JPH05506155A - 脂肪酸エステルまたは油の連続供給を用いる発酵によるソホロサイドの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 共 ケ　脂肪酸エステルまたは油の連続供給を用いる発酵によるソホロサイドの生産 方法 ？　本発明は、発酵によるソホロサイド（ｓ＋＋ｐｈｏｒｏｓｉｄｅｓ１組成物 の、基質の連続供給Ｃ半回分操作）　（ｌｅｄ−ｂＮｃｈ）を用いる生産方法に 関する。ソホロサイドは、例えば化粧品研究において、ふけを防ぐ髪のトリート メント、およびデオドラントの静菌剤として、特にＨＰ−８−２０９７８３のラ クトン形態で用いられる。

特許ＵＳ　３，２０５，１５０オヨヒＵＳ　３，３１２，５８４ニオイテ、現在 Ｃｘｎｄｉｄｔ　ｂｏｍｂｉｃｏｌｘに分類されている菌株である、Ｔｏ＋ｕｌ ｏｐｓ口ｂｏｍｂｉｃｏ［ｘの培養を利用する発酵方法によって、かなりの量の ソホロサイドが生産されることが記載されている。

ソホロサイドは、下記式［月および［２］　によって表わされる化合物の混合物 として考えられている：（以下余白） たはメチル基を表わす）。

これらの化合物は、洗浄剤としておよび乳化剤として使用でき、これらはソホロ ース基（Ｈｏｕｐｅｍｅｎｔ　＋ｏｐｈｏｒｏｓｅｌによる優れた吸湿性および 吸水性と、脂肪酸から生じる疎水性とを示す。

しかしながらソホロサイドは、多数の同族体の集合であり、これらの同族体の形 成比率は、これらの基質、例えば炭化水素源によって、および発酵条件によって 様々である（　ＦＲ２，３９９，４３８＞。

その結果、これらの化合物の特性および機能は、一般にこれらの同族体の集合を 用いるという事実を考慮すると、同族体の比率とともに変わり、発酵方法によっ である一定の比率で生成物を生産するのは、現在までのところ、難しいことがわ かっている。

先行技術は、次の文献によって例証されている：′Ｊｏｕｒｎｇｌ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　Ａｍｅｒｉｃｔｎ　Ｏｉｌ　ＣｈｅＩＩｌｉｓｔｓ　５ｏｃｉｅ＋７’、６ ５巻、Ｎｏ、　９　、ｆ！１８８年９月、アメリカ合衆国イリノイ州、シャンペ イン、１４６０〜１４６６頁、ＨｌＪ、ＡＳＭＥＲら、’Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　 ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｅｌｕｃｉｄＮｉｏｎ　ｘｎｄ　 ｂｉ。

ｃｏｎｙｇｒｓｉｏｎ　ｏｆ　５Ｏｐｈｏｒｏｔｅ　１ｉｐｉｄｓ’。

ソホロサイドの調製は一般に、特許ＵＳ　３．２０５．１５０に記載されている ような基質の存在下に実施される。例えばこの基質は、炭化水素、飽和または不 飽和脂肪酸、グリセリドを含む酸のエステル、例えば大豆油のような植物油であ ってもよい。

供給は、通常、各添加について、当初反応容積に対して約２重量％の量で、約１ ２〜２４時間の間隔で、不連続に実施される。

多量の基質の存在（約３〜４％）は、生産されるソホロサイドの収率の減少につ ながることが明らかである。

さらには、最後の基質添加の２４〜４８時間後、それ以上の転換はまったく見ら れない。

このバッチ生産方法は、特許Ｕｓ　４．２９７．３４０にも記載されている。こ こではかなりの量（１５０ｇ）の基質の添加が、６日間２４時間毎に行なわれ、 培養の総生産時間は７日間である。

これらの不連続供給方法によって、２３％を越えない、粗ソホロサイドの最終生 産率に達することになり、その結果これらの方法では限定された生産率しか示さ ない。この限定の原因は、発酵媒質の残留油または残留エステルを、脂肪酸に転 換する微生物の脂肪分解能力にめることができる。これらの脂肪酸は、微生物の 成長にとっては阻害物質ではないが、これらは、既に媒質中に存在する時に、ソ ホロサイドの生産速度にかなりな影響を与えやすい。

従って本発明の目的は、先行技術の欠点を解消することである。

特に培養菌株の生産率、生産されるソホロサイドの収率、およびこのことによっ て、所望のソホロサイド生産率を改善しうるソホロサイドの生産方法が発見され た。

より詳細には、本発明は、ソホロサイド組成物の半回分操作（ｌｅｄ　ｈａｔｃ ｈ）生産方法であって、少なくとも１つのＣａｎｄｉｄａ　ｂｏｍｂｉｃｏｌａ またはＣａｎｄｉｄａ　ａｐｉｃｏｌｉ菌株を、窒素源を含む培養媒質中で、前 記菌株を生産するような適切な条件下に培養し、前記培養菌株が、反応帯域にお いて、適切な換気、温度、９１（条件下に、好ましくは過剰の糖供給、および少 なくとも１つの適切な基質の連続供給を受ける方法において、下記一連の操作を 少なくとも１回実施することを特徴とする方法に関する： （ａｌ　当初反応容積１リツトルあたり、毎時０．０１〜４グラムの反応帯域内 の供給流量で、反応帯域内の前記基質の残留濃度が、供給時間の間、当初反応容 積１リツトルあたり、多くともせいぜい１８グラムの値に維持されるような供給 時間の間、前記基質の菌株への供給を実施し、かつ （ｂ）生産されるソホロサイド組成物を回収する。

好ましくは基質の連続供給は、経時的に、漸減曲線に従って実施されてもよい。

この方法の特徴によれば、ソホロサイド組成物の回収工程は、基質供給または反 応帯域の換気の停止、水を含むソホロサイド下部相のデカンテーション後の回収 、および、一般に温度ｌＯ〜９０℃で、例えば１０〜６０分の間、ソホロサイド の少なくとも１回の水洗浄からな用いられる菌株は、有利にはＣａｎｄｉｄａ　 ｂｏｍｂｉｃｏｌａ　ＣＢＳ　６００９である。この場合、見られる生産性は優 れており、生産されるソホロサイド収率は、先行技術のものよりもはるかに高い 。

この方法の実施は、下記のようにして行なってもよ−第一方法によれば、前記操 作条件において、反応帯域内の供給流量を調節して基質を供給し、注入される基 質の総量が、多くともせいぜい当初反応容積の２８０ｇ、ビｌに達する時に、基 質の供給を停止し、前記のようにソホロサイド組成物を回収する。

−より有利な第二方法によれば、基質の残留濃度が、一般に０１〜１８ｇ、Ｉ　 、好ましくは０．５〜３ｇ、１−１の予め固定された値の近くになるような条件 下に、反応帯域における供給流量を調節して、基質を供給する。反応帯域内の溶 解された０２濃度が、有利にはゼロ近くになるやいなや、基質の供給と発酵器の 攪拌とを停止し、溶液をデカントし、ソホロサイド相を回収し、これを少なくと も一度、温度１０〜９０℃で洗浄し、このソホロサイド相が除去された反応帯域 に、再び基質を供給する。このようにして、微生物の生合成能力が尽きるまで、 供給、デカンテーション、および回収のこの一連の操作を繰返すことができる。

この方法および連続供給のもう１つの特徴によれば、反応帯域は、当初、場合に よっては過剰の糖と、当初反応容積の０．５〜４０ｇ、ｌ　、有利には１〜２５ ｇ、１刊の基質濃度を含んでいてもよく、例えば長くとも４８時間の期間の後、 すなわち当初基質濃度が、一般に、〜１ 当初反応媒質１リツトルあたり０．１〜１５ｇ、ｌ　、好ましくは０．１〜５． 、−１である時に、基質の前記菌株への連続供給を行なう。

良好な結果を得ることができる、この方法のもう１つの有利な特徴によれば、反 応帯域内への基質の連続供給流量は、当初反応容積の１．［ｌ〜３．０ｇ、ｈ、 １−１、好ましくは２．０〜２．５ｇ、ｈ、ｔ　であってもよい。

この基質は、通常、少なくとも１つの動物油、少なくとも１つの植物油、および ／または前記油の少なくとも１つのエステルを含んでいる。前記油および前記エ ステルは、１０〜２４個の炭素原子を有する（飽和または不飽和）脂肪族直鎖を 組込んでいる。

好ましい油およびエステルとして、菜種油、ひまわり油、ヤシ油または大豆油、 およびこれらのメチルまたはエチルエステルを挙げることができる。

前記エステルを用いて、優れた結果が得られた。

培養媒質は、例えばアミノ酸、例えば特に酵母菌の抽出物、大豆のペプトン、カ ゼインの加水分解生成物、トウモロコシの浸出液、麦のグルテンの加水分解生成 物、肉の抽出物の形態で、無機窒素源（アンモニウムイオン形態）および／また は有機窒素源を含んでいてもよい。無機元素、例えばカリウム、ナトリウム、マ グネシウム、およびオリゴ元素、例えば鉄、マンガンモリブデンの塩の形態（硫 酸塩、燐酸塩、塩化物）での添加によって、さらに成長を改良することもできる 。

培養媒質は、少なくとも１つの糖、例えばグルコースまたはサッカロースを含ん でいてもよい。

培養条件は、通常、下記のとおりである。温度：１８〜３５℃：ｐＨ・３．０〜 ８．００良好なレベルの活性は、温度２０〜３０℃、ｐＨ３，０〜ｌｌ［Ｉ５． ０の範囲で得られ、温度２２〜２８℃、ｐＨ３，５〜４．０で優れたレベルの活 性が見られる。発酵は、当初無菌および好気条件で実施される。

この方法のもう１つの特徴によれば、菌株に糖および基質の供給を受けさせるた めに、反応帯域に、培養媒質に含まれた菌株を導入してもよいが、この方法のも う１つの特徴によれば、当業者に知られた技術によって、培質媒質から菌株を抜 出し、これを反応帯域に導入し、ここで糖および基質の供給を受けさせる。

ソホロサイドの生産方法は、一般には下記条件で実施される。すなわち温度：１ ８〜３５℃；　９Ｈ：　２．５〜１１．０　。

有利には３．０〜４．［１，換気流量・圧力１〜５バール、好ましくは１〜２バ ール（１バール−０，１ＭＰａ　）下で０２〜２ｖｖＭである。

生産の間ずっと、例えば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムの溶液の供給に よって、９Ｈは、前記範囲内の規定値（ｖａｌｅｕ＋　ｄｅ　ｃｏｎｓｉｇｎｅ ）に制御され、かつ調節される。

当初反応容積に対して用いられる細胞（ｃｅｌｌυＩｅ）の量は、通常、１リツ トルあたり１〜１００ｇの乾燥重量、好ましくは１リツトルあたり１０〜３０ｇ の乾燥重量である。

下記の例証実施例を見れば、本発明がより良く理解できよう。

［実施例１］ この実施例は、本発明によって実施される発酵について記載する。Ｃａｎｄ：ｄ ａ　ｂｏｍｈｉｃｏｌａ　ＣＢＳ　６００９菌株が、媒質に植付ける（ｅｎｓｅ ｍｅｎｃｅ＋）ために用いられる。媒質は、グルコースとは別に、基質が無いも のである。基質は、植付は後に連続的に添加される。これは菜種のエチルエステ ルである。

用いられる培養媒質は下記のとおりであるニゲルコースおよびＭｇ５Ｏ−７Ｈ２ ０は、水、Ｉ、６２Ｏｍｌ中溶液として、４リツトルの容量の実験室の発酵器に おいて殺菌され、一方ＫＨＰＯ、（ＮＨ４）として、エルレンマイヤーフラスコ で別に殺菌される。

２つの溶液の殺菌は、温度１２０℃で、３０分間オートクレーブで実施され、培 養媒質は、２つの溶液の冷却後に再び作られる。これには、発酵媒質と同じ媒質 ２００ｍ１であるが、１ｍ１の菜種のエチルエステルが添加されたものを用いて 、エルレンマイヤーフラスコで調製された予備培養液（ｐ＋ｅｃｕＮ＋＋＋ｅ） ２（１０ｍｌが植付けられる。

このフラスコには、Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｍｂｉｃｏｌａ菌株の凍結物（ｃｏｎ ｇｅ　ｌ　ａ　ｔ）約１ｇが植付けられる。このフラスコは、攪拌下、２５℃の 温度でインキュベートされる。これは２４時間後、発酵器の予備培養液を生じる 。

生産の発酵は、２リツトルの当初反応容積に対して、４リツトルの容量の発酵器 において実施される。

媒質の攪拌は、ＲＡＹＮＥＲＩ　タービンによって得られ、このタービンの回転 速度は、１．（１（１（ｌ　ｒｐｍである。換気は、大気圧下、空気０．５　ｖ 、　ｖ、　ｍ、に固定されている。培養の自動酸性化（ａｕｔｏ−ａｃｉｄｉｆ ｉｃａｌｉａｎｌ後、媒質のｐＨは、４Ｎ水酸化ナトリウム溶液によって、３． ５の一定値に維持される。水酸化ナトリウム溶液の反応器への添加は、ｐＨメー ターに制御されている電磁弁によって調節される。培養媒質中に溶解した酸素含 量は、記録装置に連結されたポーラログラフ電極によって、連続的に測定される 。

グルコース媒質のあらゆる限定を避けるため、固体形態のこの糖の５回の添加を 行なう。ｔ＝２４ｈ、ｔ＝４８　ｈ、ｔ　＝７２　ｈにおける最初の３つは、各 々当初媒質１リツトルあたり４５ｇのグルコースに相当するが、一方、ｔ　＝９ ６　ｈＳｔ　＝１２０　ｈにおける最後の２つは、各々１リツトルあたり３２． ５ｇのグルコースに相当する。

菜種のエチルエステルの供給は、螺動ポンプによって実施される。このポンプの 供給速度は、ｔ＝９６ｈまで一■−１ ２ｇ、Ｉ、ｈ　の割合、ついでｔ＝Ｉ４４ｈまでＩｇ。

利　−１ １、ｈ　の割合に固定される。試料の採取によって、ソホロサイドの生産を追跡 する。これはＧｏｂｂｅｒｌ　らの方法（１９８４年、Ｂｉｏｌｅｃｈｎｏｌ、 １ｅｆＦ、６．２２５〜２Ｈ１頁）によって測定する。微生物の成長後に始まる この生産は、菜種のエチルエステルの添加とともに増加する。

ヘプタンでの熱間抽出後、気相クロマトグラフィで測定された菜種のエチルエス テルの残留濃度は、０．７ｇ。

、−］である。

１４４時間の発酵後、攪拌、換気およびエチルエステルの供給を停止し、１時間 、粗ソホロサイドをデカントさせておく。これらを回収し、４５℃の温度で、蒸 溜水１．５１で、これらを攪拌する。これらを再び４時間デカントさせておき、 同じ条件下に二回目の洗浄を実施する。二回目の洗浄を終えると、当初媒質１リ ットルあたり５６５ｇの粗ソホロサイドを回収する。従って粗ソホロサイドに対 して、試験時間にわたって計算された発酵の生産率は、当初媒質１リツトルあた り毎時、３．９２ｇのソホロサイドに等しい。カール・フィッシャー法によって 測定された粗ソホロサイドの水含量は４５％である。供給された、糖とエステル の、各々３００と２４０　ｇ、Ｉ−１の量を考慮に入れると、グルコースとエス テルの合計に対する、無水ソホロサイドの生産収率は、５９．５％まで上がる。

生産、生産率および収率もまた、不連続エステル供給の手順（実施例２）と比較 するために、９６時間の培養後（グルコースの四回口の添加の直前）測定された 。９６時間後、粗ソホロサイドの生産は２９５　ｇ、ビ１であり、従って３．０ ７ｇ、ｌ−■の生産率に相当する。「グルコースとエチルエステル」の無水ソホ ロサイドへの転換収率は、従って３８％である。

［実施例２（比較例）コ 連続供給を、１２時間毎の菜種のエチルエステルの２０、■−１の添加に代えて 、実施例１を再び行なう。発酵器の植付けの直後に最初の添加を行なう。実施例 １のように、発酵媒質中の粗ソホロサイドの生産動力学を追跡する。発酵は、成 長が終わった時に開始するが、９６時間後、菜種のエチルエステルの９回目の添 加と同時に、あまりに早く停止する。エチルエステルの添加を続けるならば、さ らには、ソホロサイドのデカンテーションによる回収はもはや行なうことはでき ない。

これらは残留エチルエステルと密に混合されたままである。９６時間後、粗ソホ ロサイド２１０　ｇ、ｔ−’ｔ、か回収できない。粗ソホロサイドに対して、９ ６時間にわたー１−■ って計算された生産率は、２．１８ｇ、ｌ　、ｈ　である。

［グルコース（２３５ｇ、１−１）と菜種のエチルエステル（１８０ｇ、ビ１） 」の無水ソホロサイドへの転換収率（湿潤率：４５％）は、２７．８％である。

これらの成績は、実施例１において同じ時間後に得られたものより低い。

［実施例３］ ｔ＝９５ｈまで実施例１を繰返す。この時間では、媒質中に溶解した酸素消費（ ｅｐｗｉ＋ｅｍｅ＋＋ｔｌが、実質的に１００％である。この第一の期間の間、 発酵媒質中の菜種のエチルエステルの残留濃度は、０．５　ｇ、Ｉ−ｔである。

この時、攪拌、換気およびエステル供給を１５分間停止し、デカントしたソホロ サイドを抜出す。換気、攪拌、および発酵器へのエステル供給を再び行ない、下 記のように試験を続行するニ ゲルコース４５ｇ、ビ１をｔ＝９６ｈおよびｔ＝１２０ｈに、ついで３２．５ｇ 、ｌ−’をｔ＝＋４４ｈに添加する。９６時間口に、２ｇ、１．ｈ　のエチルエ ステル供給速度を、１．６ｇ、１．ｈ　に低下させ、この速度でｔ＝１４４ｂま で供給を続行する。この時、ｔ＝１６８ｈまでエステル供給速度を、０．９２ｇ 、１　、）１　に再度低下させる。ついで、デカンテーションによって、二回目 のソホロサイドの回収を行ない、これにより微生物の生合成能力は尽きていない ことが確認される。ｔ＝９５　ｈおよびｔ＝１６８ｈで回収された粗ソホロサイ ドは集められ、実施例１のように２度洗浄される。このようにして、１６８　ｈ の培養後、粗ソホロサイド７０５　ｇ。

、−１を回収する。試験期間の間に計算された発酵の生産率は、供給された糖の 量３５７．５　ｇ、■−＋およびエチルエステル量２９０　ｇ、ｌ　”に対して 、４．１９ｇ、Ｉ−’。

ｈ−１である。無水ソホロサイド収率は、２つの基質に対して５９．８％である 。

［実施例４〕 培養媒質に、菜種のエチルエステル２４ｇ、１”を添加して実施例１を繰返し、 植付けの１２時間後、エチルエステルの連続添加を開始する。注入速度は、ｔ＝ ９６ｈまで２ｇ、Ｊ、ｈ　に固定され、ついで１４４　ｈまで１ｇ、１．ｈ　に 固定される。１４４時間後、当初媒質１リットルあたり５５０ｇの粗ソホロサイ ドが回収される。粗ソホロサイドに対する生産率は、３．８２ｇ。

１、ｈ　であり、無水ソホロサイド収率は５６％である。

［実施例５コ 菜種のエチルエステルを、菜種のメチルエステルに代えて、実施例１を繰返す。

試験が終わると、５２５ｇの粗ソホロサイドを回収する。これは、３．６４ｇ、 ｌ’。

ｈ−１の粗ソホロサイドの生産率に相当し、「グルコースとエステル」の合計に 対して、無水ソホロサイド収率５３．４％に相当する。

［実施例６］ 菜種のエチルエステルを、ひまわりのメチルエステルに代えて、実施例１を繰返 す。試験が終わると、５０５ｇ、ｔ−１の粗ソホロサイドを回収する。これは、 ３゜５０、、−１．　ｈ−１の生産率に相当し、「グルコースとメチルエステル 」の合計に対して、無水ソホロサイド収率５１．４％に相当する。

［実施例７コ 菜種のメチルエステルを、菜種油に代えて、実施例１を繰返す。油の注入速度は 、ｔ＝９６ｈまで１．２ｇ。

−１−１−ｔ　−ｔ ｌ　、ｈ　に固定され、ついで０．６０ｇ、ｌ　、　ｈ　に固定される。ｔ　＝ ２４　ｈ、　ｔ　＝４８　ｈおよびｔ＝７２ｋにおける最初の３回のグルコース 添加は、各々３０ｇ、ｌ−■に相当するが、一方、ｔ＝９６ｈおよびｔ＝１２０ ｈにおける最後の２つは、各々当初媒質の２０ｇ、ｌ　、に相当する。例えば１ ４４時間の培養後、３８０　ｇの粗ソホロ−Ｉ　−１ サイドを回収する。これは、２．６４ｇ、ｌ　、ｈ　の粗ソホロサイドの生産率 に相当し、無水ソホロサイド収率５３％に相当する（湿潤率：４ｇ％）。

要　約 本発明は、ソホロサイド組成物の半回分操作（ｌｅｄ　ｂ！１ｃｂ）生産方法で あって、少なくとも１つのＣ１ｎｄｉｄ！ｂｏｍｂｉｃｏｌｘまたはＣｔｎｄｉ ｄ１ｓｐｉｃｏ１ｇ菌株を培養し、前記培養菌株が、反応帯域において、当初反 応容積１リツトルあたり、毎時０．０１〜４グラムの反応帯域内の供給流量で、 反応帯域内の前記基質の残留濃度が、供給時間の間、当初反応容積１リツトルあ たり、多くともせいぜいせいぜい１８グラムの値に維持されるような供給時間の 間、糖の過剰供給、および少なくとも１つの適切な基質の連続供給を受け、生産 されたソホロサイド組成物を回収する方法に関する。

国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．ソホロサイド組成物の半回分操作（ｉｅｄ　ｂａｔｃｈ）生産方法であって 、窒素源を含む培養媒質中で、少なくとも１つのＣａｎｉｄｉｄａ　ｂｏｍｂｉ ｃｏｌａまたはＣａｎｄｉｄａａｐｉｃｏｌａ菌株を、前記菌株を生産するよう な適切な条件下において、培養し、反応帯域において培養された前記菌株が、連 切な換気、温度およびｐＨ条件下に、糖供給、および少なくとも１つの適切な基 質供給を受ける方法において、下記の一連の操作を少なくとも１回実施すること を特徴とする方法：（ａ）当初反応容積１リットルあたり、毎時０．０１〜４グ ラムの反応帯域内の供給流量で、反応帯域内の前記基質の残留濃度が、供給時間 の間、当初反応容積１リットルあたり、多くともせいぜい１８グラムの値に維持 されるような供給時間の間、前記基質の菌株への供給を連続的に実施し、かつ （ｂ）生産されたソホロサイド組成物を回収する。
2. ２．ソホロサイド組成物の回収工程が、基質供給または反応帯域の換気の停止、 水を含むソホロサイド下部相のデカンテーション後の回収、および１０〜９０℃ の濃度で、１０〜６０分間、ソホロサイドの少なくとも１回の水洗浄からなる、 請求項１による方法。
3. ３．反応帯域内の酸素濃度が実質的にゼロである時、基質供給を停止する、請求 項１または２による方法。
4. ４．注入された基質の総量が、多くともせいぜい当初反応容積の２８０ｇ．Ｉ− １に達する時、基質供給を停止する、請求項１または２による方法。
5. ５．温度１８〜３５℃、ｐＨ２．５〜８、過剰の糖の存在下にソホロサイドの生 産を実施し、かつ圧力１〜５バール下、流量０．２〜２ｖ．ｖ．ｍで、反応帯域 を換気する、請求項１〜４のうちの１つによる方法。
6. ６．基質は、少なくとも１つの動物油、少なくとも１つの植物油、および／また は、前記油の少なくとも１つのエステルを含み、前記油および前記エステルは、 １０〜２４個の炭素原子を有する脂肪族直鎖を組込んでいる、請求項１〜５のう ちの１つによる方法。
7. ７．菌株が、Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｍｂｉｃｏｌａ　ＣＢＳ　６００９である、 請求項１〜６のうちの１つによる方法。
8. ８．培養媒質が糖を含む、請求項１〜７のうちの１つによる方法。
9. ９．反応帯域内の基質の流量が、当初反応容積の１．０〜３．０ｇ．Ｉ−１．ｈ −１である、請求項１〜８のうちの１つによる方法。
10. １０．菌株が、現場外で実施される培養から生じる、請求項１〜９のうちの１つ による方法。
11. １１．培養媒質中に含まれる前記菌株が、糖および基質の供給を受ける、請求項 １〜９のうちの１つによる方法。
12. １２．当初は、反応帯域の基質濃度が、当初反応容積の０．５〜４０ｇ．Ｉ−１ であり、当初基質濃度が０．１〜１５ｇ．Ｉ−１である時、基質の前記菌株への 連続供給を行なう、請求項１〜１１のうちの１つによる方法。
13. １３．反応容積に対して用いられる細胞（ｃｅｌｌｎｌｅ）の量が、１リットル あたり１〜１００ｇの乾燥重量である、請求項１〜１２のうちの１つによる方法 。