FI107738B - Menetelmä soforosidien valmistamiseksi fermentoimalla ja lisäämällä jatkuvasti rasvahappoestereitä tai öljyjä - Google Patents

Description

107738

Menetelmä soforosidien valmistamiseksi fermentoimalla ja lisäämällä jatkuvasti rasvahappoestereitä tai öljyjä 5 Keksintö koskee menetelmää soforosidikoostumuksen valmistami seksi fermentoimalla täydentämällä jatkuvasti substraattia (erittäin) . Soforosideja käytetään esim. kosmetologiassa, hiusten hilsekäsittelyssä ja bakteriostaattisena aineena deodoranteissa, etenkin laktonimuodossa (EP-B-0.209.783).

10 US-patenteissa 3.205.150 ja 3.312.684 on esitetty, että erä soforosideja valmistetaan fermentointimenetelmällä käyttämällä Torulopsis bombicola -viljelmää, joka kanta luokitellaan tällä hetkellä nimellä Candida bombicola.

15

Soforosidien katsotaan olevan kaavojen (1) CH,CR1 , 20 jr~1 f tj/w \i-0-c—13—cooh H0\QHH/H h

H

25 CH^Ca1 _ _ _

: Λ /H V M

f; : 1 : i-i ··.·.· 30 H oh • · • · • · · • · ja (2) ♦ · • · ♦ 0 ··· • · • · · • ♦ • · » ♦ *·♦ > · · • · • · * · • · 2 107738 CHnCR1 , 5 o-°\ "

Vh \j-O-C-M

ho\Ph h/h

H

10 CH-jCn*' -o RJ [s) f \ w»

15 H OH

0 " ^ mukaisten yhdisteiden seos, joissa kaavoissa R1 merkitsee 2 0 vetyä tai asetyyliryhmää ja R2 merkitsee vetyä tai 1-9 hiiliatomia sisältävää alkyyliryhmää silloin, kun R3 on tyydyttynyt, 7-16 hiiliatomia sisältävä hiilivetyryhmä, tai R2 merkitsee vetyä tai metyyliryhmää silloin, kun R3 on tyy-•:..j dyttymätön, 13 - 17 hiiliatomia sisältävä hiilivetyryhmä.

. 25 Näitä yhdisteitä voidaan käyttää puhdistusaineina ja emul- • ·» I. . gointlaineina ja niillä on erinomaiset hygroskooppiset ja • ♦ \ hydrofiiliset ominaisuudet soforoosi-ryhmän ansiosta ja hydrofobiset ominaisuudet rasvahapon ansiosta.

: 30

Kuitenkin soforosidit ovat useiden homologien ryhmä ja näiden • * .*·· homologien muodostumissuhde vaihtelee niiden substraatin, esim. hiilivetylähteen samoin kuin fermentointiolosuhteiden ·]·, funktiona (FR-A-2.399.438) . Siten näiden yhdisteiden ominai- ♦ · 35 suudet ja vaikutukset vaihtelevat homologien suhteiden mukai- **· sesti ottaen huomioon, että yleensä käytetään yhtä homologien ryhmää, ja tähän asti on ollut vaikeaa valmistaa fermentoin- • · • ♦ ♦ 3 107738 timenetelmällä tuote, jolla on määrätty suhde.

Tunnettu alan taso on esitetty julkaisussa Journal of the American Oil Chemists Society, voi. 65, n:o 9, syyskuu 1988, 5 Champaign, Illinois, USA, s. 1460 - 1466 artikkelissa H. J.

Asmer et ai.: "Microbiological production, structure elucidation and bioconversion of sophorose lipids".

Soforosidit valmistetaan yleensä substraatin, kuten esim.

10 US-patentissa 3.205.150 esitetyn substraatin läsnäollessa.

Tämä substraatti voi olla esimerkiksi hiilivetyjen, tyydyttyneiden tai tyydyttämättömien rasvahappojen, happoestereiden, mukaanlukien glyseridien, kasviöljyjen, kuten soijaöljyn jne. muodossa. Täydennys tapahtuu yleensä jaksottain n. 12-24 15 tunnin välein määrän ollessa n. 2 paino-% perustuen lähtö- reaktiomäärään joka lisäyksen yhteydessä.

On todettu, että suuremman substraattimäärän (n. 3 - 4 %) läsnäolo johtaa valmistettujen soforosidien saannon pienene-20 miseen. Lisäksi 24 - 48 tuntia lopullisen substraatin lisäyk sen jälkeen ei havaita mitään lisämuuntoa.

Tätä erätuotantomenetelmää on selitetty myös US-patentissa . 4.297.340, jossa substraattierä (150 g) lisätään joka 24 25 tunnin kuluttua 6 päivän ajan, jolloin koko viljelytuotanto-

« · I

aika on 7 päivää.

• · • · • · · ·· · • V Tämä keskeytyvä syöttömenetelmä mahdollistaa sen, että saa- • · !/.: daan lopullisia raa'an soforosidin tuotantotasoja, jotka ovat 30 alle 23 %, joten saannot ovat rajoitettuja. Tämän rajoituksen syynä on mikro-organismin lipolyyttinen kyky muuntaa fermen- ,·; : tointialustan jäljellä olevat esterit tai öljyt rasvahapoik- « · ♦;·. si. Nämä rasvahapot eivät inhiboi mikro-organismin kasvua, • m '· vaan ne ovat taipuvaisia vaikuttamaan merkittävästi sofo- • · .*.* 35 rosidituotannon nopeuteen niiden ollessa jo läsnä alustassa.

··· • · · ···. Keksinnön tehtävänä on eliminoida tunnetun alan tason haitat.

··· i · • · • · 4 107738

On keksitty menetelmä soforosidien valmistamiseksi, joka menetelmä mahdollistaa etenkin viljellyn kannan tuottavuuden, tuotettujen soforosidien saannon ja siten aiottujen soforosidien tuotannon parantamisen.

5

Yksityiskohtaisemmin keksintö koskee menetelmää soforosidi-koostumuksen valmistamiseksi erittäin, jossa menetelmässä viljellään vähintään yhtä Candida bombicola tai Candida apicola -kantaa viljelyalustassa, joka käsittää typpilähteen, 10 sopivissa olosuhteissa kannan viljelemiseksi, ja viljeltyyn kantaan syötetään reaktioalueella edullisesti ylimäärä sokeria ja vähintään yhtä sopivaa substraattia riittävissä ilmastus-, lämpötila- ja pH-olosuhteissa. Menetelmälle on tunnusomaista, että seuraavat vaiheet suoritetaan ainakin ker-15 ran: a. kantaa täydennetään substraatilla syöttövirtausnopeuden ollessa reaktioalueella 0,01 - 4 g/h/1 lähtöreaktiomäärää ja syöttöajan ollessa sellainen, että substraatin jäljellä oleva konsentraatio reaktioalueella pidetään arvossa, joka on 20 korkeintaan 18 g/1 lähtöreaktiomäärää tälle syöttöajalle, ja b. tuotettu soforosidikoostumus otetaan talteen.

Substraatin jatkuva syöttö voi tapahtua edullisesti ajalli- φ'. sesti vähenevän profiilin mukaisesti.

♦ » 25 • ♦ ♦ ]··♦1 Menetelmän erään piirteen mukaisesti soforosidikoostumuksen * · • 2 3 talteenottovaihe käsittää substraatin syötön tai reaktioalu- ·· · : V een ilmastuksen pysäyttämisen, alemman vettä sisältävän • · :.1·· soforosidifaasin talteenoton laskeutumisen jälkeen ja vähin- 30 tään yhden soforosidien pesun vedellä yleensä 10 - 90 °C:n lämpötilassa esim. 10 - 60 minuutin ajan.

* · • · · • · • · ·«·. Käytetty kanta on edullisesti Candida bombicola CBS 6009.

• ·

Havaittu tuottavuus on tällöin erinomainen ja tuotettujen • · 2 • · ·1.1 35 soforosidien saanto on selvästi parempi kuin tunnetulla alan • ·♦ ...· tasolla.

3 »»· » · • · • · » · 5 107738

Menetelmä voidaan suorittaa kahden suoritusmuodon mukaisesti. Ensimmäisessä suoritusmuodossa substraattia syötetään säätämällä syöttönopeus reaktioalueelle edellä mainitussa toimintaolosuhteissa, jolloin substraatin syöttö pysäytetään, kun 5 ruiskutetun substraatin kokonaismäärä saavuttaa suunnilleen korkeintaan 280 g1r1 lähtöreaktiomäärästä, ja soforosidi-koostumus otetaan talteen edellä esitetyllä tavalla. Toisen, edullisemman suoritusmuodon mukaisesti substraattia syötetään säätämällä syöttönopeus reaktioalueella sellaisissa olosuh-10 teissä, että jäljellä oleva substraattikonsentraatio on lähellä edullisesti kiinteää arvoa, joka on yleensä 0,1 - 18 ja etenkin 0,5 - 3 g·!'1. Heti, kun 02-konsentraatio liuenneella reaktioalueella on edullisesti lähes 0, substraatin syöttö ja fermentointilaitteen sekoitus pysäytetään, liuoksen 15 annetaan laskeutua, soforosidifaasi otetaan talteen ja pes tään vähintään kerran 10 - 90 °C:n lämpötilassa ja substraatti syötetään jälleen reaktioalueelle soforosidifaasista vapautettuna. Siten on mahdollista aloittaa uudelleen tämä syöttö-, laskeutus- ja talteenottojakso, kunnes mikro-or-20 ganismin biosynteesikapasiteetti on käytetty loppuun.

Menetelmän ja jatkuvan syötön erään toisen piirteen mukaisesti reaktioalue voi sisältää aluksi valinnaisesti sokeria . ylimääränä ja substraattikonsentraationa 0,5 - 40 g1l'1 • · . 25 lähtöreaktiomäärästä ja edullisesti 1 - 25 g1r1 ja kantaa * « · ..1··1 täydennetään jatkuvasti substraatilla esim. korkeintaan 48 • · * 2 tunnin aikajakson jälkeen, s.o. kun substraatin lähtökonsent- • 1 · . , ' .1 raatio on yleensä 0,1 - 15 g1l'Vl lähtöreaktioalustaa ja • · edullisesti 0,1 - 5 g1l'1.

·«« V ·1 3 0

Menetelmän erään toisen edullisen piirteen mukaisesti, joka mahdollistaa hyvien tulosten aikaansaamisen, jatkuvan subst- • ♦ *:1. raattisyötön nopeus reaktioalueella voi olla 1,0 - 3,0 g •h'1·!'1 lähtöreaktiomäärästä ja edullisesti 2,0 - 2,5 ·’·1 35 g^h'1·!'1.

>2 Tämä substraatti sisältää yleensä vähintään yhtä eläinöljyä, ► ·· « 2 • · 6 107738 vähintään yhtä kasviöljyä ja/tai vähintään yhtä mainitun öljyn esteriä, jolloin öljyt ja esterit käsittävät alifaatti-sen suoran ketjun tyydyttyneessä tai tyydyttymättömässä muodossa, jossa on 10 - 24 hiiliatomia.

5

Edullisista öljyistä ja estereistä mainittakoon rapsiöljy, auringonkukkaöljy, palmuöljy tai soijaöljy ja niiden metyyli-tai etyyliesterit.

10 Erinomaisia tuloksia saadaan mainituilla estereillä.

Viljelyalusta voi sisältää mineraalityppilähteen (ammoniumio-nien muodossa) ja/tai orgaanista typpeä, esim. aminohappojen, kuten etenkin hiivauutteen, soijapeptonin, kaseiinihydro-15 lysaattien, maissi/vilja-maserointinesteen, vehnägluteeni- hydrolysaattien ja lihauutteiden muodossa. Mineraalialkuai-neiden, kuten kaliumin, natriumin, magnesiumin ja oligoele-menttien, kuten raudan, mangaanin, molybdeenin lisäys niiden suolojen muodossa (sulfaatit, fosfaatit, kloridit) voi myös 20 parantaa edelleen kasvua. Viljelyalusta voi sisältää vähin tään yhtä sokeria, kuten glukoosia tai sakkaroosia.

Viljelyolosuhteina on yleensä 18 - 35 °C:n lämpötila ja pH 3 - 8. Hyvä aktiivisuustaso on saatu aikaan 20 - 30 °C:n lämpö- • · 25 tilassa pH-alueella 3 - 5 ja erinomaisia aktiivisuustuloksia • · · .Γ* on havaittu 22 - 28 °C:n lämpötilassa ja pH-alueella 3,5 - 4.

• · · *. . Fermentointi tapahtuu aseptisissa ja aerobioottisissa lähtö- t · · * ·* olosuhteissa.

• · r · « * M • » • ·« V 1 30 Menetelmän erään toisen piirteen mukaisesti on mahdollista johtaa viljelyalustaan sisältyvä kanta reaktioalueelle subst-raatin ja sokerin syöttämiseksi siihen, mutta erään toisen *·*: menetelmän piirteen mukaisesti kanta voidaan poistaa viljely- alustasta tunnetuilla menetelmillä ja ohjata se reaktioalu-35 eelle, jossa siihen syötetään substraattia ja sokeria.

♦ **; Soforosidin valmistusmenetelmä suoritetaan yleensä seuraavis- • · • · 7 107738 sa olosuhteissa: lämpötila 18 - 35 °C, pH 2,5 - 8 ja edullisesti 3-4, ilmastuksen virtausnopeus 0,2-2 v.v.m 1 - 5 ja edullisesti 1-2 baarin (1 baari = 0,1 MPa) paineessa.

5 Koko tuotannon ajan tarkistetaan pH ja säädetään haluttuun arvoon, joka on yllä esitetyllä alueella, lisäämällä esim. kali- tai soodaliuosta.

Käytettyjen solujen määrä verrattuna lähtöreaktiomäärään on 10 yleensä 1 - 100 g kuivapainosta/1 ja edullisesti 10 - 30 g kuivapainosta/1.

Keksintö selviää lähemmin seuraavista ei-rajoittavista valaisevista esimerkeistä: 15 ESIMERKKI 1 Tässä esimerkissä selitetään keksinnön mukaisesti suoritettua fermentointia. Kantaa Candida bombicola CBS 6009 käytetään 20 alustan siementämiseksi, joka glukoosista riippumatta on ilman substraattia, jota lisätään jatkuvasti siementämisen jälkeen. Se on rapsiöljyetyyliesteriä. Käytetään seuraavaa vilj elyalustaa: • *··· * 4 , 25 glukoosia 100 g-1'1 ί:Γ (NH4)2S04 4 g-r1 |\\ KH2P04 1 g-r1 V. MgSO4-7H20 0,5 g-r1 kuivattua viljamasetointinestettä 5,0 g-1'1 > · · '·* * 3 0

Glukoosi ja MgS04-7H20 steriloidaan 4 l:n laboratoriofermen- .*·? tointilaitteessa liuotettuna 1620 ml:aan vettä, kun taas ··* ,1 · KH2P04, (NH4)2S04 ja viljaneste steriloidaan erikseen erien- •m V. meyer-pullossa liuotettuna 180 ml:aan vettä. Näiden kahden » · ··», 35 liuoksen sterilointi tapahtuu autoklaavissa 120 °C:n lämpöti- '** lassa 30 minuutin kuluessa ja viljelyalusta muodostetaan ...* uudelleen näiden kahden liuoksen jäähtymisen jälkeen. Se • ♦ Φ» 8 107738 siemennetään 200 ml:lla esiviljelmää, joka on valmistettu erlenmeyer-pullossa, jossa on 200 ml samaa alustaa kuin fermentointialusta, mutta johon on lisätty 1 ml rapsiöljy-etyyliesteriä. Tämä pullo siemennetään n. l g:11a Candida 5 bombicola -kannan jähmää. Sitä inkuboidaan samalla sekoittaen 25 °C:ssa ja 24 tunnin kuluttua se tuottaa fermentointilait-teen esiviljelmän. Tuotantofermentointi tapahtuu fermentoin-tilaitteessa, jonka kapasiteetti on 4 litraa, ja 2 litran lähtöreaktiomäärällä.

10

Alustaa sekoitetaan käyttämällä RAYNERI-turbiinia, jonka kierrosnopeus on 1000 rpm (kierrosta/min.). Ilmastukseksi säädetään 0,5 v.v.m. ilmaa atmosfäärisessä paineessa. Viljelmän itsehapottumisen jälkeen alustan pH pidetään vakiossa 15 arvossa 3,5 4N soodaliuoksella, jonka lisäystä reaktoriin valvotaan sähköventtiiIillä pH-mittarin mukaisesti. Viljely-alustan liuenneen hapen pitoisuus mitataan jatkuvasti rekis-teröintilaitteeseen kytketyn polarografisen elektrodin avulla.

20

Mahdollisen glukoosiväliaineen rajoituksen ehkäisemiseksi sokeria lisätään 5 kertaa kiinteässä muodossa. Kolmena ensimmäisenä kertana ajankohtina t = 24 h, t = 48 h ja t = 72 h, joista kukin vastaa 45 g:aa glukoosia/1 lähtöalustaa, kun 25 taas kahtena viimeisenä kertana ajankohtina t = 96 h ja t = 120 h, joista kumpikin vastaa 32,5 g:aa glukoosia/1. Rapsiini öljyetyyliesterin syöttö saadaan aikaan peristalttisella ·**.. pumpulla, jonka syöttönopeudeksi säädetään 2 g1r,1hl ajankoh- • ·1·1: taan t = 96 h asti ja sitten 1 g·!'1 «h'1 ajankohtaan t = 144 h • · .·. j 30 asti. Soforosidituotantoa seurataan ottamalla näytteitä ja • · mittaus tapahtuu menetelmällä, jonka ovat esittäneet Göbbert • · 1 et ai (1984, Biotechnol. lett. 6, 225 - 230). Tämä tuotanto, , . joka käynnistyy mikro-organismin kasvulla, kasvaa rapsiöljy- • · · etyyliesterin lisäyksen avulla. Viimeksi mainitun jäljellä • · · *·] 35 oleva konsentraatio mitattuna kaasukromatografialla heptaa- nilla suoritetun kuumauuttamisen jälkeen on 0,7 g1r‘.

• · ··♦ • · « · ··« • · · • · • · • · · • · ♦ • · # · • ♦ 9 107738 144 tunnin kuluttua fermentointi, sekoittaminen, ilmastus ja etyyliesterin syöttö pysäytetään ja raakojen soforosidien annetaan laskeutua 1 tunnin ajan. Ne otetaan talteen ja niihin sekoitetaan 1,5 1 tislattua vettä 45 °C:ssa. Niiden 5 annetaan jälleen laskeutua 4 tunnin ajan ja sitten suorite taan toinen pesu samoissa olosuhteissa. Toisen pesun jälkeen otetaan talteen 565 g raakoja soforosideja/1 lähtöalustaa. Fermentoinnin tuottavuus laskettuna raakojen soforosidien ja . testin keston perusteella on siten 3,92 g raakoja soforoside-10 ja/litra lähtöalustaa/tunti. Raakojen soforosidien vesipitoi suus mitattuna Karl-Fischer-menetelmällä on 45 %. Ottaen huomioon sokeri- ja esterimäärät, jotka syötetään ja ovat vastaavasti 300 ja 240 g1r', vedettömän soforosidin tuotannon saanto on 59,5 % perustuen glukoosin plus esterin summaan.

15 Tuotanto, tuottavuus ja saannot mitataan myös 96 tuntia kestäneen viljelyn jälkeen (välittömästi ennen glukoosin neljättä lisäystä) vertailua varten keskeytyvän esterisyötön kanssa (esimerkki 2). 96 tunnin kuluttua raa'an soforosidin tuotanto on 295 g2r‘ ja siten tuottavuus on 3,07 g1r'.

20 "Glukoosin plus etyyliesterin" muunnon saanto vedettöminä soforosideina on tällöin 38 %.

ESIMERKKI 2 (vertailu) 25 Esimerkki 1 toistetaan korvaamalla jatkuva rapsiöljyetyylies- ’·3 terin syöttö lisäämällä joka 12. tunti 20 g‘1'1 rapsiöljyetyy- liesteriä. Ensimmäinen lisäys tapahtui välittömästi fermen- :2.. tointilaitteen siementämisen jälkeen. Esimerkin l mukaisesti ♦’·1: seurataan raa'an soforosidin tuotantokinetiikkaa fermentoin- ♦ ♦ .2.4j 30 tialustassa. Se käynnistyy kasvun lopussa, mutta pysähtyy • ♦ ennenaikaisesti 96 tunnin kuluttua samanaikaisesti rapsiöljy- > 1.2 1 etyyliesterin 9. lisäyksen kanssa. Jatkamalla etyyliesteri- . . lisäyksiä lienee myös mahdotonta ottaa talteen laskeutuksen « · · *..2 avulla soforosideja, jotka pysyvät perusteellisesti sekoitet- • · · *·[ 1 35 tuina jäljellä olevan etyyliesterin kanssa. 96 tunnin kulut- tua otettiin talteen ainoastaan 210 α·Γ' raakoja soforoside- :3: ja. Tuottavuus perustuen raakoihin soforosideihin ja 96 tun- • · · · · • « 2 • « 3 • · • 1 · • · · • « 10 107738 nin aikajaksoon on 2,18 g1l'11h·1. "Glukoosin (235 g‘1'1) plus rapsiöljyetyyliesterin (180 g·!'1)" muunnon saanto vedettöminä soforosideina (kosteuspitoisuus 45 %) on 27,8 %. Nämä tuotantoluvut ovat alhaisempia kuin esimerkissä 1 samana aikana 5 saadut luvut.

ESIMERKKI 3

Esimerkki 1 toistetaan ajankohtaan t = 95 asti, jolloin 10 esiintyy alustan liuenneen hapen olennaisesti täydellinen poistuminen. Tämän ensimmäisen jakson aikana fermentoin-tialustan jäljellä oleva rapsiöljyetyyliesterikonsentraatio on 0,5 g1r’. Sekoittaminen, ilmastus ja esterin syöttö pysäytetään 15 minuutin ajaksi ja laskeutuneet soforosidit poiste-15 taan. Fermentointilaitteen ilmastus, sekoittaminen ja esterin syöttö aloitetaan uudelleen ja testiä jatketaan seuraavalla tavalla: lisätään 45 g1r' glukoosia ajankohtina t = 96 h ja t = 120 h ja sitten 32,5 g1l'1 ajankohtana t = 144 h. 96. tuntina etyyliesterin syöttönopeus vähenee arvosta 2 g·!11 »h11 2 0 arvoon 1,6 g·!1·h"1 ja syöttöä jatketaan tällä nopeudella ajankohtaan t = 144 h asti. Tällöin esterin syöttönopeutta vähennetään jälleen arvoon 0,92 g·!'1·]!1 ajankohtaan t = 168 h asti. Tämän jälkeen soforosidia otetaan talteen toisen kerran laskeuttamalla eikä mikro-organismin biosynteesikapasiteettiä 25 ole käytetty loppuun. Ajankohtina t = 95 h ja t = 168 h talteenotetut raa'at soforosidit yhdistetään ja pestään : kahdesti esimerkin 1 mukaisesti. Tämä tuottaa 705 g'1'1 raako- ·1·.. ja soforosideja 168 tuntia kestäneen viljelyn jälkeen. Fer- ·’·1: mentoinnin tuottavuus perustuen testin kestoon on 4,19 « · .·. : 30 g1l'11h'1 syötetylle sokerimäärälle, joka on 357,5 g-Γ1, ja • · etyyliesterimäärälle, joka on 290 g1r‘. Vedettömän sofo- • · · rosidin saanto on 59,8 % perustuen näihin kahteen substraat- . . tiin.

• · · • · · • · • · · : 35 ESIMERKKI 4 • ·

« · I

• · · • · ·2'· Esimerkki 1 toistetaan lisäämällä 24 g-1'1 rapsiöljyetyylies- • · · • · · • · • · • · · · • · · • · · 2 • i 11 107738 teriä viljelyalustaan ja jatkuva etyyliesterin lisäys käynnistetään 12 tunnin kuluttua siementämisestä. Ruiskutusno-. peudeksi säädetään 2 g'l'^h'1 ajankohtaan t = 96 h asti ja sitten 1 g-l'-h'1 ajankohtaan 144 h asti. 144 tunnin kuluttua 5 otetaan talteen 550 g raakoja soforosideja/1 lähtöalustaa.

Tuottavuus raakojen soforosidien suhteen on 3,82 g·!'1·^ ja vedettömän soforosidin saanto on 56 %.

ESIMERKKI 5 10

Esimerkki 1 toistetaan korvaamalla rapsiöljyetyyliesteri rapsiöljymetyyliesterillä. Testin loputtua otetaan talteen 525 g raakoja soforosideja, mikä vastaa tuottavuutta, joka on 3,64 g'l'^h'1 raakoja soforosideja, ja saantoa, joka on 53,4 % 15 vedettömiä soforosideja, perustuen "glukoosin plus esterin" summaan.

ESIMERKKI 6 20 Esimerkki 1 toistetaan korvaamalla rapsiöljyetyyliesteri auringonkukkaöljymetyyliesterillä. Testin lopussa otetaan talteen 505 g·!'1 raakoja soforosideja, mikä vastaa tuottavuutta, joka on 3,50 g'l'^h"1, ja saantoa, joka on 51,4 % vedettömiä soforosideja, perustuen "glukoosin plus metyylies-25 terin" summaan.

• · : ESIMERKKI 7 ··· • · • « • · ·

Esimerkki 1 toistetaan korvaamalla rapsiöljymetyyliesteri • · .·. : 30 rapsiöljyllä. Öljyn ruiskutusnopeudeksi säädetään 1,2 • · · #·:·’ g1r‘»h21 ajankohtaan t = 96 h asti ja sitten 0,60 g·!'11^1.

> 2 , 1 2

Ensimmäiset kolme glukoosi lisäystä ajankohtina t = 24 h, t = . . 48 h ja t = 72 h ovat kulloinkin 30 g1r', kun taas kaksi • · · *;,2· viimeistä ajankohtina t = 96 h ja t = 120 h ovat kumpikin 20 • · · *·’ 35 g1l21 lähtöalustaa. Esim. 144 tuntia kestäneen viljelyn jäl- keen saadaan talteen 380 g raakoja soforosideja, mikä vastaa :3: tuottavuutta, joka on 2,64 g·!1·1!1 raakoja soforosideja, ja • · · • 1 · • · • · «·« · « · « 2 • ·1 3 • · 12 107738 saantoa, joka on 53 % vedettömiä soforosideja (kosteuspitoisuus 45 %) .

• · • · · * · · ··· • · • · • 1« • · · • 1 · ♦ · • « • · • · · • · · • · • ·· • · · • · · • · » · 1 • · · • · • · · • « · ♦ ♦ · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • · · ♦ 1 • · • · · • · · • · · « ·

Claims (13)

13 107738

1. Menetelmä soforosidikoostumuksen valmistamiseksi erittäin, jonka menetelmän mukaan viljellään ainakin yhtä Candida 5 bombicola tai Candida apicola -kantaa typpilähteen sisältä vässä viljelyalustassa sopivissa olosuhteissa kannan viljelemiseksi, ja viljeltyyn kantaan syötetään reaktioalueella edullisesti ylimäärä sokeria ja jatkuvasti vähintään yhtä sopivaa substraattia riittävissä ilmastus-, lämpötila- ja 10 pH-olosuhteissa, tunnettu siitä, että seuraavat vaiheet suoritetaan ainakin kerran: a. kantaa täydennetään substraatilla syöttövirtausnopeuden ollessa reaktioalueella 0,01 - 4 g/h/1 lähtöreaktiomäärää ja syöttöajan ollessa sellainen, että substraatin jäljellä 15 oleva konsentraatio reaktioalueella pidetään arvossa, joka on korkeintaan 18 g/1 lähtöreaktiomäärää tälle syöttöäjalle, ja b. tuotettu soforosidikoostumus otetaan talteen.

2. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soforosidikoostumuksen talteenottovaihe käsittää substraatin syötön tai reaktioalueen ilmastuksen pysäyttämisen, alemman vettä sisältävän soforosidifaasin talteenoton laskeutumisen jälkeen ja vähintään yhden soforosidien pesun 25 vedellä 10 - 90 °C:n lämpötilassa 10 - 60 minuutin ajan. a 1

: 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n - ·1· n e t t u siitä, että substraatin syöttö pysäytetään, kun reaktioalueen happikonsentraatio on olennaisesti 0. • « • · 30 a n ·1·

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n - 7 1 1 · n e t t u siitä, että substraatin syöttö pysäytetään, kun , . ruiskutetun substraatin koko määrä on korkeintaan 280 g‘11 i · · *· lähtöreaktiomäärästä. • · 1 f · · *»1 ‘ 35

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, ♦ · .·2. tunnettu siitä, että sof orosidituotanto tapahtuu 18 - • · · ··· • · • · • · · · ♦ · 1 a · · 2 • · 14 107738 35 °C:n lämpötilassa, pH-arvossa 2,5 - 8, sokeriylimäärän läsnäollessa, jolloin reaktioalue ilmastetaan nopeudella 0,2 - 2 v.v.m. 1-5 baarin paineessa.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraatti käsittää vähintään yhtä eläinöljyä, vähintään yhtä kasviöljyä ja/tai vähintään yhtä tämän öljyn esteriä, jolloin öljyt ja esterit käsittävät alifaattisen, suoran ketjun, jossa on 10 - 24 hiiliatomia. 10

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantana käytetään Candida bombicola CBS 6009 -kantaa.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelyalusta sisältää sokeria.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraatin virtausnopeus reak- 20 tioalueelle on 1,0 - 3,0 g*l'l*h'1 lähtöreaktiomäärästä.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kanta saadaan ex situ -valmistetusta viljelmästä. 25

*:**: 11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, ·;*♦ tunnettu siitä, että vil jelyalustassa olevaa kantaa ϊ*. täydennetään substraatilla ja sokerilla. *« · • ♦ # « «

12. Jonkin patenttivaatimuksen l-ll mukainen menetelmä, 9 ·« tunnettu siitä, että reaktioalue sisältää aluksi ♦ · ♦ *'* substraattikonsentraationa 0,5 - 40 g*r‘ lähtöreaktiomäärästä ja substraattia syötetään jatkuvasti kantaan silloin, kun *· ’ί lähtösubstraattikonsentraatio on 0,1 - 15 g·!1. - *·♦ • · · V · 35

13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-12 mukainen menetelmä, • · ,···, tunnettu siitä, että käytetty solumäärä perustuen 4 · ··· « · • · * ψ « 9 · • * · • « · • · 15 107738 reaktiomäärään on 1 g - 100 g kuivapainosta/litra. • · • i · · f · · »1« < · • ** «· ♦ I t · • · « · ♦ · 1 2 3 « · · • · ««« • · « . · · · « · * · · m t ·« • · «·« • · » t t · « * · · • · 1 2 < 1 ta1 • · • · « ·· « ·«· • · « · 3 « I « « · « M • · 16 107738