graso omega-3/omega-6 deseado, as� como diversos PUFA intermedios corriente arriba. As�, la eficacia de conversión de cada enzima también es una variable a considerar cuando se optimiza la biosíntesis de un ácido graso deseado.

5 Teniendo en mente cada una de las anteriores consideraciones, pueden identificarse los genes candidatos con las actividades desaturasa y elongasa apropiadas (por ejemplo, delta-6 desaturasas, C18/20 elongasas, delta-5 desaturasas, delta-17 desaturasas, delta-15 desaturasas, delta-9 desaturasas, delta-12 desaturasas, C14/16 elongasas, C16/18 elongasas, delta-9 elongasas, delta-8 desaturasas, delta-4 desaturasas y C20/22 elongasas) según la bibliografía pública (por ejemplo, GenBank), la bibliografía de patentes, y el análisis experimental de organismos

10 que tienen la capacidad de producir PUFA. Estos genes ser�n adecuados para su introducción en un organismo hospedante específico, para permitir o potenciar la síntesis de PUFA por el organismo.

Identificaci�n de la secuencia de una nueva delta-5 desaturasa de Euglena gracilis

En la presente invención, se ha aislado una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:1) de Euglena gracilis que codifica una delta-5 desaturasa (SEQ ID NO:2), denominada en la presente “EgD5”.

15 La comparación de las secuencias de amino�cidos deducida y de bases nucleot�dicas de EgD5 con bases de datos públicas revela que las secuencias conocidas más similares son aproximadamente 39% idénticas a la secuencia de amino�cidos de EgD5 indicada en la presente a lo largo de una longitud de 449 amino�cidos utilizando un método de alineamiento ClustalW. Los fragmentos de amino�cidos de la invención son al menos aproximadamente 90% idénticos a las secuencias de la presente, y las secuencias que son al menos aproximadamente 90%-95% idénticas

20 son las más preferidas. De forma similar, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican EgD5 preferidas que se corresponden con el presente ORF son las que codifican proteínas activas y son al menos aproximadamente 90% idénticas a las secuencias de ácidos nucleicos de EgD5 indicadas en la presente, y las secuencias que son al menos aproximadamente 90%-95% idénticas son las más preferidas.

En otras realizaciones, la presente secuencia de desaturasa EgD5 puede someterse a una optimización de codones

25 para la expresión en un organismo hospedante concreto. Tal como se conoce en la técnica, esto puede ser un medio útil para optimizar aún más la expresión de la enzima en un hospedante alternativo, puesto que el uso de codones preferidos por el hospedante puede potenciar sustancialmente la expresión del gen extraño que codifica el polip�ptido. En general, los codones preferidos por el hospedante pueden ser determinados dentro de una especie hospedante concreta estudiando la utilización de codones en proteínas (preferiblemente las que se expresan en

30 mayor cantidad) y determinando qué codones se utilizan con mayor frecuencia. Después, la secuencia codificadora para un polip�ptido de interés que tiene, por ejemplo, actividad desaturasa, puede sintetizarse en su totalidad o en parte utilizando los codones preferidos en la especie hospedante.

En una realización preferida de la presente invención, EgD5 fue sometida a una optimización de codones para la expresión en Yarrowia lipolytica. Esto fue posible determinando, en primer lugar, el perfil de utilización de codones 35 de Yarrowia lipolytica (véase la publicación PCT n.� WO 04/101757 y la patente de EEUU 7.125.672) e identificando los codones preferidos. Después, para una mayor optimización de la expresión de genes en Y. lipolytica, se determin� la secuencia consenso alrededor del cod�n de inicio “ATG”. Esta optimización produjo una modificación de 196 pb de la región codificadora de 1350 pb (14,5%) y una optimización de 189 codones del total de 449 codones (42%). Ninguna de las modificaciones en el gen con codones optimizados (“EgD5S”, SEQ ID NO:3) cambi� la

40 secuencia de amino�cidos de la proteína codificada (SEQ ID NO:2). Tal como se describe en el ejemplo 11, el gen con codones optimizados era 36% más eficaz para desaturar DGLA a ARA que el gen de tipo salvaje, cuando se expresa en Y. lipolytica.

Los expertos en la técnica ser�n capaces de utilizar las indicaciones de la presente para crear diversas otras proteínas de delta-5 desaturasa con codones optimizados adecuadas para la expresión óptima en otros

45 hospedantes (es decir, distintos de Y. lipolytica), basándose en la secuencia de EgD5 de tipo salvaje. Por consiguiente, la presente invención se refiere a cualquier proteína de delta-5 desaturasa con codones optimizados que se deriva de EgD5 de tipo salvaje (es decir, codificada por SEQ ID NO:2). Esto incluye, pero no se limita a la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:3, que codifica una proteína de delta-5 desaturasa sintética (es decir, EgD5S) que se sometió a una optimización de codones para su expresión en Yarrowia lipolytica.

50 Identificación y aislamiento de homólogos

Cualquiera de las presentes secuencias de desaturasas (es decir, EgD5, EgD5S), o sus porciones, puede utilizarse para seleccionar homólogos de delta-5 desaturasa en la misma especie bacteriana, algal, f�ngica, euglenoide o vegetal o en otra distinta, utilizando un software de análisis de secuencia. En general, estos softwares inform�ticos aparean secuencias similares asignando un grado de homología a diversas sustituciones, deleciones y otras

55 modificaciones.

Como alternativa, cualquiera de las presentes secuencias de desaturasas, o sus porciones, también pueden emplearse como reactivos de hibridación para la identificación de homólogos de delta-5. Los componentes básicos de un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos incluyen una sonda, una muestra sospechosa de contener el gen o el fragmento del gen de interés, y un método de hibridación específica. Las sondas de la presente invención generalmente son secuencias de ácidos nucleicos monocatenarios que son complementarios con las secuencias de ácidos nucleicos que se van a detectar. Las sondas son “hibridables” con la secuencia de ácido nucleico que se va a detectar. Aunque la longitud de la sonda puede variar de 5 bases a decenas de miles de bases, generalmente ser�

5 adecuada una longitud de la sonda de aproximadamente 15 bases a aproximadamente 30 bases. Solo parte de la molécula de la sonda debe ser complementaria con la secuencia de ácido nucleico que se va a detectar. Además, no es necesario que la complementariedad entre la sonda y la secuencia diana sea perfecta. La hibridación se produce entre moléculas imperfectamente complementarias, con el resultado de que cierta fracción de las bases en la región hibridada no est�n apareadas con la base complementaria apropiada.

10 Los métodos de hibridación est�n bien definidos. Generalmente, la sonda y la muestra deben mezclarse bajo condiciones que permiten la hibridación del ácido nucleico. Esto implica poner en contacto la sonda y la muestra en presencia de una sal inorgánica u orgánica con la concentración y las condiciones de temperaturas apropiadas. La sonda y la muestra de los ácidos nucleicos deben ponerse en contacto durante un tiempo lo suficientemente largo como para que se produzca cualquier posible hibridación entre la sonda y la muestra de ácidos nucleicos. La

15 concentración de la sonda o la diana en la mezcla determinar� el tiempo necesario para que se produzca la hibridación. Cuanto mayor sea la concentración de sonda o diana, más corto ser� el tiempo de incubaci�n necesario. Opcionalmente, puede añadirse un agente caotr�pico (por ejemplo, cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidionio, tiocianato de sodio, tetracloroacetato de litio, perclorato de sodio, tetracloroacetato de rubidio, yoduro de potasio, trifluoroacetato de cesio). Si se desea, puede añadirse formamida a la mezcla de hibridación, generalmente al 30

20 50% (en v/v).

Pueden emplearse diversas disoluciones de hibridación. Generalmente, estas comprenden de aproximadamente 20% al 60% en volumen, preferiblemente 30%, de un disolvente orgánico polar. Una disolución de hibridación habitual emplea aproximadamente 30-50% en v/v de formamida, cloruro de sodio aproximadamente 0,15 a 1 M, tampones aproximadamente 0,05 a 0,1 M (por ejemplo, citrato de sodio, Tris-HCl, PIPES o HEPES (intervalo de pH 25 de aproximadamente 6-9)), detergente de aproximadamente 0,05% al 0,2% (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio), o EDTA entre 0,5-20 mM, FICOLL (Pharmacia Inc.) (aproximadamente 300-500 kdal), polivinilpirrolidona (aproximadamente 250-500 kdal), y albúmina de suero. En una disolución de hibridación típica también se incluyen ácidos nucleicos vehículo no marcados de aproximadamente 0,1 a 5 mg/ml, ADN nucleico fragmentado (por ejemplo, ADN de timo de ternera o de esperma de salmón, o ARN de levadura), y opcionalmente glicina de

30 aproximadamente 0,5% al 2% en p/v. También pueden incluirse otros aditivos, tales como agentes de exclusión de volumen que incluyen una diversidad de agentes hidrosolubles o hinchables en agua polares (por ejemplo, polietilenglicol), pol�meros ani�nicos (por ejemplo, poliacrilato o polimetilacrilato) y pol�meros sacar�dicos ani�nicos (por ejemplo, sulfato de dextrano).

La hibridación de ácidos nucleicos puede adaptarse a una diversidad de formatos de ensayo. Uno de los más

35 adecuados es el formato de ensayo de “sandwich”. El ensayo de sandwich es particularmente adaptable a la hibridación bajo condiciones no desnaturalizantes. Un componente principal de un ensayo de tipo sandwich es un soporte sólido. El soporte sólido lleva adsorbido sobre él o unido covalentemente a él una sonda de ácido nucleico inmovilizada que no est� marcada y que es complementaria con una porción de la secuencia.

En otras realizaciones, cualquiera de los fragmentos de ácidos nucleicos de delta-5 desaturasas descritos en la

40 presente (o cualquiera de sus homólogos identificados) puede utilizarse para aislar genes que codifican proteínas homólogas de la misma especie bacteriana, algal, f�ngica, euglenoide o vegetal o de otra distinta. El aislamiento de genes homólogos empleando protocolos dependientes de secuencia es muy conocida en la técnica. Los ejemplos de protocolos dependientes de secuencia incluyen, pero no se limitan a: 1.) métodos de hibridación de ácidos nucleicos; 2.) métodos de amplificación de ADN y ARN, según se ejemplifica por los diversos usos de las

45 tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), Mullis et al., patente de EEUU 4.683.202; reacción en cadena de la ligasa (LCR), Tabor, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:1074 (1985); o amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), Walker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992)); y 3.) métodos de construcción y selección de bancos mediante complementaci�n.

Por ejemplo, los genes que codifican proteínas o polip�ptidos similares a las delta-5 desaturasas descritas en la

50 presente pueden aislarse directamente utilizando la totalidad o una porción de los presentes fragmentos de ácidos nucleicos como sondas de hibridación de ADN para seleccionar banco procedentes, por ejemplo, de cualquier levadura u hongo deseado, utilizando una metodología muy conocida por los expertos en la técnica (en la que se prefieren los organismos que producen ARA (o sus derivados)). Las sondas oligonucleot�dicas específicas basadas en las presentes secuencias de ácidos nucleicos pueden diseñarse y sintetizarse mediante métodos conocidos en la

55 técnica (Maniatis, supra). Además, las secuencias completas pueden utilizarse directamente para sintetizar sondas de ADN mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, marcaje de ADN con sondas aleatorias, traducción de mella o técnicas de marcaje terminal), o sondas de ARN utilizando sistemas de transcripción in vitro disponibles. Además, pueden diseñarse cebadores específicos y utilizarse para amplificar una parte (o la longitud completa) de las presentes secuencias. Los productos de la amplificación resultantes pueden

60 marcarse directamente durante las reacciones de amplificación, o marcarse después de las reacciones de amplificación, y emplearse como sondas para aislar fragmentos de ADN de longitud completa bajo condiciones de rigurosidad apropiadas.

Generalmente, en las técnicas de amplificación de tipo PCR, los cebadores tienen secuencias diferentes y no son complementarios entre s�. Dependiendo de las condiciones de ensayo deseadas, las secuencias de los cebadores deben diseñarse para proporcionar una replicaci�n eficaz y fiel del ácido nucleico diana. Los métodos para el diseño de cebadores de PCR son habituales y muy conocidos en la técnica (Thein y Wallace, "The use of oligonucleotides as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders", en Human Genetic Diseases: A Practical Approach, K.E. Davis ed. (1986), pp. 33-50, IRL, Herndon, VA; y Rychlik, W., en Methods in Molecular Biology, White, B.A. ed. (1993), vol. 15, pp. 31-39, PCR Protocols: Current Methods and Applications, Humania, Totowa, NJ).

En general, pueden utilizarse dos segmentos cortos de las presentes secuencias en los protocolos de la PCR para amplificar fragmentos de ácidos nucleicos más largos que codifican genes homólogos a partir de ADN o ARN. También se puede realizar una PCR sobre un banco de fragmentos de ácidos nucleicos clonados, en la que la secuencia de un cebador se deriva de los presentes fragmentos de ácidos nucleicos, y la secuencia del otro cebador aprovecha la presencia de tramos de ácido poliaden�lico al extremo 3’ de los genes eucariotas que codifican ARNm precursor.

Como alternativa, la segunda secuencia de cebador puede basarse en secuencias derivadas del vector de clonaci�n. Por ejemplo, los expertos en la técnica pueden seguir el protocolo RACE (Frohman et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 85:8998(1988)) para generar ADNc utilizando una PCR para amplificar copias de la región entre un único punto en el transcrito y el extremo 3’ o 5’. Pueden diseñarse cebadores orientados en la dirección 3’ y 5’ a partir de las presentes secuencias. Utilizando sistemas 3’ RACE o 5’ RACE disponibles en el mercado (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), pueden aislarse fragmentos de ADNc 3’ o 5’ específicos (Ohara et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 86:5673 (1989); Loh et al., Science, 243:217 (1989)).

En otras realizaciones, cualquiera de los fragmentos de ácidos nucleicos de delta-5 desaturasa descritos en la presente (o cualquiera de sus homólogos identificados) puede utilizarse para la creación de nuevas ácido graso desaturasas mejoradas. Tal como se conoce en la técnica, puede emplearse la mutag�nesis y selección in vitro, la mutag�nesis química, los métodos de “barajado de genes” u otros medios para obtener mutaciones de genes de desaturasas naturales. Como alternativa, pueden sintetizarse ácidos grasos mejorados mediante intercambio de dominios, en el que un dominio funcional de cualquiera de los fragmentos de ácidos nucleicos de delta-5 desaturasa descritos en la presente se intercambia por un dominio funcional en un gen de desaturasa alternativo para producir con ello una nueva proteína.

M�todos para la producción de diversos ácidos grasos omega-3 y/u omega-6

Se espera que la introducción de genes quiméricos que codifican las delta-5 desaturasas descritas en la presente (es decir, EgD5, EgD5S u otras enzimas mutantes, enzimas con codones optimizados o sus homólogos) bajo el control de los promotores apropiados, dar� como resultado una mayor producción de ARA y/o EPA en el organismo hospedante transformado, respectivamente. As�, la presente invención incluye un método para la producción directa de PUFA que comprende exponer un sustrato de acido graso (es decir, DGLA o ETA) a las enzimas desaturasas descritas en la presente (por ejemplo, EgD5, EgD5S), de modo que el sustrato se convierte en el producto de ácido graso deseado (es decir, ARA o EPA1, respectivamente).

En la presente se describe un método para la producción de ARA en una célula hospedante (por ejemplo, levadura oleaginosa, soja), en el que la célula hospedante comprende:

(i): una molécula de nucleótidos aislada que codifica un polip�ptido de delta-5 desaturasa que tiene al menos 39% de identidad cuando se compara con un polip�ptido que tiene una secuencia de amino�cidos como se indica en SEQ ID NO:2, basándose en algoritmos BLASTP o métodos de alineamiento Clustal W; y

(ii): una fuente de un ácido dihomo-∀-linoleico;

en el que la célula hospedante se cultiva bajo condiciones tales que la delta-5 desaturasa se expresa y el DGLA se convierte en ARA, y en el que ARA se recupera opcionalmente.

Los expertos en la técnica reconocerán que la amplia gama de sustratos de la delta-5 desaturasa puede permitir además el uso de la enzima para la conversión de ETA a EPA. Por consiguiente, también se describe un método para la producción de EPA, en el que la célula hospedante comprende:

(ii): una fuente de ácido eicosatetraenoico;

en el que la célula hospedante se cultiva bajo condiciones tales que la delta-5 desaturasa se expresa y el ETA se convierte en EPA, y en el que ETA se recupera opcionalmente. La invención proporciona métodos en los que se emplea el polinucle�tido de la invención.

Cada gen de delta-5 desaturasa y su correspondiente producto de enzima descrito en la presente puede utilizarse de modo indirecto para la producción de ácidos grasos omega-3 (véase la publicación de patente de EEUU n.� 2005/0136519). La producción indirecta de PUFA omega-3/omega-6 se produce cuando el sustrato de ácido graso se convierte indirectamente en el producto de ácido graso deseado, a través de una etapa o etapas intermedias o una vía o vías intermedias. As�, se contempla que las delta-5 desaturasas descritas en la presente (por ejemplo, EgD5, EgD5S u otras enzimas mutantes, enzimas con codones optimizados o sus homólogos) pueden expresarse junto con otros genes que codifican enzimas de la vía biosint�tica de PUFA (por ejemplo, delta-6 desaturasas, C18/20 elongasas, delta-17 desaturasas, delta-15 desaturasas, delta-9 desaturasas, delta-12 desaturasas, C14/16 elongasas, C16/18 elongasas, delta-9 elongasas, delta-8 desaturasas, delta-4 desaturasas, C20/22 elongasas) para producir mayores niveles de producción de ácidos grasos omega-3 de cadena más larga (por ejemplo, EPA, DPA y DHA). Los genes concretos incluidos dentro de un módulo de expresión concreto dependerán de la célula hospedante (y su perfil de PUFA y/o perfil de desaturasa/elongasa), la disponibilidad de sustrato y el producto o productos finales deseados.

Tambi�n puede ser útil alterar la delta-5 desaturasa nativa del organismo hospedante, basándose en las secuencias completas descritas en la presente, el complemento de estas secuencias completas, porciones sustanciales de estas secuencias, desaturasas con codones optimizados derivadas de estas y las secuencias sustancialmente homólogas con estas.

Vectores, módulos y sistemas de expresión vegetales, y transformación

En una realización, esta invención se refiere a un gen quimérico que comprende cualquiera de los polinucle�tidos de delta-5 desaturasa de la invención unido operablemente al menos a una secuencia reguladora adecuada para la expresión en una planta. Un promotor es un secuencia de ADN que dirige la maquinaria celular de una planta para que produzca ARN a partir de la secuencia codificadora contigua cadena abajo (3’) del promotor. La región del promotor influye en la velocidad, la etapa del desarrollo y el tipo de célula en la cual se fabrica el transcrito de ARN del gen. El transcrito de ARN se procesa para producir ARNm que actúa como molde para la traducción de la secuencia de ARN en la secuencia de amino�cidos del polip�ptido codificado. La secuencia conductora 5’ no traducida es una región del ARNm cadena arriba de la región codificadora de la proteína que puede desempeñar un papel en el inicio y la traducción del ARNm. La señal de poliadenilaci�n/fin de la transcripción 3’ es una región no traducida cadena abajo de la región codificadora de la proteína que actúa en la célula vegetal para provocar la terminación del transcripto de ARN y la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3’ del ARN.

El origen del promotor elegido para dirigir la expresión de la secuencia codificadora de delta-5 desaturasa no es importante, con la condición de que tenga la suficiente actividad transcripcional para llevar a cabo la invención mediante la expresión de ARNm traducible para los fragmentos de ácidos nucleicos deseados en el tejido del hospedante deseado en el momento adecuado. Pueden utilizarse promotores heter�logos o no heter�logos (es decir, end�genos) para practicar la invención. Por ejemplo, los promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a la subunidad alfa prima del promotor de beta-conglicina, el promotor 3 del inhibidor de la tripsina de Kunitz, el promotor de anexina, el promotor de glicinina Gy1, la subunidad beta del promotor de beta-conglicinina, el promotor de P34/Gly Bd m 30K, el promotor de albúmina, el promotor de Leg A1 y el promotor de Leg A2.

El promotor de anexina, o P34, se describe en la publicación PCT n.� WO 2004/071178 (publicada el 26 de agosto, 2004). El nivel de actividad del promotor de anexina es comparable al de muchos promotores fuertes conocidos, tales como: (1) el promotor de CaMV 35S (Atanassova et al., Plant Mol. Biol., 37:275-285 (1998); Battraw y Hall, Plant Mol. Biol., 15:527-538 (1990); Holtorf et al., Plant Mol. Biol., 29:637-646 (1995); Jefferson et al., EMBO J., 6:3901-3907 (1987); Wilmink et al., Plant Mol. Biol., 28:949-955 (1995)); (2) los promotores de oleosina de Arabidopsis (Plant et al., Plant Mol. Biol., 25:193-205 (1994); Li, Texas A&M University Ph.D. tesis, pp. 107-128 (1997)); (3) los promotores de la proteína de extensión de la ubiquitina de Arabidopsis (Callis et al., J Biol. Chem., 265(21):12486-12493 (1990)); (4) un promotor del gen de ubiquitina del tomate (Rollfinke et al., Gene, 211(2):267276 (1998)); (5) un promotor de la proteína del choque térmico de soja (Schoffl et al., Mol Gen Genet., 217(2-3):246253 (1989)); y (6) un promotor del gen de la histona H3 del maíz (Atanassova et al., Plant Mol Biol., 37(2):275-285 (1989)).

Otra característica útil del promotor de anexina es su perfil de expresión en semillas en desarrollo. El promotor de anexina es más activo en semillas en desarrollo en etapas tempranas (antes de 10 días después de la polinizaci�n) y es muy quiescente en etapas posteriores. El perfil de expresión del promotor de anexina es diferente al de muchos promotores específicos de semilla, por ejemplo, promotores de proteínas de almacenamiento de semillas, que a menudo proporcionan una actividad mayor en etapas posteriores del desarrollo (Chen et al., Dev. Genet., 10:112122 (1989); Ellerstrom et al., Plant Mol. Biol., 32:1019-1027 (1996); Keddie et al., Plant Mol. Biol., 24:327-340 (1994); Plant et al. (supra); Li (supra)). El promotor de anexina tiene un perfil de expresión más convencional pero sigue siendo diferente de otros promotores específicos de semilla conocidos. As�, el promotor de anexina ser� un candidato muy atractivo cuando se desee la sobreexpresi�n, o la supresión, de un gen en embriones en una etapa temprana del desarrollo. Por ejemplo, puede resultar deseable sobreexpresar un gen que regula el desarrollo temprano del embrión o un gen implicado en el metabolismo antes de la maduración de la semilla.

Despu�s de la identificación de un promotor apropiado adecuado para la expresión de una secuencia codificadora

de delta-5 desaturasa específica, el promotor después se une operablemente en una orientiaci�n sentido utilizando medios convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Las técnicas de ADN recombinante y de clonaci�n molecular utilizadas en la presente son muy conocidas en la técnica, y se describen más a fondo en Sambrook, J. et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2� ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 (en lo sucesivo "Sambrook et al., 1989"); o Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. y Struhl, K., eds., en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nueva York, 1990 (en lo sucesivo "Ausubel et al., 1990").

Cuando se ha fabricado la construcción recombinante, después puede introducirse en la célula vegetal elegida mediante métodos muy conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, transfecci�n, transformación y electroporaci�n). Las células de plantas de semillas oleaginosas son las células vegetales preferidas. Las células vegetales transformadas después se cultivan y se regeneran bajo condiciones adecuadas que permiten la expresión del PUFA de cadena larga, que después opcionalmente se recupera y se purifica.

Las construcciones recombinantes de la invención pueden introducirse en una célula vegetal o, como alternativa, cada construcción puede introducirse en células vegetales distintas.

La expresión en una célula vegetal puede realizarse de una manera transitoria o estable, según se describió anteriormente.

Los PUFA de cadena larga deseados pueden expresarse en la semilla. Dentro del alcance de la invención también se encuentran las semillas o partes de la planta obtenidas a partir de dichas plantas transformadas.

Las partes de la planta incluyen tejidos diferenciados y no diferenciados que incluyen, pero no se limitan a los siguientes: raíces, tallos, brotes, hojas, polen, semillas, tejido tumoral y diversas formas de células y cultivos (por ejemplo, células individuales, protoplastos, embriones y tejido de callo). El tejido de la planta puede estar en una planta o en cultivo de órganos, tejidos o células vegetales.

La expresión “órgano de la planta” se refiere a un tejido o grupo de tejidos vegetales que constituyen una parte morfológica y funcionalmente diferenciada de una planta. El término “genoma” se refiere a lo siguiente: (1) el complemento completo de material genético (genes y secuencias no codificadoras) presente en cada célula de un organismo, o virus u org�nulo; y/o (2) un conjunto completo de cromosomas heredado como una unidad (haploide) de un progenitor.

As�, esta invención también se refiere a un método para transformar una célula, que comprende transformar una célula con el gen quimérico de la invención, y seleccionar las células transformadas con el gen quimérico de la invención.

Tambi�n de interés es un método para producir una planta transformada que comprende transformar una célula vegetal con los polinucle�tidos de delta-5 desaturasa de la presente invención, y regenerar una planta a partir de la célula vegetal transformada.

Los métodos para transformar dicotiled�neas (principalmente mediante el uso de Agrobacterium tumefaciens) y obtener plantas transg�nicas se han publicado, entre otros, para el algodón (patente de EEUU n.� 5.004.863; patente de EEUU n.� 5.159.135); soja (patente de EEUU n.� 5.569.834; patente de EEUU n.� 5.416.011); Brassica (patente de EEUU n.� 5.463.174); cacahuete (Cheng et al., Plant Cell Rep., 15:653-657 (1996); McKently et al., Plant Cell Rep., 14:699-703 (1995)); papaya (Ling, K. et al., Bio/technology, 9:752-758 (1991)); y guisante (Grant et al., Plant Cell Rep., 15:254-258 (1995)). Para un análisis de otros métodos empleados habitualmente para la transformación de plantas, véase Newell, C.A. (Mol. Biotechnol., 16:53-65 (2000)). Uno de estos métodos de transformación emplea Agrobacterium rhizogenes (Tepfler, M. y Casse-Delbart, F., Microbiol. Sci., 4:24-28 (1987)). La transformación de soja utilizando el transporte directo de ADN ha sido publicada utilizando la fusión de PEG (publicación PCT n.� WO 92/17598), electroporaci�n (Chowrira, G.M. et al., Mol, Biotechnol., 3:17-23 (1995); Christou, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:3962-3966 (1987)), microinyecci�n y bombardeo de partículas (McCabe, D.E. et. al., Bio/Technology, 6:923 (1988); Christou et al., Plant Physiol., 87:671-674 (1988)).

Existen una diversidad de métodos para la regeneración de plantas a partir de tejido vegetal. El método concreto de regeneración depender� del tejido vegetal de partida y de la especie vegetal concreta que se va a regenerar. La regeneración, el desarrollo y el cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos vegetales individuales o a partir de diversos explantes transformados es muy conocido en la técnica (Weissbach y Weissbach, en: Methods for Plant Molecular Biology (eds.), Academic, San Diego, CA (1988)). Este proceso de regeneración y crecimiento incluye generalmente las etapas de la selección de las células transformadas y el cultivo de las células individualizadas a través de las etapas habituales del desarrollo embrionario hasta la etapa de pl�ntula enraizada. Las semillas y los embriones transg�nicos son regenerados de modo similar. Los brotes enraizados transg�nicos resultantes después se plantan en un medio de crecimiento de plantas apropiado, tal como tierra. Preferiblemente, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transg�nicas homocig�ticas. De otra forma, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con plantas desarrolladas a partir de semillas de líneas importantes desde el punto de vista agron�mico. A la inversa, el polen de plantas de estas líneas importantes se

emplea para polinizar las plantas regeneradas. Una planta transg�nica de la presente invención que contiene un polip�ptido deseado se cultiva utilizando métodos muy conocidos por los expertos en la técnica.

Adem�s de los procedimientos analizados anteriormente, los expertos en la técnica est�n familiarizados con los materiales didácticos convencionales que describen las condiciones y los procedimientos específicos para la construcción, la manipulación y el aislamiento de macromoléculas (por ejemplo, moléculas de ADN, pl�smidos, etc.); la generación de fragmentos de ADN recombinante y construcciones de expresión recombinantes; y la selección y el aislamiento de clones. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor, NY (1995); Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, vol.1, Cold Spring Harbor, NY (1998); Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, vol.2, Cold Spring Harbor, NY (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, NY (1997).

Los ejemplos de plantas de semillas oleaginosas incluyen, pero no se limitan a soja, especies de Brassica, girasol, maíz, algodón, lino y c�rtamo.

Los ejemplos de PUFA que tienen al menos veinte átomos de carbono y cuatro o más dobles enlaces carbonocarbono incluyen, pero no se limitan a ácidos grasos omega-3, tales como EPA, DPA y DHA, y el ácido graso omega-6 ARA. Las semillas obtenidas de estas plantas también est�n dentro del alcance de esta invención, as� como el aceite obtenido de dichas semillas.

As�, en la presente se describe una planta de semillas oleaginosas que comprende:

(a): una primera construcción de ADN recombinante que comprende un polinucle�tido aislado que codifica un polip�ptido de delta-5 desaturasa, unido operablemente al menos a una secuencia reguladora; y

(b): al menos una construcción de ADN recombinante adicional que comprende un polinucle�tido aislado unido operablemente al menos a una secuencia reguladora, que codifica un polip�ptido seleccionado del grupo que consiste en una delta-4 desaturasa, una delta-5 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-8 desaturasa, una delta-9 desaturasa, una delta-9 elongasa, una delta-12 desaturasa, una delta-15 desaturasa, una delta-17 desaturasa, una C14/16 elongasa, una C16/18 elongasa, una C18/20 elongasa y una C20/22 elongasa. Estos métodos forman parte de la invención si se emplea la construcción de ADN recombinante de la invención.

Se analizan otras desaturasas, por ejemplo, en las patentes de EEUU n.os 6.075.183, 5.968.809, 6.136.574, 5.972.664, 6.051.754, 6.410.288, y las publicaciones PCT n.os WO 98/46763, WO 98/46764, WO 00/12720 y WO 00/40705.

La elección de la combinación de módulos utilizada depende, en parte, del perfil de PUFA y/o del perfil de desaturasa/elongasa de las células de la planta de semillas oleaginosas que se van a transfomar, y del PUFA de cadena larga que se va a expresar.

En otro aspecto, esta invención se refiere a un método para fabricar PUFA de cadena larga en una célula vegetal, que comprende:

(a): transformar una célula con el gen quimérico de la invención; y

(b): seleccionar las células transformadas que fabrican PUFA de cadena larga.

Tambi�n se describe un método para producir al menos un PUFA en una célula de soja, que comprende:

(a): transformar una célula de soja con una primera construcción de ADN recombinante, que comprende:

(i): un polinucle�tido aislado que codifica un polip�ptido de delta-5 desaturasa unido operablemente al menos a una secuencia reguladora; y

(ii): al menos una construcción de ADN recombinante adicional que comprende un polinucle�tido aislado unido operablemente al menos a una secuencia reguladora, que codifica un polip�ptido seleccionado del grupo que consiste en una delta-4 desaturasa, una delta-5 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-8 desaturasa, una delta-9 desaturasa, una delta-9 elongasa, una delta-12 desaturasa, una delta-15 desaturasa, una delta-17 desaturasa, una C14/16 elongasa, una C16/18 elongasa, una C18/20 elongasa y una C20/22 elongasa;

(b): regenerar una planta de soja a partir de la célula transformada de la etapa (a); y

(c): seleccionar las semillas obtenidas a partir de las plantas de la etapa (b) que tienen un nivel alterado de PUFA, cuando se compara con el nivel en semillas obtenidas a partir de una planta de soja no transformada.

Estos métodos forman parte de la invención si se emplea la construcción de ADN recombinante de la invención.

En otras realizaciones preferidas, dicha al menos una construcción de ADN recombinante adicional codifica un

polip�ptido que tiene actividad delta-9 elongasa, por ejemplo, la delta-9 elongasa aislada o derivada de Isochrysis galbana (n.� de registro de GenBank AF390174; IgD9e) o la delta-9 elongasa aislada o derivada de Euglena gracilis.

En otras realizaciones preferidas, dicha al menos una construcción de ADN recombinante adicional codifica un polip�ptido que tiene actividad delta-8 desaturasa. Por ejemplo, la publicación PCT n.� WO 2005/103253 (publicada el 22 de abril, 2005) describe las secuencias de ácido nucleico y de amino�cidos de una enzima delta-8 desaturasa de Pavlova salina (véase también la publicación de EEUU n.� 2005/0273885). Sayanova et al. (FEBS Lett., 580:1946-1952 (2006)) describen el aislamiento y la caracterización de un ADNc a partir de la ameba del suelo de vida libre Acanthamoeba castellanii, que, cuando se expresa en Arabidopsis, codifica una C20 delta-8 desaturasa. Además, la solicitud en tramitación con la presente del cesionario de los solicitantes que tiene el n.� de solicitud provisional 60/795.810, presentada el 28 de abril, 2006 (n.� de expediente del abogado BB-1566) describe las secuencias de ácido nucleico y de amino�cidos de una enzima delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri (CCMP459). La solicitud provisional de EEUU n.� 60/853.563 (presentada el 23 de octubre, 2006; n.� de expediente del abogado BB1574) describe las secuencias de ácido nucleico y de amino�cidos de una enzima delta-8 desaturasa de Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491 , Eutreptiella sp. CCMP389 y Eutreptiella cf_gymnastica CCMP 1594.

Sistemas de expresión microbianos. Módulos y vectores, y transformación

Los genes de delta-5 desaturasa y los productos g�nicos descritos en la presente (es decir, EgD5, u otras enzimas mutantes, enzimas con codones optimizados o sus homólogos) también pueden producirse en células hospedantes microbianas heter�logas, en particular en las células de levaduras oleaginosas (por ejemplo, Yarrowia lipolytica).

Los sistemas de expresión microbianos y los vectores de expresión que contienen secuencias reguladoras que dirigen la expresión de alto nivel de proteínas extra�as son muy conocidos por los expertos en la técnica. Cualquiera de estos puede utilizarse para construir genes quiméricos para la producción de cualquiera de los productos g�nicos de las presentes secuencias. Estos genes quiméricos después pueden introducirse en microorganismos apropiados a través de una transformación para proporcionar una expresión de alto nivel de las enzimas codificadas.

Los vectores o módulos de ADN útiles para la transformación de células hospedantes microbianas adecuadas son muy conocidos en la técnica. La elección específica de las secuencias presentes en la construcción depende de los productos de la expresión deseados (supra), la naturaleza de la célula hospedante y el medio propuesto para separar las células transformadas de las células no transformadas. Sin embargo, generalmente el vector o el módulo contiene secuencias que dirigen la transcripción y la traducción del gen o genes pertinentes, un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicaci�n autónoma o la integración cromos�mica. Los vectores adecuados comprenden una región 5’ del gen que controla el inicio de la transcripción (por ejemplo, un promotor) y una región 3’ del fragmento de ADN que controla el fin de la transcripción (es decir, un terminador). Lo más preferido es que ambas regiones de control se deriven de genes procedentes de la célula hospedante microbiana transformada, aunque debe entenderse que no es necesario que estas regiones de control se deriven de los genes nativos a la especie específica elegida como hospedante de producción.

Las regiones de control del inicio o los promotores que son útiles para dirigir la expresión de los presentes ORF de delta-5 desaturasa en la célula hospedante microbiana deseada son numerosas y familiares para los expertos en la técnica. Casi cualquier promotor capaz de dirigir la expresión de estos genes en la célula hospedante seleccionada es adecuado para la presente invención. La expresión en una célula hospedante microbiana puede lograrse de una manera transitoria o estable. La expresión transitoria puede realizarse induciendo la actividad de un promotor regulable unido operablemente al gen de interés. La expresión estable puede lograrse mediante el uso de un promotor constitutivo unido operablemente al gen de interés. Como ejemplo, cuando la célula hospedante es una levadura, se proporcionan regiones transcripcionales y traduccionales funcionales en células de levadura, en particular de la especie hospedante (ve�nse, por ejemplo, las publicaciones PCT n.os WO 2004/101757 y WO 2006/052870 para las regiones reguladoras del inicio de la transcripción preferidas para su uso en Yarrowia lipolytica). Puede utilizarse cualquiera de una serie de secuencias reguladoras, dependiendo de si se desea una transcripción constitutiva o inducida, de la eficacia del promotor para expresar el ORF del interés, de la facilidad de la construcción y similares.

Se ha descubierto que las secuencias de nucleótidos que rodean al cod�n de inicio de la traducción “ATG” afectan a la expresión en células de levadura. Si el polip�ptido deseado se expresa mal en levaduras, las secuencias de nucleótidos de los genes exígenos pueden modificarse para que incluyan una secuencia de inicio de la traducción eficaz en levaduras para obtener una expresión óptima del gen. Para la expresión en levaduras, esto puede realizarse mediante mutag�nesis específica dirigida a sitio de un gen expresado de modo ineficaz condens�ndolo dentro de marco con un gen de levadura end�geno, preferiblemente un gen altamente expresado. Como alternativa, se puede determinar la secuencia de inicio de la traducción consenso en el hospedante e introducir esta secuencia en genes heter�logos para su expresión óptima en el hospedante de interés.

La región de terminación puede derivarse de la región 3’ del gen a partir del cual se obtuvo la región de inicio o a partir de un gen diferente. Se conoce un gran número de regiones de terminación que actúan de modo satisfactorio en una diversidad de hospedantes (cuando se utilizan en los mismos géneros y especies de los cuales se derivan o en otros diferentes). La región de terminación habitualmente se selecciona más por conveniencia que por cualquier propiedad concreta. Preferiblemente, cuando el hospedante microbiano es una célula de levadura, la región de terminación se deriva de un gen de levadura (en particular, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Yarrowia o Kluyveromyces). También se sabe que las regiones 3’ de genes de mamífero que codifican el ∀-interfer�n y el #-2 interfer�n actúan en levaduras. Las regiones de control de la terminación también pueden derivarse de

5 diversos genes nativos a los hospedantes preferidos. Opcionalmente, un sitio de terminación puede ser innecesario, pero lo más preferido es que se incluya. Aunque no se pretende limitación alguna, las regiones de terminación útiles en la presente descripción incluyen: aproximadamente 100 pb de la región 3’ de la proteasa extracelular de Yarrowia lipolytica (XPR; n.� de registro de GenBank M17741); los terminadores de acil-coA oxidasa (Aco3: n.� de registro de GenBank AJ001301 y n.� CAA04661; Pox3: n.� de registro de GenBank XP_503244); el terminador de Pex20 (n.� de registro de GenBank AF054613); el terminador de Pex16 (n.� de registro de GenBank U75433); el terminador de Lip1 (n.� de registro de GenBank Z50020); el terminador de Lip2 (n.� de registro de GenBank AJ012632); y el terminador de 3-oxoacil-coA tiolasa (OCT; n.� de registro de GenBank X69988).

Tal como saben los expertos en la técnica, simplemente insertar un gen en un vector de clonaci�n no asegura que ser� expresado con éxito al nivel necesario. En respuesta a la necesidad de una alta tasa de expresión se han 15 creado muchos vectores de expresión especializados manipulando una serie de elementos genéticos diferentes que controlan aspectos de la transcripción, la traducción, la estabilidad de las proteínas, la limitación de oxígeno y la secreción de la célula hospedante microbiana. De modo más específico, algunas de las características moleculares que se han manipulado para el control de la expresión g�nica incluyen: (1) la naturaleza del promotor transcripcional y las secuencias del terminador pertinentes; (2) el número de copias del gen clonado y si el gen est� portado por un pl�smido o est� integrado en el genoma de la célula hospedante; (3) la localización celular final de la proteína extra�a sintetizada; (4) la eficacia de la traducción y el plegamiento correcto de la proteína en el organismo hospedante; (5) la estabilidad intrínseca del ARNm y la proteína del gen clonado dentro de la célula hospedante; y

(6) la utilización de codones dentro del gen clonado, de modo que su frecuencia se aproxime a la frecuencia de utilización de codones preferida de la célula hospedante. Cada uno de estos tipos de modificaciones est� incluido en

25 la presente invención, como un medio para optimizar aún más la expresión de la delta-5 desaturasa descrita en la presente.

Cuando se ha obtenido el ADN que codifica un polip�ptido adecuado para la expresión en una célula hospedante microbiana apropiada (por ejemplo, levadura oleaginosa) (por ejemplo, un gen quimérico que comprende un promotor, un ORF y un terminador), se coloca en un vector plasm�dico capaz de tener replicaci�n autónoma en una célula hospedante, o se integra directamente en el genoma de la célula hospedante. La integración de los módulos de expresión puede producirse de modo aleatorio dentro del genoma del hospedante o puede dirigirse a través del uso de construcciones que contienen suficientes regiones de homología con el genoma del hospedante como para dirigir la recombinación dentro del locus del hospedante. Cuando las construcciones se dirigen a un locus end�geno, todas o algunas de las regiones reguladoras de la transcripción y la traducción pueden ser proporcionadas por el

35 locus end�geno.

En la presente invención, el método de expresar genes preferido en Yarrowia lipolytica es mediante la integración de ADN lineal en el genoma del hospedante; y la integración en múltiples localizaciones dentro del genoma puede ser particularmente útil cuando se desee un alto nivel de expresión de los genes (por ejemplo, en el locus Ura3 (n.� de registro de GenBank AJ306421), el locus del gen Leu2 (n.� de registro de GenBank AF260230), el gen Lys5 (n.� de registro de GenBank M34929), el locus del gen Aco2 (n.� de registro de GenBank AJ001300), el locus del gen Pox3 (Pox3: n.� de registro de GenBank XP_503244; o Aco3: n.� de registro de GenBank AJ001301), el locus del gen de delta-12 desaturasa (publicación PCT n.� WO2004/104167), el locus del gen Lip1 (n.� de registro de GenBank Z50020) y/o el locus del gen Lip2 (n.� de registro de GenBank AJ012632)).

De forma ventajosa, el gen Ura3 puede utilizarse repetidamente en combinación con la selección con ácido 5

45 fluoroor�tico (ácido 5-fluorouracil-6-carbox�lico monohidrato; “5-FOA”) (ver a continuación) para ayudar a que las modificaciones genéticas se integren en el genoma de Yarrowia de una manera fácil.

Cuando dos o más genes se expresan a partir de vectores de replicaci�n distintos, resulta deseable que cada vector tenga un medio diferente de selección y carezca de homología con la otra construcción o construcciones para mantener una expresión estable y evitar la redisposici�n de elementos entre construcciones. La elección juiciosa de las regiones reguladoras, la selección de medios y el método de propagación de la construcción o construcciones introducidas pueden determinarse de modo experimental de modo que todos los genes introducidos se expresen a los niveles necesarios para proporcionar la síntesis de los productos deseados.

Las construcciones que comprenden el gen de interés pueden introducirse en una célula hospedante microbiana mediante cualquier técnica convencional. Estas técnicas incluyen la transformación (por ejemplo, transformación con

55 acetato de litio (Methods in Enzymology, 194:186-187 (1991)), fusión de protoplastos, impacto bol�stico, electroporaci�n, microinyecci�n o cualquier otro método que introduzca el gen de interés en la célula hospedante. Unas indicaciones más específicas aplicables a levaduras oleaginosas (concretamente, Yarrowia lipolytica) incluyen los documentos U.S. 4.880.741 y U.S. 5.071.764, y Chen, D.C. et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 48(2):232-235 (1997)).

Por conveniencia, una célula hospedante que ha sido manipulada mediante cualquier método para captar una

secuencia de ADN (por ejemplo, un módulo de expresión) se denominar� en la presente “transformada” o “recombinante”. As�, los términos “transformada” y “recombinante” se emplean de modo intercambiable en la presente. El hospedante transformado tendr� al menos una copia de la construcción de expresión y puede tener dos

o más, dependiendo si el gen se integra en el genoma, se amplifica, o est� presente en un elemento extracromos�mico que tiene un número múltiple de copias.

La célula hospedante transformada puede identificarse mediante diversas técnicas de selección, según se describe en las publicaciones PCT n.os WO 2004/101757 y WO 2006/052870. Los métodos de selección preferidos para su uso en la presente son la resistencia a kanamicina, higromicina y el aminoglic�sido G418, as� como la capacidad para crecer sobre medios que carecen de uracilo, leucina, lisina, tript�fano o histidina. En realizaciones alternativas, se emplea 5-FOA para la selección de mutantes Ura- de levaduras. El compuesto es tóxico para las células de levadura que poseen un gen URA3 activo que codifica la orotidina 5’-monofosfato descarboxilasa (OMP descarboxilasa); as�, basándose en esta toxicidad, el 5-FOA es especialmente útil para la selección y la identificación de cepas de levaduras mutantes Ura- (Bartel, P.L. y Fields, S., Yeast 2-Hybrid System, Oxford University, Nueva York, v. 7, pp. 109-147, 1997). De modo más específico, primero se puede inactivar el gen Ura3 nativo para producir una cepa que tenga fenotipo Ura-, realizándose la selección basándose en la resistencia a 5-FOA. Después, una agrupación de múltiples genes quiméricos y un nuevo gen Ura3 pueden integrarse en un locus diferentes del genoma de Yarrowia para producir, con ello, una nueva cepa que tiene un fenotipo Ura+. La posterior integración produce una nueva cepa Ura3- (de nuevo identificada utilizando la selección con 5-FOA), cuando el gen Ura3 introducido se desactiva. As�, el gen Ura3 (en combinación con la selección con 5-FOA) puede utilizarse como marcador de selección en múltiples rondas de transformación.

Despu�s de la transformación, los sustratos adecuados para la presente delta-5 desaturasa (y opcionalmente, otras enzimas PUFA que se coexpresan dentro de la célula hospedante) pueden ser producidos por el hospedante de forma natural o transg�nica, o pueden proporcionarse de modo ex�geno.

Las células hospedantes microbianas para la expresión de los presentes genes y fragmentos de ácidos nucleicos pueden incluir hospedantes que crecen sobre una diversidad de materias primas, que incluyen carbohidratos simples o complejos, ácidos grasos, ácidos orgánicos, aceites y alcoholes y/o hidrocarburos a través de un amplio intervalo de valores de temperatura y pH. Basándose en las necesidades del cesionario de los solicitantes, los genes descritos en la presente invención se expresarán en una levadura oleaginosa (y en particular Yarrowia lipolytica); sin embargo, se contempla que, debido a que la transcripción, la traducción y el aparato biosint�tico de proteínas est�n muy conservados, cualquier bacteria, levadura, alga y/u hongo ser� un hospedante microbiano adecuado para la expresión de los presentes fragmentos de ácidos nucleicos.

Sin embargo, los hospedantes microbianos preferidos son las levaduras oleaginosas. Estos organismos son capaces, de modo natural, de sintetizar y acumular aceites, pudiendo dicho aceite comprender más de aproximadamente 25% del peso seco celular, más preferiblemente más de aproximadamente 30% del peso seco celular, y lo más preferiblemente más de aproximadamente 40% del peso seco celular. Los géneros que generalmente se identifican como levaduras oleaginosas incluyen, pero no se limitan a Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon y Lipomyces. De modo más específico, los ejemplos de levaduras que sintetizan aceites incluyen Rhodosporidium toruloides, Lipomyces starkeyii, L. lipoferus, Candida revkaufi, C. pulcherrima, C. tropicalis, C. utills, Trichosporon pullans, T. cutaneum, Rhodotorula glutinus, R. graminis, y Yarrowia lipolytica (antes clasificada como Candida lipolytica).

La más preferida es la levadura oleaginoasa Yarrowia lipolytica; y, en otra realización, las más preferidas son las cepas de Y. lipolytica denominadas ATCC n.� 20362, ATCC n.� 8862, ATCC n.� 18944, ATCC n.� 76982 y/o LGAM S(7)1 (Papanikolaou S., y Aggelis G., Bioresour. Technol., 82(1):43-49 (2002)).

Hist�ricamente, se han utilizado diversas cepas de Y. lipolytica para la fabricación y la producción de isocitrato liasa; lipasas; polihidroxialcanoatos; ácido cítrico; eritritol; ácido 2-oxoglut�rico; ∀-decalactona; ∀-dodecalatona; y ácido pir�vico. Las indicaciones específicas aplicadas para modificar la producción de ARA, EPA y DHA en Y. lipolytica se proporcionan en la solicitud de patente de EEUU n.� 11/264784 (WO 2006/055322), la solicitud de patente de EEUU n.� 11/265761 (WO 2006/052870) y la solicitud de patente de EEUU n.� 11/264737 (WO 2006/052871), respectivamente.

Otros hospedantes microbianos preferidos incluyen bacterias oleaginosas, algas y otros hongos; y, dentro de este amplio grupo de hospedantes microbianos, de particular interés son los microorganismos que sintetizan ácidos grasos omega-3/omega-6 (o aquellos que pueden ser genéticamente modificados para este fin (por ejemplo, otras levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae)). As�, por ejemplo, la transformación de Mortierella alpina (que se emplea en el mercado para la producción de ARA) con cualquiera de los presentes genes de delta-5 desaturasa bajo el control de promotores inducibles o regulables puede producir un organismo transformante capaz de sintetizar mayores cantidades de DGLA. El metodo de transformación de M. alpina se describe en Mackenzie et al. (Appl. Environ. Microbiol., 66:4655 (2000)). De forma similar, los métodos para la transformación de microorganismos thraustochytriales se describen en el documento U.S. 7.001.772.

Tambi�n se describe un método para producir ARA o EPA, respectivamente, que comprende:

(a): proporcionar una levadura oleaginosa que comprende:

(i): una primera construcción de ADN recombinante que comprende un polinucle�tido aislado que codifica un polip�ptido de delta-5 desaturasa unido operablemente al menos a una secuencia reguladora; y,

(ii): una fuente de un sustrato de desaturasa que consiste en DGLA o ETA, respectivamente; y,

(b): cultivar la levadura de la etapa (a) en presencia de una fuente de carbono fermentable adecuada, en el que el gen que codifica el polip�ptido de delta-5 desaturasa se expresa y el DGLA se convierte en ARA, o el ETA se convierte en EPA, respectivamente; y,

(c): opcionalmente recuperar el ARA o EPA, respectivamente, de la etapa (b). Puede ser necesario introducir más sustrato.

Por supuesto, puesto que los PUFA producidos de modo natural en levaduras oleaginosas se limitan a ácidos grasos 18:2 (es decir, LA), y de modo menos habitual, ácidos grasos 18:3 (es decir, ALA), en realizaciones más preferidas de la presente invención, la levadura oleaginosa estar� genéticamente modificada para que exprese multiples enzimas necesarias para la biosíntesis de PUFA de cadena larga (permitiendo con ello la producción, por ejemplo, de ARA, EPA, DPA y DHA), además de las delta-5 desaturasas descritas en la presente.

De modo específico, se describe una levadura oleaginosa que comprende:

(a): una primera construcción de ADN recombinante que comprende un polinucle�tido aislado que codifica un polip�ptido de delta-5 desaturasa unido operablemente al menos a una secuencia reguladora; y,

(b): al menos una construcción de ADN recombinante adicional que comprende un polinucle�tido aislado unido operablemente al menos a una secuencia reguladora, que codifica un polip�ptido seleccionado del grupo que consiste en una delta-4 desaturasa, una delta-5 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-9 desaturasa, una delta-12 desaturasa, una delta-15 desaturasa, una delta-17 desaturasa, una delta-9 elongasa, una C14/16 elongasa, una C16/18 elongasa, una C18/20 elongasa y una C20/22 elongasa.

En realizaciones particularmente preferidas de la levadura, dicha al menos una construcción de ADN recombinante adicional codifica un polip�ptido que tiene actividad delta-9 elongasa, por ejemplo, la delta-9 elongasa aislada o derivada de Isochrysis galbana (n.� de registro de GenBank AF390174; IgD9e o IgD9eS) o la delta-9 elongasa aislada o derivada de Euglena gracilis. Cualquier célula que comprende en su genoma el gen quimérico de la invención forma parte de la invención.

Modificaci�n metabólica de la biosíntesis de ácidos grasos omega-3 y/u omega-6 en microbios

Los métodos para manipular vías bioquímicas son muy conocidos por los expertos en la técnica, y se espera que ser�n posibles numerosas manipulaciones para maximizar la biosíntesis de ácidos grasos omega-3 y/u omega-6 en levaduras oleaginosas y, en particular, en Yarrowia lipolytica. Esta manipulación puede requerir una modificación metabólica directamente dentro de la vía biosint�tica de PUFA u otra manipulación coordinada de diversas otras vías metabólicas.

En el caso de las manipulaciones dentro de la vía biosint�tica de PUFA, puede resultar deseable aumentar la producción de LA para permitir una mayor producción de ácidos grasos omega-3 y/u omega-6. La introducción y/o la amplificación de genes que codifican delta-9 y/o delta-12 desaturasas puede lograr esto. Para maximizar la producción de ácidos grasos insaturados omega-6, los expertos en la técnica saben que la producción se ve favorecida en un microorganismo hospedante que est� sustancialmente exento de ALA; as�, preferiblemente, el hospedante se selecciona o se obtiene eliminando o inhibiendo la actividad desaturasa de tipo delta-15 u omega-3 que permite la conversión de LA en ALA. Como alternativa, puede resultar deseable maximizar la producción de ácidos grasos omega-3 (y minimizar la síntesis de ácidos grasos omega-6). En este ejemplo, se puede utilizar un microorganismo hospedante en el que la actividad delta-12 desaturasa que permite la conversión del ácido oleico en LA se elimina o se inhibe; después, se introducirían módulos de expresión apropiados en el hospedante, junto con los sustratos apropiados (por ejemplo, ALA) para la conversión en derivados de ácidos grasos omega-3 de ALA (por ejemplo, STA, ETrA, ETA, EPA, DPA, DHA).

En realizaciones alternativa, las vías bioquímicas que compiten con las vías biosint�ticas de ácidos grasos omega-3 y/u omega-6 por la energía o el carbono, o las enzimas de la vía biosint�tica de PUFA nativos que interfieren con la producción de un producto final de PUFA concreto, pueden eliminarse mediante alteración de genes o infrarregulaci�n mediante otros medios (por ejemplo, ARNm antisentido).

Un análisis detallado de las manipulaciones dentro de la vía biosint�tica de PUFA como un medio para aumentar ARA, EPA o DHA (y sus técnicas asociadas) se presenta en las publicaciones PCT n.os WO 2006/055322, WO 2006/052870 y WO 2006/052871, respectivamente, as� como las manipulaciones deseables en la vía biosint�tica de TAG y la vía de degradación de TAG (y sus técnicas asociadas).

Dentro del contexto de la presente invención, puede ser útil modular la expresión de la vía biosint�tica de ácidos grasos mediante una cualquiera de las estrategias descritas anteriormente. Por ejemplo, la presente invención proporciona métodos mediante los cuales genes que codifican enzimas clave en la vía biosint�tica de la delta-9 elongasa/delta-8 desaturasa se introducen en levaduras oleaginosas para la producción de ácidos grasos omega-3 y/u omega-6. Resultar� particularmente útil expresar los presentes genes de delta-5 desaturasa en levaduras

5 oleaginosas que no poseen, de modo natural, las vías biosint�ticas de ácidos grasos omega-3 y/u omega-6, y coordinar la expresión de estos genes para maximizar la producción de productos de PUFA preferidos utilizando diversos medios para la modificación metabólica del organismo hospedante.

Procesos de fermentación microbiana para la producción de PUFA

La célula hospedante transformada se cultiva bajo condiciones que optimizan la expresión de genes de desaturasa

10 quiméricos y para que produzca el rendimiento mayor y más económico de los PUFA deseados. En general, las condiciones del medio que pueden optimizarse incluyen el tipo y la cantidad de la fuente de carbono, el tipo y la cantidad de la fuente de nitrógeno, la proporción de carbono a nitrógeno, la cantidad de diferentes iones minerales, el nivel de oxígeno, la temperatura de crecimiento, el pH, la longitud de la fase de producción de biomasa, la longitud de la fase de acumulación de aceite, y el momento y el método de recolección de las células. Yarrowia lipolytica

15 generalmente se cultiva en un medio complejo (por ejemplo, caldo de cultivo de extracto de levadura-peptonadextrosa (YPD)) o un medio mínimo definido que carece de un componente necesario para el crecimiento y as� obliga a la selección de los módulos de expresión deseados (por ejemplo, base de nitrógeno de levaduras (DIFCO Laboratories, Detroit, MI)).

Los medios de fermentación en la presente invención deben contener una fuente de carbono adecuada. Las fuentes

20 de carbono adecuadas se indican en la publicación PCT n.� WO 2004/101757. Aunque se contempla que la fuente de carbono utilizada en la presente invención pueda incluir una amplia diversidad de fuentes que contienen carbono, las fuentes de carbono preferidas son los azúcares, el glicerol y/o los ácidos grasos. Las más preferidas son la glucas y/o los ácidos grasos que contienen entre 10-22 carbonos.

El nitrógeno puede suministrarse a partir de una fuente inorgánica (por ejemplo, (NH4)2SO4) u orgánica (por ejemplo,

25 urea o glutamato). Además de las fuentes de carbono y nitrógeno apropiadas, el medio de fermentación también debe contener minerales, sales, cofactores, tampones, vitaminas y otros componentes adecuados conocidos por los expertos en la técnica por ser útiles para el crecimiento del hospedante oleaginoso y la estimulaci�n de las vías enzim�ticas necesarias para la producción de PUFA. Se presta una atención concreta a varios iones met�licos (por ejemplo, Mn+2, Co+2, Zn+2, Mg+2) que estimulan la síntesis de lípidos y PUFA (Nakahara, T. et al., Ind. Appl. Single

30 Cell Oils, D.J. Kyle y R. Colin, eds., pp. 61-97 (1992)).

Los medios de crecimiento preferidos en la presente invención son los medios preparados del mercado habituales, tales como la base de nitrógeno de levaduras (DIFCO Laboratories, Detroit, MI). También pueden utilizarse otros medios de crecimiento definidos o sintéticos, y el medio apropiado para el crecimiento de las células hospedantes transformantes ser� conocido por los expertos en la técnica de la microbiología o la ciencia de la fermentación. Un

35 intervalo de pH adecuado para la fermentación estar� generalmente entre aproximadamente pH 4,0 a pH 8,0, siendo preferido un pH 5,5 a pH 7,5, puesto que es el intervalo para las condiciones de crecimiento inicial. La fermentación puede realizarse bajo condiciones aerobias o anaerobias, siendo preferidas las condiciones microaerobias.

Generalmente, la acumulación de altos niveles de PUFA en las células de levaduras oleaginosas requerir� un proceso en dos etapas, puesto que el estado metabólico debe estar “equilibrado” entre el crecimiento y la

40 síntesis/almacenamiento de las grasas. As�, lo más preferiblemente, es necesario un proceso de fermentación de dos etapas para la producción de PUFA en levaduras oleaginosas (por ejemplo, Yarrowia lipolytica). Esta estrategia se describe en la publicación PCT n.� WO 2004/101757, as� como diversos diseños de procesos de fermentación adecuados (es decir, discontinuo, discontinuo alimentado y continuo) y las consideraciones durante el crecimiento.

Purificaci�n y procesamiento de aceites de PUFA

45 Los PUFA pueden encontrarse en las plantas y los microorganismos hospedantes como ácidos grasos libres o en formas esterificadas, tales como acilgliceroles, fosfol�pidos, sulfol�pidos o glicol�pidos, y pueden extraerse de las células hospedantes a través de una diversidad de medios conocidos en la técnica. Un resumen de las técnicas de extracción, los análisis de calidad y los estándares de aceptabilidad para lípidos de levaduras se encuentra en Z. Jacobs (Critical Reviews in Biotechnology, 12(5/6):463-491 (1992)). También est� disponible un breve resumen del

50 procesamiento corriente abajo en A. Singh y O. Ward (Adv. Appl. Microbiol., 45:271-312 (1997)).

En general, los medios para la purificación de PUFA pueden incluir una extracción con disolventes orgánicos, una sonicaci�n, una extracción con fluidos supercríticos (por ejemplo, utilizando di�xido de carbono), una saponificaci�n y medios físicos, tales como prensas, o sus combinaciones. Se hace referencia a las indicaciones de la publicación PCT n.� WO 2004/101757 para más detalles. Los métodos para aislar aceites de semillas son muy conocidos en la 55 técnica (Young et al., Processing of Fats and Oils, en The Lipid Handbook, Gunstone et al., eds., capítulo 5, pp. 253257, Chapman & Hall, Londres (1994)). Por ejemplo, el aceite de soja se produce utilizando una serie de etapas que implican la extracción y la purificación de un producto de aceite comestible a partir de la semilla que porta el aceite. Los aceites de soja y los subproductos de soja se producen utilizando las etapas generalizadas mostradas en la

tabla 3.

Tabla 3

Etapas generalizadas para la producción de aceite de soja y subproductos de soja

Etapa del proceso: Proceso Impurezas retiradas y/o subproductos obtenidos

n.� 1: semilla de soja

n.� 2: extracción del aceite harina

n.� 3: desgomado lecitina

n.� 4: refinamiento con álcali o físico gomas, ácidos grasos libres, pigmentos

n.� 5: lavado con agua jabón

n.� 6: decoloración color, jabón, metales

n.� 7: (hidrogenación)

n.� 8: (winterizaci�n) estearina

n.� 9: desodoraci�n ácidos grasos libres, tocoferoles, esteroles, volátiles

n.� 10: productos de aceites

De modo más específico, las semillas de soja se limpian, se templan, se descascarillan y se transforman en copos, aumentando con ello la eficacia de la extracción del aceite. La extracción del aceite normalmente se logra con una extracción con un disolvente (por ejemplo, hexano), pero también puede lograrse con una combinación de presión física y/o extracción con disolventes. El aceite resultante se denomina aceita bruto. El aceite bruto puede desgomarse con fosfol�pidos hidratantes y otros complejos de lípidos polares y neutros que facilitan su separación de la fracción de triglic�ridos no hidratantes (aceite de soja). Las gomas de lecitina resultantes después pueden procesarse para fabricar productos de lecitina importantes desde el punto de vista comercial utilizados en una diversidad de productos alimentarios e industriales como agentes de emulsión y liberación (es decir, antipegado). El aceite desgomado después puede refinarse para la eliminación de las impurezas (principalmente ácidos grasos libres, pigmentos y gomas residuales). El refinamiento se realiza mediante la adición de un agente cáustico que reacciona con los ácidos grasos libres para formar jabón e fosfatidas hidratadas y proteínas en el aceite bruto. Se emplea agua para lavar las trazas de jabón formado durante el refinamiento. Los subproductos de material jabonoso pueden utilizarse directamente en piensos animales o acidularse para recuperar los ácidos grasos libres. El color se elimina mediante una adsorción con una tierra decolorante que elimina la mayoría de la clorofila y los compuestos carotenoides. El aceite refinado puede hidrogenarse, produciendo con ello grasas con diversas texturas y propiedades de fusión. La winterizaci�n (fraccionamiento) puede utilizarse para eliminar la estearina del aceite hidrogenado a través de una cristalización bajo condiciones de enfriamiento cuidadosamente controladas. Una desodoraci�n (principalmente mediante una destilación de vapor al vacío) es la última etapa y est� diseñada para eliminar los compuestos que imparte olor o sabor al aceite. Otros subproductos valiosos, tales como tocorefoles y esteroles, pueden ser retirados durante el proceso de desodoraci�n. El destilado desodorizado que contiene estos subproductos puede comercializarse para la producción de vitamina E natural y otros productos farmacéuticos de alto valor. Los aceites y grasas refinados, decolorados (hidrogenados, fraccionados) y desodorizados pueden envasarse y comercializarse directamente o procesarse aún más para producir productos más especializados. Una referencia más detallada al procesamiento de las semillas de soja, la producción de aceite de soja y la utilización de los subproductos puede encontrarse en Erickson, Practical Handbook of Soybean Processing and Utilization, The American Oil Chemists’ Society and United Soybean Board (1995). El aceite de soja es líquido a temperatura ambiente porque tiene un contenido relativamente bajo en ácidos grasos insaturados, cuando se compara con otros aceites, tales como aceite de coco, palma, nuez de palma y manteca de cacao.

Los aceites vegetales y microbianos que contienen PUFA que se han refinado y/o purificado pueden hidrogenarse para producir con ello grasas con diversas texturas y propiedades de fusión. Muchas grasas procesadas (que incluyen productos para untar, grasas para bollería, mantequillas duras, margarinas, mantecas panaderas, etc.) requieren diversos grados de solidez a temperatura ambiente y solo pueden producirse mediante la alteración de las propiedades físicas del aceite de origen. Esto se logra de manera más habitual mediante una hidrogenación catalítica.

La hidrogenación es una reacción química en la que se añade hidrógeno a los dobles enlaces del ácido graso insaturado con la ayuda de un catalizador, tal como níquel. Por ejemplo, el aceite de soja con alto contenido en ácido oleico contiene ácidos grasos linol�nicos, LA y oleicos insaturados, y cada uno de estos puede hidrogenarse. La hidrogenación tiene dos efectos principales. En primer lugar, la estabilidad oxidativa del aceite aumenta como resultado de la reducción del contenido en ácidos grasos insaturados. En segundo lugar, las propiedades físicas del aceite cambian debido a que las modificaciones en los ácidos grasos aumentan el punto de fusión, dando como

resutlado una grasa semil�quida o sólida a temperatura ambiente.

Existen muchas variables que afectan a la reacción de hidrogenación que, a su vez, alteran la composición del producto final. Las condiciones de funcionamiento, que incluyen la presión, la temperatura, el tipo y la concentración de catalizador, la agitaci�n y el diseño del reactor, est�n entre los parámetros más importantes que pueden controlarse. Pueden utilizarse condiciones de hidrogenación selectivas para hidrogenar los ácidos grasos más insaturados preferentemente con respecto a los menos insaturados. A menudo se emplea una hidrogenación muy ligera o de cepillado para aumentar la estabilidad de los aceites líquidos. Una hidrogenación posterior convierte un aceite líquido en una grasa físicamente sólida. El grado de hidrogenación depende de la actuación deseada y las características de fusión diseñadas para el producto final concreto. Las mantecas líquidas (utilizadas para la fabricación de productos horneados, grasas sólidas y mantecas utilizadas para operaciones de fritura y asado comerciales) y materiales de base para la fabricación de margarinas est�n entre la miríada de posibles productos de aceite y grasas que pueden obtenerse mediante la hidrogenación. Una descripción más detallada de la hidrogenación y de los productos de la hidrogenación puede encontrarse en Patterson, H.B.W., Hydrogenation of Fats and Oils: Theory and Practice, The American Oil Chemists’ Society (1994).

Se ha creado bastante polémica con los aceites hidrogenados debido a la presencia de isómeros de ácidos grasos trans que surgen del proceso de hidrogenación. Se ha relacionado la ingesta de grandes cantidades de isómeros trans con unos efectos perjudiciales para la salud, que incluyen una mayor proporción de lipoprote�nas de baja densidad a alta densidad en el plasma sanguíneo y un mayor riesgo de enfermedad cardíaca coronaria.

Aceites que contienen PUFA para su uso en productos alimentarios

En la actualidad, el mercado ofrece una gran variedad de productos alimentarios y piensos que incorporan ácidos grasos omega-3 y/u omega-6 (en particular ARA, EPA y DHA). Se contempla que los aceites vegetales/de semillas, y los aceites de semillas alteradas y microbianos descritos en la presente que comprenden PUFA actuarán en los productos alimentarios y piensos para impartir beneficios para la salud en las actuales formulaciones. Comparados con otros aceites vegetales, se cree que estos aceites actúan de forma similar a otros aceites en aplicaciones alimentarias desde un punto de vista físico (por ejemplo, los aceites parcialmente hidrogenados, tales como el aceite de soja, se emplean ampliamente como ingredientes para productos para untar blandos, margarina y manteca para hornear y freir).

Los aceites vegetales/de semillas, y los aceites de semillas alteradas y microbianos que contienen ácidos grasos omega-3 y/u omega-6 según se describen en la presente ser�n adecuados para su uso en una diversidad de productos alimentarios y piensos que incluyen, pero no se limitan a análogos de alimentos, productos cárnicos, productos de cereales, alimentos cocinados, aperitivos y productos lácteos. Además, los presentes aceites vegetales/de semillas, y los aceites de semillas alteradas y microbianos pueden utilizarse en formulaciones para impartir un beneficio para la salud en alimentos medicinales, que incluyen nutricionales m�dicos, suplementos dietéticos, leche maternizada, as� como productos farmacéuticos. Los expertos en la técnica del procesamiento de alimentos y la formulación de alimentos comprenderán la manera en que la cantidad y la composición de aceites vegetales y microbianos pueden añadirse al producto alimentario o pienso. Esta cantidad se denomina en la presente una cantiadad ”eficaz”, y depender� del producto alimentario o pienso, de la dieta a la que pretende suplementar el producto o del trastorno m�dico que el alimento m�dico o el nutricional m�dico pretende corregir o tratar.

Pueden fabricarse análogos de alimentos utilizando procesos muy conocidos por los expertos en la técnica. Pueden mencionarse análogos de la carne, análogos del queso, análogos de la leche y similares. Los análogos de la carne fabricados a partir de soja contienen proteína de soja o tofu y otros ingredientes mezclados entre s� para simular diversos tipos de carnes. Estas alternativas a la carne se comercializan como alimentos congelados, enlatados o secados. Normalmente pueden utilizarse de la misma manera que los alimentos a los que sustituyen. Las alternativas a la carne fabricadas a partir de soja son excelentes fuentes de proteínas, hierro y vitamina B. Los ejemplos de análogos de la carne incluyen, pero no se limitan a análogos del jamón, análogos de salchichas, análogos de beicon y similares.

Los análogos de alimentos pueden clasificarse como imitaciones o sustitutos dependiendo de sus características funcionales y de composición. Por ejemplo, un queso de imitacion solo es necesario que se parezca al queso que se desea sustituir. Sin embargo, un producto puede denominarse generalmente un sustituto del queso solo si es nutricionalmente equivalente al queso que sustituye y si cumple los requisitos mínimos de composición de ese queso. As�, los sustitutos del queso a menudo tendrán un mayor nivel de proteínas que los quesos de imitación y estarán reforzados con vitaminas y minerales.

Los análogos de la leche o productos alimentarios no lácteos incluyen, pero no se limitan a leches de imitación y postres helados no lácteos (por ejemplo, los fabricados a partir de soja y/o productos de proteínas de soja).

Los productos cárnicos incluyen una amplia variedad de productos. En EEUU, “carne” incluye “carnes rojas” producidas a partir de ganado vacuno, cerdos y ovejas. Además de las carnes rojas también se incluyen piezas de aves de corral, que incluyen pollos, pavos, ocas, galllinas de Guinea, patos, y el pescado y el marisco. Existe un

amplio surtido de productos cárnicos sazonados y procesados: frescos, curados y fritos, y curados y cocinados. Las salchichas y los perritos calientes son ejemplos de productos cárnicos procesados. As�, la expresión “productos cárnicos”, tal como se emplea en la presente, incluye, pero no se limita a productos cárnicos procesados.

Un producto alimentario de cereales es un producto alimentario derivado del procesamiento de granos de cereal. Los granos de cereal incluyen cualquier planta de la familia de las gramíneas que produzca un grano comestible (semilla). Los granos más populares son cebada, maíz, mijo, avena, quinoa, arroz, centeno, sorgo, triticale, trigo y arroz salvaje. Los ejemplos de productos alimentarios de cereales incluyen, pero no se limitan a grano integral, grano triturado, sémola, harina, salvado, germen, cereales para el desayuno, alimentos extrusionados, pastas y similares.

Un producto de bienes horneados comprende cualquiera de los productos alimentarios de cereales mencionados anteriormente que ha sido horneado o procesado de una manera comparable al horneado (es decir, secar o endurecer mediante calor). Los ejemplos de un producto de bienes horneados incluyen, pero no se limitan a pan, tartas, rosquillas, barras, pastas, migados de pan, aperitivos horneados, minigalletas, minigalletas saladas, minigalletitas, y minibizcochos secos. Tal como se mencion� anteriormente, los aceites descritos en la presente pueden utilizarse como ingrediente.

Un producto alimentario de aperitivo comprende cualquiera de los productos alimentarios descritos anteriormente o a continuación.

Un producto alimentario frito comprende cualquiera de los productos alimentarios descritos anteriormente o a continuación que se ha frito.

Un producto alimentario saludable es cualquier producto alimentario que imparte un beneficio para la salud. Muchos productos alimentarios derivados de semillas oleaginosas pueden considerarse alimentos saludables.

Una bebida puede estar en forma líquida o en forma de un polvo seco.

Por ejemplo, pueden mencionarse las bebidas no carbonatadas, tales como zumos de fruta, frescos, congelados, enlatados o concentrados; bebidas de leche sola o con aromas, etc. Las leches maternizadas nutricionales para adultos y bebés son muy conocidas en la técnica y est�n disponible en el mercado (por ejemplo, Similac�, Ensure�, Jevity�, y Alimentum� de Ross Products Division, Abbott Laboratories).

Las leches maternizadas son líquidos o polvos reconstituidos con los que se alimenta a bebés y niños pequeños. Una “leche maternizada” se define en la presente como un producto nutricional ent�rico que puede sustituir a la lecha materna humana para la alimentación de bebés y generalmente est� compuesto de un porcentaje deseado de grasa mezclada con porcentajes deseados de carbohidratos y proteínas en una disolución acuosa (por ejemplo, véase la patente de EEUU n.� 4.670.285). Basándose en estudios de composición a escala global, as� como en los niveles especificados por grupos de expertos, la lecha materna humana promedio generalmente contiene de aproximadamente 0,20% al 0,40% de ácidos grasos totales (suponiendo aproximadamente 50% de calorías de las grasas); y, en general, la proporción de DHA a ARA varía de aproximadamente 1:1 a 1:2 (ve�se, por ejemplo, las formulaciones de Enfamil LIPIL™ (Mead Johnson & Company) y Similac Advance™ (Ross Products Division, Abbott Laboratories)). Las leches maternizadas desempeñan un papel especial en las dietas de bebés porque a menudo son la única fuente de nutrientes para los bebés; y aunque dar el pecho sigue siendo el mejor alimento para los bebés, las leches maternizadas son un apoyo lo bastante parecido como para que los bebés no solo sobrevivan sino que también crezcan.

Un producto lácteo es un producto derivado de la leche. Un análogo de la lecho o producto no lácteo se deriva de una fuente distinta de la leche, por ejemplo, la lecha de soja analizada anteriormente. Estos productos incluyen, pero no se limitan a lecha entera, leche desnatada, leche fermentada, productos tales como yogur o leche agria, nata, mantequilla, leche condensada, leche deshidratada, leche en polvo para café, crema para café, helados, queso, etc.

Otros productos alimentarios en los que pueden incluirse aceites que contienen PUFA son, por ejemplo, gomas de mascar, pasteles y escarchados, gelatinas y flanes, caramelos duros y blandos, mermeladas y jaleas, azúcar blanco granulado, sustitutos del azúcar, salsas dulces, coberturas y jarabes, y mezclas de polvos combinados en seco.

Aceites que contienen PUFA para su uso en productos alimentarios saludables y productos farmacéuticos

Un producto alimentario saludable es cualquier producto alimentario que imparte un beneficio para la salud e incluye alimentos funcionales, alimentos m�dicos, nutricionales m�dicos y suplementes dietéticos. Además, los aceites vegetales/de semillas descritos en la presente, las semillas alteradas de la invención y los aceites microbianos descritos en la presente pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas convencionales (por ejemplo, los aceites que contienen PUFA de cadena larga pueden incorporarse con facilidad en cualquiera de los productos alimentarios mencionados anteriormente para producir con ello un alimento funcional o m�dico). Las formulaciones más concentradas que comprenden PUFA incluyen cápsulas, polvos, comprimidos, geles blandos, cápsulas de gel, concentrados líquidos y emulsiones que pueden utilizarse como suplemento dietético en seres humanos o animales distintos de los seres humanos.

Aceites que contienen PUFA para su uso en piensos para animales

Los piensos para animales se definen de modo genérico en la presente como productos previstos para su uso como pienso o para mezclar en piensos para animales distintos de los seres humanos. Los aceites vegetales/de semillas descritos en la presente, las semillas alteradas de la invención y los aceites microbianos descritos en la presente pueden utilizarse como ingrediente en diversos piensos para animales.

De modo más específico, aunque no limitado, se espera que los aceites descritos en la presente puedan utilizarse en productos alimentarios para mascotas, productos alimentarios para rumiantes y aves de corral, y productos alimentarios de acuicultura. Los productos alimentarios para mascotas son aquellos productos previstos para alimentar a una mascota (por ejemplo, perro, gato, ave, reptil, roedor). Estos productos pueden incluir los anteriores productos alimentarios de cereales y saludables, as� como carne y subproductos de la carne, productos de proteínas de soja, productos de hierba y paja (por ejemplo, alfalfa, fleo, avena o bromo, verduras). Los productos alimentarios para rumiantes y aves de corral son aquellos en los que el producto est� previsto para alimentar a un animal (por ejemplo, pavos, pollos, ganado bovino, cerdos). Al igual que los anteriores alimentos para mascotas, estos productos pueden incluir productos alimentarios de cereales y saludables, productos de proteínas de soja, carne y subproductos de la carne, y productos de hierba y paja, según se list� anteriormente. Los productos alimentarios de acuicultura (o “acuapiensos”) son aquellos productos previstos para su uso en la acuicultura, es decir, lo concerniente a la propagación, el cultivo o la cría de organismos acuáticos y/o animales en agua dulce o salada.

Ejemplos

La presente invención se define más a fondo en los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, solo se ofrecen como ilustración.

M�todos generales

Las técnicas de ADN recombinante y de clonaci�n molecular convencionales utilizadas en los ejemplos son muy conocidas en la técnica y son descritas por: 1.) Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) (Maniatis); 2.) T.J. Silhavy, M.L. Bennan, y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984); y 3.) Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, Hoboken, NJ (1987).

Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y el crecimiento de cultivos microbianos son muy conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas para su uso en los siguientes ejemplos pueden encontrarse tal como se exponen en Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R.G.E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillips, eds), American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994)); o en Thomas D. Brock, en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2� ed., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1989). Todos los reactivos, las enzimas de restricción y los materiales utilizados para el crecimiento y el mantenimiento de las células microbianas se obtuvieron en Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), a menos que se indique lo contrario. Las células de E. coli (XL1-Blue) competentes se obtuvieron en Stratagene Company (San Diego, CA). Las cepas de E. coli generalmente se cultivaron a 37 �C en placas Luria Bertani (LB).

La clonaci�n molecular general se realizó según métodos convencionales (Sambrook et al., supra). La secuencia de ADN se gener� en un secuenciador automático ABI utilizando la tecnología de tinte de terminador (patente de EEUU 5.366.860; documento EP 272.007) utilizando una combinación de vector y cebadores específicos de inserción. La edición de la secuencia se realizó en un Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). Todas las secuencias representan una cobertura de al menos dos veces en ambas direcciones. Las comparaciones de las secuencias genéticas se realizaron utilizando un software DNASTAR (DNASTAR Inc., Madison, WI).

El significado de las abreviaturas es el siguiente: "seg" significa segundo o segundos, "min" significa minuto o minutos, "h" significa hora u horas, "d" significa día o días, "∃l" significa microlitro o microlitros, "ml" significa mililitro mililitros, "l" significa litro o litros, "∃M" significa micromolar, "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol o milimoles, "∃mole" significa micromol o micromoles, "g" significa gramo o gramos, "∃g" significa microgramo o microgramos, "ng" significa nanogramo o nanogramos, "U" significa unidad o unidades, "pb" significa par o pares de bases, y "kB" significa kilobase o kilobases.

Tranformaci�n y cultivo de Yarrowia lipolytica

La cepa ATCC n.� 20362 de Yarrowia lipolytica se obtuvo en American Type Culture Collection (Rockville, MD). Las cepas de Y. lipolytica generalmente se cultivaron a 28 �C sobre agar YPD (extracto de levadura al 1%, bactopeptona al 2%, glucosa al 2%, agar al 2%).

La transformación de Y. lipolytica se realizó según el método de Chen, D.C. et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 48(2):232-235 (1997)), a menos que se indique lo contrario. Brevemente, Yarrowia se cultiv� en estr�as sobre una

placa de YPD y se cultiv� a 30 �C durante aproximadamente 18 hr. Se rasparon, con un asa de siembra, varias cantidades considerables de células de la placa y se resuspendieron en 1 ml de tampón de transformación que contenía 2,25 ml de PEG al 50%, PM medio 3350; 0,125 ml de acetato de Li 2 M, pH 6,0; 0,125 ml de DTT 2 M; y 50 mg de ADN de esperma de salmón cizallado. Después aproximadamente 500 ng de ADN plasm�dico linealizado se incub� en 100 ∃l de las células resuspendidas, y se mantuvo a 39 �C durante 1 hr con mezclado en v�rtice a intervalos de 15 min. Las células se cultivaron en placas con medio de selección y se mantuvieron a 30 �C durante 2 a 3 días.

Para la selección de los transformantes en general se emple� medio mínimo ("MM"); la composición de MM es como sigue: base de nitrógeno de levadura al 0,17% (DIFCO Laboratories, Detroit, MI) sin sulfato de amonio ni amino�cidos, glucosa al 2%, prolina al 0,1%, pH 6,1). Se añadieron suplementos de uracilo según fuera apropiado hasta una concentración final del 0,01% (produciendo con ello el medio de selección "MMU", preparado con agar 20 g/l).

Como alternativa, los transformantes se seleccionaron en un medio de selección de ácido 5-fluoroor�tico ("FOA"; también ácido 5-fluorouracil-6-carbox�lico monohidrato), que comprende: base de nitrógeno de levadura al 0,17% (DIFCO Laboratories) sin sulfato de amonio ni amino�cidos, glucosa al 2%, prolina al 0,1%, uracilo 75 mg/l, uridina 75 mg/l, FOA 900 mg/l (Zymo Research Corp., Orange, CA) y agar 20 g/l.

An�lisis de ácidos grasos de Yarrowia lipolytica

Para el análisis de ácidos grasos, las células se recogieron mediante centrifugaci�n, y los lípidos se extrajeron como se describe en Bligh, E.G. y Dyer, W.J. (Can. J. Biochem. Physiol., 37:911-917 (1959)). Se prepararon los ésteres met�licos de ácidos grasos mediante transesterificaci�n del extracto lip�dico con met�xido de sodio (Roughan, G., y Nishida I., Arch Biochem Biophys., 276(1):38-46 (1990)) y después se analizaron con un Hewlett-Packard 6890 GC equipado con una columna de 30 -m x 0,25 mm (d.i.) HP-INNOWAX (Hewlett-Packard). La temperatura de la estufa fue de 170 �C (25 min de mantenimiento) hasta 185 �C a 3,5 �C/min.

Para la transesterificaci�n de bases directa, el cultivo de Yarrowia (3 ml) se recolect�, se lav� una vez con agua destilada y se secó al vacío en un Speed-Vac durante 5-10 min. Se a�adi� met�xido de sodio (100 ∃l al 1%) ala muestra, y después la muestra se agit� en v�rtice y se balance� durante 20 min. Después de añadir 3 gotas de NaCl 1 M y 400 ∃l de hexano, la muestra se agit� en v�rtice y se centrifug�. La capa superior se retir� y se analizó mediante GC según se describió anteriormente.

Ejemplo 1: Condiciones de crecimiento de Euglena gracilis, perfil de lípidos y aislamiento de ARNm

Euglena gracilis se obtuvo del laboratorio del doctor Richard Triemer en the Michigan State University (East Lansing, MI). A partir de 10 ml del cultivo en crecimiento activo se traslad� una parte alícuota de 1 ml a 250 ml de medio de Euglena gracilis (Eg) en una botella de vidrio de 500 ml. El medio Eg se prepar� combinando 1 g de acetato de sodio, 1 g de extracto de carne de vaca (n.� de catálogo U126-01, Difco Laboratories, Detroit, MI), 2 g de Bacto� triptona (n.� de catálogo 0123-17-3, Difco Laboratories) y 2 g de Bacto� extracto de levadura (n.� de catálogo 012717-9, Difco Laboratories) en 970 ml de agua. Después de esterilizar con filtro se añadieron de modo aséptico 30 ml de sobrenadante de tierra-agua (n.� de catálogo 15-3790, Carolina Biological Supply Co., Burlington, NC) para producir el medio Eg final. Los cultivos de Euglena gracilis se hicieron crecer a 23 �C con un ciclo de 16 h de luz, 8 h de oscuridad durante 2 semanas sin agitaci�n.

Despu�s de 2 semanas, se retiraron 10 ml del cultivo para el análisis de lipidos y se centrifigaron a 1.800 x g durante 5 min. El sedimento se lav� una vez con agua y se volvió a centrifugar. El sedimento resultante se secó durante 5 min al vacío, se resuspendi� en 100 ∃l de hidróxido de trimetilsulfonio (TMSH) y se incub� a temperatura ambiente durante 15 min con agitaci�n. Después de esto se añadieron 0,5 ml de hexano y los viales se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente con agitaci�n. Los ésteres met�licos de ácidos grasos (5 ∃l inyectados de la capa de hexano) se separon y se cuantificaron utilizando un cromat�grafo de gases Hewlett-Packard 6890 equipado con una columna capilar de sílice fundida Omegawax 320 (n.� de catálogo 24152, Supelco Inc., Bellefonte, PA). La temperatura de la estufa se program� para que se mantuviese a 220 �C durante 2,7 min, aumentase hasta 240 �C a 20 �C/min y después se mantuviese durante 2,3 min más. El gas vehículo fue suministrado por un generador de hidrógeno Whatman. Los tiempos de retención se compararon con los de los ésteres met�licos de patrones disponibles en el mercado (n.� de catálogo U-99-A, Nu-Chek Prep, Inc., Elysian, MN), y el cromatograma resultante se muestra en la figura 2.

El resto del cultivo de dos semanas (240 ml) se sediment� mediante centrifugaci�n a 1.800 x g durante 10 min, se lav� una vez con agua y se volvió a centrifugar. El ARN total se extrajo del sedimento resutlante utilizando el reactivo RNA STAT-60™ (TEL-TEST, Inc. Friendswood, TX) y siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante (uso de 5 ml de reactivo, ARN disuelto en 0,5 ml de agua). De esta manera, se obtuvo 1 mg de ARN total (2 mg/ml) del sedimento. El ARNm se aisl� del 1 mg de ARN total utilizando un kit de purificación de ARNm (Amersham Biosciencies, Piscataway, NJ) siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. De esta forma se obtuvieron 85 ∃g de ARNm.

Ejemplo 2: Síntesis de ADNc de Euglena gracilis

El ADNc se sintetizó directamente del ARNm de Euglena gracilis como sigue. De modo específico, el ARNm se ceb� con un cebador adaptador AP (SEQ ID NO:65) del kit 3’-RACE de Invitrogen (Carlsbad, CA), en presencia del oligonucle�tido Smart IV (SEQ ID NO:66) del kit de banco de ADNc BD-Clontech Creator™ Smart™ (Mississauga, ON, Canada). La transcripción inversa se realizó con la transcriptasa inversa Superscript II del kit the 3’-RACE según el protocolo del kit de banco de ADNc Creator™ Smart™.

La mezcla de síntesis de la 1� hebra de ADNc se emple� como molde para la amplificación con PCR, utilizando AP como cebador 3’, y el cebador CDSIII 5’ (SEQ ID NO:36) como cebador 5’ (suministrado con el kit de banco de ADNc BD-Clontech Creator™ Smart™). La amplificación se realizó con una mezcla de ADNc polimerasa de Clontech Advantage a 94 �C durante 30 seg, seguido de 20 ciclos de 94 �C durante 10 seg y 68 �C durante 6 min. Se realizó una extensión final a 68 �C durante 7 min.

Ejemplo 3: Aislamiento de una porción de la región codificadora del gen de delta-5 desaturasa de Euglena gracilis

El presente ejemplo describe la identificación de una porción del gen de Euglena gracilis que codifica la delta-5 desaturasa (denominado en la presente “EgD5” (SEQ ID NO:1 y 2)) mediante el uso de cebadores derivados de regiones conservadas de otras secuencias de delta-5 y delta-8 desaturasas conocidas.

Se emplearon diversas consideraciones cuando se evaluaron cuáles eran las desaturasas que podrían permitir el diseño de cebadores degenerados adecuados para aislar la delta-5 desaturasa de Euglena gracilis. De modo específico, los solicitantes sabían que solo las secuencias de delta-5, delta-6 y delta-8 desaturasa comprenden un motivo “HPGG” conservado en su N-terminal (siendo dicho dominio “HPGG” parte del dominio del citocromo B5 muy conocido); por contraste, las delta-9 desaturasas poseen un motivo “HPGG” del dominio del citocromo B5 en su extremo C-terminal, mientras que las delta-17 y delta-12 desaturasas carecen del dominio del citocromo B5. Se supuso que una vía de delta-9 elongasa/delta-8 desaturasa actúa en Euglena gracilis; as�, entre las desaturasas que comparten el motivo “HPGG” conservado N-terminal, solo se espera que aparezcan dentro del organismo las delta-5 y delta-8 desaturasas. Por último, aunque solo se conocen una pocas secuencias de delta-8 desaturasas, numerosas delta-5 desaturasas son públicas. Los solicitantes han seleccionado las secuencias de delta-5 desaturasa que poseen una menor homología con los genes de delta-5 desaturasa “tradicionales” y que también comparten homología entre s�.

Bas�ndose en lo anterior, las cuatro delta-5 desaturasas y dos delta-8 desaturasas mostradas a continuación en la tabla 3 se alinearon, utilizando el método de Clustal W (lento, preciso, opción Gonnet; Thompson et al., Nucleic Acids Res., 22:4673-4680 (1994)) del programa MegAlign™ del software DNASTAR.

Tabla 3

Delta-5 y delta-8 desaturasas alineadas para identificar regiones de amino�cidos conservados

Desaturasa: Organismo Referencia SEQ ID NO:

delta-5: Pythium irregulare n.� de registro de GenBank AAL13311 12

delta-5: Phytophthora megasperma n.� de registro de GenBank CAD53323 13

delta-5: Phaeodactylum tricomutum n.� de registro de GenBank AAL92562 14

delta-5: Dictyostelium discoideum n.� de registro de GenBank XP_640331 15

delta-8: Euglena gracilis publicaciones PCT n�. WO 2006/012325 y n.� WO 2006/012326 16

delta-8: Pavlova lutheri Ejemplo 12 (a continuación) 18

La figura 3 muestra una porción del alineamiento resultante, que contiene varios tramos de secuencia de amino�cidos conservados entre los 6 organismos diferentes. Basándose en este alineamiento, se diseñaron dos conjuntos de oligonucle�tidos degenerados para amplificar una porción de la región codificadora del gen de delta-5 desaturasa de Euglena gracilis, que se corresponde con las regiones de la figura 3 que est�n indicadas como “Región conservada 1” y “Región conservada 2”. De modo específico, se dise�� la secuencia de amino�cidos conservados GHH(I/V)YTN (SEQ ID NO:19) para que se correspondiese con la región conservada 1, mientras que se dise�� la secuencia de amino�cidos conservados N(Y/F)Q(V/I)EHH (SEQ ID NO:20) para que se correspondiese con la región conservada. Para reducir la degeneración de los oligonucle�tidos, se diseñaron 4 conjuntos de oligonucle�tidos (concretamente, 5-1A, 5-1B, 5-1C y 5-1D) que codifican la región conservada 1; y se diseñaron 4 conjuntos de oligonucle�tidos (concretamente, 5-5AR, 5-5BR, 5-5CR y 5-5DR) que codifican la hebra antisentido de la región conservada 2.

Tabla 4

Oligonucle�tidos degenerados utilizados para amplificar el gen de delta-5 desaturasa de Euglena gracilis

Nombre del oligonucle�tido: Secuencia SEQ ID NO:

5-1A: GGHCAYCAYRTBTAYACAAA SEQ ID NO:27

5-1B: GGHCAYCAYRTBTAYACCAA SEQ ID NO:28

5-1C: GGHCAYCAYRTBTAYACGAA SEQ ID NO:29

5-1D: GGHCAYCAYRTBTAYACTAA SEQ ID NO:30

5-5AR: TGRTGVACAAYYTGRWARTT SEQ ID NO:31

5-5BR: TGRTGVACTAYYTGRWARTT SEQ ID NO:32

5-5CR: TGRTGVACCAYYTGRWARTT SEQ ID NO:33

5-5DR: TGRTGVACGAYYTGRWARTT SEQ ID NO:34

(Nota: el código de degeneración de ácidos nucleicos utilizado para SEQ ID NO:27 a 34 fue el siguiente: R = A/G; Y = C/T; W = A/T; B = G/T/C; V = G/A/C; y H = A/C/T)

Bas�ndose en las secuencias de longitud completa de las secuencias delta-5 de la tabla 3, se estableció la hipótesis de que el fragmento del gen delta-5 de Euglena gracilis amplificado como se describió anteriormente tendría una longitud de aproximadamente 600 pb (carece de aproximadamente 210 amino�cidos en su N-terminal y 70

5 amino�cidos en su C-terminal).

Se realizó un total de dieciséis amplificaciones de PCR diferentes, puesto que se ensayaron todas las combinaciones posibles de cebadores (es decir, el cebador 5-1A se emple� con cada uno de 5-5AR, 5-5BR, 5-5CR y 5-5DR de modo individual; de manera similar, el cebador 5-1B se emple� con cada uno de 5-5AR, 5-5BR, 5-5CR y 5-5DR, etc.). las amplificaciones de PCR se realizaron en un volumen total de 50 ∃l que comprende: tampón de

10 PCR (que contiene KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,75), MgSO4 2 mM, Triton X-100 al 0,1%), BSA 100 ∃g/ml (concentración final), cada desoxirribonucle�tido trifosfato 200 ∃M, 10 pmol de cada cebador, 10 ng de ADNc de E. gracilis y 1 ∃l de ADN polimerasa Taq (Epicentre Technologies, Madison, WI). Las condiciones de termociclaci�n se ajustaron para 35 ciclos a 95 �C durante 1 min, 56 �C durante 30 seg y 72 �C durante 1 min, seguido de una extensión final a 72 �C durante 10 min.

15 Los productos de la PCR se purificaron utilizando un kit de purificación de PCR de Qiagen (Valencia, CA). Un fragmento del tamaño esperado aproximado después se purificó tras una electroforesis en gel en agarosa al 1% (en p/v) y después se clon� en el vector pGEM-T-easy (Promega, Madison, WI). El ADN acoplado se emple� para transformar células de E. coli DH10B y se seleccionaron los transformantes en agar de LB (bactotriptona al 1%, bacto-extracto de levadura al 0,5% y NaCl al 1%) que contenía ampicilina (100 ∃g/ml). El análisis del ADN

20 plasm�dico de un grupo de 12 transformantes confirm� la presencia de la inserción con el tamaño esperado (los pl�smidos se denominaron "pT-F10-1", "pT-F10-2", "pT-F10-3", etc. hasta "pT-F10-12").

El análisis de la secuencia muestra que pT-F10-1 contiene un fragmento de 590 pb (SEQ ID NO:4) que codifica 196 amino�cidos (SEQ ID NO:5) (que incluyen los amino�cidos que se corresponden con la región conservada 1 y 2). La identidad de la secuencia de Euglena se determin� realizando búsquedas BLAST (“Basic Local Alignment Search 25 Tool”, herramienta de búsqueda de alineamientos locales básica; Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1993)) para encontrar similitudes con las secuencias contenidas en la base de datos “nr” de BLAST (que comprende todas las traducciones de CDS de GenBank no redundantes, las secuencias derivadas de la estructura tridimensional del banco de datos de proteínas Brookhaven, la base de datos de secuencias de proteínas SWISS-PROT, las bases de datos EMBL y DDBJ). La secuencia se analizó para la similitud con todas las secuencias de

30 ADN públicas contenidas en la base de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTN proporcionado por the National Center for Biotechnology Information (NCBI). La SEQ ID NO:4 se compar� para la similitud con todas las secuencias de proteínas públicas contenidas en la base de datos "nr", utilizando el algoritmo BLASTX (Gish, W. y States, D.J., Nature Genetics, 3:266-272 (1993)) proporcionado por NCBI.

Se indican los resultados de la comparación con BLASTX que resumen la secuencia con la cual SEQ ID NO:4

35 presenta la mayor similitud, según el porcentaje de identidad, el porcentaje de similitud y el valor de la esperanza. El “porcentaje de identidad” se define como el porcentaje de amino�cidos que son idénticos entre las dos proteínas. El “porcentaje de similitud” se define como el porcentaje de amino�cidos que son idénticos o est�n conservados entre las dos proteínas. El “valor de la esperanza” calcula la significancia estadística del apareamiento, especificando el número de apareamientos, con una puntuación concreta, que se esperan en una búsqueda de una base de datos de

40 este tamaño absolutamente por azar. As�, la secuencias de amino�cidos traducida de SEQ ID NO: 4 (es decir, SEQ ID NO:5) tiene 38% de identidad y 53% de similitud con la secuencia de amino�cidos de la delta-8-esfingol�pido desaturasa de Thalassiosira pseudonana (n.� de registro de GenBank AAX14502; SEQ ID NO:21), con un valor de la esperanza de 5E-28; además, el fragmento parcial de SEQ ID NO:4 tiene 37% de identidad y 52% de similitud con la delta-5 ácido graso desaturasa de Phaeodactylum tricomutum (n.� de registro de GenBank AAL92562; SEQ ID NO:14), con un valor de la esperanza de 7E-28.

Ejemplo 4: Aislamiento de la región codificadora 5’ del gen de delta-5 desaturasa de Euglena gracilis

5 Para aislar la porción N-terminal de la delta-5 desaturasa putativa identificada en el ejemplo 3, se utilizó una técnica 5’ RACE basada en los protocolos RACE de dos empresas diferentes (concretamente, Invitrogen y BD-Clontech).

Brevemente, el ADNc bicatenario de Euglena gracilis (ejemplo 2) se emple� como molde en un experimento de 5’ RACE, que comprende dos rondas separadas de amplificación con PCR. En la primera ronda de amplificación con PCR, los cebadores oligonucleot�dicos consisten en un oligonucle�tido específico de gen (concretamente, 10 ODMW480; SEQ ID NO:35) y el oligonucle�tido genérico cebador CDSIII 5’ (SEQ ID NO:36) del kit de banco de ADNc BD-Clontech Creator™ Smart™. Las amplificaciones con PCR se realizaron en un volumen total de 50 ∃l que comprende: 25 ∃l de premezcla LA Taq™ mix (TaKaRa Bio Inc., Otsu, Shiga, 520-2193, Japón), 10 pmol de cada cebador, y 1 ∃l de ADN polimerasa Taq (Epicentre Technologies, Madison, WI). Las condiciones de termociclado se ajustaron para 35 ciclos a 95 �C durante 1 min, 56 �C durante 30 seg y 72 �C durante 1 min, seguido de una

15 extensión final a 72 �C durante 10 min.

La segunda ronda de amplificación con PCR emplea 1 ∃l del producto de la primera ronda de la reacción de PCR como molde. Los cebados consistieron en un oligonucle�tido específico de gen (concretamente, ODMW479; SEQ ID NO:37) y el oligonucle�tido genérico DNR CDS 5’ (SEQ ID NO:38), suministrado con el kit de banco de ADNc BDClontech’s Creator™ Smart™. La amplificación se realizó como se describió anteriormente.

20 Los productos de la segunda ronda de la reacción de PCR se sometieron a una electroforesis en agarosa al 1% (en p/v). Los productos entre 400 pb y 800 pb después se purificaron del gel y se clonaron en el vector pGEM-T-easy (Promega, Madison, WI). El ADN acoplado se emple� para transformar E. coli DH10B, y los transformantes se seleccionaron en agar LB agar que contenía ampicilina (100 ∃g/ml).

El análisis del ADN plasm�dico de un transformante que comprende la región 5’ del gen de delta-5 desaturasa

25 putativo confirm� la presencia del pl�smido esperado, denominado pT-EgD5-5’C2. El análisis de la secuencia demostr� que pTEgD5-5’C2 contenía un fragmento de 797 pb (SEQ ID NO:6), que se solapa con 238 pb del extremo 5’ del fragmento de 590 pb de pT-F10-1 (ejemplo 3, SEQ ID NO:4) y que proporciona además 559 pb de la secuencia 5’ cadena arriba (SEQ ID NO:7) (figura 4). La secuencia de pT-EgD5-5’C2 también corrige la secuencia que se corresponde con la región conservada 1, resultante del uso de un oligonucle�tico degenerado para la

30 amplificación con PCR inicial del fragmento de 590 pb en pT-F10-1 (ejemplo 3). Sin embargo, no aparece ningún cod�n de inicio de la traducción en el fragmento de 797 pb extendido de SEQ ID NO:6.

Se realizó una segunda ronda del 5’ RACE modificado como se describió anteriormente, excepto que se emplearon los oligonucle�tidos YL791 (SEQ ID NO:39) e YL792 (SEQ ID NO:40) como cebadores específicos de genes. Los productos entre 200 pb y 400 pb después se purificaron a partir de un gel y se clonaron en el vector pGEM-T-easy

35 (Promega, Madison, WI). El ADN acoplado se transform� en E. coli DH10B, y los transformantes se seleccionaron en agar LB que contenía ampicilina (100 ∃g/ml).

El análisis del ADN plasm�dico de un transformante que comprende la región 5’ del gen de delta-5 desaturasa putativo confirm� la presencia del pl�smido esperado, denominado pT-EgD5-5’2nd. El análisis de la secuencia demostr� que pTEgD5-5’2nd contenía un fragmento de 273 pb (SEQ ID NO:8), que se solapa con 253 pb del extremo

40 5’ del fragmento de ADN en pT-EgD5-5’C2 descrito anteriormente, y además proporciona 20 pb de la secuencia 5’ cadena arriba (SEQ ID NO:9). Diecisiete (17) pb de los 20 pb codifican la porción N-terminal del gen delta-5 desaturasa putativo, que incluyen el cod�n de inicio de la traducción, proporcionando as� la secuencia 5’ completa del gen.

Ejemplo 5: Aislamiento de la región codificadora 3’ del gen de delta-5 desaturasa de Euglena gracilis

45 Para aislar la región C-terminal de la delta-5 desaturasa putativa identificada en el ejemplo 3, se emple� una técnica 3’ RACE. La metodología se describió anteriormente en el ejemplo 4; sin embargo, los cebadores utilizados en la primera y la segunda ronda de la amplificación de PCR son los que aparecen en la siguiente tabla 5.

Tabla 5

Cebadores oligonucleot�dicos empleados para 3’ RACE

Amplificacion con PCR: Oligonucle�tido específico de gen Oligonucle�tido genérico

1� ronda: ODMW469 (SEQ ID NO:41) AUAP (SEQ ID NO:42)

2� ronda: YL470 (SEQ ID NO:43) AUAP (SEQ ID NO:42)

* El cebador AUAP es suministrado en el kit de 3’-RACE de Invitrogen (Carlsbad, CA).

Despu�s del aislamiento y la purificación de los productos (es decir, 400-800 pb), los fragmentos se clonaron en el vector pGEM-T-easy (Promega) y se transformaron en E. coli DH10B, como en el ejemplo 4.

El análisis del ADN plasm�dico de un transformante que comprende la región 3’ del gen de delta-5 desatura confirma la presencia del pl�smido esperado, denominado pT-EgD5-3’. El análisis de la secuencia demuestra que pT-EgD5-3’ 5 contiene un fragmento de 728 pb (SEQ ID NO:10), que se solapa con 264 pb del extremo 3’ del fragmento de 590 pb de pT-F10-1 (ejemplo 3, SEQ ID NO:4) y proporciona 464 pb de secuencia 3’ cadena abajo adicional (SEQ ID NO:11). Las primeras 184 pb del fragmento de 464 pb incluidas dentro de pT-EgD5-3’ codifican la region codificadora C-terminal (que incluye el cod�n de fin de la traducción) del gen de delta-5 desaturasa putativo. La secuencia de pT-EgD5-3’ también corrige la secuencia que se corresponde con la región conservada 2, resultante

10 del uso de un oligonucle�tico degenerado para la amplificación con PCR inicial del fragmento de 590 pb en pT-F10-1 (ejemplo 3).

Despu�s de dos rondas de 5’ RACE y una ronda de 3’ RACE, se determin� la secuencia de ADN de la región codificadora de delta-5 desaturasa de Euglena gracilis (EgD5) putativa completa. Tal como se muestra en la figura 4, la CDS de EgD5 tenía una longitud de 1350 pb (SEQ ID NO:1) y codifica un polip�ptido con 449 amino�cidos (SEQ 15 ID NO:2), basándose en el alineamiento de SEQ ID NO:4, 6, 8 y 10. Los resultados de las búsquedas con BLASTP utilizando el gen de EgD5 de longitud completa como secuencia de búsqueda demostraron que comparte 30% de identidad y 56% de similitud con la delta-5 ácido graso desaturasa de Phaeodactylum tricomutum (n.� de registro de GenBank AAL92562; SEQ ID NO:14), con un valor de la esperanza 1E-80. Además, el gen de EgD5 de longitud completa comparte 37% de identidad y 55% de similitud con la delta-8-esfingol�pido desaturasa de Thalassiosira

20 pseudonana (n.� de registro de GenBank AAX14502; SEQ ID NO:21), con una valor de la esperanza de 3E-75.

Ejemplo 6: Generación de la construcción pDMW367, que comprende EgD5

El presente ejemplo describe la generación de pDMW367, que comprende un gen quimérico FBAIN::EgD5::Pex20-3’ gene (figura 5C). Este se dise�� para integrar el gen quimérico en el genoma de Yarrowia lipolytica y después estudiar la función de la delta-5 desatura de Euglena gracilis en Yarrowia lipolytica.

25 Basándose en el ADNc de longitud completa de EgD5 (SEQ ID NO:1), se emplaron los oligonucle�tidos YL794 y YL797 (SEQ ID NO:44 y 45, respectivamente) como cebadores para amplificar la primera porción de EgD5 (figura 5A). El cebador YL794 contiene un sitio NcoI, y el cebador YL797 contiene un sitio HindIII. Después se emplearon los cebadores YL796 y YL795 (SEQ ID NO:46 y 47, respectivamente) como cebadores para amplificar la segunda porción de EgD5. El cebador YL796 contiene un sitio HindIII, mientras que el cebador YL797 contiene un sitio NotI.

30 Las reacciones de PCR, utilizando las parejas de cebadores YL794/YL797 o YL796/YL795, con el ADNc de Euglena gracilis (ejemplo 2) como molde, se realizaron individualmente en un volumen total de 50 ∃l que comprende: tampón de PCR (que contiene KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,75), MgSO4 2 mM, Triton X-100 al 0,1%), BSA 100 ∃g/ml (concentración final), 200 ∃M de cada desoxirribonucle�tido trifosfato, 10 pmol de cada cebador, y 1 ∃l de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, San Diego, CA). Las condiciones de termociclaci�n se ajustaron

35 para 35 ciclos a 95 �C durante 1 min, 56 �C durante 30 seg y 72 �C durante 1 min, seguido de una extensión final a 72 �C durante 10 min.

Los productos de la PCR individuales se purificaron utilizando un kit de purificación de PCR de Qiagen. Los productos de la PCR de la reacción amplificada con los cebadores YL794/YL797 se digirieron con NcoI y HindIII, mientras que los productos de la PCR de la reacción amplificada con los cebadores YL796/YL795 se digirieron con 40 HindIII y NotI. Los fragmentos de ADN digeridos con NcoI/HindIII y HindIII/NotI se purificaron tras una electroforesis en gel en agarosa al 1% (en p/v) y después se acoplaron direccionalmente con pZUF17 digerido con NcoI/NotI (figura 5B; SEQ ID NO:22; comprende un gen de delta-17 desaturasa sintético ("D17st") derivado de Saprolegnia diclina (publicación de patente de EEUU n.� 2003/0196217 A1), con codones optimizados para la expresión en Yarrowia lipolytica (publicación PCT n.� WO 2004/101757)). El producto de este acoplamiento fue pDMW367 (figura

45 5C; SEQ ID NO:23), que as� contenía los siguientes componentes:

Tabla 6

Componentes del pl�smido pDMW367 (SEQ ID NO:23)

Sitios RE y nucleótidos dentro de SEQ ID NO:23: Descripción del fragmento y los componentes del gen quimérico

EcoR I/BsiW I (7416-1671): FBAIN::EgD5::Pex20, que comprende: - FBAIN: promotor FBAIN de Yarrowia lipolytica (publicación PCT n.� WO 2005/049805; patente de EEUU 7.202.356) - EgD5: delta-5 desaturasa de Euglena gracilis (SEQ ID NO:1 descrita en la presente; indicado como "Euglena D5DS" en la figura) - Pex20: secuencia del terminador Pex20 del gen Pex20 de Yarrowia (n.� de registro de GenBank AF054613)

Componentes del pl�smido pDMW367 (SEQ ID NO:23)

2707-1827: origen de la replicaci�n del pl�smido ColE1

3637-2777: gen de resistencia a la ampicilina (AmpR) para la selección en E. coli

4536-5840: secuencia de replicaci�n autónoma de Yarrowia (ARS18; n.� de registro de GenBank A17608)

7373-5886: gen Ura 3 de Yarrowia (n.� de registro de GenBank AJ306421)

La expresión “promotor FBAIN” o “región del promotor FBAIN” se refiere a la región no traducida 5’ cadena arriba delante del cod�n de inicio de la traducción “ATG” de la enzima fructosa-bisfosfato aldolasa de Yarrowia lipolytica

(E.C.4.1.2.13) codificada por el gen fba1 y que es necesaria para la expresión, más una porción de la región codificadora 5’ que tiene un intr�n del gen fba1.

5 Ejemplo 7: Generación de la cepa M4 de Yarrowia lipolytica para producir aproximadamente 8% de DGLA de los lípidos totales

El presente ejemplo describe la construcción de la cepa M4, derivada de Yarrowia lipolytica ATCC n.� 20362, capaz de producir 8% de DGLA con relación a los lípidos totales. Esta cepa se modificó para que expresase la vía de delta6 desaturasa/delta-6 elongasa, mediante la introducción de la construcción pKUNF12T6E (figura 6A; SEQ ID

10 NO:24). Esta construcción se gener� para integrar cuatro genes quiméricos (que comprenden una delta-12 desaturasa, una delta-6 desaturasa y dos C18/20 elongasas) en los loci Ura3 de la cepa de Yarrowia de tipo salvaje ATCC n.� 20362, para permitir con ello la producción de DGLA. As�, pKUNF12T6E contiene los siguientes componentes:

Tabla 7

Componentes del pl�smido pKUNF12T6E (SEQ ID NO:24)

Sitios RE y nucleótidos dentro de SEQ ID NO:24: Descripción del fragmento y los componentes del gen quimérico

AscI/BsiWI (9420-8629): 784 pb de la porción 5’ del gen Ura3 de Yarrowia (n.� de registro de GenBank AJ306421)

SphI/PacI (12128-1): 516 pb de la porción 3’ del gen Ura3 de Yarrowia (n.� de registro de GenBank AJ306421)

SwaI/BsiWI (6380-8629): FBAIN::EL1S::Pex20, que comprende: - FBAIN: promotor FBAIN de Yarrowia lipolytica (publicación PCT n.� WO 2005/049805; patente de EEUU 7.202.356; indicado como “Fab1+intr�n” en la figura) - EL1S: gen de elongasa 1 con codones optimizados (publicación PCT n.� WO 2004/101753), derivado de Mortierella alpina (n.� de registgro de GenBank AX464731) - Pex20: secuencia del terminador Pex20 del gen Pex20 de Yarrowia (n.� de registro de GenBank AF054613)

BglII/SwaI (4221-6380): TEF::delta-6S::Lip1, que comprende: - TEF: promotor TEF* de Yarrowia lipolytica *TEF promoter (n.� de registro de GenBank AF054508) - delta-6S: gen de delta-6 desaturasa con codones optimizados (publicación PCT n.� WO 2004/101753), derivado de Mortierella alpina (n.� de registro de GenBank AF465281) - Lip1: secuencia del terminador Lip1 del gen Lip1 de Yarrowia (n.� de registro de GenBank Z50020)

Componentes del pl�smido pKUNF12T6E (SEQ ID NO:24)

PmeI/ClaI (4207-1459): FBA::F.delta-12::Lip2, que comprende: - FBA: promotor FBA de Yarrowia lipolytica (publicación PCT n.� WO 2005/049805; patente de EEUU 7.202.356; indicado como "FBA1" en la figura) - F.delta-12: gen de delta-12 desaturasa de Fusarium moniliforme (publicación PCT n.� WO 2005/047485) - Lip2: secuencia del terminador Lip2 del gen Lip2 de Yarrowia (n.� de registro de GenBank AJ012632)

ClaI/PacI (1459-1): TEF::EL2Syn::XPR2, que comprende: - TEF: promotor TEF de Yarrowia lipolytica (n.� de registro de GenBank AF054508) - EL2Syn: gen de elongasa con codones optimizados (SEQ ID NO:25), derivado de Thraustochytrium aureum (patente de EEUU 6.677.145) - XPR2: aproximadamente 100 pb de la región 3’ del gen Xpr de Yarrowia (n.� de registro de GenBank M17741)

El pl�smido pKUNF12T6E se digirió con AscI/SphI, y después se utilizó para la transformación de Y. lipolytica de tipo salvaje ATCC n.� 20362 según los métodos generales. Las células transformantes se cultivaron en placas con medio de selección de FOA y se mantuvieron a 30 �C durante 2 a 3 días. Las colonias resistencias a FOA se recogieron y se cultivaron en estr�as en placas de selección de MM y MMU. Las colonias que podían crecer en las placas de

5 MMU pero no en la placas de MM se seleccionaron como cepas Ura-. Después, colonias individuales de las cepas Ura- se inocularon en MMU líquido a 30 �C y se agitaron a 250 rpm/min durante 2 días. Las células se recogieron mediante centrifugaci�n, los lípidos se extrajeron y se prepararon los ésteres met�licos de los ácidos grasos mediante transesterificaci�n, y después se analizaron con un Hewlett-Packard 6890 GC.

Los análisis de GC mostraron la presencia de DGLA en los transformantes que contienen los 4 genes quiméricos de

10 pFUNF12T6E, pero no en la cepa control de Yarrowia de tipo salvaje. La mayoría de las 32 cepas Uraseleccionadas produjeron aproximadamente 6% de DGLA de los lípidos totales. Hubo 2 cepas (concretamente, las cepas M4 y 13-8) que produjeron aproximadamente 8% de DGLA de lípidos totales.

Ejemplo 8: Análisis funcional del gen EgD5 en la cepa M4 de Yarrowia lipolytica

El pl�smido pDMW367 (ejemplo 6) que comprende un gen quimérico FBAIN::EgD5::Pex20 se transform� en la cepa

15 M4 (ejemplo 7), según se describe en los métodos generales. Los transformantes se seleccionaron en placas de MM. Después de 2 días de cultivo a 30 �C, los transformantes cultivados en las placas de MM se seleccionaron y se volvieron a cultivar en estr�as en placas de MM fresco. Tras haber sido cultivadas, estas cepas se inocularon de forma individual en 3 ml de MM líquido a 30 �C y se agitaron a 250 rpm/min durante 2 días. Las células se recogieron mediante centrifugaci�n, los lípidos se extrajeron y se prepararon los ésteres met�licos de ácidos grasos mediante

20 transesterificaci�n, y después se analizaron con un Hewlett-Packard 6890 GC.

Los análisis de GC mostraron que había aproximadamente 5,6% de DGLA y 2,8% de ARA de los lípidos totales producidos en los tres transformantes, mientras que se determin� que la eficacia de la conversión de DGLA a ARA en estas tres cepas era de aproximadamente 33% (media). La eficacia de la conversión se midió según la siguiente fórmula: ([producto]/[sustrato+producto])*100, en la que “producto” incluye el producto inmediato y todos los

25 productos en la vía derivados de él. As�, estos datos experimentales demuestran que la delta-5 desaturasa de Euglena gracilis clonada, descrita en la presente como SEQ ID NO:1 y 2, desatura DGLA a ARA con eficacia.

Ejemplo 9: Síntesis de un gen de delta-5 desaturasa con codones optimizados (“EgD5S”) para la expresión en

Yarrowia lipolytica

La utilización de codones del gen de delta-5 desaturasa de Euglena gracilis (SEQ ID NO:1 y 2; EgD5) se optimizó

30 para la expresión en Yarrowia lipolytica, de una manera similar a la descrita en la publicación PCT n.� WO 2004/101753 y la patente de EEUU 7.125.672. De modo específico, se dise�� un gen de delta-5 desaturasa con codones optimizados (denominado “EgD5S”; SEQ ID NO:3) basándose en la secuencia codificadora del gen de delta-5 desaturasa de EgD5, según el patrón de utilización de codones de Yarrowia lipolytica (publicación PCT n.� WO 2004/101753), la secuencia consenso alrededor del cod�n de inicio de la traducción “ATG”, y las reglas

35 generales de estabilidad del ARN (Guhaniyogi, G. y J. Brewer, Gene, 265(1-2):11-23 (2001)). Además de la modificación del sitio de inicio de la traducción, se modificaron 198 pb de la región codificadora de 1350 pb (14,5%, figura 7), y se optimizaron 189 codones (42%). El contenido en GC se redujo desde 55,5% dentro del gen de tipo salvaje (es decir, EgD5) hasta 54,4% dentro del gen sintético (es decir, EgD5S). Se incorpor� un sitio NcoI y sitios NotI alrededor del cod�n de inicio de la traducción y después del cod�n de fin de EgD5S, respectivamente. Ninguna de las modificaciones en el gen con codones optimizados cambi� la secuencia de amino�cidos de la proteína codificada (SEQ ID NO:2). El gen EgD5S diseñado (SEQ ID NO:3) fue sintetizado por GenScript Corporation (Piscataway, NJ) y clonado en pUC57 (n.� de registro de GenBank Y14837) para generar pEgD5S (figura 6B; SEQ

5 ID NO:48).

Ejemplo 10: Generación de la construcción pDMW369, que comprende EgD5S

El presente ejemplo describe la construcción del pl�smido pDMW369 que comprende un gen quimérico FBAIN::EgD5S::Pex20. El pl�smido pDMW369 (figura 6C; SEQ ID NO:49) se construyó reemplazando el fragmento Nco I/Not I de pZUF17 (figura 5B; SEQ ID NO:22) por el fragmento Nco I/Not I EgD5S de pEgD5S (figura 6B; SEQ

10 ID NO:48). El producto de este acoplamiento fuer pDMW369, que con ello contiene los siguientes componentes:

Tabla 8

Componentes del pl�smido pDMW369 (SEQ ID NO:49)

Sitios RE y nucleótidos dentro de SEQ ID NO:49: Descripción del fragmento y los componentes del gen quimérico

EcoR I/BsiW I (6063-318): FBAIN::EgD5S::Pex20, que comprende: - FBAIN: promotor FBAIN de Yarrowia lipolytica (publicación PCT n.� WO 2005/049805; patente de EEUU 7.202.356; indicado como “FBA1+intr�n” en la figura) - EgD5S: delta-5 desaturasa con codones optimizados (SEQ ID NO:3, descrita en la presente como EgD5S) derivado de Euglena gracilis - Pex20: secuencia del terminador Pex20 del gen Pex20 de Yarrowia (n.� de registro de GenBank AF054613)

1354-474: origen de la replicaci�n del pl�smido ColE1

2284-1424: gen de resistencia a la ampicilina (AmpR) para la selección en E. coli

3183-4476: secuencia de replicaci�n autónoma de Yarrowia (ARS18; n.� de registro de GenBank A17608)

6020-4533: gen Ura 3 de Yarrowia (n.� de registro de GenBank AJ306421)

Ejemplo 11: Expresión de la delta-5 desaturasa con codones optimizados (“EgD5S”) en la cepa M4 de Yarrowia lipolytica

El pl�smido pDMW369 (ejemplo 10, que comprende un gen quimérico FBAIN::EgD5S::Pex20) se transform� en la

15 cepa M4 (ejemplo 7), según se describe en los métodos generales. Los transformantes se seleccionaron en placas de MM. Después de 2 días de cultivo a 30 �C, los transformantes cultivados en las placas de MM se seleccionaron y se volvieron a cultivar en estr�as en placas de MM fresco. Tras haber sido cultivadas, se recogieron células individuales de esas cepas mediante centrifugaci�n, los lípidos se extrajeron y se prepararon los ésteres met�licos de ácidos grasos mediante transesterificaci�n, y después se analizaron con un Hewlett-Packard 6890 GC.

20 Los análisis de GC mostraron que había aproximadamente 3,3% de DGLA y 2,7% de ARA del total de lípidos producidos en los tres transformantes, mientras que se determin� que la eficacia de la conversión de DGLA a ARA en estas tres cepas era de aproximadamente 45% (media, calculada como se describe en el ejemplo 8). As�, estos datos experimentales demuestran que la delta-5 desaturasa de Euglena gracilis sintética con codones optimizados para la expresión en Yarrowia lipolytica (EgD5S, según se indica en SEQ ID NO:3) es aproximadamente 36% más

25 eficaz para desaturar DGLA a ARA que el gen EgD5 de tipo salvaje (SEQ ID NO:1).

Ejemplo 12: Aislamiento de una delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri (CCMP459)

El presente ejemplo describe el aislamiento de la delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri (CCMP459) utilizada en el ejemplo 3 y en la figura 3 (también describa en la solicitud de patente de EEUU n.� 11/737.772, presentada el 20 de abril, 2007). Esto requiere la síntesis de ADNc de Pavlova lutheri (CCMP459); la construcción del banco y la

30 secuenciaci�n; la identificación de los homólogos de delta-8 desaturasa; y la clonaci�n de la delta-8 desaturasa de longitud completa a partir de ADN gen�mico.

S�ntesis de ADNc de Pavlova lutheri (CCMP459), construcción del banco y secuenciaci�n

Se sintetizó un banco de ADNc de Pavlova lutheri (CCMP459) según se describe en la publicación PCT n.� WO 2004/071467 (publicada el 26 de agosto, 2004). Brevemente, se obtuvieron sedimentos congelados de Pav459 de 35 the Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton (CCMP, West Boothbay Harbor, ME). Estos sedimentos se trituraron en nitrógeno líquido y el ARN total se extrajo de Pav459 utilizando el kit Qiagen

RNeasy� Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA), según las instrucciones del fabricante. A partir de este ARN total se aisl� el ARNm utilizando resina de celulosa con oligo dT, que después se emple� para la construcción de un banco de ADNc utilizando el vector pSport1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). El ADNc producido de esta manera se clon� direccionalmente (5’ SalI/3’ NotI) en el vector pSport1. El banco de Pav459 contenía aproximadamente 6,1 x 105 clones por ml, cada uno con un tamaño medio de la inserción de aproximadamente 1200 pb. El banco de Pavlova lutheri se denomin� eps1c.

Para la secuenciaci�n, primero se recuperaron los clones de los cultivos en glicerol archivados cultivados/congelados en placas de medio de congelación de 384 pocillos, y se inocularon con un recolector de colonias QPix� automático (Genetix) en placas de 96 pocillos profundos que contenían LB + ampicilina 100 mg/ml. Después de cultivar durante 20 hr a 37 �C, las células se sedimentaron mediante centrifugaci�n y se conservaron a 20 �C. Después los pl�smidos se aislaron en un robot Eppendorf 5Prime, utilizando un método minipreparativo de lisis alcalina en formato de 96 pocillos modificado (Eppendorf PerfectPrep�). Brevemente, se emple� un filtr� y un colector al vacío para facilitar la retirada de los restos celulares después de la precipitación con acetato. Entonces el ADN plasm�dico se unió a una segunda placa de filtro directamente del filtrado, se lav�, se secó y se eluy�.

Se secuenciaron los extremos de los pl�smidos en placas de 384 pocillos, utilizando el cebador T7 cebado con vector (SEQ ID NO:50) y el kit de secuenciaci�n ABI BigDye versión 3 Prism. Para la reacción de secuenciaci�n se emplearon 100-200 ng del molde y 6,4 pmol del cebador, y se repitieron 25 veces las siguientes condiciones de reacción: 96 �C durante 10 seg, 50 �C durante 5 seg y 60 �C durante 4 min. Después de la limpieza con etanol, los productos de la reacción de secuenciaci�n de ciclos se separaron y se detectaron en secuenciadores automáticos Perkin-Elmer ABI 3700.

Identificaci�n de homólogos de la enzima delta-8 desaturasa a partir del banco de ADNc de Pavlova lutheri eps1c

Se identificaron los clones de ADNc que codifican los homólogos de delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri (denominados en la presente delta-8 desaturasas) realizando búsquedas BLAST para la similitud con secuencias contenidas en la base de datos “nr” BLAST (según se descibe en el ejemplo 3). El valor de P (probabilidad) de observar un apareamiento de una secuencia de ADNc con una secuencia contenida en la base de datos en la que se realizó la búsqueda solo por azar, según se calcula con BLAST, se indica en la presente como valores de “pLog”, que representan el negativo del logaritmo del valor de P indicado. Por consiguiente, cuanto mayor sea el valor de pLog, mayor ser� la probabilidad de que la secuencia de ADNc y el “acierto” de BLAST representen proteínas homólogas.

La búsqueda con BLASTX utilizando la secuencia de nucleótidos del clon eps1c.pk002.f22 revel� la similitud de la proteína codificada por el ADNc con la delta-6 desaturasa de Rhizopus stolonifer (SEQ ID NO:51) (n.� de registro de NCBI AAX22052 (GI 60499699), locus AAX22052, CDS AY795076; Lu et al., no publicado). La secuencia de una porción de la inserción de ADNc del clon eps1c.pk002.f22 se muestra en SEQ ID NO:52 (extremo 5’ de la inserción de ADNc). Después se obtuvo la secuencia de la inserción completa (eps1c.pk002.f22:fis) y se muestra en SEQ ID NO:53. La secuencia de la secuencia de amino�cidos deducida (desde el nucleótido 1 de SEQ ID NO:53 hasta el primer cod�n de fin en el nucleótido 864 de SEQ ID NO:53) se muestra en SEQ ID NO:54. La secuenciaci�n de la inserción completa se realizó utilizando un protocolo de transposición modificado. Los clones identificados para la secuenciaci�n de la inserción completa se recuperaron de las cepas en glicerol archivadas como colonias individuales, y se aisl� el ADN plasm�dico mediante lisis alcalina. Los moldes de pl�smidos se transpusieron con el kit de transposición Template Generation System (TGS II) (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia), siguiendo el protocolo del fabricante. El ADN transpuesto se transform� en células EH10B electrocompetentes (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) mediante electroporaci�n. Se seleccionaron aleatoriamente múltiples transformantes de cada reacción de transposición, se prepar� el ADN plasm�dico, y los moldes se secuenciaron como se indicó anteriormente (ABI BigDye v3.1) hacia fuera del sitio del acontecimiento de transposición, utilizando los cebadores exclusivos SeqE (SEQ ID NO: 55) y SeqW (SEQ ID NO:56).

Se recogieron los datos de secuencia (software ABI Prism Collections) y se ensamblaron utilizando el programa de ensamblaje de secuencias Phrap (P. Green, University of Washington, Seattle). Los ensamblajes se visualizaron con el editor de secuencias Consed (D. Gordon, University of Washington, Seattle) para la edición final.

La secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:54 se evalu� mediante BLASTP, produciendo un valor de pLog de 19,52 (valor de E de 3e-20) frente a la delta-6 desaturasa de Mortierella alpina (n.� de registro de NCBI BAC82361 (GI 34221934), locus BAC82361, CDS AB070557; Sakuradani y Shimizu, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67:704-711 (2003)). Basándose en los resultados de la comparación de BLASTP con la desaturasa de Mortierella alpina y otras ácido graso desaturasas, la delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri no era de longitud completa y carecía de la secuencia en el extremo 5’.

Conaci�n de la delta-8 desaturasa de longitud completa a partir del ADN gen�mico de Pavlova lutheri

Se aisl� el ADN gen�mico de Pavlova lutheri (CCMP459) utilizando el kit Qiagen DNeasy� Plant Maxi Prep Kit según el protoclo del fabricante. Utilizando 1 columna maxi por 1 gr de sedimento de células congelado se aisl� un total de 122 ∃g de ADN gen�mico a partir de 4 g de cultivo de Pavlova lutheri. La concentración final del ADN

gen�mico fue de 22,8 ng/∃l. Se sintetizaron bancos GenomeWalker utilizando el kit Universal GenomeWalker™ (BD Biosciences Clonetech, Palo Alto, CA) siguiendo el protocolo del fabricante (Prot# PT3042-1, versión PRO3300). Brevemente, se prepararon cuatro digestiones de restricción según el protocolo utilizando 300 ng de ADN gen�mico por reacción. Después de la limpieza con fenol, los sedimentos se disolvieron en 4 ∃l de agua y los adaptadores se acoplaron según el protocolo.

Para la PCR primaria, se emple� el kit de PCR gen�mica GC Advantage� (BD Biosciences Clonetech) siguiendo el protocolo del fabricante (Prot # PT3090-1, versión PR1X433). Para cada digestión de restricción, 1 ∃l del banco se combin� con 22,8 ∃l de agua de calidad de PCR, 10 ∃l de 5x tampón de reacción de PCR gen�mica GC, 2,2 ∃l de Mg(CH3CO2)2 25 mM, 10 ∃l de GC-Melt (5 M), 1 ∃l de 50x mezcla de dNTP (10 mM cada uno), 1 ∃l de mezcla de pol. gen�mica GC Advantage (50x), 1 ∃l de cebador AP1 Universal GenomeWalker� (10 ∃M, SEQ ID NO:57) y 1 ∃l de GSP PvDES (10 ∃M, SEQ ID NO:58). Después de una desnaturalización a 95 �C, se repitieron 35 veces las siguientes condiciones de reacción: 94 �C durante 30 seg, 68 �C durante 6 min. Después de estas condiciones de reacción se realizó una extensión adicional a 68 �C durante 6 min, seguido de un enfriamiento hasta 15 �C hasta la retirada.

La reacción de PCR primaria para cada banco se analizó mediante una electroforesis en gel de agarosa, y se observaron las bandas de ADN con unos pesos moleculares de aproximadamente 6 kB, 3,5 kB, 2,5 kB y 1,2 kB. Las bandas de ADN de cada banco se purificaron utilizando el kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean™ (Zymo Research, Orange, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. El ADN resultante se clon� en el vector pGEM�-T Easy Vector (Promega) siguiendo el protocolo del fabricante, y las inserciones se secuenciaron utilizando los cebadores T7 (SEQ ID NO:50) y M13-28Rev (SEQ ID NO:59) según se describió anteriormente. Entonces se obtuvieron otras secuencias utilizando un cebador de secuenciaci�n específico de gen PavDES seq (SEQ ID NO:60) que se deriv� de los datos de secuencia recién obtenidos. La secuencia del extremo 5’ completa obtenida mediante paseo del genoma se muestra en SEQ ID NO:61. La secuencia de las regiones solapantes de la secuencia gen�mica (SEQ ID NO:61) y el EST totalmente secuenciado eps1c.pk002.f22:fis (SEQ ID NO:53) se alinearon utilizando Sequencher™ (versión 4.2, Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) empleando el algoritmo de ensamblaje Large Gap. De modo interesante, la comparación demostr� que el EST que se secuenci� originariamente (SEQ ID NO:53) carece de 459 pb cuando se compara con la secuencia gen�mica (SEQ ID NO:61). Esta secuencia que falta en el EST parece ser una deleci�n y no un intr�n, puesto que no se identificaron sitios de corte de intrones claros en el ADN gen�mico en el extremo 5’ del gen. La secuencia gen�mica para el extremo 5’ (SEQ ID NO:61) se combin� con el extremo 3’ de la secuencia EST (SEQ ID NO:53) para producir la SEQ ID NO:62. Utilizando el software de análisis de secuencia Using EditSeq™ 6.1 (DNASTAR Inc., Madison, WI), se identificó un ORF (SEQ ID NO:17). La secuencia de amino�cidos codificada por SEQ ID NO:17 se muestra en SEQ ID NO:18.

La secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:18 se evalu� con BLASTP, produciendo un valor de pLog de 35,10 (valor de E de 8e-36) frente a la delta-6 desaturasa de Rhizopus stolonifer (SEQ ID NO:63) (n.� de registro de NCBI ABB96724 (GI 83027409), locus ABB96724, CDS DQ291156; Zhang et al., no publicado). Además, la delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri es 78,0% idéntica a la secuencia de delta-8 desaturasa de Pavlova salina (SEQ ID NO:64) descrita en la publicación PCT n.� WO 2005/103253 (publicada el 22 de abril, 2005) utilizando el método de Jotun Hein. Los cálculos del porcentaje de identidad de secuencia realizados mediante el método de Jotun Hein (Hein, J.J., Meth. Enz., 183:626-645 (1990)) se realizaron utilizando el programa MegAlign™ v6.1 del paquete bioinform�tico LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI) con los parámetros por defecto para el alineamiento apareado (KTUPLE = 2). La delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri es 76,4% idéntica con la secuencia de delta-8 desaturasa de Pavlova salina utilizando el método Clustal V. Los cálculos del porcentaje de identidad de secuencia realizados mediante el método Clustal V (Higgins, D.G. y Sharp, P.M., Comput. Appl. Biosci,. 5:151-153 (1989); Higgins et al., Comput. Appl, Biosci., 8:189-191 (1992)) se realizaron utilizando el programa MegAlign™ v6.1 del paquete bioinform�tico LASERGENE (DNASTAR Inc.) con los parámetros por defecto para el alineamiento apareado (KTUPLE = 1, PENALIZACI�N DE HUECO = 3, VENTANA = 5, DIAGONALES GUARDADAS = 5 yPENALIZACI�N DE LONGITUD DE HUECO = 10). Las puntuaciones de BLAST y las probabilidades indican que el fragmento de SEQ ID NO:17 codifica la delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri completa.

Las figuras 8A y 8B muestran un alineamiento Clustal V (con los parámetros por defecto) de SEQ ID NO:18 (la secuencia de amino�cidos de la delta-8 desaturasa de Pavlova lutheri), SEQ ID NO:64 (la secuencia de amino�cidos de la delta-8 desaturasa de Pavlova salina, supra), SEQ ID NO:16 (la secuencia de amino�cidos de la delta-8 desaturasa de Euglena gracilis, secuencia descrita como SEQ ID NO:2 en la publicación PCT n.� WO 2006/012325; publicada el 2 de febrero, 2006), SEQ ID NO:63 (la secuencia de amino�cidos de la delta-6 ácido graso desaturasa de Rhizopus stolonifer (n.� de registro de NCBI ABB96724, supra)) y SEQ ID NO:51 (la secuencia de amino�cidos de la delta-6 ácido graso desaturasa de Rhizopus stolonifer (n.� de registro de NCBI AAX22052, supra)). Los resultados del alineamento Clustal V demuestran que SEQ ID NO:18 es 76,4%, 22,6%, 22,2% y 22,2% idéntica a SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:63 y SEQ ID NO:51, respectivamente.

Ejemplo 13: Transformación de cultivos de embriones de soja somáticos

Condiciones de cultivo

Cultivos en suspensión embriog�nicos de soja (cv. Jack) se mantuvieron en 35 ml de medio líquido SB196 (ver a continuación) en un agitador rotatorio, 150 rpm, 28 �C con luces fluorescentes blancas frías con un fotoperiodo de

16:8 hr luz/oscuridad con una intensidad lumínica de 60-85 ∃E/m2/s. Los cultivos se subcultivaron cada 7 días a 2 semanas inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 35 ml de líquido fresco SB196 (el intervalo de subcultivo preferido es cada 7 días).

5 Los cultivos en suspensión embriog�nicos de soja se transformaron con pl�smidos de expresión de soja mediante el método del bombardeo de pistola de partículas (Klein et al., Nature, 327:70 (1987)) utilizando un instrumento DuPont Biolistic PDS1000/HE (retroajuste de helio) para todas las transformaciones.

Inicio del cultivo en suspensión embriog�nico de soja

Se iniciaron cultivos de soja dos veces cada mes con 5-7 días entre cada inicio. Se recogen vainas con semillas

10 inmaduras de plantas de soja disponibles 45-55 días después de la plantación, se retiran las cáscaras y se colocan en una caja magenta esterilizada. Las semillas de soja se esterilizan agitándolas durante 15 min en una disolución de Clorox al 5% con 1 gota de jabón de marfil (es decir, 95 ml de agua destilada en autoclave más 5 ml de Clorox y 1 gota de jabón, bien mezclado). Las semillas se enjuagan utilizando dos botellas de 1 litro de agua destilada estéril y las que son menores que 4 mm se colocan en portaobjetos para microscopio individuales. El extremo pequeño de

15 la semilla se corta y los cotiledones se extraen de la cubierta de la semilla por presión. Los cotiledones se trasladan a placas que contienen medio SB1 (25-30 cotiledones por placa). Las placas se envuelven con cinta de fibra y se conservan durante 8 semanas. Despues de este tiempo, los embriones secundarios se cortan y se colocan en medio líquido SB196 durante 7 días.

Preparaci�n del ADN para el bombardeo

20 Para el bombardeo se emplea un pl�smido intacto o un fragmento de ADN plasm�dico que contiene los genes de delta-5 desaturasa de interés y el gen del marcador seleccionable. Los fragmentos de los pl�smidos de expresión de soja que comprenden la delta-5 desaturasa de la presente invención se obtienen mediante aislamiento en gel de los pl�smidos digeridos. Los fragmentos de ADN resultantes se separan mediante una electroforesis en gel sobre agarosa SeaPlaque GTG al 1% (BioWhitaker Molecular Applications) y los fragmentos de ADN que contienen los

25 módulos de genes se cortan del gel de agarosa. El ADN se purifica de la agarosa utilizando la enzima de digestión GELase siguiendo el protocolo del fabricante.

Se añade una parte alícuota de 50 ∃l de agua destilada estéril que contiene 3 mg de partículas de oro a 5 ∃l de una disolución de ADN 1 ∃g/ml (el pl�smido intacto o el fragmento de ADN preparado como se describió anteriormente), 50 ∃l de CaCl2 2,5 M, y 20 ∃l de espermidina 0,1 M. La mezcla se agita durante 3 min en el nivel 3 de un agitador de

30 v�rtice y se centrifuga durante 10 seg en una microcentr�fuga de escala experimental. Después de un lavado con 400 ∃l de etanol al 100%, el sedimento se suspende mediante sonicaci�n en 40 ∃l de etanol al 100%. La suspensión de ADN (5 ∃l) se dispensa a cada disco volante del instrumento de discos Biolistic PDS1000/HE. Cada parte alícuota de 5 ∃l contiene aproximadamente 0,375 mg de partículas de oro por bombardeo (es decir, por disco).

Preparaci�n del tejido y bombardeo con ADN

35 Aproximadamente 150-200 mg de cultivos en suspensión embri�nicos de 7 días se colocan en una placa Petri vacía y estéril de 60 x 15 mm, y la placa se cubre con una malla de plástico. El tejido se bombardea con 1 o 2 disparos por placa ajustándose la presión de ruptura de membrana a 7584,23 kPa (1100 psi) y la cámara se somete a un vacío de 68,6-71,1 cm (27-28 pulgadas) de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente a 8,9 cm (3,5 pulgadas) de la pantalla de retención/detención.

40 Selección de embriones transformados

Los embriones transformados se seleccionan utilizando higromicina como marcador seleccionable. De modo específico, después del bombardeo, el tejido se coloca en medio SB196 fresco y se cultiva como se describió anteriormente. Seis días después del bombardeo el medio SB196 se intercambia por medio SB196 fresco que contiene higromicina 30 mg/l. El medio de selección se repone cada semana. De cuatro a seis semanas después de

45 la selección, se observa tejido verde transformado creciendo de los agrupamientos embriog�nicos necr�ticos no transformados. El tejido verde aislado se retira y se inocula en placas de múltiples pocillos para generar nuevos cultivos en suspensión embriog�nicos transformados cl�nicamente propagados.

Maduraci�n de los embriones

Los embriones se cultivan durante 4-6 semanas a 26 �C en medio SB196 con bombillas de luz fluorescente blanca

50 fría (Phillips cool white Econowatt F40/CW/RS/EW) y Agro (Phillips F40 Agro) (40 vatios) con un fotoperiodo de 16:8 hr con una intensidad de luz de 90-120 ∃E/m2s. Después de este tiempo, los agrupamientos de embriones se trasladan a un medio de agar sólido, SB166, durante 1-2 semanas. Los agrupamientos después se subcultivan con medio SB103 durante 3 semanas. Durante este periodo, los embriones individuales se retiran de los agrupamientos y se seleccionan para alteraciones en su composición de ácidos grasos, según se describió anteriormente.

55 Recetas de los medios

Medio de proliferaci�n líquido SB 196 -FN Lite (por litro)

MS FeEDTA - 100x disolución madre 1 10 ml

MS sulfato - 100x disolución madre 2 10 ml

FN Lite haluros - 100x disolución madre 3 10 ml

FN Lite P, B, Mo - 100x disolución madre 4 10 ml

Vitamina B5 (1 mUl) 1,0 ml

2,4-D (concentración final 10 mg/l) 1,0 ml

KNO3 2,83 gm

(NH4)2SO4 0,463 gm

Asparagina 1,0 gm

Sacarosa (al 1%) 10 gm

pH 5,8

Disoluciones madre de FN Lite

n.� de disolución madre 1000 ml: 500 ml

MS Fe EDTA 100x disolución madre1

Na2 EDTA* 3,724 g: 1,862 g

FeSO4 - 7H2O 2,784 g: 1,392 g

*Añadir primero, disolver en una botella oscura con agitaci�n.

MS Sulfato 100x disolución madre2

MgSO4 - 7H2O 37,0 g: 18,5 g

MnSO4 - H2O 1,69 g: 0,845 g

ZnSO4 - 7H2O 0,86 g: 0,43 g

CuSO4 - 7H2O 0,0025 g: 0,00125 g

FN Lite haluros 100x disolución madre 3

CaCl2 - 2H2O 30,0 g: 15,0 g

KI 0,083 g: 0,0715 g

CoCl2 - 6H2O 0,0025 g: 0,00125 g

FN Lite P, B, Mo 100x disolución madre4

KH2PO4 18,5 g: 9,25 g

H3BO3 0,62 g: 0,31 g

Na2MoO4 - 2H2O 0,025 g: 0,0125 g

Medio sólido SB1 (por litro)

1 paquete de sales MS (Gibco/BRL, n.� de catálogo 11117-066)

1 ml de vitamina B5 1000x disolución madre

31,5 g de sacarosa

2 ml de 2,4-D (concentración final 20 mg/l)

pH 5,7

8 g de agar TC

Medio sólido SB 166 (por litro)

1 paquete de sales MS (Gibco/BRL, n.� de catálogo 11117-066)

1 ml de vitamina B5 1000x disolución madre

60 g de maltosa

750 mg de MgCl2 hexahidrato

5 g de carbón activado

pH 5,7

2 g de gelrite

Medio sólido SB 103 (por litro)

1 paquete de sales MS (Gibco/BRL, n.� de catálogo 11117-066)

1 ml de vitamina B5 1000x disolución madre

60 g de maltosa

750 mg de MgCl2 hexahidrato

pH 5,7

2 g de gelrite

Medio sólido SB 71-4 (por litro)

1 botella de sales B5 de Gamborg con sacarosa (Gibco/BRL, n.� de catálogo 21153-036)

pH 5,7

2 g de agar TC

Disoluci�n madre de 2,4-D

Se obtiene prefabricada en Phytotech, n.� de catálogo D 295, concentración 1 mg/ml.

Disoluci�n madre de vitamina B5 (por 100 ml)

Se conservan partes alícuotas a -20 �C.

10 g de mioinositol

100 mg de ácido nicot�nico

100 mg de piridoxina HCl

1 g de tiamina

Si la disolución no se disuelve con rapidez, aplicar un nivel bajo de calor mediante la placa de agitaci�n caliente.

Ejemplo 14: Análisis funcional de la delta-5 desaturasa de SEQ ID NO:1 y 2 en embriones de soja somáticos

Los embriones de soja somáticos maduros son un buen modelo de embriones cig�ticos. Cuando est�n en el estado de embrión globular en cultivo líquido, los embriones de soja somáticos contienen cantidades muy pequeñas de triacilglicerol (TAG) o proteínas de almacenamiento típicas de los embriones de sjoa cig�ticos en maduración. En esta etapa del desarrollo, la proporción de triacilglic�ridos totales a los lípidos polares totales (fosfol�pidos y glicol�pidos) es de aproximadamente 1:4, que es típica de los embriones de soja cig�ticos en la etapa del desarrollo a partir de la cual se inicia el cultivo de embrión somático. También en la etapa globular, los ARNm para importantes proteínas de la semilla, la subunidad #’ de la %-conglicinina, el inhibidor de tripsina de Kunitz 3, y la lectina de semillas est�n casi totalmente ausentes. Tras la transferencia a un medio sin hormonas para permitir la diferenciación hacia el estado de embrión somático en maduración, TAG se convierte en la clase de lípidos más abundante. Además, los ARNm para la subunidad #’ de la %-conglicinina, el inhibidor de tripsina de Kunitz 3, y la lectina de semillas se convierten en mensajeros muy abundantes en la población de ARNm total. Sobre esta base, el sistema de embrión de soja somático se comporta de un modo muy similar a los embriones de soja cig�ticos en maduración in vivo, y por tanto constituye un sistema modelo bueno y rápido para analizar los efectos fenot�picos de la modificación de la expresión de genes en la vía biosint�tica de ácidos grasos (véase la ublicaci�n PCT n.� WO

2002/00904, ejemplo 3). De modo más importante, el sistema modelo también predice la composición de ácidos grasos de las semillas procedentes de plantas derivadas de embriones transg�nicos.

Los embriones de soja somáticos transg�nicos que contienen la delta-5 desaturasa de la presente invención se analizan de la siguiente forma. Se preparan los ésteres met�licos de ácidos grasos a partir de un único embrio�n de soja somático madurado, mediante transesterificaci�n. Los embriones individuales se colocan en un vial que contiene 50 ∃l de hidróxido de trimetilsulfonio (TMSH) y 0,5 ml de hexano, y se incuban durante 30 min a temperatura ambiente con agitaci�n. Los ésteres met�licos de ácidos grasos (5 ∃l inyectados de la capa de hexano) se separan y se cuantifican utilizando un cromat�grafo de gases Hewlett-Packard 6890 equipado con una columna capilar de sílice fundido Omegawax 320 (n.� de catálogo 24152, Supelco Inc.). La temperatura de la estufa se program� para mantenerse a 220 �C durante 2,6 min, aumentar hasta 240 �C a 20 �C/min y después mantenerse durante 2,4 min más. El gas vehículo se suministra mediante un generador de hidrógeno Whatman. Los tiempos de retención se comparan con los de patrones de ésteres met�licos disponibles en el mercado (Nu-Chek Prep., Inc.). De modo habitual, se analizan mediante GC 5-10 embriones por evento, utilizando la metodología descrita anteriormente.

Ejemplo 15: Coexpresi�n de otras combinaciones de módulos de promotor/gen/terminador en embriones de soja somáticos

Adem�s de los genes, los promotores, los terminadores y los módulos de genes descritos en la presente, los expertos en la técnica pueden apreciar que otras combinación de módulos de promotor/gen/terminador pueden sintetizarse de un modo similar, pero no limitado, al descrito en la presente. Por ejemplo, las publicaciones PCT n.� WO 2004/071467 y n.� WO 2004/071178 describen el aislamiento de una serie de secuencias de promotores y terminadores de la transcripción para su uso en la expresión específica de embrión en la soja. Además, las publicaciones PCT n.� WO 2004/071467, n.� WO 2005/047479 y n.� WO 2006/012325 describen la síntesis de múltiples combinaciones de módulos de promotor/gen/terminador mediante el acoplamiento de promotores, genes y terminadores de la transcripción individuales en combinaciones exclusivas. En general, se emplea un sito NotI franqueado por el promotor adecuado (por ejemplo, los listados en la tabla 9, pero no exclusivamente) y un terminador de la transcripción (por ejemplo, los listados en la tabla 10, pero no exclusivamente) para clonar el gen deseado. Los sitios NotI pueden añadirse a un gen de interés, tales como los listados en la tabla 11, pero no exclusivamente, utilizando una amplificación por PCR con oligonucle�tidos diseñados para introducir sitios NotI en los extremos 5’ y 3’ del gen. El producto de PCR resultante después se digiere con NotI y se clona en un módulo de promotor/NotI/terminador adecuado.

Adem�s, las publicaciones PCT n.� WO 2004/071467, n.� WO 2005/047479 y n.� WO 2006/012325 describen el posterior acoplamiento de módulos de genes individuales en combinaciones exclusivas, junto con módulos de marcadores seleccionables adecuados, para obtener la expresión fenot�pica deseada. Aunque esto se realiza principalmente utilizando diferentes sitios de enzimas de restricción, los expertos en la técnica pueden apreciar que puede utilizarse una serie de técnicas para lograr la combinación de promotor/gen/terminador de la transcripción deseada. Haciendo esto, puede lograrse cualquier combinación de módulos de promotor/gen/terminador de la transcripción específicos de embrión. Los expertos en la técnica también apreciarán que esos módulos pueden colocarse en fragmentos de ADN individuales o en múltiples fragmentos en los que la coexpresi�n de los genes es el resultado de la cotransformaci�n de múltiples fragmentos de ADN.

Tabla 9 Tabla 10

Promotores específicos de semillas

Promotor: Organismo Referencia del promotor

subunidad #’ de la %-conglicinina: soja Beachy et al., EMBO J., 4:3047-3053 (1985)

inhibidor de tripsina de Kunitz: soja Jofuku et al., Plant Cell, 1:1079-1093 (1989)

anexina: soja publicación PCT n.� WO 2004/071467

glicinina Gy1: soja publicación PCT n.� WO 2004/071467

alb�mina 2S: soja patente de EEUU 6.177.613

legumina A1: guisante Rerie et al., Mol. Gen. Genet, 225:148-157 (1991)

subunidad % de la %-conglicinina: soja publicación PCT n.� WO 2004/071467

BD30 (también denominado P34): soja publicación PCT n.� WO 2004/071467

legumina A2: guisante Rerie et al., Mol. Gen. Genet, 225:148-157 (1991)

Terminadores de la transcripción

Terminador de la transcripción: Organismo Referencia

faseolina 3’: judía publicación PCT n.� WO 2004/071467

inhibidor de tripsina de Kunitz 3’: soja publicación PCT n.� WO 2004/071467

BD30 (también denominado P34) 3’: soja publicación PCT n.� WO 2004/071467

legumina A2 3’: guisante publicación PCT n.� WO 2004/071467

alb�mina 2S 3’: soja publicación PCT n.� WO 2004/071467

Tabla 11

Genes de la vía biosint�tica de PUFA

Gen: Organismo Referencia

delta-6 desaturasa: Saprolegnia diclina publicación PCT n.� WO 2002/081668

delta-6 desaturasa: Mortierella alpina patente de EEUU 5.968.809

elongasa: Mortierelia alpina publicación PCT n.� WO 2000/12720; patente de EEUU 6.403.349

delta-5 desaturasa: Mortierella alpina patente de EEUU 6.075.183

delta-5 desaturasa: Saprolegnia diclina publicación PCT n.� WO 2002/081668

delta-15 desaturasa: Fusarium moniliforme publicación PCT n.� WO 2005/047479

delta-17 desaturasa: Saprolegnia diclina publicación PCT n.� WO 2002/081668

elongasa: Thraustochytrium aureum publicación PCT n.� WO 2002/08401; patente de EEUU 6.677.145

elongasa: Pavlova sp. Pereira et al., Biochem. J., 384:357-366 (2004)

delta-4 desaturasa: Schizochytrium aggregatum publicación PCT n.� WO 2002/090493

delta-9 elongasa: Isochrysis galbana publicación PCT n.� WO 2002/077213

delta-9 elongasa: Euglena gracilis solicitud de patente de EEUU n.� 11/601563

delta-8 desaturasa: Euglena gracilis publicación PCT n.� WO 2000/34439; patente de EEUU 6.825.017; publicación PCT n.� WO 2004/057001; publicación PCT n.� WO 2006/012325

delta-8 desaturasa: Acanthamoeba castellanii Sayanova et al., FEBS Lett., 580:1946-1952 (2006)

delta-8 desaturasa: Pavlova salina publicación PCT n.� WO 2005/103253

delta-8 desaturasa: Pavlova lutheri solicitud de patente de EEUU n.� 11/737.772

Ejemplo 16: Selección con clorsulfurona (ALS) y regeneración de plantas

Selecci�n con clorsulfurona (ALS)

5 Después del bombardeo, el tejido vegetal se divide entre dos matraces con medio SB196 fresco y se cultiva como se describe en el ejemplo 13. De 6 a 7 días después del bombardeo, el SB196 se intercambia por medio SB196 fresco que contiene el agente de selección de clorsulfurona 100 ng/ml. El medio de selección se repone cada semana. De 4 a 6 semanas después de la selección se observa tejido verde transformado creciendo de los agrupamientos embriog�nicos necr�ticos no transformados. El tejido verde aislado se retira y se inocula en placas de múltiples

10 pocillos que contienen medio SB196 para generar nuevos cultivos en suspensión embriog�nicos transformados cl�nicamente propagados.

Regeneraci�n de embriones somáticos de soja en plantas

Para obtener plantas completas a partir de cultivos en suspensión embriog�nicos, el tejido debe regenerarse. Los embriones se maduran como se describe en el ejemplo 13. Después de subcultivar en medio SB103 durante 3 semanas, los embriones individuales se retiran de los agrupamientos y se seleccionan para alteraciones en su composición de ácidos grasos según se describe en el ejemplo 14. Debe advertirse que cualquier fenotipo detectable que resulte de la expresión de los genes de interés puede seleccionarse en esta etapa. Esto incluye, pero no se limita a alteraciones en el perfil de ácidos grasos, perfil y contenido en proteínas, contenido en carbohidratos,

5 velocidad de crecimiento, viabilidad, o la capacidad para desarrollarse normalmente en una planta de soja.

Los embriones individuales madurados se desecan colocándolos en una placa Petri pequeña vacía (35 x 10 mm) durante aproximadamente 4 a 7 días. Las placas se sellan con cinta de fibra (creando una pequeña cámara de humedad). Los embriones desecados se plantan en medio SB71-4, en donde se deja que germinen bajo las mismas condiciones de cultivo que las descritas anteriormente. Las pl�ntulas germinadas se retiran del medio de

10 germinación y se enjuagan a fondo con agua y después se plantan en Redi-Earth en una bandeja compacta de 24 células cubierta por una c�pula de plástico transparente. Después de 2 semanas se retira la c�pula y se deja las plantas se endurezcan durante otra semana. Si las pl�ntulas parecen robustas se transplantan a macetas de 25,4 cm (10 pulgadas) de Redi-Earth con hasta 3 pl�ntulas por maceta. Después de 10 a 16 semanas, las semillas maduras se recolectan, se pican y se analizan para los ácidos grasos, según se describió en el ejemplo 14.

15 Las recetas de los medios pueden encontrarse en el ejemplo 13, y la disolución madre de clorsulfurona es 1 mg/ml en hidróxido de amonio 0,01 N.

Ejemplo 17: Compraci�n de la especificidad de sustrato de la delta-5 desaturasa de Mortierella alpina (MaD5) con la delta-5 desaturasa de Euglena gracilis (EgD5) en Yarrowia lipolytica

El presente ejemplo describe la comparación de la especificidad de sustrato de una delta-5 desaturasa de Mortierella

20 alpina (MaD5; SEQ ID NO:67 y 68) que se describe en la patente de EEUU 6.075.183 y las publicaciones PCT n.� WO 2004/071467 y WO 2005/047479) con la de EgD5 (SEQ ID NO:2) en Yarrowia lipolytica.

Este trabajo incluye las siguientes etapas: (1) construcción del vector de expresión pY98 de Yarrowia que comprende MaD5; (2) transformación de pY98 y pDMW367 en la cepa Y2224 de Yarrowia; y (3) comparación de los perfiles de lípidos dentro de los organismos transformantes que comprenden pY98 o pDMW367 después de

25 suministrar sustratos de ácidos grasos.

Construcci�n del vector de expresión pY98 de Yarrowia que comprende MaD5

El pl�smido pY5-22 (SEQ ID NO:69) es un pl�smido lanzadera que puede replicarse en E. coli y Yarrowia lipolytica, que contiene lo siguiente: una secuencia de replicaci�n autónoma de Yarrowia (ARS18; n.� de registro de GenBank M91600); un origen de la replicaci�n plasm�dico CoIE1; un gen de resistencia a la ampicilina (AmpR) para la

30 selección en E. coli; un gen URA3 de Yarrowia (n.� de registro de GenBank AJ306421) para la selección en Yarrowia; y un módulo TEF::NcoI/NotI::XPR quimérico, en el que "XPR" est� a aproximadamente 100 pb de la región 3’ del gen Xpr de Yarrowia (n.� de registro de GenBank M17741). Aunque la construcción del pl�smido pY5-22 no se describe en la presente en detalle, este se deriva de pY5 (previamente descrito en la publicación PCT n.� WO 2004/101757).

35 El pl�smido pY5-22GPD (SEQ ID NO:70) se cre� a partir de pY5-22 (SEQ ID NO:69) reemplazando el promotor de TEF por el promotor de GPD de Yarrowia lipolytica (SEQ ID NO:71) utilizando técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica. El “promotor de GPD” de Yarrowia se refiere a la región no traducida 5’ cadena arriba delante del cod�n de inicio de la traducción “ATG” de una proteína codificada por el gen de la gliceraldeh�do-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) de Yarrowia lipolytica y que es necesaria para la expresión (publicación PCT n.� WO

40 2005/003310). De modo más específico, el promotor de GPD de Yarrowia lipolytica se amplificó a partir del pl�smido pYZDE2-S (SEQ ID NO:72; que ha sido descrito previamente en la solicitud de patente de EEUU n.� 11/737.772, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia) utilizando los oligonucle�tidos GPDsense (SEQ ID NO:73) y GPDantisense (SEQ ID NO:74). El fragmento de ADN resultante se digirió con SalI/NotI y se clon� en el fragmento SalI/NotI de pY5-22 (SEQ ID NO:69), reemplazando as� al promotor de TEF y el sitio NcoI/NotI por el

45 promotor de GPD y un sitio NotI exclusivo, produciendo con ello pY5-22GPD (SEQ ID NO:70).

El gen de delta-5 desaturasa de The Mortierella alpina (SEQ ID NO:67) se liber� de pKR136 (SEQ ID NO:75; que ha sido descrito previamente en la publicación PCT n.� WO 2004/071467 (cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia)) mediante una digestión con NotI y se cl�no en el sitio NotI de pY5-22GPD para producir pY98 (SEQ ID NO:76; figura 9).

50 Transformación de pY98 (que comprende MaD5) y pDMW367 (que comprende EgD5) en la cepa Y2224 de Yarrowia y comparación de los perfiles lip�dicos

La cepa Y2224 se aisl� de la siguiente manera: Células de Yarrowia lipolytica ATCC n.� 20362 de una placa de agar YPD (extracto de levadura al 1%, bactopeptona al 2%, glucosa al 2%, agar al 2%) se cultiv� en estr�as en una placa de MM (75 mg/l de cada uno de uracilo y uridina, YNB 6,7 g/l con sulfato de amonio, sin amino�cidos, y glucosa 20

55 g/l) que contenía 5-FOA 250 mg/l (Zymo Research). Las placas se incubaron a 28 �C y cuatro de las colonias resultantes se cultivaron por separado en placas de MM que contenían 5-FOA 200 mg/ml y placas de MM que carecían de uracilo y uridina para confirmar la auxotrof�a de uracilo de Ura3.

La cepa Y2224 se transform� con pY98 (SEQ ID NO:76, figura 9) y pDMV367 (SEQ ID NO:23, figura 5C, ejemplo 6) según se describe en los métodos generales.

Colonias individuales del transformante de Yarrowia lipolytica que contiene pY98 (SEQ ID NO:76) o pDMV367 (SEQ ID NO:23) se cultivaron en 3 ml de MM sin uracilo suplementado con tergitol al 0,2% a 30 �C durante 1 día. Después de esto se trasladaron 0,1 ml a 3 ml del mismo medio suplmentado con EDA, ETrA, DGLA, ETA o sin ácidos grasos. Se incubaron durante 16 h a 30 �C, 250 rpm y después se obtuvieron los sedimentos mediante centrifugaci�n. Las células se lavaron una vez con agua, se sedimentaron mediante centrifugaci�n y se secaron al aire. Los sedimentos se transesterificaron (Roughan, G. y Nishida, I., Arch. Biochem. Biophys., 276(1):38-46 (1990)) con 500 ∃l de met�xido de sodio al 1% durante 30 min a 50 �C, tras lo cual se añadieron 500 ∃l de NaCl 1 M y 100 ∃l de heptano. Después de un mezclado a fondo y una centrifugaci�n, los ésteres met�licos de ácidos grasos (FAME) se analizaron mediante GC.

Los FAME (5 ∃l inyectados de la capa de hexano) se separaron y se cuantificaron utilizando un cromat�grafo de gases Hewlett-Packard 6890 equipado con una columna capilar de sílice fundida Omegawax 320 (n.� de catálogo 24152, Supelco Inc.). La temperatura de la estufa se program� para que se mantuviese a 220 �C durante 2,6 min, aumentase hasta 240 �C a 20 �C/min y después se mantuviese durante 2,4 min más. El gas vehículo fue suministrado por un generador de hidrógeno Whatman. Los tiempos de retención se compararon con los de los ésteres met�licos de patrones disponibles en el mercado (Nu-Chek Prep, Inc.).

Los perfiles de ácidos grasos de Yarrowia lipolytica que expresa pY98 (SEQ ID NO:76) o pDMV367 (SEQ ID NO:23) y alimentados con diversos sustratos se muestran en la figura 10A. En la figura 10A, las zonas en gris indican los sustratos empleados y los productos producidos; los ácidos grasos se identifica como 16:0 (palmitato), 16:1, 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), LA, GLA, ALA, STA, EDA, SCI (ácido esciad�nico o ácido cis-5,11,14eicosatrienoico; 20:3 omega-6), DGLA, ARA, ETrA, JUP (ácido juniper�nico o ácido cis-5,11,14,17-eicosatrienoico;

20:4 omega-3), ETA y EPA. Las composiciones de ácidos grasos se expresan como el porcentaje en peso (% en p.) de los ácidos grasos totales.

El porcentaje de delta-5 desaturaci�n ("% delta-5 desat.") de EgD5 y MaD5 para cada sustratro se muestra en la figura 10B y se calcula dividiendo en porcentaje en peso para el producto (SCI, JUP, ARA o EPA) entra la suma del porcentaje en peso para el sustrato y el producto (EDA y SCI, ETA y JUP, DGLA y ARA, o ETA y EPA, respectivamente) y multiplicando por 100 para expresar un porcentaje, dependiendo del sustrato empleado.

Las actividades de EgD5 y MaD5 se comparan utilizando la proporción del porcentaje de delta-5 desaturaci�n (“Propor. Desat Eg/Ma”) en la figura 10B y se calculan dividiendo el porcentaje de delta-5 desaturaci�n para EgD5 sobre un sustrato concreto entre el porcentaje de delta-5 desaturaci�n para MaD5 sobre el mismo sustrato.

La especificidad de sustrato de EgD5 y MaD5 para el sustrato de ácido graso omega-6 correcto (es decir, DGLA) frente al ácido graso subproducto (es decir, SCI) o el sustrato de ácido graso omega-3 correcto (es decir, ETA) frente al ácido graso subproducto (es decir, JUP) también se muestra en la figura 10B. De modo específico, la especificidad de sustrato (“Prop. Prod./Subprod.”) para los sustratos de omega-6 se calcula dividiendo el porcentaje de delta-5 desaturaci�n (“% delta-5 desat.”) para DGLA entre el porcentaje de delta-5 desaturaci�n (“% delta-5 desat.”) para EDA, y se muestra en las mismas líneas que los resultados para DGLA. La especificidad de sustrato (“Prop. Prod./Subprod.”) para los sustratos de omega-3 se calcula dividiendo el porcentaje de delta-5 desaturaci�n (“% delta-5 desat.”) para ETA entre el porcentaje de delta-5 desaturaci�n (“% delta-5 desat.”) para ETrA, y se muestra en las mismas líneas que los resultados para ETA. Además, se determin� la proporción de especificidad de sustrato (“Prop. Prod./Subprod. Eg/Ma”) para los sustratos de omega-6 dividiendo la especificidad de sustrato de EgD5 sobre los sustratos de omega-6 (es decir, DGLA/EDA) entre la de MaD5. Se calcul� la proporción de especificidad de sustrato (“Prop. Prod./Subprod. Eg/Ma”) para los sustratos de omega-3 dividiendo la especificidad de sustrato de EgD5 sobre los sustratos de omega-3 (es decir, ETA/ETrA) entre la de MaD5.

La preferencia de EgD5 y MaD5 por sustratos de omega-6 u omega-3 se compara utilizando la proporción del porcentaje de delta-5 desaturaci�n (“Prop. n-6/n-3”) en la figura 10B, y se calcula dividiendo el porcentaje de delta-5 desaturaci�n de EgD5 y MaD5 sobre un sustrato de omega-6 concreto (DGLA o EDA) entre el porcentaje de delta-5 desaturaci�n sobre el correspondiente sustrato de omega-3 (ETA o ETrA, respectivamente).

A partir de los resultados de la figura 10B, es evidente que EgD5 es aproximadamente 2,6 a 2,9 veces más activa en Yarrowia que MaD5 cuando se emplean DGLA, EDA y ETA como sustratos. La excepción es la actividad para ETrA, que es aproximadamente la misma para ambas enzimas. La especifidad de sustrato de EgD5 y MaD5 por el sustrato de omega-6 correcto (es decir, DGLA frente a EDA) es aproximadamente la misma en Yarrowia pero existe una preferencia de aproximadamente 2,5 mayor de EgD5 por ETA (con relación a ETrA) frente a MaD5. La alta actividad y la especificidad de sustrato preferida por ETA frente a ETrA de EgD5 puede ser útil para la producción de PUFA de cadena larga. La EgD5 también muestra preferencia por sustratos de omega-6 (es decir, EDA y DGLA) frente a los sustratos de omega-3 (es decir, ETrA y ETA), respectivamente.

Ejemplo 18: Construcción del vector de expresión de soja eKR916 para la coexpresi�n de la delta-5 desaturasa de Mortierella alpina (MaD5) con una delta-9 elongasa derivada de Euglena gracilis (EgD9e) y una delta-8 desaturasa derivada de Euglena gracilis (EgD8)

El presente ejemplo describe la construcción de un vector de soja para la coexpresi�n de MaD5 (SEQ ID NO:67, ejemplo 17) con EgD9e (SEQ ID NO:77; que se describe en la solicitud de EEUU n.� 11/601.563 (presentada el 16 de noviembre, 2006; n.� de expediente del abogado BB-1562) y EgD8 (SEQ ID NO:78; descrita como Eg5 en la

5 publicación PCT n.� WO 2006/012325).

Delta-9 elongasa de Euglena gracilis (EgD9e)

Un clon del banco de ADNc de Euglena (eeg1c), denominado eeg1c.pk001.n5f, que contiene la delta-9 elongasa de Euglena gracilis (EgD9e; SEQ ID NO:77) se emple� como molde para amplificar EgD9e con los cebadores oligonucleot�dicos oEugEL1-1 (SEQ ID NO:79) y oEugEL1-2 (SEQ ID NO:80) utilizando la ADN polimerasa VentR�

10 (n.� de catálogo M0254S, New England Biolabs Inc., Beverly, MA) siguiendo el protocolo del fabricante. El fragmento de ADN resultante se clon� en el vector de clonaci�n pCR-Blunt� utilizando el kit de clonaci�n de PCR Zero Blunt� (Invitrogen Corporation), siguiendo el protocolo del fabricante, para producir pKR906 (SEQ ID NO:81).

Un pl�smido de partida pKR72 (n.� de registro ATCC PTA-6019; SEQ ID NO:82, secuencia de 7085 pb), un derivado de pKS123 que ha sido previamente descrito en la publicación PCT n.� WO 02/008269 (cuyos contenidos se 15 incorporan en la presente como referencia), contiene el gen de higromicina B fosfotransferasa (HPT) (Gritz, L. y Davies, J., Gene, 25:179-188 (1983)), flanqueado por el promotor de T7 y un terminador de la transcripción (concretamente, un módulo T7prom/HPT/T7term), y un origen de la replicaci�n bacteriano (ori) para la selección y replicaci�n en bacterias (por ejemplo, E. coli). Además, pKR72 también contiene HPT, flanqueado por el promotor de 35S (Odell et al., Nature, 313:810-812 (1985)) y el terminador de la transcripción NOS 3’ (Depicker et al., J. Mol.

20 Appl. Genet., 1:561-570 (1982)) (concretamente, un módulo 35S/HPT/NOS3’ cassette) para la selección en plantas, tales como la soja. pKR72 también contiene un sitio de restricción NotI, flanqueado por el promotor para la subunidad #’ de %-conglicinina (Beachy et al., EMBO J., 4:3047-3053 (1985)) y la región de fin de la transcripción 3’ del gen de faseolina (Doyle et al., J. Biol. Chem., 261:9228-9238 (1986)), lo cual permite una potente expresión específica de tejido en las semillas de soja de los genes clonados en el sitio NotI.

25 El fragmento Asci del pl�smido pKS102 (SEQ ID NO:83), previamente descrito en la publicación PCT n.� WO 02/00905 (cuyos contenidos se incorporan en la presente como referencia), que contiene un módulo T7prom/hpt/T7term y un origen bacteriano ori, se combin� con el fragmento AscI del pl�smido pKR72 (SEQ ID NO:82), que contiene un módulo %con/NotI/Phas para producir pKR197 (SEQ ID NO:84), previamente descrito en la publicación PCT n.� WO 04/071467 (cuyos contenidos se incorporan en la presente como referencia).

30 El gen de la delta-9 elongasa de Euglena gracilis se liber� de pKR906 (SEQ ID NO:81) mediante una digestión con NotI y se clon� en el sitio NotI de pKR197 (SEQ ID NO:84) para producir el vector de clonaci�n intermedio vector pKR911 (SEQ ID NO:85).

Delta-8 desaturasa de Euglena gracilis (EgD8)

El pl�smido pKR680 (SEQ ID NO:86), que ha sido previamente descrito en la publicación PCT n.� WO 2006/012325

35 (cuyos contenidos se incorporan en la presente como referencia), contiene la delta-8 desaturasa de Euglena gracilis (EgD8; SEQ ID NO:78; descrita como Eg5 en el documento WO 2006/012325) flanqueada por un promotor del inhibidor de tripsina de soja de Kunitz (KTi) (Jofuku et al., Plant Cell, 1:1079-1093 (1989)) y la región de terminación 3’ KTi, cuyo aislamiento se describe en la patente de EEUU 6.372.965, seguido del terminador de la transcripción de albúmina de soja, que ha sido previamente descrito en la publicación PCT n.� WO 2004/071467 (concretamente, un

40 módulo Kti/NotI/Kti3’Salb3’).

El pl�smido pKR680 (SEQ ID NO:86) se digirió con BsiWI, y el fragmento que contenía EgD8 se clon� en el sitio BsiWI de pKR911 (SEQ ID NO:85) para producir pKR913 (SEQ ID NO:87).

Delta-5 desaturasa de Mortierella alpina (MaD5)

El pl�smido pKR767 (SEQ ID NO:88), que ha sido previamente descrito en la publicación PCT n.� WO 2006/012325

45 (cuyos contenidos se incorporan en la presente como referencia), contiene la delta-5 desaturasa de Mortierella alpina (MaD5; SEQ ID NO:67) flanqueada por el promotor para el gen Gy1 de glicinina de soja y la región de fin de la transcripción 3’ de legumina A2 de soja (concretamente, un módulo Gy1/MaD5/legA2, cuya construcción se describe en el documento WO 2006/012325).

El módulo Gy1/Mad5/legA2 se liber� de pKR767 (SEQ ID NO:88) mediante una digestión con SbfI y el fragmento

50 resultante se clon� en el sitio SbfI de pKR913 (SEQ ID NO:87) para producir pKR916 (SEQ ID NO:89). En la figura 11A se muestra un dibujo esquemático de pKR916. De esta forma, la delta-9 elongasa de Euglena gracilis (indicada como "eug el1" en la figura 11A) se coexpres� con la delta-8 desaturasa de Euglena gracilis (indicada como "eug d8sq5" en la figura 11A) y la delta-5 desaturasa de Mortierella alpina (indicada como "DELTA 5 DESATURASA M ALPINA" en la figura 11A) detrás de promotores fuertes específicos de semilla.

55 Ejemplo 19: Construcción del vector de expresión de soja pKR1037 para la coexpresi�n de la delta-5 desaturasa de Euglena gracilis (EgD5) con una delta-9 elongasa derivada de Euglena gracilis (EgD9e) y una delta-8 desaturasa derivada de Euglena gracilis (EgD8)

El presente ejemplo describe la construcción de un vector de soja para la coexpresi�n de EgD5 (SEQ ID NO:1, ejemplo 5) con EgD9e (SEQ ID NO:77, ejemplo 18) y EgD8 (SEQ ID NO:78, ejemplo 18).

5 El pl�smido de partida pKR974 (SEQ ID NO:90) es idéntico a pKR767 (SEQ ID NO:88, ejemplo 18) excepto que el fragmento NotI que contiene MaD5 ha sido reemplazado por un fragmento NotI que contiene la delta-5 desaturasa de Saprolegnia diclina (SdD5; SEQ ID NO:94, que se describe en la publicación PCT n.� WO 2004/071467). Además, un sitio MfeI en el terminador legA2 de pKR767 (SEQ ID NO:88) se retira mediante digestión con Mfel, rellenando el sitio Mfel y reacoplando (es decir, CAATTG se convierte en CAATTAATTG), y por tanto, el terminador

10 legA2 de pKR974 (SEQ ID NO:90) tiene 770 pb frente a 766 pb para pKR767 (SEQ ID NO:88).

Para clonar EgD5 en un vector de expresión de soja es necesario introducir un sitio de restricción NotI en el extremo 5’ del gen. Los expertos en la técnica sabrán que hay muchas maneras de introducir sitios de restricción en genes, tales como, pero sin limitarse a PCR o mediante subclonaci�n en vectores que contienen los sitios apropiados. En este caso, para introducir un sitio NotI en el extremo 5’ de EgD5 (SEQ ID NO:1), pDMW367 (SEQ ID NO:23) se

15 digirió con MfeI y después se digirió parcialmente con NcoI. El fragmento NcoI/MfeI que contiene una EgD5 de longitud completa (SEQ ID NO:1) se clon� en el sitio NcoI/MfeI de un vector de clonaci�n intermedio que tiene un sitio NotI directamente cadena arriba del sitio NcoI (concretamente, GCGGCCGCAAACCATGG). El pl�smido resultante después se digiere con NotI, y el fragmento que contiene EgD5 (SEQ ID NO:1) se clon� en el sitio NotI de pKR974 (SEQ ID NO:90) para producir pKR1032 (SEQ ID NO:91).

20 El módulo Gy1/EgD5/legA2 se liber� de pKR1032 (SEQ ID NO:91) mediante una digestión con SbfI, y el fragmento resultante se clon� en el sitio SbfI de pKR913 (SEQ ID NO:87) para producir pKR1037 (SEQ ID NO:92). En la figura 11B se muestra un dibujo esquemático de pKR1037 (SEQ ID NO:92). De esta forma, la delta-9 elongasa de Euglena gracilis (indicada como "eug el1" en la figura 11B) puede coexpresarse con la delta-8 desaturasa de Euglena gracilis (indicada como "eug d8-sq5" en la figura 11 B) y la delta-5 desaturasa de Euglena gracilis (indicada como "eug d5

25 DS" en la figura 11 B) detrás de promotores fuertes específicos de semilla.

Ejemplo 20: Coexpresi�n de la delta-9 elongasa de Euglena gracilis, la delta-8 desaturasa de Euglena gracilis, y la delta-17 desaturasa de Saprolegnia diclina con la delta-5 desaturasa I de Mortierella alpina (pKR916 y nKR328) o la delta-5 desaturasa de Euglena gracilis (pKR1037 y pKR328) en embriones somáticos de soja

El presente ejemplo describe la transformación y la expresión en embriones somáticos de soja de pKR916 (SEQ ID

30 NO:89, ejemplo 18, que contiene EgD9e, EgD8 y MaD5) con pKR328 (SEQ ID NO:93, figura 11C, previamente descrito en la publicación PCT n.� WO 04/071467), que contiene la delta-17 desasturasa de Saprolegnia diclina (SdD17) y el gen de higromicina fosfotransferasa para la selección sobre higromicina. El presente ejemplo también describe la la transformación y la expresión en embriones somáticos de soja de pKR1037 (SEQ ID NO:92, ejemplo 19, que contiene EgD9e, EgD8 y EgD5) con pKR328 (SEQ ID NO:93, figura 11 C).

35 Un cultivo en suspensión embriog�nico de soja (cv. Jack) se transform� con el fragmento AscI que contiene el módulo de expresión de pKR916 (SEQ ID NO:89) y el pl�smido intacto pKR328 (SEQ ID NO:93), o con el fragmento AscI que contiene el módulo de expresión de pK1037 (SEQ ID NO:92) y el pl�smido intacto pKR328 (SEQ ID NO:93), según se describe en el ejemplo 13.

Los embriones se maduraron en medio líquido de histodiferenciaci�n y maduración de soja (medio líquido SHaM;

40 Schmidt et al., Cell Biology and Morphogenesis, 24:393 (2005)) utilizando un procedimiento modificado. Brevemente, después de 4 semanas de selección en SB196, según se describe en el ejemplo 13, se trasladaron los agrupamientos de embriones a 35 ml de SB228 (medio líquido SHaM) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. El tejido se mantuvo en medio líquido SHaM en un agitador rotatorio a 130 rpm y 26 �C con luces fluorescentes blancas frías con un fotoperiodo de 16:8 hr luz/oscuridad a una intensidad lumínica de 60-85 ∃E/m2/s durante 2 semanas a

45 medida que los embriones maduraban. Los embriones que crecieron durante 2 semanas en medio líquido SHaM tienen el mismo tamaño y contenido en ácidos grasos que los embriones cultivados en SB166/SB103 durante 5-8 semanas, según se describe en el ejemplo 13.

Recetas de los medios

SB 228 - Histodiferenciaci�n y maduración de soja (SHaM) (por litro)

H2O DDI 600 ml

FN-Lite Macro Salts para SHaM 10x 100 ml

MS Micro Salts 1000x 1 ml

MS FeEDTA 100 x 10 ml

CaCl 100x 6,82 ml

SB 228 - Histodiferenciaci�n y maduración de soja (SHaM) (por litro)

Vitamina B5 1000x: 1 ml

L-metionina: 0,149 g

Sacarosa: 30 g

Sorbitol: 30 g

Ajustar el volumen a 900 ml

pH 5,8

Autoclave

A�adir al medio enfriado (&30 �C)

*Glutamina (concentración final 30 mM) al 4%: 110 ml

*Nota: el volumen final ser� de 1010 ml después de la adición de glutamina.

Puesto que la glutamina se degrada con relativa rapidez, puede resultar preferido añadirla inmediatamente antes de utilizar el medio. Si se añade glutamina, la caducidad es de 2 semanas; el medio base puede conservarse durante más tiempo sin glutamina.

FN-Lite Macro para SHAM 10x - Disolución madre n.� 1 (por litro)

(NH4)2SO4 (sulfato de amonio) 4,63 g KNO3 (nitrato de potasio) 28,3 g

MgSO4�7H2O (sulfato de magensio heptahidrato) 3,7 g KH2PO4 (fosfato de potasio monob�sico) 1,85 g Completar hasta el volumen Autoclave

MS Micro 1000x - Disolución madre n.� 2 (por 1 litro)

H3BO3 (ácido bórico) 6,2 g MnSO4�H2O (sulfato de manganeso monohidrato) 16,9 g ZnSO4�7H2O (sulfato de cinc heptahidrato) 8,6 g

Na2MoO4�2H2O (molibdato de sodio dihidrato) 0,25 g CuSO4�5H2O (sulfato de cobre pentahidrato) 0,025 g CoCl2�6H2O (cloruro de cobalto hexahidrato) 0,025 g KI (yoduro de potasio) 0,8300 g Completar hasta el volumen Autoclave

FeEDTA 100x - Disolución madre n.� 3 (por litro)

Na2EDTA* (EDTA sodio) 3,73 g

FeSO4�7H2O (sulfato de hierro heptahidrato) 2,78 g *El EDTA debe disolverse completamente antes de añadir hierro. Completar hasta el volumen La disolución es fotosensible. La botella o botellas deben envolverse en

una lámina de aluminio para omitir la luz. Autoclave

Ca 100x - Disolución madre n.� 4 (por litro)

CaCl2�2H2O (cloruro de calcio dihidrato) 44 g

Completar hasta el volumen

Autoclave

Vitamina B5 100x - Disolución madre n.� 5 (por litro)

Tiamina�HCl 10 g

�cido nicot�nico 1 g

Piridoxina�HCl 1 g

Mioinositol 100 g

Completar hasta el volumen

Conservar congelada

Glutamina al 4% - Disolución madre n.� 6 (por litro)

Agua DDI calentada hasta 30 �C 900 ml

L-glutamina 40 g

A�adir gradualmente con agitaci�n y aplicando calor bajo

No superar 35 �C

Completar hasta el volumen

Esterilizar mediante filtración

Conservar congelada*

*Nota: Calentar la disolución madre descongelada en un baño a 31 �C para disolver completamente los cristales.

Despu�s de la maduración en medio líquido SHaM, los embriones individuales se retiraron de los agrupamientos, se 5 secaron y se seleccionaron para alteraciones en su composición de ácidos grasos, tal como se describió anteriormente.

Un subconjunto de los embriones de soja (concretamente, seis embriones por acontecimiento) transformados con pKR916 (SEQ ID NO:89) y pKR328 (SEQ ID NO:93), o pKR1037 (SEQ ID NO:92) y pKR328 (SEQ ID NO:93), se recolectaron e introdujeron en viales de GC de vidrio y se prepararon los ésteres met�licos de ácidos grasos 10 mediante transesterificaci�n. Para la transesterificaci�n se añadieron 50 ∃l de hidróxido de trimetilsulfonio (TMSH) y 0,5 ml de hexano a los embriones en los viales de vidrio y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con agitaci�n. Los ésteres met�licos de ácidos grasos (5 ∃l inyectados de la capa de hexano) se separaron y se cuantificaron utilizando un cromat�grafo de gases Hewlett-Packard 6890 con una columna capilar de sílice fundida Omegawax 320 (n.� de catálogo 24152, Supelco Inc.). La temperatura de la estufa se program� para mantenerse a

15 220 �C durante 2,6 min, aumentar hasta 240 �C a 20 �C/min y después mantenerse durante 2,4 min más. El gas vehículo se suministra mediante un generador de hidrógeno Whatman. Los tiempos de retención se comparan con los de patrones de ésteres met�licos disponibles en el mercado (Nu-Chek Prep., Inc.).

De esta forma, se analizaron 60 acontecimientos transformados con pKR916 (SEQ ID NO:89) y pKR328 (SEQ ID NO:93) y 45 acontecimientos transformados con pKR1037 (SEQ ID NO:92) y pKR328 (SEQ ID NO:93). La media de

20 los perfiles de ácidos grasos para los diez acontecimientos que tienen la mayor actividad delta-5 desaturasa para cada transformación (pKR916 y pKR328, pKR1037 y pKR328) se muestran en la figura 12A y la figura 12B, respectivamente.

En las figuras 12A y 12B, los ácidos grasos se identifican como 16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUP, ETA y EPA. Los ácidos grasos listados como “otros” incluyen:

25 18:2 (5,9), GLA, STA, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) o 20:2 (8,11) y DPA. Cada uno de estos “otros” ácidos grasos est� presente con una abundancia relativa menor que 3,0% de los ácidos grasos totales. Las composiciones de ácidos grasos para un embrión individual se expresan como el porcentaje en peso (% en p) de los ácidos grasos totales, y la media de la composición de ácidos grasos es una media de seis embriones individuales por cada acontecimiento.

La actividad de la delta-5 desaturasa para los sustratos “correctos” (es decir, DGLA y ETA) se expresa como el

30 porcenta de delta-5 desaturaci�n (“Correcto % delta-5 desat.”), calculado según la siguiente fórmula: ([producto]/[sustrato + producto])*100. De modo más específico, el porcentaje de delta-5 desaturaci�n para los sustratos “correctos” se determin� como: ([ARA + EPA]/[DGLA + ETA + ARA + EPA])*100.

La actividad de la delta-5 desaturase para los sustratos “incorrectos” (es decir, EDA y ERA) también se expresa como el porcentaje de delta-5 desaturaci�n (“Incorrecto % delta-5 desat.”), calculado como: ([SCI + JUP]/[EDA + ERA + SCI + JUP])*100.

5 Las especificidades de sustrato de MaD5 y EgD5 por los sustratos “correctos” (es decir, DGLA y ETA) frente a los sustratos “incorrectos” (es decir, EDA y ERA) se compararon, y la comparación se muestra en la figura 13. En la figura 13, la actividad de la delta-5 desaturasa por los sustratos “correctos” (“Correcto % delta-5 desat.”) se representa en el eje de abscisas, y la actividad de la delta-5 desaturase para los sustratos “incorrectos” (“Incorrecto % delta-5 desat.”) se representa en el eje de ordenadas para MaD5 (datos de la figura 12A) y EgD5 (datos de la

10 figura 12B).

La figura 12B demuestra que la actividad de EgD5 en embriones de soja es muy alta, con una media de conversión (Correcto % delta-5 desat.) del 77% al 99% en los diez acontecimientos con mayor puntuación. La especificidad de sustrato de EgD5 (figura 13) tiene preferencia por los sustratos “correctos” frente a los sustratos “incorrectos”, cuando se compara con MaD5. Debido a la alta actividad y especificidad de sustrato, EgD5 puede ser útil para

15 producir PUFA tales como, pero sin limitarse a EPA y DHA, en una célula hospedante.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> E. I. du Pont de Nemours & Company

<120> Delta-5 desaturasa y su uso para fabricar ácidos grasos poliinsaturados

<130> BB1629 5 <150> documento US 60/801.172

<151>

<160> 94

<170> PatentIn versión 3.4

<210> 1 10 <211> 1350

<212> ADN

<213> Euglena gracilis

<220>

<221> característica_misc 15 <222> (1)..(1350)

<223> delta-5 desaturasa

<400> 1

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> Euglena gracilis

<400> 2

<210> 3

<211> 1350

<212> ADN

<213> Euglena gracilis

<220>

<221> característica_misc

<223> delta-5 desaturasa sintética (con codones optimizados) para Yarrowia lipolytica

<400> 3

<210> 4

<211> 590

<212> ADN

<213> Euglena gracilis

<400> 4

<210> 5

<211>: 196 10 <212> PRT

<213> Euglena gracilis

<400> 5

<210> 6

<211> 797

<212> ADN

<213> Euglena gracilis

<400> 6

<210> 7

<211> 559

<212> ADN

<213> Euglena gracilis

<400> 7

<210> 8

<211>: 273 10 <212> ADN

<213> Euglena gracilis

<400> 8

15: <210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Euglena gracilis

<400> 9

ggaatggctc tcagtcttac: 20

20: <210> 10

<211> 728

<212> ADN

<213> Euglena gracilis

<400> 10

<210> 11

<211> 464

<212> ADN

<213> Euglena gracilis

10 <400> 11

<210> 12

<211> 456

<212>: PRT 15 <213> Pythium irregulare (n.� de registro de GenBank AAL13311)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<223> delta-5 desaturasa

<400> 12

<210> 13

<211> 477

<212> PRT

<213> Phytophthora megasperma (n.� de registro de GenBank CADS3323)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<223> delta-5 desaturasa

<400> 13

<210> 14

<211> 469

<212> PRT

<213> Phaeodactylum tricornutum (n.� de registro de GenBank AAL92562)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<223> delta-5 desaturasa

<400> 14

<210> 15

<211> 467

<212> PRT

<213> Dictyostelium discoideum (n.� de registro de GenBank XP_640331)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<223> delta-5 desaturasa

<400> 15

<210> 16

<211> 421

<212>: PRT 5 <213> Euglena gracilis

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<223> delta-8 desaturasa

<300> 10 <302> DELTA-8 DESATURASA Y SU USO PARA FABRICAR ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS

<310> documento WO2006012325

<311>

<312>

<313> (1) .. (421)

15 <300>

<302> DELTA-8 DESATURASA Y SU USO PARA FABRICAR ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS

<310> documento WO2006012326

<311>

<312> 20 <313> (1) .. (421)

<400> 16

<210> 17

<211> 1269

<212> ADN

<213> Pavlova lutheri

<220>

<221> característica_misc

<223> delta-8 desaturasa

<400> 17

<210> 18

<211> 423

<212> PRT

<213> Pavlova lutheri

<400> 18

<210> 19

<211> 7

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región conservada n.� 1 dentro de delta-5 y delta-8 desaturasas

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 10 <222> (4) .. (4)

<223> X = Ile o Val

<400> 19

<210> 20 15 <211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región conservada n.� 2 dentro de delta-5 y delta-8 desaturasas

20 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (2) .. (2)

<223> X = Y o F

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (4) .. (4)

<223> X = Val o Ile

<400> 20

<210> 21

<211> 476

<212> PRT 10 <213> Thalassiosira pseudonana (n.� de registro de GenBank AAX14502)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<223> delta-8 desaturasa

<400> 21

<210> 22

<211> 8165

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pZUF17

<400> 22

<210> 23

<211> 8438

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pDMW367

<400> 23

<210> 24

<211> 12649

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pKUNF12T6E

<220>

<221> característica_misc

<222> (2507)..(2507)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> característica_misc

<222> (2512) .. (2515)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 24

<210> 25

<211> 819

<212> ADN

<213> Thraustochytrium aureum

<220>

<221> característica_misc

<223> elongasa sintética (con codones optimizados) para Yarrowia lipolytica

<400> 25

<210> 26

<211> 272

<212> PRT

<213> Thraustochytrium aureum

15 <400> 26

5: <210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador 5-1A

<400> 27

gghcaycayr tbtayacaaa: 20

10: <210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> Cebador 5-1B

<400> 28

gghcaycayr tbtayaccaa: 20

20: <210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador 5-1C

<400> 29

25: gghcaycayr tbtayacgaa 20

<210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

30: <220> <223> Cebador 5-1D

<400> 30

gghcaycayr tbtayactaa: 20

35: <210> 31 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador 5-5AR

40: <400> 31

tgrtgvacaa yytgrwartt: 20

<210> 32 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador 5-5BR

<400> 32

5: tgrtgvacta yytgrwartt 20

<210> 33 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> Cebador 5-5CR

<400> 33

tgrtgvacca yytgrwartt: 20

15: <210> 34 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador 5-5DR

20: <400> 34

tgrtgvacga yytgrwartt: 20

25: <210> 35 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador ODMW480

<400> 35

ccgataccag tcaatttggt cagcctc: 27

30: <210> 36 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

35: <220> <223> Cebador CDSIII 5’

<400> 36

aagcagtggt atcaacgcag agt: 23

40: <210> 37 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador ODMW479

<400> 37

45: cttaaccttg cagttcttgt cggggatc 28

<210> 38

<211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5: <220> <223> Cebador DNR CDS 5’

<400> 38

caacgcagag tggccattac gg: 22

10: <210> 39 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador YL791

15: <400> 39 cacctcgcgc attgtccgct taacgtc 27

<210> 40 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20: <220> <223> Cebador YL792

<400> 40

tgcgaaggga gaatcatacg tgtagac: 27

25: <210> 41 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador ODMW469

30: <400> 41

cttcatcttc cggaccgcat tcttgc: 26

35: <210> 42 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador AUAP

<400> 42

ggccacgcgt cgactagtac: 20

40: <210> 43 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

45: <220> <223> Cebador ODMW470

<400> 43

cctcactggg acctcattgc tgatcacc: 28

<210> 44 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5: <220> <223> Cebador YL794

<400> 44

tttccatggc tctcagtctt accacagaac ag: 32

10: <210> 45 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador YL797

15: <400> 45

gtacatgtac caagcttgga agcggtg: 27

20: <210> 46 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador YL796

<400> 46

caccgcttcc aagcttggta catgtac: 27

25: <210> 47 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

30: <220> <223> Cebador YL795

<400> 47

tttgcggccg cttaggaatc ctgtgcgtcc ttcacgcag: 39

35: <210> 48 <211> 4070 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Pl�smido pEgD5S

<400> 48

<210> 49

<211> 8438

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pDMW369

<400> 49

<210> 50

<211> 19

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador T7

<400> 50

ggaaacagct atgaccatg 19

10 <210> 51

<211> 459

<212> PRT

<213> Rhizopus stolonifer (n.� de registro de GenBank AAX22052)

<400> 51

<210> 52

<211> 695

<212> ADN

<213> Pavlova lutheri

<400> 52

<210> 53

<211> 1106

<212> ADN

<213> Pavlova lutheri

<400> 53

<210> 54

<211> 287 10 <212> PRT

<213> Pavlova lutheri

<400> 54

5: <210> 55 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador SeqE

<400> 55

cgacacactc caatctttcc: 20

10: <210> 56 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> Cebador SeqW

<400> 56

ggtggctgga gttagacatc: 20

20: <210> 57 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador AP1

<400> 57

25: gtaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 58 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

30: <220> <223> Cebador GSP PvDES

<400> 58

ctgcgaagac ccagcacagg: 20

35: <210> 59 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador M13-28Rev

40: <400> 59

gtaatacgac tcactatagg gc: 22

5: <210> 60 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador PavDes seq

<400> 60

ttgtggcgct caatcatctc c: 21

10: <210> 61 <211> 1294 <212> ADN <213> Pavlova lutheri

<400> 61

<210> 62

<211> 1927

<212> ADN

<213> Pavlova lutheri

<400> 62

<210> 63

<211> 459

<212> PRT

<213> Rhizopus stolonifer (n.� de registro de GenBank ABB96724)

<400> 63

5: <210> 64 <211> 427 <212> PRT <213> Pavlova salina

<300> <302> SÍNTESIS DE RECOMBINANTES: ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS DE CADENA LARGA POR CÉLULAS

10: <310> documento WO 2005/103253 <311> <312> <313> (1) .. (427)

<400> 64

5: <210> 65 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador AP

<400> 65

ggccacgcgt cgactagtac tttttttttt ttttttt: 37

10: <210> 66 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> cebador oligonucleot�dico Smart IV

<400> 66

aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccggg: 39

20: <210> 67 <211> 1338 <212> ADN <213> Mortierella alpina

<400> 67

<210> 68

<211> 446

<212> PRT

<213> Mortierella alpina

<400> 68

<210> 69

<211> 6473

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pY5-22

<400> 69

<210> 70

<211> 6970

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pY5-22GPD

<400> 70

<210> 71

<211> 968

<212> ADN 5 <213> Yarrowia lipolytica

<300>

<302> PROMOTORES DE GLICERALDEH�DO-3-FOSFATO DESHIDROGENASA Y FOSFOGLICERATO MUTASA PARA LA EXPRESIÓN DE GENES EN LEVADURAS OLEAGINOSAS

<310> documento US-2005-0014270-Al 10 <311>

<312>

<313> (1) .. (968)

<400> 71

<210> 72

<211> 8630

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pYZDE2-S

<400> 72

<210> 73

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador GPDsense

<400> 73

atacgagatc gtcaaggg: 18

5: <210> 74 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador GPDantisense

10: <400> 74

gcggccgcgg attgatgtgt gtttaa: 26

15: <210> 75 <211> 6339 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Pl�smido pKR136

20: <220> <221> característica_misc <222> (4078) .. (4078) <223> n es a, c, g, o t

<400> 75

<210> 76

<211> 8319

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pY98

<400> 76

<210> 77

<211> 774

<212> ADN

<213> Euglena gracilis

<400> 77

<210> 78

<211> 1263

<212> ADN

<213> Euglena gracilis

<400> 78

5: <210> 79 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador oEugEL1-1

<400> 79

agcggccgca ccatggaggt ggtgaatgaa: 30

10: <210> 80 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15: <220> <223> Cebador oEugEL1-2

<400> 80

tgcggccgct cactgaatct ttttggctcc: 30

20: <210> 81 <211> 4311 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Pl�smido pKR906

<400> 81

<210> 82

<211> 7085

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pKR72

<400> 82

<210> 83

<211> 2540

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pKS102

<400> 83

<210> 84

<211> 4359

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pKR197

<400> 84

<210> 85

<211> 5147

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pKR911

<400> 85

<210> 86

<211> 6559

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pKR680

<220>

<221> característica_misc 10 <222> (4340) .. (4340)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 86

<210> 87

<211> 9014

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pKR913

<220>

<221> característica_misc 10 <222> (7839) .. (7839)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 87

<210> 88

<211> 5561

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pKR767

<400> 88

<210> 89

<211> 11889

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pKR916

<220>

<221> característica_misc 10 <222> (7810)..(7810)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 89

<210> 90

<211> 5661

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pKR974

<400> 90

<210> 91

<211> 5578

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pKR1032

<400> 91

<210> 92

<211> 11907

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pKR1037

<220>

<221> característica_misc 10 <222> (7810)..(7810)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 92

<210> 93

<211> 8671

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Pl�smido pKR328

<400> 93

<210> 94

<211> 1413

<212> ADN

<213> Saprolegnia diclina

<400> 94

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un polinucle�tido aislado, que comprende:

(a)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polip�ptido que tiene actividad delta-5 desaturasa, en el que el polip�ptido tiene al menos 90% de identidad de amino�cidos, basada en el método de alineamiento Clustal W, cuando se compara con una secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2;

(b)

una secuencia de nucleótidos que codifica un polip�ptido que tiene actividad delta-5 desaturasa, en el que la secuencia de nucleótidos tiene al menos 90% de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento BLASTN, cuando se compara con una secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3; o

(c)

un complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) o (b), en el que el complemento y la secuencia de nucleótidos est�n formados por el mismo número de nucleótidos y son 100% complementarios.
2.- El polinucle�tido de la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos:

(a)

consiste en SEQ ID NO: o SEQ ID NO:3;

(b)

codifica un polip�ptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:2; o

(c)

codifica una delta-5 desaturasa, según se indica en SEQ ID NO:2, en el que dicha secuencia tiene los codones

optimizados para la expresión en Yarrowia sp. 3.- Un polip�ptido que tiene actividad delta-5 desaturasa, en el que el polip�ptido tiene al menos 90% de identidad de amino�cidos, basada en el método de alineamiento Clustal W, cuando se compara con una secuencia de amino�cidos indicada en SEQ ID NO:2.
4.- Un gen quimérico que comprende el polinucle�tido de la reivindicación 1 o 2, unido operablemente al menos a una secuencia reguladora.
5.- Una célula que comprende, en su genoma, el gen quimérico de la reivindicación 4. 6.- La célula de la reivindicación 5, en la que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en plantas y levaduras.
7.- Un método para transformar una célula, que comprende transformar una célula con el gen quimérico de la

reivindicaci�n 4, y seleccionar las células transformadas con el gen quimérico de la reivindicación 4. 8.- El método de la reivindicación 7, en el que dicha célula es una célula vegetal, y dicho método comprende además la etapa de regenerar una planta a partir de la célula vegetal transformada.
9.- El método de la reivindicación 8, en el que la planta es una planta de soja. 10.- Un método para fabricar ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en una célula vegetal, que comprende:

(a)

transformar una célula vegetal con el gen quimérico de la reivindicación 4;

(b)

seleccionar las células transformadas que fabrican los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga.
11.- Un método para producir al menos un ácido graso poliinsaturado en una célula de una planta de semillas oleaginosas, que comprende:

(a)

transformar una célula de una planta de semillas oleaginosas con un gen quimérico de la reivindicación 4 y al menos una construcción de ADN recombinante adicional que comprende un polinucle�tido aislado unido operablemente al menos a una secuencia reguladora, que codifica un polip�ptido seleccionado del grupo que consiste en una delta-4 desaturasa, una delta-5 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-8 desaturasa, una delta-12 desaturasa, una delta-15 desaturasa, una delta-17 desaturasa, una delta-9 desaturasa, una delta-9 elongasa, una C14/16 elongasa, una C16/18 elongasa, una C18/20 elongasa y una C20/22 elongasa;

(b)

regenerar una planta de semillas oleaginosas a partir de la célula transformada de la etapa (a); y

(c)

seleccionar las semillas obtenidas a partir de las plantas de la etapa (b) que tienen un nivel alterado de ácidos grados poliinsaturados, cuando se compara con el nivel en semillas obtenidas a partir de una planta de semillas oleaginosas no transformada.
12.- El método de la reivindicación 11, en el que la planta de semillas oleaginosas se selecciona del grupo que consiste en soja, especies de Brassica, girasol, maíz, algodón, lino y c�rtamo.
13.- El método de una cualquiera de las reivindicaiones 10 a 12, que comprende además la etapa de extraer dicho ácido graso poliinsaturado.
14.- Una planta transg�nica que comprende, en su genoma, el gen quimérico de la reivindicación 4.
15.- La planta transg�nica de la reivindicación 14, que es una planta de semillas oleaginosas.
16.- La planta de semillas oleaginosas de la reivindicación 15, que comprende además una construcción de ADN

5 recombinante adicional que comprende un polinucle�tido aislado unido operablemente al menos a una secuencia reguladora, que codifica un polip�ptido seleccionado del grupo que consiste en una delta-4 desaturasa, una delta-5 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-8 desaturasa, una delta-12 desaturasa, una delta-15 desaturasa, una delta-17 desaturasa, una delta-9 desaturasa, una delta-9 elongasa, una C14/16 elongasa, una C16/18 elongasa, una C18/20 elongasa y una C20/22 elongasa.

10 17.-La planta de semillas oleaginosas de la reivindicación 15 o 16, que se selecciona del grupo que consiste en soja, especies de Brassica, girasol, maíz, algodón, lino y c�rtamo.
18.- Una semilla transg�nica, que:

(a) comprende, en su genoma, el gen quimérico de la reivindicación 4;

(b) se obtiene a partir de la planta fabricada por el método de la reivindicación 8 o 9, y comprende el polinucle�tido 15 de la reivindicación 1 o 2; o

(c) se obtiene a partir de la planta de semillas oleaginosas de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, o a partir de la planta de semillas oleaginosas obtenida a partir del método de la reivindicación 11 o 12, y comprende el polinucle�tido de la reivindicación 1 o 2.
19.- Un alimento o un pienso que incorpora la semilla de la reivindicación 18.

20 20.- Un método para fabricar un alimento o un pienso, que comprende:

(a)

procesar la semilla transg�nica de la reivindicación 18 para obtener aceite, e incluir dicho aceite en dicho alimento o pienso; o

(b)

incluir la semilla transg�nica de la reivindicación 18 en dicho alimento o pienso.
21.- El método de la reivindicación 20, en el que dicho alimento es un análogo de la carne, un análogo del queso, un 25 análogo de la lecha, o un producto alimentario de cereales.