JP2013535987A - 高レベルのエイコサペンタエン酸生産のための組換え微生物宿主細胞 - Google Patents

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Abstract

乾燥細胞重量の重量％としての測定で、ω−３多価不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］を２５重量％を超えて含んでなる微生物油を産生できる、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の遺伝子操作株が本明細書で開示される。

Description

本出願は、そのそれぞれを参照によってその内容全体を本明細書に援用する、２０１０年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／３７７，２４８号明細書、２０１０年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／４２８，２７７号明細書、および２０１１年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／４７９，９２１号明細書の優先権を主張する。
本発明は生物工学の分野にある。より具体的には、本発明は、ω−３多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］であるエイコサペンタエン酸を高濃度で効率的に産生できる、遺伝子操作組換え微生物宿主細胞に関する。
エイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」；シス−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸；ω−３］の臨床および薬学的価値は、良く知られている（特許文献１）。同様に、天然微生物源からまたは魚油および海洋性プランクトンからの単離を介するＥＰＡ製造とは対照的に、組換え手段を使用して微生物中でＥＰＡを製造する利点もまた、よく認識されている。
文献は、ＥＰＡ生成に関与するω−３／ω−６多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］生合成経路の様々な部分が、植物および非油性酵母に導入される、いくつかの最近の実施例を報告するが、出願人らの譲受人による著しい努力は、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の使用に焦点を合わせている（特許文献２；３；１；４）。油性酵母は、自然に油を合成し蓄積できる酵母と定義され、油の蓄積は細胞乾燥重量の少なくとも２５％であり、またはこれらの酵母は、油の合成と蓄積ができるように遺伝子改変され、油の蓄積は細胞乾燥重量の少なくとも２５％である。
より具体的には、特許文献３は、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、およびＣ１６／１８エロンガーゼ遺伝子の発現による、組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中における、γ−リノレン酸［「ＧＬＡ」；ω−６］の同時合成なしの総脂肪酸［「ＴＦＡ」］の９％のＥＰＡの製造を実証した。
特許文献１は、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、およびジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現によって、組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中で最大でＴＦＡの５５．６％のＥＰＡを産生する、最適化組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を記載する。
特許文献４は、ＴＦＡの５０％までのＥＰＡを含んでなり、ＴＦＡの重量％として測定されたリノール酸に対して、ＴＦＡの重量％として測定されたＥＰＡの比率が少なくとも３．１である、微生物油を産生する、さらなる最適化組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を記載する。特許文献１に詳述されるようなω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を発現することに加えて、これらの改善された株は、以下によって際立っている。
１）少なくとも１つのマルチザイムを含んでなり、前記マルチザイムは、少なくとも１つの脂肪酸Δ８デサチュラーゼに連結した少なくとも１つの脂肪酸Δ９エロンガーゼ［「ＤＧＬＡシンターゼ」］を有するポリペプチドを含んでなる；
２）任意選択的に、マロニルＣｏＡシンセターゼまたはアシルＣｏＡリゾリン脂質アシル基転移酵素［「ＬＰＬＡＴ」］からなる群から選択される酵素をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなる；および
３）その発現が下方制御されている、少なくとも１つのペルオキシソーム形成因子タンパク質を含んでなる。
米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書 米国特許第７，２３８，４８２号明細書 米国特許第７，９３２，０７７号明細書 米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書
上で引用した開示にもかかわらず、リノール酸［「ＬＡ」；ω−６］などの中間体脂肪酸生成や、最終油生成物中の副産物脂肪酸を最小化しながら、高い総脂質含量（すなわち高いＥＰＡ生産性）に加えて、総脂肪酸の重量％として高いＥＰＡ生産を可能にする、ＥＰＡの商業生産のために株の改良が必要である。出願人らは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の改善された最適化株を操作することで既述の問題を解決し、改善は、乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも２５重量％のＥＰＡを含んでなる微生物油の製造を可能にする。
第１の実施形態では、本発明は、乾燥細胞重量の重量％としての測定で、少なくとも２５重量％のエイコサペンタエン酸を含んでなる油を産生する、組換え微生物宿主細胞に関する。
第２の実施形態では、本明細書で開示されるのは、総脂肪酸の重量％としての測定で、少なくとも４５重量％のエイコサペンタエン酸を含んでなる油である。
好ましくは、前出のいずれの油も、総脂肪酸の重量％として測定されたリノール酸に対する、総脂肪酸の重量％として測定されたエイコサペンタエン酸の比率が、少なくとも２．４である。
第３の実施形態では、本明細書で開示されるのは、
（ａ）少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼに連結した少なくとも１つのΔ９エロンガーゼを有するポリペプチドを含んでなる、少なくとも１つのマルチザイム；
（ｂ）その発現が下方制御されている、少なくとも１つのペルオキシソーム形成因子タンパク質；および
（ｃ）少なくともリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素［「ＬＰＡＡＴ」］活性を有する、少なくとも２つのポリペプチド；
（ｄ）少なくともリン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素［「ＰＤＡＴ」］活性を有する、少なくとも１つのポリペプチド
を含んでなる組換え微生物宿主細胞である。
第４の実施形態では、組換え微生物宿主細胞は、少なくとも１つの変異Δ９エロンガーゼポリペプチドをさらに含んでなってもよく、前記変異Δ９エロンガーゼポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでなり、配列番号１は、
ｉ）Ｌ３５Ｆ変異；
ｉｉ）Ｌ３５Ｍ変異；
ｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ変異；
ｉｖ）Ｌ３５Ｇ変異と、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、およびＡ２５４Ｙからなる群から選択される、少なくとも１つのその他の変異；
ｖ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｌ１０８Ｇ、およびＩ１７９Ｒ変異；
ｖｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、およびＩ１７９変異；
ｖｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｓ９Ｄ、Ｙ８４Ｃ、およびＩ１７９Ｒ変異；
ｖｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｙ８４Ｃ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
ｉｘ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｗ１３２Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
ｋ）Ｋ５８ＲおよびＩ２５７Ｔ変異；
ｘｉ）Ｄ９８Ｇ変異；
ｘｉｉ）Ｌ１３０ＭおよびＶ２４３Ａ変異；および
ｘｉｉｉ）Ｋ５８Ｒ、Ｌ３５Ｆ、Ｌ３５Ｇ、Ｌ３５Ｍ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｄ９８Ｇ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｌ１３０Ｍ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｖ２４３Ａ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、Ａ２５４Ｙ、およびＩ２５７Ｔからなる群から選択される、少なくとも２つの変異を含んでなるあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異によって、配列番号３と異なる。
好ましくは、少なくとも１つの変異Δ９エロンガーゼポリペプチドはＬ３５Ｇ置換を含んでなり、変異Δ９エロンガーゼポリペプチドは、配列番号３のΔ９エロンガーゼ活性と比べて改善されたΔ９エロンガーゼ活性を有する。
好ましくは、少なくとも１つのマルチザイムは、
（ａ）配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択されるリンカー；および
（ｂ）配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６からなる群から選択される配列から本質的になるアミノ酸配列
からなる群から選択される特性を有する。
好ましくは少なくとも２つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素の少なくとも１つは、
（ａ）配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２５からなる群から選択される配列から本質的になるアミノ酸配列、および
（ｂ）配列番号１８、配列番号２２、配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法に基づいて少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有し、配列番号２６および配列番号２７からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素ファミリーモチーフをさらに含んでなるポリペプチド
からなる群から選択される。
好ましくは、少なくとも１つのリン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素は、（ａ）配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択される配列から本質的になるアミノ酸配列；および
（ｂ）配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法に基づいて少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択される。
好ましくは、宿主細胞はヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）である。
第５の実施形態では、本発明は、
ａ）エイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油が生成される、本発明のいずれかの宿主細胞を培養するステップと；
ｂ）ステップ（ａ）の微生物油を任意選択的に回収するステップと
を含んでなる、エイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油を製造する方法に関する。
第６の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって生成される油のさらなる処理に関する。
生物学的寄託
以下の生物学的材料が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託され、以下の名称、受入番号、および寄託日を有する。
Figure 2013535987
上に列挙した生物学的材料は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って寄託された。列挙された寄託は、指定の国際寄託機関で少なくとも３０年間維持され、それを開示する特許の付与に際して公的に入手可能となる。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載される手順に従って、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４１２から誘導された。
ω−３およびω−６脂肪酸生合成経路を示し、下記のこの経路の説明を検討する際に合わせ見るべきである。 ω−３およびω−６脂肪酸生合成経路を示し、下記のこの経路の説明を検討する際に合わせ見るべきである。 ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５株（米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書）の発酵過程における、ＥＰＡ％ＴＦＡとＬＡ％ＴＦＡの関係を図示する。 ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来する、様々なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の開発を図で表す。 ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来する、様々なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の開発を図で表す。 （Ａ）ｐＺＫＵＭ；および（Ｂ）ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎのプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＹ１８７；および（Ｂ）ｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎのプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＺＫ１６−ＭｙＬ８Ｎ；および（Ｂ）ｐＺＫ１６−ＭＬ３のプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＺＫＭＰ−ｍＬ９ＤＰ；および（Ｂ）ｐＺＫＭＰ−ｍＬ９ＤＣＢのプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５；および（Ｂ）ｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆのプラスミドマップを提供する。 Ｚ５５６７株に由来する、様々なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の開発を図示する。 ｐＹＰＳ２３４による相同的組換え反応を概略的に図示する。 ｐＹＰＳ２３４のプラスミドマップを提供する。 ｐＹＰＳ２３３による相同的組換え反応を概略的に図示する。 ｐＹＰＳ２３３のプラスミドマップを提供する。 ｐＹＰＳ２４１による相同的組換え反応を概略的に図示する。 ｐＹＰＳ２４１のプラスミドマップを提供する。 （Ａ）ｐＺＲ５ＡＵ−５５５；および（Ｂ）ｐＺＲ５ＡＵ−５５５Ｍのプラスミドマップを提供する。 ｐＺＵＦｍＥｇＤ９ＥＳのプラスミドマップである。 配列比較のＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法を使用した、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）［配列番号１３３］、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）［配列番号１３４］、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）［配列番号１３５］、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）［配列番号１３６］、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）［配列番号１３７］、オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉ）［配列番号１３８］、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）ＣＣＭＰ４５９種［配列番号１３９］、パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ）［配列番号１４０］、オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉ）［配列番号１４１］、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）［配列番号３４］、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）［配列番号３２］、ユートレプチエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）ＣＣＭＰ３８９種［配列番号３８］、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）［配列番号４２］、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）［配列番号１４２］、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）［配列番号１４３］、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）［配列番号１４４］、およびスラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＦＪＮ−１０種［配列番号１４５］からの１７個の脂肪酸エロンガーゼの配列比較である。 図１５Ａの続きである。 図１５Ｂの続きである。 図１５Ｃの続きである。 図１５Ｄの続きである。 図１５Ｅの続きである。 図１５Ｆの続きである。 図１５Ｇの続きである。 ＥｇＤ９ｅＳの膜トポロジーモデルを示す；各垂直円柱が膜貫通断片を示す一方、各水平円柱は内膜小葉の中または近くに位置する疎水性ストレッチを示す。 任意選択的に、Ｌ３５Ｆ変異；Ｌ３５Ｍ変異；Ｌ３５Ｇ変異；Ｌ３５Ｇ変異と、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、およびＡ２５４Ｙからなる群から選択される、少なくとも１つのその他の変異；Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｌ１０８Ｇ、およびＩ１７９Ｒ変異；Ｌ３５Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、およびＩ１７９Ｒ変異；Ｌ３５Ｇ、Ｓ９Ｄ、Ｙ８４Ｃ、およびＩ１７９Ｒ変異；Ｌ３５Ｇ、Ｙ８４Ｃ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｗ１３２Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；Ｋ５８ＲおよびＩ２５７Ｔ変異；Ｄ９８Ｇ変異；Ｌ１３０ＭおよびＶ２４３Ａ変異；およびＫ５８Ｒ、Ｌ３５Ｆ、Ｌ３５Ｇ、Ｌ３５Ｍ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｄ９８Ｇ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｌ１３０Ｍ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｖ２４３Ａ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、Ａ２５４Ｙ、およびＩ２５７Ｔからなる群から選択される、少なくとも２つの変異を含んでなるあらゆる組み合わせを含んでなる、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成変異Δ９エロンガーゼ、すなわち「ＥｇＤ９ｅＳ−変異体コンセンサス」；配列番号１）の描写を示す。 Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用した、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）［「ＩｇＤ９ｅ」］（配列番号４２）、ユートレプチエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）ＣＣＭＰ３８９種［「Ｅ３８９Ｄ９ｅ」］（配列番号３８）、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）［「ＥｇＤ９ｅ」］（配列番号３２）、およびＥ．アナベナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）［「ＥａＤ９ｅ」］（配列番号３４）のΔ９エロンガーゼの配列比較である。 ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ酵素の予測された位相モデルである。 ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）からの野生型Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５；配列番号１８４）と、Ｓ３４７Ｒ変異を含有する変種野生型ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５Ｒ；配列番号１９２）とのＤＮＡ配列比較を示す。 ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）からの野生型Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５；配列番号１８４）と、Ｓ３４７Ｒ変異を含有する変種野生型ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５Ｒ；配列番号１９２）とのＤＮＡ配列比較を示す。 プラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４の構築を図示する。 ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）からの野生型Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５Ｒ；配列番号１９２）の５’部分と、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン最適化Δ５デサチュラーゼ変異遺伝子（すなわちＥｇＤ５Ｍ；配列番号１０５）の最初の２０４ｂｐとの配列アラインメントを示す。 （Ａ）ｐＥｇＤ５Ｍ；および（Ｂ）ｐＤＭＷ３６７−５Ｍのプラスミドマップを提供する。
本発明は、本明細書の一部を構成する、以下の詳細な説明、および添付の配列説明からより完全に理解され得る。
以下の配列は、参照によって本明細書に援用する、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
配列番号１〜４３７は、表１で同定されるプロモーター、遺伝子またはタンパク質（またはその断片）、プライマーまたはプラスミドをコードするＯＲＦである。
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本明細書において引用される、全ての特許、特許出願、および刊行物は、その内容全体を参照によって援用する。
本開示では、いくつかの用語および略称が使用される。標準三文字コードまたは一文字コードを使用して、アミノ酸に言及する。以下の定義が提供される。
「読み取り枠」は、「ＯＲＦ」と略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、「ＰＣＲ」と略記される。
「Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」は、「ＡＴＣＣ」と略記される。
「多価不飽和脂肪酸」は、「ＰＵＦＡ」と略記される。
「トリアシルグリセロール」は、「ＴＡＧ」と略記される。
「補酵素Ａ」は、「ＣｏＡ」と略記される。
「総脂肪酸」は、「ＴＦＡ」と略記される。
「脂肪酸メチルエステル」は、「ＦＡＭＥ」と略記される。
「乾燥細胞重量」は、「ＤＣＷ」と略記される。
「重量％」は、「ｗｔ％」と略記される。
本明細書の用法では、「発明」または「本発明」という用語は、特許請求の範囲および明細書に記載される、本発明の全ての態様および実施形態を指すことが意図され、いかなる特定の実施形態または態様にも限定されないものと解釈される。
「食品」、「医薬品」、「乳児用調製粉乳」、「健康補助食品」、「動物飼料」、および「水産養殖飼料」という用語は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書で定義される通りである。
本明細書の用法では、「バイオマス」という用語は、具体的には、商業的に有意な量でＥＰＡを産生する組換え生産宿主の発酵からの消耗済みまたは使用済み細胞物質を指す。好ましい産生宿主は油性酵母の組換え株、好ましくはヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の、より好ましくはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の組換え株である。バイオマスはホールセル、ホールセル溶解産物、均質化細胞、部分的加水分解細胞物質、および／または部分的精製細胞物質（例えば微生物産生油）の形態であってもよい。
「脂質」という用語は、あらゆる脂溶性（すなわち親油性）天然分子を指す。脂質の概説は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書で提供される（その中の表２を参照されたい）。
「油」という用語は２５℃で液体の脂質物質を指し；油は疎水性であるが、有機溶媒に可溶性である。油性生物では、油が総脂質の大部分を構成する。「油」は主にトリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］からなるが、その他の中性脂質、リン脂質、および遊離脂肪酸もまた含有してよい。油中の脂肪酸組成と総脂質の脂肪酸組成は、一般に類似しており；したがって総脂質中の脂肪酸濃度の増大または減少は、油中の脂肪酸濃度の増大または減少に対応し、逆もまた然りである。
「中性脂肪」とは、脂肪体の細胞中に貯蔵脂肪として一般に見られる脂質を指し、細胞のｐＨでは脂質は荷電基を有さないため、このように称される。一般にそれらは完全に非極性で、水に対する親和性がない。中性脂質とは、一般に脂肪酸によるグリセロールのモノ−、ジ−、および／またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはトリアシルグリセロールと称され、または集合的にアシルグリセロールとも称される。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出するためには、加水分解反応が起きなくてはならない。
「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］という用語は、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸、ならびに鎖長のより短い飽和および不飽和脂肪酸を含有し得る。
「総脂肪酸」［「ＴＦＡ」］という用語は、本明細書では、例えば生物由来資源または油であってもよい特定サンプル中で、（当該技術分野で知られているような）塩基エステル交換法によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化し得る、細胞性脂肪酸の総和を指す。したがって総脂肪酸は、中性脂質画分（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、およびＴＡＧをはじめとする）からの脂肪酸、および極性脂質画分（例えばホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン画分をはじめとする）からの脂肪酸を含むが、遊離脂肪酸は含まない。
細胞の「総脂質含量」という用語は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の％としてのＴＦＡ測定値であるが、総脂質含量は、ＤＣＷの％としてのＦＡＭＥ測定値［「ＦＡＭＥ％ＤＣＷ」］として近似し得る。したがって総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、例えば１００ミリグラムのＤＣＷあたりの総脂肪酸のミリグラムと同等である。
総脂質中の脂肪酸濃度は、本明細書では、例えば１００ミリグラムのＴＦＡあたりの特定の脂肪酸のミリグラムのように、ＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］として表される。本開示中では、特に断りのない限り、総脂質に対する特定脂肪酸のパーセントへの言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に等しい（例えば総脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡに等しい）。
場合によっては、細胞中の特定脂肪酸含量をその乾燥細胞重量の重量％（「％ＤＣＷ」）として表すことが有用である。したがって、例えばＥＰＡ生産性の尺度［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］は、次式に従って判定される。
（ＥＰＡ％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００
しかし乾燥細胞重量の重量％（「％ＤＣＷ」）としての細胞中の特定脂肪酸含量は、以下のように近似し得る。
（ＥＰＡ％ＴＦＡ）＊（ＦＡＭＥ％ＤＣＷ）］／１００
「脂質プロフィール」および「脂質組成」という用語は同義であり、総脂質中または油中などの特定の脂質画分に含有される個々の脂肪酸の量を指し、この量はＴＦＡの重量％として表される。混合物中に存在する個々の脂肪酸の総和は、１００になるべきである。
「抽出油」という用語は、その中で油が合成される微生物などのその他の細胞物質から分離された油を指す。抽出油は多種多様な方法を通じて得られ、最も単純なものは物理的手段のみを伴う。例えば、様々なプレス構造（例えばスクリュー、エキスペラー、ピストン、ビードビーターなど）を使用した機械的破砕が、細胞物質から油を分離し得る。それに代えて、油抽出は様々な有機溶剤（例えばヘキサン）による処理を通じて、酵素的抽出を通じて、浸透圧衝撃を通じて、超音波抽出を通じて、超臨界流体抽出（例えばＣＯ２抽出）を通じて、鹸化を通じて、そしてこれらの方法の組み合わせを通じて行い得る。抽出油は精製され、またはさらに濃縮されてもよい。本明細書に記載される抽出油は、少なくとも４５のＥＰＡ％ＴＦＡを含んでなる。
「混合油」という用語は、所望の組成物を得るために、本明細書に記載される抽出油と、任意の油の組み合わせまたは個々の油とを混合またはブレンドして得られる油を指す。したがって、例えば異なる微生物からの数種類の油を共に混合して、所望のＰＵＦＡ組成物が得られ得る。代案としては、またはそれに加えて、本明細書で開示されるＰＵＦＡ含有油と、魚油、植物油または双方の混合物とをブレンドして、所望の組成物が得られ得る。
「脂肪酸」という用語は、約Ｃ１２〜Ｃ２２の様々な鎖長の長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指すが、鎖長のより長い酸およびより短い酸の双方も知られている。優勢な鎖長は、Ｃ１６〜Ｃ２２の間である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」の簡易表記体系によって表され、式中、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは二重結合数である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、および「ω６脂肪酸」［「ω−６」または「ｎ−６」］対「ω３脂肪酸」［「ω−３」または「ｎ−３」］の間の区別の追加的詳細は、参照によって本明細書に援用する米国特許第７，２３８，４８２号明細書中に提供される。
本明細書でＰＵＦＡを記述するのに使用される命名法を表２に示す。「略記法」と題された欄ではω−基準系を使用して、炭素数、二重結合数、そしてこの目的で１番目であるω炭素から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸とそれらの前駆体の一般名、明細書全体を通じて使用される略称、および各化合物の化学名を要約する。
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「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、およびＤＰＡｎ−６などのω−６脂肪酸に、およびＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどのω−３脂肪酸に変換する代謝過程を指す。この過程は、文献で十分に記載されている。（例えば米国特許第７，９３２，０７７号明細書および米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書を参照されたい。）簡単に述べるとこの過程は、小胞体膜内に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と称される一連の特有な延長酵素および不飽和化酵素による、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長と、二重結合の付加を通じた分子の不飽和化とを伴う。より具体的には「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」とは、ＰＵＦＡの生合成と関連付けられている以下の酵素のいずれか（および前記酵素をコードする遺伝子）を指す。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼおよび／またはＣ２０／２２エロンガーゼ。
「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」という用語は、少なくとも１つのΔ９エロンガーゼと少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼを含んで、それによってＥＤＡおよび／またはＥＴｒＡを中間体脂肪酸として、ＬＡおよびＡＬＡから、それぞれＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡの生合成が可能になるＰＵＦＡ生合成経路を指す。その他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼの発現により、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡもまた合成されてもよい。
「変換効率」および「％基質変換」と言う用語は、例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼまたはマルチザイムなどの特定の酵素が、基質を生成物に変換し得る効率を指す。変換効率は、次式に従って判定される。
（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００
式中、「生成物」は、即時生成物と、経路中のそれから誘導される全ての生成物とを含む。
「デサチュラーゼ」という用語は、不飽和化させ得る、すなわち１つまたは複数の脂肪酸に二重結合を導入して対象の脂肪酸または前駆体を生成し得るポリペプチドを指す。特定脂肪酸に言及するための明細書全体を通じたω基準系の使用にもかかわらず、Δシステムを使用して、基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼ活性を示すことがより都合良い。本明細書において特に興味深いのは、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、およびΔ１２デサチュラーゼである。その他の有用なデサチュラーゼとしては、Δ４デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、およびΔ９デサチュラーゼが挙げられる。
「エロンガーゼ」という用語は、脂肪酸炭素鎖を伸長して、エロンガーゼが作用する脂肪酸基質よりも炭素２個分だけ長い酸を生成し得るポリペプチドを指す。この伸長過程は、米国特許第７，６５９，１２０号明細書に記載されるように、脂肪酸シンターゼと共同して多段階機序で起きる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、ＡＲＡからＤＴＡ、およびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。一般に、エロンガーゼの基質選択性はやや広範であるが、鎖長と、不飽和の程度およびタイプとの双方によって区別される。例えば、Ｃ１４／１６エロンガーゼはＣ１４基質（例えばミリスチン酸）を利用し、Ｃ１６／１８エロンガーゼはＣ１６基質（例えばパルミチン酸）を利用し、Ｃ１８／２０エロンガーゼはＣ１８基質（例えばＧＬＡ、ＳＴＡ）を利用し、Ｃ２０／２２エロンガーゼ［Δ５エロンガーゼまたはＣ２０エロンガーゼとも称される］はＣ２０基質（例えばＡＲＡ、ＥＰＡ）を利用する。本明細書の目的では、２つの異なるタイプのＣ１８／２０エロンガーゼを定義し得る。Δ６エロンガーゼは、それぞれＧＬＡおよびＳＴＡからＤＧＬＡおよびＥＴＡへの変換を触媒するのに対し、Δ９エロ
ンガーゼは、それぞれＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの転換を触媒し得る。
「Ｃ１８からＣ２０への延長変換効率」は、それによってＣ１８／／２０エロンガーゼが、Ｃ１８基質（すなわちＬＡ、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ）をＣ２０生成物（すなわちＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ）に変換し得る効率を指す。これらのＣ１８／／２０エロンガーゼは、Δ９エロンガーゼまたはΔ６エロンガーゼのいずれかであり得る。
「Δ９延長変換効率」という用語は、それによってΔ９エロンガーゼが、Ｃ１８基質（すなわちＬＡ、ＡＬＡ）をＣ２０生成物（すなわちＥＤＡ、ＥＴｒＡ）に変換し得る効率を指す。
「ＥｇＤ９ｅ」という用語は、本明細書で配列番号３１によってコードされる、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されたΔ９エロンガーゼ（配列番号３２）を指す。同様に「ＥｇＤ９ｅＳ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成Δ９エロンガーゼ（すなわち配列番号２および３）を指す。ＥｇＤ９ｅおよびＥｇＤ９ｅＳ、同様にΔ９エロンガーゼモチーフに関するさらなる詳細は、米国特許第７，６４５，６０４号明細書に記載される。
「ＥａＤ９ｅ」という用語は、本明細書において配列番号３３によってコードされる、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）から単離されたΔ９エロンガーゼ（配列番号３４）を指す。同様に「ＥａＤ９ｅＳ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、Ｅ．アナベナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）に由来する合成Δ９デサチュラーゼ（すなわち配列番号３５および３６）を指す。ＥａＤ９ｅおよびＥａＤ９ｅＳに関するさらなる詳細は、米国特許第７，７９４，７０１号明細書に記載される。
「Ｅ３８９Ｄ９ｅ」という用語は、本明細書で配列番号３７によってコードされる、ユートレプチエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）ＣＣＭＰ３８９種から単離されたΔ９エロンガーゼ（配列番号３８）を指す。同様に「Ｅ３８９Ｓ９ｅＳ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ユートレプチエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）ＣＣＭＰ３８９種に由来する合成Δ９デサチュラーゼ（すなわち配列番号３９および４０）を指す。Ｅ３８９Ｄ９ｅおよびＥ３８９Ｄ９ｅＳに関するさらなる詳細は、米国特許第７，６４５，６０４号明細書に記載される。
「ＩｇＤ９ｅ」という用語は、本明細書において配列番号４１によってコードされる、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）から単離されたΔ９エロンガーゼ（配列番号４２；ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＬ３７６２６（ＧＩ １７２２６１２３））を指す。
「変異Δ９エロンガーゼ」または「変異ＥｇＤ９ｅＳ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成Δ９エロンガーゼ（すなわちＥｇＤ９ｅＳ［配列番号２および３］）と比較して、少なくとも１つの変異を有するΔ９エロンガーゼを指す。「変異」としては、あらゆる欠失、挿入、および点変異（またはそれらの組み合わせ）が挙げられるが、好ましい実施形態では、変異ＥｇＤ９ｅＳは配列番号１（図１６Ｂ）で記載され、配列番号１は、ａ）Ｌ３５Ｆ変異；ｂ）Ｌ３５Ｍ変異；ｃ）Ｌ３５Ｇ変異；ｄ）Ｌ３５Ｇ変異と、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、およびＡ２５４Ｙからなる群から選択される、少なくとも１つのその他の変異；ｅ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｌ１０８Ｇ、およびＩ１７９Ｒ変異；ｆ）Ｌ３５Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、およびＩ１７９Ｒ変異；ｇ）Ｌ３５Ｇ、Ｓ９Ｄ、Ｙ８４Ｃ、およびＩ１７９Ｒ変異；ｈ）Ｌ３５Ｇ、Ｙ８４Ｃ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；ｉ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｗ１３２Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；ｊ）Ｋ５８ＲおよびＩ２５７Ｔ変異；ｋ）Ｄ９８Ｇ変異；ｌ）Ｌ１３０ＭおよびＶ２４３Ａ変異；およびｍ）Ｋ５８Ｒ、Ｌ３５Ｆ、Ｌ３５Ｇ、Ｌ３５Ｍ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｄ９８Ｇ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｌ１３０Ｍ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｖ２４３Ａ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、Ａ２５４Ｙ、およびＩ２５７Ｔからなる群から選択される、少なくとも２つの変異を含んでなるあらゆる組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異によって、配列番号３と異なる。列挙された各置換では、最初の文字はＥｇＤ９ｅＳ（配列番号３）中のアミノ酸に対応し、２番目の文字は変異体（配列番号１）中の同じ位置に見られるアミノ酸に対応し、すなわちＬ３５Ｆは、ＥｇＤ９ｅＳ中の位置３５のＬｅｕ［Ｌ］から、ＥｇＤ９ｅＳ変異体中のＰｈｅ［Ｆ］への変化を示す。この命名法は、本明細書に記載されるΔ９エロンガーゼタンパク質内の変異に言及するために明細書全体を通じて使用され；同様の表記法が、ヌクレオチド配列内の置換を記述するのに使用される（すなわちＣ６２Ｔは、ＥｇＤ９ｅＳ（配列番号２）中の位置６２のシトシン［Ｃ］から、ＥｇＤ９ｅＳ変異体中のチミン［Ｔ］への変化を示す）。
異なるポリペプチド配列にもかかわらず、酵素活性を比較すると、変異ＥｇＤ９ｅＳは、ＥｇＤ９ｅＳよりも「改善されたΔ９エロンガーゼ活性」を有する。したがって変異ＥｇＤ９ｅＳ配列は、ＥｇＤ９ｅＳと比べて酵素活性が増大している（すなわちＥｇＤ９ｅＳの酵素活性の少なくとも約１０１〜１１０％、好ましくは少なくとも約１１０〜１２５％、より好ましくは少なくとも約１２５〜１５０％、最も好ましくは約１５０％を超える）。好ましい範囲は上述の通りであるが、有用な変換効率の例としては、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、１３０％、１３１％、１３２％、１３３％、１３４％、１３５％、１３６％、１３７％、１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、１４５％、１４６％、１４７％、１４８％、１４９％、および１５０％などの５０％から少なくとも１５０％のあらゆる整数百分率が挙げられる。
「ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ」という用語は、本明細書で配列番号４３によってコードされるＥｇＤ９ｅＳ（配列番号３）と比較して、単一Ｌ３５Ｇ変異を有する合成変異Δ９エロンガーゼ（配列番号４４）を指す。
「マルチザイム」または「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの独立して分離可能な酵素機能を有する単一ポリペプチドを指し、第１の酵素活性は、好ましくは第２の酵素活性に連結する（米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書）。少なくとも２つの独立して分離可能な酵素機能間の「リンカー」は、単一ポリペプチドからなってもよいが、リンカーはまた、Ｐｒｏなどの１つのアミノ酸残基から、または少なくとも１つのＰｒｏを含んでなるポリペプチドからなってもよい。好ましいリンカーは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択される。
「ＤＧＬＡシンターゼ」という用語はマルチザイムを指し、Δ９エロンガーゼはΔ８デサチュラーゼに連結する。「ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ」という用語は、リンカー配列（すなわち配列番号４［ＧＡＧＰＡＲＰＡＧＬＰＰＡＴＹＹＤＳＬＡＶＭＧＳ］；米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書）による、Δ９エロンガーゼ「ＥｇＤ９ｅＳ」（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）とΔ８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（米国特許第７，７０９，２３９号明細書）との連結によって生成する、ＤＧＬＡシンターゼ（配列番号１１および１２）を指す。同様に、「ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ」という用語は、配列番号４に記載のリンカー配列による、Δ９エロンガーゼ「ＥａＤ９ｅＳ」（米国特許第７，７９４，７０１号明細書）とΔ８デサチュラーゼ「ＥａＤ８Ｓ」（米国特許第７，７９０，１５６号明細書）との連結によって生成する、ＤＧＬＡシンターゼ（配列番号１３および１４）を指す。そして「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ」という用語は、配列番号４に記載のリンカー配列による、Δ９エロンガーゼ「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）とΔ８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）との連結によって生成する、ＤＧＬＡシンターゼ（配列番号１５および１６）を指す。
「アシル基転移酵素」という用語は、供与体脂質から受容体脂質分子へのアシル基の転移に関与する酵素を指す。
「アシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシル基転移酵素」または「リゾリン脂質アシル基転移酵素」［「ＬＰＬＡＴ」］という用語は、ｓｎ−２位で多様なリゾリン脂質基質をアシル化する能力を有する、アシル基転移酵素の広範なクラスを指す。より具体的には、ＬＰＬＡＴとしては、ＬＰＡからホスファチジン酸［「ＰＡ」］への変換を触媒する能力を有するリゾホスファチジン酸［「ＬＰＡ」］アシル基転移酵素［「ＬＰＡＡＴ」］、ＬＰＣからホスファチジルコリン［「ＰＣ」］への変換を触媒する能力を有するリゾホスファチジルコリン［「ＬＰＣ」］アシル基転移酵素［「ＬＰＣＡＴ」］、ＬＰＥからホスファチジルエタノールアミン［「ＰＥ」］への変換を触媒する能力を有するリゾホスファチジルエタノールアミン［「ＬＰＥ」］アシル基転移酵素［「ＬＰＥＡＴ」］、ＬＰＳからホスファチジルセリン［「ＰＳ」］への変換を触媒する能力を有するリゾホスファチジルセリン［「ＬＰＳ」］アシル基転移酵素［「ＬＰＳＡＴ」］、ＬＰＧからホスファチジルグリセロール［「ＰＧ」］への変換を触媒する能力を有するリゾホスファチジルグリセロール［「ＬＰＧ」］アシル基転移酵素［「ＬＰＧＡＴ」］、およびＬＰＩからホスファチジルイノシトール［「ＰＩ」］への変換を触媒する能力を有するリゾホスファチジルイノシトール［「ＬＰＩ」］アシル基転移酵素［「ＬＰＩＡＴ」］が挙げられる。
「少なくともリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素［「ＬＰＡＡＴ」］活性を有するポリペプチド」という用語は、アシルＣｏＡ＋１−アシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸→ＣｏＡ＋１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸（ＥＣ２．３．１．５１）の反応を触媒できる酵素を指す。したがって「ＬＰＡＡＴ」は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２−Ａ１号明細書に記載されるような、１）ＬＰＡＡＴ活性を有し、配列番号１８（ＭａＬＰＡＡＴ１）、配列番号２２（ＹｌＬＰＡＡＴ１）、および配列番号２３（ＳｃＬＰＡＡＴ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法に基づいて少なくとも約４３．９％のアミノ酸同一性を共有する；および／または、２）ＬＰＡＡＴ活性を有して、ＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号２６）およびＥＧＴ
Ｒ（配列番号２７）からなる群から選択される、少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素ファミリーモチーフを有する、タンパク質を指す。ＬＰＡＡＴポリペプチドの例としては、後述するＳｃＬＰＡＡＴ、ＳｃＬＰＡＡＴＳ、ＭａＬＰＡＡＴ１、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ、およびＹｌＬＰＡＡＴ１が挙げられる。
「ＳｃＬＰＡＡＴ」という用語は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されたＬＰＡＡＴ（配列番号２３）を指す（ＯＲＦ「ＹＤＬ０５２Ｃ」）。対照的に、「ＳｃＬＰＡＡＴＳ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する合成ＬＰＡＡＴを指す（すなわち配列番号２４および２５）（米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２−Ａ１号明細書）。
「ＭａＬＰＡＡＴ１」という用語は、配列番号１７に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）から単離されたＬＰＡＡＴ（配列番号１８）を指す。対照的に、「ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）に由来する合成ＬＰＡＡＴを指す（すなわち配列番号１９および２０）（米国特許第７，８７９，５９１号明細書）。
「ＹｌＬＰＡＡＴ１」という用語は、配列番号２１に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離されたＬＰＡＡＴ（配列番号２２）を指す。
「少なくともリン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素［［ＰＤＡＴ］］活性を有するポリペプチド」という用語は、脂肪酸アシル基をリン脂質（例えばホスファチジルコリン）のｓｎ−２位から、１，２−ジアシルグリセロール［Ｅ．Ｃ．２．３．１．１５８］のｓｎ−３位置に転移でき、したがってリゾリン脂質とＴＡＧをもたらす酵素を指す。ＰＤＡＴおよびジアシルグリセロールアシル基転移酵素（ＤＡＧ ＡＴ）［Ｅ．Ｃ．２．３．１．２０］のどちらもＴＡＧ生合成の最終段階に関与するが、ＰＤＡＴのみがアシルＣｏＡ−非依存性機序を介してＴＡＧを合成してもよい。配列番号３０に記載の代表的ＰＤＡＴ酵素は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のＬＲＯ１遺伝子によってコードされる（Ｄａｈｌｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６４８７（２０００））。
「ＹｌＰＤＡＴ」という用語は、配列番号２８に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離されたＰＤＡＴ（配列番号２９）を指す（米国特許第７，９０１，９２８号明細書）。
「コリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ」という用語は、シチジン三リン酸［「ＣＴＰ」］＋コリンリン酸⇔二リン酸＋シチジン二リン酸コリン［「ＣＤＰコリン」］の化学反応を触媒する、ホスファチジルコリン［「ＰＣ」］生合成経路の酵素（ＥＣ２．７．７．１５）を指す。したがってこの酵素は、リン含有ヌクレオチド基を転移できるトランスフェラーゼ（すなわちヌクレオチジルトランスフェラーゼ）であり、したがってグリセロリン脂質代謝に関与する。
「ＹｌＰＣＴ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離され、配列番号４５によってコードされる、コリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ（配列番号４６）を指す。
「ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ」という用語は、ＣＤＰコリンと１，２−ジアシルグリセロールからのホスファチジルコリンの合成を触媒する、ホスファチジルコリン［「ＰＣ」］生合成経路の酵素（ＥＣ２．７．８．２）を指す。
「ＹｌＣＰＴ１」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離され、配列番号４７によってコードされる、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（配列番号４８）を指す。ＹｌＣＰＴ１は、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載される（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５０１７０３（ＹＡＬＩ０Ｃ１０９８９ｇ）もまた参照されたい）。
「マロニルＣｏＡシンセターゼ」［ＥＣ６．２．１．−］は、マロン酸＋ＡＴＰ＋ＣｏＡ→マロニルＣｏＡ＋ＡＭＰ＋ピロリン酸（ＰＰｉ）の酵素反応を触媒する。酵素は、最初にマロン酸培養シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）から精製されたが（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｓ．ａｎｄ Ｓ．Ｋ．Ｂａｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：５０９８−５１０４（１９８５））、それ以来、様々な根粒菌相同体が、マメ科植物根粒内のバクテロイドから単離されている（例えば，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｓ．ａｎｄ Ｈ．Ｚ．Ｃｈａｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７３：５１１−５１６（１９９１）；およびＫｉｍ，Ｙ．Ｓ．ａｎｄ Ｓ．Ｗ．Ｋａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９７：３２７−３３３（１９９４）参照）。
「ＭＣＳ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）次亜種ビシアエ（ｖｉｃｉａｅ）３８４１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＹＰ＿７６６６０３）に由来する、マロニルＣｏＡシンセターゼをコードする合成遺伝子を指す（すなわち配列番号４９および５０）（米国特許出願公開第２０１０−０１５９５５８−Ａ１号明細書）。
「ペルオキシソーム」という用語は、全ての真核生物細胞に見られる遍在性細胞小器官を指す。それらは、細胞質ゾルからそれらの内容物を隔てて、後述する機能に必須の様々な膜タンパク質を含有する、単一脂質二重膜を有する。ペルオキシソームは、「拡張シャトル機構」を介してタンパク質を選択的に移入する。より具体的には、ペルオキシソーム膜を通じたＡＴＰ加水分解の手段によるタンパク質移入過程に関与する、ペルオキシンと称される、少なくとも３２個の既知のペルオキシソームタンパク質がある。細胞タンパク質がペルオキシソームに移入されると、それらは典型的にいくつかの分解手段にさらされる。例えばペルオキシソームは、細胞にとって毒性の物質を分解できる、例えばカタラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、および尿酸オキシダーゼなどの酸化酵素を含有する。代案としては、ペルオキシソームは、脂肪酸分子を分解してアセチルＣｏＡの自由分子を生成し、それはβ酸化と称される過程において、細胞質ゾルに搬出されて戻される。
「ペルオキシソーム形成因子タンパク質」、「ペルオキシン」、および「Ｐｅｘタンパク質」という用語は同義であり、ペルオキシソーム形成に関与し、および／またはペルオキシソーム膜を通じたＡＴＰ加水分解の手段による、細胞タンパク質の移入過程に関与するタンパク質を指す。これらのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子の頭字語は、「Ｐｅｘ遺伝子」である。命名システムは、Ｄｉｓｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３５：１−３（１９９６）に記載される。これまでに様々な真核生物生物中で、少なくとも３２個の異なるＰｅｘ遺伝子が同定されている。１７の異なる真菌種のゲノム配列のコンピュータシミュレーションによる分析を実施した、Ｋｉｅｌ，Ｊ．Ａ．Ｋ．Ｗ．ら（Ｔｒａｆｆｉｃ，７：１２９１−１３０３（２００６））によるレビューに基づいて、以下のＰｅｘタンパク質が同定された。Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂｐ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様、およびＰｅｘ２６ｐ。集合的に、これらのタンパク質は、本明細書で「Ｐｅｘタンパク質」と称され、「Ｐｅｘ遺伝子」によってコードされる。
少なくとも１つのペルオキシソーム形成因子タンパク質中における、またはそれと関連した「下方調節」という用語は、野生型タンパク質の活性と比較した、天然Ｐｅｘタンパク質の活性の低下または完全破壊を指す。下方制御は、典型的に、天然Ｐｅｘ遺伝子が、その遺伝子の一部内における挿入、消去、または標的化変異を指す「破壊」を有して、遺伝子がゲノムから欠失し、いかなるタンパク質も翻訳されないような完全遺伝子ノックアウトがもたらされ、または挿入、欠失、アミノ酸置換またはその他の標的変異を有するＰｅｘタンパク質の翻訳がもたらされる場合に起きる。下方制御されたＰｅｘタンパク質は、下方制御されていないＰｅｘタンパク質と比較して、活性が損なわれ、非機能性であり得る。Ｐｅｘタンパク質の低発現またはその欠如をもたらす下方制御はまた、制御配列、転写および翻訳要素および／または情報伝達経路の操作を介して、またはセンス、アンチセンスまたはＲＮＡｉ技術などの使用によってももたらし得る。
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿った特定位置で保存される、一連のアミノ酸を意味する。その他の位置のアミノ酸が相同タンパク質間で変化し得るのに対し、特定位置で高度に保存されたアミノ酸は、これらのアミノ酸が、タンパク質の構造、安定性、または活性にとって重要であり得ることを示唆する。それらはタンパク質相同体ファミリーの整合配列中のそれらの高度な保存によって同定されるので、それらは新しく判定された配列があるタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判定する識別子または「シグネチャー」として使用し得る。
「微生物宿主細胞」および「微生物宿主生物」という用語は本明細書で同義的に使用され、外来性または異種遺伝子を受け入れることができ、それらの遺伝子を発現できる微生物を指す。「組換え微生物宿主細胞」とは、組換え遺伝子操作されている微生物宿主細胞を指す。
一般に「油性」という用語は、それらのエネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０）。この過程において、油性微生物の細胞油含量は概してＳ字形曲線に従い、脂質濃度は対数後期または初期定常期にそれが最大に達するまで増大し、次に静止後期および死滅期において徐々に低下する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ ａｎｄ Ｗａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９−２５（１９９１））。本出願の目的では、「油性」という用語は、それらの乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の少なくとも約２５％を油として蓄積し得る微生物を指す。
「油性酵母」という用語は、油を産生し得る、すなわち油がそれらのＤＣＷの約２５％を超えて蓄積し得る、酵母に分類される油性微生物を指す。油性酵母の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、これに限定されるものではない。酵母がＤＣＷの約２５％を超えて油を蓄積する能力は、組換え遺伝子操作の試みを通じた、または生物の天然能力を通じたものであってもよい。
「発酵性炭素源」という用語は、微生物が代謝してエネルギーを得る炭素源を意味する。典型的な炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、グリセロール、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、および炭素含有アミンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「単離核酸断片」という用語は、本明細書において同義的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を任意選択的に含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。ヌクレオチド（通常それらの５’一リン酸の形態で見られる）は、次のような一文字名によって言及される。「Ａ」はアデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸またはデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸またはデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」はピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」はＧまたはＴ、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴ、「Ｉ」はイノシン、および「Ｎ」は任意のヌクレオチドである。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価、またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定のいずれかによって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分な、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係性を記述するために使用される。例えばＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする、遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について良く知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
「合成遺伝子」は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適遺伝子発現のために調整される。当業者は、宿主によって好まれるコドンに向けて、コドン使用頻度を偏らせた場合の成功裏の遺伝子発現の可能性を認識する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づき得る。例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用頻度プロフィールが、米国特許第７，１２５，６７２号明細書に提供される。
「遺伝子」とは、特異的タンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード領域の上流および／または下流の調節配列（例えばコード領域の転写開始部位上流の５’非翻訳領域、３’非コード領域）を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、それ自体の制御配列と共に天然に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界では一緒に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが、天然に見られるのとは異なる様式で配列された調節配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を構成し得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するように、そのコドン使用頻度がデザインされている遺伝子である。
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「調節配列」は、コード配列の転写開始部位上流に位置するヌクレオチド配列、５’非翻訳領域および３’非コード領域を指し、それらは関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を及ぼすこともある。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、作動体結合部位、およびステムループ構造が挙げられる。
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般にプロモーター配列は、コード配列の５’上流である。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえよい。当業者は、異なる組織または細胞タイプにおいて、または異なる細胞成長および／または発達段階において、または異なる環境的または生理学的条件に答えて、異なるプロモーターが遺伝子の発現を指示してもよいことを理解する。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子が発現されるようにするプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」、および「ターミネーター」という用語は、コード配列３’下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これは、ポリアデニル化認識配列と、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードするその他の配列とを含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことで特徴付けられる。３’領域は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響し得る。
「作動的に結合する」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、それはコード配列と作動的に連結する。すなわちコード配列は、プロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで制御配列に作動的に結合し得る。
「組み換え」という用語は、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術を通じた核酸の単離セグメントの操作による、２つのさもなければ分離した配列セグメントの人為的組み合わせを指す。
「発現」という用語は、本明細書での用法では、センス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も含む。
「形質転換」は、核酸分子の宿主生物への移入を指す。核酸分子は、自律的に複製するプラスミドであってもよく；またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物または「形質転換体」と称される。
「安定形質転換」は、遺伝的に安定した遺伝形質がもたらされる（すなわち核酸断片が「安定して組み込まれる」）、核および細胞小器官ゲノムの双方を含む宿主生物ゲノムへの核酸断片の移入を指す。対照的に、「一過性形質転換」は、組み込みまたは安定遺伝形質のない遺伝子発現がもたらされる、宿主生物の核、またはＤＮＡ含有細胞小器官への核酸断片の移入を指す。
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの直線または環状であってもよい、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列を有してもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が結合しまたは組み換えされて、細胞に発現カセットを導入できる特有な構造になる。
「発現カセット」という用語は、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子産物の発現に必要である、コード配列に先行する（５’非コード配列）および後続の（３’非コード配列）制御配列とを含んでなる、ＤＮＡ断片を指す。したがって発現カセットは、典型的に、１）プロモーター；２）コード配列（すなわちＯＲＦ）；および３）真核生物中では通常、ポリアデニル化部位を含有するターミネーターから構成される。発現カセットは通常はベクター内に含めて、クローニングおよび形質転換を容易にする。各宿主に対して妥当な制御配列を使用しさえすれば、異なる発現カセットを細菌、酵母、植物、および哺乳類細胞をはじめとする異なる生物に形質転換できる。
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用なあらゆるコンピュータアルゴリズム、またはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販されることもあり、または独立して開発されることもある。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１）ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９０））；３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹが挙げられるが、これに限定されるものではない。本出願の文脈内では、特に断りのない限り、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、分析結果は、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書での用法では「デフォルト値」とは、ソフトウェアを初期化した際に、初めからロードされる値またはパラメーターのあらゆる組を意味する。
核酸またはポリペプチド配列の文脈において「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウ間で最大一致のために整列させると同じになる、２つの配列中の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。したがって「配列同一性百分率」または「％同一性」は、比較ウィンドウ間で最適に整列させた２つの配列を比較して判定される値を指し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２配列の最適配列比較のために、（付加または欠失を含まない）基準配列との比較で、付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでなってもよい。百分率は、双方の配列内で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置数を判定して、一致する位置数を得て、一致する位置数を比較ウィンドウ内の総位置数で除して、結果に１００を乗じて同一性百分率を得て、計算される。
「％同一性」および「％類似性」を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムで体系化されている。「％同一性」および「％類似性」は、１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない公知の方法によって容易に計算され得る。
配列アラインメントおよび％同一性または類似性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をはじめとするが、これに限定されるものではない、相同的な配列を検出するようにデザインされた多様な比較法を使用して判定されてもよい。それに代えて、「配列比較のＢＬＡＳＴＮ法」は、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較する、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ［「ＮＣＢＩ」］によって提供されるアルゴリズムであるのに対し、「ＢＬＡＳＴＰアラインメント法」は、デフォルトパラメーターを使用してタンパク質配列を比較する、ＮＣＢＩによって提供されるアルゴリズムである。
本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）による出版によって、詳しく記載される。
図１Ａおよび図１Ｂは組み合わさって、後述するようなＥＰＡ生成の複数経路を描写する。全ての経路は、オレイン酸がΔ１２デサチュラーによって、第１のω−６脂肪酸であるリノール酸［「ＬＡ」］に最初に変換されることを要する。次に「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」および基質としてＬＡを使用して、長鎖ω−６脂肪酸が次のように形成される。１）ＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサジエン酸［「ＥＤＡ」］に変換され；２）ＥＤＡがΔ８デサチュラーゼによってジホモ−γ−リノレン酸［「ＤＧＬＡ」］に変換され；３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによってアラキドン酸［「ＡＲＡ」］に変換され；４）ＡＲＡがＣ２０／２２エロンガーゼによってドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」］に変換され；５）ＤＴＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」］に変換される。
「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」はまた、基質としてα−リノレン酸［「ＡＬＡ」］を使用して、長鎖ω−３脂肪酸を次のように生成し得る。１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによって第１のω−３脂肪酸ＡＬＡに変換され；２）ＡＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサトリエン酸［「ＥＴｒＡ」］に変換され；３）ＥＴｒＡがΔ８デサチュラーゼによってエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」］に変換され；４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによってエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］に変換され；５）ＥＰＡがＣ２０／２２エロンガーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］に変換され；６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］に変換される。任意選択的に、ω−６脂肪酸がω−３脂肪酸に変換されてもよい。例えばＥＴＡおよびＥＰＡはΔ１７デサチュラーゼ活性によって、それぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから生成される。本明細書の目的で有利には、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路は、顕著な量のγ−リノレン酸［「ＧＬＡ」］を欠く、ＥＰＡ油の生成を可能にする。
ω−３／ω−６脂肪酸生合成の代わりの経路は、Δ６デサチュラーゼおよびＣ１８／２０エロンガーゼを利用し、すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」である。より具体的には、Δ６デサチュラーゼによって、ＬＡおよびＡＬＡがそれぞれＧＬＡおよびステアリドン酸［「ＳＴＡ」］に変換されてもよく、次にＣ１８／２０エロンガーゼが、ＧＬＡをＤＧＬＡにおよび／またはＳＴＡをＥＴＡに変換する。
組換え微生物宿主細胞中における経済的なＥＰＡの商業生産には、ＥＰＡ濃度［「ＥＰＡ％ＴＦＡ」］、総脂質含量［「ＴＦＡｓ％ＤＣＷ」］およびＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］をはじめとする、多様な変数の考察が必要である。さらに所望の脂肪酸、すなわちＥＰＡの生成を最大化するために、中間体脂肪酸と、最終油生成物中の副産物脂肪酸の生成とを低下させることが望ましい。
中間体脂肪酸は、その他の代謝経路酵素の作用によって、ＥＰＡにさらに変換し得る脂肪酸（例えばオレイン酸、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ）である。対照的に、副産物脂肪酸（例えばシアドン酸、ジュニペロン酸）は、ＥＰＡでもなく、またはＥＰＡにさらに変換され得る中間体脂肪酸でもない、生成するあらゆる脂肪酸を指す。
米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書は、約２３．６未満のＬＡ％ＴＦＡ（ＥＰＡ：ＬＡ比１．８３）で少なくとも約４３．３のＥＰＡ％ＴＦＡを含んでなる、微生物油を産生する能力を有する、組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の最適化株を記載する。好ましい株はＹ４３０５であり、その最大生産量は、ＥＰＡ：ＬＡ比３．０３で５５．６のＰＡ％ＴＦＡであった。一般に、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書のＥＰＡ株は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の以下の遺伝子を含んでなる。
ａ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；および
ｂ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；および
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；および
ｄ）Δ１７デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；および
ｅ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；および
ｆ）Ｃ１６／１８エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子；および
ｇ）任意選択的に、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＣＰＴ１）をコードする少なくとも１つの遺伝子。
上述の酵素機能を有する好ましい遺伝子の例は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表３に記載される。これらの遺伝子は限定的であることは意図されず；それよりむしろ米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の遺伝子は、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼおよび／またはＣＰＴ１機能性を有する、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の適切な遺伝子の選択を導くために、有用な参考の役割を果たすものである。
当業者は理解するように、特定の各宿主細胞は、所与のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用において、「コドンバイアス」を呈示する。したがってそのコドン使用頻度が、ＥＰＡ生成のために遺伝子操作される組換え微生物宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように、特定の各Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼおよび／またはＣＰＴ１遺伝子をデザインすることが望ましい。
その他の種から同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者は良く理解している。好ましい核酸断片、すなわちΔ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼおよび／またはＣＰＴ１ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表３に記載されるものと少なくとも約７０〜８０％同一であるポリペプチドをコードする一方、より望ましい核酸断片は、少なくとも約８０〜８５％または少なくとも約８５〜９０％または少なくとも約９０〜９５％にさえ至って同一であるアミノ酸配列をコードする。
米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書は、ＥＰＡ％ＴＦＡおよびＥＰＡ：ＬＡ比に基づいて、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載される株と比較して改善された微生物油を産生する能力を有する、組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の最適化株を記載する。好ましい株はＹ９５０２であり、その最大生産量は５７のＥＰＡ％ＴＦＡであり、ＥＰＡ：ＬＡ比は４．４９で、ＥＰＡ生産性は２１．３のＥＰＡ％ＤＣＷであった。米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に詳述されるω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子の発現に加えて、これらの改善された株は、以下によって際立っている。
１）少なくとも１つのマルチザイムを含んでなり、前記マルチザイムは、少なくとも１つの脂肪酸Δ８デサチュラーゼに連結する少なくとも１つの脂肪酸Δ９エロンガーゼ［「ＤＧＬＡシンターゼ」］を有するポリペプチドを含んでなる；
２）任意選択的に、マロニルＣｏＡシンセターゼ［「ＭＣＳ」］またはアシルＣｏＡリゾリン脂質アシル基転移酵素［「ＬＰＬＡＴ」］からなる群から選択される酵素をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなる；
３）その発現が下方制御されている、少なくとも１つのペルオキシソーム形成因子タンパク質を含んでなる；
４）少なくとも約５０のＥＰＡ％ＴＦＡを産生する；および
５）少なくとも約３．１のＥＰＡ：ＬＡ比を有する。
マルチザイムリンカーは、好ましくは配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択され；マルチザイムは、好ましくはＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ（配列番号１２）、ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ（配列番号１４）、およびＥ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ（配列番号１６）からなる群から選択される配列から本質的になる配列である。その発現が下方制御されている少なくとも１つのペルオキシソーム形成因子タンパク質は、好ましくはＰｅｘ１ｐ（配列番号５１）、Ｐｅｘ２ｐ（配列番号５２）、Ｐｅｘ３ｐ（配列番号５３）、Ｐｅｘ３Ｂｐ（配列番号５４）、Ｐｅｘ４ｐ（配列番号５５）、Ｐｅｘ５ｐ（配列番号５６）、Ｐｅｘ６ｐ（配列番号５７）、Ｐｅｘ７ｐ（配列番号５８）、Ｐｅｘ８ｐ（配列番号５９）、Ｐｅｘ１０ｐ（配列番号６０）、Ｐｅｘ１２ｐ（配列番号６１）、Ｐｅｘ１３ｐ（配列番号６２）、Ｐｅｘ１４ｐ（配列番号６３）、Ｐｅｘ１６ｐ（配列番号６４）、Ｐｅｘ１７ｐ（配列番号６５）、Ｐｅｘ１９ｐ（配列番号６６）、Ｐｅｘ２０ｐ（配列番号６７）、Ｐｅｘ２２ｐ（配列番号６８）、およびＰｅｘ２６ｐ（配列番号６９）からなる群から選択され、Ｐｅｘ３ｐノックアウトが特に好ましい。
上の配列は、組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主細胞で使用するのに好ましいが、これらの遺伝子が限定的であることは意図されない。組換え微生物宿主細胞内で発現される特定のデサチュラーゼおよびエロンガーゼに関して先に考察したように、所与のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用における「コドンバイアス」を考慮しなくてはならない。したがってＤＧＬＡシンターゼマルチザイムのデザインと好ましいＰｅｘ遺伝子ノックアウトに関する、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載される教示を、ＥＰＡ生成のために遺伝子操作されるあらゆる組換え微生物宿主細胞に応用してもよい。好ましい核酸断片、すなわちＤＧＬＡシンターゼおよび／またはＰｅｘポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが、上に記載されるものと少なくとも約７０〜８０％同一であるポリペプチドをコードする一方、より望ましい核酸断片は、少なくとも約８０〜８５％または少なくとも約８５〜９０％または少なくとも約９０〜９５％にさえ至って同一であるアミノ酸配列をコードする。
本明細書で提供されるのは、ＥＰＡ生産性の増大（すなわちＥＰＡ％ＤＣＷの増大として測定される）に基づいて、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載される株と比較して、改善された微生物油を産生する能力を有する、さらに改善された最適化組換え微生物宿主細胞である。本明細書で開示される改善された組換え微生物宿主細胞は、（米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されるように、少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼに連結した少なくとも１つのΔ９エロンガーゼを有するポリペプチドを含んでなる）少なくとも１つのマルチザイムを含んでなり、（米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載されるように）その発現が下方制御されている少なくとも１つのペルオキシソーム形成因子タンパク質を含んでなる、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を発現することの他に、以下によって際立っている。
１）少なくともリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素［「ＬＰＡＡＴ」］活性を有する、少なくとも２つのポリペプチドを含んでなる；
２）少なくともリン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素［「ＰＤＡＴ」］活性を有する、少なくとも１つのポリペプチドを含んでなる；
３）任意選択的に、少なくとも１つの変異Δ９エロンガーゼポリペプチドを含んでなり、前記変異Δ９エロンガーゼポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでなり、前記配列番号１は、
ｉ）Ｌ３５Ｆ変異；
ｉｉ）Ｌ３５Ｍ変異；
ｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ変異；
ｉｖ）Ｌ３５Ｇ変異と、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、およびＡ２５４Ｙからなる群から選択される少なくとも１つのその他の変異；
ｖ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｌ１０８Ｇ、およびＩ１７９Ｒ変異；
ｖｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、およびＩ１７９変異；
ｖｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｓ９Ｄ、Ｙ８４Ｃ、およびＩ１７９Ｒ変異；
ｖｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｙ８４Ｃ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
ｉｘ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｗ１３２Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
ｘ）Ｋ５８ＲおよびＩ２５７Ｔ変異；
ｘｉ）Ｄ９８Ｇ変異；
ｘｉｉ）Ｌ１３０ＭおよびＶ２４３Ａ変異；および
ｘｉｉｉ）Ｋ５８Ｒ、Ｌ３５Ｆ、Ｌ３５Ｇ、Ｌ３５Ｍ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｄ９８Ｇ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｌ１３０Ｍ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｖ２４３Ａ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、Ａ２５４Ｙ、およびＩ２５７Ｔからなる群から選択される、少なくとも２つの変異を含んでなるあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異によって配列番号３と異なる；および
４）ＤＣＷの重量％としての測定で、少なくとも２５重量％のＥＰＡを含んでなる微生物油を産生する。
上述のように、本明細書で開示される改善された組換え微生物宿主細胞は、株が、少なくともＬＰＡＡＴ活性を有する少なくとも２つのポリペプチドと、少なくともＰＤＡＴ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドとを有することで特有であり；したがって新生グリセロリン脂質生合成経路の構成要素の上方制御が所望される。
生体膜の主要構成要素であるグリセロリン脂質は、ｓｎ−１位とｓｎ−２位においてＲ基として付着し、極性頭部基がリン酸ジエステル結合を介してｓｎ−３位置で連結する脂肪酸があるグリセロールコアを含有する（米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２−Ａ１号明細書を参照されたい）。グリセロリン脂質は、変わりやすいホスホリル頭部基に起因するだけでなく、またそれらの脂肪酸の異なる鎖長と飽和度の結果としてのおびただしい多様性を有する。一般に、飽和および一不飽和脂肪酸がｓｎ−１位でエステル化されるのに対し、ＰＵＦＡはｓｎ−２位でエステル化される。
グリセロリン脂質の生合成は、複雑である。下の表３は、最初にＫｅｎｎｅｄｙ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２２：１９３−２１４（１９５６））によって記載された、新生経路の段階を要約する。
Figure 2013535987
それらの新規合成に続いて、グリセロリン脂質は、ｓｎ−２位における脂肪酸アシル組成物の迅速な交代を被り得る。この「再構築」または「アシル編集」は、膜の構造および機能、ストレス状態への生物学的応答、および生物工学的応用における脂肪酸組成と量の操作にとって重要である。具体的には、再構築は、グリセロリン脂質の脱アシル化と、得られたリゾリン脂質の引き続く再アシル化（すなわち細胞アシルＣｏＡプールからアシルＣｏＡ脂肪酸が除去され、リン脂質プール中で様々なリゾリン脂質基質がｓｎ−２位でアシル化される）に帰するとされている。
脂肪酸生合成は、アシルＣｏＡプールとリン脂質プール間のアシル基の迅速な交換を要する（すなわち不飽和化が主にリン脂質のｓｎ−２位で起きるのに対し、延長はアシルＣｏＡプール中で起きる）ため、多様な研究が、アシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシル基転移酵素［「ＬＰＬＡＴ」］をＰＵＦＡ生合成遺伝子と共に同時発現させて、遺伝子導入生物の油中の所望の脂肪酸量を増大させ、全含油量を増大させ、または所望の脂肪酸を選択的に増大させることの有益な効果について検討している（国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレット、国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレット、国際公開第２００６／０６９９３６号パンフレット、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット、国際公開第２００９／００１３１５号パンフレット、国際公開第２００９／０１４１４０号パンフレットを参照されたい）。しかし米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２−Ａ１号明細書で開示される研究が、ＥＰＡの高レベル生産のために遺伝子操作された油性生物中における、ＬＰＡＡＴおよびＬＰＣＡＴの効果を調べるために行われた最初の研究であった。
より具体的には、米国特許出願公開第２０１０−０３１７８８２−Ａ１号明細書の実施例３、４、７、および８は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して、総脂質に対して約５１％ＥＰＡを産生するように遺伝子操作されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の組換え株Ｙ８４０６中における、ＳｃＬＰＡＡＴ１Ｓ、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ、およびＹｌＬＰＡＡＴ１の過剰発現効果を比較する（下の表４に記載される）。
Figure 2013535987
ＭａＬＰＡＡＴ１とＹｌＬＰＡＡＴ１が３４．０％の配列同一性を共有したのに対し、ＳｃＬＰＡＡＴとＹｌＬＰＡＡＴ１は４３．９％の配列同一性を共有し；Ｌｅｗｉｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８：５７６４−５７７１（１９９９））と、Ｙａｍａｓｈｉｔａら（Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７７１：１２０２−１２１５（２００７））によって記載されるように、３つの野生型タンパク質は全て、ＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号２６）およびＥＧＴＲ（配列番号２７）に記載の１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素ファミリーモチーフを有した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における、ＳｃＬＰＡＡＴ１Ｓ、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ、およびＹｌＬＰＡＡＴ１の過剰発現は、（ａ）染色体への組み込みによって、ＭａＬＰＡＡＴ１ＳまたはＹｌＬＰＡＡＴ１のいずれかを保有する直線化ＤＮＡを形質転換して安定した組み込みをもたらし、形質転換体を比較的富栄養の非選択培地で培養した後；または（ｂ）自己複製配列とＹｌＬＰＡＡＴまたはＳｃＬＰＡＡＴ１Ｓのどちらかを保有する環状プラスミドＤＮＡを形質転換し、形質転換体を選択培地上で培養した後に分析された［すなわち表４で「染色体への組み込み」または「プラスミド発現」のどちらかとして標識される］。ＬＰＡＡＴの過剰発現が、染色体への組み込みではなく、プラスミド発現を介して起きた場合、結果は最小化され、現象（ｐｈｅｎｏｍｅｎｕｍ）は、恐らく染色体への組み込みの「位置効果」および／または異なる増殖条件に起因し；さもなければプラスミドの喪失もまた、観察された結果に寄与し得る。しかしいずれにしても、表４の結果は、これらの各パラメータを対照と比較すると、ＬＰＡＡＴ過剰発現が、ＴＦＡの重量％としてのＬＡ（１８：２）濃度［「ＬＡ％ＴＦＡ」］の有意な低下、ＴＦＡの重量％としてのＥＰＡ濃度［「ＥＰＡ％ＴＦＡ」］の増大、およびΔ９エロンガーゼの変換効率増大をもたらしたことを実証する。
上で要約した結果に基づいて、改善されたＥＰＡ％ＤＣＷを産生する能力を有する、組換え微生物宿主細胞の改善された最適化株は、したがって
（ａ）配列番号１８（ＭａＬＰＡＡＴ１）、配列番号２０（ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ）、配列番号２２（ＹｌＬＰＡＡＴ１）、配列番号２３（ＳｃＬＰＡＡＴ１）、および配列番号２５（ＳｃＬＰＡＡＴ１Ｓ）からなる群から選択される配列から本質的になる配列；および（ｂ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法に基づいて、配列番号１８（ＭａＬＰＡＡＴ１）、配列番号２２（ＹｌＬＰＡＡＴ１）、および配列番号２３（ＳｃＬＰＡＡＴ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有し、配列番号２６および配列番号２７からなる群から選択される、少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素ファミリーモチーフをさらに含んでなる、ポリペプチド
からなる群から選択される、少なくとも２つのＬＰＡＡＴを含んでなる。
明確さのために、少なくとも２つのＬＰＡＡＴは、以下のどちらかであり得る。１）単一種から単離された特定のＬＰＡＡＴの同一コード配列の２つのコピー；または２）集合的に２つのＬＰＡＡＴがもたらされる、「Ａ」種から単離されたＬＰＡＡＴの１つのコード配列と、「Ｂ」種から単離されたＬＰＡＡＴの１つのコード配列。
本発明の最適化組換え微生物宿主細胞はまた、ＰＤＡＴ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含んでなる。Ｄａｈｌｑｖｉｓｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９７：６４８７−６４９２（２０００））およびＯｅｌｋｅｒｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：１５６０９−１５６１２（２０００））は、（レシチン：コレステロールアシル基転移酵素タンパク質ファミリーと構造的に関連する）アシルＣｏＡ−非依存性ＰＤＡＴ酵素によって、アシルＣｏＡ不在下でＴＡＧ合成を行い得ることを最初に認識した。より具体的には、ＤａｈｌｑｖｉｓｔらおよびＯｅｌｋｅｒｓらは、ＰＤＡＴをコードする、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＲＯ１遺伝子（配列番号３０；「ＳｃＰＤＡＴ」）の過剰発現が、ＴＡＧ含有量の増大をもたらす一方、ＳｃＰＤＡＴの欠失はＴＡＧ合成の有意な低下を引き起こすことを実証した。この研究に続いて、米国特許第７，２６７，９７６号明細書は、ＳｃＰＤＡＴと４７．１％のアミノ酸配列同一性を共有すると判定された、ＰＤＡＴ（すなわち本明細書の配列番号２８および２９）をコードするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２遺伝子のクローニング、過剰発現、およびノックアウトについて記載した。中断されたＰＤＡＴを有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、野性型株（約２９〜３８％）と比較してより低い含油量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を有することが判明した一方、ＰＤＡＴ２およびＤＧＡＴ２の中断の双方を有する株は、対照と比べてわずか１７〜２７％の含油量を有すると判定された。次にＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴが、その天然ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２遺伝子に中断を有するＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株中で発現され；ＴＦＡ％ＤＣＷは対照と比較して形質転換株中で倍増した。
上の考察に基づいて、当業者は、総脂質含量の変更においてＰＤＡＴの果たす役割を理解するであろう。したがって本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞は、
（ａ）配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択される配列から本質的になる配列、および
（ｂ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法に基づいて、配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも約９０％のアミノ酸同一性、またはより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１つのＰＤＡＴを含んでなる。
以前の研究は、リン脂質とアシルＣｏＡプール間のアシル基の転移不良のために、Δ９延長（Δ６延長も同様に）が長鎖ＰＵＦＡ生合成における支障であることを示しているため、最近、商業的に有用な組換え微生物宿主細胞中のＰＵＦＡ生合成経路への組み込みに適した、高活性を有するΔ９エロンガーゼ変異体を同定するために、Ｅ．Ｉ．ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙによってかなりの努力がなされている。２０１０年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／３７７２４８号明細書［代理人整理番号ＣＬ４７８３ＵＳＰＲＶ、その内容全体を参照によって援用する］に記載され、本明細書において実施例１０Ａ−１０Ｊとして記載されるように、変異ＥｇＤ９ｅＳポリペプチド（すなわちＥｇＤ９ｅＳ［配列番号３］に由来する）中で特異的変異が同定され、それは配列番号３の酵素活性と比べると、ＬＡからＥＤＡへの変換に基づく酵素活性に最高４５％の改善をもたらした。
より具体的には、Δ９エロンガーゼからの結晶構造が欠如しており、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ９エロンガーゼ［「ＩｇＤ９ｅ」；配列番号４１および４２］の変種ヒスチジンボックス［「Ｈｉｓ−ｂｏｘ」］モチーフ中のＧｌｎ残基の重要性に関する一研究のみ（Ｑｉ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５４７：１３７−１３９（２００３））があることを踏まえて、Δ９エロンガーゼ内で適切な変異を同定する合理的な（ｒａｔｉｏｎａｌｅ）標的化アプローチは、理想的ではなかった。Δ９エロンガーゼ活性により同定された最初のＰＵＦＡ−特異的エロンガーゼであるＩｇＤ９ｅは、Δ６エロンガーゼ中に存在する高度に保存されたＨｉｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ［「ＨｘｘＨＨ」；配列番号７２］モチーフの代わりに、Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ［「ＱｘｘＨＨ」；配列番号７１］モチーフを有することが分かった。Ｑｉ，Ｂ．らは、ＧｌｎのＨｉｓ、ＡｌａまたはＰｈｅ残基による置換が、分析された各変異ＩｇＤ９ｅポリペプチド中のΔ９エロンガーゼ活性の低下をもたらしたことを実証し、したがって「ヒスチジンボックス中のグルタミン残基は、最適な酵素触媒作用に必須なように見える」と結論した。
Ｑｉらの研究に加えて、ＩｇＤ９ｅ（配列番号４２）、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ［「ＥｇＤ９ｅ」；配列番号３２；米国特許第７，６４５，６０４号明細書］、およびユートレプチエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）ＣＣＭＰ３８９種Δ９エロンガーゼ［「Ｅ３８９Ｄ９ｅ」；配列番号３８；米国特許第７，６４５，６０４号明細書］の間で、７つのモチーフが保存されていることが知られている。これらのモチーフは、米国特許第７，６４５，６０４号明細書に記載され、Ｙ−Ｎ−Ｘ−（ＬまたはＦ）−Ｘ４−Ｓ−Ｘ２−Ｓ−Ｆ（配列番号７３）；Ｆ−Ｙ−Ｘ−Ｓ−Ｋ−Ｘ２−（ＥまたはＤ）−Ｙ−Ｘ−Ｄ−（ＴまたはＳ）−Ｘ２−Ｌ（配列番号７４）；Ｌ−（ＱまたはＨ）−Ｘ−Ｆ−Ｈ−Ｈ−Ｘ−Ｇ−Ａ（配列番号７５）；Ｍ−Ｙ−Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｘ７−（ＫまたはＲまたはＮ）−Ｆ（配列番号７６）；Ｋ−Ｘ−Ｌ−（ＩまたはＬまたはＭ）−Ｔ−Ｘ２−Ｑ（配列番号７７）；Ｗ−Ｘ−Ｆ−Ｎ−Ｙ−Ｘ−Ｙ（配列番号７８）；およびＹ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｖ−Ｘ２−Ｌ−Ｆ（配列番号７９）が挙げられ、式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得て、下線付きアミノ酸はΔ９エロンガーゼに特有であってもよい。
したがってΔ９エロンガーゼをコードする変異配列のライブラリーは、ＥｇＤ９ｅＳ（配列番号２）をテンプレートとして使用して、誤りがちなＰＣＲ［「ｅＰＣＲ」］によって合成的に遺伝子操作され、ＥｇＤ９ｅＳは、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるプラスミドコンストラクト内に含有された。次にｅＰＣＲライブラリーをヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に形質転換し、ＧＣ分析およびＥＤＡ生成に基づいて、改善されたΔ９エロンガーゼ活性についてスクリーニングした。
完全に非機能的な変異Δ９エロンガーゼ（すなわち検出可能なΔ９エロンガーゼ活性を有さない）、または野生型酵素ＥｇＤ９ｅＳと比較して実質的に低下したΔ９エロンガーゼ活性を有する変異Δ９エロンガーゼをもたらす、多数のクローンが同定された。しかし驚くことに、ＬＡからＥＤＡへの変換効率［（［ＥＤＡ］／［ＬＡ＋ＥＤＡ］）＊１００として計算される］の改善をもたらす、様々な変異が同定された。具体的には、４つの異なる変異Δ９エロンガーゼ遺伝子を含んでなる（すなわちＥｇＤ９ｅＳ［配列番号３］のタンパク質配列と比較して、それぞれＫ５８Ｒ／Ｉ２５７Ｔ変異、Ｌ３５Ｆ変異、Ｄ９８Ｇ変異、およびＬ１３０Ｍ／Ｖ２４３Ａ変異を含んでなる）、５つの個々の形質転換体が同定され、Δ９エロンガーゼ変換活性は野性型ＥｇＤ９ｅＳ（表５、後述）の１０５％〜１１７％の範囲であり、５〜１７％の改善に相当した。したがってこの研究は、ＥｇＤ９ｅＳのΔ９エロンガーゼ活性が、タンパク質工学によって実際に改善され得ることを実証した。
次に、上のＥｇＤ９ｅＳ ｅＰＣＲライブラリーから得られる最初のデータを利用して、部位飽和ライブラリー作成の標的とするのに適する、ＥｇＤ９ｅＳ内の２つの異なるアミノ酸残基（すなわち残基３５および１０７）を合理的に同定した。この場合もやはり、得られた変異ＥｇＤ９ｅＳのΔ９エロンガーゼ活性に対する各変異の効果をスクリーニングし、このようにしてＬＡからＥＤＡへの変換効率の改善をもたらす２つの追加的な変異を同定できるようにした。具体的には、変異Δ９エロンガーゼ内にＬ３５Ｇ変異またはＬ３５Ｍ／Ｑ１０７Ｅ変異のいずれかを含んでなる形質転換株が同定され、Δ９エロンガーゼ変換活性は、野生型ＥｇＤ９ｅＳ（表５、後述）の１４２％〜１４５％または１３２％のいずれかであり、３２〜４５％の改善に相当した。
Ｌ３５Ｇ変異の同定に続いて、ＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）技術および標的としてＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ遺伝子を使用して、５０個の異なるアミノ酸残基を標的にする引き続くライブラリーを作成した。それぞれＬ３５Ｇ変異と組み合わさった２５個の異なる変異が同定され、親エロンガーゼ、すなわちＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ（表５、後述）と比べて、９６％〜１４１％のΔ９エロンガーゼ変換活性をもたらし−４％〜４１％の改善に相当した。
最後に、最近の研究は、ＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）ライブラリー内で同定された複数の有益な変異を組み合わせ（または「スタック」し）、それによって合成コドン最適化ＥｇＤ９ｅＳ配列内の適切な個々のアミノ酸変異を「スタック」することを試みている。このようにして、例えば配列番号３と比較して、Ａ２１Ｖ、Ｌ３５Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異を含んでなる変異Δ９エロンガーゼは、ＥｇＤ９ｅＳ（表５、後述）と比較して、１２３％のΔ９エロンガーゼ変換活性をもたらすことが実証されており、２３％の改善に相当する。
Figure 2013535987
したがって上に詳述した研究の結果として、本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞は、少なくとも１つの変異Δ９エロンガーゼポリペプチドを含んでなってもよく、前記
変異Δ９エロンガーゼポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでなり、図１６Ｂに表されるように、配列番号１は、
ｉ）Ｌ３５Ｆ変異；
ｉｉ）Ｌ３５Ｍ変異；
ｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ変異；
ｉｖ）Ｌ３５Ｇ変異と、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、およびＡ２５４Ｙからなる群から選択される少なくとも１つのその他の変異；
ｖ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｌ１０８Ｇ、およびＩ１７９Ｒ変異；
ｖｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、およびＩ１７９変異；
ｖｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｓ９Ｄ、Ｙ８４Ｃ、およびＩ１７９Ｒ変異；
ｖｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｙ８４Ｃ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
ｉｘ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｗ１３２Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
ｘ）Ｋ５８ＲおよびＩ２５７Ｔ変異；
ｘｉ）Ｄ９８Ｇ変異；
ｘｉｉ）Ｌ１３０ＭおよびＶ２４３Ａ変異；および
ｘｉｉｉ）Ｋ５８Ｒ、Ｌ３５Ｆ、Ｌ３５Ｇ、Ｌ３５Ｍ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｄ９８Ｇ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｌ１３０Ｍ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｖ２４３Ａ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、Ａ２５４Ｙ、およびＩ２５７Ｔからなる群から選択される、少なくとも２つの変異を含んでなるあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異によって、配列番号３と異なる。
好ましい実施形態では、変異ＥｇＤ９ｅＳは、配列番号３と比較して、少なくとも１つのＬ３５Ｇ変異を含んでなる。例えば、配列番号３と比較して単一Ｌ３５Ｇ変異を有する、配列番号４４に記載の「ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ」として本明細書に記載される変異Δ９エロンガーゼポリペプチドのΔ９エロンガーゼ活性は、ＥｇＤ９ｅＳのΔ９エロンガーゼ活性と比較して１４２〜１４５％であり、４２〜４５％の改善に相当した。
上述されるような少なくとも２つのＬＰＡＡＴ、少なくとも１つのＰＤＡＴと（任意選択的に）少なくとも１つの変異Δ９エロンガーゼ、ならびにＥＰＡ生合成のためのΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼω−３／ω−６脂肪酸生合成経路（すなわち少なくとも１つのΔ９エロンガーゼ、少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼ、少なくとも１つのΔ５デサチュラーゼ、少なくとも１つのΔ１７デサチュラーゼ、少なくとも１つのΔ１２デサチュラーゼ、および少なくとも１つのＣ１６／１８エロンガーゼを含んでなり、少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼに連結した少なくとも１つのΔ９エロンガーゼを含んでなる少なくとも１つのマルチザイムが存在する）をコードする遺伝子を発現するのに加えて、少なくとも２５のＥＰＡ％ＤＣＷを産生する発明の組換え宿主細胞は、様々なその他の異種遺伝子を任意選択的に発現してもよい。これらとしては、以下に詳述するように、例えばコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ［「ＰＣＴ」］、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ［「ＣＰＴ１」］、マロニルＣｏＡシンセターゼ［「ＭＣＳ」］、および／またはΔ９デサチュラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
ホスファチジルコリン［「ＰＣ」］生合成経路は、３つのステップを含んでなる。
（ｉ）コリンキナーゼ［ＥＣ２．７．１．３２］によって触媒される、ＡＴＰ＋コリン→ＡＤＰ＋Ｏ−ホスホコリン；
（ｉｉ）コリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ［「ＰＣＴ」；ＥＣ２．７．７．１５］によって触媒される、シチジン三リン酸［「ＣＴＰ」］＋コリンリン酸←→二リン酸＋シチジン二リン酸−コリン［「ＣＤＰ−コリン」］；および
（ｉｉｉ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ［「ＣＰＴ１」；ＥＣ２．７．８．２］によって触媒される、ＣＤＰ−コリン＋１，２−ジアシルグリセロール←→シチジン−５’−一リン酸［「ＣＭＰ」］＋ホスファチジルコリン。
米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書は、ＣＰＴ１をコードする、少なくとも１つの遺伝子の任意の同時発現を記載する。上記明細書では、ＰＣＴをコードする少なくとも１つの遺伝子の任意の同時発現が提案される。これらの酵素のいずれかまたは双方の発現はＰＣ生合成経路を上方制御し、それによってＰＣの生合成増大がもたらされる。ＰＵＦＡはＰＣ（およびその他のグリセロリン脂質）のｓｎ−２位でエステル化される。したがってこれらの酵素の発現増大は、組換え微生物宿主細胞中にＰＵＦＡが貯蔵されてもよい、追加的な機序を提供してもよい（すなわちＰＵＦＡの一次貯蔵はＴＡＧの形態であるが）。ＰＣの生成増大はまた、１）ＰＣのｓｎ−２位から脂肪酸を遊離するホスホリパーゼＡ２などのホスホリパーゼ；および２）ｓｎ−２位でＬＰＣを再アシル化するＬＰＣＡＴなどのＬＰＬＡＴの協奏的作用を通じて、引き続く細胞内の「再構築」または「アシル編集」を促進してもよい。これは細胞アシルＣｏＡプールからのアシルＣｏＡ脂肪酸の除去と、リン脂質プール中におけるｓｎ−２位での様々なリゾリン脂質基質のアシル化を容易にする。
上に記載した特定の理論に拘束されることなく、本開示に従って遺伝子操作された組換え宿主細胞内における、ＰＣＴおよび／またはＣＰＴ１のいずれかの過剰発現が望ましいことがある。ＰＣＴおよび／またはＣＰＴ１をコードする遺伝子は、宿主細胞に天然または異種であってもよい。例えばヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の最適化株中では、配列番号４５に記載のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＰＣＴ遺伝子（配列番号４６のタンパク質をコードする）および／または配列番号４７に記載のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＣＰＴ１遺伝子（配列番号４８のタンパク質をコードする）、または配列番号４６および／または配列番号４８と配列および機能に実質的に類似性を有する関連酵素を発現することが好ましい。
米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書は、ＥＰＡ生合成のために遺伝子操作された組換え宿主細胞中でマロニルＣｏＡシンセターゼ［「ＭＣＳ」］をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドの任意の同時発現を記載する。以前の研究は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のＰＵＦＡの遺伝子工学生産に関わる遺伝子変異の多くが、微生物発酵中にさらに利用され得ない有機酸「副産物」の蓄積増大をもたらすと判定した（マロン酸が全有機酸蓄積の約４５％を構成する）。特に米国特許出願公開第２０１０−０１５９５５８−Ａ１号明細書は、ＥＰＡを産生するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）組換え株中における異種ＭＣＳ［ＥＣ６．２．１．−］の発現を記載し、それは以下の酵素反応を触媒する。マロン酸＋ＡＴＰ＋ＣｏＡ→マロニルＣｏＡ＋ＡＭＰ＋ピロリン酸（ＰＰｉ）。副産物（すなわちマロン酸）をマロニルＣｏＡに変換することで、この基質は、生物内における脂肪酸合成中に使用可能になった。したがって約９４％（ｇ／ｇ ＤＣＷ）のマロン酸副産物生成の低下に加えて、異種ＭＣＳの発現もまた、生物内における炭素およびエネルギーの浪費を回避するのを助け、発酵プロセス中の最適ｐＨ範囲の維持に必要な塩基の量を低下させ、発酵廃液内の中和が必要な副産物有機酸の量を低下させる。好ましいＭＣＳは、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）次亜種ビシアエ（ｖｉｃｉａｅ）３８４１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＹＰ＿７６６６０３）から誘導され、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された（すなわち配列番号４９および５０）。
ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の最適化株中で、または本開示に従って遺伝子操作されたその他の組換え宿主細胞中で、前出の配列番号４９および５０に記載のＭＣＳ、または配列番号５０と配列および機能に実質的に類似性を有する関連酵素を発現することが、望ましいことがある。
本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞中で任意選択的に発現されてもよい別の遺伝子は、Δ９デサチュラーゼである。当業者には明らかであるように、この特定酵素の過剰発現は、ステアリン酸［１８：０］からオレイン酸［１８：１］への変換を増大させ、それによってＰＵＦＡ生合成経路中への炭素のより大きな「プッシング（ｐｕｓｈｉｎｇ）」がもたらされる。
本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞は、少なくとも１つの変異Δ５デサチュラーゼをさらに含んでなってもよい。Δ６、Δ８、およびΔ４デサチュラーゼと並んで、Δ５デサチュラーゼは長鎖ＰＵＦＡ「フロントエンド」デサチュラーゼとして知られている（メチル依存性不飽和化とは対照的に、既存の二重結合と脂肪酸のアシル基のカルボキシル末端との間で不飽和化が起きる）。これらのデサチュラーゼは、３個のヒスチジンボックス［Ｈ（Ｘ）３−４Ｈ（配列番号１８６および１８７）、Ｈ（Ｘ）２−３ＨＨ（配列番号１８８および１８９）、およびＨ／Ｑ（Ｘ）２−３ＨＨ（配列番号１９０および１９１）］によって特徴付けられ、電子供与体として機能するそれらのＮ末端に融合チトクロームｂ５ドメインを有することから、チトクロームｂ５融合スーパーファミリーのメンバーである。残るチトクロームｂ５ドメイン配列の多様性にもかかわらず、チトクロームｂ５ドメインは、保存されたヘム結合モチーフ（すなわちＨＰＧＧ配列［配列番号１８１］）もまた含有する。酵素活性に対するＨＤＡＳＨモチーフの重要性は未だ解明されていないが、Δ５デサチュラーゼの特性として以前同定された追加的な保存されたシグネチャーモチーフもまた、ヒスチジンに富むようである（すなわちＨＤＡＳＨ配列［配列番号１８３］）。
本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異Δ５デサチュラーゼは、
ａ）配列番号１８０［ＨｘＧｘ］に記載のアミノ酸モチーフと、配列番号１８２［ＨｘｘｘＨ］に記載のアミノ酸モチーフとを含んでなり、配列番号１８０［ＨｘＧｘ］が配列番号１８１［ＨＰＧＧ］と同一でなく、配列番号１８２［ＨｘｘｘＨ］が配列番号１８３［ＨＤＡＳＨ］と同一でない、変異ポリペプチド；
ｂ）配列番号１０６［ＥｇＤ５Ｍまたはコドン最適化ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号１０８［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓ］、配列番号１１０［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ］、配列番号１１２［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ］、配列番号２９９［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５７ｇ］、配列番号３０１［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ａ］、配列番号３０３［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号３２９［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５６ｅ］、配列番号３３１［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ａ］、配列番号３３３［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号３６３［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｓ］、配列番号３６５［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５９ｇ］からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチド
からなる群から選択されてもよい。
本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞は、少なくとも約２５のＥＰＡ％ＤＣＷ、好ましくは少なくとも約２５〜３０のＥＰＡ％ＤＣＷ、より好ましくは少なくとも約３０〜３２．５のＥＰＡ％ＤＣＷ、より好ましくは少なくとも約３２．５〜３５のＥＰＡ％ＤＣＷ、および最も好ましくは少なくとも約３５〜４０のＥＰＡ％ＤＣＷを含んでなる、微生物油を産生できる。発酵当業者は、発酵作業それ自体、培地条件、工程パラメータ、スケールアップなど、ならびに培養物が試料採取される特定の時点次第で、特定組換え微生物宿主細胞の油プロファイルに変動性が現れることを理解するであろう。したがって指定された遺伝子型を有する、特定の組換え微生物宿主は、最適条件下で培養した際に、少なくとも約２５のＥＰＡ％ＤＣＷを含んでなる微生物油を産生できることもあるが、少なくとも約２５のＥＰＡ％ＤＣＷを含んでなる微生物油を必ずしも常に産生しない（例えば発酵時間が不十分な場合など）。したがって本考察は、適切な条件下で培養した際に、少なくとも約２５のＥＰＡ％ＤＣＷを産生する生物の「能力」に言及する。
当業者には明らかであるように、本明細書に記載される手順を使用して、少なくとも約２５のＥＰＡ％ＤＣＷを産生できる、多数の異なる最適化組換え株を遺伝子操作し得る。総脂肪酸の百分率としてのＥＰＡ濃度［「ＥＰＡ％ＴＦＡ」］および総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］の双方の要素が、乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡの細胞内含有量［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］に影響を及ぼすので、商業目的のために好ましい株の選択では双方を検討する。すなわちＥＰＡ％ＤＣＷは、次のように計算される。
（ＥＰＡ％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００
例えば、４０のＥＰＡ％ＴＦＡを産生して６２．５のＴＦＡ％ＤＣＷを有する株、４５のＥＰＡ％ＴＦＡを産生して５５．５５のＴＦＡ％ＤＣＷを有する株、５０のＥＰＡ％ＴＦＡを産生して５０のＴＦＡ％ＤＣＷを有する株、５５のＥＰＡ％ＴＦＡを産生して４５．４５のＴＦＡ％ＤＣＷを有する株、６０のＥＰＡ％ＴＦＡを産生して４１．６７のＴＦＡ％ＤＣＷを有する株、および６５のＥＰＡ％ＴＦＡを産生して３８．４６のＴＦＡ％ＤＣＷを有する株は全て、２５のＥＰＡ％ＤＣＷを産生する。
好ましい実施形態では、改善された組換え微生物宿主細胞は、少なくとも２５のＥＰＡ％ＤＣＷを含んでなる油を産生でき、少なくとも４５のＥＰＡ％ＴＦＡを産生する。より好ましくは、油は、少なくとも約４７〜５０のＥＰＡ％ＴＦＡ、好ましくは少なくとも約５０〜５５のＥＰＡ％ＴＦＡ、より好ましくは少なくとも約５５〜６０のＥＰＡ％ＴＦＡ、より好ましくは少なくとも６０〜７０のＥＰＡ％ＴＦＡ、および最も好ましくは少なくとも約７０〜８０のＥＰＡ％ＴＦＡを含んでなる。
別の実施形態では、改善された組換え微生物宿主細胞は、少なくとも２５のＥＰＡ％ＤＣＷを含んでなる油を産生でき、改善された組換え微生物宿主細胞内の脂質プロフィール、またはそれからの抽出油または未濃縮油内の脂質プロフィールは、少なくとも約２．４のＥＰＡ％ＴＦＡ対ＬＡ％ＴＦＡ比を有する。米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書で先に考察されたように、中間体脂肪酸ＬＡの濃度を最小化する（ＥＰＡ：ＬＡの比率増大をもたらす）ことで、ＰＵＦＡ生合成経路を通過する炭素のより大きな「プッシング（ｐｕｓｈｉｎｇ）」がもたらされ、ＥＰＡの合成増大が可能になる。好ましい実施形態では、ＥＰＡ：ＬＡの比率は、少なくとも約２．４〜２．７５、より好ましくは少なくとも約２．７５〜３．２５、より好ましくは少なくとも約３．２５〜４、そして最も好ましくは少なくとも約４〜５．５である。
様々な細菌、酵母、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、真菌、およびそれらの混合物をはじめとする多様な微生物宿主細胞が、微生物油を自然に産生する。そしてＥＰＡは、利用される特定微生物［例えば従属栄養珪藻キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）種およびニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）種（米国特許第５，２４４，９２１）号明細書；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アルテロモナス属（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）またはシュワーネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）種（米国特許第５，２４６，８４１号明細書）；ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）（米国特許第５，２４６，８４２号明細書）の糸状菌；またはモルティエラ・エロンガータ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）、Ｍ．エクシグア（Ｍ．ｅｘｉｇｕａ）、またはＭ．ハイグロフィラ（Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）（米国特許第５，４０１，６４６号明細書）］の天然能力に基づく多数の異なる方法によって、微生物を利用して製造し得る。天然でＥＰＡを産生する微生物について述べる役立つレビューは、Ｚ．Ｗｅｎ ａｎｄ Ｆ．Ｃｈｅｎ，Ｉｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｏｉｌｓ；Ｃ．Ｒａｔｌｅｄｇｅ ａｎｄ Ｚ．Ｃｏｈｅｎ，Ｅｄｓ．；ＡＯＣＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００５；Ｃｈａｐｔｅｒ １０の「Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ＥＰＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」と題されたレビューである。
本明細書の目的では、組換え微生物宿主細胞は、遺伝子工学ツールによって遺伝的に操作し得て、少なくとも２５のＥＰＡ％ＤＣＷを含んでなる微生物油を産生できる細胞でなくてはならない。
例えばΔ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、およびＣ１８／２０エロンガーゼの特定の組み合わせなどの適切なＰＵＦＡ生合成経路遺伝子を導入することで、ＥＰＡを産生する天然能力を欠く微生物を遺伝子操作して、ＰＵＦＡ生合成経路を発現させ得るが、導入される特定酵素（およびこれらの酵素をコードする遺伝子）は、本発明をどのようにも限定するものではないと認識される。例えば公共および特許文献は、（低濃度の生産ではあるが）ＥＰＡ生合成のために大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｏｒｉｋａｓａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０：６２５−６３０（２００４））、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｔａｖａｒｅｓ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＥＭ，７７（５）１８５４−１８６１（２０１１）を遺伝子操作する手段を教示する。
好ましい実施形態では、微生物宿主細胞は油性であり、それらはＤＣＷの約２５％超を油として蓄積する。油性微生物宿主細胞は、例えばモルティエラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、スラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、および油性酵母からなる群から選択される属のメンバーであってもよい。油性酵母は油を合成して蓄積することができ、全油含量は、ＤＣＷの約２５％を超えて、より好適にはＤＣＷの約３０％を超えて、最も好適にはＤＣＷの約４０％を超えて構成し得る。代わりの実施態様では、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの非油性酵母が、ＤＣＷの２５％を上回る油を産生し得るように、それを遺伝子操作して油性にし得る（国際公開第２００６／１０２３４２号パンフレット）。
典型的に油性酵母として同定される属としては、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例証的な油合成酵母としては、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プリケリーマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に分類された）が挙げられる。
最も好ましいのは、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり；さらなる実施形態では、最も好ましいのはＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ Ｓ．，ａｎｄ Ａｇｇｅｌｉｓ Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３−９（２００２））。
前述の属のいずれかが、少なくとも２５のＥＰＡ％ＤＣＷを含んでなる微生物油を産生できる宿主細胞を生成する、本明細書の開示に従った組換え遺伝子操作に適することもある。したがって遺伝子操作は、適切なＰＵＦＡ生合成経路の導入または上方制御に限定されないことは明らかであり；それよりむしろ宿主生物を遺伝的にさらに操作して、蓄積する総脂質を変更し、グリセロリン脂質生合成（ｂｉｏｓｙｔｈｅｓｉｓ）を変更し、細胞を通過する炭素流動を変更し、（直接または間接的）ＰＵＦＡ分解をもたらす経路を変更するなどしてもよい。
ＥＰＡの構造形態は限定的でなく；したがって例えば、ＥＰＡは総脂質中に、ＦＦＡまたはエステル化形態で存在してもよいことが留意される。好適には、少なくとも１つのＰＵＦＡはＴＡＧの形態である。
本明細書の開示に従って、ＥＰＡ生産のために多数の組換え微生物宿主細胞を遺伝子操作し得るが、本発明はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で実証されている。しかし当業者は、本発明の手順が、その中で本発明が実証されている、種または属の使用に限定されないことを理解するであろう。それよりむしろ、少なくとも２５のＥＰＡ％ＤＣＷを含んでなる微生物油を産生できる、あらゆる油性酵母またはあらゆるその他の適切な微生物が、本手順で使用するのに等しく適する。
外来性遺伝子の高レベル発現を誘導する制御配列を含有する、微生物発現系および発現ベクターは、当業者に良く知られている。これらのいずれかを使用して、好ましいデサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＤＧＬＡシンターゼ、ＬＰＡＡＴ、ＰＤＡＴ、ＰＣＴ、ＣＰＴ１、およびＭＣＳタンパク質をコードするキメラ遺伝子を構築し得る。標準形質転換法を使用して、これらのキメラ遺伝子を微生物宿主細胞に導入し、コードされた酵素の高レベル発現を提供し得る。
微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクター（例えばコンストラクト、プラスミド）およびＤＮＡ発現カセットは、当該技術分野で周知である。コンストラクト中に存在する配列の特定の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質、および形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する提案される手段に左右される。しかし典型的に、ベクターは、少なくとも１つの発現カセット、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体への組み込みを可能にする配列を含有する。適切な発現カセットは、典型的に、プロモーター、選択された遺伝子のコード配列、およびターミネーターを含んでなる。双方の制御領域が、形質転換宿主細胞からの遺伝子に由来することが最も望ましい。
２つ以上の遺伝子が別個の自己複製ベクターから発現される場合、各ベクターが異なる選択手段を有することが望ましく、その他のコンストラクトとの相同性を欠いて、安定発現を維持し、コンストラクト間の要素の再集合を妨げるべきである。調節領域の賢明な選択、選択手段、および導入コンストラクトの増殖法は、導入遺伝子が所望の生成物の合成を提供するのに必要なレベルで発現されるように、実験的に判定し得る。
対象遺伝子を含んでなるコンストラクトまたはベクターは、あらゆる標準技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７（１９９１）］などの）形質転換、微粒子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、または関心のある遺伝子を宿主細胞に導入するその他の任意の方法が挙げられる。一例として、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２−２３５（１９９７））は、直線化ＤＮＡ断片に基づくヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のための組み込み技術を記載する。
便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」または「形質転換体」または「組み換え」と本明細書で称する。形質転換宿主は、発現カセットがゲノムに組み込まれるのか、または複数のコピー数を有する染色体外要素上に存在するのかに応じて、発現カセットの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。形質転換宿主細胞は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書、および米国特許第７，２５９，２５５号明細書に記載されるような様々な選択技術によって同定し得る。
本明細書で使用される好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する耐性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンが欠如している培地上で増殖する能力である。代わりの実施態様では、酵母Ｕｒａ−変異体を選択するために５−フルオロオロト酸（５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物；「５−ＦＯＡ」）が使用され（米国特許出願第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書）、または形質転換体を選択するためにスルホニル尿素除草剤耐性を与える天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（またはアセト乳酸シンターゼ；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）が利用される（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）。部位特異的リコンビナーゼシステムの使用によって、複数の逐次形質転換で使用するために好ましい選択マーカーのペアを「再利用する」特有の方法もまた、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書で教示される。
当業者には周知のように、（例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＤＧＬＡシンターゼ、ＬＰＡＡＴ、ＰＤＡＴ、ＰＣＴ、ＣＰＴ１、ＭＣＳ）遺伝子を単にクローニングベクターに挿入するだけでは、所望の速度、濃度、量などでのその発現は保証されない。転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性、およびタンパク質位置、酸素制限、および宿主細胞からの分泌の側面を制御する、いくつかの異なる遺伝要素を操作することが望ましいことがある。より具体的には、遺伝子発現は、以下を変更することで制御してもよい。関連するプロモーターおよびターミネーター配列の性質；クローン遺伝子のコピー数；遺伝子がプラスミド由来であるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか；合成外来性タンパク質の最終的細胞内所在；宿主生物中における翻訳効率；宿主細胞内のクローン遺伝子タンパク質の固有の安定性；およびその使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようなクローン遺伝子中のコドン使用頻度。これらの過剰発現法のいくつかは下で考察され、例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＤＧＬＡシンターゼ、ＬＰＡＡＴ、ＰＤＡＴ、ＰＣＴ、ＣＰＴ１、およびＭＣＳをコードする遺伝子の過剰発現手段としての組換え微生物宿主細胞の遺伝子操作において有用である。
発現増大を引き起こすより強力な（調節または構成いずれかの）プロモーターの使用を通じて、ｍＲＮＡまたはコードされたタンパク質のいずれかから不安定配列を除去／消去し、またはｍＲＮＡに安定化配列を付加する（米国特許第４，９１０，１４１号明細書）ことによって、所望の遺伝子の発現を転写レベルで増大し得る。
微生物宿主細胞中における異種遺伝子発現を駆動する有用なプロモーターは多数あり、当業者に知られている。発現は、誘導性または構成的様式で達成され得る。誘導性発現が、関心のある遺伝子と作動可能に結合する調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成され得る一方、構成的発現は、関心のある遺伝子と作動可能に結合する構成的プロモーターの使用によって達成され得る。宿主種からの転写および翻訳領域が特に有用ではあるが、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＤＧＬＡシンターゼ、ＬＰＡＡＴ、ＰＤＡＴ、ＰＣＴ、ＣＰＴ１、およびＭＣＳ遺伝子の発現を誘導できる実質的にあらゆるプロモーター（すなわち天然、合成、またはキメラ）が適切である。
一般に、ターミネーターは、それからプロモーターが得られる遺伝子の３’領域、または異なる遺伝子に由来し得る。多数のターミネーターが知られており、それらが由来したのと同じおよび異なる属および種のどちらで使用した場合も、多様な宿主中で満足に機能する。ターミネーターは、通常いかなる特性のためでもなく、便宜上選択される。好ましくは、ターミネーターは酵母遺伝子から誘導される。当業者は、入手できる情報を利用してターミネーターをデザインおよび合成し得るので、ターミネーターはまた合成もされ得る。ターミネーターは不要なこともあるが、高度に好ましい。
限定することは意図されないが、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の組換え微生物宿主細胞で使用するための好ましいプロモーターおよびターミネーターは、それぞれの開示を参照によって本明細書に援用する、米国特許公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書、米国特許公開第２０１０−００６８７８９−Ａ１号明細書、米国特許公開第２０１１−００５９４９６−Ａ１号明細書、米国仮特許出第６１／４６９，９３３号明細書（代理人整理番号ＣＬ４７３６ＵＳＰＲＶ、２０１１年３月３１日出願）、米国仮特許出第６１／４７０，５３９号明細書（代理人整理番号ＣＬ５３８０ＵＳＰＲＶ、２０１１年４月１日出願）、米国仮特許出第６１／４７１，７３６号明細書（代理人整理番号ＣＬ５３８１ＵＳＰＲＶ、２０１１年４月５日出願）、および米国仮特許出第６１／４７２，７４２号明細書（代理人整理番号ＣＬ５３８２ＵＳＰＲＶ、２０１１年４月７日出願）で教示されるものである。
ＰＵＦＡ生合成経路デサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＤＧＬＡシンターゼ、ＬＰＡＡＴ、ＰＤＡＴ、ＰＣＴ、ＣＰＴ１、およびＭＣＳ遺伝子の追加的なコピー（すなわち２つ以上のコピー）を組換え微生物宿主細胞に導入し、それによってＥＰＡの生産と蓄積を増大させてもよい。具体的には、遺伝子の追加的なコピーを単一発現コンストラクト内でクローンしてもよく、および／またはプラスミドコピー数を増大させることで、またはゲノム（後述）へのクローン遺伝子の複数組み込みによって、クローン遺伝子の追加的なコピーを宿主細胞に導入してもよい。
本明細書の手順に従って最適化組換え微生物宿主細胞を作成する際は、様々なデサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＤＧＬＡシンターゼ、ＬＰＡＡＴ、ＰＤＡＴ、ＰＣＴ、ＣＰＴ１、およびＭＣＳのコピーについてしばしば言及されることに、留意することが重要である。例えばΔ９エロンガーゼの２つのコピーが必要である場合、これは以下を指し得る。１）単一種から単離された特定のΔ９エロンガーゼの同一コード配列の２つのコピー；または２）集合的に２つのΔ９エロンガーゼがもたらされる、「Ａ」種から単離されたΔ９エロンガーゼの１つのコード配列と、「Ｂ」種から単離されたΔ９エロンガーゼの１つのコード配列。
一般に、組換え宿主細胞中における発現に適する（例えばプロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターを含んでなるキメラ遺伝子を含んでなる）ＤＮＡカセットが得られると、それは宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れられ、または宿主細胞のゲノムに直接組み込まれる。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内で無作為に生じ得て、または宿主遺伝子座との組換えを標的とするのに十分な、宿主ゲノムとの相同領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的化し得る。本明細書では依存しないが、転写および翻訳調節領域の全部または一部は内在性遺伝子座によって提供され得て、コンストラクトは内在性遺伝子座を標的とする。
遺伝子改変組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主細胞に関しては、この微生物宿主中で遺伝子を発現する好ましい方法は、宿主ゲノムへの線状ＤＮＡ断片の組み込みによる。ゲノム内の複数位置への組み込みは、遺伝子の高レベルの発現が所望される場合に、特に有用である。好ましい遺伝子座としては、米国特許公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書で教示されるものが挙げられる。
さらにＪｕｒｅｔｚｅｋら（Ｙｅａｓｔ，１８：９７ー１１３（２００１））は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中に組み込まれたＤＮＡ断片の安定性が、使用される個々の形質転換体、受容者株、および標的プラットフォームに左右されることを指摘する。したがって当業者は、所望の発現レベルとパターンを示す株を得るために、特定の組換え微生物宿主の複数の形質転換体をスクリーニングしなくてはならないことを認識する。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１−２）：１３３−１４５（１９９３））、タンパク質発現のウェスタン分析、ＰＵＦＡ生成物の表現型分析またはＧＣ分析によって達成されてもよい。
本開示の形質転換組換え微生物宿主細胞は、（例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＤＧＬＡシンターゼ、ＬＰＡＡＴ、ＰＤＡＴ、ＰＣＴ、ＣＰＴ１、およびＭＣＳをコードする）キメラ遺伝子の発現を最適化し、ＥＰＡの最大かつ最も経済的な収率を生じる条件下で、培養される。一般に、炭素源のタイプと量、窒素源のタイプと量、炭素対窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス生産段階の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時期と方法を変更することで、培地条件を最適化してもよい。例えばヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、酵母抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地［「ＹＰＤ」］などの複合培地中で、または生育に必要な構成要素が欠如していることで所望の発現カセットの選択を強要する合成最少培地（例えば酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））上で一般に培養される。
本明細書に記載される方法および宿主細胞のための発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許出願公開第２０１１−００５９２０４−Ａ１号明細書で開示されるような、適切な炭素源を含有しなくてはならない。本明細書の方法で利用される炭素源は多種多様な炭素含有源を包含してもよいことが考察されるが、好ましい炭素源は糖（例えばグルコース、転化糖、果糖、およびそれらの組み合わせ）、グリセロールおよび／または脂肪酸（例えば１０〜２２個の炭素を含有するもの）である。
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸）原料から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、組換え微生物宿主の増殖と、ＥＰＡ産生酵素経路の促進とに適することが当業者に知られている、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、およびその他の構成要素を含有しなくてはならない。Ｆｅ＋２、Ｃｕ＋２、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、およびＭｇ＋２などの脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオンが注目されている（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ
Ｏｉｌｓ，Ｄ．Ｊ．Ｋｙｌｅ ａｎｄ Ｒ．Ｃｏｌｉｎ，ｅｄｓ．ｐｐ６１−９７（１９９２））。
本明細書に記載される方法および宿主細胞に好ましい増殖培地は、酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）などの一般的な商業的に調製された培地である。その他の規定培地または合成増殖培地もまた使用してよく、例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の増殖に適した培地は、微生物学または発酵化学当業者に知られている。発酵のための適切なｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、初期成長条件範囲としてはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で実行されてもよく、微好気条件が好ましい。
典型的に、代謝状態は、増殖と脂肪合成／貯蔵の間で「平衡状態」でなくてはならないので、油性酵母細胞中の高レベルのＰＵＦＡ蓄積は、二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのＥＰＡ生成のために、二段階発酵過程が必要である。このアプローチは米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載され、様々な適切な発酵過程デザイン（すなわちバッチ、流加、および連続）および増殖中の配慮についても同様である。
米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の実施例１０もまた、組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５株の２Ｌ発酵に必要なパラメータの詳細な説明を提供する（１６２時間にわたるその最大生産量は、１２．１のＥＰＡ％ＤＣＷであった［すなわち５５．６のＥＰＡ％ＴＦＡであり、ＥＰＡ％ＴＦＡ対ＬＡ％ＴＦＡ比は３．０３であった］）。本開示は、凍結培養物から接種菌液を調整して種培養を作成し、最初に高い細胞密度への迅速な増殖を促進する条件下で酵母を培養し、次に酵母を培養して（窒素を欠乏させ、グルコースを連続的に供給することで）脂質およびＰＵＦＡ蓄積を促進させる手段の記述を含む。標準操作条件によって、温度（３０〜３２℃に制御）、ｐＨ（５〜７に制御）、溶存酸素濃度、およびグルコース濃度をはじめとするプロセス変量をモニターして制御し、一貫した工程性能および最終ＰＵＦＡ油の品質を確保した。
特に米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の実施例１０のデータを利用して、本明細書の図２で示され下の表６で要約されるように、発酵の間にＥＰＡ％ＴＦＡおよびＬＡ％ＴＦＡがどのように変動するかを実証するグラフを作成し得る。
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特に約４０〜１２５時間の発酵中にＥＰＡ％ＴＦＡが増大し、約４０〜１２５時間の発酵中にＬＡ％ＴＦＡが低下し、ＥＰＡ：ＬＡ比が増大したことに留意すべきである。この分析から、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５株が１２．１のＥＰＡ％ＤＣＷを産生できた一方で、組換え微生物宿主細胞の油プロファイルは、発酵作業それ自体、培地条件、工程パラメータ、スケールアップなど、ならびに培養物が試料採取される特定の時点に依存することが明らかである。したがって遺伝子操作株は、多様な異なる脂質含量および組成（すなわちＥＰＡ％ＴＦＡ、ＬＡ％ＴＦＡ、およびＥＰＡ：ＬＡ比に基づく）を有する微生物油を産生できた。
本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞培養する際には、これらの要素を考慮して遺伝子改変宿主細胞の潜在能力を最大限に実現し、あらゆる特定の発酵作業において少なくとも２５のＥＰＡ％ＤＣＷを達成しなくてはならない。
本明細書のいくつかの態様では、一次産物は組換え微生物バイオマスである。したがって微生物バイオマスからのＥＰＡ含有油の単離および精製は、必要ないこともある（すなわちホールセルバイオマスが生成物である）。しかし特定の最終用途および／または最終産物形態が、微生物バイオマスからのＥＰＡ含有油の部分的および／または完全単離／精製を要することもあり、部分的精製微生物バイオマス、精製油、および／または精製ＥＰＡがもたらされる。これらの態様についてさらに詳しくは、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書を参照されたい。
精製および／または純化ＥＰＡを含有する油を水素化し、それによって様々な融解特性とテクスチャがある脂肪をもたらし得る。スプレッド、製菓用脂肪、ハードバター、マーガリン、ベーキング用ショートニングなどをはじめとする多数の加工脂肪は、室温における様々な程度の固体性を要し、原料油の物理特性変更を通じてのみ製造し得る。これは、通常、接触水素化を通じて達成される（追加的詳細および参考文献については、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい）。
ＥＰＡを含んでなる油性酵母バイオマスを含んでなる、食品、乳児用調製粉乳、機機能性食品、メディカルフード、医療栄養物、健康補助食品、医薬組成物、動物飼料、およびパーソナルケア製品は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書で教示され、これらの用途は、ＥＰＡそれ自体を含んでなる組換え微生物バイオマス、またはそれから単離されたＥＰＡを含んでなる微生物油のいずれについても、本明細書で同様に当てはまる。
加工および処方の当業者は、標的種および／または最終用途に準じて、一定量および組成の組換え微生物バイオマス、部分的精製バイオマス、精製油、および／または精製ＥＰＡをどのように特定製品に添加してもよいかを理解する。より具体的には、製品処方に「有効」量を組み込むべきであるが、この量は食品または飼料製品、製品が栄養補給することが意図される食餌、またはメディカルフードまたは医療栄養物が矯正しまたは治療することが意図される疾患に依存する。
最も望ましくは、ＥＰＡの有効量は、ω−３／ω−６ＰＵＦＡの消費と関連付けられている、望ましい健康特性を提供するのに十分である。典型的に、製品に組み込まれるＥＰＡの量については、数例を挙げれば、処理条件と典型的な取り扱いと貯蔵条件とに付随する損失、製品中のＥＰＡの安定性、および標的種中における生物学的利用能／生物学的吸収効率を考慮する。
加工および処方の当業者は、本明細書に記載される組換え微生物宿主細胞から生成された微生物油を濃縮し、それによって、それが少なくとも約５５〜６０％、少なくとも約６０〜６５％、少なくとも約６５〜７０％、少なくとも約７０〜８５％、少なくとも約８５〜９０％、少なくとも約９０〜９５％のＥＰＡまたは９５〜９９％にさえ至るＥＰＡを含んでなるように、総脂質画分中のＥＰＡ濃度を増大する方法に精通している。本明細書に記載される精製油をその他の精製脂肪酸（例えばＬＡ、ＧＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ）と、または代わりの脂肪酸を好ましい濃度で含有する油と混合する手段もまた、当業者に良く知られている。これらの技術は、特有に調整された脂肪酸プロファイルを含んでなる油を容易に作成できるようにする。
好ましい実施形態の説明
以下の実施例に詳述するように、ＤＣＷの２５％を超えるＥＰＡを産生する、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の様々な組換え株が本明細書で実証される。表７は、フラスコアッセイによる測定で、遺伝子型、総脂質含量、および脂質組成に基づいて、（先に遺伝子操作されて２２．５のＥＰＡ％ＤＣＷを産生する）組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株と比較した、これらの組換え株のいくつかの要約を提供する。
表内の各ブロックは、単一形質転換において生成された株または株群に相当し（すなわちＺ１９７７株、Ｚ１９７８株、Ｚ１９７９株、Ｚ１９８０株、およびＺ１９８１株は、単一形質転換からの個々のコロニーであった）、したがって同一遺伝子型を共有することが予測される。形質転換体内で発現された追加的な遺伝子、ならびにこれらの遺伝子のコピー数に注目する略語を使用して、Ｚ１９７８株に由来する株の遺伝子型を、Ｚ１９７８株の遺伝子型と比較して要約する。したがって、例えば、Ｚ１９７８株と比べて、Ｌ２５０株はＹｌＬＰＡＡＴ１を含んでなる１つの追加的な発現カセット、およびＹｌＰＤＡＴを含んでなる１つの追加的な発現カセットで形質転換され；Ｌ２５８株は、Ｚ１９７８株と比べて、Ｌ２５８株はＹｌＬＰＡＡＴ１を含んでなる２つの追加的な発現カセット、およびＹｌＰＤＡＴを含んでなる２つの追加的な発現カセットで形質転換された。
表は、細胞の総乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］、ＴＦＡの重量％としての各脂肪酸濃度［「％ＴＦＡ」］、乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含有量［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］、およびＥＰＡ％ＴＦＡ対ＬＡ％ＴＦＡの比率［「ＥＰＡ：ＬＡ比」］を要約する。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（リノール酸）、ＡＬＡ（α−リノレン酸）、ＥＤＡ（エイコサジエン酸）、ＤＧＬＡ（ジホモ−γ−リノレン酸）、ＡＲＡ（アラキドン酸）、ＥＴｒＡ（エイコサトリエン酸）、ＥＴＡ（エイコサテトラエン酸）、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、その他である。
Figure 2013535987
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少なくともＬＰＡＡＴ活性を有する少なくとも２つのポリペプチドと、少なくともＰＤＡＴ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドとを含んでなる株内では、ＥＰＡ％ＤＣＷは２５．６〜２８の範囲であり、ＥＰＡ％ＴＦＡは４５．２〜５０．４の範囲であり、ＥＰＡ％ＴＦＡ対ＬＡ％ＴＦＡの比率（「ＥＰＡ：ＬＡ比」）は２．４２〜３．２９の範囲である。
これらの株は全てＤＣＷの２５％を超えるＥＰＡを産生したが、総発酵時間を短縮することで、同一株を使用してＤＣＷの２５％未満のＥＰＡを生成してもよいことは、注目に値する。図２に関して、上で論じた組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５株の性能と類似して、表７の株はより少ないＥＰＡ％ＴＦＡと、より多くのＬＡ％ＴＦＡを産生し、発酵時間が短縮されればＥＰＡ：ＬＡ比が低下することが予測される。したがって、当業者は、これらの遺伝子操作Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株が、発酵中の特定の試料採取時点次第で、様々なＥＰＡ：ＬＡ比率で、多様な濃度のＥＰＡを有する微生物油を産生できることを理解するであろう。
ＥＰＡ、ＬＡ、およびオレイン酸が、ＴＦＡのおよそ７０〜７５％を構成する。本明細書に記載される改善された最適化組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株はまた、（約０．１％に至る検出可能レベルを有する装置を使用してＧＣ分析により測定した場合）約０．５％未満のＧＬＡまたはＤＨＡを有し、約８％未満の飽和脂肪酸含量を有することで際立っている。この飽和脂肪酸（すなわち１６：０および１８：０）の低い百分率は、ヒトおよび動物にかなりの健康上の利点をもたらす。
本発明を以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を見極め得て、その範囲と精神を逸脱することなく、本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
一般方法
実施例で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；２）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ，ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；および３）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）に記載される。
微生物培養の維持および成長に適した材料と方法は、当該技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒ．Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅ．Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗ．Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎ．Ｒ．Ｋｒｉｅｇ ａｎｄ Ｇ．Ｂ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４））；またはＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）に記載される。全ての試薬、制限酵素、および微生物細胞の増殖と維持のために使用された材料は、特に断りのない限り、ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的に、ルリア・ベルターニ［「ＬＢ」］プレート上で３７℃で培養された。
一般的分子クローニングは、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に従って実施された。ＰＣＲまたは部位特異的変異誘発がサブクローニングに伴う場合、コンストラクトを配列決定して、配列にいかなる誤りも導入されなかったことを確認した。ＰＣＲ産物は、ＰｒｏｍｅｇａのｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）またはｐＣＲ ４ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ベクターにクローンされた。
略称の意味は、次の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕは単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味し、「ＤＣＷ」は乾燥細胞重量を意味し、「ＴＦＡ」は総脂肪酸を意味し、「ＦＡＭＥ」は脂肪酸メチルエステルを意味する。
発現カセット命名法
発現カセットの構造は簡易表記体系「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」で表され、Ｘはプロモーター断片を記載し、Ｙは遺伝子断片を記載し、Ｚはターミネーター断片を記載し、それらは全て互いに作動的に連結する。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入された。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、典型的に下に示すレシピに従った、いくつかの培地中で２８〜３０℃で培養した。寒天プレートは、標準手順に従って、各液体培地に２０ｇ／Ｌの寒天を添加して、必要に応じて調製した。
ＹＰＤ寒天培地（１Ｌあたり）：１０ｇの酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］、２０ｇのＢａｃｔｏペプトン［Ｄｉｆｃｏ］、および２０ｇのグルコース。
基礎最少培地（「ＭＭ」）（１Ｌあたり）：２０ｇのグルコース、１．７ｇのアミノ酸非含有酵母窒素ベース、１．０ｇのプロリン、およびｐＨ６．１（調節の必要なし）。
最少培地＋５−フルオロオロト酸（「ＭＭ＋５−ＦＯＡ」）（１Ｌあたり）：２０ｇのグルコース、６．７ｇの酵母窒素ベース、７５ｍｇのウラシル、７５ｍｇのウリジン、および１００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの様々な濃度範囲に対するＦＯＡ活性試験に基づく適量のＦＯＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）（供給元から受領された各バッチには変動があるため）。
高グルコース培地（「ＨＧＭ」）（１リットルあたり）：８０グルコース、２．５８ｇのＫＨ２ＰＯ４、および５．３６ｇのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５（調節不要）。
発酵培地［「ＦＭ」］（１リットルあたり）：６．７０ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、６．００ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．００ｇのＫ２ＨＰＯ４、１．５０ｇのＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ、２０ｇのグルコース、および５．００ｇの酵母抽出物（ＢＢＬ）。
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載されるように実施した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸［「ＦＡ」］分析のために、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．＆ Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７（１９５９））に記載されるようにして、細胞を遠心分離によって収集し脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル交換によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｄａ Ｉ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））、引き続いて３０ｍ×０．２５ｍｍ（ｉ．ｄ．）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着した、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ ＧＣで分析した。オーブン温度は、１７０℃（２５分間の保持時間）から３．５℃／分で１８５℃にした。
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞（０．５ｍＬの培養物）を収集して蒸留水で１回洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ内で５〜１０分間真空乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μｌの１％）および既知量のＣ１５：０トリアシルグリセロール（Ｃ１５：０ ＴＡＧ；カタログ番号Ｔ−１４５、Ｎｕ−Ｃｈｅｃｋ Ｐｒｅｐ，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）をサンプルに添加し、次にサンプルをボルテックスして３０℃で５０分間振盪した。３滴の１Ｍ ＮａＣｌおよび４００μＬのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠沈した。上層を取り出して、ＧＣによって分析した。
代わりとして、発酵またはフラスコサンプルのいずれかからのブロスサンプルをルーチン分析するために、Ｌｉｐｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，２００３に記載される塩基触媒エステル交換法の変法を使用した。具体的には、ブロスサンプルを室温水中で迅速に解凍し、次に０．２２μｍのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）遠心管フィルター（カタログ番号８１６１）と共に、風袋を測定した２ｍＬ微量遠心管内に量り入れた（０．１ｍｇ）。あらかじめ測定したＤＣＷに応じて、サンプル（７５〜８００μｌ）を使用した。エッペンドルフ５４３０遠心分離機を使用して、サンプルを１４，０００ｒｐｍで５〜７分間、またはブロスを除去するのに必要な時間遠心分離した。フィルターを取り出して液体を排出し、約５００μｌの脱イオン水をフィルターに添加してサンプルを洗浄した。遠心分離して水を除去した後、フィルターを再度取り出して、液体を排出してフィルターを再度挿入した。遠心管を遠心分離機に今度は蓋を開けたまま、約３〜５分間再度挿入して乾燥させた。次にフィルターに遠心管の半ばまで切り込みを入れて、新鮮な２ｍＬ丸底エッペンドルフ管（カタログ番号２２３６３３５−２）に挿入した。
切断されたフィルター容器の縁のみに接触し、サンプルまたはフィルター材料に接触しない適切な道具によって、フィルターを遠心管の底に押しつけた。既知量のトルエン中のＣ１５：０ ＴＡＧ（前出）、および５００μｌの新鮮に調整されたメタノール溶液中の１％ナトリウムメトキシドを添加した。サンプルペレットを適切な道具によってしっかりと砕き、遠心管を閉じて５０℃ヒートブロックに３０分間入れた（ＶＷＲ カタログ番号１２６２１−０８８）。次に遠心管を少なくとも５分間放冷した。次に４００μｌのヘキサンおよび５００μｌの１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を添加して、遠心管を２×６秒間ボルテックスして１分間遠心分離した。およそ１５０μｌの上（有機）層をインサート付きＧＣバイアルに入れ、ＧＣによって分析した。
ＧＣ分析を通じて記録されたＦＡＭＥピークは、既知の脂肪酸との比較でそれらの滞留時間によって同定され、ＦＡＭＥピーク面積を既知量の内部基準（Ｃ１５：０ ＴＡＧ）と比較することで定量化された。したがってあらゆる脂肪酸ＦＡＭＥ［「μｇ ＦＡＭＥ」］の近似量（μｇ）は、式、（特定脂肪酸のＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピーク面積）＊（標準Ｃ１５：０ ＴＡＧのμｇ）に従って計算され、１μｇのＣ１５：０ ＴＡＧは０．９５０３μｇの脂肪酸に等しいので、あらゆる脂肪酸の量（μｇ）［「μｇＦＡ」］は、式、（特定脂肪酸のＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピーク面積）＊（標準Ｃ１５：０ ＴＡＧのμｇ）＊０．９５０３に従って計算される。換算係数０．９５０３は大部分の脂肪酸について測定された値の近似であり、それは０．９５〜０．９６の範囲にわたることに留意されたい。
ＴＦＡのｗｔ％として個々の各脂肪酸量を要約する脂質プロフィールは、個々のＦＡＭＥピーク面積を全てのＦＡＭＥピーク面積の和で除して１００を乗じて判定される。
フラスコアッセイによるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の総脂質含量および組成の分析
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の特定株の総脂質含量および組成の詳細な分析のために、フラスコアッセイを次のように行った。具体的には、１ループ量の新鮮な画線塗抹細胞を３ｍＬのＦＭ培地に接種して、２５０ｒｐｍおよび３０℃で培一晩養した。ＯＤ６００ｎｍを測定し、最終ＯＤ６００ｎｍが０．３になるように、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬＦＭ培地に細胞のアリコートを添加した。２５０ｒｐｍおよび３０℃の振盪インキュベーターに２日間入れた後に、６ｍＬの培養物を遠心分離によって収集し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＨＧＭに再懸濁した。２５０ｒｐｍおよび３０℃の振盪インキュベーターに５日間入れた後に、脂肪酸分析（前出）のために１ｍＬのアリコートを使用し、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］測定のために１０ｍＬを乾燥させた。
ＤＣＷ測定のために、Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＳ−６Ｒ遠心分離機内のＢｅｃｋｍａｎ ＧＨ−３．８回転子内において、４０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって１０ｍＬの培養物を収集した。ペレットを２５ｍＬの水に再懸濁して、上のように再収集した。洗浄ペレットを２０ｍＬの水に再懸濁し、あらかじめ秤量したアルミニウムパンに移した。細胞懸濁液を８０℃の真空オーブン内で一晩乾燥させた。細胞重量を測定した。
細胞の総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］を計算し、各脂肪酸濃度をＴＦＡ［「％ＴＦＡ」］の重量％として、ＥＰＡ含量を乾燥細胞重量のパーセント［「ＥＰＡ％ＤＣＷ」］として表にするデータと併せて考察した。
実施例１
少なくとも約３８．３のＴＦＡ％ＤＣＷで少なくとも約５８．７のＥＰＡ％ＴＦＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株の作成
本実施例は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して、３８．３のＴＦＡ％ＤＣＷで約５８．７のＥＰＡ％ＴＦＡを産生できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するＺ１９７８株の構築を記載する。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株の遺伝子型
Ｙ９５０２株の作成は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書に記載される。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するＹ９５０２株は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を通じて、総脂質に対して約５７．０％のＥＰＡを産生できた（図３Ａ）。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較したＹ９５０２株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ＋，Ｐｅｘ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１−，ｕｎｋｎｏｗｎ２−，ｕｎｋｎｏｗｎ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ４−，ｕｎｋｎｏｗｎ５−，ｕｎｋｎｏｗｎ６−，ｕｎｋｎｏｗｎ７−，ｕｎｋｎｏｗｎ８−，ｕｎｋｎｏｗｎ９−，ｕｎｋｎｏｗｎ１０−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２ｃｏｐｉｅｓ），ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０，ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ，ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６．略称は、次の通り。ＦｍＤ１２は、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＦｍＤ１２Ｓは、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］に由来するコドン最適化Δ１２デサチュラーゼ遺伝子であり；ＭＥ３Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］に由来するコドン最適化Ｃ１６／１８エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ９ｅは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子であり；ＥｇＤ８Ｍは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］に由来する合成変異Δ８デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］であり；ＥａＤ８Ｓは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，７９０，１５６号明細書］に由来するコドン最適化Δ８デサチュラーゼ遺伝子であり；Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユートレプチエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）ＣＣＭＰ３８９種（米国特許第７，６４５，６０４号明細書）に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子（「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」）と、Δ８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作成されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、Δ９エロンガーゼ「ＥｇＤ９ｅＳ」（前出）とΔ８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作成されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥａＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，７９４，７０１号明細書］に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子（「ＥａＤ９ｅＳ」）と、Δ８デサチュラーゼ「ＥｇＤ８Ｍ」（前出）［米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書］とを連結させて作成されたＤＧＬＡシンターゼであり；ＥｇＤ５ＭおよびＥｇＤ５ＳＭは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］に由来する変異ＨＰＧｓ（配列番号４２７）モチーフ［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］を含んでなる、合成変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子であり；ＥａＤ５ＳＭは、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）［米国特許第７，９４３，３６５号明細書］に由来する変異ＨａＧＧ（配列番号４２８）モチーフ［米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書］を含んでなる、合成変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子であり；ＰａＤ１７は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり；ＰａＤ１７Ｓは、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］に由来するコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ遺伝子であり；ＹｌＣＰＴ１は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子［米国特許第７，９３２，０７７号明細書］であり；ＭＣＳは、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）次亜種ビシアエ（ｖｉｃｉａｅ）３８４１［米国特許出願公開第２０１０−０１５９５５８−Ａ１号明細書］に由来するコドン最適化マロニルＣｏＡシンセターゼ遺伝子であり、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）［米国特許第７，８７９，５９１号明細書］に由来するコドン最適化リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子である。
Ｙ９５０２株の総脂質含量および組成の詳細な分析のために、細胞を二段階で合計７日間培養するフラスコアッセイを実施した。分析に基づいて、Ｙ９５０２株は、３．８ｇ／Ｌ ＤＣＷ、３７．１ ＴＦＡ％ＤＣＷ、２１．３ ＥＰＡ％ＤＣＷを産生し、脂質プロフィールは、１６：０（パルミチン酸）−２．５、１６：１（パルミトレイン酸）−０．５、１８：０（ステアリン酸）−２．９、１８：１（オレイン酸）−５．０、１８：２（ＬＡ）−１２．７、ＡＬＡ−０．９、ＥＤＡ−３．５、ＤＧＬＡ−３．３、ＡＲＡ−０．８、ＥＴｒＡ−０．７、ＥＴＡ−２．４、ＥＰＡ−５７．０、その他−７．５であり、各脂肪酸濃度はＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］である。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株からのＺ１９７８株の作成
Ｙ９５０２株からのＺ１９７８株の開発は図３Ｂに示され、参照によって本明細書に援用する、米国仮特許出願第６１／３７７２４８号明細書および米国仮特許出願第６１／４２８，２７７号明細書に記載される。
特に、Ｙ９５０２株中でＵｒａ３遺伝子を中断するために、ＳａｌＩ／ＰａｃＩ消化されたコンストラクトｐＺＫＵＭ（図４Ａ；配列番号８２；参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、一般方法に従って、Ｕｒａ３変異遺伝子をＹ９５０２株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計２７個の形質転換体（第１群から選択された８個の形質転換体、第２群から選択された８個の形質転換体、および第３群から選択された１１個の形質転換体を含んでなる）を最少培地＋５−フルオロオロト酸［「ＭＭ＋５−ＦＯＡ」］選択プレート上で培養して、３０℃に２〜５日間保った。さらなる実験は、形質転換体の第３群のみが、真のＵｒａ−表現型を有すると判定した。
Ｕｒａ−細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡプレートから掻き取って、一般方法に従って脂肪酸分析を行った。このようにして、ＧＣ分析は、第３群のＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で培養されたｐＺＫＵＭ−形質転換体＃１、＃３、＃６、＃７、＃８、＃１０、および＃１１中に、それぞれＴＦＡの２８．５％、２８．５％、２７．４％、２８．６％、２９．２％、３０．３％、および２９．６％のＥＰＡがあったことを示した。これらの７株をそれぞれ、Ｙ９５０２Ｕ１２株、Ｙ９５０２Ｕ１４株、Ｙ９５０２Ｕ１７株、Ｙ９５０２Ｕ１８株、Ｙ９５０２Ｕ１９株、Ｙ９５０２Ｕ２１株、およびＹ９５０２Ｕ２２株と命名した（集合的にＹ９５０２Ｕ）。
次に、コンストラクトｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎ（図４Ｂ；配列番号８３）を作成して、Ｙ９５０２Ｕ株のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＬＩ０Ｆ３２１３１ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５０６１２１）に、１つのΔ９デサチュラーゼ遺伝子、１つのコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、および１つのΔ９エロンガーゼ変異遺伝子を組み込んだ。Δ９デサチュラーゼ変異遺伝子は、ＥｇＤ９ｅＳ［配列番号３］と比較して、Ｌ３５Ｇ変異を含有した（参照によって本明細書に援用する米国仮特許出願第６１／３７７２４８号明細書［代理人整理番号ＣＬ４７８３ＵＳＰＲＶ、２０１０年８月２６日出願］に記載される；実施例１０Ａ−１０Ｆもまた参照されたい）。したがってｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎプラスミドは、以下の構成要素を含有した。
Figure 2013535987
ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９ＮプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ９５０２Ｕ１７株の形質転換のために使用した。形質転換細胞を最少培地［「ＭＭ」］プレート上に播種して、３０℃に３〜４日間保った。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹して、次に３０℃の液体ＭＭに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集して高グルコース培地［「ＨＧＭ」］に再懸濁し、次に２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。細胞に、前出の脂肪酸分析を行った。
ＧＣ分析は、ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９ＮがあるＹ９５０２Ｕ１７の選択された９６株の大部分が、ＴＦＡの５０〜５６％のＥＰＡを産生したことを示した。ＴＦＡの約５９．０％、５６．６％、５８．９％、５６．５％、および５７．６％のＥＰＡを産生した５株（すなわち、＃３１、＃３２、＃３５、＃７０、および＃８０）をそれぞれ株Ｚ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０、およびＺ１９８１と命名した。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較したこれらのｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎ形質転換株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ＋，Ｐｅｘ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１−，ｕｎｋｎｏｗｎ２−，ｕｎｋｎｏｗｎ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ４−，ｕｎｋｎｏｗｎ５−，ｕｎｋｎｏｗｎ６−，ｕｎｋｎｏｗｎ７−，ｕｎｋｎｏｗｎ８−，ｕｎｋｎｏｗｎ９−，ｕｎｋｎｏｗｎ１０−，ｕｎｋｎｏｗｎ１１−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２ｃｏｐｉｅｓ），ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０，ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ，ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６。
Ｚ１９７７、Ｚ１９７８、Ｚ１９７９、Ｚ１９８０、およびＺ１９８１株中のＹＡＬＩ０Ｆ３２１３１ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５０６１２）のノックアウトは、ｐＺＫＬ３−９ＤＰ９Ｎでの形質転換によって生じたＥＰＡ株のいずれでも確認されなかった。
Ｚ１９７７株、Ｚ１９７８株、Ｚ１９７９株、Ｚ１９８０株、およびＺ１９８１株のＹＰＤプレートからの細胞を培養し、総脂質含量と組成について分析した。具体的には、フラスコアッセイは、一般方法に記載されるようにして行われた。
したがって好ましい実施形態の説明（前出）の記述内の表７は、フラスコアッセイによる測定で、Ｚ１９７７株、Ｚ１９７８株、Ｚ１９７９株、Ｚ１９８０株、およびＺ１９８１株の全ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、各脂肪酸濃度［「％ＴＦＡ」］、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。
米国仮特許出願第６１／３７７２４８号明細書（代理人整理番号ＣＬ４７８３ＵＳＰＲＶ、２０１０年８月２６日提出）の提出に引き続いて、Ｚ１９７８株に部分的ゲノム配列決定を行った。この研究は、米国仮特許出願第６１／４２８，２７７号明細書（代理人整理番号ＣＬ５２６７ＵＳＰＲＶ、２０１０年１２月３０日出願）記載されるように、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムに組み込まれた６つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子の代わりに、遺伝子操作株が実際には４つのみを保有したと判定した。
より具体的には、下でさらに記述されるように、２つの別個のプラスミド断片（またはその部分）は、Ｚ１９７８株中に検出されなかった。
（１）コンストラクトｐＺＫＬ２−５ｍＢ８９Ｃ（米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書の配列番号１３１参照）は、１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子をＹ８０６９Ｕ株のＬｉｐ２遺伝子座に組み込み、それによってより高いＥＰＡ産生を可能にすることが意図された。しかしゲノムの配列決定は、ｐＺＫＬ２−５ｍＢ８９Ｃ断片のＬｉｐ２．３Ｎ末端部分、およびＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏキメラ遺伝子を検出できなかった。ＤＮＡ再配置は、Ｙ８１５４株作成中に、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏカセットの喪失をもたらした可能性がある（図３Ａ）。
（２）コンストラクトｐＺＫＬ１−２ＳＲ９Ｇ８５（米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書の配列番号１３２参照）は、１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子をＹ８１５４Ｕ１株のＬｉｐ１遺伝子座に組み込むことが意図された。しかしゲノム配列決定またはＰＣＲ増幅のどちらも、Ｚ１９７８株中のΔ５デサチュラーゼ遺伝子を検出できなかった。ＤＮＡ再配置は、Ｙ８２６９株作成中に、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔカセットの喪失をもたらした可能性がある（図３Ａ）。
さらにコンストラクトｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３（米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書の中の配列番号１３３参照）、およびコンストラクトｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆ（米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書中の配列番号１３５参照）が、どちらもＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ遺伝子座に組み込まれたと判定された。
したがって野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、Ｚ１９７８株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ＋，Ｐｅｘ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１−，ｕｎｋｎｏｗｎ２−，ｕｎｋｎｏｗｎ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ４−，ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ６−，ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ８−，ｕｎｋｎｏｗｎ１０−，ｕｎｋｎｏｗｎ１１−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー），ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ９５０２株およびＺ１９７８株の比較
Ｚ１９７８株中で発現される異種遺伝子は、１つのΔ９デサチュラーゼ遺伝子、１つのコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、および１つのΔ９エロンガーゼ変異体の追加的発現のみによって、Ｙ９５０２株中で発現されるものと異なる（すなわち配列番号４３および４４に記載のＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ）。ＬＡおよびＡＬＡからＥＰＡへの全Δ９エロンガーゼ変換効率［「％変換」］は、表９でＹ９５０２株およびＺ１９７８株について、次式によって計算された。
（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００
式中、生成物は、ＥＤＡ％ＴＦＡ、ＥＴｒＡ％ＴＦＡ、ＤＧＬＡ％ＴＦＡ、ＥＴＡ％ＴＦＡ、ＡＲＡ％ＴＦＡ、およびＥＰＡ％ＴＦＡの合計であり、基質は、ＬＡ％ＴＦＡ、ＡＬＡ％ＴＦＡ、ＥＤＡ％ＴＦＡ、ＥＴｒＡ％ＴＦＡ、ＤＧＬＡ％ＴＦＡ、ＥＴＡ％ＴＦＡ、
ＡＲＡ％ＴＦＡ、およびＥＰＡ％ＴＦＡの合計であった。
Figure 2013535987
上で示されるように、全Δ９エロンガーゼ変換効率がＹ９５０２株で８３．３％と判定された一方、Ｚ１９７８株では効率が改善された（すなわち８５．３％）。
実施例２
少なくとも約５７．１のＴＦＡ％ＤＣＷで少なくとも約４５．２のＥＰＡ％ＴＦＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌ２５８株の作成
本実施例は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して、５７．１のＴＦＡ％ＤＣＷで、約４５．２％のＥＰＡ％ＴＦＡを産生できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ１９７８株（実施例１）に由来するＬ２５８株の構築を記載する。
中間株Ｚ１９７８Ｕ、Ｌ２５０、およびＬ２５０Ｕの構築に必要なＬ２５８株（図３Ｂ）の構築
Ｚ１９７８Ｕ（Ｕｒａ３−）株の作成
Ｕｒａ３遺伝子を中断するために、Ｙ９５０２株のｐＺＫＵＭ形質転換について記載される（実施例１）のと同様の方法で、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図４Ａ；配列番号８２；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｚ１９７８株のＵｒａ３遺伝子にＵｒａ３変異遺伝子を組み込んだ。合計１６個の形質転換体（第１の「Ｂ」群から選択された８個の形質転換体、および第２の「Ｃ」群から選択された８個の形質転換体を含んでなる）が培養され、Ｕｒａ−表現型を有すると同定された。
ＧＣ分析は、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で培養されたＢ群ｐＺＫＵＭ−形質転換株＃１、＃２、＃３、および＃４中で、それぞれＴＦＡの３０．８％、３１％、３０．９％、および３１．３％のＥＰＡの存在を示した。これらの４株をそれぞれＺ１９７８ＢＵ１株、Ｚ１９７８ＢＵ２株、Ｚ１９７８ＢＵ３株、およびＺ１９７８ＢＵ４株と命名した。
ＧＣ分析は、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で培養された、Ｃ群ｐＺＫＵＭ−形質転換株＃１、＃２、＃５、および＃６中にそれぞれＴＦＡの３４．４％、３１．９％、３１．２％、および３１％のＥＰＡの存在を示した。これらの４株をそれぞれＺ１９７８ＣＵ１株、Ｚ１９７８ＣＵ２株、Ｚ１９７８ＣＵ３株、およびＺ１９７８ＣＵ４株と命名した。
株Ｚ１９７８ＢＵ１、Ｚ１９７８ＢＵ２株、Ｚ１９７８ＢＵ３株、Ｚ１９７８ＢＵ４株、Ｚ１９７８ＣＵ１株、Ｚ１９７８ＣＵ２株、Ｚ１９７８ＣＵ３株、およびＺ１９７８ＣＵ４株は、Ｚ１９７８Ｕ株と集合的に命名された。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌ２５０株の作成
コンストラクトｐＹ１８７（図５Ａ；配列番号８４）を作成して、Ｚ１９７８Ｕ株のゲノムに、１つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子［「ＬＰＡＡＴ」］および１つのリン脂質：ジアシルグリセロールアシル基転移酵素遺伝子［「ＰＤＡＴ」］を組み込んだ。ｐＹ１８７プラスミドは、以下の構成要素を含有した。
Figure 2013535987
ｐＹ１８７プラスミドをＳｗａＩ／ＡｐａＩで消化し、６．７ｋＢの大型の断片をアガロースゲルから精製して、次に一般方法に従って、Ｚ１９７８ＣＵ４株の形質転換のために使用した。形質転換細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に５日間保った。次に単一コロニー（１９）をＭＭプレート上に再度画線塗抹した。一般方法に従ってフラスコアッセイによって、これらの株の総脂質含量と脂肪酸組成を評価した。
分析に基づいて、Ｌ２５０株は、４．４ｇ／ＬのＤＣＷ、５１．５のＴＦＡ％ＤＣＷ、および２６のＥＰＡ％ＤＣＷを産生した。脂質プロフィールは、１６：０（パルミチン酸）−２．０、１６：１（パルミトレイン酸）−０．７、１８：０（ステアリン酸）−２．８、１８：１（オレイン酸）−６．１、１８：２（ＬＡ）−１６．７、ＡＬＡ−０．９、ＥＤＡ−３．３、ＤＧＬＡ−４．９、ＡＲＡ−０．７、ＥＴｒＡ−０．６、ＥＴＡ−３．２、ＥＰＡ−５０．４、およびその他−７．４であり、各脂肪酸濃度はＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］である（前出の好ましい実施形態の説明の記述内の表７もまた参照されたい）。
Ｌ２５０Ｕ（Ｕｒａ３−）株の作成
Ｕｒａ３遺伝子を中断するために、Ｙ９５０２株のｐＺＫＵＭ形質転換について記載される（実施例１）のと同様の方法で、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図４Ａ；配列番号８２；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｌ２５０株のＵｒａ３遺伝子にＵｒａ３変異遺伝子を組み込んだ。合計１２個の５−ＦＯＡ耐性コロニーが培養され、Ｕｒａ−表現型を有すると同定された。株＃２および株＃３をそれぞれ、Ｌ２５０Ｕ２およびＬ２５０Ｕ３と命名した（集合的にＬ２５０Ｕ株）。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌ２５８株の作成
プラスミドｐＹ１８７（表１０；配列番号８４）を使用して、Ｌ２５０Ｕ株のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムに、ＹｌＬＰＡＡＴ遺伝子（配列番号２１）およびＹｌＰＤＡＴ遺伝子（配列番号２８）の追加的なコピーを組み込んだ。一般方法に従って、プラスミドｐＹ１８７の６．７ｋＢの精製大型断片をＬ２５０Ｕ２株の形質転換のために使用した。形質転換細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に５日間保った。次に単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹した。一般方法に従って、フラスコアッセイによって、細胞総脂質含量および組成を評価した。
分析に基づいて、Ｌ２５８株は、５．０ｇ／ＬのＤＣＷ、５７．１のＴＦＡ％ＤＣＷ、および２５．８のＥＰＡ％ＤＣＷを産生した。脂質プロフィールは、１６：０（パルミチン酸）−２．３、１６：１（パルミトレイン酸）−０．９、１８：０（ステアリン酸）−３．４、１８：１（オレイン酸）−７．８、１８：２（ＬＡ）−１８．７、ＡＬＡ−０．９、ＥＤＡ−４．０、ＤＧＬＡ−５．３、ＡＲＡ−０．８、ＥＴｒＡ−０．６、ＥＴＡ−３．２、ＥＰＡ−４５．２、およびその他−６．６であり、各脂肪酸濃度はＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］である（前出の好ましい実施形態の説明の記述内の表７もまた参照されたい）。
野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、Ｌ２５８株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ＋，Ｐｅｘ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１−，ｕｎｋｎｏｗｎ２−，ｕｎｋｎｏｗｎ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ４−，ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ６−，ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ８−，ｕｎｋｎｏｗｎ１０−，ｕｎｋｎｏｗｎ１１−，ｕｎｋｎｏｗｎ１２−，ｕｎｋｎｏｗｎ１３−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー），ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１（２コピー），ＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１（２コピー）。
実施例３
少なくとも約５３のＴＦＡ％ＤＣＷで少なくとも約４７のＥＰＡ％ＴＦＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５５６５株、Ｚ５５６７株、Ｚ５５７５株、およびＺ５５７６株の作成
本実施例は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して、ＤＣＷの５３％を超えるＴＦＡで、約４７のＥＰＡ％ＴＦＡを産生できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌ２５８株（実施例２）に由来するＺ５５６５株、Ｚ５５６７株、Ｚ５５７５株、およびＺ５５７６株の構築を記載する。
中間株Ｌ２５８Ｕの構築に必要なＺ５５６５株、Ｚ５５６７株、Ｚ５５７５株、およびＺ５５７６株（図３Ｂ）の開発
Ｌ２５８Ｕ（Ｕｒａ３−）株の作成
Ｕｒａ３遺伝子を中断するために、Ｙ９５０２株のｐＺＫＵＭ形質転換について記載される（実施例１）のと同様の方法で、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図４Ａ；配列番号８２；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｌ２５８株のＵｒａ３遺伝子にＵｒａ３変異遺伝子を組み込んだ。合計２０個の形質転換体が培養され、Ｕｒａ−表現型を有すると同定された。
ＧＣ分析は、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で培養されたｐＺＫＵＭ−形質転換株＃７および＃９中に、それぞれ３７．６％および３７．２％ＥＰＡの存在を示した。これらの２株をそれぞれ、Ｌ２５８Ｕ５およびＬ２５８Ｕ６と命名し、集合的にＬ２５８Ｕ株と命名した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５５６５株、Ｚ５５６７株、Ｚ５５７５株、およびＺ５５７６株の作成
コンストラクトｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎ（図５Ｂ；配列番号８５）は、米国特許出願公開第２０１０−０３１７０７２−Ａ１号明細書の表１５に記載される。それは、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＬＩ０Ｂ１４７９５ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５００９００）に、キメラＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０遺伝子内の１つのΔ８デサチュラーゼ、キメラＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１遺伝子内の１つのマロニルＣｏＡシンセターゼ、およびキメラＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６遺伝子内の１つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素を組み込むために作成された。
一般方法に従って、ｐＺＫ１６−ＭＬ８ＮプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＬ２５８Ｕ５株およびＬ２５８Ｕ６株の形質転換のために使用した。形質転換細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に５〜６日間保った。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹して、次に３０℃の液体ＭＭに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してＨＧＭに再懸濁し、次に２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般方法に従って、細胞に脂肪酸分析を行った。
ＧＣ分析は、ｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎがある選択された４８のＬ２５８Ｕ５株の内７株が、ＴＦＡの４８％を超えるＥＰＡを産生したことを示した。ＴＦＡの約４９．７％および５０．９％のＥＰＡを産生した２株（すなわち＃３および＃３６）をそれぞれＺ５５６５およびＺ５５６７と命名した。
ＧＣ分析は、ｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎがある選択された４８のＬ２５８Ｕ６株のほとんどが、ＴＦＡの４９％を超えるＥＰＡを産生したことを示した。ＴＦＡの約５３．７％および５０．２％のＥＰＡを産生した２株（すなわち＃２および＃５）をそれぞれＺ５５７５およびＺ５５７６と命名した。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、これらのｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎ形質転換株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ＋，Ｐｅｘ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１−，ｕｎｋｎｏｗｎ２−，ｕｎｋｎｏｗｎ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ４−，ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ６−，ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ８−，ｕｎｋｎｏｗｎ１０−，ｕｎｋｎｏｗｎ１１−，ｕｎｋｎｏｗｎ１２−，ｕｎｋｎｏｗｎ１３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１４−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー），ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１（２コピー），ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー），ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１（２コピー），ＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１（２コピー）。
ｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎによる形質転換で生じたＥＰＡ株のいずれにおいても、Ｚ５５６５株、Ｚ５５６７株、Ｚ５５７５株、およびＺ５５７６株のＹＡＬＩ０Ｂ１４７９５ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５００９００）のノックアウトは確認されなかった。
フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析
一般方法に従って、Ｚ５５６５株、Ｚ５５６７株、Ｚ５５７５株、およびＺ５５７６株のＹＰＤプレートからの細胞を培養し、総脂質含量および組成について分析した。
好ましい実施形態の説明（前出）内の表７の記述は、Ｚ５５６５株、Ｚ５５６７株、Ｚ５５７５株、およびＺ５５７６株の総ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸濃度、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。平均ＤＣＷは４．８ｇ／Ｌであり、平均ＴＦＡ％ＤＣＷは５５．４であり、平均ＥＰＡ％ＴＦＡは４８．３であり、平均ＥＰＡ％ＤＣＷは２６．７５であった。
実施例４
少なくとも約５１のＴＦＡ％ＤＣＷで少なくとも約４９のＥＰＡ％ＴＦＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５６２０株、Ｚ５６２３株、およびＺ５６２５株の作成
本実施例は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して、ＤＣＷの５１％を超えるＴＦＡで、約４９のＥＰＡ％ＴＦＡを産生できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌ２５８Ｕ株（実施例３）に由来するＺ５６２０株、Ｚ５６２３株、およびＺ５６２５株の構築を記載する。
コンストラクトｐＺＫ１６−ＭｙＬ８Ｎを作成して、Ｌ２５８Ｕ株のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＬＩ０Ｂ１４７９５ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５００９００）に、１つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子、１つのマロニルＣｏＡシンセターゼ遺伝子、および１つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子を組み込んだ。より具体的には、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ遺伝子（「ＹｌＬＰＡＡＴ」；配列番号２１）およびＬｉｐ１ターミネーターが、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化されたモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ遺伝子（「ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ」；配列番号１９）およびＰｅｘ１６ターミネーターを置き換えていることを除いては、コンストラクトｐＺＫ１６−ＭｙＬ８Ｎ（図６Ａ；配列番号８６）は、ｐＺＫ１６−ＭＬ８Ｎ（図５Ｂ；配列番号８５；実施例３）と同一であった。ｐＺＫ１６−ＭｙＬ８Ｎプラスミドは、以下の構成要素を含有した。
Figure 2013535987
一般方法に従って、ｐＺＫ１６−ＭｙＬ８ＮプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＬ２５８Ｕ６株の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に５〜６日間保った。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹して、次に３０℃の液体ＭＭに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してＨＧＭに再懸濁し、次に２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。上の一般方法に記載されるようにして、細胞を脂肪酸分析した。
ＧＣ分析は、ｐＺＫ１６−ＭｙＬ８Ｎで形質転換された選択された４８のＬ２５８Ｕ６株のほぼ全てが、ＴＦＡの４９％を超えるＥＰＡを産生したことを示した。ＴＦＡの約５２．８％、５３．０％、および４９．９％のＥＰＡを産生した３株（すなわち、＃５、＃２１、および＃４８）をそれぞれＺ５６２０、Ｚ５６２３、およびＺ５６２５と命名した。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、これらのｐＺＫ１６−ＭｙＬ８Ｎ形質転換株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ＋，Ｐｅｘ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１−，ｕｎｋｎｏｗｎ２−，ｕｎｋｎｏｗｎ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ４−，ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ６−，ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ８−，ｕｎｋｎｏｗｎ１０−，ｕｎｋｎｏｗｎ１１−，ｕｎｋｎｏｗｎ１２−，ｕｎｋｎｏｗｎ１３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１４−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー），ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１（２コピー），ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１（２コピー），ＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１（２コピー）。
ｐＺＫ１６−ＭｙＬ８Ｎによる形質転換で生じたＥＰＡ株のいずれにおいても、Ｚ５６２０株、Ｚ５６２３株、およびＺ５６２５株のＹＡＬＩ０Ｂ１４７９５ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５００９００）のノックアウトは確認されなかった。
フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析
一般方法に従って、Ｚ５６２０株、Ｚ５６２３株、およびＺ５６２５株のＹＰＤプレートからの細胞を培養し、総脂質含量および組成について分析した。
好ましい実施形態の説明（前出）内の表７の記述は、Ｚ５６２０株、Ｚ５６２３株、およびＺ５６２５株の総ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸濃度、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。平均ＤＣＷは４．５ｇ／Ｌであり、平均ＴＦＡ％ＤＣＷは５２．４であり、平均ＥＰＡ％ＴＦＡは４８．４であり、平均ＥＰＡ％ＤＣＷは２５．９であった。
実施例５
少なくとも約５５のＴＦＡ％ＤＣＷで少なくとも約４８のＥＰＡ％ＴＦＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５５８１株、Ｚ５５８２株、Ｚ５５８３株、およびＺ５５８４株の作成
本実施例は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して、ＤＣＷの５５％を超えるＴＦＡで、約４８ＥＰＡ％ＴＦＡを産生できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌ２５８Ｕ株（実施例３）に由来するＺ５５８１株、Ｚ５５８２株、Ｚ５５８３株、およびＺ５５８４株の構築を記載する。
コンストラクトｐＺＫ１６−ＭＬ３（図６Ｂ、配列番号８９）を作成して、Ｌ２５８Ｕ株のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＬＩ０Ｂ１４７９５ｐ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５００９００）に、１つのマロニルＣｏＡシンセターゼ遺伝子、および１つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子、および１つのＣ１６／１８エロンガーゼ遺伝子を組み込んだ。ｐＺＫ１６−ＭＬ３プラスミドは、以下の構成要素を含有した。
Figure 2013535987
一般方法に従って、ｐＺＫ１６−ＭＬ３プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＬ２５８Ｕ５株の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に４〜５日間保った。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹して、次に３０℃の液体ＭＭに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してＨＧＭに再懸濁し、次に２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般方法に従って、細胞に脂肪酸分析を行った。
ＧＣ分析は、ｐＺＫ１６−ＭＬ３で形質転換された選択された４８のＬ２５８Ｕ５株の内１９株が、ＴＦＡの５０％を超えるＥＰＡを産生したことを示した。ＴＦＡの約５０．９％、５２．４％、５１．５％、および５１．７％のＥＰＡを産生した４株（すなわち、＃１６、＃４２、＃４６、および＃４７）をそれぞれＺ５５８１、Ｚ５５８２、Ｚ５５８３、およびＺ５５８４と命名した。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、これらのｐＺＫ１６−ＭＬ３形質転換株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ＋，Ｐｅｘ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１−，ｕｎｋｎｏｗｎ２−，ｕｎｋｎｏｗｎ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ４−，ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ６−，ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ８−，ｕｎｋｎｏｗｎ１０−，ｕｎｋｎｏｗｎ１１−，ｕｎｋｎｏｗｎ１２−，ｕｎｋｎｏｗｎ１３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１４−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー），ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１（２コピー），ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー），ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１（２コピー），ＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１（２コピー）。
ｐＺＫ１６−ＭＬ３による形質転換で生じたＥＰＡ株のいずれにおいても、Ｚ５５８１株、Ｚ５５８２株、Ｚ５５８３株、およびＺ５５８４株のＹＡＬＩ０Ｂ１４７９５遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＭ＿５００９００）のノックアウトは確認されなかった。
フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析
一般方法に従って、Ｚ５５８１株、Ｚ５５８２株、Ｚ５５８３株、およびＺ５５８４株のＹＰＤプレートからの細胞を培養し、総脂質含量および組成について分析した。
好ましい実施形態の説明（前出）内の表７の記述は、Ｚ５５８１株、Ｚ５５８２株、Ｚ５５８３株、およびＺ５５８４株の総ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸濃度、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。平均ＤＣＷは４．８ｇ／Ｌであり、平均ＴＦＡ％ＤＣＷは５６であり、平均ＥＰＡ％ＴＦＡは４８．６５であり、平均ＥＰＡ％ＤＣＷは２７．２であった。
実施例６
少なくとも約５４のＴＦＡ％ＤＣＷで少なくとも約４８のＥＰＡ％ＴＦＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５５７０株、Ｚ５５７１株、Ｚ５５７２株、およびＺ５５７４株の作成
本実施例は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して、ＤＣＷの５４％を超えるＴＦＡで、約４８ＥＰＡ％ＴＦＡを産生できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌ２５８Ｕ株（実施例３）に由来するＺ５５７０株、Ｚ５５７１株、Ｚ５５７２株、およびＺ５５７４株の構築を記載する。
コンストラクトｐＺＫＭＰ−ＭＬ９ＤＰ（図７Ａ、配列番号９２）を作成して、Ｌ２５８Ｕ株のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＬＩ０Ｆ０２２１１ｇ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５０４８９５）に、１つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子、１つのΔ９デサチュラーゼ遺伝子、および１つのコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子を組み込んだ。ｐＺＫＭＰ−ＭＬ９ＤＰプラスミドは、以下の構成要素を含有した。
Figure 2013535987
一般方法に従って、ｐＺＫＭＰ−ＭＬ９ＤＰプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＬ２５８Ｕ５株の形質転換のために使用した。形質転換細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に５日間保った。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹して、次に３０℃の液体ＭＭに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してＨＧＭに再懸濁し、次に２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般方法に従って、細胞に脂肪酸分析を行った。
ＧＣ分析は、ｐＺＫＭＰ−ＭＬ９ＤＰで形質転換された選択された４８のＬ２５８Ｕ５株の内２２株が、ＴＦＡの５０％を超えるＥＰＡを産生したことを示した。ＴＦＡの約５３．５％、５１．８％，５２．９％、および５１．８％のＥＰＡを産生した４株（すなわち、＃１７、＃２５、＃４０、および＃４６）をそれぞれＺ５５７０、Ｚ５５７１、Ｚ５５７２、およびＺ５５７４と命名した。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、これらのｐＺＫＭＰ−ＭＬ９ＤＰ形質転換株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ＋，Ｐｅｘ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１−，ｕｎｋｎｏｗｎ２−，ｕｎｋｎｏｗｎ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ４−，ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ６−，ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ８−，ｕｎｋｎｏｗｎ１０−，ｕｎｋｎｏｗｎ１１−，ｕｎｋｎｏｗｎ１２−，ｕｎｋｎｏｗｎ１３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１４−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー），ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＤＧＡＴ２Ｍ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６（２コピー），ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＡＬＫ２ＬＭ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１（２コピー），ＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１（２コピー）。
ｐＺＫＭＰ−ＭＬ９ＤＰによる形質転換で生じたＥＰＡ株のいずれにおいても、Ｚ５５７０株、Ｚ５５７１株、Ｚ５５７２株、およびＺ５５７４株のＹＡＬＩ０Ｆ０２２１１ｇ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５０４８９５）のノックアウトは確認されなかった。
フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析
一般方法に従って、Ｚ５５７０株、Ｚ５５７１株、Ｚ５５７２株、およびＺ５５７４株のＹＰＤプレートからの細胞を培養し、総脂質含量および組成について分析した。
好ましい実施形態の説明（前出）内の表７の記述は、Ｚ５５７０株、Ｚ５５７１株、Ｚ５５７２株、およびＺ５５７４株の総ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸濃度、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。平均ＤＣＷは４．９ｇ／Ｌであり、平均ＴＦＡ％ＤＣＷは５４．２であり、平均ＥＰＡ％ＴＦＡは４８．９であり、平均ＥＰＡ％ＤＣＷは２６．５５であった。
実施例７
少なくとも約５２のＴＦＡ％ＤＣＷで少なくとも約４９のＥＰＡ％ＴＦＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５５８５株およびＺ５６２７株の作成
本実施例は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して、ＤＣＷの５２％を超えるＴＦＡで、約４９ＥＰＡ％ＴＦＡを産生できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌ２５８Ｕ株（実施例３）に由来するＺ５５８５株およびＺ５６２７株の構築を記載する。
コンストラクトｐＺＫＭＰ−ＭＬ９ＤＣＢ（図７Ｂ、配列番号９５）を作成して、Ｌ２５８Ｕ株のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＬＩ０Ｆ０２２１１ｇ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５０４８９５）に、１つのリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子、１つのΔ９デサチュラーゼ遺伝子、および１つのジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を組み込んだ。ｐＺＫＭＰ−ＭＬ９ＤＣＢプラスミドは、以下の構成要素を含有した。
Figure 2013535987
一般方法に従って、ｐＺＫＭＰ−ＭＬ９ＤＣＢプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＬ２５８Ｕ５株およびＬ２５８Ｕ６株の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に５〜６日間保った。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹して、次に３０℃の液体ＭＭに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してＨＧＭに再懸濁し、次に２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般方法に従って、細胞に脂肪酸分析を行った。
ＧＣ分析は、ｐＺＫＭ−ＭＬ９ＤＣＢで形質転換された選択された５０のＬ２５８Ｕ５株の内２１株が、ＴＦＡの５０％を超えるＥＰＡを産生したことを示した。ＴＦＡの約５２．３％および５１．９％のＥＰＡを産生した２株（すなわち＃１および＃１Ｂ）をそれぞれＺ５５８５およびＺ５６２７と命名した。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、これらのｐＺＫＭＰ−ＭＬ９ＤＣＢ形質転換株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ＋，Ｐｅｘ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１−，ｕｎｋｎｏｗｎ２−，ｕｎｋｎｏｗｎ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ４−，ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ６−，ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ８−，ｕｎｋｎｏｗｎ１０−，ｕｎｋｎｏｗｎ１１−，ｕｎｋｎｏｗｎ１２−，ｕｎｋｎｏｗｎ１３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１４−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー），ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＤＧＡＴ２Ｍ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＯＣＴ，ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＡＬＫ２ＬＭ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１（２コピー），ＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１（２コピー）。
ｐＺＫＭＰ−ＭＬ９ＤＣＢによる形質転換で生じたＥＰＡ株のいずれにおいても、Ｚ５５８５株およびＺ５６２７株のＹＡＬＩ０Ｆ０２２１１ｇ遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ＿５０４８９５）のノックアウトは確認されなかった。
フラスコアッセイによる総脂質含量および組成の分析
一般方法に従って、Ｚ５５８５株およびＺ５６２７株のＹＰＤプレートからの細胞を培養し、総脂質含量および組成について分析した。
好ましい実施形態の説明（前出）内の表７の記述は、Ｚ５５８５株およびＺ５６２７株の総ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡの重量％［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸濃度、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。平均ＤＣＷは４．７ｇ／Ｌであり、平均ＴＦＡ％ＤＣＷは５４．３であり、平均ＥＰＡ％ＴＦＡは４９．４であり、平均ＥＰＡ％ＤＣＷは２６．８であった。
実施例８
少なくとも約４５のＴＦＡ％ＤＣＷで少なくとも約３６のＥＴＡ％ＴＦＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＹＯＳ９６０７株およびＹＯＳ９６０８株の作成
本実施例は、フラスコアッセイにおいて、ＤＣＷの４５％を超えるＴＦＡで、ＴＦＡの３６％を超えるＥＴＡを産生できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｚ５５６７株（実施例３）に由来するＹＯＳ９６０７株およびＹＯＳ９６０８株の構築を記載する。Ｚ５５６７株中の元の４つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子を欠失させてＹＯＳ９６０７株およびＹＯＳ９６０８株を得て、ＥＰＡの産生なしにＥＴＡを産生できるようにした。
中間体Ｚ５５６７Ｕ株、ＹＯＳ９６０１株、およびＹＯＳ９６０２株（図９）の構築に必要なＹＯＳ９６０７株およびＹＯＳ９６０８株の開発
Ｚ５５６７Ｕ（Ｕｒａ３−）株の作成
Ｕｒａ３遺伝子を中断するために、Ｙ９５０２株のｐＺＫＵＭ形質転換について記載される（実施例１）のと同様の方法で、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図４Ａ；配列番号８２；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｚ５５６７株のＵｒａ３遺伝子にＵｒａ３変異遺伝子を組み込んだ。合計１９個のＣ群の形質転換体が培養され、Ｕｒａ−表現型を有すると同定された。
ＧＣ分析は、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で培養されたｐＺＫＵＭ−形質転換株＃６、＃１１、＃１３、＃１５、および＃１６の中に、３６．９％、３７．０％、３５．６％、３６．８％、および３６．０％のＥＰＡの存在を示した。これらの５株をそれぞれ、Ｚ５５６７Ｕ１４、Ｚ５５６７Ｕ１９、Ｚ５５６７Ｕ２１、Ｚ５５６７Ｕ２３、およびＺ５５６７Ｕ２４、集合的にＺ５５６７Ｕと命名した。
ＹＯＳ９６０７株およびＹＯＳ９６０８株の作成
Ｚ５５６７株中の４つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子は、キメラＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０およびＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：ＯＣＴ遺伝子を含んでなるｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５（図８Ａ；配列番号９６）、およびキメラＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含んでなるｐＺＰ２−８５ｍ９８Ｆ（図８Ｂ；配列番号９７）の２つの異なるコンストラクトからの染色体に最初組み込まれた。これらのキメラ遺伝子を除去するために、３つの別個の相同的組換え事象が必要であった。
最初に、Ｚ５５６７Ｕ株のゲノム中のキメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ遺伝子と、Ｌｅｕ遺伝子の大部分（すなわちｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５から）とが、相同的組換え（図１０Ａ）によって、プラスミドｐＹＰＳ２３４（図１０Ｂ；配列番号９９）内の９９３ｂｐのｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡ断片（配列番号９８）で置き換えられ、ここで９９３ｂｐのｓｔｕｆｆｅｒは、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）カルニチン／アシルカルニチンキャリア遺伝子の５’および３’部分を含んでなった。より具体的には、ｐＹＳＰ２３４プラスミドは、以下の構成要素を含有した。
Figure 2013535987
第１の乗換え事象がＬｙｓ５−５’ＤＮＡ断片内で起きたのに対し、第２の乗換え事象はＹＡＴ１プロモーター領域内で起きた。この相同的組換えから、そのゲノム中に、Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−表現型と、３つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子を有するＹＯＳ９６０１株が生じた。
次にＹＯＳ９６０１株のゲノム中のキメラＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６およびＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：ＯＣＴ遺伝子が、相同的組換え（図１１Ａ）によって、プラスミドｐＹＰＳ２３３（図１１Ｂ；配列番号１０１）内の１０１９ｂｐのｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡ断片（配列番号１００）で置き換えられ、ここで１０１９ｂｐのｓｔｕｆｆｅｒは、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＬＫ２遺伝子の５’および３’部分を含んでなった。ｐＹＳＰ２３３プラスミドは、以下の構成要素を含有した。
Figure 2013535987
第１の乗換え事象がＬｙｓ５−３’ＤＮＡ断片内で起きたのに対し、第２の乗換え事象は３’ＬｅｕまたはＹＡＴ１プロモーター領域内で起きた。この相同的組換えから、Ｌｅｕ−Ｕｒａ−表現型と、ゲノム内に残る１つの機能性Δ５デサチュラーゼ遺伝子とを有するＹＯＳ９６０２株が生じた。
最後に、ＹＯＳ９６０２株のゲノム中のキメラＥＸＰ１：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｌｉｐ１遺伝子を相同的組換え（図１２Ａ）によって、プラスミドｐＹＳＰ２４１（図１２Ｂ；配列番号１０２）内の機能性Ｌｅｕ２遺伝子で置き換えた。ｐＹＳＰ２４１プラスミドは、以下の構成要素を含有した。
Figure 2013535987
第１の乗換え事象が染色体Ｂの位置２８７０１４８と２８７１２５０の間の領域で起きたのに対し、第２の乗換え事象はプラスミドｐＹＳＰ２４１のＥａＤ８Ｓ領域内で起き、それによってＹＯＳ９６０７（Ｕｒａ−）株およびＹＯＳ９６０８（Ｕｒａ−）株が生じた。この相同的組換えから、それぞれゲノム内にＵｒａ−表現型を有し、Δ５デサチュラーゼ遺伝子を有さない、ＹＯＳ９６０７株およびＹＯＳ９６０８株（同一遺伝子型を有する２つの別個のコロニーに相当する）が生じた。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、ＹＯＳ９６０７株およびＹＯＳ９６０８株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ−，Ｐｅｘ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１−，ｕｎｋｎｏｗｎ２−，ｕｎｋｎｏｗｎ３−，ｕｎｋｎｏｗｎ４−，ＹＡＬＩ０Ｅ１２９４７ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ６−，ＹＡＬＩ０Ｂ２１８９０ｇ−，ｕｎｋｎｏｗｎ８−，ｕｎｋｎｏｗｎ１０−，ｕｎｋｎｏｗｎ１１−，ｕｎｋｎｏｗｎ１２−，ｕｎｋｎｏｗｎ１３−，ｕｎｋｎｏｗｎ１４−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ：：Ｐｅｘ２０，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー），ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ９ｅＳ／ＥａＤ８Ｓ：：Ｌｉｐ２，ＧＰＤＩＮ：：ＹｌＤ９：：Ｌｉｐ１，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ，ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ，ＧＰＤＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ１６，ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ，ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１，ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ，ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡ：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１（２コピー），ＥＸＰ１：：ＹｌＰＣＴ：：Ｐｅｘ１６，ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｐｅｘ１６（２コピー），ＦＢＡＩＮｍ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１（２コピー），ＹＡＴ１：：ＹｌＰＤＡＴ：：Ｌｉｐ１（２コピー）。
ＹＯＳ９６０１（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）株、ＹＯＳ９６０２（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）株、ＹＯＳ９６０７（Ｕｒａ−）株、ＹＯＳ９６０８（Ｕｒａ−）株、およびＺ５５６７Ｕ（Ｕｒａ−）対照株の脂肪酸組成および含油量を分析するために、上の一般方法に記載の三連フラスコアッセイを実施した。
表１８は、全ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡの重量％としての各脂肪酸濃度［「％ＴＦＡ」］、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。脂肪酸は表７の通りであり、２０：４（５，１１，１４，１７）はジュニペロン酸を指す。各サンプル中の全脂肪酸の総計は、１００になる。
Figure 2013535987
フラスコ実験のデータは、ＹＯＳ９６０１（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）株がゲノム内に３つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子を含んでなり、約３３のＥＰＡ％ＴＦＡを産生した一方、ＹＯＳ９６０２（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）株は、そのゲノム内に１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子のみを含んでなり、約３０のＥＰＡ％ＴＦＡを産生したことを実証した。対照的に、ＹＯＳ９６０７（Ｕｒａ−）株およびＹＯＳ９６０８（Ｕｒａ−）株はＥＰＡを全く産生できなかったが、約３６％のＥＴＡを産生した。ＹＯＳ９６０７（Ｕｒａ−）株およびＹＯＳ９６０８（Ｕｒａ−）株中のΔ５デサチュラーゼ活性の欠如は、上の全脂肪酸分析によって検証され；ＰＣＲ分析もまた、Δ５デサチュラーゼ遺伝子をコードするあらゆるＤＮＡ配列の欠如を確認した。フラスコアッセイ中において、Ｚ５５６７Ｕ（Ｕｒａ−）株は、Ｚ５５６７株と比較してより少ないＥＰＡ％ＤＣＷを産生した。
実施例９
少なくとも約４９のＴＦＡ％ＤＣＷで少なくとも約５０のＥＰＡ％ＴＦＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８１７４株、Ｙ８１８４株、およびＹ８１８７株の作成
本実施例は、フラスコアッセイにおいて、ＤＣＷの４９％を超えるＴＦＡで、ＴＦＡの約５０％を超えるＥＰＡを産生できる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＹＯＳ９６０７株およびＹＯＳ９６０８株（実施例８）に由来するＹ８１７４株、Ｙ８１８４株、およびＹ８１８７株の構築を記載する。これらの株は、ＹＯＳ９６０７（Ｕｒａ−）株およびＹＯＳ９６０８（Ｕｒａ−）株の染色体に、３つの二重変異Δ５デサチュラーゼを組み込むことで作成され、それによってＥＰＡを産生する形質転換株の能力を復元した。
より具体的には、ＨＰＧＧ［配列番号１８１］およびＨＤＡＳＨ［配列番号１８３］モチーフの双方における変異を含んでなる二重変異Δ５デサチュラーゼ（参照によって本明細書に援用する米国仮特許出願第６１／４２８，２７７号明細書［代理人整理番号ＣＬ５２６７ＵＳＰＲＶ、２０１０年１２月３０日出願］に記載される）は、ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ（配列番号１１０；実施例１１Ｌ）、ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ（配列番号１１２；実施例１１Ｍ）、ＥｇＤ５Ｍ（すなわちＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ；配列番号１０６；実施例１１Ｉ、および１１Ｋ）、およびＥｇＤ５Ｍ１（すなわちＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓ；配列番号１０８；実施例１１Ｊおよび１１Ｋ）からなる群から選択された。
コンストラクトｐＺＲ５ＡＵ−５５５（図１３Ａ；配列番号１１３）を作成して、ＹＯＳ９６０７株およびＹＯＳ９６０８株の染色体Ｃの１６８５３９２および１６８７２６７の間の領域に、３つのキメラ変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわち、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ：：Ｏｃｔ、およびＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ（ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ｇ）：：Ｐｅｘ１６を組み込み、それによってＥＰＡの生成を可能にした。
ｐＺＲ５ＡＵ−５５５プラスミドは、以下の構成要素を含有した。
Figure 2013535987
ｐＺＲ５ＡＵ−５５５のキメラＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ（ＥｇＤ５Ｒ−３４ｇ１５８ｇ）：：Ｐｅｘ１６遺伝子の代わりにキメラＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ１（ＥｇＤ５−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓ）：：Ｐｅｘ１６遺伝子が使用された（すなわちＥｇＤ５−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓが配列番号１０７で記載される）ことを除いては、コンストラクトｐＺＲ５ＡＵ−５５５Ｍ（図１３Ｂ；配列番号１１４）はｐＺＲ５ＡＵ−５５５と同一であった。
一般方法に従って、ｐＺＲ５ＡＵ−５５５およびｐＺＲ５ＡＵ−５５５ＭプラスミドをＡｓｃＩで別々に消化し、次にＹＯＳ９６０７株およびＹＯＳ９６０８株を個々に形質転換するために使用した。形質転換細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に５日間保った。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹して、引き続いて３０℃の液体ＭＭに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集してＨＧＭに再懸濁し、次に２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般方法に従って、細胞に脂肪酸分析を行った。
ＹＯＳ９６０７株中への９６個のｐＺＲ５ＡＵ−５５５ｍ形質転換体のＧＣ分析は、ＴＦＡの５０．８％のＥＰＡを産生する１株（すなわち＃８６）を同定し、この株をＺ８１８４株と命名した。同様に、ＹＯＳ９６０８株中への９６個のｐＺＲ５ＡＵ−５５５形質転換体のスクリーニングは、ＴＦＡの５１．３％のＥＰＡを産生する１株（すなわち＃６８）を同定し、この株をＺ８１７４株と命名した。そしてＹＯＳ９６０８株中への９６個のｐＺＲ５ＡＵ−５５５ｍ形質転換体のＧＣ分析は、ＴＦＡの５１．２％のＥＰＡを産生する１株（すなわち＃５６）を同定し、この株をＺ８１８７株と命名した。
複製フラスコアッセイを実施して、これらの新しいＥＰＡ株脂肪酸の組成および含油量を判定した。表２０は、全ＤＣＷ、ＴＦＡ％ＤＣＷ、ＴＦＡの重量％としての各脂肪酸濃度［「％ＴＦＡ」］、およびＥＰＡ％ＤＣＷを要約する。脂肪酸は表７（前出）の通りに同定され、２０：４（５，１１，１４，１７）はジュニペロン酸を指す。各サンプル中の全脂肪酸の総計は、１００になる。
３株は全て、ＴＦＡの５０％を超えるＥＰＡを産生でき、ＴＦＡはＤＣＷの４９％を超えた。
Figure 2013535987
実施例１０
リノール酸からエイコサジエン酸への変換効率が改善された変異Δ９エロンガーゼ
本実施例は、実施例１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈ、１０Ｉ、および１０Ｊとして本明細書に分けて記載し、配列番号１に記載のアミノ酸
配列を含んでなる変異Δ９エロンガーゼポリペプチドの説明を支持する実験データを記載し、配列番号１は、（ｉ）Ｌ３５Ｆ変異；（ｉｉ）Ｌ３５Ｍ変異；（ｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ変異；（ｉｖ）Ｌ３５Ｇ変異と、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、およびＡ２５４Ｙからなる群から選択される少なくとも１つのその他の変異；（ｖ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｌ１０８Ｇ、およびＩ１７９Ｒ変異；（ｖｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、およびＩ１７９変異；（ｖｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｓ９Ｄ、Ｙ８４Ｃ、およびＩ１７９Ｒ変異；（ｖｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｙ８４Ｃ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；（ｉｘ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｗ１３２Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；（ｘ）Ｋ５８ＲおよびＩ２５７Ｔ変異；（ｘｉ）Ｄ９８Ｇ変異；（ｘｉｉ）Ｌ１３０ＭおよびＶ２４３Ａ変異；および（ｘｉｉｉ）Ｋ５８Ｒ、Ｌ３５Ｆ、Ｌ３５Ｇ、Ｌ３５Ｍ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｄ９８Ｇ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｌ１３０Ｍ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｖ２４３Ａ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、Ａ２５４Ｙ、およびＩ２５７Ｔからなる群から選択される、少なくとも２つの変異を含んでなるあらゆる組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異によって、配列番号３と異なる。実施例１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈ、１０Ｉ、および１０Ｊはまた、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国仮特許出願第６１／３７７２４８号明細書［代理人整理番号ＣＬ４７８３ＵＳＰＲＶ、２０１０年８月２６日出願にも記載される。
実施例１０Ａ：ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、（ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する）合成Δ９エロンガーゼ遺伝子［「ＥｇＤ９ｅＳ」］を含んでなる、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳの構築
キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなり、ＥｇＤ９ｅＳがヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での発現のためにコドン最適化されたミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成Δ９エロンガーゼである、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ベクターｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ（図１４；配列番号１１５）の構築は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，６４５，６０４号明細書の実施例８に記載される。ＥｇＤ９ｅＳ（配列番号２）のヌクレオチド配列は、翻訳開始部位の修正に加えて、７７７ｂｐコード領域の内１１７ｂｐ（１５．１％）が修飾され、１０６コドン（４０．９％）が最適化されているので、野性型ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ（「ＥｇＤ９ｅ」；配列番号３１）のヌクレオチド配列と異なる（それにもかかわらずコドン最適化遺伝子［すなわち配列番号３］によってコードされるタンパク質配列は、野生型タンパク質配列［すなわち配列番号３２］と同一である）。
実施例１０Ｂ：Δ９エロンガーゼ変換効率の増大した変異Δ９エロンガーゼを含んでなるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体を分析するための一般的な方法
本実施例は、誤りがちなポリメラーゼ連鎖反応［「ｅＰＣＲ」］ライブラリー（実施例１０Ｃ）、部位飽和ライブラリー（実施例１０Ｅ）、ＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）ライブラリー（実施例１０Ｇ）、またはコンビナトリアルライブラリー（実施例１０Ｉ）（後述）中で作成され、非変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子（配列番号９（「対照」または「野生型」と称される）または様々な変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子のいずれかを発現する、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株（野生型ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自律突然変異からのＦＯＡ耐性変異体［単離は国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの実施例７に記載される］）のｐＺＵＦｍＥｇＤ９ＥＳ形質転換体内の脂質プロファイルを分析する、一般的手段を記載する。
変異体ライブラリーの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）への形質転換
電気穿孔によって、各変異体ライブラリーからのプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ １０エレクトロコンピテント細胞（カタログ番号Ｃ４０４０５２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。形質転換細胞を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン添加ルリア・ベルターニ［「ＬＢ」］寒天プレート上に塗り広げ、３７℃のインキュベーター内で一晩培養した。製造業者のプロトコルに従って、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出した。
次に一般方法に記載されるようにして、ＤＮＡ分子をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株に形質転換し、形質転換体をＭＭプレート上で選択した。３０℃での培養の２日後、ＭＭプレート上で選択された形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線塗抹した。
迅速スクリーニングプレートアッセイ
各変異体ライブラリーの予備機能解析のために、迅速スクリーニング「プレートアッセイ」を使用した。このプレートアッセイのためには、上の再画線塗抹ＭＭプレートからのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体を培地プレートから直接分析した。水酸化トリメチルスルホニウム［「ＴＭＳＨ」］を使用して、ＦＡＭＥを調製した。
ＴＭＳＨは、メタノール中における酸化銀との反応による水酸化物溶液への転換後に、ヨウ化トリメチルスルホニウム［「ＴＭＳＩ」］から調製された。具体的には、４．４ｇのＴＭＳＩを１００ｍＬのＭｅＯＨに混合し、５０℃の水浴中で１時間インキュベートして；次に５ｇのＡｇ２Ｏを溶液に添加し、室温で４時間撹拌した。最終溶液を使用前に濾過した。ＴＭＳＨは、Ｏ−アシル脂質（すなわちＴＡＧ）の塩基触媒エステル交換と、遊離脂肪酸のエステル化を引き起こした（Ａ．Ｈ．Ｅｌ−Ｈａｍｄｙ ＆ Ｗ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｊ．ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，６３０：４３８−４４１（１９９３））。
１μｌループを使用して、再画線塗抹ＭＭプレートから細胞を直接取り、０．３５ｍＬインサート付きガスクロマトグラム［「ＧＣ」］バイアル内の５０μｌのＴＭＳＨに懸濁した。次にヘプタン（１５０μｌ）をバイアルインサートに添加し、バイアルに蓋をして、次に室温で撹拌しながら２０分間インキュベートした。引き続いてＦＡＭＥのＧＣ分析のために、Ｏｍｅｇａｗａｘ ３２０溶融シリカキャピラリーカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を装着したＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ７８９０ ＧＣに、ヘプタン層からの１μｌを注入した。滞留時間を市販の標準物質（標準＃４６１，Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）からのメチルエステルと比較した。
ＥｇＤ９ｅＳ変異体を含んでなる細胞から得られたＦＡＭＥプロファイルを非変異ＥｇＤ９ｅＳ対照のものと比較した。この一次スクリーニングの結果は、二次確認アッセイを実施する変異体の選択の基礎としての役割を果たした。確認アッセイのための変異体を選択するのに使用される基準は、脂質プロフィール、特に全ての総合ピークの合計［「ＥＤＡ％ＴＦＡ」］と比較したパーセントとして対応するＦＡＭＥのＧＣピーク面積から計算されるＥＤＡの濃度、および／またはＬＡからＥＤＡへの変換効率に基づいた。各形質転換体のＬＡからＥＤＡへの変換効率［「％変換」］は、次式に従って計算された。
（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００
式中、生成物はＥＤＡ％ＴＦＡであり、基質はＴＦＡの面積パーセントとしてのＬＡ濃度［「ＬＡ％ＴＦＡ」］であった。
「確認」アッセイ
迅速スクリーニング「プレートアッセイ」により、対照と比較してΔ９伸長活性の改善が実証されたＥｇＤ９ｅＳ変異体を引き続く確認アッセイのために選択した。
ＥｇＤ９ｅＳ変異体を含んでなるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体を最初にＭＭプレート上に再画線塗抹して、次に個々の形質転換体を３０℃の３ｍＬの液体ＭＭの三連培養物に接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集して脂質を抽出し、ナトリウムメトキシドでの脂質抽出物のエステル交換によってＦＡＭＥを調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｄａ Ｉ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６（１９９０））、引き続いてプレートアッセイ（前出）で記載されたようにして、ＧＣによって分析した。
Δ９伸長活性の改善の確認に続いて、製造会社が推奨する通りに、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ（商標）Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＩＩキット（カタログ番号Ｄ２００４；Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、各変異ｐＺＵＦｍＥｇＤ９ＥＳプラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株形質転換体から回収した。
レスキューしたプラスミドを、ベクターおよび挿入特異的プライマーを用いたダイターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書；欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ自動配列決定装置上で配列決定した。遺伝子配列の比較は、当該技術分野で周知の標準ツールを使用して達成した。
実施例１０Ｃ：２つのＥｇＤ９ｅＳ誤りがちなＰＣＲライブラリーの構築
本実施例は、２つのΔ９エロンガーゼ誤りがちなポリメラーゼ連鎖反応［「ｅＰＣＲ」］ライブラリーの合成を記載する。２つのｅＰＣＲライブラリーは二段法で作成され、それは、最初にテンプレート内にランダム変異を含んでなる一連のメガプライマーの生成を要し、これらのメガプライマーを使用したｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ中の点変異の作成がそれに続いた。コンストラクトｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ（配列番号１１５）（実施例１０Ａ）を第１のｅＰＣＲライブラリーのためのＤＮＡテンプレートとして使用した。第２のｅＰＣＲライブラリーは、第１のｅＰＣＲライブラリーのスクリーニングからのヒットをＤＮＡテンプレートとして使用した。
ランダム変異誘発キットを使用したメガプライマーの作成
ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩランダム変異誘発キット（カタログ番号２００５５０；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、標的タンパク質中にランダムアミノ酸置換を作成した。それは、ＧおよびＣとの対比でＡおよびＴにおいて同等の変異率がある、偏りのより少ない変異スペクトルを生じる、２種の異なるポリメラーゼの組み合わせを含んでなる、新しい誤りがちなＰＣＲ酵素混合組成を使用して、誤りがちなＰＣＲ中に、標的遺伝子に変異を導入することで機能する。生成物の高収率のために最適化された緩衝液条件の単一セットを使用して、１ｋＢあたり１〜１６個の変異の変異率が達成され得ると宣伝されている。所望の変異率は、単に、反応中の最初のテンプレートＤＮＡ量および／または実施される増幅サイクル数を変えることで制御し得る。
製造会社が推奨するプロトコルを使用して、上のキットを利用し、ＥｇＤ９ｅＳ「メガプライマー」を作成した。これらのメガプライマーは約９３０ｂｐの長さであり、ＥｇＤ９ｅＳ（配列番号２）をコードする７７７ｂｐを含んでなった。反応混合物は、１μｌの第１のｅＰＣＲライブラリーあたり１６ｎｇのＤＮＡテンプレート、または１μｌの第２のライブラリーあたり２．０ｎｇのＤＮＡテンプレートのいずれかを含有した。それはまた、反応緩衝液、ｄＮＴＰ（０．８ｍＭ）、プライマーｐＺＵＦｍ＿６９８０＿０１２２０８ｆ（配列番号１１６）（２μＭ）、プライマーｐＺＵＦｍ＿４０＿０１２２０８ｒ（配列番号１１７）（２μＭ）、およびＭｕｔａｚｙｍｅ（登録商標）ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（０．２５Ｕ／μｌ）も含んでなった。ＰＣＲ反応は、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ勾配装置（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）内の薄壁２００μｌ管内で実施した。以下の条件を使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。９５℃で２分間、それに続く９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で９０秒間の伸長を３０サイクル。７２℃で４分間の最終伸長サイクルを実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。
製造会社が推奨する通り、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５キット（カタログ番号Ｄ４００３；Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲ産物を精製した。精製二本鎖ＰＣＲ産物をそれぞれＥｇＤ９ｅＳ内に様々な変異を含有する「メガプライマー」として利用した。
ＥｇＤ９ｅＳのＰＣＲ変異遺伝子を作成する標準クローニング法
第１のｅＰＣＲライブラリーのために、「メガプライマー」をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化した。次に室温で５時間の連結反応によって、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ゲル精製ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ遺伝子断片をゲル精製ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ｐＺＵＦｍＥｇＤ９ＥＳベクター（配列番号１１５）に直接ライゲートした。
ＥｇＤ９ｅＳのｅＰＣＲ変異遺伝子を作成する部位特異的変異誘発
第２のｅＰＣＲライブラリーを作成するために、ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ（図１４；配列番号１１５）に、「メガプライマー」内のＥｇＤ９ｅＳ変異体を導入するようにデザインされた反応中で、上述の「メガプライマー」を利用し、それによって非変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子を様々な変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子で置換した。これは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ ＸＬ部位特異的変異誘発キット（カタログ番号２００５２４；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して達成された。
双方のプラスミド鎖の変異原性プライマー誘導複製のための高忠実度ＰｆｕＵｌｔｒａ
ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ部位特異的変異誘発キットを使用して、二本鎖ベクター中の関心のあるインサート内に点変異を作成し、アミノ酸を置換して、単一／複数の隣接するアミノ酸を消去しまたは挿入した。キットは、特化ベクター、特有な制限酵素認識部位、または複数形質転換を必要とせず、実質的にあらゆる二本鎖プラスミド中において、部位特異的変異を可能にする。基本的手順は、どちらも所望の変異を含有してベクターの逆ストランドに相補的であり、温度サイクル中にプライマーの転置なしに、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される、２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを利用する。オリゴヌクレオチドプライマーの伸長からは、互い違いに位置するニックを含有する変異プラスミドが生成し、次にそれをＤｐｎ Ｉエンドヌクレアーゼで処理した。この制限酵素はメチル化および半メチル化ＤＮＡに対して特異的であり、それによって親ＤＮＡテンプレートの消化と、変異含有合成ＤＮＡの選択を可能にする。次に所望の変異を含有するニックのあるベクターＤＮＡを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）宿主に形質転換して、増殖させる。
しかし本手順では、従来の合成オリゴヌクレオチドプライマーの代わりに、様々な変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子を含んでなる二本鎖メガプライマーを使用した。具体的には、キットが提供する５．０μｌの１０×反応緩衝液、１．０μｌの５０ｎｇ／μｌ ｐＺＵＦｍＥｇＤ９ＥＳテンプレート（配列番号１１５）、４２μｌのメガプライマー、キットが提供する１．０μｌの４０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、およびキットが提供する１．０μｌのＰｆｕ−Ｕｌｔｒａ ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる、５０μｌの反応を調製した。この反応混合物を薄壁２００μｌ容量ＰＣＲ管に入れ、以下の条件を使用してＰＣＲ増幅を実施した。９５℃で３０秒間、それに続く９５℃で３０秒間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、および６８℃で６分間の伸長を２５サイクル。６８℃で８分間の最終伸長サイクルを実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。
完了した部位特異的変異誘発反応混合物に、キットが提供するＤｐｎＩ制限酵素（１．０μｌ）を直接添加し、酵素消化を３７℃で１時間実施してＤＮＡテンプレートを除去した。ＤＮＡ浄化キット（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して消化生成物を精製して溶出し、ｐＺＵＦｍＥｇＤ９ＥＳベクター主鎖内に含有される様々な変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子を含んでなる、１０μｌの精製ＤＮＡを得た。
実施例１０Ｄ：Δ９エロンガーゼ変換効率の改善を有するｅＰＣＲＥｇＤ９ｅＳライブラリー変異体の同定
本実施例は、１）野生型タンパク質ＥｇＤ９ｅＳ（配列番号３）と比較して、ＬＡからＥＤＡへのΔ９エロンガーゼ変換効率が改善されたＥｇＤ９ｅＳ ｅＰＣＲライブラリー変異体の同定；および２）これらのＥｇＤ９ｅＳ ｅＰＣＲライブラリー変異体の配列分析を記載する。
ＥｇＤ９ｅＳ ｅＰＣＲ変異体の同定
実施例１０Ｂに記載されるようにして、実施例１０Ｃで調製されたｅＰＣＲ遺伝子ライブラリー変異体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ １０エレクトロコンピテント細胞に形質転換して精製し、引き続いてＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株に形質転換した。実施例１０Ｂの迅速スクリーニング「プレートアッセイ」を使用して、１，７２４個のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）形質転換体の脂肪酸プロファイルをスクリーニングした。これらの変異体のほとんどは、対照と比較して低下した活性を呈示した。しかし５つの形質転換体は、実施例１０Ｂの確認アッセイに基づいて、対照と比較して改善されたΔ９伸長活性を呈示することが確認された。
２つの独立した確認アッセイからのデータを表２１および表２２に提示し、個々のｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ対照形質転換体のＦＡＭＥプロファイルをｅＰＣＲ変異体と比較する。より具体的には、各株について、（実施例１０Ｂに記載されるようにして判定される）対応するＦＡＭＥのＧＣピーク面積から、全ての総合ピークの合計と比較したパーセントとして計算される各脂肪酸濃度［「％ＴＦＡ」］、およびＬＡからＥＤＡへの％変換を下の表２１および表２２に示し、平均値は灰色で強調され「平均」として示される。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、およびＥＤＡとして同定される。ＥｇＤ９ｅＳ対照と比較した各変異体の性能比較は、変異体がその中で分析される特定の確認アッセイ内のみで実施すべきである（すなわちアッセイ＃１とアッセイ＃２の間では比較を実施し得ない）。
Figure 2013535987
Figure 2013535987
上に示す確認アッセイ＃１中のデータを要約すると、非変異コドン最適化ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子を含んでなるｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳで形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株のクローンは、平均で３．１のＥＤＡ％ＴＦＡを産生し、これらの５つのクローン中のＬＡからＥＤＡへの平均変換効率［「％変換」］は、約１５．５％と判定された。対照的に、変異株１．２ｅｐ−８のＬＡからＥＤＡへの平均％変換は１７．８％（または対照との比較で１１５％）であり；変異株１．９ｅｐ−６３の平均％変換は１６．３％（または対照との比較で１０５％）であり；変異株１．４ｅｐ−１６１の平均％変換は１６．４％（または対照との比較で１０６％）であった。
確認アッセイ＃２では、ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳで形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株のクローンは、２．９のＥＤＡ％ＴＦＡを産生し、これらの４株中のＬＡからＥＤＡへの平均％変換は約１６．９％と判定された。変異株２．１ｅｐ−９４のＬＡからＥＤＡへの平均％変換は１９．８％（または対照との比較で１１７％）であり；変異株２．１ｅｐ−９５の平均％変換は１８．８％（または対照との比較で１１１％）であった。
したがってこれらの実験は、ＥｇＤ９ｅＳ ｅＰＣＲ変異体１．２ｅｐ−８、１．９ｅｐ−６３、１．４ｅｐ−１６１、２．１ｅｐ−９４、および２．１ｅｐ−９５によって呈示された、Δ９エロンガーゼ変換効率の改善を確認した。
ＥｇＤ９ｅＳ ｅＰＣＲ変異体の配列
変異体１．２ｅｐ−８、１．９ｅｐ−６３、１．４ｅｐ−１６１、２．１ｅｐ−９４、および２．１ｅｐ−９５からレスキューされたプラスミドをＤＮＡ配列決定によって特性解析し、解析は、表２３に示されるように、変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子内の様々なヌクレオチド置換、および発現されるアミノ酸の置換を明らかにした。各変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子に、および変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子を含んでなる各変異ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳプラスミドに、アミノ酸置換を示唆する名称を与えた。列挙される各置換（すなわちＬ３５Ｇ）について、第１の文字は非変異ＥｇＤ９ｅＳ（すなわち配列番号３）中のアミノ酸に対応し、第２の文字は変異体中の同じ位置に見られるアミノ酸に対応し、すなわちＬ３５Ｇは、位置３５のＥｇＤ９ｅＳからＥｇＤ９ｅＳ変異体中のＧｌｙへの変化を示す）。
Figure 2013535987
したがって、例えば変異体１．２ｅｐ−８からレスキューされたプラスミドは、２つのヌクレオチド置換（すなわちＣ１０３ＴおよびＡ６５４Ｇ）を含んでなった。これらの２つのヌクレオチド置換は、１つの発現されるアミノ酸置換（すなわちＬ３５Ｆ）、および１つのサイレントアミノ酸変異（すなわちＧ２１８Ｇ；ＧＧＡおよびＧＧＧはどちらもＧｌｙをコードするため、Ａ６５４Ｇヌクレオチド置換の結果として、このアミノ酸は変異タンパク質中で無変化である）に相当する。アミノ酸変化Ｌ３５ＦをもたらすＣ１０３ＴおよびＡ６５４Ｇ変異を含んでなるプラスミドがｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ−Ｌ３５Ｆ（配列番号１２０）と命名された一方、その中の変異Δ９エロンガーゼのヌクレオチド配列は「ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｆ」（配列番号１１８）と命名され、配列番号１１９に記載のタンパク質配列を有した。
実施例１０Ｅ：２部位飽和ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子ライブラリーの構築
本実施例は、ＥｇＤ９ｅＳ（配列番号３）内のアミノ酸位置３５および１０７の標的化によって作成された、部位飽和［「ＳＳ」］ライブラリーの合成を記載する。位置３５を標的化する理論的根拠が実施例１０Ｄの結果に基づいたのに対し、位置１０７を標的にする理論的根拠は後述される。ＳＳライブラリーは二段法で作成され、それは、最初にテンプレート内に標的化変異を含んでなるメガプライマーの生成を要し、これらのメガプライマーを使用したｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ中の点変異の作成がそれに続いた。
ＥｇＤ９ｅＳの位置１０７を標的にする理論的根拠
最初に、配列比較のＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法を使用して、下の表２４に記載される１７個の脂肪酸エロンガーゼのアミノ酸配列を配列比較した。
Figure 2013535987
デフォルトパラメータ（すなわちｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ ２５０、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝０．２および全長配列比較アルゴリズム）で、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗパッケージ（バージョン１．８３）を使用して、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４））によって記載されるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ配列比較法を実施した。配列比較結果を（図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ、１５Ｅ、１５Ｆ、１５Ｇ、および１５Ｈを含んでなる）図１５に示す。「Ｔｒａｃｅ＿１」、「Ｔｒａｃｅ＿２」、「Ｔｒａｃｅ＿３」、および「Ｔｒａｃｅ＿４」は、下で定義される機能性Ｉ群、ＩＩ群、ＩＩＩ群、およびＩＶ群の各列のコンセンサスを表し、すなわちＴｒａｃｅ １は、Ｃｉ＿ｅｌｏ、Ｏｍ＿ｅｌｏ、Ｍｐ＿ｅｌｏ１、Ｐｐ＿ｅｌｏ１、Ｍｐ＿ｄ５ｅ、およびＯｔ＿ｅｌｏ１を含んでなるＧｒｏｕｐＩ中のタンパク質配列のコンセンサスを表す。各列のコンセンサスは、以下のように定義された。具体的には、列が完全に保存されているならば、コンセンサスは、大文字で示される保存アミノ酸として表される。物理化学的特性の観点から列が保存されている場合、コンセンサスは小文字で表され、「ｋ」はアミノ酸ＤおよびＥ（負の電荷）を表し、「ｑ」はアミノ酸Ｈ、Ｋ、およびＲ（正の電荷）を表し、「ｐ」はアミノ酸ＮおよびＱ（極性）を表し、「ａ」はアミノ酸Ｉ、Ｌ、およびＶ（脂肪族）を表し、「ｄ」はアミノ酸Ｆ、Ｗ、およびＹ（芳香族）を表し、「ｈ」はアミノ酸ＡおよびＧ（小型）を表し、「ｓ」はアミノ酸Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、およびＴ（親水性）を表し、「ｆ」はアミノ酸Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｃ、およびＭ（疎水性）を表す。列が保存されていない場合、コンセンサスは大文字「Ｘ」で表された。
近隣結合系統樹は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ配列比較から作成された。系統樹トポロジーに基づいて、異なる基質特異性の官能基に相当すると仮定された４群に、１７個の配列を分割した。Ｉ群は、Ｃｉ＿ｅｌｏ、Ｏｍ＿ｅｌｏ、Ｍｐ＿ｅｌｏ１、Ｐｐ＿ｅｌｏ１、Ｍｐ＿ｄ５ｅ、およびＯｔ＿ｅｌｏ１を含んでなり；ＩＩ群は、Ｐａｖ＿ｅｌｏ２、Ｐｓ＿ｅｌｏ２、およびＯｔ＿ｅｌｏ２を含んでなり；ＩＩＩ群は、Ｅａ＿ｄ９ｅ、Ｅｇ＿ｄ９ｅ、Ｅ３９８＿ｄ９ｅ、およびＩｇ＿ｄ９ｅを含んでなり；ＩＶ群は、Ｔｐ＿ｅｌｏ２、Ｔｐ＿ｅｌｏ１、Ｍａ＿ｄ６ｅ、およびＴｈ＿ｅｌｏ２を含んでなる。
図１５の配列比較および近隣結合系統樹の分類を考慮して、以下の結論が導かれた。第１にいくつかの位置は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ群内で、１７配列の全てにわたり完璧に保存されている。これらの位置は、エロンガーゼの触媒活性に恐らく必須であると見なされ、したがって変異標的から除外された。いくつかの位置は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ群内の配列のいくつかのみで保存された（すなわち完璧に保存されなかった）。これらの位置は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ群の官能基内のエロンガーゼによって呈示される基質特異性に恐らく重要であると見なされた。いくつかの位置は、ＩＩＩ群（４つの既知のΔ９エロンガーゼを全て含んでなる）内で比較的保存されが、バリエーションもまた呈示された；ＥｇＤ９ｅの番号を付けに基づく、アミノ酸位置２２、４７、５４、１０１、１０７、１１１、１１５、１６１、１８２、１９２、および２４２を参照されたい。これらの位置は、Δ９エロンガーゼの活性に恐らく重要であると見なされ、Ｅａ＿ｄ９ｅ（配列番号３４）、Ｅｇ＿ｄ９ｅ（配列番号３２）、Ｅ３９８＿ｄ９ｅ（配列番号３８）、およびＩｇ＿ｄ９ｅ（配列番号４２）の基質特異性の相違を調節すると仮定された。
ＴＭＨＭＭプログラム（「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ
ｈｅｌｉｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＢｉｏＣｅｎｔｒｕｍ−ＤＴＵ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ，ＤＫ−２８００ Ｌｙｎｇｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、ＥｇＤ９ｅＳ内の膜貫通ドメイン［「ＴＭ」］の分析を実施した。予測は、ＮおよびＣ末端の双
方が細胞質側に位置する、６個の膜貫通らせん（アミノ酸残基３２〜５１、６６〜８８、１１４〜１３６、１５６〜１７５、１８８〜２０６、２２１〜２４３に相当する）を示唆した。ＴＭＨＭＭプログラムを使用して、Ｏｔ＿ｅｌｏ２、Ｉｇ＿ｅｌｏ１、Ｐａｖ＿ｅｌｏ２、およびＴｐ＿ｅｌｏ２を同様に分析すると、膜貫通らせん数は４〜８個で変動した。したがって、これらの変動する予測を統合するために、以下のいくつかの機能性情報を使用した。
１．高度に保存されたヒスチジンに富むモチーフ［Ｑ／Ｈ］ｘｘＨＨ（「Ｈｉｓ−ｂｏｘ」）は、Ｉｇ＿ｄ９ｅ（配列番号４２）の最適酵素活性に必須であることが示されているが、基質特異性の直接原因ではない（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５４７：１３７−１３９（２００３））。したがって、これはＨｉｓ−ｂｏｘ（ＥｇＤ９ｅＳ中のアミノ酸残基１３４〜１３８に相当する）が活性部位に関与することを強力に示唆し；基質が活性部位にアクセスし得るように、それは折り畳みタンパク質の細胞質側またはその近くに位置しなくてはならない。
２．荷電残基があるいくつかの高度に保存された位置が、ＥｇＤ９ｅＳのＣ末端に存在する。それらは恐らく活性と関係があり、したがってＣ末端は折り畳みタンパク質の細胞質側に位置する。
Ｈｉｓ−ｂｏｘは膜の外面に位置し得ないので、アミノ酸残基１１４〜１３６間、およびアミノ酸残基１５６〜１７５間の膜貫らせんを予測するＴＭＨＭＭ結果とは対照的に、上の考察は、残基１１４〜１３６間の配列領域が膜を貫通しないことを示唆する。Ｃ末端が細胞質側に位置する場合、１５６〜１７５間の予測されたＴＭドメインもまた膜を貫通しない。エロンガーゼの基質は高度に疎水性であるので、それは恐らく脂質二重層中に分配される。（Ｈｉｓ−ｂｏｘをはじめとする）活性部位は、膜表面またはその非常に近くにあってもよい。
したがって本明細書では、これらの２つの疎水性領域（すなわちアミノ酸残基１１４〜１３６およびアミノ酸残基１５６〜１７５に相当する）は、内膜小葉中またはその近くに位置して、活性部位が膜に近いことを確実にすることが予測される。ＥｇＤ９ｅＳについて予測された最終的な膜トポロジーモデルを図１６Ａに示す。具体的には、各垂直円柱が膜貫通断片を示す一方、各水平円柱は内膜小葉の中または近くに位置する疎水性ストレッチを示す。Ｈｉｓ−ｂｏｘ（すなわちアミノ酸残基１３４〜１３８に相当する）内の保存されたＧｌｎ［Ｑ］およびＨｉｓ［Ｈ］は、小さな丸で示される。最後に、「中」が細胞質空間に対応するのに対し、「外」は細胞質空間に相当する。
保存パターン解析が、ＩＩＩ群Δ９脂肪酸エロンガーゼ内に、酵素活性に影響を及ぼすと予測された１１個の異なるアミノ酸残基（すなわちＥａ＿ｄ９ｅ［配列番号３４］、Ｅｇ＿ｄ９ｅ［配列番号３２］、Ｅ３９８＿ｄ９ｅ［配列番号３８］、およびＩｇ＿ｄ９ｅ［配列番号４２］）を同定したのに対し、予測されたトポロジーモデルからの結果は、候補残基をさらに限定した。具体的には、酵素活性にとって重要な位置は、活性部位がある細胞質側またはその近くになくてはならないと理由付けられた。アミノ酸残基４７、５４、および１９２は、この基準を満たせず、したがってそれらはΔ９エロンガーゼの活性を調節する上で重要であり得ないと推測された。
上の理論的根拠に基づいて、ＥｇＤ９ｅＳの９エロンガーゼ活性に恐らく顕著に影響を及ぼす候補残基は、配列番号３の完全長タンパク質内の２５８残基から、位置２２、１０１、１０７、１１１、１１５、１６１、１８２、および２４２に相当する、わずか８残基に減少した。これらの８つの位置は、ＥｇＤ９ｅＳの基質変換率を改善するための部位特異的変異誘発の標的として推奨された。下の実験データは、位置１０７を標的とした。
部位飽和ライブラリー構築のためのメガプライマーの作成
オリゴヌクレオチドＥｇＤ９Ｅ＿１０２＿０５３００８ｆ（配列番号１４６）およびＥｇＤ９Ｅ＿７６０＿０５３００８ｒ（配列番号１４７）をデザインして、それぞれＥｇＤ９ｅＳ（配列番号３）のアミノ酸残基３５および１０７を標的とした。これらのオリゴヌクレオチドの商業的合成に続いて、それらをＰＣＲ反応で利用して、ＳＳライブラリー構築で使用するための適切なメガプライマーを作成した。具体的には、Ｐｆｕ−Ｕｌｔｒａポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に提供される５．０μｌの１０×反応緩衝液、１．０μｌの５０ｎｇ／μｌ ＥｇＤ９ｅＳ（配列番号２）、１．０μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマーＥｇＤ９Ｅ＿１０２＿０５３００８ｆ（配列番号１４６）、１．０μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌプライマーＥｇＤ９Ｅ＿７６０＿０５３００８ｒ（配列番号１４７）、１．０μｌの４０ｍＭ ｄＮＴＰミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１．０μｌの高忠実度Ｐｆｕ−Ｕｌｔｒａ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および４０μｌの水を含有する、５０μｌの反応混合物を調製した。Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ勾配装置（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）内におけるＰＣＲ反応のために、混合物を薄壁２００μｌ管に入れた。以下の条件を使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。９５℃で３０秒間、それに続く９５℃で３０秒間の変性、５４℃で１分間のアニーリング、および７２℃で２分間の伸長を３０サイクル。７２℃で４分間の最終伸長サイクルを実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。
製造会社が推奨する通りに、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５キット（カタログ番号Ｄ４００３；Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲ産物を精製した。精製二本鎖ＰＣＲ産物は、それぞれＥｇＤ９ｅＳ内に様々な変異を含有する「メガプライマー」として利用した。
ＥｇＤ９ｅＳの部位飽和変異遺伝子を作成する部位特異的変異誘発
次に、ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ（図１４；配列番号１１５）に、「メガプライマー」内のＥｇＤ９ｅＳ変異体を導入するようにデザインされた反応中で、上述の「メガプライマー」を利用し、それによって非変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子を様々な変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子で置換した。これは、実施例１０Ｃに記載されるように、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ ＸＬ部位特異的変異誘発キット（カタログ番号２００５２４；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して達成された。具体的には、部位特異的変異誘発反応組成物および増幅条件は、実施例１０Ｃに記載されるのと同一であり、ＤｐｎＩ制限酵素およびＤＮＡ浄化方法についても同様であった。
実施例１０Ｆ：Δ９エロンガーゼ変換効率が改善されたＥｇＤ９ｅＳ部位飽和ライブラリー変異体の同定
本実施例は、１）野生型タンパク質ＥｇＤ９ｅＳ（配列番号３）と比較して、ＬＡからＥＤＡへのΔ９エロンガーゼ変換効率が改善されたＥｇＤ９ｅＳ変異体の同定；および２）これらのＥｇＤ９ｅＳ変異体の配列分析を記載する。
ＥｇＤ９ｅＳ部位飽和変異体の同定
実施例１０Ｂに記載されるようにして、実施例１０Ｅで調製されたＳＳライブラリー変異体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ １０エレクトロコンピテント細胞に形質転換して精製し、引き続いてＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株に形質転換した。実施例１０Ｂの迅速スクリーニング「プレートアッセイ」を使用して、ＳＳライブラリーからのコンストラクトによる５１０個のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）形質転換体の脂肪酸プロファイルを分析した。３つの形質転換体が、実施例１０Ｂの確認アッセイに基づいて、対照と比較して改善されたΔ９伸長活性を呈示することが確認された。
確認アッセイからのデータを表２５に提示し、個々のｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ対照形質転換体のＦＡＭＥプロファイルをＳＳライブラリー変異体と比較する。より具体的には、各株について、（実施例１０Ｂに記載されるようにして判定される）ＴＦＡの面積パーセントとしての各脂肪酸濃度［「％ＴＦＡ」］、およびＬＡからＥＤＡへの％変換を下の表２５に示し、平均値は灰色で強調され「平均」として示される。脂肪酸は、実施例１０Ｄの略称に基づいて同定される。
Figure 2013535987
確認アッセイでは、非変異コドン最適化ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子を含んでなるｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳで形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株のクローンは、平均で３．５のＥＤＡ％ＴＦＡを産生し、これらの４株中のＬＡからＥＤＡへの平均変換効率［「％変換」］は、約１８．７％と判定された。比較すると、変異株２．４ｓｄ２−２４のＬＡからＥＤＡへの平均％変換は２７．２％（または対照との比較で１４５％）であり；変異株２．４ｓｄ２−５２の平均％変換は２６．６％（または対照との比較で１４２％）であり；変異株２．４ｓｄ２−５３の平均％変換は２４．６％（または対照との比較で１３２％）であった。したがってこのアッセイは、部位飽和変異体２．４ｓｄ２−２４、２．４ｓｄ２−５２、および２２．４ｓｄ２−５３によって呈示された、Δ９エロンガーゼ変換効率の改善を確認した。
ＥｇＤ９ｅＳ部位飽和変異体の配列
変異体２．４ｓｄ−２４、２．４ｓｄ−５２、および２．４ｓｄ−５３からレスキューされたプラスミドをＤＮＡ配列決定によって特性解析し、解析は、表２６に示されるように、変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子内の様々なヌクレオチド置換、および発現されるアミノ酸の置換を明らかにした。各変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子に、および変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子を含んでなる各変異ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳプラスミドに、アミノ酸置換を示唆する名称を与えた。
Figure 2013535987
当業者には明白であるように、出願人らは、遺伝コードの縮重に基づいて、多様なヌクレオチド配列が、例えばＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇに記載のタンパク質をコードし得ることを認識する。したがって、例えばアミノ酸残基位置３５で配列番号４４に記載の変異タンパク質中でコードされるＧｌｙは、ＧＧＧ（配列番号４３に記載のΔ９エロンガーゼ読み取り枠［「ＯＲＦ」］）、ＧＧＡ（配列番号１５２に記載のΔ９エロンガーゼＯＲＦ）、ＧＧＣ（配列番号１５３に記載のΔ９エロンガーゼＯＲＦ）、およびＧＧＴ（配列番号１５４に記載のΔ９エロンガーゼＯＲＦ）によってコードされ得る。コードされたタンパク質中にサイレント変異をもたらす多様なその他のヌクレオチド置換もまた検討され、したがってＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ（配列番号４４）をコードする本明細書で提供されるヌクレオチド配列は、本開示を制限するものと解釈すべきでない。本発明の変異タンパク質をコードして、Δ９エロンガーゼ活性を有する、本明細書に記載されるヌクレオチド配列のいずれかの中における同様のバリエーションが検討された。
実施例１０Ｇ：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ ＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）ライブラリーの作成
本実施例は、親酵素と比べてＬＡからＥＤＡへの変換効率の４２〜４５％の改善を実証した、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ変異体（配列番号４４；実施例１０Ｆ）内の５０個の異なったアミノ酸位置を標的にすることで作成された、ＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）ライブラリーの合成を記載する。したがって本実施例は、Ｌ３５変異を含んでなるＥｇＤ９ｅＳ変異体中に「スタック」し得る、追加的な有益な変異を同定することを求めた。
下でさらに詳細に記載する自動ロボットプラットフォームであるＳｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）は、ＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）ライブラリーを作成し、配列位置あたりの変異体数およびそれらの比率を非常に正確に制御し得る。したがって自動工程は、部位飽和ライブラリー（実施例１０Ｅ）作成時に考察された限定的残基とは対照的に、Δ９エロンガーゼ活性に対するそれらの影響を判定するために、実験的に検査し得る候補残基数を大幅に増大させ得る利点を提供する。
機能部位評価のためにＥｇＤ９ｅＳ内の５０個の異なった残基を標的にする理論的根拠
Δ−９エロンガーゼは、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）［「ＩｇＤ９ｅ」］（配列番号４２；国際公開第２００２／０７７２１３号パンフレット、国際公開第２００５／０８３０９３号パンフレット、国際公開第２００５／０１２３１６号パンフレット、および国際公開第２００４／０５７００１号パンフレット；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＬ３７６２６）、ユートレプチエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）ＣＣＭＰ３８９種［「Ｅ３８９Ｄ９ｅ」］（配列番号３８；米国特許第７，６４５，６０４号明細書）、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）［「ＥｇＤ９ｅ」］(配列番号３２；米国特許第７，６４５，６０４号明細書）、およびＥ．アナベナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）［「ＥａＤ９ｅ」］（配列番号３４；米国特許第７，７９４，７０１号明細書）から同定され、機能解析されている。これらの各エロンガーゼは、ＬＡをＥＤＡに変換できることが示されている。（デフォルトパラメータ（すなわちｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ ２５０、ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝０．２、および全長配列比較アルゴリズムを使用したＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（バージョン１．８３）分析に基づいて）ＥｇＤ９ｅ、ＥａＤ９ｅ、およびＥ３８９Ｄ９ｅが、互いに６０％を超える配列類似性を共有するのに対し、ＩｇＤ９Ｅは、ＥｇＤ９ｅ、ＥａＤ９ｅ、およびＥ３８９Ｄ９ｅのいずれか１つとわずか約３５％の配列類似性を共有する。
Δ９エロンガーゼ変換効率が改善されている変異体（例えばＤ９８Ｇ［実施例１０Ｄ］およびＬ３５Ｇ［実施例１０Ｆ］）をもたらす位置は、中程度の配列保存性を有することが観察された。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）のＡｌｉｇｎＸ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のデフォルトパラメータを使用して、ＩｇＤ９ｅ、ＥｇＤ９ｅ、ＥａＤ９ｅ、およびＥ３８９Ｄ９ｅのアミノ酸配列アラインメントを作成し、その他の中程度に保存された残基を同定した。全ての整合配列中で保存された、米国特許第７，６４５，６０４号明細書のΔ９エロンガーゼモチーフは、共通配列内の下線付き太字として図に示される。（配列番号３に記載のＥｇＤ９ｅＳの配列と同一である）配列番号３２のＥｇＤ９ｅ配列内の太字の残基は、変異されてΔ９エロンガーゼ活性が改善された変異エロンガーゼをもたらす残基を示す。これらの変異の位置はまた、配列比較の各横列上の星印で強調表示されている。
これらの中程度に保存された残基は、非変異ＥｇＤ９ｅＳ対照と比較して改善された活性を有する、変異酵素の第２世代を潜在的にもたらすアミノ酸置換の標的の有望な候補かもしれないという仮説が立てられた。
これらの４つの相同的な酵素配列の比較で、２５８個のアミノ酸位置の内５８個は４つのエロンガーゼ酵素の全てで保存されていると判定され；したがってこれらの残基は、検討から除外された。さらに９２個の位置は、ＥｇＤ９ｅ、ＥａＤ９ｅ、およびＥ３８９Ｄ９ｅの間で保存されていると判定され；これらの残基もまた、検討から除外された。最後に、相同体間でランダムなアミノ酸変化を有する位置は、常態ではタンパク質機能に重要な役割を果たさないので、４つのエロンガーゼ酵素の全てで４つの異なるアミノ酸残基を有すると判定された追加的な２２個の位置が、機能評価のための標的化位置としての検討から除外された。
配列番号３２内の残る８６個の位置（すなわち位置１、３、４、５、９、１２、２１、２２、２７、２８、２９、３２、３５、３７、４１、４２、４５、４７、４８、５１、５２、５３、５４、５７、５８、６０、６２、６３、６６、６７、７０、７１、７３、７４、８０、８３、８４、８５、８９、９４、９８、１０１、１０４、１０５、１０７、１０８、１１１、１１５、１２７、１３１、１３２、１４３、１４９、１５２、１５３、１５５、１５６、１６１、１６８、１６９、１７９、１８１、１８２、１９２、１９６、２０４、２０７、２０９、２１０、２１１、２１６、２１８、２２２、２２３、２２５、２２９、２３６、２３９、２４２、２４４、２４５、２４７、２５０、２５４、２５７、および２５８）が、機能部位評価のための潜在的標的と見なされた。ＥｇＤ９ｅ（配列番号３２）、ＥａＤ９ｅ（配列番号３４）、およびＥ３８９Ｅ９ｅ（配列番号３８）中のこれらの各１つの位置でコードされるアミノ酸残基の比較を下の表２７に示す。
Figure 2013535987
上の表２７で同定された８６個の位置の内、図１６Ａの膜トポロジーモデルに基づいて、細胞膜周辺腔への最大近接を有する部位が、検討から除外された（すなわち位置４５、
４７、４８、５１、５２、５３、５４、５７、５８、６０、６２、６３、６６、６７、７０、７１、７３、７４、２０４、２０７、２０９、２１０、２１１、２１６、２１８、２２２、２２３、２２５、および２２９）。灰色の太字で強調表示された部位（すなわちＥｇＤ９ｅＳの位置３、５、９、１２、２１、２２、２７、２８、３２、３７、４１、４２、８０、８４、８５、９４、９８、１０１、１０４、１０５、１０７、１０８、１１１、１１５、１２７、１３１、１３２、１４３、１４９、１５２、１５３、１５６、１６１、１６８、１６９、１７９、１８１、１８２、１９２、１９６、２３６、２３９、２４２、２４４、２４５、２４７、２５０、２５４、２５７、および２５８）をさらなる実験的評価のために選択した。
ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５ＧのＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）変異遺伝子を作成するＳｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）
Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）（米国特許第７，６９５，９０６号明細書）は、コンビナトリアルライブラリーを「コドン１つずつ」合成する普遍的構成単位として二本鎖ＤＮＡの三つ組みを使用する（Ｓｌｏｎｉｎｇ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｕｃｈｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。ライブラリー生成のために、複数コドンをあらゆる所望の配列位置に並行して導入し得る。機能的バイアスの不在と、２０個までのコドンを選択してあらゆる比率で正確に制御送達する能力は、所望の変異体の完全なセットを含有する、ひときわ高品質のライブラリーをもたらす。
ＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）遺伝子ライブラリー（全部で５０個）は、このようにしてＳｌｏｎｉｎｇ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって作成され、各遺伝子ライブラリーは、ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ−Ｌ３５Ｇ（配列番号１４８）をテンプレートとして使用して、標的位置（すなわちＥｇＤ９ｅＳの位置３、５、９、１２、２１、２２、２７、２８、３２、３７、４１、４２、８０、８４、８５、９４、９８、１０１、１０４、１０５、１０７、１０８、１１１、１１５、１２７、１３１、１３２、１４３、１４９、１５２、１５３、１５６、１６１、１６８、１６９、１７９、１８１、１８２、１９２、１９６、２３６、２３９、２４２、２４４、２４５、２４７、２５０、２５４、２５７または２５８）に、少なくとも１６個の独立した特有な配列変異を有する。
実施例１０Ｂに記載されるように、全てのＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ変異体は、ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ−Ｌ３５Ｇによって提供されるベクター主鎖にクローンし、引き続いてＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株に形質転換して培養した。形質転換細胞（凍結グリセロール貯蔵品として提供される）およびＤＮＡは、Ｓｌｏｎｉｎｇ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得られた。形質転換細胞とＤＮＡのごく一部を配列決定して確認した。
実施例１０Ｈ：Δ９エロンガーゼ変換効率が改善されたＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５ＧＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）ライブラリー変異体の同定
本実施例は、実施例１０Ｆ（配列番号４４）で同定された変種タンパク質ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇと比較して、ＬＡからＥＤＡへのΔ９エロンガーゼ変換効率が改善されたＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ ＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）変異体の同定を記載する。
実施例１０Ｂの「確認アッセイ」手順を使用し、新鮮な再画線塗抹ＭＭプレート上の細胞培養を使用して、３ｍＬの液体ＭＭを含んでなる三連培養物を個々に接種して、ＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）ライブラリーからのコンストラクトによる８０７個のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）形質転換体の脂肪酸プロファイルをスクリーニングした。８０７個の変異体に加えて、ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ−Ｌ３５Ｇ（配列番号１４８）を含んでなるヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ２２２４株形質転換体、を実験対照として三連で接種した。
確認アッセイ中の選択された変異体からのデータを表２８に提示し、３つの代表的ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ対照のＦＡＭＥプロファイルをＳｌｏｎｏＭａｘ（登録商標）ライブラリー変異体を比較して、ＬＡからＥＤＡへの平均％変換の増大を実証する。より具体的には、各株について、（実施例１０Ｂに記載されるようにして判定される）ＴＦＡの面積パーセント［「％ＴＦＡ」］としての各脂肪酸濃度の平均（「平均」で示される）、およびＬＡからＥＤＡへの平均％変換を下の表２８に示す。脂肪酸は、実施例１０Ｄの略称に基づいて同定される。各株の説明は、それぞれ変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子中に存在する特定のアミノ酸置換を示唆する。したがってＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｓ９Ａ株は、配列番号３に記載のＥｇＤ９ｅＳの配列と比較してＬ３５Ｇ変異およびＳ９Ａ変異を有する変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子を含んでなる、変異ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳプラスミドを含んでなる。
Figure 2013535987
表２８に提示される、複製ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ対照の脂肪酸プロファイルおよびＬＡからＥＤＡへの％変換が、先に提示されたＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇプロファイルとはいくぶん異なることは注目に値する。本実験セットでは、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ対照は、以前の分析と比較して「伸び悩んだ」（すなわちＬＡからＥＤＡへの平均％変換が上で約１８．１％と判定されたのに対し、ＬＡからＥＤＡへの平均％変換は、実施例１０Ｆの表２５では約２６．６％および２７．２％と判定された）。しかしＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇによる形質転換体は、４．３のＥＤＡ％ＴＦＡ（平均、前出）を産生し、これはＥｇＤ９ｅＳによる形質転換体中の生産量を顕著に上回った（すなわち３．１のＥＤＡ％ＴＦＡ［実施例１０、表２１］、２．９のＥＤＡ％ＴＦＡ［実施例１０、表２２］、および３．５のＥＤＡ％ＴＦＡ［実施例１０、表２５］）。この理由から、表２８で提示されるＥｇＤ９ｅＳ部位−評価ライブラリーからの変異体比較のための基準として、本実験のＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ性能に加えて、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇの機能解析を反復した以前の実験からの性能（データ示さず）を使用した。
表２８に提示される２６個の選択されたエロンガーゼ変種の内、１１個は表２８の対照データと比較して、同等のまたは顕著に改善されたΔ９エロンガーゼ変換活性を実証すると同定された（太字で強調表示される）。これらの変異体には、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｓ９Ｄ（１４１％増大）、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ａ２１Ｖ（１１８％増大）、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｖ３２Ｆ（１０４％増大）、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｙ８４Ｃ（１４４％増大）、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｌ１０８Ｇ（１０４％増大）、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｗ１３２Ｔ（１００％増大）、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｍ１４３Ｎ（９６％増大）、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｌ１６１Ｔ（１３１％増大）、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｉ１７９Ｒ（１４１％増大）、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｃ２３６Ｎ（１０２％増大）、およびＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｑ２４４Ｎ（１３４％増大）が含まれ、ＥｇＤ９ｅＳと比較したΔ９エロンガーゼ変換活性は括弧内に示される。したがってＬＡからＥＤＡへの変換効率の最大４４％の改善が、実証された。
実施例１０Ｉ：ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｓ９Ｄ／Ａ２１Ｖ／Ｖ３２Ｆ／Ｙ８４Ｃ／Ｌ１０８Ｇ／Ｗ１３２Ｔ／Ｍ１４３Ｎ／Ｌ１６１Ｔ／Ｉ１７９Ｒ／Ｃ２３６Ｎ／Ｑ２４４Ｎコンビナトリアルライブラリーの作成
本実施例は、Ｌ３５変異を含んでなるＥｇＤ９ｅＳ変異体中に、上の実施例１０Ｈで同定された有益な変異（すなわちＬ３５Ｇ、Ｓ９Ｄ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｌ１０８Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｌ１６１Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、およびＱ２４４Ｎ）の様々な組み合わせを共に「スタック」する、変異ＥｇＤ９ｅＳコンビナトリアルライブラリーの合成を記載する。
コンビナトリアルライブラリー構築のための合成プライマーの作成
１１対のプライマーは、配列番号１５５〜１７６に記載されるように商業的に合成された（下の表２９参照）。各プライマー対は、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ遺伝子に、Ｓ９Ｄ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｌ１０８Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｌ１６１Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、およびＱ２４４Ｎの変異の１つを導入するようにデザインされた。
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ［「ＰＮＫ」］（カタログ番号７００３１Ｚ；ＵＳＢ Ｃｏｒｐ．）を使用して、プライマーを３７℃で６０分間リン酸化し、次に６５℃で２０分間不活性化した。各２０μｌのリン酸化反応混合物は、２．０μｌの１０×Ｔ４ ＰＮＫ緩衝液、１５．０μｌのプライマーＤＮＡ（約７μＭ）、０．６μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、０．４μｌのＴ４ ＰＮＫ、および２．０μｌの水を含有した。
ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇのコンビナトリアル変異体遺伝子を作成するための複数変異部位変異誘発
Ｃｈａｎｇｅ−ＩＴ（商標）複数変異部位特異的変異誘発キット（カタログ番号７８４８０、ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を使用して、各反応（最終反応を除く）が、プライマーセット「Ａ」の順方向プライマーおよび逆方向プライマー、そしてプライマーセット「Ｂ」の順方向プライマーおよび逆方向プライマーの封入に基づいて、２つの新しい変異を導入する、一連の６つの反応中で、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５ＧにＳ９Ｄ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｌ１０８Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｌ１６１Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、およびＱ２４４Ｎ変異を導入した（表２９）。一連の反応の最初のテンプレートがＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇであった一方、Ｃｈａｎｇｅ−ＩＴ（商標）反応１の生成物がＣｈａｎｇｅ−ＩＴ（商標）反応２のテンプレートの役割を果たした。
Figure 2013535987
より具体的には、それぞれ２．５μｌの１０×Ｃｈａｎｇｅ−ＩＴ（商標）緩衝液、２．５μｌのリン酸化順方向プライマー、２．５μｌのリン酸化逆方向プライマー、１．０
μｌのテンプレート（５０ｎｇ／μｌ）、１５．５μｌのヌクレアーゼ非含有水、および１．０μｌのＣｈａｎｇｅ−ＩＴ（商標）ＦｉｄｅｌｉＴａｑ酵素を含んでなる、２つの２５μｌのＰＣＲ反応混合物を調製した。第１の反応がプライマーセット「Ａ」からのプライマーを利用した一方、第２の反応はプライマーセット「Ｂ」からのプライマーを利用した。以下の条件を使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。９５℃で２分間、それに続く９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および６８℃で２５分間の伸長／ライゲーションを３０サイクル。６８℃で３０分間の最終伸長／ライゲーションサイクルを実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。
増幅に続いて、ＤｐｎＩ酵素の添加によってテンプレートを除去し、消化を３７℃で３時間実施した。ＰＣＲ ＤＮＡを使用して、電気穿孔によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ １０エレクトロコンピテント細胞（カタログ番号Ｃ４０４０５２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換した。形質転換細胞を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン添加ＬＢ寒天プレート上に塗り広げ、３７℃のインキュベーター内で一晩培養した。製造業者のプロトコルに従って、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からプラスミドＤＮＡを抽出した。次に精製ＤＮＡを次のＣｈａｎｇｅ−ＩＴ（商標）反応でテンプレートとして使用した。１１個の変異の残りを最初のＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇテンプレートに導入する６つ目の反応に続いて、上述したように形質転換体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からＤＮＡを精製した。次にＤＮＡをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株（前出、実施例１０Ｂ）に形質転換した。
実施例１０Ｊ：Δ９エロンガーゼ変換効率が改善されたＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｓ９Ｄ／Ａ２１Ｖ／Ｖ３２Ｆ／Ｙ８４Ｃ／Ｌ１０８Ｇ／Ｗ１３２Ｔ／Ｍ１４３Ｎ／Ｌ１６１Ｔ／Ｉ１７９Ｒ／Ｃ２３６Ｎ／Ｑ２４４Ｎコンビナトリアルライブラリー変異体の同定
本実施例は、１）野生型タンパク質ＥｇＤ９ｅＳ（配列番号３）と比較して、ＬＡからＥＤＡへのΔ９エロンガーゼ変換効率が改善された、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｓ９Ｄ／Ａ２１Ｖ／Ｖ３２Ｆ／Ｙ８４Ｃ／Ｌ１０８Ｇ／Ｗ１３２Ｔ／Ｍ１４３Ｎ／Ｌ１６１Ｔ／Ｉ１７９Ｒ／Ｃ２３６Ｎ／Ｑ２４４Ｎコンビナトリアルライブラリー変異体の同定；２）これらのＥｇＤ９ｅＳ変異体の配列分析；および３）Δ９エロンガーゼ変換効率の改善を確認するための配列決定されたＥｇＤ９ｅＳ変異体の再現を記載する。
ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇ／Ｓ９Ｄ／Ａ２１Ｖ／Ｖ３２Ｆ／Ｙ８４Ｃ／Ｌ１０８Ｇ／Ｗ１３２Ｔ／Ｍ１４３Ｎ／Ｌ１６１Ｔ／Ｉ１７９Ｒ／Ｃ２３６Ｎ／Ｑ２４４Ｎコンビナトリアルライブラリー変異体の同定
実施例１０Ｂの迅速スクリーニング「プレートアッセイ」を使用して、コンビナトリアルライブラリー（実施例１０Ｉ）からのコンストラクトによる２，３８８個のヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）形質転換体の脂肪酸プロファイルをスクリーニングした。これらの変異体のほとんどは、野性型対照ＥｇＤ９ｅＳ（配列番号３）と比較してＬＡからＥＤＡへの変換の低下を呈示した。しかし５つの形質転換体は、実施例１０Ｂの確認アッセイに基づいて、対照と比較して改善されたΔ９伸長活性を呈示することが確認された。
コロニーＰＣＲを使用して、変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子のＤＮＡ配列を判定した。手短に述べると、無菌ピペットチップを使用して、新鮮画線塗抹プレートから少量の酵母細胞を採取し、細胞を２０μｌの分子等級水に懸濁した。細胞懸濁液（２μｌ）を製造会社（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，ＬＴＤ．）の推奨事項に従って調製したＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＰＣＲミックスに移した。コロニーＰＣＲのために使用されたプライマーは、順方向プライマーＦＢＡＩＮ−Ｆ（配列番号３６６）および逆方向プライマーＹ１０２６（配列番号３６７）であった。サーマルサイクラープログラムは、９４℃で５分間のテンプレートの最初の変性と、それに続く４０サイクルの９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で３分間の伸長を含んだ。７２℃で６分間の最終伸長を実施した。
ＰＣＲ産物をプライマーＦＢＡＩＮ−Ｆ（配列番号３６６）およびＹ１０２６（配列番号３６７）によって配列決定した。ＤＮＡ配列データの解析は、変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子内のヌクレオチド置換、および発現されたアミノ酸置換を明らかにした。表３０に示すように、変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子に、および変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子を含んでなる変異ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳプラスミドに、アミノ酸置換を示唆する名称を与えた。
Figure 2013535987
表３０のアミノ酸置換に基づいて、部位特異的変異誘発のための新しいプライマーをデザインした。次に「メガプライマー」内のＥｇＤ９ｅＳ変異体をｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ（図２；配列番号１１５）に導入するようにデザインされた反応中で、これらのプライマーを利用し、それによって非変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子を表３０で同定される様々な変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子で置換した。これは、実施例１０Ｃに記載されるように、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ ＸＬ部位特異的変異誘発キット（カタログ番号２００５２４；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して達成された。実施例１０Ｂに記載されるように、これらの変異遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ １０エレ
クトロコンピテント細胞に形質転換して、精製し、配列決定し、引き続いてＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株に形質転換した。このようにして、表３０に示される変異ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子をプラスミド上に再現し、Ｙ２２２４株に再導入して戻し、ＥｇＤ９ｅＳコンビナトリアル変異体によって呈示されるΔ９エロンガーゼ変換効率の改善が、同定されたアミノ酸置換のためであることを確認した。
これらの確認アッセイからのデータを表３１に提示し、個々のｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳ対照形質転換体のＦＡＭＥプロファイルをコンビナトリアルライブラリーの変異体と比較する。保守的比較のために、各株について示されるデータは、各株についてＬＡからＥＤＡへの％変換が最も高い３分離株のＦＡＭＥプロファイルを表す。より具体的には、各株について、（実施例１０Ｂに記載されるようにして判定される）ＴＦＡの面積パーセントとしての各脂肪酸濃度［「％ＴＦＡ」］、およびＬＡからＥＤＡへの％変換を下に示し、平均値は灰色で強調され「平均」として示される。脂肪酸は、実施例１０Ｄの略称に基づいて同定される。
Figure 2013535987
配列番号２のコドン最適化ＥｇＤ９ｅＳ遺伝子（非変異体）を含んでなる、ｐＺｕＦｍＥｇＤ９ＥＳで形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株のクローンは、平均で２．５のＥＤＡ％ＴＦＡを産生し、これらの３つのクローンのＬＡからＥＤＡへの平均変換効率［「％変換」］は約１６．１％と判定された。対照的に、変異株ＥｇＤ９ＥＮ−４２７のＬＡからＥＤＡへの平均％変換は１７．８％（または対照との比較で１１０％）であった。同様に、変異株ＥｇＤ９ＥＮ−１０４３のＬＡからＥＤＡへの平均％変換は１７．５％（または対照との比較で１０８％）であった。変異株ＥｇＤ９ＥＮ−１５３４のＬＡからＥＤＡへの平均％変換は１６．８％（または対照との比較で１０４％）であり；変異株ＥｇＤ９ＥＮ−１６３５の平均％変換は１８．０％（または対照との比較で１１１％）であり；変異株ＥｇＤ９ＥＮ−１７３４の平均％変換は２０．０％（または対照との比較で１２３％）であった。
したがってこれらの実験は、それによってＥｇＤ９ｅＳコンビナトリアルライブラリー変異体ＥｇＤ９ＥＮ−４２７、ＥｇＤ９ＥＮ−１０４３、ＥｇＤ９ＥＮ−１５３４、ＥｇＤ９ＥＮ−１６３５、およびＥｇＤ９ＥＮ−１７３４によって呈示されたΔ９エロンガーゼ変換効率の改善を確認し、改善は４〜２３％の範囲に及んだ。
実施例１１
変異ＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフおよびＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフΔ５デサチュラーゼ
本実施例は、実施例１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ、１１Ｈ、１１Ｉ、１１Ｊ、１１Ｋ、１１Ｌａｎｄ１１Ｍとして分けて記載し、（ａ）配列番号１８０［ＨｘＧｘ］に記載のアミノ酸モチーフであって、配列番号１８０［ＨｘＧｘ］が配列番号１８１［ＨＰＧＧ］と同じでないアミノ酸モチーフ；および（ｂ）配列番号１８２［ＨｘｘｘＨ］に記載のアミノ酸モチーフであって、配列番号１８２［ＨｘｘｘＨ］が配列番号１８３［ＨＤＡＳＨ］と同じでないアミノ酸モチーフ
を含んでなる、Δ５デサチュラーゼ活性を有する変異ポリペプチドの説明を支持する実験データを記載する。
より具体的には、以下が、Δ５デサチュラーゼ活性を有し、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドの説明である。配列番号１１０［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇまたはＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧｓ＿ＨＤｇＳＨ］；配列番号１１２［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇまたはＥａＤ５Ｓ−ＨａＧＧ＿ＨＤｇＳＨ］；配列番号１０６［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇまたはＥｇＤ５Ｒ＊−ＨｇＧＧ＿ＨＤＡｇＨ］；および配列番号１０８［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓまたはＥｇＤ５Ｒ＊−ＨｇＧＧ＿ＨＤＡｇＨ＿３４７ｓ］。
実施例１１Ａ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ、１１Ｈ、１１Ｉ、１１Ｊ、１１Ｋ、１１Ｌ、および１１Ｍはまた、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国仮特許出願第６１／４２８，２７７号明細書［代理人整理番号ＣＬ５２６７ＵＳＰＲＶ、２０１０年１２月３０日出願］にも記載される。
後述する実施例１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｈ、１１Ｉ、および１１Ｋでは、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットに記載されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）を宿主として使用した。
Ｙ４０３６Ｕ株は、Ｙ２２２４株（Ｕｒａ３−、Ｕｒａ３遺伝子の自律変異からのＦＯＡ耐性変異体）、Ｙ４００１株（Ｌｅｕ−表現型で１７％ＥＤＡを産生する）、Ｙ４００１Ｕ１株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−）、およびＹ４０３６株（Ｌｅｕ−表現型で１８％ＤＧＬＡを産生する）の構築を介して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２から誘導された。
野性型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較した、Ｙ４０３６Ｕ株の最終遺伝子型は、次の通りであった。Ｕｒａ３−，ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２，ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２，ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０，ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６，ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０，ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ。
実施例１１Ａ：ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ［「ＥｇＤ５」］のための位相モデルの開発
ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのΔ５デサチュラーゼ［「ＥｇＤ５」；米国特許第７，６７８，５６０号明細書；配列番号１８４および１８５］内のＨＤＡＳＨモチーフの可能な重要性をより良く予測するために、下の論理および分析に基づいて位相モデル（図１８）を開発した。
最初に、ＴＭＨＭＭプログラム（「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＢｉｏＣｅｎｔｒｕｍ−ＤＴＵ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ，ＤＫ−２８００ Ｌｙｎｇｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、ＥｇＤ５の膜貫通ドメインの分析を実施した。予測は、ＮおよびＣ末端の双方が膜の細胞質側に位置する、６つの膜貫通らせん（アミノ酸残基１０３〜１２５、１３０〜１５２、１６５〜１８７、２３４〜２５６、２８０〜３０２、および３０６〜３２８）を示唆した。
以下のＥｇＤ５の相同体を使用して、同様のＴＭＨＭＭ分析を実施した。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＴ０９１６０［ニッチア・クロステリウム（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ）ミヌティシマ（ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）品種］、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＧ７１００７［オブロンギキトリウム属（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＳＥＫ３４７種］、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＬ９２５６２［フェオダクチラム・トリコルナタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）］。各相同体毎に、４つの膜貫通部分が予測され、それはＥｇＤ５で予測された最初の２つおよび最後の２つの膜貫通ドメインに相当した。
膜結合脂肪酸デサチュラーゼは３つのヒスチジンに富む（Ｈｉｓに富む）モチーフ、ＨＸ （３−４） Ｈ（配列番号１８６および１８７）、ＨＸ （２−３） ＨＨ（配列番号１８８および１８９）、および（Ｈ／Ｑ）Ｘ （２−３） ＨＨ（配列番号１９０および１９１）を特徴とする、膜二鉄タンパク質のスーパーファミリーに属する。これらのＨｉｓに富む残基は、膜の細胞質面に位置することが予測されており、酵素活性に重要であることが示されている（Ｓｈａｎｋｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：１２７８７−１２７９４（１９９４）；Ｓｈａｎｋｌｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｃａｈｏｏｎ，Ｅ．Ｂ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４９：６１１−６４１（１９９８））。ＥｇＤ５内では、最初のＨｉｓに富む領域（ＨＤＡＳＨ［配列番号１８３］）が、アミノ酸残基１６５〜１８７に及ぶ第３の予測された膜貫通部分の前に位置する一方、第２のＨｉｓに富む領域（ＨＩＭＲＨＨ［配列番号１８９］）はこの膜貫通部分の後ろに位置する。第３の膜貫通部分が実際に膜の内外にまたがれば、第２のＨｉｓに富む領域は細胞膜周辺腔内に位置し、したがってその鉄活性部位への関与を妨げる。その結果、第３の膜貫通部分（アミノ酸残基１６５〜１８７）または第４の膜貫通部分（アミノ酸残基２３４〜２５６）のどちらも、膜貫通でないというという仮説が立てられた。これは３つのΔ５デサチュラーゼ相同体（すなわちＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＴ０９１６０、ＢＡＧ７１００７、およびＡＡＬ９２５６２）のＴＭＨＭＭ予測と一致した。
Δ５デサチュラーゼ基質（すなわちＤＧＬＡ、ＥＴＡ）は高度に疎水性であるので、恐らく脂質二重層内に分配されることが推測された。同様に、３つのＨｉｓに富むクラスターから組み立てられる活性部位は、恐らく膜表面にまたはその非常に近くに現れることが推測された。したがって、それぞれ残基１６５〜１８７および２３４〜２５６の間に発見され、ＴＭＨＭＭによって最初は膜を貫通すると予測された第３および第４の膜貫通部分は、そうではなく、膜表面近くに位置して、活性部位が確実に膜の近くに配置されるようにすることが予測された。アミノ酸残基１０３〜１２５、１３０〜１５２、２８０〜３０２、および３０６〜３２８の膜貫通領域は、ＴＭＨＭＭによる予測通りであった。
このようにして、ＥｇＤ５について予測された最終トポロジーモデルを図１８に示す。垂直の円柱が膜貫通ドメインを示す一方、水平の円柱は膜を貫通しないが、内膜表面近くに位置する２つの高度に疎水性の領域を示す。丸は、恐らくは活性部位に関与するＨｉｓ残基に相当する。ＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフおよびＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフの位置もまた同定された。最後に、「中」が細胞質空間に対応するのに対し、「外」は細胞膜周辺腔に相当する。
実施例１１Ｂ：デサチュラーゼ中の天然ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ変動の測定
選択されたデサチュラーゼタンパク質配列を検査して、ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内に自然変動が起きたかどうかを判定した。具体的には、デサチュラーゼタンパク質としては、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ［「ＥｇＤ５」；米国特許第７，６７８，５６０号明細書］と、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ［「ＭａＤ５」；米国特許第５，９７２，６６４号明細書］と、その他の既知のΔ５デサチュラーゼに対するおよび／またはΔ５デサチュラーゼに密接に関係していることが知られているΔ６デサチュラーゼに対するＢＬＡＳＴヒットとが挙げられる。ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して、選択された配列を配列比較し、ＨＤＡＳＨモチーフ（またはその変種）を下の表３２に要約する。
Figure 2013535987
上の分析に基づいて、ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフのＡｓｐ［「Ｄ」］残基は恐らくＧｌｕ残基［「Ｅ」］によって置換され、Ａｌａ［「Ａ」］残基は恐らくＧｌｙ［「Ｇ」］、Ｓｅｒ［「Ｓ」］、Ｐｈｅ［「Ｆ」］、Ｔｙｒ［「Ｙ」］またはＭｅｔ［「
Ｍ」］残基によって置換され、および／またはＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフのＳｅｒ［「Ｓ」］残基は恐らくＣｙｓ［「Ｃ」］、Ａｓｎ［「Ｎ」］、Ｇｌｙ［「Ｇ」］、Ａｌａ［「Ａ」］またはＴｈｒ［Ｔ」］残基によって置換され得るようであった。
実施例１１Ｃ：野生型ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ［「ＥｇＤ５」］の配列
米国特許第７，６７８，５６０号明細書は、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのΔ５デサチュラーゼ（すなわちＥｇＤ５、配列番号１８５）の単離およびクローニングを記載する。最近、クローンされたＥｇＤ５のより詳細な分析が、以前に認識されていなかった、ＥｇＤ５Ｒと称されて本明細書で配列番号１９２および１９３として記載される、もう１つの変種「野生型」ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ配列を同定した。米国特許第７，６７８，５６０号明細書に記載されるＥｇＤ５の位置３４７のＳｅｒ残基の代わりに、ＥｇＤ５Ｒ（配列番号１９３）は、位置３４７にＡｒｇ残基を含んでなる。この矛盾は、ＰＣＲまたはｃＤＮＡ作成手順の結果として生じるという仮説が立てられた。
具体的には、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）の二本鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして５’−および３’−ＲＡＣＥ技術を使用して、ＥｇＤ５（配列番号１８４；米国特許第７，６７８，５６０号明細書の配列番号１に相当する）が得られた（米国特許第７，６７８，５６０号明細書の実施例４〜５）。次にミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼをコードするＯＲＦをＰＣＲによって増幅し、精製して制限酵素消化して、次に適切なベクターに一方向性にライゲートしてｐＤＭＷ３６７を得た（米国特許第７，６７８，５６０号明細書の実施例６）。ｐＤＭＷ３６７の配列は、米国特許第７，６７８，５６０号明細書で配列番号２３として提供された（本明細書の配列番号１９４に相当する）。米国特許第７，６７８，５６０号明細書では、ｐＤＭＷ３６７はキメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなると報告されたが、このキメラ遺伝子内のΔ５デサチュラーゼ配列は、実際にはＥｇＤ５Ｒ（配列番号１９２）のヌクレオチド配列であることが今は理解されている。
ＥｇＤ５（配列番号１８４）とＥｇＤ５Ｒ（配列番号１９２）（図１９Ａおよび１９Ｂ）の配列比較は、４つのヌクレオチドの相違を示し、配列番号１８４に関する変異は、Ｇ８１９ＧＡ、Ｔ９４８Ｃ、Ｃ１０４１Ａ、およびＧ１３４９Ａである。Ｇ１３４９Ａの変異は、ｐＤＭＷ３６７へのクローニングのためにＥｇＤ５を増幅するのに利用される、特定プライマー配列に起因する。ＥｇＤ５（配列番号１８５）およびＥｇＤ５Ｒ（すなわち配列番号１９３）の翻訳産物の配列比較は、単一アミノ酸の相違、すなわちＳ３４７Ｒの変異を明らかにする。
米国特許第７，６７８，５６０号明細書の実施例９はまた、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ＥｇＤ５に由来する、合成Δ５デサチュラーゼ（すなわちＥｇＤ５Ｓ；配列番号１９５および１９６）の作成を記載する。ＥｇＤ５のコドン最適化は、１３５０ｂｐのコード領域の内１９６ｂｐ（１４．５％）の修飾、および全４４９コドンの内１８９コドン（４２％）の最適化をもたらした。コドン最適化ＥｇＤ５Ｓ遺伝子（すなわち配列番号１９６）によってコードされるタンパク質配列は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号１８５）と同一であり、３４７位置のアミノ酸はＳｅｒである。
実施例１１Ｄ：４つの制限エンドヌクレアーゼ部位が除去された野生型ＥｇＤ５Ｒを含んでなるコンストラクトｐＤＭＷ３６７−Ｍ４［「ＥｇＤ５Ｒ＊」］の作成
本実施例は、キメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｒ＊：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるプラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４（図２０Ａ、２０Ｂ、および２０Ｃ）の構築を記載する。ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号１９７）は、引き続くクローニング手順を容易にするために作成された野生型ＥｇＤ５Ｒ（配列番号１９２）の修飾変種であり、修飾は、野生型ＥｇＤ５Ｒコード領域からの４つの制限酵素部位（すなわちＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＮｃｏＩ）の除去をもたらした。ＥｇＤ５Ｒ（配列番号１９３）およびＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号１９８）のアミノ酸配列は、同一であった。
具体的には、プラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４（配列番号１９９；図２０Ｃ）は、ｐＤＭＷ３６７（配列番号１９４、実施例１１Ｃ；図２０Ａ）に由来した。ＥｇＤ５Ｒコード領域から、天然ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＮｃｏＩ制限酵素部位を逐次除去して、ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４を作成した。最初に、ｐＤＭＷ３６７（配列番号１９４）をテンプレートとして、２対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、生体外変異誘発によってＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ部位を除去した。ＹＬ８１３（配列番号２００）およびＹＬ８１４（配列番号２０１）のプライマー対が、ＥｃｏＩ部位の変異を可能にした一方、ＹＬ８１５（配列番号２０２）およびＹＬ８１６（配列番号２０３）のプライマー対は、ＢｇｌＩＩ部位の変異を可能にした。これらの反応は、コンストラクトｐＤＭＷ３６７−Ｍ２（図２０Ｂ；配列番号２０４）を生成した。配列分析は、ｐＤＭＷ３６７−Ｍ２中の変種ＥｇＤ５Ｒのアミノ酸配列が、ｐＤＭＷ３６７中のＥｇＤ５Ｒのアミノ酸配列と同一であることを確認した。
次に、ｐＤＭＷ３６７−Ｍ２をテンプレートとして、２対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、生体外変異誘発によってＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩ部位を除去した。ＹＬ８２９（配列番号２０５）およびＹＬ８３０（配列番号２０６）のプライマー対が、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の変異を可能にした一方、ＹＬ８３１（配列番号２０７）およびＹＬ８３２（配列番号２０８）のプライマー対は、ＮｃｏＩ部位の変異を可能にした。これは、ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４の生成をもたらした。この場合もやはり、配列分析は、ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４中の変種ＥｇＤ５（すなわちＥｇＤ５Ｒ＊）のアミノ酸配列が、ｐＤＭＷ３６７中のＥｇＤ５Ｒのアミノ酸配列と同一であることを確認した。
引き続く実施例では、野生型ＥｇＤ５への言及は、特に断りのない限り、事実上、ＥｇＤ５Ｒ（配列番号１９２および１９３）およびＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号１９７および１９８）への言及を含む。
実施例１１Ｅ：ＥｇＤ５Ｒ＊のΔ５デサチュラーゼ活性と同様のΔ５デサチュラーゼ活性をもたらすＨＤｘＳＨ（配列番号４３４）変異の同定
ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフは、ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号１９８）のアミノ酸残基１５５から１５９に広がる。ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４（実施例１１Ｄ）をテンプレートとして、１９対のオリゴヌクレオチド（配列番号２０９〜２４６；後述の表３３）をプライマーとして使用して、単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によって、ＥｇＤ５Ｒ＊のＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフのＡｌａ残基を個々に変異させ、それによって全ての可能なアミノ酸置換を作り出した（すなわちＨＤｘＳＨ［配列番号４３４］変異体）。各変異からのプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ２Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。１９個の各形質転換から３個のコロニーを拾い、液体培地中において３７℃で一晩、個別培養した。プラスミド（すなわち合計５７個）をこれらの培養物から単離し、個々に配列決定して変異を確認した。
一般方法に記載されるように、野性型ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４プラスミドおよび単離された変異プラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１株に個々に形質転換した。形質転換体をＭＭＬｅｕプレート上で選択した。３０℃で２日間の培養後、形質転換反応からの各３つの形質転換体を新しいＭＭＬｅｕプレート上に画線塗抹し、３０℃でさらに２日間培養した。次にコロニーを使用して、２４ウェルＱｉａｇｅｎブロック内の３ｍＬのＭＭＬｅｕに接種した。３０℃の恒温器内でブロックを２００ｒｐｍで振盪しながら、インキュベートした。培養物を２日間インキュベートした後、ブロックを遠心分離して上清を除去し、３ｍＬのＨＧＭを添加した。ブロックを３０℃の恒温器内に戻し、さらに５日間２００ｒｐｍで振盪した。細胞を遠心分離により収集して脂質を抽出し、エステル交換により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製して、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ ＧＣで分析した。
各変異ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフに起因する、Δ５デサチュラーゼ活性（３つの形質転換体の平均）を下の表３３に要約する。ＥｇＤ５Ｒ＊変異体を含んでなる、変異ｐＤＭＷ３６７Ｍ４コンストラクトを含んでなる、形質転換体は、ＥｇＤ５Ｒ＊内の位置１５７のＡｌａ残基で起きたアミノ酸置換に準じて命名される（すなわち形質転換体ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５７ｃは、ＥｇＤ５Ｒ＊−１５７ｃと称される、位置１５７でＡｌａを置換するＣｙｓを有し、それによってＨＤｃＳＨ［配列番号３９０］モチーフをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなり；形質転換体ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５７ｇは、ＥｇＤ５Ｒ＊−１５７ｇと称される、Ａｌａを置換するＧｌｙを有し、それによってＨＤｇＳＨ［配列番号４２９］モチーフなどをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなる）。変換効率（「Ａｖｇ．Ｃｏｎｖ．Ｅｆｆｉｃ．」）は、次式に従って測定された。
（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００
式中、「生成物」は、即時生成物と、経路中のそれから誘導される全ての生成物とを含む。結果はプラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４内の野生型ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号１９８）と比較され、ＧＣ分析は、形質転換体によって総脂質の１０．８％のＤＧＬＡおよび３．６％のＡＲＡが生成されたと判定した（すなわち平均変換効率は２４．８％であった）。
Figure 2013535987
上に基づいて、ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内のＡｌａ残基は、ＥｇＤ５Ｒ＊のΔ５デサチュラーゼ活性に実質的に影響を及ぼすことなく、ＧｌｙまたはＳｅｒのいずれかで置換し得ることが明らかである。具体的には、ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５７ｇ形質転換体中のＥｇＤ５Ｒ＊−１５７ｇ（配列番号２４７）が、２３．８％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できたのに対し、ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５７ｓ形質転換体中のＥｇＤ５Ｒ＊−１５７ｓ（配列番号２４８）は、２３．３％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できた。
実施例１１Ｆ：ＥｇＤ５Ｒ＊のΔ５デサチュラーゼ活性と同様のΔ５デサチュラーゼ活性をもたらすＨＤＡｘＨ（配列番号４３５）変異の同定
ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４（実施例１１Ｄ）をテンプレートとして、１９対のオリゴヌクレオチド（配列番号２４９〜２８６；後述の表３４）をプライマーとして使用して、単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によって、ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号１９８）のＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフのＳｅｒ残基を個々に変異させ、それによって全ての可能なアミノ酸置換を作り出した（すなわちＨＤＡｘＨ［配列番号４３５］変異体）。実施例１１Ｅに記載されるようにして、変異誘発に続いてプラスミドをヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１に形質転換し、ＭＭＬｅｕおよびＨＧＭ中で形質転換体を選択して培養し、ＦＡＭＥを調製してＧＣによって分析した。
ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内の各変異に起因する、Δ５デサチュラーゼ活性（３つの形質転換体の平均）を下の表３４に要約する。ＥｇＤ５Ｒ＊変異体を含んでなる、変異ｐＤＭＷ３６７Ｍ４コンストラクトを含んでなる、形質転換体は、ＥｇＤ５Ｒ＊内の位置１５８のＳｅｒ残基で起きたアミノ酸置換に準じて命名される（すなわち形質転換体ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５８ａは、ＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ａと称される、位置１５８でＳｅｒを置換するＡｌａを有し、それによってＨＤＡａＨ［配列番号４３１］モチーフをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなり；形質転換体ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５８ｒは、ＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ｒと称される、Ｓｅｒを置換するＡｒｇを有し、それによってＨＤＡｒＨ［配列番号４１９］モチーフをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼなどを含んでなる）。変換効率は、実施例１１Ｅに記載される式に従って判定した。結果をプラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４内の野生型ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号１９８）と比較し、ＧＣ分析は、形質転換体によって総脂質の１１．３％のＤＧＬＡおよび３．４％のＡＲＡが生成されたと判定した（すなわち平均変換効率は２３．３％であった）。
Figure 2013535987
結果は、ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内のＳｅｒ残基が、ＥｇＤ５Ｒ＊のΔ５デサチュラーゼ活性に実質的に影響を及ぼすことなく、ＡｌａまたはＧｌｙのいずれかで置換し得ることを実証した。具体的には、ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５８ａ形質転換体中のＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ａ（配列番号２８７）が２３．５％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できたのに対し、ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５８ｇ形質転換体中のＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ｇ（配列番号２８８）は、２５．１％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できた。
実施例１１Ｇ：ＥｇＤ５Ｒ＊のΔ５デサチュラーゼ活性と同様のΔ５デサチュラーゼ活性をもたらすＨｘＧｘ（配列番号１８０）およびＨＤｘｘＨ（配列番号４２４）変異の同定
米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書は、チトクロームｂ５様ドメインのＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフ内に少なくとも１つの変異を有する、変異Δ５デサチュラーゼを記載する（すなわちＨｘＧｘ［配列番号１８０］変異）。ＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフは、ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号１９８）のアミノ酸残基３３から３６に広がる。
本実施例は、ＥｇＤ５Ｒ＊−１５７ｇ（実施例１１Ｅ、配列番号２４７）、ＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ａ（実施例１１Ｆ、配列番号２８７）、およびＥｇＤ５Ｒ＊−１５８ｇ（実施例１１Ｆ、配列番号２８８）のＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフ内に変異を導入して、ＨＰＧＧ（配列番号１８１）およびＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）ドメイン内の二重変異の効果を調べる。
ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５７ｇ（実施例１１Ｅ、配列番号２８９），ｐＤＭＷ３６７Ｍ４−１５８ａ（実施例１１Ｆ、配列番号２９０）、およびｐＤＭＷ３６７−１５８ｇ（実施例１１Ｆ、配列番号２９１）をテンプレートとして、数対のオリゴヌクレオチド（配列番号２９２〜２９７；表３５）をプライマーとして使用して、単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によって、変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子のＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフのＰｒｏ残基または第２のＧｌｙ残基のいずれかを個々に変異させ、それによってＨＰＧＧ（配列番号１８１）およびＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内に二重変異を作り出した。実施例１１Ｅに記載されるようにして、変異誘発に続いてプラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１株に形質転換し、ＭＭＬｅｕおよびＨＧＭ中で形質転換体を選択して培養し、ＦＡＭＥを調製してＧＣによって分析した。
ＨｘＧｘ（配列番号１８０）およびＨＤｘｘＨ（配列番号４２４）変異の双方がある、変異Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性を下の表３５に要約する。ＥｇＤ５Ｒ＊変異体を含んでなる、変異ｐＤＭＷ３６７Ｍ４コンストラクトを含んでなる、形質転換体は、ＥｇＤ５Ｒ＊のＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内のＡｌａ残基またはＳｅｒ残基のアミノ酸置換と組み合わさった、ＥｇＤ５Ｒ＊のＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフ内のＰｒｏ残基または第２のＧｌｙ残基のアミノ酸置換に準じて命名される。すなわち、例えば形質転換体ｐＤＭＷ３６７−３４ｇ１５８ｇは、ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇと称される、位置３４でＰｒｏを置換するＧｌｙを有し（それによってＨｇＧＧ［配列番号４２５］モチーフをもたらし）、位置１５８でＳｅｒを置換するＧｌｙを有する（それによってＨＤＡｇＨ［配列番号４３２］モチーフをもたらす）、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなる。変換効率は、実施例１１Ｅに記載される式に従って判定した。結果はプラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４内の野生型ＥｇＤ５Ｒ＊と比較され、ＧＣ分析は、形質転換体によって総脂質の１１．７％のＤＧＬＡおよび４．４％のＡＲＡが生成されたと判定した（すなわち平均変換効率は２７．５％であった）。
Figure 2013535987
結果は、ＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフおよびＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフがΔ５デサチュラーゼ酵素活性にとって重要ではあるが、野生型と比べて少なくとも６４％のΔ５デサチュラーゼ活性を保つ、ＨｘＧｘ（配列番号１８０）およびＨＤｘｘＨ（配列番号４２４）モチーフを有するデサチュラーゼが構築されてもよいことを実証した。具体的には、
１）ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内のＡｌａ残基のＧｌｙによる置換；または２）残基ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内のＳｅｒのＡｌａまたはＧｌｙによる置換
のいずれかの同時置換と共に、ＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフ内のＰｒｏ残基をＧｌｙで置換し得る。ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内のＳｅｒ残基のＡｌａまたはＧｌｙのいずれかによる同時置換と共に、ＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフ内のＰｒｏ残基もまたＨｉｓで置換し得る。そしてＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内のＳｅｒのＡｌａまたはＧｌｙのいずれかによる同時置換と共に、ＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフ内の第２のＧｌｙ残基をＳｅｒで置換し得る。
好ましい二重変異体は、ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５７ｇ（配列番号２９８および２９９；ｐＤＭＷ３６７−３４ｇ１５７ｇ形質転換体中において２２．９％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ａ（配列番号３００および３０１；ｐＤＭＷ３６７−３４ｇ１５８ａ形質転換体中において２４．３％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、およびＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ（配列番号３０２および３０３；ｐＤＭＷ３６７−３４ｇ１５８ｇ形質転換体中において２６．８％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）であった。
実施例１１Ｈ：ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇに由来する、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における発現のためのＮ末端コドン最適化変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子（「ＥｇＤ５Ｍ」）の合成
米国特許第７，１２５，６７２号明細書に記載されるのと同様の方法で、ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ（配列番号３０２、実施例１１Ｇ）の５’部分のコドン使用頻度をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために最適化した。具体的には、ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇの最初の２０４ｂｐをコドン最適化して、「ＥｇＤ５Ｍ」（配列番号１０５および１０６）と称されるコドン最適化Δ５デサチュラーゼ遺伝子の合成をもたらした。ＥｇＤ５Ｍは、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン（米国特許第７，１２５，６７２号明細書）「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周囲の共通配列、およびＲＮＡ安定性の一般則（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ，Ｇ．ａｎｄ Ｊ．Ｂｒｅｗｅｒ，Ｇｅｎｅ，２６５（１−２）：１１−２３（２００１））に従って、ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇのΔ５デサチュラーゼ遺伝子のコード配列に基づいてデザインされた。翻訳開始部位の修飾の他に、コード領域のＮ末端内の２０４ｂｐの内５２ｂｐが修飾され（２５．５％；図２１）、デサチュラーゼタンパク質のＮ末端内の６８個のアミノ酸の内４５個のコドンが最適化された（６６．２％）。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位は、ＥｇＤ５Ｍの翻訳開始コドン周囲および停止コドン後に、それぞれ組み込まれた。コドン最適化ＥｇＤ５Ｍ遺伝子（すなわち配列番号１０６）によってコードされるタンパク質配列は、野生型ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇタンパク質配列（すなわち配列番号３０３）と同一である。デザインされたＥｇＤ５Ｍ遺伝子（配列番号１０５）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成され、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｙ１４８３７）にクローンされて、ｐＥｇＤ５Ｍ（図２２Ａ；配列番号３０４）を生じた。
実施例１１Ｉ：ＥｇＤ５Ｍを含んでなるコンストラクトｐＤＭＷ３６７−５Ｍの作成
本実施例は、キメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる、プラスミドｐＤＭＷ３６７−５Ｍの構築を記載する。ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４（図２０Ｃ；配列番号１９９）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＥｇＤ５Ｒ＊断片をｐＥｇＤ５Ｍ（図２２Ａ；配列番号３０４）からのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＥｇＤ５Ｍ断片で置換して、プラスミドｐＤＭＷ３６７−５Ｍ（図２２Ｂ；配列番号３０５）を構築した。このライゲーションの生成物はｐＤＭＷ３６７−５Ｍであり、それは以下の構成要素を含有した。
Figure 2013535987
実施例１１Ｊ：Ｎ末端コドン最適化変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子の変種「ＥｇＤ５Ｍ１」を含んでなるコンストラクトｐＤＭＷ３６７−５Ｍ１の作成
本実施例は、キメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｍ１：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる、プラスミドｐＤＭＷ３６７−５Ｍ１（配列番号３０７）の構築を記載する。ＥｇＤ５Ｍ中の位置３４７のＡｒｇのためのＣＧＡコドンが、ＥｇＤ５Ｍ１中ではＳｅｒのためのＡＧＣコドンをコードするように変化していることを除いて、ＥｇＤ５Ｍ１（配列番号１０７）のヌクレオチド配列は、ＥｇＤ５Ｍ（配列番号１０５）と同一である。この修飾は、Δ５デサチュラーゼ活性に対する、Ｒ３４７Ｓ変異（実施例１１Ｃに記載される）の効果を分析するためにデザインされた。
デザインされたＥｇＤ５Ｍ１遺伝子（「ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓ」とも称される；配列番号１０７）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成され、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｙ１４８３７）にクローンされて、ｐＥｇＤ５Ｍ１（配列番号３０６）を生じた。
ｐＤＭＷ３６７−Ｍ４（図２０Ｃ；配列番号１９９）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＥｇＤ５Ｒ＊断片をｐＥｇＤ５Ｍ１（配列番号３０６）からのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ ＥｇＤ５Ｍ１断片で置換して、プラスミドｐＤＭＷ３６７−５Ｍ１（配列番号３０７）を構築した。このライゲーションの生成物は、キメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｍ１：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるｐＤＭＷ３６７−５Ｍ１であった。
実施例１１Ｋ：ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１株中のＥｇＤ５ＭおよびＥｇＤ５Ｍ１Δ５デサチュラーゼの機能分析
対照プラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４（配列番号１９９；実施例１１Ｄ）およびプラスミドｐＤＭＷ３６７−５Ｍ（配列番号３０５；実施例１１Ｉ）およびｐＤＭＷ３６７−５Ｍ１（配列番号３０７；実施例１１Ｊ）をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１株に、それぞれ別々に形質転換した。実施例１１Ｅに記載されるようにして、形質転換体をＭＭＬｅｕおよびＨＧＭ上で選択して培養し、ＦＡＭＥを調製してＧＣによって分析した。
ＥｇＤ５Ｒ＊、ＥｇＤ５Ｍ、およびＥｇＤ５Ｍ１のΔ５デサチュラーゼ活性（３つの形質転換体の平均）を下の表３７に要約する。変換効率（「Ｃｏｎｖ．Ｅｆｆｉｃ．」）は、実施例１１Ｅに記載される式に従って判定した。結果はプラスミドｐＤＭＷ３６７−Ｍ４内の野生型ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号１９８）と比較され、ＧＣ分析は、形質転換体によって総脂質の１０．８％のＤＧＬＡおよび３．６％のＡＲＡが生成されたと判定した（すなわち平均変換効率は２４．８％であった）。
Figure 2013535987
結果は、ＥｇＤ５Ｍ（配列番号１０６）およびＥｇＤ５Ｍ１（配列番号１０８）の双方が、野生型ＥｇＤ５Ｒ＊（配列番号１９８）よりも高いΔ５デサチュラーゼ活性を有したことを実証した。ＥｇＤ５Ｍと比べて改善されたＥｇＤ５Ｍ１のΔ５デサチュラーゼ活性は、アミノ酸残基３４７がタンパク質のΔ５デサチュラーゼ活性に影響を及ぼし、Ａｒｇとは対照的にＳｅｒが好ましいことを実証する。
実施例１１Ｌ：ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する、合成Δ５デサチュラーゼ遺伝子（「ＥｇＤ５Ｓ」）中のＨＰＧｓ（配列番号４２７）およびＨｘｘｘＨ（配列番号１８６）変異の同定
本実施例は、変異ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ（または「ＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧｓ」）遺伝子のＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内に変異を導入して、ＨＰＧＧ（配列番号１８１）およびＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）の保存ドメイン内の二重変異の効果を判定する。
ＥｇＤ５Ｓ（配列番号１９５および１９６）は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ＥｇＤ５（実施例１１Ｃ）に由来する合成Δ５デサチュラーゼである（米国特許第７，６７８，５６０号明細書）。ＥｇＤ５Ｓのアミノ酸配列はＥｇＤ５と同一であるが、ヌクレオチド配列が異なり；具体的には、翻訳開始部位の修飾に加えて、１３５０ｂｐのコード領域の内１９６ｂｐ（１４．５％）が修飾され、１８９コドン（４２％）が最適化されていた。ＧＣ含有量は、野性型遺伝子（すなわちＥｇＤ５）内の５５．５％から、合成遺伝子（すなわちＥｇＤ５Ｓ）内の５４．４％に低下した。そしてＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位は、ＥｇＤ５Ｓの翻訳開始コドン周囲および停止コドン後に、それぞれ組み込まれた。
米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書の実施例１〜４は、チトクロームｂ５様ドメインのアミノ酸残基３３〜３６に広がる、ＥｇＤ５ＳのＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフ内の第２のＧｌｙ残基の修飾（すなわちＨＰＧｘ［配列番号４３６］変異）を標的とする、部位特異的変異誘発反応のテンプレートとしてＥｇＤ５Ｓを使用した、変異ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ（配列番号３０８）の同定を記載する。このようにして、変異ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓはＨＰＧｓ（配列番号４２７）モチーフを含んでなり、ここでＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフの第２のＧｌｙ残基は、ＥｇＤ５Ｓ（配列番号１９６）をテンプレートとして使用してＳｅｒによって置換された。ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓのΔ５デサチュラーゼ活性（米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書）は、ＥｇＤ５ＳのΔ５デサチュラーゼ活性の約１０６．９％であった。プラスミドｐＤＭＷ３６９Ｓ（配列番号３０９）は変異ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ遺伝子を含有し；ベクター構成要素は、ＥｇＤ５Ｍ遺伝子の代わりに変異ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ遺伝子があることを除いて）、ｐＤＭＷ３６７−５Ｍ（本明細書の図２２Ｂ）と同様である。
実施例１１Ｇにおける二重ＥｇＤ５Ｒ＊変異体（すなわち変異ＨＰＧＧ［配列番号１８１］と変異ＨＤＡＳＨ［配列番号１８３］モチーフを同時に含んでなる）の成功裏の作成に基づいて、同様のＨｘｘｘＨ（配列番号１８６）変異をＥｇＤ５Ｓ−３６ｓに導入した際に、耐容されることが予期された。具体的には、ｐＤＭＷ３６９Ｓ（キメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｓ−３６Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる）をテンプレートとして、９対のオリゴヌクレオチド（配列番号３１０〜３２７；表３８）をプライマーとして使用して、単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によって、ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ（配列番号３０８）のＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内のＡｓｐ、ＡｌａまたはＳｅｒ残基のいずれかを個々に変異させ、それによって選択された９個のアミノ酸置換を作り出した。実施例１１Ｅに記載されるようにして、変異誘発に続いてプラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１株に形質転換し、ＭＭＬｅｕおよびＨＧＭ中で形質転換体を選択して培養し、ＦＡＭＥを調製してＧＣによって分析した。
ＨＰＧｓ（配列番号４２７）およびＨｘｘｘＨ（配列番号１８６）変異の双方がある、変異Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性（３つの形質転換体の平均）を下の表３８に要約する。ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓの変異体を含んでなる、変異ｐＤＭＷ３６９Ｓコンストラクトを含んでなる、形質転換体は、ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内のＡｓｐ、ＡｌａまたはＳｅｒ残基で起きたアミノ酸置換に準じて命名される（すなわち形質転換体ｐＤＭＷ３６９Ｓ−１５６ｅは、ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５６ｅと称される、位置１５６でＡｓｐを置換するＧｌｕを有し、それによってＨｅＡＳＨ［配列番号４３３］モチーフをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなり；形質転換体ｐＤＭＷ３６９Ｓ−１５７ｇはＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇと命名される変異Δ５デサチュラーゼを含んでなり、Ａｌａを置換するＧｌｙを有し、それによってＨＤｇＳＨ［配列番号４２９］モチーフなどをもたらす）。変換効率は、実施例１１Ｅに記載される式に従って判定した。結果はプラスミドｐＤＭＷ３６９Ｓ内のＥｇＤ５Ｓ−３６Ｓ（配列番号３０８）と比較され、ＧＣ分析は、形質転換体によって総脂質の８．１％のＤＧＬＡおよび６．８％のＡＲＡが生成されたと判定した（すなわち平均変換効率は４５．８％であった）。
Figure 2013535987
結果は、変異ＨＰＧＧモチーフ（すなわちＨＰＧｓ［配列番号４２７］）のみを有する変異ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓと比べて、なおも妥当なΔ５デサチュラーゼ活性を保ちながら、コドン最適化ＥｇＤ５ＳΔ５デサチュラーゼが、変異ＨＰＧＧ（配列番号１８１）および変異ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフの双方を含んでなるように、修飾され得ることを実証した。好ましい二重変異体は、ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５６ｅ（配列番号３２８および３２９；ｐＤＭＷ３６９Ｓ−１５６ｅ形質転換体中において３６．２％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ（配列番号１０９および１１０；ｐＤＭＷ３６９Ｓ−１５７ｇ形質転換体中において３６．６％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ａ（配列番号３３０および３３１；ｐＤＭＷ３６９Ｓ−１５８ａ形質転換体中において３９．１％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、およびＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ｇ（配列番号３３２および３３３；ｐＤＭＷ３６９Ｓ−１５８ｇ形質転換体中において３４．３％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）であった。
実施例１１Ｍ：ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）に由来する合成Δ５デサチュラーゼ遺伝子（「ＥａＤ５Ｓ」）中のＨａＧＧ（配列番号４２８）およびＨｘｘｘＨ（配列番号１８６）変異の同定
本実施例は、変異ＥａＤ５Ｓ−３５ａ（または「ＥａＤ５Ｓ−ＨａＧＧ」）遺伝子のＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内に変異を導入して、ＨＰＧＧ（配列番号１８１）およびＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）の保存ドメイン内の二重変異の効果を判定する。
米国特許第７，９４３，３６５号明細書は、Ｅ．アナベナ（Ｅ．ａｎａｂａｅｎａ）からのΔ５デサチュラーゼ（すなわちＥａＤ５、配列番号３３５および３３６）の単離およびクローニングを記載する。次にこの遺伝子は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化され、合成Δ５デサチュラーゼＥａＤ５Ｓ（配列番号３３７および３３８）がもたらされる。ＥａＤ５Ｓのアミノ酸配列はＥａＤ５と同一であるが、ヌクレオチド配列が異なり；具体的には、翻訳開始部位の修飾に加えて、１３６２ｂｐのコード領域の内１８３ｂｐ（１３．４％）が修飾され、１７４コドン（３８．３％）が最適化されていた。ＧＣ含量は野性型遺伝子（すなわちＥａＤ５；配列番号３３５）内の５７．６％から、合成遺伝子（すなわちＥａＤ５Ｓ；配列番号３３７）内の５４．６％に低下した。そしてＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位は、ＥａＤ５Ｓの翻訳開始コドン周囲および停止コドン後に、それぞれ組み込まれた。
米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書の実施例６は、チトクロームｂ５様ドメインのアミノ酸残基３４〜３７に広がる、ＥａＤ５ＳのＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフのＰｒｏ残基の修飾（すなわちＨｘＧＧ［配列番号４３７］変異）を標的とする、部位特異的変異誘発反応のテンプレートとしてＥａＤ５Ｓを使用した、変異ＥａＤ５Ｓ−３５ａ（配列番号３３４）の同定を記載する。このようにして、変異ＥａＤ５Ｓ−３５ａ（配列番号３３４）はＨａＧＧ（配列番号４２８）モチーフを含んでなり、ここでＨＰＧＧ（配列番号１８１）モチーフのＰｒｏ残基は、ＥａＤ５Ｓ（配列番号３３８）をテンプレートとして使用してＡｌａで置換された。ＥａＤ５Ｓ−３５ａのΔ５デサチュラーゼ活性（米国特許出願公開第２０１０−００７５３８６−Ａ１号明細書）は、ＥａＤ５ＳのΔ５デサチュラーゼ活性の約９９．２％であった。プラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）（配列番号３３９）は変異ＥａＤ５Ｓ−３５ａ遺伝子を含有し；ベクター構成要素は、ＥｇＤ５Ｍ遺伝子の代わりに変異ＥａＤ５Ｓ−３５ａ遺伝子があることを除いて）、ｐＤＭＷ３６７−５Ｍ（本明細書の図２２Ｂ；配列番号３０５）と同一である。
実施例１１Ｇにおける二重ＥｇＤ５Ｒ＊変異体、および実施例１１Ｌにおける二重ＥｇＤ５Ｓ変異体（すなわち変異ＨＰＧＧ［配列番号１８１］と変異ＨＤＡＳＨ［配列番号１８３］モチーフを同時に含んでなる）の成功裏の作成に基づいて、同様のＨｘｘｘＨ（配列番号１８６）変異をＥａＤ５Ｓ−３５ａに導入した際に、耐容されることが予期された。ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフは、ＥａＤ５ＳおよびＥａＤ５Ｓ−３５ａのアミノ酸残基１５６〜１６０に広がる。
ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）（キメラＦＢＡＩＮ：：ＥａＤ５Ｓ−３５ａ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなる）をテンプレートとして、９対のオリゴヌクレオチド（配列番号３４０〜３６１；表３９）をプライマーとして使用して、単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によって、ＥａＤ５Ｓ−３５ａ（配列番号３３４）のＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内のＡｓｐ、ＡｌａまたはＳｅｒを個々に変異させ、それによって選択された９個のアミノ酸置換を作り出した。実施例１１Ｅに記載されるようにして、変異誘発に続いてプラスミドをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ１株に形質転換し、ＭＭＬｅｕおよびＨＧＭ中で形質転換体を選択して培養し、ＦＡＭＥを調製してＧＣによって分析した。
ＨａＧＧ（配列番号４２８）およびＨｘｘｘＨ（配列番号１８６）変異を含んでなる、変異Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性（３つの形質転換体の平均）を下の表３９に要約する。ＥａＤ５Ｓ−３５ａの変異体を含んでなる、変異ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）コンストラクトを含んでなる、形質転換体は、ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフ内のＡｓｐ、ＡｌａまたはＳｅｒ残基で起きたアミノ酸置換に準じて命名される。すなわち形質転換体ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）−１５７ｅは、ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５７ｅと称される、位置１５７でＡｓｐを置換するＧｌｕを有し、それによってＨｅＡＳＨ［配列番号４３３］モチーフをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなり；形質転換体ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）−１５８ｇは、ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇと称される、Ａｌａを置換するＧｌｙを有し、それによってＨＤｇＳＨ［配列番号４２９］モチーフなどをもたらす、変異Δ５デサチュラーゼを含んでなる）。変換効率は、実施例１１Ｅに記載される式に従って判定した。結果はプラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）内のＥａＤ５Ｓ−３５ａ（配列番号３３４）と比較され、ＧＣ分析は、形質転換体によって総脂質の８．６％のＤＧＬＡおよび５．１％のＡＲＡが生成されたと判定した（すなわち平均変換効率は３７．２％であった）。
Figure 2013535987
結果は、変異ＨＰＧＧモチーフ（すなわちＨａＧＧ［配列番号４２８］）のみを有する変異ＥａＤ５Ｓ−３５ａと比べて、なおも妥当なΔ５デサチュラーゼ活性を保ちながら、コドン最適化ＥａＤ５ＳΔ５デサチュラーゼが、変異ＨＰＧＧ（配列番号１８１）および変異ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフの双方を含んでなるように、修飾され得ることを実証した。好ましい二重変異体は、ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ（配列番号１１１および１１２；ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）−１５８ｇ形質転換体中において２８．４％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｓ（配列番号３６２および３６３；ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）−１５８ｓ形質転換体中において２７．４％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、およびＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５９ｇ（配列番号３６４および３６５；ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）−１５９ｇ形質転換体中において２６．５％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）であった。

Claims (13)

  1. 乾燥細胞重量の質量％として測定して、少なくとも２５質量％のエイコサペンタエン酸を含んでなる油を産生する、組換え微生物宿主細胞。
  2. 油が、総脂肪酸の質量％として測定して、少なくとも４５質量％のエイコサペンタエン酸を含んでなる、請求項１に記載の組換え微生物宿主細胞。
  3. 油の総脂肪酸の質量％として測定されたリノール酸と、総脂肪酸の質量％として測定されたエイコサペンタエン酸との比率が少なくとも２．４である、請求項１または２に記載の組換え微生物宿主細胞。
  4. （ａ）少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼに連結された少なくとも１つのΔ９エロンガーゼを有するポリペプチドを含んでなる、少なくとも１つのマルチザイム；
    （ｂ）その発現が下方制御されている、少なくとも１つのペルオキシソーム形成因子タンパク質；および
    （ｃ）少なくともリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］活性を有する、少なくとも２つのポリペプチド；
    （ｄ）少なくともリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＰＤＡＴ」］活性を有する、少なくとも１つのポリペプチド
    を含んでなる、組換え宿主細胞。
  5. ｉ）Ｌ３５Ｆ変異；
    ｉｉ）Ｌ３５Ｍ変異；
    ｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ変異；
    ｉｖ）Ｌ３５Ｇ変異と、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、およびＡ２５４Ｙからなる群から選択される少なくとも１つのその他の変異；
    ｖ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｌ１０８Ｇ、およびＩ１７９Ｒ変異；
    ｖｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、およびＩ１７９変異；
    ｖｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｓ９Ｄ、Ｙ８４Ｃ、およびＩ１７９Ｒ変異；
    ｖｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｙ８４Ｃ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
    ｉｘ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｗ１３２Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
    ｘ）Ｋ５８ＲおよびＩ２５７Ｔ変異；
    ｘｉ）Ｄ９８Ｇ変異；
    ｘｉｉ）Ｌ１３０ＭおよびＶ２４３Ａ変異；および
    ｘｉｉｉ）Ｋ５８Ｒ、Ｌ３５Ｆ、Ｌ３５Ｇ、Ｌ３５Ｍ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｄ９８Ｇ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｌ１３０Ｍ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｖ２４３Ａ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、Ａ２５４Ｙ、およびＩ２５７Ｔからなる群から選択される、少なくとも２つの変異を含んでなる任意の組み合わせ
    からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異によって、配列番号３と異なる、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでなる、少なくとも１つの変異Δ９エロンガーゼポリペプチドをさらに含んでなる、請求項４に記載の組換え微生物宿主細胞。
  6. 少なくとも１つの変異Δ９エロンガーゼポリペプチドがＬ３５Ｇ置換を含んでなり、変異Δ９エロンガーゼポリペプチドが配列番号３のΔ９エロンガーゼ活性と比べて改善されたΔ９エロンガーゼ活性を有する、請求項５に記載の組換え微生物宿主細胞。
  7. マルチザイムが、
    （ａ）リンカーが、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択される；および
    （ｂ）配列が、配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６からなる群から選択される配列から本質的になる
    からなる群から選択される特性を有する、請求項４に記載の組換え微生物宿主細胞。
  8. 少なくとも２つのリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼが、
    （ａ）配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２５からなる群から選択される配列から本質的になる配列；および
    （ｂ）配列番号１８、配列番号２２、および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法に基づいて少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有し、配列番号２６および配列番号２７からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフをさらに含んでなるポリペプチド
    からなる群から選択される、請求項４に記載の組換え微生物宿主細胞。
  9. 少なくとも１つのリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼが、
    （ａ）配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択される配列から本質的になる配列；および
    （ｂ）配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法に基づいて少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド
    からなる群から選択される、請求項４に記載の組換え微生物宿主細胞。
  10. 宿主細胞がヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のものである、請求項４に記載の組換え微生物宿主細胞。
  11. 宿主細胞が、少なくとも１つの変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドをさらに含んでなり、ここで該変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドが、
    ａ）配列番号１８０［ＨｘＧｘ］に記載のアミノ酸モチーフと、配列番号１８２［ＨｘｘｘＨ］に記載のアミノ酸モチーフとを含んでなり、配列番号１８０［ＨｘＧｘ］が配列番号１８１［ＨＰＧＧ］と同一でなく、配列番号１８２［ＨｘｘｘＨ］が配列番号１８３［ＨＤＡＳＨ］と同一でない、変異ポリペプチド；
    ｂ）配列番号１０６［ＥｇＤ５Ｍまたはコドン最適化ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ）］、配列番号１０８［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓ］、配列番号１１０［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ］、配列番号１１２［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ］、配列番号２９９［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５７ｇ］、配列番号３０１［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ａ］、配列番号３０３［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号３２９［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５６ｅ］、配列番号３３１［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ａ］、配列番号３３３［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号３６３［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｓ］、および配列番号３６５［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５９ｇ］からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチド
    からなる群から選択される、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組換え微生物宿主細胞。
  12. ａ）エイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油が生産される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養するステップと；
    ｂ）任意選択的に、ステップ（ａ）の微生物油を回収するステップと
    を含んでなる、エイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油を製造する方法。
  13. ステップ（ｂ）の回収された油をさらに処理する、請求項１２に記載の方法。
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