CN1609224A - 携带α－黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体与用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药生物工程技术领域，具体涉及一种携带α－黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体α－MSH－rAAV及其制备方法。α－黑素细胞刺激素(α－melanocyte stimulating hormone，α－MSH)是近几年来发现的具有抗多种急、慢性炎症作用的内源性神经免疫调节肽，但是α－MSH半衰期较短、体内代谢较快，在治疗疾病时需要反复多次注射是其缺点。本发明提供一种可持续表达的携带α－黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体α－MSH－rAAV，可用于制备治疗自身免疫性疾病或移植排斥反应的药物。

Description

携带α-黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体与用途

技术领域：

本发明涉及医药生物工程技术领域，具体涉及一种携带α-黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体(α-MSH-rAAV)，以及该重组表达载体的制备方法、该重组表达载体用于制备治疗自身免疫性疾病和移植排斥反应药物的用途。

背景技术：

α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)是近几年来发现的具有抗多种急、慢性炎症作用的内源性神经免疫调节肽，是由13个氨基酸组成的多肽，其氨基酸序列如下：Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val。α-MSH也可以促进受损的外周神经或脊髓修复(参见Joosten等人，神经创伤杂志，16：543；(1999))。α-MSH可以用于治疗风湿性关节炎(参见Catania A等人，神经免疫调节，1：321-328，(1994))、自身免疫性卵巢炎(参见Casalino-Matsuda SM等人，生理、生物化学杂志，58：25-31，(2002))、风湿性关节炎(参见Catania A等人，神经免疫调节，1：321-328，(1994))等自身免疫性疾病，还可以抑制移植排斥反应(参见Gatti S等人，移植，74：1678-1684，(2002))。α-MSH是人体内存在的小分子调节肽，无抗原性，目前尚未发现有蓄积毒性。但是α-MSH半衰期较短、体内代谢较快，在治疗疾病时需要反复多次注射是其缺点。

以腺病毒为载体，携带α-黑素细胞刺激素基因的腺病毒重组表达载体(参见Robinson WH，临床免疫学杂志，103：7，(2002))，具有转染效率高的优点，但是腺病毒本身具有免疫原性，从靶组织中很快地被清除，因此目的基因表达时间较短。

重组腺相关病毒对人类无致病性，能感染分裂和非分裂细胞，并能使表达产物进行维持功能所必需的折叠和翻译后修饰，目的基因整合宿主细胞基因组，在体内能长期稳定表达。由于不产生野生型病毒，从而减少了宿主的免疫应答，允许基因转移至免疫活性细胞(参见XiaoX，病毒学杂志，72：2224，(1998))。腺相关病毒载体理化性质稳定，是目前基因治疗所使用的各种载体中最具优势和前途的载体之一。

发明内容：

本发明克服上述的α-MSH半衰期较短、体内代谢较快，在治疗疾病时需要反复多次注射的缺点及携带α-黑素细胞刺激素基因的腺病毒重组表达载体由于腺病毒本身具有免疫原性，从靶组织中很快地被清除，目的基因表达时间较短的缺点，提供了一种基因表达时间长的携带α-黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV。

本发明的目的在于提供一种基因表达时间长的携带α-黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV，它是由α-黑素细胞刺激素(α-MSH)基因和腺相关病毒(rAAV)载体构建而成的重组表达载体，其中α-MSH基因的核苷酸序列如下：

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本发明的另一目的在于提供一种携带α-黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV的制备方法。

由于α-MSH本身不含有信号肽序列，为了使其能够分泌至细胞外，故在α-MSH基因序列前加入了细胞因子IL-6的信号肽编码序列。

为了构建能够分泌目的基因α-MSH的腺相关病毒重组表达载体，首先运用RT-PCR技术和特异性引物，以T淋巴细胞系分离的总RNA为模板，扩增出IL-6信号肽cDNA，将IL-6信号肽基因编码序列克隆入载体质粒pGEM-3z(Stratagene公司，美国)，构建成pGEM-IL6sp。然后合成全长α-MSH双链DNA，再将其克隆入载体质粒pGEM-IL6sp，构建成pGEM-IL6sp-α-MSH重组质粒。将IL6sp-α-MSH片段克隆入含人源化重组绿色荧光蛋白(hrGFP)基因的表达载体pAAV-IRES-hrGFP(Stratagene公司，美国)，构建成pAAV-IL6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒。将pAAV-IL6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒与pHelper质粒(Stratagene公司，美国)和pRC质粒(Stratagene公司，美国)共转染人胚肾细胞株(HEK293细胞，ATCC，美国)，得到含有α-MSH基因的重组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV。

具体步骤如下：

1、构建pGEM-IL-6sp重组质粒

①以T淋巴细胞系总RNA为模板，用M-MLV RTase cDNA合成试剂盒行逆转录；

②合成IL-6信号肽引物

正向引物：5’-G GAATTCATGAAGTTCCTCTCTGC-3’

反向引物：5’-C GGTACCGCCGGCGGCCGTGGTTGTCACCA-3’

其中正向引物引入EcoR I酶切位点，反向引物引入Nae I Kpn I酶切位点；

③以逆转录产物为模板，用合成的正反向引物进行PCR扩增，扩增出IL-6信号肽cDNA，其碱基序列5’至3’为序列3：

5′atgaagttcc tctctgcaag agacttccat ccagttgcct tcttgggact gatgctggtg     60

acaaccacgg cc 3′                                                        72

④将PCR产物经EcoR I和Kpn I酶切纯化后定向克隆入载体质粒pGEM-3z，测序鉴定，构建成pGEM-IL6sp重组质粒。

2、合成α-MSH双链DNA片段

α-MSH基因的碱基序列5’至3’为序列1：

5′agttatagta tggagcactt caggtgggga aagccagta 3′                        39

合成α-MSH双链DNA片段，使其5’端和3’端分别携带Nae I和Kpn I酶切位点；

3、构建pGEM-IL-6sp-α-MSH重组质粒

将合成的α-MSH双链DNA片段经Nae I和Kpn I酶切纯化后定向克隆入上述构建的pGEM-IL-6sp重组质粒，测序鉴定，构建成pGEM-IL-6sp-α-MSH重组质粒；

4、构建pAAV-IL-6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒

将pGEM-IL-6sp-α-MSH重组质粒中的IL-6sp-α-MSH片段经EcoRI和Xho I酶切纯化后克隆入载体质粒pAAV-IRES-hrGFP，测序鉴定，通过末端连接可得到融合多肽IL-6sp-α-MSH，其碱基序列5’至3’为序列2：

5′atgaagttcc tctctgcaag agacttccat ccagttgcct tcttgggact gatgctggtg     60

acaaccacgg ccagttatag tatggagcac ttcaggtggg gaaagccagt atag 3′         114

构建成pAAV-IL6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒；

5、构建α-MSH-rAAV

将pAAV-IL-6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒和对照pAAV-IRES-hrGFP质粒分别与腺相关病毒重组系统(AAV Helper Free System)中含有重组rAAV所需腺病毒成分的pHelper质粒以及含包装和复制rAAV所需成分的pRC质粒，共转染人胚肾细胞株(HEK293细胞)，分别得到携带α-黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV和对照初级病毒颗粒hrGFP-rAAV；

6、rAAV的纯化与鉴定

初级病毒颗粒α-MSH-rAAV或hrGFP-rAAV经氯仿-PEG8000/NaCl纯化后，再用Milipore超滤管Centroplus YM 100进一步浓缩，采用SDS-PAGE蛋白电泳方法进行初步鉴定；

7、rAAV病毒滴度检测

用辣根过氧化物酶(HRP)标记的hrGFP基因为探针，点杂交病毒颗粒α-MSH-rAAV或hrGFP-rAAV中的rAAV病毒基因组(vector genomes，v.g.)，同pAAV-IRES-hrGFP标准质粒比较，计算纯化后rAAV的物理滴度为2×10¹³v.g./ml。给人纤维肉瘤细胞株(HT1080细胞)加入10倍梯度系列稀释的病毒液，培养48h，在荧光显微镜下计数某孔荧光细胞的数量n(10＜n＜100)，rAAV的感染滴度(tfu)＝n×稀释倍数，测得rAAV的感染滴度为4×10¹¹tfu/ml，物理滴度/感染滴度的比值为50。

本发明的另一目的在于利用上述制备方法得到的重组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV转染相关免疫细胞，用于治疗自身免疫性疾病和移植排斥反应。

1、α-MSH-rAAV在治疗自身免疫性疾病上的用途

自身抗原特异性T淋巴细胞具有向炎性病灶归巢的特性(参见Flugel A，免疫学，14：547，(2001))，且仅在受到相同的自身抗原刺激后才会活化，因此能将治疗性目的基因运送至靶器官，并能够可控性表达。基因修饰的自身抗原特异性T细胞已被应用于自身免疫性疾病基因治疗的实验研究(参见Mathisen PM，实验医学杂志，186：159(1997))。

为研究α-MSH基因修饰的自身抗原特异性T细胞在治疗自身免疫性疾病上的用途，首先制备出自身抗原PLP_139-151特异性T淋巴细胞(PLP_139-151-T细胞)，分别应用纯化并浓缩后的α-MSH-rAAV或hrGFP-rAAV转染PLP_139-151活化的PLP_139-151-T细胞，制备出α-MSH基因修饰的PLP_139-151特异性T细胞(α-MSH-T细胞)和对照性hrGFP-T细胞。α-MSH-T细胞在体外受到PLP_139-151刺激后，应用酶联免疫检测试剂盒(EIA)检测细胞培养上清中α-MSH的水平，发现α-MSH的分泌呈时间依赖性；[³H]掺入法检测到α-MSH-T细胞的增殖能力降低；细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌减少，TGF-β的产生却明显增加。说明α-MSH-T细胞的生物学特性发生了改变，其产生致炎性细胞因子的能力下降而产生抑炎性细胞因子的能力增加。

将α-MSH-T细胞被动回输SJL小鼠，观察其诱导被动转移性实验性自身免疫性脑脊髓炎(tEAE)的能力。给正常SJL/J小鼠被动转移PLP_139-151-T细胞或hrGFP-T细胞(5×10⁶细胞/只)，tEAE的发病率为100％；而被动回输相同数量的α-MSH-T细胞，tEAE的发病率显著降低，起始发病时间明显延长，临床症状仅出现尾无力现象。说明α-MSH-T细胞被动转移EAE的能力即致脑炎性明显降低。

在PLP_139-151主动免疫SJL/J小鼠后的第11天，即主动性复发-缓解型EAE(REAE)的起始发病期，经尾静脉分别注射α-MSH-T细胞、hrGFP-T细胞和PBS。结果发现，与hrGFP-T细胞组和PBS组相比，α-MSH-T细胞组REAE的复发率明显降低，起始复发时间延长，而且复发期的病情严重程度也明显减轻。表明α-MSH-T细胞对主动性REAE小鼠具有治疗作用。

在REAE的起始发病期回输α-MSH-T细胞，24h后血清和中枢神经系统(CNS)中都可以检测到高水平的α-MSH。血清中高水平的α-MSH维持时间相对较短；而CNS内α-MSH的含量于回输细胞后96h达到高峰，并且高水平的α-MSH可以持续1周左右。PBS处理组或回输hrGFP-T细胞组小鼠未见此现象。

在REAE的起始发病期回输α-MSH-T细胞或hrGFP-T细胞，用ELISA方法检测REAE小鼠血清及CNS中Th1/Th2型细胞因子的含量表明，与PBS处理组和回输hrGFP-T细胞组相比较，给予α-MSH-T细胞组小鼠血清及CNS中IL-2的含量显著降低，IL-10和TGF-β的含量则明显增加。说明回输α-MSH-T细胞可以降低EAE小鼠体内致炎性细胞因子的含量，而增加抑炎性细胞因子的水平。

应用α-MSH-rAAV除了可以转染自身抗原特异性T淋巴细胞外，还可以按常规方法转染其它种类的细胞，例如B淋巴细胞、树突状细胞或成纤维细胞。

除了直接应用α-MSH-rAAV或α-MSH基因修饰的细胞治疗EAE外，还可用于治疗其它种类的自身免疫性疾病，如多发性硬化、风湿性关节炎或自身免疫性卵巢炎。

2、α-MSH-rAAV在防治移植排斥反应上的用途

首先在体外培养和扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)，应用纯化并浓缩后的α-MSH-rAAV和hrGFP-rAAV分别转染DC，制备出α-MSH基因修饰的DC细胞α-MSH-DC和对照性hrGFP-DC，收获不同时间的α-MSH-DC培养上清，应用EIA试剂盒检测细胞培养上清中α-MSH的水平，转染后第3天可以检测到α-MSH(20pg/ml)，其水平逐渐升高至第6天(380pg/ml)，之后两天持续在这一水平。而hrGFP-DC和正常DC组上清中则检测不到α-MSH存在。应用流式细胞仪(FACS)检测α-MSH-DC的细胞表型变化，发现α-MSH-DC在LPS刺激下，细胞表面CD80、CD86、CD11c和MHC-II的表达低于正常组和hrGFP-DC。ELISA检测(R&D公司，美国)IL-12水平的结果表明，与Day8-DC相比，Day5-DC、hrGFP-DC、α-MSH-DC皆分泌低水平的IL-12。当各组DC经100ng/ml LPS刺激20h后，分泌IL-12的水平都较LPS刺激前明显增高，但Day8-DC分泌IL-12的水平最高(P＜0.01)，Day6-DC与hrGFP-DC分泌IL-12的水平较Day8-DC降低，α-MSH-DC分泌IL-12的水平又低于Day6-DC和hrGFP-DC(P＜0.01)。说明α-MSH-DC的成熟受到抑制，且能部分抵抗LPS的促成熟作用。

应用BALB/c小鼠来源的α-MSH-DC免疫C57BL/6受体小鼠后，采用同种小鼠异位心脏移植模型，研究了α-MSH-DC对心脏移植物存活时间的影响。结果发现，与hrGFP-DC免疫组小鼠相比较，α-MSH-DC组移植心脏存活时间明显延长，α-MSH-DC免疫受者后，明显抑制受者脾脏淋巴细胞对供者同种异基因抗原的免疫应答。

另外，可以直接应用α-MSH-rAAV来防治心脏移植时排斥反应，也可以应用α-MSH-rAAV或α-MSH-DC来防治其它器官移植时的排斥反应。

附图说明

图1：重组表达载体pAAV-IL-6sp-α-MSH-hrGFP的结构示意图

图2：重组表达载体α-MSH-rAAV的构建流程图

图3：α-MSH-T细胞受到特异性抗原(PLP_139-151)刺激后α-MSH的分泌水平图

图4：α-MSH-T细胞受PLP_139-151刺激后的增殖和细胞因子分泌水平图

图5：α-MSH-T细胞诱导tEAE发病能力的变化图

图6：α-MSH-T细胞对主动型REAE的治疗作用图

图7：α-MSH-T细胞被动回输后小鼠体内α-MSH的含量图

图8：α-MSH-T细胞被动回输后小鼠体内Th1/Th2型细胞因子的含量图

图9：α-MSH-DC培养上清中α-MSH的水平图

图10：α-MSH-DC分泌IL-12的水平图

图11：α-MSH-DC影响同种异体小鼠心脏移植物存活时间图

图12：α-MSH-DC受者小鼠脾脏T细胞与正常供者脾脏细胞的混和淋巴细胞反应图

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明作详细的描述：

实施例1：α-MSH-rAAV重组表达载体的构建

首先构建pGEM-IL-6sp重组质粒。以T细胞的总RNA为模板，用M-MLV RTase cDNA合成试剂盒(TaKaRa公司，日本)行逆转录合成cDNA。合成IL-6信号肽基因的特异性引物，即5’-G GA ATT CAT GAA GTTCCT CTC TGC-3’的正向引物和5’-C GG TAC CGC CGG CGG CCG TGG TTGTCA CCA-3’的反向引物，其中正向引物引入EcoR I酶切位点，反向引物引入Nae I Kpn I酶切位点。以上述逆转录产物为模板进行PCR，扩增出IL-6信号肽cDNA，其碱基序列5’至3’为序列3：

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acaaccacgg cc 3′                                                        72

将IL-6信号肽基因定向克隆入载体质粒pGEM-3z，测序鉴定，构建成pGEM-IL-6sp。

然后构建pGEM-IL6sp-α-MSH重组质粒。合成α-MSH基因双链DNA片段，其碱基序列5’至3’为序列1：

5′agttatagta tggagcactt caggtgggga aagccagta 3′                        39

将其定向克隆入上述构建的pGEM-IL-6sp重组质粒，测序鉴定，构建成pGEM-IL-6sp-α-MSH重组质粒。

接着构建pAAV-IL-6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒。将pGEM-IL-6sp-α-MSH重组质粒中的IL-6sp-α-MSH片段定向克隆入含人源化重组绿色荧光蛋白(hrGFP)基因的载体质粒pAAV-IRES-hrGFP(Stratagene公司，美国)中，测序鉴定，IL-6sp-α-MSH基因的碱基序列5’至3’为序列2：

加框显示的为翻译起始密码atg和翻译终止密码tag，构建成pAAV-IL6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒(图1)。上述质粒均用Qiagen去内毒素试剂盒提取和纯化。

最后，为了构建携带α-MSH基因的rAAV载体，按照图2显示的重组表达载体α-MSH-rAAV的构建流程图，运用磷酸钙方法(参见金冬雁、黎孟枫等译，分子克隆实验指南(第二版)，科学出版社(1998))将AAV Helper-Free System(Stratagene，美国)中的含有重组rAAV所需腺病毒成分的pHelper质粒以及含包装和复制rAAV所需成分的pRC质粒，与上述构建的pAAV-IL-6sp-α-MSH-hrGFP重组质粒和对照pAAV-IRES-hrGFP质粒，各10μg，分别共转染HEK293细胞(ATCC，美国)，72小时后可得到含有α-MSH基因的rAAV(α-MSH-rAAV)和对照rAAV(hrGFP-rAAV)。将α-MSH-rAAV或对照rAAV初级病毒颗粒经氯仿-PEG8000/NaCl纯化后，再用Milipore超滤管Centroplus YM 100(Milipore公司，德国)进一步地浓缩(参见李桂林等人，中华医学杂志，14：1255(2003))。采用SDS-PAGE蛋白电泳对rAAV病毒进行初步鉴定。

利用点杂交检测试剂盒(North2South Direct HRP Labeling andDetection Kit，PIERCE公司，美国)检测rAAV病毒的物理滴度。以辣根过氧化物酶(HRP)标记的hrGFP基因为探针，点杂交病毒颗粒中的rAAV病毒基因组(vector genomes，v.g.)，同pAAV-IRES-hrGFP标准质粒比较，计算纯化后α-MSH-rAAV或hrGFP-rAAV的物理滴度为2×10¹³v.g./ml。将10倍梯度系列稀释的病毒液加到体外培养的人纤维肉瘤细胞株(HT1080细胞)(ATCC，美国)中，培养48h，在荧光显微镜下计数某孔荧光细胞的数量n(10＜n＜100)，根据公式：rAAV感染滴度(tfu)＝n×稀释倍数，测得α-MSH-rAAV的感染滴度为4×10¹¹tfu/ml，其物理滴度/感染滴度的比值为50。

实施例2：α-MSH基因修饰的PLP_139-151特异性T细胞的制备及其生物学活性的检测

取PLP_139-151/CFA(Sigma公司，美国)免疫10天后SJL/J小鼠的引流淋巴结细胞，在体外经PLP_139-151(25μg/ml)刺激，再以IL-2(R&D公司，美国)扩增，反复培养3个循环后即可获得PLP_139-151特异性T细胞(PLP_139-151-T细胞)。

应用纯化并浓缩后的α-MSH-rAAV和hrGFP-rAAV分别转染PLP_139-151(25μg/ml)活化的PLP_139-151-T细胞，制备出α-MSH基因修饰的PLP_139-151特异性T细胞(α-MSH-T细胞)和对照hrGFP-T细胞。α-MSH-rAAV对活化性PLP_139-151-T细胞的最适感染复数(MOI)为4×10⁵v.g./ml，转染效率为22～25％。

α-MSH-T细胞在体外受到PLP_139-151刺激后，应用酶联免疫检测试剂盒(EIA)(Phoenix公司，美国)检测细胞培养上清中α-MSH的水平，结果表明α-MSH的分泌呈时间依赖性(图3)；如图4所示，应用[³H]掺入法检测到α-MSH-T细胞增殖能力下降，应用ELISA试剂盒(R&D公司，美国)检测到细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌减少，TGF-β的产生却明显增加。上述现象未见于活化性PLP_139-151-T细胞或hrGFP-T细胞。

实施例3：α-MSH-T细胞对主动性复发-缓解型EAE(REAE)的治疗作用实验

如图5所示，给正常SJL/J小鼠(Jackson实验室，美国)被动转移PLP_139-151-T细胞或hrGFP-T细胞(5×10⁶细胞/只)，tEAE的发病率为100％；而被动回输相同数量的α-MSH-T细胞，tEAE的发病率为28.57％(2/7)，下降了71.43％(P＜0.01)，起始发病时间由原来的转输后7天延长至11天，临床症状仅出现尾无力现象。说明α-MSH-T细胞被动转移EAE的能力即致脑炎性明显降低。

在用PLP_139-151主动免疫SJL/J小鼠后的第11天，即REAE起始发病期，经尾静脉分别注射5×10⁶α-MSH-T细胞、5×10⁶hrGFP-T细胞和PBS。结果如图6所示，与hrGFP-T细胞组和PBS相比，α-MSH-T细胞组REAE的复发率明显降低，起始复发时间延长，而且复发期的病情严重程度也明显减轻。以上结果表明α-MSH-T细胞对主动性REAE具有治疗作用。

应用EIA试剂盒(Phoenix公司，美国)检测小鼠血清和CNS中α-MSH的含量显示(图7)，在REAE的起始发病期回输α-MSH-T细胞，24h后血清和CNS中都可以检测到高水平的α-MSH，血清中高水平的α-MSH维持时间相对较短；而CNS内α-MSH的含量于回输细胞后96h达到高峰，并且高水平的α-MSH可以持续1周左右。PBS处理组或回输hrGFP-T细胞组小鼠未见此现象。

在REAE的起始发病期回输α-MSH-T细胞或hrGFP-T细胞，用ELISA试剂盒(R&D公司，美国)检测REAE小鼠血清及CNS中Th1/Th2型细胞因子的含量表明(图8)，与PBS处理组和回输hrGFP-T细胞组相比较，给予α-MSH-T细胞组小鼠血清及CNS中IL-2和IFN-γ的含量显著降低，IL-4、IL-10和TGF-β的含量则明显增加。以上结果说明，转输α-MSH-T细胞能抑制Th1型细胞因子分泌，并促进Th2型细胞因子产生。

实施例4：α-MSH基因修饰的小鼠骨髓来源的树突状细胞(α-MSH-DC)的制备及其生物学特性检测实验

为了制备出α-MSH-DC，首先体外培养和扩增了骨髓来源的DC，参考Inaba等方法(参见Inaba等人，实验医学杂志，176：1693(1992))并稍作改进，简述之：颈椎脱位法处死BALB/c小鼠，无菌取股骨骨髓细胞，Tris-NH₄Cl溶解去除红细胞后，加入抗Ia、B₂₂₀、CD4、CD8单抗(PharMingen公司，美国)，使终浓度均为10μg/ml，再加入补体(10：1稀释)，37℃水浴45min溶解去除T、B及Ia⁺细胞，洗两次后，以1×10⁶细胞/孔，加入24孔板培养，用含重组小鼠GM-CSF 10ng/ml(R&D公司，美国)、重组小鼠IL-41ng/ml(R&D公司，美国)的RPMI1640完全培养基(Gibco公司，美国)培养。培养第3天后，吸弃培养基及悬浮细胞，重新加入新鲜RPMI1640完全培养基及rmGM-CSF和rmIL-4，以后隔天半量换液，细胞培养至第6天，收集疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，置新培养板培养过夜，第2天收集悬浮细胞即为富集的第8天骨髓来源的树突状细胞(bone marrow-derived dendriticcell，BMDC)。收获培养4天的具有典型DC特征的细胞，按10⁴tfu/细胞的MOI值进行α-MSH-rAAV病毒和对照hrGFP-rAAV病毒的转染，设未经病毒转染的正常BMDC为对照。α-MSH-rAAV对BMDC的转染效率约为20％。

用α-MSH的EIA检测试剂盒测定α-MSH-DC、hrGFP-DC和培养至第5天的正常对照DC(Day5-DC)培养上清中的α-MSH水平，结果如图9所示，在α-MSH-DC上清中，转染后第3天可以检测到α-MSH(20pg/ml)，其水平逐渐升高至第6天(380pg/ml)，之后两天持续在这一水平。而hrGFP-DC和正常DC组上清中则检测不到α-MSH存在。本结果说明α-MSH-rAAV转染DC后，可以使DC有效地表达α-MSH。

为了研究α-MSH-DC的体外生物学特性，应用FACS技术检测细胞表面分子的表达，结果发现，培养至第5天和第8天的DC(Day8-DC)和hrGFP-DC经100ng/ml LPS刺激后，细胞表面皆表达高水平CD80、CD86、CD11c和MHC-II，显示出成熟型DC的表型特征，而α-MSH-DC经LPS刺激后表面CD80、CD86、CD11c和MHC-II的表达显著降低。ELISA检测(R&D公司，美国)IL-12水平的结果如图10所示，与Day8-DC相比，Day5-DC、hrGFP-DC、α-MSH-DC皆分泌低水平的IL-12(P＜0.01)，而且三组间无显著差异。当各组DC经100ng/ml LPS刺激20h后，分泌IL-12的水平都较LPS刺激前明显增高(P＜0.01)，但Day8-DC分泌IL-12的水平最高(P＜0.01)，Day6-DC与hrGFP-DC分泌IL-12的水平较Day8-DC降低，α-MSH-DC分泌IL-12的水平又低于Day6-DC和hrGFP-DC(P＜0.01)。说明α-MSH-DC的成熟受到抑制，且能部分抵抗LPS的促成熟作用。

实施例5：α-MSH-DC影响同种异体心脏移植排斥反应的实验

分别将供者BALB/c小鼠来源的Day5-DC、GFP-DC、α-MSH-DC和PBS经尾静脉注入受者C57BL/6小鼠，观察移植心脏存活期，结果如图11所示，Day5-DC和hrGFP-DC免疫组的移植心脏存活时间分别为14.6±2.21和14.3±1.57天，较未经DC免疫的PBS对照组的7.0±0.33天明显延长，而Day5-DC和hrGFP-DC免疫组之间没有明显差异；输入α-MSH-DC组移植心脏平均存活天数延长至19.3±2.35天，与Day5-DC和hrGFP-DC免疫组相比有显著的差异(P＜0.01)。表明经α-MSH基因修饰的未成熟DC在体内能明显延长移植物的存活时间。

在注射各组DC后第7天处死C57BL/6受者，收获其脾脏T淋巴细胞，与不同数量经γ射线(30Gy)灭活的BALB/c同种脾脏淋巴细胞作混合淋巴细胞反应。结果发现，与PBS组相比，Day5-DC、GFP-DC与α-MSH-DC免疫组的脾脏T淋巴细胞对供者同种抗原的刺激反应都减弱(P＜0.01)；α-MSH-DC组比Day5-DC和GFP-DC组进一步减弱(P＜0.01)，而Day5-DC与GFP-DC组之间无明显差别(P＞0.05)，见图12。结果表明，与Day5-DC和GFP-DC相比，α-MSH-DC免疫受者后，进一步抑制了受者脾脏淋巴细胞对供者同种异基因抗原的免疫应答。

SEQUENCE LISTING

<110>第二军医大学

<120>携带a-黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体与用途

<130>说明书，权利要求书

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

agttatagta tggagcactt caggtgggga aagccagta                               39

<210>2

<211>114

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgaagttcc tctctgcaag agacttccat ccagttgcct tcttgggact gatgctggtg        60

acaaccacgg ccagttatag tatggagcac ttcaggtggg gaaagccagt atag             114

<210>3

<211>72

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atgaagttcc tctctgcaag agacttccat ccagttgcct tcttgggact gatgctggtg        60

acaaccacgg cc                                                            72

Claims (8)

1、一种携带α-黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV，其特征在于它是由α-黑素细胞刺激素α-MSH基因和腺相关病毒rAAV载体构建而成，α-MSH基因的核苷酸序列如下：

5′agttatagta tggagcactt caggtgggga aagccagta 3′    39

2、权利要求1所述重组表达载体α-MSH-rAAV的制备方法，包括如下步骤：

1)构建pGEM-IL-6sp重组质粒

①以T淋巴细胞系总RNA为模板，用M-MLV Rtase cDNA合成试剂盒行逆转录

②合成IL-6信号肽引物，

正向引物：5’-G GAATTCATGAAGTTCCTCTCTGC-3’

反向引物：5’-C GGTACCGCCGGCGGCCGTGGTTGTCACCA-3’

其中正向引物引入EcoR I酶切位点，反向引物引入Nae I Kpn I酶切位点

③以逆转录产物为模板，用合成的正反向引物进行PCR扩增，扩增出IL-6信号肽cDNA，其碱基序列5’至3’为序列3：

5′atgaagttcc tctctgcaag agacttccat ccagttgcct tcttgggact gatgctggtg       60

acaaccacgg cc 3′                                                          72

④将PCR产物经EcoR I和Kpn I酶切纯化后定向克隆入载体质粒pGEM-3z，测序鉴定，构建成pGEM-IL6sp重组质粒；

2)合成α-MSH双链DNA片段

α-MSH基因的碱基序列5’至3’为序列1：

5′agttatagta tggagcactt caggtgggga aagccagta 3′                          39

合成α-MSH双链DNA片段，使其5’端和3’端分别携带Nae I和KpnI酶切位点；

3)构建pGEM-IL-6sp-α-MSH重组质粒

将合成的α-MSH双链DNA片段经Nae I和Kpn I酶切纯化后定向克隆入上述构建的pGEM-IL-6sp重组质粒，测序鉴定，构建成pGEM-IL-6sp-α-MSH重组质粒；

4)构建α-MSH-rAAV

将pAAV-IL-6sp-α-MSH重组质粒与腺相关病毒重组系统中含有重组rAAV所需腺病毒成分的pHelper质粒和含有包装和复制rAAV所需成分的pRC质粒，共转染人胚肾细胞株HEK293细胞，得到携带α-黑素细胞刺激素基因的重组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV。

3、权利要求1所述重组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV在制备治疗自身免疫性疾病或移植排斥反应药物中的用途。

4、按权利要求3所述α-MSH-rAAV的用途，所述的自身免疫性疾病是指：实验性自身免疫性脑脊髓炎、多发性硬化、自身免疫性卵巢炎或风湿性关节炎，所述的移植排斥反应是指在心脏移植、肾脏移植、肝脏移植、肠移植或皮肤移植时的排斥反应。

5、权利要求1所述重组腺相关病毒表达载体α-MSH-rAAV用于制备α-MSH基因修饰的免疫细胞的用途。

6、按权利要求5所述α-MSH-rAAV的用途，所述α-MSH基因修饰的免疫细胞是指：T淋巴细胞、B淋巴细胞或树突状细胞。

7、权利要求5或6所述免疫细胞在制备治疗自身免疫性疾病或移植排斥反应药物中的应用。

8、按权利要求7所述α-MSH-rAAV的用途，所述的自身免疫性疾病是指：实验性自身免疫性脑脊髓炎、多发性硬化、自身免疫性卵巢炎或风湿性关节炎，所述的移植排斥反应是指在心脏移植、肾脏移植、肝脏移植、肠移植或皮肤移植时的排斥反应。

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