CN1636229B - 引发单核树突细胞和t细胞th-1应答的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了诱导未成熟树突细胞(DC)成熟以及致敏这些细胞以诱导1型免疫应答的组合物和方法。本发明还提供了可用于激活及用于制备朝产生1型细胞因子和/或1型应答极化的T细胞的树突细胞群。同样地，提供了激活的、极化的T细胞群以及制备它们的方法。
Description
发明背景
抗原呈递细胞(APC)在引发有效的免疫应答方面很重要。它们不仅将抗原呈递给具有抗原特异性T细胞受体的T细胞，而且提供T细胞激活所必需的信号。这些信号仍未完全解释清楚，但包括许多细胞表面分子以及细胞因子或生长因子。原初或未极化T细胞激活所必需的因子可能与记忆T细胞再激活所必需的因子有所不同。APC呈递抗原和递送T细胞激活信号的能力通常被描述为辅佐细胞功能。虽然单核细胞和B细胞已被证明是感受态(competent)的APC，但它们在体外的抗原呈递能力似乎局限于先前致敏T细胞的再激活。因此，它们不能够在功能上直接地激活原初或未致敏T细胞群。
树突细胞(DC)是被认为能够激活原初和记忆T细胞的免疫系统中的专职抗原呈递细胞。越来越多的离体制备树突细胞用于免疫治疗，特别是癌症的免疫治疗。制备具有最佳免疫刺激性质的树突细胞需要理解并运用这些细胞离体培养的生物学。培养这些细胞的多种方案已有描述，并附有各方案的多种优点。近来的方案包括无血清培养基的利用，以及赋予培养细胞预定的免疫刺激性质的成熟条件的使用。
树突细胞的成熟是将表型上与皮肤朗格汉斯细胞(Langerhanscell)相似的未成熟DC转化为成熟的、能够迁移到淋巴结的抗原呈递细胞的过程。这个过程导致未成熟树突细胞所特有的强抗原摄取能力的丧失，以及共刺激细胞表面分子和多种细胞因子表达的上调。已知的成熟方案是以据信DC在暴露于抗原期间或之后所遇到的体内环境为基础的。这个方法最好的例子是使用单核细胞条件性培养基(MCM)作为细胞培养基。MCM通过培养单核细胞体外产生，并用作为成熟 因子的来源。MCM中参与成熟的主要成分据报道是(原)炎症细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)以及肿瘤坏死因子α(TNFα)。其它成熟因子包括前列腺素E2(PGE2)、多聚-dIdC、血管活性肠肽(VIP)、细菌脂多糖(LPS)以及分枝杆菌或分枝杆菌成分，例如特定胞壁组份。
完全成熟的树突细胞在质量上和数量上都不同于未成熟DC。完全成熟的DC表达较高水平的MHC I类和II类抗原，以及T细胞共刺激分子，即CD80和CD86。这些变化增强了树突细胞激活T细胞的能力，因为它们通过T细胞共刺激分子对应物，例如象CD28，增加了细胞表面的抗原密度以及T细胞激活信号的数量级。此外，成熟DC产生大量细胞因子，其刺激并指导T细胞应答。其中的两个细胞因子是白细胞介素10(IL-10)和白细胞介素12(IL-12)。这些细胞因子对诱导的T细胞应答方向具有相反的影响。IL-10产物导致诱导Th-2型应答，而IL-12产物导致Th-1型应答。后一种应答在期望细胞免疫应答的情况下，例如，举例来说，在癌症免疫疗法中尤为需要。Th-1型应答导致细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的诱导和分化，它们是细胞免疫系统的效应臂(effector arm)。该效应臂在抵抗肿瘤生长方面最为有效。IL-12也诱导天然杀伤(NK)细胞的生长，并具有抗血管生成活性，这两者都是有效的抗肿瘤武器。因此，利用产生IL-12的树突细胞在理论上最适用于免疫刺激。
某些树突细胞成熟因子，例如，举例来说，细菌脂多糖、细菌CpGDNA、双链RNA和CD40配体据报道诱导未成熟DC产生IL-12并致敏未成熟DC产生Th-1型应答。相反，抗炎分子例如IL-10、TGF-β、PGE-2和皮质类固醇抑制IL-12产生，并致敏细胞产生Th-2型应答。
最近报道通过干扰素γ与某些树突细胞成熟因子，例如细菌脂多糖(LPS)和CD40的组合增进树突细胞的IL-12产生。不过，LPS和CD40 都具有在成熟期间诱导小量IL-12的已知能力。因此，有可能添加IFNγ仅仅是增进产生。干扰素γ信号传导利用Jak2-Stat1途径，包括它在迁往细胞核之前Stat1701位酪氨酸残基的酪氨酸磷酸化以及继发的干扰素γ响应基因转录增强。不过，对人单核细胞来源的树突细胞的信号转导途径知之甚少。干扰素γ在这些细胞中的作用机制尚未确定。
目前称为卡介苗(BCG)的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的减毒牛菌株(牛分枝杆菌Mycobacterium bovis)已被用于癌症免疫疗法。在一个例子中，膀胱内给药活BCG被证明可有效治疗膀胱癌，尽管这种治疗的机制尚不知晓。BCG给药的效果被假定是通过诱导攻击，例如，癌细胞的免疫应答介导的。BCG在这一应答中的特定作用被认为是广义免疫反应诱导子的作用，而且具有将肿瘤抗原呈递给免疫系统的佐剂功能。
还发现BCG是树突细胞的强有力成熟因子，具有上调成熟标志CD83的能力。BCG还能够上调MHC分子以及共刺激分子CD80和CD86，伴随着内吞能力的下降。此外，已报道BCG或BCG-来源的脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabidomannan)增进细胞因子的产生，虽然与其它DC成熟因子所发现的结果相反，发现IL-12的产生是被特异性抑制的。后面的这种性质，即抑制IL-12产生，降低了利用BCG来成熟树突细胞，用于期望强烈细胞介导的细胞毒性应答(Th-1应答)的免疫疗法的吸引力。
因此，BCG在主动免疫疗法中的应用，具有诱导树突细胞成熟的潜力。不过，(仍然)需要诱导这种树突细胞成熟、同时又提供广泛免疫刺激，并致敏那些树突细胞产生具有强烈细胞毒性T细胞应答的1型(Th-1)免疫应答的组合物和利用这种组合物的方法。
发明概述
本发明提供了利用同时提供广泛免疫刺激的因子(即BCG)，诱导未成熟树突细胞(DC)成熟，并致敏那些细胞产生抗原特异性细胞毒性T细胞应答的方法和组合物。在一方面，提供了产生成熟树突细胞群的方法，包括提供未成熟树突细胞；并使未成熟树突细胞与有效浓度的BCG和干扰素γ(IFNγ)在适于未成熟树突细胞成熟的培养条件下接触，以形成成熟树突细胞群。成熟树突细胞群比在成熟期间未与BCG和IFNγ接触的未成熟树突细胞群产生升高的白细胞介素12∶白细胞介素10比例。未成熟树突细胞在与BCG和IFNγ接触之前或期间可与预定抗原接触。预定抗原可以是，例如，肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达抗原的重组细胞、细胞裂解物、膜制备物、重组制备的抗原、肽抗原(如，合成的肽抗原)或者分离的抗原。
在某些实施方案中，该方法可选地进一步包括分离单核树突细胞前体；并在分化因子存在下培养该前体，以形成未成熟树突细胞。合适的分化因子包括，例如，GM-CSF、白细胞介素4、GM-CSF和白细胞介素4的组合、或者白细胞介素13。单核树突细胞前体可以分离自人类受试者。在特别的实施方案中，成熟树突细胞产生的IL-12∶IL-10的比例为至少1∶1。
在另一方面，提供了制备成熟树突细胞群的方法。该方法一般包括提供未成熟树突细胞；并使未成熟树突细胞与有效量的BCG和干扰素γ(IFNγ)在适于未成熟树突细胞成熟的培养条件下接触，以形成成熟树突细胞群。所得的成熟树突细胞群产生1型免疫应答。未成熟树突细胞在与BCG和IFNγ接触之前或期间可与预定抗原接触。预定抗原可以是，例如，肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达抗原的重组细胞、细胞裂解物、膜制备物、重组制备的抗原、肽抗原(即合成肽)或者分离的抗原。
在某些实施方案中，该方法可选地进一步包括分离单核树突细胞前体；并在分化因子存在下培养该前体，以形成未成熟树突细胞。合适的分化因子包括，例如，GM-CSF、白细胞介素4、GM-CSF和白细胞介素4的组合、或者白细胞介素13。单核树突细胞前体可以分离自人类受试者。在特别的实施方案中，成熟树突细胞产生的IL-12∶IL-10的比例为至少大约1∶1。
而在另一方面，提供了激活T细胞的组合物。该组合物可以包括用有效浓度的BCG和IFNγ在合适的成熟条件下使之成熟的树突细胞群；和预定抗原。树突细胞群能够比在成熟期间与BCG接触而未接触IFNγ的成熟树突细胞群产生升高的白细胞介素12(IL-12)∶白细胞介素10(IL-10)比例。在某些实施方案中，树突细胞群能够产生IL-12∶IL-10的比例为至少大约10∶1。在另一个实施方式中，树突细胞群与在成熟期间在有BCG而无IFNγ存在下培养的相似未成熟树突细胞群相比，能够产生IL-12∶IL-10的比例为至少大约100∶1。
在另一方面，提供了分离的未成熟树突细胞群。该细胞群包括未成熟单核树突细胞，以及有效浓度的BCG和IFNγ以诱导未成熟树突细胞成熟。所得的成熟树突细胞与在成熟期间在有BCG而无IFNγ存在下培养的相似未成熟树突细胞群相比，产生比白细胞介素10(IL-10)多的白细胞介素12(IL-12)。该细胞群可选地可以包括预定抗原和/或分离的T细胞，例如原初T细胞。T细胞可选地可以存在于分离的淋巴细胞制备物中。
还提供了制备激活的T细胞的方法。该方法一般包括提供未成熟树突细胞；使未成熟树突细胞与预定抗原接触；并使未成熟树突细胞与有效浓度的BCG和IFNγ在适合未成熟树突细胞成熟的培养条件下接触，以形成成熟树突细胞。成熟树突细胞可以与原初T细胞接触以形成激活的T细胞，其产生IFNγ和/或向1型(Th-1)应答极化。合适的 抗原包括，例如，肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达抗原的重组细胞、细胞裂解物、膜制备物、重组制备的抗原、肽抗原(如，合成的肽抗原)或者分离的抗原。
未成熟树突细胞可以与预定抗原、BCG和IFNγ同时接触，或者所述细胞可以在与BCG和IFNγ接触之前与预定抗原接触。在某些实施方案中，该方法可以进一步包括分离单核树突细胞前体；并在分化因子存在下培养该前体，以诱导形成未成熟树突细胞。合适的分化因子包括，例如，GM-CSF、白细胞介素4、GM-CSF和白细胞介素4的组合、或者白细胞介素13。单核树突细胞前体可选地可以分离自人类受试者。在特别的实施方案中，未成熟树突细胞和T细胞相互之间是自体的(autologous)。
还提供了分离的产生白细胞介素12(IL-12)比白细胞介素10(IL-10)多的成熟树突细胞。该成熟树突细胞可以通过用包括有效浓度的BCG和IFNγ的组合物在适于树突细胞成熟的条件下使未成熟树突细胞成熟而提供。分离的成熟树突细胞可选地可以包括预定抗原。还提供了荷载有预定抗原的分离的成熟树突细胞。该树突细胞能够产生比白细胞介素10(IL-10)多的白细胞介素12(IL-12)，例如，举例来说，与在成熟期间在有BCG而无IFNγ存在下培养的相似未成熟树突细胞群相比，产生比IL-10至少多10倍的IL-12。
还提供了在动物中产生1型(Th-1)免疫应答的方法。该方法一般包括提供未成熟树突细胞；使未成熟树突细胞与有效量的BCG和干扰素γ(IFNγ)以及预定抗原在适于未成熟树突细胞成熟的培养条件下接触，以形成成熟树突细胞。成熟树突细胞可以向动物给药，或者与原初T细胞接触，以形成以产生干扰素γ(IFNγ)和/或肿瘤坏死因子α(TNFα)为特征的激活的T细胞。可以向需要针对特定抗原刺激细胞毒 性T细胞应答的动物给药激活的T细胞。合适的抗原包括，例如，肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达抗原的重组细胞、细胞裂解物、膜制备物、重组制备的抗原、肽抗原(如，合成的肽抗原)或者分离的抗原。未成熟树突细胞可选地可以与预定抗原、BCG和IFNγ同时接触，或者该未成熟树突细胞可以在与BCG和IFNγ接触之前与预定抗原接触。
在某些实施方案中，该方法可以进一步包括从动物分离单核树突细胞前体；并在分化因子存在下培养该前体，以形成未成熟树突细胞。分化因子可以是，例如，GM-CSF、白细胞介素4、GM-CSF和白细胞介素4的组合、或者白细胞介素13。
未成熟树突细胞和T细胞可以是动物自体的，或者与动物是同种异体(allogenic)的。或者，未成熟树突细胞和T细胞可以具有与动物相同的MHC单元型，或者共享MHC标志。在某些实施方案中，动物可以是人，或者可以是非人动物。
发明的详细描述
本发明提供了诱导未成熟树突细胞(DC)成熟和致敏那些细胞产生抗原特异性细胞毒性T细胞应答(Th-1应答)的方法。本发明还提供了可用于激活并制备朝产生1型细胞因子(如IFNγ、TNFα和/或IL-2)极化的T细胞的树突细胞群。这种树突细胞群包括与BCG、IFNγ和预定抗原在合适的成熟条件下接触的未成熟单核树突细胞。未成熟树突细胞可以在成熟期间或之前与抗原接触。或者，已经暴露于抗原(例如在体内)的未成熟单核树突细胞可以在合适的成熟条件下与BCG和IFNγ接触。所得的成熟树突细胞被致敏以激活并使T细胞朝1型应答极化。1型应答包括产生1型细胞因子(如IFNγ和/或IL-2)，产生比IL-10更多的IL-12，细胞毒性T细胞应答，产生Th-1细胞，以及产生某些类型的抗体。还能够上调肿瘤坏死因子α(TNFα)。相反，2 型应答以产生IL-4、IL-5和IL-10，产生比IL-12更多的IL-10，产生Th2细胞，以及缺乏诱导CTL应答为特征。
在有关方面，提供了包含未成熟树突细胞成熟因子(例如单核树突细胞前体)的组合物，其还可以致敏那些树突细胞产生1型应答。这种成熟致敏的单核树突细胞能够增强I类主要组织相容性复合体(MHC)对预定抗原，即预定外源抗原的呈递。MHC I类分子对抗原的呈递期望能够诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分化，并刺激抗原特异性CTL介导的靶细胞裂解。这种组合物包括BCG和IFNγ，它们能够与包含未成熟树突细胞的细胞群混合，以使未成熟树突细胞成熟，并逆转或克服因未成熟树突细胞与BCG接触所诱导的IL-12的抑制。与这种组合物接触的未成熟树突细胞经历成熟，并且典型地与仅与BCG接触的未成熟树突细胞群相比，产生比IL-10更大量的IL-12。
在另一方面，从受试者或供体获得的单核树突细胞前体可以与细胞因子(如GM-CSF和IL-4)接触以获得未成熟树突细胞。然后该未成熟树突细胞可以，或者只与BCG和IFNγ组合，或者与细胞因子组合，与预定抗原进行接触，以使树突细胞成熟，并致敏这些细胞，诱导T细胞1型免疫应答。在某些实施方案中，刺激MHC I类抗原加工，这可用于引起针对显示预定抗原的细胞的CTL应答。
树突细胞是发现于许多淋巴和非淋巴组织的多种抗原呈递细胞群(参见Liu，Cell 106：259-62(2001)；Steinman，Ann.Rev.Immunol.9：271-96(1991))。树突细胞包括脾内的淋巴树突细胞、表皮的朗格汉斯细胞以及血液循环中的隐蔽细胞(Veiled cell)。整体而言，树突细胞基于它们的形态、高水平的表面MHC II类分子的表达以及缺乏某些表达于T细胞、B细胞、单核细胞和天然杀伤细胞的其它表面标志而被归类为一组。特别地，单核细胞来源的树突细胞(还被称之为单核树突细胞)通常表达CD 11c、CD80、CD86，并且为HLA-DR+，但是 CD 14-。
相反，单核树突细胞前体(典型地单核细胞)通常为CD14+。单核树突细胞前体可以从其定居的任何组织，特别是淋巴组织例如脾、骨髓、淋巴结和胸腺中获得。单核树突细胞前体还可以从循环系统中分离。外周血液是容易得到的单核树突细胞前体的来源。脐带血是单核树突细胞前体的另一种来源。单核树突细胞前体可以从许多能够引起免疫应答的生物中分离。这样的生物包括动物，举例来说，包括人以及非人动物，例如，灵长类、哺乳动物(包括狗、猫、小鼠和大鼠)、禽(包括鸡)及其转基因物种。
在某些实施方案中，单核树突细胞前体和/或未成熟树突细胞可以从健康受试者或需要免疫刺激的受试者，例如，举例来说，前列腺癌病人或者细胞免疫刺激能够有益或期望细胞免疫刺激的其他受试者(即患有细菌或病毒感染的受试者等)中分离。树突细胞前体和/或未成熟树突细胞还可以从HLA匹配(HLA-matched)的健康个体中获得，用于给药需要免疫刺激的HLA匹配患者。
树突细胞前体和未成熟树突细胞
从各种来源，包括血液和骨髓中分离富集树突细胞前体和未成熟树突细胞的方法是本领域公知的。举例来说，可以通过收集肝素化的血液、通过单采血液成分术或者白细胞除去法、通过制备血沉棕黄层、玫瑰花结(rosetting)、离心、密度梯度离心(如利用Ficoll(例如 
(包被有非透析性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的胶体硅颗粒(直径15-30mm))、蔗糖等)、细胞差别裂解、过滤等分离树突细胞前体和未成熟树突细胞。在某些实施方案中，例如，举例来说，可以通过收集受试者血液、脱纤维蛋白以除去血小板以及裂解红血细胞制备白细胞群。树突细胞前体和未成熟树突细胞可选地可以，例如，通过 梯度离心富集单核树突细胞前体。
树突细胞前体和未成熟树突细胞可选地可以在封闭的无菌系统中制备。如本文所用，术语“封闭的无菌系统”或“封闭系统”是指暴露于未消毒的周围环境或气流或者其它未消毒条件的情况被最小化或者消除的系统。分离树突细胞前体和未成熟树突细胞的封闭系统通常排除在敞口式管中密度梯度离心、在敞开的空气中(open air)转移细胞、在组织培养板或未密封烧瓶中培养细胞等。在典型的实施方案中，封闭系统可以使树突细胞前体和未成熟树突细胞从原始的收集容器中无菌转移到可密封的组织培养容器中，而不暴露于未消毒的空气。
在某些实施方案中，单核树突细胞前体通过粘附于单核细胞结合基质分离，如在2001年7月25日递交的美国专利申请No.60/307,978(代理人档案号No.020093-002600US)中所公开的，兹将其公开的内容引入作为参考。举例来说，白细胞群(例如通过白细胞除去法分离的)可以与单核树突细胞前体粘附基质接触。当白细胞群与基质接触时，白细胞群中的单核树突细胞前体优先地粘附到基质上。其它白细胞(包括其它潜在的树突细胞前体)表现出降低的基质结合亲和力，从而使单核树突细胞前体在基质表面被优先富集。
合适的基质包括，例如，具有大的表面积体积比的那些基质。这样的基质可以是，例如，微粒或纤维基质。合适的微粒基质包括，例如，玻璃颗粒、塑料颗粒、包被玻璃的塑料颗粒、包被玻璃的聚苯乙烯颗粒，以及适于蛋白吸附的其它珠子。合适的纤维基质包括微毛细管和微绒毛膜。微粒或纤维基质通常可以使粘附的单核树突细胞前体被洗脱而基本不会降低粘附细胞的存活力。微粒或纤维基质可以基本上无孔的，以促进单核树突细胞前体或树突细胞从基质上洗脱下来。“基本上无孔的”基质是至少多数存在于基质中的孔要比细胞更小，以便将基质捕获的细胞降至最小程度的基质。
单核树突细胞前体对基质的粘附可选地可以通过添加结合介质而增强。合适的结合介质包括单核树突细胞前体培养基(如 RPMI 1640、DMEM、 
等)，单独地或者以任意组合的形式，补充有，例如细胞因子(如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)或白细胞介素13(IL-13))，血浆、血清(如人血清，例如自体的或同种异体的血清)，纯化的蛋白，例如血清白蛋白，二价阳离子(如钙和/或镁离子)以及有助于单核树突细胞前体特异性粘附于基质、或者防止非单核树突细胞前体粘附于基质的其它分子。在某些实施方案中，血浆和血清可被加热灭活。热灭活的血浆与白细胞可以是自体的或者异源的。
在单核树突细胞前体粘附于基质之后，将未粘附的白细胞与单核树突细胞前体/基质复合物分离。可以利用任何适当的方法从复合物中分离未粘附的细胞。例如，可以让未粘附的白细胞和复合物混合物沉淀，并倾出或排干未粘附的白细胞和介质。或者，可以离心混合物，并从沉淀复合物中倾出或排干含有未粘附白细胞的上清。
分离的树突细胞前体可以在离体培养用于分化、成熟和/或扩增(如本文所用的，分离的未成熟树突细胞、树突细胞前体、T细胞以及其它细胞是指通过人工脱离其天然环境存在的细胞，因此不是天然产物。分离的细胞能够以纯化的形式、半纯化的形式或者在非天然环境中存在)。简要地，离体分化典型地包括在一种或多种分化因子存在的情况下，培养树突细胞前体或具有树突细胞前体的细胞群。合适的分化因子可以是，例如，细胞生长因子(如细胞因子，例如(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素13(IL-13)和/或它们的组合)。在某些实施方案中，单核树突细胞前体分化形成单核细胞来源的未成熟树突细胞。
树突细胞前体能够在合适的培养条件下培养和分化。合适的组织 培养基包括 
RPMI 1640、DMEM、 等。组织培养基可以补充有血清，氨基酸，维生素，细胞因子，例如GM-CSF和/或IL-4，二价阳离子等，以促进细胞分化。在某些实施方案中，树突细胞前体可以在无血清培养基中培养。这种培养条件可选地可以排除任何动物来源的产品。在典型的树突细胞培养基中典型的细胞因子组合是GM-CSF和IL-4各大约500单位/ml。树突细胞前体在分化形成未成熟树突细胞时，在表型上与皮肤朗格汉斯细胞相似。未成熟树突细胞典型地为CD14-和CD11c+，表达低水平的CD86和CD83，并能够通过特定的细胞内吞作用捕获可溶性抗原。
使未成熟树突细胞成熟形成成熟树突细胞。成熟DC丧失摄取抗原的能力，并表现出共刺激细胞表面分子和多种细胞因子表达的上调。具体地，成熟DC与未成熟树突细胞相比表达较高水平的MHC I类和II类抗原，并且成熟树突细胞通常被鉴定为CD80+、CD83+、CD86+ 和CD14-。较高的MHC表达导致DC表面抗原密度的增加，而共刺激分子CD80和CD86的上调则通过共刺激分子的对应物(counterpart)，例如T细胞上的CD28强化T细胞激活信号。
本发明的成熟树突细胞可通过使未成熟树突细胞与有效量或浓度的BCG和IFNγ接触制备(即成熟)。有效量的BCG典型地为每毫升组织培养基约105-107cfu。有效量的IFNγ典型地为每毫升组织培养基约100-1000U。卡介菌苗(BCG)是牛分枝杆菌(M.bovis)的减毒株。如本文所用的，BCG是指完整BCG、还有胞壁组分、BCG来源的脂阿拉伯甘露聚糖、以及与诱导2型免疫应答相关的其它BCG组分。BCG可选地被失活，例如热失活的BCG、福尔马林处理的BCG等。
BCG增加表面成熟标志CD83和CD86在树突细胞上的表达，伴随着IL-12产生的抑制和内吞作用对抗原的排除。并不旨在束缚于任何特定的理论，用BCG成熟的树突细胞还被描述为涉及同型聚集和 肿瘤坏死因子-α(TNFα)的释放(参见Thurnher等，Int.J.Cancer 70：128-34(1997)，兹引入作为参考)。用IFNγ和BCG使未成熟树突细胞成熟促进DC产生IL-12，并降低和抑制IL-10产生，从而致敏成熟树突细胞的1型(Th-1)应答。
未成熟DC典型地与有效量的BCG和IFNγ接触大约1小时到大约24小时。未成熟树突细胞能够在合适的成熟培养条件下培养和成熟。合适的组织培养基包括 RPMI 1640、DMEM、 
等。组织培养基可以补充有氨基酸、维生素、细胞因子，例如GM-CSF和/或IL-4，二价阳离子等，以促进细胞成熟。典型的细胞因子组合是GM-CSF和IL-4各大约500单位/ml。
树突细胞的成熟可通过本领域公知的方法监测。细胞表面标志可由本领域熟悉的测定方法，例如流式细胞术、免疫组化法等检测。还可以监测细胞的细胞因子的产生(例如通过ELISA、FACS和其它免疫测定)。在根据本发明成熟的DC群中，IL-12水平比IL-10水平高，以促进1型(Th-1)应答。举例来说，DC能够产生IL-12/IL-10的比例从大于1∶1到大约10∶1和大约100∶1。成熟DCs还丧失通过胞饮作用摄取抗原的能力，这可以通过本领域普通技术人员熟悉的摄取测定进行分析。树突细胞前体、未成熟树突细胞以及成熟树突细胞，不论是致敏的还是未致敏的，连同抗原能够被冷藏稍后待用。冷藏方法是本领域公知的。参见美国专利5,788,963，兹将其全文引入作为参考。
抗原
根据本发明的成熟致敏树突细胞能够向T细胞呈递抗原。成熟致敏树突细胞可以通过使未成熟树突细胞在成熟之前和期间与预定抗原接触形成。或者，已经接触抗原的未成熟树突细胞(如分离前体内)可以与包含BCG和IFNγ的组合物接触，以形成致敏1型(Th-1)应答的成熟树突细胞。
合适的预定抗原可以包括期望激活T细胞的任何抗原。这样的抗原可以包括，例如，细菌抗原、肿瘤特异性或肿瘤相关抗原(例如全细胞、肿瘤细胞裂解物、分离的肿瘤抗原、融合蛋白、脂质体等)、病毒抗原，以及任何其它抗原或抗原片段，例如肽或多肽抗原。在某些实施方案中，抗原可以是，例如，但不限于，前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)或者前列腺特异性抗原(PSA)(参见Pepsidero等，Cancer Res.40：2428-32(1980)；McCormack等，Urology45：729-44(1995))。抗原还可以是细菌细胞、细菌裂解物、细胞裂解物的膜碎片、或本领域公知的任何其它来源。抗原可以是表达的或重组制备的，或者甚至是化学合成的。重组抗原还可以表达在宿主细胞(例如细菌、酵母、昆虫、脊椎动物或哺乳动物)表面，可以存在于裂解物中，或者可以从裂解物中纯化。
抗原还可以存在于来自受试者的样品中。例如，可利用来自受试者的过度增生或其它疾病的组织样品作为抗原来源。这种样品可以，例如，通过活组织检查或者外科切除手术获得。这种抗原可作为裂解物或分离的制备物利用。或者，还可以利用受试者(例如癌症病人)细胞的膜制备物或者建立的细胞系作为抗原或抗原来源。
在例示性的实施方案中，从外科手术样本中回收的前列腺肿瘤细胞裂解物可用作为抗原来源。例如，在活组织检查或者外科切除手术中获得癌症病人肿瘤的样品，可以被直接用来向树突细胞呈递抗原，或者提供用于抗原呈递的细胞裂解物。或者，可以利用癌症病人肿瘤细胞的膜制备物。肿瘤细胞可以是前列腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、脑癌、黑素瘤或任何其它类型的肿瘤细胞。裂解物和膜制备物可以通过本领域供公知的方法从分离的肿瘤细胞中制备。
在另一个例示性的实施方案中，可利用纯化或半纯化的前列腺特 异性膜抗原(PSMA，还被公知为PSM抗原)作为抗原，它与单克隆抗体7E11-C.5特异性反应(参阅Horoszewicz等，Prog.Clin.Biol.Res.37：115-32(1983)、美国专利No.5,162,504；美国专利No.5,788,963；Feng等，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.32：(Abs.1418)238(1991)；兹将其公开的内容引入作为参考)。而在另一个例示性的实施方案中，可利用具有氨基酸残基序列Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val(SEQ ID NO：1)(命名为PSM-P1)的抗原性肽作为抗原，其对应于PSMA的氨基酸残基4-12。或者，可利用具有氨基酸残基序列Ala Leu Phe Asp Ile GluSer Lys Val(SEQ ID NO：2)(命名为PSM-P2)的抗原性肽作为抗原，其对应于PSMA的氨基酸残基711-719。
在特定的实施方案中，可利用具有氨基酸残基序列Xaa Leu(或Met)Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val(或Leu)(命名为PSM-PX)的抗原性肽作为抗原，其中Xaa代表任何氨基酸残基。该肽类似于HLA-A0201结合基序，即发现于HLA-A2病人的、具有“锚定残基”亮氨酸和缬氨酸的9-10个氨基酸残基的结合基序(参见Grey等，Cancer Surveys 22：37-49(1995))。该肽可用作为HLA-A2+病人的抗原(见Central Data Analysis Committee″Allele Frequencies″，第6.3节，Tsuji，K.等编辑，Tokyo University Press，第1066-1077页)。同样地，可以利用类似其它HLA结合基序的肽。
典型地，如前所述，未成熟树突细胞在存在BCG、IFNγ和预定抗原的情况下在合适的成熟条件下培养。可选地，未成熟树突细胞可以在没有GM-CSF和IL-4或者成熟因子的典型树突细胞培养基中与预定抗原混合。在与抗原培养至少大约10分钟到2天后，可以除去抗原并添加补充有BCG和IFNγ的培养基。还可以向成熟培养基中添加细胞因子(例如GM-CSF和IL-4)。树突细胞接触的方法一般是本领域公知的(参阅Steel和Nutman，J.Immunol.160：351-60(1998)；Tao等，J.Immunol.158：4237-44(1997)；Dozmorov和Miller，Cell ImmunoL 178： 187-96(1997)；Inaba等，J Exp Med.166：182-94(1987)；Macatonia等，J Exp Med.169：1255-64(1989)；De Bruijn等，Eur.J.Immunol.22：3013-20(1992)；兹将其公开内容引入作为参考)。
然后所得的成熟致敏树突细胞与T细胞，例如原初T细胞共温育。T细胞或T细胞亚群可从许多淋巴组织中获取用作为应答细胞。这样的组织包括但不限于脾、淋巴结和/或外周血。细胞可以以混合的T细胞群或者作为纯化的T细胞亚群与成熟致敏树突细胞共温育。T细胞的纯化可通过正或负选择，包括但不限于，利用针对CD2、CD3、CD4、CD8等的抗体实现。
通过使T细胞与成熟致敏树突细胞接触，提供了抗原反应性或激活的极化T细胞或T淋巴细胞。如本文所用的，术语“极化”是指产生高水平IFNγ或者以其它方式致敏诱导1型(Th-1)应答的T细胞。这种方法典型地包括使未成熟树突细胞与BCG和IFNγ接触以制备成熟致敏树突细胞。未成熟树突细胞可以在成熟期间或之前与预定抗原接触。未成熟树突细胞可以在成熟期间与T细胞(如原初T细胞)共培养，或者在成熟并致敏树突细胞诱导1型应答之后与T细胞(如原初T细胞)共培养。未成熟树突细胞或成熟树突细胞可在成熟前富集。此外，T细胞可以在与树突细胞接触前从淋巴细胞群中富集。在具体的实施方案中，富集或纯化的CD4+T细胞群与树突细胞接触。共培养成熟致敏树突细胞和T细胞导致刺激特异性T细胞，它成熟为抗原反应性CD4+T细胞或抗原反应性CD8+T细胞。
在另一方面，通过在朝诱导1型(Th-1)T细胞应答致敏的成熟树突细胞存在下培养细胞，提供了体外再刺激T细胞的方法。这种T细胞可选地可以在饲养细胞上培养。成熟致敏树突细胞可选地可在与T细胞接触前被辐射。合适的培养条件可以包括一种或多种细胞因子(例如纯化的IL-2、伴刀豆球蛋白A刺激的脾细胞上清或者白细胞介素 15(IL-15))。通过添加未成熟树突细胞、BCG、IFNγ和预定抗原在 体外再刺激T细胞，可被用来促进T细胞群的扩增。
稳定的抗原特异性极化T细胞培养物或T细胞系能够通过周期性的再刺激在体外长期维持。这样建立的T细胞培养物或T细胞系能够被贮藏，而且若保藏的话(例如通过冷藏剂配制并冷冻)，能够长久应用，用来在期望的时间间隔内重新提供激活的极化T细胞。
在某些实施方案中，激活的CD8+或CD4+T细胞可根据本发明的方法产生。典型地，用来产生抗原反应性极化T细胞的成熟致敏树突细胞与它们待给药的受试者是同源的(例如从该受试者获取的)。或者，与目的受体受试者具有相同HLA单元型的树突细胞可在体外利用来自HLA-匹配供体的非癌变细胞(如正常细胞)制备。在具体的实施方案中，抗原反应性T细胞，包括CTL和Th-1细胞，在体外扩增作为免疫刺激的细胞来源。
细胞群的体内给药
在本发明另一方面，提供了向需要免疫刺激的受试者给药成熟致敏树突细胞、或者激活的极化T细胞、或者含有这类细胞的细胞群的方法。这种细胞群可以包括成熟致敏树突细胞群和/或激活的极化T细胞群。在某些实施方案中，这种方法通过获得树突细胞前体或未成熟树突细胞，在BCG、IFNγ和预定抗原存在下分化和成熟那些细胞，以形成朝Th-1应答致敏的成熟树突细胞群来进行。未成熟树突细胞可以在成熟之前或期间与抗原接触。这种成熟致敏树突细胞可以直接向需要免疫刺激的受试者给药。
在有关的实施方案中，成熟致敏树突细胞可以与来自受试者的淋巴细胞接触，以刺激该淋巴细胞群内的T细胞。激活的极化淋巴细胞，可选地在细胞培养物中克隆扩增抗原反应性CD4+和/或CD8+T细胞 之前，可以向需要免疫刺激的受试者给药。在某些实施方案中，激活的极化T细胞与受试者是自体的。
在另一个实施方案中，树突细胞、T细胞以及受体受试者具有相同的MHC(HLA)单元型。确定受试者HLA单元型的方法是本领域公知的。在有关的实施方案中，树突细胞和/或T细胞与受体受试者是同种异体的。举例来说，树突细胞可以与T细胞及受体是同种异体的，它们具有相同的MHC(HLA)单元型。同种异体的细胞典型地至少一个MHC等位基因相匹配(例如共享至少一个但不是所有的MHC等位基因)。在不太典型的实施方案中，树突细胞、T细胞以及受体受试者相互之间而言是同种异体的，但都具有至少一个共同的MHC等位基因。
根据一个实施方案，T细胞从与获取未成熟树突细胞的同一个受试者中获得。在体外成熟和极化后，向受试者给药该自体T细胞，以激发和/或增强现有的免疫应答。举例来说，T细胞可以通过静脉内输注给药，举例来说，以大约108-109细胞/m2体表面积的剂量给药(参见Ridell等，Science 257：238-41(1992)，兹引入作为参考)。可以在期望的时间间隔，例如按月重复输注。可以在T细胞输注期间和之后监测受体不良效应的任何迹象。
根据另一个实施方案，根据本发明用BCG和IFNγ成熟的树突细胞可以直接注射到肿瘤或含有靶抗原的其它组织内。这种成熟细胞能够摄取抗原并将抗原呈递给体内T细胞。
附图说明
图1描述了未成熟DC响应于数量增加的BCG或数量增加的BCG和干扰素γ(IFNγ)组合而导致的IL-12p70的生产情况。
实施例
下列实施例仅仅是为了举例说明本发明的各个方面而提供的，因而不应当诠释为是以任何方式限制本发明。
实施例1：在不同成熟条件下产生的IL-10和IL-12：
在这个实施例中，测定了与成熟因子BCG和/或IFNγ接触的未成熟树突细胞群的细胞因子的产生。未成熟DC通过使外周血单核细胞在补充有1％人血浆的 
培养基(Gibco-BRL)存在下与塑料接触而制备。通过洗涤除去未结合的单核细胞。结合的单核细胞在 培养基中在存在500U GM-CSF和500U IL-4每毫升情况下培养6天。
在第1个研究中，未成熟树突细胞通过添加失活的BCG成熟。测定了所得的成熟树突细胞的细胞因子的产生。向在 
培养基中的未成熟树突细胞中加入不同浓度的失活的BCG，接着于37℃培养24小时。每毫升添加的BCG稀释液示于表中，起始于4.1×108 cfu/ml的贮液。细胞因子的产生通过ELISA试验、利用针对待检测细胞因子的抗体测定。简要地，利用细胞因子特异性抗体(如IL-12或IL-10)将捕获固相表面上的细胞因子。然后用抗细胞因子的第二标记抗体处理固相表面，以检测捕获的细胞因子的存在。二抗典型地用酶标记以便于通过比色分析检测。代表实验的结果显示于下文表1中。细胞因子的量，或者细胞因子的产量，以pg/ml阐述。
表1
用BCG成熟的DC产生的IL-10和IL-12
| 供体 | 检测的 细胞因子 | 无添加 的因子 | BCG 1∶100 | BCG 1∶250 | BCG 1∶500 | BCG 1∶1000 | TNFα+ IL-1β |
| 2 | IL-12p70 | ＜5 | 393 | 239 | 335 | ＜5 | ＜5 |
| IL-12p40 | nd | nd | 2852 | nd | nd | nd | |
| 2 | IL-10 | 76.5 | 1206 | 700 | 338 | 153 | 380 |
[0072]
| 2 | p70/IL-10 | ＜0.06 | 0.33 | 0.34 | 1 | ＜0.03 | ＜0.01 |
| 3 | IL-12p70 | 249 | 318 | 260 | 74 | ＜5 | ＜5 |
| IL-12p40 | nd | nd | 12257 | nd | nd | nd | |
| 3 | IL-10 | 305 | 426 | 162 | 124 | ＜5 | 70 |
| p70/IL-10 | 0.82 | 0.75 | 1.60 | 0.60 | nd | ＜0.07 |
(″nd″指未测)
参照表1，结果证明添加BCG能够增加细胞因子IL-12、IL-10或其亚基的产量，虽然细胞因子产量的相对和绝对水平都是供体依赖性的。最高水平的增加见于IL-12p40和IL-10，提示所观察到的相对于IL-12p40的水平而言的低水平IL-12p70(由p35和p40亚基组成)，是由于缺乏IL-12p35产物。在所有条件下，除了一个存在BCG的情况之外，IL-12p70的水平与IL-10的比例小于或等于1，表明未成熟树突细胞在单独存在BCG情况下的成熟很可能使原初T细胞朝Th-2应答极化。
还测定了在相似条件下引入IFNγ的效果，并列于下表2中。细胞因子产量如上文所述测量。比较表1和2，显然在成熟因子(如BCG)存在的情况下添加IFNγ增加IL-12p70的产生。特别地，在成熟期间添加IFNγ连同BCG增加IL-12p35产量，并降低IL-10的产量。结果，IL-12p70与IL-10的比例在添加IFNγ连同BCG时总是大于1。在有些供体中，以及在某些条件下，IL-12p70与IL-10产量的比例可通过添加IFNγ连同BCG被提高到大于大约100∶1。因此，这些结果令人惊讶地证明添加IFNγ连同成熟因子BCG能够显著地增加IL-12p70的产量。
表2
用BCG和IFNγ成熟的DC产生的IL-10和IL-12
| 供体 | 细胞因子 | 仅有 IFNγ | BCG1∶100 +IFNγ | BCG1∶250 +IFNγ | BCG1∶500 +IFNγ | BCG 1∶1000 +IFNγ | TNFα +IL1β +IFNγ |
| 2 | IL-12p70 | ＜5 | 1223 | 801 | 848 | 461 | 521 |
| IL-12p40 | ＜5 | nd | 23751 | 19362 | 8666 | Nd | |
| 2 | IL-10 | ＜5 | 470 | 510 | 394 | 179 | 95 |
| p70/IL-10 | 2.60 | 1.57 | 2.15 | 2.58 | 5.48 | ||
| 3 | IL-12p70 | 212 | 6858 | 5380 | 2934 | 949 | 231 |
| IL-12p40 | ＜5 | nd | 48351 | nd | 16164 | 25645 | |
| 3 | IL-10 | 141 | 254 | 241 | 157 | ＜5 | 163 |
| p70/IL-10 | 1.50 | 27 | 22 | 18 | ＞189 | 1.41 |
(″nd″指未测)
实施例2：IFNγ对IL-10的下调是剂量依赖性的：
在这个实施例中，证明了IFNγ联合BCG下调树突细胞群IL-10产量的能力。未成熟树突细胞如上文所述制备。未成熟树突细胞单独孵育、在两种浓度之一的BCG(来自4.1×108cfu/ml贮液的1∶1000或1∶250稀释液)存在的条件下成熟、或者单独暴露于0U到1000U每毫升范围内的IFNγ。通过ELISA(同前)利用商业上可获得的抗体(例如R&D Systems，Minneapolis，MN)测量所得的树突细胞的IL-10产量，并以pg/ml报告。在对照组中，单独培养的未成熟DC(未添加BCG或IFNγ)不产生可检测的IL-10。相反，在IFNγ单独存在下培养的DC产生小量的IL-10(大约20-30pg/ml)。产生的IL-10的量在10U到1000U IFNγ每毫升的范围内不是剂量依赖性的。
相反，在BCG单独存在条件下成熟制备的DC产生大量的IL-10∶在BCG贮液1∶1000或1∶250倍稀释液存在情况下分别产生大约150pg/ml或＞250pg/ml的IL-10。在DC成熟期间向BCG添加IFNγ导致IL-10产量以剂量依赖性的方式下调。对于在BCG 1∶1000稀释液存 在条件下培养的DC，IL-10产量从大约150pg/ml IL-10(无IFNγ)降至大约20-30pg/ml IL-10(1000U IFNγ)。对于在BCG 1∶250稀释液存在条件下培养的DC，IL-10产量从大约270pg/ml IL-10(无IFNγ)降至大约50pg/ml IL-10(1000U IFNγ)。因此，未成熟DC在BCG和IFNγ存在条件下成熟能够下调IL-10产量，并克服由BCG单独诱导的对IL-10产生的明显刺激。
实施例3：IFNγ对IL-12的上调是剂量依赖性的：
在这个实施例中，证明了IFNγ上调IL-10产量的能力。未成熟树突细胞来源于在GM-CSF和IL-4存在条件下生长6天的单核细胞培养物，如上所述。未成熟DC单独用各种稀释度的BCG、或者用BCG联合各种浓度的IFNγ额外处理两天。通过ELISA试验测试培养物上清中IL-12p70的存在，如上所述。
代表实验的结果显示在图1中。对于每一个培养物，结果一式三份进行测定。响应增加量的单独的BCG，成熟DC产生相对低(＜1000pg/ml)平均浓度的IL-12p70。产生的IL-12的量以剂量依赖性的方式随着BCG量的增加而下降。相反，在添加IFNγ(10U/ml)连同BCG(贮液的1∶1000稀释液)时，IL-12的量显著升至大约5000pg/ml。在添加100U/ml IFNγ连同BCG(贮液的1∶1000稀释液)时，IL-12的量升至几乎20,000pg/ml。添加500U/ml或1000U/ml IFNγ连同BCG(贮液的1∶1000稀释液)分别产生大约21,000pg/ml和22,000pg/ml水平的IL-12。
综上所述，虽然单独的BCG似乎拮抗IL-12的产生，未成熟DC在BCG和IFNγ存在条件下的成熟显著增加IL-12产量。
实施例4：抗原特异性T细胞的刺激：
在这个实施例中，在BCG和IFNγ存在条件下成熟的未成熟DC 被证明刺激抗原特异性T细胞产生IFNγ。流感病毒A特异性的T细胞系通过在补充有5％人血清的 养基中温育2×106细胞/ml的外周血单核细胞(PBMC)和5μg/ml流感病毒M1肽(GILGFVFTL；SEQ ID NO：3)产生。这些培养条件导致流感病毒M1肽特异性的那些T细胞的选择性扩增。在培养2天后，向培养物中添加20U/ml IL-2和5ng/ml IL-15。在大约7到14天的培养后，将T细胞系置于无细胞因子的培养基中过夜。
然后将抗原特异性T细胞与未成熟DC、与单独用BCG成熟的DC、或者与用BCG和IFNγ成熟的DC共温育。抗原特异性T细胞与DC的比例为1∶1。T细胞和DC于37℃温育24小时。DC或直接荷载或渗透荷载流感病毒M1肽。简要地，从培养瓶中收集未成熟DC，并通过离心浓缩。对于渗透荷载，细胞被悬浮于小体积的高渗介质中，接着添加等体积的溶于PBS的流感病毒M1肽。在冰上温育10分钟之后，细胞被彻底洗涤。对于直接荷载，细胞被悬浮于等体积的 培养基和溶于PBS的流感病毒M1肽，并于37℃温育1小时。细胞在37℃温育2小时以允许抗原加工。
在T细胞和DC共温育之后，通过ELISA定量100μl培养物上清样品中的IFNγ测量T细胞应答。结果显示，与DC荷载方法无关，用BCG和IFNγ刺激的DC是抗原特异性T细胞的超级刺激物。与未成熟DC共培养的T细胞产生非常少的IFNγ(＜2,000pg/ml)，而与单独利用BCG成熟的DC共培养的T细胞是IFNγ的中级生产者(＞5,000pg/ml)。与利用BCG和IFNγ成熟的DC共培育的T细胞产生高水平的IFNγ(对于渗透荷载的DC是＞20,000pg/ml，或对于直接荷载的DC是＞25,000pg/ml)。
因此，用BCG和IFNγ成熟的DC是抗原特异性T细胞较好的刺激物，不依赖于DC荷载抗原的方法。
实施例5：体外抗原特异性T细胞应答的重新产生：
匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin(KLH))特异性的T细胞系通过利用或者由BCG、或者由BCG和IFNγ成熟的、并且荷载有KLH或对照蛋白的DC，以10∶1的T细胞与DC比例刺激PBMC产生。每隔3到4天向T细胞和成熟的DC提供新鲜的培养基(补充有5％人AB血清、20U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的 培养基)。细胞按照需要可扩增至较大的烧瓶中。因为对某一抗原的整体前体频率低，并且因为原初细胞需要强有力的刺激产生应答，所以在10-21天的时间间隔内重复3-4次刺激。使细胞在再刺激前在无细胞因子的培养基中过夜恢复。
使用标准的3天胸苷掺入试验测试刺激的T细胞系的KLH-特异性细胞增殖。刺激的T细胞按不同的DC与T细胞比例与KLH-脉冲的未成熟树突细胞温育。T细胞增殖以每分钟计数(CPM)测量。响应刺激的细胞增殖、或细胞因子的产生被认为是抗原特异性应答的证据。为控制抗原特异性，还在试验中包括了阴性对照抗原(流感病毒A)。
当利用单独利用BCG成熟的DC来刺激T细胞时，T细胞增殖总是较低(＜5,000CPM)。无论DC与KLH或者流感病毒A接触这种低水平的增殖都是低的。还在与未成熟DC温育中观察到低水平的增殖。在所用的效应物与刺激物比例为50∶1、25∶1或12.5∶1(T细胞比DC)的3组DC之间没有观察到显著的差异。作为对照，用BCG和IFNγ成熟的树突细胞被用来刺激T细胞，与未成熟DC或者用流感病毒A脉冲的成熟DC相比，KLH-脉冲的DC总是诱导较高的T细胞增殖(大约10,000-33,000CPM)。对于用KLH抗原脉冲的成熟DC，T细胞增殖与效应物和刺激物比例的增加成比例地增加。
还通过细胞因子分泌监测T细胞效应物功能。利用或者单独由 BCG或者由BCG和IFNγ成熟的DC刺激KLH特异性T细胞系(如上文所述产生)。在细胞用抗-CD3抗体(50ng/ml)和PMA(5ng/ml)非特异性刺激后，通过胞内细胞因子染色测试刺激的T细胞系的细胞因子产量。以产生特定细胞因子的细胞百分比测量细胞因子产量。非常低至不可检测百分比的(＜＜5％)细胞样品产生胞内IL-2、IL-4、IL-5或IL-10。在由利用BCG和IFNγ成熟的DC刺激的T细胞中未检测到IL-5和IL-10。由单独用BCG成熟的DC刺激的T细胞产生低水平的IFNγ(＜10％)和TNF-α(＜15％)。相反，较多的由利用IFNγ和BCG成熟的DC刺激的T细胞产生IFNγ(大约35％)和TNFα(＞45％)。IFNγ是已知的IL-12产生的刺激物。因此，通过用由BCG和IFNγ成熟的DC刺激T细胞，T细胞朝1型(Th-1)应答方向极化。
实施例6：Th-1细胞因子肿瘤坏死因子α(TNFα)的诱导：
在这个实施例中，证明了BCG和IFNγ组合上调1型细胞因子肿瘤坏死因子α(TNFα)的能力。简要地，未成熟树突细胞如上文所述获得，并在GM-CSF和IL-4存在条件下生长。用BCG单独或者联合IFNγ培养未成熟DC 24小时。随后，添加蛋白转运抑制剂(GolgiPlugTM，PharMingen)，以阻断产生的细胞因子从高尔基复合体的转运，并过夜温育细胞。然后收集细胞，透化处理，并用TNFα特异性荧光标记抗体或同型对照抗体利用本领域公知的方法内部染色。利用FACS分析确定TNFα阳性DC的频率以及细胞的荧光强度(表3)。发现在IFNγ存在条件下用BCG成熟的DC可增强DC产生Th-1细胞因子TNFα的能力。
表3
在存在BCG、有或没有IFNγ的条件下成熟的DC产生的TNFα
实施例7：针对细胞相关联抗原的应答的诱导：
这个实施例证明在BCG和IFNγ存在条件下成熟的DC与单独用BCG成熟的DC相比，可引发显著更高的肿瘤特异性T细胞IFNγ释放以及相似水平的抗原特异性细胞毒性。如上文所示分离未成熟树突细胞，并在GM-CSF和IL-4存在条件下培养。然后DC荷载预先用表达绿色荧光蛋白(GFP)或者流感病毒A M1蛋白的重组腺病毒感染的完整肿瘤细胞(A549)。24小时后，DC用BCG或者BCG联合IFNγ成熟。荷载肿瘤的DC或GFP或M1-表达肿瘤细胞被用来刺激自体的M1-特异性T细胞系。24小时后，收集细胞培养物上清，并进行标准IFNγELISA。只有荷载M1-表达肿瘤细胞的DC能够刺激IFNγ释放，而且在BCG加上IFNγ中成熟的DC比未成熟或BCG成熟的DC能显著更有力地诱导这种应答。
表4
针对细胞相关联抗原的应答的诱导
提供前面的实施例是用来举例说明，但并非限制所主张发明的范围的。本发明的其它变体对于本领域普通技术人员是显而易见的，并涵盖在所附的权利要求中。本文所引用的所有的出版物、专利、专利申请和其它参考文献也都在此全文引入作为参考。
Claims (39)
1.制备成熟树突细胞群的体外方法，包括：
提供未成熟树突细胞；并
使未成熟树突细胞与有效量的卡介苗和干扰素γ在适于未成熟树突细胞成熟的培养条件下接触以形成成熟树突细胞群；
其中该成熟树突细胞群比在成熟期间未与卡介苗和干扰素γ接触的未成熟树突细胞群产生升高的白细胞介素12∶白细胞介素10比例。
2.权利要求1的方法，进一步包括使未成熟树突细胞在与卡介苗和干扰素γ接触之前与预定抗原接触。
3.权利要求1的方法，进一步包括使未成熟树突细胞与预定抗原、卡介苗和干扰素γ同时接触。
4.权利要求2或3的方法，其中预定抗原是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、细胞裂解物、膜制备物、重组制备的抗原、肽抗原或者分离的抗原。
5.权利要求1的方法，进一步包括：
分离单核树突细胞前体；和
在分化因子存在下培养所述前体，以形成未成熟树突细胞。
6.权利要求5的方法，其中分化因子是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4的组合、或者白细胞介素13。
7.权利要求5的方法，其中单核树突细胞前体分离自人类受试者。
8.权利要求1的方法，其中成熟树突细胞产生白细胞介素12∶白细胞介素10的比例为至少大约1∶1。
9.权利要求1的方法，其中成熟树突细胞产生白细胞介素12∶白细胞介素10的比例为至少大约10∶1。
10.权利要求1的方法，其中成熟树突细胞产生白细胞介素12∶白细胞介素10的比例为至少大约100∶1。
11.制备成熟树突细胞群的体外方法，包括：
提供未成熟树突细胞；和
使未成熟树突细胞与有效量的卡介苗和干扰素γ在适于未成熟树突细胞成熟的培养条件下接触以形成成熟树突细胞群；
其中该成熟树突细胞群产生1型免疫应答。
12.权利要求11的方法，进一步包括使未成熟树突细胞在与卡介苗和干扰素γ接触之前与预定抗原接触。
13.权利要求11的方法，进一步包括使未成熟树突细胞与预定抗原、卡介苗和干扰素γ同时接触。
14.权利要求12或13的方法，其中预定抗原是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达抗原的重组细胞、细胞裂解物、膜制备物、重组制备的抗原、肽抗原或者分离的抗原。
15.权利要求11的方法，进一步包括：
分离单核树突细胞前体；和
在分化因子存在下培养所述前体，以形成未成熟树突细胞。
16.权利要求15的方法，其中分化因子是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4的组合、或者白细胞介素13。
17.权利要求11的方法，其中单核树突细胞前体分离自人类受试者。
18.权利要求11的方法，其中成熟树突细胞产生白细胞介素12∶白细胞介素10的比例为至少大约1∶1。
19.权利要求11的方法，其中成熟树突细胞产生白细胞介素12∶白细胞介素10的比例为至少大约10∶1。
20.权利要求11的方法，其中成熟树突细胞产生白细胞介素12∶白细胞介素10的比例为至少大约100∶1。
21.激活T细胞的组合物，包括：
用有效浓度的卡介苗和干扰素γ在适合成熟的条件下成熟的树突细胞群；和
预定抗原；
其中该树突细胞群比在成熟期间与卡介苗接触而未接触干扰素γ的成熟树突细胞群产生升高的白细胞介素12∶白细胞介素10比例。
22.权利要求21的组合物，其中树突细胞群产生白细胞介素12∶白细胞介素10的比例为至少大约10∶1。
23.权利要求21的组合物，其中树突细胞群产生白细胞介素12∶白细胞介素10的比例为至少大约100∶1。
24.分离的细胞群，包括：
分离的未成熟单核树突细胞，以及有效浓度的卡介苗和干扰素γ以诱导该未成熟树突细胞成熟；
其中所得的成熟树突细胞群产生比白细胞介素10多的白细胞介素12。
25.权利要求24的细胞群，进一步包括预定抗原。
26.权利要求24的细胞群，进一步包括分离的T细胞。
27.权利要求26的细胞群，其中T细胞是原初T细胞。
28.权利要求24的细胞群，进一步包括分离的淋巴细胞。
29.制备经致敏诱导抗源性Th-1应答的T细胞的体外方法，包括：
提供未成熟树突细胞；
使未成熟树突细胞与预定抗原接触；
使未成熟树突细胞与有效浓度的卡介苗和干扰素γ在适合未成熟树突细胞成熟的培养条件下接触以形成成熟树突细胞；和
使成熟树突细胞与原初T细胞接触以形成产生干扰素γ的激活的T细胞。
30.权利要求29的方法，其中预定抗原是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、肿瘤细胞、细菌细胞、表达抗原的重组细胞、细胞裂解物、膜制备物、重组制备的抗原、肽抗原或者分离的抗原。
31.权利要求29的方法，其中未成熟树突细胞与预定抗原、卡介苗和干扰素γ同时接触。
32.权利要求29的方法，进一步包括：
分离单核树突细胞前体；和
在分化因子存在下培养所述前体，以形成未成熟树突细胞。
33.权利要求32的方法，其中分化因子是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4的组合、或者白细胞介素13。
34.权利要求32的方法，其中单核树突细胞前体分离自人类受试者。
35.权利要求29的方法，其中未成熟树突细胞和T细胞相互之间是自体的。
36.分离的产生比白细胞介素10多的白细胞介素12的成熟树突细胞，其通过用包括有效浓度的卡介苗和干扰素γ的组合物在适于树突细胞成熟的条件下使未成熟树突细胞成熟来制备的。
37.权利要求36的分离的成熟树突细胞，进一步包括预定抗原。
38.荷载有预定抗原的分离的成熟树突细胞，该树突细胞产生比白细胞介素10多的白细胞介素12。
39.权利要求38的分离的成熟树突细胞，其中细胞产生比白细胞介素10至少多10倍的白细胞介素12。
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