CN107574149A - 一种树突状细胞的高效促成熟方法及其用途 - Google Patents
一种树突状细胞的高效促成熟方法及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种树突状细胞的高效促成熟方法及其用途。具体而言，本发明提供一种用于刺激树突状细胞的组合物，该组合物含有poly(I:C)、R848、IFN‑γ和ATP中的至少2种、至少3种或全部4种。本发明还提供含该组合物的培养液，及使用该组合物刺激树突状细胞或使用该培养液培养树突状细胞的方法。通过本发明获得的成熟DC，能高水平表达CD80、CD86及CD83表面分子标记，同时能够高水平分泌的IL‑12，有助于提高DC更有效地诱导肿瘤特异性T细胞的活化，从而提高癌症治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学、肿瘤免疫学领域，涉及一种人类树突状细胞的高效促成熟方法及其用途。
背景技术
树突状细胞(Dendritic cells,DC)是目前被广泛认可的抗原递呈功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)。通过识别肿瘤细胞的抗原，增强肿瘤细胞的免疫原性而有效避免免疫逃逸。DC通过受体配体的方式摄取外源性抗原，加工处理后，可分别与抗原表面表达的MHC限制性分子结合，分化为成熟DC，同时刺激初始T细胞方向特异性的活化为CD8+T细胞或CD4+T细胞，成熟DC具有很强的诱导初始T细胞活化，进而激活免疫应答的功能，是固有免疫中巨噬细胞和适应性免疫中B细胞功能的100～1000倍。此外，DC还可以激活体液免疫应答，通过不同的方式刺激B细胞活化、增殖发挥免疫效应。
目前应用于肿瘤的免疫细胞治疗有：免疫检查点单抗治疗，包括CTLA-4单抗与PD-1/PDL1单抗、DC-CIK/CTL细胞治疗与CAR-T细胞治疗。CTL通过细胞表面的TCR识别抗原表面的MHC-I类分子而结合特异性抗原，发挥短期内持久的，快速高效免疫应答以杀灭肿瘤细胞，因此以CTL为效应细胞的细胞免疫是抗肿瘤的主要方式，而CTL的活化需要足够数量、高度成熟的DC，方可向初始T细胞有效提呈抗原，并诱导其活化。
然而，经过长期的免疫编辑过程，恶性肿瘤尤其是中晚期恶性肿瘤患者DC功能弱化，导致肿瘤临床治疗所需DC成熟度难以达到足够水平。未成熟的DC由于功能缺陷，DC表面表型的表达和IL-12分泌量较低，无法将抗原肽有效提呈给免疫细胞。因此，有必要对DC的促成熟培养方案进行完善，才能有效的诱导免疫应答，发挥临床疗效。
Toll样受体是果蝇Toll受体的同源物，可存在于不同细胞的细胞表面和细胞内，通过识别并结合病原体相关分子模式，可刺激产生不同类型的免疫应答并发生协同作用，起到将天然免疫和适应性免疫应答联系在一起的作用。目前已经确定的人类Toll样受体家族成员有13个(TLR1-13)。它们分布于不同的免疫细胞表面或细胞内。
TLR3的配体可作为免疫佐剂，有刺激DC成熟的作用。Poly(I:C)〔聚肌苷酸胞苷酸〕是一种人工合成的高效干扰素诱生剂，是Toll样受体3的配体。Poly(I:C)与许多疫苗联合应用时可显著增强疫苗的免疫原性，促进DC的成熟，上调表达HLA-DR、CD80、CD86、CD83，从而递呈肿瘤抗原，激活CTL发挥免疫应答。
TLR7、TLR8和TLR9高度同源，与其他TLR不同，它们在细胞内涵体中起作用，吞噬和包膜溶解后结合它们的配体，可识别微生物的核酸。R848〔瑞喹莫德〕是TLR7/8的激动剂，在体外可诱导DC细胞分泌TNF-a和IL-12，增强DC细胞的抗原提呈功能。
TLR9可识别细菌的CpG-DNA，激活B细胞和APC的免疫刺激特性。腺病毒(adenovirus，Ad)是TLR9的配体，可直接刺激DC成熟。同时Ad是目前较好的一种将外源基因导入细胞内的方式，可在不损伤DC活性和免疫功能的情况下，较容易达到50-90％的转染率，且Ad不整合在宿主细胞基因中，因此整合突变致癌可能性小，基因毒性低。临床应用的DC均需负载与肿瘤相关的多抗原，负载肿瘤相关抗原的成熟DC比未成熟的DC具有更强的刺激T淋巴细胞产生特异抗肿瘤免疫应答。目前多利用Ad修饰多抗原后转染入DC细胞中，可使更多抗原进入DC，增强抗原的免疫原性；避免了完整菌体中一些病原性抗原对免疫效果的影响；同时Ad作为TLR9的配体可发挥免疫佐剂的作用促进DC成熟。
ATP是最重要的胞内代谢产物之一，也是一种重要的信号分子。近年来，ATP在抗肿瘤免疫应答中的作用也开始受到关注。报道指出，ATP可诱导树突状细胞表面CD80、CD83及CD86分子表达上调，提高IL-12的分泌能力，促进DC细胞的成熟。此外，ATP还可诱导CXC趋化因子受体4、上调CC趋化因子受体7表达在未成熟及成熟DC细胞表面、下调CC趋化因子受体5在未成熟DC细胞表面的表达，促进未成熟及成熟DC细胞的迁移。
目前，在临床应用中，用于体外培养刺激DC成熟的主要因子仍为TNF-α、IFN-γ等。TNF-α是肿瘤坏死因子超家族的成员，是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，可以通过与肿瘤细胞表面受体结合进入细胞，引起溶酶体释放导致细胞自溶发挥抗肿瘤的作用，还可以刺激DC成熟，从而刺激免疫应答。IFN-γ是一种免疫调节因子，对调节免疫应答有重要作用，可诱导细胞抗病毒，同时可直接抑制肿瘤细胞生长，同时可刺激DC成熟。常规培养方案在一定程度上提高了DC的成熟度，但与临床疗效所需的高度成熟DC仍有差距。
发明内容
本发明第一方面提供一种组合物，该组合物含有poly(I:C)、R848、IFN-γ和ATP中的至少2种。
在一个或多个实施方案中，该组合物含有poly(I:C)、R848、IFN-γ和ATP中的至少3种。
在一个或多个实施方案中，该组合物含有poly(I:C)、R848、IFN-γ和ATP全部四种。
在一个或多个实施方案中，该组合物含有：
(1)poly(I:C)和R848中的任一种或全部2种；和
(2)IFN-γ和ATP中的任一种或全部2种。
在一个或多个实施方案中，所述组合物含有poly(I:C)和任选的R848，以及IFN-γ和任选的ATP。
在一个或多个实施方案中，所述组合物含有R848和任选的poly(I:C)，以及IFN-γ和任选的ATP。
在一个或多个实施方案中，所述组合物含有poly(I:C)、R848和IFN-γ和任选的ATP。
在一个或多个实施方案中，所述组合物含有poly(I:C)、IFN-γ、ATP和任选的R848。
在一个或多个实施方案中，组合物中poly(I:C)的含量足以使其工作浓度在1-200μg/ml的范围内，例如1-150μg/ml，1-120μg/ml，1-100μg/ml，1-80μg/ml，1-50μg/ml，5-50μg/ml，10-50μg/ml，15-40μg/ml，或20-40μg/ml等。
在一个或多个实施方案中，组合物中R848的含量足以使其工作浓度在0.1-50μg/ml的范围内，例如0.1-30μg/ml，0.1-20μg/ml，0.1-10μg/ml，1-30μg/ml，1-20μg/ml，1-10μg/ml或3-8μg/ml。
在一个或多个实施方案中，组合物中IFN-γ的含量足以使其工作浓度在1-1000IU/ml的范围内，例如1-600IU/ml，1-500IU/ml，1-300IU/ml，10-300IU/ml，30-300IU/ml，50-200IU/ml，50-150IU/ml或80-120IU/ml。
在一个或多个实施方案中，组合物中ATP的含量足以使其工作浓度在0.1-10mM的范围内，例如0.1-8mM，0.1-5mM，0.1-3mM或0.5-3mM。
本发明第二方面提供一种无血清树突状细胞培养液，所述培养液含有本文所述的组合物。
在一个或多个实施方案中，所述培养液中，poly(I:C)的浓度范围是1-200μg/ml，例如1-150μg/ml，1-120μg/ml，1-100μg/ml，1-80μg/ml，1-50μg/ml，5-50μg/ml，10-50μg/ml，15-40μg/ml，或20-40μg/ml等。
在一个或多个实施方案中，所述培养液中，R848的浓度范围是0.1-50μg/ml，例如0.1-30μg/ml，0.1-20μg/ml，0.1-10μg/ml，1-30μg/ml，1-20μg/ml，1-10μg/ml或3-8μg/ml。
在一个或多个实施方案中，所述培养液中，IFN-γ的浓度范围是1-1000IU/ml，例如1-600IU/ml，1-500IU/ml，1-300IU/ml，10-300IU/ml，30-300IU/ml，50-200IU/ml，50-150IU/ml或80-120IU/ml。
在一个或多个实施方案中，所述培养液中，ATP的浓度范围是0.1-10mM，例如0.1-8mM，0.1-5mM，0.1-3mM或0.5-3mM。
在一个或多个实施方案中，所述培养液中还含有：GM-CSF和IL-4。
在一个或多个实施方案中，培养液中所述GM-CSF的浓度为1-300ng/ml，例如1-200ng/ml，1-150ng/ml，30-300ng/ml，30-200ng/ml，30-150ng/ml，50-200ng/ml，50-150ng/ml，80-150ng/ml或80-120ng/ml等。
在一个或多个实施方案中，培养液中所述IL-4的浓度为1-30ng/ml，例如1-20ng/ml，1-15ng/ml，3-30ng/ml，3-20ng/ml，3-15ng/ml，5-20ng/ml，5-15ng/ml，8-15ng/ml或8-12ng/ml等。
本发明第三方面提供一种诱导DC表面CD80、CD83和CD86分子表达或上调DC表面CD80、CD83和CD86分子表达，提高DC分泌IL-12的能力，和/或促进DC细胞成熟的方法，所述方法包括使用本文所述组合物刺激未成熟DC，或使用本文所述的培养液培育未成熟DC的步骤。
在一个或多个实施方案中，刺激或培育时间为15～30小时。
在一个或多个实施方案中，所述未成熟的DC细胞是贴壁的外周血单个核细胞。
在一个或多个实施方案中，在进行所述刺激或培育前，还包括使用选自多肽抗原、肿瘤细胞裂解物、携带抗原编码序列的重组载体、编码抗原的RNA中的一种或多种培育所述未成熟DC的步骤。
本发明第四方面提供一种本发明所述的组合物或培养液在诱导DC表面CD80、CD83和CD86分子表达或上调DC表面CD80、CD83和CD86分子表达，提高DC分泌IL-12的能力，和/或促进DC细胞成熟中的应用。
本发明第五方面提供一种本发明所述的组合物在制备用于诱导DC表面CD80、CD83和CD86分子表达或上调DC表面CD80、CD83和CD86分子表达，提高DC分泌IL-12的能力，和/或促进DC细胞成熟的培养液中的应用。
本发明第六方面提供一种成熟的DC细胞，所述DC细胞采用本文所述方法制备得到。
本发明第七方面提供本文所述成熟的DC细胞在于制备DC疫苗或诱导肿瘤特异性T细胞的活化中的应用。
附图说明
图1A、1B和1C：TLR受体激动剂组合物联合IFN-γ、ATP刺激后，DC细胞表面成熟分子CD80表达水平、CD83表达水平及CD86表达水平的流式检测。横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数目，图中检测的组合方式分别为：同型对照组；TNF-α刺激组；R848联合IFN-γ刺激组；R848联合IFN-γ、ATP刺激组；poly(I:C)联合IFN-γ刺激组；poly(I:C)联合IFN-γ、ATP刺激组；poly(I:C)、R848联合IFN-γ刺激组；poly(I:C)、R848联合IFN-γ、ATP刺激组。
图1D：TLR受体激动剂组合物联合IFN-γ、ATP刺激后，第8天DC表型表达的柱状图统计结果，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.005，****：P<0.001。
图2：TLR受体激动剂组合物联合IFN-γ、ATP刺激对DC细胞分泌IL-12的影响。该图显示第7天、第8天、第9天DC细胞IL-12分泌变化柱状图，其中灰色柱状图为poly(I:C)、R848联合IFN-γ、ATP刺激物存在的情况下DC细胞分泌IL-12的水平(实验组)，黑色柱状图为TNF-α刺激后DC细胞IL-12分泌的水平(对照组)。
图3A－3D：TLR受体激动剂组合物联合IFN-γ、ATP刺激成熟的DC对CD3+T细胞分泌细胞因子的影响。其中，图3A，3B分别为TNF-α刺激组；poly(I:C)联合IFN-γ刺激组与poly(I:C)、R848联合IFN-γ、ATP刺激物组合刺激成熟的DC细胞激活的CD3+T细胞分泌IFN-γ、TNF-α水平的流式检测。图3C为DC细胞和T细胞共培养第4天，T细胞内IFN-γ、TNF-α表达水平柱状图，图中灰色柱状图分别为poly(I:C)联合IFN-γ；poly(I:C)、R848联合IFN-γ、ATP刺激物组合刺激成熟的DC细胞激活的CD3+T细胞分泌IFN-γ、TNF-α水平检测；黑色柱状图为TNF-α刺激成熟的DC细胞激活的CD3+T细胞分泌IFN-γ、TNF-α水平检测。图3D为共培养第4天，ELISA检测上清液中IFN-γ分泌量；其中灰色柱状图为poly(I:C)、R848联合IFN-γ、ATP刺激物组诱导T细胞分泌IFN-γ的水平(实验组)，黑色柱状图为TNF-α刺激后DC细胞诱导T细胞分泌IFN-γ的水平(对照组)。
具体实施方式
本发明人经过大量的试验摸索和创造性的条件优化，提供了一种用于刺激DC的TLR受体激动剂组合物poly(I:C)、R848，并联合IFN-γ及ATP，采用该组合物刺激能够有效诱导DC细胞成熟，并使之高效分泌IL-12，进而能更有效地诱导T细胞活化及分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α，由此完成本发明。
因此，本发明提供一种组合物，该组合物可以是免疫组合物，可用于：
(1)诱导DC表面CD80、CD83和CD86分子表达或上调DC表面CD80、CD83和CD86分子表达；
(2)提高DC分泌IL-12的能力；和/或
(3)促进DC细胞成熟。
本发明的组合物可含有poly(I:C)、R848、IFN-γ和ATP中的至少2种。
在某些实施方案中，本发明的组合物至少含有poly(I:C)和IFN-γ。因此，在这些实施方案中，本发明的组合物含有poly(I:C)和任选的R848，以及IFN-γ和任选的ATP。
在某些实施方案中，本发明的组合物含有poly(I:C)、R848、IFN-γ和ATP中的至少3种。因此，例如，在这些实施方案中，本发明的组合物可含有poly(I:C)、R848和IFN-γ和任选的ATP；或者可含有poly(I:C)、IFN-γ、ATP和任选的R848。
因此，本发明的组合物可含有：(1)poly(I:C)和R848中的任一种或全部2种；和(2)IFN-γ和ATP中的任一种或全部2种。因此，例如，在某些实施方案中，所述组合物含有R848和任选的poly(I:C)，以及IFN-γ和任选的ATP。
在某些实施方案中，本发明的组合物含有poly(I:C)、R848、IFN-γ和ATP全部四种。
本发明组合物中，当含有时，poly(I:C)的含量应足以使得其工作浓度在1-200μg/ml的范围内，例如1-150μg/ml，1-120μg/ml，1-100μg/ml，1-80μg/ml，1-50μg/ml，5-50μg/ml，10-50μg/ml，15-40μg/ml，或20-40μg/ml等。
本发明组合物中，当含有时，R848的含量应足以使得其工作浓度在0.1-50μg/ml的范围内，例如0.1-30μg/ml，0.1-20μg/ml，0.1-10μg/ml，1-30μg/ml，1-20μg/ml，1-10μg/ml或3-8μg/ml。
本发明组合物中，当含有时，IFN-γ的含量应足以使得其工作浓度在1-1000IU/ml的范围内，例如1-600IU/ml，1-500IU/ml，1-300IU/ml，10-300IU/ml，30-300IU/ml，50-200IU/ml，50-150IU/ml或80-120IU/ml。
本发明组合物中，当含有时，ATP的含量应足以使得其工作浓度在0.1-10mM的范围内，例如0.1-8mM，0.1-5mM，0.1-3mM，0.5-3mM，0.5-2mM，0.5-1.5mM或0.8-1.2mM。
在某些实施方案中，本发明组合物含有：
(1)poly(I:C)，其含量应足以使其工作浓度在1-80μg/ml的范围内，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；
(2)IFN-γ，其含量应足以使其工作浓度在10-300IU/ml的范围内，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；
(3)任选的R848，当含有时，其含量应足以使其工作浓度在0.1-10μg/ml的范围内，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml；以及
(4)任选的ATP，当含有时，其含量应足以使其工作浓度在0.1-5mM的范围内，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM。
在某些实施方案中，本发明组合物含有：
(1)poly(I:C)，其含量应足以使其工作浓度在1-80μg/ml的范围内，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；
(2)IFN-γ，其含量应足以使其工作浓度在10-300IU/ml的范围内，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；
(3)R848，其含量应足以使其工作浓度在0.1-10μg/ml的范围内，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml；以及
(4)任选的ATP，当含有时，其含量应足以使其工作浓度在0.1-5mM的范围内，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM。
在某些实施方案中，本发明的组合物含有：
(1)poly(I:C)，其含量应足以使其工作浓度在1-80μg/ml的范围内，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；
(2)IFN-γ，其含量应足以使其工作浓度在10-300IU/ml的范围内，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；
(3)ATP，其含量应足以使其工作浓度在0.1-5mM的范围内，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM；以及
(4)任选的R848，当含有时，其含量应足以使其工作浓度在0.1-10μg/ml的范围内，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml。
在某些实施方案中，本发明的组合物含有：
(1)R848，其含量应足以使其工作浓度在0.1-10μg/ml的范围内，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml；
(2)IFN-γ，其含量应足以使其工作浓度在10-300IU/ml的范围内，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；
(3)任选的poly(I:C)，当含有时，其含量应足以使其工作浓度在1-80μg/ml的范围内，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；和
(4)任选的ATP，当含有时，其含量应足以使其工作浓度在0.1-5mM的范围内，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM。
在某些实施方案中，本发明的组合物含有：
(1)poly(I:C)，其含量应足以使其工作浓度在1-80μg/ml的范围内，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；
(2)R848，其含量应足以使其工作浓度在0.1-10μg/ml的范围内，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml；
(3)IFN-γ，其含量应足以使其工作浓度在10-300IU/ml的范围内，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；以及
(4)ATP，其含量应足以使其工作浓度在0.1-5mM的范围内，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM。
优选的是，本发明的上述任一种组合物还可含有GM-CSF和IL-4。在一个或多个实施方案中，组合物中GM-CSF的含量足以使其工作浓度在1-300ng/ml的范围内，例如1-200ng/ml，1-150ng/ml，30-300ng/ml，30-200ng/ml，30-150ng/ml，50-200ng/ml，50-150ng/ml，80-150ng/ml或80-120ng/ml等。在一个或多个实施方案中，组合物中IL-4的含量足以使其工作浓度在1-30ng/ml的范围内，例如1-20ng/ml，1-15ng/ml，3-30ng/ml，3-20ng/ml，3-15ng/ml，5-20ng/ml，5-15ng/ml，8-15ng/ml或8-12ng/ml等。
本文中，“工作浓度”指培养或刺激DC时该成分的浓度。
另一方面，本发明提供一种无血清树突状细胞培养液，该培养液可用于：
(1)诱导DC表面CD80、CD83和CD86分子表达或上调DC表面CD80、CD83和CD86分子表达；
(2)提高DC分泌IL-12的能力；和/或
(3)促进DC细胞成熟。
通常，本发明的培养液可含有前文所述的任一种组合物。具体而言，本发明的培养液可含有poly(I:C)、R848、IFN-γ和ATP中的至少2种。
在某些实施方案中，该培养液至少含有poly(I:C)和IFN-γ。因此，在这些实施方案中，该培养液含有poly(I:C)和任选的R848，以及IFN-γ和任选的ATP。
在某些实施方案中，该培养液含有poly(I:C)、R848、IFN-γ和ATP中的至少3种。因此，例如，在这些实施方案中，该培养液可含有poly(I:C)、R848和IFN-γ和任选的ATP；或者可含有poly(I:C)、IFN-γ、ATP和任选的R848。
因此，该培养液可含有：(1)poly(I:C)和R848中的任一种或全部2种；和(2)IFN-γ和ATP中的任一种或全部2种。因此，例如，在某些实施方案中，该培养液含有R848和任选的poly(I:C)，以及IFN-γ和任选的ATP。
在某些实施方案中，该培养液含有poly(I:C)、R848、IFN-γ和ATP全部四种。
该培养液中，当含有时，poly(I:C)的浓度可在1-200μg/ml的范围内，例如1-150μg/ml，1-120μg/ml，1-100μg/ml，1-80μg/ml，1-50μg/ml，5-50μg/ml，10-50μg/ml，15-40μg/ml，或20-40μg/ml等。
该培养液中，当含有时，R848的浓度范围可以是0.1-50μg/ml，例如0.1-30μg/ml，0.1-20μg/ml，0.1-10μg/ml，1-30μg/ml，1-20μg/ml，1-10μg/ml或3-8μg/ml。
该培养液中，当含有时，IFN-γ的浓度范围可以是1-1000IU/ml，例如1-600IU/ml，1-500IU/ml，1-300IU/ml，10-300IU/ml，30-300IU/ml，50-200IU/ml，50-150IU/ml或80-120IU/ml。
该培养液中，当含有时，ATP的浓度范围可以是0.1-10mM，例如0.1-8mM，0.1-5mM，0.1-3mM，0.5-3mM，0.5-2mM，0.5-1.5mM或0.8-1.2mM。
在某些实施方案中，该培养液含有：
(1)poly(I:C)，1-80μg/ml，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；
(2)IFN-γ，10-300IU/ml，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；
(3)任选的R848，当含有时，0.1-10μg/ml，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml；以及
(4)任选的ATP，当含有时，0.1-5mM，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM。
在某些实施方案中，该培养液含有：
(1)poly(I:C)，1-80μg/ml，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；
(2)IFN-γ，10-300IU/ml，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；
(3)R848，0.1-10μg/ml，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml；以及
(4)任选的ATP，当含有时，0.1-5mM，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM。
在某些实施方案中，该培养液含有：
(1)poly(I:C)，1-80μg/ml，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；
(2)IFN-γ，10-300IU/ml，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；
(3)ATP，0.1-5mM，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM；以及
(4)任选的R848，当含有时，0.1-10μg/ml，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml。
在某些实施方案中，该培养液含有：
(1)R848，0.1-10μg/ml，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml；
(2)IFN-γ，10-300IU/ml，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；
(3)任选的poly(I:C)，当含有时，1-80μg/ml，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；和
(4)任选的ATP，当含有时，0.1-5mM，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM。
在某些实施方案中，该培养液含有：
(1)poly(I:C)，1-80μg/ml，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；
(2)R848，0.1-10μg/ml，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml；
(3)IFN-γ，10-300IU/ml，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；以及
(4)ATP，0.1-5mM，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM。
优选的是，本发明的上述任一种培养液还可含有GM-CSF和IL-4。在一个或多个实施方案中，培养液中GM-CSF的浓度可以为1-300ng/ml，例如1-200ng/ml，1-150ng/ml，30-300ng/ml，30-200ng/ml，30-150ng/ml，50-200ng/ml，50-150ng/ml，80-150ng/ml或80-120ng/ml等。在一个或多个实施方案中，培养液中IL-4的浓度可以为1-30ng/ml，例如1-20ng/ml，1-15ng/ml，3-30ng/ml，3-20ng/ml，3-15ng/ml，5-20ng/ml，5-15ng/ml，8-15ng/ml或8-12ng/ml等。
可使用本领域周知的无血清树突状细胞培养液来配制本发明的无血清树突状细胞培养液，例如可使用来自GIBCO公司的无血清AIM-V培养液或其他常用于DC的必需培养液。通常，在所述无血清树突状细胞培养液中加入本文所述的成分，即前文所述的poly(I:C)、R848、IFN-γ和ATP中的至少2种，以及任选的GM-CSF和IL-4，即可配制得到前文所述的各种无血清树突状细胞培养液。
如前所述，本发明的组合物和培养液，尤其是上述各实施方案中所述的组合物和培养基，可用来诱导DC表面CD80、CD83和CD86分子表达或上调DC表面CD80、CD83和CD86分子表达，提高DC分泌IL-12的能力，和/或促进DC细胞成熟。因此，本发明也包括诱导DC表面CD80、CD83和CD86分子表达或上调DC表面CD80、CD83和CD86分子表达，提高DC分泌IL-12的能力，和/或促进DC细胞成熟的方法，所述方法包括使用本文所述组合物刺激未成熟的DC，或使用本文所述的培养液培育未成熟DC的步骤。可采用常规的方法刺激或培育为成熟的DC。
例如，按本领域通用刺激/培育方案，本发明的方法可包括：
(1)提供未成熟的DC；
(2)使步骤(1)获得的未成熟DC在含GM-CSF和IL-4的无血清树突状细胞培养液中培养；
(3)在步骤(2)的培养物中加入选自多肽抗原、肿瘤细胞裂解物、携带抗原编码序列的重组载体、编码抗原的RNA中的一种或多种培育所述未成熟DC；
(4)在培养液中加入本文所述的组合物，或使用本文所述的培养液培养步骤(3)获得的DC；以及
(5)收获成熟的DC。
通常，DC可来自对象外周血PBMC。在某些实施方案中，所述未成熟的DC细胞是贴壁的外周血单个核细胞。获得外周血PBMC之后，可采用常用的方法纯化PBMC，去除红细胞和血小板。然后以贴壁法获得DC源细胞。通常，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下贴壁2-4小时。
之后，使用常规的无血清树突细胞培养液中培养所述贴壁的DC，优选的是，该无血清树突状细胞培养液中补加了浓度如前文所述的GM-CSF和IL-4。培养条件为常规培养条件，例如培养条件为：37℃、5％CO2、饱和湿度。培养期间，例如在第4天，可光学显微镜下观察细胞培养板上细胞的生长情况，培养液是否浑浊及培液颜色，评估是否需要补加无血清树突状细胞培养液。确定无异常后加入GM-CSF和IL-4,继续诱导细胞分化。
通常，第六天时，同第四天观察细胞生长情况及培养液，无异常后，加入前文步骤(3)所述的物质(其MOI可以为5)，在例如5％CO2，37℃，饱和湿度培养箱继续培养。
第七天时可实施前述步骤(4)。刺激或培育时间为15～30小时。第八天，收获成熟DC。
因此，本发明也包括本文所述的组合物或培养液在诱导DC表面CD80、CD83和CD86分子表达或上调DC表面CD80、CD83和CD86分子表达，提高DC分泌IL-12的能力，和/或促进DC细胞成熟中的应用；以及本文所述的组合物在制备用于诱导DC表面CD80、CD83和CD86分子表达或上调DC表面CD80、CD83和CD86分子表达，提高DC分泌IL-12的能力，和/或促进DC细胞成熟的培养液中的应用。
本发明还提供一种成熟的DC细胞，所述DC细胞采用本文所述方法制备得到。在某些实施方案中，在本发明成熟的DC细胞24小时内IL12的分泌水平高于1.5ng/十万个细胞，优选高于1.7ng/十万个细胞，优选高于2ng/十万个细胞，更优选高于2.5ng/十万个细胞，更优选高于3ng/十万个细胞。
在某些实施方案中，本发明提供一群细胞，该群细胞含有本发明成熟的DC细胞。优选的是，该群细胞具有以下特征中的至少1项、至少2项或全部3项：
(1)CD80阳性细胞的比率高于95％，优选高于96％，更优选高于97％；
(2)CD83阳性细胞的比率高于95％，优选高于96％，更优选高于97％；和
(3)CD86阳性细胞的比率高于95％，优选高于96％，更优选高于97％。
本发明还提供本文所述成熟的DC细胞在于制备DC疫苗中的应用，以及在制备诱导肿瘤特异性T细胞的活化的药物中的应用。
因此，本发明也包括一种药物组合物，该药物组合物含有本文所述的成熟DC，以及任选的适于所述DC生长的培养液。
本发明的实验已经确认，根据本发明所述的促DC细胞成熟培养方案，所制备的成熟DC能表达更高水平的CD80、CD86及CD83表面分子标记，分泌较高水平的IL-12，进而更有效地诱导T细胞活化和分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α，所制备的成熟DC细胞能诱导T细胞产生更强的抗肿瘤免疫反应。
本发明采用TLR受体激动剂组合物联合IFN-γ、ATP共同刺激，所制备的成熟DC细胞，能使DC细胞表达更高水平的CD80、CD86及CD83，同时能够大幅度提高分泌IL-12的能力。因此，该技术必将在肿瘤免疫的基础研究和临床肿瘤免疫治疗的应用研究领域发挥重要作用，有望提高DC-CIK/CTL治疗肿瘤患者的临床疗效。本发明所述促DC细胞成熟方案与现有技术相比的独特优势将通过以下的实施例来进一步详细说明。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非限制本发明的保护范围。实施例中所涉及的方法、步骤、试剂和反应条件等，除非另有说明，否则为本领域常规的方法、步骤、试剂和反应条件。
实施例1：外周血单核细胞来源的成熟DC细胞的制备
采用临床血细胞分离机分离患者富集外周血PBMC。采用RPMI 1640培养基两倍稀释细胞悬液，加入淋巴细胞分离液密度梯度离心，用于初步纯化PBMC。采用低渗法去除红细胞，加入PBS洗涤去除血小板。细胞计数并以台盼蓝染液检测细胞活力，加入无血清X-VIVO15〔购自Lonza公司〕重悬细胞，以贴壁法获得DC源细胞，将细胞置入6孔细胞培养板，设置实验组和对照组，并将上清液中的悬浮初始T淋巴细胞冻存于液氮罐。
将细胞车间分离的PBMC以细胞数约1.2×107/孔接种至6孔细胞培养板，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下贴壁2-4小时。
取出6孔细胞培养板，将上清液收集至15ml离心管，用无血清AIM-V培养液(GIBCO公司)清洗2次并均收集入离心管，保证上清液中初始T淋巴细胞尽量取尽。将离心管于1500转/分钟离心3分钟，弃上清液，向细胞沉淀中加入冻存液(现用现配)，将细胞重悬后，按照细胞数约106/管分装置入冻存管中，将冻存管放入室温水平的程序降温盒进行梯度降温，最终于液氮罐中保存，以备第8天与DC共培养。
同时，6孔细胞培养板中，每孔加入3ml无血清AIM-V培养液和5μl/ml D++(GM-CSF100ng/mL+IL-4 10ng/mL)，光学显微镜观察细胞生长情况及形态并摄片，置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下孵箱培养。
第四天，光学显微镜下观察6孔细胞培养板细胞生长情况，培养液是否浑浊及培液颜色，评估是否需要补加AIM-V培养液，确定无异常后加入D++(5μl/ml)，继续诱导细胞分化。
第六天，同第四天观察细胞生长情况及培养液，无异常后，加入抗原使DC细胞致敏。所用抗原可参考李洁羽等，“不同方式负载AFP抗原的DC诱导抗肝癌HepG2细胞免疫效应的比较”，《中国肿瘤生物治疗杂志》，2015年，第5期(本文将其全部内容以引用的方式纳入本文)。然后在5％CO2，37℃，饱和湿度培养箱继续培养。
第七天，根据组合物的不同分组，向实验组中分别加入相应组合刺激物，各刺激物的使用量分别为：IFN-γ(100IU/ml)、poly(I:C)(30μg/ml)、R848(5μg/ml)以及ATP(1mM)，对照组中加入TNF-α(5μl/ml)，刺激细胞成熟，观察细胞变化。其中，IFN-γ、poly(I:C)和R848为Pepro Tech公司制剂，ATP为Sigma公司制剂。
第八天，收获成熟DC，光学显微镜下观察成熟DC形态并拍照，并计数，计算DC得率。
实施例2：TLR受体激动剂组合物联合IFN-γ、ATP诱导DC细胞表达更高水平的分子
表面标记物
应用流式细胞仪对多次反复实验第8天得到的DC表面表型CD80、CD83、CD86的表达进行检测，并用SPSS软件统计数据。结果显示在图1A-1D中。
具体而言，TLR受体激动剂组合物〔含poly(I:C)和R848〕联合IFN-γ、ATP刺激组的CD80、CD83、CD86的表达显著高于其它组合，其共刺激分子及成熟标记的阳性细胞比率分别为98.3％、96.5％、99.2％。三个不同来源人DC细胞的平均值则分别为97.07±1.80(％)、95.27±1.37(％)、99.37±0.47(％)。
通过图1D中柱状图可以观察到实验组和对照组的表型表达水平及差异，提示不同组合方式的刺激组结果均显著高于对照组，其中，poly(I:C)联合IFN-γ刺激组的结果优于R848联合IFN-γ刺激组，且加入ATP的刺激组CD80、CD83、CD86的表达水平显著高于未加入ATP的刺激组，其中ATP对CD83的表达提高的最为明显。
实验结果显示，刺激物组合刺激DC成熟的能力较TNF-α强，其中Toll样受体激动剂组合物联合IFN-γ、ATP刺激效果更好，同时，加入ATP刺激可以提高CD83阳性的细胞比率。
实施例3：TLR受体激动剂组合物联合IFN-γ、ATP诱导DC细胞分泌高水平的IL-12
进一步测定了DC细胞在不同组合刺激下分泌细胞因子的水平。在实验第7天、第8天、第9天连续3天，悬浮培养细胞，离心后取上清液，用ELISA法检测poly(I:C)和R848联合IFN-γ、ATP刺激组(实验组)和TNF-α刺激组(对照组)DC分泌到细胞外的IL-12剂量。
观察实验组和对照组连续3天IL-12的分泌量，结果显示在图2中。其中，实验组IL-12的分泌量第8天最高，为24954.304±694.435pg。第9天已明显下降，约为第8天分泌量的一半，提示DC在体外培养的第8天成熟度最高；分别在同一天对实验组和对照组进行比较，发现对照组IL-12分泌量极低，可认为对照组基本不分泌IL-12，而实验组IL-12大量分泌，具有显著统计学差异，提示TLR受体激动剂组合物联合IFN-γ、ATP刺激DC成熟的能力较强。
实施例4：TLR受体激动剂组合物联合IFN-γ、ATP刺激成熟的DC细胞更有效的诱导
CD3+T细胞分泌细胞因子
进一步取培养第8天实验组和对照组的DC，计数，作为刺激细胞，接种到6孔细胞培养板中。
无血清AIM-V培养液重悬第0天冻存的T淋巴细胞，计数，按细胞数比值T淋巴细胞：DC＝20:1，将初始T淋巴细胞加入6孔板，后根据总液体体积加入IL-2(50U/mL)，置37℃，5％CO2，饱和湿度条件下孵育48h。
以同样剂量DC，同等比例IL-2再次刺激48h，收集活化T细胞。
第12天，通过流式细胞仪检测细胞内IFN-γ、TNF-α阳性的细胞比率，结果显示在图3A、3B、和3C中。具体而言，TLR受体激动剂组合物〔poly(I:C)和R848〕联合IFN-γ、ATP刺激组的成熟DC细胞更有效的诱导CD3+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α，其阳性细胞比率分别为77.2％和94.6％，三个不同来源人DC细胞的平均值则分别为76.93±0.55(％)和91.0±3.17(％)，具有显著统计学差异，且poly(I:C)和R848联合IFN-γ、ATP刺激组胞内细胞因子的分泌水平同样显著高于poly(I:C)联合IFN-γ，提示DC的成熟度与T细胞的活化程度成正比。
同样，进一步通过ELISA法检测活化T细胞上清液中IFN-γ分泌量，检测后，根据标准曲线，稀释倍数和培养液中液体总体积，计算IFN-γ分泌量，图3D的结果显示：实验组IFN-γ分泌量为6756.53±145.96pg，明显高于对照组(1440.97±11.89pg)，且有统计学差异。而活化的T细胞会大量分泌IFN-γ，提示实验组T细胞活化程度较对照组好。
本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (10)
1.一种用于刺激树突状细胞的组合物，该组合物含有poly(I:C)、R848、IFN-γ和ATP中的至少2种、至少3种或全部4种。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有：
(1)poly(I:C)和R848中的任一种或全部2种；和
(2)IFN-γ和ATP中的任一种或全部2种；
优选地，所述组合物含有poly(I:C)和任选的R848，以及IFN-γ和任选的ATP；或者
优选地，所述组合物含有R848和任选的poly(I:C)，以及IFN-γ和任选的ATP；或者
优选地，所述组合物含有poly(I:C)、R848和IFN-γ和任选的ATP；或者
优选地，所述组合物含有poly(I:C)、IFN-γ、ATP和任选的R848。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，
当含有时，所述组合物中poly(I:C)的含量足以使其工作浓度在1-200μg/ml的范围内，例如1-150μg/ml，1-120μg/ml，1-100μg/ml，1-80μg/ml，1-50μg/ml，5-50μg/ml，10-50μg/ml，15-40μg/ml，或20-40μg/ml；
当含有时，所述组合物中R848的含量足以使其工作浓度在0.1-50μg/ml的范围内，例如0.1-30μg/ml，0.1-20μg/ml，0.1-10μg/ml，1-30μg/ml，1-20μg/ml，1-10μg/ml或3-8μg/ml；
当含有时，所述组合物中IFN-γ的含量足以使其工作浓度在1-1000IU/ml的范围内，例如1-600IU/ml，1-500IU/ml，1-300IU/ml，10-300IU/ml，30-300IU/ml，50-200IU/ml，50-150IU/ml或80-120IU/ml；
当含有时，所述组合物中ATP的含量足以使其工作浓度在0.1-10mM的范围内，例如0.1-8mM，0.1-5mM，0.1-3mM或0.5-3mM。
4.如权利要求1－3中任一项所述的组合物，其特征在于，
所述组合物含有：
(1)poly(I:C)，其含量应足以使其工作浓度在1-80μg/ml的范围内，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；
(2)IFN-γ，其含量应足以使其工作浓度在10-300IU/ml的范围内，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；
(3)任选的R848，当含有时，其含量应足以使其工作浓度在0.1-10μg/ml的范围内，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml；以及
(4)任选的ATP，当含有时，其含量应足以使其工作浓度在0.1-5mM的范围内，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM；或
所述组合物含有：
(1)poly(I:C)，其含量应足以使其工作浓度在1-80μg/ml的范围内，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；
(2)IFN-γ，其含量应足以使其工作浓度在10-300IU/ml的范围内，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；
(3)R848，其含量应足以使其工作浓度在0.1-10μg/ml的范围内，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml；以及
(4)任选的ATP，当含有时，其含量应足以使其工作浓度在0.1-5mM的范围内，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM；或
所述组合物含有：
(1)poly(I:C)，其含量应足以使其工作浓度在1-80μg/ml的范围内，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；
(2)IFN-γ，其含量应足以使其工作浓度在10-300IU/ml的范围内，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；
(3)ATP，其含量应足以使其工作浓度在0.1-5mM的范围内，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM；以及
(4)任选的R848，当含有时，其含量应足以使其工作浓度在0.1-10μg/ml的范围内，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml；或
所述组合物含有：
(1)R848，其含量应足以使其工作浓度在0.1-10μg/ml的范围内，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml；
(2)IFN-γ，其含量应足以使其工作浓度在10-300IU/ml的范围内，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；
(3)任选的poly(I:C)，当含有时，其含量应足以使其工作浓度在1-80μg/ml的范围内，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；和
(4)任选的ATP，当含有时，其含量应足以使其工作浓度在0.1-5mM的范围内，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM；或
所述组合物含有：
(1)poly(I:C)，其含量应足以使其工作浓度在1-80μg/ml的范围内，优选10-50μg/ml，更优选15-40μg/ml；
(2)R848，其含量应足以使其工作浓度在0.1-10μg/ml的范围内，优选1-10μg/ml，更优选3-8μg/ml；
(3)IFN-γ，其含量应足以使其工作浓度在10-300IU/ml的范围内，优选50-150IU/ml，更优选80-120IU/ml；以及
(4)ATP，其含量应足以使其工作浓度在0.1-5mM的范围内，优选0.5-2mM，更优选0.5-1.5mM。
5.一种无血清树突状细胞培养液，所述培养液含有权利要求1－4中任一项所述的组合物，和任选的GM-CSF和IL-4；
优选地，所述培养液中，poly(I:C)的浓度范围是1-200μg/ml，例如1-150μg/ml，1-120μg/ml，1-100μg/ml，1-80μg/ml，1-50μg/ml，5-50μg/ml，10-50μg/ml，15-40μg/ml，或20-40μg/ml；
优选地，所述培养液中，R848的浓度范围是0.1-50μg/ml，例如0.1-30μg/ml，0.1-20μg/ml，0.1-10μg/ml，1-30μg/ml，1-20μg/ml，1-10μg/ml或3-8μg/ml；
优选地，所述培养液中，IFN-γ的浓度范围是1-1000IU/ml，例如1-600IU/ml，1-500IU/ml，1-300IU/ml，10-300IU/ml，30-300IU/ml，50-200IU/ml，50-150IU/ml或80-120IU/ml；
优选地，所述培养液中，ATP的浓度范围是0.1-10mM，例如0.1-8mM，0.1-5mM，0.1-3mM或0.5-3mM；
优选地，所述培养液中所述GM-CSF的浓度为1-300ng/ml，例如1-200ng/ml，1-150ng/ml，30-300ng/ml，30-200ng/ml，30-150ng/ml，50-200ng/ml，50-150ng/ml，80-150ng/ml或80-120ng/ml；
优选地，所述培养液中所述IL-4的浓度为1-30ng/ml，例如1-20ng/ml，1-15ng/ml，3-30ng/ml，3-20ng/ml，3-15ng/ml，5-20ng/ml，5-15ng/ml，8-15ng/ml或8-12ng/ml。
6.一种诱导DC表面CD80、CD83和CD86分子表达或上调DC表面CD80、CD83和CD86分子表达，提高DC分泌IL-12的能力，和/或促进DC细胞成熟的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1－4中任一项所述的组合物刺激未成熟DC，或使用权利要求5所述的培养液培育未成熟DC的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述未成熟的DC细胞是贴壁的外周血单个核细胞；
所述刺激或培育时间为15～30小时；和
在进行所述刺激或培育前，还包括使用选自多肽抗原、肿瘤细胞裂解物、携带抗原编码序列的重组载体、编码抗原的RNA中的一种或多种培育所述未成熟DC的步骤。
8.权利要求1－4中任一项所述的组合物或权利要求5所述的培养液在诱导DC表面CD80、CD83和CD86分子表达或上调DC表面CD80、CD83和CD86分子表达，提高DC分泌IL-12的能力，和/或促进DC细胞成熟中的应用；或权利要求1－4中任一项所述的组合物在制备用于诱导DC表面CD80、CD83和CD86分子表达或上调DC表面CD80、CD83和CD86分子表达，提高DC分泌IL-12的能力，和/或促进DC细胞成熟的培养液中的应用。
9.一种成熟的DC细胞或含该成熟DC细胞的细胞群，所述DC细胞采用权利要求6或7所述的所述方法制备得到；
优选地，所述成熟的DC细胞24小时内IL12的分泌水平高于1.5ng/十万个细胞，优选高于1.7ng/十万个细胞，优选高于2ng/十万个细胞，更优选高于2.5ng/十万个细胞，更优选高于3ng/十万个细胞；
优选地，所述细胞群具有以下特征中的至少1项、至少2项或全部3项：
(1)CD80阳性细胞的比率高于95％，优选高于96％，更优选高于97％；
(2)CD83阳性细胞的比率高于95％，优选高于96％，更优选高于97％；和
(3)CD86阳性细胞的比率高于95％，优选高于96％，更优选高于97％。
10.权利要求9所述的成熟的DC细胞或所述细胞群在制备DC疫苗中的应用，或在制备诱导肿瘤特异性T细胞的活化的药物中的应用。
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2016
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