CN102834506A - 调节性树突细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是建立能够安全且简便地制备大量的调节性树突细胞的方法。根据本发明，提供了调节性树突细胞的制备方法，包括在[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞。

Description

调节性树突细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及在起因于免疫系统的异常应答和过度应答的移植排斥反应、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、变态反应疾病、慢性炎性疾病和败血症等疾病的预防和治疗中利用的调节性树突细胞的制备方法。更详细地，本发明涉及应用[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物、特别是(S)-(+)-1-(5-羟基-1,5-二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑[1,5-α]嘧啶-2-基]脲(NK026680)的调节性树突细胞的制备方法。进一步地，本发明涉及通过上述方法制备的调节性树突细胞、以及含有上述调节性树突细胞的药物组合物或药物试剂盒。进一步地，本发明涉及[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物在调节性树突细胞的制备中的用途。
背景技术
对于起因于免疫性的异常和过度应答的疾病的预防和治疗，迄今主要利用免疫抑制剂、抗炎症剂和抗变态反应剂等药剂。药剂治疗是有效的，但也产生副作用引起的患者的QOL低下的问题。
这些药剂也迁移到靶免疫细胞以外的组织。药物在这种靶外组织中表现非特异性的作用，从而出现副作用。由于这种副作用，常常发生尽管显示免疫抑制效果也不得不中止给药的情况，另外，进行用于减轻副作用的医疗处置等有时也降低患者的QOL。也尝试通过局部给药减轻副作用，但其限于疾病部位局限于特定的组织或器官的特应性皮炎、支气管哮喘等。
因此，尝试应用调节性树突细胞进行前述疾病等的预防和治疗。树突细胞是具有树状突起的抗原呈递细胞，在末梢非淋巴组织、淋巴组织中作为未成熟树突细胞广泛存在。在受微生物、病毒、异物等外来抗原侵袭的炎症组织中，其吞噬这些抗原而分化为成熟树突细胞，并向所属次级淋巴组织迁移。在此处，成熟树突细胞与抗原刺激共刺激幼稚T细胞，使其分化诱导为抗原特异性效应T细胞而引起免疫应答。这样的树突细胞是连接天然免疫和获得性免疫的强有力的抗原呈递细胞。
一方面揭示了，存在在炎症环境下共刺激分子的表达降低的树突细胞，这些树突细胞抑制性地调节T细胞，诱导对自身组织等的免疫耐受。这样的树突细胞称为调节性树突细胞。应用调节性树突细胞的免疫细胞疗法在小鼠中在移植物抗宿主病、自身免疫疾病、变态反应疾病模型中诱导抗原特异性不应答T细胞、调节性T细胞，从而显示治疗效果(非专利文献1、2和3)。进一步地，在小鼠败血症模型中，调节性树突细胞通过IL-10的产生阻碍炎性细胞因子的产生而显示延长寿命的效果(非专利文献4)。
专利文献1记载了，将人树突细胞或其前体细胞在体外与至少含有IL-10和TGF-β的细胞因子类共培养而诱导人免疫调节性树突细胞的方法，和通过该方法得到的人免疫调节性树突细胞。专利文献2尝试了，将调节性树突细胞作为IL-10产生促进剂使用，用于全身性炎症反应综合征。
迄今，致力于应用如前述的调节性树突细胞的免疫细胞疗法对免疫疾病的临床应用，对于实际临床应用，需要建立包含调节性树突细胞的安全性的大量制备方法。如非专利文献1中所示，迄今报告的调节性树突细胞的制备中使用包含IL-10和TGF-β的细胞因子类等，但由于这些细胞因子类由大肠杆菌等的基因重组体制备，具有阻碍大量制备的制备成本、安全性的问题。
一方面，[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物(专利文献3和4)是阻碍树突细胞的功能的物质，对小鼠延迟型过敏反应显示抑制作用(专利文献4)。特别地，在其衍生物之一的(S)-(+)-1-(5-羟基-1,5-二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-α]嘧啶-2-基]脲(下文称为“NK026680”)存在下培养树突细胞，共刺激分子的表达降低，另外NK026680对移植物抗宿主病模型和自身免疫性血管炎模型显示效果(非专利文献5和6)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开2004-298181号公报
专利文献2：特开2006-290761号公报
专利文献3：特开2005-154335号公报
专利文献4：国际公开2004/108729号公报。
非专利文献
非专利文献1：Sato K, Yamashita N, Yamashita N, Baba M, Matsuyama T. Regulatory dendritic cells protect mice from murine acute graft-versus-host disease and leukemia relapse. Immunity 2003; 18(3): 367-379.
非专利文献2：Sato K, Yamashita N, Baba M, Matsuyama T. Modified myeloid dendritic cells act as regulatory dendritic cells to induce anergic and regulatory T cells. Blood 2003; 101(9): 3581-3589.
非专利文献3：Fujita S, Yamashita N, Ishii Y, Sato Y, Sato K, Eizumi K, Fukaya T, Nozawa R, Takamoto Y, Yamashita N, Taniguchi M, Sato K. Regulatory dendritic cells protect against allergic airway inflammation in a murine athmatic model. J Allergy Clin Immunol 2008; 121(1): 95-104.
非专利文献4：Fujita S, Seino K, Sato K, Sato Y, Eizumi K, Yamashita N, Taniguchi M, Sato K. Regulatory dendritic cells act as regulators of acute lethal systemic inflammatory response. Blood 2006; 107(9): 3656-3664.
非专利文献5：Saiga K, Toyoda E, Tokunaka K, Masuda A, Matsumoto S, Mashiba H, Kuramochi H, Nemoto K, Abe F, Kawagishi N, Furukawa H, Ono M. NK026680, a novel compound suppressive of dendritic cell function, ameliorates mortality in acute lethal graft-versus-host reaction in mice. Bone Marrow Transplant 2006; 37(3): 317-323.
非专利文献6：Saiga K, Yoshida M, Nakamura I, Toyoda E, Tokunaka K, Morohashi H, Abe F, Nemoto K, Nose M. Evaluation of the ameliorative effects of immunosuppressants on crescentic glomerulonephritis in SCG/Kj mice. Int Immunopharmacol 2008; 8(9): 1183-1189。
发明内容
发明要解決的课题
本发明要解决的课题是，建立能够安全且简便地制备大量的调节性树突细胞的方法。进一步地，本发明要解决的课题是，提供维持患者的QOL的、对于免疫系统疾病的预防和治疗有用的调节性树突细胞。
解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题而深入研究，结果发现，通过在[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物的存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞，能够制备调节性树突细胞，从而完成本发明。
即，根据本发明，提供以下的发明。
(1)　调节性树突细胞的制备方法，其包括在[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物的存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞。
(2)　(1)中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物是(S)-(+)-1-(5-羟基-1,5-二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-α]嘧啶-2-基]脲。
(3)　(1)或(2)中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中可诱导为调节性树突细胞的细胞是树突细胞或其前体细胞。
(4)　(3)中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中树突细胞的前体细胞是单核细胞。
(5)　(1)至(4)中的任一项中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中可诱导为调节性树突细胞的细胞是末梢血、骨髄、脾脏、或脐带血来源的细胞。
(6)　(1)至(5)的任一项中记载的调节性树突细胞的制备方法，其包含在GM-CSF和IL-4的存在下培养细胞。
(7)　(1)至(6)的任一项中记载的调节性树突细胞的制备方法，其包含在TNF-α和/或LPS的存在下培养细胞。
(8)　由(1)至(7)的任一项中记载的制备方法制备的调节性树突细胞。
(9)　(8)中记载的调节性树突细胞，与通过在[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物不存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞而得到的细胞比较，其CD40、CD80和CD86的表达量低。
(10)　(8)或(9)中记载的调节性树突细胞，与通过在[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物不存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞而得到的细胞比较，其IL-6和IL-12 p40的产生量低。
(11)　(8)至(10)的任一项中记载的调节性树突细胞，与通过在[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物不存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞而得到的细胞比较，其诱导T细胞针对异源抗原活化的能力低。
(12)　含有(8)至(11)的任一项中记载的调节性树突细胞的药物组合物或药物试剂盒。
(13)　(12)中记载的药物组合物或药物试剂盒，其用于在起因于免疫系统的异常应答和过度应答的移植排斥反应、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、变态反应疾病、慢性炎性疾病和败血症的预防和/或治疗中应用。
(14)　[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物在调节性树突细胞的制备中的应用。
(15)　(14)中记载的应用，其中[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物是(S)-(+)-1-(5-羟基-1,5-二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-α]嘧啶-2-基]脲。
(16)　含有[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物的调节性树突细胞诱导试剂。
(17)　(16)中记载的调节性树突细胞诱导试剂，其中[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物是(S)-(+)-1-(5-羟基-1,5-二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-α]嘧啶-2-基]脲。
发明的效果
本发明中的[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物对于在生物体外从末梢血细胞、骨髄细胞等中包含的单核的细胞诱导调节性树突细胞是有用的。[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物是制备成本低且能够确保大量生产和安全性的低分子化合物。通过将[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物用于调节性树突细胞的制备，能够安全且简便地得到大量的调节性树突细胞。本发明中，可以不应用昂贵且物理性质不稳定的基因重组细胞因子类、以低成本配制大量的调节性树突细胞。另外，由于本发明的调节性树突细胞中不残留制备中使用的药剂，不发生制备中使用的药剂引起的副作用，对于骨髄抑制、脏器移植、自身免疫疾病、变态反应疾病和休克等起因于免疫系统的异常和过度应答的疾病的预防和治疗是非常有效的。
附图说明
 图1显示本发明的调节性树突细胞(NK-DC)、未处理树突细胞(CTR-DC)和未成熟树突细胞(unstim-DC)的3H-TdR的掺入(incorporation)。黑色圆圈表示NK-DC，白色圆圈表示CTR-DC，×表示unstim-DC。
图2显示分别移入本发明调节性树突细胞(NK-DC)与未处理树突细胞(CTR-DC)的C3He/J小鼠中，移植了C57BL/6小鼠的心脏的心移植C3He/J小鼠的存活率。实线表示NK-DC，点线表示CTR-DC。
具体实施方案
本发明中，通过将可诱导为调节性树突细胞的细胞(例如，树突细胞或其前体细胞等)在试管内应用[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物处理、以及根据期望应用细胞因子类和/或炎性刺激物处理，可以制备调节性树突细胞。具体地，通过向从末梢血或骨髓等收集的单核细胞中添加GM-CSF、IL-4、[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物而诱导树突细胞、和对该树突细胞进行细胞因子类和/或炎性刺激(例如TNF-α、LPS等)处理，可以获得调节性树突细胞。另外，这些细胞因子类和/或炎性刺激、和[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物的刺激顺序没有特别限制，通过以任意顺序进行该刺激顺序，可以配制调节性树突细胞。作为一个例子，通过将单核细胞在GM-CSF和IL-4的存在下体外培养，使单核细胞分化为树突细胞，得到的树突细胞通过[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物可诱导调节性树突细胞。此时，可以将单核细胞最初用GM-CSF和IL-4刺激分化为树突细胞后用[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物刺激，也可以用GM-CSF、IL-4、[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物同时刺激。此时，可以使使调节性树突细胞分化的细胞因子类(例如IL-10和TGF-β等)与[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物共存。进一步地，通过TNF-α、LPS等给予炎性刺激，可以得到成熟的调节性树突细胞。
在本发明的调节性树突细胞的制备中使用的细胞因子类、炎性刺激物没有特别限制。细胞因子类可列举，例如GM-CSF、IL-4、IL-10、TGF-β等具有分化诱导树突细胞的作用的物质。炎性刺激物可列举，例如以LPS为代表的脂多糖、TNF-α等赋予炎性刺激的细胞因子。
树突细胞通过在GM-CSF和/或IL-4的存在下培养如前述的单核细胞获得。此时的单核细胞可以源自末梢血、源自骨髄、源自脾脏细胞、源自脐带血。进一步地，可以利用细胞分选仪等，以CD1a等树突细胞特异性表面抗原的表达为指标，从这些组织、器官分离树突细胞。利用细胞分选仪分离特定细胞群可以利用公知的方法进行。用于得到本发明的调节性树突细胞的单核细胞源自哺乳动物即可，可列举灵长目、啮齿目、食肉目、偶蹄目、奇蹄目等，例如人、猴、小鼠、大鼠、兔、猫、牛、犬、马、山羊等，最优选地是人。在上述中优选地，与利用本发明的调节性树突细胞实施疾病的预防或治疗的动物为同种来源。
单核细胞、树突细胞的培养可以通过公知的淋巴系细胞培养技术进行。培养液可以应用例如RPMI1640、DMEM，可在这些基本培养基中添加适当的抗生素、动物血清等进行培养。培养容器也不进行限定，可以根据培养规模适当选择并应用市售的平板、培养皿、摇瓶。
本发明中应用的[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物具体为特开2005-154335号公报和国际公开2004/108729号公报中记载的化合物。即，本发明中应用的[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物优选地是下述通式(1)中表示的化合物或其药学容许的盐。
[化学式1]
Figure 101097DEST_PATH_IMAGE001
[式中，Ar表示任选地具有取代基的芳香族烃基或含有1～4个杂原子的芳香族杂环基，X表示O、S、NH、N-CH3或N-CN，Y表示任选地具有取代基的苯基或RNH基，R表示氢原子、氰基、任选地具有取代基的直链或支链或环状烷基、任选地具有取代基的芳香族烃基、或任选地具有取代基的含有独立地选自N、O和S的1～4个杂原子的5～7元杂环基]。
具体地，为下列的[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基脲衍生物、或其药学上容许的盐，例如，Ar是任选地具有取代基的苯基或任选地具有取代基的含有选自N、O和S的1个杂原子的5～6元芳香族杂环基，该苯基或该芳香族杂环基任选地用选自卤代基、羟基、氰基、硝基、(C1～C6)烷基、(C1～C6)烷氧基和亚烷二氧基的取代基组的相同或不同的1或2个基团取代，Ｘ是O，R是任选地用选自卤代基、羟基、(C1～C6)烷基、(C1～C6)烷氧基、(C1～C7)酰氧基、三氟甲基和三氟甲氧基的取代基组的相同或不同的1～3个基团取代的苯基或通式(2)
[化学式2]
{式中，R1表示氢原子或(C1～C6)烷基，R2表示氢原子或甲基，R3表示氢原子、苯基(该苯基任选地用选自卤代基、羟基、(C1～C6)烷基和(C1～C6)烷氧基的1个基团取代)或(C1～C10)烷基(该烷基任选地用选自卤代基、羟基、(C1～C6)烷氧基、(C1～C7)酰氧基和三氟甲基的相同或不同的1或2个基团取代)}。
本发明中应用的[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物的具体例可以列举以下的化合物，但不限于此。
(S)-1-(3-乙氧基-1-甲基丙基)-3-[7-(3,4-亚甲二氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基]脲，
(S)-1-(4-甲氧基-1-甲基丁基)-3-[7-(4-甲氧基苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基]脲，
(S)-1-(4-羟基-1,4-二甲基戊基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基]脲，
(S)-1-(5-羟基-1,5-二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基]脲，
(S)-1-(5-羟基-1,5-二甲基己基)-3-{7-[3-(吡啶-3-基甲氧基)苯基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基}脲，
(S)-1-(5-羟基-1,5-二甲基己基)-3-(7-噻吩-2-基[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)脲，
(S)-1-[1-(3-甲氧基苯基)乙基]-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基]脲，
(S)-1-[7-(3,4-亚甲二氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基]-3-[1-(3-甲氧基苯基)乙基]脲，
(S)-1-[7-(3,4-亚甲二氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基]-3-[1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙基]脲，
(S)-1-(7-噻吩-2-基[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)-3-[1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙基]脲，
(S)-1-[1-(3,4-亚甲二氧基苯基)乙基]-3-{7-[3-(吡啶-3-基甲氧基)苯基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基}脲，
(S)-1-(1,5-二甲基己基)-3-[7-(4-羟基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基]脲，
(S)-1-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基]-3-(1-苯基乙基)脲，
4-氯-2-甲氧基-N-(7-噻吩-2-基[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)苯甲酰胺，
(S)-1-(1,5-二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基]脲，
1-(2-甲氧基苯基)-3-(7-噻吩-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)脲，
1-异丙基-3-(7-噻吩-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)脲，
(R)-1-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2-基]-3-(1-苯基乙基)脲，或
(R)-1-(5-羟基-1,5-二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-α]嘧啶-2-基]脲。
本发明中应用的[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物的最优选的具体例是(S)-(+)-1-(5-羟基-1,5-二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-α]嘧啶-2-基]脲。
根据本发明，提供了[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物在调节性树突细胞的制备中的应用、以及含有[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物的调节性树突细胞诱导试剂。
培养中应用的[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物的浓度是1ng/mL～5000ng/mL、优选地10ng/mL～500ng/mL。GM-CSF、IL-4、IL-10、TGF-β、TNF-α、LPS的浓度是1ng/mL～1000ng/mL、优选地10ng/mL～100ng/mL。另外，刺激必需的培养天数没有限制，例如单核细胞用[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物、细胞因子类和/或炎性刺激共同培养数日至10日左右即可。通过用流式细胞分析等研究单核细胞或树突细胞的表面抗原的表达，可以适当确定得到目的分化程度的细胞的培养时期。刺激中应用的[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物、细胞因子类和/或炎性刺激的浓度、刺激时期等的条件可以以异源CD4阳性T细胞的抗原不应答性的诱导、树突细胞表型为指标确定。
本发明的调节性树突细胞在疾病的治疗中应用的情况下，用与本发明的调节性树突细胞要治疗的疾病关联的抗原刺激。作为抗原，如果是自身免疫疾病、变态反应性疾病，则应用与疾病关联的组织、脏器中存在的抗原蛋白或肽，另外地，编码它们的RNA、DNA类、和其变体。如果是移植物排斥、移植物抗宿主病，由于树突细胞内在地表达异源抗原，不需要再次给予抗原，但也可能应用供体或受者来源的抗原。对于此时的刺激，将本发明的调节性树突细胞在体外与抗原共培养即可。
在自身免疫疾病、变态反应性疾病治疗中，在包含培养最末日的10日至1日期间向树突细胞给予抗原，在蛋白抗原的情况下，抗原以1ng/mL～10mg/mL、优选地10ng/mL～5mg/mL的浓度体外给予。在应用通过炎性刺激物质进一步刺激的调节性树突细胞的情况下，通常与炎性刺激同时或在刺激前给予抗原。
本发明的调节性树突细胞可以在起因于免疫异常的免疫疾病等的治疗药和预防药等中使用。免疫疾病可列举移植排斥反应、自身免疫疾病、变态反应疾病、炎性疾病、败血症、休克等。
移植排斥反应可列举移植中的急性排斥反应、移植物抗宿主病、慢性排斥反应等。本发明的调节性树突细胞除对移植排斥反应的治疗和预防外，还可以在免疫耐受的诱导等中使用。移植脏器可以为骨髄、肾脏、肝脏、心脏、胰脏等任一脏器。供体宿主间的关系可以是异种间移植、异系统间移植、血型不适合间移植等任一情况。另外，对于癌治疗、自身免疫疾病治疗、基因治疗、再生医疗等中应用的骨髄移植、末梢血干细胞移植、脐带血干细胞移植等的脏器移植，本发明的调节性树突细胞也可以用于免疫抑制、移植脏器的长期移入等目的。
自身免疫疾病可列举，类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、干燥综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少症、再生不良性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、特发性血小板减少紫癜病、贝切特病、自身免疫性胃炎、胰岛素依赖性糖尿病、重症肌无力、多发性肌炎、硬皮病、混合性结缔组织病、强直性脊柱炎、慢性甲状腺炎、天疱疮、格-巴二氏综合征、HTLV-1相关脊髄病等。另外，变态反应性疾病可以是，特应性皮肤疾病、花粉症、接触性过敏症、哮喘、牛皮癣、过敏反应等。炎性疾病可列举，多发性动脉炎、结节病、肾小球肾炎、肾病综合征、难治性血管炎、韦格纳综合征等。
本发明的调节性树突细胞的给药量根据给药对象显示期望效果的用量适当设定。具体地，对给药对象(个体) 静脉内或皮下、皮内(优选地静脉内)给予0.5×105 ～109个左右的本发明的调节性树突细胞。给药时的介质是不对给药对象造成副作用等、不损害本发明的调节性树突细胞的功能的介质即可，没有特别限制，可为通常应用的介质。例如，可列举RPMI1640、DMEM等培养基，Hanks缓冲液、磷酸缓冲盐水(PBS)、生理盐水、葡萄糖液等。给药对象为哺乳动物即可，没有特别限定，可列举灵长目、啮齿目、食肉目、偶蹄目、奇蹄目等，例如人、猴、小鼠、大鼠、兔、猫、牛、犬、马、山羊等。优选地人。
关于各种疾病的预防或治疗剂对给药对象的给药时期没有特别限制，可以随时进行给药。特别是对于脏器、组织移植所伴随的移植物排斥、移植物抗宿主病，优选在预料发病的处置之前给药。人免疫调节性树突细胞的给药时期、给药量可以根据疾病的种类、疾病的严重度、患者的状态等适当确定。
本发明还包括含有本发明的调节性树突细胞的药物组合物或药物试剂盒。本发明的药物组合物含有本发明的调节性树突细胞即可，没有特别限定，例如可列举，将本发明的调节性树突细胞悬浮于如前述的不赋予给药对象副作用等、不损害本发明的调节性树突细胞的功能的介质中而成的组合物等。也包括添加了维持本发明的调节性树突细胞的状态的医药上可容许的添加剂、其它药剂而成的组合物。本发明的药物试剂盒指组合了本发明的调节性树突细胞或本发明的药物组合物与其它药剂而成的试剂盒。该其它药剂为公知的起因于免疫异常的免疫疾病等的治疗药和预防药即可，没有限定，例如可列举柳氮磺胺吡啶、布西拉明、硫代苹果酸金钠、D-青霉胺、金诺芬、阿克他利、氯苯扎利等的免疫调节药，甲氨蝶呤、来氟米特、他克莫司、咪唑立宾、环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢菌素、麦考酚酸吗乙酯等的免疫抑制药，英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、托西珠单抗、利妥昔单抗等的生物学制剂，甲芬那酸、双氯芬酸钠、萘布美通、依托度酸、环氧洛芬钠、美洛昔康等的NSAID，泼尼松龙、甲基泼尼松龙、甲基泼尼松龙乙酸酯、甲基泼尼松龙琥珀酸酯钠、地塞米松、倍他米松、氢化可的松等的类固醇药，叠氧胸苷、拉米夫定、阿巴卡韦、恩曲他滨等的NRTI，替诺福韦等的核苷酸类逆转录酶抑制剂，依法韦仑等的NNRTI，阿扎那韦、呋山那韦、洛匹那韦、利托那韦、地瑞那韦等的蛋白酶抑制药，雷特格韦等的整合酶抑制药等。另外，本发明的药物试剂盒中，本发明的调节性树突细胞和或本发明的药物组合物和其它药剂的给药顺序不受限定。
以下的实施例中，对本发明的调节性树突细胞示例了几个实施方案进行说明。但本发明不限于这些实施例。
实施例
C57BL/6小鼠骨髄细胞的收集
从C57BL/6小鼠(SLC、雄性、10～12周龄)取出大腿骨，在RPMI1640培养基中切断大腿骨的两端，取出骨内部中的骨髄组织。应用26G注射器，使这种骨髄组织单细胞化，获得C57BL/6小鼠骨髄细胞。
C57BL/6小鼠骨髄细胞向树突细胞的分化和成熟刺激
将C57BL/6小鼠骨髄细胞在含有20ng/mL的GM-CSF(Peprotech，来源：兔)和20ng/mL的IL-4(Peprotech，来源：兔)的10％FCS-RPMI1640培养基中培养7天分化成树突细胞，其后添加20ng/mL的TNF-α(Peprotech，来源：兔)使其成熟。NK026680处理如下进行，在培养第2日和第4日添加50ng/mL、第6日添加250ng/mL。
C57BL/6小鼠脾脏细胞和T细胞的收集
从C57BL/6小鼠(SLC、雄性、10～12周龄)取出脾脏，在RPMI1640培养基中从脾脏内取出脾脏细胞，应用26G注射器进行单细胞化，得到C57BL/6小鼠脾脏细胞。C57BL/6小鼠T细胞应用尼龙棉(R&D systems)从C57BL/6小鼠脾脏细胞分离收集。
C57BL/6小鼠脾脏细胞提取液
将C57BL/6小鼠脾脏细胞用超声波粉碎器粉碎，冷冻于-80℃。其后解冻、离心(300g，5分钟)除去细胞碎片，将其上清作为提取液。
C3He/J小鼠骨髄细胞的收集
从C3He/J小鼠(SLC、雄性、10～12周龄)取出大腿骨，在RPMI1640培养基中切断大腿骨的两端，取出骨内部中的骨髄组织。应用26G注射器，使这种骨髄组织单细胞化，获得C3He/J小鼠骨髄细胞。
C3He/J小鼠骨髄细胞向树突细胞的分化
将C3He/J小鼠骨髄细胞在含有20ng/mL的GM-CSF和20ng/mL的IL-4的10％FCS-RPMI1640培养基中培养7天分化成树突细胞。NK026680处理如下进行，在培养第2日和第4日添加50ng/mL、第6日添加250ng/mL。另外，第6日也加入C57BL/6小鼠脾细胞提取液。
BALB/c小鼠脾脏细胞提取液
从BALB/c小鼠(SLC、雄性、10～12周龄)取出脾脏，在RPMI1640培养基中从脾脏内取出脾脏细胞，应用26G注射器进行单细胞化，得到BALB/c小鼠脾脏细胞。将这种脾脏细胞用超声波粉碎器粉碎，冷冻于-80℃。其后解冻、离心(300g，5分钟)除去细胞碎片，将其上清作为提取液。
(实施例1)
向来源于从C57BL/6小鼠收集的骨髄细胞的树突细胞添加BALB/c小鼠来源的脾脏细胞提取液使其呈递BALB/c抗原。用流式细胞分析测定作为BALB/c的主要组织相容性抗原(MHC)的I-Ad(抗体：BD pharmingen)的表达而确认BALB/c抗原掺入效果。此时，在NK026680的存在下、非存在下培养后，用TNF-α(Peprotech，来源：兔)使细胞成熟。通过流式细胞分析来分析成熟树突细胞标志表达，确认树突细胞的成熟)。对于本发明的NK026680处理树突细胞(NK-DC)与未处理的树突细胞(CTR-DC)，使共刺激分子CD40、CD80和CD86的荧光标记抗体反应，用流式细胞分析测定平均荧光强度(MFI)而比较CD40、CD80和CD86的表达量。
实施例1的结果在表1中示出。以作为CD40、CD80和CD86的荧光标记抗体的结合量的MFI进行比较，本发明的NK026680处理树突细胞(NK-DC)的CD40、CD80和CD86的表达量与未处理的树突细胞(CTR-DC)相比变少。共刺激分子的低表达是调节性树突细胞的性质，显示本发明的NK026680处理树突细胞是调节性树突细胞。
[表1]
Figure 879008DEST_PATH_IMAGE003
(实施例2)
本实施例2中，与实施例1同样地得到从C57BL/6小鼠骨髄细胞分化成熟的本发明的NK026680处理树突细胞与未处理的树突细胞。TNF刺激后培养24小时并收集得到的培养上清，用ELISA(BD bioscience)测定免疫应答刺激细胞因子IL-6和IL-12p40浓度(n＝3)。
实施例2的结果在表2中示出。NK026680处理树突细胞的培养上清中含有的IL-6和IL-12p40浓度与未处理树突细胞的培养上清相比变少。免疫应答刺激细胞因子IL-6和IL-12p40的低产生是调节性树突细胞的性质，显示本发明的NK026680处理树突细胞是调节性树突细胞。
[表2]
Figure 77908DEST_PATH_IMAGE004
(实施例3)
本实施例3中，与实施例1同样地得到从C57BL/6小鼠骨髄细胞分化成熟的本发明的调节性树突细胞，即NK026680处理(NK-DC)与未处理的树突细胞(CTR-DC)。另外，也获得从C57BL/6小鼠骨髄细胞分化为树突细胞后与实施例1同样地呈递BALB/c抗原、但未进行利用TNF-α的成熟的未成熟树突细胞(unstim-DC)。这3种树突细胞各自混合C57BL/6小鼠T细胞后，测定3H-TdR(GE healthcare)的掺入。3H-TdR的掺入量显示树突细胞诱导T细胞针对异源抗原活化的能力。
实施例3的结果在图1中示出。与CTR-DC相比，NK-DC诱导T细胞针对BALB/c抗原活化的能力低。另外，NK-DC诱导T细胞活化的能力与unstim-DC等同。即，即使存在异源抗原刺激，NK-DC也与未成熟树突细胞同样程度地显示出诱导T细胞活化的能力降低。
(实施例4)
在本实施例4中，向C3He/J小鼠骨髄细胞来源的树突细胞中加入C57BL/6小鼠脾脏细胞的提取液使其呈递C57BL/6抗原。用流式细胞分析测定作为BALB/c的MHC的I-Ab(抗体：BD pharmingen)的表达而确认C57BL/6抗原掺入效果。此时，在NK026680的存在下、非存在下进行培养。NK026680处理(NK-DC)与未处理的树突细胞(CTR-DC)各自通过静脉内给药而移入(给药数3×106个/只，介质：磷酸缓冲盐水(PBS))C3He/J小鼠(SLC、雄性、10～12周龄)。此时，也制备树突细胞不移入的组(未处理)(n＝6)。7日后，对于NK-DC移入组、CTR-DC移入组和未处理组，移植C57BL/6小鼠(SLC、雄性、10～12周龄)的心脏并比较3组的存活率。
实施例4的结果在图2中示出。NK-DC移入组与CTR-DC移入组和未处理组相比确认到显著的存活率改善和存活期延长。
产业实用性
根据本发明的调节性树突细胞的制备方法，能够以简便的方法得到相当大量的调节性树突细胞。另外，按照本发明的调节性树突细胞的制备方法制备的调节性树突细胞对于起因于免疫性的异常和过度应答的疾病的预防和治疗是有用的。

Claims (17)

1.调节性树突细胞的制备方法，其包括在[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物的存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞。
2.权利要求1中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物是(S)-(+)-1-(5-羟基-1,5-二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-α]嘧啶-2-基]脲。
3.权利要求1或2中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中可诱导为调节性树突细胞的细胞是树突细胞或其前体细胞。
4.权利要求3中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中树突细胞的前体细胞是单核细胞。
5.权利要求1至4的任一项中记载的调节性树突细胞的制备方法，其中可诱导为调节性树突细胞的细胞是末梢血、骨髄、脾脏、或脐带血来源的细胞。
6.权利要求1至5的任一项中记载的调节性树突细胞的制备方法，其包含在GM-CSF和IL-4的存在下培养细胞。
7.权利要求1至6的任一项中记载的调节性树突细胞的制备方法，其包含在TNF-α和/或LPS的存在下培养细胞。
8.由权利要求1至7的任一项中记载的制备方法制备的调节性树突细胞。
9.权利要求8中记载的调节性树突细胞，与通过在[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物不存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞而得到的细胞比较，其CD40、CD80和CD86的表达量低。
10.权利要求8或9中记载的调节性树突细胞，与通过在[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物不存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞而得到的细胞比较，其IL-6和IL-12 p40的产生量低。
11.权利要求8至10的任一项中记载的调节性树突细胞，与通过在[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物不存在下培养可诱导为调节性树突细胞的细胞而得到的细胞比较，其诱导T细胞针对异源抗原活化的能力低。
12.含有权利要求8至11的任一项中记载的调节性树突细胞的药物组合物或药物试剂盒。
13.权利要求12中记载的药物组合物或药物试剂盒，其用于在起因于免疫系统的异常应答和过度应答的移植排斥反应、自身免疫疾病、变态反应疾病、炎性疾病、败血症或休克的预防和/或治疗中应用。
14.[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物在调节性树突细胞的制备中的应用。
15.权利要求14中记载的应用，其中[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物是(S)-(+)-1-(5-羟基-1,5-二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-α]嘧啶-2-基]脲。
16.含有[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物的调节性树突细胞诱导试剂。
17.权利要求16中记载的调节性树突细胞诱导试剂，其中[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物是(S)-(+)-1-(5-羟基-1,5-二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-α]嘧啶-2-基]脲。
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