ES2766299T3 - Composiciones y procedimientos para la activación linfocitaria de células dendríticas monocíticas y células T para generar una respuesta Th-1 - Google Patents
Composiciones y procedimientos para la activación linfocitaria de células dendríticas monocíticas y células T para generar una respuesta Th-1 Download PDFInfo
- Publication number
- ES2766299T3 ES2766299T3 ES10181985T ES10181985T ES2766299T3 ES 2766299 T3 ES2766299 T3 ES 2766299T3 ES 10181985 T ES10181985 T ES 10181985T ES 10181985 T ES10181985 T ES 10181985T ES 2766299 T3 ES2766299 T3 ES 2766299T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- dendritic cells
- antigen
- bcg
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 242
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 119
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 230000004044 response Effects 0.000 title description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 14
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 title description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 title description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 138
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 138
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 138
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims abstract description 46
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 claims abstract description 44
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 claims abstract description 37
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 12
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 56
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 31
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 26
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 26
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims description 26
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 19
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 11
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 9
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 claims description 5
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims 2
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 abstract description 104
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 abstract description 104
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 84
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 32
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 25
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 21
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 18
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 18
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 15
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 12
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 10
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 10
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 230000031261 interleukin-10 production Effects 0.000 description 9
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 8
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 7
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 6
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 5
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 4
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- -1 poly-dldC Chemical compound 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 4
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 3
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 3
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 2
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003205 Vasoactive Intestinal Peptide Proteins 0.000 description 2
- 102400000015 Vasoactive intestinal peptide Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003570 air Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000001342 constant potential amperometry Methods 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N invicorp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- VHVVPYOJIIQCKS-QEJZJMRPSA-N Ala-Leu-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 VHVVPYOJIIQCKS-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- 101000980996 Arabidopsis thaliana Phosphatidate cytidylyltransferase 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BDISFWMLMNBTGP-NUMRIWBASA-N Glu-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BDISFWMLMNBTGP-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 1
- 108010088729 HLA-A*02:01 antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000986087 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000623713 Homo sapiens Motile sperm domain-containing protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KYIIALJHAOIAHF-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 KYIIALJHAOIAHF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100023091 Motile sperm domain-containing protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- HBZBPFLJNDXRAY-FXQIFTODSA-N Ser-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HBZBPFLJNDXRAY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000012080 ambient air Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000008119 colloidal silica Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004544 dc2 Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011124 ex vivo culture Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 102000046689 human FOLH1 Human genes 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 108010061181 influenza matrix peptide (58-66) Proteins 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000029069 type 2 immune response Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5428—IL-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5434—IL-12
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
- A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/72—Undefined extracts from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
Abstract
Un procedimiento ex vivo o in vitro para producir células T activadas que comprende: poner en contacto las células dendríticas inmaduras proporcionadas con una cantidad de bacilo Calmette-Guerin (BCG) que consiste en entre 105 y 107 ufc por ml de medio de cultivo tisular y entre 100 y 1000 unidades de interferón gamma (IFNγ) por ml de medio de cultivo tisular y un antígeno predeterminado en condiciones de cultivo adecuadas para la maduración de las células dendríticas inmaduras, al objeto de formar células dendríticas maduras o una población de células dendríticas maduras; donde la población de células dendríticas maduras produce al menos 10 veces más interleuquina 12 que interleuquina 10 que una población de células dendríticas similares cultivada en presencia de BCG sin IFNγ,y poner en contacto las células dendríticas maduras con células T vírgenes para formar células T activadas que producen IFNγ, y donde las células T activadas producen una respuesta inmunitaria de tipo 1.
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos para la activación linfocitaria de células dendríticas monocíticas y células T para generar una respuesta Th-1
Antecedentes de la invención
Las células presentadoras de antígeno (CPA) son importantes para provocar una respuesta inmunitaria efectiva. No solamente presentan antígenos de células T con receptores de linfocitos T de antígeno específico, sino que también proporcionan las señales necesarias para la activación de las células T. Estas señales todavía no se han definido por completo, pero implican a diversas moléculas de superficie celular, así como receptores. Los factores necesarios para la activación de células T vírgenes (que todavía no han sido expuestas al antígeno) o no polarizadas pueden ser diferentes de los necesarios para la reactivación de las células T con memoria. La capacidad de las CPA tanto de presentar los antígenos como de proporcionar señales para la activación de las células T se denomina generalmente función celular accesoria. A pesar de que se ha demostrado que los monocitos y las células B son CPA competentes, sus capacidades de presentación de antígeno in vitro parecen limitarse a la reactivación de células T previamente sensibilizadas. Por tanto, no son capaces de activar directamente poblaciones de células T no activadas o funcionalmente vírgenes.
Las células dendríticas (CD) son las células presentadoras de antígeno profesionales del sistema inmunitario que se consideran capaces de activar tanto células T vírgenes como células T con memoria. Las células dendríticas se preparan ex vivo cada vez con mayor frecuencia para su uso en inmunoterapias, particularmente la inmunoterapia del cáncer. La preparación de células dendríticas con propiedades inmunoestimuladoras ópticas exige conocer y explotar la biología de estas células para el cultivo ex vivo. Se han descrito diversos protocolos para el cultivo de estas células, con diversas ventajas atribuidas a cada uno de ellos. Los protocolos recientes incluyen el uso de medios sin suero y el empleo de condiciones de maduración que imparten las propiedades inmunoestimuladoras deseadas a las células cultivadas.
La maduración de células dendríticas es el proceso que convierte las CD inmaduras, que son similares fenotípicamente a las células de Langerhans de la piel, en células presentadoras de antígeno maduras que pueden migrar a los nódulos linfáticos. Este proceso provoca la pérdida de la potente capacidad de absorción de antígeno que caracteriza a las células dendríticas inmaduras y la regulación al alza de la expresión de moléculas de superficie celular coestimuladoras y diversas citoquinas. Los protocolos de maduración conocidos se basan en el entorno in vivo que se cree que las CD se encuentran durante o después de la exposición a antígenos. El mejor ejemplo de este planteamiento es el uso de medios condicionados por monocitos (MCM) como medio de cultivo celular. El MCM se genera in vitro mediante el cultivo de monocitos y se utiliza como fuente de factores de maduración. Los principales componentes del MCM responsable de la maduración documentados son las citoquinas pro(inflamatorias) interleuquina 1 beta (IL-1p), interleuquina 6 (IL-6) y el factor alfa de necrosis tumoral (TNFa). Otros factores de maduración incluyen la prostaglandina E2 (PGE2), poli-dldC, péptido intestinal vasoactivo (VIP), lipopolisacárido bacteriano (LPS), así como micobacterias o componentes de micobacterias, como componentes específicos de la pared celular.
Las células dendríticas totalmente maduras difieren cualitativa y cuantitativamente de las CD inmaduras. Las CD totalmente maduras expresan unos niveles más elevados de antígenos de MHC clase I y clase II, así como de moléculas coestimuladoras de células T, es decir, CD80 y CD86. Estos cambios aumentan la capacidad de las células dendríticas para activar las células T porque incrementan la densidad de antígeno sobre la superficie celular, así como la magnitud de la señal de activación de células T a través de las contrapartes de las moléculas coestimuladoras de las células T, por ejemplo CD28. Por otra parte, las CD maduras producen grandes cantidades de citoquinas, que estimulan y dirigen la respuesta de las células T. Dos de estas citoquinas son la interleuquina 10 (IL-10) y la interleuquina 12 (IL-12). Estas citoquinas tienen efectos opuestos sobre la dirección de la respuesta de células T inducida. La producción de IL-10 produce la inducción de una respuesta de tipo Th-2, mientras que la producción de IL-12 produce una respuesta de tipo Th-1. Esta última respuesta resulta particularmente deseable cuando se pretende obtener una respuesta inmunitaria celular, como por ejemplo en la inmunoterapia del cáncer. Una respuesta de tipo Th-1 produce la inducción y diferenciación de linfocitos T citotóxicos (CTL), que son el brazo efector del sistema inmune celular. El brazo efector es sumamente efectivo para combatir el crecimiento tumoral. La IL-12 también induce el crecimiento de células asesinas naturales (NK) y presenta actividad antiangiogénica, dos armas antitumorales efectivas. Por tanto, el uso de células dendríticas que producen IL-12 resulta en teoría sumamente adecuado para la inmunoestimulación.
Se ha documentado que determinados agentes de maduración de las células dendríticas, como el lipopolisacárido bacteriano, CpG de ADN bacteriano, ARN de cadena doble y ligando CD40, provocan que las Cd inmaduras produzcan IL-12 y activan CD inmaduras para generar una respuesta Th-1. Por el contrario, las moléculas antiinflamatorias como IL-10, TGF-(5, PGE-2 y corticosteroides inhiben la producción de IL-12, y pueden activar las células para generar una respuesta Th-2.
Recientemente, se ha documentado una intensificación de la producción de IL-12 mediante células dendríticas,
combinando interferón gamma con determinados factores de maduración de células dendríticas, como el lipopolisacárido bacteriano (LPS) y CD40. Sin embargo, tanto LPS como CD40 tienen la capacidad conocida de inducir pequeñas cantidades de IL-12 durante la maduración. Por tanto, es posible que la adición de IFNy simplemente intensifique dicha producción. Las señales del interferón gamma utilizan la vía Jak2-Stat1, que incluye fosforilación de tirosina del residuo de tirosina de la posición 701 de StatI antes de su migración al núcleo con la consiguiente intensificación de la transcripción de los genes que reaccionan al interferón gamma. No obstante, se sabe muy poco acerca de las vías de transducción de la señal en células dendríticas obtenidas de monocitos humanos. No se ha determinado el mecanismo de acción del interferón gamma en estas células.
La cepa bovina atenuada (Mycobacterium bovis) de Mycobacterium tuberculosis, conocida como bacilo de Calmette-Guerin (BCG), se ha utilizado en la inmunoterapia del cáncer. En un ejemplo, la administración intravesical de BCG vivo ha demostrado ser efectiva para el tratamiento del cáncer de vejiga, aunque se desconoce el mecanismo para este tratamiento. Se ha postulado que los efectos de la administración de BCG están mediados por la inducción de una respuesta inmunitaria que ataca, por ejemplo, a las células cancerígenas. Se cree que el papel específico del BCG en esta respuesta es la de un inductor generalizado de la reactividad inmune, además de tener una función adyuvante en la presentación de antígenos tumorales al sistema inmune.
También se ha descubierto que el BCG es un potente agente de maduración para las células dendríticas, con la capacidad de regular al alza el marcador de maduración CD83. El BCG también puede regular al alza las moléculas de MHC y las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86, de forma concomitante con una reducción de la capacidad endocítica. Por otra parte, se ha documentado que el BCG, o los lipoarabidomananos obtenidos de BCG aumentan la producción de citoquina, aunque a diferencia de los resultados obtenidos con otros agentes de maduración de CD se concluyó que la producción de IL-12 se inhibe de forma específica. Esta última propiedad, la inhibición de la producción de IL-12, reduce el atractivo del uso de BCG para la maduración de células dendríticas para la inmunoterapia en la que se desea una fuerte respuesta citotóxica mediada por células (respuesta Th-1).
Por tanto, el uso de BCG en la inmunoterapia activa tiene el potencial de inducir la maduración de las células dendríticas. Sin embargo, se necesitan composiciones y procedimientos de uso de estas composiciones que induzcan dicha maduración de las células dendríticas y que ofrezcan simultáneamente una amplia estimulación inmune, y que activen estas células dendríticas para una respuesta inmunitaria de tipo 1 (Th-1) con una fuerte respuesta de las células T citotóxicas.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento ex vivo o in vitro para producir células T activadas de acuerdo con las reivindicaciones. En un aspecto, el procedimiento incluye producir una población de células dendríticas maduras, incluyendo células dendríticas inmaduras; y poner en contacto las células dendríticas inmaduras con una concentración efectiva de BCG e interferón gamma (IFNy) en condiciones de cultivo adecuadas para la maduración de las células dendríticas inmaduras a fin de formar una población de células dendríticas maduras. La población de células dendríticas maduras produce una mayor relación de interleuquina 12 a interleuquina 10 que una población de células dendríticas inmaduras que no ha estado en contacto con BCG e IFNy solo durante la maduración. Las células dendríticas inmaduras se pueden poner en contacto con un antígeno predeterminado antes del contacto con el BCG y el IFNy o durante dicho contacto. El antígeno predeterminado puede ser, por ejemplo, un antígeno de tumor específico, un antígeno asociado a un tumor, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, células tumorales, células bacterianas, células recombinantes que expresan un antígeno, un lisado celular, una preparación de membrana, un antígeno producido mediante técnicas de recombinación, un antígeno peptídico (por ejemplo, antígeno de un péptido sintético) o un antígeno aislado.
En determinadas realizaciones, el procedimiento puede incluir también de forma opcional el aislamiento de precursores de células dendríticas monocíticas y el cultivo de los precursores en presencia de un agente de diferenciación para formar una población de células dendríticas inmaduras. Entre los agentes de diferenciación adecuados se incluyen, por ejemplo, GM-SCF, interleuquina 4, una combinación de GM-CSF e interleuquina 4, o interleuquina 13. Los precursores de células dendríticas monocíticas se pueden aislar de un sujeto humano. En una realización concreta de la divulgación, las células dendríticas maduras producen una relación de Il-12 a IL-10 de al menos 1:1.
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un procedimiento para producir una población de células dendríticas maduras. En términos generales, el procedimiento incluye proporcionar células dendríticas inmaduras; y poner en contacto las células dendríticas inmaduras con una cantidad efectiva de BCG e interferón gamma (IFNy) en condiciones de cultivo adecuadas para la maduración de las células dendríticas inmaduras a fin de formar una población de células dendríticas maduras. La población de células dendríticas maduras resultante produce un tipo de respuesta inmunitaria de tipo 1. Las células dendríticas inmaduras se pueden poner en contacto con un antígeno predeterminado antes del contacto con el BCG y el IFNy o durante dicho contacto. El antígeno predeterminado puede ser, por ejemplo, un antígeno de tumor específico, un antígeno asociado a un tumor, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, células tumorales, células bacterianas, células recombinantes que expresan un antígeno, un lisado celular, una preparación de membrana, un antígeno producido mediante técnicas de recombinación, un
antígeno peptídico (por ejemplo, un péptido sintético) o un antígeno aislado.
En determinas realizaciones, el procedimiento también puede incluir opcionalmente el aislamiento de precursores de células dendríticas monocíticas y el cultivo de los precursores en presencia de un agente de diferenciación para formar las células dendríticas inmaduras. Entre los agentes de diferenciación adecuados se incluyen, por ejemplo, GM-CSF, interleuquina 4, una combinación de GM-CSF e interleuquina 4, o interleuquina 13. Los precursores de células dendríticas monocíticas se aíslan de un sujeto humano. En una realización concreta de la divulgación, las células dendríticas maduras producen una relación de IL-12 a IL-I0 de al menos 1:1.
En otro aspecto de la divulgación, se proporcionan composiciones para activar las células T. Las composiciones pueden incluir una población de células dendríticas madurada con una concentración efectiva de BCG e IFNy en condiciones adecuadas para la maduración; y un antígeno predeterminado. La población de células dendríticas puede producir una relación mayor de interleuquina 12 (IL-12) a interleuquina 10 (IL-10) que una población de células dendríticas maduras que no ha estado en contacto con BCG e IFNy durante la maduración. La población de células dendríticas puede producir una relación de IL-12 a IL-10 de al menos 10:1. En otras realizaciones, la población de células dendríticas puede producir una relación mayor de IL-12 a IL-10 (de al menos 100:1) que una población de células dendríticas inmadura similar cultivada en presencia de BCG sin IFNy durante la maduración. En otro aspecto de la divulgación, se proporciona una población de células dendríticas inmaduras aisladas. La población de células incluye células dendríticas monocíticas inmaduras y una concentración efectiva de BCG e IFNy para inducir la maduración de las células dendríticas inmaduras. Las células dendríticas maduras resultantes producen más interleuquina 12 (IL-12) a interleuquina 10 (IL-10) que una población de células dendríticas inmaduras similar cultivada en presencia de BCG sin IFNy durante la maduración. La población de células puede incluir opcionalmente un antígeno predeterminado y/o células T aisladas, como células T vírgenes. Las células T pueden opcionalmente estar presentes en una preparación de linfocitos aislados.
También se proporciona un procedimiento para producir células T activadas. En términos generales, el procedimiento incluye proporcionar células dendríticas inmaduras; poner en contacto las células dendríticas inmaduras con un antígeno predeterminado; y poner en contacto las células dendríticas inmaduras con una concentración efectiva de BCG e IFNy en condiciones de cultivo adecuadas para la maduración de las células dendríticas inmaduras a fin de formar células dendríticas maduras. Las células dendríticas maduras se pueden poner en contacto con células T vírgenes para formar células T activadas que producen IFNy y/o polarizado para generar una respuesta de tipo 1 (Th-1). Entre los antígenos adecuados se incluyen, por ejemplo, un antígeno de tumor específico, un antígeno asociado a un tumor, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, células tumorales, células bacterianas, células recombinantes que expresan un antígeno, un lisado celular, una preparación de membrana, un antígeno producido mediante técnicas de recombinación, un antígeno peptídico (por ejemplo, antígeno de un péptido sintético) o un antígeno aislado.
Las células dendríticas inmaduras se pueden poner en contacto simultáneamente con el antígeno predeterminado, BCG e IFNy, o las células se pueden poner en contacto con el antígeno predeterminado antes de ponerse en contacto con BCG e IFNy. En determinadas realizaciones, el procedimiento también puede incluir el aislamiento de precursores de células dendríticas monocíticas y el cultivo de precursores en presencia de un agente de diferenciación para inducir la formación de las células dendríticas inmaduras. Entre los agentes de diferenciación adecuados se incluyen, por ejemplo, GM-CSF, interleuquina 4, una combinación de GM-CSF e interleuquina 4, o interleuquina 13. Los precursores de células dendríticas monocíticas se pueden aislar opcionalmente de un sujeto humano. En una realización concreta, las células dendríticas inmaduras y las células T son autólogas entre sí.
En otro aspecto de la divulgación también se proporcionan células dendríticas maduras aisladas que producen una mayor relación de interleuquina 12 (IL-12) a interleuquina 10 (IL-10). Las células dendríticas maduras se pueden proporcionar mediante la maduración de células dendríticas inmaduras con una composición que comprende concentraciones efectivas de BCG e IFNy en condiciones adecuadas para la maduración de las células dendríticas. Opcionalmente se puede incluir un antígeno predeterminado con las células dendríticas maduras aisladas. También se proporcionan células dendríticas maduras aisladas cargadas con un antígeno predeterminado. Las células dendríticas pueden producir más interleuquina 10 (IL-12) que interleuquina 10 (IL-10), por ejemplo, al menos 10 veces más IL-12 que IL-10 que una población de células dendríticas inmaduras similar cultivada en presencia de BCG sin IFNy durante la maduración.
La divulgación proporciona asimismo un procedimiento para producir una respuesta inmunitaria de tipo 1 (Th-1) en un animal. En términos generales, el procedimiento consiste en proporcionar células dendríticas inmaduras; poner en contacto las células dendríticas inmaduras con cantidades efectivas de BCG e interferón gamma (IFNy), y un antígeno predeterminado, en condiciones de cultivo adecuadas para la maduración de las células dendríticas inmaduras a fin de formar células dendríticas maduras. Las células dendríticas maduras se pueden administrar a un animal o se pueden poner en contacto con células T vírgenes para formar células T activadas, que se caracterizan por la producción de interferón gamma (IFNy) y/o factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). Las células T activadas se pueden administrar al animal que precisa la estimulación de una respuesta de células T citotóxicas al antígeno específico.
Entre los antígenos adecuados se incluyen, por ejemplo, un antígeno de tumor específico, un antígeno asociado a un tumor, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, células tumorales, células bacterianas, células recombinantes que expresan un antígeno, un lisado celular, una preparación de membrana, un antígeno producido mediante técnicas de recombinación, un antígeno peptídico (por ejemplo, antígeno de un péptido sintético) o un antígeno aislado. Opcionalmente, las células dendríticas inmaduras se pueden poner en contacto de forma simultánea con el antígeno predeterminado, BCG e IFNy, o las células dendríticas inmaduras se pueden poner en contacto con el antígeno predeterminado antes de ponerse en contacto con BCG e IFNy.
En determinas realizaciones de la divulgación, el procedimiento también puede incluir el aislamiento de precursores de células dendríticas monocíticas del animal y el cultivo de precursores en presencia de un agente de diferenciación para formar las células dendríticas inmaduras. El agente de diferenciación puede ser, por ejemplo, GM-CSF, interleuquina 4, una combinación de GM-CSF e interleuquina 4, o interleuquina 13.
Las células dendríticas inmaduras y las células T pueden ser autólogas del animal o alogénicas. Alternativamente, las células dendríticas inmaduras y las células T pueden tener el mismo haplotipo del MHC que el animal o compartir un marcador MHC. En determinadas realizaciones, el animal puede ser humano o puede ser un animal no humano.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación proporciona procedimientos para inducir la maduración de células dendríticas (CD) inmaduras y para activar esas células para una respuesta de células T citotóxicas de antígeno específico (respuesta Th-1). La presente divulgación también proporciona poblaciones de células dendríticas útiles para activar y para preparar poblaciones de células T polarizadas para la producción de citoquinas de tipo 1 (por ejemplo, IFNy, TNFa, y/o IL-2). Estas poblaciones de células dendríticas incluyen células dendríticas monocíticas inmaduras que se han puesto en contacto con BCG, IFNy y un antígeno predeterminado en condiciones de maduración adecuadas. Las células dendríticas inmaduras se pueden poner en contacto con el antígeno durante o antes de la maduración. Alternativamente, las células dendríticas monocíticas inmaduras, ya expuestas a antígeno (por ejemplo, in vivo) se pueden poner en contacto con BCG e IFNy en condiciones de maduración adecuadas. Las células dendríticas maduras resultantes son activadas para activar y polarizar células T para una respuesta de tipo 1. Una respuesta de tipo 1 incluye la producción de citoquinas de tipo 1 (por ejemplo, IFNy y/o IL-2), la producción de más IL-12 que IL-10, una respuesta de células T citotóxicas, la producción de células Th-1 y la producción de determinados tipos de anticuerpos. También se puede producir una regulación al alza del factor de necrosis tumoral (TNFa). Por el contrario, una respuesta de tipo 2 se caracteriza por la producción de IL-4, IL-5 e IL-10, la producción de más IL-10 que IL-12, la producción de las células Th-2 y la ausencia de inducción de respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL).
En un aspecto relacionado de la divulgación, se proporcionan composiciones que comprenden un agente de maduración para células dendríticas inmaduras, como precursores de células dendríticas monocíticas, que también pueden activar esas células dendríticas para una respuesta de tipo 1. Estas células dendríticas monocíticas activadas maduras pueden aumentar la presentación de un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I de un antígeno predeterminado, es decir un antígeno exógeno predeterminado. La presentación de MHC de clase I del antígeno es recomendable para inducir la diferenciación de linfocitos T citotóxicos (CTL) y la estimulación de lisis mediada por CTL de antígeno específico de las células diana. Estas composiciones incluyen BCG e IFNy que se pueden mezclar con una población de células que comprende células dendríticas inmaduras, para madurar las células dendríticas inmaduras y para convertir o superar la inhibición de IL-12 inducida por el contacto de las células dendríticas inmaduras con BCG. Las células dendríticas inmaduras que se ponen en contacto con estas composiciones se someten a maduración y producen típicamente mayores cantidades de IL-12 que de IL-10, en comparación con una población de células dendríticas inmaduras que ha estado en contacto solo con BCG.
En otro aspecto de la divulgación, los precursores de las células dendríticas monocíticas obtenidas de sujetos o donantes se pueden poner en contacto con citoquinas (por ejemplo, GM-CSF e IL-4) para obtener células dendríticas inmaduras. A continuación, las células dendríticas inmaduras se pueden poner en contacto con un antígeno predeterminado, sea en combinación con BCG e IFNy solo, o en combinación con una citoquina, para madurar las células dendríticas y activar linfocitariamente las células para inducir una respuesta inmunitaria de tipo 1 en las células T. En determinadas realizaciones, se estimula el procesamiento del complejo MHC de clase 1-antígeno, lo que resulta útil para provocar una respuesta de CTL contra células que presentan el antígeno predeterminado.
Las células dendríticas son una población diversa de células presentadoras de antígeno que se encuentran en diversos tejidos linfoides y no linfoides. (Véase Liu, Cell 106:259-262 (2001); Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9:271-296 (1991)). Las células dendríticas incluyen células dendríticas linfoides del bazo, células de Langerhans de la epidermis y células veliformes de la circulación sanguínea. Colectivamente, las células dendríticas se clasifican como un grupo en función de su morfología, elevados niveles de expresión de MHC de clase II en superficie y ausencia de determinados marcadores de superficie expresados en células T, células B, monocitos y células asesinas naturales. En particular, las células dendríticas obtenidas de monocitos (también denominadas células dendríticas monocíticas) normalmente expresan CD11c, CD80, CD86, y son HLA-DR+, pero son CD 14'.
En contraste, los precursores de células dendríticas monocíticas (monocitos típicos) son normalmente CD14+. Los precursores de células dendríticas monocíticas se pueden obtener de cualquier tejido en el que residen, en particular tejidos linfoides como el bazo, la médula ósea, los nódulos linfáticos y el timo. Los precursores de células dendríticas monocíticas también se pueden aislar del sistema circulatorio. La sangre periférica es una fuente de precursores de células dendríticas monocíticas de fácil acceso. La sangre del cordón umbilical es otra fuente de precursores de células dendríticas monocíticas. Los precursores de células dendríticas monocíticas se pueden aislar de diversos organismos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria. Estos organismos incluyen animales, por ejemplo, incluyendo seres humanos y animales no humanos, tales como primates, mamíferos (incluyendo perros, gatos, ratones y ratas), aves (incluyendo pollos), así como especies transgénicas de estos.
En determinadas realizaciones, los precursores de células dendríticas monocíticas y/o células dendríticas inmaduras se pueden aislar de un sujeto sano o de un sujeto que necesita inmunoestimulación, como, por ejemplo, un paciente con cáncer de próstata u otro sujeto para el que la inmunoestimulación celular puede resultar beneficiosa o recomendable (es decir, un sujeto que tiene una infección bacteriana o viral o similares). Los precursores de células dendríticas o las células dendríticas inmaduras también se pueden obtener de un individuo sano con un antígeno leucocitario humano (HLA) compatible para su administración al sujeto que necesita la inmunoestimulación.
Precursores de células dendríticas y células dendríticas inmaduras
Los procedimientos para aislar poblaciones de células enriquecidas para obtener precursores de células dendríticas y células dendríticas inmaduras de diversas fuentes, incluyendo la sangre y la médula ósea, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los precursores de células dendríticas y las células dendríticas inmaduras se pueden aislar recogiendo sangre heparinizada, mediante aféresis o leucaféresis, a través de la preparación de la capas leucocitarias, recomposición, centrifugación, centrifugación por gradiente de densidad (por ejemplo, utilizando Ficoll (como FICOLL-Pa Qu E®), PERCOLL® (partículas de sílice coloidal (15-30 mm de diámetro) recubiertas con polivinilpirrolidona (PVP) no dializable), sacarosa y similares), lisis diferencial de las células, filtración y similares. En determinadas realizaciones, se puede preparar una población de leucocitos, como, por ejemplo, recogiendo sangre de un sujeto, sometiéndola a defibrinación para eliminar las plaquetas y lisando los eritrocitos. Los precursores de células dendríticas y células dendríticas inmaduras se pueden enriquecer opcionalmente para obtener precursores de células dendríticas monocíticas, por ejemplo, mediante centrifugación por gradiente de PERCOLL®
Opcionalmente los precursores de células dendríticas y células dendríticas inmaduras se pueden preparar en un sistema aséptico cerrado. A efectos del presente, los términos "sistema aséptico cerrado" o "sistema cerrado" se refieren a un sistema en el que se minimiza o elimina la exposición al aire en circulación o ambiental no esterilizado o a otras condiciones no estériles. Por lo general, los sistemas cerrados para el aislamiento de precursores de células dendríticas y células dendríticas inmaduras excluyen la centrifugación por gradiente de densidad en tubos abiertos, transferencia de células al aire, cultivo de células en placas de cultivo tisular o matraces no sellados y similares. En una realización típica, el sistema cerrado permite la transferencia aséptica de los precursores de células dendríticas y células dendríticas inmaduras desde un recipiente de recogida inicial a un recipiente de cultivo tisular sellable sin exposición al aire no estéril.
En determinadas realizaciones, los precursores de células dendríticas monocíticas son aislados mediante adherencia a un sustrato de unión monocítica, tal y como se divulga en el documento WO 03/010292, presentado el 25 de julio de 2002. Por ejemplo, una población de leucocitos (por ejemplo, aislados por leucaféresis) se puede poner en contacto con un sustrato para la adherencia de precursores de células dendríticas monocíticas. Cuando la población de leucocitos se pone en contacto con el sustrato, los precursores de células dendríticas monocíticas de la población de leucocitos se adhieren de forma preferente al sustrato. Otros leucocitos (incluyendo otros precursores de células dendríticas potenciales) presentan una afinidad de unión reducida al sustrato, permitiendo así que los precursores de células dendríticas monocíticas se enriquezcan de forma preferente sobre la superficie del sustrato.
Los sustratos adecuados incluyen, por ejemplo, aquellos que tienen una elevada relación entre volumen y área superficial. Estos sustratos pueden ser, por ejemplo, un sustrato de partículas o fibras. Entre los sustratos de partículas adecuados se incluyen, por ejemplo, partículas de vidrio, partículas de plástico, partículas de plástico recubiertas de vidrio, partículas de poliestireno recubiertas de vidrio y otros gránulos adecuados para la absorción de proteínas. Entre los sustratos de fibras adecuados se incluyen tubos microcapilares y membranas de microvellosidades. El sustrato de partículas o fibras normalmente permite que los precursores de células dendríticas monocíticas adheridos sean retirados sin reducir de forma notable la viabilidad de las células adheridas. Un sustrato de partículas o fibras puede ser sustancialmente no poroso para facilitar la elución de precursores de células dendríticas monocíticas o células dendríticas del sustrato. Un sustrato "sustancialmente no poroso" es un sustrato en el que al menos una mayoría de los poros presentes en el sustrato son más pequeños que las células para minimizar el número de células que quedan atrapadas en el sustrato.
La adherencia de los precursores de células dendríticas monocíticas al sustrato se puede mejorar opcionalmente mediante la adición de medios aglutinantes. Entre los medios aglutinantes adecuados se incluyen medios de cultivo de precursores de células dendríticas monocíticas (por ejemplo, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15® y
similares) suplementados, individualmente o en cualquier combinación con, por ejemplo, citoquinas (por ejemplo, Granulocyte/Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), interleuquina 4 (IL-4) o interleuquina 13 (IL-13)), plasma sanguíneo, suero (por ejemplo, suero humano, como suero autólogo o suero alogénico), proteínas purificadas, como albúmina de suero, cationes divalentes (por ejemplo, iones de magnesio y/o calcio) y otras moléculas que contribuyen a la adherencia específica de precursores de células dendríticas monocíticas al sustrato o que evitan la adherencia de precursores de células dendríticas no monocíticas al sustrato. En determinadas realizaciones, el plasma sanguíneo o suero se puede inactivar por calor. El plasma inactivado por calor puede ser autólogo o heterólogo a los leucocitos.
Tras la adherencia de precursores de células dendríticas monocíticas al sustrato, los leucocitos no adheridos se separan de los complejos de precursor de célula dendrítica monocítica/sustrato. Se puede utilizar cualquier medio adecuado para separar las células no adheridas de los complejos. Por ejemplo, se puede dejar que la mezcla de leucocitos no adheridos y complejos se asiente y los leucocitos no adheridos y los medios se pueden decantar o drenar. Alternativamente, se puede centrifugar la mezcla para decantar o drenar el supernatante que contiene los leucocitos no adheridos, separándolo de los complejos adheridos a los gránulos.
Los precursores de células dendríticas aisladas pueden ser cultivados ex vivo para la diferenciación, maduración y/o expansión. (A efectos del presente documento, las células dendríticas inmaduras aisladas, los precursores de células dendríticas y otras células se refieren a células que, por intervención humana, existen aparte de su entorno nativo y por consiguiente no son producto de la naturaleza. Las células aisladas pueden existir en forma purificada, en forma semipurificada o en un entorno no nativo). Resumiendo, la diferenciación ex vivo implica típicamente el cultivo de precursores de células dendríticas o poblaciones de células con precursores de células dendríticas, en presencia de uno o más agentes de diferenciación. Entre los agentes de diferenciación adecuados se pueden incluir, por ejemplo, factores de crecimiento celular (por ejemplo, citoquinas como (GM-CSF), Interleuquina 4 (IL-4), Interleuquina 13 (IL-13) y/o combinaciones de estas). En determinadas realizaciones, los precursores de células dendríticas monocíticas se diferencian para formar células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos.
Los precursores de células dendríticas pueden ser cultivados y diferenciados en condiciones de cultivo adecuadas. Entre los medios de cultivo tisular adecuados se incluyen AIM-V®, RPMI1640, DMEM, X-VIVO 15® y similares. Los medios de cultivo tisular pueden complementarse con suero, aminoácidos, vitaminas, citoquinas, como GM-CSF y/o IL-4, cationes divalentes y similares, para favorecer la diferenciación celular. En determinadas realizaciones, los precursores de células dendríticas pueden ser cultivados en medios sin suero. Las condiciones de cultivo pueden excluir opcionalmente cualquier producto de origen animal. Una combinación de citoquinas típica de un medio de cultivo de células dendríticas típico consta aproximadamente de 500 unidades/ml de GM-CSF y de IL-4. Los precursores de células dendríticas, cuando son diferenciados para formar células dendríticas inmaduras, son fenotípicamente similares a las células de Langerhans de la piel. Típicamente, las células dendríticas inmaduras son CD 14' y CD11c+, expresan bajos niveles de CD86 y CD83, y pueden capturar antígenos solubles por endocitosis especializada.
Las células dendríticas inmaduras se maduran para formar células dendríticas maduras. Las CD maduras pierden la habilidad de absorber antígeno y presentan una expresión regulada al alza de moléculas de superficie celular coestimuladoras y diversas citoquinas. Concretamente, las CD maduras expresan unos niveles más elevados de antígenos con MHC de clase I y II que las células dendríticas inmaduras, y las células dendríticas maduras por lo general se identifican por ser CD80+, CDS3+, CD86+, y CD14‘. Una mayor expresión de MHC provoca un aumento de la densidad del antígeno en la superficie de las CD, mientras que la regulación al alza de las moléculas coestimuladoras CD 80 y CD86 refuerza la señal de activación de células T a través de las contrapartes de las moléculas coestimuladoras, como CD28 en las células T.
Las células dendríticas maduras de la presente divulgación se pueden preparar (es decir, madurar) poniendo en contacto las células dendríticas inmaduras con cantidades o concentraciones efectivas de BCG e IFNy. Las cantidades efectivas de BCE oscilan típicamente entre 105 y 107 ufc por milímetro de medio de cultivo tisular. Las cantidades efectivas de IFNy son típicamente de unas 100-1000 U por milímetro de medio de cultivo tisular. El bacilo Calmette-Guerin (BCG) es una cepa avirulenta de M. bovis. A efectos del presente, BCG se refiere a BCG completo, así como a componentes de la pared celular, lipoarabidomananos derivados de BCG y otros componentes de BCG asociados a la inducción de una respuesta inmunitaria de tipo 2. BCG es opcionalmente inactivado, como BCG inactivado por calor, BCG tratado con formalina y similares.
El BCG aumenta la expresión de los marcadores de maduración de superficie CD83 y CD86 en las células dendríticas, concomitante con la inhibición de la producción de IL-12 y la exclusión de antígenos de la endocitosis. Sin intención de limitación a ninguna teoría concreta, la maduración de las células dendríticas por BCG también se ha caracterizado por el hecho de que implica la agregación homotípica y la liberación de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). (Véase, por ejemplo, Thumher, et al., Int. J. Cancer 70:128-134 (1997). La maduración de las células dendríticas inmaduras con IFNy y BCG favorece la producción de CD de IL-12 y reduce o inhibe la producción de IL-10, activando así las células dendríticas maduras para una respuesta de tipo 1 (Th-1).
Las CD inmaduras se ponen típicamente en contacto con cantidades efectivas de BCG e IFNy durante un periodo
aproximado de entre una y 24 horas. Las células dendríticas inmaduras pueden ser cultivadas y maduradas en condiciones de cultivo de maduración adecuadas. Entre los medios de cultivo tisular adecuados se incluyen AIM-V®, RPMI1640, DMEM, X-VIVO 15® y similares. Los medios de cultivo tisular pueden complementarse con aminoácidos, vitaminas, citoquinas, como GM-CSF y/o IL-4, cationes divalentes y similares, para favorecer la maduración celular. Una combinación de citoquinas típica consta aproximadamente de 500 unidades/ml de GM-CSF y de IL-4.
La maduración de células dendríticas se puede controlar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los marcadores de superficie celular pueden ser detectados en ensayos conocidos en la técnica, tales como citometría de flujo, inmunohistoquímica y similares. Las células pueden ser también monitorizadas en cuanto a producción de citoquinas (por ejemplo, mediante ELISA u otro inmunoensayo). En una población de CD maduradas según la presente invención, los niveles de IL-12 son superiores a los niveles de IL-10, para promover una respuesta de tipo 1 (Th-1). Por ejemplo, las CD pueden producir relaciones de IL-12 a IL-10 desde superiores a 1:3 hasta aproximadamente 10:1 o aproximadamente 100:1. Las CD maduras también pierden la capacidad para absorber antígeno por pinocitosis, lo que se puede analizar mediante los ensayos de absorción conocidos por los expertos en la técnica. Los precursores de células dendríticas, las células dendríticas inmaduras y las células dendríticas maduras, activadas o no activadas, con antígenos pueden ser criopreservadas para ser utilizadas en una fecha posterior. Los procedimientos para la criopreservación son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente USA 5788963.
Antígenos
Las células dendríticas activadas maduras según la presente invención pueden presentar antígeno a las células T. Las células dendríticas activadas maduras se pueden formar poniendo en contacto las células dendríticas inmaduras con un antígeno predeterminado antes de la maduración o durante la misma. Alternativamente, las células dendríticas inmaduras que ya se han puesto en contacto con antígeno (por ejemplo, in vivo antes del aislamiento) se pueden poner en contacto con una composición que comprende bCg e IFNy para formar células dendríticas maduras activadas para una respuesta de tipo 1 (Th-1).
Los antígenos predeterminados adecuados pueden incluir cualquier antígeno para el que se desee la activación de células T. Estos antígenos pueden incluir, por ejemplo, antígenos bacterianos, antígenos de tumor específico o asociados a tumores (por ejemplo, células completas, lisado de células tumorales, antígenos aislados de tumores, proteínas de fusión, liposomas y similares), antígenos virales y cualquier otro antígeno o fragmento de un antígeno, por ejemplo un antígeno peptídico o polipeptídico. En determinadas realizaciones, el antígeno puede ser, por ejemplo, a título meramente enunciativo, antígeno de membrana específico prostático (PSMA), fosfatasa ácida prostática (PAP) o antígeno específico prostático (PSA). (Véase, por ejemplo, Pepsidero et al., Cancer Res. 40:2428-2432 (1980); McCormack et al., Urology 45:729-744 (1995).) El antígeno también puede ser una célula bacteriana, un lisado bacteriano, un fragmento de membrana de un lisado celular o cualquier otra fuente conocida en la técnica. El antígeno se puede expresar o producir mediante técnicas de recombinación o incluso sintetizarse químicamente. El antígeno recombinante también se puede expresar sobre la superficie de una célula hospedadora (por ejemplo, bacterias, levaduras, insectos, células de vertebrados o mamíferos), puede estar presente en un lisado o puede ser purificado del lisado.
El antígeno también puede estar presente en una muestra de un sujeto. Por ejemplo, una muestra de tejido de una condición hiperproliferativa o de otro tipo en un sujeto se puede utilizar como fuente del antígeno. Esta muestra se puede obtener, por ejemplo, por biopsia o resección quirúrgica. Este antígeno se puede utilizar como un lisado o como una preparación aislada. Alternativamente, una preparación de membrana de células de un sujeto (por ejemplo, un paciente con cáncer) o una línea celular establecida se puede utilizar como antígeno o fuente de antígeno.
En un ejemplo de realización, un lisado de células de tumor prostático recuperado de muestras quirúrgicas se puede utilizar como fuente del antígeno. Por ejemplo, una muestra del tumor del propio paciente con cáncer, obtenida por biopsia o resección quirúrgica, se puede utilizar directamente para presentar antígeno a las células dendríticas o para proporcionar un lisado celular para la presentación de antígeno. Alternativamente, se puede utilizar una preparación de membrana de células tumorales de un paciente con cáncer. La célula tumoral puede ser prostática, pulmonar, ovárica, de colon, cerebral, melanoma o cualquier otro tipo de célula tumoral. Los lisados y las preparaciones de membrana se pueden preparar a partir de células tumorales aisladas mediante los procedimientos conocidos en la técnica.
En otro ejemplo de realización, se puede utilizar como antígeno un antígeno de membrana específico prostático purificado o semipurificado (PSMA, también conocido como antígeno PSM), que reacciona específicamente con anticuerpo monoclonal 7E11-C.5. (Véase generalmente Horoszewicz el at., Prog. Clin. Biol. Res. 37:115-32 (1983), Patente USA N° 5162504; Patente USA N° 5788963; Feng et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 32:(Abs, 1418)238 (1991).
En otro ejemplo más de realización, se puede utilizar como antígeno un péptido antigénico que tiene la secuencia de residuos aminoácidos Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val (SEC. ID. N°: 1) (designada PSM-P1), que corresponde a
los residuos aminoácidos 4-12 del PSMA. Alternativamente, se puede utilizar como antígeno un péptido antigénico que tiene la secuencia de residuos aminoácidos Ala Leu Phe Asp He Glu Ser Lys Val (SEC. ID. N°: 2) (designada PSM-P2), que corresponde a los residuos aminoácidos 711-719 de PSMA.
En una realización concreta, se puede utilizar como antígeno un péptido antigénico que tiene una secuencia de residuos aminoácidos Xaa Leu (o Met) Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val (o Leu) (designada PSM-PX), donde Xaa representa cualquier residuo aminoácido. Este péptido se parece al motivo de unión HLA-A0201, es decir un motivo de unión de los residuos aminoácidos 9-10 con "residuos ancla", leucina y valina que se encuentran en los pacientes con HLA-A2. (Véase, por ejemplo, Grey et al., Cáncer Surveys 22:37-49 (1995).) Este péptido se puede utilizar como antígeno para pacientes con HLA-A2+ (véase, Central Data Analysis Committee “Allele Frequencies”, sección 6.3, Tsuji, K. et al. (eds.), Tokyo University Press, pp. 1066-1077). De forma similar, se pueden utilizar péptidos que se parecen a otros motivos de unión HLA.
Típicamente, las células dendríticas inmaduras se cultivan en presencia de BCG, IFNy y el antígeno predeterminado en condiciones de maduración adecuadas, tal y como se ha descrito anteriormente. Opcionalmente, las células dendríticas inmaduras se pueden mezclar con el antígeno predeterminado en un medio de cultivo de células dendríticas típico sin GM-CSF e IL-4, o un agente de maduración. Después de que hayan transcurrido entre al menos 10 minutos y 2 días de cultivo con el antígeno, el antígeno se puede retirar y se puede añadir el medio de cultivo complementado con BCG e IFNy. También se pueden añadir citoquinas (por ejemplo, GM-CSF e IL-4) al medio de maduración. Los procedimientos para poner en contacto células dendríticas con antígeno son generalmente conocidos en la técnica. (Véase en general Steel y Nutman, J. Immunol. 160:351-360 (1998); Tao et al., J. Immunol. 158:4237-4244 (1997); Dozmorov y Miller, Cell Immunol. 178:187-196 (1997); Inaba et al., J. Exp Med. 166:182-194 (1987); Macatonia et al., J Exp Med. 169:1255-1264 (1989); De Bruijn et al., Eur. J. Immunol.
22:3013-3020 (1992).
A continuación, las células dendríticas activadas maduras resultantes son co-incubadas con células T, como células T vírgenes. Las células T o un subconjunto de células T se pueden obtener de diversos tejidos linfoides para su uso como células respondedoras, Estos tejidos incluyen, a título meramente enunciativo, el bazo, los nódulos linfáticos y/o la sangre periférica. Las células se pueden cultivar conjuntamente con células dendríticas activadas maduras como una población de células T mixtas o un subconjunto de células T purificadas. La purificación de células T se puede conseguir por selección positiva o negativa, incluyendo, entre otros, el uso de anticuerpos dirigidos a CD2, CD3, CD4, CD8, y similares.
Al poner en contacto las células T con células dendríticas activadas maduras, se proporcionan linfocitos T o células T polarizadas, o activadas o reactivas a antígeno. A efectos del presente documento, el término "polarizado" se refiere a células T que producen elevados niveles de IFNy o son de otro modo activadas para inducir una respuesta de tipo 1 (Th-1). Estos procedimientos típicamente incluyen poner en contacto células dendríticas inmaduras con BCG e IFNy para preparar células dendríticas activadas maduras. Las células dendríticas inmaduras se pueden poner en contacto con un antígeno predeterminado durante o antes de la maduración. Las células dendríticas inmaduras se pueden cultivar conjuntamente con células T (por ejemplo, células T vírgenes) durante la maduración o cultivar conjuntamente con células T (por ejemplo, células T vírgenes) tras la maduración y proceder a la activación linfocitaria de las células dendríticas para inducir una respuesta de tipo 1. Las células dendríticas inmaduras o células dendríticas maduras se pueden enriquecer antes de la maduración. Por otra parte, las células T se pueden enriquecer a partir de una población de linfocitos antes de ponerse en contacto con las células dendríticas. En una realización específica, se ponen en contacto poblaciones enriquecidas o purificadas de células T CD4+ con las células dendríticas. El cultivo conjunto de células dendríticas activadas maduras con células T provoca la estimulación de células T específicas que maduran para convertirse en células T CD4+ reactivas a antígeno o células T8+ reactivas a antígeno.
En otro aspecto de la divulgación, se proporcionan procedimientos para la reestimulación de células T in vitro, cultivando las células en presencia de células dendríticas maduras activadas para inducir una respuesta de células T de tipo 1 (Th-1). Esta célula T se puede cultivar opcionalmente con células alimentadoras. Opcionalmente las células dendríticas activadas maduras se pueden irradiar antes de ponerse en contacto con las células T. Las condiciones de cultivo adecuadas pueden incluir una o más citoquinas (por ejemplo, IL-2 purificada, supernatante de células de bazo estimuladas con concanavalina A o interleuquina 15 (IL-15)). La reestimulación in vitro de células T mediante la adición de células dendríticas inmaduras, BCG, IFNy y el antígeno predeterminado se puede utilizar para promover la expansión de las poblaciones de células T.
Se puede mantener una línea de células T o un cultivo de células T polarizadas de antígeno específico estable in vitro durante periodos de tiempo prolongados por reestimulación periódica. El cultivo de células T o la línea de células T creado de esta forma se puede almacenar y si es preservado (por ejemplo, por formulación con un crioconservante y congelación) puede ser utilizado para un nuevo suministro de células T polarizadas activadas a intervalos deseados para su uso a largo plazo.
En determinadas realizaciones, las células T activadas CD8+ o CD4+ se pueden generar según el procedimiento de la presente invención. Típicamente, las células dendríticas activadas maduras utilizadas para generar las células T
polarizadas reactivas a antígeno son singénicas al sujeto al que van a ser administradas (por ejemplo, son obtenidas del sujeto). Alternativamente, las células dendríticas que tienen el mismo haplotipo HLA que el sujeto receptor previsto se pueden preparar in vitro utilizando células no cancerosas (por ejemplo, células normales) de un donante con HLA compatible. En una realización específica, las células T reactivas a antígeno, incluyendo células CTL y Th-1, se expanden in vitro como fuente de células para la inmunoestimulación.
Administración in vivo de poblaciones de células
En otro aspecto de la divulgación se proporcionan procedimientos para la administración de células dendríticas activadas maduras o células T polarizadas activadas o una población de células que contiene estas células, a un sujeto que necesita inmunoestimulación. Estas poblaciones de células pueden incluir tanto poblaciones de células dendríticas activadas maduras como poblaciones de células T polarizadas activadas. En determinadas realizaciones, estos procedimientos se realizan obteniendo precursores de células dendríticas o células dendríticas inmaduras, diferenciando y madurando esas células en presencia de BCG, IFNy y antígeno predeterminado para formar una población de células dendríticas maduras activadas para generar una respuesta Th-1. Las células dendríticas inmaduras se pueden poner en contacto con el antígeno antes de la maduración o durante la misma. Estas células dendríticas activadas maduras se pueden administrar directamente a un sujeto que necesita inmunoestimulación.
En una realización relacionada de la divulgación, las células dendríticas activadas maduras se pueden poner en contacto con linfocitos de un sujeto para estimular las células T dentro de la población de linfocitos. Los linfocitos polarizados activados, opcionalmente seguidos por expansión clonal en el cultivo celular de células T reactivas a antígeno CD4+ y/o CD8 T, se pueden administrar a un sujeto que necesita inmunoestimulación. En determinadas realizaciones, las células T polarizadas activadas son autólogas al sujeto.
En otra realización de la divulgación, las células dendríticas, las células T y el sujeto receptor tienen el mismo haplotipo MHC (HLA). Los procedimientos para determinar el haplotipo HLA de un sujeto son conocidos en la técnica. En una realización relacionada, las células dendríticas y/o células T son alogénicas al sujeto receptor. Por ejemplo, las células dendríticas pueden ser alogénicas a las células T y el receptor, que tienen el mismo haplotipo MHC (HLA). Las células alogénicas tienen una coincidencia típica de al menos un alelo de MHC (por ejemplo, comparten al menos uno pero no todos los alelos MHC). En una realización menos típica, las células dendríticas, las células T y el sujeto receptor son todos alogénicos entre sí, pero todos comparten al menos un alelo MHC en común. De acuerdo con una realización de la divulgación, las células T se obtienen del mismo sujeto del que se han obtenido las células dendríticas inmaduras. Tras la maduración y polarización in vitro, las células T autólogas son administradas al sujeto para provocar y/o aumentar una respuesta inmunitaria existente. Por ejemplo, las células T se pueden administrar, mediante infusión intravenosa, por ejemplo, a dosis de aproximadamente 108-109 células/m2 de superficie corporal (véase, por ejemplo, Ridell et al., Science 257: 238-241 (1992).
La infusión se puede repetir a intervalos deseados, por ejemplo mensualmente. Los receptores pueden ser objeto de seguimiento durante las infusiones de las células T y después de estas, para detectar cualquier signo de efectos adversos. De acuerdo con otra realización de la divulgación, las células dendríticas maduradas con BCG e IFNy según la presente invención pueden ser inyectadas directamente en un tumor u otro tejido que contiene un antígeno diana. Estas células maduras pueden absorber el antígeno y presentar ese antígeno para las células T in vivo. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan a título meramente ilustrativo de diversos aspectos de la invención y no se interpretará que limitan la invención en modo alguno. Todos los ejemplos que no entran dentro del ámbito de aplicación de las reivindicaciones se ofrecen con fines comparativos.
Ejemplo 1: Producción de IL-10 e IL-12 en diferentes condiciones de maduración:
En este ejemplo, la producción de citoquinas se determinó a partir de poblaciones de células dendríticas inmaduras que se pusieron en contacto con los agentes de maduración BCG y/o IFNy. Se prepararon CD inmaduras poniendo en contacto monocitos de sangre periférica con plástico en presencia de medio OptiMEM® (Gibco-BRL) complementado con un 1% de plasma humano. Los monocitos no unidos se eliminaron por lavado. Los monocitos unidos se cultivaron en medio X-VIVO 15® en presencia de 500 U GM-CSF y 500 U IL-4 por mililitro durante 6 días. En un primer estudio, las células dendríticas inmaduras se maduraron mediante la adición de BCG inactivado. Se determinó la producción de citoquinas de las células dendríticas maduras resultantes. Se añadió BCG inactivado a diversas concentraciones a las células dendríticas inmaduras en medio X-VIVO 15®, para posteriormente cultivar durante 24 horas a 37°C. La dilución de BCG añadido por milímetro se especifica en la tabla, partiendo de 4,1 x 108 ufc/ml de caldo. Se determinó la producción de citoquinas mediante ensayo ELISA utilizando anticuerpos contra la citoquina a detectar. Dicho brevemente, se utiliza un anticuerpo específico para la citoquina (por ejemplo, IL-12 o IL-10) para capturar la citoquina sobre una superficie sólida. A continuación, la superficie sólida se trata con un
segundo anticuerpo etiquetado contra la citoquina para detectar la presencia de la citoquina capturada. El segundo anticuerpo está típicamente etiquetado con enzimas para facilitar la detección por ensayo colorimétrico. Los resultados de un experimento representativo se muestran a continuación en la Tabla 1. La cantidad de citoquina o producción de citoquina se indica como pg/ml.
T l 1
("sd" significa sin determinar).
Por lo que respecta a la tabla 1, los resultados demuestran que la adición de BCG puede aumentar la producción de citoquinas IL-12, IL-10 u otras subunidades, a pesar de que tanto los niveles relativos como absolutos de producción de citoquina dependen del donante. Los niveles más elevados de aumento se observaron para la IL-12 p40 y para la IL-10, lo que sugiere que el bajo nivel observado de IL-12 p70 (compuesto de las subunidades p34 y p40), con respecto al nivel de IL-12 p40, se debe a la ausencia de producción de IL-12 p35. En todas las condiciones salvo en una, cuando el BCG estaba presente, la relación de los niveles de IL-12 p70 a IL-10 eran inferiores o iguales a uno, lo que indica que la maduración de las células dendríticas en presencia de BCG solo es probable que polarice células T vírgenes para una respuesta Th-2.
Los efectos de introducir IFNy en condiciones similares también se determinaron y se presentan a continuación en la Tabla 2. La producción de citoquinas se midió como se ha descrito anteriormente. Comparando las Tablas 1 y 2, resulta evidente que la adición de IFNy en presencia de un agente de maduración (por ejemplo, BCG) aumentó la producción de IL-12 p70. En particular, la adición de IFNy con BCG durante la maduración aumentó la producción de IL-12 p35 y redujo la producción de IL-10. Como resultado, la relación de IL-12 p70 a IL-10 fue invariablemente superior a uno tras la adición de IFNy con BCG. En algunos donantes, y en determinadas condiciones, la relación de producción de IL-12 p70 a IL-10 se puede incrementar hasta ser superior a 100:1 mediante la adición de IFNy con BCG. De este modo, estos resultados demuestran sorprendentemente que la adición de IFNy con el agente de maduración BCG puede aumentar drásticamente la producción de IL-12 p70.
Tabla 2
("sd" significa sin determinar).
Ejemplo 2: La regulación a la baja de IL-10 del IFNv es dependiente de la dosis:
En este ejemplo, se demuestra la capacidad del IFNy en combinación con BCG para regular a la baja la producción de IL-10 en una población de células dendríticas. Las células dendríticas inmaduras se prepararon como se ha descrito anteriormente. Las células dendríticas inmaduras se incubaron solas, se maduraron en presencia de una o dos concentraciones de BCG (diluciones 1:1000 o 1:250 de 4,1 x 108 ufc/ml de caldo), o se expusieron a IFNy solo
en concentraciones que oscilaban entre 0 U y 1000 U por mililitro. La producción de IL-10 por parte de las células dendríticas resultantes se midió mediante ensayo ELISA (supra) utilizando un anticuerpo disponible en el mercado (por ejemplo, R&D Systems, Minneapolis, MN) y se documentó en pg/ml. En el control, las c D inmaduras cultivadas solas (sin la adición de BCG o IFNy) no produjeron ninguna cantidad detectable de IL-10 (unos 20-30 pg/ml). La cantidad de IL-10 producida no fue dependiente de la dosis en el rango de 10 U a 1000 U de IFNy por mililitro.
Por el contrario, las CD producidas mediante maduración en presencia de BCG solo produjeron cantidades significativas de IL-10: unos 150 pg/ml de >250 pg/ml de IL-10 en presencia de una dilución 1:1000 o 1:250 del caldo de BCG, respectivamente. La adición de IFNy al BCG durante la maduración de CD produjo una regulación a la baja de la producción de IL-10 de forma dependiente de la dosis. En el caso de las CD cultivadas en presencia de la dilución 1:1000 de BCG, la producción de IL-10 descendió de 150 pg/ml de IL-10 (sin IFNy) hasta 20-30 pg/ml de IL-10 (1000 U IFNy). En el caso de las CD cultivadas en presencia de la dilución 1:250 de bCg , la producción de IL-10 descendió de 270 pg/ml de IL-10 (sin IFNy) hasta 50 pg/ml de IL-10 (1000 U IFNy). Por tanto, la maduración de CD inmaduras en presencia de BCG e IFNy fue capaz de regular a la baja la producción de IL-10 y de superar la estimulación aparente de la producción de IL-10 inducida por el BCG solo.
Ejemplo 3: La regulación al alza de IL-12 por parte del IFNv es dependiente de la dosis:
En este ejemplo, se demuestra la capacidad del IFNy para regular al alza la producción de IL-12. Las células dendríticas inmaduras se obtuvieron de monocitos cultivados durante seis días en presencia de GM-CSF e IL-4, tal y como se ha descrito anteriormente. Las CD inmaduras se trataron durante otros dos días con diversas diluciones de BCG solo, o con BCG combinado con diversas concentraciones de IFNy. Los supernatantes del cultivo se sometieron a ensayo para determinar la presencia de IL-12 p70 mediante ELISA, tal y como se ha descrito anteriormente.
Los resultados de un experimento representativo se muestran en la Figura 1. Para cada cultivo, los resultados se determinaron por triplicado. En respuesta a las cantidades crecientes de BCG solo, las CD maduras produjeron una concentración media (1000 pg/ml) de IL-12 p70. La cantidad de producción de IL-12 disminuyó de forma dependiente de la dosis a medida que aumentó la cantidad de BCG. Por el contrario, tras la adición de IFNy (10 U/ml) con BCG (dilución 1:1000 del caldo), la cantidad de IL-12 aumentó de forma significativa hasta aproximadamente 5000 pg/ml. Tras la adición de 100 U/ml de IFNy con BCG (dilución 1:1000 del caldo), la cantidad de IFNy aumentó hasta casi 20000 pg/ml. La adición de IFNy a 500 U/ml o 1000 U/ml con BCG (dilución 1:1000 del caldo) resultó en unos niveles de IL-12 de aproximadamente 21 000 pg/ml y 22000 pg/ml, respectivamente.
En resumen, a pesar de que el BCG solo parecía ser antagónico a la producción de IL-12, la maduración de CD inmaduras en presencia de BCG e IFNy aumentó drásticamente la producción de IL-12.
Ejemplo 4: Estimulación de células T de antígeno específico:
En este ejemplo, se demostró que las CD inmaduras maduradas en presencia de BCG e IFNy estimulan la producción de IFNy a través de células T de antígeno específico. Se generó una línea de células T específica para Influenza A incubando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a 2 x 106 células/ml con 5 pg/ml de péptido MI de la influenza (GILGFVFTL; SEC. ID. N°:3) en medio A iM-V® complementado con un 5% de suero humano. Estas condiciones de cultivo producen la expansión selectiva de las células T específicas para el péptido MI de la influenza. Después de dos días de cultivo, se añadieron 20 U/ml de IL-2 y 5 ng/ml de IL-15 a los cultivos. Después de entre 7 y 14 días de cultivo, las líneas de células T se colocaron en un medio sin citoquinas hasta el día siguiente.
Las células T de antígeno específico se cultivaron entonces conjuntamente con CD inmaduras, con CD maduradas con BCG solo o con CD maduradas con BCG e IFNy. La relación de células T de antígeno específico/CD fue de 1:1. Las células T y las CD se incubaron a 37°C durante 24 horas. Las CD habían sido cargadas directamente o cargadas osmóticamente con el péptido MI de la influenza. En resumen, las CD inmaduras se recogieron de los matraces de cultivo y se concentraron mediante centrifugación. En el caso de la carga osmótica, las células fueron resuspendidas en un pequeño volumen de medio hiperosmótico, para después añadir un volumen igual de péptido MI de la influenza en PBS. Tras diez minutos de incubación en hielo, las células se lavaron abundantemente. En el caso de la carga directa, las células fueron resuspendidas en un volumen igual de medio X- VIVO 15® y péptido MI de la influenza en PBS, y se incubaron durante una hora a 37°C. Las células se incubaron durante dos horas a 37°C para permitir el procesamiento del antígeno.
Tras el cultivo conjunto de las células T y las CD, la respuesta de las células T se midió mediante cuantificación ELISA del IFNy de una muestra de 100 pl del supernatante del cultivo. Los resultados indican que, con independencia del procedimiento de carga de las CD, las CD estimuladas con BCG e IFNy tienen una capacidad de estimulación superior de las células T de antígeno específico. Las células T cultivadas conjuntamente con CD inmaduras produjeron muy poco IFNy (<2000 pg/ml), mientras que las células T cultivadas conjuntamente con CD maduradas utilizando BCG solo fueron las productoras intermedias de IFNy (>5000 pg/ml). Las células T cultivadas conjuntamente con CD maduradas utilizando BCG e IFNy produjeron elevados niveles de IFNy (>20000 pg/ml en el
caso de las CD de carga osmótica o >25000 pg/ml en el caso de las CD cargadas directamente.)
Por tanto, las CD maduradas con BCG e IFNy fueron mejores estimuladoras de las células T de antígeno específico, con independencia del procedimiento de carga del antígeno en las CD.
Ejemplo 5: Generación de novo de respuestas de células T de antígeno específico in vitro:
Las líneas de células específicas para la hemocianina de lapa californiana (KLH) se generaron estimulando el PBMC con CD maduradas utilizando BCG o bien BCG e IFNy, y se cargaron con KLH o proteínas de control a una relación de células T/CD de 10:1. A las células T y las CD maduradas se les añadió medio nuevo (medio AIM-V® complementado con un 5% de suero humano AB, 20 U/ml de IL-2, y 5 ng/ml de IL-15) cada 3 o 4 días. Las células se expandieron a matraces más grandes cuando resultó necesario. Debido a que la frecuencia de precursor total para un determinado antígeno era baja, y dado que las células vírgenes requieren una estimulación potente para responder, la estimulación se repitió tres o cuatro veces a intervalos de entre 10 y 21 días. Se dejó que las células se recuperasen hasta el día siguiente en medio sin citoquina antes de repetir la estimulación.
Se empleó un ensayo de incorporación de timidina estándar de 3 días para determinar la proliferación de células específicas de KLH en las líneas de células T estimuladas. Las células T estimuladas se incubaron a diversas relaciones de CD/células T con células dendríticas inmaduras pulsadas con KLH. Se medió la proliferación de células T con recuentos por minuto (CPM). La proliferación celular, o la producción de citoquinas, en respuesta a la estimulación se consideró una prueba de la respuesta de antígeno específico. Para controlar la especificidad del antígeno, se incluyó también un antígeno de control negativo (virus Influenza A) en el ensayo.
Cuando se utilizaron CD maduras con BCG solo para estimular las células T, la proliferación de células T fue constantemente baja (<5000 CPM). Este bajo nivel de proliferación fue bajo con independencia de que las CD se hubieran puesto en contacto con KLH o el virus Influenza A. También se observó un bajo nivel de proliferación en respuesta a la incubación con CD inmaduras. No se observó ninguna diferencia significativa entre los tres grupos de CD utilizados a unas relaciones de respondedor a estimulador de 50:1, 25:1, o 12.5:1 (células T/CD). Por el contrario, cuando las células dendríticas maduradas con BCG e IFNy se utilizaron para estimular las células T, las CD pulsadas con KLH generaron una proliferación uniformemente más elevada de células T (aproximadamente 10 000-33000 CPM) que en el caso de las CD inmaduras o las CD maduras pulsadas con influenza A. En el caso de las CD maduras pulsadas con antígeno de KLH, la proliferación de células T aumentó en proporción a un aumento de la relación de respondedor a estimulador.
La función efectora de las células T también se controló mediante la secreción de citoquina. Las líneas de células T específicas de KLH (generadas tal y como se ha descrito anteriormente) se estimularon utilizando CD maduradas con BCG solo o bien con BCG e IFNy. Las líneas de células T estimuladas se sometieron a ensayo para determinar la producción de citoquina mediante tinción de citoquina intracelular después de que las células fuesen estimuladas de manera no específica con anticuerpo anti-CD3 (50 ng/ml) y PMA (5 ng/ml). La producción de citoquina se midió como el porcentaje de células que producen una citoquina particular. Un porcentaje entre muy bajo e indetectable (<< 5%) de las células testadas produjo IL-2, IL-4, IL-5, o IL-10 intracelular. IL-5 e IL-10 no se detectaron en células T estimuladas con CD maduradas con BCG e IFNy. Las células T estimuladas con CD maduradas con BCG solo produjeron bajos niveles de IFNy (<10%) y TNFa (<15%). Por el contrario, unas proporciones significativas de células T estimuladas con IFNy y BCG produjeron IFNy (aproximadamente el 35%) y TNFa (>45%). El IFNy es un estimulador conocido de la producción de IL-12. Por tanto, al estimular las células T con CD maduradas con BCG e IFNy, las células T son polarizadas para una respuesta de tipo 1 (Th-1).
Ejemplo 6: Inducción del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) de la citoquina Th-1:
En este ejemplo, se demostró la capacidad de la combinación de BCG e IFNy para regular al alza el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) de la citoquina tipo 1. En resumen, las células dendríticas inmaduras se obtuvieron como se ha descrito anteriormente y se cultivaron en presencia de GM-CSF e IL-4. A continuación, las CD inmaduras se cultivaron con BCG solo o en combinación con IFNy durante unas 24 horas. Posteriormente, se añadió un inhibidor de transporte de proteína (GolgiPlug™, PharMingen) para bloquear el transporte de las citoquinas producidas del complejo de Golgi y las células se incubaron hasta el día siguiente. A continuación, se recogieron las células, se permeabilizaron y se tiñeron internamente con un anticuerpo marcado con fluorescencia específico para TNFa o un anticuerpo de control del mismo isotipo utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Se determinaron la frecuencia de CD positivas en TNFa y la intensidad de la fluorescencia de las células mediante análisis FACS (Tabla 3). Se concluyó que la maduración de las CD con BCG en presencia de IFNy mejora la capacidad de las CD para producir el TNFa de la citoquina Th-1.
Tabla 3
Claims (6)
1. Un procedimiento ex vivo o in vitro para producir células T activadas que comprende:
poner en contacto las células dendríticas inmaduras proporcionadas con una cantidad de bacilo Calmette-Guerin (BCG) que consiste en entre 105 y 1067 ufc por ml de medio de cultivo tisular y entre 100 y 1000 unidades de interferón gamma (IFNy) por ml de medio de cultivo tisular y un antígeno predeterminado en condiciones de cultivo adecuadas para la maduración de las células dendríticas inmaduras, al objeto de formar células dendríticas maduras o una población de células dendríticas maduras;
donde la población de células dendríticas maduras produce al menos 10 veces más interleuquina 12 que interleuquina 10 que una población de células dendríticas similares cultivada en presencia de BCG sin IFNy, y poner en contacto las células dendríticas maduras con células T vírgenes para formar células T activadas que producen IFNy, y
donde las células T activadas producen una respuesta inmunitaria de tipo 1.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el antígeno predeterminado es un antígeno de tumor específico, un antígeno asociado a tumor, células tumorales, un lisado de células tumorales, proteínas de fusión de tumor específico o asociadas a tumor, liposomas de tumor específico o asociados a tumor o antígenos de tumor específico o asociados a tumores de tumores.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, donde las células dendríticas inmaduras se ponen en contacto simultáneamente con el antígeno predeterminado, BCG e IFNy o se ponen en contacto con el antígeno predeterminado antes de ponerse en contacto con el BCG e IFNy.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3, que comprende además:
aislar precursores de células dendríticas monocíticas; y
cultivar los precursores en presencia de un agente diferenciador de células dendríticas que consiste en GM-CSF, interleuquina 4, una combinación de GM-CSF e interleuquina 4 o interleuquina 13 para formar las células dendríticas inmaduras.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, donde los precursores de células dendríticas monocíticas se aíslan de un sujeto humano.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las células dendríticas inmaduras y las células T son autólogas entre sí.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US31759201P | 2001-09-06 | 2001-09-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2766299T3 true ES2766299T3 (es) | 2020-06-12 |
Family
ID=32654226
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10181985T Expired - Lifetime ES2766299T3 (es) | 2001-09-06 | 2002-09-06 | Composiciones y procedimientos para la activación linfocitaria de células dendríticas monocíticas y células T para generar una respuesta Th-1 |
| ES02761594.7T Expired - Lifetime ES2598109T3 (es) | 2001-09-06 | 2002-09-06 | Composiciones y métodos para la activación linfocitaria de células dendríticas monocíticas y células T para generar una respuesta Th-1 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02761594.7T Expired - Lifetime ES2598109T3 (es) | 2001-09-06 | 2002-09-06 | Composiciones y métodos para la activación linfocitaria de células dendríticas monocíticas y células T para generar una respuesta Th-1 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20050059151A1 (es) |
| EP (3) | EP3653055A1 (es) |
| JP (3) | JP2005505270A (es) |
| KR (3) | KR20050027163A (es) |
| CN (2) | CN1636229B (es) |
| AU (1) | AU2008221592B2 (es) |
| BR (1) | BRPI0212545B8 (es) |
| CA (1) | CA2459713C (es) |
| DK (2) | DK2322603T3 (es) |
| ES (2) | ES2766299T3 (es) |
| HK (1) | HK1079989A1 (es) |
| IL (3) | IL160720A0 (es) |
| MX (1) | MXPA04002147A (es) |
| NO (2) | NO338147B1 (es) |
| NZ (1) | NZ531530A (es) |
| PL (1) | PL372098A1 (es) |
| PT (2) | PT1441591T (es) |
| WO (1) | WO2003022215A2 (es) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT412145B (de) * | 2002-09-13 | 2004-10-25 | Forsch Krebskranke Kinder | Verfahren zur herstellung eines zellulären immuntherapeutikums auf basis von il-12-freisetzenden dendritischen zellen |
| US20040057935A1 (en) * | 2002-09-20 | 2004-03-25 | Cedars-Sinai Medical Center | Intratumoral delivery of dendritic cells |
| PL377209A1 (pl) * | 2002-12-06 | 2006-01-23 | Northwest Biotherapeutics, Inc. | Leczenie nowotworów poprzez podawanie pacjentom częściowo dojrzałych in vitro komórek dendrytycznych |
| EP1604016B1 (en) * | 2003-02-27 | 2009-01-14 | NorthWest Biotherapeutics, Inc. | Generation of dendritic cells from monocytic dendritic precursor cells with gm-csf in the absence of additional cytokines |
| EP1484064A1 (en) | 2003-06-04 | 2004-12-08 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung | Therapeutical composition containing dentritic cells and use thereof |
| US20080199484A1 (en) * | 2003-10-06 | 2008-08-21 | Cedars-Sinai Medical Center | Use Of Cox-2 Inhibitor to Prevent T-Cell Anergy Induced By Dendritic Cell Therapy |
| US7939090B2 (en) * | 2003-10-21 | 2011-05-10 | Cedars-Sinai Medical Center | System and method for the treatment of cancer, including cancers of the central nervous system |
| EP1690937B1 (en) * | 2003-11-04 | 2012-10-17 | Dnavec Research Inc. | Method of constructing transgenic dendritic cell |
| EP1775343A4 (en) | 2004-06-24 | 2007-11-14 | Dnavec Research Inc | ANTICANCER AGENTS CONTAINING A DENDRITIC CELL IN WHICH RNA VIRUSES HAVE BEEN TRANSFERRED |
| EP3805367A1 (en) * | 2005-12-08 | 2021-04-14 | NorthWest Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for inducing the activation of immature monocytic dendritic cells |
| EP1840206A1 (en) * | 2006-03-28 | 2007-10-03 | Gsf-Forschungszentrum Für Umwelt Und Gesundheit, Gmbh | Compositions for the preparation of mature dendritic cells |
| EP2084267B1 (en) | 2006-09-26 | 2018-04-11 | Cedars-Sinai Medical Center | Cancer stem cell antigen vaccines and methods |
| US8871211B2 (en) | 2006-09-28 | 2014-10-28 | Cedars-Sinai Medical Center | Cancer vaccines and vaccination methods |
| EP2328923B1 (en) | 2008-09-02 | 2016-01-13 | Cedars-Sinai Medical Center | Cd133 epitopes |
| DK2427485T3 (en) | 2009-05-07 | 2017-03-13 | Immunocellular Therapeutics Ltd | CD133 epitopes |
| US20150064217A1 (en) * | 2012-02-02 | 2015-03-05 | California Stem Cell, Inc. | Pluripotent germ layer origin antigen presenting cancer vaccine |
| JP6134785B2 (ja) | 2012-05-31 | 2017-05-24 | ジェイダブリュ クレアジェン インコーポレイテッド | 樹状細胞成熟化組成物、およびこれを用いて抗原特異的樹状細胞を製造する方法 |
| US9744193B2 (en) | 2012-09-06 | 2017-08-29 | Orbis Health Solutions Llc | Tumor lysate loaded particles |
| AU2020203845C1 (en) * | 2012-09-06 | 2022-08-11 | Orbis Health Solutions, Llc | Tumor lysate loaded particles |
| CN104981258B (zh) | 2012-12-12 | 2017-10-20 | 奥比思健康解决方案有限责任公司 | 用于组织再生的组合物、其制备方法及其用途 |
| WO2014127296A1 (en) | 2013-02-14 | 2014-08-21 | Immunocellular Therapeutics, Ltd | Cancer vaccines and vaccination methods |
| CN112891522A (zh) * | 2013-09-05 | 2021-06-04 | 奥比思健康解决方案有限责任公司 | 装载了肿瘤裂解物的微粒 |
| US10166195B2 (en) | 2014-03-05 | 2019-01-01 | Orbis Health Solutions, Llc | Vaccine delivery systems using yeast cell wall particles |
| US11669090B2 (en) | 2014-05-20 | 2023-06-06 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Autonomous vehicle operation feature monitoring and evaluation of effectiveness |
| US10373259B1 (en) | 2014-05-20 | 2019-08-06 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Fully autonomous vehicle insurance pricing |
| US9858621B1 (en) * | 2014-05-20 | 2018-01-02 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Autonomous vehicle technology effectiveness determination for insurance pricing |
| US10599155B1 (en) | 2014-05-20 | 2020-03-24 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Autonomous vehicle operation feature monitoring and evaluation of effectiveness |
| US9972054B1 (en) | 2014-05-20 | 2018-05-15 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Accident fault determination for autonomous vehicles |
| US10102587B1 (en) | 2014-07-21 | 2018-10-16 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Methods of pre-generating insurance claims |
| US20210118249A1 (en) | 2014-11-13 | 2021-04-22 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Autonomous vehicle salvage and repair |
| PL424035A1 (pl) * | 2015-06-30 | 2019-01-02 | Northwest Biotherapeutics, Inc. | Optymalnie aktywowane komórki dendrytyczne, które indukują ulepszoną lub zwiększoną przeciwnowotworową odpowiedź odpornościową |
| BR112018000027A2 (pt) | 2015-06-30 | 2022-09-06 | Univ Nova De Lisboa | População celular viável, método de produção e usos da mesma |
| US11107365B1 (en) | 2015-08-28 | 2021-08-31 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Vehicular driver evaluation |
| US11242051B1 (en) | 2016-01-22 | 2022-02-08 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Autonomous vehicle action communications |
| US11719545B2 (en) | 2016-01-22 | 2023-08-08 | Hyundai Motor Company | Autonomous vehicle component damage and salvage assessment |
| US11441916B1 (en) | 2016-01-22 | 2022-09-13 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Autonomous vehicle trip routing |
| US10324463B1 (en) | 2016-01-22 | 2019-06-18 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Autonomous vehicle operation adjustment based upon route |
| US10134278B1 (en) | 2016-01-22 | 2018-11-20 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Autonomous vehicle application |
| US10395332B1 (en) | 2016-01-22 | 2019-08-27 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Coordinated autonomous vehicle automatic area scanning |
| US10386845B1 (en) | 2016-01-22 | 2019-08-20 | State Farm Mutual Automobile Insurance Company | Autonomous vehicle parking |
| KR102038114B1 (ko) * | 2016-02-26 | 2019-10-30 | 주식회사 엘지화학 | 광학 점착제용 (메타)아크릴레이트기 함유 벤조페논의 제조방법 및 광학 점착제 조성물 |
| US12059434B2 (en) | 2017-02-28 | 2024-08-13 | University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Short-term activated DC1s and methods for their production and use |
| EP4041298A4 (en) * | 2019-10-07 | 2024-07-24 | Northwest Biotherapeutics Inc | IN VITRO METHODS AND COMPOSITIONS FOR ENHANCING ACTIVATION OF DENDRITIC CELLS AND T CELLS AND FOR INDUCING A TH -1 IMMUNE RESPONSE |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5162504A (en) * | 1988-06-03 | 1992-11-10 | Cytogen Corporation | Monoclonal antibodies to a new antigenic marker in epithelial prostatic cells and serum of prostatic cancer patients |
| US5366866A (en) * | 1991-07-25 | 1994-11-22 | Duke University | Method of diagnosing ovarian and endometrial cancer with monoclonal antibodies OXA and OXB |
| US5227471A (en) * | 1992-01-30 | 1993-07-13 | Eastern Virginia Medical School Of The Medical College Of Hampton Roads | Monoclonal antibody PD41 that binds to a prostate mucin antigen that is expressed in human prostatic carcinoma |
| US5788963A (en) * | 1995-07-31 | 1998-08-04 | Pacific Northwest Cancer Foundation | Isolation and/or preservation of dendritic cells for prostate cancer immunotherapy |
| CN1172718C (zh) * | 1995-10-04 | 2004-10-27 | 依默耐克斯有限公司 | 树突状细胞刺激因子 |
| US7659119B2 (en) * | 1996-02-12 | 2010-02-09 | Argos Therapeutics, Inc. | Method and compositions for obtaining mature dendritic cells |
| DE69840739D1 (de) * | 1997-10-27 | 2009-05-28 | Merix Bioscience Inc | Methode und Zusammensetzung zur Herstellung von reifen dendritischen Zellen |
| JP2000143534A (ja) * | 1998-11-13 | 2000-05-23 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 樹状細胞ワクチン及びその製造方法 |
| JP2000279181A (ja) * | 1999-04-01 | 2000-10-10 | Japan Science & Technology Corp | ヒト樹状細胞の発現遺伝子群 |
| WO2001048154A1 (fr) * | 1999-12-28 | 2001-07-05 | Toyoshima, Kumao | Agent de maturation pour cellules dendritiques immatures |
| US6247378B1 (en) * | 2000-01-06 | 2001-06-19 | Deere & Company | Operator control device for an infinitely variable transmission |
| DK2363139T3 (en) * | 2000-05-12 | 2016-05-30 | Northwest Biotherapeutics Inc | A method of increasing the class I presentation of exogenous antigens by human dendritic cells |
| US7252996B2 (en) * | 2001-01-15 | 2007-08-07 | I.D.M. Immuno-Designed Molecules | Ancillary composition for the preparation of committed mature dentritic cells |
| AU2002326463A1 (en) * | 2001-07-25 | 2003-02-17 | Northwest Biotherapeutics, Inc. | Methods and apparatus for enrichment and culture of monocytic dendritic cell precursors |
-
2002
- 2002-09-06 DK DK10181985.2T patent/DK2322603T3/da active
- 2002-09-06 KR KR1020047003386A patent/KR20050027163A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-09-06 KR KR1020117012621A patent/KR20110081341A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-09-06 BR BRPI0212545A patent/BRPI0212545B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-09-06 IL IL16072002A patent/IL160720A0/xx unknown
- 2002-09-06 CN CN028198174A patent/CN1636229B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-09-06 DK DK02761594.7T patent/DK1441591T3/en active
- 2002-09-06 EP EP19202820.7A patent/EP3653055A1/en not_active Withdrawn
- 2002-09-06 NZ NZ531530A patent/NZ531530A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-09-06 MX MXPA04002147A patent/MXPA04002147A/es active IP Right Grant
- 2002-09-06 PT PT2761594T patent/PT1441591T/pt unknown
- 2002-09-06 WO PCT/US2002/028620 patent/WO2003022215A2/en active Application Filing
- 2002-09-06 PL PL02372098A patent/PL372098A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-09-06 US US10/488,744 patent/US20050059151A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-06 CA CA2459713A patent/CA2459713C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-06 KR KR1020147023675A patent/KR101803702B1/ko active IP Right Grant
- 2002-09-06 CN CN201210470111.XA patent/CN102973928B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-09-06 EP EP02761594.7A patent/EP1441591B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-06 JP JP2003526345A patent/JP2005505270A/ja active Pending
- 2002-09-06 ES ES10181985T patent/ES2766299T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-06 ES ES02761594.7T patent/ES2598109T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-06 PT PT101819852T patent/PT2322603T/pt unknown
- 2002-09-06 EP EP10181985.2A patent/EP2322603B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-03-03 IL IL160720A patent/IL160720A/en active IP Right Grant
- 2004-03-05 NO NO20040965A patent/NO338147B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-01-04 HK HK06100064.5A patent/HK1079989A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-05-29 US US12/129,549 patent/US20080254064A1/en not_active Abandoned
- 2008-09-19 AU AU2008221592A patent/AU2008221592B2/en not_active Ceased
-
2011
- 2011-07-04 JP JP2011148711A patent/JP5777956B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-04-18 IL IL219266A patent/IL219266A/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-03-02 JP JP2015040165A patent/JP6114768B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2015-11-16 NO NO20151562A patent/NO20151562A1/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2766299T3 (es) | Composiciones y procedimientos para la activación linfocitaria de células dendríticas monocíticas y células T para generar una respuesta Th-1 | |
| US20090297541A1 (en) | Maturation of dendritic cells | |
| US20120244620A1 (en) | Compositions and methods for inducing the activation of immature monocytic dendritic cells | |
| CA3157004A1 (en) | In vitro methods and compositions for enhancing the activation of dendritic cells and t cells, and for inducing a th-1 immune response | |
| AU2013201707B2 (en) | Compositions and methods for priming monocytic dendritic cells and T cells for Th-1 response | |
| AU2002326846A1 (en) | Compositions and methods for priming monocytic dendritic cells and T cells for Th-1 response | |
| AU2013206016B2 (en) | Compositions and methods for inducing the activation of immature monocytic dendritic cells |