DE4042342C2 - - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
- C12P19/06—Xanthan, i.e. Xanthomonas-type heteropolysaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
Es ist bekannt, daß Mikroorganismen aus verschiedenen
Gattungen in der Lage sind, in bestimmten Substraten aus
Mono- und Disacchariden Polysaccharide zu bilden.
Zum Beispiel sind Stämme von Xanthomonas campestris die
wichtigsten Organismen für eine technische Herstellung von
Xanthanen. Xanthan besteht aus einer Hauptkette mit 1,4-β-
glykosidischen Bindungen und Seitenketten mit Mannose und
Glucuronsäure.
Die Struktur von Xanthan entspricht folgender Formel:
Xanthan entsteht aus Disaccharid gemäß folgender nicht
stöchiometrischer Reaktionsformel:
Polysaccharide wie zum Beispiel Xanthan werden als Dickungs
mittel zum Beispiel in der Lebensmittelindustrie und in der
kosmetischen Industrie sowie in der Papierindustrie und
Erdölindustrie angewandt. Dabei können sie mit Dextrinen,
pflanzlichen Dickungsmitteln, Polyalkenoxiden, anderen
Polysacchariden und dergleichen gemischt werden. Sie können
auch in Farben, Lacke und in Zahnpasta eingearbeitet werden.
Eine wichtige Anwendung liegt in der Ölgewinnung, wo sie als
Zusatz zum "Flutungswasser" gut geeignet sind.
Xanthane werden in Verfahren des Standes der Technik als Nativ-
Polysaccharide mit Xanthomonas campestris hergestellt. Als Sub
strate dienen zuckerhaltige Medien mit Zusatz von Mineralsal
zen und komplexen N-Quellen, z. B. Destillationsrückständen.
Bei hoher Viskosität nimmt die Polysaccharidbildung wieder ab.
Verschiedene Sauerstoffkonzentrationen haben wenig Einfluß,
wichtig ist jedoch der pH-Wert, der bei 5-8 gehalten werden
sollte. Die Fermentation läuft bei 25 bis 35°C ab. Bei Melasse
als Substrat dauert die Polysaccharidbildung im Submerfermen
ter 60-70 h.
Die Ausbeuten betragen 60-80% des vorgelegten Zuckers,
allerdings dürfen wegen der hohen Viskosität nicht mehr
als 8% Zuckerlösung im Fermenter vorliegen.
Es sind bereits Bakterienstämme der Gattung Xanthomonas
campestris beschrieben:
US 44 07 950,
US 44 07 951.
US 44 07 951.
Der erfindungsgemäße Stamm DSM 5278 unterscheidet sich von
den Xanthomonas-camprestis-Stämmen
NRRL - B - 1459
ATCC 31601
ATCC 31602
ATCC 31922
ATCC 31923
ATCC 31601
ATCC 31602
ATCC 31922
ATCC 31923
durch seine Stabilität in kontinuierlicher Kultur auf
komplexem Medium über einen Zeitraum von mindestens
3 Monaten und durch seine hohe vol. Produktitvität von 2 kg
Xanthan pro m³ und h und seine spezifische Produktivität
von 1,4 kg Xanthan pro kg Zellmasse und Stunde.
Die max. spez. Wachstumsrate des erfindungsgemäßen Stammes
Xanthomonas campestris DSM 5278 beträgt auf komplexem Medium
0,395 pro Stunde.
Im folgenden Beispiel wird die Erfindung näher erläutert.
Die Stammhaltung des Stammes DSM 5278 erfolgt in Nunc-Einfrier
röhrchen. Ca. 1/3 des Röhrchens werden mit Glaskugeln
0,2 mm gefüllt und mit 0,3 ml Glycerin überschichtet und
autoklaviert. Nach dem Abkühlen werden 0,8 ml Flüssigkeits
kultur, 578 nm 0D 6, hinzugegeben. Die Flüssigkeits
kultur sollte ca. 8 h alt sein, d.h. sich am Ende der
log. Wachstumsphase, aber vor der Produktionsphase befinden.
Anschließend wird mit einer Kanüle sämtliche Flüssigkeit
vom Boden abgesaugt und das Röhrchen sofort bei -20°C
eingefroren. Die Kultur ist dann ein Jahr lang wieder
rekultivierbar.
Nach dem Auftauen der Röhrchen werden die Glaskugeln eines
Röhrchens in einen Erlenmeyerkolben mit 20 ml Medium 1
überführt. Der Erlenmeyerkolben wird anschließend im
Schüttelbrutschrank bei 200 Upm und 29°C geschüttelt. Zur
Kontrolle wird mit dieser Kultur ein Ausstrich auf YM-
Agarplatten durchgeführt und 5 Tage bei 30°C bebrütet.
1 ml der durchkultivierten Kultur im Erlenmeyerkolben werden
in 20 ml Medium 1, pH 5,5, transferiert und 24 h inkubiert.
Anschließend kann die Kultur maximal 4mal transferiert
werden.
20 ml der durchkultivierten Kultur eines Erlenmeyerkolbens
werden in einen Fernbachkolben mit 200 ml Medium 1, pH 5,5,
transferiert. Der Fernbachkolben wird bei 200 Upm und 29°C
24 h im Schüttelbrutschrank inkubiert. Anschließend wird die
Kultur in einen sterilen 250-ml-Erlenmeyerkolben mit Boden
olive und Anstechgarnitur überführt und dient zum Animpfen
eines 2-l-Fermenters.
Der Fermenter enthält 2 l Medium 1 mit einem pH von 5,5.
Nach dem Animpfen wird 24 h bei 29°C, guter Durchmischung
und 1 vvm Begasungsrate im Batchbetrieb kultiviert. An
schließend wird auf kontinuierlichen Betrieb umgeschaltet.
Der pH sollte auf 6,5 und die Temperatur auf 30°C geregelt
werden. Die Durchflußrate sollte D=0,07 (1/h) sein. Das
Medium 1 sollte einen pH von 6 und 2,5% Saccharose enthalten
und steril filtriert werden.
Das Fermentationsmedium 1 sollte mit 5-10% Inokulum beimpft
werden. Beträgt die Inokulummenge 1%, hat dies eine
verlängerte lag-Phase von 24 h zur Folge. Der pH des
Mediums sollte 5,5 und die Temperatur 29°C betragen. Eine
Begasungsrate von 1,0 vvm ist ausreichend. Als erste C-Quelle
wird Citronensäure verwertet. Der pH driftet dabei in den
alkalischen Bereich (pH 7-8). In dieser Phase wird haupt
sächlich Biomasse und kein Produkt gebildet. Anschließend
wird als weitere C-Quelle Saccharose aufgenommen. Das Bio
massewachstum kommt aufgrund der N-Limitation zum Still
stand, und die Produktionsphase beginnt. Durch Ausscheidung
verschiedener organischer Säuren fällt der pH wieder in
den sauren Bereich. Wenn ein pH von 6,5 erreicht ist, muß
die pH-Regulation zugeschaltet und bei pH 6,5 konstant
gehalten werden.
Bei der Batch-Produktion ist nun mit den Fermentationspara
metern pH 6,5, 29°C und 1,0 vvm Begasungsrate so lange weiter
zu fermentieren, bis der Saccharose-Gehalt nicht weiter
abnimmt (unter 1 g/l Endkonzentration) und die Viskosität
nicht weiter ansteigt.
Für die kontinuierliche Produktion ist nach 10-24 h, wenn
pH 6,5 erreicht sein sollte, auf kontinuierlichen Medien
zufluß und Produktabzug umzuschalten. Es ist zuerst eine
Durchflußrate von D=0,1 (1/h) einzustellen. Die Durch
flußrate kann den verschiedenen Erfordernissen angepaßt
werden. Eine Durchflußrate von D=0,1 (1/h) ist ein
Kompromiß zwischen einer niedrigen Durchflußrate von D=0,03
(1/h), wobei eine hohe Produktausbeute und ein
Xanthan mit einer hohen Viskosität pro TS gebildet wird,
und einer hohen Durchflußrate von D=0,2 (1/h), wobei
eine hohe Produktivität erzielt wird. Weitere wichtige
Parameter, die von der Durchflußrate abhängen, sind die
Zellgröße und der Acetatgehalt des Xanthans.
Das Verfahren beinhaltet drei verschiedene Nährmedien.
Das Nährmedium 1 hat den Vorteil, daß Xanthomonas campestris
auf diesem Medium eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit hat.
Große Schwankungen der Durchflußrate und Medienzusammen
setzung führen deshalb nicht zum Auswaschen der Biomasse.
Das Nährmedium 2 hat gegenüber dem Nährmedium 1 die Vorteile
des niedrigeren Preises, der höheren Produktionsausbeute und
der höheren Produktivität. Diese Vorteile werden durch eine
niedrigere Wachstumsgeschwindigkeit der Biomasse erkauft.
Das Nährmedium 3 ist ein rein synthetisches Nährmedium. Es
hat die Vorteile eines niedrigen Preises, der guten
Filtrierbarkeit, sowohl des Nährmediums als auch des
Produktes und des hohen Produkt/Biomasse-Verhältnisses.
Medium 1 | |
Saccharose | |
25 g/l für Konti bzw. 40 g/l für Batch | |
Mg SO₄ × 7 H₂O | 0,2 g/l |
Citronensäure | 1,0 g/l |
K₂HPO₄ | 1,0 g/l |
NH₄Cl | 0,32 g/l |
Hefeautolysat | 1,0 g/l |
ad Leitungswasser, mit KOH auf pH 5,5 (zum Autoklavieren) bzw. pH 6,0 (zum Sterilfiltrieren) einstellen. |
Medium 2 (nur für kontinuierliche Fermentation) | |
Saccharose|25,0 g/l | |
Citronensäure | 1,0 g/l |
K₂HPO₄ | 0,4 g/l |
HN₄SO₄ | 1,0 g/l |
Hefeautolysat | 0,1 g/l |
ad Leitungswasser, mit KOH auf pH 5,5 bzw. 6,0 (bei Sterilfiltration) einstellen. |
Medium 3 | |
Saccharose|25,0 g/l | |
Citronensäure | 2,0 g/l |
K₂HPO₄ | 0,5 g/l |
Mg SO₄ × 7 H₂O | 0,2 g/l |
NH₄NO₃ | 0,6 g/l |
YM-Agar-Medium | |
Glucose|6,0 g/l | |
Hefeautolysat | 1,8 g/l |
Malzextrakt | 1,8 g/l |
Pepton aus Fleisch | 3,0 g/l |
Agar Agar | 12,0 g/l |
ad 600 ml VE-Wasser. Der pH sollte sich auf 6,2±0,2 einstellen und wird nicht weiter korrigiert. |
Kontinuierliche Kultur
Nährmedium 1
Stamm: Xanthomonas campestris DSM 5278
Durchflußrate D = 0,07 (1/h)
pH 6,5
T = 29°C
Nährmedium 1
Stamm: Xanthomonas campestris DSM 5278
Durchflußrate D = 0,07 (1/h)
pH 6,5
T = 29°C
Kontinuierliche Kultur
Nährmedium 2
Stamm: Xanthomonas campestris DSM 5278
Durchflußrate D = 0,2 (1/h)
pH 6,5, T=29°C, TS 10 g/l, BTS 1,4 g/l
Nährmedium 2
Stamm: Xanthomonas campestris DSM 5278
Durchflußrate D = 0,2 (1/h)
pH 6,5, T=29°C, TS 10 g/l, BTS 1,4 g/l
Claims (1)
- Xanthomonas campestris DSM 5278.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4042342A DE4042342A1 (de) | 1990-02-27 | 1990-02-27 | Xanthomonas campestris dsm 5278 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4042342A DE4042342A1 (de) | 1990-02-27 | 1990-02-27 | Xanthomonas campestris dsm 5278 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4042342A1 DE4042342A1 (de) | 1991-10-10 |
DE4042342C2 true DE4042342C2 (de) | 1992-01-16 |
Family
ID=6421746
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE4042342A Granted DE4042342A1 (de) | 1990-02-27 | 1990-02-27 | Xanthomonas campestris dsm 5278 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4042342A1 (de) |
-
1990
- 1990-02-27 DE DE4042342A patent/DE4042342A1/de active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE4042342A1 (de) | 1991-10-10 |
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