BR112020004921A2

BR112020004921A2 - cepa consumidora de ácido acético

Info

Publication number: BR112020004921A2
Application number: BR112020004921-2A
Authority: BR
Inventors: Hans Marinus Charles Johannes De Bruijn
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.
Priority date: 2017-09-26
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2020-09-15
Also published as: CN111133111A; AR113030A1; EP3688177A1; US20200270645A1; CA3074001A1; US11414683B2; WO2019063544A1

Abstract

A invenção descreve um processo para a produção de etanol a partir de uma composição compreendendo glicose e entre 50 µM e 100 mM de ácido acético, o referido processo compreendendo fermen-tar a referida composição na presença de uma levedura recombinante que é capaz de converter o ácido acético anaerobicamente; manter a quantidade de ácido acético não dissociado em um valor de pelo menos 50 µM; e recuperar o etanol. O referido processo é útil para hidrolisados que contenham amido e que sejam celulósicos, contendo ácido acético e vantajosamente resulta em maior consumo de ácido acético e, portanto, maior rendimento de etanol.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CEPA CONSUMIDORA DE ÁCIDO ACÉTICO". Campo da Invenção

[001] A invenção refere-se a um processo para a produção de etanol a partir de uma composição que compreende glicose e ácido acético na presença de uma levedura recombinante que é capaz da conversão do ácido acético para etanol. Antecedentes da Invenção

[002] O bioetanol é produzido por Saccharomyces cerevisiae a partir de uma variedade de substratos, incluindo amido de milho, fibra de milho e paleta de milho, e também de outros hidrolisados lignocelu- lósicos de matérias-primas não alimentares (por exemplo, culturas energéticas e resíduos agrícolas). Esses materiais de biomassa po- dem conter ácido acético, como um constituinte do próprio material ou formado por contaminação bacteriana. Este ácido acético forma uma fonte potencial de etanol.

[003] A WO 2011/149353 descreve uma célula de levedura que compreende um gene exógeno que codifica uma enzima com ativida- de de acetaldeído desidrogenase, cujo gene confere à célula de leve- dura a capacidade de converter ácido acético em etanol.

[004] No entanto, a conversão de ácido acético em etanol é fre- quentemente incompleta. Por esse motivo, é necessário melhorar a conversão do ácido acético. Tabela 1 - Descrição da listagem de sequência SEQ ID Descrição NO: 1 E. coli bifuncional NAD + acetaldeído acetildeído dependente/álcool desidrogenase (adhE) 2 E. coli etanolamina utilizando proteína (eutE) 3 L. plantarum acetaldeído desidrogenase (acdH) 4 L. innocua acetaldeído desidrogenase (acdH) 5 S. aureus acetaldeído/desidrogenase alcool (adhE) 6 E. coli desidrogenase glicerol (gldA) 7 K. pneumoniae desidrogenase glicerol (gldA) 8 E. aerogenes desidrogenase glicerol (gldA)

9 Y. aldovae desidrogenase glicerol (gldA) 10 S. cerevisiae dihidróxiacetona quinase (DAK1) 11 K. pneumoniae dihidróxiacetona quinase (dhaK) 12 Y. lipolytica dihidróxiacetona quinase (DAK1) 13 S. pombe dihidróxiacetona quinase (DAK1) 14 D. rerio aquaporin a 9 (T3) 15 Z. rouxii ZYRO0E01210p (T5) 16 B. animalis xylulose-5P/ fosfocetolase de frutose-6P 17 B. adolescentis xylulose-5P/ fosfocetolase de frutose-6P 18 B. lactis xylulose-5P/ fosfocetolase de frutose-6P 19 L. mesenteroides xylulose-5P/ fosfocetolase de frutose-6P 20 B. subtilis fosfotransacetilase 21 L. plantarum fosfotransacetilase 22 B. adoloscentis fosfotransacetilase tylase 23 M. thermophila fosfotransacetilase lase 24 B. adolescentis acetato quinase 25 A. nidulans acetato quinase 26 S. cerevisiae desidrogenase de aldeído ALD2 27 S. cerevisiae desidrogenase de aldeído ALD3 28 S. cerevisiae desidrogenase de aldeído ALD4 29 S. cerevisiae desidrogenase de aldeído ALD5 30 S. cerevisiae desidrogenase de aldeído ALD6 Sumário da invenção

[005] A invenção descreve um processo para a produção de eta- nol a partir de uma composição que compreenda glicose e entre 50 µM e 100 mM de ácido acético, o referido processo compreendendo fer- mentar a referida composição na presença de uma levedura recombi- nante que é capaz de converter o ácido acético anaerobicamente; manter a quantidade de ácido acético não dissociado a um valor de pelo menos 50 µM; e recuperar o etanol. O referido processo é útil pa- ra hidrolisados que contenham amido e celulósico, contendo ácido acético e vantajosamente resulta em um maior consumo de ácido acé- tico e, portanto, em maiores rendimentos de etanol. A etapa de manter a quantidade de ácido acético dissociado para um valor de pelo menos 50 µM pode compreender: monitorar a quantidade de ácido acético não dissociado na composição e se a quantidade de ácido acético não dissociado cair abaixo de 50 µM; adição de ácido à composição até que a quantidade de ácido acético não dissociado atinja um valor de pelo menos 50 µM, de preferência adicionando um ácido. Alternativa-

mente, a etapa de manter a quantidade de ácido acético não dissocia- do para um valor de pelo menos 50 µM pode compreender o monito- ramento da quantidade de ácido acético não dissociado na composi- ção e se a quantidade de ácido acético não dissociado se aproxima de 50 µM, mas antes da quantidade cair para abaixo de 50 µM: a adição de ácido à composição até que a quantidade de ácido acético não as- sociado atinja um valor acima de 50 µM, de preferência através da adição de um ácido. A levedura recombinante pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima com atividade de acetildeído desidrogenase acetilante (EC 1.2.1.10 ou EC 1.1.1.2); uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima com ativi- dade de acetil-CoA sintetase (E.C.6.2. 1.1) e, opcionalmente, uma se- quência de ácido nucleico que codifica uma enzima com atividade de desidrogenase de álcool dependente de NAD (EC 1.1.1.1). A levedura recombinante pode ainda compreender uma sequência de ácido nu- cleico que codifica uma enzima que possui atividade de glicerol desi- drogenase. A levedura recombinante pode compreender uma deleção ou interrupção de uma ou mais sequências de nucleotídeos endóge- nas que codificam uma aldeído desidrogenase ou pode ter atividade reduzida do aldeído desidrogenase em comparação com a levedura de tipo original correspondente. Essa célula pode ainda compreender um ou mais genes que codificam uma enzima com atividade de fosfoketo- lase (PKL) (EC 4.1.2.9 ou EC 4.1.2.22), um ou mais genes que codifi- cam uma enzima com atividade de fosfotransacetilase (PTA) (EC

2.3.1.8) e/ou um ou mais genes que codificam uma enzima com ativi- dade de acetato-quinase (ACK) (EC 2.7.2.12). A levedura recombinan- te também pode compreender um ácido nucleico que codifica uma en- zima que possui atividade de di-hidroxiacetona cinase. A levedura re- combinante pode ainda compreender uma deleção ou interrupção de uma ou mais sequências de nucleotídeos endógenas que codificam uma glicerol-3-fosfato desidrogenase. A levedura recombinante tam- bém pode compreender uma deleção ou interrupção de uma ou mais sequências de nucleotídeos endógenas que codificam uma glicerol 3- fosfato fosfo-hidrolase, tal como S. cerevisiae GPP1 ou GPP2. A leve- dura recombinante também pode compreender um transportador de glicerol. A composição pode ser um hidrolisado de biomassa lignocelu- lósico ou um hidrolisado de amido, como um hidrolisado de amido de milho. A levedura pode ser uma Saccharomyces cerevisiae. Descrição detalhada da invenção

[006] A expressão de uma acetildeído desidrogenase acetilada exógena em levedura permite que a levedura converta ácido acético, que pode estar presente tanto em hidrolisados lignocelulósicos quanto em hidrolisados de amido de milho, em etanol. A redução dependente de NADH do ácido acético em etanol foi proposta como um substituto para a formação de glicerol como um sumidouro redox em culturas anaeróbias de S. cerevisiae cultivadas em glicose, fornecendo assim uma base estequiométrica para a eliminação da produção de glicerol (como subproduto) durante produção industrial de etanol e, conse- quentemente, um maior rendimento de etanol. Contudo, o inventor descobriu de forma surpreendente que, quando é utilizada essa leve- dura, existe frequentemente uma quantidade residual de ácido acético no meio de fermentação que permanece não convertida. Esta quanti- dade residual de ácido acético pode ser tão grande quanto vários mi- limolares. O inventor descobriu e forma surpreendente que, adicionan- do uma pequena quantidade de ácido, a levedura retomou o consumo de ácido acético. Percebendo que a adição de ácido força o ácido acé- tico para sua forma protonada (isto é, não dissociada), ele deduziu que pode haver uma concentração mínima de ácido acético não dissociado necessária para que a levedura consuma ácido acético. Ele realmente descobriu que a levedura requer uma concentração mínima de ácido acético não dissociado de pelo menos 50 µM - se a quantidade diminu- ir abaixo de 50 µM, o consumo de ácido acético diminui gradualmente e acaba parando completamente, mesmo se houver uma quantidade considerável de acetato dissociado presente nos meios de fermenta- ção. Se for esse o caso, aumentando a quantidade de ácido acético não dissociado para um valor de pelo menos 50 µM, o consumo de ácido acético continua quase completo. O inventor percebeu que a le- vedura consome apenas ácido acético não dissociado e não a forma dissociada de ácido acético, e ainda que a levedura possa consumir esse ácido acético não dissociado apenas a uma concentração de cerca de 50 μM. Aparentemente, quando a quantidade de ácido acéti- co não dissociado cai para uma concentração abaixo de 50 µM, a le- vedura para de consumir o ácido acético completamente, mesmo se houver um reservatório considerável de acetato no meio de fermenta- ção.

[007] Assim, a invenção se refere a um processo para a produ- ção de etanol a partir de uma composição compreendendo um açúcar e entre 50 µM e 100 mM de ácido acético, o referido processo com- preendendo: - fermentação da referida composição na presença de uma levedura recombinante que é capaz de converter o ácido acético anae- robicamente; - manutenção da quantidade de ácido acético dissociado a um valor de pelo menos 50 µM; e - recuperando o etanol.

[008] A quantidade de ácido acético não dissociado pode ser mantida em um valor de pelo menos 60 µM, pelo menos 70, pelo me- nos 80, pelo menos 90, pelo menos 100 µM ou pelo menos 120 µM, pelo menos 150 µM ou pelo menos 200µM.

[009] A quantidade superior de ácido acético não associado é menos crucial, mas pode ser de 100 mM ou menos, de preferência de 80 mM ou menos, 60 mM ou menos, 40 mM ou menos, 30 mM ou me- nos, 20 mM ou menos, 20 mM ou menos 10 mM ou menos, 5 mM ou menos, 2 mM ou menos, 1 mM ou menos. Se a quantidade de ácido acético não dissociado for muito alta, por exemplo 100 mM, o resulta- do pode ser um crescimento diminuído, fermentação incompleta e/ou o rendimento de etanol diminuído, possivelmente devido à toxicidade do ácido acético. Uma vez que se prevê que o pH durante o processo de fermentação no qual o ácido acético é convertido em etanol se aumen- te, a quantidade de ácido acético não dissociado também diminuirá. Dessa forma, desde que a concentração inicial de ácido acético na composição não seja superior a 100 mM, a quantidade de ácido acéti- co não dissociado não aumentará acima de 100 mM, e não é necessá- rio tomar medidas ativas para impedir o aumento de ácido acético não dissociado a um nível acima de 100 mM. Hipoteticamente, quase todo o ácido acético na composição está na forma não dissociada, mas isso exigiria um valor de pH muito baixo, o que não é propício para a fer- mentação. Portanto, em uma modalidade, a quantidade de ácido acé- tico não dissociado é mantida a um valor de 100 mM ou menos, de preferência 80 mM ou menos, 60 mM ou menos, 40 mM ou menos, 40 mM ou menos, 30 mM ou menos, 20 mM ou menos 10 mM ou menos, 5 mM ou menos, 2 mM ou menos, 1 mM ou menos, por exemplo, adi- cionando uma base, como NaOH ou KOH.

[0010] No processo da invenção, é previsto que o pH aumente du- rante a fermentação como resultado do consumo de ácido acético. Por isso, em uma modalidade, o processo da invenção resulta em um au- mento do pH da composição.

[0011] Em uma modalidade, pelo menos parte do ácido acético é convertido em etanol.

[0012] Através de toda a presente especificação e reivindicações anexas, as palavras "compreendem" e "incluem" e variações como "compreende", "compreendendo", "inclui" e "incluindo" devem ser in- terpretadas e forma inclusiva. Ou seja, essas palavras pretendem transmitir a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não recitados especificamente, onde o contexto permitir. Os artigos "a" e "an" são usados aqui para se referir a um ou mais de um (ou seja, a um ou pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um aminoácido" pode significar um aminoácido ou mais de um aminoácido.

[0013] No contexto da invenção, "manter a quantidade de ácido acético dissociado em um valor de pelo menos 50 µM" não significa que a quantidade de ácido acético não dissociado nunca deve cair abaixo de 50 µM. Por certo, durante o processo de fermentação, pode acontecer que a quantidade de ácido acético não dissociado ocasio- nalmente caia abaixo de 50 µM. Quando isso ocorre, o processo exige a restauração da quantidade de ácido acético não associado a um va- lor de pelo menos 50M. Nesse cenário, as etapas para obter uma quantidade de pelo menos 50 µM de ácido acético não associado são tomadas após a concentração cair abaixo de 50 µM. O tempo entre o momento em que a quantidade de ácido acético dissociado caiu abai- xo do valor de 50 µM e a restauração da quantidade de ácido acético dissociado para um valor de pelo menos 50 µM não é crucial. Isso po- de ser feito instantaneamente, ou depois de 1 minuto, depois de 5 mi- nutos, mesmo depois de 30 minutos ou 1 hora.

[0014] Alternativamente, a "manutenção" também pode ser reali- zada de modo que a quantidade de ácido acético não dissociado não caia abaixo de 50 µM.

[0015] Em ambos os cenários, é vantajoso monitorar a quantidade de quantidade de ácido acético não dissociado durante o processo de fermentação.

[0016] No contexto da invenção, o termo "ácido acético não disso- ciado" é entendido como o mesmo "ácido acético protonado".

[0017] O versado na técnica sabe como manter a quantidade de ácido acético não dissociado entre 50 µM e 100 mM. Ele/ela pode mo- nitorar a quantidade de ácido acético não dissociado. Assim, em uma modalidade, o processo compreende a etapa de monitorar a quantida- de de ácido acético não dissociado.

[0018] A pessoa versada na técnica entende que a quantidade de ácido acético não dissociado depende, inter alia, da quantidade total de ácido acético na composição (protonada e dissociada), bem como do pH. Dessa forma, em uma modalidade, a quantidade de ácido acé- tico dissociado é mantida a um valor de pelo menos 50 µM, através do ajuste do pH. Como o consumo de ácido acético geralmente resulta em um aumento do pH e a quantidade de ácido acético não dissociado depende, inter alia, do pH, de modo que, em um pH mais alto, a quan- tidade de ácido acético não dissociado diminua, quando a quantidade de ácido acético não dissociado cai abaixo 50 mM, o pH da composi- ção pode ser diminuído. Isso pode ser feito adicionando um ácido. Por- tanto, em uma modalidade, o processo compreende adicionar um áci- do. Qualquer tipo de ácido pode ser suficiente, por exemplo, ácidos orgânicos, como ácido cítrico, ou ácidos inorgânicos, como ácido clorí- drico, ácido sulfúrico ou ácido nítrico. São de preferência os ácidos for- tes, pois ácidos fracos podem inibir a levedura. O ácido fosfórico é muito adequado e pode ter o efeito adicional de suplementar o meio de fermentação com fosfato. O ácido pode ser adicionado uma vez ou (dependendo da quantidade de ácido acético) duas, vezes, três vezes etc. durante a fermentação.

[0019] O ácido pode ser adicionado até que a quantidade de ácido acético não dissociado atinja um valor de 50 µM ou superior, como por exemplo um valor entre 50 e 60 µM, ou um valor entre 50 e 70 µM, ou entre 50 e 100 µ M, ou entre 50 e 150 µM, ou entre 50 e 200 µM.

[0020] O processo também pode compreender a etapa de monito- ramento do pH. O pH da composição é de preferência mantido entre 3 e 6, de preferência entre 4 e 5. O limite superior do pH é de preferên- cia tal que a quantidade de ácido acético não associado seja pelo me- nos 50 µM, e isso depende da quantidade total de ácido acético na composição. O versado na técnica pode monitorar prontamente o pH e a quantidade de ácido acético não dissociado (veja abaixo) e ajustar o pH de modo que a quantidade de ácido acético não dissociado seja mantida (ou restaurada) para um valor de pelo menos 50 µM.

[0021] A quantidade de ácido acético não associado pode ser ana- lisada por HPLC. A HPLC geralmente mede todos os sais de ácido acético e acetato (isto é, ambos não dissociados, isto é, forma proto- nada e forma dissociada de ácido acético) porque a fase móvel é tipi- camente acidificada. Para medir a quantidade de ácido acético disso- ciado na composição, uma abordagem adequada é medir a quantida- de (total) de acetato da composição como está, medir o pH da compo- sição e calcular a quantidade de ácido acético dissociado usando o pKa do ácido acético.

[0022] Dessa forma, em uma modalidade, o processo compreen- de: - monitorização da quantidade de ácido acético não disso- ciado na composição e, se a quantidade de ácido acético não dissoci- ado cair abaixo de 50 µM - adicionar ácido à composição até que a quantidade de ácido acético não dissociado atinja um valor de pelo menos 50 µM, de preferência através da adição de um ácido.

[0023] Em outra modalidade, o processo compreende: - monitorar a quantidade de ácido acético não dissociado na composição e se a quantidade de ácido acético não dissociado se aproximar de 50 µM, mas antes que a quantidade desça abaixo de 50 µM: - adição de ácido à composição até que a quantidade de ácido acético não associado atinja um valor acima de 50 µM, de prefe- rência através da adição de um ácido.

[0024] Com a finalidade de evitar qualquer dúvida, a invenção também inclui um processo para a produção de etanol a partir de uma composição compreendendo um açúcar e entre 50 µM e 100 mM de ácido acético, o referido processo compreendendo: - fermentação da referida composição na presença de uma levedura recombinante que é capaz de converter o ácido acético de forma anaeróbica; - monitorar a quantidade de ácido acético não dissociado na composição e se a quantidade de ácido acético não dissociado se aproxima de 50 µM, mas antes que a quantidade desça abaixo de 50 µM: - adição de ácido à composição até que a quantidade de ácido acético não dissociado atinja um valor acima de 50 µM (como 55 µM ou mais, 60 µM ou mais, 70 µM ou mais, 80 µM ou mais, 90 µ M ou mais, 100 µM ou mais), de preferência adicionando um ácido; e - recuperando o produto etanol produto etanol produzido.

[0025] A enzima que acetila o acetaldeído desidrogenase (EC1.2.1.10 ou EC1.1.1.2) catalisa a conversão da acetil-coenzima A em acetaldeído. Essa conversão pode ser representada pela fórmula da reação de equilíbrio (I): (I) acetil-coenzima A + NADH + H + <-> acetaldeído + NAD + + coenzima A.

[0026] É entendido que a levedura recombinante utilizada no pro- cesso da invenção compreende naturalmente pelo menos um gene endógeno que codifica uma acetil-CoA sintetase e pelo menos um ge-

ne endógeno que codifica uma desidrogenase de álcool. Assim, no contexto desta invenção, esta levedura recombinante, que é transfor- mada com um gene que codifica uma acetaldeído desidrogenase ace- tilante, e que possui os genes endógenos que codificam acetil CoA sintetase e álcool desidrogenase é capaz de concluir a conversão do ácido acético em etanol.

[0027] Em uma modalidade, a levedura recombinante compreen- de: - uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzi- ma com atividade de acetildeído desidrogenase acetilante (EC

1.2.1.10 ou EC 1.1.1.2); - uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzi- ma com atividade acetil-CoA sintetase (E.C.6.2. 1.1) e, opcionalmente, - uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzi- ma que possui atividade desidrogenase dependente de NAD (EC

1.1.1.1).

[0028] A levedura recombinante usada no processo é capaz de converter o ácido acético anaerobicamente. Em uma modalidade, a levedura recombinante é capaz de converter ácido acético em pelo menos etanol. Em outra modalidade, a levedura recombinante é capaz de converter cada um de glicose e ácido acético em pelo menos eta- nol. No contexto desta invenção, as expressões "capaz de converter ácido acético" e "capaz de converter cada um de glicose e ácido acéti- co" são entendidos como significando que pelo menos parte do ácido acético e/ou glicose é convertida em pelo menos etanol.

[0029] O ácido nucleico que codifica uma enzima com atividade de acetildeído desidrogenase acetilante é de preferência dependente de NAD + e pode ter uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou um homólogo funcional da mesma com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%. 85%, 90% ou 95% ou cujo homólogo funcional é derivado, por meio de uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos, da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5. O acetaldeído acetilante pode compreender tan- to a atividade de acetildeído desidrogenase (EC 1.2.1.10 ou EC

1.1.1.2) dependente de NAD + quanto à atividade de desidrogenase de álcool dependente de NAD + (EC 1.1.1.1). A sequência de ácido nucleico que codifica a acetaldeído desidrogenase acetilante depen- dente de NAD + pode, em princípio, ser originária de qualquer orga- nismo que compreenda uma sequência de ácido nucleico que codifica a referida desidrogenase. As acetildeído desidrogenasses acetildeidas acetiladas conhecidas que podem catalisar a redução da acetil- coenzima A dependente de NADH em acetaldeído podem, em geral, ser divididas em três tipos de homólogos funcionais de acetaldeído desidrogenase acetildeído dependentes de NAD +: 1) Proteínas bifuncionais que catalisam a conversão rever- sível de acetil-CoA em acetaldeído e a subsequente conversão rever- sível de acetaldeído em etanol. Um exemplo desse tipo de proteína é a proteína AdhE em E. coli (Gen Bank No: NP_ 415757). AdhE parece ser o produto evolutivo de uma fusão de genes. A região NH2-terminal da proteína AdhE é altamente homóloga ao aldeído: NAD + oxidoredu- tases, enquanto a região COOH-terminal é homóloga a uma família de etanol dependente de Fe2 +: NAD + oxidoredutases (Memorial- Hernandez et al., (2000) J. BioI Chern 275: 33869-33875). O E. coli AdhE está sujeito a oxidação catalisada por metal e, portanto, sensível ao oxigênio (Tamarit et ai. (1998) J. BioI. Chern. 273: 3027-32). 2) Proteínas que catalisam a conversão reversível da ace- til-coenzima A em acetaldeído em microrganismos anaeróbicos estri- tos ou facultativos, mas não possuem a atividade desidrogenase do álcool. Um exemplo deste tipo de proteínas foi relatado em Clostridium kluyveri (Smith et al. (1980) Arch. Biochem. Biophys. 203: 663-675). Uma acetildeído desidrogenase acetilante foi anotada no genoma de Clostridium kluyveri DSM 555 (GenBank No: EDK33116). Uma proteí- na homóloga AcdH é identificada no genoma de Lactobacillus planta- rum (GenBank No: NP_ 784141). Outro exemplo deste tipo de proteí- nas é o referido produto genético em Clostridium beijerinckii NRRL B593 (Toth et ai. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65: 4973-4980, Gen- Bank No: AAD31841). 3) Proteínas que fazem parte de um complexo bifuncional aldolase-desidrogenase envolvido no catabolismo de 4-hidroxi-2- cetovalerato. Tais enzimas bifuncionais catalisam as duas etapas fi- nais da via de meta-clivagem para o catecol, um intermediário em mui- tas espécies bacterianas na degradação de fenóis, toluatos, naftaleno, bifenilos e outros compostos aromáticos (Powlowski e Shingler (1994) Biodegradation 5, 219- 236) O 4-hidroxi-2-cetovalerato é primeiro con- vertido pela 4-hidroxi-2-cetovalerato aldolase em piruvato e acetaldeí- do; em seguida, o acetaldeído é convertido por acetilação de acetalde- ído desidrogenase em acetil-CoA. Um exemplo deste tipo de acetalde- ído desidrogenase acetilante é a proteína DmpF em Pseudomonas sp CF600 (GenBank No: CAA43226) (Shingler et al. (1992) J. Bacteriol. 174: 711-24). A proteína MphF de E. coli (Ferrandez et ai. (1997) J. Bacteriol. 179: 2573-2581, GenBank No: NP_ 414885) é homóloga à proteína DmpF em Pseudomonas sp. CF600.

[0030] Uma sequência de ácido nucleico adequada pode, em par- ticular, ser encontrada em um organismo selecionado do grupo de Es- cherichia, específiamente E. coli; Mycobacterium, em particular Myco- bacterium marinum, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium tubercu- losis; Carboxidotermo, em particular Carboxidotermo hidrogenofor- mans; Entamoeba, em particular Entamoeba histolytica; Shigella, em particular Shigella sonnei; Burkholderia, em particular Burkholderia pseudo mallei, Klebsiella, em particular Klebsiella pneumoniae; Azoto- bacter, em particular Azotobacter vinelandii; Azoarcus sp; Cupriavidus, em particular Cupriavidus taiwanensis; Pseudomonas, em particular Pseudomonas sp. CF600; Pelomaculum, em particular Pelotomaculum thermopropionicum. De preferência, a sequência de ácido nucleico que codifica a acetaldeído desidrogenase acetiladora dependente de NAD + é originária de Escherichia, de mais preferência a partir de E. coli.

[0031] Especificamente adequado é um gene mhpF de E. coli, ou um seu homólogo funcional. Este gene é descrito em Fernindez et al. (1997) J. Bacteriol. 179: 2573-2581. Os bons resultados foram obtidos com S. cerevisiae, em que um gene mhpF a partir de E. coli foi incor- porado. Em outra modalidade vantajosa, uma sequência de ácido nu- cleico que codifica um acetilado desidrogenase (acetilante) é de Pseu- domonas, em particular dmpF, p. de Pseudomonas sp. CF600.

[0032] A sequência de ácido nucleico que codifica a acetaldeído desidrogenase acetilante pode ser uma sequência de ácido nucleico do tipo selvagem. Além disso, uma acetaldeído desidrogenase aceti- lante (ou sequência de ácido nucleico que codifica essa atividade) po- de, por exemplo, ser selecionada a partir do grupo de Escherichia coli adHE, Entamoeba histolytica adh2, Staphylococcus aureus adhE, Pi- romyces sp.E2 adhE, Clostridium kluyveri EDK33116 , Escherichia coli eutE, Listeria innocua acdH e Pseudomonas putida YP 001268189. Para as sequências de algumas dessas enzimas, sequências de áci- dos nucleicos que codificam essas enzimas e metodologia para incor- porar a sequência de ácidos nucleicos em uma célula hospedeira, é feita referência a WO 2009/ 013159, em particular o Exemplo 3, a Ta- bela 1 (página 26) e os números de ID de sequência mencionados na mesma, dos quais a Tabela 1 de publicação e as sequências repre- sentadas pelos números de ID de sequência mencionados na referida tabela são incorporadas aqui, neste pedido de patente por referência.

[0033] A acetil-CoA sintetase (também conhecida como acetato- CoA ligase e enzima ativadora de acetil) é uma enzima onipresente, encontrada em procariotes e eucariotes, que catalisa a formação de acetil-CoA a partir de acetato, coenzima A (CoA) e ATP, como mostra- do abaixo: (II) ATP + acetato + CoA = AMP + difosfato + acetil-CoA

[0034] A atividade desta enzima é crucial para a manutenção dos níveis requeridos de acetil-CoA, um intermediário chave em muitos processos biossintéticos e catabólicos importantes. É especialmente importante em espécies eucarióticas, pois é a única via para a ativa- ção do acetato de acetil-CoA nesses organismos (algumas espécies procarióticas também podem ativar o acetato através do acetato de cinase/fosfotransacetilase ou por acetil-CoA sintase de formação de ADP). Os eucariotes têm tipicamente duas isoformas da acetil-CoA sintase, uma forma citosólica envolvida em processos biossintéticos e uma forma mitocondrial envolvida principalmente na geração de ener- gia.

[0035] As estruturas cristalinas de uma forma eucariótica (por exemplo, de levedura) e bacteriana (por exemplo, de Salmonella) des- ta enzima foram determinadas. A enzima de levedura é trimérica, en- quanto a enzima bacteriana é monomérica. No entanto, o estado tri- mérico da proteína de levedura pode ser exclusivo deste organismo, pois os resíduos envolvidos na interface do trímero são pouco conser- vados em outras sequências. Apesar das diferenças no estado oligo- mérico das duas enzimas, as estruturas dos monômeros são quase idênticas. Um domínio N-terminal grande (~ 500 resíduos) que contém duas folhas beta paralelas é seguido por um domínio C-terminal pe- queno (~ 110 resíduos) contendo uma folha beta de três vertentes com hélices. O site ativo ocorre na interface do domínio, com seu conteúdo determinando a orientação do domínio C-terminal.

[0036] A levedura recombinante pode compreender um ACS en- dógeno super expresso. A célula recombinante pode compreender um heterólogo. Exemplos de ACS heterólogos adequados estão listados na tabela 2. Tabela 2: Consulta BLAST - ACS2 de Saccharomyces cerevisiae Descrição Identidade (%) Número de acesso acetato--CoA ligase ACS2 [Saccharomyces cerevi- 100 NP_013254.1 siae S288c] acetil CoA sintetase [Saccharomyces cerevisiae 99 EDN59693.1 YJM789] acetato--CoA ligase [Kluyveromyces lactis NRRL 85 XP_453827.1 Y-1140] acetato--CoA ligase [Candida glabrata CBS 138] 83 XP_445089.1 acetato--CoA ligase [Scheffersomyces stipitis CBS 68 XP_001385819.1 6054] acetil-coenzima A sintetase FacA [Aspergillus fu- 63 EDP50475.1 migatus A1163] acetato--CoA ligase facA-Penicillium chrysogenum 62 XP_002564696.1 [Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255]

[0037] Em uma modalidade, a levedura recombinante pode com- preender nucleotídeos que codificam uma enzima que possui glicerol desidrogenase ligada a NAD +. Como usado aqui, neste pedido de pa- tente uma glicerol desidrogenase catalisa pelo menos a reação que se segue: (III) glicerol + NAD + <-> glicerona + NADH + H +

[0038] Desse modo, os dois substratos dessa enzima são glicerol e NAD +, enquanto seus três produtos são glicerona, NADH e H +. Glicerona e di-hidroxiacetona são aqui sinônimos.

[0039] Essa enzima pertence à família das oxido redutases, espe- cificamente aquelas que atuam no grupo de doadores CH-OH com NAD + ou NADP + como aceitador. O nome sistemático dessa classe de enzima é glicerol: NAD + 2-oxidoredutase. Outros nomes de uso comum incluem glicerina desidrogenase e glicerol desidrogenase liga- da ao NAD +. Essa enzima participa do metabolismo glicerolipídico. Estudos estruturais mostraram que a enzima é dependente de zinco, com o sítio ativo entre os dois domínios da proteína.

[0040] Em uma modalidade, a enzima que possui atividade de gli- cerol desidrogenase é de preferência uma glicerol desidrogenase liga- da a NAD + (EC 1.1.1.6). Essa enzima pode ser de origem bacteriana ou, por exemplo, de origem fúngica. Um exemplo é o gldA de E. coli.

[0041] Alternativamente, a enzima que possui atividade de glicerol desidrogenase é uma glicerol desidrogenase ligada a NADP + (EC

1.1.1.72).

[0042] Quando a levedura recombinante é utilizada para a produ- ção de etanol, o que normalmente ocorre sob condições anaeróbicas, são preferidas as glicerol desidrogenasses ligadas ao NAD +.

[0043] Em uma modalidade, a levedura recombinante compreende um ou mais genes que codificam uma glicerol desidrogenase heterólo- ga representada pelas sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 6, 7, 8 ou 9, ou um homólogo funcional das mesmas com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, de preferência de pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%. 85%, 90% ou 95% ou cujo homólogo funcional é de- rivado, por meio de uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos, da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 6, 7, 8 ou 9.

[0044] A levedura recombinante compreende um ácido nucleico que codifica uma enzima que possui atividade de di-hidroxiacetona cinase. A enzima dihidroxiacetona cinase catalisa pelo menos uma das seguintes reações: (IV) CE 2.7.1.28: ATP + D-gliceraldeído <=> ADP + D- gliceraldeído 3-fosfato ou (V) CE 2.7.1.29: ATP + glicerona <=> ADP + fosfato de glicerona.

[0045] Esta família consiste em exemplos da forma de cadeia úni- ca de di-hidroxiacetona-quinase (também chamada glicerona-quinase)

que usa ATP (EC 2.7.1.29 ou EC 2.7.1.28) como doador de fosfato, em vez de uma fosfoproteína como em Escherichia coli. Essa forma possui domínios separáveis homólogos às subunidades K e L da en- zima E. coli e é encontrada em leveduras e outros eucariotos e em al- gumas bactérias, incluindo Citrobacter freundii. Foi demonstrado que o membro do tomate fosforila di-hidroxiacetona, 3,4-di-hidroxi-2-buta- nona e algumas outras aldoses e cetoses. Foi demonstrado que mem- bros de mamíferos catalisam tanto a fosforilação da di-hidroxiacetona quanto a divisão dos compostos de ribonucleosídeo difosfato-X entre os quais o FAD é o melhor substrato. Na levedura existem duas isozi- mas da dihidroxiacetona quinase (Dak1 e Dak2). Em uma modalidade, a levedura recombinante compreende DAK endógeno que é superex- presso.

[0046] A enzima que possui atividade de di-hidroxi acetona qui- nase pode ser codificada por um gene endógeno, como por exemplo um DAK1, cujo gene endógeno é de preferência colocado sob controle de um promotor constitutivo. A célula recombinante pode compreender uma modificação genética que aumenta a atividade específica da di- hidroxiacetona cinase na célula.

[0047] Em uma modalidade, a levedura recombinante compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam uma di- hidroxi acetona cinase representada pela sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NO: 10, 11, 12 ou 13 ou por um homólogo funcional da mesma com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%. 85%, 90% ou 95% ou cujo homólogo funcional é derivado, por meio de uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos, da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 10, 11, 12 ou 13, cujo gene é de prefe- rência colocado sob controle de um promotor constitutivo.

[0048] Em uma modalidade, a levedura recombinante compreende uma deleção ou interrupção de uma ou mais sequências de nucleotí- deos endógenas que codificam uma glicerol-3-fosfato desidrogenase. Tal deleção ou interrupção pode resultar na diminuição ou remoção da atividade enzimática. Como usado aqui, neste pedido de patente uma glicerol 3-fosfato desidrogenase catalisa pelo menos a seguinte rea- ção: (VI) fosfato de di-hidroxiacetona + NADH fosfato de glicerol + NAD+.

[0049] A glicerol-3-fosfato desidrogenase pode ser completamente deletada ou pelo menos é deletada uma parte que codifica uma parte da enzima essencial para sua atividade. Em particular, bons resultados foram alcançados com uma célula de S. cerevisiae, em que os qua- dros de leitura abertos do gene GPD1 e do gene GPD2 foram inativa- dos. A inativação de um gene estrutural (gene alvo) pode ser realizada por um versado na técnica, sintetizando ou construindo sinteticamente um fragmento de DNA que consiste em um gene marcador selecioná- vel, ladeado por sequências de DNA idênticas às sequências que flan- queiam a região do genoma hospedeiro da célula que deve ser excluí- do. De modo específico, bons resultados foram obtidos com a inativa- ção dos genes GPD1 e GPD2 em Saccharomyces cerevisiae pela in- tegração dos genes marcadores kanMX e hphMX4. Em seguida este fragmento de DNA é transformado em uma célula hospedeira. As célu- las transformadas que expressam o gene marcador dominante são verificadas com relação à substituição correta da região que foi proje- tada para ser excluída, por exemplo, através de uma reação em ca- deia da polimerase diagnóstica ou por hibridização de Southern. A gli- cerol-3-fosfato desidrogenase excluída ou interrompida pertence de preferência a EC 1.1.5.3, como GUT2, ou a EC 1.1.1.8, como GPD1 e ou GPD2. Na modalidade, a célula está livre de genes que codificam glicerol-3-fosfato desidrogenase dependente de NADH. Os genes

GPD1 e GPD2 podem ser excluídos ou interrompidos, embora seja de preferência que o GPD2, mas não o GPD1, seja excluído ou interrom- pido. A WO 011/ 010923 descreve métodos para excluir ou interrom- per uma glicerol-3-fosfato desidrogenase.

[0050] Em uma modalidade, a levedura recombinante compreende uma exclusão ou interrupção de uma ou mais sequências de nucleotí- deos endógenas que codificam uma glicerol 3-fosfato fosfo-hidrolase, como a S. cerevisiae GPP1 ou GPP2. Tal deleção ou interrupção pode resultar em diminuição ou remoção da atividade enzimática.

[0051] Em uma modalidade, a célula recombinante compreende um ou mais genes que codificam para um transportador de glicerol. O glicerol que está disponível externamente no meio (por exemplo, da parte posterior do mosto de milho) ou segregado após a síntese celu- lar interna pode ser transportado para a célula e convertido em etanol pela expressão concomitante (super) de uma glicerol desidrogenase e di-hidroxi acetona quinase. Em uma modalidade, a célula recombinan- te compreende um ou mais genes que codificam um transportador he- terólogo de glicerol representado pela SEQ ID NO: 14 ou 15, ou um homólogo funcional do mesmo com uma identidade de sequência de pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70%, 75%, 80%. 85%, 90% ou 95% ou cujo homólogo funcional é derivado, por meio de uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos, da se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou 15.

[0052] Em uma modalidade, a composição é um hidrolisado de biomassa. Esse hidrolisado de biomassa pode ser um hidrolisado de biomassa lignocelulósico. A lenhocelulose aqui inclui partes de bio- massa e hemicelulose e hemicelulose. Também a lignocelulose inclui frações lignocelulósicas de biomassa. Materiais lignocelulósicos ade- quados podem ser encontrados na relação que se segue: primários para pomares, chaparral, resíduos de moinho, resíduos de madeira urbana, resíduos municipais, resíduos de exploração, desbaste de flo- restas, culturas lenhosas de rotação curta, resíduos industriais, palha de trigo, palha de aveia, palha de arroz, palha de cevada, palha de centeio, palha de linho, cascas de soja, cascas de arroz, palha de ar- roz, alimentação de glúten de milho, cascas de aveia, cana de açúcar, fogão de milho, talos de milho, espigas de milho, espigas de milho, cascas de milho, alternar grama, miscanthus, sorgo doce, caules de canola, caules de soja, capim-pradaria, gama grass, rabo de raposa; polpa de beterraba sacarina, polpa de frutas cítricas, cascas de se- mentes, resíduos celulósicos de animais, aparas de relva, algodão, algas marinhas, árvores, madeira leve, madeira de lei, choupo, pinho, arbustos, gramíneas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana de açúcar, milho, cascas de milho, placas de milho, caroço de milho, fibra de grãos, produtos e subprodutos da moagem úmida ou seca de grãos, resíduos sólidos municipais, desperdícios de papel, resíduos de jar- dim, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resí- duos sólidos urbanos, resíduos de papel e celulose resíduos de fábri- cas de papel, galhos, arbustos, bengalas, milho, cascas de milho, uma colheita energética, floresta, uma fruta, uma flor, um grão, uma grama, uma colheita herbácea, uma folha, casca, uma agulha, um tronco, uma raiz, uma muda, um arbusto, trocar grama, uma árvore, um vegetal, casca de frutas, uma videira, polpa de beterraba sacarina, sementes de trigo, cascas de aveia, madeira dura ou macia, resíduos orgânicos gerados a partir de um processo agrícola, resíduos de madeira flores- tal ou uma combinação de dois ou mais deles.

A lenhocelulose, que pode ser considerada uma potencial fonte renovável, geralmente com- preende os polissacarídeos celulose (glucanos) e hemiceluloses (xila- nos, heteroxilanos e xiloglucanos). Além disso, alguma hemicelulose pode estar presente como glucomananos, por exemplo, em matérias- primas derivadas da madeira.

A hidrólise enzimática desses polissaca-

rídeos em açúcares solúveis, incluindo monômeros e multímeros, por exemplo glicose, celobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, ma- nose, ramose, ribose, ácido galacturônico, ácido glucurônico e outras hexoses e pentoses ocorre sob a ação de diferentes enzimas atuando em conjunto. Além disso, as pectinas e outras substâncias pécticas, como os arabinanos, podem representar uma proporção considerável da massa seca das paredes celulares típicas de tecidos vegetais não lenhosos (cerca de um quarto a metade da massa seca pode ser pec- tina). O material de lenhocelulose pode ser pré-tratado. O pré-tra- tamento pode compreender a exposição do material de lenhocelulose a um ácido, uma base, um solvente, calor, um peróxido, ozônio, tritu- ração mecânica, moagem, moagem ou despressurização rápida, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais. Este pré-tratamento quí- mico é frequentemente combinado com pré-tratamento térmico, como por exemplo, entre 150 a 220°C durante de 1 a 30 minutos.

[0053] Em outra modalidade, a composição é um hidrolisado de amido, tal como um hidrolisado de amido de milho.

[0054] No contexto da invenção, um "hidrolisado" significa um po- lissacarídeo que foi despolimerizado através da adição de água para formar açúcares mono e oligossacarídeos. Os hidrolisados podem ser produzidos por hidrólise enzimática ou ácida do material contendo po- lissacarídeos.

[0055] "Expressão" refere-se à transcrição de um gene em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou RNA mensageiro (mRNA) com tradução subsequente em uma proteína.

[0056] Como utilizado aqui, neste pedido de patente, "promotor" é uma sequência de DNA que direciona a transcrição de um gene (estru- tural), em particular um ou mais genes da fosforibulocinase. O promo- tor permite maior expressão durante condições anaeróbicas do que sob condições aeróbicas.

[0057] O termo "um" ou "uma", conforme usado aqui, é definido como "pelo menos um", a menos que especificado de outra forma.

[0058] Ao se referir a um substantivo (por exemplo, um composto, um aditivo, etc.) no singular, o plural deve ser incluído. Assim, quando se refere a uma parte específica, como por exemplo, "nucleotídeo", isto significa "pelo menos um" dessa porção, p. "pelo menos um nu- cleotídeo", a menos que especificado de outra forma. O termo 'ou', conforme usado aqui, deve ser entendido como 'e/ou'.

[0059] O termo 'fermentação', 'fermentativo' e os similares é usado aqui, neste pedido de patente, no sentido clássico, isto é, para indicar que um processo é ou foi realizado sob condições anaeróbicas. As condições anaeróbicas são definidas aqui, neste pedido de patente, como condições sem oxigênio ou nas quais essencialmente nenhum oxigênio é consumido pela célula de levedura, em particular uma célu- la de levedura, e geralmente corresponde a um consumo de oxigênio inferior a 5 mmol/lh, em particular a um consumo de oxigênio inferior a 2,5 mmol/lh ou inferior a 1 mmol/lh De mais preferencia, 0 mmol/l/ h é consumido (ou seja, o consumo de oxigênio não é detectável. Isso de um modo geral corresponde a uma concentração de oxigênio dissolvi- do no caldo de cultura de menos de 5% da saturação do ar, em parti- cular a uma concentração de oxigênio dissolvido de menos de 1 % de saturação do ar ou menos de 0,2% da saturação do ar.

[0060] O termo "levedura" ou "célula de levedura" se refere a um grupo filogeneticamente diverso de fungos unicelulares, a maioria dos quais estão na divisão de Ascomycota e Basidiomycota. As leveduras que brotam ("leveduras verdadeiras") são classificadas na ordem Sac- charomycetales, com Saccharomyces cerevisiae como as espécies mais conhecidas.

[0061] O termo "recombinante", conforme usado aqui, neste pedi- do de patente, se refere a uma célula que contenha ácido nucleico que é o resultado de uma ou mais modificações genéticas usando a(s) téc- nica(s) de DNA recombinante e/ou outra(s) técnica(s) de mutagêne- se(s). Em particular, uma célula recombinante pode compreender áci- do nucleico não presente em uma célula de tipo original corresponden- te, qual ácido nucleico foi introduzido nessa cepa (célula) usando téc- nicas de DNA recombinante (uma célula transgênica) ou qual ácido nucleico não está presente no referido tipo original é o resultado de uma ou mais mutações - por exemplo, com a utilização de técnicas de DNA recombinante ou outra técnica de mutagênese, como irradiação por UV - em uma sequência de ácido nucleico presente no referido tipo de origem (como um gene que codifica um polipeptídeo do tipo de ori- gem) ou em que a sequência de ácido nucleico de um gene foi modifi- cada para atingir o produto de polipeptídeo (codificando o mesmo) em direção a outro compartimento celular. Além disso, o termo "recombi- nante (célula)", em particular, se refere a uma cepa (célula) da qual as sequências de DNA foram removidas com a utilização de técnicas de DNA recombinante.

[0062] A expressão "ácido nucleico", tal como utilizado aqui, neste pedido de patente, inclui a referência a um polímero desoxirribonucleo- tídeo ou ribonucleotídeo, isto é, um polinucleotídeo, na forma de fila- mento simples ou duplo, e a menos que limitado de outro modo, abrange análogos conhecidos com a natureza essencial dos nucleotí- deos naturais, na medida em que se hibridam com ácidos nucleicos de cadeia simples de uma maneira semelhante aos nucleotídeos que ocorrem na natureza (por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos). Um polinucleotídeo pode ser de tamanho completo ou uma subsequência de um gene estrutural ou regulador nativo ou heterólogo. Salvo indica- ção em contrário, o termo inclui referência à sequência especificada, bem como a sequência complementar da mesma. Assim, DNAs ou RNAs com esqueletos modificados para estabilidade ou por outras ra-

zões são "polinucleotídeos", como o termo aqui é pretendido. Além disso, DNAs ou RNAs compreendendo bases incomuns, como inosina, ou bases modificadas, como bases tritiladas, para citar apenas dois exemplos, são polinucleotídeos, como o termo é usado aqui, neste pe- dido de patente. Será apreciado que uma grande variedade de modifi- cações foram feitas no DNA e no RNA que servem a muitos propósitos úteis conhecidos pelos versados na técnica. O termo polinucleotídeo, tal como é empregado aqui, neste pedido de patente, abrange tais formas de polinucleotídeos quimicamente, enzimaticamente ou meta- bolicamente modificadas, bem como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células, incluindo, entre outras coisas, células simples e complexas.

[0063] Quando uma enzima é mencionada com referência a uma classe de enzimas (EC), a classe de enzimas é uma classe em que a enzima é classificada ou pode ser classificada, com base na Nomen- clatura Enzimática fornecida pelo Nomenclatura Comitee of the Intena- tional Union os Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), cuja nomenclatura pode ser encontrada em http://www.chem.qmul.ac.uk/ iubmb/ enzyme/. Outras enzimas adequadas que ainda não foram classificadas em uma classe especificada, mas podem ser classifica- das como tais devem ser incluídas.

[0064] Se referido aqui, neste pedido de patente, a uma sequência de proteína ou de ácido nucleico, como um gene, por referência a um número de acesso, esse número é usado em particular para se referir a uma sequência de proteína ou ácido nucleico (gene) com uma se- quência que pode ser encontrada via www.ncbi.nlm.nih.gov/ (conforme disponível em 14 de junho de 2016), salvo indicação em contrário.

[0065] A expressão "homólogo funcional" (ou em suma "homólo- go") de um polipeptídeo que possui uma sequência específica (por exemplo, SEQ ID NO: X), como utilizado aqui, neste pedido de paten-

te, se refere a um polipeptídeo que compreende a referida sequência específica com a condição de que um ou mais aminoácidos são substi- tuídos, deletados, adicionados e/ou inseridos e cujo polipeptídeo pos- sui (qualitativamente) a mesma funcionalidade enzimática para con- versão do substrato.

Esta funcionalidade pode ser testada através do uso de um sistema de ensaio que compreende uma célula de levedura recombinante que compreende um vetor de expressão para a expres- são do homólogo em levedura, o referido vetor de expressão compre- endendo uma sequência de ácido nucleico heteróloga operacional- mente ligada a um promotor funcional na levedura e a referida se- quencia heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo ho- mólogo cuja atividade enzimática na célula de levedura deve ser tes- tada e avaliar se a referida conversão ocorre nas referidas células.

Os homólogos candidatos podem ser identificados com a utilização de análises de similaridade in sílica.

Um exemplo detalhado dessa análise é descrito no Exemplo 2 da WO 2009/013159. O versado na técnica será capaz de derivar a partir de como os homólogos candidatos ade- quados podem ser encontrados e, opcionalmente após a otimização do códon (par), será capaz de testar a funcionalidade necessária des- ses homólogos candidatos usando um sistema de ensaio adequado, como descrito acima.

Um homólogo adequado representa um polipep- tídeo com uma sequência de aminoácidos semelhante a um polipeptí- deo específico de mais de 50%, de preferência de 60% ou mais, em particular de pelo menos 70%, mais em particular de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% e com a funcionalidade enzimática necessária.

No que diz respeito às sequências de ácidos nucleicos, o termo homólogo funcional pretende incluir sequências de ácidos nucleicos que diferem de outra sequência de ácidos nucleicos devido à degenerescência do código genético e codificam a mesma sequência polipeptídica.

[0066] A identidade de sequência é definida aqui, neste pedido de patente, como uma relação entre duas ou mais sequências de amino- ácidos (polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais sequências de áci- do nucleico (polinucleotídeo), conforme determinado pela comparação das sequências. Geralmente, as identidades ou semelhanças das se- quências são comparadas em todo o comprimento das sequências comparadas. Na técnica, "identidade" também significa o grau de rela- ção entre sequências de aminoácidos ou sequências de ácidos nuclei- cos, conforme o caso, conforme determinado pela correspondência entre as sequências dessas sequências.

[0067] É dito que as sequências de aminoácidos ou nucleotídeos são homólogas quando exibem um certo nível de similaridade. Duas sequências sendo homólogas indicam uma origem evolutiva comum. Se duas sequências homólogas estão intimamente relacionadas ou mais distantes é indicado por "percentagem de identidade" ou "percen- tagem de similaridade", que é alta ou baixa, respectivamente. Embora contestado, para indicar "percentagem de identidade" ou "percenta- gem de similaridade", "nível de homologia" ou "percentagem de homo- logia" são frequentemente usados de forma intercambiável. Uma com- paração de sequências e determinação da percentagem de identidade entre duas sequências podem ser realizadas com a utilização de um algoritmo matemático. A pessoa versada na técnica estará ciente do fato de que vários programas de computador diferentes estão disponí- veis para alinhar duas sequências e determinar a homologia entre du- as sequências (Kruskal, JB (1983).An overwiew on sequence copari- son em D, Samkof and J, Krustal, eds.) An overview of sequence com- parison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley).). A identidade percentual entre duas se- quências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo

Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências. (Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). O algoritmo alinha sequências de aminoácidos e sequências de nucle- otídeos. O algoritmo Needleman-Wunsch foi implementado no pro- grama de computador NEEDLE. Para os fins desta invenção, foi utili- zado o programa NEEDLE do pacote EMBOSS (versão 2.8.0 ou supe- rior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp276—277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Com relação à sequên- cias de proteínas, o EBLOSUM62 é usado para a matriz de substitui- ção. Para sequências de nucleotídeos, é utilizado EDNAFULL. Outras matrizes podem ser especificadas. Os parâmetros opcionais utilizados para o alinhamento de sequências de aminoácidos são uma penalida- de de folga de 10 e uma penalidade de extensão de folga de 0,5. O especialista compreenderá que todos esses parâmetros diferentes produzirão resultados ligeiramente diferentes, mas que a identidade percentual geral de duas sequências não é significativamente alterada ao usar algoritmos diferentes. Definição de Homologia Global

[0068] A homologia ou identidade é a porcentagem de correspon- dências idênticas entre as duas sequências completas na região ali- nhada total, incluindo quaisquer lacunas ou extensões. A homologia ou identidade entre as duas sequências alinhadas é calculada da seguin- te forma: Número de posições correspondentes no alinhamento mos- trando um aminoácido idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento, incluindo as lacunas. A identidade definida como aqui pode ser obtida na NEEDLE e é rotulada na saída do programa como "IDENTIDADE". Definição de identidade mais longa

[0069] A homologia ou identidade entre as duas sequências ali-

nhadas é calculada da seguinte forma: Número de posições corres- pondentes no alinhamento mostrando um aminoácido idêntico em am- bas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento após subtração do número total de lacunas no alinhamento. A identi- dade definida como aqui pode ser obtida da NEEDLE usando a opção NOBRIEF e é rotulada na saída do programa como "identidade mais longa".

[0070] Uma variante de uma sequência de nucleotídeos ou amino- ácidos divulgada aqui, neste pedido de patente, também pode ser de- finida como uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos que pos- sue uma ou várias substituições, inserções e/ou deleções em compa- ração com a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos especifica- mente divulgada aqui, neste pedido de patente (por exemplo, na de listagem de sequências).

[0071] Opcionalmente, ao determinar o grau de similaridade de aminoácidos, o versado na técnica pode também levar em considera- ção as chamadas substituições de aminoácidos "conservadoras", co- mo ficará claro para o versado na tecnica. As substituições conserva- doras de aminoácidos se referem à permutabilidade de resíduos com cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos que possui cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos que possui cadeias laterais ali- fáticas-hidroxil é serina e treonina; um grupo de aminoácidos que pos- sui cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos que possui cadeias laterais aromáticas é fenila- lanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos que possui ca- deias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de ami- noácidos que possui cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Em uma modalidade, os grupos conservadores de substi- tuição de aminoácidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tiro-

sina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina. Variantes substitucionais da sequência de aminoácidos divulgadas aqui, neste pedido de patente, são aquelas em que pelo menos um resíduo nas sequências divulgadas foi removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. De preferência, a alteração de aminoácidos é conservadora. Em uma modalidade, as substituições conservadoras com relação à cada um dos aminoácidos que ocorrem naturalmente são as seguin- tes: Ala a Ser; Arg para Lys; Asn para Gln ou His; Asp para Glu; Cys para Ser ou Ala; Gln para Asn; Glu para Asp; Gly para Pro; Dele para Asn ou Gln; Ile para Leu ou Val; Leu para Ile ou Val; Lis para Arg; Gln ou Glu; Encontrou-se com Leu ou Ile; Phe para Met, Leu ou Ttyr; Ser para Thr; Thr para Ser; Trp para Tyr; Tyr para Trp ou Phe; e Val para Ile ou Leu.

[0072] As sequências de nucleotídeos podem ser definidas através da sua capacidade de se hibridar com partes de sequências de nu- cleotídeos específicas divulgadas aqui, neste pedido de patente, res- pectivamente, sob condições de hibridação moderadas ou de prefe- rência sob condições rigorosas. Condições de hibridação rigorosas são definidas aqui, neste pedido de patente, como condições que permitem que uma sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 25, de preferência de cerca de 50 nucleotídeos, 75 ou 100 e de mais preferência de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, se hibride a uma temperatura de cerca de 65°C em uma solução que compreende cerca de 1 M de sal, de preferência 6 x SSC ou qualquer outra solução com uma força iônica comparável e lavando a 65°C em uma solução que compreenda cerca de 0,1 M de sal, ou menos, de preferência de 0,2 x SSC ou qualquer outra solução com uma comparação força iôni- ca. De preferência, a hibridação é realizada durante a noite, isto é, pe- lo menos durante 10 horas e de preferência a lavagem é realizada du- rante pelo menos uma hora com pelo menos duas alterações da solu-

ção de lavagem. Estas condições irão normalmente permitir a hibrida- ção específica de sequências com cerca de 90% ou mais de identida- de de sequência.

[0073] Condições moderadas são definidas aqui neste pedido de patente, como condições que permitem que sequências de ácidos nu- cleicos de pelo menos 50 nucleotídeos, de preferência de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, se hibridizem em uma temperatura de cerca de 45°C em uma solução que compreenda cerca de 1 M de sal, de preferência 6 x SSC ou qualquer outra solução com uma força iônica comparável e lavagem em temperatura ambiente em uma solução que compreende cerca de 1 M de sal, de preferência 6 x SSC ou qualquer outra solução com uma força iônica comparável. De preferência, a hi- bridação é realizada durante a noite, isto é, pelo menos durante 10 ho- ras, e de preferência a lavagem é realizada durante pelo menos uma hora com pelo menos duas alterações da solução de lavagem. Estas condições normalmente permitem a hibridação específica de sequên- cias com até 50% de identidade de sequência. O versado na técnica será capaz de modificar essas condições de hibridação, a fim de iden- tificar especificamente sequências que variam de identidade entre 50% e 90%.

[0074] Como usado aqui, neste pedido de patente, "heterólogo" com referência a um ácido nucleico ou proteína é um ácido nucleico ou proteína que se origina a partir de uma espécie estranha ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificado de sua forma nativa na composição e/ou locus genômico por intervenção humana delibe- rada. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um gene estrutural heterólogo é de uma espécie diferente daquela da qual o gene estrutural foi derivado ou, se da mesma espécie, um ou ambos são substancialmente modificados de sua forma original. Uma proteína heteróloga pode se originar a partir de uma espécie estranha ou, se pertencer à mesma espécie, é substancialmente modificada de sua forma original por intervenção humana deliberada.

[0075] A levedura recombinante é de preferência selecionada a partir do grupo de Saccharomycetaceae, como Saccharomyces cere- visiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces beticus, Saccha- romyces fermentati, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces uvarum e Saccharomyces bayanus; Schizosaccharomyces, tais como Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicus, Schi- zosaccharomyces octosporus e Schizosaccharomyces cryophilus; To- rulaspora tais como Torulaspora delbrueckii; Kluyveromyces como Kluyveromyces marxianus; Pichia tais como Pichia stipitis, Pichia pas- toris ou Pichia angusta, Zygosaccharomyces como Zygosaccha- romyces bailii; Brettanomyces tais como Brettanomyces intermedius, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, Brettanomyces nanus, Dekkera Bruxellis e Dekkera anomala; Metschnikowia, Issatchenkia, tais como Issatchenkia orientalis, Kloeckera, como Kloeckera apicula- ta; Aureobasisium como Aureobasidium pullulans. Uma de preferencia é a Saccharomyces cerevisiae.

[0076] A levedura recombinante usada no processo pode compre- ender: - um conjunto constituído pelos genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1, opcionalmente sob controle de forte promotor constituti- vo; - um conjunto constituído por um gene xylA sob controle de forte promotor constitutivo; - um conjunto compreendendo um gene XKS1 sob controle de forte promotor constitutivo; - um conjunto constituído pelos genes araA, araB e araD sob controle de um forte promotor constitutivo;

- supressão de um gene da aldose redutase.

[0077] Em uma modalidade, a levedura recombinante compreende uma exclusão ou interrupção de uma ou mais sequências de nucleotí- deos endógenas que codificam uma aldeído desidrogenase (E.C.

1.2.1.4) ou cuja levedura reduziu a atividade da aldeído desidrogenase em comparação com a levedura de tipo selvagem correspondente.

[0078] Como usado aqui, neste pedido de patente, uma aldeído desidrogenase catalisa pelo menos a seguinte reação: (VII) acetaldeído + NADP+ + H2O ácido acético + NADPH + H+

[0079] As referidas uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam uma aldeído desidrogenase codificam de preferência uma aldeído desidrogenase ALD2, ALD3, ALD4, ALD5 ou ALD6 ou uma enzima que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NO: 16, 27, 28, 29 ou 30, ou uma sequência funcional homó- logos dos mesmos com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, de preferência de pelo menos 60%, de mais de preferência de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, ou cujo homólogo funcional seja derivado, por meio de uma ou mais substituições, dele- ções ou inserções de aminoácidos da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 16, 27, 28, 29 ou 30.

[0080] Essa levedura também pode compreender ainda: - um ou mais genes que codificam para uma enzima com atividade fosfoketolase (PKL) (EC 4.1.2.9 ou EC 4.1.2.22) ou uma en- zima com uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NO: 16, 17, 18 ou 19, ou homólogos funcionais das mesmas, com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, de preferência de pelo menos 60%, e mais preferência de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, ou cujo homólogo funcional seja derivado, por meio de uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 16, 17, 18 ou 19; - um ou mais genes que codificam uma enzima com ativi- dade fosfotransacetilase (PTA) (EC 2.3.1.8) ou uma enzima com uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NO: 20, 21, 22 ou 23 ou seus homólogos funcionais com uma identidade de sequên- cia de pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, de mais de preferência de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou cujo homólogo funcional é derivado, por meio de uma ou mais substituições ou deleções de aminoácidos ou inserções da sequência de aminoáci- dos das SEQ ID NO: 20, 21, 22 ou 23; e/ou - um ou mais genes que codificam uma enzima com ativi- dade de acetato-cinase (ACK) (EC 2.7.2.12) ou uma enzima com uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NO: 24 ou 25, ou seus homólogos funcionais com uma identidade de sequência de em pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, mais de prefe- rência de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou cujo ho- mólogo funcional é derivado, por meio de uma ou mais substituições, deleções ou substituições ou inserções de aminoácidos da sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 24 ou 25.

[0081] Na forma como utilizada aqui, neste pedido de patente, uma fosfoketolase catalisa pelo menos a conversão de D-xilulose 5- fosfato em D-gliceraldeído 3-fosfato e acetil fosfato. A fosfoketolase está envolvida em pelo menos uma das seguintes reações: EC 4.1.2.9: (VIII) D-xilulose-5-fosfato + fosfato  acetil fosfato + D- gliceraldeído 3-fosfato + H2O D-ribulose-5-fosfato + fosfato ↔ acetil fosfato + D- gliceraldeído 3-fosfato + H2O EC 4.1.2.22: (IX) D-frutose 6-fosfato + fosfato  acetil fosfato + D-eritrose

4-fosfato + H2O

[0082] É descrito um ensaio enzimático adequado para medir a atividade da fosfoketolase, como por exemplo,. em Sonderegger et al. (2004, Applied & Environmental Microbiology, 70 (5), pp. 2892-2897). Em uma modalidade, o um ou mais genes que codificam uma enzima com atividade de fosfoketolase codifica uma enzima que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8, ou um homólogo funcional das mesmas com uma identidade de se- quência de pelo menos 50 %, de preferência de pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%. 85%, 90% ou 95%. Sequências de ácido nucleico adequadas que codificam uma enzima que possui fosfoketolase po- dem ser encontradas em um organismo selecionado do grupo de As- pergillus niger, Neurospora crassa, L. casei, L. plantarum, L. planta- rum, B. adolescentis, B. bifidum, B. gallicum, B. animalis, B. lactis, L. pentosum, L. acidophilus, P. chrysogenum, A. nidulans, A. clavatus, L. mesenteroides e O. oenii.

[0083] A célula recombinante pode compreender um ou mais ge- nes (heterólogos) que codificam uma enzima que possui atividade de fosfotransacetilase. Na forma como utilizada aqui, neste pedido de pa- tente, uma fosfotransacetilase catalisa pelo menos a conversão de acetil fosfato em acetil-CoA. Em uma modalidade, o um ou mais genes que codificam uma enzima com atividade fosfotransacetilase codifica uma enzima que possui uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NO: 9, 10, 11 ou 12, ou seus homólogos funcionais com uma identidade de sequência de pelo menos 50% de preferência de pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%. 85%, 90% ou 95%. Sequências de ácidos nucleicos adequadas que codificam uma enzima que possui fosfotransacetilase podem ser encontradas em um organismo selecio- nado a partir do grupo de B. adolescentis, B. subtilis, C. cellulolyticum, C. phytofermentans, B. bifidum, B. animalis, L. mesenteroides, Lacto-

bacillus plantarum, M. thermophila e O. oeniis.

[0084] Como aqui utilizado, uma fosfotransacetilase catalisa pelo menos a conversão de acetil fosfato em acetil-CoA. Sequências de ácidos nucleicos adequadas que codificam uma enzima que possui fosfotransacetilase podem ser encontradas em um organismo selecio- nado do grupo de B. adolescentis, B. subtilis, C. cellulolyticum, C. phytofermentans, B. bifidum, B. animalis, L. mesenteroides, Lactobaci- llus plantarum, M. thermophila e O. oeniis.

[0085] Na forma como utilizada aqui, neste pedido de patente, uma acetato-cinase catalisa pelo menos a conversão de acetato em acetil fosfato.

[0086] A levedura acima é especificamente útil se a composição for um hidrolisado lignocelulósico e pode ser construída com a utiliza- ção de técnicas conhecidas de expressão recombinante. A modifica- ção do co-fator pode ser efetuada antes, simultaneamente ou após qualquer uma das modificações de 1) até 5).

[0087] A célula de levedura recombinante de acordo com a inven- ção pode ser submetida a engenharia evolutiva para melhorar suas propriedades. Os processos de engenharia evolutiva são processos conhecidos. A engenharia evolutiva é um processo em que fenótipos industrialmente relevantes de um micro-organismo, aqui, neste pedido de patente, a célula de levedura recombinante, podem ser acoplados à taxa de crescimento específica e/ou à afinidade através de um nutrien- te, por um processo de seleção natural de configuração racional. A Engenharia Evolutiva é por exemplo descrita em detalhes em Kuijper, M, et al., FEMS, Cell Eucariotic Research 5 (2005) 925-934, WO 2008/ 041840 e WO 2009/ 112472. Depois da engenharia evolutiva, a célula de levedura recombinante fermentadora de pentose resultante é isola- da. O isolamento pode ser executado de qualquer maneira conhecida, como por exemplo, através de separação de células de um caldo de célula de levedura recombinante usado na engenharia evolutiva, por exemplo, colhendo uma amostra de célula ou por filtração ou centrifu- gação.

[0088] Em uma modalidade, a célula de levedura recombinante é livre de marcadores. Como utilizado aqui, neste pedido de patente, o termo "marcador" se refere a um gene que codifica uma característica ou um fenótipo que permite a seleção ou a triagem de uma célula hos- pedeira que contém o marcador. Sem marcadores significa que os marcadores estão essencialmente ausentes na célula de levedura re- combinante. Ser livre de marcadores é particularmente vantajoso quando marcadores de antibióticos foram utilizados na construção da célula de levedura recombinante e são removidos posteriormente. A remoção de marcadores pode ser realizada com a utilização de qual- quer técnica adequada da técnica precedente, como por exemplo, re- combinação intramolecular.

[0089] Em uma modalidade, a célula de levedura recombinante industrial é construída com base em uma célula hospedeira tolerante a um inibidor, em que a construção é conduzida como descrito a seguir aqui, neste pedido de patente. As células hospedeiras tolerantes a ini- bidores podem ser selecionadas através de seleção de cepas para crescimento em materiais que contenham inibidores, como ilustrado em Kadar et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), vol. 136-140, 847- 858, em que foi selecionada uma cepa ATCC 26602 de S. cerevisiae tolerante a inibidores.

[0090] A levedura recombinante pode compreender as atividades enzimáticas necessárias para a conversão de piruvato em um produto de fermentação desejado, como etanol, butanol (por exemplo, n- butanol, 2-butanol e isobutanol), ácido lático, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumá- rico, ácido málico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propano-diol,

etileno, glicerol, um antibiótico ß-lactâmico ou uma cefalosporina.

[0091] Em uma modalidade, a levedura recombinante é derivada a partir de uma célula de levedura recombinante industrial. Uma célula industrial e uma célula de levedura recombinante industrial podem ser definidas como se segue. Os ambientes vivos das células (células de levedura recombinante) nos processos industriais são significativa- mente diferentes dos do laboratório. As células de levedura recombi- nantes industriais devem ser capazes de ter um bom desempenho sob várias condições ambientais que podem variar durante o processo. Tais variações incluem alterações nas fontes de nutrientes, pH, con- centração de etanol, temperatura, concentração de oxigênio, etc., que juntas têm potencial impacto no crescimento celular e na produção de etanol de Saccharomyces cerevisiae. Sob condições industriais adver- sas, as linhagens tolerantes ao meio ambiente devem permitir cresci- mento e produção robustos. As cepas de células de levedura recombi- nantes industriais são geralmente mais robustas em relação a essas mudanças nas condições ambientais que podem ocorrer nas aplica- ções em que são usadas, como na indústria de panificação, indústria de cerveja, fabricação de vinho e indústria de etanol de biocombustí- vel. Em uma modalidade, a célula de levedura recombinante industrial é construída com base em uma célula hospedeira industrial, em que a construção é conduzida como descrito a seguir. Exemplos de células de levedura industrial (S. cerevisiae) são Ethanol Red® (Fermentis) Fermiol® (DSM) e Thermosacc® (Lallemand).

[0092] A levedura recombinante é de preferência tolerante a inibi- dores, ou seja, eles podem suportar inibidores comuns no nível que normalmente têm com condições comuns de pré-tratamento e hidróli- se, de modo que as células de levedura recombinante possam encon- trar ampla aplicação, ou seja, com alta aplicabilidade para diferentes matérias-primas, diferentes pré-tratamentos métodos e diferentes con-

dições de hidrólise. Em uma modalidade, a célula de levedura recom- binante é tolerante a inibidores. A tolerância ao inibidor é a resistência aos compostos inibidores. A presença e o nível de compostos inibitó- rios na lignocelulose podem variar amplamente com a variação da ma- téria-prima, processo de hidrólise do método de pré-tratamento. Os exemplos de categorias de inibidores são os ácidos carboxílicos, fura- nos e/ou compostos fenólicos. Os exemplos de ácidos carboxílicos são ácido lático, ácido acético ou ácido fórmico. Os exemplos de furanos são furfural e hidroximetilfurfural. Os exemplos ou compostos fenólicos são vanilina, ácido sérico, ácido ferúlico e ácido cumárico. As quanti- dades típicas de inibidores são para ácidos carboxílicos: vários gramas por litro, até 20 gramas por litro ou mais, dependendo da matéria- prima, do pré-tratamento e das condições de hidrólise. Para furanos: várias centenas de miligramas por litro até vários gramas por litro, de- pendendo da matéria-prima, do pré-tratamento e das condições de hi- drólise. Para fenólicos: várias dezenas de miligramas por litro, até um grama por litro, dependendo da matéria-prima, do pré-tratamento e das condições de hidrólise.

[0093] Em uma modalidade, a célula de levedura recombinante é uma célula que é naturalmente capaz de fermentação alcoólica, de preferência, fermentação alcoólica anaeróbica. Uma célula de levedura recombinante tem de preferência uma alta tolerância ao etanol, uma alta tolerância ao pH baixo (isto é, capaz de crescer em um pH menor que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3 ou cerca de 2,5) e em direção a uma alta tolerância orgânica e/ou uma alta tolerância à temperaturas elevadas.

[0094] A levedura recombinante compreende, ou é transformada com ou é geneticamente modificada com uma sequência de nucleotí- deos que não ocorrem naturalmente na célula em questão. Técnicas para a expressão recombinante de enzimas em uma célula, bem como para modificações genéticas adicionais de uma célula de levedura re- combinante são bem conhecidas dos versados na técnica. Tipicamen- te, essas técnicas envolvem a transformação de uma célula com um construto de ácido nucleico que compreenda a sequência relevante. Tais métodos são, por exemplo, conhecidos em manuais padrão, co- mo Sambrook e Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Ma- nual (3ª edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ou F. Abusable et al., eds., "Current protocolos in molecular biology", Green Publishing e Wiley Interscience, New York (1987). Métodos para transformação e modificação genética de células hospedeiras fúngicas são conhecidos, por exemplo, nas EP-A- 0635574, WO 98/46772, WO 99/60102, WO 00/37671, WO 90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635574 e US 6.265.186.

[0095] O processo para a produção de etanol é um processo de fermentação que é de preferência executado em uma temperatura ideal para a levedura. Dessa forma, para a maioria das células de le- vedura recombinante, o processo de fermentação é realizado em uma temperatura inferior a cerca de 50°C, inferior a cerca de 42ºC ou inferi- or a cerca de 38°C.

[0096] Os processos de fermentação podem ser realizados em lote, lote alimentado ou modo contínuo. Um processo separado de hi- drólise e fermentação (SHF) ou um processo simultâneo de sacarifica- ção e fermentação (SSF) também pode ser aplicado. Uma combinação desses modos de processo de fermentação também pode ser possível para uma produtividade ideal.

[0097] A recuperação do etanol é conhecida na técnica e pode compreender técnicas de fracionamento e adsorção. Por exemplo, uma cerveja ainda pode ser usada para processar um produto fermen- tado, que contém etanol em uma mistura aquosa, para produzir uma mistura que contenha etanol enriquecido que é então submetida a fra-

cionamento (por exemplo, destilação fracionada ou outras técnicas si- milares). Em seguida, as frações que contêm as maiores concentra- ções de etanol podem ser passadas através de um adsorvedor para a remoção da maior parte, se não de toda a água restante do etanol. Em uma modalidade além da recuperação do produto de fermentação, a levedura pode ser reciclada. Os exemplos não limitativos que se se- guem se destinam a ser meramente ilustrativos. Exemplos Materiais e Métodos Meios

[0098] As fermentações são realizadas com a utilização de meios sintéticos (Luttik 2000) e industriais (hidrolisado de palha de milho, mosto de milho). Sempre que as cepas são aplicadas com uma auxo- trofia de histidina, os meios são suplementados com 200 mg/l de histi- dina. O meio de hidrolisado da panela de milho é preparado diluindo um hidrolisado de 17% ds da panela de milho 1,5 vezes com água desmineralizada e complementando-o com 24g/l de xilose, 1 g/ l de ureia e glicerol em quantidade equimolar ao acetato no hidrolisado. Para evitar o crescimento de qualquer contaminante bacteriano pre- sente no hidrolisado, são adicionados neomicina e penicilina G em uma concentração final de 50 μg/mL e 100 μg/mL, respectivamente. Aproximadamente 250 μo/l de anti espuma de silicone (Dow Corning 1520) são adicionados para evitar a formação de espuma. O hidrolisa- do aplicado foi previamente pré-tratado com ácido diluído em NREL, pH ajustado (de aproximadamente 1 a 2) para pH 4,5 usando amônia 2M e subsequentemente hidrolisado enzimaticamente usando o co- quetel enzimático proprietário da DSM. Antes da fermentação, o pH do meio é ajustado para 5,5 com 2M KOH.

[0099] O mosto de milho é preparado misturando 30% p/p de sóli- dos de milho moído (Limagrain Westhove Maize L3) com água desmi-

neralizada, ajustando o pH para 5,5 com H2SO4 2M, adição de 0,02% p/p de alfa-amilase (Termamyl, Novozymes) e incubando durante 4 horas a 80°C em um agitador rotativo (150 RPM). A ureia (1,25 g/l) é adicionada como fonte de N. Para imitar as concentrações de ácido acético encontradas nas plantas de etanol de milho, o material tritura- do é suplementado com 1,5 g/l de ácido acético e o pH é ajustado para 5,0 coim a utilização de 2M H2SO4/ KOH. No início da fermentação, são adicionados 0,16 g/kg de glucoamilase (Spirizyme, Novozymes). Condições de pré-cultura

[00100] Uma faixa de cultura de estoque congelada (glicerol) é ris- cada na placa YhPD (extrato de levedura 10g/l, fito-tom 20g/l, 20 g/l de glicose e ágar de 15 g/l) e incubada durante 3 dias a 30°C. 3 colônias são transferidas da placa de ágar para um balão de agitação de 500 mL contendo 200 mL de um meio mineral (Luttik et al., 2000), em pH 6,0, ajustado com KOH 6N. As culturas são incubadas de um dia para o outro (17 a 20 horas) em uma incubadora agitadora (200 rpm) a 30°C. Depois o peso do conteúdo da célula seca (DCW), o conteúdo da cultura é determinado por filtragem (ver Dry Cell weight determina- tion). Uma quantidade de pré-cultura correspondente á quantidade de inoculação necessário para a fermentação é centrifugada, (3 min, 13500 x g) lavada uma vez com um volume de cultura frio (4°C) de água desmineralizada estéril, centrifugada mais uma vez, ressuspensa em meio de fermentação e transferida para o fermentador. Condições de Fermentação

[00101] As fermentações são realizadas em sistemas de mini bior- reator DASbox (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) de 250 mL, com volume de trabalho de 200 mL. As fermentações são controladas pela temperatura em 32°C, agitadas a 300 RPM e, onde indicado, o pH é limitado ao valor superior designado pela adição controlada de 2M de H2SO4. Para garantir condições anaeróbicas, o espaço livre é aumen-

tado com 50 mL/ min de N2. Cepas

[00102] A cepa YD01437 foi descrita em detalhe em PCT/ EP 2014/ 068325/ WO 2015/028583, e especificamente nos exemplos 6 e 7, ce- pa T5. Análises de amostras

[00103] O peso das células secas é determinado através da filtra- gem de uma quantidade conhecida de amostra de caldo de fermenta- ção sobre filtros de nitrocelulose pré-pesados (tamanho de poro 0,45 mm) e lavando a biomassa de levedura com água desmineralizada, secando durante 4 horas a 103°C e pesando. Os metabólitos no caldo de fermentação são determinados por análises por HPLC no sobrena- dante das amostras de caldo depois da centrifugação. O método apli- cado é descrito em detalhes na WO 2016/097202. Com relação a amostras de SSF, 1 mL/l de uma solução estoque de acarbose de 10 g/ l é adicionado às amostras para interromper a atividade da glucoa- milase. Exemplo 1 Meio sintético

[00104] Meio sintético (luttik 2000), com 10% m/v de glicose, 1,5 g/l de ácido acético, (iniciando) pH 5,5, ajustado com 2M KOH. Passo 0,5 g CDW/L YD01437. Sem controle de pH (A)

[00105] O ácido acético é convertido à medida que as cepas cres- cem de forma anaeróbica, o pH sobe para aproximadamente 7,0, pon- to em que a conversão é parada devido a um nível mínimo de ácido acético não dissociado, apesar da presença de aproximadamente 0,54 g/l de acetato total. O crescimento do fermento, portanto, para ou é muito lento. pH mantido em 5,5 (B)

[00106] O ácido acético é convertido na medida em que as cepas crescem de forma anaeróbica, porém o pH permanece em 5,5. Dessa forma, a conversão e o crescimento do ácido acético continuam por mais tempo (em comparação com A) até atingir o limite mínimo de aproximadamente 50 µM de ácido acético não dissociado, antes que a glicose se esgote. O acetato total restante é agora muito menor; apro- ximadamente 0,001 g/l, levando a um maior rendimento de etanol. Exemplo 2 Hidrolisado de lignocelulose

[00107] Hidrolisado de milho amassado, passo 0,5 g CDW/l YD01437. Sem controle de pH (C)

[00108] O ácido acético é convertido (co-conversão com glicerol), o pH sobe para 7,1, ponto em que é interrompido devido a um limite mí- nimo de aproximadamente 50 µM de ácido acético não dissociado, apesar da presença de aproximadamente 2,5 g/l de acetato total. A conversão de açúcar (xilose) continua até o esgotamento. pH mantido em 5,5 (D)

[00109] O ácido acético é convertido (co-conversão com glicerol), mas o pH permanece em 5,5; portanto, a conversão do ácido acético continua por mais tempo (em comparação com C) até atingir também o limite mínimo de aproximadamente 50 µM de ácido acético não dis- sociado, antes que a xilose se esgote. O acetato total restante é agora muito menor; ~ 0,02 g/l, levando a um maior rendimento de etanol. Exemplo 3 Mosto de milho

[00110] Mosto de milho, passo 0,075 g CDW/l YD01437. Sem controle de pH (C)

[00111] O ácido acético é convertido à medida que as cepas cres- cem anaerobicamente, o pH sobe para 7,0, altura em que é parado devido a ter atingido um limiar mínimo de aproximadamente 50µM de ácido acético não dissociado, apesar da presença de acetato total re- sidual. O crescimento da levedura ou para ou é muito lento devido à ausência do redox afundar. A glicose livre se acumula devido à falta de crescimento, apresentando estresse osmótico para a levedura. A con- versão da glicose progride a uma taxa incrementalmente mais lenta ou pode parar completamente. pH mantido em 5,5 (D)

[00112] O ácido acético é convertido à medida que as cepas cres- cem anaerobicamente, mas o pH permanece em 5,5, portanto a con- versão do ácido acético continua por mais tempo (em comparação com o C) até também atingir o limiar mínimo de aproximadamente 50µM de ácido acético não-desmembrado, antes que a glicose se es- gote. O acetato total restante é agora muito mais baixo; aproximada- mente 0,001 g/L, levando a uma maior produção de etanol.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a produção de etanol a partir de uma composição compreendendo glicose e entre 50 µM e 100 mM de ácido acético, caracterizado pelo referido processo compreender: - fermentação da referida composição na presença de uma levedura recombinante que é capaz de converter o ácido acético anae- robicamente; - manutenção da quantidade de ácido acético não dissocia- do a um valor de pelo menos 50 µM; e - recuperação do etanol.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que a etapa de manutenção da quantidade de ácido acético dissociado para um valor de pelo menos 50 µM compreende: - monitorar a quantidade de ácido acético não dissociado na composição e se a quantidade de ácido acético não dissociado cair abaixo de 50 µM; - adição de ácido à composição até que a quantidade de ácido acético não dissociado atinja um valor de pelo menos 50 µM, de preferência adicionando um ácido.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que a etapa de manutenção da quantidade de ácido acético dissociado para um valor de pelo menos 50 µM compreende: - monitorar a quantidade de ácido acético não dissociado na composição e se a quantidade de ácido acético não dissociado se aproxima de 50 µM, mas antes que a quantidade desça abaixo de 50 µM: - adição de ácido à composição até que a quantidade de ácido acético não associado atinja um valor acima de 50µM, de prefe- rência adicionando um ácido.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a levedura recombinante compreende: - uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzi- ma com atividade de acetildeído desidrogenase acetilante (EC

1.2.1.10 ou EC 1.1.1.2); - uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzi- ma com atividade de acetil-CoA sintetase (E.C.6.2. 1.1); e opcional- mente, - uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzi- ma que possui atividade desidrogenase dependente de NAD (EC

1.1.1.1).

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a levedura recombinante compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzi- ma que possui atividade de glicerol desidrogenase.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a levedura recombinante compreende um ácido nucleico que codifica uma enzima que possui atividade de di-hidroxiacetona cinase.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a levedura recombinante compreende uma deleção ou interrupção de uma ou mais sequências de nucleotídeos endógenas que codificam uma glicerol-3-fosfato desi- drogenase.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a levedura recombinante compreende uma deleção ou interrupção de uma ou mais sequências de nucleotídeos endógenas que codificam uma glicerol 3-fosfato fosfo- hidrolase, como S. cerevisiae GPP1 ou GPP2.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a levedura recombinante compreende um transportador de glicerol.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a levedura recombinante compreende uma exclusão ou interrupção de uma ou mais sequências de nucleotídeos endógenas que codificam um aldeído desidrogenase ou cuja levedura reduziu a atividade da aldeído desidrogenase em comparação com a levedura de tipo selvagem correspondente.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracteri- zado pelo fato de que as referidas sequências de nucleotídeos codifi- cam aldeído desidrogenase ALD2, ALD3, ALD4, ALD5 e/ou ALD6, pre- ferencialmente ALD6.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, ca- racterizado pelo fato de que o fermento compreende ainda: - um ou mais genes que codificam uma enzima com ativi- dade de fosfocetolase (PKL) (EC 4.1.2.9 ou EC 4.1.2.22) ou uma en- zima com uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8 ou seus homólogos funcionais com uma identidade de sequência de pelo menos 50%, e - um ou mais genes que codificam uma enzima com ativi- dade fosfotransacetilase (PTA) (EC 2.3.1.8) ou uma enzima com uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NO: 9, 10, 11 ou 12, ou seus homólogos funcionais com uma identidade de sequência de pelo menos 50%; e ou - e/ou um ou mais genes que codificam uma enzima com atividade de acetato-cinase (ACK) (EC 2.7.2.12) ou uma enzima com uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NO: 1 ou 2, ou seus homólogos funcionais com uma sequência identidade de pelo menos 50%.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a composição é um hidroli- sado de biomassa lignocelulósica.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a composição é um hidroli- sado de amido, tal como um hidrolisado de amido de milho.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a levedura é uma Saccha- romyces cerevisiae.