JP4733043B2 - 改変された量の塩化物およびカリウムを使用した微細藻類における高レベルのdhaの産生法 - Google Patents
改変された量の塩化物およびカリウムを使用した微細藻類における高レベルのdhaの産生法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、一般に、培養培地における改変された量の塩化物イオンおよびカリウムイオンを使用した、海産微生物による高度不飽和脂肪酸の産生の方法に関する。より具体的には、本発明は、低い塩化物イオンおよび高いカリウムイオンの環境において培養することを含む非腐食性条件下で、発酵槽において、従属栄養性海産渦鞭毛虫クリプテコジニウム(Crypthecodinium)を含む海産微細藻類を培養することにより、高レベルのドコサヘキサエン酸(DHA)を産生する方法に関する。本発明は、低いpHレベルにおける、海産微生物による、DHAを含む高度不飽和脂肪酸の産生の方法にも関する。
心血管性および炎症性の疾患(即ち、関節炎およびアテローム性動脈硬化症)の減少、抑うつの減少、妊娠の最後の三半期の延長、並びに腫瘍増殖の阻害を含む、ヒトにおける長鎖オメガ-3脂肪酸の増加した食事からの摂取の有益な効果は、よく立証されている。クリプテコジニウム属のものを含む、いくつかの従属栄養性海産微生物は、これらの重要な必須脂肪酸を高レベルに産生することが見出されている(Jiang and Chen,Process Biochemistry 35(2000)1205-1209;Jiang and Chen,Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,(1999)Vol.23,508-513;Vazhappilly and Chen,Journal of the American Oil Chemists Society,(1998)Vol.75,No.3 p393-397;Kyle,米国特許第5,407,957号;米国特許第5,397,591号;米国特許第5,492,938号;および米国特許第5,711,983号)。
塩化ナトリウムは発酵槽の腐食という問題を起こすため、クリプテコジニウムのための培養培地中の塩化ナトリウムレベルを最小化することを試みる中で、本発明者らは、驚くべきことに、約4.5g/L NaCl(2.73g/l塩化物イオンに相当)で得られる収率に類似したDHAの収率を維持しつつ、塩化物イオンの(300ppmまたは0.3g/l塩化物イオンへの)減少を補償するために、培養培地中のナトリウム塩、そして好ましくはカリウム塩を操作することによって、塩化ナトリウムレベルを低下させ得ることを発見した。
本発明は、渦鞭毛藻綱の海産微細藻類の増殖のために使用される高い塩化ナトリウムレベルにより引き起こされる発酵槽の腐食という前述のような問題を解決する。本発明者らは、培養培地中において改変された量の塩化物イオンおよびカリウムイオンを使用することにより、低塩化ナトリウム条件下での渦鞭毛藻綱の海産微細藻類の商業的に実行可能なレベルの増殖およびDHAの産生を可能にする培養培地成分を発見した。より具体的には、本発明者らは、塩化ナトリウムを非腐食性レベルにまで低下させることにより引き起こされるナトリウムの不足が、培養培地中のカリウムレベルを増加させることにより少なくとも部分的に相殺され得ることを発見した。
この実施例は、4.5g/l NaClを含む標準スクリーニング培地(SSM)の調製を記載する。培地を調製するための最初の工程は、表1に示されるように、以下の化合物を蒸留水に添加し、最終的な所望の容量の90%にすることを含む。化合物は、全て、Sigma Aldrich, St. Louis, MOより入手可能である。
1 塩化カルシウム二水和物は244g/molであり28.7%塩化物を含む。
2 ストック溶液を別にオートクレーブ処理し、オートクレーブ後の培地に無菌的に添加する;2週間ごとに新鮮に作成される。
3 ストック溶液を0.2ミクロンのフィルターで濾過滅菌し;暗所で4℃で保管する。オートクレーブ後の培地に無菌的に添加する。
4 ストック溶液を別にオートクレーブ処理する。オートクレーブ後の培地に無菌的に添加する。
この実施例は、1.41g/l NaClを含む1000ppm塩化物イオンスクリーニング培地(SSM)の調製を記載する(塩化カルシウムおよび塩化カリウムと合わせて、およそ1000ppm、1g/l塩化物イオンとなる)。培地を調製するための最初の工程は、表2に示されるように、以下の化合物を脱イオン蒸留水に添加し、最終的な所望の容量の90%にすることを含む。化合物は、全て、Sigma Aldrich, St. Louis, MOより入手可能である。
1 ストック溶液を別にオートクレーブ処理し、オートクレーブ後の培地に無菌的に添加する;2週間ごとに新鮮に作成される。
2 ストック溶液を0.2ミクロンのフィルターで濾過滅菌し;暗所で4℃で保管する。オートクレーブ後の培地に無菌的に添加する。
3 ストック溶液を別にオートクレーブ処理する。オートクレーブ後の培地に無菌的に添加する。
この実施例は、0.211g/l NaClを含む300ppm塩化物イオンスクリーニング培地(SSM)の調製を記載する(塩化カルシウムおよび塩化カリウムと合わせて、0.3g/l塩化物イオンとなる)。培地を調製するための最初の工程は、表3に示されるように、以下の化合物を脱イオン蒸留水に添加し、最終的な所望の容量の90%にすることを含む。化合物は、全て、Sigma Aldrich, St. Louis, MOより入手可能である。
1 ストック溶液を別にオートクレーブ処理し、オートクレーブ後の培地に無菌的に添加する;2週間ごとに新鮮に作成される。
2 ストック溶液を0.2ミクロンのフィルターで濾過滅菌し;暗所で4℃で保管する。オートクレーブ後の培地に無菌的に添加する。
3 ストック溶液を別にオートクレーブ処理する。オートクレーブ後の培地に無菌的に添加する。
この実施例は、pH6.3のSSMにおけるクリプテコジニウム・コーニーの増殖および収穫のための手法を記載する。
この実施例は、先行技術の培地を使用した低いNaClレベルにおけるC.コーニーの増殖およびDHAの産生を記載する。
1 塩化ナトリウムからの塩化物イオンの量(0.20g/l)のみを反映している。実施例1〜3参照。
この実施例は、実施例1に記載された培養培地において4.5g/l NaClで達成されたDHAの収率を記載する。
この実施例は、硫酸カリウムおよび硫酸ナトリウムの形態の様々な濃度のカリウムイオンおよびナトリウムイオンを使用した低塩化物培地における増強されたC.コーニーの増殖およびDHAの産生を記載する。
1 0.45g/l塩化ナトリウムにより添加されたナトリウムイオンまたは0.18g/lナトリウムイオンを含む。
この実施例は、ある範囲(0.32g/l、0.64g/l、0.96g/l、1.28g/l、1.60g/l、および1.9g/l)の硫酸カリウム、並びに4.9g/lおよび9.8g/lの硫酸ナトリウムを含有している培地を使用した、C.コーニーの増殖およびDHAの産生の増強を証明する。
1 0.45g/l塩化ナトリウムにより添加されたナトリウムイオンまたは0.18g/lナトリウムイオンを含む。
以下の実施例は、pH5における増殖に適応した株を得るためのC.コーニーの継代培養を記載する。
以下の実施例は、2730ppm塩化物イオン培地においてpH6.3で培養されたC.コーニーT-HF株、および1000ppm塩化物イオン培地においてpH5で培養された低pH株からのDHA収率の比較を記載する。
以下の実施例は、2730ppm塩化物イオン培地においてpH4.5で増殖するようC.コーニーT-HF株を適応させる努力を記載する。
以下の実施例は、カリウム濃度を操作することにより、pH4.5におけるC.コーニーの増殖およびDHA収率のための条件を画定する努力を記載する。
この実施例は、pH6.3、1.0g/l塩化物イオンにおいて、実施例12に記載されたpH4.5株およびT-HF株を使用して得られたDHAの収率を比較する時間経過実験を記載する。
ずれ時間を減少させ、pH4.5における7日間DHA収率を、実施例1に記載されたような培地でpH6.3で培養されたC.コーニーに関して得られた収率と比較可能なものにするため、実施例10に記載された技術を使用して、上記実施例13に記載されたイオン濃度のさらなる最適化、およびpH5に適応したC.コーニーT-HF株のさらなる継代培養が、実施される。
Claims (29)
- 培養培地中でクリプテコジニウム(Crypthecodinium)属の従属栄養性微細藻類を培養することによりドコサヘキサエン酸(DHA)を産生する方法であって、培地が、
(a)2g/L以下の濃度の塩化物イオン;および
(b)0.25g/L〜10g/Lの濃度のカリウムイオンを含み、
微細藻類が、細胞109個当たり少なくとも0.04gのDHAを産生する、方法。 - 微細藻類がクリプテコジニウム・コーニー(Crypthecodinium cohnii)種のものである、請求項1記載の方法。
- 塩化物イオンの濃度が1.0g/L以下である、請求項1記載の方法。
- 塩化物イオンの濃度が0.3g/L以下である、請求項1記載の方法。
- カリウムイオンの濃度が0.4g/L〜10g/Lである、請求項1記載の方法。
- カリウムイオンの濃度が0.8g/L〜10g/Lである、請求項1記載の方法。
- カリウムイオンの供給源が硫酸カリウムである、請求項1記載の方法。
- 培地が1g/L〜8g/Lの濃度のナトリウムイオンをさらに含む、請求項1記載の方法。
- ナトリウムイオンの濃度が1.5g/L〜5g/Lである、請求項8記載の方法。
- ナトリウムイオンの供給源が硫酸ナトリウムである、請求項8記載の方法。
- カリウムイオンの濃度が0.8g/Lであり、かつナトリウムイオンの濃度が3.2g/Lである、請求項8記載の方法。
- 培養培地中でクリプテコジニウム(Crypthecodinium)属の従属栄養性微細藻類を培養する工程を含むバイオマスの製造方法であって、培地が、
(a)2g/L以下の濃度の塩化物イオン;および
(b)0.25g/L〜10g/Lの濃度のカリウムイオンを含み、
微細藻類が、細胞109個当たり少なくとも0.04gのDHAを産生する、バイオマスの製造方法。 - 微細藻類が細胞109個当たり少なくとも0.10gのDHAを産生する、請求項1記載の方法。
- 微細藻類が細胞109個当たり少なくとも0.20gのDHAを産生する、請求項1記載の方法。
- 微細藻類からDHA含有脂質を回収することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 培養培地中でクリプテコジニウム属の従属栄養性微細藻類を培養することによりドコサヘキサエン酸(DHA)を産生する方法であって、培地が、
(a)2g/L以下の濃度の塩化物イオン;
(b)0.25g/L〜10g/Lの濃度のカリウムイオン;および
(c)27:1のナトリウム:カリウムの重量比以下の比のナトリウムイオンを含み、
微細藻類が、細胞109個当たり少なくとも0.04gのDHAを産生する、方法。 - 微細藻類がクリプテコジニウム・コーニー種のものである、請求項16記載の方法。
- カリウムイオンの供給源が硫酸カリウムである、請求項16記載の方法。
- ナトリウムイオンの供給源が硫酸ナトリウムである、請求項16記載の方法。
- 塩化物イオンの濃度が1.0g/L以下である、請求項16記載の方法。
- 塩化物イオンの濃度が0.3g/L以下である、請求項16記載の方法。
- カリウムイオンの濃度が0.4g/L〜10g/Lである、請求項16記載の方法。
- カリウムイオンの濃度が0.8g/L〜10g/Lである、請求項16記載の方法。
- ナトリウム:カリウム比が15:1重量比以下である、請求項16記載の方法。
- カリウムイオンの濃度が0.8g/Lであり、かつナトリウム:カリウム比が4:1重量比である、請求項16記載の方法。
- 培養培地中でクリプテコジニウム属の従属栄養性微細藻類を培養する工程を含むバイオマスの製造方法であって、培地が、
(a)2g/L以下の濃度の塩化物イオン;
(b)0.25g/L〜10g/Lの濃度のカリウムイオン;および
(c)27:1のナトリウム:カリウムの重量比以下の比のナトリウムイオンを含み、
微細藻類が、細胞109個当たり少なくとも0.04gのDHAを産生する、バイオマスの製造方法。 - 微細藻類が細胞109個当たり少なくとも0.10gのDHAを産生する、請求項16記載の方法。
- 微細藻類が細胞109個当たり少なくとも0.20gのDHAを産生する、請求項16記載の方法。
- 微細藻類からDHA含有脂質を回収することをさらに含む、請求項16記載の方法。
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