JP5782426B2

JP5782426B2 - 制御性樹状細胞の作製方法

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Publication number: JP5782426B2
Application number: JP2012501802A
Authority: JP
Inventors: 省藤堂; 健一郎山下; 晋柴崎
Original assignee: Hokkaido University NUC; Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Hokkaido University NUC; Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 2010-02-23
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2015-09-24
Anticipated expiration: 2031-02-23
Also published as: AU2011221314B2; EP2540821A4; US20130052734A1; KR20120135265A; WO2011105394A1; RU2597976C2; AU2011221314A1; CN102834506A; RU2012140456A; US20150139971A1; CA2790922A1; EP2540821A1; JPWO2011105394A1

Description

本発明は、免疫系の異常応答及び過剰応答に起因する移植拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫疾患、アレルギー疾患、慢性炎症性疾患及び敗血症などの疾患の予防及び治療に利用される制御性樹状細胞の作製方法に関する。より詳細には、本発明は、［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体、特には（Ｓ）−(＋)−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール［１，５−α］ピリミジン−２−イル］ウレア（ＮＫ０２６６８０）を用いた制御性樹状細胞の作製方法に関する。更に本発明は、上記方法により作製される制御性樹状細胞、並びに上記制御性樹状細胞を含む医薬組成物又は医薬キットに関する。更に本発明は、制御性樹状細胞の作製のための、［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体の用途に関する。

免疫性の異常及び過剰応答に起因する疾患の予防及び治療にはこれまで免疫抑制剤、抗炎症剤及び抗アレルギー剤等の薬剤によるものが主なものであった。薬剤治療は有効ではあるものの、副作用により患者のＱＯＬの低下も問題となっていた。

これらの薬剤は標的免疫細胞以外の組織にも移行する。この標的外組織で薬物が非特異的作用を示すことにより、副作用が出現する。この副作用により免疫抑制効果を示したにも関わらずやむなく投与を中止せざるを得ない場合が多々あり、また副作用軽減のための医療処置などが行われて患者のＱＯＬが低下することもある。局所投与による副作用の軽減も試みられているが、疾患部位が特定の組織もしくは器官に局在するアトピー性皮膚炎や気管支喘息などに限られる。

そこで、制御性樹状細胞を用いた前記疾患等の予防及び治療が試みられている。樹状細胞は樹状突起を有する抗原提示細胞であり、末梢非リンパ組織やリンパ組織に未熟樹状細胞として広く存在する。微生物、ウイルス、異物等の外来抗原に侵襲された炎症組織では、これらの抗原を貪食して成熟樹状細胞へと分化し、所属二次リンパ組織に移行する。ここで、成熟樹状細胞はナイーブＴ細胞に抗原刺激と共刺激を与え、抗原特異的エフェクターＴ細胞に分化誘導して免疫応答を惹起する。このように樹状細胞は自然免疫と獲得免疫をつなぐ強力な抗原提示細胞である。

一方、炎症環境下においても共刺激分子の発現が低下している樹状細胞が存在し、これらの樹状細胞がＴ細胞を抑制的に制御して自己組織等に対する免疫寛容を誘導していることが示唆されている。このような樹状細胞は制御性樹状細胞と呼ばれている。制御性樹状細胞を用いた免疫細胞療法は、マウスにおいて移植片対宿主病、自己免疫疾患、アレルギー疾患モデルにおいて抗原特異的不応答Ｔ細胞や制御性Ｔ細胞の誘導により治療効果を示した（非特許文献１、２及び３）。さらに、マウス敗血症モデルにおいて制御性樹状細胞はＩＬ−１０の産生を介して炎症性サイトカインの産生を阻害して延命効果を示した（非特許文献４）。

特許文献１にはヒト樹状細胞またはその前駆細胞をｉｎｖｉｔｒｏで少なくともＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを含むサイトカイン類と共に培養し、ヒト免疫制御性樹状細胞を誘導する方法および該方法により得られたヒト免疫制御性樹状細胞が記載されている。特許文献２には制御性樹状細胞をＩＬ−１０産生促進剤として使用し、全身性炎症反応症候群に用いることが試みられている。

これまでに、前記のような制御性樹状細胞を用いた免疫細胞療法の免疫疾患への臨床応用への取り組みが行われてきたが、実際に臨床応用するためには制御性樹状細胞の安全性を含めた大量調製法の確立が必要である。非特許文献１で示されたように、現在まで報告されている制御性樹状細胞の作製にはＩＬ−１０及びＴＧＦ−βを含むサイトカイン類等が使用されているが、これらのサイトカイン類は大腸菌などの遺伝子組み換え体からの製造であることから、大量調製を阻む製造コストや安全性の問題が残されている。

一方で、［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体（特許文献３及び４）は樹状細胞の機能を阻害する物質であり、マウス遅延型過敏反応に対して抑制作用を示した（特許文献４）。特に、その誘導体の一つである（Ｓ）−(＋)−１−（５−ｈｙｄｒｏｘｙ−１，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｅｘｙｌ）−３−［７−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−［１，２，４］ｔｒｉａｚｏｌｏ［１，５−α］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌ］ｕｒｅａ（以下「ＮＫ０２６６８０」という）の存在下、樹状細胞を培養すると共刺激分子の発現が低下し、またＮＫ０２６６８０は、移植片対宿主病モデル及び自己免疫性の血管炎モデルに対して効果を示した（非特許文献５及び６）。

特開２００４−２９８１８１号公報特開２００６−２９０７６１号公報特開２００５−１５４３３５号公報国際公開２００４／１０８７２９号公報

Sato K, Yamashita N, Yamashita N, Baba M, Matsuyama T. Regulatory dendritic cells protect mice from murine acute graft-versus-host disease and leukemia relapse. Immunity 2003; 18(3): 367-379. Sato K, Yamashita N, Baba M, Matsuyama T. Modified myeloid dendritic cells act as regulatory dendritic cells to induce anergic and regulatory T cells. Blood 2003; 101(9): 3581-3589. Fujita S, Yamashita N, Ishii Y, Sato Y, Sato K, Eizumi K, Fukaya T, Nozawa R, Takamoto Y, Yamashita N, Taniguchi M, Sato K. Regulatory dendritic cells protect against allergic airway inflammation in a murine athmatic model. J Allergy Clin Immunol 2008; 121(1): 95-104. Fujita S, Seino K, Sato K, Sato Y, Eizumi K, Yamashita N, Taniguchi M, Sato K. Regulatory dendritic cells act as regulators of acute lethal systemic inflammatory response. Blood 2006; 107(9): 3656-3664. Saiga K, Toyoda E, Tokunaka K, Masuda A, Matsumoto S, Mashiba H, Kuramochi H, Nemoto K, Abe F, Kawagishi N, Furukawa H, Ono M. NK026680, a novel compound suppressive of dendritic cell function, ameliorates mortality in acute lethal graft-versus-host reaction in mice. Bone Marrow Transplant 2006; 37(3): 317-323. Saiga K, Yoshida M, Nakamura I, Toyoda E, Tokunaka K, Morohashi H, Abe F, Nemoto K, Nose M. Evaluation of the ameliorative effects of immunosuppressants on crescentic glomerulonephritis in SCG/Kj mice. Int Immunopharmacol 2008; 8(9): 1183-1189.

本発明は、大量の制御性樹状細胞を安全かつ簡易に作製できる方法を確立することを解決すべき課題とする。更に本発明は、患者のＱＯＬを維持する免疫系疾患の予防及び治療に有用な制御性樹状細胞を提供することを解決すべき課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、制御性樹状細胞に誘導可能な細胞を［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体の存在下で培養することによって制御性樹状細胞を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）制御性樹状細胞に誘導可能な細胞を［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体の存在下で培養することを含む、制御性樹状細胞の作製方法。
（２）［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体が、（Ｓ）−(＋)−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−α］ピリミジン−２−イル］ウレアである、（１）に記載の制御性樹状細胞の作製方法。
（３）制御性樹状細胞に誘導可能な細胞が、樹状細胞又はその前駆細胞である、（１）又は（２）に記載の制御性樹状細胞の作製方法。
（４）樹状細胞の前駆細胞が、単球である、（３）に記載の制御性樹状細胞の作製方法。

（５）制御性樹状細胞に誘導可能な細胞が、末梢血、骨髄、脾臓、又は臍帯血に由来する細胞である、（１）から（４）の何れか１項に記載の制御性樹状細胞の作製方法。
（６）細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で培養することを含む、（１）から（５）の何れか１項に記載の制御性樹状細胞の作製方法。
（７）細胞をＴＮＦ-α及び／またはＬＰＳの存在下で培養することを含む、（１）から（６）のいずれか１項に記載の制御性樹状細胞の作製方法。

（８）（１）から（７）の何れか１項に記載の作製方法で作製された制御性樹状細胞。
（９）制御性樹状細胞に誘導可能な細胞を［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体の非存在下で培養することにより得られる細胞と比較して、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現量が低い、（８）に記載の制御性樹状細胞。
（１０）制御性樹状細胞に誘導可能な細胞を［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体の非存在下で培養することにより得られる細胞と比較して、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の産生量が低い、（８）又は（９）に記載の制御性樹状細胞。
（１１）制御性樹状細胞に誘導可能な細胞を［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体の非存在下で培養することにより得られる細胞と比較して、異系抗原に対するＴ細胞の活性化誘導能が低い、（８）から（１０）の何れか１項に記載の制御性樹状細胞。

（１２）（８）から（１１）の何れか１項に記載の制御性樹状細胞を含む医薬組成物又は医薬キット。
（１３）免疫系の異常応答及び過剰応答に起因する移植拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫疾患、アレルギー疾患、慢性炎症性疾患及び敗血症の予防及び／又は治療のために使用する、（１２）に記載の医薬組成物又は医薬キット。

（１４）制御性樹状細胞の作製のための、［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体の使用。
（１５）［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体が、（Ｓ）−(＋)−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−α］ピリミジン−２−イル］ウレアである、（１４）に記載の使用。

（１６）［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体を含む、制御性樹状細胞誘導試薬。
（１７）［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体が、（Ｓ）−(＋)−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−α］ピリミジン−２−イル］ウレアである、（１６）に記載の制御性樹状細胞誘導試薬。

本発明において［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体は、生体外で末梢血細胞、骨髄細胞などに含まれる単核球から制御性樹状細胞を誘導するのに有用である。［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体は、製造コストが低く大量生産と安全性を確保できる低分子化合物である。［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体を制御性樹状細胞の作製に用いることにより、大量の制御性樹状細胞を安全かつ簡易に得ることができる。本発明では、高価で物性が不安定な遺伝子組み換えサイトカイン類を用いることなく低コストで大量の制御性樹状細胞を調製することができる。また、本発明の制御性樹状細胞には製造に用いた薬剤が残留することがないため、製造に用いた薬剤に起因する副作用を生じることなく、骨髄抑制、臓器移植、自己免疫疾患、アレルギー疾患及びショック等の免疫系の異常及び過剰応答に起因する疾患の予防及び治療に非常に有効である。

図１は、本発明制御性の樹状細胞（ＮＫ−ＤＣ）、未処理樹状細胞（ＣＴＲ−ＤＣ）及び未成熟樹状細胞（ｕｎｓｔｉｍ−ＤＣ）の３Ｈ−ＴｄＲの取り込みを示す。黒丸はＮＫ−ＤＣを示し、白丸はＣＴＲ−ＤＣを示し、×はｕｎｓｔｉｍ−ＤＣを示す。図２は、本発明制御性樹状細胞（ＮＫ−ＤＣ）と未処理樹状細胞（ＣＴＲ−ＤＣ）をそれぞれ移入したＣ３Ｈｅ／Ｊマウスに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの心臓を移植した心移植Ｃ３Ｈｅ／Ｊマウスの生存率を示す。実線はＮＫ−ＤＣを示し、点線はＣＴＲ−ＤＣを示す。

本発明においては、制御性樹状細胞に誘導可能な細胞（例えば、樹状細胞又はその前駆細胞など）を、試験管内で［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体、並びに所望によりサイトカイン類及び／または炎症性刺激物質を用いて処理することによって、制御性樹状細胞を作製することができる。具体的には、末梢血もしくは骨髄等から採取された単球に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体を添加して誘導される樹状細胞、及び当該樹状細胞にサイトカイン類及び／または炎症性刺激（例えばＴＮＦ−α、ＬＰＳ等）を処理することによって、制御性樹状細胞を得ることができる。また、これらのサイトカイン類及び／または炎症性刺激、及び［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体の刺激の順番は特に限定されず、刺激の順番は任意の順番で行うことにより、制御性樹状細胞を調製できる。一例としては、単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下ｉｎｖｉｔｒｏにおいて培養することにより単球を樹状細胞に分化せしめ、得られる樹状細胞は［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体によって、制御性樹状細胞を誘導することができる。この際、単球を最初にＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で刺激し樹状細胞に分化させた後に［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体で刺激してもよいし、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体で同時に刺激してもよい。この際、［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体と共に制御性樹状細胞を分化させるサイトカイン類（例えばＩＬ−１０及びＴＧＦ−βなど）が共存してもよい。さらに、ＴＮＦ−αやＬＰＳ等により炎症性刺激を与えることにより、成熟した制御性樹状細胞を得ることができる。

本発明の制御性樹状細胞の作製に用いられるサイトカイン類や炎症性刺激物質には特段の限定はない。サイトカイン類としては例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β等の樹状細胞を分化誘導する作用のあるものが挙げられる。炎症性刺激物質としては例えばＬＰＳに代表されるリポ多糖やＴＮＦ−α等の炎症性刺激を与えるサイトカインが挙げられる。

樹状細胞は前述のように単球をＧＭ−ＣＳＦ及び／またはＩＬ−４の存在下で培養することにより得られる。この際の単球は末梢血由来でも、骨髄由来でも、脾臓細胞由来でも、臍帯血由来でもよい。さらに、これらの組織、器官から樹状細胞をセルソーター等によりＣＤ１ａ等の樹状細胞特異的な表面抗原の発現を指標に単離することもできる。セルソーターによる特定の細胞集団の単離は公知の方法により行えばよい。本発明の制御性樹状細胞を得るための単球は哺乳動物由来であればよく、霊長目、齧歯目、食肉目、偶蹄目、奇蹄目等、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、ヤギ等が挙げられ、最も好ましくはヒトである。上記の中でも好ましくは、本発明の制御性樹状細胞により疾患の予防又は治療を施される動物と同種由来である。

単球、樹状細胞の培養は、周知のリンパ系細胞の培養技術により行なうことができる。培養液としては例えばＲＰＭＩ１６４０やＤＭＥＭを用いることができ、これらの基本培地に適当な抗生物質や動物血清等を添加して培養すればよい。培養容器も限定されず、培養規模に応じて市販のプレート、ディッシュ、フラスコを適宜選択して用いることができる。

本発明で用いる［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体は、具体的には、特開２００５−１５４３３５号公報、及び国際公開２００４／１０８７２９号公報に記載されている化合物である。即ち、本発明で用いる［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体は、好ましくは、下記一般式（１）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である。

［式中、Ａｒは置換基を有していてもよい、芳香族炭化水素基又は１〜４個のヘテロ原子を含有する芳香族複素環基を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ−ＣＨ₃又はＮ−ＣＮを示し、Ｙは置換基を有していてもよいフェニル基又はＲＮＨ基を示し、Ｒは水素原子、シアノ基、置換基を有していてもよい直鎖又は分岐鎖又は環状のアルキル基、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、若しくは置換基を有していてもよいＮ、Ｏ及びＳから独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する５〜７員の複素環基を示す］。
具体的には例えば、Ａｒは置換基を有していてもよいフェニル基若しくは置換基を有していてもよいＮ、Ｏ及びＳから選択される１個のヘテロ原子を含有する５〜６員の芳香族複素環基であり、該フェニル基若しくは該芳香族複素環基はハロゲノ基、水酸基、シアノ基、ニトロ基、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシル基及びアルキレンジオキシ基からなる置換基群より選ばれる同一又は異なった１又は２個の基で置換されていてもよく、ＸはＯであり、Ｒはハロゲノ基、水酸基、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシル基、（Ｃ１〜Ｃ７）アシルオキシ基、トリフルオロメチル基及びトリフルオロメトキシ基からなる置換基群より選ばれる同一又は異なった１〜３個の基で置換されていてもよいフェニル基又は
一般式（２）

｛式中、Ｒ１は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ２は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ３は水素原子、フェニル基（当該フェニル基はハロゲノ基、水酸基、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基及び（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシル基からなる群から選ばれる１個の基で置換されていてもよい）又は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル基（当該アルキル基は、ハロゲノ基、水酸基、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシル基、（Ｃ１〜Ｃ７）アシルオキシ基及びトリフルオロメチル基からなる群から選ばれる同一又は異なった１又は２個の基で置換されていてもよい）を示す｝である［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イルウレア誘導体、又はその薬学的に許容される塩である。

本発明で用いる［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体の具体例としては、以下の化合物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
（Ｓ）−１−（３−エトキシ−１−メチルプロピル）−３−［７−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］ウレア，
（Ｓ）−１−（４−メトキシ−１−メチルブチル）−３−［７−（４−メトキシフェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］ウレア，
（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシ−１，４−ジメチルペンチル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］ウレア，
（Ｓ）−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］ウレア，
（Ｓ）−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−｛７−［３−（ピリジン−３−イルメトキシ）フェニル］−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル｝ウレア，
（Ｓ）−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−（７−チオフェン−２−イル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル）ウレア，
（Ｓ）−１−［１−（３−メトキシフェニル）エチル］−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］ウレア，
（Ｓ）−１−［７−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］−３−［１−（３−メトキシフェニル）エチル］ウレア，
（Ｓ）−１−［７−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］−３−［１−（３，４，５−トリメトキシフェニル）エチル］ウレア，
（Ｓ）−１−（７−チオフェン−２−イル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル）−３−［１−（３，４，５−トリメトキシフェニル）エチル］ウレア，
（Ｓ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）エチル］−３−｛７−［３−（ピリジン−３−イルメトキシ）フェニル］−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル｝ウレア，
（Ｓ）−１−（１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−ヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］ウレア，
（Ｓ）−１−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］−３−（１−フェニルエチル）ウレア，
４−クロロ−２−メトキシ−Ｎ−（７−チオフェン−２−イル［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル）ベンズアミド，
（Ｓ）−１−（１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］ウレア，
１−（２−メトキシフェニル）−３−（７−チオフェン−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル）ウレア，
１−イソプロピル−３−（７−チオフェン−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル）ウレア，
（Ｒ）−１−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］−３−（１−フェニルエチル）ウレア又は
（Ｒ）−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−α］ピリミジン−２−イル］ウレア

本発明で用いる［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体の最も好ましい具体例は、（Ｓ）−(＋)−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−α］ピリミジン−２−イル］ウレアである。

本発明によれば、制御性樹状細胞の作製のための、［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体の使用、並びに［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体を含む、制御性樹状細胞誘導試薬が提供される。

培養に用いる［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体の濃度は、１ｎｇ／ｍＬ〜５０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＬＰＳの濃度は、１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬである。また、刺激に必要な培養日数は、限定されないが、例えば単球を［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体、サイトカイン類及び／または炎症性刺激と共に数日から１０日間程度培養すればよい。単球または樹状細胞の表面抗原の発現をフローサイトメトリー等で調べることにより、目的の分化程度の細胞が得られる培養期間を適宜決定することができる。刺激に用いる［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン誘導体、サイトカイン類及び／または炎症性刺激の濃度、刺激期間等の条件は、異系ＣＤ４陽性Ｔ細胞の抗原不応答性の誘導や樹状細胞表現型を指標として決定できる。

本発明の制御性樹状細胞を疾患の治療に用いる場合、本発明の制御性樹状細胞を治療しようとする疾患に関連した抗原で刺激する。抗原としては、自己免疫疾患やアレルギー性疾患であれば、疾患と関連する組織・臓器に存在する抗原タンパク、またはペプチド、また、それらをコードするＲＮＡ、ＤＮＡ類、およびその改変体を用いる。移植片拒絶や移植片対宿主病であれば、樹状細胞が内在的に異系抗原を発現しているため抗原を改めて付与する必要はないが、ドナーあるいはレシピエント由来の抗原を用いる場合も有り得る。この際の刺激は、本発明の制御性樹状細胞をｉｎｖｉｔｒｏで抗原と共に培養すればよい。

自己免疫疾患やアレルギー性疾患治療における樹状細胞への抗原付与については培養最終日を含む１０日間から１日間の期間、蛋白抗原の場合、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度でｉｎｖｉｔｒｏで付与する。炎症性刺激物質によって更に刺激した御性樹状細胞を用いる場合は、通常、炎症性刺激と同時或いは刺激前に抗原を付与する。

本発明の制御性樹状細胞は，免疫の異常に起因する免疫疾患等の治療薬及び予防薬等に使用できる。免疫疾患として、移植拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患、敗血症、ショックなどが挙げられる。

移植拒絶反応としては，移植における急性拒絶反応、移植片対宿主病、慢性拒絶反応等が上げられる。本発明の制御性樹状細胞は移植拒絶反応に対する治療及び予防の他、免疫寛容の誘導等に使用できる。移植臓器は、骨髄、腎臓、肝臓、心臓、膵臓等いずれの臓器でも可能である。供与者宿主間の関係は、異種間移植、異系統間移植、血液不適合間移植等、いずれの場合でも可能である。また本発明の制御性樹状細胞は、癌治療、自己免疫疾患治療、遺伝子治療、再生医療等で用いられる骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血幹細胞移植等の臓器移植に対して、免疫抑制、移植臓器の長期生着等を目的として使用することもできる。

自己免疫疾患として、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、シェーグレン症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少症、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、字越自己免疫性心筋炎、突発性血小板減少症紫斑病、ベーチェット病、自己免疫性胃炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、多発性筋炎、強皮症、混合性結合組織病、強直性脊椎炎、慢性甲状腺炎、天疱瘡、ギラン・バレー症候群、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症等が挙げられる。また、アレルギー性疾患として、アトピー性皮膚疾患、花粉症、接触性過敏症、喘息、乾癬、アナフィラキシー等が可能である。炎症性疾患としては、多発動脈炎、サルコードーシス、糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、難治性血管炎、ウェゲナー症候群等が挙げられる。

本発明の制御性樹状細胞の投与量は、投与対象に所望する効果が認められる用量に適宜設定される。具体的には、投与対象（個体）に対して０．５×１０⁵ 〜１０⁹個程度の本発明の制御性樹状細胞が、静脈内あるいは皮下、皮内（好ましくは静脈内）に投与される。投与の際の媒体としては、投与対象に副作用等を与えず、本発明の制御性樹状細胞の機能を損なわない媒体であれば特段の限定はなく、通常用いられるものでよい。例えば、ＲＰＭＩ１６４０やＤＭＥＭなどの培地、ハンクス緩衝液、燐酸緩衝塩液（ＰＢＳ）、生理食塩水、ブドウ糖液などが挙げられる。投与対象としては、哺乳動物であれば特段の限定はなく、霊長目、齧歯目、食肉目、偶蹄目、奇蹄目等、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、ヤギ等が挙げられる。好ましくはヒトである。

投与対象への各種疾患の予防又は治療剤の投与時期に関しては特に限定されず随時行うことができる。特に臓器・組織移植に伴う移植片拒絶、移植片対宿主病については、発症が予想される処置以前での投与が好ましい。ヒト免疫制御性樹状細胞の投与時期、投与量は、疾患の種類、疾患の重篤度、患者の状態等に応じて適宜決定することができる。

本発明は、本発明の制御性樹状細胞を含む医薬組成物又は医薬キットをも含む。本発明の医薬組成物とは本発明の制御性樹状細胞を含むものであれば特段の限定はなく、例えば、本発明の制御性樹状細胞を前記したような投与対象に副作用等を与えず、本発明の制御性樹状細胞の機能を損なわない媒体に懸濁させたものなどが挙げられる。本発明の制御性樹状細胞の状態を維持する医薬上許容し得る添加物や、その他の薬剤を添加したものも含まれる。本発明の医薬キットとは本発明の制御性樹状細胞又は本発明の医薬組成物とその他の薬剤を組み合わせたものを指す。その他の薬剤としては公知の免疫の異常に起因する免疫疾患等の治療薬及び予防薬であれば限定はなく、例えばサラゾスルファピリジン、ブシラミン、金チオりんご酸ナトリウム、Ｄ−ペニシラミン、オーラノフィン、アクタリット、ロベンザリッド等の免疫調節薬、メトトレキサレート、レフルノミド、タクロリムス、ミゾリビン、シクロフォスファミド、アザチオプリン、シクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル等の免疫抑制薬、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、トシリズマブ、リツキシマブ等の生物学的製剤、メフェナム酸、ジクロフェナクナトリウム、ナブメトン、エトドラク、ロキソプロフェンナトリウム、メロキシカム等のＮＳＡＩＤｓ、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン酢酸エステル、メチルプレドニゾロンコハク酸エステルナトリウム、デキサメタゾン、ベタメサゾン、ヒドロコルチゾン等のステロイド薬、ジドブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン等のＮＲＴＩ、テノホビル等のヌクレオチド系逆転写酵素阻害薬、エフェビレンツ等のＮＮＲＴＩ、アタザナビル、ホスアンプレナビル、ロビナビル、リトナビル、ダルナビル等のプロテアーゼ阻害薬、ラルテグラビル等のインテグラーゼ阻害薬等が挙げられる。なお、本発明の医薬キットにおいては本発明の制御性樹状細胞と又は本発明の医薬組成物とその他の薬剤の投与順序は限定されない。

以下の実施例において、本発明の制御性樹状細胞について、いくつかの実施形態を例示して説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞の採取
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＳＬＣ、雄、１０〜１２週齢）から大腿骨を取り出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で大腿骨の両端を切断して骨内部にある骨髄組織を取り出した。２６Ｇシリンジを用いて、この骨髄組織を単一細胞化して、Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞を得た。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞の樹状細胞への分化及び成熟刺激
Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞は、２０ｎｇ/ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、由来：ラビット）及び２０ｎｇ/ｍＬのＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、由来：ラビット）を含む１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で７日間培養して樹状細胞に分化させ、その後２０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、由来：ラビット）を添加して成熟させた。ＮＫ０２６６８０処理は、培養２日目及び4日目に５０ｎｇ／ｍＬ、６日目に２５０ｎｇ／ｍＬを添加して行った。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞及びＴ細胞の採取
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＳＬＣ、雄、１０〜１２週齢）から脾臓を取り出し、脾臓内から脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中で取り出し、２６Ｇシリンジを用いて単一細胞化してＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞を得た。Ｃ５７ＢＬ／６マウスＴ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞からナイロンウール（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分離採取した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞抽出液
Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞を超音波粉砕器で粉々にし、−８０℃に凍結させた。その後解凍し、遠心（３００ｇ・５分）にて細胞破片を除去し、その上清を抽出液とした。

Ｃ３Ｈｅ／Ｊマウス骨髄細胞の採取
Ｃ３Ｈｅ／Ｊマウス（ＳＬＣ、雄、１０〜１２週齢）から大腿骨を取り出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で大腿骨の両端を切断して骨内部にある骨髄組織を取り出した。２６Ｇシリンジを用いて、この骨髄組織を単一細胞化してＣ３Ｈｅ／Ｊマウス骨髄細胞を得た。

Ｃ３Ｈｅ／Ｊマウス骨髄細胞の樹状細胞への分化
Ｃ３Ｈｅ／Ｊマウス骨髄細胞は、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４を含む１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で７日間培養して樹状細胞に分化させた。ＮＫ０２６６８０処理は、培養２日目及び4日目に５０ｎｇ／ｍＬ、６日目に２５０ｎｇ/ｍＬを添加して行った。また、６日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾細胞抽出液も加えた。

ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞抽出液
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＣ、雄、１０〜１２週齢）から脾臓を取り出し、脾臓内から脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中で取り出し、２６Ｇシリンジを用いて単一細胞化してＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞を得た。この脾臓細胞を超音波粉砕器で粉々にし、−８０℃に凍結させた。その後解凍し，遠心（３００ｇ・５分）にて細胞破片を除去し、その上清を抽出液とした。

（実施例１）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから採取した骨髄細胞由来の樹状細胞にＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞抽出液を加えてＢＡＬＢ／ｃ抗原を提示させた。ＢＡＬＢ／ｃ抗原取込効果は、ＢＡＬＢ／ｃの主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）であるＩ−Ａｄ（抗体：ＢＤｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の発現をフローサイトメトリーで測定することで確認した．この際、ＮＫ０２６６８０の存在下、非存在下で培養した後、ＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、由来：ラビット）で成熟させた。フローサイトメトリーによる成熟樹状細胞マーカー発現解析により、樹状細胞の成熟を確認した）。本発明のＮＫ０２６６８０処理樹状細胞（ＮＫ−ＤＣ）と未処理の樹状細胞（ＣＴＲ−ＤＣ）における共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の蛍光標識抗体を反応させ、フローサイトメトリーで平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによりＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現量を比較した。

実施例１の結果を表１に示す。ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の蛍光標識抗体の結合量であるＭＦＩで比較すると、本発明のＮＫ０２６６８０処理樹状細胞（ＮＫ−ＤＣ）のＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現量は、未処理の樹状細胞（ＣＴＲ−ＤＣ）に比べて少なかった。共刺激分子の低発現は制御性樹状細胞の性質であり、本発明のＮＫ０２６６８０処理樹状細胞は、制御性樹状細胞であることを示した。

（実施例２）
本実施例２では、実施例１と同様にＣ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞から分化成熟させた本発明のＮＫ０２６６８０処理樹状細胞と未処理の樹状細胞を得た。ＴＮＦ刺激後２４時間培養して得た培養上清を採取し，免疫応答刺激サイトカインＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０濃度をＥＬＩＳＡ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で測定した（ｎ＝３）。

実施例２の結果を表２に示す。ＮＫ０２６６８０処理樹状細胞の培養上清に含まれるＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０濃度は、未処理樹状細胞の培養上清に比較して少なかった。免疫応答刺激サイトカインＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の低産生は制御性樹状細胞の性質であり、本発明のＮＫ０２６６８０処理樹状細胞は制御性樹状細胞であることを示した。

（実施例３）
本実施例３では、実施例１と同様に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞から分化成熟させた本発明の制御性樹状細胞であるＮＫ０２６６８０処理（ＮＫ−ＤＣ）と未処理の樹状細胞（ＣＴＲ−ＤＣ）を得た。また、Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞から樹状細胞に分化させた後実施例１と同様にＢＡＬＢ／ｃ抗原を提示させたが、ＴＮＦ−αによる成熟を行わなかった未成熟樹状細胞（ｕｎｓｔｉｍ−ＤＣ）も得た。これら３種の樹状細胞に対して、それぞれＣ５７ＢＬ／６マウスＴ細胞を混合した後、３Ｈ−ＴｄＲ（ＧＥヘルスケア）の取り込みを測定した。３Ｈ−ＴｄＲの取り込み量は、樹状細胞の異系抗原に対するＴ細胞の活性化誘導能を示す。

実施例３の結果を図１に示す。ＮＫ−ＤＣはＣＴＲ−ＤＣに比べて、ＢＡＬＢ／ｃ抗原に対するＴ細胞の活性化誘導能が低かった。また、ＮＫ−ＤＣのＴ細胞活性化誘導能は、ｕｎｓｔｉｍ−ＤＣと同等であった。すなわち、ＮＫ−ＤＣは、異系抗原刺激があっても未成熟樹状細胞と同程度にＴ細胞誘導活性能が低下していることが示された。

（実施例４）
本実施例４では、Ｃ３Ｈｅ／Ｊマウス骨髄細胞由来の樹状細胞にＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞の抽出液を加えてＣ５７ＢＬ／６抗原を提示させた。Ｃ５７ＢＬ／６抗原取込効果は、ＢＡＬＢ／ｃのＭＨＣであるＩ−Ａｂ（抗体：ＢＤｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の発現をフローサイトメトリーで測定することで確認した．この際、ＮＫ０２６６８０の存在下、非存在下で培養した。ＮＫ０２６６８０処理（ＮＫ−ＤＣ）と未処理の樹状細胞（ＣＴＲ−ＤＣ）をそれぞれＣ３Ｈｅ／Ｊマウス（ＳＬＣ、雄、１０〜１２週齢）に静脈内投与して移入した（投与数３×１０⁶個／匹、媒体：燐酸緩衝塩液（ＰＢＳ））。この際、樹状細胞を移入しない群（Ｎｏ−ｔｒｅａｔ）も準備した（ｎ＝６）。７日後に、ＮＫ−ＤＣ移入群、ＣＴＲ−ＤＣ移入群及びＮｏ−ｔｒｅａｔ群に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＳＬＣ、雄、１０〜１２週齢）の心臓を移植して３群の生存率を比較した。

実施例４の結果を図２に示す。ＮＫ−ＤＣ移入群は、ＣＴＲ−ＤＣ移入群及びＮｏ−ｔｒｅａｔ群に比べて顕著に生存率の改善と生存期間の延長が認められた。

本発明による制御性樹状細胞の作製方法によれば、簡易な方法でありながら大量の制御性樹状細胞を得ることができる。また、本発明の制御性樹状細胞の作製方法により作製される制御性樹状細胞は、免疫性の異常及び過剰応答に起因する疾患の予防及び治療に有用である。

Claims

制御性樹状細胞に誘導可能な細胞を（Ｓ）−(＋)−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−α］ピリミジン−２−イル］ウレアの存在下で分化させる工程、及び、その後に、前記の分化した細胞を炎症性刺激下で培養する工程を含む、制御性樹状細胞の作製方法。
制御性樹状細胞に誘導可能な細胞が、樹状細胞又はその前駆細胞である、請求項１に記載の制御性樹状細胞の作製方法。
樹状細胞の前駆細胞が、単球である、請求項２に記載の制御性樹状細胞の作製方法。
制御性樹状細胞に誘導可能な細胞が、末梢血、骨髄、脾臓、又は臍帯血に由来する細胞である、請求項１から３の何れか１項に記載の制御性樹状細胞の作製方法。
細胞を分化させる工程が、細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で培養することを含む、請求項１から４の何れか１項に記載の制御性樹状細胞の作製方法。
細胞を炎症性刺激下で培養する工程が、細胞をＴＮＦ-α及び／またはＬＰＳの存在下で培養することを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の制御性樹状細胞の作製方法。
請求項１から６の何れか１項に記載の作製方法で作製された制御性樹状細胞。
制御性樹状細胞に誘導可能な細胞を（Ｓ）−(＋)−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−α］ピリミジン−２−イル］ウレアの非存在下で培養することにより得られる細胞と比較して、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現量が低い、請求項７に記載の制御性樹状細胞。
制御性樹状細胞に誘導可能な細胞を（Ｓ）−(＋)−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−α］ピリミジン−２−イル］ウレアの非存在下で培養することにより得られる細胞と比較して、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の産生量が低い、請求項７又は８に記載の制御性樹状細胞。
制御性樹状細胞に誘導可能な細胞を（Ｓ）−(＋)−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−α］ピリミジン−２−イル］ウレアの非存在下で培養することにより得られる細胞と比較して、異系抗原に対するＴ細胞の活性化誘導能が低い、請求項７から９の何れか１項に記載の制御性樹状細胞。
請求項７から１０の何れか１項に記載の制御性樹状細胞を含む医薬組成物又は医薬キット。
免疫系の異常応答及び過剰応答に起因する移植拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症性疾患、敗血症又はショックの予防及び／又は治療のために使用する、請求項１１に記載の医薬組成物又は医薬キット。
請求項７から１０の何れか１項に記載の制御性樹状細胞の作製のための、（Ｓ）−(＋)−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−α］ピリミジン−２−イル］ウレアの使用。
（Ｓ）−(＋)−１−（５−ヒドロキシ−１，５−ジメチルヘキシル）−３−［７−（４−メトキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−α］ピリミジン−２−イル］ウレアを含む、請求項７から１０の何れか１項に記載の制御性樹状細胞を誘導するための試薬。