CN103249834A

CN103249834A - 生产高水平二十碳五烯酸的重组微生物宿主细胞

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Publication number: CN103249834A
Application number: CN2011800410640A
Authority: CN
Inventors: S-P.洪; P.L.夏普; Z.薛; N.S.亚达夫; H.张; Q.朱
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2010-08-26
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2031-08-26
Also published as: CL2013000533A1; AU2011293180B2; AU2011293180A1; US20120052537A1; CA2807834C; JP2013535987A; DK2609203T3; CA2807834A1; EP2609203B1; BR112013004351A2; KR20130138760A; CN103249834B; WO2012027689A1; EP2609203A1; US8703473B2

Abstract

本文公开了含油酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）的工程化菌株，其能够产生微生物油，所述微生物油包含以干细胞重量的重量百分比测量的大于25重量%的二十碳五烯酸[“EPA”]（ω-3多不饱和脂肪酸）。

Description

生产高水平二十碳五烯酸的重组微生物宿主细胞

本专利申请要求提交于2010年8月26日的美国临时申请61/377,248、提交于2010年12月30日的美国临时申请61/428,277和提交于2011年4月28日的美国临时申请61/479,921的权益，上述每一申请全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及工程化重组微生物宿主细胞，其能够以高浓度有效地产生二十碳五烯酸（ω-3多不饱和脂肪酸[“PUFA”]）。

背景技术

二十碳五烯酸[“EPA；顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸；ω-3]的临床和药物价值是众所周知的（美国专利申请公布2009-0093543-A1）。类似地，相对于从天然的微生物源或通过分离从鱼油和海洋浮游生物生产EPA，利用重组方法在微生物中生产EPA的优点也是被充分认可的。

尽管文献报道了负责EPA的生产的ω-3/ω-6多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生物合成途径的多个部分在其中被引入植物和非含油酵母的许多最近的例子，申请人的受让人的主要努力聚焦在含油酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）（美国专利7,238,482；美国专利7,932,077；美国专利申请公布2009-0093543-A1；美国专利申请公布2010-0317072-A1）的使用上。含油酵母被定义为天然地能够合成和积聚油的那些酵母（其中油的积聚为细胞干重的至少25%），或经过遗传工程改造，使得它们变得能够合成和积聚油的那些酵母（其中油的积聚为细胞干重的至少25%）。

更具体地，美国专利7,932,077展示了通过表达下列基因：Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶和C_16/18延伸酶，在重组解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株中，占总脂肪酸[“TFA”]9%的EPA的生产而没有γ-亚麻酸[“GLA”；ω-6]的共合成。

美国专利申请公布2009-0093543-A1描述了通过表达下列基因：Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_16/18延伸酶和二酰基甘油胆碱磷酸转移酶，在重组解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株中产生占TFA至多55.6%的EPA的优化的重组解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株。

美国专利申请公布2010-0317072-A1描述了进一步优化的重组解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株，其产生包含占TFA高至50%的EPA的微生物油，并且具有以TFA的重量百分比测量的EPA对以TFA的重量百分比测量的亚油酸至少3.1的比率。除了表达如美国专利申请公布2009-0093543-A1中所详述的ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因之外，这些改进的菌株的特征还在于：

1)包含至少一种复合酶，其中所述复合酶包含多肽，所述多肽具有至少一个脂肪酸Δ9延伸酶，所述脂肪酸Δ9延伸酶连接至少一个脂肪酸Δ8去饱和酶[“DGLA合酶”]；

2)任选地包含至少一种编码酶的多核苷酸，所述酶选自丙二酰-CoA合成酶或酰基-CoA溶血磷脂酰基转移酶[“LPLAT”]；以及

3)包含至少一种过氧化物酶体生物合成因子蛋白，所述过氧化物酶体生物合成因子蛋白的表达已被下调。

尽管有以上引用的公开，就允许除高的总脂质含量外，还有占总脂肪酸的高重量%的EPA生产，同时使中间体脂肪酸如亚油酸[“LA”；ω-6]的生产和最终的油产物中的副产物脂肪酸最小化的EPA商业生产而言，菌株的改善依然是必要的。通过工程化改良的优化的解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）菌株，申请人已解决了上述问题，其中所述改良使得能够生产包含以干细胞重量的重量百分比测量的至少25重量%的EPA的微生物油。

发明内容

在第一实施例中，本发明涉及重组微生物宿主细胞，所述重组微生物宿主细胞产生油，所述油包含以干细胞重量的重量百分比测量的至少25重量%的二十碳五烯酸。

在第二实施例中，本文公开了油，所述油包含以总脂肪酸的重量百分比测量的至少45重量%的二十碳五烯酸。

优选地，上述的两种油中任一种具有以总脂肪酸的重量百分比测量的二十碳五烯酸对以总脂肪酸的重量百分比测量的亚油酸至少2.4的比率。

在第三实施例中，本文公开了重组微生物宿主细胞，其包含：

(a)至少一种包含多肽的复合酶，所述多肽具有至少一种Δ9延伸酶，所述Δ9延伸酶连接至少一种Δ8去饱和酶；

(b)至少一种过氧化物酶体生物合成因子蛋白，所述过氧化物酶体生物合成因子蛋白的表达已被下调；和

(c)至少两种多肽，所述多肽具有至少溶血磷脂酸酰基转移酶[“LPAAT”]活性；

(d)至少一种多肽，所述多肽具有至少磷脂:二酰基甘油酰基转移酶[“PDAT”]活性。

在第四实施例中，所述重组微生物宿主细胞还可以包含至少一种突变Δ9延伸酶多肽，其中所述突变Δ9延伸酶多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3具有至少一个氨基酸突变的差异，所述突变选自：

i)L35F突变；

ii)L35M突变；

iii)L35G突变；

iv)L35G突变和至少一种选自下列的其它突变：S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W和A254Y；

v)L35G、A21V、L108G和I179R突变；

vi)L35G、W132T和I179突变；

vii)L35G、S9D、Y84C和I179R突变；

viii)L35G、Y84C、I179R和Q244N突变；

ix)L35G、A21V、W132T、I179R和Q244N突变；

x)K58R和I257T突变；

xi)D98G突变；

xii)L130M和V243A突变；以及

xiii)包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自：K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y和I257T。

优选地，所述至少一种突变Δ9延伸酶多肽包含L35G取代，并且在与SEQ ID NO:3的Δ9延伸酶活性进行比较时，所述突变Δ9延伸酶多肽具有改善的Δ9延伸酶活性。

优选地，所述至少一种复合酶具有选自下列的特性：

(a)选自下列的接头：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；以及

(b)基本上由选自下列的序列组成的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16。

优选地，所述至少两种溶血磷脂酸酰基转移酶中的至少一种选自：

(a)基本上由选自下列的序列组成的氨基酸序列：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25；以及

(b)多肽，所述多肽基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23的氨基酸序列进行比较时具有至少43.9%的氨基酸同一性，并且所述多肽还包含至少一种选自SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序。

优选地，所述至少一种磷脂:二酰基甘油酰基转移酶选自：

(a)基本上由选自下列的序列组成的氨基酸序列：SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；以及

(b)多肽，所述多肽基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的氨基酸序列进行比较时具有至少90%的氨基酸同一性。

优选地，所述宿主细胞属于耶氏酵母属（Yarrowia）。

在第五实施例中，本发明涉及制备包含二十碳五烯酸的微生物油的方法，其包括：

a)培养本发明的任一个宿主细胞，其中产生包含二十碳五烯酸的微生物油；以及

b)任选地回收所述步骤（a）的微生物油。

在第六实施例中，本发明涉及进一步加工由本发明的方法制备的油。

生物保藏

下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心（American Type CultureCollection）（ATCC）（10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209），并具有下列名称、保藏号和保藏日期。

生物材料	保藏号	保藏日期
			解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Y8412	ATCC PTA-10026	2009年5月14日

上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题发明的许可。

根据如美国专利申请公布2010-0317072-A1所述的方法，解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Y9502来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Y8412。

附图说明和序列描述

图1A和图1B示出了ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，并且应结合下文对该途径的描述。

图2图示了在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Y4305（美国专利申请公布2009-0093543-A1）的发酵过程中，EPA%TFA和LA%TFA之间的关系。

图3A和图3B图解了来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）ATCC 20362的多种解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株的开发。

图4提供了下列质粒的质粒图谱：（A）pZKUM；和（B）pZKL3-9DP9N。

图5提供了下列质粒的质粒图谱：（A）pY187；和（B）pZK16-ML8N。

图6提供了下列质粒的质粒图谱：（A）pZK16-MyL8N；和（B）pZK16-ML3。

图7提供了下列质粒的质粒图谱：（A）pZKMP-mL9DP；和（B）pZKMP-mL9DCB。

图8提供了下列质粒的质粒图谱：（A）pZKSL-5S5A5；和（B）pZP2-85m98F。

图9图示了来源于菌株Z5567的多种解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）菌株的开发。

图10A图示了与pYPS234的同源重组反应，而图10B提供了pYPS234的质粒图谱。

图11A图示了与pYPS233的同源重组反应，而图11B提供了pYPS233的质粒图谱。

图12A图示了与pYPS241的同源重组反应，而图12B提供了pYPS241的质粒图谱。

图13提供了下列质粒的质粒图谱：（A）pZR5AU-555；和（B）pZR5AU-555M。

图14是pZUFmEgD9ES的质粒图谱。

图15A、15B、15C、15D、15E、15F、15G和15H是使用ClustalW比对方法，对来自玻璃海鞘（Ciona intestinalis）[SEQ ID NO:133]、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[SEQ ID NO:134]、地钱（Marchantiapolymorpha）[SEQ ID NO:135]、小立碗藓（Physcomitrella patens）[SEQID NO:136]、地钱（Marchantia polymorpha）[SEQ ID NO:137]、Ostreococcus tauri[SEQ ID NO:138]、巴夫藻属（Pavlova sp.）CCMP459[SEQ ID NO:139]、盐生巴夫藻（Pavlova salina）[SEQ ID NO:140]、Ostreococcus tauri[SEQ ID NO:141]、Euglena anabaena[SEQ ID NO:34]、小眼虫（Euglena gracilis）[SEQ ID NO:32]、小型绿藻属（Eutreptiellasp.）CCMP389[SEQ ID NO:38]、绿光等鞭金藻（Isochrysis galbana）[SEQID NO:42]、假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）[SEQ ID NO:142]、假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）[SEQ ID NO:143]、高山被孢霉（Mortierella alpina）[SEQ ID NO:144]和破囊壶菌（Thraustochytrium sp.）FJN-10[SEQ ID NO:145]的十七种脂肪酸延伸酶的比对。

图16A显示了EgD9eS的膜拓扑学模型；每一垂直的圆柱体表示一个跨膜片段，而每一水平的圆柱体表示位于内膜单张内或其附近的疏水延伸。

图16B显示了来源于小眼虫（Euglena gracilis）的合成突变Δ9延伸酶（即，“EgD9eS-突变共有序列”；SEQ ID NO:1），其任选地包含：L35F突变；L35M突变；L35G突变；L35G突变和至少一种选自下列的其它突变：S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W和A254Y；L35G、A21V、L108G和I179R突变；L35G、W132T和I179R突变；L35G、S9D、Y84C和I179R突变；L35G、Y84C、I179R和Q244N突变；L35G、A21V、W132T、I179R和Q244N突变；K58R和I257T突变；D98G突变；L130M和V243A突变；以及，包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自：K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y和I257T。

图17是使用

的AlignX程序（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA），对绿光等鞭金藻（Isochrysis galbana）[“IgD9e”]（SEQID NO:42）、小型绿藻属（Eutreptiella sp.）CCMP389[“E389D9e”]（SEQ ID NO:38）、小眼虫（Euglena gracilis）[“EgD9e”]（SEQ ID NO:32）和E.anabaena[“EaD9e”]（SEQ ID NO:34）的Δ9延伸酶的比对。

图18是小眼虫（Euglena gracilis）Δ-5去饱和酶的预测的拓扑学模型。

图19A和19B显示了来自小眼虫（Euglena gracilis）的野生型Δ5去饱和酶基因（即，EgD5；SEQ ID NO:184）与包含S347R突变的变体野生型小眼虫（E.gracilis）Δ5去饱和酶基因（即，EgD5R；SEQ ID NO:192）的DNA序列的比对。

图20A、20B和20C示出了质粒pDMW367-M4的构建。

图21显示了来自小眼虫（E.gracilis）的野生型Δ5去饱和酶基因（即，EgD5R；SEQ ID NO:192）的5'部分与解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）的经密码子优化的Δ-5去饱和酶突变基因（即，EgD5M；SEQID NO:105）的头204bp的序列比对。

图22提供了下列质粒的质粒图谱：（A）pEgD5M；和（B）pDMW367-5M。

根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。

下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825（“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”（“Requirements for PatentApplications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid SequenceDisclosures-the Sequence Rules”）），并且符合世界知识产权组织（WorldIntellectual Property Organization）（WIPO）ST.25标准（1998）以及EPO和PCT的序列表要求（规则5.2和49.5（a-bis）以及行政指令（Administrative Instructions）的208节和附录C）。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§1.822所示的规则。

SEQ ID NO:1-437是编码启动子、基因或蛋白质（或它们的片段）的开放阅读框（ORF）、引物或质粒，如表1中所述。

表1：基因和蛋白质序列号概述

具体实施方式

本文引用的所有专利、专利申请和公布全文以引用方式并入本文。

在本公开中，使用了大量的术语和缩写。标准的三字母编码或单字母编码被用于表示氨基酸。给出了如下定义。

“开放阅读框”缩写为ORF。

“聚合酶链反应”缩写为“PCR”。

“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。

“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。

“三酰基甘油”缩写为“TAG”。

“辅酶A”缩写为“CoA”。

“总脂肪酸”缩写为“TFA”。

“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。

“干细胞重量”缩写为“DCW”。

“重量百分比”缩写为“重量%”。

如本文所用的，术语“发明”或“本发明”旨在指如本文中的权利要求和说明书中所描述的本发明的所有方面和所有实施例，并无意于局限于任一具体实施例或方面。

术语“食品”、“药物”、“婴儿代乳品”、“饮食补充剂”、“动物饲料”和“水产养殖饲料”如美国专利申请公布2010-0317072-A1中所定义的。

如本文所用，术语“生物质”具体地指所消耗的或使用的细胞材料，其来自以商业上有意义的量产生EPA的重组生产宿主的发酵。优选的生产宿主是含油酵母的重组菌株，优选耶氏酵母属（Yarrowia），更优选解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）。生物质可以是以下形式：全细胞、全细胞溶解产物、均质化的细胞、部分水解细胞物质、和/或部分纯化细胞物质（例如微生物产生的油）。

术语“脂质”指任何脂溶性的（即，亲脂的）、天然存在的分子。美国专利申请公布2009-0093543-A1中提供了对脂质的一般综述（参见其中的表2）。

术语“油”是指在25℃时为液体的脂类物质；所述油是疏水性的，但在有机溶剂中是可溶性的。在含油生物中，油构成总脂质的主要部分。“油”主要由三酰基甘油（TAG）组成，但是也可以包含其它中性脂质、磷脂和游离脂肪酸。油脂中的脂肪酸组成和总脂质的脂肪酸组成一般是相似的；因此，总脂质中的脂肪酸浓度的升高或降低将对应于油中的脂肪酸浓度的升高或降低，反之亦然。

“中性脂质”指那些一般作为贮存脂肪存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们之所以被称为“中性脂质”，是因为在细胞的pH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂类一般指脂肪酸的甘油单酯、二酯、和/或三酯，也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油，或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放游离脂肪酸，必须发生水解反应。

术语“三酰基甘油”[“TAG”]是指由三个脂肪酰残基酯化一个甘油分子组成的中性脂质。TAG能够包含长链PUFA和饱和脂肪酸，以及较短链的饱和的和不饱和的脂肪酸。

本文所用术语“总脂肪酸”[“TFA”]是指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定样品中能通过碱酯交换方法（如本领域所已知的）被衍生为脂肪酸甲酯[“FAME”]，所述样品可以是例如生物质或油脂。因此总脂肪酸包括来自中性脂类级分（包括二酰基甘油、单酰基甘油和TAG）和极性脂质级分（包括，例如，磷脂酰胆碱和磷酸酰乙醇胺级分）的脂肪酸，但是不包括游离脂肪酸。

术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以占干细胞重量[“DCW”]的百分比的形式表示，不过总脂质含量可近似地以FAME占DCW的百分比[“FAME%DCW”]量度。因此，总脂质含量[“TFA%DCW”]等于，例如，脂肪酸毫克数每100毫克DCW。

本文将总脂质中的脂肪酸浓度表示为TFA重量百分比[“%TFA”]，例如每100毫克TFA的给定脂肪酸毫克数。除非本文公开中另外具体声明，给定脂肪酸对总脂质的百分比等同于以%TFA表示的脂肪酸浓度（例如总脂质的%EPA等同于EPA%TFA）。

在一些情况下，将细胞中给定脂肪酸的含量表达为它占干细胞重量的重量%[“%DCW”]是有用的。因此，例如，EPA产率[“EPA%DCW”]的测量将按照下列算式确定：（EPA%TFA）*（TFA%DCW）]/100。然而，以给定的脂肪酸占干细胞重量的重量百分比[“%DCW”]表示的给定的脂肪酸在细胞中的含量可以近似计算为：（EPA%TFA）*（FAME%DCW）]/100。

术语“脂质特征”和“脂质组成”是可互换的，并且指在特定脂质级分中，例如在总脂质或油脂中，包含的各种脂肪酸分别的量，其中所述量以TFA的重量%形式表示。混合物中存在的各单个脂肪酸的总量应当是100。

术语“提取油”指已经从其它细胞材料中分离的油，例如其中合成油的微生物。提取油通过多种方法获得，其中最简单的方法仅涉及物理方法。例如，使用多种挤压构造（例如，螺杆、螺旋压榨机、活塞、珠磨器等）的机械压碎能够从细胞材料分离油。作为另外一种选择，可通过用多种有机溶剂处理（例如己烷）、酶提取、渗透压冲击破碎、超声波提取、超临界流体提取（例如CO₂提取）、皂化、以及这些方法的组合进行油提取。提取油可以被纯化或被进一步浓缩。本文所述的提取油将包含至少45EPA%TFA。

术语“混合油”是指通过将本文所述的提取油与任何组合的或单独的油混合或共混以得到所期望的组成而获得的油。因此，例如，来自不同微生物的各种类型的油能够被混合以得到所期望的PUFA组成。作为另外一种选择或除此之外，本文所公开的包含PUFA的油能够与鱼油、植物油或二者的混合物共混，以得到所期望的组成。

术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸（链烷酸），链长为约C₁₂-C₂₂，尽管更长和更短链长的酸都是已知的。主要的链长介于C₁₆和C₂₂之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳（“C”）原子的总数，而Y表示双键的数目。附加的关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸”（“PUFA”）、以及　ω-6脂肪酸”（ω-6或n-6）对“ω-3脂肪酸”（ω-3或n-3）之间的区别的详细信息提供于美国专利7,238,482中，该专利以引用方式并入本文。

表2提供了用于描述本文PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始（为此ω碳的编号为1）。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸以及它们的前体的通用名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名。

表2：多不饱和脂肪酸及其前体的命名

通用名	缩写	化学名	简化符号
				肉豆蔻酸	--	十四酸	14:0
棕榈酸	棕榈酸	十六酸	16:0
				棕榈油酸	--	9-十六碳烯酸	16:1
硬脂酸	--	十八酸	18:0
				油酸	--	顺式-9-十八碳烯酸	18:1
亚油酸	LA	顺式-9,12-十八碳二烯酸	18:2ω-6
				γ-亚麻酸	GLA	顺式-6,9,12-十八碳三烯酸	18:3ω-6
二十碳二烯酸	EDA	顺式-11,14-二十碳二烯酸	20:2ω-6
				二高-γ-亚麻酸	DGLA	顺式-8,11,14-二十碳三烯酸	20:3ω-6
花生四烯酸	ARA	顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸	20:4ω-6
				α-亚麻酸	ALA	顺式-9,12,15-十八碳三烯酸	18:3ω-3
十八碳四烯酸	STA	顺式-6,9,12,15-十八碳四烯酸	18:4ω-3
				二十碳三烯酸	ETrA	顺式-11,14,17-二十碳三烯酸	20:3ω-3
二十碳四烯酸	ETA	顺式-8,11,14,17-二十碳四烯酸	20:4ω-3
				二十碳五烯酸	EPA	顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸	20:5ω-3
二十二碳四烯酸	DTA	顺式-7,10,13,16-二十二碳四烯酸	22:4ω-6
				二十二碳五烯酸	DPAn-6	顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸	22:5ω-6
二十二碳五烯酸	DPA	顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸	22:5ω-3
				二十二碳六烯酸	DHA	顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸	22:6ω-3

术语“PUFA生物合成途径”是指将油酸转化成诸如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DTA和DPAn-6之类的ω-6脂肪酸和诸如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA之类的ω-3脂肪酸的代谢过程。文献（例如，参见美国专利7,932,077和美国专利申请公布2009-0093543-A1）中很好地描述了该过程。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延伸酶（称为“PUFA生物合成途径酶”）进行。更具体地讲，“PUFA生物合成途径酶”是指下列与PUFA生物合成相关的任何酶（以及编码该酶的基因），包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和/或C_20/22延伸酶。

术语“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”将指包括至少一种Δ9延伸酶和至少一种Δ8去饱和酶，从而使得能分别从LA和ALA开始，以EDA和/或ETrA作为脂肪酸中间产物来生物合成DGLA和/或ETA的PUFA生物合成途径。当表达其它去饱和酶和延伸酶时，也可合成ARA、DTA、DPAn-6、EPA、DPA和DHA。

术语“转化效率”和“底物转化百分比”是指特定酶（如去饱和酶、延伸酶或复合酶）能够将底物转化成产物的效率。转化效率根据下面的公式测量：（[产物]/[底物+产物]）×100，其中“产物”包括源于它的途径中的中间产物和所有产物。

术语“去饱和酶”指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和（即引入双键）而产生所关注的脂肪酸或前体的多肽。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文特别关注的是：Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶和Δ12去饱和酶。其它有用的去饱和酶能够包括Δ4去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ15去饱和酶和Δ9去饱和酶。

术语“延伸酶”指能延长脂肪酸碳链从而产生比该延伸酶作用于其上的脂肪酸底物长2个碳原子的酸的多肽。该延伸过程在与脂肪酸合成酶相关的多步骤机制中发生，如美国专利7,659,120中所述。由延伸酶体系催化的反应的例子是将GLA转化成DGLA、将STA转化成ETA、将ARA转化成DTA和将EPA转换成DPA。通常，延伸酶的底物选择性有些广泛，但由链长度和不饱和的程度及类型两者来区分。例如，C_14/16延伸酶将利用C₁₄底物（例如肉豆蔻酸），C_16/18延伸酶将利用C₁₆底物（例如棕榈酸），C_18/20延伸酶将利用C₁₈底物（例如GLA、STA）而C_20/22延伸酶[也称为Δ5延伸酶或C20延伸酶]将利用C₂₀底物（例如ARA、EPA）。出于本文的目的，可确定两种不同类型的C_18/20延伸酶：Δ6延伸酶将分别催化GLA和STA转化成DGLA和ETA，而Δ9延伸酶能够分别催化LA和ALA转换成EDA和ETrA。

“C₁₈-C₂₀延伸转化效率”是指C_18//20延伸酶能够将C₁₈底物（即LA、ALA、GLA、STA）转化成C₂₀产物（即EDA、ETrA、DGLA、ETA）的效率。这些C_18//20延伸酶可以或是Δ9延伸酶或是Δ6延伸酶。

术语“Δ9延伸转化效率”是指Δ9延伸酶能够将C₁₈底物（即LA、ALA）转化成C₂₀产物（即EDA、ETrA）的效率。

术语“EgD9e”指分离自小眼虫（Euglena gracilis）的由本文的SEQID NO:31编码的Δ9延伸酶（SEQ ID NO:32）。类似地，术语“EgD9eS”是指来源于小眼虫（E.gracilis）的合成Δ9延伸酶，其经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中表达（即SEQ ID NO:2和3）。涉及EgD9e和EgD9eS以及Δ9延伸酶基序的更多细节描述于美国专利7,645,604中。

术语“EaD9e”指分离自Euglena anabaena的由本文的SEQ ID NO:33编码的Δ9延伸酶（SEQ ID NO:34）。类似地，术语“EaD9eS”是指来源于E.anabaena的合成Δ9延伸酶，其经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中表达（即SEQ ID NO:35和36）。关于EaD9e和EaD9eS的更多细节描述于美国专利7,794,701中。

术语“E389D9e”是指分离自小型绿藻属（Eutreptiella sp.）CCMP389的由本文的SEQ ID NO:37编码的Δ9延伸酶（SEQ ID NO:38）。类似地，术语“E389S9eS”是指来源于小型绿藻属（Eutreptiella sp.）CCMP389的合成Δ9延伸酶，其经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）中表达（即SEQ ID NO:39和40）。关于E389D9e和E389D9eS的更多细节描述于美国专利7,645,604中。

术语“IgD9e”是指分离自绿光等鞭金藻（Isochrysis galbana）的由本文的SEQ ID NO:41编码的Δ9延伸酶（SEQ ID NO:42；NCBI登录号AAL37626（GI17226123））。

术语“突变Δ9延伸酶”或“突变EgD9eS”是指相对于来源于小眼虫（Euglena gracilis）的经密码子优化以在（Yarrowia lipolytica）中表达的合成Δ9延伸酶，具有至少一个突变Δ9延伸酶（即，EgD9eS[SEQ ID NO:2和3]）。虽然“突变”可以包括任何缺失、插入和点突变（或它们的组合），在优选的实施例中突变EgD9eS是在SEQ ID NO:1（图16B）中所示的，其中SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3具有至少一个氨基酸突变的差异，所示突变选自：a）L35F突变；b）L35M突变；c）L35G突变；d）L35G突变和至少一种选自下列的其它突变：S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W和A254Y；e）L35G、A21V、L108G和I179R突变；f）L35G、W132T和I179R突变；g）L35G、S9D、Y84C和I179R突变；h）L35G、Y84C、I179R和Q244N突变；i）L35G、A21V、W132T、I179R和Q244N突变；j）K58R和I257T突变；k）D98G突变；l）L130M和V243A突变；以及m）包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自：K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y和I257T。对于所列的每一取代，第一个字母对应于EgD9eS（SEQID NO:3）中的氨基酸，第二个字母对应于存在于突变体（SEQ ID NO:1）中相同位置的氨基酸，即，L35F表示从EgD9eS中位置35的亮氨酸[L]至EgD9eS突变体中的苯丙氨酸[F]的转变。上述命名法在本说明书通篇中被用于表示本文所述的Δ9延伸酶中的突变；类似的符号被用于描述核苷酸序列中的取代（即，C62T表示从EgD9eS（SEQ ID NO:2）中位置62的胞嘧啶[C]至EgD9eS突变体中胸腺嘧啶[T]的转变。

尽管多肽序列不同，当比较酶活性时，突变EgD9eS将具有比EgD9eS“改善的Δ9延伸酶活性”。因此，突变EgD9eS序列将具有与EgD9eS的相比提高的酶活性（即，至少约为EgD9eS的酶活性的至少约101-110%、优选至少约110-125%、更优选至少约125-150%、并且最优选大于约150%）。尽管优选的范围是上文所述的，转化效率的有用的例子包括从50%至至少150%的任何整数百分比，例如51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、101%、102%、103%、104%、105%、106%、107%、108%、109%、110%、111%、112%、113%、114%、115%、116%、117%、118%、119%、120%、121%、122%、123%、124%、125%、126%、127%、128%、129%、130%、131%、132%、133%、134%、135%、136%、137%、138%、139%、140%、141%、142%、143%、144%、145%、146%、147%、148%、149%和150%。

术语“EgD9eS-L35G”是指相对于EgD9eS（SEQ ID NO:3）具有单个L35G突变的由本文的SEQ ID NO:43编码的合成突变Δ9延伸酶（SEQ IDNO:44）。

术语“复合酶”或“融合蛋白”是指具有至少两种独立的和可分离的酶活性的单一多肽，其中第一种酶活性优选与第二种酶活性相连接（美国专利申请公布2008-0254191-A1）。所述至少两种独立的和可分离的酶活性之间的“接头”可以由单一多肽组成，尽管所述接头也可以由一个氨基酸残基如脯氨酸、或包含至少一个脯氨酸的多肽组成。优选的接头选自：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

术语“DGLA合酶”是指复合酶，其中Δ9延伸酶连接至Δ8去饱和酶。术语“EgD9eS/EgD8M”是指通过用接头序列（即SEQ ID NO:4[GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS]；美国专利申请公布2008-0254191-A1）将Δ9延伸酶“EgD9eS”（美国专利7,645,604）连接至Δ8去饱和酶“EgD8M”（美国专利7,709,239）产生的DGLA合酶（SEQ ID NO:11和12）。类似地，术语“EaD9eS/EaD8S”是指通过用如SEQ ID NO:4所示的接头序列将Δ9延伸酶“EaD9eS”（美国专利7,794,701）连接至Δ8去饱和酶“EaD8S”（美国专利7,790,156）产生的DGLA合酶（SEQ ID NO:13和14）。同样，术语“E389D9eS/EgD8M”是指通过用如SEQ ID NO:4所示的接头序列将Δ9延伸酶“E389D9eS”（美国专利7,645,604）连接至Δ8去饱和酶“EgD8M”（参见上文）产生的DGLA合酶（SEQ ID NO:15和16）。

术语“酰基转移酶”是指负责将酰基基团从供体脂质转移至受体脂质分子的酶。

术语“酰基-CoA：溶血磷脂酰基转移酶”或“溶血磷脂酰基转移酶”[“LPLAT”]是指具有使多种溶血磷脂底物在sn-2位酰化的能力的一大类酰基转移酶。更具体地，LPLAT包括具有催化LPA至磷脂酸[“PA”]的转化的能力的溶血磷脂酸[“LPA”]酰基转移酶[“LPAAT”]、具有催化LPC至磷脂酰胆碱[“PC”]的转化的能力的溶血磷脂酰胆碱[“LPC”]酰基转移酶[“LPCAT”]、具有催化LPE至磷脂酰乙醇胺[“PE”]的转化的能力的溶血磷脂酰乙醇胺[“LPE”]酰基转移酶[“LPEAT”]、具有催化LPS至磷脂酰丝氨酸[“PS”]的转化的能力的溶血磷脂酰丝氨酸[“LPS”]酰基转移酶[“LPSAT”]、具有催化LPG至磷脂酰甘油[“PG”]的转化的能力的溶血磷脂酰甘油[“LPG”]酰基转移酶[“LPGAT”]、和具有催化LPI至磷脂酰肌醇[“PI”]的转化的能力的溶血磷脂酰肌醇[“LPI”]酰基转移酶[“LPIAT”]。

术语“具有至少溶血磷脂酸酰基转移酶[“LPAAT”]活性的多肽”将指那些能够催化下列反应的酶：酰基-CoA+1-酰基-sn-甘油-3-磷酸盐→CoA+1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸盐（EC2.3.1.51）。因此，“LPAAT”是指如美国专利申请公布2010-0317072-A1和美国专利申请公布2010-0317882-A1中所述的蛋白质，其：1）具有LPAAT活性并且基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO:18（MaLPAAT1）、SEQ ID NO:22（YlLPAAT1）和SEQ ID NO:23（ScLPAAT1）的氨基酸序列进行比较时，具有至少约43.9%的氨基酸同一性；和/或，2）具有LPAAT活性并且具有至少一种选自NHxxxxD（SEQ ID NO:26）和EGTR（SEQ ID NO:27）的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序。

LPAAT多肽的例子包括ScLPAAT、ScLPAATS、MaLPAAT1、MaLPAAT1S和YlLPAAT1，参见下文。

术语“ScLPAAT”是指从啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）（ORF“YDL052C”）分离的LPAAT（SEQ ID NO:23）。相对地，术语“ScLPAATS”是指来源于啤酒糖酵母（S.cerevisiae）的经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中表达的合成LPAAT（即SEQ IDNO:24和25）（美国专利申请公布2010-0317882-A1）。

术语“MaLPAAT1”是指从高山被孢霉（Mortierella alpina）分离的LPAAT（SEQ ID NO:18），其由如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列编码。与此相对，术语“MaLPAAT1S”是指来源于高山被孢霉（M.alpina）的经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中表达的合成LPAAT（即SEQ ID NO:19和20）（美国专利7,879,591）。

术语“YlLPAAT1”是指从解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）分离的LPAAT（SEQ ID NO:22），其由如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列编码。

术语“具有至少磷脂：二酰基甘油酰基转移酶[“PDAT”]活性的多肽”将指那些能够从磷脂（例如，磷脂酰胆碱）的sn-2位转移脂肪酰基至1，2-二酰基甘油的sn-3位，从而产生溶血磷脂和TAG的酶[E.C.2.3.1.158]。尽管PDAT和二酰基甘油酰基转移酶（DAG AT）[E.C.2.3.1.20]均参与TAG生物合成的最终步骤，仅PDAT可以经由不依赖酰基-CoA的机制合成TAG。代表性的PDAT酶，如SEQ ID NO:30所示，是由啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的LRO1基因编码的（Dahlqvist等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：6487（2000））。

术语“YlPDAT”是指从解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）分离的PDAT（SEQ ID NO:29），其由如SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列编码（美国专利7,901,928）。

术语“胆碱磷酸胞苷酰转移酶”是指磷脂酰胆碱[“PC”]生物合成途径的酶（EC2.7.7.15），其催化下列化学反应：

因此，该酶是能够转移包含磷的核苷酸基团，从而在甘油磷脂代谢中起作用的转移酶（即，核苷酸转移酶）。

术语“YlPCT”指从解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）分离的磷酸胆碱胞苷酰转移酶（SEQ ID NO:46），其由SEQ ID NO:45编码。

术语“二酰基甘油胆碱磷酸转移酶”是指磷脂酰胆碱[“PC”]生物合成途径的酶（EC（EC2.7.8.2），其催化从CDP-胆碱和1,2-二酰基甘油合成磷脂酰胆碱。

术语“YlCPT1”是指从解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）分离的二酰基甘油胆碱磷酸转移酶（SEQ ID NO:48），其由SEQ ID NO:47编码。YlCPT1描述于国际申请公布WO2006/052870中（另参见GenBank登录号XM_501703（YALI0C10989g））。

“丙二酰-CoA合成酶”[EC6.2.1.-]催化下列酶促反应：丙二酸+ATP+CoA→丙二酰-CoA+AMP+焦磷酸（PPi）。该酶首先纯化自丙二酸-生长型荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）（Kim，Y.S.和S.K.Bang，J.Biol.Chem.，260：5098-5104（1985）），尽管之后又从豆科植物根瘤中的类细菌分离了多种根瘤菌同源物（参见例如，Kim，Y.S.和H.Z Chae，Biochem..J.，273：511-516（1991）和Kim，Y.S.和S.W.Kang，Biochem.J.，第297卷，第327-333页（1994））。

术语“MCS”是指编码来源于豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarumbv.viciae3841）的丙二酰-CoA合成酶（GenBank登录号YP_766603）的经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中表达的合成基因（即SEQ ID NO:49和50）（美国专利申请公布2010-0159558-A1）。

术语“过氧化物酶体”是指普遍存在于所有真核细胞中的细胞器。它们具有单独的脂双层膜，该膜将它们的内容物与细胞溶质分离开来，并且包含下文所述功能必需的多种膜蛋白。过氧化物酶体经由“扩展的穿梭机制（extended shuttle mechanism）”选择性输入蛋白。更具体地讲，存在着至少32个已知的过氧化物酶体蛋白（称为peroxin），它们参与通过ATP水解穿过过氧化物酶体膜输入蛋白的过程。一旦细胞蛋白进入过氧化物酶体，它们通常通过一些方法降解。例如，过氧化物酶体包含氧化酶，例如过氧化氢酶、D-氨基酸氧化酶和尿酸氧化酶，这些酶能够降解对细胞有毒的物质。作为另外一种选择，过氧化物酶体降解脂肪酸分子以生成乙酰-CoA游离分子，它们被回输到细胞溶质中，该过程称为β-氧化。

术语“过氧化物酶体生物合成因子蛋白”、“过氧化物酶体蛋白”和“Pex蛋白”是可互换的，并且是指参与过氧化物酶体生物发生的蛋白质和/或参与细胞蛋白质借助ATP水解穿越过氧化物酶体膜向内运输的过程的蛋白质。编码任何这些蛋白质的基因的缩写为“Pex基因”。Pex基因的命名系统描述于Distel等人，J.Cell Biol.，135：1-3（1996）中。迄今已经在多种真核生物中鉴定了至少32个不同的Pex基因。基于Kiel，J.A.K.W.等人的文献（Traffic，7：1291-1303（2006）），其中对17种不同真菌物种的基因组序列进行了生物信息学分析，鉴定了下列Pex蛋白：Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp、Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21Bp、Pex22p、Pex22p样和Pex26p。这些蛋白本文将统称为由“Pex基因”编码的“Pex蛋白”。

术语“下调”在至少一种过氧化物酶体生物合成因子蛋白中或与之相关时，是指与野生型蛋白质的活性相比，天然的Pex蛋白的活性的降低或消除。下调通常在天然的Pex基因具有“破坏”时发生，“破坏”指在该基因的部分中的插入、缺失、或定向突变，所述破坏导致整个基因敲除使得该基因从基因组中缺失并且不翻译出蛋白质，或导致翻译的Pex蛋白具有插入、缺失、氨基酸取代或其它定向突变。相对于没有下调的Pex蛋白，下调的Pex蛋白将具有降低的活性，并且能够是不具备功能的。导致Pex蛋白质的表达降低或缺失的下调还可以通过操纵调控序列、转录和翻译因子和/或信号转导途径，或通过使用有义、反义或RNAi技术等实现。

术语“保守结构域”或“基序”意指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其它位置的氨基酸能够发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸很表明这些氨基酸可能是对蛋白质的结构、稳定性或活性重要的。因为它们可通过它们在蛋白质同源物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标签或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。

术语“微生物宿主细胞”和“微生物宿主生物”本文中可互换地使用，并且是指能够接纳外源或异源性基因并且能够表达这些基因的微生物。“重组微生物宿主细胞”是指已被重组改造的微生物宿主细胞。

一般来讲，术语“含油的”指那些倾向于以油形式贮存它们的能源的生物（Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980）。在此过程中，含油微生物的细胞油含量一般符合S形曲线，其中脂质浓度增加，直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期时它达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期期间逐渐下降（Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25（1991））。就本专利申请的目的而言，术语“含油的”是指能够将它们的干细胞重量[“DCW”]的至少约25%积累为油的那些微生物。

术语“含油酵母”是指能够产生油（即，其中油能够以占它们DCW的超过约25%积累）的被分类为酵母的那些含油微生物。含油酵母的例子包括但不限于如下属：耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、丝孢酵母属（Trichosporon）和油脂酵母属（Lipomyces）。所述酵母以占其DCW的超过约25%积累油的能力可以是来自重组改造工作或者来自该微生物的天然能力。

术语“可发酵的碳源”指微生物将其代谢以获取能量的碳源。一般的碳源包括但不限于：单糖、二糖、低聚糖、多糖、烷烃、脂肪酸、脂肪酸的酯、甘油、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、二氧化碳、甲醇、甲醛、甲酸盐和含碳胺类。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”本文可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等的范围。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个片段构成。核苷酸（通常以它们的5'-单磷酸形式存在）可以用如下的单字母名称指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸（分别对应RNA或DNA），“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤（A或G），“Y”表示嘧啶（C或T），“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。

氨基酸或核苷酸序列的“主要部分”是包含多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列的足够用于推断地鉴定该多肽和基因的序列的部分，如美国专利申请公布2010-0317072-A1中所描述的，所述鉴定是通过本领域的技术人员对序列的人工评估，或使用例如BLAST（Basic Local AlignmentSearch Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410（1993））的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定进行的。

术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。

“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

“合成基因”是基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚性，而被定制以最优化基因表达的。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因（其中序列信息可获得）的检测。例如，在美国专利7,125,672中提供了解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）的密码子使用谱。

“基因”是指表达特定蛋白质的核酸片段，并且其可以指单独的编码区或可以包含所述编码区上游和/或下游的调控序列（例如，所述编码区的转录起始位点上游的5'非翻译区、3'非编码区）。“天然基因”指自然状态下与其自身的调控序列一起的基因。“嵌合基因”指为非天然基因的任何基因，包含天然状态下不一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”指在生物体基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来”基因指通过基因转移导入至宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。“经密码子优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调控序列”是指位于编码序列的转录起始位点上游的核苷酸序列、5'非翻译区和3'非编码区，并且其可以影响相关的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、增强子、沉默子、5'非翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。

“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，启动子序列位于编码序列的5'上游。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的细胞生长和/或发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而指导基因的表达。引起基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

术语“3'非编码序列”、“转录终止子”和“终止子”指位于编码序列3'下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3'端。3'区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。

术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，以便其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它可操作地连接编码序列。即，编码序列处于启动子的转录控制下。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。

术语“重组”指两个原本分离的序列片段的人工组合，例如通过化学合成或通过以遗传工程技术操纵分离的核酸片段实现人工合成。

如本文所用，术语“表达”是指有义（mRNA）或反义RNA的转录和稳定积聚。表达还包括mRNA至多肽的翻译。

“转化”指将核酸分子转移进宿主生物体内。所述核酸分子可以是自主复制的质粒；或者，其可以被整合进宿主生物的基因组。含有转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化的”生物体或“转化体”。

“稳定转化”是指将核酸片段转移进宿主生物的基因组中（既包括核基因组也包括细胞器基因组），导致基因稳定遗传（即，该核酸片段被“稳定地整合”）。相反“瞬时转化”指将核酸片段转入宿主生物的核中或包含DNA的细胞器中，在无整合或无稳定的遗传特性的情况下引起基因表达。

术语“质粒”和“载体”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以具有源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，并且可以是线性的或环状的、单链或双链DNA或RNA的，其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体，该独特构建体能够将表达盒引入细胞中。

术语“表达盒”指DNA片段，所述DNA片段包含：所选基因的编码序列和所选基因产物表达所需的位于该编码序列之前（5'非编码序列）和之后（3'非编码序列）的调控序列。因此，表达盒通常由如下序列构成：1）启动子；2）编码序列（即，ORF）；和，3）在真核生物中通常包含多聚腺苷酸化位点的终止子。表达盒通常包含于载体中，以有利于克隆和转化。可以将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物体中，只要能针对每种宿主使用正确的调控序列。

术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1）GCG程序包（Wisconsin Package Version9.0，Genetics Computer Group（GCG），Madison，WI）；2）BLASTP、BLASTN、BLASTX（Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410（1990））；3）DNASTAR（DNASTAR，Inc.Madison，WI）；4）Sequencher（Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI）；和，5）整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序（W.R.Pearson，Comput.MethodsGenome Res.，[Proc.Int.Symp.]（1994），会议日期1992，111-20，编辑：Suhai、Sandor，Plenum：New York，NY）。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

在核酸或多肽序列上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指两序列中的核酸碱基或氨基酸残基当在指定比较窗口中比对最大匹配时是相同的。因此，“序列同一性百分比”或“同一性百分比”指通过在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列而测得的值，其中在与参考序列（其不包含添加或缺失）进行比较时，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失（即缺口）以实现两个序列的最佳比对。所述百分比的计算方法是，统计相同的核酸碱基或氨基酸残基在两段序列中同时出现的位点的数量以得到匹配位点数，将此匹配位点数除以比对窗口中的总位点数，再将结果乘以100，从而得到序列一致性百分比。

用于测定“同一性百分比”和“相似性百分比”的方法在被编码于可公开获得的计算机程序中。同一性百分比和相似性百分比能够容易地通过已知方法计算出来，所述方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：1）Computational Molecular Biology（Lesk，A.M.编辑）Oxford University：NY（1988）；2）Biocomputing：Informatics and Genome Projects（Smith，D.W.编辑）Academic：NY（1993）；3）Computer Analysis of Sequence Data，Part I（Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑）Humania：NJ（1994）；4）Sequence Analysis in Molecular Biology（von Heinje，G.编辑）Academic（1987）；和，5）Sequence Analysis Primer（Gribskov，M.和Devereux，J.编辑）Stockton：NY（1991）。

序列比对和百分比同一性或相似性的计算可以用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定，这些方法包括但不限于LASERGENE生物信息学计算软件包（DNASTAR Inc.，Madison，WI）的MegAlign^TM程序。作为另外一种选择，“BLASTN比对方法”是由美国国立生物技术信息中心[“NCBI”]提供的算法，采用默认参数比较核苷酸序列，而“BLASTP比对方法”是由NCBI提供的算法，采用默认参数比较蛋白质序列。

本文使用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且被描述于下列文献中：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY（1989）（下文称为“Maniatis”）；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY（1984）；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ（1987）。

图1A和图1B共同描绘了用于EPA生产的多种途径，如下文所述。所有途径都需要最初通过Δ12去饱和酶将油酸转化成亚油酸[“LA”]（第一个ω-6脂肪酸）。然后，使用“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”并以LA作底物，如下所述来形成长链ω-6脂肪酸：1）通过Δ9延伸酶将LA转化成二十碳二烯酸[“EDA”]；2）通过Δ8去饱和酶将EDA转化成二高-γ-亚麻酸[“DGLA”]；3）通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成花生四烯酸[“ARA”]；4）通过C_20/22延伸酶将ARA转化成二十二碳四烯酸[“DTA”]；以及，5）通过Δ4去饱和酶将DTA转化成二十二碳五烯酸[“DPAn-6”]。

“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”还能够使用α-亚麻酸[“ALA”]作为底物，产生长链ω-3脂肪酸如下：1）通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA（第一个ω-3脂肪酸）；2）通过Δ9延伸酶将ALA转化成二十碳三烯酸[“ETrA”]；3）通过Δ8去饱和酶将ETrA转化成二十碳四烯酸[“ETA”]；4）通过Δ5去饱和酶将ETA转化成二十碳五烯酸[“EPA”]；5）通过C_20/22延伸酶将EPA转化成二十二碳五烯酸[“DPA”]；以及，6）通过Δ4去饱和酶将DPA转化成二十二碳六烯酸[“DHA”]。任选地，ω-6脂肪酸可以被转化成ω-3脂肪酸。例如，ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA产生。就本文目的而言，有利的是Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径能够生产不含显著量的γ-亚麻酸[“GLA”]的油。

ω-3/ω-6脂肪酸生物合成的替代途径利用Δ6去饱和酶和C_18/20延伸酶，即，“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”。更具体地，LA和ALA可以通过Δ6去饱和酶分别被转化成GLA和十八碳四烯酸[“STA”]；然后，C_18/20延伸酶将GLA转化成DGLA和/或将STA转化成ETA。

EPA在重组微生物宿主细胞中的经济的商业生产需要考虑多种变量，包括EPA浓度[“EPA%TFA”]、总脂质含量[“TFA%DCW”]和EPA产率[“EPA%DCW”]。此外，还希望在最终的油产物中减少中间体脂肪酸和副产物脂肪酸的产生，以使所期望的脂肪酸即EPA的生产最大化。

中间体脂肪酸是能够通过其它代谢途径的酶的作用被进一步转化成EPA的那些脂肪酸（例如，油酸、LA、ALA、EDA、DGLA、ETA）。与此相对，副产物脂肪酸（例如，金松烯酸、杜松烯酸）是指所产生的既不是EPA也不是能被进一步转化成EPA的中间体脂肪酸的任何脂肪酸。

美国专利申请公布2009-0093543-A1描述了具有生产微生物油的能力的优化的重组解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株，其中所述微生物油包含至少约43.3EPA%TFA，同时具有少于约23.6LA%TFA（EPA:LA比率为1.83）。优选的菌株是Y4305，其最高产量为55.6EPA%TFA，具有3.03的EPA:LA比率。一般来讲，美国专利申请公布2009-0093543-A1的EPA菌株包含ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的下列基因：

a)至少一种编码Δ9延伸酶的基因；和

b)至少一种编码Δ8去饱和酶的基因；和

c)至少一种编码Δ5去饱和酶的基因；和

d)至少一种编码Δ17去饱和酶的基因；和

e)至少一种编码Δ12去饱和酶的基因；和

f)至少一种编码C_16/18延伸酶的基因；和

g)任选地，至少一种编码二酰基甘油

胆碱磷酸转移酶（CPT1）的基因。

具有上文所述的酶功能的优选的基因的例子如美国专利申请公布2009-0093543-A1的表3中所示。这些基因并非旨在是限制性的；相反，美国专利申请公布2009-0093543-A1的基因应当作为有用的参考，指导对具有Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_16/18延伸酶和/或CPT1功能的ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的适合基因的选择。

如本领域的技术人员所将会知道的，每种特定的宿主细胞在使用核苷酸密码子来规定给定的氨基酸时将表现出“密码子偏好性”。因此，设计每种特定的Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_16/18延伸酶和/或CPT1基因，使得其密码子使用频率接近将被工程化改造以生产EPA的重组微生物宿主细胞所偏好的密码子使用频率，将是合乎期望的。

本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其它物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。优选的核酸片段，即，编码Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_16/18延伸酶和/或CPT1多肽的分离的多核苷酸，编码与美国专利申请公布2009-0093543-A1的表3中所述的那些至少约70-80%相同的多肽，而更优选的核酸片段编码至少约80-85%或至少约85-90%或甚至至少约90-95%相同的氨基酸序列。

美国专利申请公布2010-0317072-A1描述了具有生产改进的微生物油的能力的优化的重组解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株，所述改进是基于EPA%TFA和EPA:LA的比率，相对于美国专利申请公布2009-0093543-A1中所述的那些菌株而言。优选的菌株是Y9502，其最高产量是57EPA%TFA，具有4.49的EPA:LA比率和21.3EPA%DCW的EPA产率。除了表达如美国专利申请公布2009-0093543-A1中所详述的ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因外，这些改进的菌株的特征还在于：

2)任选地包含至少一种编码酶的多核苷酸，所述酶选自丙二酰-CoA合成酶[“MCS”]或酰基-CoA溶血磷脂酰基转移酶[“LPLAT”]；

3)包含至少一种过氧化物酶体生物合成因子蛋白，所述过氧化物酶体生物合成因子蛋白的表达已被下调；

4)产生至少约50EPA%TFA；和

5)具有至少约3.1的EPA:LA比率。

复合酶接头优选地选自：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；并且，所述复合酶优选具有基本上由选自下列的序列组成的序列：EgD9eS/EgD8M（SEQ ID NO:12）、EaD9eS/EaD8S（SEQ ID NO:14）和E389D9eS/EgD8M（SEQ ID NO:16）。所述至少一种其表达已被下调的过氧化物酶体生物合成因子蛋白优选地选自：Pex1p（SEQ ID NO:51）、Pex2p（SEQ ID NO:52）、Pex3p（SEQ ID NO:53）、Pex3Bp（SEQ IDNO:54）、Pex4p（SEQ ID NO:55）、Pex5p（SEQ ID NO:56）、Pex6p（SEQ ID NO:57）、Pex7p（SEQ ID NO:58）、Pex8p（SEQ ID NO:59）、Pex10p（SEQ ID NO:60）、Pex12p（SEQ ID NO:61）、Pex13p（SEQ ID NO:62）、Pex14p（SEQ ID NO:63）、Pex16p（SEQ ID NO:64）、Pex17p（SEQ ID NO:65）、Pex19p（SEQ ID NO:66）、Pex20p（SEQ ID NO:67）、Pex22p（SEQ ID NO:68）和Pex26p（SEQ ID NO:69），其中Pex3p的敲除是尤其优选的。

尽管上述序列就在重组的耶氏酵母（Yarrowia）宿主细胞中的使用而言是优选的，这些基因并非旨在是限制性的。如之前关于在重组微生物宿主细胞中表达的特定去饱和酶和延伸酶已论及的，在用于规定给定氨基酸的核苷酸密码子的使用中的“密码子偏好性”是必须要考虑的。因此，可以将美国专利申请公布2010-0317072-A1中所示的关于DGLA合酶复合酶的设计和优选的Pex基因敲除的教导，应用于将被工程化改造以产生EPA的任何重组微生物宿主细胞。优选的核酸片段，即编码DGLA合酶和/或Pex多肽的分离多核苷酸，编码与上文所述的那些至少约70-80%相同的多肽，而更优选的核酸片段编码至少约80-85%或至少约85-90%或甚至至少约90-95%相同的氨基酸序列。

本文提供了基于提高的EPA产率（即，测量为提高的EPA%DCW），相对于美国专利申请公布2009-0093543-A1和美国专利申请公布2010-0317072-A1中所描述的那些菌株，具有生产改进的微生物油的能力的进一步改进的最优化的重组微生物宿主细胞。除了表达表达ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因之外，其中所述基因包括至少一种复合酶（其中所述复合酶包含多肽，所述多肽具有至少一个Δ9延伸酶，所述Δ9延伸酶连接至少一个Δ8去饱和酶，如美国专利申请公布2010-0317072-A1中所述）并且包含至少一种过氧化物酶体生物合成因子蛋白，所述过氧化物酶体生物合成因子蛋白的表达已被下调（如美国专利申请公布2010-0317072-A1中所述），本文所公开的改进的重组微生物宿主细胞的特征还在于：

1)包含至少两种多肽，所述多肽具有至少溶血磷脂酸酰基转移酶[“LPAAT”]活性；

2)包含至少一种多肽，所述多肽具有至少磷脂：二酰基甘油酰基转移酶[“PDAT”]活性；

3)任选地包含至少一种突变Δ9延伸酶多肽，其中所述突变Δ9延伸酶多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3具有至少一个氨基酸突变的差异，所述突变选自：

i)L35F突变；

ii)L35M突变；

iii)L35G突变；

v)L35G、A21V、L108G和I179R突变；

vi)L35G、W132T和I179突变；

vii)L35G、S9D、Y84C和I179R突变；

viii)L35G、Y84C、I179R和Q244N突变；

ix)L35G、A21V、W132T、I179R和Q244N突变；

x)K58R和I257T突变

xi)D98G突变；

xii)L130M和V243A突变；和

xiii)包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自：K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y和I257T；和

4)产生包含以DCW的重量%测量的至少25重量%的EPA的微生物油。

如上文所指出的，本文所公开的改进的重组微生物宿主细胞的独特之处在于，该菌株具有至少两种具有至少LPAAT活性的多肽和至少一种具有至少PDAT活性的多肽；因此，期望存在甘油磷脂从头生物合成途径的组分的上调。

甘油磷脂是生物膜的主要组分，其包含甘油核心，脂肪酸作为R基连接在甘油核心的sn-1位和sn-2位上，而极性头部基团通过磷酸二酯键连接在sn-3位上（参见美国专利申请公布2010-0317882-A1）。甘油磷脂具有极大的多样性，这不仅是因为可变的磷酰基头部基团，还因为它们的脂肪酸的不同链长和饱和度。一般而言，饱和的和单不饱和的脂肪酸在sn-1位被酯化，而PUFA在sn-2位被酯化。

甘油磷脂的生物合成是复杂的。下面的表3概述了最初由Kennedy和Weiss（J.Biol.Chem.，222：193-214（1956））描述的从头合成途径的步骤：

表3：甘油磷脂从头生物合成的一般反应

在被从头合成之后，甘油磷脂能够经历sn-2位的脂肪酰成分的快速翻转。这种“重构”，或者“酰基编辑”，对于膜的结构和功能、对压力条件的生物学应答、以及在生物技术应用中对脂肪酸组成和数量的操纵是重要的。具体地，重构是由于甘油磷脂的脱酰反应和所产生的溶血磷脂随后的再酰化（即，使得酰基-CoA脂肪酸被从细胞的酰基-CoA库中移除并且在磷脂库中多种溶血磷脂底物在sn-2位被酰化）。

多项研究预期了酰基-CoA：溶血磷脂酰基转移酶[“LPLATs”]与PUFA生物合成基因的共表达，提高转基因生物的油中所期望的脂肪酸的量、提高总的油含量或选择性地提高所期望的脂肪酸的含量的有益效果，因为脂肪酸生物合成需要酰基在酰基-CoA库和磷脂库之间的迅速交换（即，去饱和作用主要在磷脂的sn-2位发生，而延伸在酰基-CoA库中发生）（参见，国际申请公布WO2004/076617、WO2004/087902、WO2006/069936、WO2006/052870、WO2009/001315、WO2009/014140）。但是，美国专利申请公布2010-0317882-A1中所公开的工作，是第一个进行的用于检测LPAAT和LPCAT在针对高水平的EPA生产工程化的含油生物中的效应的研究。

更具体地，美国专利申请公布2010-0317882-A1的实例3、4、7和8比较了ScLPAAT1S、MaLPAAT1S和YlLPAAT1（如下文的表4中所述）在重组解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Y8406中的表达的效应，所述菌株通过表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径，而被工程化为生产相对于总脂质～51%的EPA。

MaLPAAT1和YlLPAAT1具有34.0%的序列同一性，而ScLPAAT和YlLPAAT1具有43.9%的序列同一性；全部三种野生型蛋白质具有如NHxxxxD（SEQ ID NO:26）和EGTR（SEQ ID NO:27）所示的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序，如Lewin，T.W等人（Biochemistry，38：5764-5771（1999））和Yamashita等人（Biochim，Biophys.Acta，1771：1202-1215（2007））所述。

在进行了下列之后，分析了ScLPAAT1S、MaLPAAT1S和YlLPAAT1在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中的过表达：（a）通过染色体整合，转化了线性化的携带MaLPAAT1S或YlLPAAT1的DNA，以产生稳定整合，其中转化体在相对丰富的非选择性培养基上生长；或（b）转化了携带自主复制序列以及YlLPAAT或ScLPAAT1S的环状质粒DNA，转化体在选择性培养基上生长[即，在表4中被标记为“染色体整合”或“质粒表达”]。相对于通过染色体整合，当LPAAT的过表达通过质粒表达发生时，结果是最小化的，这种现象可能是由于染色体整合的“位置效应”和/或不同的生长条件；或者，质粒的损失也可能导致所观察到的结果。然而，在任何情况下，表4中的结果展示了LPAAT的过表达导致了以占TFA的重量%计的LA（18:2）浓度[“LA%TFA”]的显著降低、以占TFA的重量%计的EPA浓度[“EPA%TFA”]的升高、和Δ9延伸酶转化效率的升高，上述这些参数均为与对照相比。

基于以上总结的结果，具有产生改进的EPA%干细胞重量的能力的重组微生物宿主细胞的改进的优化的菌株，因此包含至少两种选自下列的LPAAT：

(a)基本上由选自下列的序列组成的序列：SEQ ID NO:18（MaLPAAT1）、SEQ ID NO:20（MaLPAAT1S）、SEQ ID NO:22（YlLPAAT1）、SEQ ID NO:23（ScLPAAT1）和SEQ ID NO:25（ScLPAAT1S）；以及

(b)多肽，所述多肽基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO:18（MaLPAAT1）、SEQ ID NO:22（YlLPAAT1）和SEQ ID NO:23（ScLPAAT1）的氨基酸序列进行比较时具有至少43.9%的氨基酸同一性，并且所述多肽还包含至少一种选自SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序。

需要澄清的是，所述至少两种LPAAT能够是：1）针对从单一物种分离的特定LPAAT的相同编码序列的两个拷贝；或2）针对从物种“A”分离的LPAAT的一种编码序列和针对从物种“B”分离的LPAAT的一种编码序列，因此总共产生两种LPAAT。

本发明的优化的重组微生物宿主细胞还将包含至少一种具有PDAT活性的多肽。Dahlqvist等人（Proc.Nat.Acad.Sci.（USA），97：6487-6492（2000））和Oelkers等人（J.Biol.Chem.，275：15609-15612（2000））是首先认识到TGA的合成能够在酰基-CoA的不存在下，通过不依赖酰基-辅酶的PDAT酶（结构上与卵磷脂：胆固醇酰基转移酶家族蛋白质相关）发生的。更具体地，Dahlqvist等人和Oelkers等人证明了编码PDAT（SEQID NO:30；“ScPDAT”）的啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）LRO1基因的过表达导致了提高的TAG含量，而ScPDAT的缺失导致了TAG合成的显著降低。延续这一工作，美国专利7,267,976描述了编码PDAT的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）ATCC90812基因（即，本文的SEQ ID NO:28和29）的克隆、过表达和敲除，所述基因被测定为与ScPDAT具有47.1%的氨基酸序列同一性。具有被破坏的PDAT的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株被发现与野生型菌株相比具有较低的油含量[“TFA%DCW”]（大约29-38%），而同时具有PDAT2和DGAT2的破坏的菌株被测定为与对照相比仅具有17-27%的油含量。然后，在自身的天然PDAT和DGAT2基因具有破坏的啤酒糖酵母（S.cerevisiae）菌株中，表达了解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）PDAT；与对照相比，TFA%DCW在上述转化体菌株中是两倍的。

基于上述讨论，本领域的技术人员将会知道PDAT在改变总脂质含量中的作用。本文所述的重组微生物宿主细胞将因此包含至少一种选自下列的PDAT：

(a)基本上由选自下列的序列组成的序列：SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:30，以及

(b)多肽，所述多肽基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO:29和、SEQ ID NO:30的氨基酸序列进行比较时具有至少约90%的氨基酸同一性、或更优选至少约95%的氨基酸同一性。

近来，E.I.duPont de Nemours&Company已投入了相当多的努力来鉴定具有高活性的Δ9延伸酶突变体，其将适合在商业上有用的重组微生物宿主细胞中整合进PUFA生物合成途径，因为在先的研究已显示，Δ9延伸（以及Δ6延伸）由于酰基在磷脂和酰基-CoA库之间的转移不佳而是长脸PUFA生物合成中的瓶颈。如美国临时申请61/377248[代理人档案号CL4783USPRV，提交于2010年8月26日，其全文以引用方式并入本文]中所述并在本文中作为实例10A-10J所示出的，在突变EgD9eS多肽中鉴定了特定的突变（即，来源于EgD9eS[SEQ ID NO:3]），基于LA至EDA的转化，与SEQ ID NO:3的酶活性相比，其导致了酶活性至多45%的提高。

更具体地，由于来自Δ9延伸酶的晶体结构的缺乏，原理靶向的鉴定适合的突变的方法在Δ9延伸酶中是不理想的，仅有一项研究涉及谷氨酰胺残基在绿光等鞭金藻（Isochrysis galbana）Δ9延伸酶[“IgD9e”；SEQ IDNO:41和42]的变异的组氨酸盒[“His-box”]基序中的重要性（Qi，B.等人，FEBS Lett.，547：137-139（2003））。被鉴定的第一个具有Δ9延伸酶活性的PUFA特异性延伸酶IgD9e，被发现具有Gln-Xaa-Xaa-His-His[“QxxHH”；SEQ ID NO:71]基序，而不是存在于Δ6延伸酶中的高度保守的His-Xaa-Xaa-His-His[“HxxHH”；SEQ ID NO:72]基序。Qi，B.等人证明了用组氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸残基取代谷氨酰胺在本文所分析的每种突变IgD9e多肽中导致了较低的Δ9延伸酶活性，并从而得出了“组氨酸盒中的谷氨酰胺残基似乎对于对佳的酶催化反应是必需的”的结论。

除了Qi等人的工作之外，七种基序也已知是在IgD9e（SEQ ID NO:42）、小眼虫（Euglena gracilis）Δ9延伸酶[“EgD9e”；SEQ ID NO:32；美国专利7,645,604]和小型绿藻属（Eutreptiella sp.）CCMP389Δ9延伸酶[“E389D9e”；SEQ ID NO:38；美国专利7,645,604]的二者和三者之间是保守的。这些基序描述于美国专利7,645,604中，并且包括：Y-N-X-（L或F）-X₄-S-X₂-S-F（SEQ ID NO:73）；F-Y-X-S-K-X₂-（E或D）-Y-X-D-（T或S）-X₂-L（SEQ ID NO:74）；L-（Q或H）-X-F-H-H-X-G-A（SEQ IDNO:75）；M-Y-X-Y-Y-X₇-（K或R或N）-F（SEQ ID NO:76）；K-X-L-（I或L或M）-T-X₂-Q（SEQ ID NO:77）；W-X-F-N-Y-X-Y（SEQ ID NO:78）；和Y-X-G-X-V-X₂-L-F（SEQ ID NO:79）；七种X能够是任何氨基酸，并且带下划线的氨基酸可能是Δ9延伸酶特有的。

因此，用EgD9eS（SEQ ID NO:2）作为模板，通过易错PCR[“ePCR”]设计合成了编码Δ9延伸酶的突变序列的文库，其中EgD9eS被包含在包含嵌合的FBAINm::EgD9eS::Pex20基因的质粒构建体内。然后，将ePCR文库转入解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica），并基于气相色谱（GC）分析和EDP的生产，针对提高的Δ9延伸酶活性进行筛选。

鉴定了导致完全不具备功能的突变Δ9延伸酶（即，不具有可检测的Δ9延伸酶活性）或相对于野生型的酶EgD9eS具有充分降低的Δ9延伸酶活性的突变Δ9延伸酶的多个克隆。然而，令人吃惊地，鉴定了导致提高的LA至EDA的转化效率[以（[EDA]/[LA+EDA]）*100计算]的多种突变。具体地，五种单独的转化体被鉴定为包含四种不同的突变Δ9延伸酶基因（即，与EgD9eS的蛋白质序列[SEQ ID NO:3]相比，分别包含K58R/I257T突变、L35F突变、D98G突变和L130M/V243A突变），其中所述Δ9延伸酶的转化活性在为野生型EgD9eS的105%至117%之间变化（表5，参见下文），相当于5-17%的提高。因此，该工作展示了EgD9eS的Δ9延伸酶活性的确能够通过蛋白质工程而被提高。

然后，从上述EgD9eS ePCR文库获得的初始数据被用于从原理上鉴定EgD9eS中的两种适用于构建点饱和文库的两种不同的氨基酸残基（即，残基35和107）。同样，筛选了每一突变对所得到的突变EgD9eS的Δ9延伸酶活性的影响，从而使得能够鉴定两种导致提高的LA至EDA转化效率的附加的突变。具体地，鉴定了在突变Δ9延伸酶中包含L35G突变或L35M/Q107E突变的转化体菌株，其中Δ9延伸酶转化效率为野生型EgD9eS的142%-145%或132%（表5，参见下文），相当于32-45%的提高。

随着L35G突变的鉴定，使用

技术并以EgD9eS-L35G作为靶，构建了靶向50种不同氨基酸残基的后续文库。鉴定了二十五种不同的突变，每种与L35G突变一起，导致了与亲本延伸酶，即EgD9eS-L35G相比从96%至141%的Δ9延伸酶转化活性（表5，参见下文），相当于-4%至41%的提高。

最后，最近的工作已试图合并（或“堆积”）在

文库中鉴定的多种有益的突变，从而在合成的经密码子优化的EgD9eS序列中“堆积”适当的个别氨基酸突变。因此，例如，相对于SEQ ID NO:3包含A21V、L35G、W132T、I179R和Q244N突变的突变Δ9延伸酶已被证明导致相对于EgD9eS为123%的提高的Δ9延伸酶转化活性（表5，参见下文），相当于23%的提高。

表5：具有提高的Δ9延伸酶活性的突变的概述

a“相对活性”是指每种突变EgD9eS相对于如SEQ ID NO:3所示的EgD9eS的Δ9延伸酶活性的Δ9延伸酶活性。

b“相对活性”是指每种突变EgD9eS相对于如SEQ ID NO:44所示的EgD9eS-L35G的Δ9延伸酶活性的Δ9延伸酶活性。

作为上文所详述的工作的结果，本文所述的重组微生物宿主细胞可以因此包含至少一种突变Δ9延伸酶多肽，其中所述突变Δ9延伸酶多肽包含如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3具有至少一个氨基酸突变的差异，如图16B中所显示的，所述突变选自：

i)L35F突变；

ii)L35M突变；

iii)L35G突变；

V)L35G、A21V、L108G和1179R突变；

vi)L35G、W132T和1179突变；

vii)L35G、S9D、Y84C和1179R突变；

viii)L35G、Y84C、1179R和Q244N突变；

ix)L35G、A2lV、W132T、1179R和Q244N突变；

x)K58R和1257T突变

xi)D98G突变；

xii)L130M和V243A突变；和

xiii)包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自：K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、1179M、Il79R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y和1257T。

在优选的实施例中，所述突变EgD9eS相对于SEQ ID NO：3至少包含L35G突变。例如，本文中作为“EgD9eS-L35G”描述的相对于SEQ ID NO：3具有单个L35G突变的突变△9延伸酶多肽(如SEQ ID NO：44中所示)的△9延伸酶活性，相对于EgD9eS的△9延伸酶活性为142-145％，相当于42-45％的提高。

除了表达如上文所述的至少两种LPAAT、至少一种PDAT和(任选地)至少一种突变△9延伸酶，以及编码用于EPA生物合成的ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径△9延伸酶／△8去饱和酶的基因(即，包含至少一种△9延伸酶、至少一种△8去饱和酶、至少一种△5去饱和酶、至少一种△17去饱和酶、至少一种△12去饱和酶和至少一种C_16／18延伸酶，其中存在至少一种包含连接至少一个脂肪酸△8去饱和酶的至少一个△9延伸酶的复合酶)之外，产生至少25 EPA％DCW的本发明的重组宿主细胞还可以任选地表达多种其它异源性基因。这些可以包括，例如，编码磷酸胆碱胞苷酰转移酶[“PCT”]、二酰基甘油胆碱磷酸转移酶[“CPTl”]、丙二酰CoA合成酶[“MCS”]和／或△9去饱和酶的基因，如下文所详述的。

磷脂酰胆碱[“PC”]生物合成途径包含三个步骤：

(i)ATP+胆碱→ADP+O-胆碱磷酸，由胆碱激酶[EC2.7.1.32]催化；

(ii)

由磷酸胆碱胞苷酰转移酶[“PCT”；EC2.7.7.15]催化；以及

(iii)

由二酰基甘油胆碱磷酸转移酶[“CPT1”；EC2.7.8.2]催化。

美国专利申请公布2009-0093543-A1描述了至少一种编码CPT1的基因的任选的共表达。本文建议至少一种编码PCT的基因的任选的共表达。这些酶之一或全部两者的表达将上调PC生物合成途径，从而导致提高的PC生物合成。PUFA在PC（以及其它的甘油磷脂）的sn-2位酯化。因此，这些酶的提高的表达可以提供附加的机制，在其中PUFA可以被储存在重组微生物宿主细胞中（即，尽管PUFA的主要的储存将是以TAG的形式）。提高的PC生产还可以通过下列的协同作用有利于在细胞内随后的“重构”或“酰基编辑”：1）磷脂酶，例如磷脂酶A₂，其从PC的sn-2位释放脂肪酸；和，2）LPLAT，例如在sn-2位使LPC再酰化的LPCAT。这有利于酰基-CoA脂肪酸从细胞的酰基-CoA库的移除和在磷脂库中多种溶血磷脂底物在sn-2位的酰化。

不受上文所示的特定理论的约束，在按照本公开改造的重组宿主细胞中过表达PCT和/或CPT1可以是合乎期望的。编码PCT和/或CPT1的基因对于所示宿主细胞可以是天然的或异源性的。例如，在最优化的耶氏酵母（Yarrowia）菌株中，表达如SEQ ID NO:45（编码SEQ ID NO:46的蛋白质）所示的耶氏酵母PCT基因和/或如SEQ ID NO:47（编码SEQ ID NO:48的蛋白质）所示的耶氏酵母CPT1基因、或在序列和功能上与SEQ IDNO:46和/或SEQ ID NO:48具有充分的相似性的相关的酶是优选的。

美国专利申请公布2010-0317072-A1描述了至少一种编码丙二酰CoA合成酶[“MCS”]的多肽在针对EPA的生物合成工程化的重组宿主细胞中的任选的共表达。在先的研究已确定，许多与在解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）中工程化PUFA的生产相关的基因突变导致有机酸“副产物”的提高的积聚，其不能够在微生物发酵过程中被进一步利用（丙二酸占所积聚的总的有机酸的～45%）。具体地，美国专利申请公布2010-0159558-A1描述了异源性MCS[EC6.2.1.-]在生产EPA的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）的重组菌株中的表达，其催化下列酶促反应：丙二酸+ATP+CoA→丙二酰-CoA+AMP+焦磷酸（PPi）。通过将所述副产物（即，丙二酸）转化成丙二酰-CoA，该底物变得可供在该生物中合成脂肪酸的过程中使用。因此，除了使丙二酸作为副产物的产生降低～94%（g/g DCW），异源性MCS的表达还有助于在该生物中避免碳和能量的浪费、降低在发酵过程中维持最优的pH范围所需要的碱的量和降低在发酵废蒸汽中需要中和的副产物有机酸的量。优选的MCS来源于豌豆根瘤菌（Rhizobiumleguminosarum bv.viciae）3841（GenBank登录号YP_766603）并且其经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）中表达（即SEQ ID NO:49和50）。

在按照本公开工程化的最优化的耶氏酵母（Yarrowia）或其它重组宿主细胞中，表达如上文的SEQ ID NO:49和50所示的MCS、或在序列和功能上与SEQ ID NO:50具有充分的相似性的相关的酶，可能是合乎期望的。

可以任选地在本文所述的重组微生物宿主细胞中表达的另外的基因是Δ9去饱和酶。如对于本领域的技术人员将显而易见的，这种特定的酶的过表达将提高硬脂酸[18:0]至油酸[18:1]的转化，从而导致将碳更多地“推”入PUFA生物合成途径。

本文所述的重组微生物宿主细胞还可以包含至少一种突变Δ5去饱和酶。连同Δ6、Δ8和Δ4去饱和酶一起，已知Δ5去饱和酶是长链PUFA“前端”去饱和酶（其中去饱和发生在业已存在的双键和脂肪酸酰基的羧基末端之间，与甲基定向的去饱和相反）。这些去饱和酶特征在于三个组氨酸框[H（X）_3-4H（SEQ ID NO:186和187）、H（X）_2-3HH（SEQ ID NO:188和189）和H/Q（X）_2-3HH（SEQ ID NO:190和191）]，以及是细胞色素b₅融合超家族的成员，因为它们在N末端具有融合细胞色素b₅结构域，该结构域起到电子供体的作用。所述细胞色素b₅结构域还包含保守的血红素结合基序（即，HPGG序列[SEQ ID NO:181]），尽管其余的细胞色素b₅结构域序列有差异。早前被鉴定为Δ5去饱和酶的特征的附加的保守特征基序似乎也富含组氨酸（即，HDASH序列[SEQ ID NO:183]），尽管HDASH基序对于酶活性的重要性尚未被阐明。

在本发明的一些实施例中，所述至少一种Δ5去饱和酶可以选自：

a)突变多肽，所述突变多肽包含：如SEQ ID NO:180[HxGx]所示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO:180[HxGx]与SEQ ID NO:181[HPGG]是不同的；以及，如SEQ ID NO:182[HxxxH]所示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO:182[HxxxH]与SEQ ID NO:183[HDASH]是不同的；

b)突变多肽，所述突变多肽具有选自下列的氨基酸序列：SEQ IDNO:106[EgD5M或经密码子优化的EgD5R*-34g158g]、SEQ IDNO:108[EgD5R*-34g158g347s]、SEQ ID NO:110[EgD5S-36s157g]、SEQ ID NO:112[EaD5S-35a158g]、SEQ ID NO:299[EgD5R*-34g157g]、SEQ ID NO:301[EgD5R*-34g158a]、SEQ IDNO:303[EgD5R*-34g158g]、SEQ ID NO:329[EgD5S-36s156e]、SEQ ID NO:331[EgD5S-36s158a]、SEQ ID NO:333[EgD5S-36s158g]、SEQ ID NO:363[EaD5S-35a158s]、SEQ ID NO:365[EaD5S-35a159g]。

本文所述的重组微生物宿主细胞将能够生产包含至少约25EPA%DCW，优选至少约25-30EPA%DCW，更优选至少约30-32.5EPA%DCW，更优选至少约32.5-35EPA%DCW，最优选至少约35-40EPA%DCW的微生物油。如发酵领域的技术人员将会理解的，依赖于发酵自身的运行、培养基条件、工艺参数、规模等，以及对培养物取样的特定时间点，特定重组微生物宿主细胞的油组成谱中将存在可变性。因此，具有特定基因型的特定重组微生物宿主当在最优化的条件下被培养时可能能够生产包含至少约25EPA%DCW的微生物油，但将不会总是生产包含至少约25EPA%DCW的微生物油（例如，当发酵长度不足时）。因此，本文的讨论指的是微生物当在适当的条件下被培养时生产至少约25EPA%DCW的“能力”。

如对于本领域的技术人员将显而易见的，使用本文所述的方法能够工程化众多能够生产至少约25EPA%DCW的不同的优化的重组菌株。出于商业目的对优选的菌株的选择将既考虑以占总脂肪酸的百分比计的EPA浓度[“EPA%TFA”]，又考虑总脂质含量[“TFA%DCW”]，因为这两个参数均影响以占干细胞重量计的细胞EPA含量[“EPA%DCW”]。即，EPA%DCW计算如下：（EPA%TFA）*（TFA%DCW）]/100。例如，产生40EPA%TFA并具有62.5TFA%DCW的菌株、产生45EPA%TFA并具有55.55TFA%DCW的菌株、产生50EPA%TFA并具有50TFA%DCW的菌株、产生55EPA%TFA并具有45.45TFA%DCW的菌株、产生60EPA%TFA并具有41.67TFA%DCW的菌株和产生65EPA%TFA并具有38.46TFA%DCW的菌株均产生25EPA%DCW。

在优选的实施例中，所述改进的重组微生物宿主细胞将能够产生包含至少25EPA%DCW的微生物油并将产生至少45EPA%TFA。更优选，所述油将包含至少约47-50EPA%TFA，优选至少约50-55EPA%TFA，更优选至少约55-60EPA%TFA，更优选至少约60-70EPA%TFA，以及最优选至少约70-80EPA%TFA。

在另一实施例中，所述改进的重组微生物宿主细胞将能够产生包含至少25EPA%DCW的油，并且在所述改进的重组微生物宿主细胞内或在从其提取的或未浓缩的油内的脂质特征将具有至少约2.4的EPA%TFA对LA%TFA比率。如在美国专利申请公布2009-0093543-A1中的在先的讨论，使中间体脂肪酸LA的浓度最小化（导致提高的EPA:LA比率），将导致更多的碳被“推”着通过PUFA生物合成途径并允许提高的EPA合成。在优选的实施例中，EPA:LA的比率将为至少约2.4-2.75，更优选至少约2.75-3.25，更优选至少约3.25-4，以及最优选至少约4-5.5。

多种微生物宿主细胞天然地产生微生物油，包括多种细菌、酵母、藻类、眼虫、原生藻菌、真菌、以及它们的混合物。并且，EPA能够基于利用的特定微生物的天然能力经由多个不同方法由微生物产生[例如异养生物硅藻小环藻属（Cyclotella sp.）和菱形藻属（Nitzschia sp.）（美国专利5,244,921）；假单胞菌属（Pseudomonas）、交替单胞菌属（Alteromonas）或希瓦氏菌属（Shewanella）菌种（美国专利5,246,841）；草腐霉枯萎属（Pythium）的丝状真菌（美国专利5,246,842）；或长被孢霉属（Mortierella elongata）、微小被孢霉（M.exigua）、或喜湿被孢霉（M.hygrophila）（美国专利5,401,646）]。描述天然产生EPA的微生物的有用参考文献为Z.Wen和F.Chen，Single Cell Oils；C.Ratledge和Z.Cohen编辑；AOCS Publishing，2005；第10章，题目为“Prospects for EPAproduction using microorganisms”。

出于本文的目的，所述重组微生物宿主细胞应当是能够通过基因工程工具接受遗传学操作的细胞，并且能够产生包含至少约25EPA%DCW的微生物油。

通过导入合适的PUFA生物合成途径基因，例如Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶和C_18/20延伸酶的特定组合，能够将缺乏制造EPA的天然能力的微生物工程化以表达PUFA生物合成途径，但是应当认识到导入的特定酶（以及编码那些酶的基因）绝不对本发明构成限制。例如，公开文献和专利文献教导了用于EPA生物合成（尽管是以低的生产水平）的对下列的工程化的方法：大肠杆菌（Escherichia coli）（Orikasa，A.等人，Cell Mol.Biol.50：625-630（2004））、啤酒糖酵母（Saccharomyces cereviasiae）（Tavares，S.等人，AEM，77（5）1854-1861（2011）。

在优选的实施例中，所述微生物宿主细胞是含油的，使得它们DCW的超过约25%积聚为油。含油微生物宿主细胞可为例如选自下组的属的成员：被孢霉属（Mortierella）、破囊壶菌属（Thraustochytrium）、裂殖壶菌属（Schizochytrium）和含油酵母（oleaginous yeast）。含油酵母能够合成并积聚油，其中总油含量可占DCW的大于约25%，更优选占DCW的大于约30%，而最优选占DCW的大于约40%。在其它实施例中，非含油酵母能够经基因修饰变成含油的，使得它能够产生占DCW的大于25%的油，例如酵母如啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）（国际专利申请公布WO2006/102342）。

通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、丝孢酵母属（Trichosporon）和油脂酵母属（Lipomyces）。更具体地讲，示例性的油合成酵母包括：圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）、斯达氏油脂酵母（Lipomyces starkeyii）、产油油脂酵母（L.lipoferus）、拉可夫氏假丝酵母（Candida revkaufi）、铁红假丝酵母（C.pulcherrima）、热带假丝酵母（C.tropicalis）、产朊假丝酵母（C.utilis）、茁芽丝孢酵母（Trichosporonpullans）、皮状丝孢酵母（T.cutaneum）、胶粘红酵母（Rhodotorulaglutinus）、禾木科红酵母（R.graminis）和解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）（以前归类为解脂假丝酵母（Candida lipolytica））。

最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）；并且，在另一实施例中，最优选的是命名为ATCC20362、ATCC8862、ATCC18944、ATCC76982和/或LGAM S（7）1的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株（Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.82（1）：43-9（2002））。

任何上文提及的属均可以适合按照本公开进行重组改造，以产生能够产生包含至少25EPA%DCW的微生物油的宿主细胞。因此，将显而易见的是，遗传学操作不限于引入或上调适当的PUFA生物合成途径；相反，所述宿主生物还可以接受遗传学操作以改变所积聚的总脂质、改变甘油磷脂的生物合成、改变通过细胞的碳流、改变（直接或间接地）导致PUFA降解的途径，等。

要指出的是，EPA的结构形式是不限的；因此例如，EPA可在总脂质中以FFA或酯化形式存在。优选地，所述至少一种PUFA为TAG形式。

尽管多种重组微生物宿主细胞能够按照本公开被工程化以产生EPA，本发明在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中是已被证明的。本领域的技术人员将会知道，本发明的方法不限于使用本发明在其中已被证明的物种或属。相反，能够产生包含至少25EPA%DCW的微生物油的任何含油酵母或任何其它适合的微生物将同样适用于本发明的方法。

含有引导外来基因高水平表达的调控序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员熟知的。任何的这些能够被用于构建编码优选的去饱和酶、延伸酶、DGLA合酶、LPAAT、PDAT、PCT、CPT1和MCS蛋白质的嵌合基因。然后能够使用标准转化方法将这些嵌合基因导入所述微生物宿主细胞以提供高水平表达的编码酶。

可用于转化微生物宿主细胞的载体（如构建体、质粒）和DNA表达盒是本领域中为人们所熟知的。存在于构建体中的序列的具体选择取决于所需的表达产物、宿主细胞的性质以及提出的相对于未转化细胞分离转化细胞的手段。然而，通常该载体包含至少一个表达盒、一个选择性标记和允许自主复制或染色体整合的序列。适合的表达盒通常包含启动子、所选择的基因的编码序列和终止子。最优选两个控制区都来源于来自转化宿主细胞的基因。

如果两种或更多种基因从独立的复制载体表达，则希望每个载体具有不同的选择手段并且应该缺乏与其它构建体的同源性以便维持稳定表达和防止元件在构建体之间重配（reassortment）。可用实验方法确定对调控区、选择手段和所引入的构建体的增殖方法的正确选择，以便所有导入的基因均以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。

包含受关注的基因的构建体或载体，可以通过任何标准技术被导入宿主细胞。这些技术包括转化如醋酸锂转化（Methods in Enzymology，194：186-187（1991））、基因枪轰击（bolistic impact）、电穿孔、显微注射或将所关注的基因导入宿主细胞中的任何其它方法。例如，美国专利4,880,741和5,071,764以及Chen，D.C.等人（Appl.Microbiol.Biotechnol.，48（2）：232-235（1997））描述了基于DNA的线性化片段的用于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）的整合技术。

为方便起见，已经通过任何方法操纵来摄取DNA序列（如表达盒）的宿主细胞在本文中称为“转化的”、“转化体”、或“重组体”。转化的宿主将具有至少一个拷贝的表达盒，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该表达盒是整合进基因组内还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。转化的宿主细胞可以通过多种选择技术来鉴定，如美国专利7,238,482和美国专利7,259,255所述。

用于本文的优选选择方法是对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。在备选的实施例中，5-氟乳清酸（5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；“5-FOA”）被用于选择酵母尿嘧啶-突变体（美国专利申请公布2009-0093543-A1），或者可利用赋予磺酰尿类除草剂抗性（国际申请公布WO2006/052870）的天然乙酰羟酸合酶（或乙酰乳酸合酶；E.C.4.1.3.18）进行对转化体的选择。美国专利申请公布2009-0093543-A1中还教导了一种独特的方法，该方法通过使用位点特异性重组酶体系，“循环利用”一对优选的选择标记，用于连续进行的多重转化中。

如本领域的技术人员所熟知的，仅仅将基因（例如去饱和酶、延伸酶、DGLA合酶、LPAAT、PDAT、PCT、CPT1、MCS）插入克隆载体不确保它能以所需速率、浓度、量等表达。操纵许多控制转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和蛋白质位置、氧限制和从宿主细胞的分泌的不同遗传元件可能是合乎期望的。更具体地讲，通过改变以下几个方面可控制基因表达：相关启动子和终止子序列的性质；所克隆基因的拷贝数；所述基因是质粒携带的或整合到宿主细胞基因组中去的；所合成的外来蛋白质的最终细胞定位；在宿主生物中的翻译效率；所克隆基因的蛋白质在宿主细胞内的固有稳定性；以及所克隆基因中的密码子使用，使得其频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。这些过表达方法中的多种将在下文中被讨论，并且在对重组微生物宿主细胞的遗传学操作中作为过表达编码例如去饱和酶、延伸酶、DGLA合酶、LPAAT、PDAT、PCT、CPT1和MCS的基因的方法是有用的。

通过使用更强的启动子（调控型的或组成型的）引起表达增加、通过从mRNA或编码蛋白中移除/删除去稳定化序列、或通过将稳定序列加到mRNA（美国专利4,910,141）上，能在转录水平上提高所需基因的表达。

对于驱动异源性基因在微生物宿主细胞中的表达有用的启动子有很多，并且是本领域的技术人员已知的。表达能以诱导型或组成型完成。诱导型表达可通过诱导可操作地连接至所关注的基因的可调节启动子的活性来完成，而组成型表达可通过利用可操作地连接至所关注的基因的组成型启动子来实现。几乎任何能够指导去饱和酶、延伸酶、DGLA合酶、LPAAT、PDAT、PCT、CPT1和MCS基因的表达的启动子（即，天然的、合成的、或嵌合的）都将是适合的，尽管来自该宿主物种的转录和翻译区是尤其有用的。

终止子通常能够来源于启动子从其获得的基因的3'区或来自不同的基因。大量的终止子是已知的，并且在用于与它们所源自的属和物种相同的和不同的属和物种时，在多种宿主中令人满意地起作用。终止子的选择通常更多是为了方便而不是因为任何特殊的性质。优选地，终止子来源于酵母基因。终止子还能够是合成的，本领域的技术人员能够利用可利用的信息来设计和合成终止子。终止子可以是非必需的，但它是高度优选的。

尽管不旨在进行限制，用于耶氏酵母（Yarrowia）的重组微生物宿主细胞中的优选的启动子和终止子是美国专利公布2009-0093543-A1、美国专利公布2010-0068789-A1、美国专利公布2011-0059496-A1、美国临时专利申请61/469,933（代理人档案号CL4736USPRV，提交于2011年3月31日）、美国临时专利申请61/470,539（代理人档案号CL5380USPRV，提交于2011年4月1日）、美国临时专利申请61/471,736（代理人档案号CL5381USPRV，提交于2011年4月5日）和美国临时专利申请61/472,742（代理人档案号CL5382USPRV，提交于2011年4月7日）中所教导的那些，上述每一公开以引用方式并入本文。

PUFA生物合成途径去饱和酶、延伸酶DGLA合酶、LPAAT、PDAT、PCT、CPT1和MCS基因的附加的拷贝（即，多于一个的拷贝）可以被引入重组微生物宿主细胞中，以从而提高EPA的产生和积聚。具体地，基因的附加的拷贝可以被克隆在单种表达构建体内；和/或所克隆基因的附加的拷贝可以通过增加质粒拷贝数或通过将克隆基因多次整合进基因组中来导入宿主细胞中（参见下文）。

要指出的重要的一点是，当按照本文的方法制备最优化的重组微生物宿主细胞时，多种去饱和酶、延伸酶、DGLA合酶、LPAATs、PDATs、PCTs、CPT1s和MCS的拷贝数是经常被提及的。例如如果需要2拷贝的Δ9延伸酶，这能够是指：1）针对从单一物种分离的特定Δ9延伸酶的相同编码序列的两个拷贝；或，2）针对从物种“A”分离的Δ9延伸酶的一种编码序列和针对从物种“B”分离的Δ9延伸酶的一种编码序列，因此总共产生两种Δ9延伸酶。

一般来讲，一旦已经获得适用于在重组微生物宿主细胞中表达的DNA盒（例如包含启动子、ORF和终止子的嵌合基因），则将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或将其直接整合进宿主细胞的基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或可以通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。虽然不依赖本文，如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。

相对于工程化的重组解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）宿主细胞，在该微生物宿主中表达基因的优选的方法是通过将线性DNA片段整合进该宿主的基因组中。当期望基因高水平表达时，整合到基因组中的多个位置可以是尤其有用的优选的基因座包括美国专利公布2009-0093543-A1中的那些教导。

此外，Juretzek等人（Yeast，18：97-113（2001）提出在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中的整合DNA片段的稳定性取决于单个转化体、受体菌株和所用的靶向平台。因此，技术人员将认识到，特定重组微生物宿主的多个转化体必须被筛选，以获得表现出所期望的表达水平和模式的菌株。这种筛选可以通过DNA印迹的Southern分析（Southern，J.Mol.Biol.，98：503（1975））、mRNA表达的Northern分析（Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618（1-2）：133-145（1993））、蛋白质表达的Western分析、PUFA产物的表型分析或GC分析来完成。

本公开的转化的重组微生物宿主细胞在使嵌合基因（例如，编码去饱和酶、延伸酶、DGLA合酶、LPAAT、PDAT、PCT、CPT1和MCS的）的表达最优化的条件下生长，并产生最大的和最经济的EPA产量。通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法来优化培养基条件。例如，解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）通常生长在复合培养基（如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖液体培养基[“YPD”]）或缺乏生长所必需的成分并由此强迫选择所需表达盒的确定成分的基本培养基中（如酵母氮源培养基（Yeast Nitrogen Base（DIFCO Laboratories，Detroit，MI））。

用于本文所述方法和宿主细胞的发酵培养基必须包含合适的碳源，如在美国专利7,238,482和美国专利公布2011-0059204-A1中所教导的。尽管预期在本发明中利用的碳源可以涵盖很多种包含碳的源，优选的碳源是糖类（例如，葡萄糖、转化蔗糖、果糖和它们的组合）、甘油和/或脂肪酸（例如，包含介于10-22个碳的那些）。

氮可以由无机源（如（NH₄）₂SO₄）或有机源（如尿素或谷氨酸）提供。除了合适的碳源和氮源，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合重组微生物宿主细胞生长和促进用于产生EPA的酶途径的其它组分。特别关注的是促进脂质和PUFA合成的几种金属离子，例如Fe⁺²、Cu⁺²、Mn⁺²、Co⁺²、Zn+2和Mg⁺²（Nakahara,T.等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin编辑，第61-97页（1992））。

用于本文所述方法和宿主细胞的优选的生长培养基是常规的商业制备培养基，例如酵母氮源基础培养基（Yeast Nitrogen Base，DIFCOLaboratories，Detroit，MI）。也可以使用其它确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，且适于例如解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）生长的培养基对微生物学或发酵科学领域的技术人员来说将是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH4.0至pH8.0之间，其中优选将pH5.5至pH7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选微氧条件。

通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要包括两个阶段的过程，由于代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选的是，两个阶段的发酵过程是在解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）中产生EPA所必需的。这种方法，以及多种适合的发酵工艺设计（即分批式、补料分批式和连续式）和生长过程中的注意事项，描述于美国专利7,238,482中。

美国专利申请公布2009-0093543-A1的实例10还提供了重组解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Y4305（其最大的产量是12.1EPA%DCW[即，55.6EPA%TFA，具有3.03的EPA%TFA对LA%TFA比率]，经过了162小时）的2-L发酵所需的参数的详细描述。该公开包括了对用于从冷冻的培养物制备接种物以产生种菌培养物的方法、在促进快速生长至高的细胞浓度的条件下对酵母的初始培养、和随后用于促进脂质和PUFA积聚（通过氮饥饿和持续提供葡萄糖）的对酵母的培养的描述。方法变量包括温度（控制在30-32℃之间）、pH（控制在5-7之间）、溶解氧浓度和葡萄糖浓度，监控并按照标准运行条件控制这些变量以确保过程性能始终如一和最终的PUFA油质量。

具体地，美国专利申请公布2009-0093543-A1的实例10的数据能够被用于产生展示EPA%TFA和LA%TFA如何随着发酵过程变化的图，如本文的图2中所显示的，并且总结在下文的表6中。

表6：EPA%TFA和LA%TFA之间随着发酵过程的关系

具体地，应当指出的是，EPA%TFA在发酵的～40-125小时期间升高，LA%TFA在发酵的～40-125小时期间降低，并且EPA:LA比率升高。从这一分析显而易见的是，当解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Y4305能够产生12.1EPA%DCW时，所述重组微生物宿主细胞的油组成谱将依赖于发酵自身的运行、培养基条件、工艺参数、规模等，以及对培养物取样的特定时间点。因此，该工程化的菌株能够产生具有多种不同的脂质含量和组成（即，基于EPA%TFA、LA%TFA和EPA:LA比率）的微生物油。

当培养本文所述的重组微生物宿主细胞时，也必须考虑这些因素，以充分实现工程化的宿主细胞的潜力并在任何特定的发酵运行中实现至少25EPA%DCW。

在本文的某些方面，初级产物是重组微生物生物质。同样地，从所述微生物生物质中分离和纯化包含EPA的油可能是不必要的（即，其中全细胞生物质是产品）。然而，某些最终用途和/或产品形式可能需要来自所述微生物生物质的部分和/或全部分离/纯化的包含EPA的油，以产生部分纯化的微生物生物质、纯化油、和/或纯化EPA。关于这些方面的更多细节参见美国专利申请公布2010-0317072-A1。

包含已经精炼过的和/或纯化过的EPA的油可被氢化，从而产生具有多种熔炼特性和质地的脂肪。多种经加工的脂肪，包括涂脂、糖脂、硬黄油、人造黄油、烘焙起酥油等，需要室温下不同的硬度，并且仅能通过改变来源油的物理特性来制备。这最常见的是通过催化加氢实现（更多细节和参考文献参见国际申请公布WO2006/052870）。

美国专利申请公布2010-0317072-A1中教导了包含含有EPA的含油酵母生物质的食品、婴儿代乳品、功能性食物、医疗食物、医疗营养品、饮食补充剂、药物组合物、动物饲料和个人护理产品，并且这些用途就包含EPA的重组微生物生物质或从其分离的包含EPA的微生物油而言同样是适用的。

加工和配制领域的技术人员将了解重组微生物生物质、部分纯化生物质、纯化的油、和/或纯化的EPA的量和组成是如何根据目的物种和/或最终用途加入特定产品中的。更具体地讲，“有效”量将被掺入产品制剂，然而该量将取决于食物或饲料产品、期望补充该产品的膳食或医疗食物或医疗营养品打算纠正或治疗的医学状况。

最期望地，有效量的EPA将足以提供与ω-3/ω-6PUFA消耗相关的期望健康特性。通常，掺入产品的EPA量考虑了与加工条件、一般处理和贮藏条件、EPA在产品中的稳定性、以及目的物种的生物利用/生物吸收效率相关的损失。

加工和配制领域的技术人员将熟悉浓缩从本文所述的重组微生物宿主细胞产生的微生物油，从而提高EPA在总脂质级分中的浓度的方法，该方法使得它包含至少约55-60%、至少约60-65%、至少约65-70%、至少约70-85%、至少约85-90%、至少约90-95%的EPA或甚至95-99%的EPA。本领域的技术人员也熟知混合本文所述的纯化的油与其它纯化的脂肪酸（例如LA、GLA、EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、ALA、STA、ETrA、ETA、DPA和DHA）、或包含优选浓度的替代脂肪酸的油的方法。这些技术使得能够制备包含独特定制的脂肪酸谱的油。

优选实施例的描述

含油酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）的多种重组菌株在本文中被证明产生大于25EPA%DCW，如下文的实例中所详述的。相对于重组解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Z1978（在先地被工程化以产生22.5EPA%DCW），基于基因型、如通过烧瓶检测法测定的总脂质含量和脂质组成，表7提供了这些重组菌株中的一些的总结。

表中的每一区段表示在单次转化中产生的一株或多株菌株（即，菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981是来自单次转化的单独的克隆）并因此预期具有相同的基因型。相对于菌株Z1978的基因型，采用高亮表示在所述转化体内表达的附加的基因以及这些基因的拷贝数的简化的符号，总结了来源于菌株Z1978的这些菌株的基因型。因此，例如，与菌株Z1978相比，菌株L250是用一种包含YlLPAAT1的附加的表达盒和一种包含YlPDAT的附加的表达盒转化的；与菌株Z1978相比，菌株L258是用两种包含YlLPAAT1的附加的表达盒和两种包含YlPDAT的附加的表达盒转化的。

该表总结了细胞的总干细胞重量[“DCW”]、细胞的总脂质含量[“TFA%DCW”]、以占TFA的重量百分比计的每种脂肪酸的浓度[“%TFA”]、以占干细胞重量的百分比计的EPA浓度[“EPA%DCW”]和EPA%TFA对LA%TFA的比率[“EPA:LA比率”]。脂肪酸是16:0（棕榈酸）、16:1（棕榈油酸）、18:0（硬脂酸）、18:1（油酸）、18:2（亚油酸）、ALA（α-亚麻酸）、EDA（二十碳二烯酸）、DGLA（二高-γ-亚麻酸）、ARA（花生四烯酸）、ETrA（二十碳三烯酸）、ETA（二十碳四烯酸）、EPA（二十碳五烯酸）以及其它的。

这些菌株内包含至少两种具有至少LPAAT活性的多肽和至少一种具有至少PDAT活性的多肽，EPA%DCW为从25.6至28范围，EPA%TFA为从45.2至50.4范围并且EPA%TFA对LA%TFA的比率（“EPA:LA比率”）为从2.42至3.29范围。

值得指出的是，尽管全部这些菌株均产生了大于25EPA%DCW，相同的菌株可以通过缩短总的发酵时间被用于产生小于25EPA%DCW。与上文关于图2讨论的重组解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Y4305的表现相似，如果缩短发酵时间，表7的这些菌株预期将产生更低的EPA%TFA、更高的LA%TFA、并具有降低的EPA:LA比率。因此，本领域的普通技术人员将会知道，取决于在发酵中的特定取样时间点，这些工程化的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株能够产生以多种EPA:LA比率具有多种浓度的EPA的微生物油。

EPA、LA和油酸构成了TFA的大约70-75%。本文所述的改进的优化的重组解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株的特征还在于具有小于约0.5%的GLA或DHA（当使用具有低至约0.1%的检测水平的设备通过GC分析测量时）和具有小于约8%的饱和脂肪酸含量。饱和脂肪酸（即，16:0和18:0）的这种低百分比导致对人类和动物的实质性的健康有益效果。

实例

本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实例，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特征，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明做出各种变化和修改以使其适用于各种用法和条件。

一般方法

实例中使用的标准重组DNA技术和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有所描述：1）Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY（1989）（Maniatis）；2）T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY（1984）；和3）Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ（1987）。

适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适合用于下列的实例中的技术可见于Manual of Methods for GeneralBacteriology（P.Gerhardt，R.G.E.Murray，R.N.Costilow，E.W.Nester，W.A.Wood，N.R.Krieg和G.B.Phillips编辑），American Society forMicrobiology：Washington，D.C.（1994））；或Thomas D.Brock inBiotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第2版，SinauerAssociates：Sunderland，MA（1989）中的描述。用于生长和维持微生物细胞的所有试剂、限制性酶和材料得自DIFCO Laboratories（Detroit，MI）、New England Biolabs，Inc.（Beverly，MA）、GIBCO/BRL（Gaithersburg，MD）、或Sigma-Aldrich Chemical Company（St.Louis，MO），除非另外指明。通常于37℃在Luria Bertani[“LB”]平板上培养大肠杆菌（E.coli）菌株。

一般的分子克隆按照标准方法（Sambrook等人，参见上文）进行。当PCR或定点诱变涉及亚克隆时，测序构建体以确认未将错配导入序列。PCR产物被克隆进Promega pGEM-T-easy（Madison，WI）或pCR4TOPO（Invitrogen，San Diego，CA）载体。

缩写的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔每升，“mM”表示毫摩尔每升，“M”表示摩尔每升，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对，“kB”表示千碱基，“DCW”表示干细胞重量，“TFA”表示总脂肪酸，“FAME”表示脂肪酸甲酯。

表达盒的命名

表达盒的结构将通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段而Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。

解脂耶氏酵母的转化和培养

解脂耶氏酵母菌株ATCC20362购自美国典型培养物保藏中心（Rockville，MD）。解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株通常是在根据下面所示的配方的数种培养基中于28-30℃生长的。根据标准方法，按要求通过将20g/L琼脂加入到每个液体培养基中来制备琼脂板。

YPD琼脂培养基（每升）：10g酵母提取物[Difco]，20g Bacto蛋白胨[Difco]和20g葡萄糖。

基本培养基[“MM”]（每升）：20g葡萄糖，1.7g酵母氮源，1.0g脯氨酸和pH6.1（无需调节）。

基本培养基+5-氟乳清酸[“MM+5-FOA”]（每升）：20g葡萄糖，6.7g酵母氮基，75mg尿嘧啶，75mg尿苷和合适量的FOA（Zymo Research Corp.，Orange，CA），基于对100mg/L至1000mg/L的浓度范围内进行的FOA活性测试（因为从供应商处收到的每一批活性均发生变化）。

高葡萄糖培养基[“HGM”]（每升）：80葡萄糖，2.58g KH₂PO₄和5.36g K₂HPO₄，pH7.5（不需要调节）。

发酵培养基[“FM”]（每升）：6.70g/L酵母氮源，6.00g KH₂PO₄，2.00g K₂HPO₄，1.50g MgSO₄*7H₂O，20g葡萄糖和5.00g酵母提取物（BBL）。

解脂耶氏酵母的转化如美国专利申请公布2009-0093543-A1中所述进行，该文献以引用方式并入本文。

解脂耶氏酵母的脂肪酸分析

为了进行脂肪酸[“FA”]分析，将细胞通过离心收集并提取脂质，如Bligh，E.G.&Dyer，W.J.（Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917（1959））所述。通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备脂肪酸甲酯[“FAME”]（Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys.,276（1）：38-46（1990））并随后将其用配有30m×0.25mm（内径）HP-INNOWAX（Hewlett-Packard）柱的Hewlett-Packard6890气相色谱仪（GC）进行分析。烘箱温度以3.5℃/分钟从170℃（保持25分钟）升到185℃。

为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母细胞（0.5mL培养物），在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分钟。将甲醇钠（100μl1%）和已知量的C15:0三酰基甘油（C15:0TAG；目录号T-145，Nu-Check Prep，Elysian，MN）加入样品中，然后将样品于50℃涡旋振荡30分钟。在加入3滴1M氯化钠和400μl己烷后，涡旋并离心样品。移除上层并用GC进行分析。

作为另外一种选择，Lipid Analysis，William W.Christie，2003中描述的修改的碱催化酯交换方法被用于对来自发酵或烧瓶样品的肉汤样品的常规分析。具体地，在室温的水中使肉汤样品迅速解冻，然后称量（0.1mg）至带有0.22μm

离心管过滤器（目录号8161）的涂焦油的2mL微量离心管中。根据先前测定的DCW，使用了样品（75-800μl）。用Eppendorf5430离心机，以14,000rpm离心样品5-7分钟或移除肉汤所需的时间长度。移除过滤器，倒出液体，加入～500μl去离子水至过滤器中洗涤样品。离心除去水后，再次移出过滤器，倒出液体并重新插入过滤器。然后将管子重新插入离心机中，这一次保持盖子打开，离心～3-5分钟进行干燥。然后在管子上方大约1/2处切开过滤器，并插入新的2mL圆底Eppendorf管（目录号2236335-2）。

用仅接触切开的过滤器容器边缘而不接触样品或过滤材料的适当的工具将过滤器推至管子的底部。加入溶于甲苯的已知量的C15:0TAG（参见上文）以及500μl新鲜制备的1%甲醇钠溶于甲醇的溶液。用适当的工具将样品沉淀块用力捣碎，盖上管子并置于50℃加热块（VWR目录号12621-088）中30分钟。然后使管子冷却至少5分钟。然后，加入400μl己烷和500μl1M NaCl水溶液，涡旋振荡管子2×6秒并离心1分钟。将大约150μl上层（有机层）置于带有插入件的GC小瓶中，并通过GC进行分析。

经由GC分析记录的FAME峰值在与已知脂肪酸进行比较时通过它们的保留时间进行鉴定，并且通过比较FAME与已知量的内部标准品（C15:0TAG）的峰面积进行定量。因此，根据下式计算任何脂肪酸FAME的近似量（μg）[“μg FAME”]：（特定脂肪酸的FAME峰的面积/标准品FAME峰的面积）*（标准品C15:0TAG的μg数），而任何脂肪酸的量（μg）[“μg FA”]根据下式计算：（特定脂肪酸的FAME峰的面积/标准品FAME峰的面积）*（标准品C15:0TAG的μg数）*0.9503，因为1μg的C15:0TAG等于0.9503μg脂肪酸。注意：0.9503的转换因子是大多数脂肪酸测定的近似值，其范围介于0.95和0.96之间。

通过用单个FAME峰面积除以所有FAME峰面积的总数并乘以100，确定了总结以占TFA的重量%表示的每种单独的脂肪酸的量的脂质特征。

通过烧瓶检测法对解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中总脂质含量和组成的分析

为了详细分析在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）的特定菌株中的总脂质含量和组成，如下进行了烧瓶检测分析。具体而言，一个接种环的新鲜划线的细胞被接种至3mL FM培养基，并于30℃以250rpm培养过夜。测量OD_600nm，在125mL烧瓶中，加入一个等分试样的细胞，使得25mL FM培养基中最终的OD_600nm为0.3。在30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mLHGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行脂肪酸分析（参见上文），并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定。

就DCW测定而言，通过在Beckman GS-6R离心机的Beckman GH-3.8转子中以4000rpm离心5分钟，收集了10mL培养物。沉淀被重悬于25mL水中，并如上文所述重新收集。将洗涤后的沉淀物重悬在20mL水中并转移到预先称过重的铝盘上。在80℃的真空炉中干燥上述细胞悬浮液过夜。测定细胞的重量。

计算细胞总脂质含量[“TFA%DCW”]，并且将其与列表显示以TFA%重量[“%TFA”]表示的每种脂肪酸浓度和以干细胞重量百分比表示的EPA含量[“EPA%DCW”]的数据综合考虑。

实例1

以至少约38.3TFA%DCW产生至少约58.7EPA%TFA的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Z1978的生成

本实例描述了来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）ATCC20362的菌株Z1978的构建，该菌株通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达能够以38.3TFA%DCW产生约58.7EPA%TFA。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Y9502的基因型

菌株Y9502的生成描述于美国专利申请公布2010-0317072-A1中。菌株Y9502来源于解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）ATCC20362，其能够通过表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径产生相对于总脂质约57.0%的EPA（图3A）。

相对于野生型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）ATCC20362，菌株Y9502的最终基因型是：Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，未知9-，未知10-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16（2拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT1::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16。缩写如下：FmD12是串珠镰孢菌（Fusariummoniliforme）Δ12去饱和酶基因[美国专利7,504,259]；FmD12S是经密码子优化的Δ12去饱和酶基因，来源于串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）[美国专利7,504,259]；ME3S是经密码子优化的C_16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉（Mortierella alpina）[美国专利7,470,532]；EgD9e是小眼虫（Euglena gracilis）Δ9延伸酶基因[美国专利7,645,604]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫（Euglena gracilis）[美国专利7,645,604]；EgD8M是合成突变Δ8去饱和酶基因[美国专利7,709,239]，来源于小眼虫（Euglena gracilis）[美国专利7,256,033]；EaD8S是经密码子优化的Δ8去饱和酶基因，来源于Euglena anabaena[美国专利7,790,156]；E389D9eS/EgD8M是通过连接来源于小型绿藻属（Eutreptiella sp.）CCMP389（美国专利7,645,604）的经密码子优化的Δ9延伸酶基因（“E389D9eS”）与Δ8去饱和酶“EgD8M”（参见上文）[美国专利申请公布2008-0254191-A1]产生的DGLA合酶；EgD9eS/EgD8M是通过连接Δ9延伸酶“EgD9eS”（参见上文）与Δ8去饱和酶“EgD8M”（参见上文）[美国专利申请公布2008-0254191-A1]产生的DGLA合酶；EaD9eS/EgD8M是通过连接来源于Euglena anabaena的经密码子优化的Δ9延伸酶基因（“EaD9eS”）[美国专利7,794,701]与Δ8去饱和酶“EgD8M”（参见上文）[美国专利申请公布2008-0254191-A1]产生的DGLA合酶；EgD5M和EgD5SM是包含突变HPG（SEQ ID NO:427）基序[美国专利申请公布2010-0075386-A1]的合成突变Δ5去饱和酶基因，来源于小眼虫（Euglenagracilis）[美国专利7,678,560]；EaD5SM是包含突变HaGG（SEQ ID NO:428）基序[美国专利申请公布2010-0075386-A1]的合成突变Δ5去饱和酶基因，来源于Euglena anabaena[美国专利7,943,365]；PaD17是瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）Δ17去饱和酶基因[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的Δ17去饱和酶基因，来源于瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）[美国专利7,556,949]；YlCPT1是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）二酰基甘油磷酸胆碱转移酶基因[美国专利7,932,077]；MCS是经密码子优化的丙二酰-CoA合成酶基因，来源于豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum bv.viciae）3841[美国专利申请公布2010-0159558-A1]，以及MaLPAAT1S是经密码子优化的溶血磷脂酸酰基转移酶基因，来源于高山被孢霉（Mortierella alpina）[美国专利7,879,591]。

为了详细分析菌株Y9502中的总脂质含量和组成，进行烧瓶测定，其中细胞在2个阶段生长总计7天。基于分析，菌株Y9502产生了3.8g/LDCW、37.1TFA%DCW、21.3EPA%DCW，并且其脂质特征如下，其中每种脂肪酸的浓度以占TFA的重量百分比计[“%TFA”]：16:0（棕榈酸）—2.5，16:1（棕榈油酸）—0.5，18:0（硬脂酸）—2.9，18:1（油酸）—5.0，18:2（LA）—12.7，AlA—0.9，EDA—3.5，DGLA—3.3，ARA—0.8，ETrA—0.7，ETA—2.4，EPA—57.0，其它—7.5。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Z1978从菌株Y9502的生成

菌株Z1978从菌株Y9502的产生显示于表3B中，并且描述于美国临时申请61/377248和61/428,277中，上述文献以引用方式并入本文。

具体地，为了破坏菌株Y9502中的Ura3基因，SalI/PacI-消化的构建体pZKUM（图4A；SEQ ID NO:82；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中，该文献以引用方式并入本文）被用于按照一般方法将Ura3突变基因整合进菌株Y9502的Ura3基因。使总计27个转化体（从包括8个转化体的第一组、包括8个转化体的第二组、和包括11个转化体的第三组中选择）生长在基本培养基+5-氟乳清酸[“MM+5-FOA”]选择性平板上并于30℃维持2至5天。进一步的实验确定了仅第三组转化体拥有真正的Ura-表型。

从MM+5-FOA平板上刮下Ura-细胞，并根据“一般方法”对其进行脂肪酸分析。以这种方式，GC分析显示，在第三组的MM+5-FOA平板上生长的pZKUM-转化体1、3、6、7、8、10和11中分别有占TFA28.5%、28.5%、27.4%、28.6%、29.2%、30.3%和29.6%的EPA。这七个菌株分别被命名为菌株Y9502U12、Y9502U14、Y9502U17、Y9502U18、Y9502U19、Y9502U21和Y9502U22（统称为Y9502U）。

然后，构建了构建体pZKL3-9DP9N（图4B；SEQ ID NO:83），以将一直Δ9去饱和酶基因、一种磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因和一种Δ9延伸酶突变基因整合进菌株Y9502U的耶氏酵母YALI0F32131p基因座（GenBank登录号XM_506121）。所述Δ9去饱和酶突变基因相对于EgD9eS[SEQ IDNO:3]（如美国临时申请61/377248[代理人档案号CL4783USPRV，提交于2010年8月26日]中所述，该文献以引用方式并入本文；亦参见实例10A-10F）包含L35G突变。因此，pZKL3-9DP9N质粒包含下列组分：

表8：质粒pZKL3-9DP9N（SEQ ID NO:83）的描述

用AscI/SphI消化pZKL3-9DP9N质粒，然后用于转化菌株Y9502U17。将转化的细胞铺在基本培养基[“MM”]平板上并在30°维持3至4天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于高葡萄糖培养基中[“HGM”]，然后以250rpm/min摇动5天。对上述细胞进行脂肪酸分析，参见上文。

GC分析显示，所选择的96个用pZKL3-9DP9N产生的Y9502U17菌株中大多数产生占TFA50-56%的EPA。将产生了占TFA约59.0%、56.6%、58.9%、56.5%和57.6%的EPA的五个菌株（即，31、32、35、70和80）分别命名为菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981。

相对于野生型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）ATCC20362，这些pZKL3-9DP9N转化的菌株的最终基因型是：Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，未知9-，未知10-，未知11-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16（2拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPDIN::YlD9::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT1::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16，EXP1::YlPCT::Pex16。

在任何用pZKL3-9DP9N转化产生的这些EPA菌株中，YALI0F32131p基因座（GenBank登录号XM_50612）的敲除在菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981中未被确认。

使来自菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981的YPD平板的细胞生长，并就总脂质含量和组成对它们进行了分析。具体地，如“一般方法”中所述进行了烧瓶检测。

因此，优选的实施例的描述中的表7（参见上文）总结了菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981的总的DCW、TFA%DCW、每种脂肪酸的浓度[“%TFA”]和EPA%DCW，如通过烧瓶检测法所测定的。

在提交了美国临时申请61/377248（代理人档案号CL4783USPRV，提交于2010年8月26日）之后，对菌株Z1978进行了部分基因组测序。该工作，如美国临时申请61/428,277（代理人档案号CL5267USPRV，提交于2010年12月30日）中所述，确定了并非有六个Δ5去饱和酶基因被整合进耶氏酵母基因组，上述工程化的菌株实际上仅具有四个。

更具体地，两个分别的质粒片段（或它们的部分）在菌株Z1978中未被检测到，如下文所详述的。

(1)构建体pZKL2-5mB89C（参见美国专利申请公布2010-0317072-A1，其中的SEQ ID NO:131）旨在将一种Δ5去饱和酶基因整合进菌株Y8069U的Lip2基因座，以从而允许高水平的EPA产生。然而，基因组测序没有检出pZKL2-5mB89C片段和GPDIN::EgD5SM::Aco嵌合基因的Lip2.3N末端部分。DNA重排可能导致了在Y8154菌株（图3A）的生成过程中GPDIN::EgD5SM::Aco盒的丢失。

(2)构建体pZKL1-2SR9G85（参见美国专利申请公布2010-0317072-A1，其中的SEQ ID NO:132）旨在将一种Δ5去饱和酶基因整合进菌株Y8154U1的Lip1基因座。然而，基因组测序或PCR扩增均没能在菌株Z1978中检测到所述Δ5去饱和酶基因。DNA重排可能导致了在Y8269菌株（图3A）的生成过程中GPM::EgD5SM::Oct盒的丢失。

此外，还确定了构建体pZSCP-Ma83（参见美国专利申请公布2010-0317072-A1，其中的SEQ ID NO:133）和构建体pZP2-85m98F（参见美国专利申请公布2010-0317072-A1其中的SEQ ID NO:135）均被整合进YALI0B21890g基因座。

因此，相对于野生型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）ATCC20362，菌株Z1978的真实基因型如下：Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，YALI0E12947g-，未知6-，YALI0B21890g-，未知8-，未知10-，未知11-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16（2拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPDIN::YlD9::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT1::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16，EXP1::YlPCT::Pex16。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Y9502和菌株Z1978的比较

在菌株Z1978中表达的异源性基因与在菌株Y9502中表达的那些仅在附加地表达一种Δ9去饱和酶基因、一种磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因和一种Δ9延伸酶突变体（即，EgD9eS-L35G，如SEQ ID NO:43和44所示）方面不同。在表9中按照下式对Y9502和Z1978菌株计算了LA和ALA至EPA的总的Δ9延伸酶转化效率[“%转化”]：（[产物]/[底物+产物]）*100，其中所述产物是EDA%TFA、ETrA%TFA、DGLA%TFA、ETA%TFA、ARA%TFA和EPA%TFA的总和，并且所述底物是LA%TFA、ALA%TFA、EDA%TFA、ETrA%TFA、DGLA%TFA、ETA%TFA、ARA%TFA和EPA%TFA的总和。

表9：转化体解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y9502和Z1978中总脂质含量和组成以及Δ9延伸酶活性的比较

如上文所显示的，总的Δ9延伸酶转化效率在菌株Y9502中被测定为83.3%，而在菌株Z1978中的效率是提高的（即，85.3%）。

实例2

以至少约57.1TFA%DCW产生至少约45.2EPA%TFA的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株L258的生成

本实例描述了来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Z1978（实例1）的菌株L258的构建，该菌株通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达能够以57.1TFA%DCW产生约45.2EPA%TFA。

菌株L258（图3B）的构建需要构建中间菌株Z1978U、L250和L250U。

菌株Z1978U（Ura3-）的生成

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM（图4A；SEQ ID NO:82；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中）以与就菌株Y9502（实例1）的pZKUM转化所描述的相似的方式被用于将Ura3突变基因整合进菌株Z1978的Ura3基因。使总计16个转化体（从第一个包括8个转化体的“B”组和第二个包括8个转化体的“C”组中选择）生长，并鉴定为具有Ura-表型。

GC分析显示，生长在MM+5-FOA平板上的B组pZKUM-转化体菌株1、2、3和4中分别存在占TFA30.8%、31%、30.9%和31.3%的EPA。这4种菌株分别被命名为菌株Z1978BU1、Z1978BU2、Z1978BU3和Z1978BU4。

GC分析显示，生长在MM+5-FOA平板上的C组pZKUM-转化体菌株1、2、5和6中分别存在占TFA34.4%、31.9%、31.2%和31%的EPA。这4种菌株分别被命名为菌株Z1978CU1、Z1978CU2、Z1978CU3和Z1978CU4。

菌株Z1978BU1、Z1978BU2、Z1978BU3、Z1978BU4、Z1978CU1、Z1978CU2、Z1978CU3和Z1978CU4菌株被统称为菌株Z1978U。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株L250的生成

构建了构建体pY187（图5A；SEQ ID NO:84）以将一种溶血磷脂酸酰基转移酶基因[“LPAAT”]和一种磷脂:二酰基甘油酰基转移酶基因[“PDAT”]整合进菌株Z1978U的基因组。pY187质粒包含下列组分：

表10：质粒pY187（SEQ ID NO:84）的组分

用SwaI/ApaI消化pY187质粒，从琼脂糖凝胶上纯化了6.7kB大片段，然后按照“一般方法”用于转化菌株Z1978CU4。将转化的细胞铺板于MM平板上，并在30℃维持5天。然后将单菌落（19）重新划线接种至MM平板上。按照“一般方法”，通过烧瓶检测法测定了这些菌株的总脂质含量和脂肪酸组成。

基于分析，菌株L250产生了4.4g/L DCW、51.5TFA%DCW和26EPA%DCW。其脂质特征如下，其中每种脂肪酸的浓度以占TFA的重量百分比计[“%TFA”]：16:0（棕榈酸）—2.0，16:1（棕榈油酸）—0.7，18:0（硬脂酸）—2.8，18:1（油酸）—6.1，18:2（LA）—16.7，ALA—0.9，EDA—3.3，DGLA—4.9，ARA—0.7，ETrA—0.6，ETA—3.2，EPA—50.4和其它—7.4（参见优选的实施例的描述中的表7，参见上文）。

菌株L250U（Ura3-）的生成

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM（图4A；SEQ ID NO:82；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中）以与就菌株Y9502（实例1）的pZKUM转化所描述的相似的方式被用于将Ura3突变基因整合进菌株L250的Ura3基因。使总计十二个5-FOA抗性菌落生长，并鉴定为具有Ura-表型。菌株2和菌株3分别被命名为L250U2和L250U3（统称为菌株L250U）。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株L258的生成

质粒pY187（表10；SEQ ID NO:84）被用于将YlLPAAT基因（SEQID NO:21）和YlPDAT基因（SEQ ID NO:28）的附加的拷贝整合进菌株L250U的耶氏酵母基因组中。纯化的质粒pY187的6.7kB大片段被用于按照“一般方法”转化菌株L250U2。将转化的细胞铺板于MM平板上，并在30℃维持5天。然后将单菌落重新划线接种至MM平板上。按照“一般方法”通过烧瓶检测法对上述细胞进行了总脂质含量和组成的检测。

基于分析，菌株L258产生了5.0g/L DCW、57.1TFA%DCW和25.8EPA%DCW。其脂质特征如下，其中每种脂肪酸的浓度以占TFA的重量百分比计[“%TFA”]：16:0（棕榈酸）—2.3，16:1（棕榈油酸）—0.9，18:0（硬脂酸）—3.4，18:1（油酸）—7.8，18:2（LA）—18.7，ALA—0.9，EDA—4.0，DGLA—5.3，ARA—0.8，ETrA—0.6，ETA—3.2，EPA—45.2和其它—6.6（亦参见优选的实施例的描述中的表7，参见上文）。

相对于野生型解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）ATCC20362，菌株L258最终基因型是：Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，YALI0E12947g-，未知6-，YALI0B21890g-，未知8-，未知10-，未知11-，未知12-，未知13-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16（2拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPDIN::YlD9::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT1::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1，EXP1::YlPCT::Pex16，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16，FBAINm::YlLPAAT1::Lip1（2拷贝），YAT1::YlPDAT::Lip1（2拷贝）。

实例3

以至少约53TFA%DCW产生至少约47EPA%TFA的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Z5565、Z5567、Z5575和Z5576的生成

本实例描述了来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株L258（实例2）的菌株Z5565、Z5567、Z5575和Z5576的构建，这些菌株通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达能够以大于53TFA%DCW产生约47EPA%TFA。

菌株Z5565、Z5567、Z5575和Z5576（图3B）的构建需要构建中间菌株L258U。

菌株L258U（Ura3-）的生成

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM（图4A；SEQ ID NO:82；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中）以与就菌株Y9502（实例1）的pZKUM转化所描述的相似的方式被用于将Ura3突变基因整合进菌株L258的Ura3基因。总计20个转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。

GC分析显示，在生长于MM+5-FOA平板上的pZKUM-转化体菌株7和9中，分别存在37.6%和37.2%的EPA。这2个菌株分别被命名为L258U5和L258U6，统称为菌株L258U。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Z5565、Z5567、Z5575和 Z5576的生成

构建体pZK16-ML8N（图5B；SEQ ID NO:85）描述于美国专利申请公布2010-0317072-A1，其中的表15中。构建了该构建体以将嵌合的YAT1::EgD8M::Pex20基因中的一个Δ8去饱和酶、嵌合的FBA::MCS::Lip1基因中的一个丙二酰-CoA合成酶和嵌合的YAT1::MaLPAAT1S::Pex16基因中的一个溶血磷脂酸酰基转移酶整合进耶氏酵母YALI0B14795p基因座（GenBank登录号XM_500900）。

按照“一般方法”用AscI/SphI消化了pZK16-ML8N质粒，然后用于单独地转化菌株L258U5和L258U6。将转化的细胞铺板于MM平板上，并在30℃维持5至6天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，所选择的48个带有pZK16-ML8N的L258U5菌株中的7个产生了占TFA大于48%的EPA。将产生了占TFA约49.7%和50.9%的EPA的两个菌株（即，3和36）分别命名为菌株Z5565和Z5567。

GC分析显示，所选择的48个带有pZK16-ML8N的L258U6菌株中的大多数产生了占TFA大于49%的EPA。将产生了占TFA约53.7%和50.2%的EPA的两个菌株（即，2和5）分别命名为菌株Z5575和Z5576。

相对于野生型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）ATCC20362，这些pZK16-ML8N转化体菌株最终基因型是：Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，YALI0E12947g-，未知6-，YALI0B21890g-，未知8-，未知10-，未知11-，未知12-，未知13-，未知14-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，YAT1::EgD8M::Pex20，GPD::EaD8S::Pex16（2拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPDIN::YlD9::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT1::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1（2拷贝），EXP1::YlPCT::Pex16，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16（2拷贝），FBAINm::YlLPAAT1::Lip1（2拷贝），YAT1::YlPDAT::Lip1（2拷贝）。

在通过用pZK16-ML8N转化产生的任何这些EPA菌株中，YALI0B14795p基因座（GenBank登录号XM_500900）的敲除在菌株Z5565、Z5567、Z5575和Z5576中没有被确认。

通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析

培养了来自YPD平板的菌株Z5565、Z5567、Z5575和Z5576的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。

优选的实施例的描述中的表7（参见上文）总结了菌株Z5565、Z5567、Z5575和Z5576的总的DCW、TFA%DCW、以占TFA的重量百分比计的每种脂肪酸的浓度[“%TFA”]和EPA%DCW。平均的DCW是4.8g/L，平均的TFA%DCW是55.4，平均的EPA%TFA是48.3，而平均的EPA%DCW是26.75。

实例4

以至少约51TFA%DCW产生至少约49EPA%TFA的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Z5620、Z5623和Z5625的生成

本实例描述了来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株L258U（实例3）的菌株Z5620、Z5623和Z5625的构建，这些菌株通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达能够以大于51TFA%DCW产生约49EPA%TFA。

构建了构建体pZK16-MyL8N以将一种Δ8去饱和酶基因、一种丙二酰-CoA合成酶基因和一种溶血磷脂酸酰基转移酶基因整合进菌株L258U的耶氏酵母YALI0B14795p基因座（GenBank登录号XM_500900）。更具体地，除了解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）LPAAT基因（“YlLPAAT”；SEQ ID NO:21）和Lip1终止子取代了经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）中表达的高山被孢霉（Morteriella alpina）LPAAT基因（“MaLPAAT1S”；SEQ ID NO:19）和Pex16终止子之外，构建体pZK16-MyL8N（图6A；SEQ ID NO:86）与pZK16-ML8N（图5B；SEQ ID NO:85；实例3）是相同的。pZK16-MyL8N质粒包含下列组分：

表11：质粒pZK16-MyL8N（SEQ ID NO:86）的描述

将pZK16-MyL8N质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株L258U6。将转化体细胞铺在MM平板上并在30℃维持5至6天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。对上述细胞进行了脂肪酸分析，如上文的“一般方法”中所示。

GC分析显示，所选择的48株用pZK16-MyL8N转化的L258U6菌株几乎全部产生了占TFA大于49%的EPA。将产生了占TFA约52.8%、53.0%和49.9%的EPA的三个菌株（即，5、21和48）分别命名为菌株Z5620、Z5623和Z5625。

相对于野生型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）ATCC20362，这些pZK16-MyL8N转化体菌株的最终基因型是：Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，YALI0E12947g-，未知6-，YALI0B21890g-，未知8-，未知10-，未知11-，未知12-，未知13-，未知14-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，YAT1::EgD8M::Pex20，GPD::EaD8S::Pex16（2拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPDIN::YlD9::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT1::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1（2拷贝），EXP1::YlPCT::Pex16，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16，YAT1::YlLPAAT::Lip1，FBAINm::YlLPAAT1::Lip1（2拷贝），YAT1::YlPDAT::Lip1（2拷贝）。

在通过用pZK16-MyL8N转化产生的任何这些EPA菌株中，YALI0B14795p基因座（GenBank登录号XM_500900）的敲除在菌株Z5620、Z5623和Z5625中没有被确认。

通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析

培养了来自YPD平板的菌株Z5620、Z5623和Z5625的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。

优选的实施例的描述中的表7（参见上文）总结了菌株Z5620、Z5623和Z5625的总的DCW、TFA%DCW、以占TFA的重量百分比计的每种脂肪酸的浓度[“%TFA”]和EPA%DCW。平均的DCW是4.5g/L，平均的TFA%DCW是52.4，平均的EPA%TFA是48.4，而平均的EPA%DCW是25.9。

实例5

以至少约55TFA%DCW产生至少约48EPA%TFA的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Z5581、Z5582、Z5583和Z5584的生成

本实例描述了来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株L258U（实例3）的菌株Z5581、Z5582、Z5583和Z5584的构建，这些菌株通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达能够以大于55TFA%DCW产生约48EPA%TFA。

构建了构建体pZK16-ML3（图6B，SEQ ID NO:89）以将一种丙二酰-CoA合成酶基因、一种溶血磷脂酸酰基转移酶基因和一种C_16/18延伸酶基因整合进菌株L258U的YALI0B14795p基因座（GenBank登录号XM_500900）。pZK16-ML3质粒包含下列组分：

表12：质粒pZK16-ML3（SEQ ID NO:89）的描述

将pZK16-ML3质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株L258U5。将转化体细胞铺在MM平板上并在30℃维持4至5天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，所选择的48株用pZK16-ML3转化的L258U5菌株中的19株产生了占TFA大于50%的EPA。将产生了占TFA约50.9%、52.4%、51.5%和51.7%的EPA的四个菌株（即16、42、46和47）分别命名为菌株Z5581、Z5582、Z5583和Z5584。

相对于野生型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）ATCC20362，这些pZK16-ML3转化的菌株最终基因型是：Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，YALI0E12947g-，未知6-，YALI0B21890g-，未知8-，未知10-，未知11-，未知12-，未知13-，未知14-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，GPAT::ME3S::Pex20，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16（2拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPDIN::YlD9::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT1::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1（2拷贝），EXP1::YlPCT::Pex16，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16（2拷贝），FBAINm::YlLPAAT1::Lip1（2拷贝），YAT1::YlPDAT::Lip1（2拷贝）。

在通过用pZK16-ML3转化产生的任何这些EPA菌株中，YALI0B14795基因座（GenBank登录号XM_500900）的敲除在菌株Z5581、Z5582、Z5583和Z5584中没有被确认。

通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析

培养了来自YPD平板的菌株Z5581、Z5582、Z5583和Z5584的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。

优选的实施例的描述中的表7（参见上文）总结了菌株Z5581、Z5582、Z5583和Z5584的总的DCW、TFA%DCW、以占TFA的重量百分比计的每种脂肪酸的浓度[“%TFA”]和EPA%DCW。平均的DCW是4.8g/L，平均的TFA%DCW是56，平均的EPA%TFA是48.65，而平均的EPA%DCW是27.2。

实例6

以至少约54TFA%DCW产生至少约48EPA%TFA的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Z5570、Z5571、Z5572和Z5574的生成

本实例描述了来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株L258U（实例3）的菌株Z5570、Z5571、Z5572和Z5574的构建，这些菌株通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达能够以大于54TFA%DCW产生约48EPA%TFA。

构建了构建体pZKMP-ML9DP（图7A，SEQ ID NO:92）以将一种溶血磷脂酸酰基转移酶基因、一种Δ9去饱和酶基因和一种磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因整合进菌株L258U的耶氏酵母YALI0F02211g基因座（GenBank登录号XP_504895）。pZKMP-ML9DP质粒包含下列组分：

表13：质粒pZKMP-ML9DP（SEQ ID NO:92）的描述

用AscI/SphI消化了pZKMP-ML9DP质粒，然后按照“一般方法”用于转化菌株L258U5。将转化体细胞铺在MM平板上并在30℃维持5天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，所选择的48株用pZKMP-ML9DP转化的L258U5菌株中的22株产生了占TFA大于50%的EPA。将产生了占TFA约53.5%、51.8%、52.9%和51.8%的EPA的四个菌株（即17、25、40和46）分别命名为菌株Z5570、Z5571、Z5572和Z5574。

相对于野生型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）ATCC20362，这些pZKMP-ML9DP转化体菌株最终基因型是：Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，YALI0E12947g-，未知6-，YALI0B21890g-，未知8-，未知10-，未知11-，未知12-，未知13-，未知14-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16（2拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，DGAT2M::YlD9::Lip1，GPDIN::YlD9::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT1::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1，EXP1::YlPCT::Pex16（2拷贝），YAT1::MaLPAAT1S::Pex16，ALK2LM1::MaLPAAT1S::Pex20,FBAINm::YlLPAAT1::Lip1（2拷贝），YAT1::YlPDAT::Lip1（2拷贝）。

在任何用pZKMP-ML9DP转化产生的这些EPA菌株中，YALI0F02211g基因座（GenBank登录号XP_504895）的敲除在菌株Z5570、Z5571、Z5572和Z5574中未被确认。

通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析

培养了来自YPD平板的菌株Z5570、Z5571、Z5572和Z5574的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。

优选的实施例的描述中的表7（参见上文）总结了菌株Z5570、Z5571、Z5572和Z5574的总的DCW、TFA%DCW、以占TFA的重量百分比计的每种脂肪酸的浓度[“%TFA”]和EPA%DCW。平均的DCW是4.9g/L，平均的TFA%DCW是54.2，平均的EPA%TFA是48.9，而平均的EPA%DCW是26.55。

实例7

以至少约52TFA%DCW产生至少约49EPA%TFA的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Z5585和Z5627的生成

本实例描述了来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株L258U（实例3）的菌株Z5585和Z5627的构建，这些菌株通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达能够以大于52TFA%DCW产生约49EPA%TFA。

构建了构建体pZKMP-ML9DCB（图7B，SEQ ID NO:95）以将一种溶血磷脂酸酰基转移酶基因、一种Δ9去饱和酶基因和一种二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因整合进菌株L258U的耶氏酵母YALI0F02211g基因座（GenBank登录号XP_504895）。pZKMP-ML9DCB质粒包含下列组分：

表14：质粒pZKMP-ML9DCB（SEQ ID NO:95）的描述

用AscI/SphI消化了pZKMP-ML9DCB质粒，然后按照“一般方法”分别用于转化菌株L258U5和L258U6。将转化体细胞铺在MM平板上并在30℃维持5至6天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

GC分析显示，所选择的50株用pZKMP-ML9DCB转化的L258U5菌株中的21株产生了占TFA大于50%的EPA。将产生了占TFA约52.3%和51.9%的EPA的两个菌株（即，1和1B）分别命名为菌株Z5585和Z5627。

相对于野生型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）ATCC20362，这些pZKMP-ML9DCB转化体菌株最终基因型是：Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，YALI0E12947g-，未知6-，YALI0B21890g-，未知8-，未知10-，未知11-，未知12-，未知13-，未知14-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16（2拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，DGAT2M::YlD9::Lip1,GPDIN::YlD9::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT1::Aco，EXP1::YlCPT1::OCT，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1，EXP1::YlPCT::Pex16，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16，ALK2LM1::MaLPAAT1S::Pex20,FBAINm::YlLPAAT1::Lip1（2拷贝），YAT1::YlPDAT::Lip1（2拷贝）。

在任何用pZKMP-ML9DCB转化产生的这些EPA菌株中，YALI0F02211g基因座（GenBank登录号XP_504895）的敲除在菌株Z5585和Z5627中未被确认。

通过烧瓶检测法对总脂质含量和组成的分析

培养了来自YPD平板的菌株Z5585和Z5627的细胞并按照一般方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。

优选的实施例的描述中的表7（参见上文）总结了菌株Z5585和Z5627的总的DCW、TFA%DCW、以占TFA的重量百分比计的每种脂肪酸的浓度[“%TFA”]和EPA%DCW。平均的DCW是4.7g/L，平均的TFA%DCW是54.3，平均的EPA%TFA是49.4，而平均的EPA%DCW是26.8。

实例8

以至少约45TFA%DCW产生至少约36ETA%TFA的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株YOS9607和YOS9608的生成

本实例描述了来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Z5567（实例3）的菌株YOS9607和YOS9608的构建，这些菌株在烧瓶检测法中能够以大于45TFA%DCW产生大于36ETA%TFA。删除了菌株Z5567中初始的四种Δ5去饱和酶基因，以得到菌株YOS9607和YOS9608，从而允许ETA的产生而没有EPA的产生。

菌株YOS9607和YOS9608的构建需要构建中间菌株Z5567U、YOS9601和YOS9602（图9）。

菌株Z5567U（Ura3-）的生成

为了破坏Ura3基因，构建体pZKUM（图4A；SEQ ID NO:82；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中）以与就菌株Y9502（实例1）的pZKUM转化所描述的相似的方式被用于将Ura3突变基因整合进菌株Z5567的Ura3基因。总计19个C组转化体被培养并被鉴定为具有Ura-表型。

GC分析显示，在生长于MM+5-FOA平板上的pZKUM-转化体菌株6、11、13、15和16中，存在36.9%、37.0%、35.6%、36.8%和36.0%的EPA。这5种菌株分别被命名为Z5567U14、Z5567U19、Z5567U21、Z5567U23和Z5567U24，统称为Z5567U。

菌株YOS9607和YOS9608的生成

四种Δ5去饱和酶基因首先在菌株Z5567中从两种不同的构建体上被整合进染色体：pZKSL-5S5A5（图8A；SEQ ID NO:96）包含嵌合的EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20和YAT1::EaD5SM::OCT基因，而pZP2-85m98F（图8B；SEQ ID NO:97）包含嵌合的EXP1::EgD5SM::Lip1基因。需要三个分别的同源重组事件来移除这些嵌合基因。

首先，通过同源重组，用质粒pYPS234（图10B；SEQ ID NO:99）中的993bp填充DNA片段（SEQ ID NO:98）替代菌株Z5567U的基因组中的嵌合的FBAIN::EgD5SM基因和所述Leu基因（即，来自pZKSL-5S5A5）的大部分（图10A），其中所述993bp填充序列包含耶氏酵母肉毒碱/酰基肉毒碱载体基因的5'和3'部分。更具体地，pYSP234质粒包含下列组分：

表15：质粒pYSP234（SEQ ID NO:99）的描述

第一个交换事件发生在Lys5-5'DNA片段内，而第二个交换事件发生在YAT1启动子内。从这一同源重组产生了菌株YOS9601，其具有Leu-Ura-表型，并且在其基因组中有三个Δ5去饱和酶基因。

然后，通过同源重组，用质粒pYPS233（图11B；SEQ ID NO:101）中的1019bp填充DNA片段（SEQ ID NO:100）替代菌株YOS9601的基因组中的嵌合的EXP1::EgD5M::Pex16和YAT1::EaD5SM::OCT基因（图11A），其中所述1019bp填充序列包含耶氏酵母ALK2基因的5'和3'部分。pYSP233质粒包含下列组分：

表16：质粒pYPS233（SEQ ID NO:101）的描述

第一个交换事件发生在Lys5-3'DNA片段内，而第二个交换事件发生在3'Leu或YAT1启动子区内。从这一同源重组产生了菌株YOS9602，其具有Leu-Ura-表型，并且在其基因组中保留有一个功能性Δ5去饱和酶基因。

最后，通过同源重组，用质粒pYSP241（图12B；SEQ ID NO:102）中的功能性Leu2基因替代了菌株YOS9602基因组中的嵌合的EXP1::EgD5SM::Lip1基因（图12A）。pYSP241质粒包含下列组分：

表17：质粒pYPS241（SEQ ID NO:102）的描述

第一个交换事件发生在染色体B的位点2870148和2871250之间的区域内，而第二个交换事件发生在质粒pYSP241的EaD8S区域内，从而产生了菌株YOS9607（Ura-）和YOS9608（Ura-）。从这一同源重组产生了菌株YOS9607和YOS9608（对应于具有相同基因型的两个分别的克隆），各自具有Ura-表型并在其基因组中不具有Δ5去饱和酶基因。

相对于野生型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）ATCC20362，YOS9607和YOS9608菌株最终基因型是：Ura-，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，YALI0E12947g-，未知6-，YALI0B21890g-，未知8-，未知10-，未知11-，未知12-，未知13-，未知14-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，YAT1::EgD8M::Pex20，GPD::EaD8S::Pex16（2拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPDIN::YlD9::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT1::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1（2拷贝），EXP1::YlPCT::Pex16，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16（2拷贝），FBAINm::YlLPAAT1::Lip1（2拷贝），YAT1::YlPDAT::Lip1（2拷贝）。

为了分析菌株YOS9601（Leu-，Ura-）、YOS9602（Leu-，Ura-）、YOS9607（Ura-）、YOS9608（Ura-）和Z5567U（Ura-）对照的脂肪酸组成和油含量，如上文的“一般方法”所示进行了一式三份的烧瓶检测。

表18总结了总的DCW、TFA%DCW、以占TFA的重量百分比计的每种脂肪酸的浓度[“%TFA”]和EPA%DCW。脂肪酸如表7中所示，其中20:4（5,11,14,17）是指杜松烯酸。在每个样本中的所有脂肪酸的总和为100。

烧瓶实验的数据表明，在基因组中包含三个Δ5去饱和酶基因的菌株YOS9601（Leu-，Ura-）产生了约33EPA%TFA，而在基因组中仅包含一个Δ5去饱和酶基因的菌株YOS9602（Leu-Ura-）产生了约30EPA%TFA。与此相对，菌株YOS9607（Ura-）和YOS9608（Ura-）没能产生任何EPA，但产生了约36%ETA。通过上文的总脂肪酸分析验证了Δ5去饱和酶活性在菌株YOS9607（Ura-）和YOS9608（Ura-）中的缺失；PCR分析也确认了没有任何编码Δ5去饱和酶基因的DNA序列。在烧瓶检测中，与菌株Z5567相比，Z5567U（Ura-）菌株产生了较少EPA%DCW。

实例9

以至少约49TFA%DCW产生至少约50EPA%TFA的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Y8174、Y8184和Y8187的生成

本实例描述了来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株YOS9607和YOS9608（实例8）的菌株Y8174、Y8184和Y8187的构建，这些菌株在烧瓶检测法中能够以大于49TFA%DCW产生大于约50EPA%TFA。这些菌株是通过将三种双突变Δ5去饱和酶整合进菌株YOS9607（Ura-）和YOS9608（Ura-）的染色体中产生的，从而恢复了转化体菌株产生EPA的能力。

更具体地，在HPGG[SEQ ID NO:181]和HDASH[SEQ ID NO:183]基序（如美国临时申请61/428,277[CL5267USPRV，提交于2010年12月30日]中所述，该文献以引用方式并入本文）中均包含突变的双突变Δ5去饱和酶，是选自：EgD5S-36s157g（SEQ ID NO:110；实例11L）、EaD5S-35a158g（SEQ ID NO:112；实例11M）、EgD5M（即，EgD5R*-34g158g；SEQ ID NO:106；实例11I和11K）和EgD5M1（即，EgD5R*-34g158g347s；SEQ ID NO:108；实例11J和11K）。

构建了构建体pZR5AU-555（图13A；SEQ ID NO:113），以将三种嵌合的突变Δ5去饱和酶基因（即，FBAIN::EgD5S-36s157g::Pex20、YAT1::EaD5S-35a158g::Oct和EXP1::EgD5M（EgD5R-34g158g）::Pex16）整合进菌株YOS9607和YOS9608染色体C的1685392和1687267之间的区域，从而允许EPA的产生。

pZR5AU-555质粒包含下列组分：

表19：质粒pZR5AU-555（SEQ ID NO:113）的描述

除了嵌合的EXP1::EgD5M1（EgD5-34g158g347s）::Pex16基因被用于替代pZR5AU-555中的嵌合的EXP1::EgD5M（EgD5R-34g158g）::Pex16基因（即，其中EgD5-34g158g347s如SEQ ID NO:107所示）之外，构建体pZR5AU-555M（图13B；SEQ ID NO:114）与pZR5AU-555是相同的。

用AscI分别消化了pZR5AU-555和pZR5AU-555M质粒，然后按照“一般方法”，单个地用于转化菌株YOS9607和YOS9608。将转化体细胞铺在MM平板上并在30℃维持5天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。根据“一般方法”，对细胞进行了脂肪酸分析。

对96种pZR5AU-555m转化体YOS9607菌株的GC分析鉴定了一种产生占TFA50.8%的EPA的菌株（即，86）；该菌株被命名为菌株Z8184。类似地，对96种pZR5AU-555转化体YOS9608菌株的筛选鉴定了一种产生占TFA51.3%的EPA的菌株（即，68）；该菌株被命名为菌株Z8174。以及，对96种pZR5AU-555m转化体YOS9608菌株的GC分析鉴定了一种产生占TFA51.2%的EPA的菌株（即，56）；该菌株被命名为菌株Z8187。

通过进行重复的烧瓶检测，测定了这些新的EPA菌株的脂肪酸组成和油含量。表20总结了总的DCW、TFA%DCW、以占TFA的重量百分比计的每种脂肪酸的浓度[“%TFA”]和EPA%DCW。鉴定的脂肪酸如表7（参见上文），其中20：4（5,11,14,17）是指杜松烯酸。每种样品的全部脂肪酸的和总计为100。

因此，全部3种菌株均能够以大于49TFA%DCW产生大于50EPA%TFA。

实例10

具有提高的亚油酸至二十碳二烯酸转化效率的突变Δ9延伸酶

本实例（本文中分部分描述为实例10A、10B、10C、10D、10E、10F、10G、10H、10I和10J）示出了支持对突变Δ9延伸酶多肽的描述的实验数据，所述多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中SEQID NO:1与SEQ ID NO:3具有至少一个氨基酸突变的差异，所述突变选自：（i）L35F突变；（ii）L35M突变；（iii）L35G突变；（iv）L35G突变和至少一种选自下列的其它突变：S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W和A254Y；（v）L35G、A21V、L108G和I179R突变；（vi）L35G、W132T和I179突变；（vii）L35G、S9D、Y84C和I179R突变；（viii）L35G、Y84C、I179R和Q244N突变；（ix）L35G、A21V、W132T、I179R和Q244N突变；（x）K58R和I257T突变；（xi）a D98G突变；（xii）L130M和V243A突变；以及（xiii）包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自：K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y和I257T。美国临时专利申请61/377248[代理人档案号CL4783USPRV，提交于2010年8月26日，其全文以引用方式并入本文]也示出了实例10A、10B、10C、10D、10E、10F、10G、10H、10I和10J。

实例10A：包含经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中表达的合成Δ9延伸酶基因（来源于小眼虫（Euglena gracilis））[“EgD9eS”]的解脂耶氏酵母表达载体pZuFmEgD9ES的构建

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）载体pZuFmEgD9ES（图14；SEQ ID NO:115）的构建描述于美国专利7,645,604的实例8中，该文献全文以引用方式并入本文，所述载体pZuFmEgD9ES包含嵌合的FBAINm::EgD9eS::Pex20基因，其中EgD9eS是来源于小眼虫（Euglenagracilis）并且经密码子优化以在耶氏酵母中表达的合成Δ9延伸酶。EgD9eS（SEQ ID NO:2）的核苷酸序列不同于野生型小眼虫（Euglenagracilis）Δ9延伸酶（“EgD9e”；SEQ ID NO:31），除了修饰翻译起始位点之外，还修饰了777bp的编码区的117bp（15.1%）并最优化了106个密码子（40.9%）（然而由经密码子优化的基因[即SEQ ID NO:3]编码的蛋白序列与野生型蛋白序列[即SEQ ID NO:32]相同）。

实例10B：用于分析具有提高的Δ9延伸酶转化效率的包含突变Δ9延伸酶的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）转化体的一般方法

本实例描述了用于分析解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Y2224（来自野生型耶氏酵母菌株ATCC20362[分离描述于国际申请公布WO2008/073367中]Ura3基因的自发突变的FOA抗性突变体）的pZUFmEgD9ES转化体中的脂质特征的一般方法，所述转化体表达非突变EgD9eS基因（SEQ ID NO:2（称为“对照”或“野生型”）或在易错聚合酶链反应[“ePCR”]文库（实例10C）、点饱和文库（实例10E）、

文库（实例10G）、或组合文库（实例10I）（描述于下文）中产生的多种突变EgD9eS基因。

将突变文库转入大肠杆菌（Escherichia coli）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）

通过电穿孔将来自每一突变文库的质粒转入了大肠杆菌（E.coli）Top10电感受态细胞（目录号C404052，Invitrogen，Carlsbad，CA）。将转化的细胞涂布在含有100mg/L氨苄青霉素的Luria-Bertani[“LB”]琼脂平板上，并使其在37℃培养箱中生长过夜。使用

Spin Miniprep试剂盒（Qiagen Inc.，Valencia，CA），按照制造商的规程，从大肠杆菌（E.coli）转化体提取了质粒DNA。

然后将DNA分子转入了解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224，如“一般方法”中所述，并且在MM平板上选择了转化体。在30℃生长2天后，采集在MM平板上选择的转化体并重新划线接种到新制MM平板上。

快速筛选平板检测法

快速筛选“平板检测法”被用于对每种突变文库的初步功能分析。对于这一平板检测法，从上述培养基平板直接对来自上文的重新划线的MM平板的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）转化体进行了分析。使用三甲基氢氧化硫[“TMSH”]制备了FAME。

在通过与氧化银在甲醇中反应转化成溶液之后，从三甲基碘化锍[“TMSI”]制备了TMSH。具体地，将4.4g TMSI混合在100mL MeOH中，并在50℃水浴中孵育1小时；然后，向溶液中添加5g Ag₂O并在室温搅拌4小时。TMSH导致邻-酰基脂质（即，TAG）的碱催化的酯交换和游离脂肪酸的酯化作用（A.H.El-Hamdy&W.W.Christie，J.ofChromatography，630：438-441（1993））。

使用1μl环，从上述重新划线的MM平板直接获取了细胞，并在带有0.35mL插入件的气相色谱[“GC”]小瓶中悬浮于50μl TMSH中。然后将庚烷（150μl）添加至上述小瓶插入件，盖上小瓶，然后在搅拌下于室温孵育20分钟。随后，向配备了Omegawax320熔融二氧化硅毛细管柱（SupelcoInc.，Bellefonte，PA）的Hewlett Packard7890GC中注入庚烷层1μl，用于对FAME的GC分析。将保留时间与来自商品化标准品（Standard461，Nu-Chek Prep，Inc.，Elysian，MN）的甲酯的那些进行比较。

将从包含EgD9eS突变体的细胞获得的FAME谱与非突变EgD9eS对照的进行比较。把这一初次筛选的结果作为选择用于第二次的确认检测的突变体的基础。用于确认检测的突变体的选择所用的标准是基于脂质特征，尤其是从对应的FAME的GC峰面积相对于全部完整的峰的总和的百分比计算的EDA的浓度[“EDA%TFA”]和/或LA至EDA的转化效率。对于每种转化体，LA至EDA的转化效率[“%转化”]按照下式计算：（[产物]/[底物+产物]）*100，其中所述产物是EDA%TFA，而所述底物是以占TFA的面积百分比计的LA的浓度[“LA%TFA”]。

通过快速筛选“平板检测法”表现出相对于对照的Δ9延伸活性的提高的EgD9eS突变体被选择用于随后的确认检测。

包含EgD9eS突变体的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）转化体首先被重新划线至MM平板上，然后每一单独的转化体在30℃被接种至一式三份3mL液体MM培养基中，并250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，提取脂质，通过脂质提取物与甲醇钠的酯交换制备FAME（Roughan，G.和Nishida I.，Arch.Biochem.Biophys.，276（1）：38-46（1990））并随后通过GC进行了分析，如平板检测法（参见上文）所述。

在确认了提高的Δ9延伸活性之后，使用Zymoprep^TMYeast PlasmidMiniprep II试剂盒（目录号D2004，Zymo Research，Orange，CA），按照制造商的建议，从上述解脂耶氏酵母菌株Y2224转化体回收了每种突变pZUFmEgD9ES质粒。

使用染料终止技术（美国专利5,366,860；EP272,007），用载体和插入-特异性引物，在ABI自动测序仪上对回收的质粒进行了测序。使用本领域所熟知的标准工具进行了序列的比较。

实例10C：两个EgD9eS易错PCR文库的构建

本实例描述了两个Δ9延伸酶易错聚合酶链反应[“ePCR”]文库的合成。以两步法构建了两个ePCR文库，所述两步法首先需要在生成在模板内包含随机突变的一系列大引物，然后使用这些大引物在pZuFmEgD9ES中制造点突变。构建体pZuFmEgD9ES（SEQ ID NO:115）（实例10A）被用作DNA模板，用于第一个ePCR文库。第二个ePCR使用来自对第一个ePCR文库的筛选的命中作为DNA模板。

使用随机突变生成试剂盒产生大引物

GeneMorph II Random Mutagenesis试剂盒（目录号200550，Stratagene，La Jolla，CA）被用于在靶蛋白质中产生随机的氨基酸取代。其功能是在易错PCR过程中将突变引入靶基因，所述易错PCR使用新型易错PCR酶共混物，包括两种不同的聚合酶的组合，以产生具有相当的A和T对G和C突变率的偏差较小的突变谱。其广告宣称，使用针对高的产物产量优化的一组缓冲液条件，能够得到1-16个突变每kB的突变率。通过改变反应中模板DNA的初始量和/或所进行的扩增循环的数量，能够容易地控制所期望的突变率。

上述试剂盒被用于产生EgD9eS“大引物”，采用了制造商推荐的规程。这些大引物为约930bp长，并且包含编码EgD9eS（SEQ ID NO:2）的777bp。反应混合物对于第一个ePCR文库而言包含每μl16ng的DNA模板，对于第二个文库而言包含每μl2.0ng的DNA模板。它还包含反应缓冲液、dNTP（0.8mM）、引物pZUFm_6980_012208f（SEQ ID NO:116）（2μM）、引物pZUFm_40_012208r（SEQ ID NO:117）（2μM）和

II DNA聚合酶（0.25U/μl）。PCR反应在Mastercycler梯度设备（Brinkmann Instruments，Inc.，Westbury，NY）中，在薄壁200μl管中进行。PCR扩增使用下列条件进行：95℃2分钟，然后是30个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃延伸90秒。进行了在72℃4分钟的最终延伸循环，然后在4℃结束反应。

使用DNA Clean&Concentrator^TM-5试剂盒（目录号D4003，ZymoResearch，Orange，CA），按照制造商的建议，纯化了PCR产物。纯化的双链PCR产物被用作“大引物”，每种在EgD9eS内包含多个突变。

构建EgD9eS的ePCR突变基因的标准克隆方法

对于第一个ePCR文库，用NcoI和NotI限制性酶消化了“大引物”。然后使用T4DNA连接酶（Promega，Madison，WI），经过室温5小时的连接反应，将凝胶纯化的NcoI/NotI基因片段直接连接至凝胶纯化的NcoI/NotI pZUFmEgD9ES载体（SEQ ID NO:115）。

用于构建EgD9eS的ePCR突变基因的定点诱变

为了构建第二个ePCR文库，上文所述的“大引物”被用在设计用于将所述“大引物”中的EgD9eS突变引入pZuFmEgD9ES（图14；SEQ IDNO:115）中的反应中，从而用多种突变EgD9eS基因替换非突变EgD9eS基因。这是使用

II XL定点诱变试剂盒（目录号200524，Stratagene，La Jolla，CA）实现的。

II定点诱变试剂盒被用于在双链载体中的所关注的插入内制造点突变、取代氨基酸、以及删除或插入单个/多个相邻的氨基酸，其使用高保真PfuUltra DNA聚合酶用于突变生成引物指导的对质粒双链的复制。该试剂盒不需要专门的载体、单一限制性位点或多重转化，并且实际上允许在任何双链质粒中的位点特异性突变。基本的过程利用两种合成的寡核苷酸引物，二者均包含所期望的突变且与载体的相对的链互补，在温度循环过程中通过高保真DNA聚合酶被延伸而没有引物的位移。寡核苷酸引物延伸产生包含交错缺口的突变质粒，然后用Dpn I内切核酸酶对其进行处理。这种限制性酶是特异性针对甲基化的和半甲基化的DNA的，从而允许对亲本DNA模板的消化和对包含突变合成DNA的选择。然后用包含所需突变的带切口的载体DNA转化大肠杆菌宿主并在其中增殖。

然而，在本方法中，包含多种突变EgD9eS基因的双链大引物被用于替代常规的合成的寡核苷酸引物。具体地，制备了50μl的反应，包含5.0μl10x试剂盒提供的反应缓冲液、1.0μl50ng/μl pZUFmEgD9ES模板（SEQ IDNO:115）、42μl大引物、1.0μl40mM试剂盒提供的dNTP混合物和1.0μl试剂盒提供的Pfu-Ultra DNA聚合酶。将反应混合物置于薄壁200μl-容量PCR管中，并使用下列条件进行PCR扩增：95℃30秒，然后是25个循环的95℃变性30秒、55℃退火1分钟和68℃延伸6分钟。最后在68℃进行8分钟的最终延伸循环，然后在4℃终止反应。

将试剂盒提供的DpnI限制性酶（1.0μl）直接添加至最终的定点诱变反应混合物，并在37℃进行1小时的酶切消化，以除去DNA模板。使用DNA纯化试剂盒（Zymo Research）纯化了消化产物，并洗脱得到10μl纯化的DNA，包含在pZUFmEgD9ES载体主链中含有的突变EgD9eS基因。

实例10D：具有提高的Δ9延伸酶转化效率的ePCR EgD9eS文库突变体的鉴定

本实例描述了：1）与野生型蛋白质EgD9eS（SEQ ID NO:3）的相比，具有提高的LA至EDAΔ9延伸酶转化效率的ePCR EgD9eS文库突变体的鉴定；和，2）这些EgD9eS ePCR文库突变体的序列分析。

EgD9eS ePCR突变体的鉴定

将实例10C中制备的ePCR基因文库突变体转入大肠杆菌（E.coli）Top10电感受态细胞中、纯化并随后转入了解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224，如实例10B中所述。使用实例10B中的快速筛选“平板检测法”筛选了1,724个耶氏酵母转化体的脂肪酸谱。然而，基于实例10B的确认检测，五个转化体被确认与对照相比表现出提高的Δ9延伸活性。

来自两个独立的确认检测的数据显示在表21和表22中，并将单独的pZuFmEgD9ES对照转化体的FAME谱与ePCR突变体的那些进行了比较。更具体地，对于每种菌株，从对应的FAME的GC峰面积相对于全部完整的峰的总和的百分比计算的每种脂肪酸的浓度[“%TFA”]和LA至EDA的转化效率（如实例10B中所述测定）显示在下文的表21和表22中，平均值以灰色高亮表示并以“平均”标示。脂肪酸被鉴定为16:0（棕榈酸）、16:1（棕榈油酸）、18:0（硬脂酸）、18:1（油酸）、LA和EDA。每种突变体的性能相对于EgD9eS对照的比较应当仅在每种突变体在其中有被分析的特定确认检测之内进行（即，不能在检测1和检测2之间进行比较）。

表21：确认检测1：表达EgD9eS或其ePCR文库突变变体的转化体解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224中的脂质组成

表22：确认检测2：表达EgD9eS或其ePCR文库突变变体的转化体解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224中的脂质组成

总结以上在确认检测1中显示的数据，用包含非突变的经密码子优化的EgD9eS基因的pZuFmEgD9ES转化的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224的克隆，产生了平均3.1EDA%TFA，其中在这五个克隆中LA至EDA的平均转化效率[“%转化”]被测定为约15.5%。与此相对，突变株1.2ep-8的LA至EDA的平均转化效率是17.8%（或相对于对照为115%）；突变株1.9ep-63的平均转化效率是16.3%（或相对于对照为105%）；以及，突变株1.4ep-161的平均转化效率是16.4%（或相对于对照为106%）。

在确认检测2中，用pZuFmEgD9ES转化的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224的克隆，产生了2.9EDA%TFA，其中在这四种菌株中LA至EDA的平均转化效率被测定为约16.9%。突变株2.1ep-94的LA至EDA的平均转化效率是19.8%（或相对于对照为117%）；以及，突变株2.1ep-95的平均转化效率是18.8%（或相对于对照为111%）。

因此，这些实验确认了由EgD9eS ePCR突变体1.2ep-8、1.9ep-63、1.4ep-161、2.1ep-94和2.1ep-95表现出的提高的Δ9延伸酶转化效率。

EgD9eS ePCR突变体的序列

通过DNA测序表征了从突变体1.2ep-8、1.9ep-63、1.4ep-161、2.1ep-94和2.1ep-95回收的质粒，并且分析显示了突变EgD9eS基因内的多种核苷酸取代和所表达的氨基酸取代，如表23中所显示的。对每种突变EgD9eS基因和包含所述突变EgD9eS基因的每种突变pZuFmEgD9ES质粒，给予了表示氨基酸取代的命名。对于所列的每一取代（即L35G），第一个字母对应于在非突变EgD9eS（即SEQ ID NO:3）中的氨基酸，而第二个字母对应于在突变体中存在于相同位置的氨基酸，即L35G表示从EgD9eS中位点35处的亮氨酸至EgD9eS突变体中甘氨酸的变化）。

表23：测序的EgD9eS ePCR文库突变体的概述

因此，例如，从突变体1.2ep-8回收的质粒包含2个核苷酸取代（即C103T和A654G）。这两个核苷酸取代对应于一个表达的氨基酸取代（即，L35F）和一个沉默氨基酸突变（即，G218G；因为GGA和GGG均编码甘氨酸，作为A654G核苷酸取代的结果，该氨基酸在突变蛋白质中没有改变）。导致了氨基酸变化L35F的包含C103T和A654G突变的质粒，被命名为pZuFmEgD9ES-L35F（SEQ ID NO:120），而其中的突变Δ9延伸酶的核苷酸序列被命名为“EgD9eS-L35F”（SEQ ID NO:118），具有如SEQ ID NO:119所示的蛋白质序列。

实例10E：双位点饱和EgD9eS基因文库的构建

本实例描述了通过以EgD9eS（SEQ ID NO:3）中的氨基酸位置35和107作为靶标制备的点饱和[“SS”]文库的合成。以位置35作为靶标的基本原理是基于实例10D的结果，而以位置107作为靶标的基本原理描述如下。以两步法构建了SS文库，首先需要生成在模板内包含靶突变的大引物，然后使用这些大引物来在pZuFmEgD9ES中制造点突变。

靶向EgD9eS的位置107的基本原理

首先，使用ClustalW比对方法比对了17种脂肪酸延伸酶的氨基酸序列，如下文的表24所述。

表24：用于保守模式分析的脂肪酸延伸酶

使用ClustalW软件包（版本1.83），以默认参数（即，protein weightmatrix=Gonnet250，gap opening penalty=10，gap extension penalty=0.2和全长比对算法）执行了Thompson等人（Nucleic Acids Res.22：4673-4680（1994））描述的Clustal W比对方法。比对结果显示在图15（包括图15A、15B、15C、15D、15E、15F、15G和15H）中。“迹线_1”、“迹线_2”、“迹线_3”和“迹线_4”表示针对功能性的组I、组II、组III和组IV的每一列的共有部分，如下文所定义的，即，迹线1表示包括Ci_elo、Om_elo、Mp_elo1、Pp_elo1、Mp_d5e和Ot_elo1的组I中的蛋白质序列的共有部分。每一列的共有部分被定义如下。具体地，如果该列是完全保守的，则共有部分以该保守的氨基酸表示，显示为大写字母。如果该列在物理-化学性质方面是保守的，则共有部分以小写字母表示，其中“k”表示氨基酸D和E（带负电），“q”表示氨基酸H、K和R（带正电），“p”表示氨基酸N和Q（极性的），“a”表示氨基酸I、L和V（脂族的），“d”表示氨基酸F、W和Y（芳族的），“h”表示氨基酸A和G（小的），“s”表示氨基酸D、E、N、Q、H、K、R、S和T（亲水的），而“f”表示氨基酸I、L、V、F、W、Y、C和M（疏水的）。如果该列是不保守的，则共有部分以大写字母“X”表示。

从上述Clustal W比对中生成了邻接树。基于树状拓扑，上述17种序列被分为了4组，猜测它们对应于不同底物特异性的功能性组：组I包括Ci_elo、Om_elo、Mp_elo1、Pp_elo1、Mp_d5e和Ot_elo1；组II包括Pav_elo2、Ps_elo2和Ot_elo2；组III包括Ea_d9e、Eg_d9e、E398_d9e和Ig_d9e；以及，组IV包括Tp_elo2、Tp_elo1、Ma_d6e和Th_elo2。

考虑图15的比对和邻接树的分组，得出了下列结论。首先，一些位置在组I、II、III和IV内的全部17种序列间是绝对保守的。这些位置被认为对于延伸酶的催化活性可能是必不可少的，并因此排除了将其作为突变的靶标。一些位置仅在组I、II、III和IV内的一些序列中是保守的（即，不是绝对保守的）。这些位置被认为可能对于功能性组或组I、II、III或IV内的延伸酶表现出的底物特异性是重要的。一些位置在组III（包括全部四种已知的Δ9延伸酶）内是相对保守的，但也表现出变化；参见氨基酸位置22、47、54、101、107、111、115、161、182、192和242，以EgD9e的编号计。这些位置被认为对于Δ9延伸酶的活性可能是重要的，并且被推定为调节Ea_d9e（SEQ ID NO:34）、Eg_d9e（SEQ ID NO:32）、E398_d9e（SEQ ID NO:38）和Ig_d9e（SEQ ID NO:42）的底物特异性的差异。

使用TMHMM程序（“Prediction of transmembrane helices inproteins”；TMHMM Server v.2.0，Center for Biological SequenceAnalysis，BioCentrum-DTU，Technical University of Denmark，DK-2800Lyngby，Denmark）进行了对EgD9eS内的跨膜[“TM”]结构域的分析。预测显示了六个跨膜螺旋（对应于氨基酸残基32-51、66-88、114-136、156-175、188-206、221-243），N-和C-端均位于细胞质侧。当用上述TMHMM程序对Ot_elo2、Ig_elo1、Pav_elo2和Tp_elo2进行类似的分析时，跨膜螺旋的数量为4至8不等。因此，为了强化这些变化的预测，使用了下列的功能信息。

1.高度保守的富含组氨酸的基序[Q/H]xxHH（“His-box”）已被显示对于Ig_d9e（SEQ ID NO:42）的最优化的酶活性是必不可少的，但并不直接负责底物特异性（Qi等人，FEBS Letters，547：137-139（2003））。因此，这有力地暗示了His-box（对应于EgD9eS中的氨基酸残基134-138）与活性位点有关；并且，它应当位于折叠好的蛋白质的细胞质侧或其附近，使得底物能够接近活性位点。

2.多个具有带电残基的高度保守的位置存在于EgD9eS的C末端。它们可能与活性有关，因此C末端可能位于折叠好的蛋白质的细胞质侧。

与预测了氨基酸残基114-136之间和氨基酸残基156-175之间的跨膜螺旋的TMHMM结果相反，上述考虑表明，残基114-136之间的序列并不跨膜，因为组氨酸盒不能位于膜的向外一面。如果C末端位于细胞质侧，则所预测的156-175之间的TM结构域也不能跨膜。因为延伸酶的底物是高度疏水的，它很可能会分配进脂双层。活性位点（包括组氨酸盒）可以存在于膜的表面处或非常接近膜的表面。

因此，本文预测这两个疏水性区域（即，对应于氨基酸残基114-136和氨基酸残基156-175）位于内膜单张内或其附近，以确保活性位点接近膜。针对EgD9eS预测的最终的膜拓扑模型显示在图16A中。具体地，每一垂直的圆柱体表示一个跨膜片段，而每一水平的圆柱体表示位于内膜单张内或其附近的疏水延伸。组氨酸盒（即，对应于氨基酸残基134-138）内保守的谷氨酰胺[Q]和组氨酸[H]残基以小圆圈表示。最后，“内”表示细胞质的空间，而“外”表示细胞周质空间。

尽管保守模式分析鉴定了组IIIΔ9脂肪酸延伸酶（即，Ea_d9e[SEQ IDNO:34]、Eg_d9e[SEQ ID NO:32]、E398_d9e[SEQ ID NO:38]和Ig_d9e[SEQ ID NO:42]）内被预测为影响酶活性的11个不同的氨基酸残基，来自预测的拓扑模型的结果进一步限制了候选的残基。具体地，推断对于酶活性而言重要的那些位置必须位于活性位点所在的细胞质侧或其附近。氨基酸残基47、54和192没能满足这一条件，因此它们被假定对于调节Δ9延伸酶的活性不能够是重要的。

基于上述原理，可能显著地影响EgD9eS的Δ9延伸酶活性的候选残基被从SEQ ID NO:3的全长蛋白质中的258个残基减少到仅8个残基，对应于位置22、101、107、111、115、161、182和242。这八个位置被推荐作为靶标用于定点诱变，以提高EgD9eS的底物转化率。下文的实验数据靶向了位置107。

用于构建点饱和文库的大引物的产生

寡核苷酸EgD9E_102_053008f（SEQ ID NO:146）和EgD9E_760_053008r（SEQ ID NO:147）被设计用于分别靶向EgD9eS（SEQ ID NO:3）的氨基酸残基35和107。在商品化地合成了这些寡核苷酸之后，将它们用于PCR反应，以产生适合的大引物，用于构建SS文库。具体地，制备了50μl反应混合物，包含：5.0μl与Pfu-Ultra聚合酶（Stratagene）一起提供的10x反应缓冲液、1.0μl50ng/μl EgD9eS（SEQ IDNO:2）、1.0μl10pmol/μl引物EgD9E_102_053008f（SEQ ID NO:146）、1.0μl10pmol/μl引物EgD9E_760_053008r（SEQ ID NO:147）、1.0μl40mMdNTP混合物（Promega，Madison，WI）、1.0μl高保真Pfu-Ultra DNA聚合酶（Stratagene）和40μl水。混合物被置于薄壁200μl管中，用于在Mastercycler梯度设备（Brinkmann Instruments，Inc.Westbury，NY）中进行PCR反应。PCR扩增使用下列条件进行：95℃30秒，然后是30个循环的95℃变性30秒、54℃退火1分钟和72℃延伸2分钟。最后在72℃进行4分钟的最终延伸循环，然后在4℃终止反应。

用于产生EgD9eS的点饱和突变基因的定点诱变

然后，上文所述的“大引物”被用在设计用于将所述“大引物”中的EgD9eS突变引入pZuFmEgD9ES（图14；SEQ ID NO:115）中的反应中，从而用多种突变EgD9eS基因替换非突变EgD9eS基因。这是使用

II XL定点诱变试剂盒（目录号200524，Stratagene，LaJolla，CA）进行的，如实例10C中所述。具体地，定点诱变反应的组成和扩增条件与实例10C中所描述的是相同的，如DpnI限制性酶切和DNA纯化的方法。

实例10F：具有提高的Δ9延伸酶转化效率的EgD9eS点饱和文库突变体的鉴定

本实例描述了：1）与野生型蛋白质EgD9eS（SEQ ID NO:3）的相比，具有提高的LA至EDA的Δ9延伸酶转化效率的EgD9eS点饱和文库突变体的鉴定；和，2）这些EgD9eS突变体的序列分析。

EgD9eS点饱和突变体的鉴定

将实例10E中制备的SS文库转入大肠杆菌（E.coli）Top10电感受态细胞中、纯化并随后转入了解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224，如实例10B中所述。使用实例10B的快速筛选“平板检测法”分析了带有来自SS文库的构建体的510个耶氏酵母转化体的脂肪酸谱。基于实例10B的确认检测，三个转化体被确认与对照相比表现出提高的Δ9延伸活性。

来自确认检测的数据显示在表25中，并将单独的pZuFmEgD9ES对照转化体的FAME谱与SS文库突变体的那些进行了比较。更具体地，对于每一菌株，以占TFA的面积百分比计的每种脂肪酸的浓度[“%TFA”]和LA至EDA的转化效率（如实例10B中所述测定）显示于下文的表25中，而平均值以灰色高亮表示并以“平均”标示。脂肪酸基于实例10D的缩写被鉴定。

表25：确认检测：表达EgD9eS或其SS文库突变变体的转化体解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224中的脂质组成

在确认检测中，用包含非突变的经密码子优化的EgD9eS基因的pZuFmEgD9ES转化的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224的克隆，产生了平均3.5EDA%TFA，其中在这四个菌株中LA至EDA的平均转化效率[“%转化”]被测定为约18.7%。与此相比，突变株2.4sd2-24的LA至EDA的平均转化效率是27.2%（或相对于对照为145%）；突变株2.4sd2-52的平均转化效率是26.6%（或相对于对照为142%）；以及，突变株2.4sd2-53的平均转化效率是24.6%（或相对于对照为132%）。因此，该检测确认了点饱和突变体2.4sd2-24、2.4sd2-52和22.4sd2-53表现出提高的Δ9延伸酶转化效率。

EgD9eS点饱和突变体的序列

通过DNA测序表征了从突变体2.4sd-24、2.4sd-52和2.4sd-53回收的质粒，并且分析显示了突变EgD9eS基因内的多种核苷酸取代和所表达的氨基酸取代，如表26中所显示的。对每种突变EgD9eS基因和包含所述突变EgD9eS基因的每种突变pZuFmEgD9ES质粒，给予了表示氨基酸取代的命名。

表26：测序的EgD9eS SS文库突变体的概述

如对于本领域的技术人员将显而易见的，申请人知道，基于遗传密码的简并性，多种核苷酸序列能够编码，例如，如EgD9eS-L35G所示的蛋白质。因此，例如，在如SEQ ID NO:44所示的突变蛋白质中，在氨基酸残基位置35处编码的甘氨酸，能够被GGG（如在如SEQ ID NO:43所示的Δ9延伸酶开放阅读框[“ORF”]中）、GGA（如在如SEQ ID NO:152所示的Δ9延伸酶ORF中）、GGC（如在如SEQ ID NO:153所示的Δ9延伸酶ORF中）和GGT（如在如SEQ ID NO:154所示的Δ9延伸酶ORF中）编码。在所编码的蛋白质中导致沉默突变的多种其它核苷酸取代也已被预期，因此本文提供的编码EgD9eS-L35G（SEQ ID NO:44）的核苷酸序列不应当被解释为是对本公开的限制。在编码本发明的和具有Δ9延伸酶活性的突变蛋白质的任何本文所述的核苷酸序列内，预期了类似的变型。

实例10G：EgD9eS-L35G

文库的构建

本实例描述了通过靶向EgD9eS-L35G突变体（SEQ ID NO:44；实例10F）内的50个不同的氨基酸位置制备的

文库的合成，与亲本酶相比，其展示了LA至EDA的转化效率42-45%的提高。因此，本实例试图鉴定能够“堆积”至包含L35突变的EgD9eS突变体中的附加的有益突变。

详述于下文中的自动化机器人平台

产生了

文库，每一序列位置的突变数量和它们的比率在其中能够被非常精确地控制。因此，相对于构建点突变文库（实例10E）时所考虑的有限的残基，在能够被以实验方式测定其对Δ9延伸酶活性的影响的候选残基的数量能够被大大提高方面，这种自动化方法提供了优势。

靶向EgD9eS内50种不同残基用于功能性位点评估的原理

来自绿光等鞭金藻（Isochrysis galbana）[“IgD9e”]（SEQ ID NO:42；PCT公布WO2002/077213、WO2005/083093、WO2005/012316和WO2004/057001；GenBank登录号AAL37626）、小型绿藻属（Eutreptiellasp.）CCMP389[“E389D9e”]（SEQ ID NO:38；美国专利7,645,604）、小眼虫（Euglena gracilis）[“EgD9e”]（SEQ ID NO:32；美国专利7,645,604）和E.anabaena[“EaD9e”]（SEQ ID NO:34；美国专利7,794,701）的Δ9延伸酶已被鉴定和从功能上表征。这些延伸酶中的每一种已被显示能够使LA转化成EDA。EgD9e、EaD9e和E389D9e互相具有大于60%的序列相似性，而IgD9E与EgD9e、EaD9e和E389D9e中的任何一种仅具有约35%的序列相似性（基于ClustalW（版本1.83）分析，使用默认参数（即，protein weight matrix=Gonnet250，gap opening penalty=10，gap extension penalty=0.2和全长比对算法）。

据观察，导致具有提高的Δ9延伸酶转化效率的突变的位置（例如，D98G[实例10D]和L35G[实例10F]）具有中等的序列保守性。使用默认参数的Vector

的AlignX程序（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA）（图17），对IgD9e、EgD9e、EaD9e和E389D9e进行了氨基酸序列比对，以鉴定其它的中度保守残基。在所比对的全部序列之间均保守的美国专利7,645,604的Δ9延伸酶基序，在图中显示为共有序列中带下划线的、粗体的文本。SEQ ID NO:32的EgD9e序列（其在序列方面与EgD9eS的是相同的，如SEQ ID NO:3所示）中粗体的残基表示被突变以产生具有提高的Δ9延伸酶活性的突变延伸酶的残基。这些突变的位置也以星号在比对的每一行上方高亮表示。

据假定，这些中度保守的残基可以是用于氨基酸取代以可能地产生第二代的突变酶的靶标的良好候选，所述突变酶相对于非突变EgD9eS对照具有提高的活性。

比较这四种同源酶的序列，258个氨基酸位置中的58个被确定为在全部四种延伸酶之间是保守的；因此，这些残基被排除在考虑之外。此外，92个位置被确定为在EgD9e、EaD9e和E389D9e之间是保守的；这些位置也被排除在考虑之外。最后，由于在同源物之间具有随机的氨基酸变化的位置通常在蛋白质功能方面不起重要作用，被确定为在全部四种延伸酶之间具有四种不同的氨基酸残基的附加的22个位置因此被排除在作为靶位置用于功能性评估的考虑之外。

SEQ ID NO:32内其余的86个位置（即，位置1、3、4、5、9、12、21、22、27、28、29、32、35、37、41、42、45、47、48、51、52、53、54、57、58、60、62、63、66、67、70、71、73、74、80、83、84、85、89、94、98、101、104、105、107、108、111、115、127、131、132、143、149、152、153、155、156、161、168、169、179、181、182、192、196、204、207、209、210、211、216、218、222、223、225、229、236、239、242、244、245、247、250、254、257和258）被认为是用于功能性位点评估的潜在靶标。在EgD9e（SEQ ID NO:32）、EaD9e（SEQ ID NO:34）和E389E9e（SEQ ID NO:38）中的这些位置中的每一个被编码的氨基酸残基的比较显示于下面的表27中。

表27：用于功能性位点评估的位置

*位置是基于针对EgD9e（SEQ ID NO:32）的比对，其具有与EgD9eS的（SEQ IDNO:3）相同的序列。

在上文的表27中鉴定的86个位置之中，基于图16A的膜拓扑模型，与细胞周质空间具有最大的接近性的那些被排除在进一步的考虑之外（即，位置45、47、48、51、52、53、54、57、58、60、62、63、66、67、70、71、73、74、204、207、209、210、211、216、218、222、223、225和229）。以灰色粗体文本高亮显示的那些位点（即，EgD9eS的位置3、5、9、12、21、22、27、28、32、37、41、42、80、84、85、94、98、101、104、105、107、108、111、115、127、131、132、143、149、152、153、156、161、168、169、179、181、182、192、196、236、239、242、244、245、247、250、254、257和258）被选择用于进一步的实验性评估。

用于产生EgD9eS-L35G的突变基因的

（美国专利7,695,906）使用一组双链DNA三联体作为通用搭建模块，用于“一次一个密码子”地合成组合文库（SloningBioTechnology，Puchheim，Germany）。对于文库的产生，多个密码子能够在任何所期望的序列位置被平行地引入。功能性偏差的不存在，和选择并精确控制至多20个任何比率的密码子的递送的能力，导致了包含所期望的整组突变的极高品质的文库。

如此，使用pZuFmEgD9ES-L35G（SEQ ID NO:148）作为模板，由Sloning BioTechnology构建了

基因文库（总计50个），每一基因文库在靶位置（即，EgD9eS的位置3、5、9、12、21、22、27、28、32、37、41、42、80、84、85、94、98、101、104、105、107、108、111、115、127、131、132、143、149、152、153、156、161、168、169、179、181、182、192、196、236、239、242、244、245、247、250、254、257或258）具有至少16个独立的和特有的序列突变。

全部的EgD9eS-L35G突变被克隆进由pZuFmEgD9ES-L35G提供的载体主链，随后被转入解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224并被培养，如实例10B中所述。从Sloning BioTechnology获得了转化的细胞（作为冷冻的甘油储备物提供）和DNA。一小部分转化的细胞和DNA被测序和确认。

实例10H：具有提高的Δ9延伸酶转化效率的EgD9eS-L35G 文库突变体的鉴定

本实例描述了与实例10F中鉴定的变体蛋白EgD9eS-L35G（SEQ IDNO:44）的相比，具有提高的LA至EDA的Δ9延伸酶转化效率的EgD9eS-L35G

突变体的鉴定。

使用实例10B的“确认检测”方法，对带有来自文库的构建体的807个耶氏酵母转化体的脂肪酸谱进行了筛选，使得生长在新鲜的重新划线的MM平板上的细胞被用于单独地接种一式三份的包含3mL液体MM的培养物。除了上述807个突变体之外，包含pZuFmEgD9ES-L35G（SEQ ID NO:148）的耶氏酵母菌株Y2224也被一式三份地接种，作为实验对照。

在确认检测中来自所选择的突变体的数据显示于表28中，将三个代表性的EgD9eS-L35G对照的FAME谱与

文库突变体的那些进行了比较，显示了LA至EDA的平均转化效率的提高。更具体地，对于每种菌株，以占TFA的面积百分比[“%TFA”]计的每种脂肪酸平均的（表示为“平均”）浓度和LA至EDA的平均转化效率（如实例10B中所述测定）显示于下文的表28中。脂肪酸基于实例10D的缩写被鉴定。每种菌株的描述表示了各自的突变EgD9eS基因中存在的具体氨基酸取代。因此，菌株EgD9eS-L35G/S9A含有包含突变EgD9eS基因的突变pZuFmEgD9ES质粒，与如SEQ ID NO:3所示的EgD9eS的序列相比，所述基因具有L35G突变和S9A突变。

表28：确认检测：表达EgD9eS-L35G或其

突变变体的转化体解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224中的脂质组成

值得注意的是，表28中显示的重复的EgD9eS-L35G对照的脂肪酸谱和LA至EDA的转化效率，与之前报告的EgD9eS-L35G的特征谱有所不同。在本组实验中，EgD9eS-L35G对照与之前的分析相比“表现不佳”（即，LA至EDA的平均转化效率被测定为约18.1%，参见上文，而在实例10F中，LA至EDA%的平均转化效率被测定为约26.6%和27.2%，表25）。然而，含有EgD9eS-L35G的转化体产生了4.3EDA%TFA（平均，参见上文），这显著高于含有EgD9eS的转化体中产生的（即，3.1EDA%TFA[实例10D，表21]、2.9EDA%TFA[实例10D，表22]和3.5EDA%TFA[实例10F，表25]）。由于这个原因，除了本实验中EgD9eS-L35G的表现之外，来自重复了对EgD9eS-L35G的功能性分析（数据未显示）的之前的实验的表现也被用作用于比较来自表28中显示的EgD9eS位点评估文库的突变体的基础。

在表28中的26个选择的延伸酶变体之中，十一个被鉴定为相对于表28的对照数据展示了可比较的或显著提高的Δ9延伸酶转化活性。这些突变体包括EgD9eS-L35G/S9D（141%提高）、EgD9eS-L35G/A21V（118%提高）、EgD9eS-L35G/V32F（104%提高）、EgD9eS-L35G/Y84C（144%提高）、EgD9eS-L35G/L108G（104%提高）、EgD9eS-L35G/W132T（100%提高）、EgD9eS-L35G/M143N（96%提高）、EgD9eS-L35G/L161T（131%提高）、EgD9eS-L35G/I179R（141%提高）、EgD9eS-L35G/C236N（102%提高）和EgD9eS-L35G/Q244N（134%提高），其中相对于EgD9eS的Δ9延伸酶转化活性显示在圆括号中。因此，展示了至高44%的LA至EDA转化效率的提高。

实例10I：EgD9eS-L35G/S9D/A21V/V32F/Y84C/L108G/W132T/ M143N/L161T/I179R/C236N/Q244N组合文库的构建

本实例描述了突变EgD9eS组合文库的合成，其中上文在实例10H中鉴定的有益突变（即，L35G、S9D、A21V、V32F、Y84C、L108G、W132T、M143N、L161T、I179R、C236N和Q244N）的多种组合被“堆积”至包含L35突变的EgD9eS突变体中。

用于构建组合文库的合成的引物的产生

商品化地合成了十一对引物，如SEQ ID NO:155-176所述（参见，表29，见下文）。每一引物对被设计用于将下列突变中的一种引入EgD9eS-L35G基因：S9D、A21V、V32F、Y84C、L108G、W132T、M143N、L161T、I179R、C236N和Q244N。

使用T4多核苷酸激酶[“PNK”]（目录号70031Z，USB Corp.）在37℃使引物磷酸化60分钟，然后在65℃灭活20分钟。每一20μl的磷酸化反应混合物包含：2.0μl10x T4PNK缓冲液、15.0μl引物DNA（约7μM）、0.6μl100mM ATP、0.4μl T4PNK和2.0μl水。

多重突变位点诱变以构建EgD9eS-L35G的组合突变基因

Change-IT^TM多重突变定点诱变试剂盒（目录号78480，USBCorporation，Cleveland，OH）被用于将S9D、A21V、V32F、Y84C、L108G、W132T、M143N、L161T、I179R、C236N和Q244N突变在一系列的6个反应中引入EgD9eS-L35G，每一反应（除了最后一个反应之外）通过包括引物组“A”的正向引物和反向引物与引物组“B”的正向引物和反向引物（表29）引入两个新的突变。虽然这一系列的反应中初始的模板是EgD9eS-L35G，Change-IT^TM反应1的产物在Change-IT^TM反应2中被用作模板，以此类推。

更具体地，制备了两份25μl PCR反应混合物，每一份包含2.5μl10xChange-IT^TM缓冲液、2.5μl磷酸化的正向引物、2.5μl磷酸化的反向引物、1.0μl模板（50ng/μl）、15.5μl无核酸酶的水和1.0μl Change-IT^TMFideliTaq酶。第一份反应使用了来自引物组“A”的引物，而第二份使用了引物组“B”的引物。PCR扩增使用下列条件进行：95℃2分钟，然后是30个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒和68℃延伸/连接25分钟。最后在68℃进行30分钟的最终延伸/连接循环，然后在4℃终止反应。

扩增之后，通过加入DpnI酶除去了模板，消化在37℃进行3小时。PCR DNA被用于通过电穿孔转化大肠杆菌（E.coli）Top10电感受态细胞（目录号C404052，Invitrogen，Carlsbad，CA）。将转化的细胞涂布在含有100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上，并使其在37℃培养箱中生长过夜。使用

Spin Miniprep试剂盒（Qiagen Inc.，Valencia，CA），按照制造商的规程，从转化体大肠杆菌（E.coli）细胞提取了质粒DNA。然后，纯化的DNA在下一个Change-IT^TM反应中被用作模板。在把11个突变中的最后一个引入初始的EgD9eS-L35G模板中的第六个反应之后，从转化体大肠杆菌（E.coli）细胞纯化了DNA，如上文所述。然后将上述DNA转入了解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224（参见上文，实例10B）。

实例10J：具有提高的Δ9延伸酶转化效率的EgD9eS-L35G/S9D/ A21V/V32F/Y84C/L108G/W132T/M143N/L161T/I179R/C236N/Q244N 组合文库突变体的鉴定

本实例描述了：1）与野生型蛋白质EgD9eS（SEQ ID NO:3）的相比，具有提高的LA至EDA的Δ9延伸酶转化效率的EgD9eS-L35G/S9D/A21V/V32F/Y84C/L108G/W132T/M143N/L161T/I179R/C236N/Q244N组合文库突变体的鉴定；2）这些EgD9eS突变体的序列分析；以及，3）测序的EgD9eS突变体的重新构建，以确认提高的Δ9延伸酶转化效率。

EgD9eS-L35G/S9D/A21V/V32F/Y84C/L108G/W132T/M143N/ L161T/I179R/C236N/Q244N组合文库突变体的鉴定

使用实例10B的快速筛选“平板检测法”，对含有来自组合文库（实例10I）的2,388个耶氏酵母转化体的脂肪酸谱进行了筛选。与野生型对照EgD9eS（SEQ ID NO:3）相比，这些突变体中的大多数表现出降低的LA至EDA的转化。然而，基于实例10B的确认检测，五个转化体被确认与对照相比表现出提高的Δ9延伸活性。

使用菌落PCR确定了突变EgD9eS基因的DNA序列。简言之，使用无菌的移液器吸头从新鲜划线的平板取样了少量的酵母细胞，并将所述细胞悬浮于20μl分子级水中。将细胞悬浮液（2μl）转移至按照制造商的建议制备的TaKaRa Ex Taq PCR混合液中（Takara Biotechnology Co.，LTD.）。用于菌落PCR的引物是正向引物FBAIN-F（SEQ ID NO:366）和反向引物Y1026（SEQ ID NO:367）。热循环程序包括模板在94℃初始变性5分钟，然后是40个循环的94℃变性30秒、56℃退火30秒和72℃延伸3分钟。在72℃进行了6分钟的最终延伸。

用引物FBAIN-F（SEQ ID NO:366）和Y1026（SEQ ID NO:367）对PCR产物进行了测序。对DNA序列数据的分析显示了突变EgD9eS基因中的核苷酸取代和所表达的氨基酸取代。对突变EgD9eS基因和包含所述突变EgD9eS基因的突变pZuFmEgD9ES质粒，给予了表示氨基酸取代的命名，如表30中所示。

表30：测序的EgD9eS组合文库突变体的概述

基于表30的氨基酸取代，设计了用于定点诱变的新的引物。然后，这些引物被用在设计用于将所述“大引物”中的EgD9eS突变引入pZuFmEgD9ES（图2；SEQ ID NO:115）的反应中，从而将非突变EgD9eS基因替代为表30中鉴定的多种突变EgD9eS基因。这是使用

II XL定点诱变试剂盒（目录号200524，Stratagene，La Jolla，CA）进行的，如实例10C中所述。将这些突变基因转入了大肠杆菌（E.coli）Top10电感受态细胞中、纯化、测序、并随后转入了解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224，如实例10B中所述。以这种方式，表30中显示的突变EgD9eS基因被重新构建在质粒上，并重新引入回菌株Y2224，以确认EgD9eS组合突变体所表现出的提高的Δ9延伸酶转化效率是由于所鉴定的氨基酸取代。

来自这些确认检测的数据显示在表31中，并将单独的pZuFmEgD9ES对照转化体的FAME谱与组合文库的那些突变体进行了比较。就保守的比较而言，针对每一菌株显示的数据显示，3个分离株的FAME谱具有就每一菌株而言LA至EDA的最高转化效率。更具体地，对于每一菌株，以占TFA的面积百分比计的每种脂肪酸的浓度[“%TFA”]和LA至EDA的转化效率（如实例10B中所述测定）显示于下文，而平均值以灰色高亮表示并以“平均”标示。脂肪酸基于实例10D的缩写被鉴定。

表31：确认检测：表达EgD9eS或其组合突变变体的转化体解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224中的脂质组成

用包含SEQ ID NO:2（非突变）的经密码子优化的EgD9eS基因的pZuFmEgD9ES转化的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y2224的克隆，产生了平均2.5EDA%TFA，其中在这三个克隆中LA至EDA的平均转化效率[“%转化”]被测定为约16.1%。与此相对，突变株EgD9EN-427的LA至EDA的平均转化效率是17.8%（或相对于对照为110%）。类似地，突变株EgD9EN-1043的LA至EDA的平均转化效率是17.5%（或相对于对照为108%）。突变株EgD9EN-1534的LA至EDA的平均转化效率是16.8%（或相对于对照为104%）；突变株EgD9EN-1635的平均转化效率是18.0%（或相对于对照为111%）；以及，突变株EgD9EN-1734的平均转化效率是20.0%（或相对于对照为123%）。

因此，这些实验确认了EgD9eS组合文库突变体EgD9EN-427、EgD9EN-1043、EgD9EN-1534、EgD9EN-1635和EgD9EN-1734表现出的提高的Δ9延伸酶转化效率，其中的提高为从4-23%范围。

实例11

突变HPGG（SEQ ID NO:181）基序和HDASH（SEQ ID NO:183）基序Δ5去饱和酶

本实例（本文中分部分描述为实例11A、11B、11C、11D、11E、11F、11G、11H、11I、11J、11K、11L和11M）示出了支持对具有Δ5去饱和酶活性的突变多肽的描述的实验数据，所述多肽包含：（a）如SEQID NO:180[HxGx]所示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO:180[HxGx]与SEQID NO:181[HPGG]是不同的；以及，（b）如SEQ ID NO:182[HxxxH]所示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO:182[HxxxH]与SEQ ID NO:183[HDASH]是不同的。

更具体地，下列是对突变多肽的描述，所述突变多肽具有Δ5去饱和酶活性并具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:110[EgD5S-36s157g或EgD5S-HPGs_HDgSH]；SEQ ID NO:112[EaD5S-35a158g或EaD5S-HaGG_HDgSH]；SEQ ID NO:106[EgD5R*-34g158g或EgD5R*-HgGG_HDAgH]；和SEQ ID NO:108[EgD5R*-34g158g347s或EgD5R*-HgGG_HDAgH_347s]。

实例11A、11C、11D、11E、11F、11G、11H、11I、11J、11K、11L和11M也列于美国临时专利申请61/428,277[代理人档案号CL5267USPRV，提交于2010年12月30日]中，该文献全文以引用方式并入本文。

描述于国际申请公布WO2008/073367中的解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y4036U（Leu-，Ura-）被用作实例11D、11E、11F、11H、11I和11K中的宿主，参见下文。

通过菌株Y2224（Ura3-，来自Ura3基因的自发突变的FOA抗性突变体）、菌株Y4001（产生17%EDA，具有Leu-表型）、菌株Y4001U1（Leu-和Ura-）和菌株Y4036（产生18%DGLA，具有Leu-表型）的构建，菌株Y4036U来源于解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）ATCC20362。

相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC20362，菌株Y4036U最终的基因型是：Ura3-，YAT1::ME3S::Pex16，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::OCT。

实例11A：小眼虫（Euglena gracilis）Δ5去饱和酶[“EgD5”]的拓扑模型的开发

为了更好地预测来自小眼虫（E.gracilis）的Δ5去饱和酶[“EgD5”；美国专利7,678,560；SEQ ID NO:184和185]中的HDASH基序可能的重要性，基于逻辑和下文的分析开发了拓扑模型（图18）。

首先，使用TMHMM程序（“Prediction of transmembrane helices inproteins”；TMHMM Server v.2.0，Center for Biological SequenceAnalysis，BioCentrum-DTU，Technical University of Denmark，DK-2800Lyngby，Denmark）进行了对EgD5的跨膜结构域的分析。预测显示了六个跨膜螺旋（对应于氨基酸残基103-125、130-152、165-187、234-256、280-302和306-328），N-和C-端均位于膜的细胞质侧。

使用下列的EgD5的同源物进行了类似的TMHMM分析：GenBank登录号AAT09160[小新月菱形藻（Nitzschia closterium f.minutissima）]，GenBank登录号BAG71007[Oblongichytrium sp.SEK347]和GenBank登录号AAL92562[三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）]。对于每种同源物，预测了四种跨膜片段，对应于针对EgD5预测的前两个和后两个跨膜结构域。

膜结合的脂肪酸去饱和酶属于以三个富含组氨酸（His-rich）的基序为特征的膜双铁蛋白质超家族：HX_（3-4）H（SEQ ID NO:186和187）、HX_（2- _3）HH（SEQ ID NO:188和189）和（H/Q）X_（2-3）HH（SEQ ID NO:190和191）。这些富含组氨酸的残基已被预测位于膜的细胞质侧，并且已被显示对于酶活性是重要的（Shanklin，J.等人，Biochemistry,33：12787-12794（1994）；Shanklin，J.和Cahoon，E.B.，Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.，49：611-641（1998））。在EgD5中，第一个富含组氨酸的区域（HDASH[SEQ ID NO:183]）位于跨越氨基酸残基165-187的第三个预测的跨膜片段之前，而第二个富含组氨酸的区域（HIMRHH[SEQ ID NO:189]）位于该跨膜片段之后。如果上述第三个跨膜片段的确跨膜，则第二个富含组氨酸的区域将位于细胞周质空间中——从而阻止了它参与到铁-活性位点中。因此，假定第三个跨膜片段（氨基酸残基165-187）和第四个跨膜片段（氨基酸残基234-256）均不跨膜。这与针对三种Δ5去饱和酶同源物（即，GenBank登录号AAT09160、BAG71007和AAL92562）的TMHMM预测是一致的。

由于Δ5去饱和酶底物（即，DGLA、ETA）是高度疏水的，它被假定很可能分配至脂双层中。类似地，假定从三个富含组氨酸的簇组装的活性位点将很可能位于膜表面或其附近。因此，最初被TMHMM预测为跨越膜的、被发现分别在残基165-187和234-256之间的第三和第四个跨膜片段，反而被预测为位于膜表面附近，以确保活性位点定位在膜附近。氨基酸残基103-125、130-152、280-302和306-328处的跨膜区域依然如TMHMM所预测的。

因此，针对EgD5预测的最终的拓扑模型显示于图18中。垂直的圆柱体表示跨膜结构域，而水平的圆柱体表示并不跨膜，而是位于内膜表面附近的两个高度疏水的区域。圆圈对应于据推测涉及活性位点的组氨酸残基。还鉴定了HPGG（SEQ ID NO:181）基序和HDASH（SEQ ID NO:183）基序。最后，“内”表示细胞质的空间，而“外”表示细胞周质空间。

实例11B：去饱和酶中天然的HDASH（SEQ ID NO:183）基序变异的确定

对经选择的去饱和酶蛋白质序列进行了检测，以确定天然的变异是否在HDASH（SEQ ID NO:183）基序内出现。具体地，所述去饱和酶蛋白质包括小眼虫（Euglena gracilis）Δ5去饱和酶[“EgD5”；美国专利7,678,560]、高山被孢霉（Morteriella alpina）Δ5去饱和酶[“MaD5”；美国专利5,972,664]、以及已知的Δ5去饱和酶和/或已知与Δ5去饱和酶密切相关的Δ6去饱和酶的BLAST命中。使用LASERGENE生物信息学计算包（DNASTAR Inc.，Madison，WI）中的MegAlign^TM程序对所选择的序列进行了比对，HDASH基序（或其变体）总结在下文的表32中。

表32：HDASH（SEQ ID NO:183）基序的天然变体

基于以上分析，似乎HDASH（SEQ ID NO:183）基序的Asp[“D”]残基可能能够被Glu残基[“E”]取代，Ala[“A”]残基可能能够被Gly[“G”]、Ser[“S”]、Phe[“F”]、Tyr[“Y”]或Met[“M”]残基取代和/或HDASH（SEQ ID NO:183）基序的Ser[“S”]残基可能能够被Cys[“C”]、Asn[“N”]、Gly[“G”]、Ala[“A”]或Thr[T”]残基取代。

实例11C：野生型小眼虫（Euglena gracilis）Δ5去饱和酶的序列 [“EgD5”]

美国专利7,678,560描述了来自小眼虫（E.gracilis）的Δ5去饱和酶的分离和克隆（即，EgD5，SEQ ID NO:185）。最近，对其中克隆的EgD5的更详细的分析已鉴定了又一种变体“野生型”小眼虫（E.gracilis）Δ5去饱和酶序列，其被命名为EgD5R，如本文中的SEQ ID NO:192和193所示，它是之前未被鉴别出的。EgD5R（SEQ ID NO:193）在位置347处包含精氨酸残基，而不是如美国专利7,678,560中所述的EgD5的位置347处的丝氨酸残基。据推测这种差异是PCR或cDNA生成技术造成的。

具体地，EgD5（SEQ ID NO:184我，对应于美国专利7,678,560的SEQ ID NO:1）是以小眼虫（E.gracilis）的双链cDNA作为模板，使用5'-和3'-RACE技术获得的（美国专利7,678,560的实例4-5）。然后，以小眼虫（E.gracilis）cDNA作为模板，通过PCR扩增了编码小眼虫（E.gracilis）Δ5去饱和酶的ORF、纯化、进行限制性消化，然后定向连接至适当的载体中，以得到pDMW367（美国专利7,678,560的实例6）。pDMW367的序列在美国专利7,678,560中作为SEQ ID NO:23提供（对应于本文中的SEQ ID NO:194）。尽管在美国专利7,678,560中报道了pDMW367包含嵌合的FBAIN::EgD5::Pex20基因，现在知道在这个嵌合基因内的Δ5去饱和酶序列实际上是EgD5R（SEQ ID NO:192）的核苷酸序列。

EgD5（SEQ ID NO:184）和EgD5R（SEQ ID NO:192）（图19A和19B）的比对显示了四个核苷酸的差异，其中突变相对于SEQ ID NO:184是G819GA、T948C、C1041A和G1349A。G1349A突变是由用于扩增EgD5以供克隆进pDMW367的特异性引物序列导致的。EgD5（SEQ ID NO:185）和EgD5R（即SEQ ID NO:193）的翻译产物的比对显示了单个氨基酸的差异，即S347R突变。

美国专利7,678,560，实例9还描述了来源于EgD5并经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）中表达的合成Δ5去饱和酶（即，EgD5S；SEQ ID NO:195和196）的产生。EgD5的密码子最优化导致1350bp编码区中的196bp被修饰（14.5%）并最优化了总计449个密码子中的189个密码子（42%）。由经密码子优化的EgD5S基因（即SEQ ID NO:196）编码的蛋白质序列与野生型蛋白质序列（即SEQ ID NO:185）是相同的，其中在位置347处的氨基酸是丝氨酸。

实例11D：包含去除了四个限制性内切核酸酶位点的野生型EgD5R [“EgD5R*”]的构建体pDMW367-M4的生成

本实例描述了包含嵌合的FBAIN::EgD5R*::Pex20基因的质粒pDMW367-M4（图20A、20B和20C）的构建。EgD5R*（SEQ ID NO:197）是野生型EgD5R（SEQ ID NO:192）经修饰的变体，其被构建用于帮助随后的克隆过程，其中的修饰导致四种限制性酶切位点（即，EcoRI、HindIII、BglII和NcoI）从野生型EgD5R编码区的除去。EgD5R（SEQ IDNO:193）和EgD5R*（SEQ ID NO:198）的氨基酸序列是相同的。

具体地，质粒pDMW367-M4（SEQ ID NO:199；图20C）来源于pDMW367（SEQ ID NO:194，实例11C；图20A）。天然的EcoRI、HindIII、BglII和NcoI限制性酶切位点被从EgD5R编码区顺序除去，以产生pDMW367-M4。首先，用pDMW367（SEQ ID NO:194）作为模板，并使用两对寡核苷酸作为引物，通过体外诱变除去了EcoRI和BglII位点。引物对YL813（SEQ ID NO:200）和YL814（SEQ ID NO:201）使得能够突变EcoI位点，而引物对YL815（SEQ ID NO:202）和YL816（SEQ ID NO:203）使得能够突变BglII位点。这些反应产生了构建体pDMW367-M2（图20B；SEQ ID NO:204）。序列分析确认了pDMW367-M2中的变体EgD5R的氨基酸序列与pDMW367中的EgD5R的氨基酸序列是相同的。

然后，用pDMW367-M2作为模板，并使用两对寡核苷酸作为引物，通过体外诱变除去了HindIII和NcoI位点。引物对YL829（SEQ ID NO:205）和YL830（SEQ ID NO:206）使得能够突变HindIII位点，而引物对YL831（SEQ ID NO:207）和YL832（SEQ ID NO:208）使得能够突变NcoI位点。这导致了pDMW367-M4的生成。

同样，序列分析确认了pDMW367-M4中的变体EgD5（即，EgD5R*）的氨基酸序列与pDMW367中的EgD5R的氨基酸序列是相同的。

对于后续的实例，提及野生型EgD5时将实际上包括提及了EgD5R（SEQ ID NO:192和193）和EgD5R*（SEQ ID NO:197和198），除非另外指明。

实例11E：导致与EgD5R*的Δ5去饱和酶活性相似的Δ5去饱和酶活性的HDxSH（SEQ ID NO:434）突变的鉴定

HDASH（SEQ ID NO:183）基序跨越了EgD5R*（SEQ ID NO:198）的氨基酸残基155至159。用pDMW367-M4（实例11D）作为模板，并用19对寡核苷酸（SEQ ID NO:209-246；表33，参见下文）作为引物，进行了单个氨基酸的突变，以通过定点诱变（QuickChange试剂盒，Stratagene，CA）使EgD5R*的HDASH（SEQ ID NO:183）基序的丙氨酸残基单个地突变，从而产生全部可能的氨基酸取代（即，HDxSH[SEQ IDNO:434]突变体）。来自每一突变的质粒被转入了大肠杆菌（E.coli）XL2Blue细胞。来自19种转化体中的每一种的三个菌落被挑出，并于37℃在液体培养基中单独地生长过夜。从这些培养物中分离质粒（即，总计57种）并单独测序，以确定突变。

野生型pDMW367-M4质粒和所分离的突变质粒被单独地转入了解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y4036U1，如“一般方法”中所述。在MMLeu平板上选择转化株。于30℃生长2天后，来自每一转化反应的三个转化体被划线至新的MMLeu平板上，并于30℃再孵育2天。然后将菌落用于接种24孔Qiagen板中的3mL MMLeu。在以200rpm摇动的30℃培养箱中孵育上述板。培养物被孵育2天后，离心上述板，移除上层清液，并加入3mL的HGM。上述板被放回30℃培养箱中，以200rpm再摇动5天。通过离心收集细胞，提取脂质，并通过酯交换制备了脂肪酸甲酯[“FAMEs”]，然后用Hewlett-Packard6890GC进行了分析。

与每种突变HDASH（SEQ ID NO:183）基序相关的Δ5去饱和酶活性（3个转化体的平均值）总结在下文的表33中。按照针对EgD5R*内位置157处的丙氨酸残基所发生的氨基酸取代，命名了包含突变pDMW367M4构建体的转化体，其中所述突变构建体包含EgD5R*突变（即，转化体pDMW367M4-157c包含被命名为EgD5R*-157c的突变Δ5去饱和酶，并在位置157具有半胱氨酸对丙氨酸的取代，从而产生了HDcSH[SEQ ID NO:390]基序；转化体pDMW367M4-157g包含被命名为EgD5R*-157g的突变Δ5去饱和酶，并在位置157具有甘氨酸对丙氨酸的取代，从而产生了HDgSH[SEQ ID NO:429基序，等等）。转化效率（“平均转化效率”）根据如下公式测量：（[产物]/[底物+产物]）×100，其中“产物”包括源于它的途径中的中间产物和所有产物。将结果与质粒pDMW367-M4中的野生型EgD5R*（SEQ ID NO:198）的进行了比较，其中GC分析测定了由转化体产生了占总脂质10.8%的DGLA和3.6%的ARA（即，平均转化效率为24.8%）。

表33：EgD5R*和HDxSH（SEQ ID NO:434）基序突变体中的Δ5去饱和酶活性

*每种EgD5R*基因（突变或野生型）在pDMW367-M4内表达。

**百分比活性是相对于EgD5R*。

基于以上所述，显然HDASH（SEQ ID NO:183）基序内的丙氨酸残基能够被甘氨酸或丝氨酸取代而基本上不会影响EgD5R*的Δ5去饱和酶活性。具体地，pDMW367M4-157g转化体中的EgD5R*-157g（SEQ ID NO:247）能够以23.8%的转化效率使DGLA转化成ARA，而pDMW367M4-157s转化体中的EgD5R*-157s（SEQ ID NO:248）能够以23.3%的转化效率使DGLA转化成ARA。

实例11F：导致与EgD5R*的Δ5去饱和酶活性相似的Δ5去饱和酶活性的HDAxH（SEQ ID NO:435）突变的鉴定

用pDMW367-M4（实例11D）作为模板，并用19对寡核苷酸（SEQID NO:249-286；表34，参见下文）作为引物，进行了单个氨基酸的突变，以通过定点诱变（QuickChange试剂盒，Stratagene，CA）使EgD5R*（SEQ ID NO:198）的HDASH（SEQ ID NO:183）基序的丝氨酸残基单个地突变，从而产生全部可能的氨基酸取代（即，HDAxH[SEQ ID NO:435]突变体）。诱变之后，质粒被转入解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Y4036U1，选择转化体并生长于MMLeu和HGM中，制备了FAME并通过GC进行了分析，如实例11E中所述。

与HDASH（SEQ ID NO:183）基序内的每种突变相关的Δ5去饱和酶活性（3个转化体的平均值）总结在下文的表34中。按照针对EgD5R*内位置158处的丝氨酸残基所发生的氨基酸取代，命名了包含突变pDMW367M4构建体的转化体，其中所述突变构建体包含EgD5R*突变体（即，转化体pDMW367M4-158a包含被命名为EgD5R*-158a的突变Δ5去饱和酶，并在位置158具有丙氨酸对丝氨酸的取代，从而产生了HDAaH[SEQ ID NO:431]基序；转化体pDMW367M4-158r包含被命名为EgD5R*-158r的突变Δ5去饱和酶，并具有精氨酸对丝氨酸的取代，从而产生了HDArH[SEQ ID NO:419]基序，等等）。按照实例11E中所述的式测量了转化效率。将结果与质粒pDMW367-M4中的野生型EgD5R*（SEQ ID NO:198）的进行了比较，其中GC分析测定了由转化体产生了占总脂质11.3%的DGLA和3.4%的ARA（即，平均转化效率为23.3%）。

表34：EgD5R*和HDAxH（SEQ ID NO:435）基序突变体中的Δ5去饱和酶活性

*每种EgD5R*基因（突变或野生型）在pDMW367-M4内表达。

**百分比活性是相对于EgD5R*。

结果表明，HDASH（SEQ ID NO:183）基序内的丝氨酸残基能够被丙氨酸或甘氨酸取代而基本上不会影响EgD5R*的Δ5去饱和酶活性。具体地，pDMW367M4-158a转化体中的EgD5R*-158a（SEQ ID NO:287）能够以23.5%的转化效率使DGLA转化成ARA，而pDMW367M4-158g转化体中的EgD5R*-158g（SEQ ID NO:288）能够以25.1%的转化效率使DGLA转化成ARA。

实例11G：导致与EgD5R*的Δ5去饱和酶活性相似的Δ5去饱和酶活性的HxGx(SEQ ID NO:180)和HDxxH(SEQ ID NO:424)突变的鉴定

美国专利公布2010-0075386-A1描述了在细胞色素b₅-样结构域的HPGG（SEQ ID NO:181）基序中具有至少一个突变的突变Δ5去饱和酶（即，HxGx[SEQ ID NO:180]突变）。HPGG（SEQ ID NO:181）基序跨越了EgD5R*（SEQ ID NO:198）的氨基酸残基33至36。

本实例在EgD5R*-157g（实例11E，SEQ ID NO:247）、EgD5R*-158a（实例11F，SEQ ID NO:287）和EgD5R*-158g（实例11F，SEQ ID NO:288）的HPGG（SEQ ID NO:181）基序内引入了突变，以观察HPGG（SEQ ID NO:181）和HDASH（SEQ ID NO:183）结构域内双重突变的效应。

用pDMW367M4-157g（实例11E，SEQ ID NO:289）、pDMW367M4-158a（实例11F，SEQ ID NO:290）和pDMW367-158g（实例11F，SEQID NO:291）作为模板，并用多对寡核苷酸（SEQ ID NO:292-297；表35）作为引物，进行了单个氨基酸的突变，以通过定点诱变（QuickChange试剂盒，Stratagene，CA）使突变Δ5去饱和酶的HPGG（SEQ ID NO:181）基序的脯氨酸残基或第二个甘氨酸残基单个地突变，从而在HPGG（SEQ ID NO:181）和HDASH（SEQ ID NO:183）基序内产生双重突变。诱变之后，质粒被转入解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y4036U1，选择转化体并生长于MMLeu和HGM中，制备了FAME并通过GC进行了分析，如实例11E中所述。

既具有HxGx（SEQ ID NO:180）又具有HDxxH（SEQ ID NO:424）突变的突变Δ5去饱和酶的Δ5去饱和酶活性总结在下文的表35中。按照针对EgD5R*的HPGG（SEQ ID NO:181）基序内的脯氨酸残基或第二个甘氨酸残基所发生的氨基酸取代，结合针对EgD5R*的HDASH（SEQ ID NO:183）基序内的丙氨酸残基或丝氨酸残基所发生的氨基酸取代，命名了包含突变pDMW367M4构建体的转化体，其中所述突变构建体包含EgD5R*突变。即，例如，转化体pDMW367-34g158g包含被命名为EgD5R*-34g158g的突变Δ5去饱和酶，并在位置34具有甘氨酸对脯氨酸的取代（从而产生了HgGG[SEQ ID NO:425]基序）和在位置158具有甘氨酸对丝氨酸的取代（从而产生了HDAgH[SEQ ID NO:432]基序），等等。按照实例11E中所述的式测量了转化效率。将结果与质粒pDMW367-M4中的野生型EgD5R*的进行了比较，其中GC分析测定了由转化体产生了占总脂质11.7%的DGLA和4.4%的ARA（即，平均转化效率为27.5%）。

结果表明，尽管HPGG（SEQ ID NO:181）基序和HDASH（SEQ IDNO:183）基序对于Δ5去饱和酶的酶活性是重要的，去饱和酶可以被构建为具有HxGx（SEQ ID NO:180）和HDxxH（SEQ ID NO:424）基序，而与野生型相比保留了至少64%的Δ5去饱和酶活性。具体地，HPGG（SEQID NO:181）基序内的脯氨酸残基能够被甘氨酸取代并同时具有下列取代之一：1）HDASH（SEQ ID NO:183）基序内的丙氨酸残基被甘氨酸；或，2）HDASH（SEQ ID NO:183）基序内的丝氨酸残基被丙氨酸或甘氨酸。HPGG（SEQ ID NO:181）基序内的脯氨酸残基还能够被组氨酸取代，同时HDASH（SEQ ID NO:183）基序内的丝氨酸残基被丙氨酸或甘氨酸取代。并且，HPGG（SEQ ID NO:181）基序内的第二个甘氨酸残基还能够被丝氨酸取代，同时HDASH（SEQ ID NO:183）基序内的丝氨酸残基被丙氨酸或甘氨酸取代。

优选的双重突变体是EgD5R*-34g157g（SEQ ID NO:298和299；在pDMW367-34g157g转化体内能够以22.9%的转化效率使DGLA转化成ARA）、EgD5R*-34g158a（SEQ ID NO:300和301；在pDMW367-34g158a转化体内能够以24.3%的转化效率使DGLA转化成ARA）和EgD5R*-34g158g（SEQ ID NO:302和303；在pDMW367-34g158g转化体内能够以26.8%的转化效率使DGLA转化成ARA）。

实例11H：来源于EgD5R*-34g158g的、针对在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中的表达N末端经密码子优化的突变Δ5去饱和酶基因（“EgD5M”）的合成

EgD5R*-34g158g（SEQ ID NO:302，实例11G）的5'部分的密码子使用，是以与美国专利7,125,672中所述的相似的方式，针对在解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）中的表达经过优化的。具体地，EgD5R*-34g158g的前204bp是经密码子优化的，以导致被命名为“EgD5M”（SEQ ID NO:105和106）的经密码子优化的Δ5去饱和酶基因的合成。EgD5M是基于EgD5R*-34g158g的Δ5去饱和酶基因的编码序列，按照耶氏酵母的密码子使用模式（美国专利7,125,672）、‘ATG'翻译起始密码子周围的共有序列以及RNA稳定性的一般规则（Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265（1-2）：11-23（2001））设计的。除了修饰翻译起始位点之外，还对编码区的N末端内204bp中的52bp进行了修饰（25.5%；图21），所述去饱和酶蛋白质的N末端的68个氨基酸中的45个密码子被优化（66.2%）。分别将NcoI位点和NotI位点整合到EgD5M的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。由经密码子优化的EgD5M基因编码的蛋白质序列（即SEQ IDNO:106）与野生型EgD5R*-34g158g蛋白质序列（即SEQ ID NO:303）是相同的。设计的EgD5M基因（SEQ ID NO:105）由GenScript Corporation（Piscataway，NJ）合成并将其克隆到pUC57（GenBank登录号Y14837）中，以产生pEgD5M（图22A；SEQ ID NO:304）。

实例11I：包含EgD5M的构建体pDMW367-5M的生成

本实例描述了包含嵌合的FBAIN::EgD5M::Pex20基因的质粒pDMW367-5M的构建。质粒pDMW367-5M（图22B；SEQ ID NO:305）是通过用来自pEgD5M（图22A；SEQ ID NO:304）的NcoI/NotI EgD5M片段替换pDMW367-M4（图20C；SEQ ID NO:199）的NcoI/NotI EgD5R*片段构建的。连接的产物是pDMW367-5M，其因此包含下列组分：

表36：质粒pDMW367-5M（SEQ ID NO:305）的组分

实例11J：包含N末端经密码子优化的突变Δ5去饱和酶基因的变体 “EgD5M1”的构建体pDMW367-5M1的生成

本实例描述了包含嵌合的FBAIN::EgD5M1::Pex20基因的质粒pDMW367-5M1（SEQ ID NO:307）的构建。除了在EgD5M中位置347处编码精氨酸的CGA密码子变成了EgD5M1中编码丝氨酸的AGC密码子之外，EgD5M1（SEQ ID NO:107）的核苷酸序列与EgD5M（SEQ ID NO:105）的是相同的。这种改变被设计用于分析R347S突变（描述于实例11C中）对Δ5去饱和酶活性的影响。

由GenScript Corporation（Piscataway，NJ）合成了设计的EgD5M1基因（也被称为“EgD5R*-34g158g347s”；SEQ ID NO:107），并将其克隆进pUC57（GenBank登录号Y14837）以产生pEgD5M1（SEQ ID NO:306）。

质粒pDMW367-5M1（SEQ ID NO:307）是通过用来自pEgD5M1（SEQ ID NO:306）的NcoI/NotI EgD5M1片段替换pDMW367-M4（图20C；SEQ ID NO:199）的NcoI/NotI EgD5R*片段构建的。连接的产物是pDMW367-5M1，包含嵌合的FBAIN::EgD5M1::Pex20基因。

实例11K：EgD5M和EgD5M1Δ5去饱和酶在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Y4036U1中的功能分析

对照质粒pDMW367-M4（SEQ ID NO:199；实例11D）以及质粒pDMW367-5M（SEQ ID NO:305；实例11I）和pDMW367-5M1（SEQ IDNO:307；实例11J）各自被分别地转入了解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y4036U1。选择转化体并使它们生长于MMLeu和HGM中，制备了FAME并通过GC进行了分析，如实例11E中所述。

EgD5R*、EgD5M和EgD5M1的Δ5去饱和酶活性（3个转化体的平均值）总结于下文的表37中。按照实例11E中所述的式子测量了转化效率（“转化效率”）。将结果与质粒pDMW367-M4中的野生型EgD5R*（SEQ ID NO:198）的进行了比较，其中GC分析测定了由转化体产生了占总脂质10.8%的DGLA和3.6%的ARA（即，平均转化效率为24.8%）。

表37：EgD5R*、EgD5M和EgD5M1中的Δ5去饱和酶活性

结果表明，EgD5M（SEQ ID NO:106）和EgD5M1（SEQ ID NO:108）均具有比野生型EgD5R*（SEQ ID NO:198）更高的Δ5去饱和酶活性。与EgD5M相比，EgD5M1提高的Δ5去饱和酶活性表明，以丝氨酸相对于精氨酸作为优选，氨基酸残基347不影响蛋白质的Δ5去饱和酶活性。

实例11L：在来源于小眼虫（Euglena gracilis）并经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中表达的合成Δ5去饱和酶基因（“EgD5S”）中的HPGs（SEQ ID NO:427）和HxxxH（SEQ ID NO: 186）突变的鉴定

本实例在突变EgD5S-36s（或“EgD5S-HPGs”）基因的HDASH（SEQ ID NO:183）基序中引入了突变，以测定HPGG（SEQ ID NO:181）和HDASH（SEQ ID NO:183）保守结构域内双重突变的效应。

EgD5S（SEQ ID NO:195和196）是来源于EgD5（实例11C）并经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）中表达的合成Δ5去饱和酶（美国专利7,678,560）。尽管EgD5S的氨基酸序列与EgD5是相同的，但核苷酸序列是不同的；具体地，除了修饰翻译起始位点，还对1350bp编码区中的196bp进行了修饰（14.5%）并优化了189个密码子（42%）。GC含量从野生型基因（即EgD5）中的55.5%减少到合成基因（即EgD5S）中的54.4%。并且，分别将NcoI位点和NotI位点整合到EgD5S的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。

美国专利公布2010-0075386-A1的实例1至4描述了突变EgD5S-36s（SEQ ID NO:308）的鉴定，其使用EgD5S作为定点诱变反应中的模板，靶向对EgD5S的HPGG（SEQ ID NO:181）基序的第二个甘氨酸残基的修饰，所述基序跨越细胞色素b5-样结构域的氨基酸残基33至36（即，HPGx[SEQ ID NO:436]突变）。因此，突变EgD5S-36s包含HPGs（SEQ ID NO:427）基序，其中HPGG（SEQ ID NO:181）基序的第二个甘氨酸残基是以EgD5S（SEQ ID NO:196）作为模板被丝氨酸取代的。EgD5S-36s（美国专利公布2010-0075386-A1）的Δ5去饱和酶活性是EgD5S的Δ5去饱和酶活性的约106.9%。质粒pDMW369S（SEQ ID NO:309）包含突变EgD5S-36s基因；所述载体的组分与pDMW367-5M（本文的图22B）的那些是相似的，不同之处在于突变EgD5S-36s基因取代了EgD5M基因）。

基于在实例11G中双重EgD5R*突变体（即，同时包含突变HPGG[SEQ ID NO:181]和突变HDASH[SEQ ID NO:183]基序）的成功生成，预期类似的HxxxH（SEQ ID NO:186）突变在被引入EgD5S-36s中时将被耐受。具体地，用pDMW369S（包含嵌合的FBAIN::EgD5S-36S::Pex20基因）作为模板，并用9对寡核苷酸（SEQ ID NO:310-327；表38）作为引物，进行了单个氨基酸的突变，以通过定点诱变（QuickChange试剂盒，Stratagene，CA）使EgD5S-36s（SEQ ID NO:308）的HDASH（SEQ IDNO:183）基序内的天冬氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基单个地突变，从而产生9种所选择的氨基酸取代。诱变之后，质粒被转入解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y4036U1，选择转化体并生长于MMLeu和HGM中，制备了FAME并通过GC进行了分析，如实例11E中所述。

既具有HPGs（SEQ ID NO:427）又具有HxxxH（SEQ ID NO:186）突变的突变Δ5去饱和酶的Δ5去饱和酶活性（3个转化体的平均值）总结在下文的表38中。按照针对HDASH（SEQ ID NO:183）基序内的天冬氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基所发生的氨基酸取代，命名了包含突变pDMW369S构建体的转化体，其中所述突变构建体包含EgD5S-36s的突变（即，转化体pDMW369S-156e包含被命名为EgD5S-36s156e的突变Δ5去饱和酶，并在位置156具有谷氨酸对天冬氨酸的取代，从而产生了HeASH[SEQ ID NO:433]基序；转化体pDMW369S-157g包含被命名为EgD5S-36s157g的突变Δ5去饱和酶，并且具有甘氨酸对丙氨酸的取代，从而产生了HDgSH[SEQ ID NO:429]基序，等等）。按照实例11E中所述的式测量了转化效率。将结果与质粒pDMW369S中的EgD5S-36S（SEQ ID NO:308）的进行了比较，其中GC分析测定了由转化体产生了占总脂质8.1%的DGLA和6.8%的ARA（即，平均转化效率为45.8%）。

结果表明，经密码子优化的EgD5SΔ5去饱和酶能够被修饰，以包含突变HPGG（SEQ ID NO:181）和突变HDASH（SEQ ID NO:183）基序，同时仍保留与仅具有突变HPGG基序（即，HPGs[SEQ ID NO:427]）的突变EgD5S-36s相比适当的Δ5去饱和酶活性。优选的双重突变体是EgD5S-36s156e（SEQ ID NO:328和329；在pDMW369S-156e转化体中能够以36.2%的转化效率使DGLA转化成ARA）、EgD5S-36s157g（SEQ ID NO:109和110；在pDMW369S-157g转化体中能够以36.6%的转化效率使DGLA转化成ARA）、EgD5S-36s158a（SEQ ID NO:330和331；在pDMW369S-158a转化体中能够以39.1%的转化效率使DGLA转化成ARA）和EgD5S-36s158g（SEQ ID NO:332和333；在pDMW369S-158g转化体内能够以34.3%的转化效率使DGLA转化成ARA）。

实例11M：来源于Euglena anabaena并经密码子优化以在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中表达的合成Δ5去饱和酶基因（“EaD5S”）中的HaGG（SEQ ID NO:428）和HxxxH（SEQ ID NO:186）突变的鉴定

本实例在突变EaD5S-35a（或“EaD5S-HaGG”）基因的HDASH（SEQ ID NO:183）基序中引入了突变，以测定HPGG（SEQ ID NO:181）和HDASH（SEQ ID NO:183）保守结构域内双重突变的效应。

美国专利7,943,365描述了来自E.anabaena的Δ5去饱和酶（即，EaD5；SEQ ID NO:335和336）的分离和克隆。然后，针对在解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）中的表达对该基因进行了密码子优化，产生了合成Δ5去饱和酶EaD5S（SEQ ID NO:337和338）。尽管EaD5S的氨基酸序列与EaD5是相同的，但核苷酸序列是不同的；具体地，除了修饰翻译起始位点，还对1362bp编码区中的183bp进行了修饰（13.4%）并优化了174个密码子（38.3%）。GC含量从野生型基因（即，EaD5；SEQ ID NO:335）中的57.6%降低至合成基因（即，EaD5S；SEQ ID NO:337）中的54.6%。分别将NcoI位点和NotI位点整合到EaD5S的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。

美国专利公布2010-0075386-A1的实例6描述了突变EaD5S-35a（SEQID NO:334）的鉴定，其使用EaD5S作为定点诱变反应中的模板，靶向对EaD5S的HPGG（SEQ ID NO:181）基序的脯氨酸残基的修饰，所述基序跨越细胞色素b₅-样结构域的氨基酸残基34至37（即，HxGG[SEQ ID NO:437]突变）。因此，突变EaD5S-35a（SEQ ID NO:334）包含HaGG（SEQID NO:428）基序，其中HPGG（SEQ ID NO:181）基序的脯氨酸残基是以EaD5S（SEQ ID NO:338）作为模板被丙氨酸取代的。EaD5S-35a（美国专利公布2010-0075386-A1）的Δ5去饱和酶活性是EaD5S的Δ5去饱和酶活性的约99.2%。质粒pZuFmEaD5S-A（S）（SEQ ID NO:339）包含突变EaD5S-35a基因；所述载体的组分与pDMW367-5M（本文的图22B；SEQID NO:305）是相同的，不同之处在于突变EaD5S-35a基因取代了EgD5M基因）。

基于在实例11G中双重EgD5R*突变体和实例11L中双重EgD5S突变体（即，同时包含突变HPGG[SEQ ID NO:181]和突变HDASH[SEQ IDNO:183]基序）的成功生成，预期类似的HxxxH（SEQ ID NO:186）突变在被引入EaD5S-35a中时将被耐受。HDASH（SEQ ID NO:183）基序跨越EaD5S和EaD5S-35a的氨基酸残基156-160。

用pZuFmEaD5S-A（S）（包含嵌合的FBAIN::EaD5S-35a::Pex20基因）作为模板，并用9对寡核苷酸（SEQ ID NO:340-361；表39）作为引物，进行了单个氨基酸的突变，以通过定点诱变（QuickChange试剂盒，Stratagene，CA）使EaD5S-35a（SEQ ID NO:334）的HDASH（SEQ IDNO:183）基序内的天冬氨酸、丙氨酸或丝氨酸单个地突变，从而产生9种所选择的氨基酸取代。诱变之后，质粒被转入解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）菌株Y4036U1，选择转化体并生长于MMLeu和HGM中，制备了FAME并通过GC进行了分析，如实例11E中所述。

包含HaGG（SEQ ID NO:428）和HxxxH（SEQ ID NO:186）突变的突变Δ5去饱和酶的Δ5去饱和酶活性（3个转化体的平均值）总结在下文的表39中。按照针对HDASH（SEQ ID NO:183）基序内的天冬氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基所发生的氨基酸取代，命名了包含突变pZuFmEaD5S-A（S）构建体的转化体，其中所述突变构建体包含EaD5S-35a的突变。即，例如，转化体pZuFmEaD5S-A（S）-157e包含被命名为EaD5S-35a157e的突变Δ5去饱和酶，并在位置157具有谷氨酸对天冬氨酸的取代，从而产生了HeASH[SEQ ID NO:433]基序；转化体pZuFmEaD5S-A（S）-158g包含被命名为EaD5S-35a158g的突变Δ5去饱和酶，并且具有甘氨酸对丙氨酸的取代，从而产生了HDgSH（SEQ ID NO:429）基序，等等。按照实例11E中所述的式测量了转化效率。将结果与质粒pZuFmEaD5S-A（S）中的EaD5S-35a（SEQ ID NO:334）的进行了比较，其中GC分析测定了由转化体产生了占总脂质8.6%的DGLA和5.1%的ARA（即，平均转化效率为37.2%）。

结果表明，经密码子优化的EaD5SΔ5去饱和酶能够被修饰，以包含突变HPGG（SEQ ID NO:181）和突变HDASH（SEQ ID NO:183）基序，同时仍保留与仅具有突变HPGG基序（即，HaGG[SEQ ID NO:428]）的突变EaD5S-35a相比适当的Δ5去饱和酶活性。优选的双重突变体是EaD5S-35a158g（SEQ ID NO:111和112；在pZuFmEaD5S-A（S）-158g转化体中能够以28.4%的转化效率使DGLA转化成ARA）、EaD5S-35a158s（SEQID NO:362和363；在pZuFmEaD5S-A（S）-158s转化体中能够以27.4%的转化效率使DGLA转化成ARA）和EaD5S-35a159g（SEQ ID NO:364和365；在pZuFmEaD5S-A（S）-159g转化体中能够以26.5%的转化效率使DGLA转化成ARA）。

Claims

1.重组微生物宿主细胞，所述重组微生物宿主细胞产生油，所述油包含以干细胞重量的重量百分比测量的至少25重量%的二十碳五烯酸。

2.根据权利要求1所述的重组微生物宿主细胞，其中所述油包含以总脂肪酸的重量百分比测量的至少45重量%的二十碳五烯酸。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的重组微生物宿主细胞，其中所述油具有以总脂肪酸的重量百分比测量的二十碳五烯酸对以总脂肪酸的重量百分比测量的亚油酸至少2.4的比率。

4.重组微生物宿主细胞，包含：

5.根据权利要求4所述的重组微生物宿主细胞，还包含至少一种突变Δ9延伸酶多肽，其中所述突变Δ9延伸酶多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3具有至少一个氨基酸突变的差异，所述突变选自：

i)L35F突变；

ii)L35M突变；

iii)L35G突变；

v)L35G、A21V、L108G和I179R突变；

vi)L35G、W132T和I179突变；

vii)L35G、S9D、Y84C和I179R突变；

viii)L35G、Y84C、I179R和Q244N突变；

ix)L35G、A21V、W132T、I179R和Q244N突变；

x)K58R和I257T突变；

xi)D98G突变；

xii)L130M和V243A突变；以及

6.根据权利要求5所述的重组微生物宿主细胞，其中所述至少一种突变Δ9延伸酶多肽包含L35G取代，并且在与SEQ ID NO:3的Δ9延伸酶活性进行比较时，所述突变Δ9延伸酶多肽具有改善的Δ9延伸酶活性。

7.根据权利要求4所述的重组微生物宿主细胞，其中所述复合酶具有选自下列的特性：

(b)基本上由选自下列的序列组成的序列：SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14和SEQ ID NO:16。

8.根据权利要求4所述的重组微生物宿主细胞，其中所述至少两种溶血磷脂酸酰基转移酶选自：

(a)基本上由选自下列的序列组成的序列：SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25；以及

(b)多肽，所述多肽基于Clustal W比对方法，在与选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的氨基酸序列进行比较时具有至少43.9%的氨基酸同一性，并且所述多肽还包含至少一种选自SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶家族基序。

9.根据权利要求4所述的重组微生物宿主细胞，其中所述至少一种磷脂:二酰基甘油酰基转移酶选自：

(a)基本上由选自下列的序列组成的序列：SEQ ID NO:29和SEQID NO:30；以及

10.根据权利要求4所述的重组微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞属于耶氏酵母属（Yarrowia）。

11.根据权利要求4-10中任一项所述的重组微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含至少一种突变Δ5去饱和酶多肽，其中所述突变Δ5去饱和酶多肽选自：

a)突变多肽，所述突变多肽包含：如SEQ ID NO:180[HxGx]所示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO:180[HxGx]与SEQ ID NO:181[HPGG]是不同的；以及如SEQ ID NO:182[HxxxH]所示的氨基酸基序，其中SEQ ID NO:182[HxxxH]与SEQ ID NO:183[HDASH]是不同的；

b)突变多肽，所述突变多肽具有选自下列的氨基酸序列：SEQ IDNO:106[EgD5M或经密码子优化的EgD5R*-34g158g]、SEQ IDNO:108[EgD5R*-34g158g347s]、SEQ ID NO:110[EgD5S-36s157g]、SEQ ID NO:112[EaD5S-35a158g]、SEQ ID NO:299[EgD5R*-34g157g]、SEQ ID NO:301[EgD5R*-34g158a]、SEQID NO:303[EgD5R*-34g158g]、SEQ ID NO:329[EgD5S-36s156e]、SEQ ID NO:331[EgD5S-36s158a]、SEQ ID NO:333[EgD5S-36s158g]、SEQ ID NO:363[EaD5S-35a158s]和SEQ IDNO:365[EaD5S-35a159g]。

12.制备包含二十碳五烯酸的微生物油的方法，包括：

a)培养权利要求1-10中任一项的宿主细胞，其中产生包含二十碳五烯酸的微生物油；以及

b)任选地回收所述步骤（a）的微生物油。

13.根据权利要求12所述的方法，其中进一步加工所述步骤（b）的回收的油。