DE3922797A1

DE3922797A1 - Verfahren zur herstellung von butanol und aceton durch fermentation ausgehend von zuckerrohrmelasse

Info

Publication number: DE3922797A1
Application number: DE3922797A
Authority: DE
Inventors: Francois Fayolle; Roux Francoise Le; Jean-Paul Vandecasteele
Original assignee: IFP Energies Nouvelles IFPEN
Current assignee: IFP Energies Nouvelles IFPEN
Priority date: 1988-07-13
Filing date: 1989-07-11
Publication date: 1990-01-18
Also published as: IT8921170A0; FR2634218A1; ES2016038A6; FR2634218B1; IT1230781B

Description

Die Herstellung des Gemisches von Butanol und von Aceton (noch Herstellung von Lösungsmitteln genannt) durch Fermen tation ist seit langer Zeit bekannt und ist industriell eingesetzt worden ausgehend von stärkehaltigen Substraten, wie Mais, oder Zuckern wie den Melassen. In diesem letzten Fall stellt die Kapazität der lösungsmittel-produzierenden Stämme von Clostridium zur Hydrolyse der Saccharose häufig eine Beschränkung der Leistungsfähigkeit der Lösungsmittel produktion dar. Bei bestimmten Stämmen erfordert die Fer mentation sogar, daß man vorher eine vollständige Hydro lyse (Inversion) der Saccharose der Melasse in Glukose und Fruktose (Invert-Zucker) durchführt, wie beispielsweise berichtet in der US-PS 21 23 078 oder von Beesch, S.C. (1952) "Acetone-butanol fermentation on sugars", Ind. Eng. Chem., 44, 1677-1682.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fermentation von Zuckerrohr-Melassen zu Butanol und zu Aceton. Diese Melassen enthalten sowohl Saccharose wie auch Invert-Zucker. Das Verfahren der Erfindung erlaubt eine gute Umwandlung der Zucker und eine erhöhte Konzen tration an Lösungsmitteln ohne die Inversion der Saccharose der Melasse zu erfordern. Dieses Verfahren, das einen saccharolytischen Lösungsmittelproduktionsstamm von Clostridium in einem Reaktionsmedium verwendet, das als Zuckersubstrat eine Rohrmelasse enthält, ist dadurch gekennzeichnet:

a) man liefert am Anfang dem genannten Stamm ein Reaktionsmedium enthaltend die genannte Melasse mit einer Konzentration zwischen 0 und 20 g Gesamtzucker (Saccharose plus Invertzucker) pro Liter Anfangsreaktionsmedium,
b) man läßt die Konzentration an Invertzucker (die zwischen 20 und 30 Gew.-% der Gesamtzucker der Melasse darstellt) verringern bis auf einen Wert zwischen 0 und 2 g pro Liter Anfangsreaktionsmedium,
c) man füttert kontinuierlich den genannten Stamm in ge nannter Melasse mit einem Strom zwischen 1 und 5 g Gesamtzuckern pro Liter Anfangsreaktionsmedium und pro Stunde und dergestalt, daß die Restkonzentration an Invertzucker während der Dauer der Fütterung höchstens 4 g pro Liter des Anfangsreaktionsmediums ist, und
d) man gewinnt das so erhaltene Lösungsmittelgemisch.

Unter Gemisch von Lösungsmittel versteht man ein Gemisch enthaltend üblicherweise in Gew.-% zwischen 60 und 75% von n-Butanol, 25 bis 40% Aceton und, im allgemeinen, eine geringe Menge, üblicherweise weniger als 1%, Ethanol.

Man kann vorteilhafterweise einen Stamm von Clostridium verwenden, gewählt unter den saccharolytischen Stämmen gehörend zu Lösungsmittelproduktionssorten entsprechend den Sorten Clostridium acetobutylicum und glostridium beeÿerinckii. Die Anmelderin hat festgestellt, daß mit diesen Stämmen, kultiviert unter üblichen Fermentations bedingungen, d.h. wenn die gesamte Menge an zur Verfügung gestellter Melasse von Anfang an vorhanden ist, die Produktion von Lösungsmittel schwächer ist, wenn die Melasse ohne vorherige Inversion der Saccharose geliefert wird, als wenn sie vorher beispielsweise durch enzymatische Weise invertiert wird durch Wirkung einer Inulase oder einer Invertase, entsprechend den genannten Angaben des Standes der Technik, wie oben ausgeführt.

Mit dem Verfahren der Erfindung werden Lösungsmittel produktionsleistungen erhalten, die denjenigen einer klassischen Fermentation überlegen sind, mit nicht-inver tierten Melassen, und die Ergebnisse nähern sich denen, er halten bei konventioneller Fermentation mit invertierten Melassen.

Man hat ausgezeichnete Ergebnisse beobachtet bei Betriebs weise vorzugsweise mit dem Stamm Clostridium beÿerinckii NRRL B-592 (früher bekannt unter dem Namen Clostridium butylicum NRRL B-592), der Sammlung "Northern Utilization Research and Development Division", US Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA.

Die üblichen Fermentationsbedingungen sind im folgenden beschrieben.

Ein gutes Aktivitätsniveau wurde erhalten bei einer Temperatur zwischen 25 und 38°C und man beobachtet ausge zeichnete Aktivitätsniveaus bei einer Temperatur zwischen 32 und 35°C.

In einer dem Fachmann bekannten Weise umfaßt die Aceton- Butanol-Fermentation eine Säure-Phase (Produktion von Essigsäure und Buttersäure), die sich anzeigt durch einen Anfangsfall des pH′s bis auf ein Minimalniveau auf welchem es gehalten wird durch Zuführung von Ammoniak im Verlaufe der Fermentation.

Alternativ kann dieser pH-Abfall begrenzt werden durch vor herige Einfügung in das Reaktionsmilieu von einem Puffer, wie Kalziumcarbonat. Diese erste Phase der Fermentation wird gefolgt von einer Lösungsmittel-Produktions-Phase im Verlauf derer die produzierten Säuren teilweise wieder ver braucht werden, was sich zeigt durch einen leichten An stieg des pH′s. Ein gutes Aktivitätsniveau wurde erhalten durch Halten des pH′s in einem Bereich von 5,0 bis 6,8; man beobachtet ausgezeichnete Aktivitätsniveaus bei einem pH von 5,2 bis 6,1.

Die Fermentation findet statt unter anaeroben Bedingungen und unter strikten Sterilitätsbedingungen. Man rührt im allgemeinen das Medium durch bekannte mechanische Mittel.

Das Reaktionsmedium enthält üblicherweise eine Quelle von mineralischem Stickstoff in Form von Ammoniumionen, bei spielsweise von Ammoniumsulfat oder von Ammoniak. Die Zu gabe von organischem Stickstoff in Form von Aminosäuren, durch Liefern von beispielsweise Hefeextrakt oder von Mais quellflüssigkeit, wird vorzugsweise durchgeführt. Die Zu gabe von Kaliumionen in Form von Phosphat kann das Wachs tum verbessern.

Das Reaktionsmedium umfaßt als zuckerhaltiges Substrat nichtinvertierte Zuckerrohrmelasse. Die in dieser Melasse enthaltenen Zucker sind im allgemeinen in der Form eines Disaccharids, der Saccharose, üblicherweise zu 70 bis 80 Gew.-% der Gesamtzucker, und Monosaccharide, Glukose und Fruktose (Invertzucker) zu 20 bis 30 Gew.-% der Gesamt zucker.

Die anfänglich vorliegende Gesamt-Zucker-Konzentration liegt vorteilhafterweise zwischen 0 und 20 g pro Liter des Anfangsreaktionsmediums und in bevorzugter Weise zwischen 5 und 15 g pro Liter des Anfangsreaktionsmediums.

Nach einer weiteren Ausführungsform vorliegender Erfindung läßt man die Konzentrationen an Invertzucker (Glukose und Fructose) sich verringern aufgrund der metabolischen Aktivität des Stammes und seiner zellulären Entwicklung, bis auf einen Wert vorteilhafterweise zwischen 0 und 2 g pro Liter des Anfangsreaktionsmediums und vorzugsweise zwischen 0 und 1 g pro Liter des Anfangsreaktionsmediums. Wenn diese Restkonzentration an Invertzucker erreicht ist, läßt man die kontinuierliche Zufütterung von zucker haltigem Substrat beginnen. Gute Ergebnisse der Her stellung von Lösungsmitteln werden erhalten, wenn der Zu fuhrstrom vorteilhafterweise zwischen 1 und 5 g von Gesamt zucker pro Liter des Anfangsreaktionsmediums und pro Stunde liegt. Mit einem Zufütterungs-Zustrom vorzugsweise von 2 bis 3,2 g von Gesamtzuckern pro Liter Anfangs reaktionsmedium und pro Stunde, erhält man eine merkliche Steigerung der Lösungsmittel-Produktion in Bezug auf den Stand der Technik. Das Aufrechterhalten einer schwachen oder Null-Konzentration an Invertzucker während der Fermen tation ist, in der Erfahrung der Anmelderin, eine uner wartete aber essentielle Bedingung einer guten Lösungs mittelproduktion. Man hat somit festgestellt, daß die Zu fütterungs-Zuströme an Melasse, die geringer sind als die angegebenen, zu einer Verstärkung der Produktion an Säuren zum Nachteil derjenigen der Lösungsmittel führen können.

Der Zufütterungsstrom kann entweder konstant gehalten werden während der Gesamtdauer der Zufütterung, oder er kann variieren in kontinuierlicher Form in den oben be schriebenen Grenzen. Eine verwendbare Zufütterung besteht darin, den Strom zuckerhaltigen Substrates zu steuern mit der Geschwindigkeit des Gas-Ausstromes der Fermentation. Diese Arbeitsweise ist möglich, wenn eine automatische Registriervorrichtung des Gasstromes, wie beschrieben im Beispiel 1, verwendet wird. Im Falle der Steuerung des Substratstromes mit der Geschwindigkeit der Ausgasung liegt der verwendete Zuckerstrom im allgemeinen zwischen 2,5 und 3 g Gesamtzuckern pro Liter des Gasproduktes.

Die Zufütterung an Melasse kann von 20 bis 100 Stunden dauern und vorteilhafterweise von 35 bis 45 Stunden.

Vorteilhafterweise wird die Zufütterung des zuckerhaltigen Substrates durchgeführt, ausgehend von einem Lagerreser voir, in welchem die Konzentration an Substrat erhöht ist, was die Reaktionsvolumina minimiert.

Unter den oben angegebenen Bedingungen hat man Fermenta tionsdauern beobachtet, die 4 Tage nicht überschreiten, mit ausgezeichneten Produktionsniveaus an Lösungsmitteln (Aceton und Butanol) und einer schwächeren Produktion von Säuren. Diese Dauer liegt vorteilhafterweise zwischen 40 und 50 Stunden. Die Globalgesamtzufuhren an zuckerhaltigem Substrat sind im allgemeinen zwischen 80 und 130 g pro Liter des Anfangsreaktionsmediums.

Die im folgenden dargelegten Beispiele illustrieren die Vorteile des Verfahrens der Erfindung, verglichen mit einer gemäß dem Stand der Technik durchgeführten Fermen tation. Diese Vorteile sind insbesondere eine Endkonzen tration an angesammelten Lösungsmitteln, die einem verbes serten Verbrauch an Zuckern entspricht, und einer kürzeren Fermentationsdauer. Diese beiden Elemente wirken zusammen zum Erhalt einer verbesserten Produktivität der Synthese von Lösungsmitteln, ausgedrückt in g an produzierten Lösungsmitteln pro Liter des End-Reaktions-Mediums und pro Stunde.

Unter anderem führt das Verfahren gleichermaßen zu einer schwächeren Konzentration an Rest-Säuren.

Beispiele Beispiel 1 Fermentation mit Zufuhr von Zuckerrohrmelasse mit dem Stamm Clostridium beÿerinckii NRRL B-592

Dieses Beispiel beschreibt eine erfindungsgemäße Fermentation, d. h. der Stamm Clostridium beÿerinckii NRRL B-592 wird auf ein Medium mit schwacher Konzentration an Zuckern zur Minimierung der Konzentration an Invertzucker angeimpft. Die Zuckerrohrmelasse wird dann im Laufe der Zeit mit konstanter Geschwindigkeit hinzugefügt.

Das Fermentationsmedium ist das folgende:

- Gesamtzucker ausgehend
10 g/l (davon 7,5 g Saccharose und 2,5 g Glukose und Fruktose) Zuckerrohrmelasse
- Hefeextrakt	0,8 g/l
- KH₂PO₄	0,8 g/l
- (NH₄)₂ SO₄	1,6 g/l

2,3 Liter dieses Mediums werden in einen Laborfermenter von 6 Litern gebracht und die Gesamtheit während 40 Minuten bei 110°C in einem Autoklaven sterilisiert, dann nach Abkühlung auf 35°C unter Stickstoffsstrom wird der pH auf 6,2 eingestellt durch Zugabe von 10%igem (Gewicht/ Volumen) Ammoniak. Dieses Medium wird dann beimpft unter anaeroben Bedingungen mit einer Vorkultur des Stammes NRRL B-592.

Die Animpfungs-Kette ist die folgende: Ein Röhrchen von 10 ml des Mediums besteht aus:

- Gesamtzucker\|30 g/l
- Hefeextrakt	0,5 g/l
- KH₂PO₄	0,5 g/l
- (NH₄)₂ SO₄	3 g/l
- CaCO	5 g/l

wird beimpft ausgehend von einem Aufbewahrungsröhrchen des Stammes NRRL B-592. Diese Röhrchenkultur wird unter an aeroben Bedingungen durchgeführt während 24 Stunden. Sie erlaubt die Beimpfung eines Erlenmeyer-Kolbens, enthaltend 200 ml des gleichen Mediums wie oben. Dieser Kolben wird bei 34°C während 18 Stunden inkubiert. Man schüttet dann den Inhalt steril in 2,3 l Fermentationsmedium, beschrieben wie oben (zu einem Anfangsreaktionsmedium von 2,5 l).

Die Azeton-Butanol-Fermentation produziert eine Ausgasung bestehend aus CO und H . Diese Ausgasung wird gemessen durch Führung eines Ausgangs des Fermenters zu einem Meß gerät für Gasvolumina. Die durch das Meßgerät gemessenen Gasvolumen werden durch einen Rechner registriert, der sofort die Gasströme berechnet.

Der pH wird gleichermaßen permanent gemessen und reguliert mittels eines regulierenden pH-Meters, durch Zugabe von 10%igem Ammoniak, auf pH 5,5. Der Ammoniak wird zugefügt mittels eines Elektroventils, verknüpft mit dem pH-Meter und stellt einerseits das Regulierungsmittel dar und andererseits die Hauptzufuhr an Stickstoff, notwendig für das Wachstum des Stammes NRRL B-592.

Die Gesamtzucker bei Animpfung sind 10 g/l, bestehend aus 7,5 g/l Saccharose und 2,5 g/l Invertzucker (Glukose und Fruktose). Wenn der Wert an Zuckern in invertierter Form 0 erreicht, nach 4 Stunden Reaktion, startet man die kontinuierliche Zufuhr mittels einer peristaltischen Pumpe mit einem Zustrom von 44 ml/Stunde einer Melasse-Lösung mit 170 g/l Gesamtzuckern, gemäß einem stündlichen Zufütterungsstrom von 7,48 g Gesamtzuckern oder noch von 3 g Gesamtzuckern pro Liter anfänglichem Reaktionsmedium.

Dieser Z strom erlaubt es, zu jedem Zeitpunkt eine maximale Restkonzentration an Invertzuckern von kleiner als 4 g/l aufrecht zu erhalten. Dieser Zustrom wird während der gesamten Dauer der Einführung festgehalten.

Nach Animpfung reduziert sich der pH rasch bis auf den Regulationswert von 5,5, der nach 4 Stunden Reaktion erhalten wird. Die Zufuhr 10%igen Ammoniaks startet automatisch, um den pH bei diesem Wert zu halten, bis zur 18. Stunde der Reaktion, dann steigt er an bis auf den Wert von 5,8 bis 5,9, der bis zum Ende der Reaktion gehalten wird.

Parallel dazu startet die Ausgasung 2 Stunden nach Animpfung des Reaktionsmediums. Die Geschwindigkeit der Ausgasung steigert sich und erreicht ein Maximum von 4 l/ Stunde zwischen 24 und 30 Stunden der Reaktion und sinkt dann fortschreitend ab bis zum Ende der Reaktion. Die Gesamtproduktion an Gas ist etwa 100 l.

Während dieser Fermentation hat man 1,5 l der Zuckerrohr melasse-Lösung mit 170 g/l Gesamtzucker hinzugefügt, ent sprechend 255 g Gesamtzuckern. Am Ende der Fermentation, die 48 Stunden dauert, erhöhen sich die Restzucker auf 1,7 g/l des Endreaktionsmediums, und bestehen ausschließlich aus Sacccharose.

Die Endkonzentration an Aceton beträgt 6,1 g/l End reaktionsmedium, diejenige an n-Butanol 14,4 g/l End reaktionsmedium, die Gesamtproduktion an Lösungsmitteln beträgt somit 20,5 g/l Endreaktionsmedium.

Die Endproduktion an Gesamtsäuren beträgt 1,6 g/l des Endreaktionsmediums (davon 1,0 g Essigsäure und 0,6 g Buttersäure pro Liter Endreaktionsmedium). Die produzierten Lösungsmittel Butanol und Azeton werden in bekannter Weise durch Destillation gewonnen.

Dieses Beispiel zeigt, daß unter Kultivierung des Stammes NRRL B-592 unter Bedingungen der Zuckerrohrmelassezufuhr:

- die Endkonzentration an Lösungsmitteln und an Säuren 20,5 bzw. 1,6 g/l Endreaktionsmedium sind,
- nahezu die Gesamtheit der gelieferten Zucker verbraucht wird,
- die Produktivität an Gesamtlösungmitteln 0,43 g/l und pro Stunde beträgt.

Beispiel 2 (Vergleichsbeispiel):

Gemäß dem Stand der Technik hat man eine konventionelle Fermentation durchgeführt (d.h. mit Zufuhr des zucker haltigen Substrates in Gesamtheit durchgeführt zum Zeit punkt 0) mit dem Stamm Clostridium beÿerinckii NRRL B- 592.

Das Fermentationsmedium ist das folgende:

- Gesamtzucker bestehend aus Zuckerrohrmelasse
59,4 g/l (davon 40 g Saccharose und 20 g Invertzucker
- Hefeextrakt	0,5 g/l
- KH₂PO₄	0,5 g/l
- (NH₄)₂ PO₄	1 g/l

Das Medium wird hergestellt in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise.

Die Animpfungskette ist identisch mit derjenigen, die in Beispiel 1 beschrieben wurde.

Man stellt fest:

- Der pH sinkt auf den Wert 5,5 in den ersten 6 Stunden der Fermentation, er wird auf diesem Wert durch Regulierung mit 10%igem Ammoniak gehalten und steigt, ausgehend von der 18. Stunde.
- Das Volumen der gasförmigen Produkte beträgt 74 Liter, die Entgasungsgeschwindigkeit stellt ein spezielles Profil mit 2 Maxima dar: Eines von 2,4 l/Stunden nach 22 Reaktionsstunden, ein anderes von 2 l/Stunden nach 34 Reaktionsstunden.
- Die Dauer der Fermentation beträgt etwa 70 Stunden.
- Die Gesamtproduktion an Lösungsmitteln beträgt 15,6 g/l Endreaktionsmedium (davon 3,6 g/l Azeton und 12 g/l n-Butanol).
- Die Säureproduktion ist 4,6 g/l Endreaktionsmedium.

Dieses Beispiel zeigt, daß unter Verwendung des Stammes NRRL B-592 gemäß dem Stand der Technik auf Zuckerrohr melasse:

- die Endkonzentration an Lösungmitteln und an Säuren 15,6 und 4,8 g/l Endreaktionsmedium sind,
- nicht alle gelieferten Zucker verbraucht werden, es verbleiben tatsächlich 13 g/l Zucker, die aus Saccharose bestehen,
- die Produktivität an Gesamtlösungsmitteln 0,22 g/l und pro Stunde beträgt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Butanol und Aceton oder von Butanol, Aceton und Ethanol, durch Fermentation eines Reaktionsmediums enthaltend Zuckerrohrmelasse in Anwesenheit wenigstens eines Stamms von saccharolytischem Clostridium, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden aufeinanderfolgenden Stufen umfaßt:

a) man liefert dem Stamm eine Anfangskonzentration an Melasse zwischen 0 bis 20 g Gesamtzucker (Saccharose plus Invert-Zucker) pro Liter von Anfangs-Reaktions-Medium,
b) man läßt die Konzentration an Invert-Zucker, die zwischen 20 und 30 Gew.-% der Gesamtzucker der Melasse darstellt, abnehmen bis auf einen Wert zwischen 0 und 2 g pro Liter des Anfangsreaktions mediums,
c) man füttert kontinuierlich den Stamm in Melasse mit einem Strom zwischen 1 und 5 g Gesamtzucker pro Liter Anfangsreaktionsmedium und pro Stunde dergestalt, daß die verbleibende Konzentration an Invert- Zucker während der Dauer der Melasse-Zuführung höchstens 4 g pro Liter des Anfangsreaktions mediums beträgt, und
d) man gewinnt ein so hergestelltes Gemisch von Butanol und Aceton oder von Butanol, Aceton und Ethanol.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (a) die Konzentration an anfänglich anwesenden Gesamtzuckern zwischen 5 und 15 g pro Liter des Anfangsreaktionsmediums liegt.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (b) man die Konzentration an Invert- Zucker sich verringern läßt auf einen Wert zwischen 0 und 1 g pro Liter des Anfangsreaktionsmediums.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (c) die Fütterungs-Zufuhr an Melasse zwischen 2 und 3,2 g von Gesamtzuckern pro Liter des Anfangsreaktionsmediums und pro Stunde liegt.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (d) man eine Mischung enthaltend 60 bis 75 Gew.-% Butanol und 25 bis 40 Gew.-% Aceton gewinnt.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß genannter Stamm von Clostridium gewählt wird in der Gruppe gebildet durch die saccharolytischen Stämme der Sorte Clostridium acetobutylicum und der saccharolytischen Stämme der Sorte Clostridium beÿerinckii.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß genannter Stamm von saccharolytischem Clostridium ein Stamm von Clostridium beÿerinckii NRRL B-592 ist.