CN103502461A - 在含油酵母中通过提高yap1转录因子活性提高油含量 - Google Patents

Abstract

本文描述了具有提高的油含量的转基因含油酵母，其包含提高的Yap1转录因子活性，其中所述提高的油含量是与非转基因含油酵母的油含量相比的。所述提高的Yap1转录因子活性是由过表达Yap1转录因子、通过提高所述转录因子和能够激活所述转录因子的蛋白质之间的相互作用、或通过它们的组合引起的。本文还描述了使用这些酵母菌株的方法。

Description

在含油酵母中通过提高YAP1转录因子活性提高油含量

本专利申请要求2010年12月30日提交的美国临时申请61/428,655的权益，该临时申请全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及包含提高的Yap1转录因子活性而引起提高的油含量的含油酵母菌株。

背景技术

反应性氧物质[“ROS”]是包含氧并且包含未配对的价电子层电子的化学反应性分子。ROS，例如羟基自由基、超氧阴离子、和过氧化氢[“H₂O₂”]，作为有氧代谢的副产物在细胞中持续地产生，例如，通过呼吸作用过程中氧至水的不完全还原。ROS还通过暴露于辐射、光照、金属、和氧化还原活性药物而在脂肪酸的β-氧化过程中产生。由于ROS可扰乱细胞的氧化还原状态并最终导致对细胞组分（包括脂质、蛋白质、和DNA）的毒性损伤，细胞必须具有多种方法来感测ROS水平和转换该信号，使得细胞防止氧化胁迫的效应和维持细胞的完整性。

通常，ROS的水平通过使用谷胱甘肽还原-氧化（氧还）循环和硫氧还蛋白体系而被控制，使得从NADPH接受电子并用于将H₂O₂还原为水。更具体地，电子从NADPH至硫氧还蛋白还原酶至硫氧还蛋白至抗氧化蛋白至H₂O₂地传递，产生水。该途径中的多种基因的调控是复杂的。在酵母啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）中对H₂O₂的适应性响应已被发现涉及至少167种蛋白质的表达的改变（Godon，C.等人，J.Biol.Chem.，273:22480-22489（1998））。

酵母啤酒糖酵母中感测H₂O₂水平的一种方式依赖基于氧化应激反应的主要转录因子（即，转录因子蛋白质Yap1）的信号途径。响应于H₂O₂胁迫，基于至少一种分子内二硫键的形成（由抗氧化蛋白如Tsa1和Gpx3催化并被其它蛋白质如Ybp1促进的反应），在Yap1中发生多步骤的构象变化。以这种活性的氧化形式，Yap1控制至少32种不同蛋白质（包括参与细胞抗氧化防御和谷胱甘肽/NADPH再生的那些）的大的调节子的表达（Lee，J.等人，J.Biol.Chem.，274:16040-16046（1999））。Yap1的钝化通过用Yap1-控制的硫氧还蛋白的酶还原发生，从而提供了自调控机制。缺少功能性Yap1蛋白质的啤酒糖酵母突变菌株对通过H₂O₂的杀灭是高度敏感的。

已知具有更多双键的脂肪酸是更易受脂质过氧化作用影响的。因此，多不饱和脂肪酸[“PUFA”]是更易受通过ROS的氧化降解作用影响的，因为它们在其间包含多个位于具有尤其反应性的氢的亚甲基-CH₂-基团的双键。Avery，A.M.和S.V.Avery（J.Biol.Chem.，276:33730-33735（2001））报道了啤酒糖酵母gpx1Δ/gpx2Δ/gpx3Δ突变体对于在补充了PUFAα-亚麻酸[“ALA”；18:3]的培养基中生长是缺陷型的，其中ALA能够占总的膜脂肪酸的至多60%；gpx1Δ、gpx2Δ和gpx3Δ突变体还展示了对于18:3的毒性，尽管该效应基于外源18:3向膜脂质内较缓慢的掺入速率而被延迟。

由于ROS在进行有氧代谢的细胞中持续地产生，并且由于ROS能够导致细胞的损伤和死亡，本领域的技术人员将会知道提高重组地工程化的生物防御ROS的能力的方法。在产生微生物油的那些生物中尤其如此，因为在某些微生物菌株中，在产生这些油的过程中，ROS的产生能够导致微生物油生产中的较低的产量和/或降低的效率。

已经发现，工程化改造含油酵母以具有提高的Yap1转录因子活性和产生PUFA，导致了提高的脂质含量[“TFA%DCW”]和提高的平均PUFA滴度[“PUFA%DCW”]。

发明内容

在一个实施例中，本发明涉及具有提高的油含量的转基因含油酵母，其包含提高的Yap1转录因子活性，其中所述提高的油含量是与非转基因含油酵母细胞的油含量相比的。

在第二个实施例中，所述提高的Yap1转录因子活性是由过表达Yap1转录因子、通过提高所述转录因子和能够激活所述转录因子的蛋白质之间的相互作用、或通过它们的组合引起的。

在第三个实施例中，所述能够激活所述转录因子的蛋白质选自：Gpx3、Ybp1和Tsa1。

在第四个实施例中，所述Yap1转录因子包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有转录因子活性并且包含：（a）bZIP亮氨酸拉链基序；（b）N-末端富含半胱氨酸的结构域，其包含至少两个由至少6个氨基酸隔开的半胱氨酸残基的序列；和（c）C-末端富含半胱氨酸的结构域，其包含至少两个由至少8个氨基酸隔开的半胱氨酸残基的序列。

在第五个实施例中，所述Gpx3蛋白质包含：（a）编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于BLASTP比对方法，所述多肽在与选自SEQ ID NO:26[ScGpx3]或SEQ ID NO:28[YlGpx3]的序列进行比较时具有至少70%的氨基酸同一性；（b）编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于BLASTN比对方法，所述核苷酸序列在与选自SEQ ID NO:25[ScGpx3]或SEQ ID NO:27[YlGpx3]的序列进行比较时具有至少70%的序列同一性；和（c）（a）或（b）的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100%互补的。

在第六个实施例中，所述Tsa1蛋白质包含： （a）编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于BLASTP比对方法，所述多肽在与选自SEQ ID NO:34[ScTsa1]或SEQ ID NO:36[YlTsa1]的序列进行比较时具有至少70%的氨基酸同一性；（b）编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于BLASTN比对方法，

所述核苷酸序列在与选自SEQ ID NO:33[ScTsa1]或SEQ ID NO:35[YlTsa1]的序列进行比较时具有至少70%的序列同一性；和（c）（a）或（b）的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100%互补的。

在第七个实施例中，所述Ybp1蛋白质包含：（a）编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中所述多肽选自SEQ ID NO:38[ScYbp1]或SEQ ID NO:40[YlYbp1]；（b）编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于保守结构域分析方法，将所述多肽序列分类在kinetochor_Ybp2超家族内；或（c）（a）或（b）的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100%互补的。

在第八个实施例中，所述转基因含油酵母细胞来自选自下列的属：耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、丝孢酵母属（Trichosporon）和油脂酵母属（Lipomyces）。优选地，所述转基因含油酵母细胞是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）。

在第九个实施例中，所述转基因含油酵母细胞产生至少一种多不饱和脂肪酸。

在第十个实施例中，本发明涉及提高含油酵母中油含量的方法，其包括：

a)工程化所述含油酵母以过表达选自下列的蛋白质：

(i)   Yap1转录因子；

(ii)  能够激活所述转录因子的蛋白质；

(iii) （a）和（b）的组合；以及

b)使所述含油酵母在适宜的条件下生长以产生与非转基因含油酵母的油含量相比提高的油含量。

附图说明和序列描述

图1是啤酒糖酵母GPX3[“ScGPX3”]通过其激活啤酒糖酵母YAP1[“ScYap1”]的机制的图。ScGPX3包含Cys36和Cys82，它们形成分子间二硫键（-S-S-）或被还原为包含硫醇基（-SH）。ScYap1包含N-末端和C-末端富含半胱氨酸的结构域（各自以黑色显示）；这些富含半胱氨酸的结构域中的Cys303、Cys310和Cys315和Cys598、Cys620和Cys629被显示为6条垂直的黑色线。Cys36ScGpx3的硫醇基（-SH）与H₂O₂反应，导致水的释放和磺酸（-SOH）的形成。然后-SOH与ScYap1（还原形式）的Cys598的-SH缩合，形成分子间二硫键（-S-S-），然后其被转换为ScYap1的Cys303和Cys598之间的分子内二硫键，从而产生氧化的ScYap1蛋白质中的构象变化。

图2是ScYAP1（SEQ ID NO:2）和YlYAP1（SEQ ID NO:4）之间的序列比较。在ScYAP1的位点69-115（对应于YlYAP1的位点115-166）的带下划线的、粗体的碱性氨基酸，表示用于DNA结合的bZIP结构域的碱性区域。在ScYAP1的位点87、94、108、和115（对应于YlYAP1的位点138、145、159、和166），在比对中以星号显示的粗体的亮氨酸残基，是bZIP结构域的亮氨酸拉链基序。在ScYAP1的位点303、310、315、598、620和629（对应于YlYAP1的位点309、316、483、505和514）的带框线的半胱氨酸残基，对于分子间和分子内相互作用是重要的（或很可能重要的）。

图3提供了下列质粒的质粒图谱：（A）pYRH60；和（B）pYRH61。

图4显示了在提高的H₂O₂浓度（即，从0mM至50mM H₂O₂）下，在YPD平板上的H₂O₂敏感度检测结果。（A）比较了解脂耶氏酵母菌株Y4184（对照）和Y4184U（yap1Δ）细胞的生长。（B）比较了用pRS316（对照）或pYRH61转化的啤酒糖酵母菌株BY4743（对照）和BY4743（yap1Δ）细胞的生长。

图5提供了下列质粒的质粒图谱：（A）pYRH43；和（B）pYRH65。

图6是ScGPX3（SEQ ID NO:26）和YlGPX3（SEQ ID NO:28）之间的序列比较。在ScGpx3的位点36、64和82（对应于YlGpx3的位点42、70和88）的带框线的半胱氨酸残基，对于分子间和分子内相互作用是重要的（或很可能重要的）。

图7是ScTsa1（SEQ ID NO:34）和YlTsa1（SEQ ID NO:36）之间的序列比较。在ScTsa1的位点48和171（对应于YlTsa1的位点48和169）的带框线的半胱氨酸残基，对于分子间和分子内相互作用是重要的（或很可能重要的）。

图8是ScYbp1（SEQ ID NO:38）和YlYbp1（SEQ ID NO:40）之间的序列比较。

图9是ScYbp1（SEQ ID NO:38）、YlYbp1（SEQ ID NO:40）、光滑假丝酵母（Candida glabrata）Ybp1[“CgYbp1”]（SEQ ID NO:43）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）NRRL Y-1140Ybp1[“KlYbp1”]（SEQ ID NO:44）、木糖发酵酵母（Scheffersomyces stipitis）CBS6054Ybp1[“SsYbp1”]（SEQ ID NO:45）、鲁氏酵母（Zygosaccharomycesrouxii）CBS732Ybp1[“ZrYbp1”]（SEQ ID NO:46）、和白假丝酵母（Candida albicans）SC5314Ybp1[“CaYbp1”]（SEQ ID NO:47）之间的序列比较。

下面的序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825（“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”（“Requirements for PatentApplications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid SequenceDisclosures-the Sequence Rules”）），并且符合世界知识产权组织（WorldIntellectual Property Organization）（WIPO）ST.25标准（1998）以及EPO和PCT的序列表要求（规则5.2和49.5（a-bis）以及行政指令（Administrative Instructions）的208节和附录C）。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规定。

SEQ ID NO:1至47是表1中鉴定的ORF编码基因、蛋白质（或它们的部分）、引物或质粒。

表1：核酸和蛋白质序列号简述

具体实施方式

本文所引用的所有专利、专利申请和出版物均以引用方式将其全文并入本文。

在本公开中，使用了大量的术语和缩写。给出了如下定义。

“开放阅读框”缩写为“ORF”。

“聚合酶链反应”缩写为“PCR”。

“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。

“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。

“三酰基甘油”缩写为“TAG”。

“总脂肪酸”缩写为“TFA”。

“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。

“细胞干重”缩写为“DCW”。

“重量百分比”缩写为“重量%”。

“反应性氧物质”缩写为“ROS”。

“过氧化氢”缩写为“H₂O₂”。

如本文所用的并在所附的权利要求书中的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如提及“细胞”包括一个或多个细胞及其本领域技术人员已知的等同物等等。

“转录因子”是指与DNA调控元件相互作用，以影响结构基因的表达或第二种调节基因的表达的蛋白质（或编码该蛋白质的DNA）。更具体地，转录因子（单独地或与其它蛋白质一起在复合物中）通过，例如，激活或抑制转录起始，影响DNA至mRNA的转录。转录因子可包含一个或多个DNA结合结构域，它们附接至邻近它们所调控的基因的特异性DNA序列。

“Yap1转录因子活性”是指由于Yap1转录因子而产生的活性，Yap1转录因子是参与控制氧化应激反应的细胞途径的AP-1家族的转录调节子。提高的Yap1转录因子活性导致对一类蛋白质的调控，其通常使得对ROS（例如，当遭遇H₂O₂胁迫时）的耐受性提高。根据本文所描述的本发明，提高的Yap1转录因子活性导致提高的油含量。

“Yap1转录因子”是指具有Yap1转录因子活性的转录因子。一般来讲，此类蛋白质应具有：（a）bZIP亮氨酸拉链基序；（b）N-末端富含半胱氨酸的结构域，所述结构域包含至少两个由至少六（6）个氨基酸隔开的半胱氨酸残基的序列；和（c）C-末端富含半胱氨酸的结构域，所述结构域包含至少两个由至少八（8）个氨基酸隔开的半胱氨酸残基的序列。

“bZIP亮氨酸拉链基序”被表征为包含：（i）跨越大约十四至十六个氨基酸的碱性DNA结合区域（即，包含精氨酸和赖氨酸残基）；和（ii）邻近的富含亮氨酸的拉链区域（即，包含允许二聚化的均匀分布的亮氨酸残基）（Hurst，H.C.Transcription factors1：bZIP proteins.Protein Profile,2：101–168（1995））。通常，亮氨酸残基以七个氨基酸的间隔被隔开；尽管其它疏水性氨基酸如甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸已被报道与亮氨酸组合形成拉链结构。

术语“ScYAP1”（SEQ ID NO:1；GenBank登录号NM_001182362.1）是指从啤酒糖酵母S288c分离的AP-1家族的Yap1转录因子，由SEQ ID NO:2编码。如GenBank中所注释的，ScYAP1是氧化胁迫耐受性所必须的，并且通过多步骤的二硫键的形成和从细胞质向细胞核的运输而被H₂O₂激活。ScYAP1还介导对镉的抗性。

术语“YlYAP1”（SEQ ID NO:4；YALI0F03388p；GenBank登录号XP_504945）是指从解脂耶氏酵母分离的Yap1转录因子，由本文的SEQID NO:3编码。

术语“能够激活Yap1转录因子的蛋白质”是指以促进Yap1转录因子的氧化的方式与Yap1转录因子相互作用，使得该转录因子包含至少一种分子内二硫键并从而处于“激活状态”的蛋白质。优选的能够激活Yap1转录因子的蛋白质包括Yap1结合蛋白（Ybp1）和抗氧化蛋白质Gpx3和Tsa1，尽管这不应理解为限制了本发明。

“Yap1结合蛋白”或“Ybp1”是指与Yap1转录因子结合的结合蛋白。如Gulshan，K.等人（J.Biol.Chem.，286（39）：34071-34081（2011））中所描述的，Yap1和Ybp1很可能在细胞内直接相互作用，但是尚未实现对相互作用位点或结构域的进一步定位。

术语“ScYbp1”（SEQ ID NO:38；GenBank登录号NP_009775.1）是指从啤酒糖酵母S288c分离的Yap1结合蛋白，由本文的SEQ ID NO:37编码（Veal，E.A.等人，J Biol Chem.，278（33）：30896-30904（2003）；Gulshan，K.等人，参见上文）。如GenBank中所注释的，ScYbp1作为“转录因子Yap1p的特定半胱氨酸残基的氧化（导致Yap1p响应于胁迫的核定位）所必需的蛋白质”起作用。

术语“YlYbp1”（SEQ ID NO:40；YALI0B03762g；GenBank登录号XP_500469.1）是指从解脂耶氏酵母分离的Yap1结合蛋白，由本文的SEQID NO:39编码。

“抗氧化蛋白”或“Prx蛋白”包含氧化还原活性的半胱氨酸残基。在催化过程中，过氧化半胱氨酸被氧化（例如，被H₂O₂）为次磺酸，其与还原半胱氨酸残基缩合形成二硫化物（其中所述还原半胱氨酸残基是位于同一Prx分子内或另外的Prx分子内，导致二聚体的形成）。该二硫键被硫氧还蛋白还原，以再生活性的Prx。因此，Prx蛋白在氧化还原循环中是活性的，通过硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶从NADPH接受电子。如T.Tachibana等人（J.Biol.Chem.，284（7）：4464-4472（2009））所规定的，在出芽酵母中显示出硫氧还蛋白依赖的过氧化物酶活性的蛋白质包括五种Prx家族蛋白质[即，Tsa1、Tsa2、Prx1、Ahp1、Dot5]和两种谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）-样蛋白质[即，Gpx2、Gpx3]，尽管“Prx”在本文中将被用于指Prx蛋白质和Gpx-样蛋白质。能够激活Yap1转录因子的优选的Prx蛋白质包括Gpx3和Tsa1。

术语“ScGpx3”（SEQ ID NO:26；GenBank登录号NM_001179559.1；E.C.1.11.1.15）是指从啤酒糖酵母S288c分离的硫醇过氧化物酶，由SEQ ID NO:25编码。如GenBank中所注释的，ScGpx3作为氢过氧化物受体起作用，以感测细胞内H₂O₂水平和转换氧化还原信号至Yap1p转录因子。

术语“YlGpx3”（SEQ ID NO:28；YALI0E02310p；GenBank登录号XP_503454）是指从解脂耶氏酵母分离的硫醇过氧化物酶，由本文的SEQID NO:27编码。

术语“ScTsa1”（SEQ ID NO:34；E.C.1.11.1.15；GenBank登录号NP_013684）是指从啤酒糖酵母S288c分离的硫氧还蛋白过氧化物酶，由本文的SEQ ID NO:33编码（Trotter，E.W.等人，Biochem J.，412（1）：73-80（2008））。如GenBank中所注释的，ScTsa1属于抗氧化蛋白（PRX）2-Cys亚家族，其中抗氧化蛋白作为“硫醇特异性抗氧化剂（TSA）蛋白起作用，其通过还原H₂O₂、过氧亚硝基、和有机氢过氧化物，通过其过氧化物酶活性赋予细胞保护性功能”。

术语“YlTsa1”（SEQ ID NO:36；YALI0B15125g；GenBank登录号XP_500915.1）是指从解脂耶氏酵母分离的硫氧还蛋白过氧化物酶，由本文的SEQ ID NO:35编码。

一般来讲，术语“含油的”指那些倾向于以油形式贮存它们的能源的生物（Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980）。在此过程中，含油微生物的细胞油含量一般符合S形曲线，其中脂质浓度增加，直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期时它达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期期间逐渐下降（Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25（1991））。就本专利申请的目的而言，术语“含油的”是指能够将它们的干细胞重量[“DCW”]的至少约25%积累为油的那些微生物。

术语“含油酵母”是指那些能够产油并被归类为酵母的含油微生物，即，其中油能够积聚到超过它们DCW的约25%。含油酵母的例子包括但不限于如下属：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。所述酵母以占其DCW的超过约25%积累油的能力可以是来自重组改造工作或者来自该微生物的天然能力。

术语“转基因含油酵母”一般地是指由于转化过程而包含外来的或异源的核酸片段的含油酵母。然而，就本文的目的而言，术语“转基因含油酵母”将具体地指由于转化过程而包含外来的或异源的核酸片段的含油酵母，其中所述外来的或异源的核酸的表达在所述含油酵母中导致提高的Yap1转录因子活性。因此，例如，本发明的转基因含油酵母可被遗传工程化，以过表达编码Yap1转录因子或能够激活Yap1转录因子的蛋白质的嵌合基因，其中所述Yap1转录因子或能够激活Yap1转录因子的蛋白质是天然基因或外来基因。

与此相对，本文中的非转基因含油酵母将指，除了该非转基因含油酵母未被在所述转基因含油酵母中导致提高的Yap1转录因子活性的外来的或异源的核酸转化，并从而缺少该特定的外来的或异源的核酸之外，与它所与之比较的转基因含油酵母具有相同的基因型的含油酵母。要澄清的是，本发明的非转基因含油酵母可表达至少一种外来基因或异源的核酸，但这不导致提高的Yap1转录因子活性。

“转化”指将核酸分子转移进宿主生物体内。所述核酸分子可以是自主复制的质粒；或者，其可以被整合进宿主生物的基因组。含有转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化的”生物体或“转化体”。

术语“脂质”指任何脂溶性的（即，亲脂的）、天然存在的分子。美国专利申请公布2009-0093543-A1中提供了对脂质的一般综述（参见其中的表2）。

术语“油”是指在25℃时为液体的脂类物质；所述油是疏水性的，但在有机溶剂中是可溶性的。在含油的生物中，油构成了总脂质的主要部分。“油”主要由三酰基甘油（TAG）组成，但是也可以包含其它中性脂质、磷脂和游离脂肪酸。油脂中的脂肪酸组成和总脂质的脂肪酸组成一般是相似的；因此，总脂质中的脂肪酸浓度的升高或降低将对应于油中的脂肪酸浓度的升高或降低，反之亦然。

“中性脂质”是指那些通常以贮存脂肪形式存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们如此地命名是因为在细胞pH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂类一般指脂肪酸的甘油单酯、二酯、和/或三酯，也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油，或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放游离脂肪酸，必须发生水解反应。

术语“三酰基甘油”[“TAG”]是指由三个脂肪酰残基酯化一个甘油分子组成的中性脂质。TAG能够包含长链多不饱和的和饱和的脂肪酸，以及较短链的饱和的和不饱和的脂肪酸。

本文所用术语“总脂肪酸”[“TFA”]是指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定样品中能通过碱酯交换方法（如本领域所已知的）被衍生为脂肪酸甲酯[“FAME”]，所述样品可以是例如生物质或油脂。因此总脂肪酸包括来自中性脂类级分（包括二酰基甘油、单酰基甘油和TAG）和极性脂质级分（包括，例如，磷脂酰胆碱和磷酸酰乙醇胺级分）的脂肪酸，但是不包括游离脂肪酸。

术语“总脂质含量”和“油含量”本文中可互换使用，是指以TFA占干细胞重量[“DCW”]的百分比测量的细胞的脂质/油含量，尽管总脂质含量能够被近似为以占DCW的百分比测量的FAME[“FAMEs%DCW”]。因此，总脂质含量[“TFAs%DCW”]等于，例如，脂肪酸毫克数每100毫克DCW。

本发明的转基因含油酵母的油含量必须在可比较的生长条件下（例如，碳源的类型/量、氮源的类型/量、碳对氮的比率、矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产阶段的长度、油积聚阶段的长度和收获细胞的时间/方法）与本发明的非转基因含油酵母的油含量比较。

如本文所用，“分离的核酸片段”是RNA或DNA的聚合物，它是单链或双链的，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。

氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以推定鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST（Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.215：403-410（1993））。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有10个或更多邻接氨基酸或30个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定（如Southern杂交）和基因分离（如细菌菌落或噬菌斑的原位杂交）的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在聚合酶链反应（“PCR”）中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“主要部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。

术语“互补”描述了在以反向平行取向对齐时能以Watson-Crick法则进行碱基配对的两条核苷酸碱基序列之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷能与胸腺嘧啶碱基配对，胞嘧啶能与鸟嘌呤碱基配对。

“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，期望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

“合成基因”可由使用本领域的技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸基本单位组合而成。将这些构件进行连接并退火以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏好性，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因（其中序列信息可获得）的检测。例如，美国专利7,125,672中提供了解脂耶氏酵母的密码子使用谱，该文献以引用方式并入本文。

“基因”指可表达特定蛋白质的核酸片段，并且其可以指单独的编码区或可包括在编码序列之前的调控序列（5'非编码序列）和在编码序列之后的调控序列（3'非编码序列）。“天然基因”指自然状态下与其自身的调控序列一起的基因。“嵌合基因”指为非天然基因的任何基因，包含天然状态下不一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”指在生物体基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来”基因（或“外源”基因）是指通过基因转移导入至宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。“经密码子优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。

“合适的调控序列”指位于编码序列的上游（5'非编码序列）、中间或下游（3'非编码序列）的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调控序列可包括启动子、增强子、沉默子、5'非翻译前导序列（例如在转录起始位点和翻译起始密码子之间的序列）、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。

“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应不同的环境条件或生理条件而指导基因的表达。引起基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

术语“3'非编码序列”、“转录终止子”和“终止子”本文中可互换使用，是指位于编码序列3'下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3'端。3'区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。

术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，以便其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它可操作地连接至编码序列。即，编码序列处于启动子的转录控制下。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。

如本文所用，术语“表达”是指有义（mRNA）或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

“稳定转化”是指将核酸片段转移进宿主生物的基因组中（既包括核基因组也包括细胞器基因组），导致基因稳定遗传（即，该核酸片段被“稳定地整合”）。相反“瞬时转化”指将核酸片段转入宿主生物的核中或包含DNA的细胞器中，在无整合或无稳定的遗传特性的情况下引起基因表达。

术语“质粒”和“载体”指通常携带有不属于细胞中央代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。此类元件可具有源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，并且可以是线性或环状的、单链或双链DNA或RNA的，其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体，该独特构建体能够将表达盒引入细胞中。

术语“表达盒”指DNA片段，所述DNA片段包含：所选基因的编码序列和所选基因产物表达所需的位于该编码序列之前（5'非编码序列）和之后（3'非编码序列）的调控序列。因此，表达盒通常由如下序列构成：1）启动子序列；2）编码序列（即，开放阅读框（“ORF”））；和3）3'非翻译区（即终止子），在真核生物中其通常含有多腺苷酸化位点。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。可以将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物体中，只要能针对每种宿主使用正确的调控序列。

术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1）GCG程序包（Wisconsin Package Version9.0，Genetics Computer Group（GCG），Madison，WI）；2）BLASTP、BLASTN、BLASTX（Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410（1990））；3）DNASTAR（DNASTAR，Inc.Madison，WI）；4）Sequencher（Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI）；和5）所述FASTA程序结合了Smith-Waterman算法（W.R.Pearson，Comput.MethodsGenome Res.，[Proc.Int.Symp.]（1994），Meeting Date1992，111-20，编辑：Suhai，Sandor，Plenum：New York，NY）。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

在核酸或多肽序列上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指两序列中的核酸碱基或氨基酸残基当在指定比较窗口中比对最大匹配时是相同的。因此，“序列同一性百分比”或“同一性百分比”指通过在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列而测得的值，其中在与参考序列（其不包含添加或缺失）进行比较时，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失（即缺口）以实现两个序列的最佳比对。所述百分比的计算方法是，统计相同的核酸碱基或氨基酸残基在两段序列中同时出现的位点的数量以得到匹配位点数，将此匹配位点数除以比对窗口中的总位点数，再将结果乘以100，从而得到序列一致性百分比。

用于测定“同一性百分比”和“相似性百分比”的方法在被编码于可公开获得的计算机程序中。同一性百分比和相似性百分比能够容易地通过已知方法计算出来，所述方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：1）Computational Molecular Biology（Lesk，A.M.编辑）Oxford University：NY（1988）；2）Biocomputing：Informatics and Genome Projects（Smith，D.W.编辑）Academic：NY（1993）；3）Computer Analysis of Sequence Data，Part I（Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑）Humania：NJ（1994）；4）Sequence Analysis in Molecular Biology（von Heinje，G.编辑）Academic（1987）；和5）Sequence Analysis Primer（Gribskov，M.和Devereux，J.编辑）Stockton：NY（1991）。

序列比对和百分比同一性的计算可使用设计用于检测同源序列的多种比对方法来确定。

序列的多重比对能够采用包括几种改变形式的算法在内的“Clustal比对方法”进行，包括“ClustalV比对方法”和“ClustalW比对方法”（描述于Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153（1989）；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191（1992））并存在于MegAlign^TM（版本8.0.2）程序（同上）中。用Clustal程序比对序列后，可通过查看程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”。

术语“保守结构域”或“基序”指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其它位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表明对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们可通过它们在蛋白质同源物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标签或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。

术语“保守结构域分析方法”是指美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information[“NCBI”]）的“鉴定保守结构域（Identify Conserved Domains）”工具，其使用CD-检索来检测蛋白质序列中的保守结构域（Marchler-Bauer，A.和S.H.Bryant，Nucleic AcidsRes.，32（W）327-331（2004）；Marchler-Bauer，A.等人，Nucleic AcidsRes.，37（D）205-210（2009）；和Marchler-Bauer，A.等人，NucleicAcids Res.，39（D）225-229（2011））。

术语“kinetochor_Ybp2超家族”是指描述于Pfam蛋白质数据库（Finn，R.D.等人，Nucleic Acids Res.，36（Database issue）：D281–D288（2008））中的Pfam08568家族蛋白质。

本文使用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且被描述于下列文献中：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY（1989）（下文称为“Maniatis”）；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY（1984）；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ（1987）。

激活因子蛋白质1[“AP-1”]是一种转录因子，它是由亚基组成的异二聚体蛋白质，这些亚基是至少三个不同的原癌基因家族的产物：Jun（c-Jun、v-Jun、JunB、JunD）、Fos（c-Fos、v-Fos、FosB、FosB2、Fra-1、Fra-2）和激活转录因子（B-ATF、ATF2、ATF3/LRF1）家族。AP-1调控响应于多种刺激的基因表达，包括细胞因子、生长因子、胁迫、以及细菌和病毒感染；因此，AP-1通过上调包含AP-1识别元件、具有如TGA（C/G）TCA的序列的基因的转录，控制多种细胞过程。AP-1通过碱性氨基酸区域与该DNA序列结合，而二聚结构通过亮氨酸拉链形成。

YAP1是AP-1的啤酒糖酵母等同物，并且已被推断为作为氧化应激反应的主要转录因子起作用（Moye-Rowley等人，Genes Dev.,3：283-292（1989））（SEQ ID NO:2）。结构上，该蛋白质具有由富含亮氨酸的拉链区域和邻近的碱性区域（即，包含精氨酸和赖氨酸残基）组成的bZip结构基序，以及N-末端富含半胱氨酸的结构域（即，Cys303、Cys310和Cys315）和C-末端富含半胱氨酸的结构域（即，Cys598、Cys620和Cys629）。

功能上，至少一个分子内二硫键响应于H₂O₂胁迫在Cys303和Cys598之间形成，从而导致Yap1的多步骤的构象变化和Yap1在核的积聚（由于出核转运信号的修饰）。以这种活性的氧化形式，Yap1控制至少32种不同蛋白质（包括谷胱甘肽和戊糖磷酸途径的细胞抗氧化剂和酶类）的大的调节子的表达（Lee，J.等人，J.Biol.Chem.，274:16040-16046（1999））。Yap1的钝化通过用Yap1-控制的硫氧还蛋白的酶还原发生，从而提供了自调控机制。

啤酒糖酵母Yap1蛋白质的氧化并不直接响应于H₂O₂地发生；相反，组成型表达的硫醇过氧化物酶蛋白质（例如，Gpx3；SEQ ID NO:26）转导H₂O₂信号并负责催化分子内二硫键在Yap1中的形成（Inoue等人，J.Biol.Chem.，274：27002-27009（1999）；Delaunay，A.等人，Cell，111：471-481（2002））。该谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）-样蛋白质的Cys36首先通过二硫键与Yap1的Cys598桥接，该二硫键被转换为Yap1分子内二硫键（图1，重新创建自Tachibana，T.等人，J.Biol.Chem.284：4464-4472（2009）；Okazaki等人，Mol.Cell，27：675-688（2007））。不与Yap1反应的Gpx3蛋白质能够将H₂O₂直接还原为水，导致在Gpx3蛋白质的Cys36和Cys82之间形成分子内二硫键。用于激活Yap1的Gpx3-依赖的途径是已知的（Azevedo，D.等人，Free Radic.Biol,Med.，35：889-900（2003））。

除了Gpx3之外，一系列其它的包含至少一个氧化还原活性的半胱氨酸残基的抗氧化蛋白（Prx）能够激活Yap1转录因子（通过直接或间接的方式）。具体地，T.Tachibana等人（J.Biol.Chem.,284（7）：4464-4472（2009））将五种Prx家族蛋白质[即，Tsa1、Tsa2、Prx1、Ahp1、Dot5]和两种Gpx-样蛋白质[即，Gpx2、Gpx3]鉴定为在出芽酵母中具有硫氧还蛋白依赖的过氧化物酶活性（全部这些将在本文中被一般地称为Prx蛋白质）。这些蛋白质与Yap1相互作用的确切性质仍然有待研究。Tachibana，T.等人（J.Biol.Chem.，284：4464-4472（2009））报道了啤酒糖酵母Tsa1（SEQ ID NO:34）以与Gpx3的相似的方式与Yap1相互作用，基于Cys-48和Cys-171。

尽管Yap1和Ybp1相互作用的确切机制是未知的，Ybp1已被证明同样影响Yap1转录因子的激活。Gulshan，K.等人（J.Biol.Chem.，286（39）：34071-34081（2011））在啤酒糖酵母和光滑假丝酵母中研究了Ybp1和Yap1之间的相互作用；他们报道了“Yap1和Ybp1很可能在细胞中直接相互作用进一步定位这两种蛋白质的相互作用基序的努力是失败的”。在该文中推测Yap1和Ybp1的相互作用很可能涉及多种的、低亲和力的相互作用，而Yap1的氧化很可能触发了折叠的蛋白质从它的Ybp1伴侣的释放。Ybp1在啤酒糖酵母中的过量产生也被报道导致了提高的H₂O₂耐受性。

氧化应激反应的机制是相对而言很保守的（尽管在物种之间有一些差异），并且Yap1p同源物，例如白假丝酵母（Candida albicans）中的Cap1p和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中的Pap1p，也已知响应于氧化胁迫从转录上调控一些抗氧化基因（Ikner，A.和K.Shiozaki,Mutat.Res.，569:13-27（2005））。然而，氧化应激反应在含油酵母中起作用的方式被表征得少得多。含油酵母天然地能够合成和积聚油，其中总的油含量能够占干细胞重量[“DCW”]的大于约25%，更优选占DCW的大于约30%，更优选占DCW的大于约40%，更优选占DCW的大于约50%，最优选占DCW的大于约60%（其中该油积聚的比率是在根据本发明在酵母中提高天然的Yap1转录因子活性的任何努力之前的）。多种酵母天然地被分类为含油的；然而，在替代实施例中，非含油的生物能够经基因修饰变成含油的，例如，酵母如啤酒糖酵母（参见国际申请公布WO2006/102342）。

通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。更具体地讲，示例性的油合成酵母包括：圆红冬孢酵母（Rhodosporidiumtoruloides）、斯达氏油脂酵母（Lipomyces starkeyii）、产油油脂酵母（L.lipoferus）、拉可夫氏假丝酵母（Candida revkaufi）、铁红假丝酵母（C.pulcherrima）、热带假丝酵母（C.tropicalis）、产朊假丝酵母（C.utilis）、茁芽丝孢酵母（Trichosporon pullans）、皮状丝孢酵母（T.cutaneum）、胶粘红酵母（Rhodotorula glutinus）、禾本红酵母（R.graminis）、和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）（诸如，例如但不限于被命名为ATCC20362、ATCC8862、ATCC18944、ATCC76982和/或LGAM S（7）1（Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.，82（1）：43-9（2002）的解脂耶氏酵母菌株）。

如同其它进行有氧代谢并从而依赖对ROS（通过呼吸作用过程中氧至水的不完全还原产生）的防御的生物，专性有氧的含油酵母也需要多种方式来感测和响应氧化胁迫。在本发明中，啤酒糖酵母Yap1、Gpx3、Tsa1和Ybp1基因的同源物已在含油酵母解脂耶氏酵母中被鉴定，如下表中所总结的。每一对蛋白质的比对是用CLUSTAL W（1.81）多序列比对（Thompson J.D.等人，Nucleic Acids Res.22：4673-4680（1994））进行的。

表2：Yap1、Gpx3、Tsa1和Ybp1同源物

令人吃惊地，当解脂耶氏酵母Yap1[“YlYap1”]和Gpx3[“YlGpx3”]蛋白质被过表达以导致提高的Yap1转录因子活性时，转基因的解脂耶氏酵母被发现具有与非转基因的解脂耶氏酵母的油含量相比提高的油含量（以TFA%DCW测量）。

因此，本发明涉及具有提高的油含量的转基因含油酵母，所述转基因含油酵母包含提高的Yap1转录因子活性，其中所述提高的油含量是与非转基因含油酵母的油含量相比的。

本文推测提高的油含量在转基因含油酵母中被观察到，因为提高的Yap1转录因子活性提供了对氧化胁迫的提高的抗性。上述对氧化胁迫的提高的抗性的一个有益后果是对脂质过氧化作用的提高的防御，其从而导致了转基因含油酵母中提高的油/脂质含量。在脂质分子之中，PUFA是对ROS尤其敏感的，并且据显示，脂肪酸对脂质过氧化作用的敏感性随着脂肪酰链的不饱和程度而升高（Porter，N.A.等人，Lipids，30:277-290（1995））。脂质过氧化作用被显示通过产生影响膜完整性的极性氢过氧化物影响细胞活力（Howlett，N.G.和S.V.Avery，Appl.Microbiol.Biotechnol.，48（4）：539-545（1997）；Howlett，N.G.和S.V.Avery，Appl.Environ.Microbiol.，63（8）：2971-2976（1997））。然而，此前还没有研究显示了Yap1转录因子过表达对油含量的影响。

优选地，本发明的转基因含油酵母将能够产生比非转基因含油酵母的油含量高至少10-25%的油含量。更优选地，油含量的提高是至少高25-45%，最优选地，油含量的提高是比非转基因含油酵母的油含量高至少45-65%。因此，本领域的技术人员将会知道，油含量的提高能够是从10%一直到并且包括100%或更高的任何整数百分比（或其分数），即，具体地，当与非转基因含油酵母的油含量比较时，10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的油含量的提高。

如上所述，微生物油将包含三酰基甘油（包括长链多不饱和的和/或饱和的脂肪酸，以及短链饱和的和/或不饱和的脂肪酸）、以及其它中性脂质、磷脂和游离脂肪酸。

在一个实施例中，在具有提高的油含量的转基因含油酵母中提高的Yap1转录因子活性是由过表达Yap1转录因子引起的。适合的Yap1转录因子将优选地包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有转录因子活性并且包含：

a)bZIP亮氨酸拉链基序；

b)N-末端富含半胱氨酸的结构域，所述结构域包含至少两个由至少6个氨基酸隔开的半胱氨酸残基的序列；和

c)C-末端富含半胱氨酸的结构域，所述结构域包含至少两个由至少8个氨基酸隔开的半胱氨酸残基的序列。

bZIP亮氨酸拉链基序包含跨越大约十四至十六个氨基酸的碱性DNA结合区域（即，包含精氨酸和赖氨酸残基）和邻近的富含亮氨酸的拉链区域（即，包含允许二聚化的均匀分布的亮氨酸残基）（Hurst，H.C.，Protein Profile，2:101-168（1995））。

一种优选的Yap1转录因子是解脂耶氏酵母Yap1[“YlYap1”]多肽序列，如SEQ ID NO:4所示。在替代性实施例中，ScYAp1（SEQ ID NO:2）或任何表4中所列的序列（实例1）、或它们的同源物或密码子优化的衍生物，可被用于本发明中。

在另一个实施例中，在具有提高的油含量的转基因含油酵母中提高的Yap1转录因子活性，是通过提高该转录因子和能够激活该转录因子的蛋白质之间的相互作用（即，通过过表达所述能够激活该转录因子的蛋白质自身）引起的。优选地，所述能够激活所述转录因子的蛋白质选自：Gpx3、Ybp1和Tsa1。

例如，适合的Gpx3蛋白质将包含：

a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于BLASTP比对方法，所述多肽在与选自SEQ ID NO:26[ScGpx3]或SEQ ID NO:28[YlGpx3]的序列进行比较时具有至少70%的氨基酸同一性；

b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于BLASTN比对方法，所述核苷酸序列在与选自SEQ ID NO:25[ScGpx3]或SEQ ID NO:27[YlGpx3]的序列进行比较时具有至少70%的序列同一性；或

c)（a）或（b）的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100%互补的。

适合的Gpx3蛋白质将包含至少一种氧化还原活性的半胱氨酸残基，例如ScGpx3（SEQ ID NO:26）的Cys36和Cys82。

优选地，编码Gpx3的多肽序列如SEQ ID NO:28（“YlGpx3”）所示。在替代性实施例中，基于CLUSTALW比对方法，编码Gpx3的多肽序列在与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28进行比较时具有至少70%的序列同一性，即，所述多肽在与其比较时可具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的同一性。在替代性实施例中，表9（实例5）中所列的序列、或它们的同源物或密码子优化的衍生物，可被用于本发明中。

类似地，适合的Tsa1蛋白质将包含：

a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于BLASTP比对方法，所述多肽在与选自SEQ ID NO:34[ScTsa1]或SEQ ID NO:36[YlTsa1]的序列进行比较时具有至少70%的氨基酸同一性；

b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于BLASTN比对方法，所述核苷酸序列在与选自SEQ ID NO:33[ScTsa1]或SEQ ID NO:35[YlTsa1]的序列进行比较时具有至少70%的序列同一性；或

c)（a）或（b）的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100%互补的。

适合的Tsa1蛋白质将包含至少一种氧化还原活性的半胱氨酸残基，例如ScTsa1（SEQ ID NO:34）的Cys48和Cys171。

优选地，编码Tsa1的多肽序列如SEQ ID NO:36（“YlTsa1”）所示。在替代性实施例中，基于CLUSTALW比对方法，编码Tsa1的多肽序列在与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36进行比较时具有至少70%的序列同一性，即，所述多肽在与其比较时可具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的同一性。在替代性实施例中，表12（实例9）中所列的序列、或它们的同源物或密码子优化的衍生物，可被用于本发明中。

适合的Ybp1蛋白质将包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中所述多肽序列基于保守结构域分析方法被分类在kinetochor_Ybp2超家族内。

优选地，编码Ybp1的多肽序列如SEQ ID NO:40（“YlYbp1”）所示。在替代性实施例中，ScYbp1（SEQ ID NO:38）或任何表13或表14中所列的序列（实例10，即，包括SEQ ID NO:43-48）、或它们的同源物或密码子优化的衍生物，可被用于本发明中。

为清楚起见，在本发明的转基因含油酵母中提高的Yap1转录因子活性，能够通过过表达天然的Yap1转录因子、外来的Yap1转录因子、天然的能够激活所述转录因子的蛋白质、外来的能够激活所述转录因子的蛋白质、或它们的任何组合而实现。过表达可以，例如，通过将适当的基因的附加的拷贝在多拷贝质粒上引入宿主细胞中而发生。这些基因可与导致其所编码的功能活性增加的合适调控序列整合进染色体中。可修饰靶基因以处于非天然启动子或改变的天然启动子的控制下。可通过突变、缺失和/或置换体内改变内源启动子。

如上文所指出的，可能期望针对在所关注的含油酵母中的表达，对上文所描述的Yap1、Gpx3、Tsa1或Ybp1蛋白质中的任何一种进行密码子优化。例如，能够针对在解脂耶氏酵母中的表达，对表4、9、12、13或14中所列的任何序列进行密码子优化。基于先前对解脂耶氏酵母密码子使用谱的确定、对那些优选的密码子的鉴定、以及对‘ATG’起始密码子周围的共有序列的确定（参见美国专利7,238,482），这是可能的。

在另一个实施例中，表4、9、12、13或14中所列的序列或它们的部分，可被用于利用序列分析软件在相同的或其它的物种中检索Yap1、Gpx3、Tsa1或Ybp1同源物。通常，这种计算机软件通过将同源程度赋予多种置换、缺失和其它修饰来匹配相似的序列。使用软件算法，如具有低复杂度滤波器和以下参数的BLASTP比对方法：Expect value=10，matrix=Blosum62（Altschul等人，Nucleic Acids Res.，第25卷，第3389-3402页（1997）），该方法是用于将表4、9、12、13或14中的任何Yap1、Gpx3、Tsa1或Ybp1蛋白质对核酸或蛋白质序列数据库进行比较并从而鉴定在优选生物中的相似已知序列的熟知方法。

使用软件算法搜索已知序列数据库尤其适用于分离对可公开获得的Yap1、Gpx3、Tsa1或Ybp1序列具有相对低的百分比同一性的同源物，例如在表4、9、12、13或14中描述的那些。可预测的是：分离与可公开获得的Yap1、Gpx3、Tsa1或Ybp1序列具有至少约70%-75%的同一性、更优选至少约80%-85%同一性的Yap1、Gpx3、Tsa1或Ybp1同源物将是相对更容易的。此外，那些至少约85%-90%相同的序列将尤其适于分离，那些至少约90%-95%相同的序列将最容易分离。

一些Yap1、Gpx3、Tsa1或Ybp1同源物也已通过使用这些酶独特的基序而被分离。如人们将会知道的，这对于转录因子是尤其有用的，尽管共有多个保守的序列基序，转录因子彼此之间共享相对低的序列同源性。基序（例如，Yap1转录因子的bZIP亮氨酸拉链基序的碱性DNA结合区域和邻近的富含亮氨酸的拉链区域、N-末端富含半胱氨酸的结构域和C-末端富含半胱氨酸的结构域）通过它们在蛋白质同源物的家族的对齐的序列中的高度保守性而被鉴定。作为独有的“标记”，它们能决定具有新测定序列的蛋白是否属于以前鉴定过的蛋白家族。类似地，Gpx3和Tsa1同源物预期包含至少一个氧化还原活性的半胱氨酸残基，其在蛋白质序列中的相对位置将是保守的。这些基序作为快速鉴定新型同源基因的诊断工具是有用的。

本文所述或公开文献中的任何Yap1、Gpx3、Tsa1或Ybp1核酸片段，或任何鉴定的同源物，可用于从相同的或其它的物种中分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的例子包括但不限于：1）核酸杂交方法；2）DNA和RNA扩增方法，例如核酸扩增技术的多种应用，如聚合酶链反应[“PCR”]（美国专利4,683,202）；连接酶链反应[“LCR”]（Tabor，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82:1074（1985））；或链置换扩增[“SDA”]（Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第89卷，第392页（1992））；和3）文库构建和互补筛选方法。

本发明还涉及提高含油酵母中油含量的方法，其中所述方法包括：

a)工程化所述含油酵母以过表达选自下列的蛋白质：

(i)   Yap1转录因子；

(ii)  能够激活所述转录因子的蛋白质；

(iii) （a）和（b）的组合；以及

b)使所述含油酵母在适宜的条件下生长以产生与非转基因含油酵母的油含量相比提高的油含量。

本领域的普通技术人员知道描述下列的标准的来源资料：1）用于构建、操纵和分离大分子，例如DNA分子、质粒等的具体条件和规程；2）重组DNA片段和重组表达构建体的产生；以及3）克隆的筛选和分离。参见Maniatis，Silhavy，和Ausubel，如上文所引用的。

一般来讲，存在于重组表达构建体中的序列的具体选择取决于期望的表达产物、宿主细胞的性质以及提出的相对于未转化细胞分离转化细胞的方法。通常，载体含有至少一个表达盒、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。适合的表达盒通常包含启动子、所选择的基因的编码序列（例如，编码其表达导致提高的Yap1转录因子活性的多肽）、和终止子（即，嵌合基因）。优选地，两个控制区均来源于来自所转化的宿主细胞的基因。

几乎任何能够指导编码本发明的多肽的ORF的表达的启动子（即，天然的、合成的、或嵌合的）都将是适合的，不过来自解脂耶氏酵母的转录和翻译区域是尤其有用的。表达能以诱导型或组成型完成。诱导型表达能够通过诱导可操作地连接至所关注的基因（例如，Yap1、Gpx3、Tsa1、Ybp1）的可调节启动子的活性来完成，而组成型表达能够通过利用可操作地连接至所关注的基因的组成型启动子来实现。

终止子能够来源于启动子所得自的基因的3'区或来源于不同的基因。大量的终止子是已知的，并且在用于与它们所源自的属和物种相同的和不同的属和物种时，在多种宿主中令人满意地起作用。终止子的选择通常更多是为了方便而不是因为任何特殊的性质。优选地，终止子来源于酵母基因。终止子还能够是合成的，本领域的技术人员能够利用可利用的信息来设计和合成终止子。终止子可以是非必需的，但它是高度优选的。

尽管不旨在进行限制，用于重组解脂耶氏酵母中的优选的启动子和终止子是美国专利公布2009-0093543-A1、美国专利公布2010-0068789-A1、美国专利公布2011-0059496-A1、美国临时专利申请61/469,933（代理人档案号CL4736USPRV，提交于2011年3月31日）、美国临时专利申请61/470,539（代理人档案号CL5380USPRV，提交于2011年4月1日）、美国临时专利申请61/471,736（代理人档案号CL5381USPRV，提交于2011年4月5日）和美国临时专利申请61/472,742（代理人档案号CL5382USPRV，提交于2011年4月7日）中所教导的那些，上述每一公开以引用方式并入本文。更具体地，优选的启动子包括：GPD、GPDIN、GPM、GPM/FBAIN、FBA、FBAIN、FBAINm、GPAT、YAT1、EXP1、DGAT2、EL1、ALK2、和SPS19。

许多专门的表达载体已被构建，以获得高的表达率。此类载体是通过调整控制转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和定位、和从宿主细胞的分泌的某些性质而制备的。这些性质包括：相关转录启动子和终止子序列的性质；所克隆基因的拷贝数目（其中可以在单个表达构建体中克隆另外的拷贝和/或将另外的拷贝通过增加质粒拷贝数或通过将克隆基因多次整合进基因组中来引入宿主细胞中）；基因是质粒携带的还是整合进了宿主细胞的基因组中；蛋白质在宿主生物内的翻译和正确折叠的效率；所克隆基因的mRNA和蛋白质在宿主细胞内的固有稳定性；以及所克隆基因中的密码子使用，使得其频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。

获得了适合在含油酵母中表达的DNA盒（例如，包含由启动子、编码其表达导致提高的Yap1转录因子活性[例如，Yap1、Gpx3、Tsa1、Ybp1]的多肽的ORF、和终止子组成的嵌合基因）之后，即将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或者包含所述嵌合基因的DNA片段被直接整合进基因组。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生，或者能够通过使用包含与基因组具有足以将重组靶向至特定基因座的同源性的区域的构建体来定向。如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可由内源性基因座提供。

包含所关注的嵌合基因的构建体可以通过任何标准技术被引入含油酵母中。这些技术包括转化如醋酸锂转化（Methods in Enzymology，194:186-187（1991））、基因枪轰击（bolistic impact）、电穿孔、显微注射或将所关注的基因导入宿主细胞中的任何其它方法。适用于解脂耶氏酵母的更具体的教导包括美国专利4,880,741和美国专利5,071,764以及Chen，D.C.等人（Appl.Microbiol.Biotechnol.，48（2）：232-235（1997））。优选地，线性DNA片段向宿主基因组中的整合在解脂耶氏酵母宿主细胞的转化中是有利的。当期望基因高水平表达时，整合到基因组中的多个位置可以是尤其有用的优选的基因座包括美国专利公布2009-0093543-A1中所教导的那些。

术语“转化的”、“转化体”或“重组”本文中可互换使用。转化的宿主将具有至少一个拷贝的表达构建体，并且可具有两个或更多个拷贝，这取决于该表达盒是整合到基因组内的、被扩增的、还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。转化宿主细胞能通过选择导入构建体上包含的标记进行鉴定。作为另外一种选择，分离的标记构建体可用期望的构建体进行共转化，该方法与多种将多个DNA分子导入宿主细胞的转化技术一样。通常，就转化的宿主在选择性培养基上生长的能力对它们进行选择，所述选择性培养基可掺入了抗生素或缺少未被转化的宿主生长所必需的因子，例如营养物质或生长因子。导入的标记基因可赋予抗生素抗性，或编码必需的生长因子或酶，从而当在转化宿主中表达时允许在选择培养基上生长。转化宿主的选择也能发生在表达标记蛋白能被直接地或间接地检测出来时。更多的选择技术描述于美国专利7,238,482、美国专利7,259,255和WO2006/052870中。

整合的DNA片段在含油酵母中的稳定性依赖于具体的转化体、受体菌株和所使用的靶向平台。因此，特定重组微生物宿主的多个转化体应当被筛选，以获得表现出所期望的表达水平和模式的菌株。DNA印迹的Southern分析（Southern，J.Mol.Biol.，98：503（1975））、mRNA表达的Northern分析（Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618（1-2）：133-145（1993））、蛋白质表达的Western分析、表型分析或GC分析是适合的筛选方法。

适合用于本发明中的宿主细胞是含油酵母，其能够积聚占它们的DCW超过约25%的油，如上文所规定的。在本文的一些实施例中，所述含油酵母宿主是野生型菌株；在替代性实施例中，含油酵母宿主是之前经受了用表达载体进行的转化的转化的或重组的菌株，所述表达载体是不影响Yap1转录因子活性的天然水平的。例如，在一些实施例中，所述含油酵母之前已经过改造，使得其能够产生至少一种所关注的非天然的产物，其中适合的所关注的非天然产物的例子包括，例如，多不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、氨基酸、维生素、甾醇类、类黄酮、有机酸、多元醇和羟基酯、醌衍生的化合物和白藜芦醇，尽管本文中这并不旨在是限制性的。

值得指出的是，含油酵母宿主可在其微生物油中（通过天然的能力或基因修饰）产生“多不饱和脂肪酸”（或“PUFA”）。尽管与PUFA，尤其是ω-3和ω-6PUFA相关联的健康有益效果已有很好的文献记录，这些分子是尤其易受细胞内脂质过氧化作用的影响的，因为它们在中间包含位于具有特别反应性的氢的亚甲基-CH₂-基团的多个双键。更具体地，本文中PUFA是指具有至少18个碳原子和2个或更多个双键的脂肪酸。术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸（链烷酸），链长为约C₁₂-C₂₂（尽管更长和更短链长的酸均是已知的）。主要的链长介于C₁₆和C₂₂之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳（“C”）原子的总数，而Y表示双键的数目。另外的关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸”[“PUFA”]、以及“ω-6脂肪酸”[“n-6”]对“ω-3脂肪酸”[“n-3”]之间的区别的详细信息在美国专利7,238,482中有所提供，该专利以引用方式并入本文。美国专利申请公布2009-0093543-A1，表3，提供了ω-3和ω-6PUFA以及它们的前体的化学名和常用名以及常用缩写的详细摘要。

然而，PUFA的一些例子包括但不限于亚油酸[“LA”，18:2ω-6]、γ-亚麻酸[“GLA”，18:3ω-6]、二十碳二烯酸[“EDA”，20:2ω-6]、二高-γ-亚麻酸[“GLA”，20:3ω-6]、花生四烯酸[“ARA”，20:4ω-6]、二十二碳四烯酸[“DTA”，22:4ω-6]、[“DPAn-6”，22:5ω-6]、α-亚麻酸[“ALA”，18:3ω-3]、十八碳四烯酸[“STA”，18:4ω-3]、二十碳三烯酸[“ETA”，20:3ω-3]、二十碳四烯酸[“ETrA”，20:4ω-3]、二十碳五烯酸[“EPA”，20:5ω-3]、二十二碳五烯酸[“DPAn-3”，22:5ω-3]和二十二碳六烯酸[“DHA”，22:6ω-3]。

已有大量努力花在了工程化解脂耶氏酵母菌株用于PUFA生产上。例如，美国专利7,238,482展示了在酵母中生产ω-6和ω-3脂肪酸的可行性。美国专利7,932,077展示了占总脂肪酸28.1%的EPA的重组生产；美国专利7,588,931展示了占总脂肪酸14%的ARA的重组生产；美国专利7,550,286展示了占总脂肪酸5%的DHA的重组生产；并且，美国专利申请公布2009-0093543-A1描述了用于EPA生产的优化的重组菌株并展示了占总脂肪酸至多55.6%的EPA的生产。美国专利申请公布2010-0317072-A1描述了进一步优化的重组解脂耶氏酵母菌株，其产生包含占TFA高至50%的EPA的微生物油，并且具有以TFA的重量百分比测量的EPA对以TFA的重量百分比测量的亚油酸至少3.1的比率。转化体解脂耶氏酵母表达去饱和酶（即，Δ12去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ4去饱和酶）和延伸酶（即，C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶、C_20/22延伸酶和Δ9延伸酶）基因的多种组合以生产PUFA。

表3提供了关于上文所引用的文献中描述的一些具体的解脂耶氏酵母菌株的信息，其中所述菌株具有去饱和酶和延伸酶的多种组合。应当认识到，这些是能够在本发明中用作适合的宿主细胞的示例性菌株，尽管具体的菌株和所产生的具体的PUFA（或它们的量）不以任何方式对本发明构成限制。

对于本领域的普通技术人员而言将显而易见的是，在产生至少一种PUFA的含油酵母中还原反应性氧物质[“ROS”]的方法将是尤其合乎期望的。因此，本发明的一个实施例涉及具有提高的油含量并且产生至少一种PUFA的转基因含油酵母，其中所述转基因含油酵母具有提高的Yap1转录因子活性，并且其中所述提高的油含量是与非转基因含油酵母的油含量相比较。提供的Yap1转录因子活性，通过Yap1转录因子自身的过表达或通过能够激活Yap1转录因子的蛋白质（例如Gpx3、Tsa1Ybp1）的过表达，可附加地导致细胞中给定的PUFA提高的含量（以其占干细胞重量的重量百分比[“%DCW”]计）。

例如，EPA产量或EPA滴度[“EPA%DCW”]的测量按照下列算式确定：（EPA%TFA）*（TFA%DCW）]/100。在上文的表3中所列的主要产生EPA的任何菌株中，预期在酵母中导致提高的Yap1转录因子活性的遗传操纵将既导致提高的油含量[“TFA%DCW”]又导致提高的EPA滴度[“EPA%DCW”]。

在优选的实施例中，产生至少一种PUFA的本发明的转基因含油酵母，将能够产生与给定的PUFA在非转基因含油酵母（即，它的Yap1转录因子活性没有被提高）中以其占DCW的重量百分比计的含量相比，高至少10-25%的给定PUFA以其占DCW的重量百分比计的含量。更优选地，给定PUFA的提高是至少25-45%，最优选地，给定PUFA的提高是至少高45-65%。因此，本领域的技术人员将会知道，给定PUFA以其占DCW的重量百分比计的提高能够是从10%一直到并且包括100%或更高的任何整数百分比（或其分数），即，具体地，10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%。

转化的宿主细胞能够在使得嵌合基因（例如，编码其表达导致提高的Yap1转录因子活性的多肽[例如，Yap1、Gpx3、Tsa1、Ybp1]等）的表达最优化，并产生微生物油的最高的和最经济的产量的条件下生长。一般来讲，可以被优化的培养基条件包括：碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法。含油酵母生长在复合培养基（例如，酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖液体培养基（YPD））或缺乏生长所必需的成分并由此强迫选择所需表达盒的确定成分的基本培养基中（例如，Yeast Nitrogen Base（DIFCO Laboratories，Detroit，MI））。

用于本文所述方法和宿主细胞的发酵培养基必须包含合适的碳源，如在美国专利7,238,482和美国专利公布2011-0059204-A1中所教导的。尽管预期本发明中利用的碳源可以涵盖许多种含碳源，但优选的碳源是糖类、甘油和/或脂肪酸。最优选的是葡萄糖、蔗糖、转化蔗糖、果糖和/或包含介于10-22个之间的碳原子的脂肪酸。

氮可以由无机的（例如，(NH₄)₂SO₄）或有机的（例如，尿素、谷氨酸、或酵母提取物）来源提供。除了包含蔗糖和氮源外，发酵培养基还包含合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域的技术人员已知的适合所述微生物生长和促进微生物油的生产所必需的酶途径的其它组分。要特别注意促进脂质和PUFA合成的几种金属离子（如Fe⁺²、Cu⁺²、Mn⁺²、Co⁺²、Zn⁺²、Mg⁺²）（Nakahara，T.等人，Ind.Appl.Single CellOils，D.J.Kyle和R.Colin编辑，第61-97页（1992））。

本发明中优选的生长培养基是普通的商业制备的培养基，例如YeastNitrogen Base（DIFCO Laboratories，Detroit，MI）。也可以使用其它确定的或合成的生长培养基，微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于具体微生物生长的合适培养基。适于发酵的pH范围通常介于约pH4.0至pH8.0之间，其中优选将pH5.5至pH7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选微氧条件。

通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要包括两个阶段的发酵过程，因为代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选地，采用两阶段的发酵过程用于在含油酵母中生产PUFA。这种方法在美国专利7,238,482中有所描述，其也描述了多种合适的发酵工艺设计（即分批式、补料分批式和连续式）和生长过程中的注意事项。

美国专利申请公布2009-0093543-A1的实例10还提供了重组解脂耶氏酵母菌株Y4305（其最大的产量是12.1EPA%DCW[即，55.6EPA%TFA，具有3.03的EPA%TFA对LA%TFA比率]，经过了162小时）的2-L发酵所需的参数的详细描述。该公开包括了对用于从冷冻的培养物制备接种物以产生种菌培养物的方法、在促进快速生长至高的细胞浓度的条件下对酵母的初始培养、和随后用于促进脂质和PUFA积聚（通过氮饥饿和持续提供葡萄糖）的对酵母的培养的描述。方法变量包括温度（控制在30-32℃之间）、pH（控制在5-7之间）、溶解氧浓度和葡萄糖浓度，监控并按照标准运行条件控制这些变量以确保过程性能始终如一和最终的PUFA油质量。

具体地，美国专利申请公布2009-0093543-A1的实例10的数据对于展示重组微生物宿主细胞的油谱将依赖于发酵自身的运行、方法参数、规模放大等，以及培养物被取样的具体时间点是有用的。因此，该文献中具体的工程化的菌株能够产生具有多种不同的脂质含量和组成（即，基于EPA%TFA、LA%TFA和EPA:LA比率）的微生物油。

当培养本文所述的转基因含油酵母时应当考虑这些因素，以在任何特定的发酵运行中充分实现该酵母的潜能。当要比较油含量时，转基因含油酵母和非转基因含油酵母应当在相似的条件下生长和取样。

在本文的一些方面中，主要产品是含油酵母生物质。同样地，从生物质中分离和纯化微生物油可能是不必要的（即，其中全细胞生物质是产品）。

然而，某些最终用途和/或产品形式可能需要对来自生物质的微生物油的部分和/或全部分离/纯化，以产生部分纯化的生物质、纯化的油、和/或纯化的它们的脂质级分。例如，PUFA可以以游离脂肪酸或酯化形式（如甘油酯、磷脂、硫脂或糖脂）存在于宿主微生物中，并且可以通过多种本领域熟知的方法从宿主细胞中提取出来。关于酵母脂质的提取技术、质量分析和可接受标准的一篇综述是Z.Jacobs（Critical Reviews inBiotechnology，12（5/6）：463-491（1992））的综述。A.Singh和O.Ward（Adv.Appl.Microbiol.，45：271-312（1997））也提供了有关下游加工的简述。

一般来讲，用于回收和纯化来自微生物生物质的微生物脂质和/或PUFA的方法可包括用有机溶剂萃取（例如美国专利6,797,303和美国专利5,648,564）、超声处理、超临界流体萃取（如使用二氧化碳）、皂化和物理方法例如挤压、珠磨器、或它们的组合。可参阅美国专利公开7,238,482的教导以获得更多细节。

存在过多掺入了ω-3和/或ω-6脂肪酸（尤其是例如ALA、GLA、ARA、EPA、DPA和DHA）的食物和饲料产品。预期包含长链PUFA的微生物量、部分纯化的包含PUFA的微生物量、纯化的包含PUFA的微生物油和/或纯化的PUFA将在食物和饲料产品中起作用以赋予该制剂健康益处。更具体地，包含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油将适合在多种食物和饲料产品中使用，所述产品包括但不限于：食物类似物、肉制品、谷类制品、烘焙食品、快餐食品和乳制品（详见美国专利申请公布2006-0094092）。饲料产品还包括供动物使用的那些。

本发明的组合物可用于医疗食物的配方中以使其具有健康有益效果，所述医疗食物包括医疗营养品、膳食补充剂、婴儿代乳品以及药物。食物加工和食物配制领域的技术人员将了解所述各种油的量和组成如何加入到食物或饲料产品中。该量在本文中将称为“有效”量并将取决于食物或饲料产品、旨在补充该产品的膳食或医疗食物或医疗营养品旨在纠正或治疗的医疗状况。

本发明的组合物可用于医疗食物的配方中以使其具有动物健康有益效果，所述医疗食物包括医疗营养品、膳食补充剂、和药物。

实例

缩写的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔浓度，“mM”表示毫摩尔浓度，“M”表示摩尔浓度，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对并且“kB”表示千碱基对。

表达盒的命名

表达盒的结构通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段而Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。

解脂耶氏酵母的转化和培养

解脂耶氏酵母菌株ATCC20362购自美国典型培养物保藏中心（Rockville，MD）。解脂耶氏酵母菌株通常是在根据下面所示的配方的数种培养基中于28-30℃生长的。

合成的完全培养基[“SC”]培养基（每升）：6.7g含硫酸铵并且不含氨基酸的酵母氮源；20g葡萄糖；1.9g/L不含尿嘧啶的酵母合成省却培养基补充剂（Yeast synthetic drop-out medium supplement）。

高葡萄糖培养基[“HGM”]（每升）：80葡萄糖，2.58g KH₂PO₄和5.36g K₂HPO₄，pH7.5（不需要调节）。

合成的右旋糖培养基[“SD”]（每升）：6.7g含硫酸铵并且不含氨基酸的酵母氮源；20g葡萄糖。

发酵培养基[“FM”]（每升）：6.7g/L不含氨基酸的YNB；6g/LKH₂PO₄；2g/L K₂HPO₄；1.5g/L MgSO₄-七水合物；5g/L酵母提取物；2%碳源（其中所述碳源是葡萄糖或蔗糖）。

解脂耶氏酵母的转化如美国专利申请公布2009-0093543-A1所述进行，其以引用方式并入本文。

解脂耶氏酵母的脂肪酸分析

为了进行脂肪酸[“FA”]分析，将细胞通过离心收集并提取脂质，如Bligh，E.G.和Dyer，W.J.（Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917（1959））所述。通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备脂肪酸甲酯[“FAME”]（Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys.,276（1）：38-46（1990））并随后将其用配有30m×0.25mm（内径）HP-INNOWAX（Hewlett-Packard）柱的Hewlett-Packard6890气相色谱仪（GC）进行分析。烘箱温度以3.5℃/分钟从170℃（保持25分钟）升到185℃。

为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母细胞（0.5mL培养物），在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分钟。将甲醇钠（100μl，1%）和已知量的C15:0三酰基甘油（C15:0TAG；目录号T-145，Nu-Check Prep，Elysian，MN）加入样品中，然后将样品于50℃涡旋振荡30分钟。在加入3滴1M氯化钠和400μl己烷后，涡旋并离心样品。移除上层并用GC进行分析。

作为另外一种选择，将描述于Lipid Analysis，William W.Christie，2003中的碱催化酯交换反应的改进法用于对来自发酵或烧瓶样品的肉汤样品的常规分析。具体地，将培养液体样品在室温下快速融化，随后称量（至0.1mg）进入油化的2mL微量离心管中，其具有0.22μm 

离心管滤器（目录号8161）。根据先前测定的DCW，使用了样品（75-800μl）。用Eppendorf5430离心机，以14,000rpm离心样品5-7分钟或移除肉汤所需的时间长度。移除过滤器，倒出液体，加入～500μl去离子水至过滤器中洗涤样品。离心除去水后，再次移出过滤器，倒出液体并重新插入过滤器。然后将管子重新插入离心机中，这一次保持盖子打开，离心～3-5分钟进行干燥。然后在管子上方大约1/2处切开过滤器，并插入新的2mL圆底Eppendorf管（目录号2236335-2）。

用仅接触切开的过滤器容器边缘而不接触样品或过滤材料的适当的工具将过滤器推至管子的底部。加入已知量的C15:0TAG（同上）甲苯溶液和500μl新鲜制备的1%甲醇钠甲醇溶液。用适当的工具将样品沉淀块用力捣碎，盖上管子并置于50℃加热块（VWR目录号12621-088）中30分钟。然后使管子冷却至少5分钟。然后，加入400μl己烷和500μl1M NaCl水溶液，涡旋振荡管子2×6秒并离心1分钟。将大约150μl上层（有机层）置于带有插入件的GC小瓶中，并通过GC进行分析。

经由GC分析记录的FAME峰值在与已知脂肪酸进行比较时通过它们的保留时间进行鉴定，并且通过比较FAME与已知量的内部标准品（C15:0TAG）的峰面积进行定量。因此，根据下式计算任何脂肪酸FAME的近似量（μg）[“μg FAME”]：（特定脂肪酸的FAME峰的面积/标准品FAME峰的面积）*（标准品C15:0TAG的μg数），而任何脂肪酸的量（μg）[“μg FA”]根据下式计算：（特定脂肪酸的FAME峰的面积/标准品FAME峰的面积）*（标准品C15:0TAG的μg数）*0.9503，因为1μg的C15:0TAG等于0.9503μg脂肪酸。注意：0.9503的转换因子是大多数脂肪酸测定的近似值，其范围介于0.95和0.96之间。

通过用单个FAME峰面积除以所有FAME峰面积的总数并乘以100，确定了总结以占TFA的重量%表示的每种单独的脂肪酸的量的脂质特征。

通过烧瓶检测法对解脂耶氏酵母中总脂质含量和组成的分析

为了分析在解脂耶氏酵母的特定菌株中的总脂质含量和组成，如下进行了烧瓶检测。具体而言，一个接种环的新鲜划线的细胞被接种至3mLFM培养基，并于30℃以250rpm生长过夜。测量OD_600nm，在125mL烧瓶中，加入一个等分试样的细胞，使得25mL FM培养基中最终的OD_600nm为0.3。在30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mL HGM中。在30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行脂肪酸分析（参见上文），并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定。

就DCW测定而言，通过在Beckman GS-6R离心机的Beckman GH-3.8转子中以4000rpm离心5分钟，收集了10mL培养物。沉淀被重悬于25mL水中，并如上文所述重新收集。将洗涤后的沉淀物重悬在20mL水中并转移到预先称过重的铝盘上。细胞悬浮液在80℃真空炉中干燥过夜。测量细胞重量。

计算细胞总脂质含量[“TFA%DCW”]，并且将其与列表显示以TFA%重量[“%TFA”]表示的每种脂肪酸浓度和以干细胞重量百分比表示的EPA含量[“EPA%DCW”]的数据综合考虑。

实例1

与啤酒糖酵母YAP1具有同源性的解脂耶氏酵母基因的鉴定

通过用ScYap1作为查询序列，对“Yeast project Genolevures”（Center for Bioinformatics，LaBRI，Talence Cedex，France）（亦参见Dujon，B.等人，Nature，430（6995）：35-44（2004））的公开的解脂耶氏酵母蛋白质数据库进行BLAST检索，在解脂耶氏酵母中鉴定了啤酒糖酵母Yap1（GenBank登录号NM_001182362；SEQ ID NO:1）[“ScYap1”]的直系同源物。

在全部的解脂耶氏酵母蛋白质中，与ScYap1具有最高的同源性（具有1.8e-18的期望值）的蛋白质序列，YALI0F03388p（GenBank登录号XP_504945；SEQ ID NO:4），被命名为“YlYap”。YALI0F03388p在其中被注释为“与同AP-1-样转录因子相关的uniprot|Q9P5L6粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）NCU03905.1较弱地相似”。

ScYap1和推定的YlYap1的比对显示在图2中。两种蛋白质均具有碱性的亮氨酸拉链（bZIP）基序，对应于邻近亮氨酸拉链的富含碱性氨基酸的N-末端碱性区域，亮氨酸拉链的特征在于以七个氨基酸的间隔被规律地隔开的多个亮氨酸残基。就该图而言，粗体字体和下划线显示的精氨酸和赖氨酸氨基酸残基对应于碱性区域；星号突出显示了亮氨酸拉链内的每一亮氨酸残基。立式框突出显示了ScYap1的N-末端富含半胱氨酸的结构域内的半胱氨酸残基（即，对应于SEQ ID NO:2的Cys303、Cys310和Cys315）和C-末端富含半胱氨酸残基的结构域内的半胱氨酸残基（即，对应于SEQ ID NO:2的Cys598、Cys620和Cys629）。这些残基中的五个在YlYap1中是保守的。如Toone和Jones（Curr.Opin.Genet.Dev.，9：55-61（1999））中所讨论的，bZIP结构域和富含半胱氨酸的结构域是AP-1家族蛋白质的特征。

使用编码YALI0F03388p（SEQ ID NO:4）的蛋白质序列，进行了美国国家生物技术信息中心（National Center for BiotechnologyInformation[“NCBI”]）BLASTP2.2.26+（Basic Local Alignment SearchTool；Altschul，S.F.等人，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402（1997）；Altschul，S.F.等人，FEBS J.，第272卷，第5101-5109页（2005））检索，以鉴定BLAST“nr”数据库（包括所有非冗余GenBank CDS区的翻译序列、来自NCBI参考序列计划（Reference Sequence Project）的RefSeq蛋白质序列、Brookhaven蛋白质数据库[“PDB”]中的蛋白质序列数据库、SWISS-PROT蛋白质序列数据库、蛋白质信息资源[“PIR”]中的蛋白质序列数据库和蛋白质研究基金[“PRF”]蛋白质序列数据库）中具有相似性的序列。

可根据%同一性、%相似性和期望值报告BLASTP比较的结果，所述比较概述了与SEQ ID NO:4具有最高相似性的序列。“%同一性”定义为两种蛋白质之间相同的氨基酸的百分比。“%相似性”定义为两种蛋白质之间相同的或保守的氨基酸的百分比。“期望值”用给定分值估计限定匹配数的匹配的统计显著性，该匹配数是在完全偶然地搜索数据库中这种大小片段时所预期的。

非常多的蛋白质被鉴定为与YALI0F03388p（SEQ ID NO:4）具有相似性。表4提供了具有大于或等于“2e-13”的期望值和具体地鉴定了该蛋白质的注释的那些命中的部分总结（即，对假设蛋白的命中被排除在外），尽管这不应被认为是限制了本公开。表4中的蛋白质与SEQ ID NO:4具有介于13至87%之间的查询覆盖度。

表4：与YlYap1（SEQ ID NO:4）具有相似性的基因

基于BLASTP检索，YALI0F03388p（SEQ ID NO:4）以30%的同一性和47%的相似度以及1e-41的期望值，与来自葡萄胞盘菌（Botryotiniafuckeliana）的假定蛋白BC1G_14094（GenBank登录号XP_001547321）具有最佳的相似度。

在已知功能的蛋白质之中，最好的命中是：来自太田节皮菌（Arthroderma otae）CBS113480的Chap1（GenBank登录号XP_002847259.1），具有30%的同一性和46%的相似度，以及2e-39的期望值；来自嗜热毛壳菌嗜热变种（Chaetomium thermophilum var.thermophilum）DSM1495的推定的Ap-1样转录因子，具有31%的同一性和46%的相似度，以及1e-37的期望值；以及，来自异旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus）的Chap1（GenBank登录号AAS64313），具有48%的同一性和64%的相似度，以及2e-27的期望值。Chap1已知是啤酒糖酵母Yap1的功能性同源物（S.Lev等人，Eukaryotic Cell，4（2）：443-454（2005））。

基于上述分析，SEQ ID NO:3被假定为编码解脂耶氏酵母的Yap1转录因子（“YlYap1”），其中其蛋白质序列如SEQ ID NO:4所示。

并不令人意外的是，YlYap1与其它bZIP转录因子具有这样的相对低的百分比同一性和相似度。例如，光滑假丝酵母（Candida glabrata）CgAP1p（GenBank登录号XP446996）已被肯定地表征为Yap1的功能性直系同源物（Chen，K.-H.等人，Gene，386（1-2）：63-72（2007））。尽管有共有的功能，Chen等人报道了光滑假丝酵母CgAP1p显示了与啤酒糖酵母Yap1p（GenBank登录号NP013707）仅37%的氨基酸同一性，与乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）KlAP1p（GenBank登录号P56095）30%的同一性，与白假丝酵母（Candida albicans）CAP1p（GenBank登录号AAD00802）26%的同一性，和与粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）Pap1p（GenBank登录号CAB66170）19%的同一性；然而，值得注意的是，光滑假丝酵母CgAP1p和啤酒糖酵母Yap1p之间的同一性在bZip结构域（73%同一性）、N-末端富含半胱氨酸的结构域（75%同一性）和C-末端富含半胱氨酸的结构域（85%同一性）中是尤其高的。

因此，尽管有上文描述的序列分析，对于确认YlYap1以与ScYap1的同源的方式发挥功能，进一步的功能性分析依然是必要的。

实例2

解脂耶氏酵母YAP1敲除菌株Y4184U（yap1Δ）中提高的过氧化氢敏 感度

本实例描述了使用构建体pYRH60（图3A；SEQ ID NO:5）来下调来自生产EPA的工程化的解脂耶氏酵母菌株Y4184U（实例7，参见下文）的染色体YAP1基因的表达。用YAP1敲除构建体片段转化解脂耶氏酵母菌株Y4184U，产生了菌株Y4184U（yap1Δ）。测定并比较了Yap1敲除对氧化胁迫敏感度以及对积聚的脂质水平和EPA的生产的影响。具体地，与其天然的Yap1未被敲除的细胞相比，YAP1的敲除导致了对H₂O₂的超敏感。

菌株Y4184U（yap1Δ）的构建

质粒pYRH60来源于质粒pYPS161，其被描述于美国专利申请2010-0062502（其中的实例2，图5A，SEQ ID NO:40）并且包含下列组分：

表5：质粒pYPS161（SEQ ID NO:6）的描述

解脂耶氏酵母YAP1基因（“YlYAP1”；SEQ ID NO:3）的940bp5’启动子区域（SEQ ID NO:7）取代了pYPS161（SEQ ID NO:6）的AscI/BsiWI片段，并且YlYAP1基因的1164bp3’终止子区域（SEQ ID NO:32）取代了pYPS161的PacI/SphI片段，以产生pYRH60（SEQ ID NO:5；图3A）。

用纯化的YAP1敲除构建体pYRH60（SEQ ID NO:5）的4.7kB AscI/SphI片段转化了解脂耶氏酵母菌株Y4184U（一般方法）。

为了筛选具有yap1缺失的细胞，对YlYap1进行了实时定量PCR，以耶氏酵母属翻译延伸因子基因TEF1（GenBank登录号AF054510）作为对照。用Primer Express软件版本2.0（Applied Biosystems，Foster City，CA）分别设计了靶向YAP1基因和对照TEF1基因的实时PCR引物和

探针。具体地，设计了实时PCR引物Yl-EF-1214F（SEQ ID NO:8）、Yl-EF-1270R（SEQ ID NO:9）、YAP1-346F（SEQ ID NO:10）和YAP1-409R（SEQ ID NO:11），以及YAP1-366T（即，5’6-FAM^TM-CGGGCTGCCCAAAGGGCC-TAMRA^TM，其中核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示）。从Applied Biosystems获得了TaqMan探针YL-EF-MGB-1235T（即，5’6-FAM^TM-CCTTCACTGAGTACCC-TAMRA^TM，其中核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示）。TaqMan荧光探针5’末端具有结合的6-FAM^TM荧光报告基因染料，而3’末端包含TAMRA^TM淬灭剂。PCR引物和YAP1探针得自Sigma-Genosys（Woodlands，TX）。

敲除候选DNA通过在50μl水中悬浮1个菌落进行制备。对于每一样品，TEF1和YAP1的反应一式三份地在相同的实时PCR孔内进行。实时PCR反应包括10皮摩尔各种正向和反向引物（即，Yl-EF-1214F、Yl-EF-1270R、YAP1-346F和YAP1-409R，参见上文）和2.5皮摩尔

探针（即，YL-EF-MGB-1235T和YAP1-366T，参见上文）、

Universal PCR Master Mix--No

Uracil-N-Glycosylase（UNG）（目录号PN4326614，Applied Biosystems）、1μl菌落悬浮液和8.5μl无RNase/DNase水，每个反应总体积为20μl。反应在

7900Sequence Detection System上使用下列条件进行：初始在95℃变性10分钟，随后进行95℃变性15秒、60℃退火1分钟的循环40次。

在每个循环期间通过监控6-FAM^TM荧光自动收集实时数据。使用TEF1基因阈值循环（CT）值进行数据归一化以进行数据分析，这按照ABI

7900Sequence Detection System说明书（参见ABI User Bulletin2“Relative Quantitation of Gene Expression”）进行。敲除克隆被鉴定为YAP1基因没有可检测的信号并且TEF1的C_T值≤30。

上文所列的方法将所筛选的克隆中的一个鉴定为yap1敲除的。解脂耶氏酵母Y4184U的yap1Δ突变体被命名为RHY240。

对敲除菌株Y4184U（yap1Δ）的H ₂ O ₂ 敏感度检测

在啤酒糖酵母中，缺少Yap1的菌株对于用H₂O₂灭杀是超敏感的。该表型与Yap1在控制氧化胁迫防御基因（例如TRR1（细胞质硫氧还蛋白还原酶）、TRX2（硫氧还蛋白）、GLR1（谷胱甘肽还原酶）、和GSH1（γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶））的诱导中的功能相关。为了测试推定的YlYap1作为氧化胁迫调节子的功能，对Y4184U（yap1Δ）进行了H₂O₂敏感度检测。

使Y4184U（yap1Δ）和Y4184（对照）细胞在SC培养基中生长至对数生长期（OD₆₀₀为～0.5），并用新鲜的SC培养基稀释至OD₆₀₀为0.01。将稀释的培养物的等分试样（100μl）与终浓度为从0至50mM的新鲜H₂O₂一起在30℃孵育1小时，从每一样品取7μl铺在YPD平板上。使细胞于30℃在YPD平板上继续生长2天。

Y4184U（yap1Δ）细胞显示出比对照菌株Y4184高得多的对H₂O₂胁迫的敏感度（图4A）。该结果支持了YlYap1（对应于YALI0F03388p）对于解脂耶氏酵母中的氧化胁迫防御是重要的并且是ScYap1的功能性同源物这一假说。

实例3

解脂耶氏酵母YAP1在啤酒糖酵母YAP1敲除菌株BY4743（yap1Δ） 中的过表达

本实例描述了使用中心粒质粒pYRH61（图3B；SEQ ID NO:14）来在啤酒糖酵母yap1Δ菌株中过表达推定的YlYap1（SEQ ID NO:4），以评估对氧化胁迫敏感度的影响。具体地，YlYAP1的过表达导致了在啤酒糖酵母yap1Δ菌株中对H₂O₂的超敏感性的功能性补偿。

啤酒糖酵母过表达质粒pYRH61的构建

质粒pYRH61来源于带有URA3作为选择性标记的中心粒质粒pRS316（Sikorski和Hieter，Genetics，122:19-27（1989））。pYRH61包含下列组分：

表6：质粒pYRH61（SEQ ID NO:14）的描述

具体地，使用引物Yl.Yap1-F-SpeI（SEQ ID NO:15）和Yap1-R（SEQID NO:16），通过PCR从解脂耶氏酵母基因组扩增了YlYAP1基因的1.6kB片段。反应混合物包含1μl基因组DNA、每种引物各1μl（来自20μM的储液）、2μl水、和45μl来自Invitrogen的AccuPrime PfxSuperMix。扩增如下进行：首先于95℃变性5分钟，然后是35个循环的：95℃变性60秒，55℃退火60秒，68℃延伸180秒。最后在72℃进行7分钟的延伸循环，随后在4℃终止反应。从PCR反应获得了1.6kb的DNA片段。

用SpeI/NotI消化了所扩增的基因，并与啤酒糖酵母FBA1基因[“ScFBA1”]的601bp5’启动子区域（SEQ ID NO:17）和ScFBA1的1022bp3’终止子区域（SEQ ID NO:18）一起克隆进pRS316（SEQ ID NO:19），以产生pYRH61（SEQ ID NO:14；图3B）。因此，pYRH61包含嵌合的ScFBA1::YlYAP1::ScFBA1基因。

表达pYRH61的啤酒糖酵母菌株的H ₂ O ₂ 敏感度检测

用pRS316（载体对照）或pYRH61转化了啤酒糖酵母菌株BY4743（MATa/α his3Δ1/his3Δ1leu2Δ0/leu2Δ0LYS2/lys2Δ0met15Δ0/MET15ura3Δ0/ura3Δ0）和它的同基因的yap1Δ菌株BY4743（yap1Δ）（得自Invitrogen，Carlsbad，CA），以评估YlYap1过表达对氧化胁迫敏感度的影响。

使细胞在缺乏尿嘧啶的SC培养基中生长至对数生长期（OD₆₀₀为～0.5），并用新鲜的SC培养基稀释至OD₆₀₀为0.01。将稀释的培养物的等分试样（100μl）与终浓度为从0至50mM的新鲜H₂O₂一起在30℃孵育1小时，从每一样品取7μl铺在YPD平板上。使铺板的细胞于30℃在YPD平板上继续生长2天。

图4B显示了H₂O₂敏感度检测的结果。具体地，上方两行是BY4743转化体（即，分别具有对照载体或pYRH61），而下方两行是BY4743（yap1Δ）转化体（即，分别具有对照载体或pYRH61）。

如图4B中所显示的，用对照质粒pRS316转化的BY4743yap1Δ菌株表现出比具有对照物或pYRH61的它的同基因的BY4743野生型菌株更高的对H₂O₂胁迫的敏感度。当YlYap1在BY4743yap1Δ菌株中过表达时，细胞对氧化胁迫的抗性变得比具有对照质粒的BY4743yap1Δ转化体强得多，表明YlYap1（SEQ ID NO:4）赋予了对氧化胁迫的抗性。

本文的结果支持了YlYap1（对应于YALI0F03388p）是ScYap1的功能性同源物并且与氧化胁迫防御相关联这一假说。

实例4

解脂耶氏酵母YAP1在解脂耶氏酵母菌株Y4184和Y9502中的过表达

本实例描述了过表达构建体pYRH43（图5A；SEQ ID NO:20）的合成及其向解脂耶氏酵母菌株Y4184U（实例7）和Y9502U（实例8）中的转化。测定并比较了YlYAP1过表达对脂质积聚水平的影响。具体地，YlYAP1的过表达导致了与其天然的Yap1水平未被操纵的细胞相比提高的总脂质（测量为以占总的干细胞重量的百分比计的总脂肪酸[“TFA%DCW”]）。

解脂耶氏酵母过表达质粒pYRH43的构建

质粒pYRH43来源于质粒pZuFmEaD5s（描述于美国专利7,943,365的实例6中，该文献以引用方式并入本文）。质粒pZuFmEaD5s包含嵌合的FBAINm::EaD5S::PEX20基因，其中：（i）FBAINm是编码果糖-二磷酸醛缩酶（E.C.4.1.2.13）的fba1基因上游的解脂耶氏酵母启动子（美国专利7,202,356）；（ii）EaD5S是来源于Euglena anabaena并经密码子优化以在耶氏酵母属中表达的合成的Δ5去饱和酶，侧翼为NcoI/NotI限制性酶位点；并且（iii）PEX20是来自耶氏酵母属PEX20基因（GenBank登录号AF054613）的PEX20终止子序列。

使用引物Yap1-F（SEQ ID NO:21）和Yap1-R（SEQ ID NO:16），通过PCR从解脂耶氏酵母基因组扩增了YlYAP1基因的1.6kB片段。反应混合物包含1μl基因组DNA、每种引物各1μl（来自20μM的储液）、2μl水、和45μl来自Invitrogen的AccuPrime Pfx Supermix。扩增如下进行：首先于95℃变性5分钟，然后是35个循环的：95℃变性1秒，55℃退火1秒，68℃延伸3秒。最后在72℃进行7分钟的延伸循环，随后在4℃终止反应。从PCR反应获得了1.6kb的DNA片段。

用PciI/NotI消化了所扩增的基因并用于替换pZuFmEaD5s的NcoI/NotI片段，以产生pYRH43。因此，pYRH43包含嵌合的FBAINm::YlYAP1::PEX20基因。

通过实时定量PCR鉴定转化体菌株Y4184U+YAP1和Y9502U+Yap1

用BsiWI/PacI切割了质粒pYRH43，分离了4.4kB的片段并用于转入（“一般方法”）解脂耶氏酵母菌株Y4184U（实例7）和Y9502U（实例8），从而产生菌株Y4184U+YAP1和Y9502U+Yap1。

通过用耶氏酵母属TEF1基因作为对照以与实例2中所描述的相似的方式进行实时定量RT-PCR，确认了YlYAP1的过表达。

引物适于利用基因组DNA的一系列稀释和下文详述的PCR条件进行实时定量。对于每一引物和探针的组，使用所获得的C_T值对DNA纳克数的对数进行了线性回归分析，并确认了扩增效率是在90-110%之内。

通过首先用Qiagen RNeasy^TM试剂盒（Valencia，CA）分离RNA，制备了来自菌株Y4184U+YAP1和Y9502U+Yap1的cDNA。然后通过用DNase（目录号PN79254，Qiagen）在室温下处理2μg RNA15分钟消除残余的基因组DNA，随后在75℃灭活5分钟。使用来自Applied Biosystems（目录号PN4368813）的High Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒，按照制造商推荐的规程从1μg处理的RNA生成cDNA。

对于每一样品，一式三份地分别进行了YlTEF1和YlYAP1的实时PCR反应。实时PCR反应包括正向和反向引物（100μM）（即，ef-324F[SEQID NO:22]、ef-392R[SEQ ID NO:23]、YAP1-346F[SEQ ID NO:10]和YAP1-409R[SEQ ID NO:11]）各0.2μl、每种

探针（100μM）（即，ef-345T[即，5’6-FAM^TM-TGCTGGTGGTGTTGGTGAGTT-TAMRA^TM，其中核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示]和YAP1-366T[即，5’6-FAM^TM-CGGGCTGCCCAAAGGGCC-TAMRA^TM，其中核苷酸序列如SEQID NO:13所示]）0.05μl、10μlUniversal PCR Master Mix--No

Uracil-N-Glycosylase（UNG）（目录号PN4326614，AppliedBiosystems）、1μl稀释的cDNA（1:10）、和8.55μl无RNase/DNase水，每一反应总体积为20μl。反应在ABI PRISM7900Sequence DetectionSystem上使用下列条件进行：初始在95℃变性10分钟，随后进行95℃变性15秒、60℃退火1分钟的循环40次。用TEF1引物组对每一样品进行了阴性的逆转录RNA对照，以确认基因组DNA的不存在。如实例2中所描述的收集了实时数据。

基于这一分析，推断出Y4184U+Yap1菌株与Y4184U（Ura+）对照菌株的相比表现出大约高2.9倍的YlYAP1基因表达水平，从而确认了质粒pYRH43的功能性。

转化体菌株Y4184U+YAP1中的脂质含量和组成

使解脂耶氏酵母菌株Y4184U（Ura+）（对照）和菌株Y4184U+Yap1在差不多的含油的条件下生长。更具体地，通过首先使培养物在25mL SD培养基中（起始OD₆₀₀为～0.3）于30℃有氧生长48小时，然后离心收集细胞，实现了含油的条件。然后将沉淀物重悬在25mL HGM中，并进一步以250rpm和30℃在振荡培养箱中孵育5天。

解脂耶氏酵母Y4184U（Ura+）对照和Y4184U+Yap1菌株的DCW、细胞的总脂质含量[“TFA%DCW”]、以占TFA的重量百分比计的每种脂肪酸的浓度[“%TFA”]和EPA产量（即，以其占干细胞重量的百分比计的EPA含量[“EPA%DCW”]）显示在下文的表7中，平均值以灰色高亮显示并标记为“平均值”。脂肪酸的缩写如下：硬脂酸（18:0）、油酸（18:1）、亚油酸（18:2）、和二十碳五烯酸（“EPA”，20:5）。

表7：解脂耶氏酵母菌株Y4184U（Ura+）和Y4184U+Yap1中的脂质 含量和组成

与Y4184U（Ura+）菌株的相比，YlYAP1（SEQ ID NO:4）（对应于基因座YALI0F03388p）在Y4184U中的过表达使脂质含量[“TFA%DCW”]提高了大约12%并且使平均EPA滴度[“EPA%DCW”]提高了大约15%。

转化体菌株Y9502U+YAP1中的脂质含量和组成

使解脂耶氏酵母菌株Y9502（对照）和菌株Y9502U+Yap1（三个分离株）一式两份地在差不多的含油条件下生长，参见上文。表8以与表7中所使用的相似的格式总结了DCW、TFA%DCW、以%TFA计的每种脂肪酸的浓度、和EPA%DCW。

表8：解脂耶氏酵母菌株Y9502和Y9502U+Yap1中的脂质含量和组成

与Y9502的相比，YlYAP1（SEQ ID NO:4）（对应于基因座YALI0F03388p）在Y9502U中的过表达使脂质含量[“TFA%DCW”]提高了大约16%并且使平均EPA滴度[“EPA%DCW”]提高了大约15%。

因此，看起来YlYAP1在生产PUFA的解脂耶氏酵母菌株中的过表达提供了对氧化胁迫的提高的抗性。上述对氧化胁迫的提高的抗性的一个有益后果是对脂质过氧化作用的提高的防御，其从而导致了提高的脂质和PUFA含量。

实例5

与啤酒糖酵母GPX3具有同源性的解脂耶氏酵母基因的鉴定

通过用ScGpx3作为查询序列，对“Yeast project Genolevures”（Center for Bioinformatics，LaBRI，Talence Cedex，France）（亦参见Dujon，B.等人，Nature,430（6995）：35-44（2004））的公开的解脂耶氏酵母蛋白质数据库进行BLAST检索，在解脂耶氏酵母中鉴定了啤酒糖酵母Gpx3（

登录号NM_001179559；SEQ ID NO:26）[“ScGpx3”]的直系同源物。

在全部的解脂耶氏酵母蛋白质中，与ScGpx3具有最高的同源性（具有4e-68的期望值）的蛋白质序列YALI0E02310p（GenBank登录号XP_503454；SEQ ID NO:28）被命名为“YlGpx3”。YALI0E02310p在其中被注释为“与作为氢过氧化物受体起作用来感测细胞内氢过氧化物水平和将氧化还原信号转导至Yap1p转录因子的uniprot|P40581啤酒糖酵母YIR037w HYR1（YKL026C的直系同源物）硫醇过氧化物酶高度相似”。

ScGpx3和推定的YlGpx3的比对显示在图6中。立式框突出显示了对于分子间和分子内相互作用重要的ScGpx3的Cys36和Cys82（Delaunay，A.等人，Cell，111：471-481（2002））。这些残基在YlGpx3中是保守的。

按照实例1中所列的方法，使用编码YALI0E02310p的蛋白质序列（SEQ ID NO:28），进行了NCBI BLASTP2.2.26+检索，以鉴定BLAST“nr”数据库内的具有相似性的序列。

非常多的蛋白质经鉴定与YALI0E02310p（SEQ ID NO:28）具有显著的相似性。表9提供了具有大于或等于“8e-72”的期望值和具体地鉴定了该蛋白质的注释的那些命中的部分总结（即，对假设蛋白和来自啤酒糖酵母的蛋白的命中被排除在外），尽管这不应被认为是限制了本公开。表9中的蛋白质与SEQ ID NO:28具有介于93至95%之间的查询覆盖度。

表9：与YlGpx3（SEQ ID NO:28）具有相似性的基因

基于BLASTP检索，YALI0E02310p（SEQ ID NO:28）以73%的同一性和86%的相似度以及1e-85的期望值，与来自棉阿舒囊霉（Ashbyagossypii）的假定蛋白（

登录号NP_985509）具有最佳的相似度。在已知功能的蛋白质中，最佳的命中是来自巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）的硫醇过氧化物酶（

登录号XP_002491803，被重命名为巴斯德驹形氏酵母（Komagataella pastoris）），具有71%的同一性和89%的相似度以及8e-85的期望值，之后是具有72%的同一性和86%的相似度以及7e-84的期望值的ScGPX3。

基于上述分析，SEQ ID NO:27被假定为编码解脂耶氏酵母的Gpx3硫醇过氧化物酶（“YlGpx3”），其中其蛋白质序列如SEQ ID NO:28所示。

实例6

解脂耶氏酵母GPX3在解脂耶氏酵母菌株Y4184中的表达

本实例描述了过表达构建体pYRH65（图5B；SEQ ID NO:29）的合成及其向解脂耶氏酵母菌株Y4184U（实例7）内的转化。测定并比较了YlGPX3过表达对脂质积聚水平的影响。具体地，YlGPX3的过表达导致了与其天然的Gpx3水平未被操纵的细胞相比提高的总脂质（测量为以占总的干细胞重量的百分比计的总脂肪酸[“TFA%DCW”]）。

解脂耶氏酵母过表达质粒pYRH65的构建

使用引物GPX3-F（SEQ ID NO:30）和GPX3-R（SEQ ID NO:31），从解脂耶氏酵母ATCC20362的基因组DNA扩增了编码YALI0E02310g的510bp片段。反应混合物包含1μl基因组DNA、每种引物各1μl（来自20μM的储液）、2μl水、和45μl来自Invitrogen的AccuPrime PfxSuperMix。扩增如下进行：首先于95℃变性5分钟，然后是35个循环的：95℃变性60秒，55℃退火60秒，68℃延伸60秒。最后在72℃进行7分钟的延伸循环，随后在4℃终止反应。从PCR反应获得了0.51kb的DNA片段。

用NcoI/NotI切割了所扩增的基因并用于构建pYRH65（图5B；SEQID NO:29），其包含下列组分：

表10：质粒pYRH65的描述

转化体菌株Y4184U+Gpx3中的脂质含量和组成

用BsiWI/PacI切割了质粒pYRH65，分离了3.3kB片段并用于转化解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y4184U，从而产生了菌株Y4184U+Gpx3。

使解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y4184U（Ura+）（对照）和菌株Y4184U+Gpx3在差不多的含油条件下生长（如实例4中所述）。表11以与表7中所使用的相似的格式总结了DCW、TFA%DCW、以%TFA计的每种脂肪酸的浓度、和EPA%DCW。

表11：解脂耶氏酵母菌株Y4184U（Ura+）和Y4184U+Gpx3中的脂 质含量和组成

与Y4184U（Ura+）菌株的相比，YlGPX3（SEQ ID NO: 27）（对应于基因座YALI0E02310g）在Y4184U中的过表达使脂质含量[“TFA%DCW”]提高了大约47%并且使平均EPA滴度[“EPA%DCW”]提高了大约40%。

因此，看起来YlGpx3在生产PUFA的解脂耶氏酵母菌株中的过表达提供了对氧化胁迫的提高的抗性。上述对氧化胁迫的提高的抗性的一个有益后果是对脂质过氧化作用的提高的防御，其从而导致了提高的脂质和PUFA含量。

实例7

用于高水平EPA生产的解脂耶氏酵母菌株Y4184和Y4184U的构建

解脂耶氏酵母菌株Y4184U在实例4和6中被用作宿主。菌株Y4184U来源于解脂耶氏酵母ATCC20362，并且能够通过表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径产生相对于总脂质高水平的EPA。该菌株具有Ura-表现，并且其构建描述于PCT公布WO2008/073367的实例7中，该文献以引用方式并入本文。

菌株Y4184U的开发需要构建菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U、Y4069、Y4084、Y4084U1、Y4127（在2007年11月29日保藏于美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection），保藏号ATCC PTA-8802）、Y4127U2、Y4158、Y4158U1和Y4184。

相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC20362的菌株Y4184（生产占总脂质30.7%的EPA）的最终基因型是未知1-、未知2-、未知4-、未知5-、未知6-、未知7-、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20（2个拷贝）、GPAT::EgD9e::Lip2、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBA::EgD9eS::Pex20、YAT1::EgD9eS::Lip2、GPD::EgD9eS::Lip2、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1（2个拷贝）、GPM/FBAIN::FmD12S::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::FmD12::Oct、GPD::FmD12::Pex20、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、YAT1::Rd5S::Oct、FBAIN::EgD5::Aco、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::YlCPT1::Aco、GPD::YlCPT1::Aco。

上文的缩写如下：ME3S是经密码子优化的C_16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉（Mortierella alpina）[美国专利7,470,532]；EgD9e是小眼虫（Euglena gracilis）Δ9延伸酶基因[美国专利7,645,604]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫（Euglena gracilis）[美国专利7,645,604]；EgD8M是合成的突变型Δ8去饱和酶[美国专利7,709,239]，来源于小眼虫（Euglena gracilis）[美国专利7,256,033]；FmD12是串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）Δ12去饱和酶基因[美国专利7,504,259]；FmD12S是经密码子优化的Δ12去饱和酶基因，来源于串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）[美国专利7,504,259]；EgD5是小眼虫（Euglenagracilis）Δ5去饱和酶[美国专利7,678,560]；EgD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶基因，来源于小眼虫（Euglena gracilis）[美国专利7,678,560]；RD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶，来源于多甲藻属（Peridinium sp.）CCMP626[美国专利7,695,950]；PaD17是瓜果腐霉菌（Pythiumaphanidermatum）Δ17去饱和酶[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的Δ17去饱和酶，来源于瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）[美国专利7,556,949]；以及，YlCPT1是解脂耶氏酵母二酰基甘油磷酸胆碱转移酶基因[美国专利7,932,077]。

最后，为了破坏菌株Y4184中的Ura3基因，构建体pZKUE3S（PCT公布WO2008/073367，其中的SEQ ID NO:78）被用于将EXP1::ME3S::Pex20嵌合基因整合进菌株Y4184的Ura3基因，以分别产生菌株Y4184U1（占总脂质11.2%的EPA）、Y4184U2（占总脂质10.6%的EPA）和Y4184U4（占总脂质15.5%的EPA）（统称为Y4184U）。

值得注意的是，PCT公布WO2008/073367描述了由于不同的生长条件，Y4184（30.7%）对Y4184U（平均12.4%）中定量的EPA%TFA的差异。

实例8

用于高水平EPA生产的解脂耶氏酵母菌株Y9502和Y9502U的构建

解脂耶氏酵母菌株Y9502U在实例4中被用作宿主。菌株Y9502U来源于解脂耶氏酵母ATCC20362，并且能够通过表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径产生相对于总脂质高水平的EPA。该菌株具有Ura-表型。

解脂耶氏酵母菌株Y9502的基因型

菌株Y9502的生成描述于美国专利申请公布2010-0317072-A1。菌株Y9502来源于解脂耶氏酵母ATCC20362，能够通过表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径产生相对于总脂质约57.0%的EPA。

菌株Y9502相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC20362的最终基因型为Ura+、Pex3-、未知1-、未知2-、未知3-、未知4-、未知5-、未知6-、未知7-、未知8-、未知9-、未知10-、YAT1::ME3S::Pex16、GPD::ME3S::Pex20、YAT1::ME3S::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、GPAT::EgD9e::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD8M::Lip1、GPD::EaD8S::Pex16（2个拷贝）、YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1、YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco、FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、GPDIN::FmD12::Pex16、EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、GPDIN::EgD5SM::Aco、GPM::EgD5SM::Oct、EXP1::EgD5SM::Lip1、YAT1::EaD5SM::Oct、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::YlCPT1::Aco、YAT1::MCS::Lip1、FBA::MCS::Lip1、YAT1::MaLPAAT1S::Pex16。

上文所用到并且未列在实例7中的缩写如下：EaD8S是经密码子优化的Δ8去饱和酶基因，来源于Euglena anabaena[美国专利7,790,156]；E389D9eS/EgD8M是通过连接来源于小型绿藻属（Eutreptiella sp.）CCMP389（美国专利7,645,604）的经密码子优化的Δ9延伸酶基因（“E389D9eS”）与Δ8去饱和酶“EgD8M”（参见上文）[美国专利申请公布2008-0254191-A1]；EgD9eS/EgD8M是通过连接Δ9延伸酶“EgD9eS”（参见上文）与Δ8去饱和酶“EgD8M”（参见上文）[美国专利申请公布2008-0254191-A1]；EaD9eS/EgD8M是通过连接来源于Euglenaanabaena的经密码子优化的Δ9延伸酶基因（“EaD9eS”）[美国专利7,794,701]与Δ8去饱和酶“EgD8M”（参见上文）[美国专利申请公布2008-0254191-A1]；EgD5M和EgD5SM是包含突变型HPG（SEQ ID NO:41）基序[美国专利申请公布2010-0075386-A1]的合成突变Δ5去饱和酶基因，来源于小眼虫（Euglena gracilis）[美国专利7,678,560]；EaD5SM是包含突变型HaGG（SEQ ID NO: 42）基序[美国专利申请公布2010-0075386-A1]的合成的突变型Δ5去饱和酶基因，来源于Euglena anabaena [美国专利7,943,365]；MCS是经密码子优化的丙二酰-CoA合成酶基因，来源于豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum bv. viciae）3841[美国专利申请公布2010-0159558-A1]，以及MaLPAAT1S是经密码子优化的溶血磷脂酸酰基转移酶基因，来源于高山被孢霉（Mortierella alpina）[美国专利7,879,591]。

为对菌株Y9502中的总脂质含量和组分进行详细分析进行了烧瓶检测分析，其中细胞在总计7天中进行两阶段生长。基于分析，菌株Y9502产生了3.8g/L DCW、37.1 TFA % DCW、21.3 EPA % DCW，并且其脂质特征如下，其中每种脂肪酸的浓度以占TFA的重量百分比计[“% TFA”]：16:0（棕榈酸）—2.5，16:1（棕榈油酸）--0.5，18:0（硬脂酸）--2.9，18:1（油酸）--5.0，18:2（LA）—12.7，AlA—0.9，EDA—3.5，DGLA—3.3，ARA--0.8，ETrA--0.7，ETA—2.4，EPA—57.0，其它—7.5。

解脂耶氏酵母菌株Y9502U的基因型

为了破坏菌株Y9502中的Ura3基因，SalI/PacI-消化的构建体pZKUM（参见美国专利申请公布2009-0093543-A1，其中的表15、SEQ ID NO:133和图8A）被用于按照“一般方法”将Ura3突变型基因整合进入菌株9502的Ura3基因。使总计27个转化体（选自包括8个转化体的第一组、包括8个转化体的第二组和包括11个转化体的第三组）生长于基本培养基+5-氟乳清酸[“MM+5-FOA”]选择平板上并在30℃维持2至5天。MM+5-FOA包含（每升）：20g葡萄糖、6.7g酵母氮源、75mg尿嘧啶、75mg尿苷和适量（基于对从100mg/L至1000mg/L的浓度范围的FOA活性试验（因为供应商提供的每批料中会发生改变））的FOA（Zymo ResearchCorp.，Orange，CA）。

进一步的实验确定了仅第三组转化体拥有真正的Ura-表型。

将所述Ura-细胞从该MM+5-FOA平板刮下并且根据常规方法进行脂肪酸分析。以这种方式，GC分析显示，在第三组的MM+5-FOA平板上生长的pZKUM-转化体1、3、6、7、8、10和11中分别有占TFA28.5%、28.5%、27.4%、28.6%、29.2%、30.3%和29.6%的EPA。这七个菌株分别被命名为菌株Y9502U12、Y9502U14、Y9502U17、Y9502U18、Y9502U19、Y9502U21和Y9502U22（统称为Y9502U）。

实例9

与啤酒糖酵母Tsa1基因具有同源性的解脂耶氏酵母基因的鉴定

通过用ScTsa1作为查询序列，对“Yeast project Genolevures”（Center for Bioinformatics，LaBRI，Talence Cedex，France）（亦参见Dujon，B.等人，Nature,430（6995）：35-44（2004））的公开的解脂耶氏酵母蛋白质数据库进行BLAST检索，在解脂耶氏酵母中鉴定了啤酒糖酵母Tsa1（

登录号NP_013684；SEQ ID NO:34）[“ScTsa1”]的直系同源物。

在全部的解脂耶氏酵母蛋白质中，与ScTsa1具有最高的同源性（具有1e-82的期望值）的蛋白质序列，YALI0B15125g（GenBank登录号；XP_500915.1SEQ ID NO:36），被命名为“YlTsa1”。YALI0B15125g在其中被注释为“与uniprot|P34760啤酒糖酵母YML028w TSA1（YDR453C的直系同源物）硫氧还蛋白过氧化物酶高度相似，作为核糖体相关联的和胞质游离的抗氧化剂起作用”。

ScTsa1和推定的YlTsa1的比对显示在图7中。在ScTsa1和YlTsa1中都只有两个半胱氨酸残基。立式框突出显示了对于分子间和分子内相互作用重要的ScTsa1的Cys48和Cys171（Tachibana，T.等人，J.Biol.Chem.，284：4464-4472（2009））。前一个半胱氨酸残基在YlTsa1中是保守的，而后一个在YlTsa1中与ScTsa1相比向上游移动了两个氨基酸。

按照实例1中所列的方法，使用编码YALI0B15125g的蛋白质序列（SEQ ID NO:36），进行了NCBI BLASTP2.2.26+检索，以鉴定BLAST“nr”数据库内的具有相似性的序列。

非常多的蛋白质经鉴定与YALI0B15125g（SEQ ID NO:36）具有显著的相似性。表12提供了具有大于或等于“2e-102”的期望值和具体地鉴定了该蛋白质的注释的那些命中的部分总结（即，对假设蛋白的命中被排除在外），尽管这不应被认为是限制了本公开。表12中的蛋白质与SEQ IDNO:36具有介于95至100%之间的查询覆盖度。

表12：与YlTsa1（SEQ ID NO:36）具有相似性的基因

基于BLASTP检索，YALI0B15125g（SEQ ID NO:36）与来自葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）ATCC42720的Tsa1过氧化物酶（

登录号XP_002616355.1）具有最高的相似度，具有81%的同一性和92%的相似度以及4e-117的期望值，之后是来自季也蒙酵母（Meyerozyma guilliermondii）ATCC6260的TSA1过氧化物酶，具有80%的同一性和91%的相似度以及3e-115的期望值。

基于上述分析，SEQ ID NO:35被假定为编码解脂耶氏酵母的TSA1过氧化物酶（“YlTsa1”），其中其蛋白质序列如SEQ ID NO:36所示。

本文假定YlTsa1在生产PUFA的解脂耶氏酵母菌株中的过表达将提供对氧化胁迫的提高的抗性。上述对氧化胁迫的提高的抗性的一个有益后果将是对脂质过氧化作用的提高的防御，其将从而导致提高的脂质和PUFA含量。

实例10

与啤酒糖酵母Ybp1基因具有同源性的解脂耶氏酵母基因的鉴定

通过用ScYbp1作为查询序列，对“Yeast project Genolevures”（Center for Bioinformatics，LaBRI，Talence Cedex，France）（亦参见Dujon，B.等人，Nature,430（6995）：35-44（2004））的公开的解脂耶氏酵母蛋白质数据库进行BLAST检索，在解脂耶氏酵母中鉴定了啤酒糖酵母Ybp1（登录号NP_009775.1；SEQ ID NO:38）[“ScYbp1”]的直系同源物。

在全部的解脂耶氏酵母蛋白质中，与ScYbp1具有最高的同源性（具有5e-22的期望值）的蛋白质序列，YALI0B03762g（GenBank登录号XP_500469.1；SEQ ID NO:40），被命名为“YlYbp1”。YALI0B03762g在其中被注释为“与介导有丝分裂进行的uniprot|P53169啤酒糖酵母YGL060w YBP2（YBR216C的直系同源物）中心动粒相关联蛋白质较弱地相似”。

ScYbp1和推定的YlYbp1的比对显示在图8中，不过在所述蛋白质之间只有很少的保守序列被标记。

按照实例1中所列的方法，使用编码YALI0B03762g的蛋白质序列（SEQ ID NO:40），进行了NCBI BLASTP2.2.26+检索，以鉴定BLAST“nr”数据库内的具有相似性的序列。

几种蛋白质被鉴定为与YALI0B03762g（SEQ ID NO:40）具有相似性。表13提供了具有大于或等于“2e-37”的期望值和具体地鉴定了该蛋白质的注释的那些命中的部分总结（即，对假设蛋白和来自啤酒糖酵母的蛋白的命中被排除在外），尽管这不应被认为是限制了本公开。表13中的蛋白质与SEQ ID NO:40具有介于74至93%之间的查询覆盖度。

表13：与YlYbp1（SEQ ID NO:40）具有相似性的基因

基于BLASTP检索，YALI0B03762g（SEQ ID NO:40）以28%的同一性和48%的相似度以及1e-54的期望值，与来自葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）ATCC42720的假定蛋白CLUG_00080（

登录号XP_002618921.1）具有最佳的相似度。

在已知功能的蛋白质之中，最佳的命中是来自木糖发酵酵母（Scheffersomyces stipitis）CBS6054的YAP1结合蛋白2（

登录号XP_001386941.2），具有30%的同一性和49%的相似度以及6e-53的期望值，之后是来自纤细假丝酵母（Candida tenuis）ATCC10573的YAP1结合蛋白2（

登录号EGV63342.1），具有28%的同一性和47%的相似度，以及3e-48的期望值。

基于上述分析，SEQ ID NO:39被假定为编码解脂耶氏酵母的YAP1结合蛋白（“YlYbp1”），其中其蛋白质序列如SEQ ID NO:40所示。

将SEQ ID NO:40所示的蛋白质序列与表14中所列的下列蛋白质进行比对，采用CLUSTAL W（1.81）多重序列比对（图9；Thompson J.D.等人，Nucleic Acids Res.22：4673-4680（1994））来进一步评估YlYbp1。假定这些蛋白中的每一种编码Ybp1的同源物。

表14：与YlYbp1（SEQ ID NO:40）比对的蛋白质

根据对比对的目测，在所述蛋白质之间观察到相对少的保守序列区域。然而，根据使用美国国立生物技术信息中心（National Center forBiotechnology Information[“NCBI”]）的“鉴定保守结构域（IdentifyConserved Domains）”工具来观察在所述蛋白质序列内使用CD-检索检测到的保守结构域的分析（Marchler-Bauer，A.和S.H.Bryant，Nucleic AcidsRes.，32（W）327-331（2004）；Marchler-Bauer，A.等人，Nucleic AcidsRes.，37（D）205-210（2009）；和Marchler-Bauer，A.等人，NucleicAcids Res.，39（D）225-229（2011）），这七种蛋白质中的每一种包括在kinetochor_Ybp2超家族（Pfam08568；被描述为固有地涉及中心动粒的蛋白质家族）之内。因此，这种区别性特征作为鉴定来自其它物种的其它Ybp1蛋白质的方法可以是有用的。

本文假定YlYbp1在生产PUFA的解脂耶氏酵母菌株中的过表达将提供对氧化胁迫的提高的抗性。上述对氧化胁迫的提高的抗性的一个有益后果将是对脂质过氧化作用的提高的防御，其将从而导致提高的脂质和PUFA含量。

Claims (12)

1.具有提高的油含量的转基因含油酵母，包含提高的Yap1转录因子活性，其中所述提高的油含量是与非转基因含油酵母的油含量相比的。

2.根据权利要求1所述的转基因含油酵母，其中所述提高的Yap1转录因子活性是由过表达Yap1转录因子、通过提高所述转录因子和能够激活所述转录因子的蛋白质之间的相互作用、或通过它们的组合引起的。

3.根据权利要求2所述的转基因含油酵母，其中所述能够激活所述转录因子的蛋白质选自：Gpx3、Ybp1和Tsa1。

4.根据权利要求2所述的转基因含油酵母，其中所述Yap1转录因子包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有转录因子活性并且包含：

a)bZIP亮氨酸拉链基序；

b)N-末端富含半胱氨酸的结构域，其包含至少两个由至少6个氨基酸隔开的半胱氨酸残基的序列；和

c)C-末端富含半胱氨酸的结构域，其包含至少两个由至少8个氨基酸隔开的半胱氨酸残基的序列。

5.根据权利要求4所述的转基因含油酵母，其中所述Yap1转录因子的序列选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。

6.根据权利要求3所述的转基因含油酵母，其中所述Gpx3蛋白质包含：

a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于BLASTP比对方法，所述多肽在与选自SEQ ID NO:26[ScGpx3]或SEQ ID NO:28[YlGpx3]的序列进行比较时具有至少70%的氨基酸同一性；

b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于BLASTN比对方法，所述核苷酸序列在与选自SEQ ID NO:25[ScGpx3]或SEQ ID NO:27[YlGpx3]的序列进行比较时具有至少70%的序列同一性；或

c)（a）或（b）的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100%互补的。

7.根据权利要求3所述的转基因含油酵母，其中所述Tsa1蛋白质包含：

a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于BLASTP比对方法，所述多肽在与选自SEQ ID NO:34[ScTsa1]或SEQ ID NO:36[YlTsa1]的序列进行比较时具有至少70%的氨基酸同一性；

b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于BLASTN比对方法，所述核苷酸序列在与选自SEQ ID NO:33[ScTsa1]或SEQ ID NO:35[YlTsa1]的序列进行比较时具有至少70%的序列同一性；或

c)（a）或（b）的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100%互补的。

8.根据权利要求3所述的转基因含油酵母，其中所述Ybp1蛋白质包含：

a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中所述多肽选自SEQ ID NO:38[ScYbp1]或SEQ ID NO:40[YlYbp1]；或

b)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽能够与所述Yap1转录因子相互作用以提高Yap1转录因子活性，其中基于保守结构域分析方法，将所述多肽序列分类在kinetochor_Ybp2超家族内；或

c)（a）或（b）的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100%互补的。

9.根据权利要求1所述的转基因含油酵母，其中所述转基因含油酵母来自选自下列的属：耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、丝孢酵母属（Trichosporon）和油脂酵母属（Lipomyces）。

10.根据权利要求8所述的转基因含油酵母，其中所述转基因含油酵母是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）。

11.根据权利要求1所述的转基因含油酵母，其中所述转基因含油酵母产生至少一种多不饱和脂肪酸。

12.提高含油酵母中油含量的方法，包括：

a)工程化所述含油酵母以过表达选自下列的蛋白质：

(i)Yap1转录因子；

(ii)能够激活所述转录因子的蛋白质；

(iii)（a）和（b）的组合；以及

b)使所述含油酵母在适宜的条件下生长以产生与非转基因含油酵母的油含量相比提高的油含量。

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