CN107345211A - 引入外源多肽的活细胞脂质体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种引入外源多肽的活细胞脂质体，以经Δ6‑去饱和酶基因重组的工程菌为载体，引入外源多肽被包裹进所述经Δ6‑去饱和酶基因重组的工程菌的脂滴内。本发明还公开一种引入外源多肽的活细胞脂质体的制备方法及应用。本发明具有如下有益效果：经双酶切鉴定，重组质粒上的目的片段插入方向正确；实现了D6D的稳定、长久表达；实时荧光定量PCR表明D6D的表达水平提高了2倍左右；经气相色谱法分析，转化菌株中的GLA较野生菌株提高了3.3倍多；花生四烯酸提高很多。

Description

引入外源多肽的活细胞脂质体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种引入外源多肽的活细胞脂质体及其应用。

背景技术

许多不饱和脂肪酸因其广泛的生理活性和其在人类健康、营养方面的重要作用越来越受人们关注；多肽药物又因其半衰期短、易被酶降解而限制了应用。

微生物油脂的合成过程与动植物几乎相似，最主要的部分就是脂肪酸的合成，主要有两种胞质酶系催化，乙酰CoA羧化酶和脂肪酸合酶复合体，以乙酰CoA为碳源经过多次碳链延长合成饱和脂肪酸，或再经过去饱和作用合成不饱和脂肪酸。在去饱和过程中主要由各种去饱和酶负责催化，是合成长链不饱和脂肪酸的关键，能在脂肪酸碳链上引入C＝C双键，提高脂肪酸的不饱和度，酵母中广泛存在脂肪酸去饱和酶。

而合成不饱和脂肪酸的酶分为两种，甲基定向和羧基定向的脂肪酸去饱和酶。甲基定向的脂肪酸去饱和酶从甲基端固定的碳原子处引入碳碳双键，被称为ω-去饱和酶；羧基定向的脂肪酸去饱和酶从羧基端固定的碳原子处引入碳碳双键，被称为Δ(delta)-去饱和酶，也称为“front-end”去饱和酶。Δ9-去饱和酶将第一个碳碳双键引入饱和脂肪酸中，第二个碳碳双键由Δ12和Δ6-去饱和酶负责引入，Δ15去饱和酶则负责引入第三个双键。

在细胞合成18C饱和脂肪酸后，硬脂酸经硬脂酰-CoA去饱和酶去饱和得到油酸；油酸经Δ12-去饱和酶催化生成亚油酸，经Δ15-去饱和酶合成α-亚麻酸(ALA)；亚油酸经Δ6-去饱和酶催化生成γ-亚麻酸GLA。其中，Δ6-去饱和酶是GLA合成途径中的关键酶，第一次克隆出Δ6-去饱和酶是1993年从蓝藻中分离克隆得到的，第一次通过生物技术获得GLA是在1996年在土豆中表达蓝藻的Δ6-去饱和酶基因生产GLA。GLA在人体中进一步脱氢延长形成花生四烯酸(AA)、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质，对人体有重要生理意义，因而近年人们对Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的研究热度较高，也取得了较大进展。

虽然已经有多篇报道表明，表达外源Δ6-脂肪酸脱氢酶在酵母中会使GLA含量增加，但是迄今为止，尚未出现利用基因工程构建可以高产γ-亚麻酸(GLA)的酵母菌菌株的报道。

α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)是属于黑皮质家族，是由阿黑皮素原(POMC)派生出来的一种内源性神经肽，由13个氨基酸构成的短肽，在自然界以阳离子的形式存在，是所有黑皮质激素肽的前体蛋白，由脑垂体负责分泌表达。尽管α-MSH是由脑垂体产生的，但是在防御细胞、外周组织如皮肤都有它的身影，说明其免疫调节特性。α-MSH的生理特性说明了其在机体免疫特别是固有免疫中的重要性以及在抗菌方面也可发挥重要作用。目前对α-MSH应用比较广泛的是其抗炎症作用，因其能调节许多炎症因子，说明具有强大的抗炎功能。α-MSH对几乎所有类型的炎症都有强大的抑制作用，包括急性炎症、慢性炎症、系统炎症、局部炎症、过敏性炎症以及中枢神经系统的抗炎，作用可通过中枢、外周在多种内分泌、免疫调节系统发挥作用。但由于α-MSH本身也存在着缺点，其半衰期较短，在体内半衰期只有20多分钟，所以现行的给药方式是注射，且需不断注射来维持药效，给病人带来不便和痛苦，如果直接口服多肽，体内消化道的酶会将其降解，所以需要开发一种新的口服给药方式来实现这种肽的应用。

H22LP是我们实验室前期筛选得到的广谱趋化因子受体US28拮抗肽。US28作为人类巨细胞病毒(HCMV)编码的4个七跨膜趋化因子受体之一，是一个广谱的CC类炎症趋化因子受体，在HCMV感染的细胞中对β趋化因子的结合和钙流信号诱导起重要作用。我们通过对US28进行跨膜结构域和结合模拟位的预测，寻找出其N端与趋化因子激动的部位，合成相应部位的多肽，最终筛选出能阻断US28与其对应的CC类趋化因子相互作用、具有更少免疫原性和更强活性以用来作为拮抗剂的小分子先导物H22LP，经前期实验证明H22LP可以通过直接与病毒颗粒作用来达到抑制HCMV的效果。

多肽药物因其半衰期短、体内易被酶分解等特点不适合口服，从而限制了它的应用，需要探索新的口服载体。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明的第一目的是提供一种引入外源多肽的活细胞脂质体。

本发明的第二目的是提供所述引入外源多肽的活细胞脂质体的应用。

为解决上述的技术问题，本发明采用如下技术方案：一种引入外源多肽的活细胞脂质体，以经Δ6-去饱和酶基因重组的工程菌为载体，引入外源多肽被包裹进所述经Δ6-去饱和酶基因重组的工程菌的脂滴内。

所述工程菌为导入Δ6-去饱和酶(D6D)基因重组的粘红酵母GM4-D6D。

所述外源多肽可以是GLA、α-MSH或者多肽H22LP。H22LP是实验室前期筛选得到的广谱趋化因子受体US28拮抗肽。US28作为人类巨细胞病毒(HCMV)编码的4个七跨膜趋化因子受体之一，是一个广谱的CC类炎症趋化因子受体，在HCMV感染的细胞中对β趋化因子的结合和钙流信号诱导起重要作用。我们通过对US28进行跨膜结构域和结合模拟位的预测，寻找出其N端与趋化因子激动的部位，合成相应部位的多肽，最终筛选出能阻断US28与其对应的CC类趋化因子相互作用、具有更少免疫原性和更强活性以用来作为拮抗剂的小分子先导物H22LP，经前期实验证明H22LP可以通过直接与病毒颗粒作用来达到抑制HCMV的效果。

所述Δ6-去饱和酶(D6D)由刺孢小克银汉霉的D6D基因的分离与扩增得到的。

Δ6-去饱和酶(D6D)基因重组的粘红酵母GM4-D6D的构建方法,其包括的步骤如下：

(1)表达载体pPGK1Z-rD-ME的抽提；

(2)连接PGK1基因和D6D基因；

(3)PGK1-D6D片段与表达载体载体的双酶切反应、连接。

表达载体pPGK1Z-rD-ME的抽提的方法的步骤如下：

(1)将含有pPGK1Z-rD质粒的大肠杆菌DH5α接种到装有5mLLB-amp培养基中，于37℃下250rpm振荡培养过夜；

(2)吸取1.5mL过夜菌液于离心管中，4℃下12000rpm离心1分钟，弃上清；

(3)用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将菌体沉淀悬浮于200μLSTET缓冲液中，用涡旋混合器充分混匀；

(4)加入4mL新配制的溶菌酶溶液，混匀后于室温下静置5分钟；

(5)用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45秒，取出后立刻12000rpm离心5分钟；

(6)用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8mL5％CTAB，用混合器混匀后，13000rpm离心5分钟，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体；

(7)加入1.2M NaCl 300mL，充分溶解沉淀物，再加入750mL的预冷乙醇，充分混匀后，13000rpm离心15分钟，弃上清液；

(8)取1mL 70％冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，13000rpm离心5min，弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥5-10min；

(9)沉淀物溶于50mL TE缓冲液中，混合器混匀，于-20℃保存备用。

连接PGK1基因和D6D基因的引物为：

PGK1-Bam HI primer1：

5′-CGCGGATCCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC-3′(Bam HI)

PGK1-XhoIprimer2：

5′-TATCCGCTCGAGTGTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAGATGTCGCCTATTATT-3′(XhoI)

D6D-XhoIprimer1：

5′-TCTGCTTTCTTCGCTCCGCTCGAGATGTCAGGGCAAACTCGAG-3′(XhoI)

D6D-XhoIprimer2：

5′-CATGCCATGGATCATCTAAAACATCTTTTGAGAG-3′(NcoI)。

粘红酵母与D6D基因片段的摩尔比要控制在1:3-10。

一种引入外源多肽的活细胞脂质体的制备方法，包括的步骤如下：

(1)制备工程菌株GM4-D6D菌株感受态细胞。

(2)将10μg修饰了的外源多肽(FITC-αMSH和FITC-H22LP)溶解后与感受态细胞混合后共100μL，加入到0.2cm已预冷的电转化杯中；

(3)电击化；

(4)电击结束后，立即向转化杯中加入900μL预冷的1M山梨醇溶液，用枪轻微吸打混匀，然后将其转至灭过菌的离心管中，30℃静置lh，离心后加入1mL新鲜的YPD培养基重悬菌体，30℃，200rpm摇1小时；

(5)最后得到的菌株分别命名为GM4-D6D-FαMSH和GM4-D6D-FH22LP。

所述电击化包括的步骤如下：

(1)将80μL己制备好的感受态细胞与20μL(约10μg)已线性化好的待转化质粒DNA混合,加入到0.2cm已预冷的电转化杯中；

(2)将装有混合液的电转化杯冰浴5min；

(3)调整好电转仪的参数:电压1.5kV，电容25uF，电阻200Ω，电击持续时间约为5ms左右；

(4)电击结束后，立即向转化杯中加入1mL预冷的1M山梨醇溶液,用枪轻微吸打混匀,然后将其转至灭过菌的离心管中,30℃静置lh，然后加入1mL新鲜的YPD培养基，30℃，200rpm摇1小时；

(5)室温下3000rpm，离心4min，用200μL ddH2O重悬菌体；

(6)将消液涂布于YPD平板(含50μL Zeocin)，置于30℃培养箱中培养2-3d,直到长出单菌落为止。

粘红酵母是一株高产油脂菌株，其自身的脂肪酸组成与植物油脂相似，且含有多种有益成分，如类胡萝卜素、L-苯丙氨酸、不饱和脂肪酸等。以高产GLA的粘红酵母载体，通过电穿孔将外源多肽药物转入酵母胞内，并因多肽的亲脂性而进入富含GLA的脂滴内，通过口服整个酵母来实现GLA和外源多肽药物的同时传递。

引入外源多肽的活细胞脂质体在多肽药物中的应用，可以制成生物胶囊。

引入外源多肽的活细胞脂质体在肽类分子相关功能性食品制备中的应用，可以制成保健食品等，可以是粉剂或者口服液等。

本发明具有如下有益效果：成功构建了外源基因D6D表达载体pPGK1Z-rD-D6D，经双酶切鉴定，重组质粒上的目的片段插入方向正确；将重组质粒导入粘红酵母中，经转化菌株PCR鉴定，重组质粒成功导入粘红酵母中并插入到粘红酵母的基因组中，实现了D6D的稳定、长久表达；实时荧光定量PCR表明D6D的表达水平提高了2倍左右；经气相色谱法分析，转化菌株中的GLA较野生菌株提高了3.3倍多；GM4-D6D-αMSH组的小鼠的血清和肝脏中亚油酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸的相对含量较Normal组的显著增加，其中血液中GM4-D6D-αMSH组的GLA含量较Normal组提高了约7.26倍，花生四烯酸提高了约1.55倍；肝脏中GM4-D6D-αMSH组的GLA含量较Normal组提高了约4.33倍，花生四烯酸提高了约1.28倍；因为本身GM4-D6D-αMSH菌株可产生较多的γ-亚麻酸，所以小鼠口服会使血清中的GLA的含量增多，同时与对照组相比，GM4-D6D-αMSH组中花生四烯酸增多可能是因为部分γ-亚麻酸向花生四烯酸转化。

附图说明

图1是粘红酵母整合表达载体pPGK1Z-rD-D6D的构建的技术路线图；

图2是菌落形态图观察照片；

图3是PGK1(A)和D6D(B)基因的PCR扩增条带图；

图4是粘红酵母转化菌株GM4-D6D的插入片段D6D的PCR检测图(其中1、2、3道为重组菌株，4、5、6道为空载体菌株)；

图5是重组质粒pPGK1Z-rD-D6D双酶切鉴定图(以pPGK1Z-rD做对照，其中1道为pPGK1Z-rD-D6D，2道为pPGK1Z-rD)；

图6是粘红酵母D6D基因表达水平图；

图7是共聚焦显微镜图片分析FITC标记的多肽进入胞内后的位置油滴用尼罗红染色图，其中(A)红色荧光通道，(B)绿色荧光通道，(C)A和B两张图的叠加图。

图8是电转化进入胞内的多肽的浓度图；

图9是血清中α-MSH的浓度如；

图10是α-MSH的组织分布图。

具体实施例

为了更好地阐述本发明内容，下面用若干较佳的具体实施例进行说明。但这些具体实施例只是为了说明本发明的内容，而不是对本发明内容进行限制。

2.1实验材料与仪器说明

2.1.1菌种

粘红酵母(Rhodotorula glutinis)GM4为GM4为经常规手段筛选并保存；

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)2.1445购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMMCC)；

刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)MIAN6；

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α。

2.1.2质粒

表达载体pPICZ-rD，构建并保存。

2.1.3培养基及主要试剂

(1)YPD培养基(1L)，YPD-zeocin培养基(1L)，Luria-Bertani(LB)培养基(1L)，LB-ampicillin培养基(g/L)，低盐LB-zeocin培养基，Potato dextrose agar(PDA)培养基(g/L)。

(2)STET缓冲液，TE缓冲液，10％SDS，质粒提取液，10xDNA buffer链接缓冲液，Tricine SDS-PAGE电泳试剂。

以上试剂均按现有常规方法配制。

2.2.1目的基因的分离与扩增

2.2.1.1酿酒酵母PGK1基因的分离与扩增

1、分离：

酿酒酵母接种于50mL/250mL YPD液体培养基中，30℃，180rpm培养至OD₆₆₀＝3时离心(12000r/min，5min，4℃)，弃上清，收集菌体。无菌水冲洗菌体两次后离心，后用冷无菌水重悬菌体，菌悬液转至含液氮和1g矾土的研钵中研磨破碎菌体细胞，然后转至5mLDNA提取缓冲液中(50mM TRIS,10mM MgCl₂,50mM NaCl，1％(wt/vol)SDS，pH7.4)的离心管中。经过反复的苯酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀步骤，酿酒酵母DNA被分离出来。

2、PCR扩增：

根据PGK1基因序列，设计引物。

正向引物5′-CGCGGATCCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC-3′(Bam HI)

反向引物5′-TATCCGCTCGAGTGTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAG-3′(XhoI)

PCR反应体系按TakaraPCR反应试剂盒操作(购自宝生物工程(大连)有限公司)。

PCR反应条件如下：

94℃5min，94℃0.5min，55℃1min，72℃1min，72℃10min，30个循环，取5μLPCR扩增产物待经2％琼脂糖凝胶电泳分析。

2.2.1.2刺孢小克银汉霉D6D基因的分离与扩增

1、分离：

刺孢小克银汉霉总RNA的提取操作流程参考Wan和Zhang等人的方法[47]。刺孢小克银汉霉在PDA液体培养基中于28℃，240rpm/min生长3天，菌丝通过过滤收集，并用磷酸盐缓冲液冲洗，加入液氮研磨后迅速转入已加有适量TRIzol(Invitrogen)的离心管中来提取总RNA，用Oligotex mRNA Mini Kit(Qiagen)从总RNA中提取mRNA。

2、PCR扩增：

根据已公布的刺孢小克银汉霉D6D基因序列(GenBank accession number：DQ177498)，设计D6D引物。

正向引物5′-CCGCTCGAGATGTCAGGGCAAACTCGAG-3′(XhoI)

反向引物5′-CATGCCATGGATCATCTAAAACATCTTTTGAGAG-3′(NcoI)

3、反转录(RT)反应：

(1)每次RT反应中，按下表加入各组分：

(2)70℃放置5分钟，然后迅速置于冰上5分钟；

(3)顺次加入如下组分：

(4)37℃反应1小时。

(5)75℃孵育15分钟终止反应，保存于-20℃或直接用于下游实验。

4、PCR反应：

PCR反应体系按TakaraPCR反应试剂盒操作(购自宝生物工程(大连)有限公司)。PCR反应条件：94℃5min，94℃0.5min，55℃1min，72℃1min，72℃10min，30个循环，取5μLPCR扩增产物待经2％琼脂糖凝胶电泳分析。

2.2.1.3凝胶电泳与PCR产物回收

1、凝胶电泳：

(1)制备2％琼脂糖凝胶：称取2g琼脂糖，加入100mL 1×TAE电泳缓冲液，微波炉加热，直至完全融化，加入1.5μl 10mg/ml的EB，摇匀；

(2)将琼脂糖凝胶液冷却至70℃左右，倒入已放好的制胶槽内，冷却直至成凝胶，将凝胶及胶槽取出，放置于电泳槽内，加入1xTAE电泳缓冲液直至浸没凝胶；

(3)把上样缓冲液(溴酚蓝)混合到DNA样品，用移液枪将样品加入到凝胶板的小槽内；

(4)加样后，立即通电进行电泳，电压120V，当溴酚蓝将至凝胶顶端时，停止电泳；

(5)取出凝胶，用含有0.5μg/ml的EB/1xTAE溶液染色30min，再用蒸馏水清洗15min；

(6)在紫外灯下观察，观察到条带后，采用凝胶成像系统拍照保存。

2、PCR产物回收：

使用紫外光显影出目的DNA条带，用切片刀切割相应的琼脂带，置入离心管中；具体操作步骤如下:加入Binding BufferII(7～4μl/1mg琼脂凝胶)，于60℃水浴摇匀，直至完全溶解；将溶解的琼脂凝胶放进UNIQ-10柱子中5min,用收集管收集滤液，8000rpm常温离心15min；弃去收集的废液，取下UNIQ-10柱，入600μl Wash Solution，8000rpm离心2min；将溶解的琼脂凝胶放进UNIQ-10柱子中5min,用收集管收集滤液，8000rpm常温离心15min；取出UNIQ-10柱放于新的离心管中，在柱子膜中央加入40μl Elution Buffer，50℃中放置5min；室温下12000rpm离心1min，液体即为回收DNA，-20℃冻存备用。

2.2.2表达外源D6D整合载体pPGK1Z-rD-D6D的构建

2.2.2.1整合载体pPGK1Z-rD-D6D的构建路线图

利用同源重组原理设计D6D基因整合表达载体，构建技术路线见图1：

2.2.2.2表达载体pPGK1Z-rD-ME的抽提

pPGK1Z-rD质粒为本实验室构建并保存的，按照以下步骤抽提质粒：

(1)将含有pPGK1Z-rD质粒的大肠杆菌DH5α接种到装有5mLLB-amp培养基中，于37℃下250rpm振荡培养过夜；

(2)吸取1.5mL过夜菌液于离心管中，4℃下12000rpm离心1分钟，弃上清；

(3)用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将菌体沉淀悬浮于200μL STET缓冲液中，用涡旋混合器充分混匀；

(4)加入4mL新配制的溶菌酶溶液，混匀后于室温下静置5分钟；

(5)用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45秒，取出后立刻12000rpm离心5分钟；

(6)用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8mL5％CTAB，用混合器混匀后，13000rpm离心5分钟，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体；

(7)加入1.2M NaCl 300mL，充分溶解沉淀物，再加入750mL的预冷乙醇，充分混匀后，13000rpm离心15分钟，弃上清液；

(8)取1mL70％冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，13000rpm离心5min，弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥5-10min；

(9)沉淀物溶于50mL TE缓冲液中，混合器混匀，于-20℃保存备用。

2.2.2.3重叠PCR连接PGK1和D6D

为了实现外源基因D6D在强启动子PGK1的带动下高效表达，我们用Overlap PCR将强启动子PGK1基因和D6D基因片段连接，以保证两个基因片段之间无其他序列，从而避免因其他基因的引入糙造成目的基因表达异常。

用于PGK1和D6D的Overlap PCR引物如下：

PGK1-Bam HI primer1：

5′-CGCGGATCCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC-3′(Bam HI)

PGK1-XhoIprimer 2：

5′-TATCCGCTCGAGTGTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAGATGTCGCCTATTATT-3′(XhoI)

D6D-XhoIprimer1：

5′-TCTGCTTTCTTCGCTCCGCTCGAGATGTCAGGGCAAACTCGAG-3′(XhoI)

D6D-XhoIprimer2：

5′-CATGCCATGGATCATCTAAAACATCTTTTGAGAG-3′(NcoI)

分别以PGK1-Bam HI primer1、PGK1-XhoIprimer 2和D6D-XhoIprimer1、D6D-XhoIprimer2分别扩增PGK1和D6D，5个循环后回收PGK1和D6D片段，以回收的PGK1和D6D片段为共同模板，PGK1-Bam HI primer1和D6D-XhoIprimer2为上、下游引物进行OverlapPCR，得到PGK1-D6D片段。

Overlap PCR反应体系为：

PCR反应条件：94℃5min，94℃0.5min，55℃1min，72℃1min，72℃10min，30个循环。

2.2.2.4 PGK1-D6D片段与载体的双酶切反应、连接

1、将Overlap PCR产物与pPGK1Z-rD分别进行NcoI和Bam HI双酶切

质粒pPGK1Z-rD NcoI/Bam HI双酶切反应体系：

片段PGK1-D6D NcoI/Bam HI双酶切反应体系：

酶切反应在37℃水浴反应3小时。

2、连接反应

酶切反应后,PGK1-D6D片段和载体pPGK1Z-rD分别用回收试剂盒回收纯化,然后用T4DNA连接酶连接双酶切后的载体pPGK1Z-rD和PGK1-D6D片段,构建重组质粒pPGK1Z-rD-D6D。

连接反应反应体系如下:

16℃水浴过夜反应,载体与外源DNA片段的摩尔比要控制在1:3-10。

2.2.3重组质粒pPGK1Z-rD-D6D电转化粘红酵母感受态细胞

2.2.3.1粘红酵母感受态的制备步骤

(1)挑取酵母单菌落接种在5mL YPD液体培养基，于30℃，250rpm振荡培养过夜；

(2)以1％接种量转接至100mL YPD液体培养基，于30℃，250rpm振荡培养至细胞OD₆₀₀≈1.4；

(3)菌液于4℃，3000g离心5min沉淀细胞，弃上清，用100mL无菌水重悬；重复一次。

(4)4℃，3000g离心2min沉淀细胞，弃上清，用20mL冰预冷的1M山梨醇重悬细胞；

(5)4℃，3000g离心2min沉淀细胞，弃上清，用200μL 1M山梨醇重悬细胞，用于转化。

2.2.3.2质粒线性化

将约10μg重组质粒pPGK1Z/rD/D6D用Sac I进行单酶切,酶的用量、酶切时的温度,参照厂家说明书,完全酶切所用的时间要特别注意,既不能部分酶切,亦不能将质粒消化掉,这对电转的效率有着十分重要的作用。

酶切体系如下所示:

2.2.3.3电转化

将线性化好的重组质粒电转化至粘红酵母GM4：

(1)将80μL己制备好的感受态细胞与20μL(约10μg)已线性化好的待转化质粒DNA混合,加入到0.2cm已预冷的电转化杯中；

(2)将装有混合液的电转化杯冰浴5min；

(3)调整好电转仪的参数:电压1.5kV，电容25uF，电阻200Ω，电击持续时间约为5ms左右；

(4)电击结束后，立即向转化杯中加入1mL预冷的1M山梨醇溶液,用枪轻微吸打混匀,然后将其转至灭过菌的离心管中,30℃静置lh，然后加入1mL新鲜的YPD培养基，30℃，200rpm摇1小时；

(5)室温下3000rpm，离心4min，用200μL ddH2O重悬菌体；

(6)将消液涂布于YPD平板(含50μL Zeocin)，置于30℃培养箱中培养2-3d,直到长出单菌落为止。

2.2.3.4重组粘红酵母的PCR检测

挑取YPD抗性平板上长势较好的单菌落转接到YPD液体培养基中，30℃，250rpm振荡培养至OD600大于2；

取1mL菌液12000rpm离心2min，弃上清，加入100μL TE缓冲液重悬菌体，水浴煮沸5-10min，立即置于-20℃冰箱冻存15min，室温下静置使菌悬液溶解，12000rpm离心5min，取上清液5μL为模板进行PCR检测。反应体系如下：

PCR反应条件：94℃5min，94℃0.5min，55℃0.5min，72℃1.5min，72℃5min，30个循环。

2.2.3.5质粒的酶切验证

经菌液PCR初步验证后，提取正确阳性克隆中的质粒，用Nco I和Bam HII分别对重组质粒进行双酶切鉴定，反应温度为37℃。

酶切反应体系如下：

2.2.3.6转化子稳定性检测

将粘红酵母转化子接种于40mLYPD液体培养基中，30℃，250rpm振荡培养24h-36h。取1mL菌液用无菌水分别稀释到10^-2,10^-3,10^-4，各取200μL不同稀释度的稀释液分别涂布于普通YPD平板和YPD-Zeocin抗性平板，计算菌落数，分别记为总菌数和带有整合质粒的菌落数。以1％接种量转接至YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养，以24h为10世代，共培养50个世代。每隔10世代进行一次平板计数。

计算质粒稳定性：稳定性(％)＝带有整合质粒的菌落数÷总菌数×100％。

2.2.4转化子D6D表达水平测定

用实时荧光定量PCR来检测D6D在转化菌株中的表达水平。野生菌株GM4和转化菌株GM4-D6D分别在YPD培养基中发酵24h、48h、72h后收集，提取野生菌株和转化菌株的总RNA，方法参照2.2.1.3；经过反转录得到cDNA，方法参照2.2.1.3。将合成后的cDNA稀释30倍，用于实时荧光定量PCR。D6D的实时荧光定量PCR引物为：

F:5′-ATGTCAGGGCAAACTCGAG-3′

R:5′-ATCATCTAAAACATCTTTTGAGAG-3′

以上述稀释好的cDNA为模版，按照荧光定量试剂盒SYBR PrimeScript TM RT-PCRKit指导进行。

荧光定量PCR扩增的反应体系为：

PCR扩增条件为：95℃3s，95℃5s，60℃31s，40个循环。同时对Real-time PCR产物进行SYBR熔解曲线分析，每个试样平行做4次反应，重复试验2次，并参考Pfaffl(2001)的方法进行数据分析。

2.2.5转化菌株GM4-D6D的脂肪酸组成分析

1、菌株GM4-D6D总脂肪酸的提取

(1)收集在YPD液体培养基培养至稳定期的GM4-D6D菌株，离心后用蒸馏水清洗两遍，5000g于4℃离心5min收集菌体后烘干至恒重，重量后放于研钵中研磨成粉末，用滤纸包好菌粉再次烘干至恒重；

(2)将滤纸包裹的菌粉放于抽提筒中，注入无水乙醚浸没样品，在70度左右的恒温水浴中回流抽提8h左右，乙醚中无油为抽提结束，除去溶剂后的油脂待用；

(3)向提取的油脂加入1mL 2％(wt/vol)硫酸-甲醇，60℃酯化2h；

(4)冷却后加入1mL己烷，涡旋10min萃取脂肪酸甲酯；

(5)取步骤(4)中己烷800μL加入到玻璃瓶中进行GC分析。

2、GC分析

用Bruker 450-GC仪器配氢火焰离子化(FID)检测器和毛细管色谱柱HP-INNOWAX(30m×0.25mm)。柱温升温程序为：150℃(1min)，10min升至230℃，并在230℃保持2min，分流比为10:1，对照脂肪酸甲酯标准品的保留时间，对不同脂肪酸进行定性定量分析。

结果证明

2.3.1粘红酵母的菌落形态

粘红酵母GM4在孟加拉平板上生长3天后，其形态如图2所示。菌落平均直径在3～5mm，颜色为红色或橘红色，光泽，表面光滑且边缘整齐，呈圆形凸起。

2.3.1 PCR扩增检测目的片段

通过设计特定引物对摸底基因PGK1和D6D进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分析，图3中(A)显示在800bp左右扩增出目的条带，图3中(B)显示在13000bp左右扩增出目的条带。

将重组质粒经过电转化法导入粘红酵母感受态细胞，对粘红酵母的细胞裂解液进行PCR检测，以目的基因D6D的特异性引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分析，图5显示1、2、3通道(重组菌株)在13000bp左右扩增出目的条带，阴性对照(空载体菌株，即野生粘红酵母菌株GM4，没有重组质粒转化)则无条带。说明重组质粒pGK1Z-rD-D6D成功转入粘红酵母并插入到粘红酵母基因组中。

重组菌GM4-D6D经过培养后，提取质粒，经过EcoRI和HindIII双酶切后电泳成像，结果如图4，可看到在2100bp和3100bp左右有条带(通道1)，酶切后的片段大小与所插入的目的基因片段大小相符，说明重组质粒上的目的基因片段的插入方向正确。

2.3.2重组质粒稳定性检测

为了检测重组质粒pPGK1Z-rD-D6D的遗传稳定性，我们对转化菌株在非选择压力下摇瓶培养60世代，沾取菌液于Zeocine抗性平板上涂布、培养，计算菌落数。结果如表2-1所示，显示转化的粘红酵母菌株在连续培养60世代后，稳定性仍然可以达到99.31％，表明在非选择压力下，粘红酵母中的质粒具有良好的遗传稳定性。

表2-1重组质粒的稳定性检测

2.3.3转化粘红酵母菌株D6D的表达分析

实时荧光定量PCR分析D6D基因转录水平的结果见图6，转化菌株的D6D表达水平为野生菌株的2倍左右，野生菌株D6D转录水平在培养72小时后降到较低水平，而转化菌株在其生长和γ-亚麻酸表达阶段，其D6D的转录水平一直都高于野生菌株。D6D的高转录水平可以可以为γ-亚麻酸的和合成提供所需的足够的酶，从而使γ-亚麻酸的合成量维持在较高的水平。

2.3.4γ-亚麻酸的积累研究

为了过表达D6D基因的粘红酵母转化菌株是否会产生较高水平的GLA，实验过程中对其脂肪酸成分进行了测定及分析，发现转化菌株的GLA含量显著增高，由原来的3.12％提高到10.36％，同时GLA合成的底物亚油酸的含量明显降低，由此可以看出，与野生菌株相比，转化菌株可以积累更多的GLA。

表2-2转化菌株和野生菌株的脂肪酸组成

本发明中，Δ6-脂肪酸去饱和酶是合成长链多不饱和脂肪酸的限速酶，分别在n-3途径中催化ALA脱氢生成SDA和n-6途径中的油酸(LA)脱氢生成GLA。在γ-亚麻酸的生物合成过程中，△6-脂肪酸去饱和酶将LA的第六位碳原子脱氢转化成GLA。经过研究者们不断努力，已经有不少GLA代谢关键酶的编码基因被克隆并且实现功能验证，有的基因还被利用到脂肪酸代谢途径修饰中，并取得理想效果。如Laoteng等成功分离Mucor rouxii中的Δ6-脂肪酸去饱和酶，发现其于植物的Δ6-脂肪酸去饱和酶有高度的相似性，并使其在酿酒酵母中成功得以表达；He Lu等人发现在豆豉的发酵过程中会有大量的GLA产生，因此分离出高产GLA的根霉菌，并从中克隆得到Δ6-脱饱和酶基因，将其表达于酿酒酵母中可导致GLA的积累；王萍等人将刺孢小克银汉霉菌中的Δ6-脂肪酸去饱和酶表达于橘林油脂酵母中，使其GLA的含量占总脂肪酸的1.2％。而本实验中，经过脂肪酸分析，发现转化菌株中的LA明显低于野生菌株，这也可以从侧面反应出LA经D6D催化进一步合成了GLA，从而使转化菌株中LA的含量降低，GLA的含量增多。

粘红酵母是一株高产油脂的稳定菌株，常备用来生产微生物油脂和不饱和脂肪酸、类胡萝卜素等。本实验室前期筛选到一株产脂能力较强的粘红酵母，其脂含量可以高达22.54％。在本实验中，我们利用了本实验室前期的粘红酵母表达质粒构建工作，成功构建整合表达载体pPGK1Z-rD-D6D，该载体上含有粘红酵母的两个rDNA片段以及酿酒酵母的强启动子PGK1，以rDNA为整合位点实现目的基因的稳定高拷贝表达，从而将外源刺孢小克银汉霉菌的D6D基因整合到粘红酵母的染色体上，使其能够稳定、高效表达，结果显示传代60代后，质粒仍能稳定存在于转化株内，并且粘红酵母转化菌株的D6D表达水平明显高于野生菌株，其GLA的产量也明显提高。

总的来说，本发明成功构建了外源基因D6D表达载体pPGK1Z-rD-D6D，经双酶切鉴定，重组质粒上的目的片段插入方向正确；将重组质粒导入粘红酵母中，经转化菌株PCR鉴定，重组质粒成功导入粘红酵母中并插入到粘红酵母的基因组中，实现了D6D的稳定、长久表达；实时荧光定量PCR表明D6D的表达水平提高了2倍左右；经气相色谱法分析，转化菌株中的GLA较野生菌株提高了3.3倍多。

引入外源多肽的活细胞脂质体及外源多肽在胞内的定位制备材料

3.1.1试验菌株

粘红酵母重组菌株GM4-D6D

3.1.2培养基

同2.1.2

3.1.3主要试剂

0.5mg/mL的尼罗红染色剂；FITC和Plam修饰的α-MSH和H22LP

引入外源多肽的方法

3.2.1电穿孔方法介导外源多肽进入GM4-D6D胞内

(1)制备工程菌株GM4-D6D菌株感受态细胞，方法同2.2.3.1。

(2)将10μg修饰了的FITC-αMSH和FITC-H22LP溶解后与感受态细胞混合后共100μL，加入到0.2cm已预冷的电转化杯中；

(3)电击过程同2.2.3.3；

(4)电击结束后，立即向转化杯中加入900μL预冷的1M山梨醇溶液，用枪轻微吸打混匀，然后将其转至灭过菌的离心管中，30℃静置lh，离心后加入1mL新鲜的YPD培养基重悬菌体，30℃，200rpm摇1小时；

(5)最后得到的菌株分别命名为GM4-D6D-FαMSH和GM4-D6D-FH22LP；

(6)将α-MSH通过电穿孔转入GM4-D6D胞内，得到菌株GM4-D6D-αMSH，用于第四章的实验。

3.2.2激光共聚焦检测多肽在胞内的位置

分别取0.1mL GM4-D6D-FαMSH和GM4-D6D-FH22LP菌液在1.5mL EP管中，3000rpm离心5min，用0.1mL蒸馏水重悬，加入几滴尼罗红染料，避光保存2-3min，然后通过共聚焦显微镜(TCSSP2)观察。观察绿色荧光用488nm的激光源，观察红色荧光用514纳米的激光源。

3.2.3荧光分光光度计定量分析

(1)配制FITC-αMSH和FITC-H22LP的浓度梯度标准液；并取1mL标准液到1毫升比色皿，待测定荧光强度Fs；

(2)移取1毫升GM4-D6D-FαMSH和GM4-D6D-FH22LP菌液到1毫升比色皿，待测荧光强度Fx；

(3)配制空白溶液于1毫升比色皿，待测荧光强度F0；

(4)做(Fs-F0)与待测样品标准品浓度C之间的标准曲线；

(5)放进荧光分光光度计测读：激发波长514nm，散发波长492nm，确定活体细胞α-MSH和H22LP的荧光强度进行定量；

(6)根据(Fx-F0)从标准曲线上求得样品的含量。

3.2.3数据分析

数据分析使用GraphPad Prism5.0，统计数据用Mean±SD表示，组间的差异性分析采用单因素方差(one-way ANOVA)。

3.3实验结果

3.3.1共聚焦显微镜(CLSM)的方法验证多肽进入胞内的位置

为了检测多肽是否进入胞内以及他们在胞内的位置，用疏水性荧光物质尼罗红染料染色脂滴，在红色荧光通道会现红色；多肽本身被FITC标记，在绿色荧光通道会显绿色。如图7所示，分别使用红色和绿色荧光通道则分别可以看到尼罗红染色的脂滴和显绿色的多肽FITC-FαMSH和FITC-FH22LP，而把两张图叠加，发现红色和绿色的荧光点完全重合(绿色荧光点要比红色的荧光点要小些)，叠加后呈黄色，表明两种物质存在于同一个纳米粒子内。这可说明两种多肽均引入到胞内，并且因为自身的亲脂作用进入到脂滴里。

3.3.2荧光分光光度法测定胞内多肽FITC-αMSH和FITC-H22LP的含量

电转化后，我们离心出去溶液中的多肽，收集菌液，运用荧光分光光度法测定胞内多肽FITC-αMSH和FITC-H22LP的含量，从图8可以看出，两种多肽的浓度差别不大，均为3mg/mL左右，而最初电转化时多肽的浓度为10mg/mL，说明电转化后胞内多肽的浓度可到达最初浓度的1/3，而且两种多肽在胞内的浓度没有显著性差异。

本发明电穿孔已经被广泛应用于质粒的转化，其原理是使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成纳米级别的孔洞，使外源质粒进入胞内，从而实现细胞的转化，此方法也适用于RNA的进入，同样也有人运用电穿孔的方法使外源蛋白进入到细胞内，我们借鉴此种方法，将外源多肽通过电穿孔的方法使其进入粘红酵母GM4-D6D胞内，得到菌株GM4-D6D-FαMSH和GM4-D6D-FH22LP，因为我们使多肽具有脂溶性，所以从激光共聚焦的图中可以看出他们进入到粘红酵母的油滴中，同时通过荧光分光光度法测定胞内多肽FITC-αMSH和FITC-H22LP的含量，发现通过电穿孔的方法可以将越1/3的外源多肽转移到粘红酵母胞内，而Mark等人利用电穿孔的方法将牛血清白蛋白转进红细胞中的最大量为1/4；并且两种多肽通过电穿孔进入到胞内后的含量差别不大，均为3μg/mL，说明此方法也适用于多肽转化进入粘红酵母胞内。

曾经有文章报道口服活酵母做为疫苗的载体，用将酵母制作成微囊做为天然脂质体包裹药物，或者口服灭活的酵母传递多不饱和脂肪酸，在这里酵母充当的是天然生物胶囊的角色，可以通过口服整个酵母来实现药物的运输以及不饱和脂肪酸等。

总的来说，本发明通过电穿孔的方法使FITC-αMSH和FITC-H22LP进入到粘红酵母GN4-D6D胞内；激光共聚焦实验证明两种多肽进入到油滴内；荧光分光光度法测定胞内多肽FITC-αMSH和FITC-H22LP的含量，发现两种肽的含量没有显著性差异，并且为初始量的1/3。

健康小鼠体内研究

4.1实验材料与仪器

4.1.1实验菌株

菌株GM4-D6D-αMSH和GM4-D6D

4.1.4实验小鼠

15只SPF级BALB/c小鼠，体重为18-20g/只，年龄在7-8周左右，购买于中山大学实验动物中心。在实验前，小鼠饲养在清洁级动物实验室，室温为20-25℃，湿度为60％，每天接受光照12h，每天更换新鲜食品和水一次。

4.2实验方法

4.2.1 GM4-D6D-αMSH的小鼠体内研究

4.2.1.1α-MSH在血清中的浓度

1、小鼠分组

(1)GM4-D6D-αMSH组，取6只正常小鼠，每天除饲喂正常的饲料，还饲喂灭活的GM4-D6D-αMSH菌株，每只每天饲喂量为1×10¹⁰CFU；

(2)GM4-D6D组，取6只正常小鼠，每天除饲喂正常的饲料，还饲喂灭活的GM4-D6D菌株，每只每天饲喂量为1×10¹⁰CFU，做为对照；

2、小鼠眼球取血

在饲喂后的第1,3,5,7天，采用眼球后静脉丛取血法取血(一次采血0.2mL)测血清中α-MSH的浓度。

3、测血清中α-MSH浓度

2500rpm离心15min，用ELISA试剂盒测血清中α-MSH浓度，具体如下：

(1)取适当浓度为300pg/mL的标准品稀释为一系列浓度梯度的稀释液；

(2)分别设置空白样品孔、标准样品孔、待测样品孔，空白样品孔添加100μL样品稀释液，标准样品孔和待测样品孔分别添加100μL标准样品或待测样品，盖上覆盖膜，轻轻振荡，37℃反应120min；

(3)去除液体，甩干，每孔加入生物素标记抗体稀释液100倍的生物素标记抗体工作液100μL，37℃下反应60min；

(4)弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗孔(每孔加350μL洗涤液)，2min/次，洗干后再次甩干；

(5)将辣根过氧化酶(HRP)标记亲和素用其稀释液稀释100倍，每孔加入HRP稀释工作液100μL，37℃下反应60min；

(6)重复步骤(4)

(7)每孔加入底物溶液90μL，37℃避光显色45min；

(8)显色后，每孔加终止溶液50μL，终止反应；

(9)加入终止液10min后，用酶标仪在450nm波长下测量各孔的OD值；

(10)根据标准样品测得的OD值，绘制标准曲线，根据标准曲线，计算样品浓度。

4.2.1.2α-MSH组织分布

(1)上述小鼠经过7天的给药以及取血后，在第七天将小鼠颈椎脱臼处死，分别取肝、脾、肺、肾，清除其上面的连带脂肪组织和结缔组织，生理盐水冲洗干净，用滤纸将组织吸干；

(2)剪取适量组织，精确称重后加入1mL生理盐水制成匀浆；

(3)制成匀浆的样品在200rpm，25℃下震荡20min，然后在25000rpm下离心15min；

(4)将上清过0.22μm微孔滤膜，去除杂志后用ELISA试剂盒测α-MSH浓度，方法同上。

4.2.2血清及肝脏脂肪酸组分测定

4.2.2.1小鼠分组

GM4-D6D-αMSH组，取6只正常小鼠，每天除饲喂正常的饲料，还饲喂GM4-D6D-αMSH菌株，每只每天饲喂量为1×1010 CFU；Normal组，取6只正常小鼠，每天只饲喂正常的饲料和同等体积的生理盐水，做为对照。

4.2.2.1血清中脂肪酸测定

在饲喂7天使，小鼠通过眼球取血，离心后将血清样品甲脂化。血清样品甲酯化的方法如下：

将采集的血清加入0.2mL苯，混匀，转入安瓿瓶中，再加入0.8mL甲醇，使苯:甲醇＝1:4，缓慢向安瓿瓶里注入100μL乙酰氯，封口水浴锅中水解1小时，加入2.5mLK2CO3终止反应。然后将反应液在4000rpm转速下离心10min，取上清进行GC-MS分析，方法同2.2.5。

4.2.2.2肝脏中脂肪酸测定

同样在第七天颈椎脱臼处死小鼠，取80mg肝脏，加入氯仿:甲醇＝2:1的萃取溶剂，匀浆后移入离心管中，25000rpm离心15min，沉淀重复一次萃取过程，合并两次离心上清。加入0.2倍体积的1.45mM的NaCl溶液，取下层氮气吹干，甲酯化处理同血清样品。

4.2.3数据处理

数据处理及作图使用GraphPad Prism5.0，统计数据用平均数±标准差表示，组间的对比采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组之间的数据分析采用Student’s test，p<0.05认为是组间存在显著差异。

4.3实验结果

4.3.1α-MSH在血清以及组织中的检测

为了检测GM4-D6D-αMSH运载α-MSH的效果，我们使小鼠服用GM4-D6D-αMSH后，在第1、3、5、7天通过眼球取血，用ELISA试剂盒检测血清中α-MSH的浓度，服用GM4-D6D的小鼠作对照。如图所示，在GM4-D6D-αMSH组，α-MSH在血清中的含量随着服用天数的增加而增加，在1至5天，α-MSH的含量几乎呈直线增加，在5天后，几乎不增加并且趋向于平稳，而在GM4-D6D组，α-MSH的含量在一定浓度一直保持平衡状态，且GM4-D6D-αMSH组α-MSH在血清中的含量显著高于GM4-D6D组(p<0.05)。

由小鼠组织分布图(图10)可见，GM4-D6D-αMSH运载α-MSH使其在肝、肺、脾、肾中的分布显著增加，尤其在肝的分布浓度由5.35pg/g提高至17.36pg/g，提高了3.24倍，而几乎不进入心肌组织。这可能是与脂质主要在肝脏代谢的原因，我们猜测α-MSH很可能是随着脂质形成乳糜微粒而被携带，并一起进入淋巴系统，最后进入血液，运送到身体各个组织，尤其是脂质代谢的主要器官肝脏。

4.3.2脂肪酸成分分析

从表4-1中的数据可以看出，GM4-D6D-αMSH组的小鼠的血清和肝脏中亚油酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸的相对含量较Normal组的显著增加，其中血液中GM4-D6D-αMSH组的GLA含量较Normal组提高了约7.26倍，花生四烯酸提高了约1.55倍；肝脏中GM4-D6D-αMSH组的GLA含量较Normal组提高了约4.33倍，花生四烯酸提高了约1.28倍。因为本身GM4-D6D-αMSH菌株可产生较多的γ-亚麻酸，所以小鼠口服会使血清中的GLA的含量增多，同时与对照组相比，GM4-D6D-αMSH组中花生四烯酸增多可能是因为部分γ-亚麻酸向花生四烯酸转化。

表4-1血清脂肪酸成分分析表(％)

表4-2肝脏脂肪酸成分分析表(％)

α-MSH是一种人体内源性神经性多肽，对人体亲和力好，有很强的抗炎作用，能调节多种炎症因子，适用于炎症性的疾病，根据之前的研究，注射α-MSH可以减轻LPS诱导的小鼠炎症，但是此方法存在弊端，注射会增加病人的痛苦。又因为α-MSH半衰期很短，而且做为多肽将其进行口服的话会被消化道的酶降解掉，而起不到治疗作用，那么我们尝试用酵母在做为其运载体而进行口服，经过前面的菌株构建，已成功使α-MSH进入胞内并且显示其位于油滴内，通过本章的实验发现，小鼠口服携带α-MSH的菌株GM4-D6D-αMSH后，α-MSH的含量在血清和重要器官组织中含量显著增高，改变了α-MSH的给药方法，解决了半衰期短的问题。并且通过组织分布实验发现α-MSH在肝脏中的含量增加更为显著，因此有益于用来治疗肝脏疾病。

GLA作为多不饱和脂肪酸本身就具有抗菌、抗炎的作用，而且也有多方面的保健作用。我们通过在粘红酵母中过表达D6D实现GLA的过表达，而且不饱和脂肪酸大多是和甘油结合后生成三酰甘油储存在油滴中，那么我们本次实验就是实现了油滴中既富含GLA，又含有α-MSH，通过口服灭活的重组酵母，实现酵母对于两种抗炎物质的传递，同时该株粘红酵母经本实验室前期验证，其脂肪酸成分与植物油相似[10]，并且含有丰富的胡萝卜素，其成分有很好的保健作用。我们经实验发现，口服整个GM4-D6D-αMSH菌株后，不仅GLA的含量增加了，而且GLA的进一步产物花生四烯酸即ARA的含量也增加了，实现了小鼠体内多种不饱和脂肪酸含量的增加。综上所述，口服整个富含GLA和α-MSH的酵母可以简单、有效的实现两种物质口服传递，那么这种方法也适用于做为其他多肽药物或者疏水药物的口服传递。

通过小鼠口服GM4-D6D-αMSH菌株后，血清以及肝、肺、肾、脾中α-MSH的浓度增加，在重要组织器官中，肝中的α-MSH的浓度增加更为显著；小鼠口服GM4-D6D-αMSH菌株后，血清和肝的GLA、ARA的浓度增加。

本发明以粘红酵母做为载体，通过过表达D6D提高菌株GLA的含量，并通过电穿孔实现外源多肽α-MSH和H22LP进入胞内油滴中，并经健康小鼠口服整个酵母菌株GM4-D6D-αMSH评价该方法口服传递α-MSH和GLA的效果，具体结果总结如下：

(1)通过构建外源基因D6D的表达载体pPGK1-rD-D6D，实现Δ6-去饱和酶基因在粘红酵母中的稳定遗传，并实现D6D的过表达，使重组菌株中的GLA含量较野生菌株提高了3.3倍多。

(2)通过电穿孔方法，实现外源多肽进入胞内，通过激光共聚焦发现进入胞内的多肽位于油滴内；并且此方法适用于两种不同的多肽α-MSH和H22LP，两种多肽进入胞内的含量没有明显差异。

(3)口服整个携带GLA和α-MSH的菌株GM4-D6D-αMSH，发现小鼠血清和重要器官(肝、肺、脾、肾)中α-MSH的含量增加，特别是肝脏提高了3.24倍；血清和肝中的GLA和GLA的下一步产物ARA的含量也得到了提高，其中血液中GLA含量提高了约7.26倍，花生四烯酸提高了约1.55倍；肝脏中GLA含量较提高了约4.33倍，花生四烯酸提高了约1.28倍。

酵母既有单细胞微生物的特点，如酵母本身较小只有几微米、容易培养、细胞生长快等，也有真核细胞所具有的特点，如可以进行真核细胞的转录后翻译、没有内毒素等，而且到目前为止已经将酵母在遗传学和结构上的特点研究的较为清楚，利于进行基因修饰，构建工程菌，同时酵母可实现工业化大规模生产，目前已有关于酵母的产品上市。酵母充当载体，通过口服整个酵母来实现不饱和脂肪酸的传递已有报道，我们实验的独特之处是可同时运载不饱和脂肪酸和多肽药物，酵母特殊的细胞壁结构，使得其对消化道的胃酸有较强的抵抗作用，能作为一种天然的生物胶囊为生物大分子提供良好的保护，保护不饱和脂肪不被氧化，保护多肽药物不被酶降解。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：以经Δ6-去饱和酶基因重组的工程菌为载体，引入外源多肽被包裹进经Δ6-去饱和酶基因重组的工程菌的脂滴内。

2.根据权利要求1所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：所述外源多肽是α-MSH或者多肽H22LP。

3.根据权利要求2所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：所述工程菌为导入Δ6-去饱和酶(D6D)基因重组的粘红酵母GM4-D6D。

4.根据权利要求3所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：所述Δ6-去饱和酶由刺孢小克银汉霉的D6D基因的分离与扩增得到的。

5.根据权利要求3所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：Δ6-去饱和酶(D6D)基因重组的粘红酵母的构建方法,其包括的步骤如下：

(1)表达载体pPGK1Z-rD-ME的抽提；

(2)连接PGK1基因和D6D基因；

(3)PGK1-D6D片段与表达载体载体的双酶切反应、连接。

6.根据权利要求5所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：表达载体pPGK1Z-rD-ME的抽提的方法的步骤如下：

(1)将含有pPGK1Z-rD质粒的大肠杆菌DH5α接种到装有5mL LB-amp培养基中，于37℃下250rpm振荡培养过夜；

(2)吸取1.5mL过夜菌液于离心管中，4℃下12000rpm离心1分钟，弃上清；

(3)用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将菌体沉淀悬浮于200μLSTET缓冲液中，用涡旋混合器混匀；

(4)加入4mL溶菌酶溶液，混匀后于室温下静置5分钟；

(5)用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45秒，取出后立刻12000rpm离心5分钟；

(6)用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8mL 5％CTAB，用混合器混匀后，13000rpm离心5分钟，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体；

(7)加入1.2M NaCl 300mL，充分溶解沉淀物，再加入750mL的预冷乙醇，充分混匀后，13000rpm离心15分钟，弃上清液；

(8)取1mL 70％冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，13000rpm离心5min，弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥5-10min；

(9)沉淀物溶于50mL TE缓冲液中，混合器混匀，于-20℃保存备用。

7.根据权利要求6所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：粘红酵母与D6D基因片段的摩尔比要控制在1:3-10。

8.一种引入外源多肽的活细胞脂质体的制备方法，其特征在于：包括的步骤如下：

(1)制备工程菌株GM4-D6D菌株感受态细胞；

(2)将10μg修饰了的外源多肽溶解后与感受态细胞混合后共100μL，加入电转化杯中；

(3)电击化；

(4)电击结束后，立即向转化杯中加入900μL预冷的1M山梨醇溶液，用枪轻微吸打混匀，然后将其转至灭过菌的离心管中，30℃静置1h，离心后加入1mL新鲜的YPD培养基重悬菌体，30℃，200rpm摇1小时；

(5)得到的菌株。

9.根据权利要求8所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体的制备方法，其特征在于：所述电击化步骤如下：

(1)将80μL己制备好的感受态细胞与20μL已线性化好的待转化质粒DNA混合,加入到0.2cm已预冷的电转化杯中；

(2)将装有混合液的电转化杯冰浴5min；

(3)调整好电转仪的参数:电压1.5kV，电容25uF，电阻200Ω，电击持续时间为5ms；

(4)电击结束后，立即向转化杯中加入1mL预冷的1M山梨醇溶液,用枪轻微吸打混匀,然后将其转至灭过菌的离心管中,30℃静置1h，然后加入1mL新鲜的YPD培养基，30℃，200rpm摇1小时；

(5)室温下3000rpm，离心4min，用200μL ddH2O重悬菌体；

(6)将消液涂布于含50μL Zeocin的YPD平板，置于30℃培养箱中培养2-3d,直到长出单菌落为止。

10.根据权利要求1所述的一种引入外源多肽的活细胞脂质体，其特征在于：在多肽相关药物和肽类分子相关功能性食品制备中的应用。