PT1785492E - PROCESSO PARA A PREPARAÆO DE áCIDO DOCOSA-HEXAENËICO E áCIDO DOCOSAPENTAENËICO - Google Patents

PROCESSO PARA A PREPARAÆO DE áCIDO DOCOSA-HEXAENËICO E áCIDO DOCOSAPENTAENËICO Download PDF

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PT1785492E
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Toshiaki Yaguchi
Tsutomu Sogo
Shigeaki Fujikawa
Sakayu Shimizu
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Description

ΡΕ1785492 1
DESCRIÇÃO
"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ÁCIDO DOCOSA-HEXAENÓICO E ÁCIDO DOCOSAPENTAENÓICO"
Campo Técnico A presente invenção diz respeito a um processo para a preparação de lípidos contendo ácido docosa--hexaenóico (daqui em diante, também referido como "DHA") e/ou ácido docosapentaenóico (daqui em diante, também referido como "DPA") pela cultura de um microorganismo, bem como um processo para a preparação de DHA e/ou DPA a partir dos lipidos. A presente invenção também diz respeito a um microorganismo pertencendo ao género Ulkenia tendo a capacidade para produzir os lipidos. Técnica Antecedente 0 DHA está contido em óleo de peixe pertencendo ao grupo peixe azul. Particularmente, o DHA está contido no óleo de sardinhas ou atum, no qual o DHA está contido numa quantidade à volta de 20%.
Recentemente, devido à descoberta de material de peixe contendo uma alta concentração de DHA tal como a gordura orbital de atum, ou devido ao progresso na tecnologia para a produção de ácidos gordos altamente 2 ΡΕ1785492 purificados, têm sido feitos esforços intensivos para elucidar as funções fisiológicas do DHA, e para investigar o seu uso prático. Tornou-se evidente que as funções fisiológicas do DHA incluem um efeito de abaixamento do colesterol, um efeito anticoagulante e um efeito carcinostático. Em relação ao sistema metabólico do cérebro, tem-se também tornado evidente que o DHA é eficaz no melhoramento da memória e aprendizagem, na prevenção da demência senil e no tratamento da doença de Alzheimer. Além disso, foi provado que o DHA é um ácido gordo essencial para o crescimento de peixes juvenis. Pelas razões acima mencionadas, o DHA é usado em vários alimentos, materiais alimentícios e engodos. 0 DPA é também conhecido por estar contido em óleo de peixe, ainda que o conteúdo seja extremamente baixo. A maioria das funções fisiológicas do DPA são ainda desconhecidas. A única função conhecida para o DPA é a sua utilidade como agente de suporte para o transporte de agentes farmacêuticos para o interior do cérebro [Publicação da Patente Japonesa (Kokai) N° 61-204136 (1986) ] . É esperado, contudo, que o DPA pode desempenhar um papel fisiológico no corpo animal, uma vez que é conhecido que o DPA aumenta em compensação pela falta de DHA num corpo de animal [Homayoun et al., J. Neurochem., 51(1988) 45; Hamm et al. , Biochem. J., 245 (1987) 907; e
Rebhung et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58 (1994) 314].
Se se pretender obter DHA e/ou DPA a partir de 3 ΡΕ1785492 óleo de peixe, existem várias desvantagens, por exemplo, o baixo conteúdo dos ácidos gordos desejados, a incapacidade de manter uma fonte de óleo de peixe estável devido à migração dos peixes, ou o odor desagradável inerente no óleo de peixe. Além disso, é dificil obter lipidos com qualidade de confiança, visto que o óleo de peixe contém adicionalmente ácidos gordos insaturados tais como ácido araquidónico (ARA) e ácido icosapentaenóico (EPA), os quais tornam os lipidos susceptíveis a oxidação.
Além de óleo de peixe, os lipidos acumulados em células cultivadas de um microorganismo tendo uma capacidade para produzir DHA e/ou DPA são considerados como uma fonte de DHA e/ou DPA. Por exemplo, os seguintes microorganismos são conhecidos por produzirem DHA e/ou DPA: Vibrio marinus ATCC 15381, uma bactéria isolada do fundo do mar; as bactérias Vibrio isoladas nos intestinos de um peixe do mar profundo; fungos flagelados tais como Thraustochytrium aureum ATCC 34304, Thraustochytrium sp. ATCC 28211, ATCC 20890 e ATCC 20891, Schizochytrium sp. ATCC 20888 e ATCC 20889 (Patente dos E.U.A. N° 5 340 742), Thraustochytrium estirpe SR21 (Nippon Nogei Kagaku Kaishi, 69, edição extra, (5 de Julho de 1995), e Japonochytrium sp. ATCC 28207 [Publicação da Patente Japonesa (Kokai) N° 1-199588 (1989)]; microalgas tais como Cyclotella cryptica, Crypthecodinium cohnii [Publicação da Patente Japonesa (Kohyo) N° 5-503425 (1993)], e Emiliania sp. [Publicação da Patente Japonesa (Kokai) N° 5-308978 (1993)]. 4 ΡΕ1785492
Na utilização de qualquer dos microorganismos acima mencionados, contudo, vários problemas existem, por exemplo, um baixo rendimento de DHA e/ou DPA, uma necessidade de um periodo de cultura prolongado para a obtenção de uma quantidade suficiente de DHA e/ou DPA, ou uma necessidade de um meio ou condição de cultura específicos para a produção. Quando uma alga tal como Emiliania sp. é utilizada para a produção, um alto rendimento de DHA pode ser conseguido, ainda que possa existir uma desvantagem que é os passos de cultura serem complicados devido à necessidade de luz para a cultura. Consequentemente, um tal processo não é adequado para a produção industrial.
Deste modo, a presente invenção aqui descrita torna possivel a vantagem de proporcionar um processo que pode produzir DHA e/ou DPA bem como lipidos contendo DHA e/ou DPA usando um meio não dispendioso e convencional e passos simples para a produção, num periodo curto e com um alto rendimento. A presente invenção proporciona um processo para a preparação de lipidos contendo DHA e/ou DPA compreendendo a cultura num meio de um microorganismo pertencendo ao género Ulkenia tendo a capacidade para produzir DHA e/ou DPA, e a recuperação dos lipidos da cultura. A presente invenção também proporciona um processo para a preparação de DHA e/ou DPA compreendendo 5 ΡΕ1785492 cultura num meio de um microorganismo pertencendo ao género Ulkenia tendo a capacidade para produzir DHA e/ou DPA, a recuperação dos lípidos da cultura, e a separação do DHA e/ou DPA a partir dos lipidos.
Revelação da Invenção
Um processo para a preparação de lipidos contendo ácido docosa-hexaenóico e ácido docosapentaenóico de acordo com a presente invenção compreende a cultura num meio de um microorganismo pertencendo ao género Ulkenia tendo a capacidade para produzir lipidos contendo ácido docosa--hexaenóico e ácido docosapentaenóico, e a recuperação dos referidos lipidos de uma cultura.
Um processo para a preparação de ácido docosa--hexaenóico de acordo com a presente invenção compreende a cultura num meio de um microorganismo pertencendo ao género Ulkenia tendo a capacidade para produzir lípidos contendo ácido docosa-hexaenóico, a recuperação dos referidos lípidos da cultura, e a separação do referido ácido docosa--hexaenóico dos referidos lípidos.
Um processo para a preparação de ácido docosapentaenóico de acordo com a presente invenção compreende a cultura num meio de um microorganismo pertencendo ao género Ulkenia tendo a capacidade para produzir lípidos contendo ácido docosapentaenóico, a recuperação dos referidos lípidos da cultura, e a separação do referido ácido docosapentaenóico dos referidos lípidos. 6 ΡΕ1785492 A presente invenção proporciona células de um microorganismo pertencendo ao género Ulkenia contendo lipidos contendo ácido docosa-hexaenóico e/ou ácido docosa-pentaenóico. A presente invenção proporciona Ulkenia sp. estirpe SAM2179 tendo a capacidade para produzir lipidos contendo ácido docosa-hexaenóico e ácido docosapentaenóico. A presente invenção proporciona um alimento para suplementação de nutriente, uma fórmula adequada para alimentação de crianças uma fórmula adequada para alimentação de crianças imaturas, um alimento para bebé, um alimento para mães de aleitamento ou grávidas, um alimento geriátrico, um agente entérico promotor da nutrição, um alimento para animais, um aditivo para um alimento para animais, e um engodo para microorganismos para engodos contendo os lipidos obtidos por um dos processos acima mencionados.
Um processo para a preparação de lipidos estruturais contendo ácido docosa-hexaenóico e ácido docosapentaenóico da presente invenção compreende a cultura num meio de um microorganismo pertencendo ao género Ulkenia tendo a capacidade para produzir lipidos contendo ácido docosa-hexaenóico e ácido docosapentaenóico, a recuperação dos referidos lipidos de uma cultura, e o tratamento dos referidos lipidos com lipase fúngica para converter ácidos 7 ΡΕ1785492 gordos nas posições 1 e 3 em ácidos gordos de cadeia média (C: 8-12, ver "SEIKAGAKUJITEN" (segunda edição) pp. 834, ΤΟΚΥΟ KAGAKUDOJIN (1990)).
Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é um cromatograma liquido de triacil-gliceróis em lipido neutro obtidos pela presente invenção.
Melhor Modo para Levar a Cabo a Invenção A presente invenção está descrita com maior detalhe abaixo. Conforme aqui usado, o termo "ácido docosa-hexaenóico" ou "DHA" refere-se à série (n-3) de ácido docosa-hexaenóico. Conforme aqui usado, o termo "ácido docosapentaenóico" ou "DPA" refere-se à série (n-3) e/ou série (n-6) de ácido docosapentaenóico. Os termos "gorduras", "lípidos" e "óleo" são aqui usados com o mesmo significado.
Quaisquer microorganismos pertencendo ao género Ulkenia podem ser usados no processo da presente invenção, visto que eles têm a capacidade para produzir DHA e/ou DPA. Por exemplo, podem ser usadas Ulkenia sp. estirpes SAM 2180 e SAM 2179 isoladas da água do mar pelos presentes inventores. De entre estas estirpes, as estirpes SAM 2179 produzem não só DHA mas também DPA num grau superior. Esta estirpe foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (endereço: 1-3, Higashi 1 chome Tsukuba-shi ΡΕ1785492
Ibaraki-ken 305, JAPÃO), em 23 de Julho de 1996 e foi-lhe atribuído um número de acesso FERM BP-5601.
As características micológicas das estirpes Ulkenla sp. SAM 217 9 e SAM 2180 são como segue. Quando estes microorganismos foram cultivados num meio líguido KMV (M. Fuller e A. Jaworski eds.; Zoosporic Fungi in Teaching <5 Research VII + 303 PP, 1987. Southeastern Publishing Corporation, Atenas) a 20 °C no escuro, foram observadas células globosas ou ovais, e foram também observados zoosporos biflagelados. Contudo, uma rede de filamentos de ectoplasma não foi observada. De acordo com isto, estes microorganismos foram classificados em fungos pertencendo aos Thraustochytriales com referência a Icons of the Japanese Water Mould with Precise Explanation por Yosio Kobayasi e Kazuko Konno (publicado privadamente pelos autores a suas expensas, p 169, 1986) . Além disso, estes microorganismos formaram rizóides, com falta de apófises, e formaram células tipo amiba no meio líquido KMV. Por conseguinte, eles foram identificados como fungos pertencendo ao género Ulkenia, e os dois isolados foram designados como Ulkenia sp. SAM 2179 e SAM 2180, respectivamente. O microorganismo pertencendo ao género Ulkenia usado no processo da presente invenção não está limitado à estirpe do tipo selvagem, mas pode também incluir um mutante ou uma estirpe recombinante. Deste modo, o uso de um mutante ou uma estirpe recombinante desenhada para produzir eficientemente DHA e/ou DPA cai dentro do âmbito e 9 ΡΕ1785492 alcance da presente invenção. Tais mutantes ou estirpes recombinantes incluem microorganismos desenhados para conterem uma percentagem mais alta de DHA e/ou DPA em lípidos, uma quantidade total mais alta dos lípidos, ou ambas, em comparação com a percentagem ou a quantidade produzida pela estirpe do tipo selvagem original, utilizando os mesmos substratos. A estirpe de tipo selvagem de acordo com a presente invenção contém pelo menos 25% de DHA e/ou 5% de DPA, preferivelmente 40-48% de DHA e/ou 8-13% de DPA nos lipidos. Além disso, a estirpe de tipo selvagem de acordo com a presente invenção contém pelo menos 3 g de DHA e/ou 0,5 g de DPA, preferivelmente 5 g de DHA e/ou 1 g de DPA por litro de meio. Além disso, os microorganismos desenhados para produzirem uma quantidade comparável de DHA e/ou DPA com a correspondente estirpe de tipo selvagem, utilizando eficientemente substratos com um desempenho de custo superior, estão também contemplados.
Os microorganismos de acordo com a presente invenção são cultivados pela inoculação de um meio liquido ou sólido com uma pré-cultura dos microorganismos. O meio pode ou não conter água do mar natural ou artificial.
Quaisquer fontes de usadas incluindo, por exemplo, tação, hidratos de carbono tai xilose, sacarose, maltose, amido mina e dextrano, bem como ácido feijão-soja, óleo, ácido glutâmico, carbono convencionalmente mas sem constituir limi-s como glucose, frutose, solúvel, fucose, glucosa-oleico, gorduras tais como melaços, glicerol, 10 ΡΕ1785492 manitol e acetato de sódio podem ser usadas como fonte de carbono a serem adicionadas ao meio.
Fontes de azoto naturais tais como peptona, extracto de levedura, extracto de malte, extracto de carne, casaminoácido e licor de infusão de milho, bolo de feijão-soja, fontes de azoto orgânicas tais como glutamato de sódio e ureia, e fontes de azoto inorgânicas tais como acetato de amónio, sulfato de amónio, cloreto de amónio e nitrato de amónio podem ser usadas como fonte de azoto.
Além disso, fosfatos tais como fosfato de potássio e di-hidrogenofosfato de potássio, sais inorgânicos tais como sulfato de amónio, sulfato de sódio, sulfato de magnésio, sulfato de ferro, sulfato de cobre, cloreto de magnésio e cloreto de cálcio e vitaminas podem ser adicionados como micronutrientes, se necessário. A quantidade destes componentes no meio não é especificamente definida, visto que as concentrações dos componentes não têm um efeito prejudicial no crescimento dos microorganismos. Em geral, as fontes de carbono podem ser adicionadas a uma concentração de 20 a 180 g por litro de meio, e as fontes de azoto podem ser adicionadas a uma concentração de 0,6 a 6 g por litro de meio. Preferivelmente, a quantidade da fonte de azoto é aumentada em correspondência com o aumento na quantidade da fonte de carbono. 11 ΡΕ1785492
Depois da preparação do meio, o seu pH é ajustado até um intervalo entre 3,0 e 8,0, preferivelmente entre 3,5 e 5,0, mais preferivelmente entre 3,5 e 4,5, usando um ácido ou base adequados, e em seguida o meio é esterilizado por autoclavagem ou semelhante. A cultura de um microorga-nismo é usualmente realizada durante 2 a 7 dias, preferivelmente durante 2 a 5 dias, a 10 até 35 °C, preferivelmente a 17 até 30 °C, ou com arejamento-agitação, com chocalhamento, ou numa cultura estacionária.
Além disso, precursores de DHA e/ou DPA podem ser adicionados ao meio de maneira a acelerar a produção de DHA e/ou DPA. Por exemplo, hidrocarbonetos tais como tetra-decano, hexadecano e octadecano, ácidos gordos tais como ácido oleico, ácido linoleico e ácido α-linolénico, ou sais (e. g. sais de sódio ou potássio) ou seus ésteres são usados como precursores. Além disso, gorduras contendo estes ácidos gordos como constituinte (e. g. azeite, óleo de feijão-soja, óleo de semente de algodão ou óleo de palma) podem ser adicionados. Estes componentes podem ser usados isolados ou em combinação com um outro.
Fontes de carbono, fontes de azoto, precursores ou semelhantes podem ser adicionados ao meio antes ou durante a cultura. A adição destes componentes pode ser realizada uma vez, repetidamente ou continuamente.
De maneira a recuperar lípidos contendo DHA e/ou DPA num rendimento adequado para uso prático, é preferível 12 ΡΕ1785492 usar um meio líquido e cultivar com arejamento-agitação. Um fermentador com agitação convencional ou um fermentador com coluna de borbulhamento podem ser usados.
Cultivando conforme acima descrito, lípidos contendo DHA e/ou DPA são produzidos e acumulados em células. Quando um meio líquido é usado, lípidos que contêm DHA e/ou DPA podem ser recuperados de uma cultura, ou uma cultura esterilizada, durante o período de cultura, de uma cultura, ou uma cultura esterilizada, e no fim da cultura, ou de células cultivadas, ou células secas, recolhidos a partir de qualquer uma das culturas acima mencionadas. Conforme aqui usado, o termo "cultura" inclui células cultivadas, células cultivadas secas e células cultivadas processadas bem como caldo de cultura contendo células e sobrenadante de cultura. DHA e/ou DPA podem ser isolados a partir de lípidos contendo DHA e/ou DPA recuperados de células cultivadas, como segue. Após a cultura, as células são recolhidas da cultura por meios de separação convencional sólido/líquido tais como centrifugação e filtração. As células são extensivamente lavadas com água e, preferivelmente, elas são em seguida secas. A secagem das células pode ser realizada por congelação-secagem, secagem ao ar ou semelhante. As células secas são em seguida destruídas, por exemplo, por meio de dino-moinho ou por ultra-sons, e os lípidos são extraídos das células com um solvente orgânico, preferivelmente sob corrente de azoto. Pode ser 13 ΡΕ1785492 usado um solvente orgânico tal como éter, hexano, metanol, etanol, clorofórmio, diclorometano ou éter de petróleo. A extracção alternada com metanol e éter de petróleo ou extracção com um sistema solvente misto de clorofórmio/me-tanol/água também pode ser usada. Uma alta concentração de lipidos contendo DHA e/ou DPA é obtida por evaporação do solvente orgânico a partir do extracto sob uma pressão reduzida.
Alternativamente, a extracção pode ser realizada com células molhadas. Neste caso, um solvente compatível com água tal como metanol e etanol, ou um solvente misto com água constituído por álcool ou álcoois e água e/ou outros solventes podem ser usados. Os outros procedimentos são conforme acima descrito. A quantidade de DHA nos lipidos obtidos conforme acima descrito é pelo menos 3 g por litro de cultura, preferivelmente 5 g por litro de cultura. A quantidade de DPA nos lipidos é de pelo menos 0,7 g por litro de cultura, preferivelmente 1,0 g por litro de cultura.
Nos lipidos obtidos conforme acima descrito, DHA e/ou DPA estão presentes na forma de lipidos neutros (e. g. triacilglicerol) ou lipidos polares (e.g. fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina ou fosfatidilinositol). A purificação de triacilgliceróis contendo DHA e/ou DPA de lipidos contendo DHA e/ou DPA recuperados de uma cultura é realizada usando um método convencional tal como separação por arrefecimento ou cromatografia em coluna. 14 ΡΕ1785492
Tipicamente, o conteúdo de lípidos neutros nos lipidos da presente invenção é muito alto (mais do que 90% de lipidos no total). A composição representativa de ácidos gordos nos lipidos neutros é como segue. Ácido palmítico: 30-38%; DHA (n-3): 40-48%; DPA (n-6): 8-13%; EPA (n-3) : 0-1%; ARA: 0-0,6%; outros ácidos gordos: 10-20%.
Os lipidos neutros dos lipidos da presente invenção contêm pelo menos 85% de triacilgliceróis, preferivelmente pelo menos 90% de triacilgliceróis. A quantidade de diacilgliceróis ou monoacilgliceróis nos lipidos neutros é muito baixa. Esterol livre e/ou éster de esterol também está contido numa quantidade de 1-3%. Tipicamente, as espécies moleculares seguintes são encontradas nos triacilgliceróis: 16:0-16:0-22:5, 16:0-16:0-22:6, 16:0-22:5-22:6, 16:0-22:6-22:6, 22:5-22:6-22:6 e 22:6-22:6-22:6, em que, por exemplo, "16:0" significa um ácido gordo tendo "16" átomos de carbono e nenhuma ("0") ligações duplas. É interessante que triacilgliceróis consistindo por apenas ácidos gordos poli-insaturados existam nos lipidos da presente invenção. A separação de DHA e/ou DPA de lipidos contendo DHA e/ou DPA pode ser realizada hidrolisando os lipidos, e em seguida concentrando e separando os ácidos gordos mistos ou ésteres de ácido gordo mistos resultantes preparados a partir deles, usando um método convencional tal como adição de ureia, separação por arrefecimento ou cromatografia em coluna. 15 ΡΕ1785492 0 DHA e/ou DPA bem como os lípidos contendo DHA e/ou DPA obtidos conforme acima descrito podem ser adicionados a vários alimentos, materiais alimentícios ou engodos para contrariar uma deficiência de DHA e/ou DPA. Exemplos de tais alimentos incluem, por exemplo, nutriente para suplementos alimentares, fórmula adequada para alimentação de crianças ou crianças imaturas, alimentos saudáveis, alimentos funcionais (tal como um agente entérico para a promoção da nutrição), alimentos para bebé, alimentos para mães de aleitamento ou grávidas e alimentos geriátricos. Os materiais alimentícios incluem alimento para animais domésticos tais como porcos e vacas, alimento para aves domésticas tais como frangos, alimentos para animais de companhia tais como cães, gatos e semelhantes, e alimento para criação de peixe. Os engodos incluem, por exemplo, aqueles para microorganismos (os assim chamados zooplânctones) que são dados como engodo para a cultura de peixe e marisco.
Particularmente, para materiais alimentícios e engodos, é vantajoso e económico usar uma cultura de um microorganismo da presente invenção, células recolhidas da cultura, ou um resíduo das células após a recuperação dos lípidos. Por exemplo, células de microorganismos que produzem DHA e/ou DPA podem ser directamente usadas para alimentar juvenis de peixe (os peixes quando não adultos), em vez de directamente alimentá-los através de zooplânctones e semelhantes. Estes materiais podem ser usados após secagem ou esterilização, se necessário. 16 ΡΕ1785492
Os lípidos da presente invenção podem ser usados para a produção de ovos de aves domésticas enriquecidos com DHA e/ou DPA, os quais são obtidos alimentando as aves domésticas para a recolha do ovo (preferivelmente frangos) com alimento contendo os lípidos da presente invenção. 0 óleo de gema de ovo enriquecido com DHA e/ou DPA também pode ser produzido pela extracção do óleo destes ovos ou das gemas dos ovos de aves domésticas usando um método convencional. As fórmulas adequadas para a alimentação de crianças e crianças imaturas, alimentação para bebé, alimento para mães de aleitamento ou grávidas contendo tal óleo de gema de ovo estão também contempladas. Têm sido feitos há muito tempo esforços para fazer a composição de leite em pó para bebés semelhante ao leite humano. Em particular, é importante fazer a composição dos ingredientes principais do leite humano (isto é, proteína, gordura e açúcar) em leite em pó semelhantes ao do leite humano. No que respeita a lípidos, tem sido um problema que o leite em pó convencional é deficiente em ácidos gordos poli-insaturados, os quais estão inerentemente contidos no leite humano. Vários relatos sobre a composição de ácidos gordos insaturados no leite humano foram publicados (para ácidos gordos poli--insaturados no leite de mães americanas, europeias e africanas, ver INFORM, 6(8) (1995) 940-946; para ácidos gordos poli-insaturados no leite de mães japonesas, ver JJPEN, 13 (9) (1991) 765-772). 17 ΡΕ1785492
Recentemente, foi demonstrado que ARA e DHA, ambos os quais estão contidos no leite humano, são eficazes no crescimento de bebés ("Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Research", Elsevier Science Publishers, (1993) precipitado 2 61-2 64) . A importância de ARA e DHA no aumento da altura e no desenvolvimento do cérebro foi também relatada (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90 (1993) 1073-1077; Lancet, 344 (1994) 1319-1322).
Por conseguinte, existe um interesse crescente na adição de ARA e DHA para modificar o leite. O leite modificado contendo óleo de peixe como fonte para DHA está agora no mercado. O óleo de peixe também contém EPA, o qual está escassamente presente no leite humano e que foi relatado por conferir um efeito adverso sobre o crescimento de crianças imaturas ("Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Research", Elsevier Science Publishers, (1993) precipitado 261-264). Os lípidos da presente invenção são adequados como aditivo para leite modificado, visto que o conteúdo de EPA é extremamente baixo. Os lipidos da presente invenção podem além disso ser adicionados a alimentos para bebés.
Os lipidos da presente invenção podem ser adicionados a alimentos, tal como alimento para suplementação de nutriente, alimento geriátrico ou alimento saudável, para o fornecimento de DHA e/ou DPA ou para a manutenção da saúde. A composição do alimento pode ser na forma de alimentos 18 ΡΕ1785492 sólidos ou líquidos, ou alimentos contendo óleos. 0 conteúdo de lípidos no alimento está preferivelmente entre 0,001 e 50% numa base ponderai, dependendo da natureza do alimento ao qual os lípidos são adicionados.
Exemplos de alimentos contendo óleos incluem alimentos naturais contendo inerentemente óleos (tal como carne, peixe ou noz), alimentos aos quais os lípidos são adicionados na confecção (tal como sopa), alimentos para os quais os lípidos são usados como meio de aquecimento (tal como «donuts»), alimentos gordos (tal como manteiga), alimentos processados nos quais os lípidos são adicionados no processamento (tal como bolinhos) ou alimentos aos quais os lípidos são pulverizados ou aplicados no completamento do processamento (tal como biscoitos duros). Os lípidos (ou DHA e/ou DPA separados) da presente invenção também podem ser adicionados a alimentos de agricultura, alimentos de fermentação, alimentos de animais de exploração pecuária, alimentos do mar ou bebidas, que não contêm gorduras.
Alternativamente, os lípidos da presente invenção também podem ser adicionados a um alimento funcional que exibe a actividade fisiológica de DHA e/ou DPA para a recuperação de uma função diminuída do corpo ou para a prevenção da sua diminuição. O alimento funcional da presente invenção pode estar na forma de uma formulação médica ou numa forma processada (tal como um agente entérico para a promoção da nutrição, pó, grânulo, trocisco, solução interna, suspensão, emulsão, xarope e semelhantes) em que os lípidos da presente invenção são 19 ΡΕ1785492 combinados com proteína, sacárido, lípido, elementos traços, vitamina, agente de emulsificação ou perfume.
Além disso, os lípidos da presente invenção podem ser usados como aditivo para um cosmético ou uma lavagem, ou um material de partida para a produção de um seu derivado a ser usado como medicamento.
Daqui em diante, a presente invenção será especificamente descrita por meio de exemplos. Contudo, a invenção não está limitada aos exemplos. (Exemplo 1)
Produção de lípidos usando microorganismos pertencendo ao género Ulkenia (1)
As estirpes Ulkenia sp. SAM 2180 e SAM 2179 foram cultivadas num fermentador (jarro fermentador) com volume de 5 litros (L) contendo 3 L de meio tendo a seguinte composição sob as seguintes condições de cultura. (1) Composição do meio 1) Glucose (g/L): 60 2) Fosfato de potássio (g/L): 3 3) Fosfato de amónio (g/L): 2 4) Licor de infusão de milho (g/L): 0,7 5) Água do mar artificial 50% (L): 1 4,0 6) pH: 20 ΡΕ1785492 (2) Condições de cultura 1) Temperatura da cultura (°C): 28 2) Quantidade de arejamento (WM) : 0,5 3) Velocidade de agitação (rpm): 300 4) Ajustamento de pH: mantida a pH 4 com hidróxido de só
dio 10% m/v e ácido sulfúrico 1 M
Após a cultura, as células foram recolhidas por centrifugação e secas por congelação, e em seguida foi medida a quantidade (numa base ponderai) de células por litro de meio. A destruição das células e a extracção dos lipidos foram em seguida realizadas por adição de uma mistura de clorofórmio/metanol (2:1, v/v) às células secas numa razão de 100 volumes por massa das células e homogeneização da mistura na presença de pérolas de vidro. Após lavagem do extracto de acordo com o método de Folch, o solvente foi evaporado para se obterem lipidos purificados, e a massa dos lipidos foi em seguida medida.
De modo a estimar a composição em ácido gordo dos lipidos purificados resultantes, ésteres de metilo de ácido gordo foram preparados por dissolução de uma porção dos lipidos numa solução mista de uma quantidade igual de solução de metanol contendo HC1 10% e diclorometano, e tratamento por calor da mistura a 60 °C durante 2 horas. Os ésteres foram em seguida sujeitos a cromatografia gasosa para analisar a composição em ácido gordo. As condições de separação para a cromatografia gás-liquido foram como segue. 21 ΡΕ1785492 (3) Condições de separação 1) Coluna: coluna capilar TC-70 (GL Science Co., LTD.), diâmetro interno 0,25 mm x comprimento 30 m 2) Caudal: 0,8 mL/min, 100 kPa (pressão da cabeça da coluna) 3) Gás agente de suporte: gás azoto 4) Temperatura da coluna: modo crescente, 170-220 °C (4 °C/min)
5) Detecção: FID
Os resultados são mostrados nos seguintes Quadros 1 e 2.
Quadro 1
Estirpe Tempo de Massa celu- Quantidade Percentagem Quantidade Quantidade cultura lar seca total de de conteúdo de DHA de DPA (dias) (g)*1 lípidos de lipidos (g)*1 (g)*1 (g)*1 (%m)*2 SAM2180 3 23,2 14,1 61 4,0 0,9 SÃM2179 3 19,5 11,9 61 5,5 1,3 n) Massa por litro de meio *2) Percentagem versus células secas
Quadro 2
Estirpe 14:0 15:0 16:0 17:0 18:0 20:4 20:5 22:5 22:6 (AA) (EPA) (DPA) (DHA) SAM2180 2,7 2,4 55, 0 1,0 1,4 - 0,2 6,7 28,7 SAM2179 2,4 0,9 37,2 0,3 0, 8 0,4 0, 6 10,6 46,2 22 ΡΕ1785492 (Exemplo 2)
Produção de lipidos usando microorganismo pertencendo ao género Ulkenia (2) A estirpe Ulkenia sp. SAM 2179 foi cultivada num fermentador (jarro fermentador) com volume de 5 litros (L) contendo 3 L de meio tendo a seguinte composição sob as seguintes condições de cultura. (1) Composição do meio 1) Glucose (g/L): 60 2) Fosfato de potássio (g/L): 3 3) Fosfato de amónio (g/L): 2 4) Cloreto de magnésio (g/L): 1,3 5) Sulfato de sódio (g/L): 1 6) Cloreto de cálcio (g/L): 0,3 7) Licor de infusão de milho (g/L): 0,7 8) pH: 4,0 (2) Condições de cultura 1) Temperatura da cultura (°C): 28 2) Quantidade de arejamento (WM) : 0,5 3) Velocidade de agitação (rpm): 300 4) Ajustamento de pH: mantida a pH 4 com hidróxido de só
dio 10% m/v e ácido sulfúrico 1 M
Após a cultura, as células foram recolhidas por centrifugação e secas por congelação, e em seguida foi medida a quantidade (numa base ponderai) de células por litro de meio. A destruição das células e a extracção dos 23 ΡΕ1785492 líp idos foram em seguida realizadas por adição de uma mistura de clorofórmio/metanol (2:1, v/v) às células secas numa razão de 100 volumes por massa das células e homogeneização da mistura na presença de pérolas de vidro. Após lavagem do extracto de acordo com o método de Folch, o solvente foi evaporado para se obterem lipidos purificados, e a massa dos lipidos foi em seguida medida.
De modo a estimar a composição em ácido gordo dos lipidos purificados resultantes, ésteres de metilo de ácido gordo foram preparados por dissolução de uma porção dos lipidos numa solução mista de uma quantidade igual de solução de metanol contendo HC1 10% e diclorometano, e tratamento por calor da mistura a 60 °C durante 2 horas. Os ésteres foram em seguida sujeitos a cromatografia gasosa para analisar a composição em ácido gordo. As condições de separação para a cromatografia gás-liquido foram conforme descritas no Exemplo 1.
Os resultados são mostrados nos seguintes Quadros 3 e 4.
Quadro 3
Estirpe Tempo de cultura (dias) Massa celular seca (gf1 Quantidade total de lipidos (gf1 Percentagem de conteúdo de lipidos (%mf2 Quantidade de DHA (gf1 Quantidade de DPA (gf1 3ΆΜ2179 3 21,5 12,0 56 5,5 1,5 n) Massa por litro de meio *2) Percentagem versus células secas 24 ΡΕ1785492
Quadro 4
Estirpe 14:0 15:0 16:0 17:0 18:0 20:4 20:5 22:5 22:6 (AA) (EPA) (DPA) (DHA) SAM2179 2, 0 1,5 34,3 0,5 0, 9 0,7 0,7 12,4 45,8 (Exemplo 3)
Análise de lipidos de Ulkenia sp. SAM 2179 Lípidos neutros e lipidos polares foram separados a partir dos lipidos obtidos no Exemplo 1 por técnica de partição líquido-liquido convencional usando hexano e metanol 90%. 0,92 g de lipidos neutros e 0,05 g de lipidos polares foram obtidos a partir de 1 g dos lipidos, respectivamente. Os resultantes lipidos neutros e lipidos polares foram analisados usando cromatografia de camada fina. O desenvolvimento de cor foi conseguida usando ácido sulfúrico, em seguida a identidade das manchas resultantes foi confirmada por comparação dos seus valores Rf com os de lipidos padrão.
Mais de 90% dos lipidos neutros eram triacil-gliceróis. Os lipidos polares consistem de fosfatidilcolina (60-80%), fosfatidiletanolamina (5-20%) e fosfatidilinosi-tol (2-8%).
Os triacilgliceróis nos lipidos neutros foram ainda analisados por separação de espécies moleculares em cromatografia liquida (coluna: coluna ODS; fase móvel: 25 ΡΕ1785492 acetona/acetonitrilo (3:2); detecção: refractómetro diferencial) (ver Figura 1). Os picos resultantes foram isolados e, após hidrólise, convertidos a ésteres de metilo. Os residuos de ácido gordo foram determinados usando croma-tografia gás-liquido.
Os cinco picos principais foram identificados conforme mostrado no Quadro 5. Os triacilgliceróis eram compostos de 12,8% de 1,2,3-tri-docosa-hexaenoil-triacil-glicerol e 8,0% de l-docosapentaenoil-2,3-di-docosa-hexa-enoil-triacilglicerol. Cerca de 20% do total de triacilgliceróis era composto por ácidos gordos tri-poli-insa-turados.
Quadro 5
Pico Espécies moleculares Razão (%) 1 22 : 6-22:6-22:6 12,8 2 22:5-22:6-22:6 8,0 3 16:0-22:6-22:6 18,3 4 16:0-22:5-22:6 8,1 5 16:0-16:0-22 : 6 10,8 (Exemplo 4)
Determinação do sitio de ligação de residuos de ácido gordo em triacilgliceróis O sitio de ligação do residuo de ácido gordo nos triacilgliceróis obtidos no Exemplo 3 foi analisado como segue. Os triacilgliceróis obtidos no Exemplo 3 (espécies moleculares: 16:0-16:0-22:6) foram secos e tratados com 26 ΡΕ1785492 lipase (de Rhizopus japonicus) específica para a posição 1,3. 0 resíduo de ácido gordo foi identificado usando GC/MS depois dos 2-monoacilgliceróis resultantes serem trimetilsililados. 0 tratamento com lipase foi realizado em 2 mL de tampão acetato 50 mM (pH 5,5) com 1000 unidades de lipase a 35 °C durante 30 minutos. Os produtos de reacção foram extraídos com éter e trimetilsililados usando agente de trimetilsililação comercialmente disponível.
Foi observado um pico fragmento correspondendo à massa molecular de monoacilgliceróis aos quais 22:6 está ligado, indicando que os triacilgliceróis são 16:0—22:6— -16:0 aos quais os resíduos de ácido gordo de 22:6 estão ligados na posição 2 das espinhas dorsais de glicerol. (Exemplo 5)
Preparação de leite modificado contendo DHA e DPA
Leite modificado contendo DHA e DPA foi preparado pela adição de 0,44 g dos lípidos no Exemplo 1, que contêm 46,2% de DHA e 10,6% de DPA, a 100 g de leite em pó. A composição de DHA e DPA no leite resultante foi 0,80% e 0,19% do total de ácidos gordos, respectivamente, a qual era semelhante à do leite humano. (Exemplo 6)
Preparação de lípidos estruturais contendo DHA e DPA 50 mL de solução de lipase (5600 U/mL, lipase específica para a posição 1,3 de Rhizopus delemar) foram 27 ΡΕ1785492 misturados com 2,5 g de CaC03 como agente de suporte imobilizante. A enzima foi imobilizada e precipitada pela adição de 40 mL de acetona à mistura e a enzima imobilizada foi em seguida seca. A actividade especifica da enzima imobilizada resultante foi de 9,3 U/mg. 120 mg da enzima imobilizada foram misturados com 1 g de lipidos contendo DHA e DPA obtidos de SAM2180 no Exemplo 1, 2 g de ácido caprilico e 60 mg de água com agitação a 30 °C durante 8 horas. Os triacilgliceróis foram em seguida recuperados da mistura reaccional usando um método convencional e a composição em ácido gordo dos triacilgliceróis foi determinada. Os resultados são mostrados no Quadro 6.
Quadro 6 8:0 14:0 15:0 16:0 17:0 18:0 20:4 20:5 22:5 22:6 (AA) (EPA) (DPA) (DHA) Sem tratamento 0,0 2,7 2,4 55,0 1,0 1,4 0,0 0,2 6,7 28,7 Após tratamento 36,2 1,8 1,2 17,6 1,0 1,8 0,0 0,2 7,3 30,4 com lipase
Mais de 30% dos triacilgliceróis têm ácidos gordos poli-insaturados na posição SN2 dos gliceróis. Assim, estes lipidos são adequados para fazer lipidos estruturais que contêm ácidos gordos de cadeia média na posição SNI e SN3 dos gliceróis e ácidos gordos poli--insaturados na posição SN2 dos gliceróis.
Aplicabilidade Industrial
Os lipidos que contêm uma quantidade alta de DHA e/ou DPA e uma quantidade baixa de EPA podem ser obtidos 28 ΡΕ1785492 pelo processo da presente invenção. DHA e/ou DPA podem também ser obtidos pela sua separação posterior a partir dos lípidos.
Os lípidos contendo DHA e/ou DPA, o DHA separado e o DPA separado da presente invenção, são úteis como aditivos para alimentos, materiais alimentícios, engodos, medicamentos e semelhantes. Para materiais alimentícios ou engodos, as células contendo DHA e/ou DPA da presente invenção podem ser usadas. Ovos de aves domésticas ou gemas de ovos de aves domésticas enriquecidos de DHA e/ou DPA podem ser produzidos por alimentação de aves domésticas com os materiais alimentícios da presente invenção.
Lisboa, 29 de Junho de 2010

Claims (26)

  1. ΡΕ1785492 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para a preparação lípidos contendo ácido docosa-hexaenóico e/ou ácido docosapentaenóico compreendendo: a cultura num meio de um microorganismo do género Ulkenia tendo a capacidade para produzir lípidos contendo ácido docosa-hexaenóico e/ou ácido docosapentaenóico, e a recuperação dos referidos lípidos de uma cultura.
  2. 2. Um processo para a preparação de ácido docosa-hexaenóico e/ou ácido docosapentaenóico compreendendo: o método de acordo com a Reivindicação 1, e compreendendo ainda a separação do referido ácido docosa-hexaenóico e/ou ácido docosapentaenóico dos referidos lípidos.
  3. 3. Um processo para a preparação de lípidos estruturais contendo ácido docosa-hexaenóico e/ou ácido docosapentaenóico compreendendo: o método de acordo com a Reivindicação 1, e compreendendo ainda o tratamento dos referidos lípidos com uma lipase fúngica para converter ácidos gordos nas posições 1 e 3 em ácidos gordos de cadeia Cs-i2·
  4. 4. Células de um microorganismo do género 2 ΡΕ1785492 Ulkenia contendo lípidos compreendendo lípidos neutros contendo 30-38% de ácido palmítico, 40-48% de ácido docosa--hexaenóico, 8-13% de ácido docosapentaenóico, 0-1% de ácido icosapentaenóico, 0-0,6% de ácido araquidónico e 10--20% de outros ácidos gordos numa base ponderai do total de ácidos gordos presentes.
  5. 5. Células de um microorganismo do género Ulkenia de acordo com a Reivindicação 4, contendo lipidos que compreendem ácido docosa-hexaenóico e ácido docosapentaenóico, em que as referidas células compreendem lipidos neutros contendo triacilgliceróis que consistem de apenas ácidos gordos poli-insaturados.
  6. 6. Células de acordo com as Reivindicações 4 ou 5, em que o lipido neutro contém pelo menos 85% numa base ponderai, preferivelmente 90% numa base ponderai, de triacilgliceróis.
  7. 7. Um género Ulkenia tendo a capacidade para produzir lipidos compreendendo lipidos neutros contendo 30--38% de ácido palmitico, 40-48% de ácido docosa-hexaenóico, 8-13% de ácido docosapentaenóico, 0-1% de ácido icosapentaenóico, 0-0,6% de ácido araquidónico e 10-20% de outros ácidos gordos numa base ponderai do total de ácidos gordos presentes.
  8. 8. Um extracto lipidico obtenível a partir de um microorganismo do género Ulkenia por um método de acordo 3 ΡΕ1785492 com a Reivindicação 1, o referido extracto lipídico compreendendo lipidos neutros contendo 30-38% de ácido pal-mítico, 40-48% de ácido docosa-hexaenóico, 8-13% de ácido docosapentaenóico, 0-1% de ácido icosapentaenóico, 0-0,6% de ácido araquidónico e 10-20% de outros ácidos gordos numa base ponderai do total de ácidos gordos presentes.
  9. 9. Um extracto lipídico de acordo com a Reivindicação 8 contendo lipidos que compreendem ácido docosa-hexaenóico e ácido docosapentaenóico, o referido extracto lipídico compreendendo lipidos neutros contendo triacilgli-ceróis constituídos por apenas ácidos gordos poli-insa-turados.
  10. 10. Um extracto lipídico de acordo com as Reivindicações 8 ou 9 em que o lípido neutro contém pelo menos 85% numa base ponderai, preferivelmente 90% numa base ponderai, de triacilgliceróis.
  11. 11. Um extracto lipídico obtenível a partir de um microorganismo do género Ulkenia contendo lipidos que compreendem ácido docosa-hexaenóico e/ou ácido docosapentaenóico por um método de acordo com a Reivindicação 1, o referido extracto lipídico compreendendo lipidos neutros contendo cerca de 20% de triacilgliceróis consistindo apenas de ácidos gordos poli-insaturados.
  12. 12. Uma preparação de lipidos estruturais obteníveis por tratamento de um extracto lipídico de acordo 4 ΡΕ1785492 com qualquer uma das Reivindicações 8-11 com uma lipase fúngica para converter os ácidos gordos nas posições 1 e 3 em ácidos gordos de cadeia Cs-i2 ·
  13. 13. Um alimento para suplementação de nutriente contendo um extracto lipidico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8-11.
  14. 14. Uso de uma fórmula contendo um extracto lipidico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8-11, num produto alimentar para alimentação de crianças, crianças imaturas ou bebés.
  15. 15. Uso de um extracto lipidico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8-11, como alimento geriátrico, um extracto entérico para promoção da nutrição ou um alimento para mães de aleitamento ou grávidas.
  16. 16. Uso de um extracto lipidico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8-11, ou células de acordo com qualquer uma das Reivindicações 4-6, como alimento para animais, aditivo alimentar para animais ou engodo para zooplâncton a alimentar.
  17. 17. Uso de um microorganismo do género Ulkenia tendo a capacidade para produzir lípidos contendo ácido docosa-hexaenóico e/ou ácido docosapentaenóico, como aditivo alimentar para suplementação de nutriente. 5 ΡΕ1785492
  18. 18. Uso de um extracto lipídico de acordo com qualquer uma das Reivindicações 8-11 como aditivo alimentar para suplementação de nutriente.
  19. 19. Uso de uma preparação de lipidos estruturais de acordo com a Reivindicação 12 como aditivo alimentar para suplementação de nutriente.
  20. 20. Uso de acordo com as Reivindicações 18 ou 19, em que o aditivo alimentar está incluído numa produto alimentar para alimentação de uma mãe de aleitamento ou grávida, um bebé, uma criança imatura, uma criança ou uma pessoa idosa.
  21. 21. Uso de acordo com qualquer uma das Reivindicações 18-20 como agente entérico para a promoção da nutrição.
  22. 22. Uso de acordo com qualquer uma das Reivindicações 17-20 como alimento para animais.
  23. 23. Uso de acordo com a Reivindicação 17 como engodo para zooplâncton a alimentar.
  24. 24. Uso de acordo com a Reivindicação 22, em que o microorganismo do género Ulkenia é usado após secagem ou esterilização.
  25. 25. Células de um microorganismo pertencendo ao 6 ΡΕ1785492 género Ulkenia contendo lípidos contendo ácido docosa--hexaenóico e/ou ácido docosapentaenóico.
  26. 26. Uma estirpe Ulkenia sp. SAM2179 tendo o número de acesso FERM BP-5601 e a capacidade para produzir lipidos contendo ácido docosa-hexaenóico e ácido docosapentaenóico . Lisboa, 29 de Junho de 2010
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