DE69115684T4

DE69115684T4 - Verfahren zur herstellung von sophorosiden durch fermentation mit kontinuierliche zuführung von fettsäureestern und/oder ölen

Info

Publication number: DE69115684T4
Application number: DE69115684T
Authority: DE
Inventors: Jeannine F-92500 Rueil-Malmaison Lemal; Remy F-78400 Chatou Marchal; Caroline F-92500 Rueil-Malmaison Sulzer
Original assignee: IFP Energies Nouvelles IFPEN
Current assignee: IFP Energies Nouvelles IFPEN
Priority date: 1990-12-20
Filing date: 1991-12-17
Publication date: 1997-06-05
Anticipated expiration: 2011-12-18
Also published as: EP0516803A1; JP3170644B2; JPH05506155A; FI923761A; DE69115684T2; FI923761A0; FR2670798B1; DK0516803T3; US5616479A; DE69115684D1; ES2084340T3; FI107738B; CA2075177A1; ATE131875T1; EP0516803B1; CA2075177C; FR2670798A1; WO1992011381A1

Description

Der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Sophorosiden durch Fermentation unter kontinuierlicher Zufuhr des Substrats (fed-batch). Die Sophorosiden werden zum Beispiel in der Kosmetik, bei der Behandlung von Haaren gegen Schuppen und als bakteriostatischer Wirkstoff in Deodorants, im besonderen in der Lactonform EP-B-209783 verwendet.
Es wurde in den Patenten US 3205150 und US 3312684 erwähnt, daß eine Menge an Sophorosiden durch ein Fermentationsverfahren hergestellt wurde, bei dem eine Torulopsis bombicola eingesetzt wurde, und zwar ein Stamm, der gegenwärtig als Candida bombicola klassifiziert wird.
Als Sophoroside wird ein Gemisch aus den beiden Verbindungen die durch die Formeln (1) und (2) dargestellt sind, betrachtet,
in denen R¹ Wasserstoff oder eine Acetylgruppe und R² Wasserstoff oder einen Alkylrest mit ein bis neun Kohlenstoffatomen darstellt, wenn R³ ein gesättigter Kohlenwasserstoffrest mit 7 bis 16 Kohlenstoffatomen ist oder R² Wasserstoff oder eine Methylgruppe darstellt, wenn R³ ein ungesättigter Kohlenwaserstoffrest mit 13 bis 17 Kohlenstoffatomen ist.
Diese Verbindungen sind als Reinigungsmittel und Emulgatoren verwendbar und besitzen hervorragende hygroskopische und hdrophile Eigenschaften aufgrund der Sophorosegruppe, und hydrophobe, vom Fettsäurerest stammende Eigenschaften.
Gleichwohl sind die Sophoroside ein Gemisch zahlreicher Homologer und das Verhältnis der Bildung dieser Homologen variiert abhängig vom Substrat, zum Beispiel einer Kohlenwasserstoffquelle und den Fermentationsbedingungen (FR 2399438).
Folglich variieren die Eigenschaften und die Funktionen dieser Verbindungen mit den Verhältnissen der Homologen aufgrund der Tatsache, daß man im allgemeinen ein Gemisch dieser Homologen verwendet und es erweist sich bis heute als schwierig, ein Produkt mit einem gegebenen Verhältnis durch ein Fermentationsverfahren herzustellen.
Der Stand der Technik kann durch die Schrift Journal of the American Oil Chemists Society, Vol. 65, Nr. 9, Sept. 1988, Champaign, Illinois, USA, Seiten 1460 - 1466: H.J Asmer et al. -"Microbial Production, Structure Eludication and Bioconversion of Sophorose Lipids" beschrieben werden.
Die Herstellung von Sophorosiden wird im allgemeinen in Gegenwart eines Substrates, wie im Patent US 3205150, durchgeführt. Zum Beispiel kann dieses Substrat aus Kohlenwasserstoffen, gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren, Fettsäureestern einschließlich der Glyceride und pflanzlichen Ölen wie Sojaöl, bestehen.
Die Zufuhr wird gewöhnlich diskontinuierlich in Zeitintervallen von ungefähr 12 bis 24 Stunden mit einer Menge von ungefähr 2 Gew.-% im Verhältnis zum ursprünglichen Reaktionsvolumen bei jeder Zugabe durchgeführt.
Es wird betont, daß die Gegenwart von mehr Substratmenge (ungefähr 3 bis 4 %) zu einer Verringerung der Ausbeute gebildeter Sophoroside führt.
Außerdem wird vierundzwanzig bis achtundvierzig Stunden nach der letzten Substratzugabe keine weitere Umwandlung mehr beobachtet.
Dieses Herstellungsverfahren im Satzbetrieb wird auch im Patent US 4297340 beschrieben, wo die Zugabe einer Substratmenge (150 g) sechs Tage lang alle 24 Stunden durchgeführt wird, und die Gesamtdauer der Produktion der Kultur sieben Tage beträgt.
Diese Verfahren der diskontinuierlichen Zufuhr erlauben es. Endausbeuten an rohen Sophorosiden zu erhalten, die 23 % nicht überschreiten und folglich sind sie nur begrenzt produktiv. Die Ursache dieser Begrenzung kann in den lipolytischen Fähigkeiten des Mikroorganismus gesehen werden, der die übrigen Öle oder Ester des Fermentationsmediums in Fettsäuren umwandelt. Diese Fettsäuren sind keine Inhibitoren für das Wachstum des Mikroorganismus, aber sie sind fähig, empfindlich die Herstellungsgeschwindigkeit der Sophoroside zu beeinflussen, wenn sie bereits im Medium vorhanden sind.
Der Gegenstand der Erfindung ist es, den Nachteilen des Stands der Technik abzuhelfen.
Es wurde ein Verfahren zur Herstellung von Sophorosiden gefunden, das es im besonderen erlaubt, die Produktivität des kultivierten Stammes zu verbessem, die Ausbeute an hergestellten Sophorosiden und in Folge die Produktion an gewünschten Sophorosiden.
Genauer gesagt, betnfft die Erfindung ein Verfahren zur Produktion im fed-batch eines Gemisches aus Sophorosiden, bei dem man mindestens einen Stamm Candida bombicola oder Candida apicola in einem mindestens eine Stickstofffquelle enthaltenden Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen kultiviert, so daß man den besagten Stamm erzeugt und den besagten kultivierten Stamm in einer Reaktionszone mit einer Zufuhr von Zucker, vorzugsweise in Überschuß, und einer kontinuierlichen Zufuhr von mindestens einem geeigneten Substrat unter angemessenen Bedingungen der Belüftung, der Temperatur und des pH-Werts unterwirft, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens einmal die folgende Sequenz durchführt:
a) die Ernährung des Stammes mit dem besagten Substrat wird in der Reaktionszone mit einer Ernährungszufuhr zwischen 0,01 und 4 Gramm pro Stunde und pro Liter des Anfangsreaktionsvolumens und während einer Emährungsdauer die so bemessen ist. daß die verbleibende Konzentration an dem besagten Substrat in der Reaktionszone auf einem Wert von höchstens 18 Gramm pro Liter des Ausgangsreaktionsvolumens während der besagten Ernährungsdauer gehalten wird, durchgeführt: und
b) das Gemisch der erzeugten Sophoroside gewonnen wird.
Vorzugsweise kann die kontinuierliche Ernährung mit Substrat nach einem mit der Zeit abfallenden Profil durchgeführt werden.
Nach einem Kennzeichen des Verfahrens umfaßt der Schritt zur Gewinnung des Gemisches an Sopharosiden das Aussetzen der Ernährung mit Substrat oder der Belüftung der Reaktionszone, die Gewinnung der unteren Sophorosidephase, die Wasser enthält, nach Dekantieren und mindestens eine Wäsche der Sophorosiden mit Wasser bei einer Temperatur zwischen im allgemeinen einschließlich 10 und 90 ºC, zum Beispiel 10 bis 60 min lang.
Der verwendete Stamm ist vorteilhatterweise Candida bombicola CBS 6009. Die beobachtete Produktivität ist nämlich hervorragend und die Ausbeute an gebildeten Sophorasiden liegt weit über derjenigen des Standes der Technik.
Die Anwendung des Verfahrens kann auf die folgende Weise geschehen:
einer ersten Art folgend führt man Substrat 7u, indem die Ernährungszufuhr in die Reaktionszone unter den beschriebenen Arbeitsbedingungen geregelt wird, man stoppt die Substratzufuhr, wenn die gesamte zugeführte Menge an Substrat höchstens 280 g/l des Ausgangsreaktionsvolumens erreicht hat und man gewinnt das Gemisch aus Sophorosiden, wie oben beschrieben wurde;
- einer zweiten, vorteilhafteren Art folgend, führt man Substrat zu, indem die Ernährungszufuhr in die Reaktionszone unter Bedingungen geregelt wird, daß die Konzentration an Substrat rahe an einem vorher festgelegten Wert zwischen im allgemeinen einschließlich 0,1 und 18 g/l und vorteilhafterweise zwischen 0,5 und 3 g/l liegt. Sobald die Konzentration an in der Reaktion szene gelöstem O&sub2; sich vorteilhafterweise Null nähert, stoppt man die Zufuhr von Substrat und das Rühren des Fermenters, dekantiert die Lösung, gewinnt die Soo,horosidephase, die man mindestens einmal bei einer Temperatur zwischen einschließlich 10 und 90 ºC wäscht und man führt der Reaktionszone, die von dieser Sophorosidephase befreit wurde, erneut Substrat zu. Man kann also diese Sequenz der Ernährung, der Dekantierung und des Gewinnens wiederbeginnen, bis die Biosynthesefähigkeit der Mikroorganismen erschöoft ist.
Nach einem anderen Kennzeichen des Verfahrens und der kontinuierlichen Ernährung kann die Reaktionszone zu Anfang eventuell einen Zucker im Überschuß und eine Substratkonzentration von 0,5 bis 40 g/l des Anfangsreaktionsvolumens, vorteilhafterweise zwischen 1 und 25 g/l nchaiten und man führt die kontinuierliche Ernährung des besagten Stammes mit Substrat nach iner Dauer von zum Beispiel mehr als 48 Stunden durch, das heißt, wenn die Ausgangskonzentration an Substrat im allgemeinen zwischen einschließlich 0,1 und 15 g/l des Ausgangsreaktionsmediums und vorzugsweise zwischen 0,1 und 5 g/l liegt.
Nach einem anderen vorteilhaften Kennzeichen des Verfahrens, das es erlaubtu gute Ergebnisse zu erzielenu kann die kontinuierliche Ernährungszufuhr mit Substrat in der Reaktionszone zwischen einschließlich 1,0 und 3,0 g/Stunde pro Liter des Ausgangsreaktionsvolumens und vorteilhafterweise zwischen 2,0 und 2,5 g/Stunde pro Liter liegen.
Dieses Substrat umfaßt gewöhnlich mindestens ein tierisches Öl, mindestens ein pflanzliches Öl und/oder mindestens einen Ester des besagten Öles, wobei die besagten Öle und die besagten Ester eine lineare aliphatische (gesättigte oder ungesättigte) Kette mit 10 bis 24 Kohlenstoffatomen umfassen.
Unter den bevorzugten Ölen und Estern können genannt werden: das Öl oder die Methyl- oder Ethylester von Raps-, Sonnenblumen-, Palmen- oder Sojaöl.
Mit den besagten Estern wurden hervorragende Ergebnisse erzielt.
Das Kulturmedium kann eine Quelle von mineralischem Stickstoff (in Form von Ammoniumionen) und/oder organischem Stickstoff, zum Beispiel in Form von Aminosäuren, wie im besonderen Hefeextrakt, Sojapepton, Kaseinhydrolysaten, Maisquellwasser, Weizenglutenhydrolysaten und Fleischextrakten enthalten. Die Zugabe von mineralischen Elementen wie zum Beispiel Kalium, Natrium, Magnesium und Spurenelementen wie Eisen, Mangan und Molybdän in Form ihrer Salze (Sulfate, Phosphate, Chloride) kann ebenfalls das Wachstum verbessern.
Das Kulturmedium kann mindestens einen Zucker wie Glucose oder Saccharose enthalten.
Die Kulturbedingungen sind gewöhnlich die folgenden: Temperatur 18 - 35 ºC; pH 3,0 - 8,0. Ein gutes Aktivitätsniveau wurde bei einer Temperatur zwischen einschließlich 20 und 30 ºC und in einem pH-Bereich von 3,0 bis 5,0 erzielt, und man beobachtet hervorragende Aktivitätsniveaus bei einer Temperatur zwischen einschließlich 22 und 28 ºC und bei einem pH-Wert zwischen 3,5 und 4,0. Die Fermentation vollzieht sich unter antiseptischen Ausgangsbedingungen und aerob.
Nach einem anderen Kennzeichen des Verfahrens kann man den im Kulturmedium vorhandenen Stamm in die Reaktionszone einführen, um ihn mit Zucker und mit Substrat zu versorgen, aber man kann auch nach einem anderen Kennzeichen des Verfahrens den Stamm aus dem Kulturmedium durch Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, abziehen und in die Reaktionszone einführen, wo er mit Zucker und Substrat versorgt wird.
Das Verfahren zur Herstellung von Sophorosiden wird im allgemeinen unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Temperatur: 18 bis 35 ºC, pH: 2,5 bis 8, vorteilhafterweise 3,0 bis 4,0, Luftzufuhr mit Raumgeschwindigkeit 0,2 bis 2 Volumen pro Volumen und Minute unter einem Druck von 1 bis 5 bar und vorzugsweise 1 bis 2 bar (1 bar = 0,1 Mpa).
Während der gesamten Herstellungszeit wird der pH-Wert überwacht und auf einen vorgeschriebenen, in der weiter oben beschriebenen Spanne enthaltenen Wert durch Zugabe von zum Beispiel einer Soda-der Pottaschelösung geregelt.
Die Menge der eingesetzten Zellen im Verhältnis zum Ausgangsreaktionsvolumen liegt gewöhnlich zwischen 1 bis 100 g Trockengewicht pro Liter und vorzugsweise zwischen 10 und 30 g Trockengewicht pro Liter.
Die Erfindung ist im Hinblick auf die beschreibenden folgenden Beispiele besser zu verstehen:

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt eine erfindungsgemäß durchgeführte Fermentation. Der Stamm Candida bombicola CBS 6009 wird zum Animpfen eines Mediums verwendet, das von Glucose abgesehen, ohne Substrat ist. Dieses wird nach dem Animpfen kontinuierlich zugeführt. Es handelt sich um Rapsethylester.
Das folgende Kulturmedium wurde verwendet:
Glucose 100 g/l
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 4 g/l
KH&sub2;PO&sub4; 1 g/l
Mg SO&sub4; x 7 H&sub2;O 0,5 g/l
Getrocknetes Maisquellwasser 5,0 g/l
Glucose und Mg SO&sub4; x 7 H&sub2;O werden in einem Laborfermenter mit einer Kapazität von 4 Litern in 1620 ml Wasser gelöst sterilisiert, während KH&sub2;PO&sub4;, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; und das Maisquellwasser in einem Erlen meyerkolben in 180 ml Wasser gelöst, getrennt sterilisiert werden. Die Sterilisierung der beiden Lösungen wird in einem Autoklaven bei einer Temperatur von 120 ºC 30 Minuten lang durchgeführt und das Kulturmedium wird nach dem Abkühlen der beiden Lösungen gemischt. Es wird mit 200 ml einer in einem Erlenmeyerkolben mit 200 ml desselben Mediums wie das Fermentationsmedium präparierten Vorkultur angeimpft, zu dem aber 1 ml Rapsethylester zugegeben wurde. Dieser Kolben wird mit ungefähr 1 g des tiefgefrorenen Stammes Candida bombicola angeimpft. Er wird unter Schütteln bei einer Temperatur von 25ºC inkubiert. Er liefert nach 24 Stunden die Vorkultur für den Fermenter.
Die Fermentation zur Produktion wird in einem 4 Liter großem Fermenter in einem Ausgangsreaktionsvolumen von zwei Litern durchgeführt.
Das Rühren des Mediums erfolgt mittels einer RAYNERI-Turbine, deren Rotationsgeschwindigkeit 1000 upm beträgt. Die Belüftung ist auf einen Wert der Raumgeschwindigkeit von 0.5 Volumen pro Volumen und Minute Luft unter Atmosphärendruck festgelegt Nach der selbständigen Ansäuerung der Kultur wird der pH-Wert auf einem konstanten Wert von 3,5 mittels einer 4N Sodalösung gehalten, deren Zugabe in den Reaktor durch ein von einem pH-Meter geregeltes Magnetventil gesteuert wird. Der Gehalt an im Kulturmedium gelösten Sauerstoff wird kontinuierlich mittels einer mit einem Schreiber verbundenen Polarimeterelektrode gemessen.
Um jegliche Glucoseknappheit des Mediums zu vermeiden, wird dieser Zucker fünf mal in fester Form zugegeben. Die drei ersten Zugaben erfolgen zu den Zeiten t = 24 h, t = 48 h, t = 72 h, wobei jede 45 g Glucose pro Liter des Ausgangsreaktionsvolumens entspricht, während die beiden letzten zur Zeit t = 96 h und t = 120 h jeweils 32,5 g Glucose pro Liter entsprechen. Die Versorgung mit Rapsethylester erfolgt mittels einer peristaltischen Pumpe, deren Zuführgeschwindigkeit bis zur Zeit t = 96 h auf eine Menge von 2 g/l h und bis zur Zeit t = 144 h auf eine Menge von 1 g/l h festgelegt ist. Die Bildung der Sophoroside wird durch die Entnahme von Proben verfolgt, die nach der Methode von Göbbert et al. (1984, Biotechnol. lett. 6, 225 - 230) gemessen werden. Diese Bildung, die nach dem Wachstum der Mikroorganismen beginnt, steigt mit der Zugabe des Rapsethylesters. Dessen Restkonzentration, gemessen durch Gaschromatographie nach Heißextraktion mit Heptan, ist gleich 0,7 g/l.
Nach 144 h Fermentation werden das Rühren, die Belüftung und die Zufuhr von Rapsethylester gestoppt um die rohen Sophoroside sich eine Stunde lang absetzen zu lassen. Sie werden gesammelt und mit 1,5 l destilliertem Wasser bei einer Temperatur von 45 ºC gerührt. Man läßt sie sich vier Stunden lang erneut absetzen und führt eine zweite Wäsche unter denselben Bedingungen durch. Am Ende der zweiten Wäsche gewinnt man 565 g rohe Sophoroside pro Liter des Ausgangsmediums. Die Produktivität der Fermentation bezogen auf rohe Sophoroside und die Dauer des Versuches beträgt gleich 3,92 g rohe Sophoroside pro Liter Ausgangsmedium und pro Stunde. Der Wassergehalt der rohen Sophoroside beträgt, nach der Karl-Fischer- Methode gemessen, 45 %. Berücksichtigt man die Mengen an Ester und Zucker, die zugeführt worden sind, und die gleich 300 und 240 g/l, respektive, sind, übersteigt die Ausbeute an wasserfreien Sophorosiden bezogen auf die Summe Glucose plus Ester 59,5 %. Die Bildung, die Produktivität und die Ausbeuten wurden ebenfalls 96 Stunden Kultivierungsdauer (direkt vor der vierten Zugabe von Glucose), zum Vergleich mit dem Verlauf der diskontinuierlichen Zufuhr des Esters, gemessen (Beispiel 2). Nach 96 Stunden entspricht die Produktion an rohen Sophorosiden 295 g/l und die Produktivität 3,07 g/l h. Die Ausbeute der Umwandlung von "Glucose plus Ethylester" in wasserfreie Sophoroside ist also gleich 38 %.

Beispiel 2 (vergleichend)

Man beginnt wie in Beispiel 1, ersetzt aber die kontinuierliche Versorgung mit Rapsethylester durch eine Zugabe von 20 g/l Rapsethylester alle 12 Stunden. Die erste Zugabe findet direkt nach der Animpfung im Fermenter statt. Wie in Beispiel 1 verfolgt man die Kinetik der Bildung der rohen Sophoroside im Fermentationsmedium. Diese beginnt am Ende des Wachstums, aber sie endet vorzeitig nach 96 Stunden, zur gleichen Zeit, wie die 9. Zugabe des Rapsethylesters. Wenn man die Zugabe des Ethylesters fortsetzen würde, könnte man obendrein nicht die Gewinnung der Sophoroside, die innig mit dem übrigen Ethylester vermischt sind, durch Phasentrennen durchführen. Nach 96 Stunden gewinnt man 210 g/l rohe Sophoroside. Die berechnete Produktivität bezogen auf rohe Sophoroside und auf die Dauer von 96 Stunden ist gleich 2,18 g/l h. Die Ausbeute der Umwandlung von "Glucose (235 g/l) plus Rapsethylester (180 g/l)" in wasserfreie Sophoroside (Feuchtigkeitsgehalt: 45 %) ist gleich 27,8%. Diese Ergebnisse liegen unterhalb derjenigen, die nach der selben Zeit im Beispiel 1 erhalten wurden.

Beispiel 3

Beispiel 1 wird bis zu einer Zeit t = 95 h wiederholt, dem Zeitpunkt, an dem der im Medium gelöste Sauerstoff fast ganz erschöpft ist. Während dieser ersten Periode ist die Konzentration an überschüssigem Rapsethylester im Fermentationsmedium gleich 0,54 g/l. Dann werden das Rühren, die Belüftung und die Versorgung mit Ester 15 Minuten lang eingestellt und die abgesetzten Sophoroside werden abgezogen Dann werden das Rühren, die Belüftung und die Versorgung des Fermenters mit Ester wieder in Gang gesetzt und der Versuch wie folgt fortgesetzt:
man gibt 45 g/l Glucose zur Zeit t = 96 h und t = 120 h und dann 32,5 g/l bei t = 144 h zu. In der 96. Stunde reduziert man die Geschwindigkeit der Versorgung mit Ethylester von 2 g/l h auf 1,6 g/l h und führt die Zufuhr mit dieser Geschwindigkeit bis zu t = 144 h fort. Zu diesem Zeitpunkt verringert man nochmals die Geschwindigkeit der Versorgung mit Ethylester auf 0,92 g/l h bis zu t = 168 h. Anschließend führt man ein zweites Gewinnen von Sophorosiden durch Absetzen durch, und stellt fest, daß die Biosynthesekapazitäten des Mikroorganismus nicht erschöpft sind. Die zu den Zeitpunkten t = 95 h und t = 168 und gewonnenen rohen Sophoroside werden vereinigt und zweimal wie in Beispiel 1 gewaschen. So gewinnt man 705 g/l roher Sophoroside nach 168 h Kulturdauer. Die berechnete Produktivität der Fermentation bezogen auf die Versuchsdauer beträgt 4,19 g/l h für eine Menge an geliefertem Zucker von 357,5 g/l und eine Menge an Ethylester von 290 g/l. Die Ausbeute an wasserfreien Sophorosiden beträgt 59,8 % bezogen auf beide Substrate.

Beispiel 4

Man wiederholt Beispiel 1, indem man 24 g/l Rapsethylester zum Kulturmedlum zugibt und man beginnt mit der kontinuierlichen Versorgung mit Ethylester zwölf Stunden nach dem Animpfen. Die Zufurgeschwindigkeit ist auf 2 g/l h bis zu t = 96 h und dann 1 g/l h bis 144 h festgelegt. Man gewinnt nach 144 Stunden 550 g/l roher Sophoroside pro Liter des Ausgangsmediums. Die Produktivität bezogen auf rohe Sophoroside beträgt 3,82 g/l h und die Ausbeute an wasserfreien Sophorosiden beträgt 56 %.

Beispiel 5

Man wiederholt Beispiel IV indem man den Rapsethylester gegen Rapsmethylester ersetzt. Man gewinnt am Ende des Versuches 525 g/l roher Sophoroside, was einer Produktivität an rohen Sophorosiden von 3,64 g/l h und einer Ausbeute an wasserfreien Sophorosiden von 53,4% bezogen auf die Summe "Glucose plus Ester" entspricht.

Beispiel 6

Man wiederholt Beispiel 1, indem man den Rapsethylester gegen Sonnenblumenmethylester ersetzt. Man gewinnt am Ende des Versuches 505 g/l roher Sophoroside, was einer Produktivität von 3,50 g/l h und einer Ausbeute an wasserfreien Sophorosiden von 51,4% bezogen auf die Summe "Glucose plus Methylester" entspricht.

Beispiel 7

Man wiederholt Beispiel 1, indem man den Rapsethylester gegen Rapsöl ersetzt. Die Geschwindigkeit der Ölzufuhr ist auf 1.2 g/l h bis zu t = 96 h und dann auf 0,60 g/l h festgelegt. Die drei ersten Glucosezugaben zu den Zeiten t = 24 h, t = 48 h und t = 72 h entsprechen jeweils 30 g/l während die beiden letzten bei t = 96 h und t = 120 h jeweils 20 g/l des Ausgangsmediums entsprechen. Nach einer Kulturzeit von z.B. 144 Stunden gewinnt man 380 g roher Sophoroside, was einer Produktivität von 2.64 g/l h an rohen Sophorosiden und einer Ausbeute von 53 % wasserfreier Sophoroside (Wassergehalt: 45 %) entspricht.

Claims

1. Verfahren zur Produktion im fed-batch eines Gemisches aus Sophorosiden, bei dem man mindestens einen Stamm Candida bombicola oder Candida apicala in einem eine Stickstofffquelle enthaltenden Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen kultiviert, so daß man den besagten Stamm erzeugt und den besagten kultivierten Stamm in einer Reaktionszone mit einer Zufuhr von Zucker und einer Zufuhr von mindestens einem geeigneten Substrat unter angemessenen Bedingungen der Belüftung, der Temperatur und des pH-Werts unterwirft, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens einmal die folgende Sequenz durchführt:

a) die Ernährung des Stammes mit dem besagten Substrat wird in der Reaktionszone mit einer kontinuterlichen Ernährurgszuruhr zwischen 0,01 und 4 Gramm pro Stunde und pro Liter des Anfangsreaktionsvolumens und während einer Ernährungsdauer, die so bemessen ist, daß die verbleibende Konzentration an dem besagten Substrat in der Reaktionszone auf einem Wert von höchstens 18 Gramm pro Liter des Ausgangsreaktionsvolumens während der besagten Ernährungsdauer gehalten wird, durchgeführt: und

b) das Gemisch der erzeugten Sophoroside gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Schntt zur Gewinnung des Gemisches von Sophorosiden das Anhalten der Versorgung mit Substrat oder der Belüftung der Reaktionszone, die Gewinnung der unteren Wasser enthaltenden Sophorosidenphase nach dem Absetzenlassen und mindestens eine Wäsche der Sophorosiden mit Wasser bei einer Temperatur zwischen einschließlich 10 und 90 ºC 10 bis 50 Minuten lang umfaßt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, bei dem die Versorgung mt Substrat angehalten wird, wenn die Sauerstoffkonzentration in der Reaktionszone fast gleich Null ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, bei dem die Versorgung mit Substrat angehalten wird, wenn die Gesamtmenge des zugesetzten Substrates höchstens 280 g/l des Ausgangsreaktionsvolumens erreicht.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem man die Herstellung der Sophorosiden bei einer Temperatur von 18 bis 35 ºC, bei einem pH-Wert von 2,5 bis 8 und in Gegenwart eines Überschusses an Zucker durchführt und bei der man die Reaktionszone mit einem Durchsatz von Luft mit einer Raumgeschwindigkeit von 0,2 bis 2 Volumen pro Volumen und Minute unter einem Druck von 1 bis 5 bar versorgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das Substrat mindestens ein tierisches Öl, mindestens ein pflanzliches Öl und/oder mindestens einen Ester des besagten Öls enthält und der besagte Ester eine lineare aliphatische Kette mit 10 bis 24 Kohlenstoffatomen umfaßt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem der Stamm Candida bombicola CBS 6009 ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Kulturmedium Zucker enthält.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem der Substratdurchsatz in der Reaktionszone zwischen 1,0 und 3,0 g/l h des Ausgangsreaktionsvolumens beträgt.

10.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem der Stamm aus einer ex-situ durchgeführten Kultur stammt.

11.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem man den besagten im Kulturmedium enthaltenen Stamm mit Zucker und Substrat versorgt.

12.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem die Reaktionszone ursprünglich eine Substratkonzentration von 0,5 bis 40 g/l des Ausgangsreaktionsvolumens enthält und man mit der kontinuierlichen Versorgung des besagten Stammes mit Substrat fortfährt, wenn die Ausgangskonzentration des Substrats zwischen 0,1 und 15 g/l liegt.

13.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem die Menge der eingesetzten Zellen bezogen auf das Reaktionsvolumen zwischen 1 bis 100 g Trockengewicht pro Liter liegt.