CN102216464B - 操纵snf1蛋白激酶活性用于改变含油生物中的油含量 - Google Patents

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Abstract

公开了通过降低异源三聚SNF1蛋白激酶活性提高真核细胞中总脂质含量、多不饱和脂肪酸总含量[“PUFA”]、和/或去饱和脂肪酸对饱和脂肪酸的比率的方法。优选地，编码SNF1蛋白激酶的Snf1χ-亚基、Gal83β-亚基或Snf4 γ-亚基的染色体基因、编码Sak1、Hxk2、Glk1或Reg1的上游调节基因、或编码Rme1、Cbr1或Snf3的下游基因在含油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的PUFA生产菌株中被操纵，导致其总脂质含量高于包含异源三聚SNF1蛋白激酶活性不降低的亲本菌株。

Description

操纵SNF1蛋白激酶活性用于改变含油生物中的油含量
本申请要求提交于2008年8月29日提交的美国临时申请61/093007的优先权，该临时申请的公开内容全文引入本文以供参考。
发明领域
本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及基于降低异源三聚SNF1蛋白激酶的活性用于操纵含油生物脂质级分中的油含量的方法，所述蛋白激酶是基因表达的全局调节子。
背景技术
全局调节系统调节遍布于基因组中的多个基因的表达，使得生物体的总体生理、代谢和发育状态对环境变化发生迅速的并且有时显著的响应。术语“全局调节子”描述了相对小量的基因，它们的产物对细胞状态具有广泛的影响。这些调节子的一个功能是编码结合基因的启动子元件(例如增强子或沉默子)的产物，所述基因的表达受这些调节子的影响；其他调节子通过活化或灭活级联的细胞反应发挥功能。目前仅仅开始认识到使用这些调节子在微生物菌株中产生强力调节系统的潜力。
已经有大量文献证明了与多不饱和脂肪酸[“PUFA”]相关的健康有益效果。因此，已有相当多的研究与大规模生产PUFA有关，所述生产方法通过：1)培养微生物如异养生物硅藻小环藻属和菱形藻属；假单胞菌属、交替单胞菌属或希瓦氏菌属菌种；草腐霉枯萎属丝状真菌；或长被孢霉属(Mortierella elongata)、短小被孢霉属(M.exigua)或M.hygrophila，上述微生物天然生产特定脂肪酸；以及2)发现允许合成脂肪酸的脂肪酸去饱和酶和延伸酶基因，并且随后经由基因工程方法将这些基因导入不天然生产ω-3/ω-6 PUFA的生物中。然而该工作的商业开发已经受到限制，这是因为优选ω-3/ω-6 PUFA的生产受限和/或基本上不能改善油产量/控制生产的油组合物的特性。
共有的美国专利7,238,482描述了使用含油酵母解脂耶氏酵母作为生产宿主用于生产PUFA的用途。含油酵母被定义为是那些天然能够合成并积聚油的酵母，其中细胞干重一般大于25％。本领域已经描述了生产宿主的优化(参见例如国际申请公布WO 2006/033723、美国专利申请公布2006-0094092、美国专利申请公布2006-0115881、美国专利申请公布2006-0110806和美国专利申请公布2009-0093543-A1)。本文所述的重组菌株包含多种嵌合基因，所述基因表达多拷贝的异源去饱和酶和延伸酶，并且任选地包含多个天然去饱和酶、酰基转移酶和过氧化物酶体生源蛋白敲除以能够合成并积聚PUFA。
商业生产PUFA需要对宿主细胞进行进一步优化。本发明人致力于鉴定含油生物中的全局调节子，其将解耦脂质的生物合成过程和生长的含油阶段。此类调控元件将是非常受期待的，因为它将具有广泛的特异性以活化和/或抑制次级代谢产物基因，同时使得菌株能够正常地或接近正常地发育和生长。
已发现，降低异源三聚SNF1蛋白激酶的活性导致解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中的脂质积聚增加。尽管以前有多项研究与异源三聚SNF1蛋白激酶网络有关，但关于SNF1蛋白激酶的细胞功能及其调控的许多细节仍未被充分了解，需要进行阐释。以前关于SNF1敲除的研究也还未在含油生物中进行。虽然AMPK/SNF1激酶家族在真核生物中普遍是高度保守的并且是维持细胞能量平衡所必需的，但其特定调节模式可在不同生物中存在差异。
这似乎是首次发现一种广义机制：其中异源三聚SNF1蛋白激酶活性的降低导致令人惊异地发现脂质生物合成增加，产生组成型含油生物。
发明概述
在第一实施方案中，本发明涉及转基因含油真核宿主细胞，所述细胞包含：
(a)异源三聚SNF1蛋白激酶，所述酶在与非转基因含油真核宿主细胞的异源三聚SNF1蛋白激酶的活性进行比较时活性降低；以及
(b)在与非转基因含油真核宿主细胞的总脂质含量进行比较时提高的总脂质含量，所述宿主细胞包含活性不降低的异源三聚SNF1蛋白激酶。
在第二实施方案中，本发明涉及如本文所述的转基因含油真核宿主细胞，其中所述异源三聚SNF1蛋白激酶的活性降低和总脂质含量的提高是由于选自下列的修饰：
(a)改变与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白；
(b)改变编码异源三聚SNF1蛋白激酶亚基的多核苷酸；以及
(c)改变由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白。
在第三实施方案中，本发明涉及本发明的转基因含油真核宿主细胞，其中所述异源三聚SNF1蛋白激酶的活性降低和总脂质含量的提高是由于选自下列的修饰：
(a)与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白的减量调节，所述上游调节蛋白是选自Sak1和Tos3的激酶；
(b)与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白的增量调节，所述上游调节蛋白是由己糖激酶同工酶2(Hxk2)组成的己糖激酶；
(c)与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白的增量调节，所述上游调节蛋白是葡糖激酶(Glk1)；
(d)与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白的增量调节，所述上游调节蛋白是Reg1-Glc7蛋白-磷酸酶1复合物的蛋白，选自Reg1和Glc7；
(e)编码异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1α-亚基的多核苷酸的减量调节；
(f)编码异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1α-亚基的多核苷酸调节域的增量调节；
(g)无催化活性的Snf1α-亚基的增量调节；
(h)编码异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1β-亚基的多核苷酸的减量调节，所述β-亚基由Gal83组成；
(i)编码异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1γ-亚基的多核苷酸的减量调节；
(j)由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白的增量调节，所述下游蛋白是选自Rme1和Mhy1的锌指蛋白；
(k)由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白的增量调节，所述下游蛋白是微粒体细胞色素b5还原酶(Cbr1)；
(l)由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白的增量调节，所述下游蛋白是葡萄糖转运蛋白(Snf3)；
(m)由异源三聚SNF1蛋白激酶通过磷酸化调节的下游蛋白的突变的变体的增量调节，所述下游蛋白是选自乙酰-CoA羧化酶和二酰基甘油酰基转移酶的蛋白，并且其中所述突变的变体不能被异源三聚SNF1蛋白激酶磷酸化。
在第四实施方案中，本发明涉及如本文所述的含油真核宿主细胞，其中编码SNF1蛋白激酶α-亚基的多核苷酸包含分离的Snf1核苷酸分子，所述核苷酸分子包含：
a)编码具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTP比对方法在与选自下列的氨基酸序列进行比较时，该多肽具有至少80％的氨基酸同一性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27；
b)编码具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法在与选自下列的核苷酸序列进行比较时，该核苷酸序列具有至少80％的序列同一性：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26；
c)编码具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条件下与选自下列的核苷酸序列杂交：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26；或者，
d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。
在第五实施方案中，本发明包括如本文所述的转基因含油真核宿主细胞，其中所述含油真核宿主细胞选自藻类、真菌、卵菌、类眼虫、原生藻菌(stramenopiles)和酵母。具体地讲，所述酵母选自耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。优选的酵母是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
获取自本发明的转基因含油真核宿主细胞的油或脂质也在本发明的范围内。
在第六实施方案中，本发明涉及提高包含异源三聚SNF1蛋白激酶的含油真核宿主细胞的总脂质含量的方法，所述方法包括：
(a)转化含油真核宿主细胞，其中异源三聚SNF1蛋白激酶活性在与非转化含油真核宿主细胞中的异源三聚SNF1蛋白激酶的活性水平进行比较时降低；
(b)在合适条件下使步骤(a)的转化细胞生长，其中总脂质含量在与获取自具有活性不降低的异源三聚SNF1蛋白激酶的非转化含油真核宿主细胞的总脂质含量进行比较时提高；并且
(c)任选地，从步骤(b)的细胞中回收油或脂质。
在第七实施方案中，本发明涉及一种方法，其中具有异源三聚SNF1蛋白激酶的含油真核宿主细胞通过选自下列的修饰进行转化：
(a)改变与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白；
(b)改变编码异源三聚SNF1蛋白激酶亚基的多核苷酸；以及
(c)改变由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白。
在第八实施方案中，本发明涉及一种方法，其中改变选自：
(a)与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白的减量调节，所述上游调节蛋白是选自Sak1和Tos3的激酶；
(b)与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白的增量调节，所述上游调节蛋白是由己糖激酶同工酶2(Hxk2)组成的己糖激酶；
(c)与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白的增量调节，所述上游调节蛋白是葡糖激酶(Glk1)；
(d)与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白的增量调节，所述上游调节蛋白是Reg1-Glc7蛋白-磷酸酶1复合物的蛋白，选自Reg1和Glc7；
(e)编码异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1α-亚基的多核苷酸的减量调节；
(f)编码异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1α-亚基的多核苷酸调节域的增量调节；
(g)无催化活性的Snf1α-亚基的增量调节；
(h)编码异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1β-亚基的多核苷酸的减量调节，所述β-亚基由Gal83组成；
(i)编码异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1γ-亚基的多核苷酸的减量调节；
(j)由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白的增量调节，所述下游蛋白是选自Rme1和Mhy1的锌指蛋白；
(k)由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白的增量调节，所述下游蛋白是微粒体细胞色素b5还原酶(Cbr1)；
(l)由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白的增量调节，所述下游蛋白是葡萄糖转运蛋白(Snf3)；
(m)由异源三聚SNF1蛋白激酶通过磷酸化调节的下游蛋白的突变的变体的增量调节，所述下游蛋白是选自乙酰-CoA羧化酶和二酰基甘油酰基转移酶的蛋白，并且其中所述突变的变体不能被异源三聚SNF1蛋白激酶磷酸化。
在第九实施方案中，本发明涉及一种方法，其中编码SNF1蛋白激酶的Snf1α-亚基的多核苷酸包含分离的核苷酸分子，所述核苷酸分子包含：
a)编码具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTP比对方法在与选自下列的氨基酸序列进行比较时，该多肽具有至少80％的氨基酸同一性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27；
b)编码具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法在与选自下列的核苷酸序列进行比较时，该核苷酸序列具有至少80％的序列同一性：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26；
c)编码具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条件下与选自下列的核苷酸序列杂交：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26；或者，
d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。
含油真核宿主细胞可选自藻类、真菌、卵菌、类眼虫、原生藻菌和酵母。所述酵母优选地选自耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。最优选地，所述酵母是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
在第十实施方案中，本发明涉及提高获取自含油真核宿主细胞的微生物油中的多不饱和脂肪酸总含量的方法，所述含油真核宿主细胞包含异源三聚SNF1蛋白激酶，所述方法包括：
(a)用编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的分离多核苷酸转化含油真核宿主细胞，其中异源三聚SNF1蛋白激酶的活性在与非转化含油真核宿主细胞中的异源三聚SNF1蛋白激酶的活性水平进行比较时也降低；
(b)在合适条件下使步骤(a)的转化细胞生长，其中总脂质含量在与获取自无降低活性的异源三聚SNF1蛋白激酶的非转化含油真核宿主细胞的总脂质含量进行比较时提高；并且
(c)任选地，从步骤(b)的细胞中回收油或脂质。
在第十一实施方案中，本发明涉及如本文所述的方法，其中编码功能性多不饱和脂肪酸的基因选自Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ4去饱和酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶、C20/22延伸酶和Δ9延伸酶，并且异源三聚SNF1蛋白激酶的活性降低是由于选自下列的修饰：
(a)改变与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白；
(b)改变编码异源三聚SNF1蛋白激酶亚基的多核苷酸；以及
(c)改变由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白。
此外，多不饱和脂肪酸可为ω-3脂肪酸或ω-6脂肪酸。
生物保藏
下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209)，并具有下列名称、保藏号和保藏日期。
上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题发明的许可。
附图简述和序列表
图1是异源三聚SNF1蛋白激酶的非活性形式和活性形式的示意图，以及影响该激酶的上游调节蛋白。
图2A和图2B示出了ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑下文对该途径的描述时应被视为一起。
图3图示了解脂耶氏酵母菌株Y4184的发育，该菌株在总脂质级分中生产大于30.7％的EPA，以及菌株Y4184U。
图4A和图4B当被视为一起时示出解脂耶氏酵母(SEQ ID NO：27)、啤酒糖酵母(GenBank登录号M13971；SEQ ID NO：2)、乳酸克鲁维酵母(GenBank登录号X87975；SEQ ID NO：17)、白假丝酵母(GenBank登录号L78129；SEQ ID NO：21)、热带假丝酵母(GenBank登录号AB024535；SEQ ID NO：23)和光滑假丝酵母(GenBank登录号L78130；SEQ ID NO：25)的Snf1α-亚基蛋白的比对。
图5提供了以下质粒的质粒图谱：(A)pYPS161；以及(B)pYRH10。
图6提供了pYRH18的质粒图谱。
图7A图示了时间过程实验的结果，该实验比较解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362中以干细胞重量百分比表示的脂质含量(即，脂肪酸甲酯[“FAME”])对Y2224(snf1Δ)菌株RHY11中的脂质含量。同样地，图7B图示了时间过程实验的结果，该实验比较Y4184U(Ura+)对照菌株(即，菌株Cont-4)和Y4184U(snf1Δ)菌株RHY46中以干细胞重量百分比表示的脂质含量。
图8提供了以下质粒的质粒图谱：(A)pYRH44；以及(B)pZUFmEaD5S。
图9提供了pYRH47的质粒图谱。
根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。
下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirements forPatent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。
SEQ ID NO：1-191是编码基因或蛋白(或它们的片段)的ORF、引物或质粒的ORF，如表1所述。
表1：核酸和蛋白质SEQ ID Number摘要
本文引用的所有专利和非专利文献均以引用方式全文并入本文。
给出了如下定义。
“开放阅读框”缩写为“ORF”。
“聚合酶链反应”缩写为“PCR”。
“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC：”。
“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。
“三酰基甘油”缩写为“TAG”。
“总脂肪酸”缩写为“TFA”。
“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。
“干细胞重量”缩写为“DCW”。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”不旨在局限于本发明的任一具体实施方案，而是在一般情况下适用于如权利要求和说明书中所描述的本发明的任何实施方案和所有实施方案。
术语“全局调节子”指相对小量的基因，它们的产物对细胞状态具有广泛的影响。真核生物中的一个此类家族是高度保守的蛋白激酶SNF1-AMPK家族，该家族是保持能量平衡所必需的，即，通过响应哺乳动物、植物和真菌细胞AMP∶ATP比率调节分解对合成的能量过程。该家族包括三个相关的异源三聚丝氨酸/苏氨酸激酶：哺乳动物中的AMP-活化蛋白激酶(AMPK)；酵母/真菌中的SNF1蛋白激酶(最初当snf1突变在搜索啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)突变体的过程中被发现时对其命名，该突变体不能利用蔗糖[即，蔗糖不发酵](Carlson，M.等人，Genetics，98：25-40(1981))；以及植物中SNF1相关的激酶。激酶是“异源三聚”，因此需要三个蛋白亚基的复合物(即，α，β和γ)以形成功能酶。
术语“基因调节网络”一般指细胞中DNA片段的集合，它们彼此并与细胞中的其他物质相互作用，从而影响网络中的基因转录成mRNA的速率；这些网络部件通常使得调节多层化，第一层基因产物调节另一组基因的表达，诸如此类。就本文目的而言，术语“异源三聚SNF1蛋白激酶网络”指包括异源三聚SNF1蛋白激酶的基因调节网络。因此，该网络包括与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白、所有编码异源三聚SNF1蛋白激酶的亚基和由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白。
术语“丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶”指具有磷酸化丝氨酸或苏氨酸的-OH基能力的激酶(EC 2.7.11.1)。虽然丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶都磷酸化它们底物中的丝氨酸或苏氨酸，它们基于侧磷酸基受体位点的残基选择特定残基进行磷酸化，其一起包含共有序列。待磷酸化的底物的共有序列残基通常在若干个关键氨基酸上与激酶的催化裂隙接触(通常通过疏水力和离子键)。
术语“SNF1蛋白激酶”指异源三聚丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它包含：1)催化Snf1α亚基；2)β亚基(由一至三个可变蛋白编码，这取决于物种[例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有三个可变的β亚基，鉴定为Sip1、Sip2和Gal83；白假丝酵母(Candida albicans)(以及可能的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))各具有两个β亚基；以及乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)各具有单独一个β亚基]；以及，3)称为Snf4的γ亚基。异源三聚SNF1蛋白激酶响应葡萄糖限制或其他环境胁迫通过磷酸化进行活化(例如氮胁迫、钠离子胁迫、碱性pH、氧化应激反应)。每个蛋白亚基包含对应特定保守区域的保守序列不同区域，所述保守区有利于异源三聚的亚基相互作用和/或功能(参见Hedbackter，K.和M.Carlson，Frontiers in Bioscience，13：2408-2420(2008))。
术语“Snf1”指SNF1蛋白激酶的α亚基，它由SNF1基因编码。该亚基包含与Snf4和激酶结构域相互作用的N-末端激酶结构域和C-末端调控区(参见Hedbackter，K.和M.Carlson，Frontiers in Bioscience，13：2408-2420(2008))。Snf1催化亚基的活化需要磷酸化保守Asp-Phe-Gly[“DFG”]和Ala-Pro-Glu[“APE”]基序之间的苏氨酸残基，所述基序位于催化激酶结构域的N-末端活化环片段内(Estruch，F.等人，Genetics，132：639-650(1992)；McCartney，R.R.和M.C.Schmidt，J.Biol.Chem.，276(39)：36460-36466(2001))。
术语“与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白”指在异源三聚SNF1蛋白激酶网络中的功能位于SNF1蛋白激酶自身上游的多种蛋白。因此，上游调节蛋白包括例如激酶如Sak1、Tos3和Elm1、己糖激酶如己糖激酶同工酶1(Hxk1)和己糖激酶同工酶2(Hxk2)、葡糖激酶如Glk1、以及Reg1-Glc7磷酸酶复合物的蛋白如Reg1和Glc7。
术语“受异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游调节蛋白”指在异源三聚SNF1蛋白激酶网络中的功能位于SNF1蛋白激酶自身下游的多种蛋白。在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)异源三聚SNF1蛋白激酶网络中的下游蛋白包括例如锌指蛋白如Rme1和Mhy1、葡萄糖转运蛋白如Snf3、微粒体细胞色素b5还原酶如Cbr1和受异源三聚SNF1蛋白激酶磷酸化调节的其他蛋白，如乙酰-CoA羧化酶[“ACC”]和二酰基甘油酰基转移酶[“DGAT”]。
术语“生物柴油燃料”或“生物柴油”指清洁燃烧的替代燃料，产自养殖的、可再生的资源。更具体地讲，将生物柴油定义为来源于植物油或动物脂的长链脂肪酸单烷基酯(最常见的植物油主要由三酰基甘油脂质组成)，它符合ASTM D6751规范以用于柴油发动机。生物柴油指在与柴油燃料混合前的纯燃料。生物柴油共混物称为“BXX”与“XX”，表示共混物中包含的生物柴油百分比。例如B20是体积百分比为百分之20的生物柴油与体积百分比为百分之80的石油柴油的共混物。生物柴油能够经少许改变或不经过改变用于压缩-点火(柴油)发动机。生物柴油使用简单、可生物降解、无毒性、并且基本上不含硫和芳族物质。
术语“保守结构域”或“基序”指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其他位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表明对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们可通过它们在蛋白质同系物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标签或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。
在异源三聚SNF1蛋白激酶中或与其相关的术语“降低的活性”指与野生型异源三聚SNF1蛋白激酶相比部分或总体减量调节异源三聚SNF1蛋白激酶复合物的激酶活性，所述复合物包含α-、β-、或γ-亚基。减量调节通常当编码α-、β-、或γ-亚基的天然基因具有“中断”或“改变”时发生，这指在该基因一部分内的插入、去除、或定向突变，导致例如全基因敲除使得该基因从基因组中去处，并且不翻译蛋白或翻译的亚基蛋白发生插入、去除、氨基酸取代或其他定向突变。蛋白中改变的位置可为例如在蛋白的N-末端部分中[例如在Snf1的N-末端活化环片段中]或在蛋白C-末端部分中。改变的亚基蛋白将具有比未被破坏的α-、β-、或γ-亚基蛋白更弱的活性，并且可能不具备功能。异源三聚SNF1蛋白激酶的活性降低也可通过操纵上游调节蛋白或调节结构域、改变异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白、转录并翻译因子和/或信号转导途径或者通过使用有义、反义或RNAi技术等实现。
术语“氨基酸”将指蛋白质或多肽的基本化学结构单位。遵照在Nucleic Acids Research，13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal，219(2)：345-373(1984)(将其以引用方式并入本文)中描述的IUPAC-IYUB标准，通过氨基酸的单字母密码或三字母密码来表示氨基酸。
术语“保守氨基酸置换”指将给定蛋白质中的氨基酸残基用另一种氨基酸置换，而不改变该蛋白质的化学或功能性质。例如，在本领域中熟知，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸(但不影响所编码、折叠蛋白质的结构和功能特性)的基因改变是常见的。为了本发明目的，将“保守氨基酸置换”定义为如下五组中的一组内的互换：
1.小的脂族、非极性残基或稍微极性的残基：Ala[A]、Ser[S]、Thr[T](Pro[P]、Gly[G])；
2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp[D]、Asn[N]、Glu[E]、Gln[Q]；
3.极性的、带正电荷的残基：His[H]、Arg[R]、Lys[K]；
4.大的脂族非极性残基：Met[M]、Leu[L]、Ile[I]、Val[V](Cys[C])；以及
5.大的芳族残基：Phe[F]、Tyr[Y]、Trp[W]。
因此如Ala这样的弱疏水性氨基酸可以由另一种疏水性更弱的残基(例如Gly)取代。同样的，也期望由一种带负电的残基取代另一种带负电的残基(例如Asp取代Glu)或一种带正电的残基取代另一种带正电的残基(例如Lys取代Arg)所引发的改变能产生功能上等同的产物。同样的，保守氨基酸取代一般保持：1)取代区域中的多肽主链的结构；2)靶位点上的分子电荷或疏水性；或3)侧链体积。此外，在许多情形中，改变蛋白质分子的N-末端和C-末端部分也将预计不会改变蛋白质的活性。
术语“非保守氨基酸置换”指通常预期会使蛋白质性质发生最大变化的氨基酸置换。因此例如非保守的氨基酸取代将是其中：1)疏水性残基取代亲水性残基(例如Leu、Ile、Val取代Ser或Thr)；2)任何其他残基取代Cys或Pro；3)带负电的残基取代具有带正电的侧链的残基(例如Asp或Glu取代Lys、Arg或His)；或4.)具有大侧链的残基置换无侧链的残基/被无侧链的残基置换(如Phe置换Gly/被Gly置换)。有时，这五组中的两组之间的非保守氨基酸置换将不会影响所编码的蛋白质的活性。
术语“脂质”指任何脂溶性的(即，亲脂的)、天然存在的分子。脂质是具有多种关键生物学功能的化合物的各种不同基团，所述功能例如细胞膜的结构组分、能量贮存来源和信号途径的中间体。可以将脂质广泛定义为疏水性或两亲性小分子，它们完全地或部分地起源于酮脂酰或异戊二烯基团。所有脂质类别的综述指Lipid Metabolites and PathwaysStrategy(LIPID MAPS)分类体系(National Institute of General MedicalSciences，Bethesda，MD)。
术语“油”是指在25℃时为液体且通常为多不饱和的脂类物质。在含油生物中，油构成总脂质的主要部分。“油”主要由三酰基甘油组成[“TAG”]，但是也可包含其他中性脂类、磷脂和游离脂肪酸。油中的脂肪酸组合物和总脂质的脂肪酸组合物一般是相似的；因此，总脂质中的PUFA浓度的提高或降低将对应于油中的PUFA浓度的升高或降低，反之亦然。
“中性脂类”指那些一般以贮存脂肪形式存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们的名称是因为在细胞pH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂类一般指甘油的脂肪酸单酯、二酯、和/或三酯，也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油，或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放游离脂肪酸，必须发生水解反应。
术语“三酰基甘油”[“TAG”]指由酰化甘油分子的三个脂肪酰残基组成的中性脂类。TAG能够包含长链PUFA和饱和脂肪酸，以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸。
术语“总脂肪酸”[“TFA”]本文指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定实例中能通过碱酯交换方法(本领域已知的方法)被衍生化成脂肪酸甲酯[“FAME”]，例如它可以是生物质或油。因此总脂肪酸包括来自中性脂类级分(包括二酰基甘油、单酰基甘油和TAG)和极性脂质级分(包括磷脂酰胆碱[“PC”]和磷酸酰乙醇胺[“PE”]级分)的脂肪酸，但是不包括游离脂肪酸。
虽然总脂质含量可近似以量度FAME的DCW百分比表示[“FAME％DCW”]，术语细胞“总脂质含量”是以干细胞重量[“DCW”]百分比表示的TFA的量度。因此总脂质含量[“TFA％DCW”]等同于例如每100毫克DCW的总脂肪酸毫克数。
本文将总脂质中的脂肪酸浓度表示为TFA重量百分比[“％TFA”]，例如每100毫克TFA的给定脂肪酸毫克数。除非本文公开中另外具体声明，给定脂肪酸对总脂质的百分比等同于以％TFA表示的脂肪酸浓度(例如总脂质的％EPA等同于EPA％TFA)。
在一些情况下，将细胞中给定脂肪酸的含量表达为其占干细胞重量的重量百分比[“％DCW”]是有用的。因此例如二十碳五烯酸％DCW将根据下式测定：[(二十碳五烯酸％TFA)*(TFA％DCW)]/100。细胞中给定脂肪酸的含量以其占干细胞重量的重量百分比[“％DCW”]表示，然而它可被近似表示为：[(二十碳五烯酸％TFA)*(FAME％DCW)]/100。
术语“脂质特征”和“脂质组合物”是可互换的，并且指在特定脂质级分(例如在总脂质或油中)中包含的单个脂肪酸的量，其中所述量用TFA重量百分比形式表示混合物中存在的各个脂肪酸的总量应当是100。
术语“萃取油”指已经从其他细胞材料中分离的油，例如其中合成油的微生物。萃取油通过多种方法获得，其中最简单的方法仅涉及物理方法。例如使用多种压榨装置的机械压榨(例如螺杆式压缩机、榨油机、活塞式榨油机、珠磨机等)可从细胞材料中分离油。作为另外一种选择，可通过用多种有机溶剂处理(例如己烷)、酶提取、渗透压冲击破碎、超声波提取、超临界流体萃取(例如CO2萃取)、皂化、以及这些方法的组合进行油萃取。萃取的油不需要进行不必要的纯化或进一步浓缩。
术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C12至C22(尽管更长和更短链长的酸均是已知的)。主要的链长介于C16和C22之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳(“C”)原子的总数，而Y表示双键的数目。总的来说，脂肪酸被分为饱和的和不饱和的两类。术语“饱和脂肪酸”是指其碳主链不含“双键”的脂肪酸。与之相反，“不饱和脂肪酸”是沿其碳主链具有“双键”的顺式异构体。另外的关于“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸”(“PUFA”)、以及“ω-6脂肪酸”[“ω-6”或“n-6对”]对“ω-3脂肪酸”[“ω-3”或“n-3”]之间的区别的详细信息在美国专利7,238,482中有所提供，该专利以引用方式并入本文。
表2中提供了用于描述本文PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始(为此ω碳的编号为1)。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸及其前体的俗名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名称。
表2：多不饱和脂肪酸和前体的命名
虽然使用本文所述方法，表2列出的ω-3/ω-6 PUFA最可能在含油酵母的油级分中积聚，但是该列表不应理解为限制性的或完全的。
术语“含油的”指那些倾向于以油形式贮存它们的能源的生物(Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980)。
术语“含油酵母”指那些能够产油并被归类为酵母的微生物。通常，含油微生物的细胞油含量符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期它达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期期间逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25(1991))。含油微生物积累油脂超过它们的干细胞重量的约25％的情形并不少见。含油酵母的实例包括但不限于如下属：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。
术语“PUFA生物合成途径”指将油酸转化成诸如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DRA、DTA和DPAn-6之类的ω-6脂肪酸和诸如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA之类的ω-3脂肪酸的代谢过程。文献中详细描述了该过程。参见例如，国际专利申请公布WO2006/052870。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和，这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延伸酶(称为“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地讲，“PUFA生物合成途径酶”指如下与PUFA生物合成相关的任何酶(以及编码该酶的基因)，包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶。
术语“去饱和酶”指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即引入双键)而产生所关注的脂肪酸或前体的多肽。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ-系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文尤其受关注的酶是：Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ15去饱和酶和Δ9去饱和酶。在本领域中，基于Δ15和Δ17去饱和酶将ω-6脂肪酸转化成它们的ω-3对应物的能力(如分别将LA转化成ALA以及将ARA转化成EPA)，偶尔也将它们称作“ω-3去饱和酶”、“ω-3去饱和酶”和/或“ω-3去饱和酶”。所期望的是通过用脂肪酸去饱和酶的基因来转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸分布的作用，从而经验性地测定特定脂肪酸去饱和酶的特异性。
术语“延伸酶”指能延长脂肪酸碳链从而产生比该延伸酶作用于其上的脂肪酸底物长2个碳原子的酸的多肽。该延长过程在与脂肪酸合酶相关的多步骤机制中发生，如美国专利公布2005/0132442和国际专利申请公布WO 2005/047480所述。延伸酶体系催化反应的实例如GLA转化成DGLA、STA转化成ETA以及EPA转化成DPA。通常，延伸酶的底物选择性有些广泛，但由链长度和不饱和的程度及类型两者来区分。例如，C14/16延伸酶将会利用C14底物(如肉豆蔻酸)，C16/18延伸酶将会利用C16底物(如棕榈酸)，C18/20延伸酶将会利用18底物(如GLA、STA、LA、ALA)，而C20/22延伸酶[也称为Δ5延伸酶]将会利用C20底物(如ARA、EPA)。就本文目的而言，能够定义两种不同类型的C18/20延伸酶：Δ6延伸酶将分别催化GLA和STA转化成DGLA和ETA，而Δ9延伸酶能够分辨催化LA和ALA转换成EDA和ETrA。
重要的是，须注意一些延长酶具有广泛的特异性并因而单个延长酶可能能够催化几种延长酶反应(如，从而既可作为C16/18延伸酶又可作为C18/20延伸酶)。可能理想的是，通过用脂肪酸延伸酶的基因来转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸概况的作用，从而经验性地测定脂肪酸延伸酶的特异性。
术语“转化效率”和“底物转化百分比”指特定酶(如去饱和酶)能够将底物转化成产物的效率。转化效率根据下式测量：([产物]/[底物+产物])*100，其中“产物”包括来源于其的途径中的中间产物和所有产物。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”本文可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等的范围。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个片段构成。核苷酸(通常以它们的5’-单磷酸形式存在)通过单字母命名指代如下：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，“N”指任何核苷酸。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是众所周知的，并在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning： A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY(1989)，其以引用方式并入本文，尤其是第11章和表11.1。温度和离子浓度条件决定了杂交的“严格性”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤可确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC，0.5％SDS在室温洗涤15分钟，然后用2X SSC，0.5％SDS在45℃重复30分钟，然后用0.2X SSC，0.5％SDS在50℃重复洗涤两次，每次30分钟。一组较优选的严格性条件使用较高温度，其中洗涤步骤与上述那些步骤相同，不同的是最后两次用0.2X SSC，0.5％SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到60℃。另一组优选的高严格性条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1X SSC、0.1％SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在0.1X SSC、0.1％SDS中于65℃下杂交，并用2X SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤。
杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度，所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的方程式(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；最优选长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以推定鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如微生物菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本文公开内容提出了编码异源三聚SNF1蛋白激酶的特定蛋白的完整氨基酸和核苷酸序列。具有如本文报道序列的有益效果，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知的目的。因此，本公开包括在附随序列表中报道的完全序列，以及那些上述序列的主要部分。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，针对DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开涵盖与所附序列表中报道的完全序列互补的分离核酸片段，以及那些基本上类似的核酸序列。
术语“同源性”或“同源”互换使用。它们指这样的核酸片段，即其中一个或多个核苷酸碱基改变并不会影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语也指核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。
此外，技术人员认识到，同源核酸序列也由它们在中等严格条件(如0.5X SSC，0.1％SDS，60℃)下，与本文所示例的序列杂交的能力，或杂交至本文公开的核苷酸序列的任何部分以及杂交至与其功能相当的序列的能力所限定。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。
术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下，核酸序列与特定核酸靶序列以比其与非靶核酸序列的杂交更高的可检测程度(例如至少2倍于背景)杂交，并指基本排除了非靶核酸。选择性杂交的序列通常彼此具有约至少80％的序列同一性，或90％的序列同一性，最多并包括100％的序列同一性(即完全互补)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针将会选择性杂交至其靶序列的条件。严格条件是序列依赖性的并将因不同的环境而异。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。作为另一种选择，可调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度少于约1000个核苷酸，任选长度少于500个核苷酸。
通常，严格条件将是如下那些条件：在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.5M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，而对于长的探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。示例性的低严格条件包括在37℃下于含有30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中杂交，以及在50至55℃下用1X至2X SSC(20X SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃下于40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在55至60℃下用0.5X至1X SSC洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃下于50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在60至65℃下用0.1X SSC洗涤。例如，另一组严格性条件包括在0.1X SSC、0.1％SDS中于65℃下杂交，并用2X SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤。
特异性通常取决于杂交后洗涤，最终洗涤溶液的离子强度和温度是关键因素。就DNA-DNA杂交体而言，热力学熔点Tm可以用Meinkoth等人，Anal.Biochem.，138：267-284(1984)中的等式估算：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L是以碱基对表示的杂交体的长度。Tm是(在确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。每出现1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可调节Tm杂交和/或洗涤条件以与具有期望同一性的序列杂交。例如，如果要寻求具有大于或等于≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，在确定的离子强度和pH下，严格条件选择为比特定序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，极严格条件可采用在比Tm低1、2、3或4℃的温度下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在比Tm低6、7、8、9或10℃的温度下杂交和/或洗涤；并且，低严格条件可采用在比Tm低11、12、13、14、15或20℃的温度下杂交和/或洗涤；利用所述等式、杂交和洗涤组合物以及所期望的Tm，本领域的技术人员将会理解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已经在本质上进行了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC的浓度以便能使用更高的温度。对核酸杂交的详尽指导可在以下文献中找到：Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays”，Elsevier，New York(1993)；以及Current Protocols inMolecular Biology，第2章，Ausubel等人编辑，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(1995)。杂交和/或洗涤条件可进行至少10、30、60、90、120或240分钟。
术语“同一性百分比”指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，它通过序列比较进行测定。“同一性百分比”也指多肽或多核苷酸序列间的序列关联程度，看情况通过比较序列间的匹配百分比进行测定。可通过已知方法容易地计算“同一性百分比”和“相似性百分比”，包括但不限于在以下文献中描述的那些方法：1)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.，Ed.)Oxford University：NY(1988)；2)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.，Ed.)Academic：NY(1993)；3)Computer Analysis of Sequence  Data，Part I(Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，Eds.)Humania：NJ(1994)；4)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.，Ed.)Academic(1987)；和5)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.，Eds.)Stockton：NY(1991)。
设定确定同一性百分比的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。用于测定同一性百分比和相似性百分比的方法在公开可获得的计算机程序中进行编辑。序列比对和百分比同一性可使用LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlignTM程序进行计算。序列的多重比对采用包括几种改变形式的算法在内的“Clustal比对方法”进行，包括“Clustal V比对方法”和“ClustalW比对方法”(在Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))并且存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlignTM(8.0.2版)程序中。用Clustal程序比对序列后，可通过查看程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”。
就多重比对而言，使用Clustal V比对方法，预设值对应于空位罚分＝10以及空位长度罚分＝10。使用Clustal V方法进行的成对比对和蛋白序列同一性百分比计算的默认参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALS SAVED＝5。就核酸而言，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4，DIAGONALS SAVED＝4。使用Clustal W比对方法进行多重比对的默认参数对应于空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，DelayDivergent Seqs(％)＝30，DNA转移权重＝0.5，蛋白质权重矩阵＝GonnetSeries，DNA权重矩阵＝IUB。
“BLASTN比对方法”是由美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)提供的算法，用于使用默认参数比较核苷酸序列，而“BLASTP比对方法”是由NCBI提供的算法，用于使用默认参数比较蛋白序列。
本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其他物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。合适的核酸片段，即编码在本文所述方法和宿主细胞中的多肽的分离多核苷酸，编码至少约70-85％相同的多肽，而较优选的核酸片段编码与本文报道的氨基酸序列至少约85-95％相同的氨基酸序列。虽然上文描述了优选的范围，同一性百分比的可用实例包括50％至100％之间的任何整数百分比，例如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。该分离核苷酸片段的任何全长或部分互补的序列也是有用的。
合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。
“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
“合成基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸构件装配而成。将这些基本单位进行退火并随后连接以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚性，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。例如在美国专利公布7,125,672中提供了解脂耶氏酵母的密码子使用特制。
“基因”指能够表达特定蛋白的核酸片段，并且其可单独指编码区或可包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”指与其自身调节序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因，包含非天然一起存在的调节序列和编码序列。因此嵌合基因可包含得自不同来源的调节序列和编码序列，或者得自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调节序列和编码序列。“内源性基因”指在生物基因组中的天然位置的天然基因。“外来”基因指通过基因转移导入到宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。“经密码子最优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。
“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调节序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、增强子、静默子、5’非翻译前导序列(例如在转录起始位点和翻译启动密码子之间的序列)、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件如增强子和静默子组成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为″组成型启动子″。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“3′非编码序列”和“转录终止子”指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。
“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录所产生的产物。当RNA转录物与DNA序列拷贝完全互补时，它指初级转录物，或者它可为来源于初级转录物的转录后加工的RNA序列，并且将其称为成熟RNA。“信使RNA”或“mRNA”指无内含子的RNA，它可以由细胞翻译成蛋白质。“cDNA”指与mRNA互补并来源于其的双链DNA。“有义”RNA指RNA转录物，它包括mRNA并能被细胞翻译成蛋白。“反义RNA”指与全部或部分靶初级转录物或mRNA互补的RNA转录物，并且它阻止靶基因的表达(美国专利5,107,065；国际专利申请公布WO 99/28508)。
术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它可操作地连接编码序列。即，编码序列处于启动子的转录控制下。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。
术语“重组体”是指例如通过化学合成或通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段而实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。
如本文所用，术语“表达”指源于核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。因此，如本文所用，术语“表达”也指产生功能性终产物(例如mRNA或蛋白[前体或成熟体])。
“转化”指将核酸分子转移至宿主生物中，导致在遗传上稳定遗传。例如，核酸分子可以是自主复制的质粒，例如，或者它可以整合进宿主生物的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化的”或“转化体”生物。
术语“质粒”和“载体”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体，该独特构建体能够将表达盒引入细胞中。
术语“表达盒”指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的DNA片段。“表达盒”一般将包含所选基因的编码序列和所选基因产物表达所需的位于编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。因此，表达盒通常由以下部分组成：1)启动子序列；2)编码序列：[“ORF”]；以及3)3′非翻译区域(即终止子)，它在真核细胞中通常包含聚腺苷酸位点。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。可以将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物体中，只要能针对每种宿主使用正确的调控序列。
术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”本文可互换使用。重组构建体包括人造的核酸片段组合，例如天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。因此，重组DNA构建体可以包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员熟知的将要用于转化宿主细胞的方法。例如可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包括本文所述的任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传因子。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同水平和模式的表达(Jones等人，EMBO J.，4：2411-2418(1985)；DeAlmeida等人，Mol.Gen.Genetics，218：78-86(1989))，因此为了获得显示所需表达水平和模式的细胞系，必须对多个事件进行筛选。
术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：1)GCG程序软件包(Wisconsin PackageVersion 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Editor(s)：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在这一描述中，除非另外指明，只要序列分析软件用于分析，分析结果都基于所用程序的“默认值”。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene  Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Assoc.和Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。
通常，含油微生物的脂质蓄积是响应存在于生长培养基中的总的碳氮比而触发。该过程(导致含油微生物中游离棕榈酸(16:0)的从头合成)在美国专利7,238,482中有详细描述。棕榈酸是长链饱和和不饱和脂肪酸衍生物的前体，这些脂肪酸衍生物通过延长酶和去饱和酶的作用形成(图2)。
可将多种脂肪酸(包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链脂肪酸)掺入TAG，它是脂肪酸的主要贮藏单位。在本文所述的方法和宿主细胞中，最期望将“长链”PUFA[“LC-PUFA”]引入TAG中，其中长链LC-PUFA包括来源于18:1底物的任何脂肪酸，所述底物具有至少18个碳原子，即，C18或更长。LC-PUFA的结构形式不受限制(因此例如LC-PUFA可以在总脂质中以游离脂肪酸形式或酯化形式存在，例如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂)。其也包括羟基化脂肪酸、环氧脂肪酸和共轭亚油酸。
虽然大多数PUFA以中性脂类的形式掺入TAG并贮存于脂质体中，但是重要的是认识到在含油生物中测量总PUFA应至少包括那些位于PC、PE和TAG级分中的PUFA。
其中油酸转化成ω-3/ω-6脂肪酸的代谢过程包括通过添加碳原子使碳链延长和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内的一系列特殊去饱和酶和延长酶。然而，如图2中看到的和如下所述的，存在多个用于产生特定ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径。
具体地讲，图2描述了下文所述的途径。所有途径都需要最初通过Δ12去饱和酶将油酸转化成亚油酸[“LA”](第一个ω-6脂肪酸)。然后使用“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”并用LA作为底物，如下形成长链ω-6脂肪酸：1)通过Δ9延伸酶将LA转化成二十碳二烯酸[“EDA”]；2)通过Δ8去饱和酶将EDA转化成二高-γ-亚麻酸[“DGLA”]；3)通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成花生四烯酸[“ARA ”]；4)通过C20/22延伸酶将ARA转化成二十二碳四烯酸[“DTA”；以及，5)通过Δ4去饱和酶将DTA转化成二十二碳五烯酸[“DPAn-6”]。
“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”也能够利用α-亚麻酸[“ALA”]作为底物如下生产长链ω-3脂肪酸：1)通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA，它是第一个ω-3脂肪酸；2)通过Δ9延伸酶将ALA转化成二十碳三烯酸[“ETrA”]；3)通过Δ8去饱和酶将ETrA转化成二十碳四烯酸[“ETA”]；4)通过Δ5去饱和酶将ETA转化成二十碳五烯酸[“EPA”]；5)通过C20/22延伸酶将EPA转化成二十二碳五烯酸[“DPA”]；以及，6)通过Δ4去饱和酶将DPA转化成二十二碳六烯酸[“DHA”]。任选地，ω-6脂肪酸可转化成ω-3脂肪酸；例如，ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA生成。就本文目的而言，有利地是Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径能够生产缺少显著量γ-亚麻酸[“GLA”]的EPA油。
ω-3/ω-6脂肪酸生物合成的替代途径利用Δ6去饱和酶和C18/20延伸酶，即，“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”。更具体地讲，可通过Δ6去饱和酶分别将LA和ALA转化成GLA和十八碳四烯酸[“STA”]；然后，C18/20延伸酶将GLA转化成DGLA和/或将STA转化成ETA。
本发明的宿主生物可天然地或经由基因工程技术任选地具有生产PUFA的能力。具体地讲，虽然多种微生物能够在常见的细胞代谢过程中合成PUFA(包括ω-3/ω-6脂肪酸)，并且它们中的一些能进行商业培养，但是这些生物很少生产或不生产具有期望的油含量的油和用于药物、膳食替代品、医疗食品、营养补充剂、其它食物产品、工业油脂化学制品或其它终端产品中的组合物。因此，越来越着重于工程化微生物以生产“设计”的脂质和油的能力，其中脂肪酸含量和组成通过基因工程进行详细指定。期望宿主将可能包含编码功能性PUFA生物合成途径的异源基因，但这是非必需的。
如果宿主生物不天然产生期望的PUFA或具有期望的脂质特征，本领域的技术人员将熟悉导入一个或多个表达盒到所选宿主生物中必需的考虑和技术，所述表达盒编码PUFA生物合成的适用酶，例如编码Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶的表达盒(图2)。在文献中向本领域的技术人员提供了多项教导用于鉴定并评估编码各个ω-3/ω-6脂肪酸生物合成所需酶的多个候选基因的适宜性，以及用于将此类表达盒导入不同宿主生物。当然，包含于具体表达盒中的具体基因将取决于宿主生物(及其PUFA概况和/或去饱和酶/延伸酶概况)、底物的可利用性和所需的终产物。将使用宿主生物解脂耶氏酵母的一些文献提供如下：美国专利7,238,482；美国专利7,465,564；美国专利申请公布US-2006-0094092；美国专利申请公布US-2006-0115881-A1；美国专利申请公布US-2006-0110806-A1；以及美国专利申请改变US-2009-0093543-A1。该列表是不完全的并且不应理解为限制性的。
优选地，含油的真核宿主细胞将能够产生占宿主细胞总脂质至少约2-5％的LC-PUFA，更优选占总脂质至少约5-15％的LC-PUFA，更优选占总脂质至少约15-35％的LC-PUFA，更优选占总脂质至少约35-50％的LC-PUFA，更优选占总脂质至少约50-65％的LC-PUFA，最优选占总脂质至少约65-75％的LC-PUFA。LC-PUFA的结构形式不受限制；因此例如EPA或DHA可在总脂质中以游离脂肪酸形式或酯化形式存在，例如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂。
许多文献已经描述了AMPK/SNF1蛋白激酶家族和当前对作为全局调节子的蛋白的结构和功能的理解。参见例如，Hardie，D.G.等人，“TheAMP-Activated/SNF1 Protein Kinase Subfamily：Metabolic Sensors of theEukaryotic Cell？”，Annu.Rev.Biochem.，67：821-855(1998)，以及Hedbacker，K.和M.Carlson，“SNF1/AMPK Pathways in Yeast”，Frontiers in Bioscience，13：2408-2420(2008)。如Hedbacker和Carlson(同上)所述，细胞需要啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的异源三聚SNF1蛋白激酶以适应葡萄糖限制条件并利用优选性次于葡萄糖的替代碳源，例如蔗糖、半乳糖、乙醇。激酶在对营养物质和环境胁迫的多种其他细胞响应中具有附加作用。SNF1蛋白激酶调节多个葡萄糖阻遏基因的转录，以及显著部分的在转录和信号转导中具有功能的那些基因。一般来讲，当异源三聚激酶被磷酸化作用活化时，例如响应葡萄糖限制时，生成ATP的分解代谢途径增加。即，呼吸、糖合成和β-氧化增量调节，而许多其他葡萄糖阻遏基因的表达增加，并且消耗ATP的合成代谢途径减少，即，脂肪酸合成和糖原代谢通过复杂的酶级联反应减量调节。
正如任何生物系统一样，异源三聚SNF1蛋白激酶的活性受若干个上游调节蛋白的严格控制以确保其活性水平受到适宜的调节。将这些上游调节蛋白、异源三聚SNF1蛋白激酶亚基、以及受异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白一起称为SNF1蛋白激酶网络。
SNF1蛋白激酶网络内的蛋白间复杂相互作用将可能永远不能得到完全了解。例如Young，E.T.等人(J.Biol.Chem.，278：26146(2003))发现超过400个啤酒糖酵母基因在葡萄糖限制条件下是SNF1依赖性的，这基于基因组学表达研究和微阵列分析。基于解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)中的微阵列分析，已经测定了超过200个基因在与它们在对照菌株中的表达进行比较时，在snf1Δ菌株中差异表达大于1.3倍(实施例11，表25)。
基于本专利申请以及多个其他公布中描述的实验，对异源三聚SNF1蛋白激酶调节的概述图示于图1中。简而言之，无活性的(左侧)和有活性的(右侧)异源三聚SNF1蛋白激酶由催化亚基Snf1、调节亚基Snf4、和连接β-亚基组成(即由Sip1、Sip2和/或Gal83编码的亚基)。Snf1本身由赋予其激酶活性的催化激酶结构域[“KD”]和与Snf4、Snf1KD及β-亚基相互作用的调节结构域[“RD”]组成。异源三聚SNF1蛋白激酶的活化需要在Snf1 KD的活化环片段上磷酸化苏氨酸。编码Snf1、Snf4或β-亚基的任何基因的表达减量调节将因此改变异源三聚SNF1蛋白激酶的功能。
与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白包括多种Ser/Thr激酶(例如Sak1、Tos3和Elm1)、己糖激酶(例如Hxk2)、和蛋白-磷酸酶1复合物的蛋白(例如Reg1和Glc7)。异源三聚SNF1蛋白激酶的活化程度似乎受Sak1、Tos3和/或Elm1激酶表达的调节，而异源三聚SNF1蛋白激酶的灭活程度似乎受Hxk2、Glk1、Reg1和Glc7表达的操纵。
当异源三聚SNF1蛋白激酶失活时，多个下游蛋白受到影响。例如转录因子如锌指蛋白(如Rme1、Mhy1)、微粒体细胞色素b5还原酶蛋白(如Cbr1)和葡萄糖转运蛋白(如Snf3)增量调节。与之相反，当异源三聚SNF1蛋白激酶具有活性时，其活性受磷酸化(例如乙酰-CoA羧化酶[“ACC”]和二酰基甘油酰基转移酶[“DGAT”])调节的多个蛋白可能失活。
已经发现异源三聚SNF1蛋白激酶活性的降低导致在转基因含油真核宿主细胞中的总脂质含量提高(用TFA％DCW进行测量)，例如在酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中的总脂质含量。可经由以下途径降低该异源三聚SNF1蛋白激酶的活性：1)减量调节Sak1和Tos3；2)增量调节Hxk2、Glk1或Reg1；3)减量调节Snf1、Snf4、Sip2或Gal83；4)增量调节Snf1调节结构域；4)增量调节Snf1的无催化活性的突变体；6)增量调节Rme1、Cbr1或Snf3；以及7)增量调节ACC或DGAT的突变体，其中所述突变的变体能被异源三聚SNF1蛋白激酶磷酸化。关于调节异源三聚SNF1蛋白激酶活性的这些机制中的每一个将在下文中讨论。
已知啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的葡萄糖阻遏受到复杂的代谢途径的严格调节。作为该途径的一部分，异源三聚SNF1蛋白激酶可由三个上游激酶Sak1、Tos3或Elm1中的任何一个活化。所有三个Snf1活化激酶包含丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，所述结构域靠近它们具有小保守序列的N末端和大的C末端结构域。基于一系列缺失突变体的制备，这些激酶的途径特异性近来已经由Rubenstein，E.M.等人(Eukaryot Cell.，5(4)：620-627(2006))进行了研究。本文证明SNF1蛋白激酶活性通过以适宜方式抑制该激酶活性破坏Sak1而降低。
根据其调节异源三聚SNF1蛋白激酶复合物的功能，猜测该葡萄糖阻遏途径的另一个主要组分是Reg1-Glc7蛋白磷酸酶复合物(参见Sanz，P.等人，Molecular and Cellular Biology，20(4)：1321-1328(2000))。Glc7是编码蛋白磷酸酶1型催化亚基的主要基因。它通过结合特定调节亚基涉及葡萄糖阻遏和多种其他细胞过程的调节，所述调节亚基使得磷酸酶靶向对应的底物。这些将Glc7靶向底物以阻遏葡萄糖的调节亚基中的其中一个是Reg1。假定响应葡萄糖并由Reg1靶向的Glc7将Snf1α-亚基或异源三聚SNF1蛋白激酶复合物的另一个组分去磷酸化，从而有利于其构型从活性状态变为自我抑制的形式。另一个发现表明Snf1负调节其自身与Reg1的相互作用。本文证明用一种使得磷酸酶复合物极度活跃的方式改变Reg1-Glc7蛋白磷酸酶复合物将降低SNF1蛋白激酶的活性。
己糖激酶PII(Hxk2)是一种糖分解酶，该酶除磷酸化葡萄糖之外，还涉及调节葡萄糖阻遏。更具体地讲，如Sanz，P.等人(同上)的文献所述，似乎Hxk2与异源三聚SNF1蛋白激酶复合物和/或Reg1-Glc7蛋白磷酸酶复合物相互作用。本文证明改变己糖激酶PII活性会降低SNF1蛋白激酶活性。
令人感兴趣的是，已经发现Hxk2调节啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)中Glk1、Hxk1和Hxk2的表达(Rodríguez，A.等人，BiochemJ.，355(3)：625-631(2001))。具体地讲，本文证明Hxk2涉及葡萄糖诱导的HXK1和GLK1基因阻遏和葡萄糖诱导的HXK2基因表达，而Hxk1作为负因子涉及GLK1和HXK2基因的表达。
虽然异源三聚SNF1蛋白激酶可影响细胞内的几百个蛋白，确定激酶直接(相对非直接而言)影响的那些蛋白可能是困难的，因此需要大量的筛选和分析。取决于生长条件等，不同下游蛋白之间的相互影响也可发生变化。
尽管存在上述不确定性，已经广泛使用微阵列分析研究发生在环境变化期间或多个缺失突变体中的代谢重整，并且许多以前未表征基因的表达模式为它们的可能功能提供了线索。例如DeRisi等人(Science，278(5338)：680-686(1997))使用微阵列分析将Sip4和Hap4鉴定为啤酒糖酵母双峰转换的重要转录因子。
本文利用类似的方法鉴定解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的异源三聚SNF1蛋白激酶网络中潜在的重要蛋白，它们可导致snf1缺失突变体和野生型菌株之间的表型差异。在这些蛋白中，两个潜在锌指蛋白的认知基因在snf1缺失菌株中的转录与在野生型菌株中的转录相比增加。这些蛋白是与啤酒糖酵母Rme1和啤酒糖酵母Mhy1同源的蛋白。
以下内容是为人们所熟知的：许多Cys2His2型锌指蛋白是涉及基因表达的转录因子。例如啤酒糖酵母Rme1(GenBank登录号NP_011558)是锌指蛋白，其功能是作为减数分裂激活因子IME1的转录阻遏蛋白(Covitz、P.A.、和Mitchell，A.P.，Genes Dev.，7：1598-1608(1993))。耶氏酵母属Rme1同源物(SEQ ID NO：116)和Mhy1锌指蛋白同源物(SEQ ID NO：121)在snf1Δ菌株中的差异表达大于1.54倍。这些蛋白尚未被表征，并且可为解脂耶氏酵母中用于脂质代谢的潜在重要的转录因子。
此外，编码啤酒糖酵母SNF3基因同源物的基因表达在snf1Δ菌株中增量调节。酵母啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的高亲和力葡萄糖转运需要SNF3基因，并且还涉及葡萄糖阻遏控制的基因表达。
除上述蛋白之外，活性异源三聚SNF1蛋白激酶(虽然异源三聚SNF1蛋白激酶不能进行逆反应，即，通过磷酸化灭活)还通过去磷酸化活化多种蛋白。在该依赖异源三聚SNF1蛋白激酶的蛋白家族内，乙酰-CoA羧化酶[“ACC”]和二酰基甘油酰基转移酶[“DGAT”]在脂质生物合成中起到极大作用。具体地讲，ACC(EC 6.4.1.2)催化脂肪酸合成中的关键调节步骤。DGAT(EC 2.3.1.20)是仅用于三酰基甘油[“TAG”]生物合成的酶，它催化酰基-CoA和1，2-二酰基甘油转化成CoA和TAG，它们是细胞中的主要贮藏脂质。存在两个DGAT酶家族：DGAT1和DGAT2。
遗憾的是，已知ACC和DGAT内的精确磷酸化位点位于非常少的ACC和DGAT序列中。例如，虽然大鼠ACC(GenBank登录号NP_071529；SEQ ID NO：147)的丝氨酸残基79[“Ser-79”]通过AMPK完全引起ACC灭活，(Davies，S.P.等人，Eur.J.Biochem.，187：183-190(1990)；Ha，J.等人，J.Biol.Chem.，269(35)：22162-22168(1994))，对应的Ser-79残基不存在于啤酒糖酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)中。已经发现AMPK/Snf1蛋白激酶家族的共有磷酸化位点是Hyd-(Xaa-Bas)-Xaa-Xaa-Ser/Thr-Xaa-Xaa-Xaa-Hyd(SEQ ID NO：148)，其中Hyd是大体积疏水性侧链(即，Leu、Met、Ile、Phe、或Val)，Bas是碱性残基(即，Arg、Lys或His，其中Arg比Lys碱性更强，Lys比His碱性更强)，而Xaa是任何氨基酸残基(参见Hardie，D.G.等人，Annu.Rev.Biochem.，67：821-855(1998))。本领域的技术人员将能够测定特定ACC或DGAT蛋白内的适宜Ser/Thr磷酸化位点，所述蛋白允许通过活化的异源三聚SNF1蛋白激酶将其去磷酸化，从而被活化。磷酸化位点的突变使得Ser/Thr残基被不能磷酸化的中性残基(例如Ala)取代，这将阻止由活化异源三聚SNF1蛋白激酶引起的ACC或DGAT蛋白的减量调节。从而期望细胞中的脂质生产提高(Xu，Jingyu等人，Plant Biotech.J.，6(8)：799-818(2008)。
如前文所述，蛋白激酶的SNF1-AMPK家族包括哺乳动物中高度保守的AMP-活化蛋白激酶[AMPK]、酵母/真菌中的SNF1蛋白激酶、以及植物中SNF1相关的激酶。细菌中不存在这些蛋白激酶的已知同源物。
在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)SNF1蛋白激酶的多个结构域和亚基内已经进行了多项研究检测多种修改形式的效应，例如缺失、突变和敲除。在各个不同的SNF1蛋白激酶亚基中对wit、Snf1、Sip1、Sip2、Gal83、Snf4保守的序列已经允许在计算机上鉴定多种直系同源的蛋白，这可见于序列条目如GenBank中，并且在本专利申请中进行了说明(表3)。
当优选宿主生物中的SNF1蛋白激酶网络内的特定基因序列(即，编码α，β和/或γ亚基、上游调节蛋白或受异源三聚SNF蛋白激酶调节的下游蛋白的基因)或其蛋白是未知的时，本领域的技术人员将认识到最期望的将是在调节所编码蛋白的活性前鉴定并分离这些基因或它们的部分，从而改变真核生物中的总脂质含量。已知这些序列，尤其是例如Snf1、Sip1、Sip2、Gal83、Snf4，有利于期望宿主中的定向破坏。
表3的SNF1蛋白激酶网络序列将可用于通过序列分析软件搜索在相同或其他藻类、真菌、卵菌、类眼虫、原生藻菌、或酵母物种中的同源物。通常，这种计算机软件通过将同源程度赋予多种置换、缺失和其他修饰来匹配相似的序列。使用软件算法，如具有低复杂度滤波器和以下参数的BLASTP比对方法：Expect value＝10，matrix＝Blosum 62(Altschul等人，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，该方法是用于将表3中的任何SNF1蛋白激酶网络蛋白对核酸或蛋白序列数据库进行比较并从而鉴定在优选宿主生物中的相似已知序列的熟知方法。
使用算法软件搜索已知序列数据库尤其适于分离对序列具有相对低的同一性百分比的同源物，如那些表3中描述的序列。可预测的一点是：分离与公开可获得的SNF1蛋白激酶网络序列具有至少约70％-85％的同源性的SNF1蛋白激酶同源物将是相对较容易的。此外，那些至少约85％-90％相同的序列将尤其适于分离，那些至少约90％-95％相同的序列将最容易分离。
将利用异源三聚SNF1蛋白激酶的啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)蛋白作为查询序列对解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)基因组数据库进行搜索，以迅速地鉴定对应的耶氏酵母属同源物。因此将期望例如在优选真核宿主细胞中编码Snf1的基因与如SEQ ID NO：2所示的啤酒糖酵母蛋白和/或其他Snf1蛋白(如表3所述的那些蛋白)具有同源性。
SNF1蛋白激酶的一些亚基同源物也已经通过使用丝氨酸/苏氨酸激酶独有的基序而被分离。例如，为人们所熟知的是Snf1在N末端活化环片段中包含保守的Asp-Phe-Gly[DFG]和Ala-Pro-Glu[APE]基序。这些基序侧接于当Snf1活化时被磷酸化的苏氨酸残基(Hardie，D.G.和D.Carling，Eur.J.Biochem.，246：259-273(1997))。该“保守结构域”区域对应于一组在特定位点高度保守的氨基酸，并且对Snf1蛋白的结构、稳定性或活性来说是必需的。例如，已经证明ScSnf1(SEQ ID NO：2)的Thr210变成Ala、Glu或Asp会导致激酶灭活(Estruch，F.等人，Genetics，132：639-650(1992)；Ludin，K.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，95：6245-6250(1999))。相关的是，Snf4包含两对胱硫醚-β-合酶[CBS]重复序列，其称为Bateman结构域(Bateman，A.，TrendsBiochem.Sci.，22：12-13(1997))。基序可通过它们在蛋白质同系物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，因此也可用作独特的“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。本领域技术人员熟知的一点是：使用这些基序作为诊断工具分别迅速鉴定新的Snf1、Snf4、Sip1、Sip2和/或Gal83基因。
作为另外一种选择，编码SNF1蛋白激酶网络或其基序的公开可用的序列可用作杂交试剂用于同源物鉴定。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有目的基因或基因片段的样本及特定的杂交方法。探针通常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是“可杂交的”。尽管探针的长度可在5个碱基到数万个碱基之间变化，但通常约15个碱基到约30个碱基的探针长度是合适的。只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的一定比率的碱基没有与正确的互补碱基配对。
杂交方法是有严格规定的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在正确浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交均会发生。混合物中的探针或标记的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。任选地，可加入离液剂，如氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾或三氟乙酸铯。如果需要，能将甲酰胺加入杂交混合物，通常为30-50％(v/v)[“按体积计”]。
可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20％至60％体积，优选30％体积的极性有机溶剂。普通的杂交溶液采用约30-50％v/v甲酰胺、约0.15至1M氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2％去污剂(如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500千道尔顿)、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500千道尔顿)和血清白蛋白。一般的杂交溶液还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选约0.5％至2％wt/vol[“重量体积比”]的甘氨酸。还可以包含其它添加剂，例如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖)在内的体积排阻剂。
核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。
任何SNF1蛋白激酶网络的核酸片段或任何鉴定的同源物可用于从相同或其它藻类、真菌、卵菌、类眼虫、原生藻菌、酵母或植物物种中分离编码同源蛋白的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖型规程的实例包括但不限于：1)核酸杂交方法；2)DNA和RNA扩增方法，如核酸扩增技术的各种应用，例如聚合酶链反应[“PCR”](美国专利4,683,202)；连接酶链反应[“LCR”](Tabor，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074(1985))；或链置换扩增[“SDA”](Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)；和3)文库构建和互补筛选方法。
例如，可使用全部或一部分那些公开可用的核酸片段作为DNA杂交探针，使用本领域技术人员熟知的方法筛选来自任何期望生物的文库，从而直接分离编码类似于公开可用的Snf1、Snf4、Sip1、Sip2和/或Gal83或它们的基序的蛋白或多肽的基因。基于公开可获得核酸序列的特异性，寡核苷酸探针可通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)设计并合成。而且，整个序列可直接用于通过熟练技术人员已知的方法，例如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术，来合成DNA探针，或使用可获得的体外转录体系来合成RNA探针。此外，能设计特异性引物并用于扩增部分或全长公开可获得的序列或它们的基序。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应后标记，并用作探针来在合适的严格条件下分离全长的DNA片段。
通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于所需的检测条件，应该设计引物序列以提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是本领域常见且熟知的(Thein和Wallace，“The use of as specific hybridization probes in the Diagnosisof Genetic Disorders”、in Human Genetic Diseases：A Practical Approach，K.E.Davis Ed.，(1986)，第33-50页，IRL：Herndon，VA；以及Rychlik，W.，Methods in Molecular Biology，White，B.镰荚金合欢(A.Ed.，(1993)Vol.15，第31-39页，PCR Protocols：Current Methods andApplications.Humania：Totowa，NJ)。
通常，可将来自SNF1蛋白激酶网络基因的可用序列的两个短片段在PCR规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的较长核酸片段。也可以对克隆的核酸片段文库进行PCR，其中一个引物的序列来源于可获得的核酸片段或它们的基序。其它引物序列利用mRNA前体编码基因3′末端存在的多腺苷酸片。
备选地，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE规程(Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：8998(1988))，通过用PCR扩增在转录物内单个位点与3′或5′端之间的区域的拷贝来产生cDNA。以3′和5′方向取向的引物可以从能利用可获得的序列设计。使用可商业获得的3′RACE或5′RACE体系(例如BRL，Gaithersburg，MD)，可以分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：5673(1989)；Loh等人，Science，243：217(1989))。
基于刚讨论的这些熟知方法中的任何一种，鉴定和/或分离所选任何优选真核生物中编码异源三聚SNF1蛋白激酶的α-、β-、或γ-亚基的同源基因(包括Snf1、Sip1、Sip2、Gal83和Snf4)、编码上游调节蛋白的基因(包括例如Sak1、Tos1、Elm1、Hxk2、Reg1和Glc7)和/或编码受异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白的基因(包括例如Rme1、Mhy1、Cbr1、Snf3、ACC、DGAT)将是可能的。任何推定SNF1蛋白激酶网络蛋白的活性可根据本文所述的方法，通过操纵宿主生物中内源性基因的活性迅速地进行确认，因为转基因真核宿主中的总脂质含量相对于非转基因真核宿主中的总脂质含量将提高。
本文描述了提高含油真核宿主细胞的总脂质含量的方法，所述含油真核宿主细胞包含异源三聚SNF1蛋白激酶，所述方法包括：
(a)转化含油真核宿主细胞，其中异源三聚SNF1蛋白激酶活性在与非转化含油真核宿主细胞中的异源三聚SNF1蛋白激酶的活性水平进行比较时降低；
(b)在合适条件下使步骤(a)的转化细胞生长，其中总脂质含量在与获取自具有活性不降低的异源三聚SNF1蛋白激酶的非转化含油真核宿主细胞的总脂质含量进行比较时提高；以及
(c)任选地，从步骤(b)的细胞中回收油或脂质。
基于以上公开，将显而易见的是降低异源三聚SNF1蛋白激酶活性的上述方法可因此通过以下步骤完成：(a)改变与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白；(b)改变编码异源三聚SNF1蛋白激酶亚基的多核苷酸；或(c)改变由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白。更具体地讲，提高含油真核宿主细胞总脂质含量的方法可通过以下方法降低异源三聚SNF1蛋白激酶的活性来完成，所述方法选自：
(a)与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白的减量调节，所述上游调节蛋白是选自Sak1、Tos3和Elm1的激酶；
(b)与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白的增量调节，所述上游调节蛋白是由己糖激酶同工酶2(Hxk2)组成的己糖激酶；
(c)与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白的增量调节，所述上游调节蛋白是葡糖激酶(Glk1)；
(d)与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白的增量调节，所述上游调节蛋白是Reg1-Glc7蛋白-磷酸酶1复合物的蛋白，选自Reg1和Glc7；
(e)编码异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1α-亚基的多核苷酸的减量调节；
(f)编码异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1α-亚基的多核苷酸调节域的增量调节；
(g)无催化活性的Snf1α-亚基的增量调节；
(h)编码异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1β-亚基的多核苷酸的减量调节，所述β-亚基由Gal83组成；
(i)编码异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1γ-亚基的多核苷酸的减量调节；
(j)由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白的增量调节，所述下游蛋白是选自Rme1和Mhy1的锌指蛋白；
(k)由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白的增量调节，所述下游蛋白是微粒体细胞色素b5还原酶(Cbr1)；
(l)由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白的增量调节，所述下游蛋白是葡萄糖转运蛋白(Snf3)；或者
(m)由异源三聚SNF1蛋白激酶通过磷酸化调节的下游蛋白的突变的变体的增量调节，所述下游蛋白是选自乙酰-CoA羧化酶和二酰基甘油酰基转移酶的蛋白，并且其中所述突变的变体不能被异源三聚SNF1蛋白激酶磷酸化。
当含油真核宿主细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)时，可根据上述方法操纵任何以下蛋白：SEQ ID NO：36[YlSak1]、SEQ IDNO：38[YlElm1]、SEQ ID NO：27[YlSnf1]、SEQ ID NO：32[YlGal83]、SEQID NO：34[YlSip2]、SEQ ID NO：30[YlSnf4]、SEQ ID NO：91[YlReg1]、SEQID NO：101[YlHxk2]、SEQ ID NO：103[YlGlk1]、SEQ ID NO：116[YlRme1]、SEQ ID NO：121[YlMhy1]、SEQ ID NO：131[YlCbr1]、SEQ IDNO：144[YlSnf3]、SEQ ID NO：150[YlACC]、SEQ ID NO：182[YlDGAT1]或SEQ ID NO：184[YlDGAT2]。
本文还描述了提高获取自含油真核宿主细胞的微生物油中的PUFA总含量的方法，所述含油真核宿主细胞包含异源三聚SNF1蛋白激酶，所述方法包括：
(a)用编码功能性PUFA生物合成途径的分离多核苷酸转化含油真核宿主细胞，其中异源三聚SNF1蛋白激酶的活性在与非转化含油真核宿主细胞中的异源三聚SNF1蛋白激酶的活性水平进行比较时也降低；
(b)在合适条件下使步骤(a)的转化细胞生长，其中总脂质含量在与获取自具有活性不降低的异源三聚SNF1蛋白激酶的非转化含油真核宿主细胞的总脂质含量进行比较时提高；以及
(c)任选地，从步骤(b)的细胞中回收油或脂质。
优选地，编码功能性PUFA生物合成途径的基因选自Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ4去饱和酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶、C20/22延伸酶和Δ9延伸酶；PUFA是ω-3脂肪酸或ω-6脂肪酸；并且异源三聚SNF1蛋白激酶的活性降低是由于选自下列的修饰：(a)改变与异源三聚SNF1蛋白激酶相关联的上游调节蛋白；(b)改变编码异源三聚SNF1蛋白激酶亚基的多核苷酸；以及(c)改变由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白。
例如，本文所示的方法导致转化的含油解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)宿主细胞相对于未转化的含油解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)宿主细胞具有提高的总脂质含量[TFA％DCW]和提高的EPA产量[EPA％DCW]，未转化的宿主细胞的异源三聚SNF1蛋白激酶活性不降低(通过改变如Sak1、Snf1、Snf4、Gal83、Reg1、Hxk2、Glk1、Rme1、Cbr1或Snf3的表达达到该目的)。
在上述一些方法中，由于异源三聚SNF1蛋白激酶的活性降低，其中转化的含油真核宿主细胞的总脂质含量提高(相对于未转化的宿主细胞)，去饱和的脂肪酸对饱和脂肪酸的比率也提高(相对于未转化的宿主细胞)。
在所有这些上述方法中，减量调节编码异源三聚SNF1蛋白激酶网络内的蛋白的天然基因能够通过在一部分基因内的插入、去除、或定向突变完成，例如在蛋白的N末端部分如Snf1的N末端活化环中，或者在蛋白的C末端部分。作为另外一种选择，减量调节可能导致全基因敲除，或者定向突变可能导致无功能蛋白。在本文所述的优选方法中，导致异源三聚SNF1蛋白激酶活性降低的减量调节通过敲除SNF1、SNF4、GAL83或SIP2基因完成，该过程分别产生snf1Δ、snf4Δ、gal83Δ或sip2Δ细胞。
与之相反，增量调节编码异源三聚SNF1蛋白激酶网络内的蛋白的天然基因能够通过本领域技术人员熟知的方法完成。例如，Reg1、Hxk2、Glk1、Rme1、Mhy1、Cbr1、Snf3、突变体ACC或突变体DGAT的表达能够通过使用较强的启动子(调节型或组成型)引起表达增加、通过移除/去除来自mRNA或表达蛋白的去稳定化序列、或者通过加入稳定序列到mRNA中而在转录水平上提高(美国专利4,910,141)。作为另外一种选择，可将过表达基因的附加拷贝导入重组宿主细胞以提高总脂质含量，这通过在单表达构建体中克隆附加拷贝的基因或通过增加质粒拷贝数将附加拷贝导入宿主细胞或将克隆基因多次整合到基因组中来完成。过表达基因可为含油真核宿主细胞天然具有的或异源的。
本文所述方法能够导致细胞的总脂质含量提高、细胞中不饱和脂肪酸对饱和脂肪酸的比率提高、和/或细胞中的PUFA总含量提高，并且因为在所有真核生物中普遍存在全局调节子SNF1蛋白激酶，所述方法一般是可应用的。然而优选的真核宿主细胞是含油的，即，那些生物趋于以脂质/油的形式贮存它们的能源。
如本文所示，异源三聚SNF1蛋白激酶的活性降低(例如通过敲除α-、β-或γ-亚基异源三聚SNF1蛋白激酶基因、通过敲除Sak1基因、通过过表达Snf1调节结构域、或者通过过表达Hxk2、Glk1、Reg1、Rme1、Cbr1或Snf3)产生含油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的突变体，它在细胞内合成脂质/微生物油的能力提高。这是一个新发现，未在其他生物的研究中得到验证。不希望受任何特定说明或理论的约束，本文假定含油酵母细胞中异源三聚SNF1蛋白激酶活性的降低导致组成型含油，从而使得油的生物合成在整个发酵过程中发生并因此导致细胞内的脂质积聚增加(通常在较短时间内)。此外，可提高总脂质中的PUFA百分比并改变总体去饱和度，这导致细胞与天然SNF1蛋白激酶未发生改变的含油酵母相比，其脂质特征发生变化。
在转化细胞中的组成型含油直接与美国专利7,238,482所述的含油酵母的典型发酵进行对比。通常含油酵母细胞中的高水平PUFA积聚需要一个两阶段过程，因为在生长和脂肪合成/贮藏之间的代谢状态必须是“平衡的”。在该方法中，发酵的第一阶段致力于生产并积聚细胞质，特征在于快速的细胞生长和细胞分裂。在发酵的第二阶段，优选的是在培养物中形成氮限制条件以促进脂质的高水平积聚。该氮限制条件的效应是降低细胞中的AMP有效浓度，从而降低线粒体的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶的活性。当这种情况发生时，柠檬酸将积聚，从而在细胞质中形成丰富的乙酰-CoA并引发脂肪酸合成。因此这一阶段特征在于细胞分裂的终止以及随后的脂肪酸合成和油积聚。
鉴于这些考虑，本文所述的优选方法适用于含油真核宿主细胞如藻类、真菌、卵菌、类眼虫、原生藻菌和酵母，它们包含异源三聚SNF1蛋白激酶的破坏，其中宿主细胞包含的油占干细胞重量的25％。尤其优选地是含油酵母属：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属或油脂酵母属。
可将本文提供的SNF1蛋白激酶的Snf1α-亚基定义为包含以下序列的分离核苷酸分子：
a)编码具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTP比对方法在与选自下列的氨基酸序列进行比较时，该多肽具有至少80％的氨基酸同一性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27；
b)编码具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比对方法在与选自下列的核苷酸序列进行比较时，该核苷酸序列具有至少80％的序列同一性：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26；
c)编码具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条件下与选自下列的核苷酸序列杂交：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26；或者，
d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。
除了本文所述的方法和转化含油真核宿主细胞外，还描述了获取自那些转化细胞的脂质或油。这些脂质和油可限定或被掺入本文所述的产品，它们可用作食品、动物饲料或用于工业应用和/或用作食品或动物饲料的副产品。例如，将非常期望其异源三聚SNF1蛋白激酶已经被操纵以提高脂质积聚的真核细胞以用于生产生物柴油燃料。
本发明包括改变优选宿主细胞中的异源三聚SNF1蛋白激酶。虽然本领域的技术人员可利用多项技术获取此类改变，特定基因的内源活性一般可通过以下技术降低或消除，例如：1)通过插入、取代和/或去除全部或部分靶基因改变所述基因；或2)过表达诱变的异源亚基(即，在包含两个或多个异源亚基的酶中)以降低酶活性，结果导致“显著的负效应”。这些技术在下文中讨论。然而，本领域的技术人员将认识到这些技术在现有文献中已有详细描述，并且不受本文所述的方法、宿主细胞、和产品的限制。本领域的技术人员也将认识到大多数适用的技术使用任何特定的含油酵母。
经由插入、取代和/或缺失的改变：就基因改变而言，为了改变基因功能，将外源DNA片段(通常是选择性标记基因)插入结构基因。将中断盒转化到宿主细胞中导致无功能的破坏基因通过同源重组置换功能性天然基因(参见例如：Hamilton等人，J.Bacteriol.，171：4617-4622(1989)；Balbas等人，Gene，136：211-213(1993)；Gueldener等人，Nucleic Acids Res.，24：2519-2524(1996)；和Smith等人，Methods Mol.Cell.Biol.，5：270-277(1996))。本领域的技术人员将了解基因定向常规方法的许多改良方法，所述方法容许有阳性选择和阴性选择、生成基因敲除、以及将外来DNA序列插入到丝状真菌、藻类、卵菌、类眼虫、原生藻菌、酵母和/或微生物系统的特定基因组位点中。
相反地，基因改变的非特异性方法是使用转座元件或转座子。转座子是随机插入DNA但随后能根据序列进行检索以测定插入位点的基因元件。体内和体外转座技术是已知的，并且涉及转座元件与转座酶的组合使用。当转座元件或转座子与核酸片段在存在转座酶的情况下接触时，转座元件将随机插入核酸片段中。该技术用于随机诱变和基因分离，因为中断基因可基于转座元件的序列进行鉴定。体外转座试剂盒可商购获得，包括Primer Island Transposition Kit，得自Perkin Elmer AppliedBiosystems，Branchburg，NJ，基于酵母的Ty1元件；Genome PrimingSystem，得自New England Biolabs，Beverly，MA，基于细菌转座子Tn7；和EZ::TN转座子插入系统，得自Epicentre Technologies，Madison，WI，基于Tn5细菌转座元件。
显著负效应：当多亚基蛋白的突变亚基与野生型蛋白共表达使得功能性低聚物的装配减少时，显著负抑制最常见(Herskowitz，I.，Nature，329(6136)：219-22(1987))。因此，显著负抑制是其中野生型基因产物的功能因为相同基因产物的共表达突变体而被削弱的一种现象。使用本领域技术人员熟知的方法，能够引起含油酵母天然异源三聚SNF1蛋白激酶的显著负抑制，从而导致脂质积聚与其天然异源三聚SNF1蛋白激酶未遭破坏的含油酵母相比增加。
熟练的技术人员能够使用这些技术以及其他熟知的技术改变本文所述的优选宿主细胞的编码异源三聚SNF1蛋白激酶上游调节蛋白、异源三聚SNF1蛋白激酶亚基、或由异源三聚SNF1蛋白激酶调节的下游蛋白的基因，所述宿主细胞例如哺乳动物系统、植物细胞、丝状真菌、藻类、卵菌、类眼虫、原生藻菌和酵母。例如其他破坏技术包括1)使用有义、反义或iRNA技术；2)使用天然具有[或已经通过突变具有]低活性或无活性的特定基因的宿主细胞；3)过表达诱变的异源亚基(即，在包含两个或多个异源亚基的酶中)，从而因为“显著的负效应”导致活性降低；4)操纵控制蛋白表达的转录和翻译因子；和/或5)操纵控制蛋白表达的信号转导途径。
本领域的技术人员能够识别改变天然异源三聚SNF1蛋白激酶的最佳方法以使脂质积聚与天然异源三聚SNF1蛋白激酶尚未被破坏的真核生物相比增加。
用于制备重组构建体的标准来源的材料如下所述，特别是：1)构建、操纵和分离大分子如DNA分子、质粒等的特定条件和程序；2)生成重组DNA片段和重组表达构建体；和3)克隆的筛选和分离。参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。
一般来讲，存在于构建体中的序列的具体选择取决于期望的表达产物、宿主细胞的性质以及提出的相对于未转化细胞分离转化细胞的手段。技术人员已知基因元件必须存在于质粒载体上以成功地转化、选择并增殖包含嵌合基因的宿主细胞。然而，通常载体或盒含有引导相关基因的转录和翻译的序列、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括控制转录启动的基因(即，启动子)的5′区域、基因编码序列和控制转录终止的DNA片段(即，终止子)的3′区域。最优选的是当两个控制区都来源于来自转化的宿主细胞的基因，尽管它们无需来源于对生产宿主是天然的基因。
用于驱动在期望宿主细胞中的异源基因或部分异源基因表达的转录启动区或启动子有多种，并且为人们所熟知。这些控制区可包含启动子、增强子、静默子、内含子序列、3’UTR和/或5′UTR区域、以及蛋白和/或RNA稳定元件。此类元件的长度和特异性可以不同。事实上，能够引导这些基因在所选宿主细胞中表达的任何启动子(即天然的、合成的或嵌合的启动子)都是适用的，但来自宿主物种的转录和翻译区是尤其有用的。在宿主细胞中的表达能够以诱导型或组成型的方式发生。诱导型表达通过诱导可操作地连接至受关注的SNF1蛋白激酶网络基因的可调控启动子的活性发生，而组成型表达通过利用组成型启动子发生。
可在重组构建体中提供编码转录终止区的3′非编码序列，该序列可以来自从中获取初始区的基因或不同基因的3′区域。大量的终止区是已知的并且当用于与它们源自的属和物种相同和不同的属和物种两者时，其在多种宿主中发挥的功能令人满意。终止区也可以源于优选宿主的多种天然基因。选择终止区通常更多的是从方便的角度出发而不是为了任何特性。
尤其有用的酵母终止区是来源于酵母基因，尤其是糖酵母属、裂殖糖酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属或克鲁维酵母属的终止区。编码γ-干扰素和α-2干扰素的哺乳动物基因的3′区域也已知能在酵母中起作用。3′-区也可以是合成的，因为本领域的技术人员可利用可获得的信息来设计和合成用作转录终止子的3′-区序列。终止区可以是非必需的，但是是高度优选的。
载体除了上述调控元件之外还可包含选择性的和/或可评分的标记。优选地，标记基因是抗生素抗性基因，使得用抗生素处理细胞引起未转化细胞的生长抑制或死亡，但不抑制转化细胞的生长。为了选择酵母转化体，可使用在酵母中发挥功能的任何标记，使之具有对卡那霉素、潮霉素、和氨基配醣物G418的抗性并能够在缺乏尿嘧啶、赖氨酸、组氨酸、或亮氨酸的培养基上生长的标记是尤其有用的。
仅仅将基因(例如编码异源三聚SNF1蛋白激酶网络蛋白的基因)插入克隆载体不确保它能以期望的速率、浓度、量等表达。响应于对高表达率的需要，通过操作许多控制转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和位置、氧限制和从微生物宿主细胞分泌的不同遗传元件，已经建立了许多专用的表达载体。一些操纵特征包括：相关转录启动子和终止子序列的性质，所克隆基因的拷贝数目以及该基因是质粒携带的还是整合进了宿主细胞的基因组中，所合成蛋白质的最终细胞定位，蛋白质在宿主生物内的翻译和正确折叠的效率，所克隆基因的mRNA和蛋白质在宿主细胞内的固有稳定性和所克隆基因中的密码子使用，以使得其频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。这些特征中的每一个可用于本文所述的方法和宿主细胞以降低异源三聚SNF1蛋白激酶的活性(例如通过改变Sak1、Elm1、Tos3、Snf1、Snf4、Gal83、Sip1、Sip2、Reg1、Hxk1、Hxk2、Glk1、Rme1、Mhy1、Cbr1或Snf3的表达)。
在制备包含至少一个嵌合基因(其包含启动子、编码异源三聚SNF1蛋白激酶网络蛋白的开放阅读框[″ORF″]和终止子)的重组构建体后，将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或直接整合到宿主细胞基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或者可以通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。
当两个或更多个基因从独立的复制载体表达时，每个载体可具有不同的选择手段并且应当缺乏与其它构建体的同源性以便维持稳定表达和防止元件在构建体之间重配(reassortment)。可用实验方法确定对调控区、选择手段和所引入的构建体的增殖方法的正确选择，以便所有导入的基因都以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。
包含所关注的基因的构建体可以通过任何标准技术导入宿主细胞中。这些技术包括转化(如醋酸锂转化[Methods in Enzymology，194：186-187(1991)])、基因枪轰击(bolistic impact)、电穿孔、显微注射、真空过滤或将所关注的基因引入宿主细胞中的任何其它方法。
为方便起见，已经通过任何方法被操纵以摄取DNA序列(如表达盒)的宿主细胞在本文中将称为“转化的”或“转化体”或“重组体”。转化的宿主将具有至少一个表达构建体的拷贝，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该基因是整合进基因组内、被扩增还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。
转化宿主细胞能通过选择导入构建体上包含的标记进行鉴定。作为另外一种选择，分离的标记构建体可用期望的构建体进行共转化，该方法与多种将多个DNA分子导入宿主细胞的转化技术一样。
通常转化宿主通过它们在选择培养基上生长的能力进行选择，选择培养基可掺入抗生素或缺乏未转化宿主必需的生长因子，如营养物质或生长因子。导入的标记基因可赋予抗生素抗性，或编码必需的生长因子或酶，从而当在转化宿主中表达时允许在选择培养基上生长。转化宿主的选择也能发生在表达标记蛋白能被直接地或间接地检测出来时。附加的选择技术在美国专利7,238,482和美国专利7,259,255中进行了描述。
无论选择哪种宿主或表达构建体，必须筛选多个转化子以获取显示期望表达水平、调节和模式的菌株。例如，Juretzek等人(Yeast，18：97-113(2001)提出在解脂耶氏酵母中的整合DNA片段的稳定性取决于单个转化子、受体菌株和所用的靶向平台。这种筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白质表达的Western分析、脂质和PUFA产物的表型分析或GC分析来完成。
根据本文方法，多种真核生物适合作为宿主，并且与天然异源三聚SNF1蛋白激酶尚未被改变的真核生物相比，其中所得转基因宿主的异源三聚SNF1蛋白激酶活性降低，并且其中细胞的总脂质含量提高(并且任选地，细胞中总PUFA含量提高和/或细胞中去饱和脂肪酸对饱和脂肪酸的比率提高)。宿主可在多种原料(包括简单或复杂的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、油、甘油和醇类、和/或碳氢化合物)上，在广泛的温度和pH值范围内生长。例如，可获得的宿主可为各种真菌、藻类、卵菌、酵母、原生藻菌和/或类眼虫。非含油生物如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)也可用作宿主细胞，因为这些生物中的异源三聚SNF1蛋白激酶的活性降低可导致脂质大量积聚，将其归类为含油的破坏突变体。
优选的宿主是含油真核生物。这些含油生物天然能够合成并积聚油，其中总油含量可占细胞干重的超过约25％，更优选占细胞干重的超过约30％，而最优选占细胞干重的超过约40％。将多种细菌、藻类、类眼虫、藓、真菌、酵母和原生藻菌天然地归类为含油生物。在这个广泛的宿主组中，特别要关注的是天然产生ω-3/ω-6脂肪酸的那些生物。例如，ARA、EPA和/或DHA经由小环藻属(Cyclotella sp.)、隐甲藻属(Crypthecodinium sp.)、被孢霉属(Mortierella sp.)、菱形藻属(Nitzschiasp.)、腐霉属(Pythium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium sp.)和裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)制备。转化高山被孢霉(M.alpina的方法如Mackenzie等人(Appl.Environ.Microbiol.，66：4655(2000))所述。类似地，用于转化破囊壶菌目微生物(例如破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium))的方法在美国专利7,001,772中公开。在另一个实施方案中，能够在异源三聚SNF1蛋白激酶活性降低之前将非含油生物基因修饰成含油生物，例如酵母如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
在较优选的实施方案中，含油真核宿主细胞是含油酵母。通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。更具体地讲，示例性的油合成酵母包括：圆红冬孢酵母、斯达氏油脂酵母、产油油脂酵母、拉可夫氏假丝酵母、铁红假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、茁芽丝孢酵母、皮状丝孢酵母、胶粘红酵母、牧草红酵母、和解脂耶氏酵母(以前归类为解脂假丝酵母)。最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；并且，在另一个实施方案中，最优选的是命名为ATCC#76982、ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944和/或LGAM S(7)1的解脂耶氏酵母菌株(Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.，82(1)：43-9(2002))。
当使用该特定宿主物种时，通过将线性DNA片段整合到宿主基因组中在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表达基因的优选方法、优选的启动子、终止区、整合基因座和中断、以及优选的选择方法在美国专利公布2006-0094092-A1、美国专利公布2006-0115881-A1、美国专利公布2009-0093543-A1和美国专利公布2006-0110806-A1中提供。还包括用于工程化解脂耶氏酵母中的ARA、EPA和DHA生产的具体教导。
本领域的技术人员将能够使用美国专利公布2006-0094092-A1、美国专利公布2006-0115881-A1、美国专利公布2009-0093543-A1和美国专利公布2006-0110806-A1中引用的教导重组工程化其他宿主细胞用于PUFA生产。
转基因真核宿主细胞在最优化脂质积聚的条件下生长(并且任选地允许最高的和最经济的LC-PUFA生产)。通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物量生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法优化培养基条件。
解脂耶氏酵母通常生长在复合培养基(如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖液体培养基[“YPD”])或缺乏生长所必需的成分并由此强迫选择所需表达盒的确定成分的极限培养基中(如Yeast Nitrogen Base(DIFCOLaboratories，Detroit，MI))。
本文所述方法和宿主细胞的发酵培养基必须包含合适的碳源，例如美国专利7,238,482中提出的碳源。虽然预期利用的碳源可包括多种碳源，优选的碳源是糖、甘油、和/或脂肪酸。最优选的碳源是葡萄糖和/或包含介于10-22个碳之间的脂肪酸。
氮可以由无机源(如(NH4)2SO4)或有机源(如尿素或谷氨酸盐)提供。除了合适的碳源和氮源之外，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合生长并促进脂质产生的酶促途径的其它组分。要特别注意促进脂质和PUFA合成的几种金属离子(如Fe+2、Cu+2、Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2)(Nakahara，T.等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin，eds.第61-97页(1992))。
用于本文所述方法和宿主细胞的优选生长培养基是常规的商业制备培养基，如酵母氮源培养基(Yeast Nitrogen Base，DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。也可以使用其它确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，且适于转基因宿主细胞生长的培养基对微生物学或发酵科学领域的技术人员来说将是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH4.0至pH8.0之间，其中优选将pH5.5至pH7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选为微好氧条件。
在一些方面，主要产品是含油酵母生物质。同样地，从生物质中分离和纯化油可能是不必要的(即，其中全细胞生物质是产品)。然而，某些最终用途和/或产品形式可能需要来自生物质的部分和/或全部分离/纯化的油，以产生部分纯化的生物质、纯化油、和/或纯化LC-PUFA。
包括PUFA在内地脂肪酸可以游离脂肪酸或酯化形式(如甘油酯、磷脂、硫脂或糖脂)存在于宿主生物中，并且可以通过多种本领域熟知的方法从宿主细胞中提取出来。关于酵母脂质的提取技术、质量分析和可接受标准的一篇综述是Z.Jacobs(Critical Reviews in Biotech.，12(5/6)：463-491(1992))的综述。有关下游加工的简述也可由A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.，45：271-312(1997))提供。
一般来讲，用于纯化脂肪酸的手段可包括用有机溶剂萃取(例如，美国专利6,797,303和美国专利5,648,564)、超声处理、超临界流体萃取(如使用二氧化碳)、皂化和物理手段(例如挤压)，或它们的组合。参见美国专利7,238,482。
如下文实施例所示和表4所述，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的转基因PUFA生产菌株中的异源三聚SNF1蛋白激酶活性降低导致总脂质含量相对于其SNF1蛋白激酶活性未改变的非转基因耶氏酵母属菌株增加。
表4汇总来自实施例2-3、5-10、和12-14的数据，使得关于相对于对照菌株总脂质含量的提高百分比[“TFA％DCW”]和EPA产量的提高百分比[“EPA％DCW”]的趋势能被推断出来。当提供单个菌株的多组数据时，这提供了获取自不同生长条件的结果。
尽管实施例间的数据不能进行直接比较，清楚地是转基因含油耶氏酵母属包含活性降低的异源三聚SNF1蛋白激酶，导致其总脂质含量在与异源三聚SNF1蛋白激酶活性不降低的非转基因含油真核宿主细胞的总脂质含量进行比较时提高。异源三聚SNF1蛋白激酶的活性降低能够通过多种方法实现。
除了观察到总脂质含量提高外，包含活性降低的异源三聚SNF1蛋白激酶的转基因含油耶氏酵母属还展示提高的EPA产量(即，总PUFA含量的提高)。上述研究中利用的特定耶氏酵母属细胞中断EPA生产是生产PUFA的宿主细胞内的特定基因工程的结果；具体地讲，EPA是导入的功能性PUFA生物合成途径的期望终产物，而非PUFA中间体或副产物。如果类似的异源三聚SNF1蛋白激酶活性降低发生(根据本文所述方法)，期望例如将在进行工程化以制备ARA作为期望的PUFA产物的菌株中观察到提高的ARA产量[ARA％DCW]，并且将在进行工程化以制备DHA作为期望的PUFA产物的菌株中观察到提高的DHA产量[DHA％DCW]。
当测试16个假定在异源三聚SNF1蛋白激酶网络中起作用的不同基因时，上文表4概述了获得的结果。在这些基因中，仅有Sip2、Elm1、Hxk1、Acs2、Sks1和Scs2不导致转基因宿主细胞中的总脂质含量改善。这不是怀疑本专利申请的前提，其中假定与异源三聚SNF1蛋白激酶活性不降低的非转基因宿主细胞相比，异源三聚SNF1蛋白激酶活性的降低导致总脂质含量提高。与之相反，上文获得的Sip2、Elm1、Hxk1、Acs2、Sks1和Scs2的负结果突出了操纵在调节异源三聚SNF1蛋白激酶活性中起显著作用的基因活性的重要性，所述调节在其中进行特定实验的生长条件下进行。例如，已知Snf1蛋白激酶对不同条件下的细胞调节起到不同作用，它与啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)Tos3协同作用。尤其是当细胞在甘油-乙醇上生长时，tos3Δ降低生长速率、Snf1催化活性、以及在葡萄糖异生基因启动子中Snf1依赖型碳源应答元件[“CSRE”]的活化；与之相比，tos3Δ在突然的葡萄糖缺乏期间不显著影响Snf1催化活性或CSRE功能(Kim，M.-D.等人，Eukaryot Cell.，4(5)：861-866(2005))。
基于本文所述教导和结果，期望将异源三聚SNF1蛋白激酶的活性降低作为提高含油真核生物总脂质含量的一个方法的可行性和商业可用性将得到了解。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例示出了实施本发明的简要方法，但不完全限定其所有可能变型。
一般方法
实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且描述于：1)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2)T.J.Silhavy，M.L.Bennan，和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及3)Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。
适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下面实施例的技术可在Manual of Methods for GeneralBacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray、Ralph N.Costilow、Eugene W.Nester、Willis A.Wood、Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips，Eds)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，第2版，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)的描述中找到。除非另外指明，用于生长和维持微生物细胞的所有试剂、限制性酶和材料得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCOLaboratories(Detroit，MI)、New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。通常于37℃下在Luria Bertani(LB)平板上培养大肠杆菌菌株。
一般的分子克隆根据标准方法(Sambrook等人，同上)来完成。DNA序列是在ABI自动测序仪上采用染料终止剂技术(美国专利5,366,860；EP 272,007)使用载体和插入片段特异性引物的组合来产生的。序列编辑是在Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)中进行的。所有序列在两个方向上覆盖至少两次。除非另外指明，使用DNASTAR软件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)比较本文的基因序列。
缩写含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔每升，“mM”表示毫摩尔每升，“M”表示摩尔每升，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对并且“kB”表示千碱基。
表达盒的命名：
表达盒的结构将通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段而Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。
从解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中扩增基因：
除非另外指明，使用来自菌株ATCC#20362的基因组DNA作模板、以及扩增受关注的期望基因特异性的正向和反向引物，PCR扩增耶氏酵母属基因以从解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中构建超表达质粒pYRH44、pYRH45、pYRH46、pYRH47、pYRH38、pYRH40、pYRH40、pYRH41、pYRH42、pYRH48、pYRH51和pYRH50。反应混合物包括20mM Tris-HCl(pH 8.4)、50mM KCl，1.5mM MgCl2，400μM各种dGTP、dCTP、dATP和dTTP，20μM引物(每种1μl)，1μl基因组DNA，22μl水和2U Taq聚合酶，总反应体积为50μl。将热循环仪的条件设定为94℃1分钟，然后为30个循环的94℃20秒、55℃20秒和72℃2分钟，之后在72℃进行7分钟最后的延伸反应。
解脂耶氏酵母的转化和培养
解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株通常是在根据下面所示配方的数种培养基中于28-30℃下培育。根据标准方法，按需要通过将20g/L琼脂添加到每种液体培养基中来制备琼脂平板。
YPD琼脂培养基(每升)：10g酵母提取物[Difco]，20g Bacto蛋白胨[Difco]；以及20g葡萄糖。
高糖培养基(HGM)(每升)：80葡萄糖，27g/L K2HPO4 6.3g/LKH2PO4。
合成右旋糖培养基(SD)(每升)：6.7g氮基酵母培养基，具有硫酸铵并且无氨基酸；和20g葡萄糖。
如美国专利申请公布2009-0093543-A1所述转化解脂耶氏酵母，该文献以引用方式并入本文。
生成解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y2224和Y4184U
菌株Y2224(来自野生型耶氏酵母属菌株ATCC#20362的Ura3基因的自发突变FOA抗性突变体)如美国专利申请公布US2007-0292924的实施例13所述进行分离，该文献以引用方式并入本文。
菌株Y4184和Y4184U通过表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径相对于总脂质产生EPA，它们如美国专利申请公布US2008-0153141的实施例7所述产生，该文献以引用方式并入本文。开发如图3所示的菌株Y4184U需要构建中间菌株Y2224(同上)、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U、Y4069、Y4084、Y4084U1、Y4127(在2007年11月29日用保藏号ATCC PTA-8802保藏于ATCC)、Y4127U2、Y4158、Y4158U1和Y4184。菌株Y4184能够产生占总脂质约31％的EPA。相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4184的最终基因型如下：unknown1-、unknown 2-、unknown 3-、unknown 4-、unknown 5-、unknown 6-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::Oct、GPM/FBAIN::FmD12S::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20(2个拷贝)、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9e::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBA::EgD9eS::Pex20、YAT1::EgD9eS::Lip2、GPD::EgD9eS::Lip2、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1(2个拷贝)、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、YAT1::RD5S::Oct、FBAIN::EgD5::Aco、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::YlCPT1::Aco、GPD::YlCPT1::Aco(其中FmD12是串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)Δ12去饱和酶基因[美国专利7,504,259]；FmD12S是密码子优化的Δ12去饱和酶基因，来源于串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)；ME3S是经密码子优化的C16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)[美国专利7,470,532]；EgD9e是小眼虫(Euglena gracilis)Δ9延伸酶基因[国际专利申请公布WO 2007/061742]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫(Euglena gracilis)[国际专利申请公布WO2007/061742]；EgD8M是合成突变体Δ8去饱和酶[国际专利申请公布WO 2008/073271]，来源于小眼虫(Euglena gracilis)[美国专利7,256,033]；EgD5是小眼虫(Euglena gracilis)Δ5去饱和酶[美国专利申请公布US2007-0292924-A1]；EgD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶基因，来源于小眼虫(Euglena gracilis)[美国专利申请公布2007-0292924]；RD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶，来源于多甲藻属CCMP626[美国专利申请公布2007-0271632]；PaD17是瓜果腐霉菌(Pythiumaphanidermatum)Δ17去饱和酶[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的Δ17去饱和酶，来源于瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)[美国专利7,556,949]；以及，YlCPT1是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)二酰基甘油磷酸胆碱转移酶基因[国际专利申请公布WO 2006/052870])。
然后通过将EXP1::ME3S::Pex20嵌合基因整合到菌株Y4184的Ura3基因中生成菌株Y4184U，从而产生Ura-表型。
解脂耶氏酵母的脂肪酸分析
对于脂肪酸[“FA”]分析，将细胞通过离心收集并如Bligh，E.G.&Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917(1959))。通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备脂肪酸甲酯[“FAME”](Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys.，276(1)：38-46(1990))并随后将其用配有30m×0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪(GC)进行分析。炉温以3.5℃/分钟从170℃(保持25分钟)升到185℃。
为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母属培养物(1mL)。将甲醇钠(500μl，1％)加入样品中，然后将样品涡旋并摇动60分钟。加入100μl 1M NaCl和400μl己烷后，将样品涡旋并离心。移出上层并如上所述用GC进行分析。
分析在可比较的含油条件下解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中 的总脂质含量和组合物
为了详细分析在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)特定菌株中的总脂质含量和组合物，如下进行烧瓶检测分析法。具体地讲，在25mL SD培养基中在起始OD600nm为～0.1的情况下，在125mL烧瓶中培养48小时。在50mL圆锥管中，以4300rpm离心5分钟收获细胞。弃去上清液，将沉淀物重悬在125mL烧瓶内的25mL HGM中。在30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，在以13,000rpm离心1分钟后使用1mL等分试样进行脂肪酸分析(同上)，并且干燥5mL等分试样用于干细胞重量[“DCW”]测定。
为了测定DCW，通过在4300rpm离心5分钟收获5mL培养物。将沉淀物重悬在10mL无菌水中并如上所述进行再收获。将洗涤后的沉淀物重悬在1mL水中(三次)并转移到预称重的铝盘上。细胞悬浮液在80℃真空炉中干燥过夜。测定细胞重量(g/L)。
当生产EPA时，计算细胞总脂质含量[“TFA％DCW”]，并且将其与列表显示以TFA％重量[“％TFA”]表示的每种脂肪酸浓度和以干细胞重量百分比表示的EPA含量[“EPA％DCW”]的数据综合考虑。来自烧瓶监测分析法的数据将在表中提供，该表概述细胞的干细胞总重量[“DCW”]、细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]、以TFA％重量[“％TFA”]表示的每种脂肪酸浓度和以干细胞重量百分比表示的EPA含量[“EPA％DCW”]。更具体地讲，脂肪酸将被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(LA)、和EPA。
实施例1
鉴定编码异源三聚SNF1蛋白激酶的Snf1
α-亚基的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)基因
在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Snf1(GenBank登录号M13971；SEQ ID NO：2)[“ScSnf1”]的直系同源物通过使用ScSnf1作为查询序列对“酵母项目Genolevures”的公开解脂耶氏酵母蛋白数据库的BLAST搜索进行鉴定(Center for Bioinformatics，LaBRI，TalenceCedex，France)(也参见Dujon，B.等人，Nature，430(6995)：35-44(2004))。
命名为“YlSnf1”的一个蛋白序列经鉴定与ScSnf1具有很大同源性。如下评估解脂耶氏酵母序列SEQ ID NO：27的同一性：通过NationalCenter for Biotechnology Information[“NCBI”]BLASTP 2.2.18(protein-protein Basic Local Alignment Search Tool；Altschul等人，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997)；Altschul等人，FEBS J.，272：5101-5109(2005))，使用其翻译后的序列搜索在BLAST“nr”蛋白数据库中包含的序列的相似性(包括所有非冗余GenBank CDS翻译、来源于Brookhaven Protein Data Bank[“PDB”]的3维结构的序列、在SWISS-PROT蛋白质序列数据库的最终主版本中包括的序列、不包括那些来自WGS项目的环境样本的PIR和PRF)，使用默认参数(预期阈值＝10；字长＝3；评分参数矩阵＝BLOSUM62；缺口成本：存在＝11，延伸＝1)。概述该序列与SEQ ID NO：27的BLASTP比较结果具有最高的相似性，这根据％同一性、％相似性和预期值而被报道。将“％同一性”定义为两个蛋白间的相同氨基酸百分比。“百分比相似性”定义为两种蛋白质之间相同的或保守的氨基酸的百分比。“期望值”用给定分值估计限定匹配数的匹配的统计显著性，该匹配数是在完全偶然地搜索数据库中这种大小片段时所预期的。
因此，使用YlSnf1的全长氨基酸序列(即，SEQ ID NO：27)作为查询序列，预期值0.0(最佳匹配)的BLASTP搜索结果显示它与树干毕赤酵母(Pichia stipitis)CBS 6054 Snf1(GenBank登录号ABN68104)具有68％的同一性和78％的相似性。此外，SEQ ID NO：27与啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)Snf1(GenBank登录号M13971)具有60％的同一性和71％的相似性，预期值0.0。
YlSnf1(SEQ ID NO：27)与ScSnf1(GenBank登录号M13971；SEQID NO：2)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的Snf1同源物(“KlSnf1”；GenBank登录号X87975；SEQ ID NO：17)、白假丝酵母(Candida albicans)Snf1(“CaSnf1”；GenBank登录号L78129；SEQID NO：21)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)Snf1(“CtSnf1”；GenBank登录号AB024535；SEQ ID NO：23)和光滑假丝酵母(Candida glabrata)Snf1(“CgSnf1”；GenBank登录号L78130；SEQ ID NO：25)的比对如图4所示。使用Vector NTI 9.1.0(Invitrogen Corp.)的AlignX程序进行多重比对，默认参数：空位开放罚分＝10；空位延伸罚分＝0.05；空位分离罚分＝8；转换权重＝0)。跨越保守“DFG”和“APE”基序的N末端活化环片段如图上框中所示。
实施例2
去除编码解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y2224中的异源 三聚SNF1蛋白激酶Snf1α-亚基的基因从而提高积聚的总脂质和去饱和 脂质的含量
本实施例描述使用构建体pYRH10(图5B；SEQ ID NO：39)敲除解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y2224中的染色体SNF1基因，从而生成菌株Y2224(snf1Δ)的过程。测定并比较Snf1敲除对积聚脂质的含量的效应。具体地讲，与天然Snf1尚未被敲除的细胞相比，敲除Snf1导致细胞中的总脂质(表示为干细胞总重量百分比[“TFA％DCW”])和去饱和脂质增加。
构建pYRH10：质粒pYRH10来源于质粒pYPS161(图5A)，它包含以下组分：
表5：对质粒pYPS161(SEQ ID NO：40)的描述
具体地讲，解脂耶氏酵母SNF1基因(“YlSNF1”；SEQ ID NO：26)的702bp的5’启动子区域(SEQ ID NO：41)置换pYPS161(SEQ ID NO：40)的AscI/BsiWI片段，YlSNF1基因的719bp的3’终止子区域(SEQ IDNO：42)置换pYPS161的PacI/SphI片段以生成pYRH10(SEQ ID NO：39；图5B)。
生成解脂耶氏酵母基因敲除菌株Y2224(snf1Δ)：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y2224用纯化的SNF1敲除构建体pYRH10(SEQ ID NO：39)的4.0kB AscI/SphI片段进行转化(一般方法)。
为了筛选具有snf1缺失的细胞，使用Taq聚合酶(Invitrogen；Carlsbad，CA)和两组不同的PCR引物。设计第一组PCR引物(即，SNF1Fii[SEQ ID NO：43]和SNF1Rii[SEQ ID NO：44])以扩增完整YlSNF1基因的1.8kB区域，因此snf1缺失突变体，即，snf1Δ，将不产生该条带。设计第二组引物生成仅当SNF1基因被缺失时出现的条带。具体地讲，一个引物(即，3UTR-URA3；SEQ ID NO：45)结合导入的4.0kBAscI/SphI破坏片段的载体序列区域，其他引物(即，3R-SNF1；SEQ IDNO：46)结合在破坏片段的同源区域外的染色体SNF1终止子序列。
使用包含以下组分的反应混合物进行菌落PCR：20mM Tris-HCl(pH8.4)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，400μM各种dGTP、dCTP、dATP和dTTP，2μM各种引物，20μl水和2U Taq聚合酶。扩增如下进行：首先于94℃变性2分钟，然后是35个循环的变性：94℃1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟。最后在72℃进行5分钟的延伸循环，随后在4℃终止反应。
在筛选的24个菌落中，23个菌落具有在染色体的随机位置整合的snf1敲除片段，因此不是snf1Δ突变体；然而，由于存在pYRH10片段，细胞能够在ura-平板上生长。这些随机整合的菌株中的两个，称为2224-1和2224-2，用作脂质生产实验中的对照物(表6，下文)。
其中一个筛选菌落是snf1敲除的菌落。将该解脂耶氏酵母Y2224snf1Δ突变体称为RHY11。
通过定量实时PCR确认解脂耶氏酵母基因敲除菌株Y2224(snf1Δ)：通过对YlSNF1的定量实时PCR对菌株RHY11中的snf1敲除进行进一步确认，使用耶氏酵母属翻译延伸因子基因TEF1基因(GenBank登录号AF054510)作为对照物。
首先，设计分别靶向于YlSNF1基因和对照TEF1基因的实时PCR引物和TaqMan探针，该设计使用Primer Express软件v 2.0(AppliedBiosystems，Foster City，CA)。具体地讲，设计实时PCR引物ef-324F(SEQ ID NO：47)、ef-392R(SEQ ID NO：48)、SNF-734F(SEQID NO：49)和SNF-796R(SEQ ID NO：50)以及TaqMan探针ef-345T(即，5’6-FAMTM-TGCTGGTGGTGTTGGTGAGTT-TAMRATM，其中核苷酸序列如SEQ ID NO：51所示)和SNF-756T(即，5’6-FAMTM-TGCCGGCGCAAAACACCTG-TAMRATM，其中核苷酸序列如EQ ID NO：52所示)。TaqMan荧光探针5’末端具有结合的6-FAMTM荧光报告基因染料，而3’末端包含TAMRATM淬灭剂。所有引物和探针获取自Sigma-Genosys(Woodlands，TX)。
敲除候选DNA通过在50μl水中悬浮1个菌落进行制备。每个样本TEF1和YlSNF1的反应分别重复三次。实时PCR反应包括20皮摩尔各种正向和反向引物(即，ef-324F、ef-392R、SNF-734F和SNF-796R，同上)、5皮摩尔TaqMan探针(即，ef-345T和SNF-756T，同上)、10μlTaqMan Universal PCR Master Mix--No AmpEraseUracil-N-Glycosylase(UNG)(目录号PN 4326614，Applied Biosystems)、1μl菌落悬浮液和8.5μl去RNase/DNase水，每个反应总体积为20μl。反应在ABI PRISMβ7900Sequence Detection System上进行，使用以下条件：首先于95℃变性10分钟，然后是40个循环的变性：95℃15秒，60℃退火1分钟。在每个循环期间通过监控6-FAMTM荧光自动收集实时数据。使用用于数据归一化的TEF1基因阈值循环(CT)值，按照ABI PRIS7900Sequence Detection System使用说明书进行数据分析。
基于这一分析，推断出RHY11是有效的Snf1敲除(即，snf1Δ)，其中该pYRH10构建体(SEQ ID NO：39)已经整合到染色体YlSNF1中。
评估用于脂质生产的解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362和Y2224 (snf1Δ)：为了评估Snf1敲除对细胞中总脂质级分和总脂质含量中的PUFA百分比的效应，解脂耶氏酵母ATCC#20362和Y2224(snf1Δ)菌株RHY11在可比较的含油的条件下生长(一般方法)。
每个菌株DCW、总细胞脂质含量[“TFA％DCW”]和以TFA％重量表示的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]如下表6所示，而平均值用灰色突出显示并用“Ave”指示。
表6：解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362和Y2224(snf1Δ)中的脂 质组成
表6中的结果显示与天然Snf1尚未被敲除的ATCC#20362的脂质含量相比，敲除Y2224(snf1Δ)中的染色体snf1基因将脂质含量[“TFA％DCW”]提高了22％。snf1Δ菌株RHY11中的去饱和脂肪酸(16:1、18:1、18:2)对饱和脂肪酸(16:0、18:0)的比率也提高了大约60％。
评估用于脂质生产的解脂耶氏酵母菌株Y2224(Ura+)和Y2224 (snf1Δ)：为了评估Snf1敲除对细胞总脂质级分和总脂质含量中PUFA百分比的效应，SNF1野生型菌株(该菌株具有整合到染色体随机位点的SNF1敲除片段(即，解脂耶氏酵母Y2224(Ura+)菌株2224-1和2224-2))和解脂耶氏酵母Y2224(snf1Δ)菌株(即，RHY11)在可比较的含油条件下生长；然而，培养物收集方法针对上文用于解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362和Y2224(snf1Δ)进行修改。具体地讲，在SD培养基中生长2天后，在HGM中培养5天，末期将类似的细胞群Y2224(Ura+)和Y2224(snf1Δ)培养物(通过培养物OD600进行判断)转移到HGM中以达到相似的最终DCW(g/L)。
DCW和脂质含量如前文所述进行测定。
每个菌株DCW、细胞总脂质含量[“TFA％DCW”]和以TFA％重量表示的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]如下表7所示，而平均值用灰色突出显示并用“Ave”指示。
表7：解脂耶氏酵母菌株Y2224(Ura+)和Y2224(snf1Δ)中的脂 质组成
类似于上文表6中所述的结果，表7结果显示与天然Snf1尚未被敲除的Y2224(Ura+)相比，敲除Y2224(snf1Δ)中的染色体SNF1基因提高脂质含量[“TFA％DCW”]超过50％。snf1Δ突变体RHY11中的去饱和脂肪酸(16:1、18:1、18:2)对饱和脂肪酸(16:0、18:0)的比率提高了大于60％。
实施例3
去除编码解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)EPA生产菌株Y4184U 中的异源三聚SNF1蛋白激酶Snf1α-亚基的基因提高积聚的总脂质和去 饱和脂质的含量
本实施例描述了使用构建体pYRH18(图6；SEQ ID NO：53)敲除染色体SNF1基因的过程，所述基因来自解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)的EPA生产工程化菌株，具体地讲是菌株Y4184U。用SNF1敲除构建体片段转化解脂耶氏酵母菌株Y4184U产生菌株Y4184U(snf1Δ)。测定并比较Snf1敲除对积聚的脂质含量和EPA生产的效应。具体地讲，敲除SNF1导致与天然Snf1尚未被敲除的细胞相比，总脂质和去饱和脂质增加。
构建体pYRH18：质粒pYRH18来源于质粒pYRH10(实施例2，SEQ ID NO：39)。首先，YlSNF1基因(SEQ ID NO：26)的1448bp 5’启动子区域(SEQ ID NO：54)置换pYRH10的AscI/BsiWI片段，该片段包含YlSNF1的702bp 5’启动子区域，从而生成较长区域的同源物以利于整合。然后，包含侧接loxP重组酶识别位点(从质粒pYLoxU-ECH(SEQ ID NO：58)中切除得到)的耶氏酵母属URA3基因(GenBank登录号AJ306421)的1.6kB片段用于置换pYRH10的BsiWI/SphI片段。这导致产生pYRH18(SEQ ID NO：53；图6)。
生成解脂耶氏酵母基因敲除菌株Y4184U(snf1Δ)：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y4184U用纯化的Snf1敲除构建体pYRH18(SEQ ID NO：53)的3.9kB AscI/SphI片段进行转化(一般方法)。使用如实施例2所述的方法分离菌株Y4184U(snf1Δ)。
在通过菌落PCR筛选的78个菌落中，55个菌落具有在染色体的随机位置整合的SNF1敲除片段，因此不是snf1Δ突变体；然而，由于存在pYRH18片段，细胞能在缺乏尿嘧啶的平板上生长。这些随机整合子中的八个称为Cont-1至Cont-8，它们用作脂质生产实验中的对照物(下文，表8-10和12-16)。
剩余的23个菌落包含在Y4184U菌株背景中的snf1敲除。在这23个snf1Δ突变体中，随机选择11个用于进一步的脂质分析，它们称为RHY43至RHY53。如实施例2所述，通过对YlSNF1基因的定量实时PCR进一步确认snf1Δ菌株中的Snf1敲除。
评估用于脂质生产的解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U (snf1Δ)：为了评估Snf1敲除对总脂质含量和FA组成的效应，选择解脂耶氏酵母Y4184U(Ura+)和Y4184U(snf1Δ)菌株(即，对照菌株Cont-1、Cont-2和Cont-3、和snf1Δ突变株RHY43至RHY53)，如一般方法所述在可比较的含油条件下生长。本文方法仅有的例外是在SD中培养2天后收集1mL细胞培养物，使得能够测量脂质含量。
每个菌株DCW、细胞总脂质含量[“TFA％DCW”]和以TFA％重量表示的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]如下表8所示，而平均值用灰色突出显示并用“Ave”指示。
表8结果显示与天然Snf1尚未被敲除的菌株Y4184U(Ura+)的脂质含量相比，敲除Y4184U(snf1Δ)中的染色体snf1基因在SD培养基中培养2天后将脂质含量[“TFA％DCW”]提高160％，在HGM中培养5天后将脂质含量提高大约61％。与饱和的18:0脂肪酸相比，在SD培养基中培养2天并在HGM中培养5天后snf1Δ突变体中的去饱和18:1和18:2脂肪酸也有显著提高。snf1Δ菌株中的去饱和脂肪酸的提高与实施例2中的结果一致。
上文在HGM中培养5天的末期产生最大平均EPA％TFA的那些Y4184U(snf1Δ)菌株是菌株RHY43、RHY44、RHY46、RHY47和RHY49、以及RHY48，它们如上所述与Cont-3、Cont-4、Cont-5、Cont-6、Cont-7和Cont-8培养物一起再次生长。如前文所述分析培养物，结果如图9所示。还测定了EPA％DCW。
表9结果显示与Y4184U(Ura+)对照菌株相比，Y4184U(snf1Δ)菌株的平均脂质含量[“TFA％DCW”]在SD培养基中培养2天后提高了大约133％，在HGM中培养5天后提高了60％。Y4184U(snf1Δ)菌株也显示了在snf1Δ突变体中的去饱和18-C脂肪酸(18:1、18:2)的显著提高，所述提高在SD培养基中培养2天后和在HGM中培养5天后均发生，这与表8中的结果一致。snf1Δ菌株中去饱和脂肪酸的提高也与实施例2的结果一致。
Y4184U(snf1Δ)菌株的总EPA％TFA可与对照菌株的总EPA％TFA相比较(表8)。然而，由于总脂质含量的显著提高，Y4184U(snf1Δ)菌株的EPA产量[“EPA％DCW”]比对照菌株的EPA产量平均高出50％。
实施例4
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y2224(snf1Δ)和Y4184U (snf1Δ)的总脂质和PUFA生产的时间过程实验
本实施例描述了用Y2224(snf1Δ)菌株(即，来自实施例2的菌株RHY11)和Y4184U(snf1Δ)菌株(即，来自实施例3的菌株RHY46)进行的时间过程实验，该实验用于进一步了解snf1Δ突变体的油合成模式。
在每个时间过程实验的6或7个不同时间点采集每个snf1Δ菌株和合适对照菌株的样本进行脂质分析。因此，最初将以下培养物接种到SD培养基中以获得～0.1的起始OD600，总培养物体积为175mL：解脂耶氏酵母ATCC#20362、Y2224(snf1Δ)菌株RHY11、Y4184U(Ura+)cont-4(实施例3)和Y4184U(snf1Δ)菌株RHY46。然后将每种细胞培养物分成七个等分试样(每个25mL)，置于125mL烧瓶中。在30℃透气培养所有培养物48小时后，如下所述采集第一时间点(第0天)样本(25mL)进行DCW和脂质分析。然后合并剩余总体积的每种150mL培养物，在250mL管中，在4300rpm离心5分钟收获。弃去上清液，将细胞重悬在150mL HGM中并转移到新的六个125mL烧瓶中，每个25mL。然后在30℃将细胞透气培养至多168小时。在每个时间点，使用一个25mL的解脂耶氏酵母ATCC#20362培养物、一个25mL的Y2224(snf1Δ)菌株RHY11培养物、一个25mL的Y4184U(Ura+)Cont-4培养物和一个25mL的Y4184U(snf1Δ)菌株RHY46培养物进行脂质分析。
根据一般方法测定DCW，使用来自5mL SD-或HGM-生长培养物的细胞。
根据一般方法测定脂质含量，使用来自1mL SD-或HGM-生长培养物的细胞。
ATCC#20362和Y2224(snf1Δ)经过7天时间段的DCW、细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]和以TFA％重量表示的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]如下表10所示，而可比较的结果如表11中的Y4184U(Ura+)和Y4184U(snf1Δ)所示。同样地，ATCC#20362和Y2224(snf1Δ)经过每个时间段的结果如图7A所示，Y4184U(Ura+)和Y4184U(snf1Δ)经过每个时间段的结果如图7B所示。
表10：解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362和Y2224(snf1Δ)中脂质 含量和组成的时间进程
表11：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U(snf1Δ)中 的脂质含量和组成的时间进程
表10结果显示与ATCC#20362的对照培养物相比，敲除Y2224背景中的染色体SNF1基因在所有分析时间点提高总脂质含量。然而，最引人注目的是在第0天时的总脂质生产的差异，它对应于在SD培养基中生长2天的末期；具体地讲，Y2224(snf1Δ)菌株比对照菌株脂质含量[“TFA％DCW”]高170％。snf1Δ突变体甚至在SD培养基中存在氮源的情况下出现油积聚，这表明：1)在该突变体中控制细胞脂质积聚的调节机制遭到破坏；以及2)在给定生长条件下细胞是组成型含油的。考虑到在其他酵母、植物、和哺乳动物的中心碳代谢中异源三聚SNF1蛋白激酶的作用，推测SNF1蛋白激酶可能具有脂质积聚调节蛋白的功能。
表11中的结果与表10中的那些结果一致，显示在敲除在Y4184U背景中的染色体SNF1基因导致比对照培养物显著更高的油积聚。在第0天时的脂质积聚对应于在SD培养基中生长2天的末期，它在Y4184U(snf1Δ)中显著提高；此外，在snf1Δ突变体中的油含量在整个时间段中持续较高。这与对照菌株中的油积聚形成对照，其峰值出现在第3天，然后降低，据推测是由于β-氧化和/或脂肪酶的作用。在对照物和snf1Δ培养物之间的EPA％TFA是类似的，但是Y4184U(snf1Δ)的EPA产量[“EPA％DCW”]比Y4184U(Ura+)对照的EPA产量高约两倍。
令人感兴趣的是，snf1Δ的组成型脂质积聚当菌株RHY46(Y4184U(snf1Δ))在复合培养基(即，FM培养基，包含6.70g/L的Yeast nitrogenbase，6.00g KH2PO4，2.00g K2HPO4，1.50g MgSO4*7H2O，20g葡萄糖和5.00g酵母提取物(BBL)；数据未示出)上生长时未被观察到。然而如前文所述，在将细胞转移到高糖培养基[HGM]后，菌株RHY46比对照菌株的脂质含量显著更高。似乎可能存在脂质积聚的另一种抑制组分，它在FM培养基中具有活性，不依赖Snf1。
实施例5
去除编码解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中异源三聚SNF1蛋 白激酶Snf4γ-亚基的基因提高积聚的总脂质含量
本实施例描述鉴定解脂耶氏酵母SNF4基因、合成敲除构建体pYRH28(SEQ ID NO：59)、以及分离。解脂耶氏酵母菌株Y4184U(snf4Δ)的过程。测定并比较染色体SNF4敲除对积聚脂质的含量的效应。具体地讲，与天然SNF4尚未被敲除的细胞相比，敲除SNF4导致总脂质(表示为干细胞总重量百分比(TFA％DCW))增加。
鉴定编码异源三聚SNF1蛋白激酶Snf4
γ-亚基的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)基因：在描述YlSnf1的类似方法中(实施例1)，基因座YALI0C03421g(SEQ ID NO：28)位于公开的解脂耶氏酵母“酵母项目Genolevures”蛋白数据库中，该基因座经鉴定与sp|P12904啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)YGL115w SNF4核调节蛋白高度相似。然而，注解指示1116bp的基因是“解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)假基因”，它缺少“ATG”翻译起始密码子。
对围绕SEQ ID NO：28的上游序列的进一步分析鉴定了一个“ATG”翻译起始密码子的10碱基上游。假定如SEQ ID NO：29所示的1126bp序列在核苷酸碱基25-175包含一个内含子，其翻译蛋白具有如SEQ IDNO：30所示的序列并命名为“YlSnf4”。期望SEQ ID NO：30编码异源三聚SNF1蛋白激酶的Snf4γ-亚基并编码功能蛋白。使用SEQ ID NO：30的全长氨基酸序列作为查询序列，预期值4e-129(最佳匹配)对BLAST“nr”蛋白数据库进行BLASTP搜索，结果显示它与树干毕赤酵母(Pichiastipitis)CBS 6054 Snf4(GenBank登录号XP_001383761)具有69％的同一性和85％的相似性。此外，SEQ ID NO：30与啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)Snf4(GenBank登录号M30470；SEQ IDNO：4)具有65％的同一性和81％的相似性，预期值为6e-116。
构建pYRH28：质粒pYRH28，来源于质粒pYPS161(实施例2；SEQ ID NO：40)，设计用于从解脂耶氏酵母中完全去除SNF4基因座。具体地讲，解脂耶氏酵母SNF4基因(“YlSNF4”；SEQ ID NO：29)的2364bp的5’启动子区域(SEQ ID NO：60)置换pYPS161(SEQ ID NO：40；图5A)的AscI/BsiWI片段，YlSNF4基因的1493bp的3’终止子区域(SEQID NO：61)置换pYPS161的PacI/SphI片段以生成pYRH28(SEQ IDNO：59)。
生成解脂耶氏酵母基因敲除菌株Y4184U(snf4Δ)：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y4184U用纯化的snf4敲除构建体pYRH28(SEQ ID NO：59)的6.5kB AscI/SphI片段进行转化(按照一般方法)。
为了筛选具有snf4缺失的细胞，使用Taq聚合酶(Invitrogen；Carlsbad，CA)和两组不同的PCR引物。设计第一组PCR引物(即，SNF4Fii[SEQ ID NO：62]和SNF4Rii[SEQ ID NO：63])以扩增完整YlSNF4基因的1.0kB区域，因此snf4缺失突变体，即，snf4Δ，将不产生该条带。设计第二组引物生成仅当snf4基因被缺失时出现的条带。具体地讲，一个引物(即3UTR-URA3；SEQ ID NO：45)结合到导入的6.5kBAscI/SphI破坏片段的载体序列区域上，而另一个引物(即，SNF4-conf；SEQ ID NO：64)结合到在破坏片段的同源序列之外染色体SNF4终止子序列上。
如实施例2所述进行菌落PCR。在筛选的30个菌落中，19个菌落具有整合到染色体随机位点上的SNF4敲除片段，因此不是snf4Δ突变体；然而，由于存在pYRH28片段，细胞能够在Ura-平板上生长。筛选出的十一(11)个菌落包含snf4敲除。这些在Y4184U菌株背景中的解脂耶氏酵母snf4Δ突变体称为RHY86至RHY96。
评估用于脂质生产的解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U (snf4Δ)：为了评估snf4Δ敲除对总脂质含量和FA组成的效应，选择解脂耶氏酵母Y4184U(Ufa+)对照菌株Cont-1和Cont-2(实施例3)和Y4184U(snf4Δ)菌株RHY86至RHY96，如一般方法所述在可比较的含油条件下生长。本文方法仅有的例外是在SD中培养2天后通过离心收集1mL细胞培养物，使得能够测量脂质含量，以及处理5mL SD培养物以测定DCW。
每个菌株DCW、细胞总脂质含量[“TFA％DCW”]和以TFA％重量表示的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]如下表12所示，而平均值用灰色突出显示并用“Ave”指示。
表12结果显示与天然Snf4尚未被敲除的菌株Y4184U(Ura+)的脂质含量相比，敲除Y4184U(snf4Δ)中的染色体snf4Δ基因在SD培养基中培养2天后将脂质含量[“TFA％DCW”]提高3倍，在HGM中培养5天后将脂质含量提高44％。虽然Y4184U(snf4Δ)中的平均EPA％TFA比Y4184U(Ura+)对照菌株中的EPA低约14％，snf4Δ菌株中的平均EPA产率[“EPA％DCW”]比其高23％，这主要是由于总脂质含量提高。
上文在HGM中培养5天的末期生产最大平均EPA％TFA的那些Y4184U(snf4Δ)菌株是菌株RHY86、RHY89和RHY93，它们如上所述与Cont-1和Cont-2培养物一起再次生长。为了进行直接比较，还包括Y4184U(snf1Δ)菌株RHY43和RHY46(实施例3)。如前文所述分析培养物，结果如表13所示。
表13：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)、Y4814U(snf1Δ)和 Y4814U(snf4Δ)
表13结果显示与天然SNF1或SNF4尚未被敲除的菌株Y4184U(Ura+)的脂质含量相比，敲除Y4184U中的染色体YlSNF1或YlSNF4基因在SD培养基中培养2天后将脂质含量[“TFA％DCW”]提高大约三倍。在HGM中培养5天后，在两个突变体中的总脂质含量为对照的约150％。
Y4184U(snf4Δ)菌株的总EPA％TFA与对照菌株(即，Cont1和Cont2菌株)的总EPA％TFA是可比较的。由于总脂质含量的显著提高，Y4184U(snf1Δ)和Y4184U(snf4Δ)菌株的EPA产量[“EPA％DCW”]比对照菌株的EPA产量平均更高。
实施例6
去除编码解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中异源三聚SNF1蛋 白激酶β-亚基的基因以提高积聚的总脂质含量
本实施例描述鉴定两个解脂耶氏酵母中的异源三聚SNF1蛋白激酶推定β-亚基、合成敲除构建体pYRH30(SEQ ID NO：65)和pYRH33(SEQID NO：66)、以及分离解脂耶氏酵母菌株Y4184U(gal83Δ)和Y4184U(sip2Δ)的过程。测定并比较染色体敲除对积聚脂质的含量的效应。具体地讲，与天然GAL83尚未被敲除的细胞相比，敲除Gal83导致总脂质(表示为干细胞总重量百分比[“TFA％DCW”])增加。
鉴定编码异源三聚SNF1蛋白激酶β-亚基的解脂耶氏酵母(Yarrowia  lipolytica)基因：在描述YlSnf1的类似方法中(实施例1)，YALI0E13926p(SEQ ID NO：32)和YALI0C00429p(SEQ ID NO：34)位于公开的解脂耶氏酵母“Yeast project Genolevures”蛋白数据库中，其经鉴定与啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)Gal83 β-亚基(GenBank登录号X72893；SEQ ID NO：10)高度相似。
基于BLASTP搜索，基因座YALI0E13926p(SEQ ID NO：32)与来自光滑假丝酵母(Candida glabrata)CBS138(GenBank登录号XP_444928.1)的推定蛋白CAGL0A03696p具有相似性最高，以及52％的同一性和66％的相似性，预期值为2e-66。下一个最佳匹配是GenBank登录号EDN62996.1的啤酒糖酵母Gal83蛋白，具有52％的同一性、63％的相似性和预期值2e-65。
基因座YALI0C00429p(SEQ ID NO：34)与SEQ ID NO：10具有44％的同一性和59％的相似性，预期值为4e-47(最佳匹配)。
根据同源性，啤酒糖酵母Gal83与YALI0E13926p同源性最高，啤酒糖酵母Sip2与YALI0C00429p同源性最高。基于以上分析，将基因座YALI0E13926g(SEQ ID NO：31)命名为“YlGAL83”，而将基因座YALI0C00429g(SEQ ID NO：33)命名为“YlSIP2”。
构建pYRH30和pYRH33：质粒pYRH30和pYRH33都来源于质粒pYPS161(实施例2)并设计用于分别从解脂耶氏酵母中去除YlGAL83和YlSIP2基因座。具体地讲，YlGAL83基因(SEQ ID NO：31)的745bp的5’启动子区域(SEQ ID NO：67)置换pYPS161(SEQ ID NO：40；图5A)的AscI/BsiWI片段，YlGAL83基因的2030bp的3’终止子区域(SEQID NO：68)置换pYPS161的PacI/SphI片段以生成pYRH30(SEQ IDNO：65)。
同样地，YlSIP2基因(SEQ ID NO：33)的2933bp的5’启动子区域(SEQ ID NO：69)置换pYPS161(SEQ ID NO：40；图5A)的AscI/BsiWI片段，YlSIP2基因的1708bp的3’终止子区域(SEQ ID NO：70)置换pYPS161的PacI/SphI片段以生成pYRH33(SEQ ID NO：66)。
生成解脂耶氏酵母敲除菌株Y4184U(gal83Δ)和Y4184U(sip2Δ)：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y4184U单独用YlGAL83敲除构建体pYRH30(SEQ ID NO：65)的纯化5.4kB AscI/SphI片段或YlSIP2敲除构建体pYRH33(SEQ ID NO：66)的7.3kB AscI/SphI片段转化。
为了筛选具有gal83或sip2缺失的细胞，使用耶氏酵母属TEF1基因作为对照，对YlGAL83和YlSIP2进行定量实时PCR(实施例2)。实时PCR引物GAL83-367F(SEQ ID NO：71)、GAL83-430R(SEQ IDNO：72)、SIP2-827F(SEQ ID NO：73)和SIP2-889R(SEQ ID NO：74)，以及TaqMan探针GAL83-388T(即，5’6-FAMTM-AAACTCAACATCACCCATCCCACATC-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO：75所示)和SIP2-847T(即，5’6-FAMTM-CCTATGGATCGCCAGTCAGACGG-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO：76所示)通过Primer Express软件2.0版(AppliedBiosystems，Foster City，CA)进行设计以靶向YlGAL83和YlSIP2基因。引物和探针获取自Sigma-Genosys，Woodlands，TX。
敲除候选DNA通过在50μl水中悬浮1个菌落进行制备。每个样本分别进行三次TEF1、YlSIP2和YlGAL83反应。实时PCR反应的组成与实施例2所述的相同，不同的是正向和反向引物包括GAL83-367F、GAL83-430R、SIP2-827F和SIP2-889R(同上)，而不是SNF-734F和SNF-796R(SEQ ID NO：49和50)，而TaqMan探针包括GAL83-388T和SIP2-847T(同上)，而不是SNF-756T(核苷酸序列如SEQ ID NO：52所示)。如实施例2所述进行扩增、数据收集和数据分析。
在筛选的90个菌落中，仅有2个菌落在Y4184U菌株背景中包含YlGAL83敲除，因此是gal83Δ突变体；这些菌株称为RHY114和RHY115。同样地，在筛选的90个菌落中，仅有3个菌落在Y4184U菌株背景中包含YlSIP2敲除，因此是sip2Δ突变体；这些菌株称为RHY101、RHY102、和RHY109。
剩余的175个菌落具有整合到基因组中的随机位点的GAL83和SIP2敲除片段，因此不是gal83Δ或sip2Δ突变体。
评估解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)、Y4184U(gal83Δ)Y4184U (sip2Δ)用于脂质生产；为了评估并比较gal83和sip2敲除对总脂质含量和FA组成的效应，如一般方法所述，解脂耶氏酵母Y4184U(Ufa+)对照菌株Cont-1和Cont-2(实施例3)、Y4184(snf1Δ)菌株RHY46(实施例3)、Y4184U(gal83Δ)菌株RHY114和RHY115、以及Y4184U(sip2Δ)菌株RHY101、RHY102、和RHY109在可比较的含油条件下生长。
本文方法仅有的例外是每个菌株的培养物在25mL SD培养基中以～0.3的起始OD600(对～0.1的起始OD600)生长，在SD中培养2天后通过离心收集1mL细胞培养物，使得能够测定脂质含量，以及处理5mL SD培养物以测定DCW。
解脂耶氏酵母Y4184U(Ura+)对照菌株、Y4184(snf1Δ)、Y4184U(gal83Δ)和Y4184U(sip2Δ)菌株的DCW、细胞总脂质含量[“TFA％DCW”]和以TFA％重量表示的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]如下表14所示，而平均值以灰色突出显示并用“Ave”指示。
表14结果显示与天然Gal83尚未被敲除的菌株Y4184U(Ura+)的脂质含量相比，敲除Y4184U(gal83Δ)中的染色体GAL83基因在SD培养基中培养2天后将脂质含量[“TFA％DCW”]提高大约2倍，在HGM中培养5天后将脂质含量提高20％。此外，Y4184U(gal83Δ)比Y4184U(Ura+)对照菌株中的平均EPA％TFA略微提高(约10％)，导致EPA产量[“EPA％DCW”]比对照平均提高约37％。
与之相反，Y4184U(sip2Δ)与对照相比不显示脂质积聚的显著效应。Snf1-Sip2复合物可能不涉及解脂耶氏酵母中的脂质积聚。作为另外一种选择，Gal83可能仅仅是生物中异源三聚SNF1蛋白激酶复合物的主要β-亚基。如果后者是真的，Sip2在不同条件下的脂质积聚中起到的作用可比本实施例所测量到的作用更显著。
与Y4184U(snf1Δ)相比，Y4184U(gal83Δ)在生长和含油培养基中显示更少的脂质积聚。
值得注意的是该实验的重复实验在Y4184U(gal83Δ)和Y4184U(sip2Δ)突变体的总脂质含量和EPA产量方面得到几乎相同的结果(数据未示出)。
实施例7
去除解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中异源三聚SNF1蛋白激 酶上游激酶基因以提高积聚的总脂质含量
本实施例描述鉴定两个解脂耶氏酵母中的异源三聚SNF1蛋白激酶上游激酶、合成敲除构建体pYRH31(SEQ ID NO：77)和pYRH54(SEQID NO：78)、以及分离解脂耶氏酵母菌株Y4184U(sak1Δ)和Y4184U(elm1Δ)的过程。测定并比较染色体敲除对积聚脂质的含量的效应。与天然Sak1尚未被敲除的细胞相比，敲除YlSAK1导致总脂质(表示为干细胞总重量百分比[“TFA％DCW”])增加。
鉴定编码异源三聚SNF1蛋白激酶上游激酶的解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica)基因：在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中有三个SNF1蛋白激酶的上游激酶：Sak1、Tos3和Elm1。这三个Snf1上游激酶在磷酸化和活化SNF1蛋白激酶方面作用重复。
在描述YlSnf1的类似方法中(实施例1)，YALI0D08822p(SEQ IDNO：36)和YALI0B17556p(SEQ ID NO：38)位于公开的解脂耶氏酵母“Yeast project Genolevures”蛋白数据库中，其经鉴定为推定的SNF1上游激酶，与啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sak1同源物Sak1、Tos3和Elm1具体同源性。更具体地讲，基于上文所述的BLASTP搜索，由基因座YALI0D08822g(SEQ ID NO：36)编码的蛋白与来自光滑假丝酵母(Candida glabrata)CBS138(GenBank登录号XP_448319.1，本文注释为与sp|P38990啤酒糖酵母YER129w丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶相似，以相似性开始)的推定蛋白CAGL0K02167p相似性最高，具有55％的同一性和67％的相似性，预期值为1e-86(片段#1)并具有32％的同一性和53％的相似性，预期值为4e-05(片段#2)。匹配度居第二位的是棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)ATCC#10895(GenBank登录号NP_983351)的ACL053Cp蛋白，本文注释为啤酒糖酵母YER129W(PAK1)和YGL179C(TOS3)的同源物。SEQ ID NO：36和NP_983351具有52％的同一性、65％的相似性和预期值2e-84(片段#1)，而比对片段#2具有31％的同一性和55％的相似性(预期值0.001)。
YALI0B17556p(SEQ ID NO：38)与来自粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)RS(GenBank登录号XP_001242320)的推定蛋白CIMG_06216具有最大的相似性。蛋白具有44％的同一性，60％的相似性和预期值3e-86。匹配度居第二位的是富克葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)的钙/钙调蛋白依赖型蛋白激酶(GenBank登录号ABW82711)，具有42％的同一性，60％的相似性和预期值6e-83。
因为YALI0D08822p(SEQ ID NO：36)显示与啤酒糖酵母Sak1的最高同源性，而YALI0B17556p(SEQ ID NO：38)与啤酒糖酵母Sak1和Elm1蛋白都具有同源性，将基因座YALI0D08822g(SEQ ID NO：35)命名为“YlSAK1”而将基因座YALI0B17556g(SEQ ID NO：37)命名为“YlELM1”。
构建pYRH31和pYRH54：质粒pYRH31和pYRH54都来源于质粒pYPS161(实施例2)并设计用于分别去除YlELM1和YlSAK1基因座。具体地讲，YlELM1基因(SEQ ID NO：37)的2542bp的5’启动子区域(SEQ ID NO：79)置换pYPS161(SEQ ID NO：40；图5A)的AscI/BsiWI片段，YlELM1基因的1757bp的3’终止子区域(SEQ ID NO：80)置换pYPS161的PacI/SphI片段以生成pYRH31(SEQ ID NO：77)。
同样地，YlSAK1基因(SEQ ID NO：35)的1038bp的5’启动子区域(SEQ ID NO：81)置换pYPS161(SEQ ID NO：40；图5A)的AscI/BsiWI片段，YlSAK1基因的1717bp的3’终止子区域(SEQ ID NO：82)置换pYPS161的PacI/SphI片段以生成pYRH54(SEQ ID NO：78)。
生成解脂耶氏酵母敲除菌株Y4184U(elm1Δ)和Y4184U(sak1Δ)：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y4184U用elm1敲除构建体pYRH31(SEQ ID NO：77)的纯化6.9kB AscI/SphI片段或sak1敲除构建体pYRH54(SEQ ID NO：78)的5.4kB AscI/SphI片段转化。
为了筛选具有elm1或sak1缺失的细胞，使用耶氏酵母属TEF1基因作为对照，对YlELM1和YlSAK1进行定量实时PCR(实施例2)。实时PCR引物ELM1-1406F(SEQ ID NO：83)、ELM1-1467R(SEQ IDNO：84)、SAK1-210F(SEQ ID NO：85)和SAK1-272R(SEQ ID NO：86)，以及TaqMan探针ELM1-1431T(即，5’6-FAMTM-AATTGCGGCCGACAGCGC-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO：87所示)和SAK1-231T(即，5’6-FAMTM-CATCAAGGTCGTGGATCGCCT-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO：88所示)通过Primer Express软件2.0版(AppliedBiosystems，Foster City，CA)进行设计以靶向YlELM1和YlSAK1基因。引物和探针获取自Sigma-Genosys，Woodlands，TX。
敲除候选DNA通过在50μl水中悬浮1个菌落进行制备。每个样本分别进行三次TEF1、YlELM1和YlSAK1反应。实时PCR反应的组成与实施例2所述的相同，不同的是正向和反向引物包括ELM1-1406F、ELM1-1467R、SAK1-210F和SAK1-272R(同上)，而不是SNF-734F和SNF-796R(SEQ ID NO：49和50)，而TaqMan探针包括ELM1-1431T和SAK1-231T(同上)，而不是SNF-756T(核苷酸序列如SEQ ID NO：52所示)。如实施例2所述进行扩增、数据收集和数据分析。
在筛选的90个菌落中，仅有2个菌落在Y4184U菌株背景中包含YlELM1敲除，因此是elm1Δ突变体；这些菌株称为RHY98和RHY99。同样地，在筛选的81个菌落中，仅有11个菌落在Y4184U菌株背景中包含YlSAK1敲除，因此是sak1Δ突变体；将这些菌株命名为RHY141至RHY151。
剩余的158个菌落具有整合到基因组中的随机位点的ELM1和SAK1敲除片段，因此不是elm1Δ或sak1Δ突变体。
评估解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)、Y4184U(elm1Δ)和Y4184U (sak1Δ)用于脂质生产：为了评估并比较elm1和sak1敲除对解脂耶氏酵母总脂质含量和FA组成的效应，如一般方法所述，Y4184U(Ura+)对照菌株Cont-1和Cont-2(实施例3)、Y4184(snf1Δ)菌株RHY46(实施例3)、Y4184U(elm1Δ)菌株RHY98和RHY99、以及Y4184U(sak1Δ)菌株RHY141至RHY151在可比较的含油条件下生长。本文方法仅有的例外是每个菌株的培养物在25mL SD培养基中以～0.3的起始OD600(相对于～0.1的起始OD600)生长，在SD中培养2天后通过离心收集1mL细胞培养物，使得能够测定脂质含量，以及处理5mL SD培养物以测定DCW。
解脂耶氏酵母Y4184U(Ura+)对照菌株、Y4184(snf1Δ)、Y4184U(elm1Δ)和Y4184U(sak1Δ)菌株的DCW、细胞总脂质含量[“TFA％DCW”]和以TFA％重量表示的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]如下表15所示，而平均值以灰色突出显示并用“Ave”指示。
表15：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)、Y4184(snf1Δ)和 Y4184U(elm1Δ)
表16结果显示与天然Gal83未被敲除的对照菌株相比，敲除Y4184U(elm1Δ)中的染色体elm1基因，在SD培养基中培养2天后以及在HGM中培养5天后，脂质含量[“TFA％DCW”]不显示任何显著变化。
表16：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U(sak1Δ)
表16结果显示与天然SAK1尚未被敲除的菌株Y4184U(Ura+)的脂质含量相比，敲除Y4184U中的染色体SAK1基因在SD培养基中培养2天后将脂质含量[“TFA％DCW”]提高2.6倍，在HGM中培养5天后将脂质含量提高38％。此外，Y4184U(sak1Δ)中的平均EPA％TFA与Y4184U(Ura+)对照菌株中的平均EPA％TFA并无显著差异，导致EPA产量[“EPA％DCW”]比对照的EPA产量平均提高约37％。
似乎YlSAK1在测试条件下是SNF1复合物的主要上游激酶。然而，不能排除YlELM1在不同条件下的脂质积聚中起重要作用的可能性。参见例如Kim，M.-D.等人的作品(Eukaryot Cell.，4(5)：861-866(2005))，其中发现啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的tos3Δ仅仅当细胞在甘油-乙醇中生长时影响Snf1的催化活性，但在突然的葡萄糖缺乏期间不影响该活性。
实施例8
超表达编码解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中的异源三聚SNF1 蛋白激酶推定调节亚基Reg1的基因以提高积聚的总脂质
本实施例描述了鉴定解脂耶氏酵母中异源三聚SNF1蛋白激酶推定调节亚基、合成超表达构建体pYRH44(图8A；SEQ ID NO：89)、以及分离解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Reg1的过程。测定并比较YlREG1超表达对脂质积聚水平的效应。与天然Reg1水平尚未被操纵的细胞相比，YlREG1超表达导致总脂质(表示为干细胞总重量百分比[“TFA％DCW”])增加。
鉴定编码异源三聚SNF1蛋白激酶的调节亚基Reg1的解脂耶氏酵 母(Yarrowia lipolytica)基因：在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，Reg1是Glc7蛋白磷酸酶1的调节亚基。Reg1-Glc7复合物通过去磷酸化灭活Snf1调节Snf1活性。在解脂耶氏酵母中有Reg1的同源物，其由基因座YALI0B16808g编码。
更具体地讲，在描述YlSNF1的类似方法中(实施例1)，基因座YALI0B16808p(SEQ ID NO：91)位于公开的解脂耶氏酵母“Yeast projectGenolevures”蛋白数据库中，其经鉴定与啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)Reg1蛋白(GenBank登录号NP_010311；SEQ ID NO：56)高度相似。
基于BLASTP搜索，YALI0B16808p(SEQ ID NO：91)与来自汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)CBS767(GenBank登录号XP_456386)的推定蛋白DEHA0A01485g相似性最高，具有32％的同一性和48％的相似性，预期值4e-51。匹配度居第二位的是GenBank登录号XP_719582的推定蛋白CaO19.9556，具有31％的同一性，48％的相似性和预期值5e-51。在已知功能的蛋白质，最佳匹配度是来自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(GenBank登录号XP_002489718)的1型蛋白磷酸酶的调节亚基，具有32％的同一性和48％的相似性，预期值2e-46。
基于以上分析，假定SEQ ID NO：90编码解脂耶氏酵母磷酸酶复合物的调节亚基并将其命名为“YlREG1”。
构建pYRH44：构建质粒pYRH44以过表达YALI0B16808g基因，该基因编码YlREG1。质粒pYRH44来源于质粒pZuFmEaD5s(图8B；SEQ ID NO：92；如美国专利公布2008-0274521-A1的实施例6所述，该文献以引用方式并入本文)。质粒pZuFmEaD5s包含嵌合FBAINm::EaD5S::PEX20基因，其中FBAINm是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)启动子(美国专利7,202,356)，EaD5S是来源于Euglenaanabaena的合成Δ5去饱和酶并经密码子优化以在耶氏酵母属中表达，其侧接NcoI/NotI限制性酶位点，PEX20终止子序列来自耶氏酵母属PEX20基因(GenBank登录号AF054613)。
YlREG1基因的2.2kB的片段通过PCR进行扩增(一般方法)，所述PCR从解脂耶氏酵母基因组中使用引物REG1-F(SEQ ID NO：93)和REG1-R(SEQ ID NO：94)进行扩增。扩增的基因用PciI/NotI消化并置换pZuFmEaD5s的NcoI/NotI片段以制备pYRH44。因此，pYRH44包含嵌合FBAINm::YlREG1::PEX20基因。
生成解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Reg1：为了过表达解脂耶氏酵母(Yarrowia解脂耶氏酵母)菌株Y4184U中的YlREG1，用BsiWI/PacI酶切pYRH44并分离出5.0kB的片段用于转化(一般方法)，从而产生菌株Y4184U+Reg1。
为了确认YlREG1的超表达，使用耶氏酵母属TEF1基因作为对照对YlREG1进行定量实时PCR(实施例2)。实时PCR引物REG1-1230F(SEQ ID NO：151)和REG1-1296R(SEQ ID NO：152)，以及TaqMan探针REG1-1254T(即，5’6-FAMTM-CGATCTTCGTCCTCGGCATCT-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO：153所示)通过PrimerExpress软件2.0版(AppliedBiosystems，Foster City，CA)进行设计以靶向YlREG1基因。引物和探针获取自Sigma-Genosys，Woodlands，TX。
引物适于利用基因组DNA的一系列稀释和下文详述的PCR条件进行实时定量。对每个引物和探针组进行线性回归，确认效率在90-110％之间。
用Qiagen RNeasyTM试剂盒(Valencia，CA)首先分离RNA以制备cDNA。然后通过用Dnase(目录号PN79254，Qiagen)在室温下处理2μgRNA 15分钟消除残余的基因组DNA，随后在75℃灭活5分钟。使用来自Applied Biosystems(目录号PN 4368813)的High Capacity cDNAReverse Transcription试剂盒，按照制造商推荐的规程从1μg处理RNA中生成cDNA。
实时PCR反应(20μl)在ABI 7900上进行，使用以下试剂：10μl ABITaqMan Universal PCR Master Mix w/o UNG(PN 4326614)，0.2μl各种正向和反向引物(100μM)，0.05μl TaqMan探针(100μM)，2μl 1∶10稀释的cDNA和7.55μl无RNA酶的水。
每个样本分别进行两次TEF1和YlREG1的反应。实时PCR反应包括0.2μl各种正向和反向引物(100μM)(即，ef-324F、ef-392R、REG1-1230F和REG1-1296R，同上)、0.05μl各种TaqMan探针(100μM)(即，ef-345T和REG1-1254T，同上)、10μl TaqMan Universal PCR MasterMix--No AmpEraseUracil-N-Glycosylase(UNG)(目录号PN 4326614，Applied Biosystems)、2μl稀释的cDNA(1∶10)和7.55μl去RNase/DNase水，每个反应总体积为20μl。反应在ABI PRISM7900 SequenceDetection System上进行，使用以下条件：初始变性在95℃进行10分钟，随后是40个循环：95℃变性15秒，60℃退火1分钟。每个样本的负逆转录RNA对照物用TEF1引物组进行以确认不存在基因组DNA。
在每个循环期间通过监控6-FAMTM荧光自动收集实时数据。使用TEF1基因阈值循环(CT)值进行数据归一化以进行数据分析，这按照ABI PRISM7900 Sequence Detection System说明书(参见ABI UserBulletin#2“Relative Quantitation of Gene Expression”)进行。
基于这一分析，推断出Y4184U+Reg1菌株表现出比Y4184U(Ura+)对照菌株高大约2.7倍的YlREG1基因表达水平。
评价解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Reg1；为了评价并比较Reg1在解脂耶氏酵母中超表达对总脂质含量和FA组成的效应，如一般方法所述，菌株Y4184U(Ura+)(对照)和菌株Y4184U+Reg1在可比较的含油条件下生长。本文方法仅有的例外是每个菌株的培养物在25mL SD培养基中以～0.3的起始OD600(相对于～0.1的起始OD600)生长。
解脂耶氏酵母Y4184U(Ura+)对照和Y4184U+Reg1菌株的DCW、细胞总脂质含量[“TFA％DCW”]和以TFA％重量表示的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]如下表17所示，而平均值用灰色突出显示并用“Ave”指示。
表17：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Reg1中的 脂质含量和组成的时间进程
表17结果显示与菌株Y4184U(Ura+)相比，在Y4184U中超表达对应于基因座YALI0B16808g的YlREG1提高脂质含量[“TFA％DCW”]大约67％并提高平均EPA产量[“EPA％DCW”]大约60％。
实施例9
超表达解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中的异源三聚SNF1蛋 白激酶推定葡糖激酶蛋白以提高积聚的总脂质
本实施例描述了鉴定个解脂耶氏酵母中的异源三聚SNF1蛋白激酶的三个推定葡糖激酶、合成超表达构建体pYRH45(SEQ ID NO：95)、pYRH46(SEQ ID NO：96)和pYRH47(SEQ ID NO：97)以提高葡萄糖阻遏信号、以及分离解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Hxk1、Y4184U+Hxk2、和Y4184U+Glk1的过程。测定并比较YlHXK1、YlHXK2和YlGLK1超表达对脂质积聚水平的效应。YlHXK2和YlGLK1超表达导致总脂质(表示为干细胞总重量百分比[“TFA％DCW”])与天然YlHXK2和YlGLK1水平未被操纵的细胞相比增加。
鉴定编码异源三聚SNF1蛋白激酶的推定葡糖激酶蛋白Hxk1、Hxk2 和Glk1的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)基因：在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，在C6位置的葡萄糖磷酸化被两种己糖激酶(即，Hxk1、Hxk2)和一种葡糖激酶(即，Glk1)催化。在这些酶中，Hxk2在细胞内的葡萄糖信号途径中起重要作用。hxk2缺失去阻遏葡萄糖阻遏，正如reg1缺失一样。在啤酒糖酵母hxh2或reg1突变体中，Snf1甚至在存在过多葡萄糖的情况下仍具有活性(即，阻遏条件)。如果葡萄糖信号途径在啤酒糖酵母和解脂耶氏酵母之间是保守的，超表达推定Hxk2同源物将降低Snf1活性，并且细胞将提高脂质积聚。
在解脂耶氏酵母中有三个己糖激酶/葡糖激酶的推定同源物，它们由基因座YALI0B22308g、YALI0E20207g和YALI0E15488g编码。
更具体地讲，在描述YlSnf1的类似方法中(实施例1)，基因座YALI0B22308p(SEQ ID NO：99)、YALI0E20207p(SEQ ID NO：101)和YALI0E15488p(SEQ ID NO：103)位于公开的解脂耶氏酵母“Yeastproject Genolevures”蛋白数据库中，其经鉴定与啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Hxk1(GenBank登录号NP_116711)、Hxk2(GenBank登录号NP_011261；SEQ ID NO：57)、或Glk1(GenBank登录号NP_009890)蛋白高度相似。
基于BLASTP搜索，YALI0B22308p(SEQ ID NO：99)与来自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)(GenBank登录号XP_453567)的HXK_KLULA蛋白相似性最高，具有58％的同一性和74％的相似性，预期值1e-179。相似性居第二位的是GenBank登录号NP_985826的AFR279Cp，具有56％的同一性，72％的相似性和预期值2e-173。
同样地，YALI0E20207p(SEQ ID NO：101)与来自马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)ATCC 18224(GenBank登录号XP_002146347)的推定己糖激酶蛋白相似性最高，具有33％的同一性和49％的相似性，预期值3e-45。相似性居第二位的是GenBank登录号XP_001938486的己糖激酶-1，具有31％的同一性，50％的相似性和预期值4e-45。
YALI0E15488p(SEQ ID NO：103)也与来自烟曲霉(Aspergillusfumigatus)Af293(GenBank登录号XP_747854)的蛋白葡糖激酶GlkA相似性最高，具有45％的同一性和62％的相似性，预期值2e-111。相似性居第二位的是GenBank登录号XP_001257412的推定葡糖激酶GlkA蛋白，具有45％的同一性，61％的相似性和预期值2e-110。
基于以上分析，假定SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100和SEQ IDNO：102编码解脂耶氏酵母中的三个不同己糖激酶/葡糖激酶同源物同工型。更具体地讲，将基因座YALI0B22308g(SEQ ID NO：98)命名为“YlHXK1”，将基因座YALI0E20207g(SEQ ID NO：100)命名为“YlHXK2”，以及将基因座YALI0E15488g(SEQ ID NO：102)命名为“YlGLK1”。
构建pYRH45、pYRH46和pYRH47：构建质粒pYRH45(SEQ IDNO：95)和pYRH46(SEQ ID NO：96)以过表达YALI0B22308g基因座和YALI0E20207g基因座，它们分别编码推定YlHxk1和YlHxk2。质粒pYRH45和pYRH46来源于pZuFmEaD5s(图8B；SEQ ID NO：92；如美国专利公布2008-0274521-A1的实施例6所述，该文献以引用方式并入本文)。
YALI0B22308g的2.0kB的片段通过PCR进行扩增(一般方法)，所述PCR从解脂耶氏酵母基因组中使用引物HXK1-F(SEQ ID NO：104)和HXK1-R(SEQ ID NO：105)进行扩增。同样地，YALI0E20207g的1.4kB片段使用引物HXK2-F(SEQ ID NO：106)和HXK2-R(SEQ ID NO：107)进行扩增。扩增基因用PciI/NotI消化并置换pZuFmEaD5s的NcoI/NotI片段以制备pYRH45和pYRH46。因此，pYRH45包含嵌合FBAINm::YlHXK1::PEX20基因而pYRH46包含嵌合FBAINm::YlHXK2::PEX20基因。
为了过表达YlGLK1，使用引物GLK1-F(SEQ ID NO：108)和GLK1-R(SEQ ID NO：109)扩增编码ORF的1.44kB片段。然后用PciII/NotI酶切这一片段并利用其制备质粒pYRH47(图9)，该质粒包含以下组分：
表18
质粒pYRH47(SEQ ID NO：97)的描述
生成解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Hxk1、Y4184U+Hxk2和 Y4184U+Glk1：为了在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y4184U中过表达YlHXK1、YlHXK2和YlGLK1，pYRH45、pYRH46和pYRH47质粒用BsiWI/PacI酶切并分离出一个4.9kB片段(包含嵌合YlHXK1基因)、一个4.2kB片段(包含嵌合YlHXK2基因)或一个4.2kB片段(包含嵌合YlGLK1基因)，并且将它们用于转化(一般方法)，从而产生菌株Y4184U+Hxk1、Y4184U+Hxk2和Y4184U+Glk1。
为了确认YlHXK1、YlHXK2和YlGLK1的超表达，使用耶氏酵母属TEF1基因作为对照，对YlHXK1、YlHXK2和YlGLK1进行定量实时PCR(实施例2)。实时PCR引物HXK1-802F(SEQ ID NO：154)、HXK1-863R(SEQ ID NO：155)、HXK2-738F(SEQ ID NO：157)、HXK2-799R(SEQ ID NO：158)、GLK1-105F(SEQ ID NO：160)和GLK1-168R(SEQ ID NO：161)，以及TaqMan探针HXK1-823T(即，5’6-FAMTM-CCGAGACCCCCATGGCCG-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO：156所示)、HXK2-759T(即，5’6-FAMTM-ATTTCCAACGCTCCCCTGTGT-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO：159所示)和GLK1-126T(即，5’6-FAMTM-AGAGCAATGCCCATGATTCCCTC-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO：162所示)通过Primer Express 软件2.0版(AppliedBiosystems，Foster City，CA)设计。引物和探针获取自Sigma-Genosys，Woodlands，TX。
如实施例8所示制备候选cDNA。每个样本分别重复进行TEF1、YlHXK1、YlHXK2和YlGLK1的反应。实时PCR反应的组成与实施例8所述的相同，不同的是正向和反向引物包括HXK1-802F、HXK1-863R、HXK2-738F、HXK2-799R、GLK1-105F和GLK1-168R(同上)，而不是REG1-1230F和REG1-1296R(SEQ ID NOs：151和152)，而TaqMan探针包括HXK1-823T、HXK2-759T和GLK1-126T(同上)，而不是REG1-1254T(核苷酸序列如SEQ ID NO：153所示)。如实施例8所述进行扩增、数据收集和数据分析。
基于这一分析，推断出Y4184U+Hkx1、Y4184U+Hkx2和Y4184U+Glk1菌株显示的YlHXK1、YlHXK2和YlGLK1基因表达水平比Y4184U(Ura+)对照菌株分别高大约14.7-、55.5-和3.2-倍。
评估解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)、Y4184U+Hxk1、 Y4184U+Hxk2和Y4184U+Glk1：为了评估解脂耶氏酵母中的葡糖激酶超表达对总脂质含量和FA组成的效应，如一般方法所述，菌株Y4184U(Ura+)(对照)、Y4184U+Hxk1、Y4184U+Hxk2和Y4184U+Glk1在可比较的含油条件下生长。本文方法仅有的例外是每个菌株的培养物在25mL SD培养基中以～0.3的起始OD600(相对～0.1的起始OD600)生长。
Y.菌株解脂耶氏酵母Y4184U(Ura+)对照、Y4184U+Hxk1、Y4184U+Hxk2和Y4184U+Glk1的DCW、细胞总脂质含量[“TFA％DCW”]和以TFA％重量表示的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]如下表19、表20和表21所示，而平均值用灰色突出显示并用“Ave”指示。
表19：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Hkx1中的 脂质含量和组成
表19结果显示在与Y4184U(Ura+)对照菌株进行比较时，在Y4184U中对应于基因座YALI0B22308p的YlHxk1的超表达不引起脂质含量[“TFA％DCW”]或EPA产量[“EPA％DCW”]的任何显著变化。
表20：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Hkx2的脂 质含量和组成
表20结果显示与Y4184U(Ura+)对照菌株相比，在Y4184U中超表达对应于基因座YALI0E20207p的YlHxk2提高脂质含量[“TFA％DCW”]大约26％并提高平均EPA产量[“EPA％DCW”]～20％。
表21：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Glk1中的 脂质含量和组成
表21结果显示与Y4184U(Ura+)对照菌株相比，在Y4184U中超表达对应于基因座YALI0E15488p的YlGlk1提高脂质含量[“TFA％DCW”]大约14％并提高平均EPA产量[“EPA％DCW”]18％。
实施例10
超表达解脂耶氏酵母中的异源三聚SNF1蛋白激酶Snf1α-亚基(或 无催化活性的Snf1)调节结构域增加积聚的总脂质
本实施例描述：1)合成设计用于超表达YlSnf1调节结构域的构建体pYRH38(SEQ ID NO：110)，并且分离解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Snf1RD；和2)合成构建体pYRH40(SEQ ID NO：112)的突变体，该突变体设计用于超表达无催化活性的YlSnf1，并且分离解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Snf1 D171A。测定并比较超表达YlSnf1调节结构域和无催化活性的YlSnf1对脂质积聚水平的效应。在两种情况下，与尚未进行类似操纵的细胞相比，超表达导致总脂质(表示为干细胞总重量百分比[“TFA％DCW”])增加。
操纵异源三聚SNF1蛋白激酶的Snf1α-亚基的实验原理：SNF1蛋白激酶复合物是异源三聚，由催化亚基Snf1、调节亚基Snf4、和靶向(或连接)β-亚基组成。Snf1本身由催化和调节结构域组成。Snf1催化结构域赋予其激酶活性，而其调节结构域与Snf4、Snf1催化结构域、和β-亚基相互作用。在啤酒糖酵母中，氨基末端激酶结构域对应于SEQ IDNO：2的残基1-391，而羧基末端调节结构域对应于残基392-633(Jiang&Carlson，Genes Dev.，10(24)：3105-3115(1996))。
在植物中，SnRK1与酵母直系同源基因Snf1在结构上和功能上类似。超表达Snf1调节结构域显示在去阻遏条件下降低葡萄糖阻遏的减轻程度(Lu等人，The Plant Cell，19(8)：2484-2499(2007))。
超表达Snf1调节结构域可与内源Snf1竞争结合到异源三聚SNF1复合物的β-亚基上，从而降低天然Snf1的活性。同样地，期望超表达无催化活性的全长Snf1将与内源Snf1竞争β-亚基和Snf4。代替去除SNF1基因，超表达Snf1蛋白的突变的变体能够类似snf1缺失对解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中脂质积聚的效应。
构建pYRH38；构建质粒pYRH38用于超表达YlSnf1调节结构域[“YlSnf1RD”]，本文将其定义为对应于YlSNF1基因的+835至+1740区域。具体地讲，编码YlSnf1RD的0.9kB DNA片段通过PCR(一般方法)从解脂耶氏酵母基因组中使用引物SNF1RD-F(SEQ ID NO：111)和SNF1Rii(SEQ ID NO：44)进行扩增。扩增后的基因用PciI/NotI消化并克隆到pYRH47主链的NcoI/NotI位点上(SEQ ID NO：97；图9；如实施例9所述，同上)。
构建pYRH40：为了构建pYRH40(SEQ ID NO：112)，野生型全长YlSNF1基因(SEQ ID NO：26)通过PCR(一般方法)从解脂耶氏酵母基因组中使用引物SNF1Fii(SEQ ID NO：43)和SNF1Rii(SEQ ID NO：44)进行扩增。扩增后的基因用PciI/NotI消化并克隆到pYRH47主链的NcoI/NotI位点上(图9；SEQ ID NO：97；如实施例9所述，同上)。
生成解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Snf1RD和Y4184U+Snf1：为了在菌株Y4184U中过表达YlSnf1RD，pYRH38用SphI/AscI酶切并分离出一个5.9kB的片段用于转化(一般方法)，从而产生菌株Y4184U+Snf1RD。同样酶切pYRH39质粒并分离出一个6.7kB的片段进行转化，从而产生菌株Y4184U+Snf1。
为了确认菌株Y4184U+Snf1RD中的YlSnf1RD和菌株Y4184U+Snf1中的YlSNF1超表达，使用耶氏酵母属TEF1基因作为对照进行定量实时PCR(实施例2)。实时PCR引物SNF-734F(SEQ IDNO：49)、SNF-796R(SEQ ID NO：50)、SNF-1230F(SEQ ID NO：185)和SNF-1293R(SEQ ID NO：186)，以及TaqMan探针SNF-756T(即，5’6-FAMTM-TGCCGGCGCAAAACACCTG-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO：52所示)和SNF-1250T(即，5’6-FAMTM-CCCATGGTCCCGCTACCCTG-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQID NO：187所示)通过Primer Express软件2.0版(AppliedBiosystems，Foster City，CA)进行设计。引物和探针获取自Sigma-Genosys，Woodlands，TX。
如实施例8所述制备候选cDNA。每个样本的TEF1、YlSnf1RD和YlSNF1的反应分别重复三次。实时PCR反应的组成与实施例8所述的相同，不同的是正向和反向引物包括SNF-734F、SNF-796R、SNF-1230F和SNF-1293R(同上)，而不是REG1-1230F和REG1-1296R(SEQ IDNO：151和152)，而TaqMan探针包括SNF-756T和SNF-1250T(同上)，而不是REG1-1254T(核苷酸序列如SEQ ID NO：153所示)。如实施例8所述进行扩增、数据收集和数据分析。
基于这一分析，推断出Y4184U+Snf1和Y4184+Snf1RD菌株分别显示比Y4184U(Ura+)对照菌株中的天然YlSNF1基因表达水平高大约3.8-和4.9-倍的YlSNF1和YlSnf1RD基因表达水平。
生成解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Snf1 D171A：质粒pYRH40然后进行定点诱变，该诱变使用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)和两个引物，YlSnf1D171A-F(SEQ ID NO：113)和YlSnf1D171A-R(SEQID NO：114)。YlSnf1(SEQ ID NO：27)的残基171编码天冬氨酸[Asp或D]，它是涉及ATP结合的高度保守残基(Hanks，S.K.等人，Science，241(4861)：42-52(1988))因此，在残基171将天冬氨酸取代为丙氨酸[Ala或A](即，D171A突变)将导致无催化活性的激酶。
为了表达菌株Y4184U中包含D171A突变的无催化活性的YlSNF1，用SphI和AscI酶切pYRH40并分离6.7KB的片段用于转化(一般方法)，从而产生菌株Y4184U+Snf1 D171A。
评估解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Snf1RD和Y4184U+Snf1 D171A：为了评估并比较解脂耶氏酵母中的Snf1突变体超表达对总脂质含量和FA组成的显著负效应，如一般方法所述，菌株Y4184U(Ura+)(对照)、Y4184U(snf1Δ)菌株RHY46(实施例3)、菌株Y4184U+Snf1RD和菌株Y4184U+Snf1 D171A在可比较的含油条件下生长。本文方法仅有的例外是每个菌株的培养物在25mL SD培养基中以～0.3的起始OD600(相对～0.1的起始OD600)生长。
解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)、Y4184U(snf1Δ)菌株RHY46、菌株Y4184U+Snf1RD和菌株Y4184U+Snf1 D171A的DCW、细胞总脂质含量[“TFA％DCW”]和以TFA％重量表示的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]如下表22和表23所示，而平均值以灰色突出显示并用“Ave”指示。
表22：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)、Y4184U(snf1Δ)和 Y4184U+Snf1RD中的脂质含量和组成
表22结果显示与Y4184U(Ura+)对照菌株相比，在Y4184U中超表达YlSNF1调节结构域[“YlSnf1RD”]提高脂质含量[“TFA％DCW”]大约10％并提高平均EPA产量[“EPA％DCW”]16％。
表23：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Snf1 D171A 中的脂质含量和组成
表23结果显示与Y4184U(Ura+)对照菌株相比，在Y4184U中超表达无催化活性的YlSnf1突变体[“YlSnf1 D171”]提高脂质含量[“TFA％DCW”]大约13％并提高平均EPA产量[“EPA％DCW”]21％。
实施例11
通过微阵列分析描述SNF1蛋白激酶网络
本实施例描述使用微阵列分析深入了解菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U(snf1Δ)基因组范围内的基因表达特征。发现与在对照菌株中的那些基因相比，涉及脂质代谢的许多基因在Y4184U(snf1Δ)菌株中增量调节。基因功能聚类分析清楚地表明Y4184U(snf1Δ)菌株中差异表达的基因在脂质代谢相关的功能中高度富集。这表明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Snf1是脂质代谢基因表达的关键调节子。
样本制备和微阵列分析选择：Y4184U(snf1Δ)菌株RHY43、RHY46和RHY47(实施例3)作为生物平行测定。同样地，菌株Y4184U(Ura+)Cont-1、Cont-2、和Cont-3具有整合到染色体中随机位点上的Snf1敲除片段，因此不是snf1Δ突变体(实施例3)，将它们用作对照。
为了制备RNA样本，细胞在SD培养基上生长，起始培养物体积为25mL，起始OD600介于0.05和0.10之间。细胞在30℃下生长至OD6002.0。通过在15mL离心管中以约2,000×g离心2分钟收获10mL来自每种培养物的等分试样。弃去液体培养基，将每种细胞沉淀物立即冷冻在液氮中，贮藏在-80℃。
使用TriozolTM试剂(Sigma，St.Louis，MO)从细胞培养物中制备总RNA。按照制造商的说明书，用0.5mm玻璃小珠和微型珠粒打浆机8(Bartlesville，OK)以最高速运行3.5分钟破碎细胞。然后用QiagenRNeasyTM试剂盒纯化提取的总RNA。
将RNA样本送往Roche NimbleGen(Madison，WI)，基于它们的专有Maskless Array Synthesizer技术合成cDNA并杂交到微阵列芯片上。数据采集也通过Roche NimbleGen进行。
将来自每个阵列的数据载入Agilent Gene Spring GX 10(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)。使用定量分位数归一化法将数据归一化。进行不同方差的Student t检验以鉴定其表达水平在snf1Δ突变样本和对照样本之间显著改变的基因。使用由等于或小于0.05的p值阈值和1.5-或2-倍改变的临界值(cutoff)组成的双标准鉴定snf1Δ突变体样本中表达水平显著改变的基因。还使用0.05的p值临界值(cutoff)制备延伸基因组用于基因功能聚类[“GO”]富集分析(下文)(表24)。
在异源三聚SNF1蛋白激酶控制下的基因表达：微阵列分析结果显示在snf1Δ突变体菌株RHY43、RHY46和RHY47中差异表达的基因相对于对照菌株Y4184U(Ura+)Cont-1、Cont-2和Cont-3中的基因在脂肪酸代谢和有机酸分解代谢的生物过程中显著富集(表24)。
表24：Snf1Δ突变体菌株中差异表达基因的生物过程的基因功能聚 类分析
  P值   GO术语
  4.08E-06   脂肪酸代谢
  0.0002084   有机酸分解代谢
  0.0002084   脂肪酸分解代谢
  0.0002084   羧酸分解代谢
  0.001676   细胞脂质分解代谢
  0.001676   脂质分解代谢
  0.005717   细胞分解代谢
  0.006687   细胞脂质代谢
  0.007202   细胞高分子分解代谢
  0.008187   脱腺苷酰依赖型脱帽
  0.008779   脂质代谢
  0.01214   分解代谢
  0.01331   磷酸肌醇磷酸化
  0.01331   脂质磷酸化
  0.01678   高分子分解代谢
在snf1Δ菌株中的表达水平显示比对照菌株高1.5倍的那些基因在表25中显示。
因为表25中的基因表达水平在snf1Δ菌株中的改变最显著，推断出这些基因的功能受异源三聚SNF1蛋白激酶网络直接控制或间接控制。此外，因为snf1Δ突变体表现出脂质积聚提高(与对照菌株相比)的表型[实施例2-10]，显示在snf1Δ菌株中的表达提高的其他基因是合适的候选基因，它们当过表达时同样能够导致脂质积聚增加。用可比较的方法，显示在snf1Δ菌株中的表达降低的那些基因是用于减量调节或完全基因敲除的合适候选基因，它们能够导致脂质积聚减少。
实施例12
在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中超表达推定锌指蛋白 Rme1，经由微阵列分析进行鉴定提高积聚的总脂质
编码推定锌指蛋白的RME1基因在snf1Δ菌株中比在对照菌株中增量调节1.54倍(实施例11，表25)。本实施例描述合成超表达构建体pYRH49(SEQ ID NO：117)、分离解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Rme1的过程。测定并比较YlRME1超表达对脂质积聚水平的效应。与天然Rme1水平尚未被操纵的细胞相比，YlRME1超表达导致总脂质(表示为干细胞总重量百分比[“TFA％DCW”])增加。
操纵推定锌指蛋白Rme1的实验原理；基于BLASTP搜索，由基因座YALI0E19965g编码的耶氏酵母属蛋白与涉及巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(GenBank登录号XP_002490092)减数分裂控制的锌指蛋白同源性最高，具有38％的同一性和50％的相似性，预期值1e-16。
啤酒糖酵母Rme1(GenBank登录号NP_011558)是锌指蛋白，其功能是作为减数分裂激活因子IME1的转录阻遏蛋白(Covitz、P.A.、和Mitchell，A.P.，Genes Dev.，7：1598-1608(1993))。更具体地讲，YALI0E19965p和GenBank登录号NP_011558具有35％的同一性和48％的相似性，预期值2.0e-12。这两个蛋白间的同源区域最紧密地围绕该锌指结构域，虽然已知锌指转录因子通常与这些结构域的外围区域同源性不高。基因座YALI0E19965p包含三个潜在的锌指[Cys2His2]，它们位于SEQ ID NO：116的氨基酸残基258-282、291-317和324-345，因此认为它们是命名为“YlRme1”的推定锌指蛋白。不确定是否YlRme1是啤酒糖酵母Rme1的功能同源物或是否YlRme1与其锌指结构域具有序列同源性。
因为许多锌指蛋白是涉及基因表达调节的转录因子，检查YlRme1超表达对总脂质的效应是有意义的。
构建pYRH49：构建质粒pYRH49以过表达YlRME1(SEQ IDNO：115)。质粒pYRH49来源于质粒pZuFmEaD5s(图8B；SEQ ID NO：92；如美国专利公布2008-0274521-A1的实施例6所述，该文献以引用方式并入本文)。
YlRME1基因的1.2kB的片段通过PCR进行扩增(一般方法)，所述PCR从解脂耶氏酵母基因组中使用引物RME1-F(SEQ ID NO：118)和RME1-R(SEQ ID NO：119)进行扩增。扩增的基因用NcoI/NotI消化并置换pZuFmEaD5s的NcoI/NotI片段以制备pYRH49。因此，pYRH49包含嵌合FBAINm::YlRME1::PEX20基因。
生成解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Rme1：为了过表达解脂耶氏酵母(Yarrowia解脂耶氏酵母)菌株Y4184U中的YlRME1，用BsiWI/PacI/HindIII酶切pYRH49并分离出4.0kB的片段用于转化(一般方法)，从而产生菌株Y4184U+Rme1。
为了筛选超表达YlRME1的细胞，使用耶氏酵母属TEF1基因作为对照对YlRME1进行定量实时PCR(实施例2)。实时PCR引物RME1-853F(SEQ ID NO：163)和RME1-919R(SEQ ID NO：164)，以及TaqMan探针RME1-881T(即，5’6-FAMTM-CTGCGTGTGGTCCCTGATCG-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQID NO：165所示)通过Primer Express软件2.0版(AppliedBiosystems，Foster City，CA)进行设计。引物和探针获取自Sigma-Genosys，Woodlands，TX。
如实施例8所示制备候选cDNA。每个样本分别重复进行TEF1和YlRME1的反应。实时PCR反应的组成与实施例8所述的相同，不同的是正向和反向引物包括RME1-853F和RME1-919R(同上)，而不是REG1-1230F和REG1-1296R(SEQ ID NO：151和152)，而TaqMan探针包括RME1-881T(同上)，而不是REG1-1254T(核苷酸序列如SEQID NO：153所示)。如实施例8所述进行扩增、数据收集和数据分析。
基于这一分析，推断出Y4184U+Rme1菌株表现出比Y4184U(Ura+)对照菌株高大约2.7倍的YlRME1基因表达水平。
评价解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Rme1：为了评价并比较YlRme1在解脂耶氏酵母中超表达对总脂质含量和FA组成的效应，如一般方法所述，菌株Y4184U(Ura+)(对照)和菌株Y4184U+Rme1在可比较的含油条件下生长。本文方法仅有的例外是每个菌株的培养物在25mL SD培养基中以～0.3的起始OD600(相对～0.1的起始OD600)生长。
解脂耶氏酵母Y4184U(Ura+)对照和Y4184U+Rme1菌株的DCW、总细胞脂质含量[“TFA％DCW”]和以TFA％重量表示的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]如下表26所示，而平均值用灰色突出显示并用“Ave”指示。
表26：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Rme1中的 脂质含量和组成
表26结果显示与Y4184U(Ura+)对照菌株相比，在Y4184U中对应于基因座YALI0E19965p超表达推定锌指蛋白YlRme1将脂质含量[“TFA％DCW”]提高大约24％并将平均EPA产量[“EPA％DCW”]提高大约22％。
基于上文显示的积极结果，其中超表达YlRME1—与对照菌株相比它在snf1Δ菌株中增量调节1.54倍---增加脂质积聚，这为实施例11示出的假说提供了证据。该假说具体地讲提出如表25所示的基因显示在snf1Δ菌株中相对于对照菌株转录水平提高，可将过表达这些基因作为提高细胞中脂质积聚的一个手段。例如，蛋白Mhy1(基因座YALI0B21582p；SEQ ID NO：121)是另一种Cys2His2-型锌指蛋白，它能用类似于本文所述的用于YlRme1的方法容易地超表达，并且人们将期望看到细胞中的脂质积聚提高(并且可能看到EPA产量提高)。
实施例13
在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中超表达Asc2 Sks1、Cbr1 和Scs2同源物，经由微阵列分析进行鉴定
ASC2、SKS1、和CBR1基因在snf1Δ菌株中分别比在对照菌株中增量调节1.36-、1.38-、和1.34倍(实施例11，表25)。同样地，认为Scs2调节的蛋白分别增量调节2.55-和3.07-倍。本实施例描述合成超表达构建体pYRH41(SEQ ID NO：122)、pYRH42(SEQ ID NO：123)、pYRH48(SEQ ID NO：124)和pYRH51(SEQ ID NO：125)、以及分离解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Asc2、Y4184U+Sks1、Y4184U+Cbr1和Y4184U+Scs2的过程。测定并比较YlAsc2、YlSks1、YlCbr1和YlScs2超表达对脂质积聚水平的效应。与天然YlAsc2、YlSks1、YlCbr1和YlScs2水平尚未被操纵的细胞相比，超表达基因不导致总脂质(表示为干细胞总重量百分比[“TFA％DCW”])增加。
操纵Asc2、Sks1、Cbr1和Scs2的实验原理：与它们在对照菌株中的表达相比，在snf1Δ菌株中小于70个基因的差异表达超过1.5-倍(实施例11，表25)。假如认为基因的表达提高倍数为1.3或更高，则基因数提高到大约200。本实施例在解脂耶氏酵母菌株Y4184U中超表达这些蛋白中的一些以评估该值。
如实施例11的表25所述，在snf1Δ菌株中将基因座YALI0F05962g的表达提高1.36-倍。本文将该ORF命名为YlASC2(SEQ ID NO：126)，它编码乙酰-CoA合成酶[E.C.6.2.1.1]，该酶能够催化以下反应： 虽然在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中有乙酰-CoA合成酶的两个同工型(即，Acs1[GenBank登录号NP_009347]和Acs2[GenBank登录号NP_013254])，但在解脂耶氏酵母中存在乙酰-CoA合成酶的单个基因。
同样地，在snf1Δ菌株中的基因座YALI0B08558g的表达提高了1.38-倍。本文命名为YlSKS1(SEQ ID NO：128)的这个ORF编码推定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其与啤酒糖酵母中的SKS1(GenBank登录号NP_015299)具有同源性。已知啤酒糖酵母SKS1涉及不依赖SNF3调节途径适应低浓度葡萄糖(Yang，Z.和Bisson，L.F.，Yeast，12(14)：1407-1419(1996)；Vagnoli，P.和Bisson，L.F.，Yeast 14(4)：359-369(1998))。在snf1Δ菌株增量调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶中，基因座YALI0B08558p的表达提高最多。
最后，在snf1Δ菌株中的基因座YALI0D04983g的表达提高了1.34-倍。本文命名为YlCBR1(SEQ ID NO：130)的这个ORF编码微粒体细胞色素b5还原酶[E.C.1.6.2.2]，并且期望其在脂肪酸去饱和中起作用。
除了如SEQ ID NOs：126、128和130所述的ORF之外，还选择本文命名为YlSCS2(SEQ ID NO：132)的基因座YALI0D05291g包含在下文的超表达实验中。具体地讲，ALK1(基因座YALI0E25982g[GenBank登录号XM_504406])和ALK2(基因座YALI0F01320g[GenBank登录号XM_504857])是snf1Δ细胞中最强的诱导基因(即，分别为2.55-和3.07-倍)。解脂耶氏酵母ALK1和ALK2的转录控制系统类似于啤酒糖酵母INO1基因(Endoh-Yamagami，S.，Eukaryot.Cell，6：734-743(2007))的转录控制系统，并且啤酒糖酵母SCS2基因在该调节中起重要作用(Loewen，C.J.R.等人，Science，304(5677)：1644-1647(2004))。
构建质粒pYRH41、pYRH42、pYRH48和pYRH51；构建质粒pYRH41、pYRH42、pYRH48、和pYRH51以分别过表达YlAsc2(SEQID NO：127)、YlScs2(SEQ ID NO：133)、YlCbr1(SEQ ID NO：131)和YlSks1(SEQ ID NO129)。这些质粒都来源于质粒pZuFmEaD5s(图8B；SEQ ID NO：92；如美国专利公布2008-0274521-A1的实施例6所述，该文献以引用方式并入本文)。
具体地讲，YlASC2基因的2.0kB片段通过PCR进行扩增(一般方法)，所述PCR从解脂耶氏酵母基因组中使用引物ASC2-F(SEQ IDNO：134)和ASC2-R(SEQ ID NO：135)进行扩增。YlSCS2基因的1.7kB片段通过PCR进行类似扩增，所述PCR从解脂耶氏酵母基因组中使用引物SCS2-F(SEQ ID NO：136)和SCS2-R(SEQ ID NO：137)进行扩增。YlCBR1基因的0.9kB片段通过PCR进行扩增，所述PCR从解脂耶氏酵母基因组中使用引物CBR1-F(SEQ ID NO：138)和CBR1-R(SEQ IDNO：139)进行扩增。以及，YlSKS1基因的1.3kB片段通过PCR进行扩增，所述PCR从解脂耶氏酵母基因组中使用引物SKS1-F(SEQ IDNO：140)和SKS1-R(SEQ ID NO：141)进行扩增。每个扩增基因用PciI/NotI或NcoI/NotI消化，然后用于置换pZuFmEaD5s的NcoI/NotI片段以分别制备pYRH41、pYRH42、pYRH48和pYRH51。因此，每个新构建的质粒包含嵌合基因，其表达由耶氏酵母属FBAINm启动子驱动。
生成解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Asc2、Y4184U+Sks1、 Y4184U+Cbr1和Y4184U+Scs2；为了在菌株Y4184U中过表达YlASC2、YlSKS1、YlCBR1和YlSCS2，每个质粒用BsiWI/PacI(YlASC2、YlSKS1和YlCBR1)或HindIII/PacI(YlSCS2)消化并分离合适的片段用于转化(一般方法)，从而产生菌株Y4184U+Asc2、Y4184U+Sks1、Y4184U+Cbr1和Y4184U+Scs2。
为了筛选超表达YlASC2、YlSKS1、YlCBR1和YlSCS2的细胞，使用耶氏酵母属TEF1作为对照，对YlASC2、YlSKS1、YlCBR1和YlSCS2进行定量实时PCR(实施例2)。实时PCR引物ACS2-YL-1527F(SEQID NO：166)、ACS2-YL-1598R(SEQ ID NO：167)、SKS1-784F(SEQ IDNO：169)、SKS1-846R(SEQ ID NO：170)、CBR1-461F(SEQ ID NO：172)、CBR1-527R(SEQ ID NO：173)、SCS2-310F(SEQ ID NO：175)和SCS2-371R(SEQ ID NO：176)，以及TaqMan探针ACS2-YL-1548T(即，5’6-FAMTM-CTGGATCCGAGGCCGAGTCGAC-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO：168所示)、SKS1-806T(即，5’6-FAMTM-TGCCGGCATTCTCAACCGCA-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQID NO：171所示)，CBR1-482T(即，5’6-FAMTM-TGGAGGAACCGGCATCACCCC-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO：174所示)和SCS2-328T(即，5’6-FAMTM-CCAAGTCCGTGCCCATCACCA-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO：177所示)通过Primer Express软件2.0版(AppliedBiosystems，Foster City，CA)进行设计。引物和探针获取自Sigma-Genosys，Woodlands，TX。
如实施例8所述制备候选cDNA。每个样本分别重复进行TEF1、YlASC2、YlSKS1、YlCBR1和YlSCS2的反应。实时PCR反应的组成与实施例8中所述的组成相同，不同的是正向和反向引物包括ACS2-YL-1527F、ACS2-YL-1598R、SKS1-784F、SKS1-846R、CBR1-461F、CBR1-527R、SCS2-310F和SCS2-371R(同上)，而不是REG1-1230F和REG1-1296R(SEQ ID NO：151和152)，而TaqMan探针包括ACS2-YL-1548T、SKS1-806T、CBR1-482T和SCS2-328T(同上)，而不是REG1-1254T(核苷酸序列如SEQ ID NO：153所示)。如实施例8所述进行扩增、数据收集和数据分析。
基于这一分析，推断出Y4184U+Asc2、Y4184U+Sks1、Y4184U+Cbr1和Y4184U+Scs2菌株与Y4184U(Ura+)对照菌株相比，显示YlASC2、YlSKS1、YlCBR1和YlSCS2基因的表达水平分别提高大约2.7-、1.3-、4.6-和3.1-倍。
评估解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)、Y4184U+Asc2、 Y4184U+Sks1、Y4184U+Cbr1和Y4184U+Scs2：为了评估并比较解脂耶氏酵母中Asc2，Scs2、Cbr1和Sks1超表达对总脂质含量和FA组成的效应，如一般方法所述，菌株Y4184U(Ura+)(对照)和菌株Y4184U+Asc2、Y4184U+Sks1、Y4184U+Cbr1和Y4184U+Scs2在可比较的含油条件下生长。本文方法仅有的例外是每个菌株的培养物在25mL SD培养基中以～0.3的起始OD600(对～0.1的起始OD600)生长。
解脂耶氏酵母Y4184U(Ura+)对照菌株、Y4184U+Asc2、Y4184U+Sks1、Y4184U+Cbr1和Y4184U+Scs2菌株的DCW、细胞总脂质含量[“TFA％DCW”]和以TFA％重量表示的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]如下表27、表28、表29和表30所示，而平均值以灰色突出显示并用“Ave”指示。
表27：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Acs2中的 脂质含量和组成
表28：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Sks1中的 脂质含量和组成
表29：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Cbr1中的 脂质含量和组成
表30：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Scs2中的脂 质含量和组成
表27、28和30的结果显示与Y4184U(Ura+)对照菌株的脂质含量相比，超表达Y4184U中的YlAsc2(对应于基因座YALI0F05962g)、YlSks1(对应于基因座YALI0B08558p)和YlScs2(对应于基因座YALI0D05291g)不导致脂质含量[“TFA％DCW”]提高。
与之相反，与Y4184U(Ura+)对照菌株相比，在Y4184U中超表达对应于基因座YALI0D04983g的YlCbr1提高脂质含量[“TFA％DCW”]大约13％并提高平均EPA产量[“EPA％DCW”]大约15％。
实施例14
在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中超表达葡萄糖转运蛋白 Snf3，经由微阵列分析进行鉴定提高积聚的总脂质水平
编码推定葡萄糖转运蛋白的SNF3基因在snf1Δ菌株中比在对照菌株中增量调节1.3倍(实施例11，表25)。本实施例描述合成超表达构建体pYRH50(SEQ ID NO：142)、分离解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Snf3的过程。测定并比较YlSnf3超表达对脂质积聚水平的效应。与天然Snf3水平尚未被操纵的细胞相比，YlSNF3超表达导致总脂质(表示为干细胞总重量百分比[“TFA％DCW”])增加。
操纵葡萄糖转运蛋白Snf3的实验原理：如实施例11的表25所述，snf1Δ菌株中的基因座YALI0C06424g(SEQ ID NO：143)表达提高1.3-倍。基于BLASTP搜索，由基因座YALI0C06424g编码的耶氏酵母属蛋白与啤酒糖酵母中的Snf3蛋白(GenBank登录号NP_010087)同源性最高(即，蛋白具有46％的同一性和67％的相似性，预期值5e-130)。因此本文将YALI0C06424g ORF命名为YlSNF3。
啤酒糖酵母Snf3[ScSnf3]是血浆膜蛋白，其功能是作为葡萄糖传感器(S.等人，EMBO J.，17：2566-2573(1998))，虽然该蛋白缺乏转运葡萄糖的能力(尽管与葡萄糖转运蛋白具有显著同源性)。ScSnf3不像其他葡萄糖转运蛋白，它包含具有341个氨基酸的长C末端尾，在细胞质中对葡萄糖感应起重要作用(S.等人，同上)。
虽然清楚地知道YlSnf3不具有与ScSnf3对应的C末端尾，但YlSnf3编码葡萄糖转运蛋白是可能的。因此，下文检查YlSnf3超表达对总脂质的效应。
构建pYRH50：构建质粒pYRH50以过表达YlSnf3(SEQ IDNO：144)。质粒pYRH50来源于质粒pZuFmEaD5s(图8B；SEQ ID NO：92；如美国专利公布2008-0274521-A1的实施例6所述，该文献以引用方式并入本文)。
包含YlSNF3基因的1.55kB片段通过PCR进行扩增(一般方法)，所述PCR从解脂耶氏酵母基因组中使用引物SNF3-F(SEQ ID NO：145)和SNF3-R(SEQ ID NO：146)进行扩增。扩增的基因用NcoI/NotI消化并置换pZuFmEaD5s的NcoI/NotI片段以制备pYRH50。因此，pYRH50包含嵌合FBAINm::YlSNF3::PEX20基因。
生成解脂耶氏酵母菌株Y4184U+Snf3：为了在菌株Y4184U中过表达YlSNF3，pYRH50用限制性酶酶切并分离出一个4.3kB的BsiWI/PacI片段用于转化(一般方法)，从而产生菌株Y4184U+Snf3。
为了筛选超表达YlSNF3的细胞，使用耶氏酵母属TEF1基因作为对照对YlRME1进行定量实时PCR(实施例2)。实时PCR引物SNF3-999F(SEQ ID NO：178)和SNF3-1066R(SEQ ID NO：179)，以及TaqMan探针SNF3-1020T(即，5’6-FAMTM-ATCGGAGCTATCGTCATGTGCTC-TAMRATM，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO：180所示)通过Primer Express软件2.0版(AppliedBiosystems，Foster City，CA)进行设计。引物和探针获取自Sigma-Genosys，Woodlands，TX。
如实施例8所示制备候选cDNA。每个样本分别重复进行TEF1和YlSNF3的反应。实时PCR反应的组成与实施例8所述的相同，不同的是正向和反向引物包括SNF3-999F和SNF3-1066R(同上)，而不是REG1-1230F和REG1-1296R(SEQ ID NO：151和152)，而TaqMan探针包括SNF3-1020T(同上)，而不是REG1-1254T(核苷酸序列如SEQID NO：153所示)。如实施例8所述进行扩增、数据收集和数据分析。
基于这一分析，推断出Y4184U+Snf3菌株表现出比Y4184U(Ura+)对照菌株高大约2.2倍的YlSNF3基因表达水平。
评价解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Snf3；为了评价并比较Snf3在解脂耶氏酵母中超表达对总脂质含量和FA组成的效应，如一般方法所述，菌株Y4184U(Ura+)(对照)和菌株Y4184U+Snf3在可比较的含油条件下生长。本文方法仅有的例外是每个菌株的培养物在25mL SD培养基中以～0.3的起始OD600(相对～0.1的起始OD600)生长。
解脂耶氏酵母Y4184U(Ura+)对照和Y4184U+Snf3菌株的DCW、细胞总脂质含量[“TFA％DCW”]和以TFA％重量表示的每种脂肪酸的浓度[“％TFA”]如下表31所示，而平均值用灰色突出显示并用“Ave”指示。
表31：解脂耶氏酵母菌株Y4184U(Ura+)和Y4184U+Snf3中的脂 质含量和组成
表31结果显示与Y4184U(Ura+)对照菌株相比，在Y4184U中对应于基因座YALI0C06424g超表达推定葡萄糖转运蛋白YlSnf3将脂质含量[“TFA％DCW”]提高大约14％并将平均EPA产量[“EPA％DCW”]提高大约14％。
基于上文所示的积极结果，其中超表达推定葡萄糖转运蛋白YlSnf3提高了相对于对照菌株的脂质生产，假定超表达其他葡萄糖转运蛋白将产生类似结果。例如，葡萄糖转运蛋白YALI0C08943p(GenBank登录号XP_501621)和YALI0F19184p(GenBank登录号XP_505610)能用类似于本文所述的用于YlSnf3的方法容易地超表达，并且人们将期望看到细胞中的脂质积聚提高(并且可能看到EPA产量提高)。同样地，能够超表达异源葡萄糖转运蛋白如来自啤酒糖酵母的HXT蛋白(例如Hxt1，GenBank登录号NP_011962；Hxt3，GenBank登录号NP_010632；Hxt4，GenBank登录号NP_011960)。
实施例15
操纵解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中的乙酰-CoA羧化酶磷酸 化位点提高积聚的总脂质
本实施例描述鉴定乙酰-CoA羧化酶[“ACC”]内的异源三聚SNF1蛋白激酶磷酸化位点、突变该位点以制备能被磷酸化的突变ACC蛋白、合成适于超表达该突变ACC*蛋白的载体、以及分离解脂耶氏酵母菌株Y4184U+ACC*的过程。将测定并比较YlACC*超表达对脂质积聚水平的效应。与天然ACC尚未突变的细胞相比，期望YlACC*超表达引起总脂质增加(表示为干细胞总重量百分比[“TFA％DCW”])。
操纵乙酰-CoA羧化酶的实验原理：乙酰-CoA羧化酶[“ACC”；EC6.4.1.2]催化脂肪酸合成中的关键调节步骤。在哺乳动物中，ACC酶活性通过AMP活化蛋白激酶[“AMPK”]，即，哺乳动物的Snf1哺乳动物直系同源物，进行调节。AMPK似乎通过去磷酸化特定ACC残基增量调节ACC的表达；例如，显示大鼠ACC(GenBank登录号NP_071529；SEQ ID NO：147)的丝氨酸残基79[“Ser-79”]完全引起ACC灭活，AMPK(Davies，S.P.等人，Eur.J.Biochem.，187：183-190(1990)；Ha，J.等人，J.Biol.Chem.，269(35)：22162-22168(1994))。换句话讲，AMPK/SNF1通过磷酸化可抑制ACC活性。
在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，已经证明ACC的酶活性由异源三聚SNF1蛋白激酶通过磷酸化调节(Mitchelhill，K.I.等人，J.Biol.Chem.，269：2361-2364(1994)；Woods，A.等人，J.Biol.Chem.，269：19509-19515(1994))；然而，大鼠ACC的对应Ser-79位点不存在于酵母ACC中。因此期望通过SNF1调节啤酒糖酵母的ACC，该调节因此必须通过磷酸化在蛋白不同位点发生。
已经发现AMPK/Snf1蛋白激酶家族的共有磷酸化位点是Hyd-(Xaa-Bas)-Xaa-Xaa-Ser/Thr-Xaa-Xaa-Xaa-Hyd(SEQ ID NO：148)，其中Hyd是大体积疏水性侧链(即，Leu、Met、Ile、Phe、或Val)，Bas是碱性残基(即，Arg、Lys或His，其中Arg比Lys碱性更强，Lys比His碱性更强)，而Xaa是任何氨基酸残基(参见Hardie，D.G.等人，Annu.Rev.Biochem.，67：821-855(1998))。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)基因座YALI0C11407g(SEQ IDNO：149)编码ACC。来自小鼠(GenBank登录号NP_579938)、大鼠(GenBank登录号NP_071529)、牛(GenBank登录号NP_071529)、啤酒糖酵母(GenBank登录号NP_776649)和耶氏酵母属的ACC蛋白进行比对。清楚的是大鼠ACC对应的Ser-79位点不存在于耶氏酵母属ACC中。推定Hyd-(Xaa-Bas)-Xaa-Xaa-Ser/Thr-Xaa-Xaa-Xaa-Hyd共有磷酸化位点位于耶氏酵母属ACC蛋白中，这些位点对应于SEQ IDNO：150的氨基酸711-719、1173-1182、1452-1462、1612-1621、1863-1873、1880-1889、2033-2041和/或2109-2119。
基于哺乳动物和啤酒糖酵母中调节ACC的保守机制，假定解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ACC的酶活性类似地由异源三聚SNF1蛋白激酶通过磷酸化进行调节(即，当ACC的AMPK/Snf1家族激酶位点未被磷酸化时，ACC活性提高)。如果能制备不能被磷酸化的突变ACC(例如通过将Ser/Thr磷酸化位点置换成不能磷酸化的中性残基如Ala)，则异源三聚SNF1蛋白激酶将不能减量调节ACC活性，从而提高细胞中的脂质生产。
令人感兴趣的是，YlACC1基因的活性(基因座YALI0C11407g；SEQ ID NO：149)在snf1Δ菌株中比在对照菌株中增量调节1.36-倍(实施例11)，而YlFAS2基因(基因座YALI0C11407g，编码脂肪酸合成酶的α-亚基，该酶负责催化长链饱和脂肪酸的合成；EC 2.3.1.41)在snf1Δ菌株中增量调节1.31-倍。这可表明除了ACC的翻译后控制受Snf1调节外，脂质生物合成中的两个关键酶的转录也受Snf1的调节。
构建pYRH_YlACC：将构建质粒pYRH_YlACC以过表达编码YlACC的ORF YALI0C11407g(SEQ ID NO：149)。质粒pYRH_YlACC将来源于质粒pZuFmEaD5s(图8B；SEQ ID NO：92；如美国专利公布2008-0274521-A1的实施例6所述，该文献以引用方式并入本文)。具体地讲，YlACC基因的0.4kB片段将通过PCR进行扩增(一般方法)，所述PCR从解脂耶氏酵母基因组中使用引物ACC1-F(SEQ ID NO：188)和ACC-NotR(SEQ ID NO：189)进行扩增。YlACC基因的另一个6.9kB片段将通过PCR(一般方法)使用引物ACC-NotF(SEQ ID NO：190)和ACC1-R(SEQ ID NO：191)进行扩增。扩增的0.4kB片段将用NcoI-NotI消化，而6.9kB片段将用NotI消化。纯化片段将用于置换pZuFmEaD5s的NcoI/NotI片段，从而产生pYRH_YlACC。因此，pYRH_YlACC将包含嵌合FBAINm::YlACC::Pex20基因。
通过定点诱变鉴定ACC中的AMPK/SNF1磷酸化位点：单氨基酸突变将使用pYRH_YlACC作为模板进行，通过定点诱变(QuickChange Kit，Stratagene，CA)分别使得YlACC(SEQ ID NO：150)的Ser-715、Ser-1178、Thr-1458、Ser-1617、Thr-1869、Ser-1885、Ser-2037或Ser-2115突变，从而生成Ala取代并制备一系列YlACC*突变体(即，YlACC*-S715A、YlACC*-S1178A、YlACC*-T1458A、YlACC*-S1617A、YlACC*-T1869A、YlACC*-S1885A、YlACC*-S2037A和YlACC*-S2115A)。在诱变后，突变YlACC*质粒将被线性化、分离并然后转化到解脂耶氏酵母Y4184U菌株中(一般方法)，从而产生菌株Y4184U+YlACC*-S715A、Y4184U+YlACC*-S1178A、Y4184U+YlACC*-T1458A、Y4184U+YlACC*-S1617A、Y4184U+YlACC*-T1869A、Y4184U+YlACC*-S1885A、Y4184U+YlACC*-S2037A和Y4184U+YlACC*-S2115A。
将如前文实施例所述测定并比较YlACC*超表达对积聚脂质水平的效应。突变体Y4184U菌株显示比天然ACC尚未突变的细胞总脂质增加(表示为干细胞总重量百分比[“TFA％DCW”])，该突变体将对应于在AMPK/Snf1磷酸化位点具有突变的突变体ACC。
实施例16
操纵解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中的二酰基甘油酰基转移 酶[“DGAT”]磷酸化位点增加积聚的总脂质
本实施例描述鉴定二酰基甘油酰基转移酶[“DGAT”]内的异源三聚SNF1蛋白激酶磷酸化位点、突变该位点以制备能被磷酸化的突变DGAT蛋白、合成适于超表达该突变DGAT*蛋白的载体、以及分离解脂耶氏酵母菌株Y4184U+DGAT*的过程。将测定并比较YlDGAT*超表达对脂质积聚水平的效应。与天然DGAT尚未突变的细胞相比，期望YlDGAT*超表达引起总脂质增加(表示为干细胞总重量百分比[“TFA％DCW”])。
操纵二酰基甘油酰基转移酶的实验原理：三酰基甘油[“TAG”]是细胞质的主要贮藏脂质。二酰基甘油酰基转移酶[“DGAT”](也称为酰基-CoA-二酰基甘油酰基转移酶或二酰基甘油O-酰基转移酶)(EC2.3.1.20)是专门用于TAG生物合成的酶，它催化酰基-CoA和1，2-二酰基甘油转化成TAG和CoA。存在两个DGAT酶家族：DGAT1和DGAT2。前一家族同酰基-辅酶A：胆固醇酰基转移酶[“ACAT”]基因家族具有同源性，而后一家族与之无关(Lardizabal等人，J.Biol.Chem.276(42)：38862-28869(2001))。
已经表明DGAT可为脂质积聚中的其中一个限速步骤。因此，假定提高DGAT活性将提高脂质积聚。DGAT活性似乎由异源三聚SNF1蛋白激酶通过磷酸化调节，调节方式类似于实施例15中所述的用于ACC的方式。
更具体地讲，对旱金莲(Tropaeolum majus)(garden nasturtium)中SnRK1(Snf1的植物直系同源基因)的研究证明DGAT1(GenBank登录号AY084052)中推定磷酸化位点(即，Ser-197)的突变提高其酶活性38％-80％(Xu，Jingyu等人，Plant Biotech.J.，6(8)：799-818(2008))。此外，当用包含修改后的DGAT1(即，具有Ser197Ala突变)的构建体转化拟南芥时，种子油含量按种子计为20％-50％。Xu等人得出结论：“...能利用该推定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶位点的改变提高DGAT1活性，并且能够表达突变DGAT1提高油含量。”遗憾的是，旱金莲DGAT的Ser-197在植物和真菌中不是保守的，尽管推定SnRK1磷酸化位点仍未在其他植物的DGAT中发现。
测定SNF1蛋白激酶的DGAT磷酸化：为了测定是否编码DGAT的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和/或啤酒糖酵母(Saccharomycescereivisae)的基因由异源三聚SNF1蛋白激酶进行磷酸化，DGAT1和/或DGAT2将从细菌表达载体中表达并用亲和纯化方法进行纯化。更具体地讲，GenBank登录号NC_001147(基因座NP_014888)编码啤酒糖酵母DGAT2酶(该酶与PDAT一起负责该生物中95％的油生物合成[Sandager，L.等人，J.Biol.Chem.，277(8)：6478-6482(2002)；Oelkers等人，J.Biol.Chem.，277：8877(2002)]；解脂耶氏酵母DGAT2(SEQID NO：184)如美国专利7,267,976所述，而解脂耶氏酵母DGAT1(SEQID NO：182)如美国专利7,273,746所述。本领域的技术人员将能够容易地通过PCR扩增这些基因并将它们克隆到合适的表达载体中，例如pET-32(Merck-Novagen，Darmstadt，Germany)，这在可商购获得的菌株大肠杆菌如BL21(Promega，Madison，Wisconsin)中表达之前。可商购获得的试剂盒如Ni-NTA离心柱(Qiagen，Valencia，CA)将允许方便的亲和纯化。
啤酒糖酵母SNF1蛋白激酶和/或解脂耶氏酵母SNF1蛋白激酶将被部分纯化，并且随后进行体外激酶测定，如Vincent，O.和M.Carlson(EMBO J.，18(23)：6672(1999))和Hong，S.-P.，等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，100：8839-8843(2003))所述。如果该实验确认DGAT1或DGAT2实际上由异源三聚SNF1蛋白激酶磷酸化，然后在选择DGAT中的推定Snf1磷酸化位点用于诱变。
通过定点诱变鉴定DGAT中的AMPK/SNF1磷酸化位点：超表达质粒包含嵌合FBAINm::YlDGAT::Pex20基因，它将通过类似于实施例15中超表达YlACC的方式进行构建。然后将使用表达质粒作为模板进行单个氨基酸的突变，使得YlDGAT中的单个推定Ser/Thr磷酸化位点通过定点诱变(QuickChange Kit，Stratagene，CA)发生突变，从而生成Ala取代并制备一系列YlDGAT*突变体。在诱变后，突变YlDGAT*质粒将被线性化、分离并然后转化到解脂耶氏酵母Y4184U中(一般方法)，从而生成多个Y4184U+YlDGAT*菌株。
将如前文实施例所述测定并比较YlDGAT*超表达对积聚脂质水平的效应。突变Y4184U菌株显示比天然DGAT尚未突变的细胞更高的总脂质(表示为干细胞总重量百分比[“TFA％DCW”])，该菌株将对应于在AMPK/Snf1磷酸化位点具有突变的DGAT突变体，如果实际上DGAT是磷酸化的，它由异源三聚SNF1蛋白激酶灭活。

Claims (3)

1.转基因含油解脂耶氏酵母宿主细胞，其包含：
(a)异源三聚SNF1蛋白激酶网络，所述异源三聚SNF1蛋白激酶网络在与对照解脂耶氏酵母宿主细胞的异源三聚SNF1蛋白激酶网络的活性进行比较时具有降低的活性，其中所述活性降低是由于：
(i)编码所述异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1α-亚基的多核苷酸的减量调节，其中所述SNF1α-亚基是SEQ ID NO:27；
(ii)编码所述SNF1α-亚基的调节域的多核苷酸的增量调节，其中所述SNF1α-亚基的调节域是由SEQ ID NO:26的核苷酸+835至+1740编码的；或
(iii)编码无催化活性的SNF1α-亚基的多核苷酸的增量调节，其中所述无催化活性的SNF1α-亚基如其中171号氨基酸残基被修饰为丙氨酸的SEQ ID NO:27所示；以及
(b)在与所述对照解脂耶氏酵母宿主细胞的总脂质含量进行比较时提高的总脂质含量，
其中所述对照解脂耶氏酵母宿主细胞是包含活性未降低的异源三聚SNF1蛋白激酶网络的非转基因解脂耶氏酵母宿主细胞。
2.权利要求1的转基因含油解脂耶氏酵母宿主细胞，其中所述异源三聚SNF1蛋白激酶网络的活性降低是由于所述(i)编码所述异源三聚SNF1蛋白激酶的SNF1α-亚基的多核苷酸的减量调节。
3.权利要求1的转基因含油解脂耶氏酵母宿主细胞，其中所述异源三聚SNF1蛋白激酶网络的活性降低是由于所述(iii)编码无催化活性的SNF1α-亚基的多核苷酸的增量调节。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012135777A1 (en) 2011-04-01 2012-10-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Yarrowia esterase/lipase promoter regions for gene expression in yeast
US8735094B2 (en) 2011-04-05 2014-05-27 E I Du Pont De Nemours And Company Yarrowia n-alkane-hydroxylating cytochrome P450 promoter regions for gene expression in yeast
WO2012138612A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Yarrowia peroxisomal 2,4-dienoyl-coa reductase promoter regions for gene expression in yeast
CN109468241A (zh) * 2011-10-19 2019-03-15 麻省理工学院 工程改造的微生物及用于微生物油生产的方法
CN102586289A (zh) * 2011-12-02 2012-07-18 华中农业大学 粘红酵母乙酰辅酶a羧化酶基因及其克隆、功能验证方法和应用
CN108064268A (zh) * 2014-05-29 2018-05-22 诺沃吉公司 增加脂质产生和优化脂质组成
AU2015266724B2 (en) 2014-05-29 2021-09-23 Ginkgo Bioworks, Inc. Increasing lipid production in oleaginous yeast
US20170145449A1 (en) * 2014-06-11 2017-05-25 Institut National De La Recherche Agronomique Improved lipid accumulation in Yarrowia lipolytica strains by overexpression of hexokinase and new strains thereof
US10513711B2 (en) 2014-08-13 2019-12-24 Dupont Us Holding, Llc Genetic targeting in non-conventional yeast using an RNA-guided endonuclease
CN108728477B (zh) * 2017-04-24 2022-02-22 华东理工大学 一种高效的转座突变系统及构建方法
CN108624600B (zh) * 2018-05-22 2021-06-18 昆明理工大学 锌指转录因子基因RkMsn4的用途
AU2020340444A1 (en) * 2019-08-30 2022-04-14 Lygos, Inc. Recombinant host cells for the production of malonate
KR102335426B1 (ko) * 2020-01-07 2021-12-06 삼성전기주식회사 코일 부품
CN113528589B (zh) * 2020-03-09 2023-03-24 山东省农业科学院生物技术研究中心 一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法及其应用
CN112662688B (zh) * 2021-01-25 2022-04-22 山东省果树研究所 核桃SnRK1蛋白激酶编码基因JrSnRK1在油脂合成与积累中的应用
CN114317466B (zh) * 2022-01-04 2023-10-27 中山大学附属第三医院 一种突变acc1蛋白及其用途
CN116790647B (zh) * 2023-02-06 2024-04-16 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 一种低背景、高信号强度的2-吡咯烷酮生物传感器及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101018865A (zh) * 2004-07-16 2007-08-15 克罗普迪塞恩股份有限公司 具有改良生长特性的植物及其制备方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7105730B1 (en) * 1999-07-12 2006-09-12 Monsanto Technology L.L.C. Nucleic acid molecules and other molecules associated with sterol synthesis and metabolism
US20060263864A1 (en) 1999-10-20 2006-11-23 Robert Busby Methods for improving secondary metabolite production of fungi
US6949356B1 (en) * 1999-10-20 2005-09-27 Microbia, Inc. Methods for improving secondary metabolite production in fungi
US7238482B2 (en) 2003-05-07 2007-07-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7267976B2 (en) 2003-07-02 2007-09-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous yeasts
US7504259B2 (en) * 2003-11-12 2009-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ12 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeast
EP1685239B1 (en) * 2003-11-12 2014-05-21 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oilseed plants and oleaginous yeast
WO2005049805A2 (en) 2003-11-14 2005-06-02 E.I. Dupont De Nemours And Company Fructose-bisphosphate aldolase regulatory sequences for gene expression in oleaginous yeast
US7465564B2 (en) 2004-08-10 2008-12-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Production of γ-linolenic acid in oleaginous yeast
US7588931B2 (en) 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US7273746B2 (en) 2004-11-04 2007-09-25 E.I. Dupont De Nemours And Company Diacylglycerol acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7732680B2 (en) * 2005-03-16 2010-06-08 Metabolix, Inc. Chemically inducible expression of biosynthetic pathways
US7943365B2 (en) 2007-05-03 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ-5 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
CN101970638B (zh) 2007-10-03 2015-02-11 纳幕尔杜邦公司 用于高水平生产二十碳五烯酸的优化解脂耶氏酵母菌株

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101018865A (zh) * 2004-07-16 2007-08-15 克罗普迪塞恩股份有限公司 具有改良生长特性的植物及其制备方法

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