CN103627640B - 一种培养裂殖壶菌的低氯培养基及用该培养基产生dha的方法 - Google Patents

一种培养裂殖壶菌的低氯培养基及用该培养基产生dha的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及海洋微生物培养技术，具体涉及一种培养裂殖壶菌的培养基及用该培养基生产二十二碳六烯酸(DHA)的方法。本发明中的培养基是一种低氯离子浓度的培养基，其使培养基中氯离子浓度低于2g/L，而钾离子浓度高于0.1g/L，钠离子浓度在１‑20g/L之间。使用本发明中的培养基能够二十二碳六烯酸(DHA)的产量基本持平或更高，而且降低了培养基对发酵、榨油、萃取等一系列生产设备的腐蚀程度，延长设备使用寿命，保证生产安全，并且能够减少生产过程中排放污水中氯离子浓度，进而降低了生产成本。

Description

一种培养裂殖壶菌的低氯培养基及用该培养基产生DHA的 方法
技术领域
本发明涉及海洋微生物培养技术领域，具体涉及一种培养裂殖壶菌的低氯培养基，以及用该培养基产生DHA的方法。
技术背景
近年来，很多研究已充分证实长链omega-3脂肪酸对人体健康具有有益效果，所述有益效果包括降低血液中甘油三酯和胆固醇含量，具有降血压，预防心血管疾病的功效，抑制血小板凝聚，防止血栓组成和中风，预防炎症和哮喘，降低血糖，预防糖尿病，预防乳腺癌和直肠癌，促进脑细胞发育，提高脑细胞活力，提高记忆力，预防视力减退，和防止老年痴呆的作用。已发现几种异养的海洋微生物能够产生高水平的这些重要的必需脂肪酸，所述海洋微生物包括破囊壶菌科的海洋微生物(Yokochi，1998；Ganuza，2008；Unagul，2006)。
裂殖壶菌因其生长速度快、易于培养、细胞内脂肪酸和DHA(C22：6n-3)含量高，是目前进行工业生产的最理想的生物体之一(Ashford，2000)，所述的DHA是最重要的长链omega-3脂肪酸之一。
目前培养裂殖壶菌生产DHA，或者直接使用海水作为培养基成分，或者模拟海水的组分来配置培养基。实际上，在已发表的关于裂殖壶菌的研究中大多数培养是在盐度大于海水大约20％-100％的培养基中进行的。Yokochi(Yokochi，1998)等人对培养基盐度做了研究，表明盐度在海水盐度的50％-200％范围内合适，张学成等人(专利申请号为200410075426)的研究则认为，培养基的盐度应该在海水盐度的20％-80％，赵肖为等人(专利申请号为200610028869)则发现培养基的盐度在海水盐度的50％-80％最佳。
海水中的天然氯浓度为19353ppm或19.35g/L左右(Horne，1969)，但是较高的氯离子浓度对不锈钢发酵罐或与发酵液接触的储罐等生产设备具有严重腐蚀作用。例如，在用于制造发酵罐的两种普通等级的不锈钢中，当氯离子浓度超过300ppm(0.3g/L氯离子)时304-不锈钢是容易腐蚀的，且当氯离子浓度超过1000ppm(1g/L氯离子)时316-不锈钢也是容易腐蚀的。虽然也存在其他等级的对氯腐蚀更有抵抗力的不锈钢材料，但它们都非常昂贵且通常只用于生产非常贵重的化合物的发酵设备。
理论上，降低培养基中的氯离子浓度就可以使不锈钢发酵罐或其他接触发酵液的储罐等设备的腐蚀实现最小化，但是实际上是很难实现的一个过程。从海洋中筛选出的微生物，如裂殖壶菌在培养基中生长时，需要一定的盐度，主要就是氯离子，优选如氯化钠，以保持生长和脂质产生。既要通过裂殖壶菌产生高产量DHA，同时要抑制或防止在商业上最理想的生产容器，不锈钢发酵罐等设备的腐蚀是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明提供了一种培养裂殖壶菌的低氯培养基，及用该培养基生产DHA的方法，所述培养基中的氯离子浓度为小于或等于0.3g/L，钾离子浓度高于0.1g/L，钠离子浓度为1-20g/L。
本发明的培养基，优选使氯离子浓度降低到1000ppm以下，更优选降低到300ppm以下。
本发明培养基中的钾盐可以是硫酸钾、碳酸钾、硝酸钾、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或多种的组合；优选的是硫酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或多种。培养基中钾离子浓度优选的为0.1g/L-8g/L。
本发明培养基中的钠离子由非氯化物钠盐提供，其可以是硫酸钠、碳酸钠、硝酸钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或多种的组合，优选的是硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或多种的组合。培养基中总钠离子浓度优选为4g/L-10g/L。
本发明的培养基中还包括碳源，碳源可以由葡萄糖、糖蜜、果糖、甘油、乳糖、麦芽糖、蔗糖中的一种或多种的组合提供，优选的由葡萄糖和甘油提供，更优选的由葡萄糖提供。碳源浓度为相当于10g/L-150g/L的葡萄糖所提供的能量，优选相当于30g/L-120g/L葡萄糖所提供的能量。
本发明的培养基中还包括氮源，氮源可以由蛋白胨、酵母膏、玉米浆、谷氨酸钠、硫酸铵、乙酸铵、硝酸钾中的一种或多种的组合提供，优选的由酵母膏、谷氨酸钠和硫酸铵提供。
本发明的培养基中还包括微量元素，微量元素可以由硫辛酸、叶酸、生物素、维生素B1、维生素B6、维生素B12中的一种或者多种组合提供，培养基中微量元素的含量为0.00001g/L-0.05g/L。
本发明的培养基中还可以包括氨基酸，所述的氨基酸可以是天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸中的一种或者多种，培养基中氨基酸的含量为0.001g/L-0.1g/L。
本发明还提供一种用上述的低氯培养基培养裂殖壶菌生产DHA的方法，其步骤包括：将裂殖弧菌接种到装有上述低氯培养基的容器中，接种量为5％-10％、于温度20-30℃、转速200-320r/min、pH＝6.5的条件下，恒温摇床培养3-5天。
优选的接种量8％、培养温度28℃、转速220r/min。
采用本发明中的低氯培养基，与以前的“高氯”培养基相比，没有对生物量、总脂肪含量或DHA含量的有不良影响。最终裂殖壶菌产生的DHA产量甚至略高于对照中使用高氯培养基时的产量。同时还降低了培养基对发酵、榨油、萃取等一系列生产设备的腐蚀程度，延长设备使用寿命，保证生产安全，并且能够减少生产过程中排放污水中氯离子浓度，进而降低了生产成本。
具体实施方式
实施例1：裂殖壶菌低氯培养基的配置
按照下表1中的配方配制氯离子总浓度为10.35g/L的对照培养基(代号为“0”)、氯离子总浓度为1g/L的低氯培养基(代号为“1”)和氯离子总浓度为0.30g/L的低氯培养基(代号为“2”)。所述代号为“0”的对照培养基中的氯离子来源包括氯化钠(其中氯离子浓度为10.32g/L)和氯化钙(其中氯离子浓度为0.03g/L)；代号为“1”的低氯培养基中的氯离子来源包括氯化钠(其中氯离子浓度为0.97g/L)和氯化钙(其中氯离子浓度为0.03g/L)；代号为“2”的培养基中氯离子来源包括氯化钠(其中氯离子浓度为0.27g/L)和氯化钙(其中氯离子浓度为0.03g/L)。另外，低氯培养基“1”和“2”中还补加了非氯化物的钾盐和钠盐，培养基中的最终钾离子和钠离子浓度分别为0.59g/L和7.5g/L。配制的培养基经过高温高压灭菌。
表1培养基的组成
注：1.单独灭菌，温度115℃，时间20-30分钟。
2.组分经过0.2μm过滤器过滤除菌；在4℃条件下黑暗储存。以无菌方式加入灭菌后的培养基中。
实施例2：低氯培养基摇瓶培养裂殖壶菌(Schizochytrium)产生DHA
1)接种培养
将裂殖壶菌(Schizochytrium)接种到装有实施例1中的“0”、“1”、“2”号无菌培养基的250mL三角瓶中，接种量为5％-10％、温度28℃、转速200-220r/min、pH＝6.5，于恒温培养室摇床上培养3-5天。
2)指标测试(生物量、总脂肪含量及DHA含量)
(1)生物量测试：取一定体积的干菌体，冷冻干燥后测试菌体的质量；
(2)总脂肪测试：采用浓HCl酸解法进行菌体破壁，使用脂肪测定仪，用无水乙醚或正己烷，将可溶物抽提出来，除去溶剂即得其含油量；
(3)DHA含量测试：采用气相色谱的方法，测试油脂中DHA的含量。
测试结果如表2所示，与对照组相比，生物量、总脂肪含量及DHA含量几乎没有受到影响。
表2生物量、总脂肪及脂肪酸组成测试结果
实验例1：氨基酸对裂殖弧菌产生DHA能力的影响
1)配制培养基
按照下表3中的配方配制培养基1-3号。所述的培养基中含氯离子浓度为0.3g/L(300ppm)、总钠离子浓度为7.5g/L、钾离子总浓度1.04g/L。对培养基进行高温高压灭菌。
表3培养基的组成
注：1单独灭菌，温度115℃，时间20-30分钟。
2组分经过0.2μm过滤器过滤除菌；在4℃条件下黑暗储存。以无菌方式加入灭菌后的培养基中。
2)接种培养
将裂殖弧菌接种到装有1-3号无菌培养基的250mL三角瓶中，接种量为5％-10％、温度28℃、转速200-220r/min、pH＝6.5，于恒温培养室摇床上培养3-5天。
3)指标测试(生物量、总脂肪含量及DHA含量)
(1)生物量测试：取一定体积的干菌体，冷冻干燥后测试菌体的质量；
(2)总脂肪测试：采用浓HCl酸解方法进行菌体破壁，使用脂肪测定仪，用无水乙醚或正己烷，将可溶物抽提出来，除去溶剂即得其含油量；
(3)DHA含量测试：采用气相色谱的方法，测试油脂中DHA的含量。
测试结果如表4所示，本发明在保持培养基低氯(0.3g/L氯离子)的条件下，钠离子浓度为7.50g/L，钾离子浓度为1.04g/L，添加天冬氨酸及赖氨酸中的任一组分或两种组分，添加量为0.01-0.03g/Ｌ对裂殖壶菌产生DHA有益。
表4生物量、总脂肪及脂肪酸组成测试结果
实验例2：微量元素对裂殖壶菌产生DHA能力的影响
1)配制培养基
按照下表5中的配方配制培养基1-3号，并将培养基进行高温高压灭菌。所述的培养基中含氯离子浓度为0.3g/L(300ppm)培养基中，总钠离子浓度为7.5g/L，总钾离子总浓度1.04g/L，天冬氨酸0.03g/L。
表5培养基的组成
注：1单独灭菌，温度115℃，时间20-30分钟。
2组分经过0.2μm过滤器过滤除菌；在4℃条件下黑暗储存。以无菌方式加入灭菌后的培养基中。
2)接种培养
将裂殖弧菌接种到装有1-3号无菌培养基的250mL三角瓶中，接种量为5％-10％、温度28℃、转速200-220r/min、pH＝6.5，于恒温培养室摇床上培养3-5天。
3)指标测试(生物量、总脂肪含量及DHA含量)
(1)生物量测试：取一定体积的干菌体，冷冻干燥后测试菌体的质量；
(2)总脂肪测试：采用浓HCl酸解方法进行菌体破壁，使用脂肪测定仪，用无水乙醚或正己烷，将可溶物抽提出来，除去溶剂即得其含油量；
(3)DHA含量测试：采用气相色谱的方法，测试油脂中DHA的含量。
测试结果如表6所示，本发明在保持培养基低氯(0.3g/L氯离子)的条件下，钠离子浓度为7.50g/L，钾离子浓度为1.04g/L，天冬氨酸添加量为0.3g/L，适当增加微量元素的添加量，对裂殖壶菌产生DHA有益，添加量为0.00001-0.02g/L。
表6生物量、总脂肪及脂肪酸组成测试结果
以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都在要求保护的本发明范围内。

Claims (6)

1.一种培养裂殖壶菌的低氯培养基，其特征在于：所述培养基中还包括碳源、氮源、微量元素和氨基酸，其中碳源含量相当于10g/L-150g/L的葡萄糖所提供的能量，微量元素的含量为0.00001g/L-0.02g/L，氨基酸的含量为0.01g/L-0.03g/L，所述培养基中的氯离子浓度为小于或等于0.3g/L，钾离子浓度为1.04-8g/L，钠离子浓度为7.5-20g/L，所述氨基酸是天冬氨酸和赖氨酸中的一种或者多种；所述微量元素由生物素、维生素B6、维生素B12中的一种或者多种提供。
2.根据权利要求1所述的低氯培养基，其特征在于：所述培养基中的钾离子由非氯化物钾盐提供，所述的非氯化物钾盐是碳酸钾、硝酸钾、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的低氯培养基，其特征在于：所述培养基中的钠离子由非氯化物钠盐提供，所述的非氯化物钠盐是碳酸钠、硝酸钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的低氯培养基，其特征在于：所述碳源由葡萄糖、糖蜜、果糖、甘油、乳糖、麦芽糖、蔗糖中的一种或多种提供，碳源含量相当于30g/L-120g/L葡萄糖所提供的能量。
5.根据权利要求1所述的低氯培养基，其特征在于：所述氮源由蛋白胨、酵母膏、玉米浆、谷氨酸钠、硫酸铵、乙酸铵、硝酸钾中的一种或多种提供。
6.一种用权利要求1-5中所述的低氯培养基培养裂殖壶菌生产DHA的方法，其步骤包括：将裂殖弧菌接种到装有上述低氯培养基的容器中，接种量为5％-10％、于温度20-30℃、转速200-320r/min、pH＝6.5的条件下，恒温摇床培养3-5天。
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