DD275480A1 - Verfahren zur herstellung von zitronensaeure durch aerobe submerse kultivierung von hefen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensaeure durch aerobe submerse Kultivierung von Hefen. Die fermentative Herstellung der Zitronensaeure erfolgt bevorzugt mit dem Stamm Yarrowia (Saccharomycopsis) lypolytica EH 59 - ZIMET 134 - oder Yarrowia (Saccharomycopsis) lipolytica H 181 - ZIMET 43.720 - fuer den Einsatz in der Lebensmittel- und pharmazeutischen Industrie und als Industriechemikalie. Durch Fermentation unter Prozessdruck von 0,15-0,3 MPa, vorzugsweise 0,2 MPa, und bei einer Biomassekonzentration bis zu 40 gkg 1, wird die Produktivitaet gegenueber vergleichbaren Verfahren erhoeht und die Oekonomie des Verfahrens verbessert. Durch die erfindungsgemaesse Verfahrensweise erhaelt man die lineare Proportionalitaet zwischen Biomasse und Produktivitaet, was gemaess Stand der Technik bisher nur fuer Fermentationen mit Biomassekonzentrationen von 20 gl 1 erreicht worden ist.

Description

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung soll an nachfolgenden Beispielen näher erläutert werden, wobei die Beispiele 1 und 2 als Stand der Technik zum Vergleich zur erfindungsgemäßen Verfahrensweise dienen.

Beispiel 1

(bilanzierte Biomassekonzentration 20 g kg"¹, drucklos)

In einen 30-l-Rührfermenter werden 10kg eines Mediums folgender Zusammensetzung gegeben:

(NH₄)₂SO₄ 9,45g-kg"¹

KH₂PO₄ 1,68 g kg"¹

MgSO₄-7 H₂O 0,84g kg"¹

CuSO₄-5 H₂O 0,048g-kg

ZnSO₄- 7 H₂= 0,053g-kg

MnSO₄-5 H₂O 0,048 g-kg

FeSO₄-7 H₂O 8,4 mg kg"

Thiamin-HCI 1,2mg kg'

Die Sterilisation erfolgt in üblicher Weise 30min bei 120⁰C.

Das Thiamin-HCI wird als wäßrige Lösung sterilfiltriert und anschließend zugesetzt. Die Animpfung erfolgt mit 2 kg Inoculum des Stammes Yarrowia (Saccharosemycopsis) lipolytica EH 59-ZIMET134, der im Schüttelkolben auf einem Medium kultiviert wurde, das die gleichen Bestandteile wie das o.g. Produktionsmedium enthält.

Zusätzlich werden dem Medium

Glukose	30,0g	Prozeßdruck	kg"1	71ІПП ІПГІР ПРІРІ"
Hefeextrakt	2,5 g	Prozeßdauer	kg-1	12 kg
CaCO3	5,0 g		•kg"1	20 g kg"1
zugesetzt. Г^АГ Pm^ARfiihri mn μ/ιιιΉαπ fnlnAi	τ На Pa гя		iviutar	4,5
IJtSt г IU^CSfOIUIIl UIIU WUlUOIl IUlUCl Bilanzmasse (Anfangsmasse)	IUO Γα!О		II IlCSlCl	5,0
bilanzierte Biomassekonzentration
pH-Wert Wachstum			100-15%LS
Produktbildung		S4O215%LS
		2 60% LS
		drucklos
рОг-Regime (bezogen auf Normaldruck)		100 h
Wachstum
Übergangsphase
Produktbildung

Die Zuführung der C-Quelle erfolgte als Vorlage von 150g-kg"¹ Glukose mit Nachdosierung. Der pH-Wert wurde mit Natronlauge statiert.

Unter den beschriebenen Bedingungen wurde eine mittlere Produktivität von 1,17 g kg"¹ h als Gesamtsäure (GZS) erreicht.

Beispiel 2

(bilanzierte Biomassekonzentration 30 g kg'¹, drucklos) Durch entsprechende Veränderung des angegebenen Mediums wurde die Biomassekonzentration auf 30g kg"¹ erhöht. Die Prozeßführung erfolgte analog der in Beispiel 1. Erreicht wurde eine mittlere Produktivität von 1,74g GZS · kg"¹ · h"¹

Beispiel 3

(bilanzierte Biomassekonzentration 20g · kg"¹; 0,2MPa) Verbunden mit einem Prozeßdruck von 0,2 MPa wurde die Fermentation bei sonst gleichen Prozeßbedingungen wie in Beispiel 1 angegeben geführt. Die erzielte mittlere Produktivität lag bei 1,37g GZS. kg"¹ · h~\

Beispiel 4

(bilanzierte Biomassekonzentration 30g kg"¹; 0,2MPa) Analog den in Beispiel 2 betriebenen Prozeßbedingungen wurde bei einem Prozeßdruck von 0,2 MPa fermentiert. Es wurde eine mittlere Produktivität von 2,08 g GZS kg"¹ · h"¹ erreicht.

Beispiel 5

(bilanzierte Biomassekonzentration 40g · kg"¹; 0,3MPa) Mit einer Biomassekonzentration 40g · kg"¹, einem Glukosefeeding und einem Prozeßdruck von 0,3 MPa wurde die Fermentation analog dem Beispiel 1 durchgeführt.

Die mittlere Produktivität lag mit 2,77g GZS · kg"¹ · h"¹ im Niveau der Linearität.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch aerobe submerse Kultivierung von Hefen der Gattung Yarrowia (Saccharomycopsis) lipolytica auf Kohlenhydratbasis, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Kultivierung der Hefe mit einem Prozeßdruck von >0,15MPa bis 0,3 M Pa, vorzugsweise 0,2MPa, und bei einer bilanzierten Biomassekonzentration von 20 bis 40 g HTS · kg~¹ gearbeitet wird.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch aerobe submerse Kultivierung von Hefen für den Einsatz in der Lebensmittel- und pharmazeutischen Industrie und als Indusfriechemikalie.

   Charakteristik bekannter technischer Lösungen

   Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Zitronensäure sind seit langer Zeit bekannt.

   Neben den klassischen Verfahren zur Erzeugung von Zitronensäure mit Hilfe der Emers- bzw. Submerstechnologie von Pilzkulturen, vorrangig Aspergillus niger auf Melassebasis, wird in immer stärkerem Maße die Synthese auf der Basis von Hefen unter aeroben submersen Kulturbedingungen genutzt. Dabei kommt eine breite Palette von Kohlenstoffquellen wie n-Alkane, Kohlenhydrate, Essigsäure, Fette, Alkohole zum Einsatz. Die Verwendung von Hefen bietet u.a. den Vorteil, daß aufgrund der Unempfindlichkeit gegenüber mechanischer Beanspruchung Hochleistungsfermentoren eingesetzt werden können, die hinsichtlich des O₂-Eintrages hohe Biomassekonzentrationen und damit hohe Produktivität zulassen. Aus der Definitionsgleichung für die Produktivität

   P = kpx

   Pigkg-'h"¹ - Produktivität

   kp(h^-1) - spezifische Produktbildungsgeschwindigkeit

   x(g-kg^-1) - Biomassekonzentration

   ist abzuleiten, daß die Steigerung der Produktivität sowohl durch Verbesserung der spezifischen Produktbildungsgeschwindigkeit als auch durch Erhöhung der aktiven (bilanzierten) Biomassekonzentration möglich ist. Zahlreiche Patentanmeldungen und Literaturberichte befassen sich mit der Steigerung der Produktivität durch Verbesserung der Ausbeute bzw. der Produktbildungsgeschwindigkeit. Hierbei nimmt die Erhöhung des ZitronensäureVIsozitronensäure-Verhältnisses einen breiten Raum ein, da bei derfermentativen Herstellung mittels Hefen der weniger erwünschte Isozitratanteil sehr hoch sein kann. Vom Einsatz ausgewählter Hefearten, Mutanten und Selektanten (DE-OS 2.115.514; DE-AS 1.812710; DD-WP 130.046; DD-WP 232.309; Ikeno, Y., et al. [1975], J. Ferm. Technol. 53,752-756) bis hin zum Zusatz von Substanzen zur Beeinflussung des Biochemismus der Hefezelle wie Fluoracetat, Cyanoessigsäure, organische heterocyclische Verbindungen (DE-OS 2.212.929; DE-OS 2.360.091; DE-OS 2.451.484; US-PS 3.717.549) sowie dem Einsatz von ausgewählten Substraten bzw. Substratkombinationen (DD-WP 139.870; Asenjo, I., et al. [1982] Biotechnol. Bioeng. Symp. 12,111-120; Franke-Rinker, D., und Mitarbeiter [1983] Zeitschr. AIIg. Mikrobiol. 23,1,9-16; US-PS 4.178.211) reichen die Maßnahmen.

   Obwohl im Hinblick auf die Erhöhung der spezifischen Produktbildungsgeschwindigkeit bzw. der Ausbeute ein beachtliches Niveau erreicht worden ist, wird ein Produktivitätsniveau von 1,0 bzw. 1,5g/kg h nicht überschritten, da zugunsten hoher Produktbildungsgeschwindigkeiten die aktive (bilanzierte) Biomassekonzentration auf relativ niedrige Werte (S 20g/kg) eingestellt wurde (DD-WP 149.875; Marchai et al. [1977] Europ. J. App. Microbiol. 4,111-123).

   Fortschritte im Sinne einer Reduzierung von kostenintensiver Fermentationstechnik werden nur dann erreicht, wenn es gelingt, hohe spezifische Produktbildungsgeschwindigkeiten bei hohen Biomassekonzentrationen zu realisieren. Unter diesem Aspekt sind nur wenige Vorschläge bekannt (DD-WP 204.942; US-PS 4.414.329; Enzminger, J., und Mitarbeiter [1986] Biotechn. Letters 8,1,7-12). Letztere sind dadurch gekennzeichnet, daß zwar die angestrebte Produktivitätssteigerung, jedoch nicht die laut Definitionsgleichung mögliche lineare Proportionalität erreicht wird.

   Es gibt auch zahlreiche Untersuchungen zum Einfluß des Gelöstsauerstoffes und Sauerstoffbedarfs auf die Produktion von Zitronensäure (Stottmeister, U., und Mitarbeiter, Sammelbericht [1982] Zeitschr. AIIg. Mikrobiologie 22,6,414-415). Daher ist bekannt, daß die Kultivierung von Hefen unter erhöhtem Prozeßdruck bei O₂-verbrauchsintensiven Prozessen zur Erhöhung der Sauerstofflöslichkeit angewandt wird (z. B. Futterhefeproduktion).

   Die Angaben zur Wirkung des Sauerstoffs auf die Zitronensäurebildung sind zum Teil widersprüchlich, aber im Ergebnis der Untersuchungen ist festgestellt worden, daß eine Erhöhung der Gelöstsauerstoffkonzentration über einen Grenzwert (40 bis 50% der Luftsättigung) keine Erhöhung der Zitronensäurebildung bewirkt (Marchai, R., et al. [1977] Europ. J. Appl. Microbiol. 4, 111-123; Biffaud, J.,Engasser, M., [1979] Biotechnol. Bioeng. XXI; 2083-2093). Bei Untersuchungen des Druckes selbst sowie der Anwendung von reinem Sauerstoff zur Beeinflussung der Zitronensäureproduktion wurde festgestellt, daß weder der Druck noch reiner Sauerstoff im untersuchten Bereich von 1,0 bis 6,0 atm, entsprechend 0,1 bis 0,6 MPa, einen signifikanten Einfluß auf die Zitronensäureproduktion zeigen (Okoshi, H. [1987] Ageric, Biol. Chem. 51 [1], 257-258).

   Im DD-WP 239.610 wird auf die Verbesserung der Raum-Zeit-Ausbeute bei der Zitronensäureherstellung mittels Hefen durch differenzierte Führung der Gelöstsauerstoffkonzentration in den einzelnen Fermentationsphasen eingewirkt. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß alle Bemühungen zur Verbesserung der Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Zitronensäure zwar Produktivitätssteigerungen bewirken, jedoch bei Biomassekonzentration > 20g HTS Г¹ nicht die aus der theoretischen Betrachtung zu erwartende lineare Proportionalität erzielt wird.

   Ziel der Erfindung

   Das Ziel der Erfindung besteht darin, bei der fermentativen Herstellung von Zitronensäure mittels Hefen die Produktivität zu erhöhen und damit die Investkosten für Fermentationstechnik zu senken.

   Darlegung des Wesens der Erfindung

   Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ausgehend von der Erhöhung der bilanzierten Biomassekonzentration, bei Einhaltung bestimmter Prozeßparameter, eine lineare Proportionalität zwischen Produktivität und aktiver (bilanzierte!·) Biomassekonzentration zu erreichen. Anhand der Beispiele 1 und 2 ist zu erkennen, daß bei druckloser Fermentation (0,10MPa) dieses Ziel nicht erreicht wird, obwohl eine ausreichende Sauerstoffversorgung garantiert war. Dieses Ergebnis entspricht dem dargestellten Stand der Technik.

   Überraschenderweise wurde gefunden, daß bei einem Prozeßdruck von 0,15-0,30MPa, vorzugsweise 0,2MPa, die lineare Proportionalität zwischen Produktivität und aktiver (bilanziertet·) Biomassekonzentration in den Grenzen zwischen 20g kg"¹ und 40g kg"¹ erreicht wird.

   Dieses Ergebnis war nicht vorhersehbar, da üblicherweise der Prozeßdruck zur Erhöhung der O₂-Löslichkeit eingesetzt wird und darüber hinaus gehende Wirkungen aufgrund der komplexen Vorgänge an und in der Zelle nicht logisch abgeleitet, sondern nur durch umfangreiche experimentelle Untersuchungen ermittelt werden können.

   Das erfindungsgemäße Verfahren zur fermentativen Herstellung von Zitronensäure wird im einzelnen wie folgt durchgeführt: In bekannter Weise in mehreren Stufen angezüchtetes Impfmaterial von Hefen der Gattung Yarrowia (Saccharomycopsis) lipolytica, insbesondere der Stamm H181-ZIMET 43720 oder EH 59 ZIMET134 (DD-WP 232.309 bzw. DD-WP 130.046) dient zum Beimpfen des Fermentationsmediums im Verhältnis von 1:10 bis 1:20.

   Das Fermentationsmedium enthält bekannte Stickstoff- und Kohlenstoffquellen sowie die übrigen bekannten Zusätze wie Nährsalze, Spurenelemente und Vitamine. Die Zugabe von Stimulatoren und Fällungsmitteln ist nicht erforderlich. Als Kohlenstoff quelle werden Kohlenhydrate, bevorzugt Monosaccharide, eingesetzt. Die Stickstoffquellen in Form von Ammoniumsalzen befindet sich zu Beginn der Fermentation in der Menge im Fermentationsmedium, daß während der Wachstumsphase 20 bis 40g HTS · kg'¹ Kulturlösung, gebildet werden, während die Kohlenhydratmenge vollständig oder teilweise nachdosiert wird. Die im Prozeß anliegende Kohlenhydratkonzentration wird von 150g · kg"¹ auf 20g · kg"¹ während des Wachstums abgesenkt und dann zwischen 5 und 50g · kg"¹, vorzugsweise 20g kg"¹, gehalten. Bei vollständigem feeding von Glukoselösung wird die Konzentration ebenfalls zwischen 5 und 50g kg"¹, vorzugsweise 20g kg"¹, gehalten. Der pH-Wert liegt in der Wachstumsphase bei 4,5 und wird in der Produktbildungsphase je nach verwendetem Hefestamm zwischen 3,5 und 5,0 statiert. Seine Regulierung erfolgt in bekannter Weise durch Zugabe von Puffersubstanzen zum Fermentationsmedium oder durch Zugabe von Lauge während der Fermentation. Die Sauerstoffversorgung der Kultur erfolgt in bekannter Weise derart, daß der Sauerstoffpartialdruck von 100% Sättigung zu Beginn der Fermentation auf 15% abgesenkt, in der Übergangsphase bei S 40% gehalten und zu Beginn der Produktbildungsphase auf 60% erhöht wird. Erfindungsgemäß erfolgt diese Arbeitsweise jedoch bei einem Druck von 0,15-0,3 MPa. Die Fermentationsdauer beträgt 100 bis 150 Stunden. Die Aufarbeitung der Fermentationslösung und die Gewinnung der Zitronensäure erfolgen nach bekannten Methoden. Bei der beschriebenen Verfahrensweise werden wesentlich höhere Raum-Zeit-Ausbeuten gegenüber den vergleichbaren herkömmlichen Verfahren erzielt. Die Raum-Zeit-Ausbeutesteigerung kann bis zu 100% betragen. Im Hinblick auf die vielfältigen im Stand der Technik dargelegten Bemühungen zur Intensivierung des Produktbildungsprozesses ist das erzielte Ergebnis im Verhältnis zur Einfachheit des Verfahrens überraschend. Darüber hinaus wird in Druckbereichen von 0,15-0,3MPa energetisch günstig gearbeitet. Durch die Steigerung der Produktivität bis zu 100% wird in einer Produktionsanlage mit vorgegebener Produktionskapazität die zu installierende Fermenterkapazität bis zu 50% reduziert. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in Rühr- oder Tauchstrahlfermentoren realisiert werden.