CN103773687B - 一种微藻的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微藻的培养方法。该方法包括：（1）将原始微藻种子液在自养生长的条件下，采用逐级提高pH值的方式进行驯化培养，初始pH为8.0～9.0，提高2～8次，每次pH提高0.5～2.0，每提高一次在相同条件下培养24～96h，驯化培养至pH为11.0～12.0，获得耐受高pH的藻液；（2）将驯化后的藻液接入pH为11.0～12.0的异养培养基中培养10～24h，然后将培养液的pH调为7.0～8.0进一步培养；（3）微藻生长处于稳定期后，结束培养，收获微藻细胞。该方法可以有效抑制微藻培养时的杂菌生长，不需添加抗生素，对微藻的品质没有不良的影响，安全可靠，价格低廉。
Description
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及一种抑制杂菌的微藻培养方法。
背景技术
微藻指微型藻类，是一种广泛分布于陆地、海洋、河流的微生物，细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素等，使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域都有很好的开发前景。很多微藻不但可进行光能自养生长，同时在无光照条件下，它们也能像细菌、酵母一样利用有机物进行异养生长。
微藻能够利用自然界中的光能和无机碳源进行自养生长，自养生长存在着生长速率低、最终生物量低、生长周期长的缺点。同时微藻在不需要光照的条件下能够利用有机物作为碳源和氮源的营养方式进行异养生长，异养生长能够克服微藻自养生长存在的生长速率低、生物量低和生长周期长的缺点，具有生长速率快、最终生物量高的优点，能够缩短周期，但是由于微藻异养生长是利用有机物作为营养方式，营养比较丰富，所以在生长过程中不像自养生长那样能够抑制细菌、真菌等污染物的生长，因此微藻异养培养方式容易造成原有杂菌的生长，引起微藻品质的下降，严重时会导致培养的失败。因此，如何防止微藻异养培养时杂菌污染的问题一直是微藻异养生长的一个瓶颈问题，近年来已经有了关于这方面的一些报道。
CN200810112998.9公开了一种从自养到异养两步培养小球藻生产生物柴油的方法，该法在异养发酵阶段为了防止杂菌的生长，在培养液中添加氯霉素或单氟乙酸钠抑菌剂，这种方法虽然能够抑制异养培养中杂菌的生长，但抑菌剂的加入在一定程度上影响微藻生长速度和微藻的品质，同时也增加了成本。
高大文等在《pH值对白腐真菌液体培养基抑制杂菌效果的影响研究》（高大文,文湘华,周晓燕等. pH值对白腐真菌液体培养基抑制杂菌效果的影响研究[J]. 环境科学,2005,26(6)）一文中表明低pH值对细菌和酵母菌的具有明显的抑制作用，但是低pH值下微藻会死亡。
CN200910089608.5公开了一种在微藻大规模培养中有效治理敌害生物的方法，该法首先确定正在培养的微藻污染的敌害生物种类，以及所述敌害生物种类的耐受酸碱程度，然后根据所述敌害生物的不同耐受酸碱程度对微藻培养体系的pH值进行调节，当确定有效杀死或抑制敌害生物后，再将pH值调回适合所述藻类正常生长的pH值。该法根据敌害生物的不同耐受酸碱程度对微藻培养体系的pH值进行调节，调节pH值的目的是杀死敌害生物，并不是为了获得耐受性的微藻；并且有些藻类的耐受性并不如敌害生物强，在杀死敌害生物的同时，微藻的生长也受到了很大的影响，对于一些耐受力不强的藻种，调节到适宜的pH值后可能生长很难恢复，影响了微藻的产量。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种微藻的培养方法。该方法可以有效抑制微藻培养时的杂菌生长，不需添加抗生素，对微藻的品质没有不良的影响，安全可靠，价格低廉。
本发明微藻培养方法包括如下内容：（1）将原始微藻种子液在自养生长的条件下，采用逐级提高pH值的方式进行驯化培养，初始pH为8.0～9.0，提高次数为2～8次，每次pH提高0.5～2.0，每提高一次在相同条件下培养24～96h，驯化培养至pH为11.0～12.0，获得耐受高pH的藻液；（2）将驯化后的藻液接入pH为11.0～12.0的异养培养基中培养10～24h，然后将培养液的pH调为7.0～8.0进一步培养；（3）微藻生长处于稳定期后，结束培养，收获微藻细胞。
本发明方法中，逐级提高pH的次数越多，微藻的适应性就更强，驯化培养获得的微藻细胞的耐受高pH的能力就越强，但是提高的次数越密集，培养周期就越长，因此，pH提高次数优选为2～5次。
本发明方法中，所述的微藻为小球藻、葡萄藻、小环藻或雨生红球藻等淡水藻。自养培养基采用本领域技术人员所熟知的SE培养基或者BG-11培养基。采用的异养培养基配方如下：葡萄糖30g/L，KNO3 9.28g/L，KH2PO4 1.4g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，CaCl2储液17mL/L，FeSO4储液8mL/L，微量元素1mL/L，其中CaCl2储液为将6.35g CaCl2·2H2O溶于1L蒸馏水中，FeSO4储液为将2.49g FeSO4·7H2O和25g EDTA溶于1L蒸馏水中，微量元素为将H3BO3 11.42g、ZnSO4·7H2O 8.82g、MnCl2·H2O 1.42g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.87g、CuSO4·5H2O1.57g、 Co(NO3)2·6H2O 0.49g溶于1L蒸馏水中。
本发明方法中，步骤（1）所述的驯化培养是将微藻种子液按1:5～1:10的体积比接入装有新鲜自养培养基的摇瓶中培养，用氢氧化钠调节pH，培养在光照振荡恒温摇床中进行，培养温度为20～35℃，光照强度为1000～10000lux，摇床转速为100～200rpm。
本发明方法中，步骤（2）所述的异养培养是将获得的耐受高pH的藻液按1:5～1:10的体积比接入发酵罐中进行培养，培养液pH为11.0～12.0，通气量为1～5L/(L·min)，在此pH值下微藻能够正常生长，酵母菌、细菌和真菌等杂菌的生长受到了抑制，培养10～24h后，微藻生长处于足够的优势。
本发明方法中，步骤（2）采用流加稀酸或者通入二氧化碳气体的方式来调节培养液pH值为7.0～8.0，培养48～120h。培养过程中，通过血球计数法获得微藻生物量的值。
本发明方法中，微藻的生长到达了稳定期，结束培养。可以采用离心、絮凝或气浮等方法收集微藻细胞。
本发明的微藻培养方法，具有以下优点：（1）对原始微藻种子液采用逐级提高pH的方式来驯化获得耐受高pH的藻液，避免了培养初期的高pH对藻液本身生长的抑制作用；（2）经过了耐受高pH的自养培养，可以有效的去除杂菌，达到纯化原始种子液的目的，再通过异养培养进行增殖，省略了原始藻液的分离纯化步骤，能够有效地避免和杀死杂菌；（3）本方法不需要添加抗生素，对微藻的品质没有不良影响，安全可靠，简单快捷，成本低廉。
具体实施方式
实施例1
将实验室保藏的小球藻液以1:9的体积比接入装有200mL SE培养基的500mL摇瓶中进行自养培养，培养在光照振荡恒温摇床中进行，培养基的初始pH用氢氧化钠调节到8.0，摇床转速为120rpm，培养温度为25℃，光照强度为3000lux；逐级提高pH值5次，每次pH提高0.6，每提高一次在相同条件下培养36h，驯化培养至pH为11.0，获得耐受高pH的藻液。经过逐级驯化培养后，一部分不耐受高pH的微藻已经死亡，继续生长的微藻为可耐受高pH的微藻，将其作为种子液，接入装有异养培养基的15L发酵罐中进行异养培养，接种比例为体积比1:9，发酵体积为10L，培养初期pH为11.0，通气量为2L/(L·min)，培养16h后，小球藻生长得到了足够的优势，镜检几乎无杂菌。此时，采用流加盐酸的方式将培养液的pH值调为大约7.5，在此pH下维持小球藻继续生长，其余条件不变，培养84h后，小球藻生长达到稳定期，结束培养。表1为异养培养的不同阶段所测得的杂菌数目和小球藻生物量。
表1 不同阶段的杂菌数目和小球藻生物量
| 时间（h） | 杂菌数目(个/mL) | 小球藻生物量(个/mL) |
| 4 | 1.37×10<sup>6</sup> | 0.53×10<sup>7</sup> |
| 8 | 1.05×10<sup>5</sup> | 1.07×10<sup>7</sup> |
| 16 | 无杂菌 | 2.45×10<sup>7</sup> |
| 20 | 无杂菌 | 4.89×10<sup>7</sup> |
| 48 | 无杂菌 | 15.78×10<sup>7</sup> |
| 72 | 无杂菌 | 30.12×10<sup>7</sup> |
| 84 | 无杂菌 | 34.12×10<sup>7</sup> |
| 90 | 无杂菌 | 33.92×10<sup>7</sup> |
从表1可以看出，由于异养培养的小球藻种子液经过了自养驯化培养，可耐受高pH值，异养培养16h，小球藻液基本能维持正常生长，同时生长的杂菌也基本得到了抑制。培养16h 后，将pH值调至7.5，进入快速增殖阶段。培养84h，小球藻生长达到稳定期，几乎无杂菌生长，生物量34.12×107个/mL。
实施例2
将实验室保藏的葡萄藻液以1:6的体积比接入装有200mL BG-11培养基的500mL摇瓶中进行自养培养，培养在光照振荡恒温摇床中进行，培养基的初始pH用氢氧化钠调节到9.0，摇床转速为150rpm，培养温度为30℃，光照强度为3000lux；逐级提高pH值2次，每次pH提高 1.5，每提高一次在相同条件下培养60h，驯化培养至pH为12.00，获得耐受高pH的藻液。经过逐级驯化培养后，一部分不耐受高pH的微藻已经死亡，继续生长的微藻为可耐受高pH的微藻，将其作为种子液，接入装有异养培养基的15L发酵罐中进行异养培养，接种比例为体积比1:6，发酵体积为10L，培养初期的pH为12.0，通气量为4L/(L·min)，培养12h后，葡萄藻生长得到了足够的优势，镜检几乎无杂菌。此时，采用流加盐酸的方式将培养液的pH值调为大约7.5，在此pH下维持葡萄藻继续生长，其余条件不变，培养84h后，葡萄藻生长达到稳定期，结束培养。表2为异养培养的不同阶段所测得的杂菌数目和葡萄藻生物量。
表2 不同阶段的杂菌数目和葡萄藻生物量
| 时间（h） | 杂菌数目(个/mL) | 葡萄藻生物量(个/mL) |
| 4 | 1.01×10<sup>6</sup> | 0.48×10<sup>7</sup> |
| 8 | 0.79×10<sup>5</sup> | 0.89×10<sup>7</sup> |
| 12 | 无杂菌 | 1.35×10<sup>7</sup> |
| 20 | 无杂菌 | 3.79×10<sup>7</sup> |
| 48 | 无杂菌 | 12.38×10<sup>7</sup> |
| 72 | 无杂菌 | 25.02×10<sup>7</sup> |
| 84 | 无杂菌 | 29.22×10<sup>7</sup> |
| 88 | 无杂菌 | 28.98×10<sup>7</sup> |
从表2可以看出，由于异养培养的葡萄藻种子液经过了自养驯化培养，可耐受高pH值，异养培养12h，生长的杂菌也基本得到了抑制，藻液几乎无杂菌污染，并且能维持正常生长。培养12h 后，将pH值调至7.5，进入快速增殖阶段。培养84h，小球藻生长达到稳定期，几乎无杂菌生长，生物量29.22×107个/mL。
比较例1
将实验室保藏的小球藻液不进行pH的自养驯化培养，直接以1:9的比例接入装有异养培养基的15L发酵罐中进行异养培养，发酵体积为10L，控制pH为最适合藻种生长的7.0～8.0之间，通气量为2L/(L·min)，培养72h后杂菌开始占优势，结束培养。表3为不进行pH自养驯化培养时，不同培养阶段的杂菌数目和小球藻生物量。
表3 不同培养阶段的杂菌数目和小球藻生物量
| 时间（h） | 杂菌数目(个/mL) | 小球藻生物量(个/mL) |
| 4 | 1.86×10<sup>6</sup> | 0.83×10<sup>7</sup> |
| 8 | 2.36×10<sup>6</sup> | 1.56×10<sup>7</sup> |
| 16 | 5.42×10<sup>6</sup> | 1.96×10<sup>7</sup> |
| 20 | 8.13×10<sup>6</sup> | 2.12×10<sup>7</sup> |
| 48 | 2.37×10<sup>7</sup> | 2.39×10<sup>7</sup> |
| 72 | 3.15×10<sup>7</sup> | 2.34×10<sup>7</sup> |
从表3结果可以看出，在pH为7.0～8.0下异养培养，虽然开始8h内小球藻的生长较高pH值时较为迅速，但是8h后，由于杂菌的生长，微藻的生长变得缓慢；48h后，由于杂菌大量生长，小球藻生长基本停止，杂菌仍在大量生长；72h后，杂菌生长占优势，小球藻品质受到了影响，结束培养。
比较例2
将实验室保藏的小球藻种不进行pH的自养驯化培养，直接以1:9的比例接入装有异养培养基的15L发酵罐中进行异养培养，发酵体积为10L。为了抑制杂菌的生长，控制初始pH为11.0，通气量为2L/(L·min)，培养16h后，杂菌和小球藻的生长都受到了抑制。此时，采用流加盐酸的方式将培养液的pH值调为大约7.5，在此pH下维持小球藻继续生长，其余条件不变，表4为异养培养的不同阶段的生长情况。
表4不同阶段的杂菌数目和小球藻生物量
| 时间（h） | 杂菌数目(个/mL) | 小球藻生物量(个/mL) |
| 4 | 1.23×10<sup>6</sup> | 2.13×10<sup>6</sup> |
| 8 | 1.05×10<sup>5</sup> | 1.21×10<sup>6</sup> |
| 16 | 无杂菌 | 1.11×10<sup>6</sup> |
| 24 | 无杂菌 | 1.76×10<sup>6</sup> |
| 48 | 无杂菌 | 2.46×10<sup>6</sup> |
| 72 | 无杂菌 | 1.85×10<sup>7</sup> |
| 96 | 无杂菌 | 1.89×10<sup>7</sup> |
从表4可以看出，采用初始pH为11.0的异养培养的方式能够使杂菌的生长得到抑制，杂菌死亡，但是同时微藻的生长也受到了抑制，部分死亡，即使培养16h后恢复pH为7.5，微藻生长缓慢，产量较低。
Claims (8)
1.一种微藻的培养方法，包括以下步骤：（1）将原始微藻种子液在自养生长的条件下，采用逐级提高pH值的方式进行驯化培养，初始pH为8.0～9.0，提高次数为2～8次，每次pH提高0.5～2.0，每提高一次在相同条件下培养24～96h，驯化培养至pH为11.0～12.0，获得耐受高pH的藻液，所述的微藻为小球藻、葡萄藻、小环藻或雨生红球藻；（2）将驯化后的藻液接入pH为11.0～12.0的异养培养基中培养10～24h，然后将培养液的pH调为7.0～8.0进一步培养；（3）微藻生长处于稳定期后，结束培养，收获微藻细胞。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：pH提高次数为2～5次。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：自养培养基采用SE培养基或者BG11培养基。
4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：采用的异养培养基配方如下：葡萄糖30g/L，KNO3 9.28g/L，KH2PO4 1.4g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，CaCl2储液17mL/L，FeSO4储液8mL/L，微量元素1mL/L，其中CaCl2储液为将6.35g CaCl2·2H2O溶于1L蒸馏水中，FeSO4储液为将2.49g FeSO4·7H2O和25g EDTA溶于1L蒸馏水中，微量元素为将H3BO3 11.42g、ZnSO4·7H2O 8.82g、MnCl2·H2O 1.42g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.87g、CuSO4·5H2O 1.57g、 Co(NO3)2·6H2O 0.49g溶于1L蒸馏水中。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于： 步骤（1）所述的驯化培养是将微藻种子液按1:5～1:10的体积比接入装有新鲜自养培养基的摇瓶中培养，用氢氧化钠调节pH，培养在光照振荡恒温摇床中进行，培养温度为20～35℃，光照强度为1000～10000lux，摇床转速为100～200rpm。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的异养培养是将获得的耐受高pH的藻液按1:5～1:10的体积比接入发酵罐中进行培养，培养液pH为11.0～12.0，通气量为1～5L/(L·min)。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）采用流加稀酸的方式或者通入二氧化碳气体的方式来调节培养液的pH为7.0～8.0，培养48～120h。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：采用离心、絮凝或气浮方法收集微藻细胞。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |