CN110923261B - 一种提高酿酒酵母细胞膜脂肪酸c20:0和/或c22:0含量的方法 - Google Patents

一种提高酿酒酵母细胞膜脂肪酸c20:0和/或c22:0含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强酿酒酵母抗高渗胁迫能力的方法，属于生物工程技术领域。利用质粒pY13过表达基因ELO2，构建过表达菌株BY4741/pY13‑ELO2，使得菌株抗高渗胁迫能力增强，具体表现为胁迫条件下，过表达菌株生物量提高29％，存活率提高22.1％；正常条件下，细胞膜上C20:0,C22:0和C24:0的脂肪酸含量分别提高了52.3％、94.1％和14.4％。上述结果表明过表达基因ELO2可以提高酵母菌株在高渗胁迫条件下的生存能力。

Description

一种提高酿酒酵母细胞膜脂肪酸C20:0和/或C22:0含量的 方法
技术领域
本发明涉及一种增强酿酒酵母抗高渗胁迫能力的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
在工业发酵过程中，微生物菌体溶度和生长速率会受到各种胁迫(如高渗、高糖、温度和pH等)的影响。高渗胁迫是一种主要的环境胁迫，细胞水分流失，导致细胞内离子和代谢产物浓度升高，并最终降低细胞活性。高渗胁迫是由高浓度的糖或盐引起的，例如氯化钠 (NaCl)。高盐胁迫是高渗胁迫的特例，对细胞的作用与高浓度糖类相似。
目前国内外主要通过外源添加辅助底物、诱变育种、基因工程、适应性进化等策略提高菌株的高渗胁迫抗性。但是这些方法都有明显的缺点，比如，添加辅助底物会增加成本和增加其他胁迫等；诱变育种具有不确定性，且得到菌株有一定机率丢失耐受能力；而适应性进化周期较长，往往需要几个月的时间。而基因工程时间短，操作简单，成本也不高，但是提高胁迫能力的遗传靶点不易得到(参考文献：Sandoval,N.R.and E.T.Papoutsakis,Engineering membrane and cell-wall programs for tolerance to toxic chemicals:Beyond solo genes.Curr Opin Microbiol,2016.33:p.56-66.)。
细胞膜是一道天然屏障，将细胞内物质与外界环境分开，从而维持细胞内稳态。而工业发酵中的很多胁迫是通过损伤细胞膜来降低菌体的生长，因此改变细胞膜成分来抵御环境胁迫是一个潜在的策略。例如，在酿酒酵母中过表达脂肪酸去饱和酶Ole1，饱和脂肪酸比不饱和脂肪酸增加，从而增强了对氧化、高渗等胁迫的耐受性(参考文献：Nasution,O.,et al., Overexpression of OLE1 enhances stress tolerance and constitutivelyactivates the MAPK HOG pathway in Saccharomyces cerevisiae.Biotechnol Bioeng,2017.114(3):p.620-631.)；在大肠杆菌中异源表达来自绿脓杆菌反式不饱和脂肪酸酶(Cti)，反式不饱和脂肪酸生成并融入细胞膜，细胞膜流动性降低，提高了对一些有机酸、醇类、芳香族化合物，以及有些环境胁迫的耐受性(参考文献：Tan,Z.,et al.,Membraneengineering via trans unsaturated fatty acids production improves Escherichiacoli robustness and production of biorenewables.Metab Eng,2016.35:p. 105-113.)；过表达乙酰辅酶羧化酶Acc1突变体，酿酒酵母脂肪酸平均长度增加，提高了对辛酸的耐受性(参考文献：Besada-Lombana,P.B.,et al.,Engineering Saccharomycescerevisiae fatty acid composition for increased tolerance to octanoicacid.Biotechnol Bioeng,2017.114(7):p. 1531-1538.)。因此，通过调节微生物体内细胞膜组分的合成来调节微生物抵御外界环境胁迫的能力已经成为一种有效的策略。然而，目前仍未出现酿酒酵母提高高渗胁迫抗性的有效方法。
发明内容
技术问题：本发明要解决的是酿酒酵母高渗胁迫抗性低的问题，使得酿酒酵母菌株在 NaCl胁迫条件下生存能力有所提高。
技术方案：为了解决上述问题，本发明通过过量表达内源的脂肪酸延伸酶Elo2来增强酿酒酵母的高渗胁迫抗性。本发明鉴定了一种调控酿酒酵母高渗胁迫的脂肪酸延伸酶Elo2的功能，发现酿酒酵母过表达ELO2基因后，与对照菌株相比，在高渗胁迫条件下生长能力提高，存活率增加，细胞膜脂肪酸C20:0,C22:0和C24:0含量提高。
本发明的第一个目的是提供一种增强酿酒酵母高渗胁迫抗性的方法，是过表达编码脂肪酸延伸酶的ELO2基因ELO2以提高菌株高渗胁迫抗性。
在本发明的一种实施方式中，所述ELO2基因的核苷酸序列是NCBI上的gene ID:850400 的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) BY4741，(见https://www.yeastgenome.org/strain/S000203456)，基因型为MATa his3Δ1leu2Δ0 met15Δ0ura3Δ0。
在本发明的一种实施方式中，所述过表达是以pY13质粒(即PY13TEF，商业化质粒)为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述过表达具体是：将ELO2基因连接到pY13质粒，由强启动子启动转录翻译，经过测序验证正确的重组质粒pY13-ELO2，再导入酿酒酵母感受态中，利用重组后的菌株含pY13质粒而能合成组氨酸这一特征筛选过表达ELO2基因的突变菌株，能够在组氨酸缺陷平板上生长的菌株即为过表达ELO2基因的菌株BY4741/pY13-ELO2。
本发明的第二个目的是提供一种酿酒酵母工程菌，其过表达了编码脂肪酸延伸酶的ELO2 基因。
在本发明的一种实施方式中，所述ELO2基因的核苷酸序列是NCBI上的gene ID:850400 的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) BY4741(见https://www.yeastgenome.org/strain/S000203456)，基因型为MATa his3Δ1leu2Δ0 met15Δ0ura3Δ0。
在本发明的一种实施方式中，所述过表达是以pY13质粒为表达载体。
本发明还提供一种提高酿酒酵母细胞膜脂肪酸C20:0，C22:0和C24:0含量的方法，所述方法是过表达编码脂肪酸延伸酶的ELO2基因ELO2。
有益效果：本发明通过在酿酒酵母中过表达ELO2基因，增强了酵母的高渗环境耐受能力，可以使菌株抗高渗胁迫能力增强，具体表现为胁迫条件下过表达菌株生物量提高29％，存活率提高22.1％；正常条件下，细胞膜上C20:0,C22:0和C24:0的脂肪酸含量分别提高了 52.3％、94.1％和14.4％。利用本发明提供的方法，可以使菌株在工业发酵过程中抗压能力变强，提高发酵生产产品的产量。
附图说明
图1：各菌株在正常条件和1.0M NaCl条件下的平板生长实验。
图2：各菌株在正常条件和1.0M NaCl条件下的的生长曲线，A：正常条件下各菌株的生长曲线；B：1.0M NaCl条件下各菌株的生长曲线。
图3：各菌株在不同浓度NaCl下的存活率。
图4：各菌株在正常条件和1.0M NaCl条件下的细胞膜脂肪酸含量。
具体实施方式
实施例1：构建过表达菌株
以BY4741基因组为模板，以ELO2-F/ELO2-R为引物(见表1)扩增得到目的基因ELO2，将扩增产物与质粒pY13用相同的限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ消化，通过T4连接酶将基因ELO2连接到pY13，由强启动子TEF1启动转录翻译，得到重组质粒pY13-ELO2。将重组质粒pY13-ELO2转入酿酒酵母BY4741中，利用重组质粒pY13-ELO2上的HIS1基因来筛选阳性转化子，最后提取质粒验证，得到过表达菌株BY4741/pY13-ELO2。
将pY13转入酿酒酵母BY4741中，得到对照菌株BY4741/pY13。
文献报道过表达RSA3基因(NCBI gene ID：850918)能增加酿酒酵母对高渗胁迫的耐受能力(参考文献：Anderson,M.J.,et al.,Identification of RCN1 and RSA3 asethanol-tolerant genes in Saccharomyces cerevisiae using a high copy barcodedlibrary.FEMS Yeast Res,2012.12(1):p. 48-60.)，因此本发明也构建了过表达RSA3基因的BY4741/pY13-RSA3菌株，构建方法与 BY4741/pY13-ELO2菌株的构建方法类似。
表1引物
引物名称 引物序列 序列号
ELO2-F GGATCCATGAATTCACTCGTTAC SEQ ID NO.1
ELO2-R CTCGAGTTACCTTTTTCTTCTGTG SEQ ID NO.2
RSA3-F GGATCCATGTCGGCAGGTGATA SEQ ID NO.3
RSA3-R CTCGAGTCAGTTCTCCATTTCT SEQ ID NO.4
实施例2：各菌株生长性能的测定
(1)平板生长实验：将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB(0.67％YeastNitrogen Base without Amino Acids,2％Glucose)液体培养基中过夜活化，再转接到YNB培养基中培养至对数期，测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD600＝1.0，以此为初始浓度，进行5次10倍梯度稀释，依次将3μL菌液点种在相应的固体YNB培养基上，30℃培养2-3天，观察菌体的生长情况并拍照(图1)。平板生长实验分析NaCl对BY4741/pY13-ELO2菌株， BY4741/pY13-RSA3菌株和BY4741/pY13菌株的生长的影响。在浓度为0M的NaCl条件下， BY4741/pY13-ELO2菌株，BY4741/pY13-RSA3菌株和BY4741/pY13菌株生长情况相同；在 1.0M的NaCl条件下，BY4741/pY13-ELO2菌株生长情况最好，BY4741/pY13-RSA3菌株生长情况次之，BY4741/pY13菌株生长情况最差。
(2)生长曲线测性：将待测菌株的单菌落接种于25mL的YNB液体培养基中过夜活化，再转接到相应的YNB液体培养基中，控制起始OD600＝0.1，30℃200rpm摇床培养，每隔2小时取样测定OD值，绘制生长曲线(图2)。
生长曲线分析NaCl对菌株BY4741/pY13，BY4741/pY13-ELO2，BY4741/pY13-RSA3生长的影响。正常条件下，过表达ELO2并不影响菌株的生长；而在浓度为1.0M的NaCl条件下，BY4741/pY13-ELO2菌株的OD600为3.26，比对照菌株提高了30.1％，比BY4741/pY13-RSA3 菌株提高了17.7％。以上结果表明，基因ELO2能够调节细胞对高渗环境的耐受能力。
实施例3：各菌株突变频率的测定
将菌株BY4741/pY13，BY4741/pY13-ELO2，BY4741/pY13-RSA3单菌落分别接种于YNB 液体培养基过夜培养，各取1mL菌液离心，用无菌水清洗两次后将各菌株稀释到10-4，然后用不同浓度NaCl于30℃处理4h，离心后弃去上清，用无菌水清洗两遍后，用200μL无菌水重悬，涂布于相应的营养缺陷平板上30℃培养2-3天，对形成的菌落计数并计算存活率。如图3所示，在各NaCl浓度下，BY4741/pY13-ELO2菌株存活率较BY4741/pY13都有所提高。在NaCl浓度为1.0M时，BY4741/pY13-ELO2菌株存活率为63.5％，比BY4741/pY13 提高了22.1％，比BY4741/pY13-RSA3菌株提高了10.1％。
实施例4：各菌株细胞膜脂肪酸含量测定
将菌株BY4741/PY13，BY4741/pY13-ELO2单菌落分别接种于YNB液体培养基过夜培养6-8h，收集菌液50mL，5000rpm，4℃下离心10min，用预冷磷酸缓冲液(pH 8.0)洗涤三次，离心得到酵母泥沉淀，真空冷冻干燥备用。
脂肪酸提取液的配置：皂化溶液：氢氧化钠45g，甲醇150mL和超纯水150mL；甲基化溶液：325mL，6.0mol·L-1盐酸和275mL甲醇；提取溶液：200mL己烷和200mL甲基三丁基乙醚；碱洗液：10.08g氢氧化钠，900mL超纯水。
脂质提取及处理：称取冷冻干燥后的菌体50mg，置于试管中，加入2mL皂化液，100℃水浴30min。冰浴冷却，加入4mL甲基化溶液混匀，80℃水浴10min。迅速冷却，加入2.5 mL提取溶液。摇匀震荡10min，保留上层溶液。在上层溶液中加入3mL碱洗液和几滴饱和氯化钠溶液，震荡摇匀5min。静置，溶液分层后，吸取上层液体于气相样品管中，进行检测。
结果如图4所示：(1)在正常条件下，相比BY4741/pY13菌株，过表达菌株 BY4741/pY13-ELO2细胞的脂肪酸的C20:0,C22:0和C24:0分别提高了52.3％、94.1％和14.4％； (2)在1.0M NaCl条件下，相比BY4741/pY13菌株，过表达菌株BY4741/pY13-ELO2细胞的脂肪酸的C20:0,C22:0和C24:0分别提高了33.1％、106.4％和31.5％。结果表明脂肪酸延伸酶Elo2对于酵母提高细胞膜脂肪酸有重要作用，其抗高渗胁迫作用可能是通过提高菌株的细胞膜脂肪酸来适应高渗胁迫环境。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种增强酿酒酵母抗高渗胁迫能力的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggatccatga attcactcgt tac 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcgagttac ctttttcttc tgtg 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggatccatgt cggcaggtga ta 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctcgagtcag ttctccattt ct 22

Claims (1)

1.一种提高酿酒酵母细胞膜脂肪酸C20:0和/或C22:0含量的方法，其特征在于，所述方法是过表达编码脂肪酸延伸酶的ELO2基因；所述ELO2基因的核苷酸序列是NCBI上的geneID: 850400的核苷酸序列；所述酿酒酵母是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BY4741；所述过表达是以pY13质粒为表达载体。
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