CN105121624A - 制备脂肪二羧酸的生物学方法 - Google Patents

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Abstract

本发明部分地涉及生产脂肪二羧酸的生物学方法和能够进行这样的生产的工程微生物。本发明提供了能够产生脂肪二羧酸的工程微生物以及由这样的微生物表达的产物。还提供了用于生产脂肪二羧酸的生物学方法。

Description

制备脂肪二羧酸的生物学方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2012年12月19日提交的美国临时专利申请61/739,661的权益，该临时专利申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明的技术部分地涉及生产脂肪二羧酸的生物学方法和能够进行该生产的工程微生物。
背景技术
微生物利用各种酶驱动的生物学途径来支持它们自身的代谢和生长。细胞在体内从脱氧核糖核酸(DNA)合成包括酶在内的天然蛋白质。DNA首先转录成包含编码蛋白质的核糖核苷酸序列的互补核糖核酸(RNA)。然后，RNA通过与各种细胞组分如核糖体相互作用指导所编码的蛋白质的翻译。所得到的酶作为生物催化剂参与生物体产生分子所涉及的途径。
可利用这些途径收集天然产生的产物。还可改变这些途径以提高产量或产生在商业上可能有价值的不同产物。重组分子生物学方法的进展使得研究人员能从一种生物体中分离DNA，并将其插入另一生物体中，从而改变酶或其他蛋白质的细胞合成。重组分子生物学方法的进展也使微生物的基因组DNA中携带的内源基因能在拷贝数上增加，从而改变酶或其他蛋白质的细胞合成。此类遗传工程化能改变宿主生物体内的生物学途径，从而使其产生所需产物。微生物工业生产能最大程度地减少对腐蚀性化学品的使用和毒性副产物的产生，因而能提供某些化合物的“清洁”来源。合适的植物来源的原料的使用允许“绿色”化合物的生产，同时进一步最大程度地减少了对石油来源的化合物的需求和使用。
发明内容
在某些方面提供了一种遗传修饰的酵母，其包含：i)活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽或活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽；(ii)改变烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰；和(iii)改变二烯酰辅酶A还原酶(DCR)活性的遗传修饰，其中所述酵母能够从包含一种或多种来自植物油的组分的原料生产二酸。在一些方面还提供了一种使用这样的遗传修饰的酵母从包含一种或多种来自植物油的组分的原料生产二酸的方法。
在某些方面还提供了一种生产二酸的方法，其包括：(a)使实施方案A1至A44、B1至B33、C1至C15和G1至G65中任一项的遗传修饰的酵母与包含能够被所述酵母转化为二酸的不饱和植物脂肪酸的原料接触；(b)在从所述原料生产含有一个或多个不饱和性的二酸的条件下培养所述酵母；以及(c)氢化并去除一个或多个不饱和性。
在以下说明书、实施例、权利要求和附图中进一步描述了某些实施方案。
附图说明
附图说明了本发明技术的实施方案，并且是非限制性的。为清楚和便于说明，附图并非按比例绘制，在一些情况下，各方面可以放大或扩大显示以便理解特定的实施方案。
图1是在β-氧化阻断的微生物中癸烷向癸二酸的转化的图示。癸酸在ω氧化过程中作为中间体形成。
图2是在β-氧化阻断的微生物中十二烷向十二烷二酸的转化的图示。月桂酸在ω氧化过程中作为中间体形成。
图3是在β-氧化阻断的微生物中含有混合链长烷烃的原料向包含癸二酸的混合二酸产物转化的图示。混合链长脂肪酸在ω氧化过程中作为中间体形成。可利用适当的分离技术将癸二酸与其他二酸产物分离。
图4是在β-氧化阻断的微生物中含有混合链长烷烃的原料向包含十二烷二酸的混合二酸产物转化的图示。混合链长脂肪酸在ω氧化过程中作为中间体形成。十二烷二酸可以通过使用合适的分离技术从其他二酸产物中分离。
图5是在部分β-氧化阻断的微生物中长链烷烃向癸二酸的转化的图示。长链烷烃通过ω-氧化途径中的活性首先转化为长链脂肪酸，随后转化为长链二酸。该长链二酸可通过β-氧化途径中的活性转化为癸二酸，同时产生酰基辅酶A。
图6是在部分β-氧化阻断的微生物中长链烷烃向十二烷二酸的转化的图示。长链烷烃通过ω-氧化途径中的活性首先转化为长链脂肪酸，随后转化为长链二酸。该长链二酸可通过β-氧化途径中的活性转化为十二烷二酸，同时产生酰基辅酶A。
图7是在部分β-氧化阻断的微生物中含有混合链长烷烃的原料向癸二酸的转化的图示。该混合链长烷烃通过ω-氧化途径中的活性首先转化为混合链长脂肪酸，随后转化为混合二酸。混合二酸可通过β-氧化途径中的活性转化为癸二酸，同时产生酰基辅酶A。
图8是在部分β-氧化阻断的微生物中含有混合链长烷烃的原料向十二烷二酸的转化的图示。该混合链长烷烃通过ω-氧化途径中的活性首先转化为混合链长脂肪酸，随后转化为混合二酸。混合二酸可通过β-氧化途径中的活性转化为十二烷二酸，同时产生酰基辅酶A。
图9图示了在完全β-氧化阻断的假丝酵母属酵母菌株中癸烷向癸二酸的转化。在孵育图中所示的时间后，对培养基进行气相色谱分析。结果表明大于99％的癸烷转化为癸二酸，通过气相色谱法还检测到最少量的癸酸。通过气相色谱法没有检测到任何其他一元酸或二酸的显著积累。实验细节和结果在实施例1中给出。
图10图示了在假丝酵母属酵母菌株中癸酸向癸二酸的转化。GC分析在预定的生长期后进行。通过使用起始浓度的癸酸，几乎所有加入的癸酸都转化为癸二酸。实验细节和结果在实施例2中给出。
图11图示了在使用部分β-氧化阻断的热带假丝酵母菌株(例如sAA106)的发酵条件下，从长链脂肪酸向混合二酸的转化期间产生的二酸的分布。实验细节和结果在实施例5中给出。
图12图示了在具有另外的遗传修饰的完全β-氧化阻断的假丝酵母属酵母菌株中癸烷向癸二酸的转化。菌株sAA003为完全β-氧化阻断的对照菌株。+CPR表示完全β-氧化阻断的菌株还包含拷贝数增加的细胞色素P450还原酶。+CPR+A12表示起始菌株sAA003包含拷贝数增加的细胞色素P450还原酶的另外的遗传修饰，并且还包含拷贝数增加的细胞色素P450A12(例如CYP52A12)。+CPR+A18表示起始菌株sAA003包含拷贝数增加的细胞色素P450还原酶的另外的遗传修饰，并且还包含拷贝数增加的细胞色素P450A18(例如CYP52A18)。+CPR+A19表示起始菌株sAA003包含拷贝数增加的细胞色素P450还原酶的另外的遗传修饰，并且还包含拷贝数增加的细胞色素P450A19(例如CYP52A19)。+CPR+A20表示起始菌株sAA003包含拷贝数增加的细胞色素P450还原酶的额外遗传修饰，并且还包含拷贝数增加的细胞色素P450A20(例如CYP52A20)。图12的y-轴是理论最大产率的百分比。实验细节和结果在实施例7中给出。
图13图示了在完全β-氧化阻断的假丝酵母属酵母菌株中月桂酸甲酯向十二烷二酸的转化结果，该菌株还包含单加氧酶还原酶活性，单加氧酶活性，或者单加氧酶还原酶活性和单加氧酶活性的遗传改变。在48小时的孵育后，对培养基进行气相色谱分析。结果表明，在摇瓶发酵实验中，含有拷贝数增加的CYP52A18单加氧酶活性和拷贝数增加的单加氧酶还原酶活性(例如CPR750)的假丝酵母菌株产生了最高产率的十二烷二酸(例如DDDA)。实验细节和结果在实施例8中给出。
图14和图15示意性地图示了采用特定的底物特异性鉴定酰基辅酶A氧化酶活性的筛选和/或选择方法。该方法可以与采用链长改变的底物特异性产生和/或鉴定酰基辅酶A氧化酶活性结合使用。筛选/选择方法的细节在实施例9中给出。
图16图示了使用不同量的癸烷作为原料，在发酵条件下，本文所述的工程微生物将癸烷转化为癸二酸的结果。实验细节和结果在实施例3中给出。
图17图示了在发酵条件下，本文所述的工程微生物将混合脂肪酸原料(例如混合链长脂肪酸)转化为癸二酸的结果。实验细节和结果在实施例4中给出。
图18示出了包含POX4启动子和POX4终止子的命名为pAA073的质粒的示意图。
图19图示了使用PCR重叠延伸产生ECI1的全长缺失盒。
图20图示了使用PCR重叠延伸产生ECI1的第二等位基因的全长缺失盒。
图21显示了从假丝酵母属菌株中分离的Pox5的酰基辅酶A氧化酶活性谱。
图22图示了用于将定点点突变引入至酰基辅酶A氧化酶基因的PCR重叠延伸方法。
图23显示了AcoI和AcoII的N-末端180个氨基酸的序列比对。以灰色突出显示的氨基酸位于α螺旋内而以粗体突出显示的氨基酸位于β折叠内。中心序列代表显示保守性残基的共有序列。
图24图示了来自假丝酵母属菌株ATCC20336的Pox4(图24A)和Pox5(图24B)的热点向导分析(HotSpotWizardanalysis)。以深灰色或浅灰色突出显示的残基是诱变“热点”。在该位置处深灰色残基显示出比浅灰色残基更大的变异性。以粗体显示的残基发现于底物结合袋内或靠近底物结合袋。
图25图示了RnAcoII的热点向导分析。以深灰色或浅灰色突出显示的残基是诱变“热点”。在该位置处深灰色残基显示出比浅灰色残基更大的变异性。以粗体显示的残基发现于底物结合袋内或靠近底物结合袋。
图26显示了全部三种蛋白质的多序列比对。RnAcoII(来自褐家鼠(R.norvegicus)的AcoII)的下划线标出的部分代表可变剪接的外显子3。
图27显示了与Pox5突变体相关的酰基辅酶A活性谱。被称为“C18”的底物被缩短并属于C18:1底物。
图28显示了与Pox4突变体相关的酰基辅酶A活性谱。
图29显示了被命名为pAA298的质粒的图谱。
图30A和图30B显示了来自维斯假丝酵母(POX4和POX5)和解脂耶氏酵母(YlPOX2、YlPOX3和YlPOX5)的选择的酰基辅酶A酶的氨基酸比对。还显示了共有序列比对。
图31显示了由亚油酸合成癸二酸。
图32显示了pAA918的质粒载体图谱。
图33除了来自ATCC20336的POX4和POX5之外还显示了六种解脂耶氏酵母酰基辅酶A氧化酶蛋白质的活性谱。使用体外酰基辅酶A氧化酶测定(例如，如实施例41中描述的)和不同链长(例如，C6，六个碳；C8，八个碳；C10，十个碳；C12，十二个碳；C14，十四个碳；和C18-1，十八个碳)的酰基辅酶A底物来测定这些酶的活性谱。
图34显示了包括ACO、ECI、DCI(二烯酰辅酶A异构酶)和DCR以及它们的反应产物和底物的反应途径的示意性示例。
具体实施方案
某些脂肪二羧酸(即，二酸，例如，十二烷二酸或癸二酸)是用于制备某些聚酰胺、聚氨酯和增塑剂的生产过程中的化学中间体，所有这些二羧酸例如均在生产诸如防腐剂、高档涂料(top-gradecoating)、热熔涂料和粘合剂、绘画材料、腐蚀抑制剂、表面活性剂、工程塑料的物品中具有广泛应用，并且还可在香料生产中用作起始材料。例如，十二烷二酸(又称为1,12十二烷二酸和DDDA)是一种为脂肪二羧酸的12个碳有机分子。在另一实例中，癸二酸，又称为1,10癸二酸和1,8辛烷二甲酸(octanedicarboxylicacid)，是一种为脂肪二羧酸的10个碳有机分子。
本文提供了用于生产脂肪二羧酸(本文中还称为二酸)的方法。可以生产任何合适的二酸，且所生产的二酸通常包含在分子的每个末端的酸部分(例如，αω二酸)。二酸有时是C4至C24二酸(即，含有4个碳至24个碳的二酸)，并且有时是C8、C10、C12、C14、C16、C18或C20二酸。本文的酵母和方法能够生产含有奇数数目的碳的二酸，并且有时产物包含选自C5、C7、C9、C11、C13、C15、C17、C19、C21和C23二酸的一种或多种二酸。二酸的烃部分有时是完全饱和的，并且有时二酸包含一个或多个不饱和性(例如，双键)。
二酸的非限制性实例包括十八烷二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)以及使用生物系统的其他有机中间体。脂肪二羧酸的非限制性实例包括软木酸(即，辛二酸、1,8-辛二酸、辛二酸、辛烷-1,8-二酸、1,6-己烷二甲酸、羊脂二酸(capryllicdiacid))、皮脂酸(即，1,10-癸二酸、癸二酸、癸烷-1,10-二酸、1,8-辛烷二甲酸、羊蜡二酸(capricdiacid))、十二烷二酸(即，DDDA、1,12-十二烷二酸、十二烷二酸、十二烷-1,12-二酸、1,10-癸烷二甲酸、十亚甲基二甲酸(decamethylenedicaboxylicacid)、1,10-二羧基癸烷(1,10-dicarboxydecane)、月桂二酸(lauricdiacid))、十四烷二酸(即，TDDA、1,14-十四烷二酸、十四烷二酸、十四烷-1,14-二酸、1,12-十二烷二甲酸、肉豆蔻二酸(myristicdiacid))、它普酸(thapsicacid)(即，十六烷二酸、1,16-十六烷二酸、十六烷二酸、十六烷-1,16-二酸、1,14-十四烷二甲酸、棕榈二酸)、顺式-9-十六碳烯二酸(即，棕榈烯二酸(palmitoleicdiacid))、辛二酸(即，1,18-十八烷二酸、十八烷二酸、十八烷-1,18-二酸、1,16-十六烷二甲酸、硬脂二酸(stearicdiacid))、顺式-9-十八碳烯二酸(即，油二酸(oleicdiacid))、顺式-9,12-十八碳烯二酸(即，亚油二酸(linoleicdiacid))、顺式-9,12,15-十八碳烯二酸(即，亚麻二酸(linolenicdiacid))、花生二酸(arachidicdiacid)(即，二十烷二酸(eicosanoicdiacid)、正二十烷二酸(icosanoicdiacid))、11-二十碳烯二酸(11-eicosenoicdiacid)(即，顺式-11-二十碳烯二酸(cis-11-eicosenedioicacid))、13-二十碳烯二酸(13-eicosenoicdiacid)(即，顺式-13-二十碳烯二酸(cis-13-eicosenedioicacid)、花生四烯二酸(arachidonicdiacid)(即，顺式-5,8,11,14-二十碳四烯二酸(cis-5,8,11,14-eicosatetraenedioicacid))。
遗传修饰的酵母可与原料一起提供以生产二酸，并且所述原料有时包含由其产生所述二酸的基本上纯的脂肪族分子。在某些实施方案中，所述原料含有可由其产生二酸的混合的一系列脂肪族分子。在一些实施方案中，所述原料中的脂肪族分子是占主导地位的脂肪族物质且有时由该脂肪族分子产生的特定二酸是所产生的占主导地位的二酸物质。占主导地位的物质通常是按脂肪族分子物质的重量计在原料中占51％或更多，或者按二酸物质的重量计在产物中占51％或更多(例如，约55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、或95％或更多)。
此类生产系统可具有显著较小的环境影响，并且与目前的制造系统相比在经济上有竞争力。因此，本文部分提供了由工程微生物生产脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的方法。在一些实施方案中，将微生物工程化为含有至少一种编码酶的异源基因，其中该酶是工程化至微生物中的新的和/或改变的途径的成员。在某些实施方案中，可选择具有升高的天然酶活性的生物。
微生物
所选的微生物通常适合遗传操作，并且通常可在用于目标脂肪二羧酸产物的工业生产的细胞密度下培养。所选的微生物可维持在发酵装置中。
本文所用的术语“工程微生物”指包含一种或多种与用作起点的微生物(下文称为“宿主微生物”)中存在的活性不同的活性的修饰微生物。在一些实施方案中，工程微生物包含异源多核苷酸，在某些实施方案中，工程微生物经历相对于宿主微生物改变活性或引入活性的选择条件。因此，工程微生物被人为直接或间接改变。宿主微生物有时是天然微生物，有时是已在某点上工程化的微生物。
在一些实施方案中，工程微生物是通常能分裂和增殖的单细胞生物体。微生物可包含一种或多种以下特征：需氧、厌氧、丝状、非丝状、单倍体、双倍体、营养缺陷型和/或非营养缺陷型。在某些实施方案中，工程微生物是原核微生物(例如，细菌)，在某些实施方案中，工程微生物是非原核微生物。在一些实施方案中，工程微生物是真核微生物(例如，酵母、真菌、变形虫)。在一些实施方案中，工程微生物是真菌。在一些实施方案中，工程生物体是酵母。
可选择任何合适的酵母作为宿主微生物、工程微生物、遗传修饰的生物体，或者异源或修饰的多核苷酸的来源。酵母包括但不限于：耶氏酵母(例如解脂耶氏酵母(以前分类为解脂假丝酵母(Candidalipolytica))、假丝酵母属酵母(例如，拉考夫假丝酵母(C.revkaufi))、维斯假丝酵母(C.viswanathii)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母、产朊假丝酵母(C.utilis))、红酵母属酵母(例如，粘红酵母(R.glutinus)、牧草红酵母(R.graminis))、红冬孢酵母属酵母(例如，圆红冬孢酵母(R.toruloides))、酵母属酵母(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、贝酵母(S.bayanus)、巴斯德酵母(S.pastorianus)、卡尔酵母(S.carlsbergensis))、隐球酵母属酵母、丝孢酵母属酵母(例如，茁芽丝孢酵母(T.pullans)、丝孢酵母(T.cutaneum))、毕赤酵母属酵母(例如，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))和油脂酵母属酵母(例如，L.starkeyii，产油油脂酵母(L.lipoferus))。在一些实施方案中，合适的酵母是蛛网霉属(Arachniotus)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Auxarthron,芽酵母属(Blastomyces)、假丝酵母属、金小孢子属(Chrysosporuim)、ChrysosporuimDebaryomyces、球孢子属(Coccidiodes)、隐球菌属、裸子囊菌属(Gymnoascus)、汉逊酵母属(Hansenula)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromces)、油脂酵母属(Lipomyces)、Lssatchenkia、小孢霉属(Microsporum)、Myxotrichum、Myxozyma、树粉孢属(Oidiodendron)、管囊酵母属(Pachysolen)、青霉属(Penicillium)、毕赤酵母属(Pichia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、帚酶属(Scopulariopsis)、瘤孢属(Sepedonium)、丝孢酵母属(Trichosporon)或耶氏酵母属(Yarrowia)的酵母。在一些实施方案中，合适的酵母是Arachniotusflavoluteus、黄曲霉(Aspergillusflavus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)、Auxarthronthaxteri、皮炎芽酵母(Blastomycesdermatitidis)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、杜氏假丝酵母(Candidadubliniensis)、无明假丝酵母(Candidafamata)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)、乳酒假丝酵母(Candidakefyr)、克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)、郎比可假丝酵母(Candidalambica)、解脂假丝酵母(Candidalipolytica)、葡萄牙假丝酵母(Candidalustitaniae)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、铁红假丝酵母(Candidapulcherrima)、拉考夫假丝酵母(Candidarevkaufi)、皱落假丝酵母(Candidarugosa)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)、赞斯托假丝酵母(Candidaxestobii)、角质金孢子菌(Chrysosporuimkeratinophilum)、粗球孢子菌(Coccidiodesimmitis)、白色隐球菌(Cryptococcusalbidus)diffluens变种、罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)、新型隐球酵母(Cryptococcusneofomans)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、Gymnoascusdugwayensis、异常汉逊氏酵母(Hansenulaanomala)、夹膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、西方伊萨酵母(Issatchenkiaoccidentalis)、东方伊萨酵母(Isstachenkiaorientalis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)、瓦尔提克鲁维酵母(Kluyveromyceswaltii)、产油油脂酵母(Lipomyceslipoferus)、Lipomycesstarkeyii、石膏样小孢霉(Microsporumgypseum)、Myxotrichumdeflexum、Oidiodendronechinulatum、Pachysolentannophilis、特异青霉(Penicilliumnotatum)、异常毕赤酵母(Pichiaanomala)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、树干发酵酵母(Pichiastipitis)、红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、胶红红酵母(Rhodotorulaglutinus)、牧草红酵母(Rhodotorulagraminis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、顶孢帚霉(Scopulariopsisacremonium)、黄瘤孢(Sepedoniumchrysospermum)、皮肤丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)、茁芽丝孢酵母(Trichosporonpullans)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)(以前归类为解脂假丝酵母)。在一些实施方案中，酵母是解脂耶氏酵母菌株，包括但不限于：ATCC20362、ATCC8862、ATCC18944、ATCC20228、ATCC76982和LGAMS(7)1菌株(PapanikolaouS.和AggelisG.,Bioresour.Technol.82(1):43-9(2002))。在某些实施方案中，酵母是一种假丝酵母属酵母。可以使用和/或遗传修饰任何合适的假丝酵母属的种以用于生产脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)。在一些实施方案中，合适的假丝酵母属的种包括但不限于白假丝酵母、杜氏假丝酵母、无明假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、郎比可假丝酵母、解脂假丝酵母、葡萄牙假丝酵母(Candidalustitaniae)、近平滑假丝酵母、铁红假丝酵母、拉考夫假丝酵母、皱落假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、维斯假丝酵母、赞斯托假丝酵母和任何其他本文所述的假丝酵母属酵母。假丝酵母菌株的非限制性实例包括但不限于sAA001(ATCC20336)、sAA002(ATCC20913)、sAA003(ATCC20962)、sAA496(US2012/0077252)、sAA106(US2012/0077252)、SU-2(ura3-/ura3-)、H5343(β氧化阻断的；美国专利号5648247)菌株。来自假丝酵母属酵母的任何合适的菌株可以用作遗传修饰的亲代菌株。
酵母属、种和菌株通常在遗传内容上如此密切相关以至于可能难以将它们区分、归类和/或命名。在一些情况下，解脂假丝酵母和解脂耶氏酵母可能难以进行区分、归类和/或命名，并且在一些情况下可以被认为是同一生物体。在一些情况下，热带假丝酵母和维斯假丝酵母可能难以进行区分、归类和/或命名(例如，参见Arie等,J.Gen.Appl.Microbiol.,46,257-262(2000))。对于本文所述的实施方案，从ATCC与其他商业或学术来源获得的一些热带假丝酵母和维斯假丝酵母菌株可被认为是等同的且同样适合的。在一些实施方案中，认为热带假丝酵母和维斯假丝酵母的一些亲代菌株只是命名不同。
可选择任何合适的真菌作为宿主微生物、工程微生物或异源多核苷酸的来源。真菌的非限制性实例包括但不限于：曲霉(例如，寄生曲霉、构巢曲霉)、破囊壶菌(Thraustochytrium)、裂殖壶菌(Schizochytrium)和根霉(Rhizopus)(例如，无根根霉(R.arrhizus)、稻根霉(R.oryzae)、黑根霉(R.nigricans))。在一些实施方案中，真菌是寄生曲霉菌株，包括但不限于：菌株ATCC24690，在某些实施方案中，真菌是构巢曲霉菌株，包括但不限于菌株ATCC38163。
可选择任何合适的原核生物作为宿主微生物、工程微生物或异源多核苷酸的来源。可选择革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。细菌的实例包括但不限于：杆菌(例如，枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium))、不动杆菌属(Acinetobacter)、诺卡式菌属(Norcardia)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌(E.coli)(如菌株DH10B、Stbl2、DH5-α、DB3、DB3.1)、DB4、DB5、JDP682和ccdA-over(例如，美国申请号09/518,188)))、链霉菌(Streptomyces)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷氏菌(S.marcessans))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、伤寒沙门氏菌(S.typhi))、巨型球菌属(Megasphaera)(例如，埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii))。细菌还包括但不限于：光合细菌(例如，绿色非硫细菌(例如，绿弯菌属(Choroflexus)细菌(例如，橙黄绿弯菌(C.aurantiacus))、绿丝菌属(Chloronema)细菌(例如，巨大绿丝菌(C.gigateum)))、绿色硫细菌(例如，绿菌属(Chlorobium)细菌(例如，泥生绿菌(C.limicola)、暗网菌属(Pelodictyon)细菌(例如，微黄暗网菌(P.luteolum))、紫色硫细菌(例如，着色菌属(Chromatium)细菌(例如，奥氏着色菌(C.okenii)))和紫色非硫细菌(例如，红螺菌属(Rhodospirillum)细菌(例如，深红红螺菌(R.rubrum))、红细菌属(Rhodobacter)细菌(例如，类球红细菌(R.sphaeroides)、荚膜红细菌(R.capsulatus))和红微菌属(Rhodomicrobium)细菌(例如，万尼氏红微菌(R.vanellii)))。
非微生物生物体的细胞可用作宿主微生物、工程微生物或异源多核苷酸的来源。此类细胞的实例包括但不限于：昆虫细胞(例如，果蝇属(例如黑腹果蝇(D.melanogaster))、夜蛾属(例如草地贪夜蛾(S.frugiperda)Sf9或Sf21细胞)和粉纹夜蛾属(Trichoplusa)(例如High-Five细胞)；线虫细胞(例如秀丽线虫(C.elegans)细胞)；禽类细胞；两栖动物细胞(例如非洲爪蟾(Xenopuslaevis)细胞)；爬行动物细胞；和哺乳动物细胞(例如NIH3T3、293、CHO、COS、VERO、C127、BHK、Per-C6、Bowes黑色素瘤和HeLa细胞)；和植物细胞(例如，拟南芥(Arabidopsisthaliana)、烟草(Nicotaniatabacum)、Cupheaacinifolia、Cupheaaequipetala、Cupheaangustifolia、Cupheaappendiculata、Cupheaavigera、Cupheaavigeravar.pulcherrima、Cupheaaxilliflora、Cupheabahiensis、Cupheabaillonis、Cupheabrachypoda、Cupheabustamanta、Cupheacalcarata、Cupheacalophylla、Cupheacalophyllasubsp.mesostemon、香膏萼距花(Cupheacarthagenensis)、Cupheacircaeoides、Cupheaconfertiflora、Cupheacordata、Cupheacrassiflora、Cupheacyanea、Cupheadecandra、Cupheadenticulata、Cupheadisperma、Cupheaepilobiifolia、Cupheaericoides、Cupheaflava、Cupheaflavisetula、Cupheafuchsiifolia、Cupheagaumeri、Cupheaglutinosa、Cupheaheterophylla、Cupheahookeriana、细叶萼距花(Cupheahyssopifolia)(Mexican-heather)、Cupheahyssopoides、火红萼距花(Cupheaignea)、Cupheaingrata、Cupheajorullensis、披针叶萼距花(Cuphealanceolata)、Cuphealinarioides、Cupheallavea、Cuphealophostoma、Cuphealutea、Cuphealutescens、Cupheamelanium、Cupheamelvilla、Cupheamicrantha、小瓣萼距花(Cupheamicropetala)、Cupheamimuloides、Cupheanitidula、Cupheapalustris、Cupheaparsonsia、Cupheapascuorum、Cupheapaucipetala、平卧萼距花(Cupheaprocumbens)、Cupheapseudosilene、Cupheapseudovaccinium、Cupheapulchra、Cuphearacemosa、Cuphearepens、Cupheasalicifolia、Cupheasalvadorensis、Cupheaschumannii、Cupheasessiliflora、Cupheasessilifolia、Cupheasetosa、海棠萼距花(Cupheaspectabilis)、Cupheaspermacoce、Cupheasplendida、Cupheasplendidavar.viridiflava、Cupheastrigulosa、Cupheasubuligera、Cupheateleandra、Cupheathymoides、Cupheatolucana、Cupheaurens、Cupheautriculosa、粘毛萼距花(Cupheaviscosissima)、Cupheawatsoniana、Cupheawrightii、披针叶萼距花)).
用作宿主生物体或异源多核苷酸的来源的微生物或细胞可商购获得。本文所述的微生物和细胞及其他合适的微生物和细胞可购自，例如InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA，美国模式培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,Virginia)和农业研究培养物保藏中心(AgriculturalResearchCultureCollection，NRRL；Peoria,Illinois)。
可以以任何合适的形式提供宿主微生物和工程微生物。例如，可在液体培养物或固体培养物(例如，基于琼脂的培养基)中提供此类微生物，该培养物可以是原代培养物或可能已传代(例如，稀释和培养)一次或多次。还可以以冷冻形式或干燥形式(例如，冻干的)提供微生物。可以以任何合适的浓度提供微生物。
碳加工途径和活性
图1-8示意性地示出了可用于从各种起始碳源或原料生产脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的工程化途径的非限制性实施方案。图1描绘了用于在具有完全阻断的β-氧化途径的微生物中使用癸烷作为碳源起始材料生产癸二酸的非限制性工程生物体途径的实施方案。图2描绘了用于在具有完全阻断的β-氧化途径的微生物中使用十二烷作为碳源起始材料生产十二烷二酸的非限制性工程生物体途径的实施方案。图3和图4描绘了用于在具有完全阻断的β-氧化途径的微生物中使用混合链长烷烃作为碳源起始材料生产混合链长二酸的非限制性工程生物体途径的实施方案。可以使用离心、有机溶剂萃取、色谱法和/或其他纯化/分离技术的合适的组合，将癸二酸(图3)和十二烷二酸(图4)与其他二酸产物进行分离和/或纯化。图5和图6描绘了用于在具有部分阻断的β氧化途径的微生物中使用长链烷烃作为碳源起始材料生产癸二酸(图5)和十二烷二酸(图6)的非限制性工程生物体途径的实施方案。图7和图8描绘了用于在具有部分阻断的β氧化途径的微生物中使用混合链长烷烃作为碳源起始材料生产癸二酸(图7)和十二烷二酸(图8)的非限制性工程生物体途径的实施方案。
使用天然存在的和/或工程化途径中的天然存在的和/或工程化的活性，将烷烃碳源起始材料进行初始代谢以产生中间体醇，该醇随后可通过图1-8中示出的ω-氧化途径中的其他天然存在的和/或工程化的活性的作用转化为羧酸(例如，脂肪酸)。
烷烃通过细胞色素P450酶的活性进行ω-羟基化，从而产生起始烷烃碳源材料的同等链长醇衍生物。在某些实施方案中，可以通过增加细胞色素P450基因的拷贝数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个基因拷贝)，通过提高调节细胞色素P450基因转录的启动子活性，或通过增加细胞色素P450基因的拷贝数并提高调节细胞色素P450基因转录的启动子活性来提高细胞色素P450活性，从而通过一种或多种细胞色素P450酶的提高的活性来增加目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的产量。在一些实施方案中，细胞色素P450酶对于宿主微生物是内源性的。在某些实施方案中，可以根据碳源起始材料增添和/或提高一种或多种细胞色素P450活性。细胞色素P450有时响应于某些原料或碳源起始材料的刺激而表现出提高的活性。在一些实施方案中，工程微生物包含受所选择的碳源起始材料或原料刺激的拷贝数增加的一种或多种细胞色素P450。可以使用任何合适的试验来确定对所选的起始碳源或原料具有反应性的细胞色素P450。在宿主微生物已暴露于所选碳源或原料不同时间后，适合用于鉴定对起始碳源或原料具有反应性的细胞色素P450的试验的非限制性实例包括RT-PCR或qRT-PCR。
细胞色素P450还原酶(CPR)的活性还原细胞色素P450，从而循环利用细胞色素P450以获得进一步的酶活性。在某些实施方案中，CPR酶对宿主微生物是内源性的。在一些实施方案中，可通过增加CPR基因的拷贝数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个拷贝的基因)，通过增强调节CPR基因转录的启动子活性，或通过增加CPR基因的拷贝数和增强调节CPR基因转录的启动子活性来提高宿主CPR活性，从而通过增加细胞色素P450的循环利用来提高目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的产量。在某些实施方案中，启动子可以是异源启动子(例如，内源性或外源性启动子)。在一些实施方案中，CPR基因是异源和外源性的，可从任何合适的生物体分离。可分离CPR基因的生物体的非限制性实例包括热带假丝酵母、酿酒酵母和巨大芽孢杆菌。
可由脂肪醇氧化酶家族的酶(例如，长链脂肪醇氧化酶EC1.1.3.20)或醇脱氢酶家族的酶(例如，脂肪醇脱氢酶；EC1.1.1.1)进行醇到醛的氧化。所述醛可以通过醛脱氢酶(例如，长链醛脱氢酶或脂肪醛脱氢酶；EC1.2.1.48)的活性被氧化成羧酸(例如，癸二酸或十二烷二酸)。在一些实施方案中，所述长链脂肪醇氧化酶、脂肪醇脱氢酶和/或长链醛脱氢酶存在于宿主生物体中。有时可通过增加酶的拷贝数，或通过提高转录基因的启动子的活性来提高通过这两个步骤的通量。在一些实施方案中，对10、12或14个碳的底物具有特异性的醇和醛脱氢酶可以从另一生物体中分离出并插入到宿主生物体中。
图1描绘了用于使用癸烷(例如，C10烷烃)作为碳源起始材料制备癸二酸的工程生物体途径的非限制性实施方案。由于癸烷的碳链长度，没有必要缩短链以得到10个碳的二酸——癸二酸。因此可以使用完全β氧化阻断的微生物来最小化所需10个碳的二酸向具有较短链长的二酸的转化。
图2描绘了用于使用十二烷(例如，C12烷烃)作为碳源起始材料制备十二烷二酸的工程生物体途径的非限制性实施方案。由于十二烷的碳链长度，没有必要缩短链以得到12个碳的二酸——十二烷二酸。因此可以使用完全β氧化阻断的微生物来最小化所需12个碳的二酸向具有较短链长的二酸的转化。
图3和图4描绘了用于使用含有混合链长烷烃的碳源或原料作为碳源起始材料产生一组混合的二酸(脂肪二羧酸)产物(包括癸二酸(图3)和十二烷二酸(图4))的工程生物体途径的非限制性实施方案。可以使用任何合适的混合链长烷烃、脂肪醇、混合链长脂肪醇原料、脂肪酸、混合脂肪酸原料、石蜡、脂肪或油。在一些实施方案中，起始材料中碳链长度的分布与混合二酸产物中所需碳链长度的分布基本相似。在某些实施方案中，富集用于所需链长度的原料。在一些实施方案中，富集用于约10个碳的碳链长度的富集级分。在一些实施方案中，富集用于约12个碳的碳链长度的富集级分。在一些实施方案中，由于产生的二酸具有与碳源起始材料中发现的链长度基本相同的链长度，因此可以使用完全β-氧化阻断的微生物来最小化具有所需链长的二酸向具有较短链长的二酸的转化。图3和图4中的途径的下面部分示出了通过使用本文所述或本领域已知的分离技术将癸二酸和十二烷二酸分别从混合二酸产物中分离。
在涉及具有部分阻断的β-氧化途径的遗传修饰生物体的某些实施方案(参见图5-8)中，适合使用的原料包括但不限于脂肪酸馏出物或可再生油的皂脚(棕榈油脂肪酸馏出物、大豆油皂脚、椰子油皂脚)、可再生油(椰子油、棕榈油、棕榈仁油、大豆油、玉米油等等)、等于或大于C10的链长的基本单独的形式(例如，基本上纯的形式)或混合物形式的脂肪酸、等于或大于C10的链长的基本单独的形式(例如，基本上纯的形式)或混合物形式的烷烃。
具有较长链长(例如，12个碳长度或更长)的碳源可以使用天然存在的和/或工程化的途径进行代谢以产生可进一步使用图5-8的下面部分所示的β氧化途径代谢的分子。在一些实施方案中，图5-8中示出的途径中的β-氧化活性还可进行工程化(例如，如本文所述)以加强代谢和目标产物的形成。在一些实施方案中，所述β-氧化途径的一种酰基辅酶A氧化酶活性进行工程化以得到强化，而在某些实施方案中，改变β-氧化途径中的其他酰基辅酶A氧化酶活性以降低或消除所述活性，从而优化所需链长的二酸或具有所需链长分布的二酸的产量。在一些实施方案中，选择和/或工程化酰基辅酶A氧化酶以改变该酶的底物特异性。在某些实施方案中，异源性和/或工程化酰基辅酶A氧化酶的底物特异性是针对在约12个碳与约18个碳之间的碳链长度，而在一些实施方案中，异源性和/或工程化酰基辅酶A氧化酶对低于12个碳长度的底物不显示活性。在某些实施方案中，具有所需链长特异性的异源性酰基辅酶A氧化酶可从任何合适的生物体中分离。包含或可用作酰基辅酶A氧化酶供体的生物体的非限制性实例包括酵母(例如，假丝酵母属、酵母属、德巴利酵母属(Debaryomyces)、Meyerozyma、洛徳酵母属(Lodderomyces)、发酵酵母属(Scheffersomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假囊酵母属(Eremothecium)、结合酵母属(Zygosaccharomyces)、Lachancea、Nakaseomyces)、动物(例如，人类(Homo)、属鼠(Rattus))、细菌(例如，埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属、芽孢杆菌属)或植物(例如，拟南芥属(Arabidopsis)、烟草属(Nictotania)、萼距花属(Cuphea))。
在某些实施方案中，中等或长链长(例如，在约10个碳到22个碳之间)的碳源起始材料(例如，烷烃、脂肪酸、脂肪醇、二羧酸)转化成用于进入β-氧化途径的酰基辅酶A衍生物。在一些实施方案中，所述酰基辅酶A衍生物可通过酰基辅酶A连接酶的活性产生。在某些实施方案中，所述酰基辅酶A衍生物随后通过具有天然的或改变的底物特异性的酰基辅酶A氧化酶(例如，又称为酰基辅酶A氧化还原酶和脂肪酰基-辅酶A氧化酶)的活性被氧化。反式-2,3-脱氢酰基辅酶A衍生物长链脂肪醇、脂肪酸或二羧酸可通过烯酰辅酶A水合酶的活性进一步转化成3-羟基酰基辅酶A。3-羟基酰基辅酶A可通过3-羟基酰基辅酶A脱氢酶的活性转化成3-氧代酰基辅酶A。3-氧代酰基辅酶A可通过乙酰辅酶AC-酰基转移酶(例如，也称为β-酮硫解酶)的活性转化成酰基辅酶A分子(缩短2个碳)和乙酰辅酶A。在一些实施方案中，可通过β氧化反复缩短酰基辅酶A分子直至产生所需碳链长度(例如，分别为10或12个碳、癸二酸或十二烷二酸)。可采用ω氧化进一步加工缩短的脂肪酸以产生二羧酸(例如，十二烷二酸)。
β-氧化活性
如本文所用的术语“β氧化途径”指用于代谢脂肪醇、脂肪酸或二羧酸的一系列酶活性。用于代谢脂肪醇、脂肪酸或二羧酸的活性包括但不限于酰基辅酶A连接酶活性、酰基辅酶A氧化酶活性、酰基辅酶A水解酶活性、酰基辅酶A硫酯酶活性、烯酰辅酶A水合酶活性、3-羟基酰基辅酶A脱氢酶活性和乙酰辅酶AC-酰基转移酶活性。术语“β氧化活性”指用于代谢脂肪醇、脂肪酸或二羧酸的β氧化途径中的任何活性。
β-氧化—酰基辅酶A连接酶
宿主生物体有时编码酰基辅酶A连接酶，可将其加入以产生工程生物体。在一些实施方案中，可通过增加酰基辅酶A连接酶基因的拷贝数，通过增强调节酰基辅酶A连接酶基因转录的启动子活性，或通过增加酰基辅酶A连接酶基因的拷贝数和增强调节酰基辅酶A连接酶基因转录的启动子活性来增强宿主酰基辅酶A连接酶活性，从而目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的产量因通过该途径的碳通量增加而增加。在某些实施方案中，可从任何合适的生物体分离酰基辅酶A连接酶基因。包含酰基辅酶A连接酶或可用作酰基辅酶A连接酶供体的生物体的非限制性实例包括假丝酵母、酵母或耶氏酵母。
β-氧化—烯酰辅酶A水合酶
烯酰辅酶A水合酶催化羟基和质子加入脂肪-酰基辅酶A的不饱和β碳，其有时由宿主生物体编码，有时可加入以产生工程生物体。在某些实施方案中，宿主或工程生物体中的烯酰辅酶A水合酶活性未改变。在一些实施方案中，可通过增加烯酰辅酶A水合酶基因的拷贝数，通过增强调节烯酰辅酶A水合酶基因转录的启动子活性，或通过增加烯酰辅酶A水合酶基因的拷贝数和增强调节烯酰辅酶A水合酶基因转录的启动子活性来增强宿主烯酰辅酶A水合酶活性，从而目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的产量因通过该途径的碳通量增加而增加。在某些实施方案中，可从任何合适的生物体分离烯酰辅酶A水合酶基因。包含烯酰辅酶A水合酶或可用作烯酰辅酶A水合酶供体的生物体的非限制性实例包括假丝酵母、酵母或耶氏酵母。
β-氧化—3-羟基酰基辅酶A脱氢酶
3-羟基酰基辅酶A脱氢酶通过除去烯酰辅酶A水合酶活性产生的新形成羟基的氢来催化3-酮基酰基辅酶A形成。在一些实施方案中，该活性由宿主生物体编码，有时可增添或提高以产生工程生物体。在某些实施方案中，宿主或工程生物体中的3-羟基酰基辅酶A活性未改变。在一些实施方案中，可通过增加3-羟基酰基辅酶A脱氢酶基因的拷贝数，通过增强调节3-羟基酰基辅酶A脱氢酶基因转录的启动子活性，或通过增加该基因的拷贝数和增强控该基因转录的启动子活性来增强宿主3-羟基酰基辅酶A脱氢酶活性，从而目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的产量因通过该途径的碳通量增加而增加。在某些实施方案中，可从任何合适的生物分离3-羟基酰基辅酶A脱氢酶基因。包含3-羟基酰基辅酶A脱氢酶或可用作3-羟基酰基辅酶A脱氢酶供体的生物体的非限制性实例包括假丝酵母、酵母或耶氏酵母。
β-氧化—乙酰辅酶AC-酰基转移酶
乙酰辅酶AC-酰基转移酶(例如，β-酮硫解酶)催化通过另一分子辅酶A的巯基切割3-酮酰基辅酶A而缩短2个碳的脂肪酰基辅酶A形成。在C-2和C-3之间插入巯基产生乙酰基辅酶A分子和短两个碳的酰基辅酶A分子。乙酰辅酶AC-酰基转移酶有时由宿主生物体编码，有时可加入以产生工程生物体。在某些实施方案中，宿主或工程生物体中的乙酰辅酶AC-酰基转移酶活性未改变。在一些实施方案中，可通过增加乙酰辅酶AC-酰基转移酶基因的拷贝数，或通过增强调节乙酰辅酶AC-酰基转移酶基因转录的启动子活性来增强宿主乙酰辅酶AC-酰基转移酶活性，从而目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的产量因通过该途径的碳通量增加而增加。在某些实施方案中，可从任何合适的生物体分离乙酰辅酶AC-酰基转移酶基因。包含乙酰辅酶AC-酰基转移酶或可用作乙酰辅酶AC-酰基转移酶供体的生物体的非限制性实例包括假丝酵母、酵母或耶氏酵母。一种类型的乙酰辅酶AC-酰基转移酶是乙酰乙酰辅酶A硫解酶(例如，“acoat”)。
β-氧化—烯酰辅酶A异构酶
诸如脂肪酸馏出物和皂脚的原料可包含不饱和脂肪酸，例如，油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)。在一些实施方案中，不饱和脂肪酸转化成保持双键的位置和取向的二羧酸。细胞可以利用另外的酶以允许这些类型的不饱和脂肪酸或二酸的氧化(例如，β氧化)。在一些情况下，对于在奇数编号位置处具有双键的底物的β-氧化，酶烯酰辅酶A异构酶(ECI)是必需的。在一些情况下，对于在偶数编号位置处具有双键的底物的β-氧化，酶二烯酰辅酶A还原酶(DCR)是必需的。
烯酰辅酶A异构酶(ECI)还可被称为烯酰辅酶Aδ异构酶1、十二碳烯酰(dodecenoyl)辅酶A异构酶、3,2反式-烯酰辅酶A异构酶、乙炔-丙二烯异构酶、δ3,δ2-烯酰辅酶A异构酶、十二碳烯酰辅酶Aδ异构酶和EC5.3.3.8(例如，在人类中)。若干种可变剪接的转录物变体也是已知的。ECI是水合酶/异构酶超家族的成员。ECI可能是参与不饱和脂肪酸的β-氧化的关键的线粒体酶。在来自不同物种的一系列ECI酶中，该酶可以将3-顺式和3-反式双键均异构化为2-反式形式。ECI可以催化在顺式-、单-和多不饱和脂肪酸逐步降解为2-反式-烯酰辅酶A中间体的过程中产生的3-顺式和3-反式-烯酰辅酶A酯的转化。ECI存在于许多微生物中，酵母物的若干种具有至少两种ECI酶。来自维斯假丝酵母(Cv)的两种ECI酶、来自热带假丝酵母(Ct)的两种ECI酶、来自解脂耶氏酵母(Y1)的一种ECI酶和来自酿酒酵母(Sc)的一种ECI酶的氨基酸序列同一性百分比在以下表1中示出。在表1中，“p”指“多肽”：
表1
在一些实施方案中，ECI因其在一些原料(例如，皂脚和脂肪酸馏出物)中的活性以及双键的正常位置而成为关键的酶。许多不饱和脂肪酸具有顺式-Δ9双键。在具有顺式-Δ9双键的18-碳二酸的β-氧化过程中，当链已缩短至12个碳时遇到双键。在该阶段，12-碳分子可以具有顺式-Δ3双键，其并非酰基辅酶A氧化酶的底物。因此，在一些情况下，需要ECI来将顺式-Δ3双键转化为反式-Δ2双键。在一些情况下，ECI反应的产物是β-氧化的第二步骤的底物，并且ECI可有效地在特定轮次的β-氧化中绕开酰基辅酶A氧化酶。在一些情况下，即使菌株包含对少于或等于C12(即，12个碳)的原料没有活性的酰基辅酶A氧化酶，活性ECI也可实现又一轮β-氧化的缩短，其可以产生用于具有顺式-Δ9双键的底物的10-碳产物。因此，在一些实施方案中，在酵母中(例如，在假丝酵母菌株中)破坏(例如，敲除或删除)ECI基因以阻止链缩短超过所需链长(例如，在这种情况下，12个碳)。在一些实施方案中，破坏ECI基因的表达(例如，敲除该表达)可导致包含10至18个碳的脂肪二羧酸产量的提高。在一些实施方案中，破坏ECI基因的表达(例如，敲除该表达)可导致包含10、12、14、16或18个碳的脂肪二羧酸产量的提高。在一些实施方案中，当使用某些原料(例如，某些皂脚或脂肪酸馏出物)时，破坏酰基辅酶A异构酶的表达可提高包含10、12、14、16或18个碳的脂肪二羧酸的产量。
二烯酰辅酶A还原酶(DCR，例如，EC1.3.1.34)是将反式-2、顺式-4二烯酰辅酶A底物转化为反式-3-烯酰辅酶A产物的外围酶(GurvitzA等,(1997)JBC272:22140-22147)。
反式-3-烯酰辅酶A随后由烯酰辅酶A异构酶(ECI)转化为反式-2-烯酰辅酶A，其为随后β后氧化中第二种酶的底物。DCR反应对于在偶数编号位置具有双键的脂肪酸(例如，亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3))的完全β)氧化通常是必需的。产自这些脂肪酸的二酸有时还需要用于完全β全氧化的DCR活性。二酸能够从任一端开始被氧化(双末端β-氧化)，并且有时被需要用以从两个方向处理双键的酶是相同的。这是因为在偶数编号位置处具有双键的偶数二酸从两端均保持偶数编号位置(与奇数编号位置处的双键类似)。
对于在偶数编号位置处具有双键的脂肪酸诸如亚油酸和亚麻酸的完全β键氧化，该反应可能是必需的。根据所需最终二酸产物的碳链长度，增强或降低宿主细胞或工程生物体中的一种或多种DCR酶的活性可能是有用的。对于具有八个或更多个碳的碳链长度的二酸产物，减少或消除宿主细胞中的一种或全部DCR酶可能是有用的或理想的。对于具有少于八个碳的碳链长度的二酸产物，增强宿主细胞或工程生物体中的一种或多种DCR酶的活性可能是有用的或理想的。
表2是可使用包含ECI和/或DCR的缺失的菌株由不饱和脂肪酸产生的二酸产物的表。Dcr-菌株通常专门地生产C8:3二酸。在一些实施方案中，诸如通过破坏编码DCR的多核苷酸，DCR多肽并没有在用于产生二酸产物(例如，己二酸、癸二酸、DDDA)的菌株中减少。在某些实施方案中，增加DCR多肽产量(例如，引入编码内源性DCR的多核苷酸的附加拷贝数；引入编码异源性DCR的多核苷酸的一个或多个拷贝)以由多元不饱和脂肪酸(诸如在大豆或玉米油中普遍存在的那些)产生肥酸。
表2
在诸如热带假丝酵母和维斯假丝酵母中存在两种DCR同源物(通常称为DCR1和DCR2)。酿酒酵母包含一种DCR酶，而解脂耶氏酵母包含至少三种DCR同源染色体(本文中称为“DCR1”、“DCR2”和“DCR3”)。一些DCR酶的同一性百分比示于以下表3和表4中，其中前缀Ct是热带假丝酵母，Cv是维斯假丝酵母，Sc是酿酒酵母且YI是解脂耶氏酵母。
表3
表4
氢化
不饱和二酸有时产自包含不饱和脂肪酸的原料，并且在这种情况下产生完全饱和的二酸通常需要对不饱和二酸进行氢化。例如，在Eci-、pox4Δ菌株中由一种或多种长链不饱和脂肪酸产生的不饱和C6:1二酸可通过采用合适的方法减少双键而转化成完全饱和的C6:0二酸。氢化方法的非限制性实例包括使用金属化学催化剂、非金属化学催化剂、酶催化剂等或其组合。
氢化反应的非限制性实例如下所示。有时氢源由分子氢提供(例如，在化学催化的情况下)，而有时氢源由酶的辅因子提供(例如，在酶催化的情况下)，酶的辅因子的非限制性实例包括NADH、NADPH、FADH2等或其组合。
在一些实施方案中，催化氢化采用合适的金属催化剂来进行，金属催化剂的非限制性实例包括铂、钯、铑、钌、镍等或其组合。有时催化剂是均相催化剂，而有时催化剂是非均相催化剂。可采用升高的温度和/或压力来提高反应速率。例如，可通过在环境温度下使用在碳上10％Pt的催化剂在3400kPa下2.5小时，将不饱和二酸(例如，顺式,顺式-粘康酸)氢化并转化为肥酸(Niu等,(2002)Biotechnol.Prog.18:201-211)。在一些实施方案中，催化氢化可采用非金属催化剂诸如受阻路易斯对(frustratedLewispair)化合物而发生(Welch等,(2006)Science314:1124-1126)。
在某些实施方案中，采用合适的天然的或工程化的酶在体内或体外进行酶氢化，所述酶可催化不饱和二酸或脂肪酸作为底物或产物的氧化还原反应。在一些实施方案中，通过增加天然酶的表达或表达能够在产生饱和二酸产物的不饱和二酸前体的生物中催化所需氢化反应的非天然酶，酶可以在体内得到利用。含有能够催化所需氢化反应的酶的生物的裂解物或者纯化或分离的酶制剂有时用于体外反应。合适的天然的或工程化的酶的非限制性实例包括酰基辅酶A脱氢酶(EC#1.3.1.8)、反式-2-烯酰辅酶A还原酶(EC#1.3.1.44)、硬脂酰辅酶A9-脱饱和酶(EC#1.14.19.1)等或其组合。在一些实施方案中，所需的反应产物(例如，饱和二酸)通过在正向或反向(例如，正反应或逆反应)起作用的酶来产生。
二烯酰辅酶A异构酶
二烯酰辅酶A异构酶(DCI，例如，EC#5.3.3、Δ3,5,Δ2,4-二烯酰辅酶A异构酶、Δ3,5,Δ2,4-二烯酰基-辅酶A异构酶)是催化Δ3,5-二烯酰辅酶A异构化为Δ2,4-二烯酰辅酶A的外围β-氧化酶(例如，参见图33)。该反应是在3,2-烯酰辅酶A异构酶(ECI)将Δ2,5-二烯酰辅酶A转化为Δ3,5-二烯酰辅酶A时发生的次要β要氧化途径的一部分。为了完全氧化该产物，DCI将Δ3,5-二烯酰辅酶A转化为Δ2,4-二烯酰辅酶A，其中后者是2,4-二烯酰辅酶A还原酶(DCR)的底物。DCR反应的产物是3-烯酰辅酶A，它是将其转化为可通过β其氧化完全氧化的2-烯酰辅酶A的ECI的底物。
DCI酶在哺乳动物系统中鉴定。尽管酿酒酵母基因YOR180c已被鉴定为DCI(Gurvitz等,J.Biol.Chem.(1999)274:24514-24521)，但还表明当酿酒酵母不含DCI酶活性时，该活性并非由YOR180c的基因产物提供(Ntamack等,(2009)Biochim.Biophys.Acta1791:371-378)。
Yor180c与来自大鼠和小鼠的已知的DCI酶的同一性百分比相当低(表5)。对热带假丝酵母和维斯假丝酵母基因组进行序列比对搜索以确定与小鼠Dci1p的相似性，来鉴定比酿酒酵母Yor180c具有更大的同一性的序列。鉴定的所有此类序列具有C-末端过氧化物酶体靶向序列，表明它们靶向过氧化物酶体区室(compartment)。鉴定的推定假丝酵母属DCI酶可包含二烯酰辅酶A异构酶活性，并且还包含烯酰辅酶A异构酶活性。它们也可以是目前未知功能的外围β-氧化酶
表5
在SEQ.ID.NO:3809-3812中提供了一些推定DCI蛋白质的序列。在一些实施方案中，根据所需二酸产物的链长度，减少或扩增具有DCI活性(例如，在维斯假丝酵母中)的多肽。例如，对于肥酸生产，可提高DCI活性以提高宿主生物中不饱和脂肪酸的生产能力(例如，可通过插入编码具有DCI的多肽的多核苷酸的一个或多个拷贝(例如，插入内源或外源多核苷酸的一个或多个拷贝)来提高DCI活性)。在一些实施方案中，对于C8和更长的二酸，降低DCI活性(例如，通过引入(i)编码具有DCI活性的多肽的多核苷酸，或(ii)可操作地连接至编码具有DCI活性的多肽的多核苷酸的启动子的破坏、缺失或敲除)。
ω氧化活性
术语“ω氧化活性”指用于代谢烷烃、脂肪醇、脂肪酸、二羧酸或糖的ω氧化途径中的任何活性。用于代谢脂肪醇、脂肪酸或二羧酸的活性包括但不限于单加氧酶活性(例如，细胞色素P450活性)、单加氧酶还原酶活性(例如，细胞色素P450还原酶活性)、醇脱氢酶活性(例如，脂肪醇脱氢酶活性或长链醇脱氢酶活性)、脂肪醇氧化酶活性、脂肪醛脱氢酶活性和硫酯酶活性。
ω氧化—单加氧酶
细胞色素P450酶(例如，单加氧酶活性)通常催化一个氧原子插入至有机底物(RH)而将其他氧原子还原成水。将氧原子插入底物的ω碳附近产生了最初起始底物的醇衍生物(例如，产生了脂肪醇)。细胞色素P450有时由宿主生物编码并且有时可以被添加以产生工程生物体。
在某些实施方案中，单加氧酶活性在宿主或工程生物体中未改变。在一些实施方案中，可以通过增加细胞色素P450基因的拷贝数或通过提高调节细胞色素P450基因转录的启动子活性来提高宿主单加氧酶活性，从而目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的产量因通过该途径的碳通量增加而增加。在某些实施方案中，可从任何合适的生物体中分离细胞色素P450基因。包含或可用作细胞色素P450酶供体的生物体的非限制性实例包括酵母(例如，假丝酵母属、酵母菌属(Saccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、Meyerozyma、洛徳酵母属(Lodderomyces)、发酵酵母属(Scheffersomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假囊酵母属(Eremothecium)、结合酵母属(Zygosaccharomyces)、Lachancea、Nakaseomyces)、动物(例如，人类(Homo)、属鼠(Rattus))、细菌(例如，埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属、芽孢杆菌属)或植物(例如，拟南芥属(Arabidopsis)、烟草属(Nictotania)、萼距花属(Cuphea))。
ω氧化—单加氧酶还原酶
细胞色素P450还原酶(例如，单加氧酶还原酶活性)通过将电子转移至细胞色素P450来催化细胞色素P450中的血红素-硫醇部分的还原。细胞色素P450还原酶有时由宿主生物体编码且有时可以被添加以产生工程生物体。在某些实施方案中，所述单加氧酶还原酶活性在宿主或工程生物体中未改变。在一些实施方案中，可以通过增加细胞色素P450还原酶基因的拷贝数或通过提高调节细胞色素P450还原酶基因转录的启动子活性来提高宿主单加氧酶还原酶活性，从而目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的产量因通过该途径的碳通量增加而增加。在某些实施方案中，可从任何合适的生物体中分离细胞色素P450还原酶基因。包含或可用作细胞色素P450还原酶供体的生物体的非限制性实例包括酵母(例如，假丝酵母属、酵母菌属(Saccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、Meyerozyma、洛徳酵母属(Lodderomyces)、发酵酵母属(Scheffersomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假囊酵母属(Eremothecium)、结合酵母属(Zygosaccharomyces)、Lachancea、Nakaseomyces)、动物(例如，人类(Homo)、属鼠(Rattus))、细菌(例如，埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属、芽孢杆菌属)或植物(例如，拟南芥属(Arabidopsis)、烟草属(Nictotania)、萼距花属(Cuphea))。
ω氧化—醇脱氢酶
在细胞内质网中，醇脱氢酶(例如，脂肪醇脱氢酶、长链醇脱氢酶)催化从醇中去除氢以产生醛或酮和氢原子以及NADH。醇脱氢酶有时由宿主生物体编码且有时可以被添加以产生工程生物体。在某些实施方案中，醇脱氢酶活性在宿主或工程生物体中未改变。在一些实施方案中，可以通过增加醇脱氢酶基因的拷贝数或通过提高调节醇脱氢酶基因转录的启动子活性来提高宿主醇脱氢酶活性，从而目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的产量因通过该途径的碳通量增加而增加。在某些实施方案中，可从任何合适的生物体中分离醇脱氢酶基因。包含或可用作醇脱氢酶供体的生物体的非限制性实例包括酵母(例如，假丝酵母属、酵母菌属(Saccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、Meyerozyma、洛徳酵母属(Lodderomyces)、发酵酵母属(Scheffersomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假囊酵母属(Eremothecium)、结合酵母属(Zygosaccharomyces)、Lachancea、Nakaseomyces)、动物(例如，人类(Homo)、属鼠(Rattus))、细菌(例如，埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属、芽孢杆菌属)或植物(例如，拟南芥属(Arabidopsis)、烟草属(Nictotania)、萼距花属(Cuphea))。
ω氧化—脂肪醇氧化酶
在细胞的过氧化物酶体中，脂肪醇氧化酶(例如，长链醇氧化酶，EC1.1.3.20)催化向两个长链醇分子添加氧以产生2个长链醛和2个水分子。脂肪醇氧化酶有时由宿主生物体编码且有时可以被添加以产生工程生物体。在某些实施方案中，脂肪醇氧化酶活性在宿主或工程生物体中未改变。在一些实施方案中，可以通过增加脂肪醇氧化酶基因的拷贝数或通过提高调节脂肪醇氧化酶基因转录的启动子活性来提高宿主脂肪醇氧化酶活性，从而目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的产量因通过该途径的碳通量增加而增加。在某些实施方案中，可从任何合适的生物体中分离脂肪醇氧化酶基因。包含或可用作脂肪醇氧化酶供体的生物体的非限制性实例包括酵母(例如，假丝酵母属、酵母菌属(Saccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、Meyerozyma、洛徳酵母属(Lodderomyces)、发酵酵母属(Scheffersomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假囊酵母属(Eremothecium)、结合酵母属(Zygosaccharomyces)、Lachancea、Nakaseomyces)、动物(例如，人类(Homo)、属鼠(Rattus))、细菌(例如，埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属、芽孢杆菌属)或植物(例如，拟南芥属(Arabidopsis)、烟草属(Nictotania)、萼距花属(Cuphea))。
ω氧化—醛脱氢酶
脂肪醛脱氢酶(例如，长链醛脱氢酶)催化长链醛氧化成长链羧酸、NADH和H+。脂肪醛脱氢酶有时由宿主生物体编码且有时可以被添加以产生工程生物体。在某些实施方案中，脂肪醛脱氢酶活性在宿主或工程生物体中未改变。在一些实施方案中，可以通过增加脂肪醛脱氢酶基因的拷贝数或通过提高调节脂肪醛脱氢酶基因转录的启动子活性来提高宿主脂肪醛脱氢酶活性，从而目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的产量因通过该途径的碳通量增加而增加。在某些实施方案中，可从任何合适的生物体中分离脂肪醛脱氢酶基因。包含或可用作脂肪醛脱氢酶供体的生物体的非限制性实例包括酵母(例如，假丝酵母属、酵母菌属(Saccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、Meyerozyma、洛徳酵母属(Lodderomyces)、发酵酵母属(Scheffersomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假囊酵母属(Eremothecium)、结合酵母属(Zygosaccharomyces)、Lachancea、Nakaseomyces)、动物(例如，人类(Homo)、属鼠(Rattus))、细菌(例如，埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属、芽孢杆菌属)或植物(例如，拟南芥属(Arabidopsis)、烟草属(Nictotania)、萼距花属(Cuphea))。
ω氧化—硫酯酶
硫酯酶(例如，酰基辅酶A硫酯酶活性，酰基-ACP硫酯酶活性)催化从含酰基辅酶A或酰基载体蛋白的脂肪酸(例如，酯化的脂肪酸)中去除辅酶A或酰基载体蛋白(例如，ACP)以产生脂肪酸和醇。所述反应在水的存在下发生，并且在巯基基团处特异地去除辅酶A或酰基载体蛋白。硫酯酶有时由宿主生物编码且有时可以被添加以产生工程生物体。在某些实施方案中，硫酯酶活性在宿主或工程生物体中未改变。在一些实施方案中，可以通过增加硫酯酶基因的拷贝数或通过提高调节硫酯酶基因转录的启动子活性来提高宿主硫酯酶活性，从而目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的产量因通过该途径的碳通量增加而增加。在某些实施方案中，可从任何合适的生物体中分离硫酯酶基因。包含或可用作硫酯酶供体的生物体的非限制性实例包括酵母(例如，假丝酵母属、酵母菌属(Saccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、Meyerozyma、洛徳酵母属(Lodderomyces)、发酵酵母属(Scheffersomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假囊酵母属(Eremothecium)、结合酵母属(Zygosaccharomyces)、Lachancea、Nakaseomyces)、动物(例如，人类(Homo)、属鼠(Rattus))、细菌(例如，埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属、芽孢杆菌属)或植物(例如，拟南芥属(Arabidopsis)、烟草属(Nictotania)、萼距花属(Cuphea))。
工程化途径
图1-8描绘了用于使用各种烷烃、脂肪酸、脂肪醇或其组合制备癸二酸和十二烷二酸的生物途径的实施方案。任何合适的烷烃、脂肪酸、脂肪醇、植物基油、种子基油、非石油衍生的皂脚等可用作生物的原料(例如，十二烷、月桂酸甲酯、月桂酸、具有10个或更多个碳的碳源(例如，用于癸二酸生产)或具有12个或更多个碳的碳源(例如，用于十二烷二酸生产))。在一些实施方案中，具有大于12个碳的碳源可使用天然存在的和/或工程化的途径进行代谢以产生可进一步使用图5-8的下面部分所示的β氧化途径代谢的分子。在一些实施方案中，图1-8中描绘的途径中的活性可如本文所述进行工程化以加强代谢和目标产物形成。
在某些实施方案中，一种或多种代谢途径中的一种或多种活性可进行工程化以增加通过所述工程化途径的碳通量从而产生所需产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)。可以选择工程化活性以使可在一种或多种其他工程化途径中使用的代谢中间体的产量增加，以获得相对于未修饰宿主生物的所需产物产量的增加。还可以选择工程化活性以使降低了所需中间体或终产物的产量的酶的活性降低(例如，反向活性)。通过工程化合适的途径中的合适的活性，可针对任何所选原料来优化这种“碳通量管理”。本文中给出了使用纯烷烃(例如，单一链长烷烃、十二烷)、混合链长烷烃、长链烷烃、纯脂肪酸(例如，单一链长脂肪酸，例如，羊蜡酸)和混合链长脂肪酸的非限制性实例(参见图1-8)。在某些实施方案中，通过工程化途径的“碳通量管理”的工艺以与对于任何给定的原料所计算的最大理论产率相近的水平和速率产生二羧酸(例如，癸二酸或十二烷二酸)。如本文所用的术语“理论产率”或“最大理论产率”指如果反应完全则可形成的化学或生物反应产物的产率。理论产率基于反应的化学计量学和理想条件，在该理想条件下起始材料被完全消耗，不期望的副反应没有发生，逆反应没有发生，且在后处理(work-up)程序中没有损失。
微生物可以进行修饰和工程化以包含或调节脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)途径中的一种或多种活性。如本文所用的术语“活性”指微生物的自然的或工程化的生物途径产生各种包含脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)以及它的前体的产物的作用。在某些实施方案中，产生活性的脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)可以由任何非哺乳动物来源提供。此类来源包括但不限于真核生物(诸如酵母和真菌)以及原核生物(如细菌)。在一些实施方案中，可将本文所述途径中的反向活性改变(例如，破坏、降低)以增加朝向目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的产生的通过β氧化途径、ω氧化途径，或者β氧化和ω氧化途径的碳通量。在一些实施方案中，遗传修饰破坏了β氧化途径中的活性或破坏了编码在β氧化途径中进行正向反应的多肽的多核苷酸，这使得β氧化活性不可检测。如本文所用的术语“不可检测”指低于使用已知检测方法或测定(例如，本文所述的)的检测的极限的分析物的量。在某些实施方案中，所述遗传修饰部分地降低了β氧化活性。如本文所用的术语“部分地降低了β氧化活性”指在工程生物体中低于在宿主或起始(starting)生物体中发现的活性水平的活性水平。
在一些实施方案中，可以修饰β-氧化活性以改变所选活性的催化特异性。在某些实施方案中，可以通过修饰与碳链长度偏好和/或特异性相关的催化结构域来改变酰基辅酶A氧化酶活性。在一些实施方案中，可通过筛选宿主生物的自然发生的变体或突变群体来发现改变的催化特异性。在某些实施方案中，可通过各种诱变技术结合选择和/或筛选所需活性来产生改变的催化剂。在一些实施方案中，可通过使用混合与匹配方法生成嵌合酰基辅酶A氧化酶来产生改变的催化活性，之后选择和/或筛选所需的催化活性。本文描述了产生具有改变的催化活性的酰基辅酶A氧化酶的实验实例。
本文提供的工程微生物内的活性可包含以下活性中的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或全部)：6-氧代己酸脱氢酶活性；6-羟基己酸脱氢酶活性；细胞色素P450活性；细胞色素P450还原酶活性；脂肪醇氧化酶活性；酰基辅酶A连接酶活性、酰基辅酶A氧化酶活性；烯酰辅酶A水合酶活性、3-羟基酰基辅酶A脱氢酶活性、脂肪酸合酶活性、脂肪酶活性、乙酰辅酶A羧化酶活性、酰基转移酶活性(二酰基甘油酰基转移酶、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶、磷脂：二酰基甘油酰基转移酶)和硫酯酶活性(例如，酰基辅酶A水解酶、酰基辅酶A硫酯酶、酰基-ACP硫酯酶、乙酰辅酶AC-酰基转移酶、β-酮硫解酶等)。在某些实施方案中，通过遗传修饰的方式改变上述活性中的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或全部)。在一些实施方案中，通过以下的方式来改变上述活性中的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或全部)：(i)添加编码具有所述活性的多肽的异源多核苷酸，和/或(ii)改变或添加调节具有所述活性的多肽的表达的调节序列。在某些实施方案中，通过以下的方式来改变上述活性中的一种或多种：(i)破坏编码具有所述活性的多肽的内源多核苷酸(例如，插入诱变)，(ii)删除调节具有所述活性的多肽的表达的调节序列，和/或(iii)删除编码具有所述活性的多肽的编码序列(例如，敲除诱变)。
如本文所用的术语“ω羟基脂肪酸脱氢酶活性”指将ω羟基脂肪酸转化成ω氧代脂肪酸。ω羟基脂肪酸脱氢酶活性可由多肽提供。在一些实施方案中，所述多肽由引入宿主微生物的异源核苷酸序列编码。在某些实施方案中，具有ω羟基脂肪酸脱氢酶活性的内源性多肽在宿主微生物中鉴定到，并且对该宿主微生物进行遗传改变以增加多肽产量(例如，引入异源启动子以与编码该多肽的多核苷酸可操作地连接；增加编码该多肽的多核苷酸的拷贝数(例如，通过引入包含该多核苷酸的质粒))。可从许多来源，包括不动杆菌、诺卡式菌、假单胞菌和黄色杆菌获得赋予ω羟基脂肪酸脱氢酶活性的核酸序列。本文提供了具有ω羟基脂肪酸脱氢酶活性的多肽的氨基酸序列，和编码该多肽的多核苷酸的核苷酸序列的实例。可通过本领域已知的任何合适的方法检测ω羟基脂肪酸脱氢酶活性的存在、不存在或量。在一些实施方案中，宿主微生物中的ω羟基脂肪酸脱氢酶活性未改变，而在某些实施方案中，相比于宿主微生物，在工程微生物中增添或提高该活性。
本文所用的术语“单加氧酶活性”指将O2的一个氧原子插入无机底物(RH)，并将另一氧原子还原成水。在一些实施方案中，单加氧酶活性指将一个氧原子掺入六碳有机底物。在某些实施方案中，单加氧酶活性指将己酸转化成6-羟基己酸。在某些实施方案中，可由任何合适的多肽，例如细胞色素P450多肽(下文称为“CYP450”)提供单加氧酶活性。可从许多来源(包括巨大芽孢杆菌)获得赋予CYP450活性的核酸序列，并可在以下生物体中诱导，包括但不限于：热带假丝酵母、解脂耶氏酵母、构巢曲霉和寄生曲霉。本文提供了用于分离编码具有CYP450活性(例如，CYP52A12多核苷酸、CYP52A13多核苷酸、CYP52A14多核苷酸、CYP52A15多核苷酸、CYP52A16多核苷酸、CYP52A17多核苷酸、CYP52A18多核苷酸、CYP52A19多核苷酸、CYP52A20多核苷酸、CYP52D2多核苷酸和/或BM3多核苷酸)的多肽的多核苷酸序列的寡核苷酸序列的实例。在一些实施方案中，宿主微生物中的单加氧酶活性未改变，在某些实施方案中，相比于宿主微生物，在工程微生物中增添或提高该活性。在一些实施方案中，改变的单加氧酶活性是内源性活性，而在某些实施方案中，改变的单加氧酶活性是外源性活性。在一些实施方案中，所述外源性活性是具有单加氧酶和单加氧酶还原酶活性的单独的多肽(例如，巨大芽胞杆菌细胞色素P450:NADPHP450还原酶)。
可通过本领域已知的任何合适的方法检测细胞色素P450活性的存在、不存在或量。例如，可通过检验含有细胞色素P450(CYP52A家族)和NADPH-细胞色素P450还原酶的反应来进行检测(参见Appl.Environ.Microbiol.69:5983和5992)。简言之，在标准条件下培养细胞，收集以便产生用于检测CYP活性的微粒体。在Tris-缓冲蔗糖(10mMTris-HClpH7.5，1mMEDTA，0.25M蔗糖)中裂解细胞来制备微粒体。首先以25,000xg，然后以100,000xg进行差速离心以分别沉淀细胞碎片和微粒体。将微粒体沉淀物重悬浮在0.1M磷酸缓冲液(pH7.5)，1mMEDTA中至终浓度约为10毫克蛋白质/毫升。加入NADPH引发含有约0.3mg微粒体、0.1mM己酸钠、0.7mMNADPH、50mMTris-HClpH7.5，1mL的反应混合物，37℃孵育10分钟。加入0.25mL5MHCl以终止反应，加入0.25mL2.5ug/mL10-羟基癸酸作为内标(3.3nmol)。NaCl-饱和条件下用4.5mL乙醚萃取混合物。将有机相转移至新的试管，蒸发至干。将残留物溶解于含有10mM3-溴甲基-7-甲氧基-1,4-苯并噁嗪-2-酮(BrMB)和饱和0.1mLK2CO3饱和乙腈配制的15mg/mL18-冠-6的乙腈中。将溶液在40℃孵育30分钟，然后加入0.05mL2％乙酸。通过HPLC拆分荧光标记的ω-羟基脂肪酸，430nm检测，355nm激发(Yamada等,1991,AnalBiochem199:132-136)。可任选地通过Northern印迹法和/或定量RT-PCR检测特异性诱导的CYP基因。(Craft等,2003,AppEnvironMicro69:5983-5991)。
本文所用的术语“单加氧酶还原酶活性”指将NAD(P)H、FMN或FAD的电子经由电子传递链传递，从而将细胞色素P450的三价血红素铁还原为亚铁状态。本文所用的术语“单加氧酶还原酶活性”还指将第二电子经由电子传递系统传递，从而将二氧加成物还原为带负电荷的过氧基团。在一些实施方案中，单加氧酶活性能在偶联的两步反应中从两电子供体NAD(P)H向细胞色素P450的血红素供电子(例如，单加氧酶活性)，其中NAD(P)H能结合具有单加氧酶还原酶活性的多肽的NAD(P)H-结合域，而电子从NAD(P)H通过FAD和FMN向单加氧酶活性的血红素穿梭，从而再生活性单加氧酶活性(例如，细胞色素P450)。在某些实施方案中，可由任何合适的多肽，例如细胞色素P450还原酶多肽(下文称为“CPR”)提供单加氧酶还原酶活性。可从许多来源获得和/或在许多来源中诱导赋予CPR活性的核酸序列，该来源包括但不限于：巨大芽孢杆菌、热带假丝酵母、解脂耶氏酵母、构巢曲霉和寄生曲霉。本文提供用于分离编码具有CPR活性的多肽的多核苷酸序列的寡核苷酸序列的实例。在一些实施方案中，宿主微生物中的单加氧酶还原酶活性未改变，在某些实施方案中，相比于宿主微生物，在工程微生物中增添或提高该活性。在一些实施方案中，改变的单加氧酶还原酶活性是内源性活性，而在某些实施方案中，改变的单加氧酶还原酶活性是外源性活性。在一些实施方案中，所述外源性活性是具有单加氧酶和单加氧酶还原酶活性的单独的多肽(例如，巨大芽胞杆菌细胞色素P450:NADPHP450还原酶)。
可通过本领域已知的任何合适的方法检测CPR活性的存在、不存在或量。例如，可采用定量核酸检测方法(例如，Sourthern印迹法、PCR、引物延伸等和它们的组合)检测与宿主微生物相比，编码CPR活性的基因数增加的工程微生物。可采用基于定量表达的分析(例如，RT-PCR、蛋白质印迹分析、Northern印迹分析等和它们的组合)检测与宿主微生物相比，编码CPR活性的基因表达增加的工程微生物。或者，可采用酶试验检测细胞色素P450还原酶活性，其中所述酶活性改变底物溶液在550纳米的吸光度(Masters,B.S.S.,Williams,C.H.,Kamin,H.(1967)MethodsinEnzymology,X,565-573)。
酰基辅酶A氧化酶
本文所用的术语“酰基辅酶A氧化酶活性”指将长链脂肪-酰基辅酶A氧化成反式-2,3-脱氢酰基辅酶A脂肪醇。在一些实施方案中，酰基辅酶A活性来自过氧化物酶体。在某些实施方案中，酰基辅酶A氧化酶活性是由POX多肽实施的过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶(POX)活性。在一些实施方案中，酰基辅酶A氧化酶活性由宿主生物编码，有时可进行改变以产生工程生物体。酰基辅酶A氧化酶活性由假丝酵母菌株ATCC20336的POX4和POX5基因编码。在某些实施方案中，可提高内源性酰基辅酶A氧化酶活性。在一些实施方案中，可彼此独立地改变POX4多肽或POX5多肽的酰基辅酶A氧化酶活性(例如，单独提高POX4活性、单独提高POX5活性、提高一个而破坏另一个，等等)。在某些实施方案中，提高一种POX活性，同时破坏另一种POX活性可改变酰基辅酶A氧化酶对于碳链长度的比活性，同时维持或增加通过β氧化途径的总体通量。
在某些实施方案中，可通过遗传改变(例如，提高)多肽的产量(例如，引入强转录或组成型表达的异源启动子以可操作地连接编码该多肽的多核苷酸；增加编码该多肽的多核苷酸拷贝数(例如，引入包含该多核苷酸的质粒，将额外的拷贝整合入宿主基因组))来增加其中一种POX基因的宿主酰基辅酶A氧化酶活性。在一些实施方案中，可通过破坏(例如，敲除、插入诱变等和它们的组合)酰基辅酶A氧化酶基因，或降低转录酰基辅酶A氧化酶基因的启动子活性(例如，向启动子或5’UTR加入阻遏序列)来降低宿主酰基辅酶A氧化酶活性。
如上所述，破坏编码POX4、POX5、或POX4和POX5的核苷酸序列有时可改变不同长度碳链(例如，碳链包括长度约1到约60个碳的脂肪醇、脂肪酸、石蜡、二羧酸)代谢的途径效率、特异性和/或比活性。在一些实施方案中，用编码选择性标记的URA3核苷酸序列破坏POX4、POX5、或POX4和POX5的核苷酸序列，将其引入宿主微生物，从而产生POX4、POX5、或POX4和POX5活性缺陷的工程生物体。可从许多来源，例如包括热带假丝酵母获得编码POX4和POX5的核酸序列。本文提供POX4和POX5氨基酸序列和编码这些多肽的多核苷酸的核苷酸序列的实例。实施例中描述了扩增由POX5基因编码的活性的实验。
另外，如上所述，可通过多种方法改变酰基辅酶A氧化酶(例如，POX4、POX5)的催化特异性。改变酰基辅酶A氧化酶的结合和/或催化特异性可证明有利于产生具有改变的链长识别、改变的链长催化活性的新型酰基辅酶A氧化酶，和/或产生具有窄的或特定的链长特异性的酰基辅酶A氧化酶活性，从而允许相对于在特定选择的原料中发现的不同长度碳链的代谢或碳链分布的代谢进一步提高途径效率、特异性和/或比活性。在一些实施方案中，改变的酰基辅酶A氧化酶序列通过以下方法进行鉴定和/或产生：(i)筛选天然存在的变体群；(ii)对内源序列进行诱变；(iii)引入具有所需特异性的异源序列；(iv)产生嵌合序列，该序列具有编码来自一个多核苷酸来源(例如，基因、生物)的序列的一部分和编码来自另一来源的序列的一部分；和/或(v)使用具有所需特异性的酰基辅酶A氧化酶的核苷酸序列和三维结构分析进行智能设计以重构内源性酰基辅酶A氧化酶，从而产生新型特异性酶。在一些实施方案中，嵌合酰基辅酶A氧化酶序列可以具有来自两个或更多个来源的多核苷酸序列贡献。在一些实施方案中，嵌合酰基辅酶A氧化酶序列包含编码来自内源多核苷酸的序列的一部分和编码来自异源多核苷酸的序列的一部分。实施例中描述了用于鉴定和/或产生具有新型催化和结合特异性的酰基辅酶A氧化酶的方法。
具有所需特异性的异源性酰基辅酶A氧化酶序列的引入
已将数以千计的酰基辅酶A氧化酶和酰基辅酶A-样氧化酶克隆、测序并从多种生物中分离(SEQIDNO.51至SEQIDNO.3673以及SEQIDNO.3810至SEQIDNO.3882)。这些酶中的许多酶被报道拥有具有选择性底物特异性的催化活性。例如，一些酰基辅酶A氧化酶(例如，来自假丝酵母属菌株的Pox5p)显示了对12至18个碳的底物的最优活性(图21)。在一些实施方案中，生物(例如，酵母)或遗传修饰生物(例如，遗传修饰的酵母，例如β例氧化活性被阻断的酵母)被工程化以表达具有选择性底物特异性的异源性酰基辅酶A氧化酶。在一些实施方案中，生物(例如，酵母)或遗传修饰的生物体(例如，遗传修饰的酵母，例如β-氧化活性被阻断的酵母)被工程化以表达选自SEQIDNO.51至SEQIDNO.3673的酰基辅酶A氧化酶或酰基辅酶A-样氧化酶。在一些实施方案中，生物(例如，酵母)或遗传修饰生物(例如，遗传修饰的酵母，例如β-氧化活性被阻断的酵母)被工程化以表达选自SEQIDNO.3810至SEQIDNO.3882的酰基辅酶A氧化酶或酰基辅酶A-样氧化酶。
可通过本领域已知的任何合适方法检测酰基辅酶A氧化酶活性的存在、不存在或量。例如，采用Shimizu等，1979所述和本文实施例所述的酶试验，可以评估POX4、POX5和其他酰基辅酶A氧化酶活性。或者，还可采用核酸检测方法(例如，PCR、引物延伸、核酸杂交等和它们的组合)或定量表达分析(例如，RT-PCR、蛋白质印迹、Northern印迹分析等和它们的组合)检测表示天然和/或破坏的POX4和POX5序列的核酸序列，其中工程生物体显示与宿主生物相比，RNA和/或多肽水平降低。
酰基辅酶A氧化酶的遗传修饰
β-氧化的限速步骤是途径中由酰基辅酶A氧化酶进行的第一步骤。不同的酰基辅酶A氧化酶可显示出不同的链长底物特异性。一些酰基辅酶A氧化酶显示出宽的链长特异性并可接受任何脂肪酰基辅酶A(或二酰基辅酶A)作为底物。然而，一些酰基辅酶A氧化酶可显示出窄的链长特异性。
例如，来自假丝酵母属菌株ATCC20336的Pox5酶显示对C10以下底物的活性降低(图21)且对C6和C8底物具有低的活性。在Pox5作为唯一功能性酰基辅酶A氧化酶的细胞中，长链脂肪酰基辅酶A或二酰基辅酶A底物可缩短至约8个碳且通常不进入另外的β碳氧化循环。较短的底物(例如，C8脂肪二羧酸)通常不被Pox5识别为底物，辅酶A通过过氧化物酶体硫酯酶去除，且由细胞分泌脂肪二羧酸(例如，α,ω-二羧酸)产物。在该实施方案中，酰基辅酶A氧化酶链长底物特异性有效地控制了产生的二酸链长。
在一些实施方案中，酵母中的β-氧化途径是活性的且包含遗传修饰的酰基辅酶A氧化酶。在一些实施方案中，对酰基辅酶A氧化酶进行遗传修饰以阻止脂肪酰基辅酶A或二酰基辅酶A底物的完全氧化。酰基辅酶A氧化酶的遗传修饰可提高所需脂肪酸或脂肪二羧酸产物的生产产率。因此，在一些实施方案中，当对酰基辅酶A氧化酶进行遗传修饰时，特定链长(例如，所需的或目标脂肪酸或脂肪二羧酸产物的链长)的脂肪酸的代谢降解显著降低。在一些实施方案中，当对酰基辅酶A氧化酶进行遗传修饰时，脂肪二羧酸产物(例如，DDDA)经由β-氧化的代谢降解显著降低。这可通过修饰酰基辅酶A氧化酶的底物特异性来实现，以使得所述酶具有针对小于所需产物链长的链长的低的活性(例如，酶活性)。
在一些实施方案中，对酰基辅酶A氧化酶的底物特异性进行修饰以使得该酶对链长少于C24(即，24个碳)的脂肪族分子具有低活性。在一些实施方案中，对酰基辅酶A氧化酶的底物特异性进行修饰以使得该酶对少于24、22、20、18、16、14、12、10、8、6或4个碳的链长具有非常低的活性。在一些实施方案中，对酰基辅酶A氧化酶的底物特异性进行修饰以使得该酶对少于18、16、14、12、10或8个碳的链长具有非常低的活性。在一些实施方案中，对酰基辅酶A氧化酶的底物特异性进行修饰以使得该酶对少于C12的链长具有非常低的活性。在一些实施方案中，对酰基辅酶A氧化酶的底物特异性进行修饰以使得该酶对少于C10的链长具有非常低的活性。
在一些实施方案中，将编码遗传修饰的酰基辅酶A氧化酶的基因在合适的生物(例如，细菌(例如，大肠杆菌)或酵母)中进行工程化和表达以测试修饰的酶的体外底物特异性。在一些实施方案中，将编码遗传修饰的酰基辅酶A氧化酶的基因在合适的酵母中进行工程化和表达，并测试底物特异性。在一些实施方案中，测试表达修饰的酰基辅酶A氧化酶的酵母的所需脂肪酸或脂肪二羧酸产物的产生。修饰的酰基辅酶A氧化酶可以以任何合适的方法产生，下文提供了该方法的非限制性实例。
酰基辅酶A氧化酶的随机诱变
可以使用本领域中已知的若干方法(例如，定点诱变)来产生遗传修饰的酰基辅酶A氧化酶的文库。随后可将遗传修饰的酰基辅酶A氧化酶基因转化入合适的酵母菌株(例如，假丝酵母属菌株(例如，维斯假丝酵母或热带假丝酵母))的β-氧化阻断的菌株中。在一些实施方案中，遗传修饰的酰基辅酶A氧化酶在pox4Δ/pox4Δpox5Δ/pox5Δ(例如，缺乏内源性酰基辅酶A氧化酶活性的生物)背景下在POX4启动子或另一强大的组成型或诱导型启动子的控制下进行表达。在一些实施方案中，遗传修饰的酰基辅酶A氧化酶在内源启动子的控制下进行表达。在一些实施方案中，遗传修饰的酰基辅酶A氧化酶在异源启动子的控制下进行表达。该转化体可通过在含有具有比感兴趣的二酸产物多两个碳的脂肪酸的脂肪酸或甲基-衍生脂肪酸中生长来进行选择。例如，对于十二烷二酸，可使该转化体在十四烷二酸中生长。随后可在杀死正在生长的细胞的试剂(例如，制霉菌素)的存在下，将该组转化体移至具有感兴趣脂肪酸(例如，十二烷二酸)的碳源的培养基中，且可以选择无法代谢所述碳源(例如，在本实例中的十二烷二酸)的细胞。随后可进一步表征所得修饰菌株的酰基辅酶A氧化酶活性。该方法可用于选择任何修饰的酰基辅酶A氧化酶(例如，本文表中列出和/或描述的那些)。此外，该方法可用于选择在合适的生物中表达的任何异源性酰基辅酶A氧化酶(例如，在SEQIDNO.51至3273和SEQIDNO.3728至3810中列出的那些)。
酰基辅酶A氧化酶的合理诱变
可以将结构和序列的信息与实验数据相结合以确定有待于在酰基辅酶A氧化酶中测试改变的特异性的特定突变。例如，可以比较测试的酰基辅酶A氧化酶的一级序列并且将其与底物特异性相关联。基于这样的分析，提出单氨基酸、小数目连续氨基酸和/或结构域以用于提供所需的底物特异性。那些氨基酸的位置可以是针对改进特异性的特定或随机突变的目标。
还可以使用本领域公知的建模方法相对于已知的三级结构模拟酰基辅酶A氧化酶结构。该模型可用于提出与底物选择性有关的氨基酸和区域。例如，生化、结构和序列的数据表明，酰基辅酶A氧化酶的N-末端通常部分地决定底物特异性。基于这种分析和如前所述测试的新的酰基辅酶A氧化酶的特异性，可引入突变或区域取代。产生的信息可用于返回到所述模型以推断新的潜在的突变。至于随机诱变，可以修饰任何合适的酰基辅酶A氧化酶以改变底物特异性(例如，在SEQIDNO.51至3273和SEQIDNO.3728至3810中列出的那些)。
如本文使用的术语“酰基辅酶A氧化酶活性”指的是酰基辅酶A氧化酶的酶活性(例如，催化活性)。酰基辅酶A氧化酶可以催化以下化学反应：
在一些实施方案中，酰基辅酶A氧化酶的活性指的是长链脂肪酸-酰基辅酶A氧化为反式-2,3-脱氢酰基辅酶A脂肪醇。在一些实施方案中，酰基辅酶A氧化酶的活性指的是其对一组选择的底物的酶活性(或其缺乏)。酰基辅酶A氧化酶的活性可受其结合底物、氧化底物和/或释放产物的能力的影响。在一些实施方案中，酰基辅酶A氧化酶在细胞的一个区室中有活性，而在细胞的另一个区室中没有活性。在一些实施方案中，酰基辅酶A氧化酶活性来自过氧化物酶体。在某些实施方案中，酰基辅酶A氧化酶活性是过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶(POX)活性，其由POX多肽实现。在一些实施方案中，酰基辅酶A氧化酶活性由宿主生物体编码且有时可被改变以产生工程生物体。酰基辅酶A氧化酶活性可被假丝酵母的POX4和POX5基因编码。在某些实施方案中，内源酰基辅酶A氧化酶活性可以提高。在一些实施方案中，在含有一种或多种酰基辅酶A氧化酶的生物体中的酰基辅酶A氧化酶可以独立地修饰(例如，可修饰一种或多种酰基辅酶A氧化酶)。在一些实施方案中，POX4多肽或POX5多肽的酰基辅酶A氧化酶活性可彼此独立地改变(例如，单独提高POX4活性、单独提高POX5的活性、提高一个而破坏另一个，诸如此类)。在某些实施方案中，提高一个POX活性的活性而破坏另一个POX活性的活性可相对于碳链长来改变酰基辅酶A氧化酶的比活性，同时保持或提高通过β氧化途径的总体通量。
在某些实施方案中，一种或多种酰基辅酶A氧化酶基因的宿主活性可通过遗传改变(例如，增加)产生多肽的量来提高(例如，引入强转录的或组成型表达的异源性启动子以与编码多肽的多核苷酸可操作地连接；编码所述多肽的多核苷酸的拷贝数增加(例如，通过引入包含多核苷酸的质粒、宿主基因组中附加拷贝的整合))。在一些实施方案中，可通过破坏(例如，敲除、插入诱变等及其组合)酰基辅酶A氧化酶基因或通过降低转录酰基辅酶A氧化酶基因的启动子(例如，向启动子或5’UTR添加阻抑序列)的活性，降低一种或多种酰基辅酶A氧化酶的宿主活性。
如上所述，编码一种或多种酰基辅酶A氧化酶(例如，POX4、POX5或POX4和POX5)的核苷酸序列的破坏有时可以改变相对于不同长度碳链(例如，包括长度为约1至约60个碳的脂肪醇、脂肪酸、链烷烃、二羧酸、脂肪族分子的碳链)代谢的途径效率、特异性和/或比活性。在一些实施方案中，用编码选择性标记的URA3核苷酸序列破坏一种或多种酰基辅酶A氧化酶(例如，POX4、POX5或POX4和POX5)的核苷酸序列，随后将其引入宿主微生物，从而产生缺乏酰基辅酶A氧化酶活性的工程生物体。
为改变底物特异性对假丝酵母Pox4和Pox5的定点诱变
在一些实施方案中，位于或邻近底物结合袋的氨基酸残基(例如，位于POX5的螺旋域3的残基(见表29))进行突变(例如，缺失或置换)，以改变POX5的活性谱。在一些实施方案中，POX5中的氨基酸428和/或429或相关的酶中的相应残基(例如，相关的酶和相应残基见表29)位于螺旋域3中并独立地突变(例如，缺失或置换)以改变POX5或相关酶的活性谱。有时，用合适的氨基酸独立地置换氨基酸428和/或429，该合适的氨基酸的非限制性的实例包括带正电荷和亲水性的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)、带负电荷和亲水性的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、含硫氨基酸(例如，丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸)、含酰胺氨基酸(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、脂肪族氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)、芳香族氨基酸(例如，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、脯氨酸、鸟氨酸、硒半胱氨酸、牛磺酸等或组合。
还如上所述，酰基辅酶A氧化酶(例如，POX4、POX5)的催化特异性可通过多种方法改变。改变酰基辅酶A氧化酶的结合和/或催化特异性可以证明有利于产生具有改变的链长识别、改变的链长催化活性的新型酰基辅酶A氧化酶，和/或产生具有有限或特定的链长特异性的酰基辅酶A氧化酶活性，从而允许进一步提高相对于在特定的所选原料中发现的不同长度碳链的代谢或碳链分布的代谢的途径效率、特异性和/或活性。在一些实施方案中，改变的酰基辅酶A氧化酶序列如下鉴定和/或产生：(i)筛选天然存在的变体群体；(ii)诱变内源序列；(iii)引入具有所需特异性的异源性序列(例如，从另外的生物体向宿主生物体中引入一种或多种未修饰的或修饰的酰基辅酶A氧化酶，在该宿主生物体中一种或多种内源酰基辅酶A氧化酶被任选破坏)；(iv)产生嵌合序列，其具有来自一个多核苷酸来源的编码序列的部分(例如，基因、生物体)和来自另外来源的编码序列的部分，和/或(v)使用核苷酸序列的智能设计和来自具有所需特异性的酰基辅酶A氧化酶的三维结构分析以重建内源酰基辅酶A氧化酶，从而产生一种新型特异性酶。在一些实施方案中，嵌合酰基辅酶A氧化酶序列可以具有来自两个或更多来源的多核苷酸序列贡献。在一些实施方案中，嵌合酰基辅酶A氧化酶序列包含来自内源多核苷酸的编码序列的一部分及来自异源性多核苷酸的编码序列的一部分。用于鉴定和/或产生具有新型催化和结合特异性的酰基辅酶A氧化酶的方法在实施例中描述。
编码酰基辅酶A氧化酶(例如，POX4和POX5)的核酸序列可以从任何合适的来源获得，其包括任何动物(例如，哺乳动物、鱼、爬行动物、两栖动物，等)、任何植物、真菌、酵母、原生动物、细菌、病毒、噬菌体，等等)。合适酵母的非限制性实例包括耶氏酵母属酵母(例如，解脂耶氏酵母(以前归类为解脂假丝酵母)、假丝酵母属酵母(例如，拉考夫假丝酵母、维斯假丝酵母、铁红假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母)、红酵母属酵母(例如，红酵母、牧草红酵母)、红冬孢酵母属酵母(例如，红冬孢酵母)、酵母属酵母(例如，酿酒酵母、贝酵母、巴斯德酵母(S.pastorianus)、卡尔酵母)、隐球酵母属酵母、丝孢酵母属酵母(例如，T.pullans、丝孢酵母)、毕赤酵母属酵母(例如，巴斯德毕赤酵母)和油脂酵母属酵母(例如，油脂酵母、L.lipoferus))。在一些实施方案中，合适的酵母是蛛网霉属、曲霉属、短梗霉属、Auxarthron、芽酵母属、假丝酵母属、Chrysosporuim、Chrysosporuim、德巴利酵母属、球孢子菌属(Coccidiodes)、隐球酵母属、裸囊菌属、汉逊酵母属、组织胞浆菌属、伊萨酵母属、克鲁维酵母属、油脂酵母属、Lssatchenkia、小孢霉属、Myxotrichum、Myxozyma、树粉孢属、管囊酵母属、青霉属、毕赤酵母属、红冬孢酵母属、红酵母属、红酵母属、酵母属、裂殖酵母属、帚霉属、瘤孢属、丝孢酵母属或耶氏酵母属的种。在一些实施方案中，合适的酵母是Arachniotusflavoluteus、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、出芽短梗霉、Auxarthronthaxteri、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、白假丝酵母、杜氏假丝酵母(Candidadubliniensis)、著明假丝酵母(Candidafamata)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、季也蒙假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、郎比可假丝酵母、解脂假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、近平滑假丝酵母、铁红假丝酵母、拉考夫假丝酵母、皱落假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、维斯假丝酵母、Candidaxestobii、Chrysosporuimkeratinophilum、粗球孢子菌(Coccidiodesimmitis)、浅白隐球酵母的流散隐球酵母变种、罗伦隐球酵母、新型隐球酵母、汉逊德巴利酵母、Gymnoascusdugwayensis、异常汉逊酵母、荚膜组织胞浆菌、Issatchenkiaoccidentalis、Isstachenkiaorientalis、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)、克鲁雄酵母菌(Kluyveromyceswaltii)、Lipomyceslipoferus、油脂酵母、石膏状小孢霉、Myxotrichumdeflexum、Oidiodendronechinulatum、管囊酵母、特异青霉、异常毕赤酵母(Pichiaanomala)、巴斯德毕赤酵母、树干毕赤酵母、红冬孢酵母、胶红红酵母(Rhodotorulaglutinus)、牧草红酵母、酿酒酵母、克鲁弗酵母、粟酒裂殖酵母、顶孢帚霉(Scopulariopsisacremonium)、黄瘤孢、丝孢酵母、Trichosporonpullans、解脂耶氏酵母或解脂耶氏酵母(以前归类为解脂假丝酵母)的种。在一些实施方案中，合适的酵母是解脂耶氏酵母菌株，其包括但不限于ATCC20362、ATCC8862、ATCC18944、ATCC20228、ATCC76982和LGAMS(7)1菌株(PapanikolaouS.和AggelisG.,Bioresour.Technol.82(1):43-9(2002))。在一些实施方案中，合适的酵母是假丝酵母属的种(即，假丝酵母)的酵母。编码酰基辅酶A氧化酶、酰基辅酶A氧化酶样活性或酰基辅酶A脱氢酶活性的任何核酸序列，可用于改变如本文所述的酵母的底物特异性。酰基辅酶A氧化酶、酰基辅酶A氧化酶样及酰基辅酶A脱氢酶的氨基酸序列和核苷酸序列的非限制性实例提供在本文及SEQIDNO.51至3810中。实施例中描述了进行修饰和扩增酰基辅酶A氧化酶基因(例如，POX5基因)活性的实验。来自假丝酵母菌菌株ATCC20336和解脂耶氏酵母的POX4和POX5的氨基酸和核苷酸水平的同一性百分比示于下表中：
同一性百分比(氨基酸)
同一性百分比(核苷酸)
酰基辅酶A氧化酶活性的存在、不存在或量可以通过本领域已知的任何合适的方法来检测。例如，如Shimizu等,1979描述的和如本文实施例中所述的酶试验，可以用于测定酰基辅酶A氧化酶的活性。代表天然和/或破坏的酰基辅酶A氧化酶序列的核酸序列还可使用核酸检测方法(例如，PCR、引物延伸、核酸杂交等和组合)或基于定量表达的分析(例如，RT-PCR、Western印迹法、Northern印迹法等和组合)来检测，其中工程生物体显示与宿主生物体相比降低的RNA和/或多肽水平。
酰基辅酶A脱氢酶
酰基辅酶A脱氢酶(ACAD)是一类可用以催化细胞线粒体中每个脂肪酸β-氧化循环的初始步骤的酶。它们可以在结构和功能上非常类似于酰基辅酶A氧化酶。其作用导致在酰基辅酶A硫酯底物的C2和C3之间引入反式双键。FAD是该机制中的必需的辅因子以使酶结合其合适的底物。
酰基辅酶A脱氢酶可以基于其对短、中等或长链脂肪酸和超长链脂肪酸酰基辅酶A底物的特异性而分类为四种不同的基团。尽管不同脱氢酶靶向不同链长的脂肪酸，但是所有类型的酰基辅酶A脱氢酶可能在机理上相似。ACAD的差异可以依据沿氨基酸序列的活性位点的位置而发生。
中等链酰基辅酶A脱氢酶是同源四聚体，每个亚基含有大约400个氨基酸和一个当量的FAD。该四聚体被归类为“二聚体的二聚体”。
酰基辅酶A脱氢酶的单个二聚体的两个单体之间的界面包含FAD结合位点，并具有广泛的键合相互作用。与此相反，在两个二聚体之间的界面几乎没有相互作用。在四聚体中共有4个活性位点，其中每个都包含一个FAD分子和一个酰基辅酶A底物。这给每个酶分子提供总共四个FAD分子和四个酰基辅酶A底物。
FAD结合在单体的三个域之间，其中只有核苷酸的部分是可及的。FAD结合明显有助于酶的整体稳定性。酰基辅酶A底物在酶的每个单体内完全结合。在一些ACAD中，活性位点排列有残基F252、T255、V259，T96、T99、A100、L103、Y375、Y375和E376。底物内感兴趣的区域可以楔在Glu376和FAD之间，排列该分子进入反应的理想位置。
一些ACAD序列示于SEQIDNO.3728至3810中。
硫酯酶
如本文所用的术语“硫酯酶活性”指从己酸酯中除去辅酶A。如本文所用的术语“硫酯酶活性”还指从活化的脂肪酸(例如，脂肪-酰基辅酶A)中除去辅酶A。具有硫酯酶活性的酶的非限制性实例包括酰基辅酶A水解酶(例如，EC3.1.2.20；还被称为酰基辅酶A硫酯酶、酰基辅酶A硫酯酶、酰基辅酶A水解酶、硫酯酶B、硫酯酶II、卵磷脂酶B、溶血磷脂酶L1(lysophopholipaseL1)、酰基辅酶A硫酯酶1和酰基辅酶A硫酯酶)。从脂肪-酰基辅酶A分子中除去辅酶A的硫酯酶催化以下反应：
酰基辅酶A+H2O-→辅酶A+羧酸，
其中羧酸通常为脂肪酸。释放的辅酶A可以在随后再用于其他细胞活性。
硫酯酶活性可由多肽提供。在某些实施方案中，所述多肽是拷贝数增加、可操作地连接至异源性和/或内源性启动子，或者拷贝数增加并可操作地连接至异源性和/或内源性启动子的内源性核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多肽由引入至宿主微生物的异源核苷酸序列编码。赋予硫酯酶活性的核酸序列可从许多来源获得，该来源包括披针叶萼距花(Cuphealanceolata)、热带假丝酵母(例如，参见SEQIDNO:33和35)和大肠杆菌(例如，参见SEQIDNO:37)。本文中提供了另外的可以用作硫酯酶多核苷酸序列供体的生物体。此类多肽的实例包括但不限于，来自披针叶萼距花的B型酰基-(ACP)硫酯酶(参见SEQIDNO:1)、来自热带假丝酵母的酰基辅酶A水解酶(例如，ACHA和ACHB，参见SEQIDNO:34和36)、来自大肠杆菌的酰基辅酶A硫酯酶(例如，TESA，参见SEQIDNO:38)。硫酯酶多核苷酸序列的非限制性实例参考在国家生物技术信息中心(NCBI)的万维网统一资源定位器(URL)ncbi.nlm.nih.gov的登录号CAB60830。
可通过本领域已知的任何合适方法来检测硫酯酶活性的存在、不存在或量。该方法的实例描述于ChemistryandBiology9:981-988中。在一些实施方案中，在宿主微生物中硫酯酶活性并未改变，而在某些实施方案中，该活性在工程微生物中相对于在宿主微生物中被添加或提高。在一些实施方案中，具有硫酯酶活性的多肽连接至另一多肽(例如，己酸合酶A或己酸合酶B多肽)。在实施例33中提供了编码硫酯酶活性和具有硫酯酶活性的多肽的多核苷酸序列的非限制性实例。
降低ω脂肪酸转化-通用的
如本文所用的术语“降低ω羟基脂肪酸转化的遗传修饰”指降低将ω羟基脂肪酸转化成另一产物的内源性活性的对宿主微生物的遗传改变。在一些实施方案中，内源性ω羟基脂肪酸脱氢酶活性降低。此类改变可有利地增加二羧酸的量，该二羧酸可进行纯化并进一步处理。
降低β氧化-通用的
如本文所用的术语“降低β-氧化活性的遗传修饰”指降低氧化含羧酸有机分子的β碳的内源性活性的对宿主微生物的遗传改变。在某些实施方案中，该有机分子是十或十二碳分子，并且有时包含一个或两个位于分子末端的羧酸部分(例如，癸二酸或十二烷二酸)。此类改变可有利地增加终产物如脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的产率。
增加脂肪酸合成-通用的
如本文使用的术语“导致脂肪酸合成增加的遗传修饰”还指降低将脂肪酸转化为脂肪-酰基辅酶A中间体的内源性活性的对宿主微生物的遗传改变。在一些实施方案中，将脂肪酸转化为脂肪-酰基辅酶A中间体的内源性活性降低。在某些实施方案中，酰基辅酶A合成酶活性降低。此类改变可有利地增加终产物如脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的产率。
酰基辅酶A合成酶
在许多生物体中，脂肪酸可通过酰基辅酶A合成酶(例如，ACS1、ACS2、EC6.2.1.3；还指酰基辅酶A合成酶、酰基辅酶A连接酶)的活性转化为脂肪-酰基辅酶A中间体。在假丝酵母属的种中，酰基辅酶A合成酶具有分别由ACS1、FAT1、ACS2A、ACS2B、ACS2C和ACS2D编码的六个同工型(例如，与酿酒酵母中的FAA1、FAT1和FAA2是同源的)。酰基辅酶A合成酶是连接酶类别的成员，并且催化以下反应，
ATP+脂肪酸+辅酶A<＝>AMP+焦磷酸+脂肪-酰基辅酶A。
脂肪酸和辅酶A常用于将脂肪酸活化成用于进入各个细胞过程的脂肪-酰基辅酶A中间体。不希望受到理论的限制，认为减少可用于各个细胞过程的脂肪-酰基辅酶A的量可以增加可用于通过相同宿主生物体中的其他工程化途径(例如，ω氧化途径，β氧化途径，ω氧化途径和β氧化途径)转化为脂肪二羧酸(例如，癸二酸或十二烷二酸)的脂肪酸的量。可通过任何合适的手段使酰基辅酶A合成酶失活。本文描述了适合用于破坏编码具有ACS1活性的多肽的核苷酸序列的基因敲除方法。在实施例33的SEQIDNO:39中提供了ACS1的核苷酸序列。在实施例中还提供了被配置用于产生ACS1的缺失突变体的整合/破坏构建体的实例。
可以通过本领域中已知的任何合适的方法来检测酰基辅酶A合成酶活性的存在、不存在或量。合适的检测方法的非限制性实例包括酶测定法(例如，Lageweg等“AFluorometricAssayforAcyl-CoASynthetaseActivity”,AnalyticalBiochemistry,197(2):384-388(1991))、基于PCR的测定法(例如，qPCR、RT-PCR)、免疫学检测方法(例如，对酰基辅酶A合成酶具有特异性的抗体)等及其组合。
如本文使用的术语“导致脂肪酸合成增加的遗传修饰”还指降低将长链和极长链脂肪酸转化为活化的脂肪-酰基辅酶A中间体的内源性活性的对宿主微生物的遗传改变。在一些实施方案中，将长链和极长链脂肪酸转化为活化的脂肪-酰基辅酶A中间体的内源性活性降低。在某些实施方案中，长链酰基辅酶A合成酶活性降低。此类改变可有利地增加终产物如脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的产率。
在一些生物体中，长链脂肪酸(例如，C12-C18链长)和极长链脂肪酸(例如，C20-C26)通常通过长链酰基辅酶A合成酶(例如，FAT1；EC6.2.1.3；还指长链脂肪酸辅酶A连接酶、酰基辅酶A合成酶；脂肪酸硫激酶(长链)；酰基活化酶；棕榈酰辅酶A合酶；二十四烷酰基辅酶A合酶；花生酰基辅酶A合成酶；酰基辅酶A合成酶；酰基辅酶A连接酶；棕榈酰辅酶A合成酶；硫激酶；棕榈酰辅酶A连接酶；酰基辅酶A连接酶；脂肪酸辅酶A连接酶；长链脂肪酰基辅酶A合成酶；油酰基辅酶A合成酶；硬脂酰辅酶A合成酶；长链脂肪酰基辅酶A合成酶；长链酰基辅酶A合成酶；脂肪酸延长酶(ELO)；LCFA合成酶；降植烷酰(pristanoyl)辅酶A合成酶；ACS3；长链酰基辅酶A合成酶I；长链酰基辅酶A合成酶II；脂肪酰基-辅酶A合成酶；长链酰基-辅酶A合成酶；和酸：辅酶A连接酶(AMP-形成)的硫酯化活性进行活化和/或转运。脂肪酸还可通过长链酰基辅酶A合成酶活性从原料转运到宿主生物体中。
长链酰基辅酶A合成酶催化以下反应：
ATP+长链羧酸+辅酶A＝AMP+二磷酸+酰基辅酶A，
其中“酰基辅酶A”指脂肪-酰基辅酶A分子。如本文指出的，脂肪酸的活化对于脂肪酸进入各个细胞过程(例如，作为能量来源、作为用于膜形成和/或重构的组分、作为碳储存分子)通常是必需的。FAT1的缺失突变体已显示积累极长链脂肪酸并且表现出对这些脂肪酸的降低的活化。不希望受到理论的限制，认为长链酰基辅酶A合成酶活性的降低可减少转化为脂肪-酰基辅酶A中间体的长链脂肪酸的量，从而增加可用于通过相同宿主生物体中的其他工程化途径(例如，ω氧化途径，β氧化途径，ω氧化途径和β氧化途径)转化为脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的脂肪酸的量。可通过任何合适的手段使长链-酰基辅酶A合成酶活性降低或失活。本文描述了适合用于破坏编码具有FAT1活性的多肽的核苷酸序列的基因敲除方法。在实施例33的SEQIDNO:41中提供了FAT1的核苷酸序列。本文描述了适合用于构建“敲除”构建体的DNA载体。
可以通过本领域中已知的任何合适的方法来检测长链-酰基辅酶A合成酶活性的存在、不存在或量。合适的检测方法的非限制性实例包括酶测定法、结合测定法(例如，Erland等,AnalyticalBiochemistry295(1):38-44(2001))、基于PCR的测定法(例如，qPCR、RTPCR)、免疫学检测方法(例如，对长链-酰基辅酶A合成酶具有特异性的抗体)等及其组合。
对ACS活性的选择性修饰
在一些实施方案中，β-氧化途径是功能性的并且对于选择性底物特异性进行修饰。在一些实施方案中，β-氧化途径仅对于二酰基辅酶A硫酯是选择性的，并且在一些实施方案中，仅对链长大于6、8、10、12、14、16、18或20个碳的二酰基辅酶A是选择性的。β-氧化选择性可以如下实现：1)利用穿过过氧化物酶体膜转运酰基辅酶A和二酸的差异，2)在细胞溶质区室中选择性地敲除酰基辅酶A合成酶(ACS)的活性，3)对于具有短链底物特异性的同工酶，敲除在过氧化物酶体区室中的ACS活性，和/或4)工程化只对大于6、8、10、12、14、16、18或20个碳的底物起作用的β-氧化途径。
在酿酒酵母中，细胞质的ACS活性由FAA1、FAA3、FAA4和FAT1编码，而过氧化物酶体活性由FAA2编码。FAA1和FAT1的同源物在假丝酵母属菌株中鉴定，然而FAA3或FAA4没有鉴定的同源物。在假丝酵母属菌株中鉴定了酿酒酵母过氧化物酶体FAA2的多达五个同源物。五个同源物中的两个显示彼此95％的同一性并且是同一基因的最可能的等位基因。在假丝酵母属菌株ATCC20336鉴定了四个FAA2同源物(例如，ACS2A至CS2D)。
在一些实施方案中，一种策略是控制ACS酶活性的亚细胞位置，以便它仅存在于过氧化物酶体中。构建FAA1和FAT1突变体faa1Δ和fat1Δ，并且其应具有极小的靶向细胞质的ACS活性。在这些突变菌株中，外源提供的长链游离脂肪酸在细胞质中积累，因为它们不能被转运至过氧化物酶体中，除非它们被活化为酰基辅酶A硫酯。高浓度的游离脂肪酸可能是有毒的，因此细胞的作用是通过将游离脂肪酸氧化为毒性较小的二羧酸来对本身解毒。不同于长链脂肪酸，长链二羧酸能扩散到过氧化物酶体区室中，然后在其中它们可被活化为二酰基辅酶A硫酯，这是进入β-氧化途径所必需的。通过具有多种过氧化物酶体ACS同工酶，其可以使得每种同工酶具有不同的底物特异性。在一些实施方案中，希望保留那些具备与脂肪酸原料的链长相匹配的底物特异性，而对链长≤6、8、10、12、14、16、18或20个碳的二酸没有活性(或低活性)的过氧化物酶体ACS酶。采用这种策略，通过β-氧化将链缩短至12个碳，例如，随后水解为二羧酸和游离辅酶A的任何长链二羧基辅酶A，不能被重新活化为二羧基辅酶A，以重新进入β-氧化以进一步缩短链。在一些实施方案中，与控制过氧化物酶体ACS的底物链长特异性相结合，过氧化物酶体硫酯酶活性与在我们的产物的所需链长下的最大活性一起扩大。这种策略可以控制通过β-氧化产生的二羧酸的链长。
在一些实施方案中，脂肪酸向过氧化物酶体的流动通过敲除基因PXA1和PXA2来控制。这些基因编码ATP结合盒转运蛋白的亚基，所述转运蛋白负责将长链脂酰辅酶A从细胞质穿过过氧化物酶体膜转运至过氧化物酶体基质。在一些实施方案中，尽管编码细胞质ACS的基因被敲除，但在细胞质中仍可有一些来自过氧化物酶体ACS的残余的ACS活性。去往过氧化物酶体的ACS同工酶在细胞质中翻译并且在引入到过氧化物酶体之前完全折叠。因此，过氧化物酶体ACS可贡献少量的细胞质ACS活性。Pxa1p/Pxa2p转运蛋白的缺失可以防止任何活化为酰基辅酶A硫酯的长链脂肪酸被转运至过氧化物酶体中进行降解。
酰基辅酶A甾醇酰基转移酶
如本文使用的术语“导致脂肪酸合成增加的遗传修饰”还指降低将脂肪酸转化为胆固醇酯的内源性活性的对宿主微生物的遗传改变。在一些实施方案中，将脂肪酸转化为胆固醇酯的内源性活性降低。在某些实施方案中，酰基辅酶A甾醇酰基转移酶活性降低。此类改变可有利地增加终产物如脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的产率。
在许多生物体中，脂肪酸可通过酰基辅酶A甾醇酰基转移酶(例如，ARE1、ARE2、EC2.3.1.26；还指甾醇O-酰基转移酶；胆固醇酰基转移酶；甾醇-酯合酶；甾醇-酯合成酶；甾醇-酯合酶；酰基辅酶A-胆固醇-O-酰基转移酶；酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶；ACAT；酰基辅酶A：胆固醇O-酰基转移酶；胆固醇酯合酶；胆固醇酯合成酶；和胆固醇酯合成酶)的活性转化为胆固醇-酯。不希望受到任何理论的限制，在引导脂肪酸远离向细胞膜内的引入并朝向脂质储存形式中可能涉及胆固醇酯化。酰基辅酶A甾醇酰基转移酶催化以下反应：
酰基辅酶A+胆固醇＝辅酶A+胆固醇酯。
胆固醇的酯化被认为限制其在细胞膜脂质中的溶解性，并因此促进胆固醇酯在细胞质内的脂肪滴(例如，碳储存分子的形式)中的积累。因此，不希望受到任何理论的限制，胆固醇的酯化反应可能导致脂质储存储分子的积累，并且酰基辅酶A甾醇酰基转移酶的活性的破坏可能导致酰基辅酶A水平的增加，该酰基辅酶A可以通过相同宿主生物体中的其他工程化途径(例如，ω氧化途径、β氧化途径、ω氧化途径和β氧化途径)而转化为脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)。可通过任何合适的手段使酰基辅酶A甾醇酰基转移酶失活。本文描述了适合破坏编码具有ARE1活性、ARE2活性，或者ARE1活性和ARE2活性的多肽的核苷酸序列的基因敲除方法。ARE1和ARE2的核苷酸序列在实施例33的SEQIDNO:43和45中提供。本文描述了适用于构建“敲除”构建体的DNA载体。
可以通过本领域中已知的任何合适的方法来检测酰基辅酶A甾醇酰基转移酶活性的存在、不存在或量。合适的检测方法的非限制性实例包括酶测定法(例如，Chen等,PlantPhysiology145:974-984(2007))、结合测定法、基于PCR的测定法(例如，qPCR、RT-PCR)、免疫学检测方法(例如，对长链-酰基辅酶A合成酶具有特异性的抗体)等及其组合。
二酰基甘油酰基转移酶和酰基转移酶
如本文使用的术语“导致脂肪酸合成增加的遗传修饰”还指降低催化二酰基甘油酯化(例如，向二酰基甘油添加酰基基团以形成三酰甘油)的内源性活性的对宿主微生物的遗传改变。在一些实施方案中，将二酰基甘油转化为三酰甘油的内源性活性降低。在某些实施方案中，酰基转移酶活性降低。在一些实施方案中，二酰基甘油酰基转移酶活性降低。在一些实施方案中，二酰基甘油酰基转移酶(例如，DGA1，EC2.3.1.20)活性和酰基转移酶(例如，LRO1)活性降低。此类改变可有利地增加终产物如脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的产率。
在许多生物体中，二酰基甘油可通过二酰基甘油酰基转移酶(例如，DGA1；EC2.3.1.20；还指甘油二酯酰基转移酶；1,2-二酰基甘油酰基转移酶；二酰基甘油酰基转移酶；甘油二酯O-酰基转移酶；棕榈酰辅酶A-sn-1,2二酰基甘油酰基转移酶；酰基辅酶A:1,2-二酰基甘油O-酰基转移酶和酰基辅酶A:1,2-二酰基-sn-甘油O-酰基转移酶)的活性转化为三酰甘油。二酰基甘油酰基转移酶催化以下反应：
酰基辅酶A+1,2-二酰基-sn-甘油＝辅酶A+三酰甘油，
并且通常被认为是甘油三酯合成中的最终且唯一的关键步骤。酵母中DGA1基因的产物通常定位于脂质颗粒上。
除了针对DGA1描述的二酰基甘油酯化活性之外，许多生物体还可以通过其他酰基转移酶活性的活性来产生甘油三酯，其他酰基转移酶活性的非限制性实例包括卵磷脂-胆固醇酰基转移酶活性(例如，LRO1；EC2.3.1.43；还指磷脂酰胆碱-甾醇O-酰基转移酶活性；卵磷脂-胆固醇酰基转移酶活性；磷脂-胆固醇酰基转移酶活性；LCAT(卵磷脂-胆固醇酰基转移酶)活性；卵磷脂：胆固醇酰基转移酶活性；和溶血卵磷脂酰基转移酶活性)和磷脂：二酰基甘油酰基转移酶(例如，EC2.3.1.158；还指PDAT活性和磷脂：1,2-二酰基-sn-甘油O-酰基转移酶活性)。EC2.3.1.43和EC2.3.1.58家族的酰基转移酶催化以下普遍的反应：
磷脂+1,2-二酰基甘油＝溶血磷脂+三酰甘油。
三酰甘油通常用作碳(例如，脂肪酸或脂质)储存分子。不希望受到任何理论的限制，认为降低酰基转移酶的活性可以降低二酰基甘油向三酰甘油的转化，这与另外的遗传修饰(例如，用于进一步从甘油骨架中除去脂肪酸的脂肪酶)相组合，可以导致可通过相同宿主生物体中的其他工程化途径(例如，ω氧化途径、β氧化途径、ω氧化途径和β氧化途径)转化为脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的脂肪酸的积累增加。可通过任何合适的手段使酰基转移酶失活。本文描述了适用于破坏编码具有DGA1活性，LRO1活性，或DGA1活性和LRO1活性的多肽的核苷酸序列的基因敲除方法。在实施例33的SEQIDNO:47中提供了DGA1的核苷酸序列。在实施例33的SEQIDNO:49中提供了LRO1的核苷酸序列。本文描述了适用于构建“敲除”构建体的DNA载体。
可以通过本领域中已知的任何合适的方法来检测酰基转移酶活性的存在、不存在或量。合适的检测方法的非限制性实例包括酶测定法(例如，Geelen,AnalyticalBiochemistry322(2):264-268(2003),Dahlqvist等,PNAS97(12):6487-6492(2000))、结合测定法、基于PCR的测定法(例如，qPCR、RTPCR)、免疫学检测方法(例如，对DGA1或LRO1酰基转移酶具有特异性的抗体)等及其组合。
多核苷酸和多肽
核酸(例如，本文中也称为核酸试剂、靶核酸、靶核苷酸序列、感兴趣的核酸序列或感兴趣的核酸区)例如可来自任何来源或组成，诸如DNA、cDNA、gDNA(基因组DNA)、RNA、siRNA(短抑制性RNA)、RNAi、tRNA或mRNA，并且可以是任何形式(例如，线性、环状、超螺旋、单链、双链等)。核酸还可包含DNA或RNA类似物(例如，含有碱基类似物、糖类似物和/或非天然骨架等)。应当理解，术语“核酸”并不涉及或隐含多核苷酸链的具体长度，因此多核苷酸和寡核苷酸也包括在该定义中。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于RNA，尿嘧啶碱基是尿苷。
核酸有时是质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒、人工染色体、酵母人工染色体(例如，YAC)或能够在宿主细胞中复制或被复制的其他核酸。在某些实施方案中，核酸可来自文库或可从来自感兴趣的生物体的酶消化、剪切或超声处理的基因组DNA(例如，片段化的)获得。在一些实施方案中，经受片段化或切割的核酸可具有约5到约10,000个碱基对、约100到约1,000个碱基对、约100到约500个碱基对，或约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个碱基对的标称、平均化或平均长度。可通过本领域中任何合适的方法产生片段，并且可由普通技术人员通过选择合适的片段产生方法来控制核酸片段的平均化、平均或标称长度。在一些实施方案中，可对片段化的DNA进行大小选择以获得特定大小范围的核酸片段。
可通过普通技术人员已知的各种方法对核酸进行片段化，该方法包括但不限于：物理、化学和酶方法。此类方法的实例描述于美国专利申请公布号20050112590(2005年5月26日公布，名称为“Fragmentation-basedmethodsandsystemsforsequencevariationdetectionanddiscovery,”在VanDenBoom等名下)。普通技术人员可选择某些方法来产生非特异性切割的片段或特异性切割的片段。可产生非特异性切割的片段样品核酸的方法的实例包括但不限于：使样品核酸与将核酸暴露于剪切力的设备接触(例如，使核酸通过注射器针头；利用弗氏压碎器(Frenchpress))；将样品核酸暴露于辐射(例如，γ、x-射线、紫外辐射；片段大小可通过辐射强度进行控制)；在水中煮沸核酸(例如，产生约500个碱基对的片段)以及将核酸暴露于酸和碱水解过程。
可通过使核酸与一种或多种特异性切割剂接触来特异性切割该核酸。如本文所用的术语“特异性切割剂”指可在一个或多个特定位点切割核酸的试剂，其有时为化学品或酶。特异性切割剂通常将根据具体的核苷酸序列在特定位点进行特异性切割。酶特异性切割剂的实例包括但不限于：内切核酸酶(例如，DNA酶(如，DNA酶I、II)；RNA酶(例如，RNA酶E、F、H、P)；CleavaseTM酶；TaqDNA聚合酶；大肠杆菌DNA聚合酶I和真核生物结构特异性内切核酸酶；鼠FEN-1内切核酸酶；I、II或III型限制性内切核酸酶，如AccI、AflIII、AluI、Alw44I、ApaI、AsnI、AvaI、AvaII、BamHI、BanII、BclI、BglI、BglII、BlnI、BsmI、BssHII、BstEII、CfoI、CIaI、DdeI、DpnI、DraI、EcIXI、EcoRI、EcoRI、EcoRII、EcoRV、HaeII、HaeII、HindII、HindIII、HpaI、HpaII、KpnI、KspI、MluI、MIuNI、MspI、NciI、NcoI、NdeI、NdeII、NheI、NotI、NruI、NsiI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、SacI、SalI、Sau3AI、ScaI、ScrFI、SfiI、SmaI、SpeI、SphI、SspI、StuI、StyI、SwaI、TaqI、XbaI、XhoI)；糖基化酶(例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶、3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶II、嘧啶水合物-DNA糖基化酶、FaPy-DNA糖基化酶、胸腺嘧啶错配-DNA糖基化酶、次黄嘌呤-DNA糖基化酶、5-羟甲基尿嘧啶DNA糖基化酶(HmUDG)、5-羟甲基胞嘧啶DNA糖基化酶、或1,N6-乙烯桥-腺嘌呤DNA糖基化酶)；外切核酸酶(例如，外切核酸酶III)；核酶和DNA核酶。样品核酸可用化学剂进行处理，或用修饰的核苷酸合成，并且可切割修饰的核酸。在非限制性实例中，可利用以下试剂处理样品核酸：(i)产生若干烷基化碱基的烷基化剂，例如甲基亚硝基脲，包括被烷基嘌呤DNA-糖基化酶识别并切割的N3-甲基腺嘌呤和N3-甲基鸟嘌呤；(ii)亚硫酸氢钠，其引起DNA中的胞嘧啶残基发生脱氨以形成可被尿嘧啶N-糖基化酶切割的尿嘧啶残基；以及(iii)化学剂，其将鸟嘌呤转化成其氧化形式——8-羟基鸟嘌呤，后者可被甲酰胺基嘧啶DNAN-糖基化酶切割。化学切割方法的实例包括但不限于：烷基化(例如，硫代磷酸酯修饰的核酸的烷基化)；含P3′-N5′-氨基磷酸酯的核酸的酸不稳定性切割；以及核酸的四氧化锇与哌啶处理。
如本文所用的术语“互补切割反应”是指用不同的切割试剂或者通过改变同一切割试剂的切割特异性在同一核酸上进行的切割反应，从而产生相同目标或参考核酸或蛋白质的交替切割模式。在某些实施方案中，可以在一个或多个反应容器中用一种或多种特异性切割剂(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种特异性切割剂)处理感兴趣的核酸(例如，在单独的容器中用各种特异性切割剂处理感兴趣的核酸)。
有时通过本领域已知的任何扩增方法(例如，PCR、RT-PCR等)扩增适用于本文所述实施方案的核酸。当使用通常难以培养的生物体(例如，生长缓慢，需要专门的培养条件等)时，核酸扩增可能是特别有利的。如本文所用的术语“扩增”或“扩增反应”指用于使核酸的靶序列的拷贝大大增加的任何体外过程。扩增有时指靶核酸的“指数”增加。然而，如本文所用的“扩增”还可指选择的核酸靶序列数目的线性增加，但不同于一次性的单引物延伸步骤。在一些实施方案中，可进行有限扩增反应(也称为预扩增)。预扩增是一种由于进行较少数目的循环，例如10个循环而发生的有限量的扩增的方法。预扩增可允许一定的扩增，但在指数期之前停止扩增，并通常产生约500个拷贝的所需核苷酸序列。采用预扩增还可限制与标准PCR反应中消耗的反应物相关的不准确性。
在一些实施方案中，有时核酸试剂稳定地整合入宿主生物的染色体中，或者在某些实施方案中，核酸试剂可以是宿主染色体的缺失部分(例如，遗传修饰的生物体，在该生物体中宿主基因组的改变赋予选择性或优先维持所需生物体携带遗传修饰的能力)。可针对其引导所需蛋白质或核酸分子产生的能力选择此类核酸试剂(例如，核酸或遗传修饰的生物体，其改变的基因组赋予该生物体可选择的性状)。需要时，可改变核酸试剂，以使密码子编码(i)相同的氨基酸(利用不同于天然序列中指定的相应物的tRNA)，或(ii)不同于正常氨基酸的氨基酸，包括非常规或非天然氨基酸(包括可检测地标记的氨基酸)。如本文所述的术语“天然序列”指在其天然环境中发现的未修饰的核苷酸序列(例如，在生物体中发现的核苷酸序列)。
核酸或核酸试剂可包含通常根据该核酸的预期用途选择的某些元件。核酸试剂中可包括或排除任何以下元件。例如，核酸试剂可包含以下核苷酸元件中的一个或多个或全部：一个或多个启动子元件、一个或多个5’非翻译区(5’UTR)、一个或多个靶核苷酸序列可插入其中的区域(“插入元件”)、一个或多个靶核苷酸序列、一个或多个3’非翻译区(3’UTR)以及一个或多个选择元件。核酸试剂可设置有此类元件中的一个或多个，并且可在将核酸引入所需生物体之前将其他元件插入该核酸中。在一些实施方案中，提供的核酸试剂包含启动子、5’UTR、任选的3’UTR和通过其将靶核苷酸序列插入(即，克隆入)核苷酸试剂的插入元件。在某些实施方案中，提供的核酸试剂包含启动子、插入元件和任选的3’UTR，且5’UTR/靶核苷酸序列与任选的3’UTR一起插入。这些元件可以按适于在所选表达系统中表达(例如，在所选生物体中表达，或在无细胞系统中表达)的任何顺序布置，并且在一些实施方案中，核酸试剂在5’到3’方向上包含以下元件：(1)启动子元件、5’UTR和插入元件；(2)启动子元件、5’UTR和靶核苷酸序列；(3)启动子元件、5’UTR、插入元件和3’UTR；以及(4)启动子元件、5’UTR、靶核苷酸序列和3’UTR。
启动子
启动子元件通常是DNA合成和/或RNA合成所需要的。启动子元件通常包含DNA区，该DNA区可通过提供用于合成对应于基因的RNA的起始位点而有利于特定基因的转录。在一些实施方案中，启动子通常位于它们所调节的基因附近，位于该基因的上游(例如，基因的5’)，并在与该基因的有义链相同的DNA链上。在一些实施方案中，启动子元件可从基因或生物体中分离，并以与多核苷酸序列功能性连接的方式插入，以允许改变的和/或调节的表达。用于核酸表达的非天然启动子(例如，通常不与给定的核酸序列相关联的启动子)通常称为异源启动子。在某些实施方案中，异源启动子和/或5’UTR可以按与编码具有如本文所述的所需活性的多肽的多核苷酸功能性连接的方式插入。对于启动子，如本文所用的术语“可操作地连接”和“与…功能性连接”指编码序列与启动子元件之间的关系。当由编码序列经由转录的表达受启动子元件调节或控制时，启动子与编码序列可操作地连接或功能性连接。对于启动子元件，术语“可操作地连接”和“功能性连接”在本文中可互换使用。
启动子通常与RNA聚合酶相互作用。聚合酶是利用先前存在的核酸试剂催化核酸合成的酶。当模板是DNA模板时，先转录RNA分子，再合成蛋白质。适用于本发明方法的具有聚合酶活性的酶包括在所选系统中具有活性，与所选模板一起用于合成蛋白质的任何聚合酶。在一些实施方案中，在本文中也称为启动子元件的启动子(例如，异源启动子)可以可操作地连接至核苷酸序列或开放阅读框(ORF)。从启动子元件开始的转录可催化与可操作地连接至该启动子的核苷酸序列或ORF序列相对应的RNA的合成，这进而导致所需肽、多肽或蛋白质的合成。
启动子元件有时表现出对调节控制的反应性。启动子元件有时还可被选择剂调节。即，从启动子元件开始的转录有时可响应于环境、营养或内部条件或信号的变化而启动、关闭、上调或下调(例如，热诱导型启动子、光调节的启动子、反馈调节的启动子、激素影响的启动子、组织特异性启动子、氧和pH影响的启动子、对选择剂(例如，卡那霉素)有反应性的启动子等)。受环境、营养或内部信号影响的启动子经常受到在启动子或其附近结合的并在某些条件下增加或降低靶序列表达的信号的影响(直接或间接)。
可影响从本文所述实施方案中使用的启动子元件开始的转录的选择剂或调节剂的非限制性实例包括但不限于：(1)编码对其他情况下有毒性的化合物(例如，抗生素)提供抗性的产物的核酸区段；(2)编码在其他情况下在受者细胞中缺乏的产物(例如，必需产物、tRNA基因、营养缺陷型标记)的核酸区段；(3)编码抑制基因产物活性的产物的核酸区段；(4)编码易于鉴定的产物(例如，表型标记，如抗生素(如β-内酰胺酶)、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)和细胞表面蛋白)的核酸区段；(5)结合在其他情况下对细胞存活和/或功能有害的产物的核酸区段；(6)在其他情况下抑制以上1-5项所述的任何核酸区段的活性的核酸片段(例如，反义寡核苷酸)；(7)结合修饰底物的产物(例如，限制性内切核酸酶)的核酸区段；(8)可用于分离或鉴定所需分子的核酸区段(例如，特异性蛋白质结合位点)；(9)编码可能在其他情况下无功能的特定核苷酸序列的核酸区段(例如，用于分子亚群的PCR扩增)；(10)缺失时直接或间接地赋予对特定化合物的抗性或敏感性的核酸区段；(11)编码具有毒性或在受者细胞中将相对无毒的化合物转化成有毒化合物的产物(例如，单纯疱疹病毒胸苷激酶，胞嘧啶脱氨酶)的核酸区段；(12)抑制含有它们的核酸分子的复制、分割或遗传性的核酸区段；和/或(13)编码条件性复制功能，例如在某些宿主或宿主细胞菌株或在某些环境条件(例如，温度、营养条件等)下的复制的核酸区段。在一些实施方案中，可加入调节剂或选择剂以改变生物所经受的现有生长条件(例如，在液体培养物中生长、在发酵罐中生长、在固体营养板上生长等)。
在一些实施方案中，可利用启动子元件的调节来改变(例如，提高、增添、降低或基本消除)肽、多肽或蛋白质的活性(例如，酶活性)。例如，在某些实施方案中，微生物可通过遗传修饰进行工程化以表达这样的核酸试剂，其可增添新的活性(例如，在宿主生物中通常未发现的活性)或通过增加从可操作地连接至感兴趣核苷酸序列(例如，感兴趣的同源或异源核苷酸序列)的同源或异源启动子开始的转录来提高现有活性的表达。在一些实施方案中，微生物可通过遗传修饰进行工程化以表达这样的核酸试剂，其在某些实施方案中，可通过降低或基本消除从可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列的同源或异源启动子开始的转录来降低活性的表达。
在一些实施方案中，可利用技术人员已知的重组DNA和遗传技术改变活性。本文中进一步描述了用于工程化微生物的方法。本文的表格提供了由氧上调的酵母启动子、由氧下调的酵母启动子、酵母转录阻抑物和它们的相关基因、如采用MEME序列分析软件测定的DNA结合基序的非限制性列表。可利用程序MEME来鉴定潜在的调节剂结合基序以检索被调节剂结合的基因区间的过度呈现的序列。对于各种调节剂，提取以小于0.001的p-值结合的基因区间的序列以用作基序查找的输入。使用以下设置运行MEME软件：6-18个碱基的基序宽度，“调制噪声(zoops)”分布模型，第6阶Markov背景模型，以及20个基序的查找限制。通过以下两个标准对找到的序列基序的显著性进行评分：由MEME计算的E-值和特异性评分。针对各调节剂，示出了具有使用各度量获得的最佳评分的基序。除了在半乳糖中生长的表位标记的Gal4的先前公布的数据集之外，显示的所有基序均源自在丰富生长条件下产生的数据集。
在一些实施方案中，可通过在选择所需的活性变化的条件下筛选生物体来发现改变的活性。例如，可对某些微生物进行调整以通过在含有代谢差或者甚至有毒的物质的培养基上选择或筛选所讨论的生物体来提高或降低活性。例如，生物体利用通常代谢差的物质生长的能力的提高可能导致利用该物质的生长率的增加。例如，对毒性物质的敏感性的降低可表现为利用较高浓度的毒性物质的生长。以该方式鉴定的遗传修饰有时被称为自然发生的突变，或者携带这些遗传修饰的生物体有时可能被称为天然存在的突变体。以该方式获得的修饰不限于启动子序列的改变。即，如上所述，通过选择性压力筛选微生物可产生这样的遗传改变：其可在非启动子序列中发生，并且有时也可在不处于感兴趣的核苷酸序列中的序列中发生，但在相关的核苷酸序列(例如，同一途径的不同步骤中涉及的基因、转运基因等)中发生。在一些实施方案中，有时可通过从独特环境中分离天然存在的变体来发现天然突变体。
同源性和同一性
除了本文提供的调节启动子序列、调节序列和编码多核苷酸外，核酸试剂还可包括与上述序列(或与互补序列)80％或更高地相同的多核苷酸序列。即，可使用与本文所述的核苷酸序列至少80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高地相同的核苷酸序列。如本文所用的术语“相同的”指两个或更多个当彼此比较时具有基本相同的核苷酸序列的核苷酸序列。一种用于确定两个核苷酸序列或氨基酸序列是否基本相同的检测是确定所共有的相同核苷酸序列或氨基酸序列所占的百分比。
序列同一性的计算可如下进行。为了最佳比较目的来比对序列(例如，为了最佳比对可在第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个中引入空位，并且为了比较目的可忽视非同源序列)。为比较目的而比对的参考序列的长度有时为该参考序列长度的30％或更高，40％或更高，50％或更高，通常为60％或更高，并且更常见为70％或更高，80％或更高，90％或更高，或100％。然后在两个序列中比较分别在相应的核苷酸或多肽位置的核苷酸或氨基酸。当第一序列中的某位置被与在第二序列中相应位置处相同的核苷酸或氨基酸占据时，认为在该位置处核苷酸或氨基酸相同。考虑到为两个序列的最佳比对而引入的空位数目和各空位的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数。
序列比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可采用数学算法来完成。两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比可采用已纳入ALIGN程序(2.0版)的Meyers和Miller,CABIOS4:11-17(1989)的算法，利用PAM120权重残基表，空位长度罚分12和空位罚分4来确定。两个氨基酸序列之间的同一性百分比还可采用已纳入GCG软件包(可在http网址www.gcg.com获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:444-453(1970)的算法，利用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。两个核苷酸序列之间的同一性百分比可采用GCG软件包(可在http网址www.gcg.com获得)中的GAP程序，利用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。常用的一组参数是Blossum62评分矩阵，其中空位开放罚分为12，空位延伸罚分为4，且移码空位罚分为5。
序列同一性还可通过在严格条件下进行的杂交试验来确定。如本文所用的术语“严格条件”指用于杂交和洗涤的条件。严格条件是本领域技术人员已知的，并且可见于CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.,6.3.1-6.3.6(1989)中。在该参考文献中描述了水性和非水性方法并且可使用其中的任一种方法。严格杂交条件的实例是在约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50℃下用0.2XSSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。严格杂交条件的另一实例是在约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在55℃下用0.2XSSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。严格杂交条件的又一实例是在约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在60℃下用0.2XSSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。通常，严格杂交条件是在约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在65℃下用0.2XSSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。更常见地，严格条件是在65℃下用0.5M磷酸钠、7％SDS处理，然后在65℃下用0.2XSSC、1％SDS洗涤一次或多次。
UTR
如上所述，核酸试剂还可包含一个或多个5’UTR以及一个或多个3’UTR。5’UTR可包含一个或多个对于其所源自的核苷酸序列为内源性的元件，并且有时包含一个或多个外源性元件。5’UTR可源自任何合适的核酸，例如来自任何合适的生物体(例如，病毒、细菌、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物)的基因组DNA、质粒DNA、RNA或mRNA。技术人员可根据所选的表达系统(例如，在所选生物体中表达，或在无细胞系统中表达)选择对5’UTR合适的元件。5’UTR有时包含技术人员已知的以下元件中的一个或多个：增强子序列(例如，转录性或翻译性)、转录起始位点、转录因子结合位点、翻译调节位点、翻译起始位点、翻译因子结合位点、辅助蛋白质结合位点、反馈调节剂结合位点、Pribnow框、TATA框、-35元件、E-盒(E-box)(螺旋-环-螺旋结合元件)、核糖体结合位点、复制子、内部核糖体进入位点(IRES)、沉默子元件等。在一些实施方案中，可分离启动子元件，以使得适当的条件性调节所必需的所有5’UTR元件均包含在启动子元件片段中，或包含在启动子元件片段的功能子序列内。
核酸试剂中的5’UTR可包含翻译增强子核苷酸序列。翻译增强子核苷酸序列通常位于核酸试剂中的启动子与靶核苷酸序列之间。翻译增强子序列通常与核糖体结合，有时是18SrRNA-结合核糖核苷酸序列(即，40S核糖体结合序列)，并且有时是内部核糖体进入序列(IRES)。IRES通常形成具有精确安置的RNA三级结构的RNA支架，该结构通过许多特异性分子间相互作用接触40S核糖体亚单位。核糖体增强子序列的实例是已知的，并可由技术人员鉴定(例如，Mignone等,NucleicAcidsResearch33:D141-D146(2005)；Paulous等,NucleicAcidsResearch31:722-733(2003)；Akbergenov等,NucleicAcidsResearch32:239-247(2004)；Mignone等,GenomeBiology3(3):reviews0004.1-0001.10(2002)；Gallie,NucleicAcidsResearch30:3401-3411(2002)；Shaloiko等,http网址www.interscience.wiley.com,DOI:10.1002/bit.20267；以及Gallie等,NucleicAcidsResearch15:3257-3273(1987))。
翻译增强子序列有时是真核序列，例如Kozak共有序列或其他序列(例如，水螅体序列，GenBank登录号U07128)。翻译增强子序列有时是原核序列，例如Shine-Dalgarno共有序列。在某些实施方案中，翻译增强子序列是病毒核苷酸序列。例如，翻译增强子序列有时来自植物病毒，例如烟草花叶病毒(TMV)、苜蓿花叶病毒(AMV)；烟草蚀纹病毒(ETV)；马铃薯病毒Y(PVY)；芜菁花叶(poty)病毒和豌豆种传花叶病毒的5’UTR。在某些实施方案中，来自TMV的约67个碱基长的ω序列作为翻译增强子序列包含在核酸试剂中(例如，缺乏鸟苷核苷酸并包含25个核苷酸长的聚(CAA)中心区)。
3’UTR可包含一个或多个对于其所源自的核苷酸序列为内源性的元件，并且有时包含一个或多个外源性元件。3’UTR可源自任何合适的核酸，例如来自任何合适的生物体(例如，病毒、细菌、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物)的基因组DNA、质粒DNA、RNA或mRNA。技术人员可根据所选的表达系统(例如，在所选生物体中表达)选择对3’UTR合适的元件。3’UTR有时包含技术人员已知的以下元件中的一个或多个：转录调节位点、转录起始位点、转录终止位点、转录因子结合位点、翻译调节位点、翻译终止位点、翻译起始位点、翻译因子结合位点、核糖体结合位点、复制子、增强子元件、沉默子元件和多聚腺苷尾。3’UTR通常包括多聚腺苷尾，并且有时不包括多聚腺苷尾，并且如果存在多聚腺苷尾，则可将一个或多个腺苷部分添加至该尾或从该尾去除(例如，可添加或减去约5个、约10个、约15个、约20个、约25个、约30个、约35个、约40个、约45个或约50个腺苷部分)。
在一些实施方案中，对5’UTR和/或3’UTR的修饰可用于改变(例如，提高、增添、降低或基本消除)启动子的活性。启动子活性的改变进而可通过改变感兴趣的核苷酸序列从包含修饰的5’或3’UTR的可操作地连接的启动子元件开始的转录来改变肽、多肽或蛋白质的活性(例如，酶活性)。例如，在某些实施方案中，微生物可通过遗传修饰进行工程化以表达包含修饰的5’或3’UTR的核酸试剂，该核酸试剂可增添新的活性(例如，在宿主生物体中通常未发现的活性)或通过增加从可操作地连接至感兴趣核苷酸序列(例如，感兴趣的同源或异源核苷酸序列)的同源或异源启动子开始的转录来提高已有活性的表达。在一些实施方案中，微生物可通过遗传修饰进行工程化以表达包含修饰的5’或3’UTR的核酸试剂，该核酸试剂在某些实施方案中可通过降低或基本消除从可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列的同源或异源启动子开始的转录来降低活性的表达。
靶核苷酸序列
核苷酸试剂有时可包含靶核苷酸序列。如本文所用的“靶核苷酸序列”编码感兴趣的核酸、肽、多肽或蛋白质，并且可以是核糖核苷酸序列或脱氧核糖核苷酸序列。靶核酸有时是非翻译的核糖核酸，并且有时是翻译的核糖核酸。非翻译的核糖核酸可包括但不限于：小干扰核糖核酸(siRNA)、短发夹核糖核酸(shRNA)、能够进行RNA干扰(RNAi)的其他核糖核酸、反义核糖核酸或核酶。可翻译的靶核苷酸序列(例如，靶核糖核苷酸序列)有时编码肽、多肽或蛋白质，它们在本文中有时被称为“靶肽”、“靶多肽”或“靶蛋白质”。
任何肽、多肽或蛋白质，或者由一种或多种肽、多肽或蛋白质催化的活性，可由靶核苷酸序列编码，并可由使用者选择。代表性的蛋白质包括酶(例如，乙酰辅酶A羧化酶、酰基辅酶A氧化酶、硫酯酶、单加氧酶、单加氧酶还原酶、脂肪醇氧化酶、酰基转移酶等)、抗体、血清蛋白质(例如，白蛋白)、膜结合蛋白、激素(例如，生长激素、促红细胞生成素、胰岛素等)、细胞因子等，并包括天然产生的和外源表达的多肽。代表性的活性(例如，在功能上相关以提供活性的酶或酶的组合)包括，例如，硫酯酶活性、单加氧酶活性、单加氧酶还原酶活性、酰基转移酶活性、ω羟基脂肪酸脱氢酶活性、β-氧化活性、ω-氧化活性等。如本文所用的术语“酶”指可用作催化剂以诱导其他化合物的化学变化，从而从一种或多种底物产生一种或多种产物的蛋白质。
本文列出了可用于本文所述实施方案的具体的多肽(例如，酶)。如本文所用的术语“蛋白质”指具有通过肽键连接的氨基酸序列的分子。该术语包括融合蛋白、寡肽、肽、环肽、多肽和多肽衍生物(无论天然的还是重组的)，并且还包括它们的片段、衍生物、同源物和变体。蛋白质或多肽有时是胞内来源的(例如，位于体内宿主细胞的核、细胞溶质或间质空间中)，并且有时是体内细胞膜蛋白。在一些实施方案(上文描述，并且在下文的工程化和改变方法中进一步详细描述)中，遗传修饰可导致对目标活性的修饰(例如，提高、基本提高、降低或基本降低)。
可翻译的核苷酸序列通常位于起始密码子(核糖核酸中的AUG和脱氧核糖核酸中的ATG)与终止密码子(例如，核糖核酸中的UAA(赭石)、UAG(琥珀)或UGA(乳白)和脱氧核糖核酸中的TAA、TAG或TGA)之间，并且有时在本文中被称为“开放阅读框”(ORF)。有时，可翻译的核苷酸序列(例如，ORF)在一种生物体中的编码(例如，大多数生物体将CTG编码为亮氨酸)与另一种生物体中的编码(例如，热带假丝酵母将CTG编码为丝氨酸)不同。在一些实施方案中，改变可翻译的核苷酸序列以纠正核苷酸供体生物体与核苷酸受体生物体(例如，工程生物体)之间的选择遗传密码(例如，密码子使用)差异。在某些实施方案中，改变可翻译的核苷酸序列以改善：(i)密码子使用，(ii)转录效率，(iii)翻译效率，(iv)等等，以及它们的组合。
核酸试剂和工具
核酸试剂有时包含一个或多个ORF。ORF可来自任何合适的来源，有时来自基因组DNA、mRNA、逆转录的RNA或互补DNA(cDNA)或包含以上一种或多种的核酸文库，并且来自含有感兴趣的核酸序列、感兴趣的蛋白质或感兴趣的活性的任何生物物种。可从中获得ORF的生物体的非限制性实例包括，例如，细菌、酵母、真菌、人、昆虫、线虫、牛、马、犬、猫、大鼠或小鼠。
核酸试剂有时包含与ORF相邻的、与该ORF一起被翻译并编码氨基酸标签的核苷酸序列。编码标签的核苷酸序列位于核酸试剂的ORF的3’和/或5’，从而编码在由该ORF编码的蛋白质或肽的C-末端或N-末端的标签。可使用不消除体外转录和/或翻译的任何标签，并且该标签可由技术人员恰当地选择。标签可有利于从培养物或发酵培养基中分离和/或纯化所需ORF产物。
标签有时例如与固相的分子或部分或可检测标记特异性结合，从而具有分离、纯化和/或检测由ORF编码的蛋白质或肽的效用。在一些实施方案中，标签包含以下元件中的一个或多个：FLAG(例如，DYKDDDDKG)、V5(例如，GKPIPNPLLGLDST)、c-MYC(例如，EQKLISEEDL)、HSV(例如，QPELAPEDPED)、流感血凝素、HA(例如，YPYDVPDYA)、VSV-G(例如，YTDIEMNRLGK)、细菌谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、链霉亲和素-或亲和素-结合标签(例如，pcDNATM6BioEaseTM BiotinylationSystem(Invitrogen))、硫氧还蛋白、β-半乳糖苷酶、VSV-糖蛋白、荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白或其多种颜色变体(例如，黄色、红色、蓝色)之一)、聚赖氨酸或聚精氨酸序列、聚组氨酸序列(例如，His6)或与金属(例如，钴、锌、铜)螯合的其他序列和/或与含砷分子结合的富含半胱氨酸的序列。在某些实施方案中，富含半胱氨酸的标签包含氨基酸序列CC-Xn-CC，其中X是任何氨基酸，并且n是1到3，并且富含半胱氨酸的序列有时是CCPGCC。在某些实施方案中，标签包含富含半胱氨酸的元件和聚组氨酸元件(例如，CCPGCC和His6)。
标签通常与结合配偶体适当地结合。例如，一些标签与抗体(例如，FLAG)结合，并且有时与小分子特异性结合。例如，聚组氨酸标签与二价金属如铜、锌和钴特异性螯合；聚赖氨酸或聚精氨酸标签与锌指特异性结合；谷胱甘肽S-转移酶标签与谷胱甘肽结合；富含半胱氨酸的标签与含砷分子特异性结合。含砷分子包括LUMIOTM剂(Invitrogen，California)，例如FlAsHTM(EDT2[4′,5′-二(1,3,2-二硫杂砷戊环-2-基)荧光素-(1,2-乙二硫醇)2])，以及ReAsH试剂(例如，授予Tsien等的名称为“TargetSequencesforSyntheticMolecules”的美国专利5,932,474；授予Tsien等的名称为“MethodsofUsingSyntheticMoleculesandTargetSequences”的美国专利6,054,271；美国专利6,451,569和6,008,378；公布的美国专利申请2003/0083373以及公布的PCT专利申请WO99/21013(均属于Tsien等，并且名称均为“SyntheticMoleculesthatSpecificallyReactwithTargetSequences”)。此类抗体和小分子有时连接至固相以方便地分离靶蛋白质或靶肽。
标签有时包含将翻译的蛋白质或肽定位于系统中的组件的序列，该序列在本文中被称为“信号序列”或“定位信号序列”。信号序列通常掺在靶蛋白质或靶肽的N-末端，并且有时掺在C-末端。技术人员已知的信号序列的实例易于掺入核酸试剂中，并且通常根据在其中进行核酸试剂表达的生物体来选择。一些实施方案中的信号序列将翻译的蛋白质或肽定位于细胞膜。信号序列的实例包括但不限于：核靶向信号(例如，类固醇受体序列和SV40病毒大T抗原的N-末端序列)；线粒体靶向信号(例如，形成两亲性螺旋的氨基酸序列)；过氧化物酶体靶向信号(例如，来自酿酒酵母的YFG中的C-末端序列)；以及分泌信号(例如，来自酿酒酵母中的转化酶、配对因子α、PHO5和SUC2的N-末端序列；枯草芽胞杆菌蛋白的多个N-末端序列(例如，Tjalsma等,Microbiol.Molec.Biol.Rev.64:515-547(2000))；α淀粉酶信号序列(例如，美国专利号6,288,302)；果胶酸裂合酶信号序列(例如，美国专利号5,846,818)；前胶原信号序列(例如，美国专利号5,712,114)；OmpA信号序列(例如，美国专利号5,470,719)；lamβ信号序列(例如，美国专利号5,389,529)；短芽胞杆菌(B.brevis)信号序列(例如，美国专利号5,232,841)；以及巴斯德毕赤酵母信号序列(例如，美国专利号5,268,273))。
标签有时直接与由ORF编码的氨基酸序列相邻(即，不存在间插序列)，并且标签有时与ORF编码的氨基酸序列基本相邻(例如，存在间插序列)。间插序列有时包含蛋白酶的识别位点，该识别位点用于从靶蛋白质或肽上切割标签。在一些实施方案中，例如，间插序列由因子Xa(如识别位点I(E/D)GR)、凝血酶(例如，识别位点LVPRGS)、肠激酶(例如，识别位点DDDDK)、TEV蛋白酶(例如，识别位点ENLYFQG)或PreScissionTM蛋白酶(例如，识别位点LEVLFQGP)切割。
间插序列在本文中有时被称为“接头序列”，并且可具有由技术人员选择的任何合适的长度。接头序列有时为约1到约20个氨基酸的长度，并且有时为约5到约10个氨基酸的长度。技术人员可选择接头长度，以基本上保留靶蛋白质或肽的功能(例如，除非由接头隔开，否则标签可降低靶蛋白质或肽的功能)，在存在蛋白酶切割位点时增强标签从靶蛋白质或肽上的解离(例如，接头存在时可增强切割)，并增强标签/靶蛋白质产物与固相的相互作用。接头可具有任何合适的氨基酸含量，并且通常包含较高比例的具有较短侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。
核酸试剂有时在标签元件与插入元件或ORF之间包含终止密码子，该终止密码子可用于翻译含有或不含标签的ORF。识别终止密码子(上述的)的突变tRNA分子抑制翻译终止，并由此称为“抑制型tRNA”。抑制型tRNA可导致插入氨基酸以及跨过终止密码子继续翻译(例如，2004年7月14日提交的名称为″ProductionofFusionProteinsbyCell-FreeProteinSynthesis″的美国专利申请号60/587,583；Eggertsson等,(1988)MicrobiologicalReview52(3):354-374，以及在“EscherichiacoliandSalmonellaCellularandMolecularBiology”,第60章,第909-921页,Neidhardt等,编著.,ASMPress,Washington,DC)中的Engleerg-Kukla等(1996))。许多抑制型tRNA是已知的，包括但不限于：supE、supP、supD、supF和supZ阻抑物，其抑制琥珀终止密码子的翻译终止；supB、glT、supL、supN、supC和supM阻抑物，其抑制赭石终止密码子的功能；以及glyT、trpT和Su-9阻抑物，其抑制乳白终止密码子的功能。通常抑制型tRNA在tRNA的反密码子环中含有一个或多个突变，这允许该tRNA与通常用作终止密码子的密码子进行碱基配对。突变tRNA负载有其关连氨基酸残基，并且在遇到终止密码子时，该关连氨基酸残基插入至正在翻译的多肽中。已经鉴定了提高终止阻抑物的效率(即，提高终止密码子连读(read-through))的突变。这些包括但不限于：uar基因(也称为prfA基因)中的突变，ups基因中的突变，sueA、sueB和sueC基因中的突变，rpsD(ramA)和rpsE(spcA)基因中的突变以及rplL基因中的突变。
因此，在ORF与标签之间包含终止密码子的核酸试剂在翻译系统中不存在抑制型tRNA时可产生翻译的单独的ORF，而在系统中存在抑制型tRNA时可产生翻译的ORF-标签融合体。抑制型tRNA可在用编码tRNA的核酸转染的细胞(例如，可将含有人tRNA-Ser抑制基因的复制缺陷型腺病毒转染入细胞，或可将含有酵母或细菌tRNA抑制基因的YAC转染入酵母细胞)中产生。技术人员可获得用于合成抑制型tRNA和用于翻译含有或不含标签的ORF的载体(例如，Tag-On-DemandTM试剂盒(InvitrogenCorporation,California)；在http网址www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/tagondemand_supernatant_man.pdf的Tag-On-DemandTMSuppressorSupernatantInstructionManual,B版,2003年6月6日；在http网址www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/tagondemand_vectors_man.pdf的Tag-On-DemandTM VectorInstructionManual,B版,2003年6月20日；以及Capone等,Amber,ochreandopalsuppressortRNAgenesderivedfromahumanserinetRNAgene.EMBOJ.4:213,1985)。
可采用本领域已知的任何方便的克隆策略将元件如ORF掺入核酸试剂中。可采用已知的方法独立于插入元件将元件插入模板，例如(1)在一个或多个已有的限制性酶切位点处切割模板并连接感兴趣的元件以及(2)通过杂交包含一个或多个合适的限制性酶切位点的寡核苷酸引物将限制性酶切位点加入模板并通过聚合酶链反应进行扩增(本文中更详细描述的)。其他克隆策略利用存在的或插入核酸试剂的一个或多个插入位点，例如用于PCR的寡核苷酸引物杂交位点和本文所述的其他位点。在一些实施方案中，可将克隆策略与遗传操作如重组组合(例如，将核酸试剂与感兴趣的核酸序列重组到待修饰生物体的基因组中，如本文进一步描述的)。在一些实施方案中，通过用一个或多个感兴趣的ORF工程化微生物(该微生物包含选自ω羟基脂肪酸脱氢酶活性、酰基辅酶A氧化酶活性、酰基转移酶活性、硫酯酶活性、单加氧酶活性和单加氧酶还原酶活性的一种或多种改变的活性)，克隆的ORF可产生(直接或间接)脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)。
在一些实施方案中，核酸试剂包含一个或多个重组酶插入位点。重组酶插入位点是核酸分子上通过重组蛋白参与整合/重组反应的识别序列。例如，Cre重组酶的重组位点是loxP，其为由侧翼为8个碱基对核心序列的两个13个碱基对反向重复序列(充当重组酶结合位点)组成的34个碱基对序列(例如，Sauer,B.,Curr.Opin.Biotech.5:521-527(1994)的图1)。重组位点的其他实例包括attB、attP、attL和attR序列，以及它们的突变体、片段、变体和衍生物，它们被重组蛋白λInt和辅助蛋白整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)识别(例如，美国专利号5,888,732；6,143,557；6,171,861；6,270,969；6,277,608；和6,720,140；2000年3月2日提交的美国专利申请号09/517,466和2003年8月14日提交的美国专利申请号09/732,914，以及美国专利公布号2002-0007051-A1；Landy,Curr.Opin.Biotech.3:699-707(1993))。
克隆核酸的重组酶的实例见于系统(Invitrogen,California)中，其包括用于在体内或体外克隆所需核酸分子的至少一个重组位点。在一些实施方案中，该系统使用含有通常基于噬菌体λ系统的至少两个不同的位点特异性重组位点(例如，att1和att2)并从野生型(att0)位点突变的载体。每个突变的位点对其相同类型的同源配偶体att位点(即，其结合配偶体重组位点)具有独特的特异性(例如，attB1与attP1，或attL1与attR1)，并且不会与其他突变型重组位点或与野生型att0位点交叉反应。不同的位点特异性能定向克隆或连接所需分子，因而能提供所克隆分子的所需取向。利用系统，通过替换受者质粒分子，有时称为目的载体上侧接att位点的选择性标记(例如，ccdB)来克隆和亚克隆侧接重组位点的核酸片段。然后通过转化ccdB敏感性宿主菌株和正选择受者分子上的标记来选择所需克隆。可在其他生物中采用负选择的相似方案(例如，利用毒性基因)，例如哺乳动物和昆虫中的胸苷激酶(TK)。
可用于工程化酵母的重组系统简述如下。该系统利用URA3基因(例如，对于酿酒酵母和白色假丝酵母)或URA4和URA5基因(例如，对于粟酒裂殖酵母)和核苷酸类似物5-氟乳清酸(5-FOA)的毒性。URA3或URA4和URA5基因编码乳清苷-5’-单磷酸(OMP)二羧酸酶。含有活性URA3或URA4和URA5基因的酵母(表型上为Ura+)将5-FOA转化成对酵母细胞有毒的氟脱氧尿苷。如果培养基中还补充有尿嘧啶，则在合适的基因中携带突变或敲除合适的基因的酵母可在5-FOA的存在下生长。
可制备核酸工程化构建体，其可包含URA3基因或盒(对于酿酒酵母)，任一侧的侧翼为相同取向的相同核苷酸序列。URA3盒包含启动子、URA3基因和功能转录终止子。加入将构建体引导至待工程生物体中感兴趣的特定核酸区域的靶序列，使得该靶序列毗邻并邻接URA3盒任一侧上的侧翼序列。可用工程化构建体转化酵母，并接种在不含尿嘧啶的基本培养基上。通过PCR筛选菌落以确定工程化构建体插入基因组中合适位置的那些转化体。在选择ura3盒的重组之前核实插入位置可减少携带至该程序的随后阶段的错误克隆的数目。然后可将正确插入的转化体复制接种在含有5-FOA的基本培养基上，以从构建体中选出URA3盒的重组，从而留下破坏的基因和可用于验证破坏的基因是否存在的可鉴定足迹(例如，核酸序列)。所述的技术可用于破坏或“敲除”基因功能，而且可用于将基因或构建体以靶向、序列特异性方式插入到宿主生物体基因组中。
在某些实施方案中，核酸试剂包含一个或多个拓扑异构酶插入位点。拓扑异构酶插入位点是被位点特异性拓扑异构酶识别和结合的限定的核苷酸序列。例如，核苷酸序列5′-(C/T)CCTT-3′是被大多数痘病毒拓扑异构酶(包括牛痘病毒DNA拓扑异构酶I)特异性结合的拓扑异构酶识别位点。与识别序列结合后，拓扑异构酶在该识别位点的最3’-胸苷处切割该链，产生包含5′-(C/T)CCTT-PO4-TOPO的核苷酸序列，这是通过拓扑异构酶中的酪氨酸与3’磷酸共价结合的拓扑异构酶的复合物(例如，Shuman,J.Biol.Chem.266:11372-11379,1991；Sekiguchi和Shuman,Nucl.AcidsRes.22:5360-5365,1994；美国专利号5,766,891；PCT/US95/16099；和PCT/US98/12372)。相比之下，核苷酸序列5′-GCAACTT-3′是IA型大肠杆菌拓扑异构酶III的拓扑异构酶识别位点。待插入的元件通常与拓扑异构酶反应模板组合，从而掺入核酸试剂中(例如，万维网URLinvitrogen.com/downloads/F-13512_Topo_Flyer.pdf；万维网URLinvitrogen.com/content/sfs/brochures/710_021849％20_B_TOPOCloning_bro.pdf；TOPOTA试剂盒和Zero克隆试剂盒产品信息)。
核酸试剂有时含有一个或多个复制起点(ORI)元件。在一些实施方案中，模板包含两个或更多个ORI，其中一个在一种生物体(例如，细菌)中有效起作用，而另一个在另一生物体(例如，真核生物，例如酵母)中有效起作用。在一些实施方案中，ORI可在一个物种(例如，酿酒酵母)中有效起作用，而另一ORI可在不同物种(例如，粟酒裂殖酵母)中有效起作用。核酸试剂有时还包含一个或多个转录调节位点。
核酸试剂可包含一个或多个选择元件(例如，用于选择核酸试剂是否存在，而非用于活化可选择性调节的启动子元件的元件)。通常采用已知的方法使用选择元件，以确定核酸试剂是否包含在细胞中。在一些实施方案中，核酸试剂包含两个或更多个选择元件，其中一个在一种生物体中有效起作用，而另一个在另一生物体中有效起作用。选择元件的实例包括但不限于：(1)编码对其他情况下有毒性的化合物(例如，抗生素)提供抗性的产物的核酸区段；(2)编码在其他情况下在受者细胞中缺失的产物(例如，必需产物、tRNA基因、营养缺陷型标记)的核酸区段；(3)编码抑制基因产物活性的产物的核酸区段；(4)编码易于鉴定的产物(例如，表型标记，如抗生素(如，β-内酰胺酶)、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)和细胞表面蛋白)的核酸区段；(5)结合在其他情况下对细胞存活和/或功能有害的产物的核酸区段；(6)在其他情况下抑制以上1-5项所述的任一核酸区段的活性的核酸区段(例如，反义寡核苷酸)；(7)结合修饰底物的产物(例如，限制性内切核酸酶)的核酸区段；(8)可用于分离或鉴定所需分子的核酸区段(例如，特异性蛋白质结合位点)；(9)编码在其他情况下可能无功能的特定核苷酸序列的核酸区段(例如，用于分子亚群的PCR扩增)；(10)当不存在时直接或间接赋予特定化合物抗性或敏感性的核酸区段；(11)编码在受者细胞中有毒性或将相对无毒的化合物转化成毒性化合物(例如，单纯疱疹病毒胸苷激酶，胞嘧啶脱氨酶)的产物的核酸区段；(12)抑制含有它们的核酸分子的复制、分割或遗传性的核酸区段；和/或(13)编码条件性复制功能，例如在某些宿主或宿主细胞株中或在某些环境条件(例如，温度、营养条件等)下的复制的核酸区段。
核酸试剂是可用于体内转录和/或翻译的任何形式。核酸有时是质粒，例如超螺旋质粒，有时是酵母人工染色体(例如，YAC)，有时是线性核酸(例如，通过PCR或限制性消化产生的线性核酸)，有时是单链，有时是双链。有时通过扩增方法，例如聚合酶链反应(PCR)方法或转录介导的扩增方法(TMA)制备核酸试剂。在TMA中，在等温反应中使用两种酶来产生通过光发射检测的扩增产物(参见，例如Biochemistry1996年6月25日；35(25):8429-38和http地址www.devicelink.com/ivdt/archive/00/11/007.html)。标准PCR方法是已知的(例如，美国专利号4,683,202；4,683,195；4,965,188；和5,656,493)，并且通常循环进行。每个循环包括热变性，其中杂合的核酸解离；冷却，其中引物寡核苷酸杂交；和聚合酶(即，Taq聚合酶)导致的寡核苷酸延伸。PCR循环过程的实例是95℃处理样品5分钟；重复进行45个循环的95℃1分钟，59℃1分10秒，和72℃1分30秒；然后在72℃处理样品5分钟。通常利用可商购的热循环仪进行多个循环。PCR扩增产物有时在较低温度(例如，4℃)下保存一段时间，有时在分析前冷冻(例如，在-20℃)。
在一些实施方案中，分离或纯化本文所述的核酸试剂、蛋白质试剂、蛋白质片段试剂或其他试剂。本文所用的术语“分离”指从其原始环境(例如，天然环境，如果其为天然存在的话，或宿主细胞，如果其为外源表达的话)中取出的材料，因此其被“人工”从其原始环境中改变。本文中关于分子使用的术语“纯化的”不指绝对纯度。“纯化的”是指与其所源自的样品相比，含有较少非感兴趣物质的同一类别的物质种类(例如，核酸或蛋白质种类)的组合物中的物质。例如，如果指核酸或蛋白质，“纯化的”指与其所源自的样品相比，含有较少非感兴趣核酸或蛋白质的核酸种类或蛋白质种类的组合物中的物质。蛋白质或核酸有时是“基本上纯的”，表明以组合物的质量计，该蛋白质或核酸占蛋白质或核酸的至少50％。基本上纯的蛋白质或核酸以组合物的质量计通常是至少75％，有时以组合物的质量计是至少95％。
工程化和改变方法
可利用本文所述的方法和组合物(例如，核酸试剂)产生工程微生物。如上所述，本文所用的术语“工程微生物”指修饰的生物体，其包含与用作修饰起点的微生物(例如，宿主微生物或未修饰的生物体)中存在的活性不同的一种或多种活性。工程微生物通常由遗传修饰引起，该遗传修饰通常由本领域技术人员利用易于获得的技术引入或选择。可用于产生改变的活性的方法的非限制性实例包括引入异源多核苷酸(例如，核酸或基因整合，也称为“敲入”)，除去内源性多核苷酸，改变已有内源性核酸序列的序列(例如，定点诱变)，破坏已有的内源性核酸序列(例如，敲除和转座子或插入元件介导的诱变)，选择改变的活性，其中该选择导致可稳定遗传的天然存在的活性的改变(例如，导致生物体基因组中的核酸序列或可复制并传代到子细胞的外遗传核酸的改变)，基于PCR的诱变，等等。本文所用的术语“诱变”指核酸(例如，核酸试剂，或宿主染色体)的任何修饰，其随后用于在宿主或修饰的生物体中生成产物。诱变的非限制性实例包括缺失、插入、置换、重排、点突变、阻抑基因突变等。诱变方法是本领域已知的，技术人员易于采用。诱变方法的非限制性实例在本文描述，也可参见Maniatis,T.,E.F.Fritsch和J.Sambrook(1982)MolecularCloning:aLaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y。可根据生产商的使用说明书利用Stratagene(SanDiego,CA)“QuickChange”试剂盒实施诱变的另一非限制性实例。
本文所用的术语“遗传修饰”指有助于在工程微生物中产生目标脂肪二羧酸产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)的任何合适的核酸添加、去除或改变。遗传修饰包括但不限于：在宿主生物体的天然核酸的一个或多个位置插入一个或多个核苷酸，在宿主生物体的天然核酸的一个或多个位置删除一个或多个核苷酸，在宿主生物体的天然核酸的一个或多个位置修饰或取代一个或多个核苷酸，将非天然核酸插入宿主生物体中(例如，插入自主复制载体)，和除去宿主生物体中的非天然核酸(例如，除去载体)。
在一些实施方案中，本文所用的术语“异源多核苷酸”指宿主微生物中不存在的核苷酸序列。在某些实施方案中，异源多核苷酸的存在量不同于宿主微生物中的存在量(例如，不同的拷贝数)，这可通过例如将更多拷贝的特定核苷酸序列引入宿主微生物(例如，特定核苷酸序列可以在宿主染色体的自主核酸中，或者可插入染色体)中来实现。在一些实施方案中，异源多核苷酸来自不同生物体，在某些实施方案中，来自同一类型的生物体、但来自外部来源(例如，重组来源)。
在一些实施方案中，采用本文所述方法和核酸试剂工程生物体可产生脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)。在某些实施方案中，产生脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的本文所述的工程微生物可包含选自下组的一种或多种改变的活性：ω氧代脂肪酸脱氢酶活性、ω羟基脂肪酸脱氢酶活性、脂肪酸合酶活性、乙酰辅酶A羧化酶活性、酰基辅酶A氧化酶活性、单加氧酶活性和单加氧酶还原酶活性。在一些实施方案中，本文所述的工程微生物可包含增添或提高以下活性的遗传修饰：ω氧代脂肪酸脱氢酶活性、ω羟基脂肪酸脱氢酶活性、脂肪酸合酶活性、乙酰辅酶A羧化酶活性、酰基辅酶A氧化酶活性、单加氧酶活性和单加氧酶还原酶活性。
在某些实施方案中，本文所述的工程微生物可包含改变的硫酯酶活性。在一些实施方案中，该工程微生物可包含增添或提高硫酯酶活性的遗传改变。在一些实施方案中，该包含增添或提高硫酯酶活性的遗传改变的工程微生物还可包含编码具有硫酯酶活性的多肽的异源多核苷酸。
本文所用的术语“改变的活性”指相对于宿主微生物，在工程微生物中增添或改变的活性(例如，增添、提高、降低、抑制或除去活性)。可通过将遗传修饰引入宿主微生物中产生活性增添、提高、降低、抑制或除去的工程微生物来改变活性。
增添的活性通常是在宿主微生物中检测不到的活性。提高的活性通常是在宿主微生物中可检测到，但在工程微生物中提高的活性。可将活性提高至任何合适的水平以便产生目标脂肪二羧酸产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)，包括但不限于：提高不到2倍(例如，提高约10％到约99％；提高约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，或提高大于约10倍。降低或抑制的活性通常是在宿主微生物中可检测到，但在工程微生物中降低或抑制的活性。活性在一些实施方案中可以降低至不可检测的水平，或在某些实施方案中是可检测的水平。可将活性降低至任何合适的水平以便产生目标脂肪二羧酸产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)，包括但不限于：降低不到2倍(例如，降低约10％到约99％；降低约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍，或降低大于约10倍。
如本文使用的术语“水平”通常是指蛋白质或核酸(例如，RNA(例如，mRNA)或DNA)的水平或量(例如，定量或相对的量)。
改变的活性有时是在宿主生物体中检测不到，但加入到工程生物体中的活性。改变的活性也可以是在宿主生物体中可检测到，但在工程生物体中提高的活性。在一些实施方案中，可通过增加编码具有目标活性的多肽的多核苷酸的拷贝数来增添或提高活性。在一些实施方案中，天然多肽的活性可以通过增加修饰的生物体中编码该多肽的多核苷酸的拷贝数而提高(例如，引入1到大约100个额外拷贝数的该多核苷酸(例如，引入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30个或更多额外拷贝数的该多核苷酸))。在某些实施方案中，可以通过向宿主微生物中插入编码异源多肽的多核苷酸而增添或提高活性，该多肽具有增添的活性或编码修饰的内源多肽。在这样的实施方案中，可以引入1到大约100个拷贝的该多核苷酸(例如，引入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30个拷贝)。“修饰的内源多肽”通常具有与天然多肽对应物的活性不同的活性(例如，不同的催化活性和/或不同的底物特异性)，并且经常是活跃的(例如，活性(例如，底物转变)是可以检测到的)。在某些实施方案中，活性可以通过在宿主微生物中插入异源多核苷酸而增添或提高，该多核苷酸是(i)可操作地连接至编码具有增添的活性的多肽的另一多核苷酸，和(ii)上调该多核苷酸产生。因此，可通过插入或修饰可操作地连接至编码具有目标活性的多肽的另一多核苷酸的调节多核苷酸来增添或提高活性。在某些实施方案中，可通过使宿主微生物经历选择环境并筛选具有可检测水平的目标活性的微生物来增添或提高活性。选择环境的实例包括但不限于：含有宿主生物可加工的底物的培养基和缺乏宿主生物可加工的底物的培养基。
改变的活性有时是在宿主生物中可检测，但在工程生物体中降低、抑制或除去(即，检测不到)的活性。在一些实施方案中，可通过减少编码具有目标活性的多肽的多核苷酸的拷贝数来降低或除去活性。在一些实施方案中，可通过以下方式降低或除去活性：(i)将多核苷酸插入编码具有目标活性的多肽的多核苷酸内(破坏性插入)，和/或(ii)除去编码具有目标活性的多肽的多核苷酸的一部分或全部(分别是缺失或敲除)。在某些实施方案中，可将异源多核苷酸插入宿主微生物中来降低或除去活性，该异源多核苷酸(i)可操作地连接至编码具有目标活性的多肽的另一多核苷酸，和(ii)下调该多核苷酸的产生。因此，可通过插入或修饰可操作地连接至编码具有目标活性的多肽的另一多核苷酸的调节多核苷酸来降低或除去活性。
还可通过以下方式降低或除去活性：(i)抑制编码具有该活性的多肽的多核苷酸或(ii)抑制可操作地连接至编码具有该活性的多肽的另一多核苷酸的多核苷酸。可通过本领域已知的合适技术抑制多核苷酸，例如使该多核苷酸编码的RNA与特异性抑制性RNA(例如，RNAi、siRNA、核酶)接触。还可通过使具有活性的多肽与特异性抑制该活性的分子(例如，酶抑制剂、抗体)接触来降低或除去该活性。在某些实施方案中，可使宿主微生物经历选择环境并筛选目标活性水平降低或除去的微生物来降低或除去活性。
在一些实施方案中，可利用非翻译核糖核酸或cDNA降低特定活性或酶的表达。例如，可通过遗传修饰而对微生物进行工程化，以通过产生与编码感兴趣活性的感兴趣核酸序列部分或基本同源的RNA分子，表达降低活性表达的核酸试剂。在某些实施方案中，该RNA分子可结合感兴趣的核酸序列并抑制该核酸序列执行其天然功能。在一些实施方案中，该RNA可采用感兴趣的核酸序列不再能执行其天然功能的方式(例如，核酶的作用)来改变编码感兴趣活性的感兴趣核酸序列。
在某些实施方案中，有时将核苷酸序列添加至一个或多个核酸试剂元件，或从一个或多个核酸试剂元件中修饰或除去，例如启动子、5’UTR、靶序列或3’UTR元件，从而在此类元件掺入核酸试剂之前或之后增强、可能增强、降低或可能降低转录和/或翻译。在一些实施方案中，可修饰或除去一种或多种以下序列(如果它们存在于5’UTR中的话)：形成稳定的二级结构(例如，四链结构或茎环茎结构(例如，EMBL序列X12949、AF274954、AF139980、AF152961、S95936、U194144、AF116649或形成此类茎环茎结构的基本上相同的序列))的序列；靶核苷酸序列起始密码子上游的翻译起始密码子；靶核苷酸序列翻译起始密码子上游的终止密码子；靶核苷酸序列翻译起始密码子上游的ORF；铁响应元件(IRE)等序列；和5’末端寡聚嘧啶通道(TOP，例如由毗邻帽的5-15个嘧啶组成)。有时将翻译增强子序列和/或内部核糖体进入位点(IRES)插入5’UTR(例如，EMBL核苷酸序列J04513、X87949、M95825、M12783、AF025841、AF013263、AF006822、M17169、M13440、M22427、D14838和M17446及基本上相同的核苷酸序列)。
有时从3’UTR除去，或在3’UTR中修饰无义密码子之后的富含AU的元件(ARE，例如AUUUA重复)和/或剪接点。有时将聚腺苷尾插入3’UTR中(如果不存在的话)，有时除去(如果存在的话)，有时将腺苷部分加入3’UTR中存在的聚腺苷尾或从中除去。因此，一些实施方案涉及一种方法，该方法包括：确定元件中是否存在提高、可能提高、降低或可能降低翻译效率的任何核苷酸序列，并增添、除去或修饰一个或多个此类序列(如果鉴定到的话)。某些实施方案涉及一种方法，该方法包括：确定元件中是否不存在提高或可能提高翻译效率的任何核苷酸序列，并将此类序列掺入核酸试剂中。
在一些实施方案中，可通过修饰ORF的核苷酸序列来改变活性。有时突变或修饰ORF(例如，通过点突变、缺失突变、插入突变、PCR诱变等)来改变、增强或提高、降低、基本降低或消除所编码蛋白质或肽的活性。修饰的ORF所编码的蛋白质或肽有时产量较低或者产生水平检测不到，在其他实施方案中，修饰的ORF编码的产物或蛋白质的产生水平较高(例如，有时修饰密码子，从而它们与宿主生物体或工程生物体中优先使用的tRNA相容)。为测定相对活性，可比较突变ORF(或含有它的细胞)的产物的活性与未修饰的ORF(或含有它的细胞)编码的产物或蛋白质的活性。
在一些实施方案中，有时突变或修饰ORF核苷酸序列以改变用于编码氨基酸的三联核苷酸序列(例如，氨基酸密码子三联体)。有时采用ORF的核苷酸序列的修饰来改变密码子三联体以改变在原始序列中发现的密码子，从而更好地匹配将表达该ORF或核酸试剂的生物体中的优选密码子使用。细菌中的密码子使用，以及由此核酸序列编码的密码子三联体，可能不同于真核生物如酵母菌或植物中的优选密码子使用。细菌物种之间的优选密码子使用也可能不同。在某些实施方案中，有时修饰ORF核苷酸序列以消除在该ORF核苷酸序列编码的mRNA的翻译期间可能导致暂停的密码子对和/或消除mRNA二级结构。在mRNA中存在核酸二级结构时有时发生翻译暂停，并且有时因存在密码子对而发生，该密码子对因导致核糖体暂停而减缓翻译速度。在一些实施方案中，由于将负载的tRNA加载入核糖体翻译机器所需的暂停时间减少，利用丰度较低的密码子三联体可减少翻译暂停。因此，为增加细菌中的转录和翻译效率(例如，转录和翻译同时发生)或为增加真核细胞中的翻译效率(例如，转录和翻译在功能上分开)，可改变感兴趣核苷酸序列的核苷酸序列，从而更好地适应宿主和/或遗传修饰的微生物的转录和/或翻译机器。在某些实施方案中，由于正确折叠的蛋白质增加和包涵体形成减少，利用减缓或暂停核糖体的丰度较低密码子减缓翻译速度可导致所需产物的产率较高。
可根据给定生物体的优选使用，通过确定核苷酸序列供体生物体的密码子分布并比较该密码子分布与受者或宿主生物体中的密码子分布来改变和优化密码子。然后可采用本文所述的技术(例如，定点诱变等)相应地改变密码子。可通过手工，或利用技术人员可商购的核酸分析软件进行密码子使用的比较。
还可采用ORF的核苷酸序列的修饰来校正在不同生物体中趋异的密码子三联序列。例如，某些酵母(例如，热带假丝酵母和麦芽糖假丝酵母)利用氨基酸三联体CUG(例如，DNA序列中的CTG)编码丝氨酸。CUG在大多数生物体中通常编码亮氨酸。为在所得多肽或蛋白质中维持正确的氨基酸，必须改变CUG密码子以反映将要表达核酸试剂的生物体。因此，如果要在上述假丝酵母属酵母菌株中表达细菌供体的ORF，必须首先将异源核苷酸序列改变或修饰成合适的亮氨酸密码子。因此，在一些实施方案中，有时改变或修饰ORF的核苷酸序列以校正不同生物体之间氨基酸密码子三联体进化中产生的差异。在一些实施方案中，如果与原始编码的氨基酸相比，所编码的氨基酸是氨基酸中的保守性或中性改变，则在特定氨基酸密码子处核苷酸序列可维持不变。
在一些实施方案中，可通过修饰翻译调节信号如终止密码子来改变活性。有时将ORF末端的终止密码子修饰成另一终止密码子，例如上述琥珀终止密码子。在一些实施方案中，有时通过插入或突变已有密码子将终止密码子引入ORF。包含修饰的末端终止密码子和/或内部终止密码子的ORF通常在包含识别终止密码子的阻遏tRNA的系统中翻译。包含终止密码子的ORF有时在包含阻遏tRNA的系统中翻译，该阻遏tRNA在目标蛋白质或目标肽的翻译期间掺入非天然氨基酸。将非天然氨基酸掺入目标蛋白质或肽的方法是已知的，包括，例如利用异源tRNA/合成酶对的方法，其中所述tRNA识别琥珀终止密码子并加载非天然氨基酸(例如万维网URLiupac.org/news/prize/2003/wang.pdf)。
根据选择用于改变(例如，通过诱变、引入或缺失)的核酸试剂的部分(例如，启动子、5’或3’UTR、ORI、ORF等)，上述修饰可通过以下方式改变给定的活性：(i)增加或降低反馈抑制机制，(ii)增加或降低启动子启动，(iii)增加或降低翻译启动，(iv)增加或降低翻译效率，(v)修饰本文所述核酸试剂表达的肽或产物的定位，(vi)增加或减少感兴趣核苷酸序列的拷贝数，(vii)表达反义RNA、RNAi、siRNA、核酶等。在一些实施方案中，改变核酸试剂或核苷酸序列可改变参与反馈抑制的区域(例如，5’UTR、启动子等)。有时可进行修饰以增加或提高反馈调节剂的结合，有时可进行修饰以降低、抑制或消除反馈调节剂的结合。
在某些实施方案中，核酸试剂或核苷酸序列的改变可改变参与转录启动的序列(例如，启动子、5’UTR等)。有时可进行修饰以提高或增加内源或异源启动子元件的启动。有时可进行修饰以除去或破坏增加或提高转录启动的序列，从而降低或消除从内源或异源启动子元件开始的转录。
在一些实施方案中，核酸试剂或核苷酸序列的改变可改变参与翻译启动或转录效率的序列(例如，5’UTR、3’UTR、丰度较高或较低的密码子三联体、翻译终止序列等)。例如，有时可进行修饰来增加或降低翻译启动、修饰核糖体结合位点。有时可进行修饰以增加或降低翻译效率。除去或增加形成发夹的序列并将密码子三联体改变成更优选或更不优选的密码子是为改变翻译启动和翻译效率而可进行的遗传修饰的非限制性实例。
在某些实施方案中，核酸试剂或核苷酸序列的改变可改变参与肽、蛋白质或其他所需产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)定位的序列。有时可进行修饰以改变、增加或除去负责将多肽、蛋白质或产物靶向到胞内细胞器、周质、细胞膜或胞外的序列。将异源产物转运到不同的胞内空间或胞外有时可降低或消除包涵体(例如，所需产物的不溶性聚集物)的形成。
在一些实施方案中，核酸试剂或核苷酸序列的改变可改变参与增加或减少感兴趣核苷酸序列拷贝数的序列。有时可进行修饰以增加或减少稳定整合入生物体基因组或外遗传核酸试剂上的ORF拷贝数。可增加感兴趣序列拷贝数的改变的非限制性实例包括通过复制基因组中的各区域来增加感兴趣序列的拷贝(例如，通过重组或导致宿主基因组的基因扩增来增加额外的拷贝)，将额外拷贝的序列克隆到核酸试剂上，或改变ORI以增加外遗传核酸试剂的拷贝数。可减少感兴趣序列拷贝数的改变的非限制性实例包括通过删除或破坏基因组中的各区域来除去感兴趣序列的拷贝，从外遗传核酸试剂除去额外拷贝的序列，或改变ORI以减少外遗传核酸试剂的拷贝数。
在某些实施方案中，还可通过改变、增加或除去参与反义RNA、RNAi、siRNA、核酶等表达的序列来实现增加或降低感兴趣核苷酸序列的表达。可采用上述方法修饰反义RNA、RNAi、siRNA、核酶等的表达。
可利用本文所述的方法和核酸试剂产生遗传修饰的微生物，该遗传修饰的微生物在参与脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)合成的细胞过程中的活性改变。在一些实施方案中，本文描述的工程微生物可包含拷贝数增加的编码具有ω氧代脂肪酸脱氢酶活性的多肽的内源多核苷酸。在某些实施方案中，本文所述的工程微生物可包含拷贝数增加的编码具有ω羟基脂肪酸脱氢酶活性的多肽的异源多核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的工程微生物可包含编码具有ω氧代脂肪酸脱氢酶活性的多肽的异源多核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的工程微生物可包含编码具有ω羟基脂肪酸脱氢酶活性的多肽的异源多核苷酸。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸可来自细菌。在一些实施方案中，该细菌可以是不动杆菌、诺卡式菌、假单胞菌或黄色杆菌。
在一些实施方案中，本文所述的工程微生物可包含编码具有单加氧酶活性的多肽的异源多核苷酸。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸可来自细菌。在一些实施方案中，该细菌可以是芽孢杆菌。在某些实施方案中，该芽孢杆菌是巨大芽孢杆菌。
在某些实施方案中，本文所述的工程微生物可包含降低ω羟基脂肪酸转化的遗传修饰。在一些实施方案中，该遗传修饰可降低ω羟基脂肪酸脱氢酶活性。在某些实施方案中，本文所述的工程微生物可包含降低β-氧化活性的遗传修饰。在一些实施方案中，该遗传修饰可降低本文所述的目标活性。
在某些实施方案中，本文所述的产生脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的工程微生物可包含改变的单加氧酶活性。在一些实施方案中，本文所述的工程微生物可包含改变单加氧酶活性的遗传修饰。在一些实施方案中，本文描述的工程微生物可包含拷贝数增加的编码具有单加氧酶活性的多肽的内源多核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的工程微生物可包含编码具有单加氧酶活性的多肽的异源多核苷酸。在某些实施方案中，所述异源多核苷酸可来自细菌。在一些实施方案中，该细菌可以是芽孢杆菌。在某些实施方案中，该芽孢杆菌是巨大芽孢杆菌。在一些实施方案中，所述遗传修饰可降低聚酮合酶活性。
在某些实施方案中，本文所述的产生脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的工程微生物可包含改变的硫酯酶活性。在一些实施方案中，该工程微生物可包含增添或提高硫酯酶活性的遗传修饰。在某些实施方案中，该工程微生物可包含编码具有硫酯酶活性的多肽的异源多核苷酸。
在一些实施方案中，硫酯酶活性改变的工程微生物可包含改变的ω氧代脂肪酸脱氢酶活性。在某些实施方案中，硫酯酶活性改变的工程微生物可包含增添或提高ω氧代脂肪酸脱氢酶活性的遗传修饰。在一些实施方案中，该工程微生物可包含编码具有改变的ω氧代脂肪酸脱氢酶活性的多肽的异源多核苷酸。在某些实施方案中，该异源多核苷酸可来自细菌。在一些实施方案中，该细菌可以是不动杆菌、诺卡式菌、假单胞菌或黄色杆菌。
在某些实施方案中，本文所述的产生脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的工程微生物可包含改变的ω羟基脂肪酸脱氢酶活性。在某些实施方案中，该工程微生物可包含增添或提高ω羟基脂肪酸脱氢酶活性的遗传修饰。在某些实施方案中，该工程微生物可包含编码具有改变的ω羟基脂肪酸脱氢酶活性的多肽的异源多核苷酸。在一些实施方案中，该异源多核苷酸来自细菌。在某些实施方案中，该细菌可以是不动杆菌、诺卡式菌、假单胞菌或黄色杆菌。在一些实施方案中，该工程微生物可以是真核生物。在某些实施方案中，该真核生物可以是酵母。在一些实施方案中，该真核生物可以是真菌。在某些实施方案中，该酵母可以是假丝酵母属酵母。在一些实施方案中，该假丝酵母属酵母可以是热带假丝酵母。在某些实施方案中，该真菌可以是耶氏酵母属真菌。在一些实施方案中，该耶氏酵母属真菌可以是解脂耶氏酵母。在某些实施方案中，该真菌可以是曲霉属真菌。在一些实施方案中，该曲霉属真菌可以是寄生曲霉或构巢曲霉。在一些实施方案中，如上所述的工程微生物可包含降低ω羟基脂肪酸转化的遗传修饰。在某些实施方案中，该遗传修饰可降低ω羟基脂肪酸脱氢酶活性。在一些实施方案中，该遗传修饰可降低β-氧化活性。在某些实施方案中，该遗传修饰可降低本文所述的目标活性。
如上所述，可通过在宿主基因组中或在稳定维持的外遗传核酸试剂中改变、引入或除去核苷酸序列来制备工程微生物。可采用本文所述或技术人员已知的方法制备用于改变、引入或除去宿主基因组或外遗传核酸中的核苷酸序列的核酸试剂。
可采用已知参考手册中(例如，Maniatis,T.,E.F.Fritsch和J.Sambrook(1982)MolecularCloning:aLaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.)描述的裂解和核酸纯化方法或利用可商购的细胞裂解和DNA纯化试剂和试剂盒，从合适的生物体的细胞中分离具有所需活性的核酸序列。在一些实施方案中，可提供用于工程化微生物的核酸以便在将生物体加工成含有该核酸后实施本文所述的方法。例如，可提取、分离、纯化或扩增样品(例如，感兴趣生物或含有多种感兴趣生物，如酵母或细菌的培养物)的感兴趣核酸。本文所用的术语“分离”指将核酸从其原始环境中(例如，如果其是天然产生的，则是天然环境，如果其是外源性表达的，则是宿主细胞)取出，因此“通过人工”从其原始环境改变。与来源样品中存在的组分的量相比，分离的核酸一般含有较少的非核酸组分(例如，蛋白质、脂质)。包含分离的样品核酸的组合物可以是基本分离的(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含非核酸组分)。本文所用的术语“纯化的”指这样的样品核酸，条件是与获得样品核酸的样品来源相比，其含有更少的核酸种类。包含样品核酸的组合物可以是基本纯的(例如，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％不含其他核酸种类)。本文所用的术语“扩增的”指对细胞、生物体或样品的核酸进行处理，该处理线性地或指数地产生核苷酸序列与样品中核酸的核苷酸序列或其部分序列相同或基本相同的扩增子核酸。如上所述，可对用于制备本文所述核酸试剂的核酸进行片段化或切割。
当处理难以培养的生物体时，有时需要扩增核酸。在需要扩增时，可采用任何适当的扩增技术。扩增多核苷酸的方法的非限制性实例包括聚合酶链反应(PCR)；连接扩增(或连接酶链反应(LCR))；基于使用Q-β复制酶或模板依赖性聚合酶的扩增方法(参见美国专利公布号US20050287592)；解旋酶依赖性等温扩增(Vincent等,"Helicase-dependentisothermalDNAamplification".EMBOreports5(8):795–800(2004))；链置换扩增(SDA)；基于嗜热SDA核酸序列的扩增(3SR或NASBA)以及转录相关扩增(TAA)。PCR扩增方法的非限制性实例包括标准PCR、AFLP-PCR、等位基因特异性PCR、Alu-PCR、不对称PCR、菌落PCR、热启动PCR、反向PCR(IPCR)、原位PCR(ISH)、序列间特异性PCR(ISSR-PCR)、长PCR、多重化PCR、巢式PCR、定量PCR、逆转录酶PCR(RT-PCR)、实时PCR、单细胞PCR、固相PCR、它们的组合等。进行PCR的试剂和硬件可商购获得。
技术人员易于获得实施上述各种类型PCR的方案。PCR条件可取决于引物序列、靶标的丰度、所需扩增量，因此本领域技术人员可从多种可用PCR方案中选择(参见例如，美国专利第4,683,195和4,683,202号；和PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,Innis等编,1990)。PCR通常用热稳定的酶自动进行。在该过程中，反应混合物的温度在变性区、引物退火区与延伸反应区自动循环。特别适于该目的机器可商购获得。适于本文所述实施方案的PCR方案的非限制性实例为，样品在95℃处理5分钟；重复45轮的95℃1分钟，59℃1分10秒，和72℃1分30秒；然后样品在72℃处理5分钟。实施例部分描述了其他PCR方案。通常利用可商购的热循环仪进行多轮循环。在某些实施方案中，也可应用本领域普通技术人员已知和选择的合适的等温扩增方法。在一些实施方案中，可利用依据本文所述序列设计的寡核苷酸或引物，从具有所需活性的生物体扩增所需序列来分离编码具有所需活性的多肽的核酸。
可将扩增、分离和/或纯化的核酸克隆入本文附图所述的重组DNA载体或克隆入合适的可商购的重组DNA载体。将感兴趣的核酸序列克隆入重组DNA载体有助于核酸的进一步操作以便制备核酸试剂(例如，通过诱变、同源重组、扩增等改变核苷酸序列)。标准克隆过程(例如，酶消化、连接等)是已知的(例如，在Maniatis,T.,E.F.Fritsch和J.Sambrook(1982)MolecularCloning:aLaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.中所述的)。
在一些实施方案中，无需任何进一步的修饰即可利用通过分离或扩增制备的核酸序列而将某种活性加入微生物，从而产生遗传修饰的或工程微生物。在某些实施方案中，可遗传修饰通过分离或扩增制备的核酸序列来改变(例如，提高或降低)所需活性。在一些实施方案中，有时遗传修饰用于将某种活性加入生物体的核酸以优化编码所需活性(例如，多肽或蛋白质)的异源多核苷酸序列。本文所用的术语“优化”可指通过优选的密码子使用进行改变以提高或增强表达。术语优化还可指修饰氨基酸序列以提高多肽或蛋白质的活性，从而与该多肽或蛋白质的“天然”形式相比，该活性表现出更高的催化活性。
可采用本领域已知的方法遗传修饰感兴趣的核酸序列。诱变技术特别适用于小规模(例如，1、2、5、10个或更多个核苷酸)或大规模(例如，50、100、150、200、500个或更多个核苷酸)遗传修饰。诱变使得技术人员能通过天然(例如，采用选择和筛选作分离)或利用化学物质、辐射或不精确的DNA复制(例如，PCR诱变)通过实验而稳定地改变生物体的遗传信息。在一些实施方案中，可利用天然核苷酸序列作为参考序列，修饰能导致活性发生所需改变的核苷酸，从而通过核酸的全规模合成进行遗传修饰。诱变方法有时是特异性的或靶向特定区域或核苷酸(例如，定点诱变、基于PCR的定点诱变和体外诱变技术，如移位(transplacement)和体内寡核苷酸定点诱变)。就遗传修饰的位置而言，诱变方法有时是非特异性或随机的(例如，化学诱变、插入元件(例如，插入或转座子元件)和不精确的基于PCR的方法)。
定点诱变是DNA分子中一个或多个特定核苷酸突变或改变的过程。通常利用克隆入环状质粒载体的感兴趣核酸序列进行定点诱变。定点诱变要求野生型序列是已知的并可用作遗传改变的平台。有时将定点诱变称为寡核苷酸指导的诱变，因为可利用在感兴趣核苷酸序列的互补序列中掺入所需遗传修饰的寡核苷酸实施该技术。野生型序列和改变的核苷酸(序列)能杂交，并利用DNA聚合酶延伸和复制杂交的核酸。将双链核酸引入宿主(例如，大肠杆菌)，在体内再进行数轮复制。然后选择和/或筛选携带突变核酸序列的转化细胞中携带正确诱变序列的那些细胞。盒式诱变和基于PCR的定点诱变是定点诱变技术的进一步改进。还可在体内进行定点诱变(例如，移位“移入移出(pop-inpop-out)”，利用合成寡核苷酸的体内定点诱变等)。
可利用含有一个或多个所需突变的寡核苷酸引物，采用PCR进行基于PCR的诱变。该技术以类似于标准定点诱变的方式起作用，除了利用热循环仪和PCR条件替代在微生物宿主中复制和选择克隆。由于基于PCR的诱变还利用环状质粒载体，可在足够轮次的热循环仪扩增后，采用标准电泳方法从含有模板序列的质粒中分离掺入遗传修饰的扩增片段(例如，线性核酸分子)。该方法的改进形式利用线性扩增方法和扩增整个质粒的一对诱变引物。该方法利用大肠杆菌Dam甲基化酶体系，该体系导致体内复制的DNA对限制性内切核酸酶DpnI敏感。PCR合成的DNA未甲基化，因此耐受DpnI。该方法能消化模板质粒，留下待分离和转化入用于DNA修复和复制的宿主细菌的遗传修饰的、PCR合成的质粒，从而有助于随后的克隆和鉴定步骤。可利用部分简并引物在基于PCR的定点诱变中加入一定的随机性。
重组有时可用作诱变的工具。同源重组使得技术人员能利用宿主生物天然DNA复制和修复酶特异性靶向已知序列中用于插入异源核苷酸序列的区域。同源重组方法有时称为“移入移出”诱变、移转、敲除诱变或敲入诱变。将核酸序列整合入宿主基因组是插入整个核酸试剂的单一交换事件(例如，移入)。第二交换事件几乎切除全部核酸试剂，只留下一部分，从而留下异源序列，通常称为“足迹”(例如，移出)。通过插入(例如，敲入)或通过双重重组留下破坏性异源核酸(例如，敲除)的诱变均用于破坏或“敲除”发生插入的基因或核酸序列的功能。通过组合选择性标记和/或营养缺陷型标记与设计成提供适当核酸靶序列的核酸试剂，技术人员能将可选择的核酸试剂靶向特定区域，然后选择“移出”所插入(例如，“移入”)核酸试剂一部分的重组事件。
此类方法利用专门设计的核酸试剂，该核酸试剂在感兴趣的核酸或基因组区域处或其附近具有已知的目标核酸序列。移出通常留下重组事件后保留的残留序列(leftoversequence)的“足迹”。残留序列可破坏基因，从而降低或敲除该基因的表达。在一些实施方案中，该方法可用于在基因的上游或下游插入序列，而这些序列能导致该基因表达提高或降低。在某些实施方案中，可采用类似的重组或“移入”方法将新基因引入宿主生物的基因组。利用ura3基因和5-FOA的酵母重组系统的实例在上文简单描述，并且本文提供了进一步的细节。
修饰方法描述于Alani等，“AmethodforgenedisruptionthatallowsrepeateduseofURA3selectionintheconstructionofmultiplydisruptedyeaststrains”,Genetics116(4):541-545,1987年8月。原始方法利用Ura3盒，其中相同核苷酸序列的1000个碱基对(bp)以相同取向克隆入URA3盒的任一侧。将约50bp的靶向序列加入构建体的各侧。双链靶向序列与宿主生物基因组中的序列互补。靶向序列能在感兴趣的区域中进行位点特异性重组。该原始技术的改进型用两个200bp同向重复替代两个1000bp序列同向重复。该改进方法还利用50bp靶向序列。该改进减少或消除了第一诱变中留下的1000bp重复中的第二敲除的重组，因此允许扩增敲除的酵母。此外，本文所用的200bp序列是留下可鉴定足迹的独特设计的自装配序列。用于设计序列的技术引入设计特征，例如与酵母菌基因组的低同一性和彼此之间的低同一性。因此，可产生自装配序列文库，从而允许在同一生物体中进行多重敲除，同时降低或消除以前敲除中可能的整合。
如上所述，URA3盒利用5-FOA在携带功能性URA3基因的酵母中的毒性。采用标准酵母转化方案，用修饰的URA3盒转化尿嘧啶合成缺陷型酵母，并将转化的细胞接种到不含尿嘧啶的基本培养基上。在一些实施方案中，可采用PCR验证是否正确插入宿主基因组的感兴趣区域，在某些实施方案中，可省去PCR步骤。包含PCR步骤可减少需要进行逆选择以“移出”URA3盒的转化体的数目。然后可用含有5-FOA的培养基对转化体(例如，所有的或通过PCR确定是正确的那些)进行逆选择，这将选择不含(例如，移出)URA3盒的重组，因而再次赋予酵母菌ura3缺陷型和对5-FOA毒性的抗性。本文提供了用于在特定区域引导重组事件的靶向序列。可采用上述方法的改进形式将基因整合入染色体，其中在重组后，功能基因留在染色体中靠近200bp足迹。
在一些实施方案中，可利用其他营养缺陷型或显性选择标记替代URA3(例如，营养缺陷型选择性标记)，而选择培养基和选择试剂有适当改变。营养缺陷型选择性标记用于合成所需生物分子(例如，氨基酸或核苷)有缺陷的菌株。其他营养缺陷型标记的非限制性实例包括：HIS3、TRP1、LEU2、LEU2-d和LYS2。某些营养缺陷型标记(例如，URA3和LYS2)允许进行逆选择以选出只留下重组构建体的一个同向重复的第二重组事件。HIS3编码参与组氨酸合成的活性。TRP1编码参与色氨酸合成的活性。LEU2编码参与亮氨酸合成的活性。LEU2-d是LEU2的低表达形式，其选择增加的拷贝数(例如，基因或质粒拷贝数)，以允许在不含亮氨酸的基本培养基上存活。LYS2编码参与赖氨酸合成的活性，并允许利用α-氨基己二酸酯逆选择不含LYS2基因的重组。
显性选择性标记是有用的，因为它们也允许将工业和/或原养型菌株用于遗传操作。此外，显性选择性标记提供的优势在于丰富培养基可用于接种和培养物生长，因而能显著提高生长速度。显性选择性标记的非限制性实例包括Tn903kanr、Cmr、Hygr、CUP1和DHFR。Tn903kanr编码参与卡那霉素抗生素抗性的活性(例如，通常是新霉素磷酸转移酶II或NPTII)。Cmr编码参与氯霉素抗性的活性(例如，通常是氯霉素乙酰基转移酶或CAT)。Hygr编码通过磷酸化潮霉素B而参与潮霉素抗性的活性(例如，潮霉素磷酸转移酶或HPT)。CUP1编码参与重金属(例如，铜)毒性的抗性的活性。DHFR编码赋予氨甲蝶呤和磺胺化合物抗性的二氢叶酸还原酶活性。
与定点或特异性诱变相反，随机诱变无需任何序列信息，并可通过多种不同方法实施。随机诱变通常用于生成可用于筛选所需基因型或表型的突变体文库。随机诱变的非限制性实例包括：化学诱变、UV-诱导的诱变、插入元件或转座子-介导的诱变、DNA改组、易错PCR诱变等等。
化学诱变通常涉及化学物质，例如甲磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸、丝裂霉素C、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、二环氧基丁烷(DEB)、1,2,7,8-二环氧基辛烷(DEO)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、4-硝基喹啉1-氧化物(4-NQO)、2-甲氧基-6-氯-9(3-[乙基-2-氯乙基]-氨基丙基氨基)-吖啶二盐酸盐(ICR-170)、2-氨基嘌呤(2AP)和羟胺(HA)，在本文作为非限制性实例提供。这些化学物质能导致碱基对置换、移码突变、缺失、颠换突变、转位突变、不正确的复制等。在一些实施方案中，可在体内进行诱变。诱变过程有时涉及利用宿主生物体DNA复制和修复机制来引入和复制一个或多个诱变的碱基。
另一类化学诱变涉及碱基类似物的使用。碱基类似物的使用导致不正确的碱基配对，与起始序列相比，其在随后轮次的复制中校正为错配的核苷酸。碱基类似物诱变为随机诱变引入少许非随机性，因为可选择能掺入起始序列中某些核苷酸处的特定碱基类似物。校正错配通常产生已知的置换。例如，溴-脱氧尿苷(BrdU)可掺入DNA中，并取代序列中的T。宿主DNA修复和复制机器有时可校正该缺陷，但有时用G错配BrdU。随后轮次的复制导致天然序列中的原始A-T转换为G-C。
当紫外线照射两个毗邻胸苷残基之间的化学键时，胸苷二聚体的形成导致紫外线(UV)诱导的诱变。宿主生物体的切除修复机制校正DNA中的该损伤，但有时该损伤被错误修复，通常导致C转为T。
插入元件或转座子介导的诱变利用天然存在的可移动遗传元件或修饰天然存在的可移动遗传元件。除了转座所需的活性(例如，利用转座酶活性移动)，转座子通常编码辅助活性。在许多实例中，转座子辅助活性是抗生素抗性标记(例如，参见上述的Tn903kanr)。插入元件通常仅编码移动核酸序列所需的活性。插入元件和转座子介导的诱变通常可随机发生，然而已知一些转座子的具体靶序列。可移动遗传元件，例如IS元件或转座子(Tn)，通常具有在转座基因的编码区侧翼的反向重复、同向重复或同时具有反向和同向重复。转座酶催化的重组事件导致元件将自身从基因组中除去并移动至新的位置，从而留下一部分反向或同向重复。转座子的经典实例是在玉米中发现的“可移动遗传元件”。转座子诱变试剂盒可商购获得，其设计成留下5密码子插入物(例如，MutationGenerationSystem试剂盒，Finnzymes，万维网URLfinnzymes.us)。这使得技术人员能鉴定插入位点，而无需完全破坏大多数基因的功能。
DNA改组是一种利用来自突变体文库成员的DNA片段并将这些片段随机重新改组以产生新的突变序列组合的方法。通常利用DNaseI，然后通过随机退火和采用自引发PCR的再连接来产生片段。随机片段退火产生的DNA突出端为PCR过程提供“引物”序列。改组可应用于通过任何上述诱变方法产生的文库。
易错PCR及其衍生方法——滚环易错PCR利用增加的镁和锰浓度以及限制量的一个或两个核苷酸来降低Taq聚合酶的保真度。在比较得到的突变型序列与野生型起始序列时，适当条件下的错误率可以高达2％。扩增后，必须将突变体编码序列文库克隆入合适的质粒。虽然点突变是易错PCR中最常见的突变类型，但缺失和移码突变也是可能的。有许多易错PCR试剂盒是可商购的，包括来自Stratagene和Clontech(例如，分别为万维网URLstrategene.com和万维网URLclontech.com)的那些。滚环易错PCR是易错PCR的改变形式，其中首先将野生型序列克隆入质粒，然后在易错条件下扩增完整的质粒。
如上所述，还可采用遗传选择和筛选用选择性培养基刺激的生物体或从独特环境中鉴定天然存在的变体来分离活性改变的生物体。例如，2-脱氧-D-葡萄糖是毒性葡萄糖类似物。用该物质培养酵母产生葡萄糖不受控的突变体。利用2-脱氧-D-葡萄糖分离了许多突变体，包括转运突变体和能同时用葡萄糖及半乳糖发酵的突变体，而不是先用葡萄糖，在葡萄糖耗尽后再用半乳糖。类似的技术已用于在实验室条件或从独特的环境中分离能代谢塑料(例如，来自垃圾场的)、石油化学品(例如，来自油轮漏油)等的突变微生物。
在一些实施方案中，当在所选生物体中以较低的或几乎检测不到的水平存在活性时，可采用类似方法分离所需活性中的天然存在的突变。该方法通常包括在液体培养基中培养生物体至特定密度，浓缩细胞，将细胞接种在对其的代谢活性需要提高的各种浓度的物质上。将细胞在中等生长温度下孵育5-10天。为增强选择过程，将平板在低温下再保存5-10天。有时低温可允许已获得活性或提高活性的菌株继续生长，而其他菌株在该低温下的生长受到抑制。在最初选择和在低温下二次生长后，可将平板复制接种在较高或较低浓度的选择物质上以便进一步选择所需活性。
可将天然、异源或诱变的多核苷酸引入核酸试剂以便引入宿主生物体中，从而产生工程微生物。技术人员可采用标准重组DNA技术(限制酶消化、连接等)将诱变的感兴趣核酸组合为合适的核酸试剂，该核酸试剂能(i)通过宿主生物体中选择而稳定地维持，或(ii)整合入宿主生物体的基因组中。如上所述，核酸试剂有时包含两个复制起点，从而允许在终产物最终引入宿主生物体(例如，酵母或真菌)之前在细菌中操作同一核酸试剂。标准分子生物学和重组DNA方法是已知的(例如，在Maniatis,T.,E.F.Fritsch和J.Sambrook(1982)MolecularCloning:aLaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.中描述的)。
可采用各种技术将核酸试剂引入微生物中。用于将异源核酸引入各种生物体中的方法的非限制性实例包括转化、转染、转导、电穿孔、超声介导的转化、粒子轰击等。在一些实例中，加入载体分子(例如，双苯并咪唑基化合物，参见美国专利5595899)能增加一般认为难以通过常规方法转化的细胞中DNA的摄取。常规的转化方法是已知的(例如，Maniatis，T.，E.F.Fritsch和J.Sambrook(1982)MolecularCloning:aLaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.中描述的)。
修饰的活性
在遗传修饰的生物体中的某些活性可以通过本领域中己知的技术进行修饰。在某些实施方案中，酰基辅酶A氧化酶活性或酰基辅酶A脱氢酶活性，或酰基辅酶A氧化酶活性和酰基辅酶A脱氢酶活性，可以在生物体中进行修饰。在一些实施方案中，可以将修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽、修饰的异源酰基辅酶A氧化酶多肽和/或修饰的异源酰基辅酶A脱氢酶多肽引入至生物体中。修饰的多肽可以由包括编码该修饰多肽的修饰多核苷酸的宿主生物体表达。修饰的多肽通常具有不同于未修饰的对应物的活性。修饰的活性有时是不同的催化活性或不同的底物特异性，或者不同的催化活性和不同的底物特异性。不同的活性有时是种比未修饰的对应多肽的活性更高或更低的活性。在一些实施方案中，对于特定底物，修饰的多肽的催化活性高于或低于未修饰的对应物的催化活性。在某些实施方案中，对于特定底物，修饰的多肽的底物特异性高于或低于未修饰的对应物的底物特异性。修饰的多肽通常是有活性的且修饰的多肽的活性通常可以被检测(例如，可以检测底物周转)。对特定多肽的所需活性有时被称为“目标活性”。
在一些实施方案中，在遗传修饰的生物体中的遗传修饰改变生物体中产生的酰基辅酶A氧化酶多肽的底物特异性。有时对于具有特定链长的底物，底物特异性降低。在一些实施方案中，对于C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20底物或其组合，修饰的酰基辅酶A氧化酶的底物特异性降低。在某些实施方案中，对于C10、C12或C18底物，修饰的酰基辅酶A氧化酶的底物特异性降低。
在一些实施方案中，在遗传修饰的生物体中的遗传修饰改变生物体中产生的酰基辅酶A脱氢酶多肽的底物特异性。有时辅因子特异性被修饰，并且在一些实施方案中，修饰的多肽倾向于利用氧作为辅因子。
可以选择一种或多种特定的修饰以产生具有目标活性的修饰的多肽。修饰通常是氨基酸修饰(例如，一个或多个氨基酸的缺失、插入)。氨基酸修饰有时是氨基酸置换。氨基酸置换有时是保守的，其非限制性的实例包括含有酸性部分的氨基酸被置换为另外的含有酸性部分的氨基酸(例如，D、E)，含有碱性部分的氨基酸被置换为另外的含有碱性部分的氨基酸(例如，H、K、R)，含有脂肪链部分的氨基酸被置换为另外的含有脂肪链部分的氨基酸(V、L、I、A)，含有环状部分的氨基酸被置换为另外的含有环状部分的氨基酸(例如，W、F、Y)，以及含有极性部分的氨基酸被置换为另外的含有极性部分的氨基酸(例如，S，T)。氨基酸置换有时是非保守的，其非限制性的实例包括含有酸性部分的氨基酸被置换为含有碱性部分的氨基酸，含有碱性部分的氨基酸被置换为含有酸性部分的氨基酸，含有相对小的部分的氨基酸(例如，G、A)被置换为另外的含有相对大的部分的氨基酸(例如，Y、W、F、I、L)，以及含有相对大的部分的氨基酸被置换为另外的含有相对小的部分的氨基酸。
可以使用任何本领域已知的任何合适的方法选择特定的修饰。在某些实施方案中，对于具有已知活性的相关多肽，参考结构是已知的，并且对目标多肽的修饰可通过比对目标多肽的结构与参考结构来引导。参考结构有时是一级结构(例如，多核苷酸或多肽序列)，且目标的一级结构可以使用本领域中已知的比对方法与参考结构对齐。可选择目标结构中与参考结构中的特定氨基酸对齐(例如，相同的或同源的)或不对齐(例如，不同的或非同源的)的特定氨基酸进行修饰。可以通过对比对的检查或通过本领域已知的软件进行选择，该软件基于比对对用于修饰的氨基酸进行鉴定、评分和/或排序。
参考结构有时是二级结构，三级结构或四级结构，其中每一个都是关于多肽的三维结构。可以使用本领域中已知的三维建模软件将目标多肽的一级结构相对于二级、三级或四级参考结构进行模建。可以使用本领域已知的三维比较软件将目标多肽的二级、三级或四级结构与二级、三级或四级参考结构进行比较。可以选择目标物中与参考物中的特定结构对齐或映射或不对齐或不映射的特定结构(例如，特定的个体氨基酸；特定的一组连续或非连续氨基酸)以供修饰。另外，可以选择目标物中邻近底物或辅因子的特定结构以供修饰。可以通过对比对或映射的检查或通过本领域已知的软件进行选择，该软件基于比对和映射对用于修饰的氨基酸和/或结构进行鉴定、评分和/或排序。
在为第一多肽中的修饰选择了特定的氨基酸和/或结构之后，可以确定在第二多肽中与第一多肽中所选的氨基酸和结构对齐的氨基酸和结构。在非限制性的实例中，本文公开了假丝酵母种POX4和POX5多肽的特定氨基酸置换和结构修饰(例如，环氨基酸缺失/插入)。另一酰基辅酶A氧化酶多肽的一级结构可以与POX4或POX5多肽的氨基酸序列或模建结构进行比对，并且还可以选择与为了在POX4或POX5多肽中修饰而选择的氨基酸对齐的其他多肽的部分或全部氨基酸以供修饰。用于选择酰基辅酶A脱氢酶修饰的某些标准也描述在本文中。
修饰的多肽的一种或多种活性可使用本领域中已知的任何合适的试验来表征。修饰的多肽可以在非目标生物体的生物体中表达，在该生物体中将会产生目标产物以用于测定活性。例如，修饰的多肽可以在细菌(例如，大肠杆菌)中表达、测定，然后引入酵母(例如，假丝酵母属酵母)中以用于产生目标二酸。
原料、培养基、补充物和添加物
通常在优化脂肪二羧酸(例如，8到18个碳的脂肪二羧酸)产率的条件下培养工程微生物。脂肪二羧酸的非限制性实例包括软木酸(即，辛二酸、1,8-辛二酸、辛二酸、辛烷-1,8-二酸、1,6-己二羧酸、羊脂二酸)、皮脂酸(即，1,10-癸二酸、癸二酸、癸烷-1,10-二酸、1,8-辛烷二甲酸、羊蜡二酸)、十二烷二酸(即，DDDA，1,12-十二烷二酸、十二烷二酸、十二烷-1,12-二酸、1,10-癸烷二甲酸、十亚甲基二甲酸、1,10-二羧基癸烷、月桂二酸)、十四烷二酸(即，TDDA、1,14-十四烷二酸、十四烷二酸、十四烷-1,14-二酸、1,12-十二烷二甲酸、肉豆蔻二酸)、它普酸(即，十六烷二酸、1,16-十六烷二酸、十六烷二酸、十六烷-1,16-二酸、1,14-十四烷二甲酸、棕榈二酸)、顺式-9-十六碳烯二酸(即，棕榈烯二酸)、十八烷二酸(即，1,18-十八烷二酸、十八烷二酸、十八烷-1,18-二酸、1,16-十六烷二甲酸、硬脂二酸)、顺式-9-十八碳烯二酸(即，油二酸)、顺式-9,12-十八碳烯二酸(即，亚油二酸)、顺式-9,12,15-十八碳烯二酸(即，亚麻二酸)、花生二酸(即，二十烷二酸、正二十烷二酸)、11-二十碳烯二酸(即，顺式-11-二十碳烯二酸)、13-二十碳烯二酸(即，顺式-13-二十碳烯二酸)、花生四烯二酸(即，顺式-5,8,11,14-花生四烯二酸)。培养条件通常优化一种或多种以下活性：ω氧代脂肪酸脱氢酶活性、ω羟基脂肪酸脱氢酶活性、乙酰辅酶A羧化酶活性、单加氧酶活性、单加氧酶还原酶活性、脂肪醇氧化酶活性、酰基辅酶A连接酶活性、酰基辅酶A氧化酶活性、烯酰辅酶A水合酶活性、3-羟基酰基辅酶A脱氢酶活性和/或酰基转移酶活性(例如，乙酰辅酶AC-酰基转移酶)活性。通常，可优化的条件的非限制性实例包括碳源的类型和用量、氮源的类型和用量、碳-氮比、氧水平、生长温度、pH、生物质产生期的长度、目标产物积累期的长度和细胞收集时间。
培养基通常含有合适的碳源。用于培养微生物和/或发酵过程的碳源有时称为原料。本文所用的术语“原料”指提供给生物体的含碳源组合物，生物体用其产生用于生长的能量和代谢物。原料可以是天然物质、“人工物质”、纯化或分离的物质、纯化物质的混合物、未纯化物质的混合物或它们的组合。原料通常由人制备和/或由人提供给生物体，通常先配制原料再给予生物体。碳源可包括但不限于一种或多种以下物质：烷烃、烯烃、一元羧酸、二元羧酸、单糖(例如，也称为“糖”，包括6-碳糖(例如葡萄糖、果糖)、5-碳糖(例如木糖和其他戊糖)等)、二糖(例如，乳糖、蔗糖)、寡糖(例如，聚糖、单糖的均聚物)、多糖(例如，淀粉、纤维素、单糖的异质聚合物或它们的混合物)、糖醇(例如，甘油)和可再生的原料(例如，干酪乳清渗过物、玉米浆、甜菜糖蜜、大麦麦芽)。
碳源还可选自一种或多种以下非限制性实例：石蜡(例如，饱和石蜡、不饱和石蜡、取代的石蜡、线性石蜡、支链石蜡或它们的组合)；烷烃(例如，十二烷)、烯烃或炔烃，它们各自可以是线性、支链、饱和、不饱和、取代的或其组合(下文更详细描述)；线性或支链醇(例如，十二烷醇)；脂肪酸(例如，约1个碳到约60个碳，包括游离脂肪酸，例如皂脚)；脂肪酸的酯；甘油单酯；甘油二酯；甘油三酯；磷脂。用于制备原料的产品的非限制性商业来源包括植物、植物油或植物产品(例如，植物油(如杏仁油、菜籽油、可可脂、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻籽油、葡萄籽油、雾冰草脂(illipe)、橄榄油、棕榈油、棕榈油精、棕榈仁油、红花油、花生油、大豆油、芝麻油、乳木果油(sheanutoil)、葵花油、胡桃油等和它们的组合)和动物脂肪(例如，牛脂、乳脂、猪油、鱼肝油)。碳源可包括石油产品和/或石油馏出物(例如，柴油、燃油、汽油、煤油、石蜡、石蜡油、石油化学产品)。在一些实施方案中，原料包含石油馏出物。碳源可以是脂肪酸馏出物(例如，棕榈油馏出物或玉米油馏出物)。脂肪酸馏出物可以是粗植物油精炼产生的副产物。在一些实施方案中，原料包含脂肪酸馏出物。
在一些实施方案中，原料包含皂脚(即，皂料)。用于纯化粗植物油以供食用的广泛应用的方法是碱或腐蚀性精炼方法。该过程用氢氧化钠的稀水溶液与存在的游离脂肪酸反应，导致皂的形成。该皂与水合磷脂、树胶和促氧化金属一起通常与精炼油分开，因为重相通过精炼离心而排出并且通常被称为皂脚。
碳源也可以包括代谢物，其可作为在本文描述的工程化途径中的代谢底物直接使用，或者通过在工程微生物中使用工程化的或天然的生物合成途径转化为不同的分子而间接使用。在某些实施方案中，代谢途径可通过在一种或多种具有和/或产生至少一种常见代谢和/或合成底物的代谢途径中增加一种或多种活性的水平，优先地偏向所需产物的产生。在一些实施方案中，工程化活性(例如，ω氧化活性)的代谢副产物(例如，脂肪酸)可以在一种或多种选自糖异生、磷酸戊糖途径、糖酵解、脂肪酸合成、β氧化和ω氧化的代谢途径中使用，以产生可被转化为脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的碳源。
本文所用的术语“石蜡”指烷烃的常用名，而无论来源(例如，植物来源、石油来源、化学合成的、微生物发酵的)或碳链长度如何。碳源有时包含石蜡，且在一些实施方案中，碳源中主要是石蜡(例如，约75％、80％、85％、90％或95％石蜡)。石蜡有时是饱和的(例如，完全饱和的)，有时包含一个或多个不饱和性(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个不饱和性)，有时被一个或多个非氢取代基取代。非氢取代基的非限制性实例包括但不限于：卤素、乙酰基、＝O、＝N-CN、＝N-OR、＝NR、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR2、OOCR、COR和NO2，其中各R独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基，且各R任选地被以下基团取代：卤素、＝O、＝N-CN、＝N-OR’、＝NR’、OR’、NR’2、SR’、SO2R’、SO2NR’2、NR’SO2R’、NR’CONR’2、NR’COOR’、NR’COR’、CN、COOR’、CONR’2、OOCR’、COR’和NO2，其中各R’独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基。
在一些实施方案中，根据待培养的工程微生物的基因型和/或表型选择原料。例如，可利用富含12-碳脂肪酸、12-碳二羧酸或12-碳石蜡或10-、12-和14-碳化合物的混合物的原料培养携带改变的酵母菌株，该改变通过破坏POX4活性部分阻断β氧化，如本文所述。具有10到14个碳的碳源的非限制性实例包括脂肪(例如，椰子油、棕榈仁油)、具有10到14个碳的石蜡(例如，烷烃、烯烃或炔烃)(例如，十二烷(也称为十二烷12、联己基、二己基和十二碳烷)、十四烷、烯烃和炔烃衍生物)、脂肪酸(十二烷酸、十四烷酸)、脂肪醇(十二烷醇、十四醇)等，它们的无毒取代衍生物或组合。
碳源有时包含烷基、烯基或炔基化合物或分子(例如，包含烷基、烯基或炔基部分的化合物(例如，烷烃、烯烃或炔烃))。在某些实施方案中，碳源中主要是烷基、烯基或炔基分子或它们的组合(例如，约75％、80％、85％、90％或95％的此类分子)。本文所用的术语“烷基”、“烯基”和“炔基”包括直链(本文称为“线性”)、支链(本文称为“非线性”)、环状单价烃基和它们的组合，当它们未取代时仅含有C和H。烷基部分的非限制性实例包括甲基、乙基、异丁基、环己基、环戊基乙基、2-丙烯基、3-丁炔基等。仅含有C和H原子且未取代的烷基有时称为“饱和的”。烯基或炔基通常是“不饱和的”，因其分别含有一个或多个双键或三键。烯基可包含任何数目的双键，例如1、2、3、4或5个双键。炔基可包含任何数目的三键，例如1、2、3、4或5个三键。烷基、烯基或炔基分子有时含有约2至约60个碳原子(C)。例如，烷基、烯基和炔基分子可包含约1个碳原子、约2个碳原子、约3个碳原子、约4个碳原子、约5个碳原子、约6个碳原子、约7个碳原子、约8个碳原子、约9个碳原子、约10个碳原子、约12个碳原子、约14个碳原子、约16个碳原子、约18个碳原子、约20个碳原子、约22个碳原子、约24个碳原子、约26个碳原子、约28个碳原子、约30个碳原子、约32个碳原子、约34个碳原子、约36个碳原子、约38个碳原子、约40个碳原子、约42个碳原子、约44个碳原子、约46个碳原子、约48个碳原子、约50个碳原子、约52个碳原子、约54个碳原子、约56个碳原子、约58个碳原子或约60个碳原子。在一些实施方案中，石蜡的平均碳原子数为约8-约18个碳原子(例如，约8个碳原子、约9个碳原子、约10个碳原子、约11个碳原子、约12个碳原子、约13个碳原子、约14个碳原子、约15个碳原子、约16个碳原子、约17个碳原子和约18个碳原子)。单一基团可包含多于一类的多重键，或多于一个多重建。当此类基团含有至少一个碳-碳双键时，它们包括在术语“烯基”的定义中，当此类基团含有至少一个碳-碳三键时，它们包括在术语“炔基”的定义中。烷基、烯基和炔基分子包括含有烷基、烯基和/或炔基部分的分子，并且包括由烷基、烯基或炔基部分组成的分子(即，烷烃、烯烃和炔烃分子)。
烷基、烯基和炔基取代基有时含有1-20个C(烷基)或2-20个C(烯基或炔基)。在一些实施方案中，它们可含有约8-20个C或约10-20个C。单一基团可包含多于一类的多重键，或多于一个多重建。当此类基团含有至少一个碳-碳双键时，它们包括在术语“烯基”的定义中，当此类基团含有至少一个碳-碳三键时，它们包括在术语“炔基”的定义中。
有时，烷基、烯基和炔基或化合物被一定程度地取代，使得此类取代可合成并可存在。典型的取代基包括但不限于：卤素、乙酰基、＝O、＝N-CN、＝N-OR、＝NR、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR2、OOCR、COR和NO2，其中各R独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C11芳基或C5-C11杂芳基，且各R任选地被以下基团取代：卤素、＝O、＝N-CN、＝N-OR’、＝NR’、OR’、NR’2、SR’、SO2R’、SO2NR’2、NR’SO2R’、NR’CONR’2、NR’COOR’、NR’COR’、CN、COOR’、CONR’2、OOCR’、COR’和NO2，其中各R’独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基。烷基、烯基和炔基还可被C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基取代，这些取代基各自可以被适合具体基团的取代基取代。
“乙炔”或“乙酰基”取代基是任选取代的2-10C炔基，并且如式-C≡C-Ri所示，其中Ri是H或C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-C12芳基烷基或C6-C12杂芳基烷基，且各Ri基任选被一个或多个选自下组的取代基取代：卤素、＝O、＝N-CN、＝N-OR’、＝NR’、OR’、NR’2、SR’、SO2R’、SO2NR’2、NR’SO2R’、NR’CONR’2、NR’COOR’、NR’COR’、CN、COOR’、CONR’2、OOCR’、COR’和NO2，其中各R’独立地是H、C1-C6烷基、C2-C6杂烷基、C1-C6酰基、C2-C6杂酰基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-12芳基烷基或C6-12杂芳基烷基，这些取代基各自任选地被一个或多个选自下组的基团取代：卤素、C1-C4烷基、C1-C4杂烷基、C1-C6酰基、C1-C6杂酰基、羟基、氨基和＝O；且其中两个R’可连接形成3-7元环，该环任选地含有最多三个选自N、O或S的杂原子。在一些实施方案中，-C≡C-Ri中的Ri是H或Me。
有时，碳源包含杂烷基、杂烯基和/或杂炔基分子或化合物(例如，包含杂烷基、杂烯基和/或杂炔基部分(如，杂烷烃、杂烯烃或杂炔烃))。“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”等的定义与相应的烃基(烷基、烯基和炔基)类似，但是术语‘杂’表示该基团在它们的主链中含有1-3个O、S或N杂原子或它们的组合；因此相应烷基、烯基或炔基中的至少一个碳原子被指定的杂原子之一代替，形成杂烷基、杂烯基或杂炔基。烷基、烯基和炔基的杂化形式的典型大小通常与相应的烃基相同，并且可存在于杂化形式上的取代基与以上对于烃基所述相同。出于化学稳定性的原因，还应理解，除非另有说明，这些基团不包括多于两个相邻的杂原子，除非在N或S上存在氧代基因，例如在硝基或磺酰基中。
本文所用的术语“烷基”包括环烷基和环烷基烷基和化合物，本文可以使用术语“环烷基”描述通过环碳原子连接的碳环非芳族化合物或基团，并且“环烷基烷基”可用于描述通过烷基连接基团与分子连接的碳环非芳族化合物或基团。类似地，可使用“杂环基”描述含有至少一个杂原子作为环成员且通过环原子(可以是C或N)与分子连接的非芳族环基；并且可使用“杂环基烷基”描述通过连接基团与另一分子连接的此类基团。适用于环烷基、环烷基烷基、杂环基和杂环基烷基的大小和取代基与以上对于烷基所述的相同。本文所用的这些术语还包括含有一个或两个双键的环，只要该环是非芳族的。
有时，碳源包含酰基化合物或部分(例如，包含酰基部分的化合物)。本文所用的“酰基”包括这样的基团，其包含烷基、烯基、炔基、芳基或烷基芳基，它们连接在羰基碳原子的两个可用价位之一处，并且杂酰基指羰基碳之外的至少一个碳被选自N、O或S的杂原子代替的相应基团。因此，杂酰基包括，例如-C(＝O)OR和-C(＝O)NR2以及-C(＝O)-杂芳基。
酰基和杂酰基通过羰基碳原子的开放价位与任何基团或分子连接。它们通常是C1-C8酰基，包括甲酰基、乙酰基、新戊酰基和苯甲酰基，C2-C8杂酰基，包括甲氧基乙酰基、乙氧基羰基和4-吡啶酰基。包含酰基或杂酰基的此类基团的烃基、芳基和杂原子可被本文所述作为通常适合酰基或杂酰基的各相应组分的取代基的取代基所取代。
有时，碳源包含一个或多个芳族部分和/或杂芳族部分。“芳族”部分或“芳基”部分指具有芳香性的公知特性的单环或稠合双环部分；实例包括苯基和萘基。类似地，“杂芳族”和“杂芳基”指含有一个或多个选自O、S或N的杂原子作为环成员的此类单环或稠合双环体系。杂原子的包含允许保持5元环以及6元环的芳香性。典型的杂芳族体系包括单环C5-C6芳族基，例如吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、噁唑基和咪唑基，通过这些单环基团之一与苯环或任何杂芳族单环基团稠合形成的稠合双环部分形成C8-C10双环基团，例如吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、异喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、吡唑并吡啶基、喹唑啉基、喹喔啉基、噌啉基等。就整个环体系的电子分布而言具有芳香性的特性的任何单环或稠环双环体系都包括在该定义中。该定义还包括双环基团，其中至少直接连接在分子残余部分上的环具有芳香性的特性。环系通常含有5-12个环成员原子。单环杂芳基有时含有5-6个环成员，双环杂芳基有时含有8-10个环成员。
芳基和杂芳基部分可被多种取代基取代，包括C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-C12芳基、C1-C8酰基和它们的杂化形式，这些取代基各自可进一步被取代；用于芳基和杂芳基部分的其他取代基包括：卤素、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR2、OOCR、COR和NO2，其中各R独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-C12芳基烷基或C6-C12杂芳基烷基，且各R任选地如上对于烷基所述被取代。芳基或杂芳基上的取代基可进一步被本文描述为适合此类取代基中各类的或适合取代基各组分的基团取代。因此，例如，芳基烷基取代基可以在芳基部分上被通常用于芳基的取代基取代，并且它可以进一步在烷基部分上被通常或适合用于烷基的取代基取代。
类似地，“芳基烷基”和“杂芳基烷基”指芳环和杂芳环体系，所述体系是独立的分子(例如，苯或取代的苯、吡啶或取代的吡啶)或通过连接基团与连接点相连，该连接基团例如是亚烷基，包括取代或未取代的、饱和或不饱和的、有环或无环的连接基团。连接基团通常是C1-C8烷基或它们的杂化形式。这些连接基团还可包括羰基，因而它们能提供作为酰基或杂酰基部分的取代基。芳基烷基或杂芳基烷基中的芳环或杂芳环可被上述用于芳基的相同取代基取代。有时，芳基烷基包括任选被上述用于芳基的基团取代的苯环和未取代的或被一个或两个C1-C4烷基或杂烷基取代的C1-C4亚烷基，其中所述烷基或杂烷基可任选地环化形成诸如环丙烷、二氧戊环或氧杂环戊烷的环。类似地，杂芳基烷基通常包括任选地被一个或多个以上描述为芳基上的典型取代基的基团和未取代的C1-C4亚烷基取代的C5-C6单环杂芳基。有时，杂芳基烷基被一个或两个C1-C4烷基或杂烷基取代，或包括任选取代的苯环或C5-C6单环杂芳基和未取代的或被一个或两个C1-C4烷基或杂烷基取代的C1-C4杂亚烷基，其中所述烷基或杂烷基可任选地环化形成诸如环丙烷、二氧戊环或氧杂环戊烷的环。
当将芳基烷基或杂芳基烷基描述为任选取代时，取代基可以在该基团的烷基或杂烷基部分上或者在芳基或杂芳基部分上。任选存在于烷基或杂烷基部分上的取代基有时与以上对于烷基所述的那些相同，并且任选存在于芳基或杂芳基部分上的取代基通常与以上对于芳基所概述的那些相同。
本文所用的“芳基烷基”如果未被取代，则是烃基，并且用环和亚烷基或类似连接基团中的碳原子总数进行描述。因此，苄基是C7-芳基烷基，苯基乙基是C8-芳基烷基。
如上所述的“杂芳基烷基”指包含通过连接基团连接的芳基的部分，并且与“芳基烷基”的区别在于芳基部分的至少一个环原子或连接基团的一个原子是选自N、O和S的杂原子。本文根据环和连接基团中的原子总数描述杂芳基烷基，它们包括通过杂烷基连接基团连接的芳基；通过烃基连接基团(例如亚烷基)连接的杂芳基；通过杂烷基连接基团连接的杂芳基。因此，例如C7-杂芳基烷基包括吡啶基甲基、苯氧基和N-吡咯基甲氧基。
本文所用的“亚烷基”指二价烃基。由于亚烷基是二价的，其能将两个其他基因连接在一起。亚烷基通常表示为-(CH2)n-，其中n可以是1-20、1-10、1-8或1-4，但是在特别指出时，亚烷基也可以被其他基团取代，并且可以为其他长度，且开放的化合价不一定在链的相对端。因此，-CH(Me)-和-C(Me)2-也可以称为亚烷基，环基如环丙-1,1-二基也可以称为亚烷基。亚烷基被取代时，取代基包括本文所述通常存在于烷基上的那些。
在一些实施方案中，原料包括碳源的混合物，其中原料中每种碳源根据工程微生物的基因型而选择。在某些实施方案中，混合碳源原料包含一种或多种选自糖、纤维素、烷烃、脂肪酸、三酰甘油、石蜡等和它们的组合的碳源。
氮可自无机(例如，(NH4)2SO4)或有机来源(例如，脲或谷氨酸)供应。除合适的碳源和氮源外，培养基还可含有适合微生物培养的适当矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素、金属离子(例如，Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2)和其他组分。
有时在复合培养基(例如，酵母提取物-蛋白胨-右旋糖肉汤(YPD))中培养工程微生物。在一些实施方案中，在缺乏生长所必需的组分的成分限定的基本培养基中培养工程微生物，从而迫使选出所需表达盒(例如，酵母氮基料(DIFCOLaboratories,Detroit,Mich.))。
在一些实施方案中，培养基是可商品化制备的常见培养基，例如酵母氮基料(DIFCOLaboratories,Detroit,Mich.)。还可利用其他成分限定的或合成的生长培养基，且用于特定微生物生长的合适培养基是已知的。可选择多种宿主生物体以供产生工程微生物。非限制性实例包括酵母(例如，热带假丝酵母(如ATCC20336、ATCC20913ATCC20962)、解脂耶氏酵母(如ATCC20228))和丝状真菌(例如，构巢曲霉(如ATCC38164)和寄生曲霉(如ATCC24690))。在具体的实施方案中，酵母在YPD培养基(10g/LBacto酵母提取物、20g/LBacto蛋白胨和20g/L右旋糖)中培养。在特定的实施方案中，丝状真菌在含有以下成分的CM(完全培养基)中生长：10g/L右旋糖、2g/LBacto蛋白胨、1g/LBacto酵母提取物、1g/L酪蛋白氨基酸、50mL/L20X硝酸盐(120g/LNaNO3，10.4g/LKCl，10.4g/LMgSO4·7H2O)、1mL/L1000X痕量元素(22g/LZnSO4·7H2O，11g/LH3BO3，5g/LMnCl2·7H2O，5g/LFeSO4·7H2O，1.7g/LCoCl2·6H2O，1.6g/LCuSO4·5H2O，1.5g/LNa2MoO4·2H2O，和50g/LNa4EDTA)和1mL/L维生素溶液(生物素、吡哆醇、硫胺素、核黄素、对氨基苯甲酸和烟酸各100mg，在100mL水中)。
生长条件和发酵
发酵的合适pH范围通常为约pH4.0至约pH8.0，其中初始培养条件通常利用约pH5.5至约pH7.0的pH范围。根据宿主生物体，可在需氧或厌氧条件下进行培养，其中有时维持微需氧条件。可采用两阶段工艺，其中一个阶段促进微生物增殖，而另一阶段促进目标分子的产生。在两阶段工艺中，第一阶段可在需氧条件下进行(例如，引入空气和/或氧)，第二阶段可在厌氧条件下进行(例如，不将空气或氧引入培养条件)。在一些实施方案中，第一阶段可在厌氧条件下进行，第二阶段可在需氧条件下进行。在某些实施方案中，两阶段工艺可包括两种或更多种生物体，例如，一种生物体在一个阶段产生中间体产物，而另一生物体在另一阶段将中间体产物加工成目标脂肪二羧酸产物(例如癸二酸或十二烷二酸)。
可将多种发酵工艺用于目标脂肪二羧酸产物的商业化生物生产。在一些实施方案中，例如，利用分批、补料-分批或连续发酵工艺从重组微生物宿主进行目标脂肪二羧酸产物的商业化生产。
分批发酵工艺通常是封闭体系，其中培养基组成在工艺开始时固定，并且在工艺期间不再进一步添加以防超出维持pH和氧水平所需的量。培养工艺开始时用所需生物体接种培养基，并且使生长或代谢活性在不向培养基中加入额外来源(即，碳源和氮源)的情况下发生。在分批工艺中，体系的代谢物和生物质组成持续改变直至培养终止时。在典型的分批工艺中，细胞从静态停滞期进行到高速生长对数期，最后到稳定期，其中生长速度降低或停止。不作处理的话，稳定期的细胞最终会死亡。
标准分批工艺的改进是补料-分批工艺，其中在发酵过程中将碳源持续加入发酵罐中。当分解代谢阻抑倾向于抑制细胞代谢时或者需要随时限制培养基中的碳源含量时，补料-分批工艺是有用的。可根据可测量的因素如pH、溶解氧和废气(例如，CO2)分压的改变来估计补料-分批系统中的碳源。
分批和补料-分批培养方法是本领域已知的。此类方法的实例可见ThomasD.Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第2版,(1989)SinauerAssociatesSunderland,Mass.和Deshpande,MukundV.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227(1992)。
在连续发酵工艺中，通常将成分限定的培养基连续加入生物反应器，同时除去等量体积的培养物以便回收产物。连续培养通常将细胞维持在对数生长期，细胞密度恒定。连续或半连续培养方法能调节影响细胞生长或终产物浓度的一个因素或任何数量的因素。例如，某种方法可限制碳源并使所有其他参数为适度代谢。在一些系统中，可连续改变影响生长的许多因素，同时由培养基浊度检测的细胞浓度维持恒定。连续系统通常维持稳态生长，因此细胞生长速度通常与从培养物中抽离培养基所致的细胞损失达到平衡。为连续培养工艺调节营养和生长因子的方法以及最大程度提高产物形成速度的技术是已知的，Brock(上文)详述了各种方法。
在涉及发酵的一些实施方案中，可利用两种或更多种微生物(例如，宿主微生物、工程微生物、分离的天然产生微生物等和它们的组合)进行发酵，其中发酵中的一种或多种生物体部分或完全利用原料(例如，混合发酵)，细胞呼吸或一种或多种生物代谢的产物可由一种或多种其他生物体进一步代谢，从而产生所需目标产物(例如，癸二酸、十二烷二酸、己酸)。在某些实施方案中，各生物体可独立发酵，将细胞呼吸或代谢的产物纯化并与另一生物体接触以产生所需目标产物。在一些实施方案中，部分或完全阻断一种或多种生物体的代谢途径(例如，β氧化、ω氧化等或它们的组合)，从而产生可用作一种或多种其他生物原料的所需产物。可利用微生物的任何合适的组合进行混合发酵或顺序发酵。
目标产物的生产、分离和产率
在各种实施方案中，从培养基中分离或纯化或从工程微生物中提取脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)。在一些实施方案中，通过本文所述方法对原料的发酵可以以理论产率的约10％到约100％的水平(例如，理论产率的约15％、约20％、约25％或更高(例如，理论产率的25％或更高、26％或更高、27％或更高、28％或更高、29％或更高、30％或更高、31％或更高、32％或更高、33％或更高、34％或更高、35％或更高、36％或更高、37％或更高、38％或更高、39％或更高、40％或更高、41％或更高、42％或更高、43％或更高、44％或更高、45％或更高、46％或更高、47％或更高、48％或更高、49％或更高、50％或更高、51％或更高、52％或更高、53％或更高、54％或更高、55％或更高、56％或更高、57％或更高、58％或更高、59％或更高、60％或更高、61％或更高、62％或更高、63％或更高、64％或更高、65％或更高、66％或更高、67％或更高、68％或更高、69％或更高、70％或更高、71％或更高、72％或更高、73％或更高、74％或更高、75％或更高、76％或更高、77％或更高、78％或更高、79％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)产生目标脂肪二羧酸产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)。本文所用的术语“理论产率”指如果反应100％完成，可从起始材料制备的产物的量。理论产率是基于反应的化学计量学和起始材料完全消耗、不发生不希望的副反应、不发生逆反应并且后处理程序中没有损失的理想条件。当浓度达到预定水平时，可检验培养基的目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)浓度并抽出。检测方法是本领域已知的，包括但不限于色谱法(例如，气相色谱法)或联合气相色谱/质谱(例如，GC-MS)方法。目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)可以以本文所述的水平范围存在。
有时，目标脂肪二羧酸产物在培养过程完成后保留在工程微生物中，并且在某些实施方案中，目标产物从微生物分泌至培养基中。对于后一实施方案，(i)可从培养系统抽出培养基并可补充新鲜培养基，和/或(ii)可在培养期间或在培养过程完成后从培养基中提取目标产物。可在固体、半固体或液体培养基之上或之中培养工程微生物。在一些实施方案中，从附着于平板的细胞中排出培养基。在某些实施方案中，如本领域已知的，以足以沉淀细胞但不破坏细胞并允许提取培养基的速度离心液体-细胞混合物。然后可将细胞重悬浮在新鲜培养基中。可按照本领域已知的方法从培养基中纯化目标产物。
本文提供了可用于从发酵液中回收目标产物和/或当使用混合链长原料时从非目标产物中分离/部分纯化目标脂肪二羧酸的方法的非限制性实例。从发酵液中回收脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)可使用多种方法完成。任选地，可以首先采用离心步骤从水相中分离细胞团和脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)。脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)在发酵条件下在水中具有有限的溶解度，并且与水有相似的密度。离心时，大多数脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)将会从水流中脱离，并且集中到细胞团流中。浓缩的脂肪二羧酸流然后通过过滤步骤进一步浓缩(例如，固态的十二烷二酸将会被截留在过滤器上，而允许水从中通过，从而浓缩产物)。一旦脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)浓缩到期望的水平，将温度提高到高于其130℃的熔点。脂肪二羧酸熔化之后，通过过滤去除剩余的杂质；通过降低温度，使脂肪二羧酸凝固，并收集固态产物而回收终产物。
或者，脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)可以如下从发酵液中回收：首先用脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)在其中可溶的有机溶剂(乙醇)萃取发酵液。然后可将有机溶剂相通过不同的膜过滤来进一步纯化脂肪二羧酸。然后可以进行随后用相同或不同的有机溶剂的萃取，并且每一轮萃取后可以接着进行膜过滤以进一步浓缩脂肪二羧酸。有机溶剂可以蒸发，剩下脂肪二羧酸作为残余物，并且可以干燥该残余物以提供固体形式的脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)。
在某些实施方案中，从培养的工程微生物中提取目标产物。可通过以足以剪切细胞膜的离心速度离心来浓缩微生物细胞。在一些实施方案中，可物理破坏(例如，剪切力，超声处理)或化学破坏(例如，接触去污剂或其他裂解剂)细胞。可通过离心或本领域已知的其他方法分离各相，并且可按照已知方法分离目标产物。
有时以基本上纯的形式(例如，90％纯或更高、95％纯或更高、99％纯或更高或99.5％纯或更高)提供商品级目标产物。在一些实施方案中，可将目标产物修饰成多种下游产物中的任一种。例如，脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)可与己二胺缩聚产生尼龙。可将尼龙进一步加工成纤维以便应用于毛毯、汽车轮胎帘布和衣物。脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)还用于生产增塑剂、润滑剂组分和用于聚氨酯系统的聚酯多元醇。食品级脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)的各种脂用作香料制作、胶凝助剂、调味品、酸化剂、发酵剂和缓冲剂中的组分。脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)具有两个羧酸(-COOH)基团，其能产生两类盐。通过进一步的取代、催化还原、金属氢化物还原、二硼烷还原、与有机金属试剂形成酮、在氧处的亲电键合和缩合反应，其衍生物、酰基卤、酐、酯、酰胺和腈用于制备多种下游产物。
可在含有目标产物的培养的微生物内提供目标产物，并且培养的微生物可新鲜提供或冷冻在液体介质中或干燥。新鲜或冷冻的微生物可容纳在合适的防潮容器中，如需要该容器也可以是温控的。有时在基本上不含细胞的培养基中提供目标产物。在一些实施方案中，提供从微生物中纯化的目标产物或修饰的目标产物，并且有时以基本上纯的形式提供目标产物。在某些实施方案中，提供结晶或粉末化的目标产物。十二烷二酸(1,12十二烷二酸；DDDA)是融点在260°F和266°F之间的白色粉末或晶体。癸二酸(1,8癸烷二羧酸)也是融点在268°F和274°F之间的白色粉末或晶体。结晶的或粉末化的脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)可以在包括一吨纸箱、圆筒、50磅袋子等在内的各种容器中运输。
在某些实施方案中，脂肪二羧酸目标产物(例如，十二烷二酸或癸二酸)以如下产率产生：约0.50克目标产物/克加入的原料，或更多；0.51克目标产物/克加入的原料，或更多；0.52克目标产物/克加入的原料，或更多；0.53克目标产物/克加入的原料，或更多；0.54克目标产物/克加入的原料，或更多；0.55克目标产物/克加入的原料，或更多；0.56克目标产物/克加入的原料，或更多；0.50克目标产物/克加入的原料，或更多；0.57克目标产物/克加入的原料，或更多；0.58克目标产物/克加入的原料，或更多；0.59克目标产物/克加入的原料，或更多；0.60克目标产物/克加入的原料，或更多；0.61克目标产物/克加入的原料，或更多；0.62克目标产物/克加入的原料，或更多；0.63克目标产物/克加入的原料，或更多；0.64克目标产物/克加入的原料，或更多；0.65克目标产物/克加入的原料，或更多；0.66克目标产物/克加入的原料，或更多；0.67克目标产物/克加入的原料，或更多；0.68克目标产物/克加入的原料，或更多；0.69克目标产物/克加入的原料，或更多；0.70克目标产物/克加入的原料，或更多；0.71克目标产物/克加入的原料，或更多；0.72克目标产物/克加入的原料，或更多；0.73克目标产物/克加入的原料，或更多；0.74克目标产物/克加入的原料，或更多；0.75克目标产物/克加入的原料，或更多；0.76克目标产物/克加入的原料，或更多；0.77克目标产物/克加入的原料，或更多；0.78克目标产物/克加入的原料，或更多；0.79克目标产物/克加入的原料，或更多；0.80克目标产物/克加入的原料，或更多；0.81克目标产物/克加入的原料，或更多；0.82克目标产物/克加入的原料，或更多；0.83克目标产物/克加入的原料，或更多；0.84克目标产物/克加入的原料，或更多；0.85克目标产物/克加入的原料，或更多；0.86克目标产物/克加入的原料，或更多；0.87克目标产物/克加入的原料，或更多；0.88克目标产物/克加入的原料，或更多；0.89克目标产物/克加入的原料，或更多；0.90克目标产物/克加入的原料，或更多；0.91克目标产物/克加入的原料，或更多；0.92克目标产物/克加入的原料，或更多；0.93克目标产物/克加入的原料，或更多；0.94克目标产物/克加入的原料，或更多；0.95克目标产物/克加入的原料，或更多；0.96克目标产物/克加入的原料，或更多；0.97克目标产物/克加入的原料，或更多；0.98克目标产物/克加入的原料，或更多；0.99克目标产物/克加入的原料，或更多；1.0克目标产物/克加入的原料，或更多；1.1克目标产物/克加入的原料，或更多；1.2克目标产物/克加入的原料，或更多；1.3克目标产物/克加入的原料，或更多；1.4克目标产物/克加入的原料，或更多；或约1.5克目标产物/克加入的原料，或更多。
在某些实施方案中，脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)以大于约0.15克/克原料(例如，十二烷、混合链长烷烃、月桂酸、混合链长脂肪酸、油等或前述的组合)的产率产生。在一些实施方案中，脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)以任何引入的原料的最大理论产率的约10％到约100％产生(例如，理论产率的约15％、约20％、约25％或更高(例如，理论产率的25％或更高、26％或更高、27％或更高、28％或更高、29％或更高、30％或更高、31％或更高、32％或更高、55％或更高、34％或更高、35％或更高、36％或更高、37％或更高、38％或更高、39％或更高、40％或更高、41％或更高、42％或更高、43％或更高、44％或更高、45％或更高、46％或更高、47％或更高、48％或更高、49％或更高、50％或更高、51％或更高、52％或更高、53％或更高、54％或更高、55％或更高、56％或更高、57％或更高、58％或更高、59％或更高、60％或更高、61％或更高、62％或更高、63％或更高、64％或更高、65％或更高、66％或更高、67％或更高、68％或更高、69％或更高、70％或更高、71％或更高、72％或更高、73％或更高、74％或更高、75％或更高、76％或更高、77％或更高、78％或更高、79％或更高、80％或更高、81％或更高、82％或更高、83％或更高、84％或更高、85％或更高、86％或更高、87％或更高、88％或更高、89％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或者99％或更高)。在某些实施方案中，脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)以大约50g/L到大约1000g/L培养基之间的浓度范围产生(例如，大约50g/L、大约55g/L、大约60g/L、大约65g/L、大约70g/L、大约75g/L、大约80g/L、大约85g/L、大约90g/L、大约95g/L、大约100g/L、大约110g/L、大约120g/L、大约130g/L、大约140g/L、大约150g/L、大约160g/L、大约170g/L、大约180g/L、大约190g/L、大约200g/L、大约225g/L、大约250g/L、大约275g/L、大约300g/L、大约325g/L、大约350g/L、大约375g/L、大约400g/L、大约425g/L、大约450g/L、大约475g/L、大约500g/L、大约550g/L、大约600g/L、大约650g/L、大约700g/L、大约750g/L、大约800g/L、大约850g/L、大约900g/L、大约950g/L或大约1000g/L)。
在一些实施方案中，脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)以大约0.5g/L/小时到大约5g/L/小时之间的生产速率产生(例如，大约0.5g/L/小时、大约0.6g/L/小时、大约0.7g/L/小时、大约0.8g/L/小时、大约0.9g/L/小时、大约1.0g/L/小时、大约1.1g/L/小时、大约1.2g/L/小时、大约1.3g/L/小时、大约1.4g/L/小时、大约1.5g/L/小时、大约1.6g/L/小时、大约1.7g/L/小时、大约1.8g/L/小时、大约1.9g/L/小时、大约2.0g/L/小时、大约2.25g/L/小时、大约2.5g/L/小时、大约2.75g/L/小时、大约3.0g/L/小时、大约3.25g/L/小时、大约3.5g/L/小时、大约3.75g/L/小时、大约4.0g/L/小时、大约4.25g/L/小时、大约4.5g/L/小时、大约4.75g/L/小时或大约5.0g/L/小时)。在某些实施方案中，在相同的发酵条件下，与相同菌株的野生型或部分工程生物体相比，工程微生物在脂肪二羧酸(例如，辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十八烷二酸、二十烷二酸)产量上具有大约5倍到500倍的增加(例如，大约5倍增加、大约10增加、大约15增加、大约20加、大约25增加、大约30加、大约35倍增加、大约40倍增加、大约45倍增加、大约50倍增加、大约55倍增加、大约60倍增加、大约65倍增加、大约70倍增加、大约75倍增加、大约80倍增加、大约85倍增加、大约90倍增加、大约95倍增加、大约100倍增加、大约125倍增加、大约150倍增加、大约175倍增加、大约200倍增加、大约250倍增加、大约300倍增加、大约350倍增加、大约400倍增加、大约450倍增加或大约500倍增加)。
在某些实施方案中，在完全β-氧化阻断的工程微生物中十二烷二酸的最大理论产率(Ymax)是每克加入的月桂酸产生大约1.15克十二烷二酸。在一些实施方案中，在完全β-氧化阻断的工程微生物中十二烷二酸的最大理论产率(Ymax)是每克加入的月桂酸甲酯产生大约1.07克十二烷二酸。在某些实施方案中，在部分β-氧化阻断的工程微生物中十二烷二酸的最大理论产率(Ymax)是每克加入的油酸产生大约0.82克十二烷二酸。在一些实施方案中，在部分β-氧化阻断的工程微生物中十二烷二酸的最大理论产率(Ymax)是每克加入的椰子油产生大约0.95克十二烷二酸。工程微生物在产生十二烷二酸的条件下的Ymax百分比按(％Ymax)＝Yp/s/Ymax*100来计算，其中(Yp/s)＝[十二烷二酸(g/L)]*烧瓶中培养物的最终体积]/[烧瓶中加入的原料(g)]。在一些实施方案中，工程微生物以最大理论产率的大约10％到大约100％产生十二烷二酸。
在某些实施方案中，在完全β-氧化阻断的工程微生物中癸二酸的最大理论产率(Ymax)是每克加入的癸烷产生大约1.42克癸二酸。在一些实施方案中，在完全β-氧化阻断的工程微生物中癸二酸的最大理论产率(Ymax)是每克加入的癸酸产生大约1.17克癸二酸。在某些实施方案中，在部分β-氧化阻断的工程微生物中癸二酸的最大理论产率(Ymax)是每克加入的椰子油产生大约0.83克癸二酸。在一些实施方案中，在部分β-氧化阻断的工程微生物中癸二酸的最大理论产率(Ymax)是每克加入的油酸产生大约0.72克癸二酸。工程微生物在产生癸二酸的条件下的Ymax百分比按(％Ymax)＝Yp/s/Ymax*100计算，其中(Yp/s)＝[癸二酸(g/L)]*烧瓶中培养物的最终体积]/[烧瓶中加入的原料(g)]。在一些实施方案中，工程微生物以最大理论产率的大约10％到大约100％产生癸二酸。
实施例
以下列出的实施例说明某些实施方案而并非限制本发明的技术。以下列出的某些实施例采用本领域已知的标准重组DNA和其他生物技术方案。许多这样的技术详细描述于Maniatis,T.,E.F.Fritsch和J.Sambrook(1982)MolecularCloning:aLaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.中。可使用Stratagene(SanDiego,CA)的“QuickChange”试剂盒，按照生产商的使用说明书实现DNA诱变。
本文描述了重组DNA技术和微生物的遗传操作的非限制性实例。在一些实施方案中，本文描述的工程生物体的菌株相配对以组合遗传背景，从而进一步加强通过天然的和/或本文描述的工程化途径的碳通量管理，用于生产所需的目标产物(例如，癸二酸或十二烷二酸)。
实施例1：在摇瓶发酵中癸烷向癸二酸的转化
用热带假丝酵母的完全β-氧化阻断的菌株(ATCC20962)的单菌落接种50mL的SP92培养基(6.7g/L酵母氮基料、3.0g/L酵母提取物、3.0g/L(NH4)2SO4、1.0g/LK2HPO4、1.0g/LKH2PO4、75g/L右旋糖)，并且培养物在30℃和约300rpm振摇下生长过夜。通过在4℃和1,050xg下离心10分钟使细胞沉淀并弃去上清液。将细胞重悬浮在20mLTB-低氮(低-N)培养基(1.7g/L不含硫酸铵的酵母氮基料、3.0g/L酵母提取物、1.0g/LK2HPO4、1.0g/LKH2PO4)中，并转移至新的无菌250mL玻璃带挡板烧瓶中，使用下列进料时间表在30℃和约250rpm振摇下孵育：在0、1、2、3、4和5小时右旋糖进料至0.1％，在30小时右旋糖进料至5％，在0、5、30和48小时癸烷进料至0.7％。在0、4、30和72小时移取样品用于气相色谱(GC)分析。气相色谱图显示该培养积累了C10二羧酸(癸二酸)，而C10一元羧酸(癸酸)的积累极少，如图9所示。孵育72小时后，癸二酸浓度为0.94g/L而癸酸浓度为0.01g/L。任何其他一元酸或二酸都没有显著的积累。
实施例2：在摇瓶发酵中癸酸向癸二酸的转化
用热带假丝酵母(ATCC20962)的单菌落接种50mL的SP92-甘油培养基(6.7g/L酵母氮基料、3.0g/L酵母提取物、3.0g/L(NH4)2SO4、1.0g/LK2HPO4、1.0g/LKH2PO4、75g/L甘油)，并且该起始培养物在30℃和约250rpm振摇下生长过夜。SP92培养基配方的变化是已知的，其非限制性实例包括右旋糖和/或甘油等或其组合的添加。本文提到的SP92培养基可包含右旋糖和/或甘油。然后用起始培养物接种在相同培养基中的25mL培养物至初始OD600nm为0.4，并在30℃和约300rpm振摇下生长过夜。通过在4℃和1,050xg下离心10分钟使细胞沉淀并弃去上清液。将细胞重悬浮在12.5mLTB-低N培养基+甘油(1.7g/L不含硫酸铵的酵母氮基料、3.0g/L酵母提取物、1.0g/LK2HPO4、1.0g/LKH2PO4、75g/L甘油)中，并转移至新的无菌250mL玻璃带挡板烧瓶中。向培养物进料0.05％或0.1％癸酸，并在30℃和约300rpm振摇下孵育。孵育24小时后，向培养物进料甘油至75g/L，并在48小时为GC采样之前继续孵育。GC分析显示，在癸酸的两种起始浓度下，几乎全部癸酸都转化为癸二酸，如图10所示。
实施例3：癸烷转化为癸二酸的发酵程序
将过滤除菌的改良SP92-甘油发酵培养基(6.7g/L酵母氮基料、3.0g/L酵母提取物、3.0g/L(NH4)2SO4、1.0g/LK2HPO4、1.0g/LKH2PO4、20g/L甘油)转移至无菌发酵容器。热带假丝酵母(ATCC20962)的生长用5％接种物接种至初始OD600nm为约1.0，并在下列条件下进行生长：30℃，约1000rpm振摇，每分钟每体积的通气体积(vvm)为1，pH5.8，且初始体积为0.3L。生长进行大约8小时，并通过添加癸烷至2g/L启动转化阶段。在添加癸烷团剂(bolus)的同时开始癸烷(1g/L-h)和葡萄糖(1.5g/L-h)的连续进料。发酵条件在30℃、1000rpm、1vvm和pH5.8下维持44小时。
在启动转化阶段之后44小时采集样品用于GC分析。显示在图16中的数据表明癸烷仅转化为C10二羧酸——癸二酸。从癸烷进料瓶中的明显蒸发损失阻碍了对产物产率的精确测定。
实施例4：在摇瓶发酵中混合脂肪酸原料向含有癸二酸的混合二酸产物的转化
用热带假丝酵母(ATCC20962)的单菌落接种5mL的SP92-甘油培养基(6.7g/L酵母氮基料、3.0g/L酵母提取物、3.0g/L(NH4)2SO4、1.0g/LK2HPO4、1.0g/LKH2PO4、75g/L甘油)，并如实施例2中所述生长。使用过夜培养物接种25mL相同培养基至初始OD600nm为0.4并在30℃和约300rpm振摇下生长过夜。通过在4℃和1,050xg下离心10分钟使细胞沉淀并弃去上清液。将细胞重悬浮在12.5mL无碳源的TB-低N培养基(1.7g/L不含硫酸铵的酵母氮基料、3.0g/L酵母提取物、1.0g/LK2HPO4、1.0g/LKH2PO4)中并转移至新的无菌250mL玻璃带挡板烧瓶中。向培养物进料0.05％癸酸、0.05％月硅酸甲酯和30g/L甘油，并在30℃、300rpm下孵育。孵育24小时后对培养物进行采样用于GC分析。
显示在图17中的结果表明C12和C10脂肪酸转化为相同链长的二羧酸(例如，C12和C10二羧酸)，并无二酸链缩短的证据(例如，没有检测到一元羧酸的显著水平)。
实施例5：长链脂肪酸向混合二酸的转化
将SP92发酵培养基过滤除菌并转移至无菌发酵容器中。热带假丝酵母(sAA106)的部分β-氧化阻断的菌株的生长用10％接种物(初始OD600nm＝3.0)启动，并在下列条件下生长：30℃，约1200rpm振摇，1vvm，pH6.1，且初始体积为0.3L。继续生长直至葡萄糖浓度降至低于2g/L，此时通过添加6NKOH使pH升至8.0和通过添加肉豆蔻酸甲酯至30g/L启动转化阶段。肉豆蔻酸甲酯团剂之后立即以1.5g/L-h的速率开始葡萄糖的连续进料。发酵条件在30℃、1200rpm、1vvm和pH8.0下维持90小时，并在转化开始后24、48和72小时添加30g/L肉豆蔻酸甲酯团剂。在24、48、72和90小时采集用于GC的样品。在图11中以图形示出的二酸谱显示在6至14个碳长度的链长范围内的二羧酸(包括癸二酸)的积累。在通过循环β-氧化途径以两个碳的增量缩短之前，肉豆蔻酸甲酯底物(肉豆蔻酸的甲酯)首先通过ω-氧化途径转化为C14二羧酸。在发酵过程中采用的葡萄糖共同进料抑制了β-氧化途径，使得所有链长的二酸积累。二酸链长分布的操作正在通过以下方式进行研究：改变发酵培养基中的葡萄糖共同进料速率，从而允许在不同葡萄糖浓度下生长。
实施例6：用于将混合长链脂肪酸转化为较短链长的混合二酸的发酵程序
将不含甘油的SP92发酵培养基过滤除菌并转移至无菌发酵容器中。向该容器中添加高压蒸汽灭菌的原始椰子油至最终浓度为80g/L。部分β-氧化阻断的热带假丝酵母菌株(sAA496)用5％接种物接种至OD600nm为1.0，并在下列条件下生长：30℃，约1200rpm振摇，1vvm，初始pH6.5，且初始体积为1.0L。pH对脂肪酸链长分布的影响通过操纵发酵培养基的pH来测定。发酵的pH1)升高至pH7.5并在整个运行中控制在该pH下，2)允许由于培养物的生长而自然下降，之后对于其余的运行，控制在pH6.0，或3)允许由于培养物的生长而自然下降，之后对于其余的运行，控制在pH4.5。在发酵时间140小时之后采集样品用于GC分析。如表6所示，表明产物二酸组成随着pH升高而转变为较长链的二酸。
表6
实施例7：使用在ω-氧化途径中具有额外遗传修饰的完全β-氧化阻断的菌株，在摇瓶发酵中癸酸向癸二酸的转化
将热带假丝酵母的多种遗传修饰的菌株接种至5mLSP92培养基(6.7g/L酵母氮基料、3.0g/L酵母提取物、3.0g/L(NH4)2SO4、1.0g/LK2HPO4、1.0g/LKH2PO4、75g/L甘油)中。这些菌株包括热带假丝酵母的完全β-氧化阻断的菌株(sAA003)，以及具有扩增的ω-氧化途径组分的sAA003的衍生物(例如，多种细胞色素P450、细胞色素P450还原酶或其组合)，并且该培养物在30℃和约250rpm振摇下生长过夜。然后用这些起始培养物接种25mL在相同培养基中的培养物，并在30℃和约250rpm振摇下生长过夜。通过在4℃和1,050xg下离心10分钟使细胞沉淀并弃去上清液。将细胞重悬浮在12.5mLTB-低N培养基+甘油(1.7g/L不含硫酸铵的酵母氮基料、3.0g/L酵母提取物、1.0g/LK2HPO4、1.0g/LKH2PO4、75g/L甘油)中并转移至新的无菌250mL玻璃带挡板烧瓶中。从5％癸酸的乙醇溶液向培养物进料0.05％，并在30℃和约300rpm振摇下孵育。孵育24小时之后，向培养物进料甘油至30g/L以及额外的0.05％癸酸团剂。继续孵育，之后在24、48和72小时取样进行GC。结果示于图12中。GC分析表明，当ω-氧化途径的特定元件扩增时，更大比例的癸酸转化为癸二酸。数据以理论最大产率的％表示。包含对CYPA18和CYPA19的遗传修饰的菌株在癸酸至癸二酸的转化中达到理论最大产率的大约80％。命名为+CPR+A18的菌株具有约30个拷贝的CYPA18，而命名为+CPR+A19的菌株具有约7个拷贝的CYPA19。
实施例8：在摇瓶发酵中月桂酸甲酯向十二烷二酸的转化
用热带假丝酵母的完全β-氧化阻断的菌株(ATCC20962)的单菌落以及具有扩增的ω-氧化途径组分的该菌株的修饰衍生物接种5mLSP92甘油培养基(6.7g/L酵母氮基料、3.0g/L酵母提取物、3.0g/L(NH4)2SO4、1.0g/LK2HPO4、1.0g/LKH2PO4、75g/L甘油)，并且培养物在30℃和约250rpm振摇下生长过夜。然后用起始培养物接种25mL在相同培养基中的培养物，并在30℃和约250rpm振摇下培养过夜。通过在4℃和1,050xg下离心10分钟使细胞沉淀并弃去上清液。将细胞重悬浮在12.5mLSP92甘油培养基中并转移至无菌250mL玻璃带挡板烧瓶。向培养物进料2％(v/v)月硅酸甲酯并在30℃和约300rpm振摇下孵育。孵育24小时之后，向培养物进料甘油至60g/L并继续孵育，之后在48小时取样进行GC。GC分析显示，ω-氧化途径的某些组分的扩增使得向十二烷二酸的转化增加(图13)。
实施例9：酰基辅酶A氧化酶底物特异性的改变
过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶POX4和POX5的底物特异性已显示参与在进料混合链长脂肪酸原料的热带假丝酵母发酵中对二酸产物链长的控制。POX4活性、POX5活性或POX4活性和POX5活性的降低或消除影响在假丝酵母中产生的二羧酸的碳链长度分布。酰基辅酶A氧化酶是循环β-氧化途径中的第一种酶，其在每个循环中使底物缩短两个碳。因此，酰基辅酶A氧化酶活性充当该途径的入口点，以供底物进入β-氧化途径。改变酰基辅酶A氧化酶活性的底物特异性，以使其对短于所需碳链长度的底物碳链(例如，C8、C10、C12、C14等)没有活性，可以阻止碳链缩短至所选阈值以下，允许所需目标链长和产物(例如，C12、十二烷二酸)的积累。
假丝酵母菌株ATCC20336中的天然酰基辅酶A氧化酶同工酶Pox4p和Pox5p具有不同的底物特异性。Pox4p同工酶具有宽底物特异性，而Pox5p具有窄底物特异性。在Pox4-、Pox5+菌株中，二酸产物的链长取决于Pox5p同工酶的底物特异性且主要产物是己二酸。
为了使发酵中较长链长(例如，C12)的所需二酸产物的产量最大化，在一些实施方案中，可以工程构建遗传修饰的生物体，其含有酰基辅酶A氧化酶活性以及适于所需二酸产物链长的底物链长特异性。酰基辅酶A氧化酶活性的来源或工程构建酰基辅酶A氧化酶活性的方法可以变化。可用于提供适用于工程设计底物特异性改变的酰基辅酶A氧化酶活性的多核苷酸序列的生物体的非限制性实例包括：植物(例如，拟南芥属、南瓜属(例如，南瓜、笋瓜)、稻属(例如，稻))；动物(例如，牛属(例如，牛)、豚鼠属(例如，豚鼠)、小鼠属(例如，小鼠)、大鼠属(大鼠)、树袋熊属(例如，树袋熊)、灵长类(例如，猩猩))；霉菌(例如盘基网柄菌属(例如，黏菌类))；昆虫(例如，果蝇)；酵母(例如，解脂耶氏酵母、麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)、光滑假丝酵母、棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)、汉逊德巴利酵母、乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母)；细菌(例如，大肠杆菌)；蓝藻菌；线虫(例如，隐杆线虫属(Caenorhabditis))；和人类。
具有不同底物链长特异性的酰基辅酶A氧化酶活性可以如下鉴定：
1)从含有不同底物链长特异性的异种生物体中选择酰基辅酶A氧化酶基因。所鉴定的基因可以转移至缺失所有酰基辅酶A氧化酶活性的假丝酵母菌株中。在这样的遗传修饰的生物体中可检测到的唯一酰基辅酶A氧化酶活性可能是由异源基因所赋予的。
2)通过来自多种酰基辅酶A氧化酶基因的域转换以产生非天然嵌合酰基辅酶A氧化酶基因的文库，来工程构建酰基辅酶A氧化酶基因文库。该嵌合基因文库可以转移至缺失全部酰基辅酶A氧化酶活性的热带假丝酵母菌株中。唯一可检测到的酰基辅酶A氧化酶活性可能是由来自非天然嵌合酰基辅酶A氧化酶基因文库的工程化基因所赋予的。
3)通过随机诱变来工程构建酰基辅酶A氧化酶基因文库。具有接近所需的底物链长特异性的天然存在的或工程化的酰基辅酶A氧化酶活性可用作随机诱变的基础，之后进行筛选和/或选择，以试图产生和鉴定具有所需底物链长特异性的改变的活性。该基因文库可以转移至缺失全部酰基辅酶A氧化酶活性的假丝酵母菌株中。唯一可检测到的酰基辅酶A氧化酶活性可能是由来自随机诱变文库的基因所赋予的。
4)使用蛋白质结构信息来指导待替换的氨基酸的位置和身份，通过智能设计和定向突变来工程构建酰基辅酶A氧化酶基因。工程化的基因可以转移至缺失全部酰基辅酶A氧化酶活性的假丝酵母菌株中。唯一可检测到的酰基辅酶A氧化酶活性可能是由工程化的基因所赋予的。
本文提供了用于选择赋予所需底物链长特异性的基因的后工程化方法的非限制性实例。通过在作为唯一碳源提供的不同链长的底物上生长而进行选择。细胞在某些底物上生长而不在其他底物上生长通常反映了该菌株中存在的酰基辅酶A氧化酶的底物链长特异性。热带假丝酵母可以利用以气相提供的烷烃作为其生长的唯一碳源。通过将滤纸浸泡在合适的烷烃中，并将无碳源的固体生长培养基倒置在该滤纸之上，来提供不同链长的烷烃，在不同的培养皿中提供各种特定的碳源(例如，特定链长的烷烃)。将携带特异性改变的酰基辅酶A氧化酶基因的连续稀释的假丝酵母点印在固体生长培养基上，作为对每种菌株中酰基辅酶A氧化酶的链长特异性的生长选择。图14和图15中显示的是该选择过程的图示，如本文所述，其提供烷烃作为气相碳源。该固体生长培养基是不含氨基酸或任何其他碳源、含有酵母氮基料的琼脂培养基。将接种的细胞倒置于含有用适当链长的烷烃浸泡过的滤纸的盖子之上，该烷烃蒸发并通过气相提供碳源，如图14所示。
如本文所述产生的含有改变的酰基辅酶A氧化酶活性的假丝酵母菌株使用本文所述的方法进行选择和/或筛选。携带不同改变的酰基辅酶A氧化酶活性的菌株(例如，菌株1(S1)、菌株2(S2)、菌株3(S3)、菌株4(S4))在丰富培养基(例如，YPD)中生长过夜。离心并洗涤过夜培养物以去除任何痕量的残留丰富培养基，并在磷酸盐缓冲溶液中制备细胞的连续稀释液。将每种菌株的连续稀释液点印在多种YNB琼脂平板(不含氨基酸或其他碳源的生长培养基)上，将单独的平板倒置于在适当链长的烷烃中浸泡的滤纸之上，并在30℃下孵育平板。菌株的生长依赖于酰基辅酶A氧化酶的链长特异性。为了利用特定的烷烃来生长，所提供的链长必须能够进入β-氧化途径。某种菌株能够生长的最短链长表示酰基辅酶A氧化酶同工酶底物特异性的最短链长。图15提供了一个实例。图15显示菌株S4能够在癸烷上生长，但不能在辛烷上生长。因此，菌株S4的修饰的酰基辅酶A氧化酶活性具有阻止利用8个碳的分子的底物链长特异性，且使用该菌株发酵产生的二酸产物通常导致8个碳的二酸。使用本文所述的方法可以选择和/或筛选具备任何所需特异性的酰基辅酶A氧化酶活性。
可以理解，本文提出的实例是用于描述选择/筛选过程的一般性方法。改变供选择和筛选过程使用的原料以适应正在寻找的酰基辅酶A氧化酶活性。例如，对于对较长链底物具有特异性的酰基辅酶A氧化酶，可以替换为具有较长碳链长度的原料以允许选择和或筛选对较长碳链长度具有特异性的酰基辅酶A氧化酶活性。
实施例10：热带假丝酵母的转化程序
用假丝酵母菌株ATCC20336的单菌落接种5mLYPD起始培养物，并在约200rpm振摇下于30℃孵育过夜。第二天，接种含有0.05％消泡剂B的25mL新鲜YPD培养物至初始OD600nm为0.4，并在约200rpm振摇下于30℃孵育培养物直至OD600nm达到1.0-2.0。通过在4℃下以1,000xg离心10分钟而沉淀细胞。将细胞通过在10mL无菌水中重悬浮进行洗涤，沉淀，在1mL无菌水中重悬浮，并转移至1.5mL微量离心管。然后用1mL无菌TE/LiOAC溶液(pH7.5)洗涤细胞，沉淀，重悬浮在0.25mLTE/LiOAC溶液中，并于30℃振摇孵育30分钟。
在1.5mL试管中将细胞溶液分成50μL等份试样，向其中加入5-8μg线性化的DNA和5μL载体DNA(煮沸并冷却的鲑精DNA，10mg/mL)。加入300μL无菌PEG溶液(40％PEG3500，1XTE，1XLiOAC)，充分混合，并于30℃孵育60分钟，其中每15分钟轻柔混合。加入40μLDMSO，充分混合，并于42℃孵育细胞溶液15分钟。然后通过以1,000xg离心30秒来沉淀细胞，重悬浮在500μLYPD培养基中，并在约200rpm振摇下于30℃孵育2小时。然后通过离心来沉淀细胞，并重悬浮在1mL1XTE中，再次沉淀细胞，重悬浮在0.2mL1XTE中，并接种于选择性培养基上。于30℃孵育平板以便转化体生长。
实施例11：URA3标记的循环利用程序
URA3基因从假丝酵母属酵母培养物ATCC20336的基因组DNA获得。与酿酒酵母相比，假丝酵母菌株ATCC20336具有数量有限的选择性标记，因此，“循环利用”URA3标记以允许利用URA3进行多轮选择。为了再利用URA3标记进行假丝酵母的后续工程化，将具有Ura+表型的单菌落接种至3mLYPD，并于30℃振摇生长过夜。然后通过离心收集过夜培养物，并重悬浮于1mLYNB+YE(6.7g/L酵母氮肉汤，3g/L酵母提取物)中。然后用YNB+YE连续稀释重悬浮的细胞，并将100μL等份试样接种于YPD平板上(于30℃孵育过夜)，以测定原始悬浮液的滴度。此外，将未稀释的悬浮液的100μL等份试样以3种不同的浓度(0.5、0.75、1mg/mL)一式三份接种于SC右旋糖(Bacto琼脂20g/L，尿嘧啶0.3g/L，右旋糖20g/L，酵母氮肉汤6.7g/L，氨基酸去除混合物2.14g/L)和5-FOA上。
在30℃下孵育平板至少5天。将SC右旋糖+5-FOA平板上出现的菌落重悬浮在50μL无菌蒸馏水中，并利用5μL在YPD和SC-URA(不含尿嘧啶的SC右旋糖培养基)平板上划线。然后将仅在YPD上生长而不在SC-URA平板上生长的菌落接种至3mLYPD，并于30℃振摇生长过夜。通过离心收集过夜培养物，并将其重悬浮于1.5mLYNB(6.7g/L酵母氮肉汤)中。用YNB连续稀释重悬浮的细胞，将100μL等份试样接种于YPD平板上，并在30℃下孵育过夜以测定原始滴度。还将各1mL未稀释的细胞悬浮液接种于SC-URA上，于30℃孵育最多7天。SC-URA平板上的菌落是回复体，并使用具有最低回复频率(<10-7)的分离物进行后续菌株工程化。
实施例12：假丝酵母脂肪醇氧化酶(FAO)等位基因的克隆和分析
从假丝酵母分离脂肪醇氧化酶基因
使用为扩增覆盖FAO1序列(FAO1的GenBank登录号为AY538780)的启动子、脂肪醇氧化酶基因(FAO)和终止子的序列区域而生成的引物，通过PCR扩增分离假丝酵母菌株(ATCC20336)脂肪醇氧化酶基因。用于从假丝酵母菌株ATCC20336扩增脂肪醇氧化酶核苷酸序列的引物示于以下表7中。
表7
PCR反应含有25μL2X主混合物、1.5μLoAA0144和oAA0145(10μM)、3.0μL基因组DNA和19μL无菌H2O。所用的热循环参数为98℃2分钟，35个循环的98℃20秒，52℃20秒，72℃1分钟，然后是72℃5分钟和4℃维持。对大小正确的PCR产物进行凝胶纯化，连接至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)中，并转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)。对含有PCR插入物的克隆进行测序以证实正确的DNA序列。从序列分析鉴定出4个FAO等位基因，命名为FAO-13、FAO-17、FAO-18和FAO-20。命名为FAO-18的克隆的序列具有与来自GenBank的FAO1序列基本上相同的序列。4个等位基因的所得质粒分别命名为pAA083、pAA084、pAA059和pAA085。如本文所述分离的FAO基因的序列同一性比较示于下表中。
表4
大肠杆菌中FAO等位基因的表达
为测定FAO对各种碳源的酶活性水平，在大肠杆菌中进一步克隆和过表达四种分离的FAO等位基因。利用上述质粒作为DNA模板，采用本文所述的条件，通过PCR扩增FAO，其中FAO-13和FAO-20的引物是oAA0268和oAA0269，FAO-17和FAO-18的引物是oAA0268和oAA0282。对大小正确的PCR产物进行凝胶纯化，连接到pET11a载体的NdeI与BamHI位点之间，并转化入BL21(DE3)大肠杆菌细胞。通过DNA测序证实含有相应FAO的菌落。还将未修饰的pET11a载体转化入BL21(DE3)细胞作为对照。得到的菌株和质粒分别命名为sAA153(pET11a)、sAA154(含有FAO-13的pAA079)、sAA155(含有FAO-17的pAA080)、sAA156(含有FAO-18的pAA081)和sAA157(含有FAO-20的pAA082)。利用这些菌株和质粒在大肠杆菌中过表达FAO。将每个菌株的一个菌落转移到5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，并于37℃和200rpm下生长过夜。用过夜培养物接种新的培养物，在25ml含有100μg/mL氨苄青霉素的LB中达到OD600nm为0.2。用0.3mMIPTG诱导OD600nm为0.8的细胞3小时，并通过在4℃下以1,050xg离心10分钟进行收集。细胞沉淀物在-20℃下储存。
在假丝酵母菌株中FAO的表达
根据由含有过表达FAO的大肠杆菌可溶性细胞提取物的酶试验确定的底物特异性概况，选择FAO-13和FAO-20这两个等位基因在假丝酵母中扩增。分别利用质粒pAA079和pAA082作为DNA模板，使用引物oAA0421和oAA0422通过PCR扩增含有FAO-13和FAO-20的DNA片段。对大小正确的PCR产物进行凝胶纯化，连接至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)中，转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)中，并对含有FAO插入物的克隆进行测序以证实正确的DNA序列。用SapI消化含有FAO-13和FAO-20的质粒，并将其连接至包含假丝酵母菌株ATCC20336PGK启动子和终止子的载体pAA105。通过限制性消化和DNA测序证实得到的质粒，分别命名为pAA115(FAO-13)和pAA116(FAO-20)。将质粒pAA115和pAA116用SpeI线性化，并转化入感受态假丝酵母Ura-菌株sAA002(SU-2，ATCC20913)和sAA103。使用引物oAA0429和oAA0281，通过菌落PCR证实FAO-13和FAO-20的整合。将得到的菌株命名为sAA278(pAA115整合入菌株sAA002)、sAA280(pAA116整合入sAA002)、sAA282(pAA115整合入sAA103)和sAA284(pAA116整合入sAA103)，并且用于在假丝酵母中的脂肪醇氧化酶过表达。
如本文所述，将各菌株的一个菌落接种到5mLYPD中并生长过夜。利用过夜培养物接种25mL新的YPD培养物直至OD600nm约为0.5。FAO过表达由PGK启动子/终止子调节，用培养基中的葡萄糖诱导，并组成型表达。包括菌株sAA002和sAA103(例如，未转化的起始菌株)作为FAO过表达的阴性对照。通过在4℃下以1,050xg离心10分钟在对数早期收集细胞(OD600nm＝约3到约5)。细胞沉淀物在-20℃下储存。
从大肠杆菌制备细胞提取物
将来自25mL表达FAO的大肠杆菌培养物的细胞沉淀物重悬浮在含有50mM磷酸钾缓冲液(pH7.6)、20％甘油、1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)、2μLBenzonase25U/μL、20μL10mg/mL溶菌酶的10mL磷酸盐-甘油缓冲液中。然后通过利用旋转摇床在室温下孵育50分钟来裂解细胞，并在4℃下以15,000xg离心细胞悬浮液30分钟。将上清液等分到1.5ml微量离心管中，并在-20℃下储存以供FAO酶活性试验。
从假丝酵母制备细胞提取物
将冷冻的热带假丝酵母细胞沉淀物重悬浮在含有50mM磷酸钾缓冲液(pH7.6)、20％甘油、1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)的1.2ml磷酸盐-甘油缓冲液中。在冰上，将重悬浮的细胞转移至含有约500μL氧化锆珠的1.5mL螺旋帽试管中。在冰上采用2分钟脉冲和1分钟静止间隔，用BeadBeater(Biospec)裂解细胞。该过程重复3次。然后将完整的细胞提取物转移至新的1.5ml试管中，并在4℃下以16,000xg离心15分钟。将上清液转移至新试管，用于FAO酶活性试验。
蛋白质浓度测定
按照生产商的推荐，利用BradfordReagent(目录号23238，Thermoscientific)测定细胞提取物中的蛋白质浓度。
FAO酶活性试验
采用Eirich等(2004)的改进方法进行FAO酶活性试验。该试验利用双酶偶联反应(例如，FAO和辣根过氧化物酶(HRP))，并可通过分光光度法监测。使用1-十二烷醇作为脂肪醇氧化酶活性试验的标准底物。FAO将十二烷醇氧化为十二烷醛，同时将分子氧还原为过氧化氢。HRP在双酶偶联反应中还原(2,2′-连氮基-双3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸；ABTS)，其中电子得自将过氧化氢氧化成ABTS，可通过分光光度法在405nm处测量。利用氨基三唑(AT)改进该试验以防止H2O2被内源性过氧化氢酶破坏，因而无需微粒体分级分离。FAO酶试验的最终反应混合物(1.0mL)由以下成分组成：500μL200mMHEPES缓冲液，pH7.6；50μL10mg/mLABTS的去离子水溶液；10μL5mM十二烷醇的丙酮溶液；40μL1MAT和5μL2mg/mL辣根过氧化物酶溶液，在50mM磷酸钾缓冲液，pH7.6中。加入提取物后，通过在室温下测量405nm处的吸光度10分钟来检测反应活性。加入到反应混合物中的提取物的量不同，因而活性落在0.2到1.0ΔA405nm/min的范围内。对于大肠杆菌表达的FAO-13，提取物的实际用量是约1.69U/mg，对于大肠杆菌表达的FAO-17是0.018U/mg，对于大肠杆菌表达的FAO-18(例如，FAO1)是0.35U/mg，对于大肠杆菌表达的FAO-20是0.47U/mg，对于假丝酵母(菌株sAA278)表达的FAO-13是0.036U/mg，对于假丝酵母(菌株sAA282)表达的FAO-13是0.016U/mg，对于假丝酵母(菌株sAA280)表达的FAO-20是0.032U/mg，对于假丝酵母(菌株sAA284)表达的FAO-20是0.029U/mg。FAO活性报告为活性单位/mg总蛋白质(1单位＝氧化的1微摩尔底物/分钟)。对于ABTS使用18.4的405nm消光系数，其等于0.5mM氧化的底物。活性试验的结果示于下表中。
实施例13：假丝酵母穿梭载体pAA061的构建
从pUC19骨架构建载体pAA061，使之携带来自假丝酵母菌株ATCC20336的选择性标记URA3以及允许插入假丝酵母启动子和终止子的修饰。利用以下表8所示的引物oAA0124和oAA0125扩增含有来自热带假丝酵母菌株ATCC20336的URA3的启动子、ORF和终止子的1,507bpDNA片段。用NdeI/MluI消化URA3PCR产物，并连接至用NdeI/BsmBI消化的pUC19的2,505bp片段(用BsmBI产生MluI相容的突出端)。为了用短21bp接头序列替代lac启动子，用SphI/SapI消化得到的质粒，并用通过寡核苷酸oAA0173和oAA0174退火产生的接头补平。将得到的质粒命名为pAA061。
表8
实施例14：假丝酵母PGK启动子和终止子的克隆
从基础载体pAA061构建载体pAA105，使之包含来自热带假丝酵母ATCC20336的磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和终止子区域以及间插多克隆位点(MCS)以供插入开放阅读框(ORF)。利用以下表9所示的引物oAA0347和oAA0348，通过PCR扩增PGK启动子区域。用限制酶PstI/XmaI消化含有PGK启动子的1,029bpDNA片段。利用以下表9所示的引物oAA0351和oAA0352，通过PCR扩增PGK终止子区域。用限制酶XmaI/EcoRI消化含有PGK终止子的396bpDNA片段。将来自pAA061的3,728bpPstI/EcoRIDNA片段用于与PGK启动子和终止子区域的三片连接反应中以产生pAA105。PGK启动子和终止子之间的序列含有限制位点以便引入将要通过功能性连接的组成型PGK启动子控制的ORF。
表9
实施例15：POX4基因座的克隆
对于来自从假丝酵母菌株ATCC20336制备的基因组DNA的YSAPOX4基因座，产生引物oAA0138和oAA0141(表10)以扩增NCBI登录号M12160的完整序列。将2,845bpPCR产物克隆入载体pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)，测序，并命名为pAA052。
表10
实施例16：POX5基因座的克隆
对于来自从假丝酵母菌株ATCC20336制备的基因组DNA的YSAPOX5基因座，产生引物oAA0179和oAA0182(表11)以扩增NCBI登录号M12161的完整序列。将2,624bpPCR产物克隆入载体pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)，测序，并命名为pAA049。
表11
实施例17：含有扩增的CPR和CYP52基因的菌株的构建
构建具有拷贝数增加的细胞色素P450还原酶(CPR)和/或细胞色素P450单加氧酶(CYP52)基因的菌株，以确定CPR和CYP52的过表达如何影响二酸产生。
CPR基因的克隆和整合
利用引入独特SapI和SphI位点的引物oAA0171和oAA0172(表12)，通过PCR扩增编码来自假丝酵母ATCC750的CPR启动子、ORF和终止子的3,019bpDNA片段。用所示限制酶切割扩增的DNA片段，将其连接至质粒pAA061(在实施例13中描述)，以产生质粒pAA067。将质粒pAA06用ClaI线性化，并转化入假丝酵母Ura-菌株sAA103(ura3/ura3，pox4::ura3/pox4::ura3，pox5::ura3/pox5::ura3)。如下所述，单独地以及与携带CYP52A15或CYP52A16基因的质粒组合地使用质粒pAA067进行转化。
CYP52A15基因的克隆和整合
利用引物oAA0175和oAA0178(见以下表12)，通过PCR扩增编码来自假丝酵母ATCC20336的CYP52A15启动子、ORF和终止子的2,842bpDNA片段，并将其克隆入pCR-BluntII-TOPO以供DNA序列验证。通过用XbaI/BamHI进行限制性消化分离克隆的CYP52A15DNA片段(2,742bp)，并将其连接至质粒pAA061(在实施例13中描述)，以产生质粒pAA077。将质粒pAA077用PmlI线性化，并转化入假丝酵母Ura-菌株sAA103(ura3/ura3，pox4::ura3/pox4::ura3，pox5::ura3/pox5::ura3)。pAA077与携带CPR基因的质粒pAA067共转化。
CYP52A16基因的克隆和整合
利用引物oAA0177和oAA0178(表12)，通过PCR扩增编码来自假丝酵母ATCC20336的CYP52A16启动子、ORF和终止子的2,728bpDNA片段，并将其克隆入pCR-BluntII-TOPO以供DNA序列验证。用引入独特SacI/XbaI限制位点的引物oAA0260和oAA0261(表12)扩增克隆的CYP52A16DNA片段。用SacI和XbaI限制酶消化扩增的DNA片段，并连接至质粒pAA061，从而产生质粒pAA078。将质粒pAA078用ClaI线性化，并转化入假丝酵母Ura-菌株sAA103(ura3/ura3，pox4::ura3/pox4::ura3，pox5::ura3/pox5::ura3)。pAA078与携带CPR基因的质粒pAA067共转化。
表12
基因组DNA的制备
从转化体制备基因组DNA以供PCR验证和Sourthern印迹分析。将分离的菌落接种至3mLYPD，并在30℃下振摇生长过夜。通过离心沉淀细胞。向各沉淀物中加入200μL破坏缓冲液(2％TritonX-100，1％SDS，100mMNaCl，10mMTrispH8和1mMEDTA)，将沉淀物重悬浮，并转移至含有200μL0.5mm氧化锆/二氧化硅珠的新鲜试管。向各试管中加入200μL苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，然后涡旋1分钟。向各试管中加入无菌蒸馏水(200μL)，并以13000rpm离心各管10分钟。水层进行乙醇沉淀，用70％乙醇洗涤。干燥后，将沉淀物重悬浮于100-200μl10mMTris中。利用相同的程序，对每个检测的菌落的25mL培养物，进行用于Sourthern印迹分析的基因组DNA制备。
含有扩增的CPR和CYP52基因的菌株的表征
利用引物oAA0252和oAA0256(CPR)、oAA0231和oAA0281(CYP52A15)以及oAA242和oAA0257(CYP52A16)，通过PCR进行整合的基因和序列的验证。用于验证的引物示于表13中。
表13
采用Sourthern印迹分析测定CPR、CYP52A15和CYP52A16基因的拷贝数。利用来自NewEnglandBioLabs的NEBlotPhototope试剂盒(目录号N7550S)，对从表14所示的各基因靶标产生的PCR产物，用基因特异性寡核苷酸制备生物素化的DNA探针。采用标准方法进行Sourthern杂交(例如，Sambrook，J.和Russell，D.W.(2001)MolecularCloning：ALaboratoryManual，(第3版)，pp.6.33-6.64.ColdSpringHarborLaboratoryPress)。采用来自NewEnglandBioLabs的Phototope-Star检测试剂盒(目录号N7020S)进行杂交探针的检测。通过所得条带的光密度分析确定拷贝数。
表14
实施例18：单加氧酶和单加氧酶还原酶活性的添加和/或扩增
细胞色素P450通常催化单加氧酶反应，例如，向有机底物(RH)中插入一个氧原子，而其他的氧原子还原为水。
RH+O2+2H++2e–→ROH+H2O
底物有时是均一的碳链长。具有单加氧酶活性的酶有时识别特定碳链长的底物或相对于均一碳链长的有机底物的碳链长的亚群。在一些实施方案中，新型细胞色素活性(例如，巨大芽孢杆菌BM3)的添加和/或某些或全部内源性或异源性单加氧酶活性(例如，CY52A12多核苷酸、CY52A13多核苷酸、CY52A14多核苷酸、CY52A15多核苷酸、CY52A16多核苷酸、CY52A17多核苷酸、CY52A18多核苷酸、CY52A19多核苷酸、CY52A20多核苷酸、CY52D2多核苷酸、BM3多核苷酸)的扩增可以有助于通过天然的和/或工程化的代谢途径的碳通量的整体提高。在某些实施方案中，添加新型单加氧酶或增大某些或全部内源性或异源性单加氧酶活性可提高特定碳链长的底物或特定碳链长混合物的底物亚群的通量。在一些实施方案中，用于在工程化菌株中扩增的单加氧酶活性的选择与用于工程化菌株生长的原料、所选原料的代谢途径和所需终产物(例如，十二烷二酸)有关。
工程化为利用基于植物的油转化为十二烷二酸的菌株可通过具有一种或多种单加氧酶活性而受益，该活性具有与该油的脂肪酸链长分布相匹配的底物特异性。例如，在椰子油中最普遍的脂肪酸是月桂酸(12个碳的长度)，因此，为利用椰子油的菌株选择的单加氧酶活性可以具有对于C12脂肪酸的底物偏好。对于工程化为利用具有不同脂肪酸链长分布的其他基于植物的油的菌株，可能希望扩增具有匹配的底物偏好的单加氧酶活性。在一些实施方案中，改变单加氧酶活性的遗传修饰提高了一种或多种对具有约12至约24个碳的碳链长度的原料(例如，混合链长烷烃、混合链长脂肪酸、皂脚等及其组合)具有底物偏好的单加氧酶活性。在某些实施方案中，该遗传修饰提高了对具有约10个碳至约16个碳的碳链长度分布的脂肪酸具有偏好的单加氧酶活性。
如先前提到的，实现单加氧酶活性的酶被单加氧酶还原酶还原，从而再生该酶。在一些实施方案中，为在工程化菌株中的扩增选择CPR取决于扩增哪种P450。在一些实施方案中，特定的CPR可以优先与一种或多种单加氧酶活性相互作用，而不与其他单加氧酶很好地相互作用。一种来自假丝酵母菌株ATCC750的单加氧酶还原酶、两种来自假丝酵母菌株ATCC20336的单加氧酶还原酶活性和一种来自巨大芽孢杆菌的单加氧酶还原酶活性正在进行关于增加和/或扩增本文所述单加氧酶的活性的评估。下表提供了用于增加或扩增单加氧酶和单加氧酶还原酶活性的核苷酸序列。
实施例19：所选β氧化活性的扩增
在此描述了扩增POX5β氧化活性的方法。如本文所述，可以使用基本类似的方法扩增不同的β氧化活性，包括非-POX(例如，酰基辅酶A氧化酶)活性和/或具有改变的底物特异性的酰基辅酶A氧化酶活性。
POX5扩增的菌株的构建
质粒pAA166(PPOX4POX5TPOX4)
使用引物oAA540和oAA541从假丝酵母20336基因组DNA扩增含有POX5核苷酸序列的PCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化，并连接至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)，转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)，并对含有PCR插入物的克隆进行测序以证实正确的DNA序列。一种这样的质粒被命名为pAA165。用BspQI消化质粒pAA165，并且分离2-kb片段。含有POX4启动子和POX4终止子的质粒pAA073也用BspQI消化并进行凝胶纯化。将分离的片段连接在一起以产生质粒pAA166。质粒pAA166含有PPOX4POX5TPOX4片段。
质粒pAA204(硫解酶缺失构建体)
使用引物oAA640和oAA641从假丝酵母20336基因组DNA扩增含有短链硫解酶(例如，乙酰辅酶A乙酰转移酶)核苷酸序列的PCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化，并连接至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)，转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)并对含有PCR插入物的克隆进行测序以证实正确的DNA序列。一种这样的质粒被命名为pAA184。使用引物oAA660和oAA661从pAA061扩增URA3PCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化，并连接至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)，如本文所述进行转化并对含有PCR插入物的克隆进行测序以证实正确的DNA序列。一种这样的质粒被命名为pAA192。质粒pAA184用BglII/SalI消化并进行凝胶纯化。用BglII/SalI消化质粒pAA192并且对1.5kb片段进行凝胶纯化。将分离的片段连接在一起以生成pAA199。使用引物oAA684和oAA685从质粒pAA061扩增备选的PURA3PCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化，并连接至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)，如本文所述进行转化并对含有PCR插入物的克隆进行测序。一种这样的质粒被命名为pAA201。质粒pAA199用SalI消化并进行凝胶纯化。用SalI消化质粒pAA201并且对0.43kbPURA3进行凝胶纯化。将分离的片段连接在一起以生成含有PURA3的同向重复的质粒pAA204。
质粒pAA221(硫解酶缺失构建体中的PPOX4POX5TPOX4)
使用引物oAA728和oAA729从质粒pAA166DNA扩增含有PPOX4POX5TPOX4核苷酸序列的PCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化，并连接至pCR-BluntII-TOPO，如本文所述进行转化并对含有PCR插入物的克隆进行测序以证实插入物的序列。一种这样的质粒被命名为pAA220。质粒pAA204用BglII消化，用虾碱性磷酸酶(SAP)处理，且对6.5kb片段进行凝胶纯化。质粒pAA220用BglII消化且对含有PPOX4POX5TPOX4的2.7kb片段进行凝胶纯化。连接所分离的片段以生成质粒pAA221。
菌株sAA617(在sAA451中的PPOX4POX5TPOX4)
菌株sAA451是ura-、部分β-氧化阻断的菌株(ura3/ura3pox4a::ura3/pox4b::ura3POX5/POX5)。用EcoRI消化质粒pAA221以释放硫解酶缺失构建体中含有PPOX4POX5TPOX4的DNA片段。对DNA进行柱纯化并转化至菌株sAA451以在SCD-ura平板上接种。两天后，将菌落在YPD平板上划线，选择单菌落并再次在YPD平板上划线。单菌落选自第二个YPD平板并通过菌落PCR来表征。在菌株sAA451中PPOX4POX5TPOX4的插入(其破坏了短链硫解酶基因)通过PCR来证实，一种这样的菌株被命名为sAA617。
菌株sAA620
菌株sAA617在YPD培养基上生长过夜并接种在SCD+URA+5-FOA上，以针对URA3的环出进行选择。如对于菌株SAA617所述，将菌落在YPD平板上划线两次，并且通过菌落PCR表征单菌落。PURA3的同向重复引起的URA3环出通过PCR来证实。一种这样的菌株被命名为sAA620。菌株sAA620具有在POX4启动子控制下的一个额外的POX5拷贝。
质粒pAA156
使用引物oAA525和oAA526从假丝酵母菌株20336基因组DNA扩增含有CYP52A19核苷酸序列的PCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化，并连接至pCR-BluntII-TOPO，如本文所述进行转化并对含有PCR插入物的克隆进行测序以证实正确的DNA序列。一种这样的质粒被命名为pAA144。用BspQI消化质粒pAA144并分离1.7-kb片段。包含POX4启动子和POX4终止子的质粒pAA073还用BspQI消化并进行凝胶纯化。将分离的片段连接在一起以产生质粒pAA156。质粒pAA156包含PPOX4CYP52A19TPOX4片段和URA3。
菌株sAA496
质粒pAA156用ClaI消化并进行柱纯化。菌株sAA451用此线性化的DNA进行转化并接种在SCD-ura平板上。检查菌落的CYP52A19整合。质粒整合阳性的菌落通过qPCR进一步分析以确定整合的CYP52A19的拷贝数。一种这样的菌株包含约13个拷贝的由CYP52A19编码的单加氧酶活性。
菌株sAA632和sAA635
菌株sAA620用此线性化的pAA156DNA进行转化并接种在SCD-ura平板上。检查几个菌落的CYP52A19整合。质粒整合阳性的菌落通过qPCR进一步分析以确定整合的CYP52A19的拷贝数。一种这样的菌株被命名为sAA632，包含约27个拷贝的由CYP52A19编码的单加氧酶活性。另外一种菌株被命名为sAA635，包含约12个拷贝的由CYP52A19编码的单加氧酶活性。
实施例20：假丝酵母ACH基因的克隆
使用如表15所示的引物oAA1095和oAA1096从假丝酵母菌株20336基因组DNA扩增ACHPCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化，并连接至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)，转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)并对含有PCR插入物的克隆进行测序以证实正确的DNA序列。
多种转化体的序列分析揭示了ACH基因的等位基因序列的存在，其被命名为ACHA和ACHB。产生了一种含有ACHA等位基因的DNA序列的载体并将其命名为pAA310。产生了一种含有ACHB等位基因的DNA序列的载体并将其命名为pAA311。
表15
实施例21：假丝酵母FAT1基因的克隆
使用如以下表16所示的引物oAA1023和oAA1024从假丝酵母20336基因组DNA扩增FAT1PCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化，并连接至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)，转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)并对含有PCR插入物的克隆进行测序以证实正确的DNA序列。含有FAT1基因的DNA序列的载体被命名为pAA296。
表16
引物 序列
oAA1023 GATATTATTCCACCTTCCCTTCATT
oAA1024 CCGTTAAACAAAAATCAGTCTGTAAA
实施例22：假丝酵母ARE1和ARE2基因的克隆
分别使用如以下表17所示的引物oAA2006/oAA2007和oAA1012/oAA1018从假丝酵母20336基因组DNA扩增ARE1和ARE2PCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化，并连接至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)，转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)并对含有PCR插入物的克隆进行测序以证实正确的DNA序列。含有ARE1基因的DNA序列的载体被命名为pAA318。含有ARE2基因的DNA序列的载体被命名为pAA301。
表17
引物 序列
oAA1012 ATGTCCGACGACGAGATAGCAGGAATAGTCAT
oAA1018 TCAGAAGAGTAAATACAACGCACTAACCAAGCT
oAA2006 ATGCTGAAGAGAAAGAGACAACTCGACAAG
oAA2007 GTGGTTATCGGACTCTACATAATGTCAACG
实施例23：为在热带假丝酵母中表达而优化的TESA基因的构建
通过密码子替换，将大肠杆菌TESA基因的基因序列为了在假丝酵母中表达而优化。使用对于天然大肠杆菌TESA基因中的每个密码子具有类似使用频率的来自假丝酵母的密码子，构建新的TESA基因序列(由于假丝酵母使用替代的酵母核遗传密码，避免使用CTG密码子)。优化的TESA基因被合成为具有侧翼BspQI限制位点并提供于载体pIDTSMART-Kan(IntegratedDNATechnologies)中。该载体被命名为pAA287。用BspQI切割质粒pAA287并凝胶纯化555bpDNA片段。还用BspQI切割质粒pAA073并凝胶纯化该线性DNA片段。将这两个DNA片段连接在一起以将优化的TESA基因置于假丝酵母POX4启动子控制之下。得到的质粒被命名为pAA294。
实施例24：假丝酵母DGA1基因的克隆
使用如以下表18所示的引物oAA996和oAA997从假丝酵母20336基因组DNA扩增DGA1PCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化，并连接至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)，转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)并对含有PCR插入物的克隆进行测序以证实正确的DNA序列。含有DGA1基因的DNA序列的载体被命名为pAA299。
表18
引物 序列
oAA996 ATGACTCAGGACTATAAAGACGATAGTCCTACGTCCACTGAGTTG
oAA997 CTATTCTACAATGTTTAATTCAACATCACCGTAGCCAAACCT
实施例25：假丝酵母LRO1基因的克隆
使用如以下表19所示的引物oAA998和oAA999从假丝酵母20336基因组DNA扩增LRO1PCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化，并连接至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)，转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)并对含有PCR插入物的克隆进行测序以证实正确的DNA序列。含有LRO1基因的DNA序列的载体被命名为pAA300。
表19
引物 序列
oAA998 ATGTCGTCTTTAAAGAACAGAAAATC
oAA999 TTATAAATTTATGGCCTCTACTATTTCT
实施例26：假丝酵母ACS1基因的克隆和缺失盒的构建
使用如以下表20所示的引物oAA951和oAA952从假丝酵母20336基因组DNA扩增ACS1PCR产物。对PCR产物进行凝胶纯化，并连接至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)，转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)并对含有PCR插入物的克隆进行测序以证实DNA序列。一种这样的质粒被命名为pAA275。用BamHI消化质粒pAA280以释放2.0kbPURA3URA3TURA3PURA3盒。质粒pAA275用BglII消化并进行凝胶纯化。将这两个小片连接在一起以产生质粒pAA276和pAA282。质粒pAA276和pAA282具有以相反方向插入ACS基因中的PURA3URA3TURA3PURA3盒。
表20
引物 序列
oAA951 CCTACTTCCACAGCTTTAATCTACTATCAT
oAA952 TTTAAGAAAACAACTAAGAGAAGCCAC
实施例27：菌株sAA722(pox4a::ura3/pox4b::ura3POX5/POX5ACS1/acs1::PURA3URA3TURA3PURA3)的构建
质粒pAA276用BamHI/XhoI消化并进行柱纯化。菌株sAA329(ura3/ura3pox4a::ura3/pox4b::ura3POX5/POX5)用线性化的DNA转化并接种在SCD-ura平板上。检查几个菌落的ACS1破坏。一个这样的菌落被命名为sAA772。
实施例28：菌株sAA741(pox4a::ura3/pox4b::ura3POX5/POX5ACS1/acs1::PURA3)的构建
菌株sAA722在YPD培养基上生长过夜并接种在5-FOA平板上。在5-FOA的存在下生长的菌落，针对在ACS1位点仅留下URA3启动子(PURA3)的URA3基因的环出进行PCR筛选。在分析的30个菌落中，只有一个菌株显示正确的遗传修饰。该菌株被命名为sAA741。
实施例29：菌株sAA776(pox4a::ura3/pox4b::ura3POX5/POX5acs1::PURA3URA3TURA3PURA3/acs1::PURA3)的构建
质粒pAA282用BamHI/XhoI消化并进行柱纯化。菌株sAA741(见实施例28)用线性化的DNA转化并接种在SCD-ura平板上。通过插入灭活检查几个菌落的双ACS1敲除。一种这样的菌株被命名为sAA776。
实施例30：菌株sAA779(pox4a::ura3/pox4b::ura3POX5/POX5acs1::PURA3/acs1::PURA3)的构建
菌株sAA776(见实施例29)在YPD培养基上生长过夜并接种在5-FOA平板上。在5-FOA的存在下生长的菌落，针对在两个ACS1拷贝中仅留下URA3启动子(PURA3)的URA3基因的环出进行PCR筛选。一种这样的菌株被命名为sAA779。
实施例31：菌株sAA811(pox4a::ura3/pox4b::ura3POX5/POX5acs1::PURA3/acs1::PURA3ura3::3xPPOX4P450A19)的构建
含有P450A19整合盒的质粒pAA156用ClaI消化并进行柱纯化。菌株sAA779(见实施例30)用线性化的DNA转化并接种在SCD-ura平板上。检查几个菌落的P450A19整合。从这些菌落中，进行qPCR以检查P450A19整合的拷贝数。命名为sAA811的一种菌株含有3个P450A19拷贝。
实施例32：菌株sAA810(pox4a::ura3/pox4b::ura3POX5/POX5acs1::PURA3/acs1::PURA3ura3::5xPPOX4P450A19ura3::8xPPOX4TESA)的构建
含有P450-A19整合盒的质粒pAA156用ClaI消化并进行柱纯化。含有TESA整合盒的质粒pAA294还用ClaI消化并进行柱纯化。菌株sAA779用两个线性化的DNA转化并接种在SCD-ura平板上。检查几个菌落的P450A19整合与TESA整合。TESA和P450A19均阳性的菌落通过qPCR进一步分析。进行qPCR以检查P450A19和TESA整合事件的拷贝数。命名为sAA810的一种菌株包含5个P450A19拷贝和8个TESA拷贝。
实施例33：一般技术与方法(用于实施例34-35)
生长培养基、试剂和条件
YPD、SCD-URA和平板以及含有5-FOA的平板如YeastGenetics:aColdSpringHarborLaboratoryManual/DavidC.Amberg,DanielJ.Burke,JeffreyStrathern,-2005ed.所述制备。
SP92+甘油如下制备：向水中添加6.7g无氨基酸Bacto酵母氮基料(BD,FranklinLakes,NJ,USA)、3.0gBacto酵母提取物(BD,FranklinLakes,NJ,USA)、3.0g硫酸铵、1.0g磷酸二氢钾、1.0g磷酸氢二钾和75g甘油至最终体积为一升。该培养基随后过滤除菌。
TB-低N培养基如下制备：每升水添加1.7g无硫酸铵Bacto酵母氮基料、3gBacto酵母提取物、1g磷酸二氢钾和1g磷酸氢二钾。对该培养基进行过滤除菌。
过夜培养物通常在标准培养管中的2-5mLScD-ura培养基或YPD培养基中在30℃下在约250rpm的摇床上生长。
分子方法
如生产商所推荐的，使用GeneJET凝胶提取试剂盒(FermentasInc,GlenBurnie,MD,USA)或Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(ZymoResearch,Irvine,CA)进行DNA片段的凝胶纯化。
使用PFUUltraIIDNA聚合酶(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)、TaqDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)、DreamTaqPCR主混合物(FermentasInc,GlenBurnie,MD,USA)或QuickLoadMidas混合物(Monserate,SanDiego,California,USA)进行PCR。根据生产商的说明书使用每一种酶。
限制酶消化根据每个生产商的推荐进行(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA或FermentasInc.,GlenBurnie,MD,USA)。DNA连接使用快速连接试剂盒(FermentasInc.,GlenBurnie,MD,USA)或使用T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)根据生产商的说明书进行。
酵母转化如实施例10所述进行。
基因组DNA制备
URA3基因从假丝酵母属酵母培养物ATCC20336的基因组DNA获得。来自假丝酵母菌株ATCC20336的基因组DNA如下制备：离心约1.5mL细胞过夜培养物，并将沉淀物重悬浮在约200μl含有2％TritonX-100、1％SDS、100mMNaCl、10MMTrispH8.0和1mMEDTA的溶液中。约200μl的酸洗玻璃珠与约200μl的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)在pH约8.0下一起添加。将样品涡旋约2分钟，之后添加约200μl水。随后以13000rpm离心样品约10分钟。将水层转移至新的微量离心管并添加等体积的氯仿：异戊醇(24:1)溶液。将该样品涡旋10秒钟，随后以13000rpm离心约2分钟。将水层转移至新的微量离心管，并添加1mL乙醇。然后将试管放置在-80℃下约15分钟，然后以13000rpm离心15分钟以沉淀DNA。用70％乙醇洗涤DNA并风干。然后将DNA重悬浮在约500μl水中。
乳酸克鲁维酵母(ATCC8585)的基因组DNA购自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(Manassas,VA,USA)。
为计算基因拷贝数，如Jin等(Appl.Environ.Microbiol.2003年1月,vol.69,no.1,495-503)所述使用qPCR方法。根据生产商的说明书，使用BrilliantIIIUltra-FastGreenQPCR主混合物(AgilentTechnologies,Englewood,CO,USA)或QuantiTectMultiplexPCRNoROX试剂盒(Qiagen)进行qPCR。来自假丝酵母菌株ATCC20336的基因组DNA或含有来自ATCC20336的肌动蛋白基因和感兴趣的基因的质粒DNA用作标准。
贯穿这些实施例中使用的引物和探针经由IntegratedDNATechnologies(Coralville,IA,USA)的标准DNA合成技术制备。
实施例34：克隆质粒AA073的构建
质粒pAA073被设计为含有来自假丝酵母菌株ATCC20336(该菌株在本文中也被称为菌株sAA001)的POX4启动子和终止子。该质粒衍生自可公开获得的质粒pUC19，其含有氨苄青霉素抗性标记。pAA073被设计为具有两个位于POX4启动子和终止子之间的SapI限制酶位点，其允许与POX4启动子串联的任何感兴趣的基因的单向克隆。包含开放阅读框和内源调节区的假丝酵母菌株ATCC20336URA3基因还作为转化体的选择标记而置于pAA073内。质粒pAA073允许通过用独特的限制酶如SpeI、ClaI或BstZ171消化该质粒而直接整合任何感兴趣的基因的多个拷贝。这些多克隆位点包含在URA3营养缺陷型标记区中并可选择性地用于避免切割感兴趣的基因(即，可搜索感兴趣的基因的DNA序列的特定限制酶切位点，并可以避免那些酶)。此外，该质粒可以用作模板以生成含有在URA3基因的3’和5’区之间插入的POX4调节区和感兴趣的基因的无抗生素DNA盒；可以使用该质粒作为模板来PCR扩增该盒，并且分离的PCR产物可以插入任何微生物菌株内。
pAA073的图谱示于图18中，而pAA073的序列作为SEQIDNO:160示出。
实施例35：从ATCC20336中克隆酰烯辅酶A异构酶(ECI)基因
利用来自酿酒酵母S288c的Eci1(即，Eci)的氨基酸序列(SEQIDNO.3705)鉴定来自假丝酵母属的种ATCCMYA-3404和ATCC20336的同源物。BLAST搜索显示在每个假丝酵母菌株中有两种Eci1p同源物，其已经被命名为Eci1p和Eci2p(表21)。所述同源物的氨基酸同一性百分比如下所示：
表21
氨基酸同一性百分比
用同样引入了独特SapI限制位点的寡核苷酸oAA2835(SEQIDNO.3712)和oAA2836(SEQIDNO.3713)从基因组DNA(ATCC20336)扩增编码SEQIDNO.3708的N-末端241个残基的ECI1基因。对770bpPCR产物进行凝胶纯化并连接到PCR-BluntII-TOPO(LifeTechnologies)中，转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞(LifeTechnologies)，并且对包含PCR插入物的克隆进行测序以确认正确的DNA序列。一种这样的质粒被命名为pAA574(SEQIDNO.3710)。
用同样引入了独特SapI限制位点的寡核苷酸oAA2837(SEQIDNO.3714)和oAA2838(SEQIDNO.3715)从基因组DNA(ATCC20336)扩增编码Eci2p的全长ECI2基因(SEQIDNO.3709)。对851bpPCR产物进行凝胶纯化并连接到PCR-BluntII-TOPO(LifeTechnologies)中，转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞(LifeTechnologies)，并且对包含PCR插入物的克隆进行测序以确认正确的DNA序列。一种这样的质粒被命名为pAA575(SEQIDNO.3711)。
实施例36-菌株sAA1764(ura3/ura3pox4a::ura3/pox4b::ura3POX5/POX5acs1::PURA3/acs1::PURA3fat1-Δ1::PURA3/fat1-Δ2::PURA3eci1-Δ1::URA3/ECI1)的产生
ECI1的第一等位基因的缺失通过用以重叠延伸PCR(OE-PCR)构建的线性DNA盒转化细胞(菌株sAA886(pox4a::ura3/pox4b::ura3POX5/POX5acs1::PURA3/acs1::PURA3fat1-Δ1::PURA3/fat1-Δ2::PURA3ura3/ura3))来实现。针对菌株sAA886中第一ECI1等位基因的缺失盒从三个DNA片段产生。第一个DNA片段(ECI15’同源物)用引物oAA3085(SEQIDNO.3716)和oAA3086(SEQIDNO.3717)从ATCC20336gDNA扩增。第二个DNA片段(PURA3URA3TURA3PURA3)用引物oAA3087(SEQIDNO.3718)和oAA3088(SEQIDNO.3719)从质粒pAA298(图29，和SEQIDNO:3784)扩增。第三个DNA片段(ECI13’同源物)用引物oAA3089(SEQIDNO.3720)和oAA3090(SEQIDNO.3721)从ATCC20336gDNA扩增。所有三个DNA片段用引物oAA3085(SEQIDNO.3716)和oAA3090(SEQIDNO.3721)通过OE-PCR在同一反应中组合以产生全长缺失盒(图19)。
菌株sAA886用所述全长缺失盒转化并接种于SCD-Ura平板上。针对缺失盒在第一ECI1等位基因处的整合，通过PCR筛选几个菌落。一种这样的菌株被命名为sAA1764。
实施例37:菌株sAA1860(ura3/ura3pox4a::ura3/pox4b::ura3POX5/POX5acs1::PURA3/acs1::PURA3fat1-Δ1::PURA3/fat1-Δ2::PURA3eci1-Δ1::PURA3/ECI1)的产生
菌株sAA1764在YPD培养基中生长过夜并且接种到5-FOA平板上。针对在第一ECI1等位基因中仅留下URA3启动子(PURA3)的URA3基因的环出，对在5-FOA的存在下生长的菌落进行PCR筛选。一种这样的菌株被命名为sAA1860。
实施例38：双ECI1敲除菌株(ura3/ura3pox4a::ura3/pox4b::ura3POX5/POX5acs1::PURA3/acs1::PURA3fat1-Δ1::PURA3/fat1-Δ2::PURA3eci1-Δ1::PURA3/eci1-Δ2::URA3)的构建
ECI1的第二等位基因的缺失通过用以重叠延伸PCR(OE-PCR)构建的线性DNA盒转化细胞来实现。针对sAA1860(ura3/ura3pox4a::ura3/pox4b::ura3POX5/POX5acs1::PURA3/acs1::PURA3fat1-Δ1::PURA3/fat1-Δ2::PURA3eci1-Δ1::PURA3/ECI1)中的第二ECI1等位基因的缺失盒从三个DNA片段产生。第一个DNA片段(ECI15’同源物)用引物oAA3212(SEQIDNO.3722)和oAA3213(SEQIDNO.3723)从ATCC20336gDNA扩增。第二个DNA片段(PURA3URA3TURA3PURA3)用引物oAA3214(SEQIDNO.3724)和oAA3215(SEQIDNO.3725)从质粒pAA298(图29，和SEQIDNO:3784)扩增。第三个DNA片段(ECI13’同源物)用引物oAA3216(SEQIDNO.3726)和oAA3217(SEQIDNO.3727)从ATCC20336gDNA扩增。所有三个DNA片段用引物oAA3212(SEQIDNO.3722)和oAA3217(SEQIDNO.3727)通过OE-PCR在同一反应中组合以产生全长缺失盒(图20)。
为产生双ECI1敲除菌株，sAA886用所述全长缺失盒转化并接种于SCD-Ura平板上。针对缺失盒在第二ECI1等位基因处的整合，通过PCR筛选几个菌落。
实施例39-酰基辅酶A氧化酶蛋白质的克隆
将来自一系列生物体的酰基辅酶A氧化酶克隆到大肠杆菌表达载体pET26b(EMD4Biosciences,Darmstadt,Germany)中，该载体包含卡那霉素抗性盒。本文描述了酰基辅酶A氧化酶的来源，用于将酰基辅酶A氧化物编码序列克隆至pET26b中的基因、引物和限制性内切酶的名称，和编码序列。酰基辅酶A氧化物编码序列用由cDNA文库、对应于生物体的公布的cDNA或基因组DNA序列设计的合适的引物通过PCR扩增。在模板来源不可得的情况下，将编码序列合成为gBlocks(IDT)并且通过标准的重叠延伸PCR钉合在一起。然后将PCR产物克隆至pCRII-BluntTOPO载体(LifeSciences)中，并且对产物进行测序以证明它们不含不想要的突变。用合适的限制酶从TOPO载体上释放编码序列，并且将其连接至已用相同的限制酶消化的pET26b中。然后用得到的表达质粒转化RosettaIIBL21细胞(Novagen)。
实施例40-大肠杆菌中酰基辅酶A氧化酶的表达
为了表达酶，使用来自Rosetta细胞的每一转化的菌落开始在37℃下生长的含有抗生素卡那霉素(为了选择pET26b)和氯霉素(为了选择在RosettaII细胞中所见的第二种质粒，该质粒介导在大肠杆菌中表达的真核蛋白质的改善的翻译)的LB的5ml过夜培养。第二天早上，用过夜培养接种30ml包含卡那霉素和氯霉素的LB至OD600读数为0.1。30ml培养物在37℃下生长2小时，然后置于冰上10分钟。为诱导表达，将异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入到培养物中至终浓度为0.1mM。在一些情况下，用NovagenOvernightExpressAutoinductionSystem1(CAT#71300-3)进行诱导。然后将细胞在15℃下振摇过夜以表达酰基辅酶A氧化酶。
实施例41-酰基辅酶A氧化酶活性测定
为检测酰基辅酶A氧化酶的活性，来自过夜诱导的细胞在50ml圆锥管中于4℃以1046xg沉淀。将细胞沉淀物重悬浮于1ml的50mMKPO4,pH7.6、50μMFAD缓冲液中，然后转移至2ml离心管中。用Misonix超声仪3000(QSonica，Newtown，CT)裂解细胞，其在功率设定为2、2个各20秒的脉冲下超声处理。在每个脉冲之间，将裂解物在冰上放置30秒。为获得上清液，将细胞碎片在4℃微型离心机中以16100xg沉淀10分钟。将上清液转移到1.5ml离心管，并且根据生产商的说明对细胞裂解物进行Bradford测定(Thermoscientific)以确定蛋白质浓度作为酰基辅酶A氧化酶测定的准备。该测定使用BeckmanCoulterDTX-800多模检测器分光光度计(BeckmanCoulterDTX-800MultimodeDetectorspectrophotometer)。该分光光度计设置为在30℃下在500nm处读取5分钟。每一反应的体积为200μl并且在50mMKPO4,pH7.6、200μg/mlBSA、0.05％TritonX-100、250μM脂肪酰基辅酶A底物、50μMFAD、10U辣根过氧化物酶、25mM对羟基苯甲酸和1mM4-氨基安替比林中含有10μg的细胞裂解物。脂肪酰基辅酶A底物覆盖从己酰辅酶A(六个碳的链长)到油酰辅酶A(18碳的链长)的范围。
在表22中，无阴影的方格表示该样品没有检测。深阴影表示没有检测到活性。浅阴影表示检测到在小于或等于0.1umol/min/ug(umol底物/分钟/μg总蛋白)检测到最小活性(即，差的活性)。中度阴影表示在>0.1umol/min/ug检测到良好的活性。
表22中的结果表明，几种酶在大肠杆菌中表达时没有功能性。此外，其余的在大肠杆菌中表达时有功能性的酶显示出宽底物特异性，或者其底物特异性与来自假丝酵母菌株ATCC20336的Pox5相似(即，对C6底物没有非常高的活性，对C12底物显示出峰值活性，并从C8一直到C18：1都具有活性)。
表22-异源酰基辅酶A氧化酶的活性
实施例42-假丝酵母Pox4、Pox5和褐家鼠VLCAD的遗传修饰
目标是1)在假丝酵母菌株ATCC20336(分别是Pox4和Pox5)的Pox4和Pox5酰基辅酶A氧化酶中设计突变以改变他们各自的底物特异性，和2)在褐家鼠超长链酰基辅酶A脱氢酶(VLCAD)中设计突变以将其转变为酰基辅酶A氧化酶。当引入到假丝酵母中时，这些突变酶可以介导脂肪酸底物通过β氧化向癸二酸、十二烷二酸或更长链二酸的选择性转化。
Pox4和Pox5的定点诱变-方法
有几种方法用来鉴定决定这些酶的底物特异性的假丝酵母菌株ATCC20336的Pox4和Pox5的区域和/或残基。在大鼠肝脏中，具有可变剪接的第三外显子的单个基因产生两种剪接形式：AcoI(酰基辅酶A氧化酶-I，褐家鼠，RnAcoI)和AcoII(酰基辅酶A氧化酶-II，褐家鼠，RnAcoII)，其氨基酸长度相同而氨基酸序列只在由差异剪接的外显子编码的区域处不同(Miyazawa,S.,Hayashi,H.,Hijikata,M.,Ishii,N.,Furuta,S.,Kagamiyama,H.,Osumi,T.,Hashimoto,T.(1987)CompletenucleotidesequenceofcDNAandpredictedaminoacidsequenceofratacyl-CoAoxidase.J.Biol.Chem.262(17):8138-43.；Osumi,T.,Ishii,N.,Miyazawa,S.,Hashimoto,T.(1987)Isolationandstructuralcharacterizationoftheratacyl-CoAoxidasegene.J.Biol.Chem.262(17):8138-43；Setoyama,C.,Tamaoki,H.,Nishina,Y.,Shiga,K.,Miura,R.(1995)Functionalexpressionoftwoformsofratacyl-CoAoxidaseandtheirsubstratespecificities.Biochem.Biophys.Res.Commun.217(2):482-7)。AcoI和AcoII的一级氨基酸序列的比较显示出由可变剪接外显子导致的残基90至133中的差异(下划线标出的残基，图23)。该剪接事件产生两种表现出不同的底物活性谱的酶：AcoI和AcoII。RnAcoI偏好碳数少的底物(例如，具有8或10个碳的脂肪酸)。RnAcoII偏好更长碳链的底物(例如，14个碳)。RnAcoII的晶体结构已经解析(PDB:1IS2(无底物)；PDB:2DDH(有十二烷酸盐底物))，并且由可变剪接的外显子编码的区域结束于在N-末端α螺旋域和其后的β折叠域之间的边界处，两者都是酰基辅酶A氧化酶特有的结构特征(酰基辅酶A脱氢酶(ACAD)超家族，NCBI保守域登录号cl0993)，并且已经被鉴定为可以决定底物特异性的区域。
为证实酰基辅酶A氧化酶的该区域在决定底物特异性中发挥作用，采用HotSpotWizard算法(Pavelka,A.,Chovancova,E.,Damborsky,J.HotSpotWizard:aWebServerforIdentificationofHotSpotsinProteinEngineering,NucleicAcidsResearch37:W376-W383,2009.http://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/)。HotSpotWizard是一种鉴定用于底物特异性或活性工程化的蛋白质区域的程序。该程序利用来自众多数据库如PDB、UniProt和NCBI的结构、功能和序列同源性数据，以鉴别是诱变“热点”的区域和/或残基。该搜索依赖于与感兴趣的酶晶体结构对应的PDB文件。对于Pox4或Pox5，没有这样的结构是可用的。因此，这两种蛋白质的结构是通过用褐家鼠AcoII的晶体结构作为模板(PDB:1IS2)建模而确定的。使用SWISS-MODEL程序产生这些模型(ArnoldK.,BordoliL.,KoppJ.和SchwedeT.(2006).TheSWISS-MODELWorkspace:Aweb-basedenvironmentforproteinstructurehomologymodeling.Bioinformatics,22,195-201；KieferF,ArnoldK,KünzliM,BordoliL,SchwedeT(2009)TheSWISS-MODELRepositoryandassociatedresources.NucleicAcidsResearch.37,D387-D392.Peitsch,M.C.(1995)ProteinmodelingbyE-mailBio/Technology13:658-660；http://swissmodel.expasy.org/)。得到的模型，其为PDB文件，作为“查询结构”输入HotSpotWizard中。HotSpotWizard分析的结果总结在图24A、24B和25中。以灰色突出显示的残基是提示的诱变“热点”。深灰色阴影表示的残基比浅灰色阴影表示的残基有更大的变异性。加粗显示的残基在底物结合袋内或附近被发现。
比对所有三种酶以显示同源区(图26)。在图26中，浅灰色阴影表示所有三种酶之间的同一性。更深的灰色阴影表示三种酶之间的部分同一性或同源性(例如，深灰色阴影可以表示比对中的三种蛋白质中的两种的同一性)。在一些情况下，深灰色阴影表示序列相似性(即，残基因为它们是酸性的、碱性的、极性或非极性的而是相似的)。下划线标出的区域(图23和图26)表示AcoII的可变剪接外显子。
利用分子建模比对鉴别在底物结合袋内或附近发现的Pox4和Pox5中的残基(加粗显示的残基，图24A和24B)。如从其晶体结构所确定的AcoII与其底物十二烷酸盐复合的分子结构(PDB:2DDH)与预测的Pox4和Pox5分子模型进行比对。位于N-末端环和α螺旋D的第一部分(表23)中的残基出现在底物入口/出口通道的表面和内衬处。在Pox4中这些残基对应于序列IDTFNK(来自假丝酵母菌株ATCC20336的Pox4的氨基酸95-100)和PDQQAQ(来自假丝酵母菌株ATCC20336的Pox5的氨基酸80-85)。根据HotSpotWizard，这整个序列是类别9，这意味着高度可变。
表23-N-末端环和α螺旋D的第一部分
蛋白质 序列 残基
1IS2(ACOII) ISDPEE 79-84
ACOI ISDPEE 79-84
Pox4 IDTFNK 95-100
Pox5 PDQQAQ 80-85
位于α螺旋D和E’之间的环中的残基形成底物结合袋的一部分。这些残基都未被鉴定为12碳底物的接触残基，但可以是更长底物的接触残基。这种四个氨基酸的区段位于ACO-Ⅰ和ACO-Ⅱ的不同外显子剪接位点内。在Pox4和Pox5中，这些氨基酸中的三个是高度保守的(表24)。第四个氨基酸是不同的(在Pox4中为113G，而在Pox5中为F98)。该区域中的四个氨基酸中，差异的残基最接近底物，并且该残基的氨基酸特性在Pox4和Pox5之间截然不同。由于这个原因，该残基是特别引人关注的。另外，根据HotSpot，该残基是高度可变的。
表24-α螺旋D和E’之间的环
蛋白质 序列 残基
1IS2(ACOII) RGHP 94-97
ACOI ANFV 94-97
Pox4 PQVG 110-113
Pox5 PQVF 95-98
残基D101是在RnACOII的2DDH晶体结构中底物碳6至碳9的接触残基。这个残基位于作为底物结合袋的一部分的α螺旋E’的起始处。由于这是接触残基并且位于ACO-I和ACO-II之间不同的序列的小区域中，Pox4和Pox5中的对应的氨基酸(表25)是引人关注的。这个残基是引人关注的，因为它在碳6-9处接触底物，并且ACO-II相比于ACO-I对链长6-12的底物具有更低的活性。如果Pox4或Pox5在该位置处被修饰为天门冬氨酸，则可以预期，对己二酸的活性将会降低并且导致更大二酸的产率的增加。这个残基的HotSpot得分为6。
表25-与底物碳6-9接触的残基
蛋白质 序列 残基
1IS2(ACOII) D 101
ACOI G 101
Pox4 G 117
Pox5 G 102
残基F284是在RnACOII的2DDH晶体结构中底物碳10至12的接触残基。这个残基在RnAcoI与RnAcoII之间是保守的。Pox4和Pox5中对应的氨基酸(表26)是非常少的在Pox4和Pox5之间不同的底物接触残基中的一个。ACOI、ACOII和Pox4酶在这个位置全部具有大的疏水残基，而Pox5酶具有小的极性残基。这个残基的HotSpot得分为9。
表26-与底物碳10-12接触的残基
蛋白质 序列 残基
1IS2(ACOII) F 284
ACOI F 284
Pox4 M 302
Pox5 T 287
位于α螺旋L的C-末端的环在Pox5中比在Pox4或ACO-I/ACO-II中小得多(表27)。这个环似乎显示出结构柔性并且可以提示底物袋的结构和底物结合袋的“吞吐”量。在这个区域中的残基在HotSpot分析中各不相同，然而，正好在Pox5中该区域的下游的残基是高度可变的(如下所示)。
表27-α螺旋L和位于α螺旋L的C-末端的环
在α螺旋L和M之间的环在Pox4和Pox5之间似乎不是可变的(表28)，尽管HotSpot分析给该残基段打出了具有高度可变性的9分。可以预期，该环，包括以上提到的之前的部分，是诱变的靶标。
表28-α-螺旋L和M之间的环
蛋白质 序列 残基
1IS2(ACOII) VWPTMV 470-475
ACOI VWPTMV 470-475
Pox4 VLNTVA 506-511
Pox5 VLSSVA 464-469
对于Pox4和Pox5两者，HotSpotWizard分析与分子建模比对相结合，确定了在相同接近区域中的残基是诱变的良好靶标。多重序列比对显示，AcoII的可变剪接外显子与所有三种酰基辅酶A氧化酶中的热点残基重叠(图26)。
表29中显示了由其氨基酸残基的二级结构和位置所指示的RnACoII中的一些另外的区域，并且也示出了解脂耶氏酵母的POX5、POX4和Aco2、Aco3和Aco5中对应的区域。
表29
用以改变底物特异性的假丝酵母Pox4和Pox5的定点诱变-方法
用HotSpotWizard和分子建模结果为指导，通过将热点区域中的主要极性或带电荷的残基转变为丙氨酸而突变Pox4和Pox5中的特定氨基酸。以下表30A和30B显示了已完成和测试的假丝酵母菌株ATCC20336Pox5和Pox4突变的总结。与表30A和30B中的一些突变体相关的酰基辅酶A活性谱的总结显示在图27(Pox5)和图28(Pox4)中。所测试的每个底物的碳数在图27和图28中每一柱条的下面显示。Pox5突变体I(表30A中灰色突出显示的)由“基于ACAD的诱变”产生(见下面的讨论)。
表30A
Pox5
表30B
Pox4
将来自假丝酵母ATCC20336的Pox4和Pox5克隆到pET26b中以供在大肠杆菌中表达并且在体外测定酰基辅酶A氧化酶活性。比较了遗传修饰的Pox4和Pox5的活性谱与野生型酶的活性谱。为改变其底物活性谱，在Pox4和Pox5的几个位置上进行了定点诱变。使用编码点突变的互补引物扩增Pox4或Pox5的编码序列，产生两至四种PCR产物，然后将产物“钉合”在一起以使用重叠延伸PCR再生整个编码区(图22)。如图22所示，重叠延伸PCR使用引物A、B、C和D进行。引物B和C是互补的并包含引入的遗传修饰(例如，突变)。使用寡核苷酸A和B进行PCR以产生与使用寡核苷酸C和D产生的产物具有重叠的产物。使用A-B产物作为C-D产物的引物用于重叠延伸，反之亦然。几种诱变引物对，例如，B-C引物对，用于在“钉合”在一起的不同位置(即A-B、C-D、E-F等)处产生突变，以产生完整的、全长编码区。为产生更多包含突变的终产物，进行了使用A引物和最3’反向引物的PCR。引物A和D用于扩增Pox4和Pox5的整个编码区并用于引入限制酶切位点(RE1和RE2)以供克隆到大肠杆菌表达载体中。用于Pox5(假丝酵母菌株ATCC20336)定点诱变的引物在表31至40中列出。用于Pox4(假丝酵母菌株ATCC20336)定点诱变的引物在表41至47中列出。
表31-Pox5(假丝酵母菌株ATCC20336)
表32-Pox5(假丝酵母菌株ATCC20336)
表33-Pox5(假丝酵母菌株ATCC20336)
表34-Pox5(假丝酵母菌株ATCC20336)
表35-Pox5(假丝酵母菌株ATCC20336)
表36-Pox5(假丝酵母菌株ATCC20336)
表37-Pox5(假丝酵母菌株ATCC20336)
*突变体CT1产生更小的片段，该片段用于替换克隆到pET26b中的野生型Pox5的XbaI和BamHI位点之间的序列。
表38-Pox5(假丝酵母菌株ATCC20336)
表39-Pox5(假丝酵母菌株ATCC20336)
表40-Pox5(假丝酵母菌株ATCC20336)
表41-Pox4(假丝酵母菌株ATCC20336)
表42-Pox4(假丝酵母菌株ATCC20336)
表43-Pox4(假丝酵母菌株ATCC20336)
表44-Pox4(假丝酵母菌株ATCC20336)
表45-Pox4(假丝酵母菌株ATCC20336)
表46-Pox4(假丝酵母菌株ATCC20336)
表47-Pox4(假丝酵母菌株ATCC20336)
体外酰基辅酶A氧化酶测定
如实施例41所述检测了大肠杆菌裂解物的酰基辅酶A氧化酶活性。
Pox4突变体的体外活性测定
表48显示了与Pox4突变体相关的酰基辅酶A氧化酶活性谱，表49表48显示了与Pox5突变体相关的酰基辅酶A氧化酶活性谱。所测底物的碳链长度在数据上面显示，如C6(6个碳)、C8(8个碳)、C10(10个碳)、C12(12个碳)、C14(14个碳)、C16(16个碳)和C18.1(18个碳)。在表48和49中，无阴影的方格表示该样品没有检测。深阴影表示没有检测到活性。浅阴影表示在小于或等于0.1umol/min/ug(umol底物/分钟/μg总蛋白)检测到最小活性(即差的活性)。中度阴影表示在>0.1umol/min/ug检测到良好的活性。
Pox4突变体C，尽管在所有测试的底物上均显示良好的活性，但对所有底物显示出降低的总活性(表48)。Pox4突变体D显示了类似的结果。对C12和C18：1底物的活性在Pox4突变体B、A、E和G(表48)和CT3(未示出)中消除。
表48-Pox4突变体的体外活性测定
*表示在克隆假丝酵母菌株ATCC20336POX5的PCR期间发生的二次突变(l692S)。
Pox5突变体的体外活性测定-结果
酰基辅酶A氧化酶活性在Pox5突变体B、C、F和M中至少对底物C6、C12和C18:1消除(表49)。突变体CT1和CT2也没有活性(未示出)。突变体A、E和I相比于野生型蛋白质的活性没有显示出改变。但是，Pox5突变体D、H、G和J相比于野生型Pox5展示出改变的底物特异性。Pox5突变体D、H和J对C6和/C8底物显示出降低的活性。Pox5突变体G对C18:1底物展示出提高的活性。
表49-Pox5突变体的体外活性测定
基于酰基辅酶A脱氢酶的诱变
酰基辅酶A氧化酶和酰基辅酶A脱氢酶(ACAD)均利用相似但不同的机制来催化酰基辅酶A底物的脱氢反应以产生2-反式-烯酰辅酶A——β-氧化中的第一步(Arent,S.,Pye,V.E.,Henriksen,A.(2008).StructureandfunctionofplantacylCoAoxidases.PlantPhys.Biochem.46:292-301)。存在不同类型的酰基辅酶A脱氢酶，并且它们根据其底物特异性分组为：超长、长、中等和短链(分别是VLCAD、LCAD、MCAD、SCAD)(Kim,J.J.,Miura,R.(2004).Acyl-CoAdehydrogenasesandacylCoAoxidases.Structuralbasisformechanisticsimilaritiesanddifferences.Eur.J.Biochem.,271(3):483-93.)。这些酶中的几种的晶体结构已经解析，并且这些数据显示出结构差异，这些差异非常可能造成其各自底物特异性的差异。VLCAD(PDB:3B96)的晶体结构已经显示了该蛋白质的区域和氨基酸残基，使其在结构上，更确切地在功能上，不同于MCAD(PDB:3MDE)(McAndrew,R.P.,Wang,Y.,Mohsen,A.W.,He,M.,Vockley,J.,Kim,J.J.(2008)。在一些情况下，更显著的差异是催化性残基的位置。在MCAD中，催化性的谷氨酸位于连接螺旋J和K的环上的位置376处，而在LCAD中，该催化性谷氨酸位于相邻的螺旋G上的位置255处(Nandy,A.,Kieweg,V.,F.G.,Vock,P.,Küchler,B.,Bross,P.,Kim,J.J.,Rasched,I.,Ghisla,S.(1996).Medium-long-chainchimerichumanAcyl-CoAdehydrogenase:medium-chainenzymewiththeactivecenterbasearrangementoflong-chainAcyl-CoAdehydrogenase.Biochemistry,35(38):12402-11；Lee,H.J.,Wang,M.,Paschke,R.,Nandy,A.,Ghisla,S.,Kim,J.J.(1996).CrystalstructuresofthewildtypeandtheGlu376Gly/Thr255Glumutantofhumanmedium-chainacyl-CoAdehydrogenase:influenceofthelocationofthecatalyticbaseonsubstratespecificity.Biochemistry,35(38):12412-20)。
VLCAD(PDB:3B96)的晶体结构也已经显示了该蛋白质的区域和氨基酸残基，使其在结构上，更确切地在功能上，不同于MCAD(PDB:3MDE)(McAndrew等,2008)。VLCAD大于其他酰基辅酶A脱氢酶蛋白质并且形成二聚体，像典型的酰基辅酶A氧化酶。它的底物结合腔与其他酰基辅酶A脱氢酶蛋白质相比更大，并且与酰基辅酶A氧化酶底物结合袋类似。这种更大且更宽敞的袋是容纳其作用于的更长脂肪酰基辅酶A底物所需的。然而，大鼠AcoII和拟南芥ACX1(PDBID:1W07)的晶体结构也显示了大的底物结合袋，并且该特征不一定解释每一种酶的底物特异性(Arent等,2008)。MCAD与VLCAD之间的结构差异提供了一些见解。在MCAD底物结合袋的基部，有两个极性/带电荷的残基(Q95和E99)与VLCAD中类似的残基(G175和G178)不同。VLCAD底物结合袋的基部的疏水性增加可能是除袋大小和深度之外的另一种对底物特异性有贡献的因素。在假丝酵母菌株ATCC20336Pox5中对应的残基是F98和G102。突变体P(F98G)是应该能更接近地重复VLCAD底物结合袋的基部的突变。
MCAD中的双突变(例如，E376G、T255E)可改变其底物特异性谱。该双突变一定程度上产生嵌合酶(MLCAD)(Nandy等,1996)。MCAD具有宽底物谱(C4-C18)，在C6和C8时具有峰值活性。LCAD具有类似地宽谱，在C10和C12时具有峰值活性。MLCAD相比于MCAD或LCAD具有更明确的底物谱(C10-C18)，在C12时具有峰值活性。然而，MLCAD的总酶活性也降低(MLCAD对C12底物的Vmax是LCAD对C12底物的Vmax的大约25％)。
部分基于上述研究的结果，Pox5如表30中描述的(突变体I)进行突变以改变其底物谱来优先地作用于更长链的底物。
VLCAD诱变
VLCAD具有适合产生更长链二酸如癸二酸或十二烷二酸的底物谱。酶活性的范围为10个碳至22个碳长的酰基底物，且对C16底物具有峰值活性。然而，VLCAD的酶促机制在最终电子受体上不同于典型的酰基辅酶A氧化酶；在VLCAD中，所述酶被电子转移铁蛋白(ETF)再氧化，而AOXs被氧再氧化以产生过氧化氢(Arent等,2008；Kim和Miura，2004)。为适应机制的不同，酰基辅酶A氧化酶(诸如拟南芥ACX1)的底物结合袋比VLCAD的更宽敞，以允许氧进入袋中充当最终电子受体并再氧化黄素腺嘌呤二核苷酸或酰基辅酶A底物脱氢所需的辅因子FAD。ETF在典型的acad中发挥此作用且在底物结合时由氧再氧化FAD受到抑制(Kumar,N.R.,Srivastava,D.K.(1995).Facileandrestrictedpathwaysforthedissociationofoctenoyl-CoAfromthemedium-chainfattyacyl-CoAdehydrogenase(MCAD)-FADH2-octenoyl-CoAcharge-transfercomplex:energeticsandmechanismofsuppressionoftheenzyme'soxidaseactivity.Biochemistry,34(29):9434-43)。这反映在相对于FAD的底物结合袋的形状上。在酰基辅酶A氧化酶中，FAD更易于暴露于溶剂，但在MCAD中，整个黄素环被埋设在蛋白质中且仅当底物不存在时是溶剂可及的(Kim和Miura，2004)。为了使acad具有氧化酶活性，底物结合袋必须变得更加溶剂可及且允许由氧氧化减少的FAD辅因子。MCAD的诱变研究已鉴别了能够获得此结果的残基。MCAD中的酪氨酸375，当改变为赖氨酸时，赋予了显著提高的(相对于野生型MCAD提高约200倍)酰基辅酶A氧化酶活性(Zeng,J.,Liu,Y.,Wu,L.,Li,D.(2007).MutationofTyr375toLys375allowsmedium-chainacyl-CoAdehydrogenasetoacquireacylCoAoxidaseactivity.Biochim.Biophys.Acta,1774(12):1628-34)。
分子建模提示，该突变增加了在活性位点中接近FAD部分的溶剂可及性。为了使VLCAD充当具有适当底物特异性谱的酰基辅酶A氧化酶，在VLCAD中进行类似的突变。在MCAD中的酪氨酸375对应于在人类和大鼠VLCAD中的苯丙氨酸461。测试VLCAD中的F461K突变，以观察其现在是否具有酰基辅酶A氧化酶活性。
实施例43：菌株sAA2220的产生
使用引物oAA3091和oAA3092从菌株sAA1764基因组DNA扩增编码ECI1第二等位基因的DNA片段。将PCR产物进行凝胶纯化，并连接至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)中，转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)，并对含有PCR插入物的克隆进行测定以证实正确的DNA序列。一种这样的质粒被命名为pAA756。
在sAA1860中的第二ECI1等位基因的缺失通过基于PCR的巢式策略创建。第二ECI1缺失盒使用引物oAA3212和oAA3217从三个小片进行PCR扩增。第一个小片(ECI1_N_Nested2)使用引物oAA3212和oAA3213从pAA756扩增。第二个小片(具有同向重复的URA3盒)使用引物oAA3214和oAA3215从质粒pAA298扩增。第三个小片(ECI1_C_Nested2)使用引物oAA3216和oAA3217从pAA756扩增。
菌株sAA1860用如上所述的第二ECI1缺失盒转化并接种在SCD-ura平板上。检查若干菌落的双ECI1缺失。一种这样的阳性菌株被命名为sAA2220。
表50-引物列表
引物 序列
oAA3085 ATCGTTACCACCATCCCTACAAT
oAA3086 CCGAAACAACCGTAGATACCTTTAAGCTACAACACTATACACGATAATTCCC
oAA3087 GGGAATTATCGTGTATAGTGTTGTAGCTTAAAGGTATCTACGGTTGTTTCGG
oAA3088 CTTGGACATTTCGACCTTGGCGGTACCGAGCTCTGCGAATT
oAA3089 AATTCGCAGAGCTCGGTACCGCCAAGGTCGAAATGTCCAAG
oAA3090 GCTTGTTCTGCAAAATGGAGTCA
oAA3091 AGGAAAGACGACCATCTTGTACAA
oAA3092 TGGTCTCTGGACAACTTCAACAAT
oAA3212 GGGGGAGATCGTTACCACCA
oAA3213 AATTCGCAGAGCTCGGTACCGCTGCTGCTGCTGCTGTTTT
oAA3214 AAAACAGCAGCAGCAGCAGCGGTACCGAGCTCTGCGAATT
oAA3215 TTCGTTGTTGGCTCTCTCCATTAAAGGTATCTACGGTTGTTTCGG
oAA3216 CCGAAACAACCGTAGATACCTTTAATGGAGAGAGCCAACAACGAA
oAA3217 CAAAGGCATCGGTCAACTCC
实施例44：sAA875和sAA2220的摇瓶表征
在含有25mLSP92培养基的250mL玻璃、无挡板烧瓶中接种5mL过夜YPD培养物(初始OD＝0.4)，并在30℃和300rpm振摇(2”投式温箱)下孵育24h。对细胞进行离心并将细胞沉淀物重悬浮于12.5mLTB-低N培养基(无氨基酸和无硫酸铵的酵母氮基料，1.7g/L；酵母提取物，3.0g/L；磷酸二氢钾，1.0g/L；磷酸氢二钾，1.0g/L)中，并转移至250mL玻璃底部带挡板的烧瓶中。添加0.281mL油酸或亚油酸以启动己二酸生产并将培养物在30℃和300rpm振摇下孵育。48小时后采样用于气相色谱(GC)分析。下面显示了用菌株sAA875(ECI1+ECI2+)和sAA2220(eci1-ECI2+)从油酸和亚油酸产生的二酸谱。在亚油酸的情况下，合并所有不饱和二酸产物，无论是具有一个还是两个双键，并且作为单不饱和产物列出。结果示于以下的表51和表52中；“g/L”指每升发酵液的所示二酸的克数。
表51
表52
实施例45：菌株sAA2428和sAA1269的构建
sAA1269的构建
假丝酵母属菌株sAA988在YPD中生长过夜并接种在5-FOA平板上。在5-FOA的存在下生长的菌落，针对只留下URA3终止子的URA3基因的环出进行PCR筛选。一种这样的菌株被命名为sAA1269。
菌株sAA2428的构建
通过从起始菌株sAA886的基因组中敲除POX5的两个等位基因，构建假丝酵母属菌株SAA2428。通过用敲除质粒构建体pAA918转化该菌株，删除这两个POX5等位基因。
敲除质粒构建体pAA918：使用寡核苷酸oAA2656/oAA2657和来自ATCC20336的基因组DNA扩增假丝酵母POX5基因的5’侧翼区的大约600bp。对该片段进行凝胶纯化，并克隆到PCRBluntIITOPO载体中以创建质粒pAA494。使用ATCC20336的基因组DNA，用引物oAA2658/oAA2659扩增POX5基因的3'侧翼区的大约500bp，并该片段克隆到PCRBluntIITOPO载体中，以创建质粒pAA495。将pAA494的EcoRI/BamHI消化片段、pAA495的HindIII/BamHI片段和pUC19的HindIII/EcoRI片段连接在一起以构建质粒pAA496。随后，将含有侧翼为NotI限制位点的URA3终止子-URA3启动子-URA3编码序列-URA3终止子的DNA片段克隆到pAA496的NotI位点以创建POX5敲除构建体质粒pAA918(图32)。
表53-引物列表
实施例46：菌株sAA2291的产生
假丝酵母属菌株sAA886用pAA918的PacI消化的片段转化并接种在SCD-ura平板上。针对第一POX5等位基因中的缺失盒的整合，通过PCR筛选若干菌落。阳性菌落被命名为sAA2291。
实施例47：菌株sAA2310的产生
菌株sAA2291在YPD培养基中生长过夜并接种在5-FOA平板上。在5-FOA的存在下生长的菌落，针对在第一POX5等位基因中仅留下URA3终止子(TURA3)的URA3基因的环出进行PCR筛选。该菌株被命名为sAA2310。
实施例48：菌株sAA2399的产生
通过用pAA918的PacI消化片段转化sAA2310来实现第二POX5等位基因的缺失，并接种在SCD-Ura平板上。在SCD-Ura平板上生长的菌落针对在第二POX5等位基因中的敲除盒的整合进行PCR筛选。阳性菌落被命名为sAA2399。
实施例49：菌株sAA2428的产生
菌株sAA2399在YPD培养基中生长过夜，并接种在5-FOA平板上。在5-FOA的存在下生长的菌落，针对在第二POX5等位基因中仅留下URA3终止子(TURA3)的URA3基因的环出进行PCR筛选。该菌株被命名为sAA2428。
实施例50：菌株sAA1269或sAA2428中ATCC20336POX4和POX5突变体的构建
ATCC20336POX4和POX5的突变体以前已经构建，以用于在大肠杆菌中表达(如上所述)。为了检测这些突变体当在从ATCC20336衍生的菌株中表达时的活性，通过PCR对其进行克隆并插入载体pAA073或pAA335中。
pAA335载体如下生成。分别使用寡核苷酸oAA2164和oAA2138或oAA2135和oAA2136，从获自假丝酵母属菌株ATCC20336的基因组DNA经PCR扩增PEX11的启动子和终止子。这两个小片用Pst1和SmaI或NdeI和SmaI消化并连接到pAA61的Pst1和NdeI位点，以形成pAA335。
如果基因被克隆到pAA073或pAA335中，那么其分别在POX4或PEX11启动子的调节下。寡核苷酸oAA540和oAA541用于扩增用于无缝克隆到pAA073中的POX5序列。寡核苷酸oAA540和oAA541用于扩增用于无缝克隆到pAA073中的POX5序列。寡核苷酸oAA2984和oAA2985用于扩增用于无缝克隆到pAA335中的POX5序列。寡核苷酸oAA3452和oAA3453用于扩增用于无缝克隆到pAA335中的POX4序列。野生型POX4的编码序列从ATCC20336的基因组DNA扩增。除了T287A，全部POX5突变体转化入sAA2428。用于POX5T287A突变体的构建转化入sAA1269中以产生菌株sAA2058。野生型POX4构建体转化到sAA2428中以产生菌株sAA2778-2780，而突变POX4D96A构建体转化到sAA1269中以产生菌株sAA2109。全部PCR扩增均按照生产商的说明使用PfuUltraIIDNA聚合酶(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)进行。通过在SCD-ura平板上的生长来选择克隆，且随后测试在含有0.1％Tween80与0.1％油酸的基本培养基上的生长。在含有Tween80和油酸的培养基上生长良好的克隆在摇瓶发酵中进行测试。在POX5的T287A突变体和POX4的D96A突变体的情况下，待测试的克隆通过qPCR进行鉴定，以确定有多少突变基因的拷贝已整合。根据生产商的说明使用BrilliantIIIUltra-FastSYBRGreenqPCR主混合物(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)进行qPCR。寡核苷酸oAA2718和oAA2719用于扩增肌动蛋白基因的一部分，而寡核苷酸oAA3515和oAA3516用于扩增PEX11启动子的一部分，作为定量基因拷贝数的方法。下面的表格显示了用于上述克隆程序和qPCR的寡核苷酸序列和通过转化从构建体的整合产生的菌株。
表54-克隆引物列表
表55-qPCR引物列表
引物 引物序列(5'-3') 限制位点
oAA2718 AGAAGCTTTGTTCAGACCAGCCGA n/a
oAA2719 ACCACCGGACATGACAATGTTACC n/a
oAA3515 GCAGAGTTAAGCCCGAGAAAGCAA n/a
oAA3516 TTGCCTTCCTCTATTCGGCTACCA n/a
表56-POX5突变体
突变体 位置 天然氨基酸 引入的突变 引物组合 产生的菌株
O 88 S A oAA540,541 sAA2645
I 284,436 G,E E,G oAA540,541 sAA2646
K 292 S A oAA540,541 sAA2648
E 95,96 P,Q A,A oAA540,541 sAA2651
P 98 F G oAA540,541 sAA2570
G 287 T A oAA2984,2985 sAA2058
表57-POX4突变体
突变体 位置 天然氨基酸 引入的突变 引物组合 产生的菌株
C 96 D A oAA3452,3453 sAA2109
实施例51：解脂耶氏酵母Pox2、Pox3和Pox5的诱变靶位点
基于褐家鼠AcoII(PDBID：1IS2A)的晶体结构，从MODBASE(ModBase:比较蛋白质结构模型数据库(DatabaseofComparativeProteinStructureModels)-http://modbase.compbio.ucsf.edu/modbase-cgi/index.cgi)获得解脂耶氏酵母Pox2、Pox3和Pox5的结构模型，并用于这些酶的HotSpotWizard分析(HotspotWizard-loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/)。解脂耶氏酵母Pox2、Pox3和Pox5的结构模型的MODBASE识别号(以及其UniProtKB识别号)示于以下表58中：
表58
所有三种解脂耶氏酵母酶中含有类似于在ATCC20336的POX4和POX5中发现的那些诱变“热点”。下面的表59基于如上所示的多重序列比对显示了ATCC20336的POX4和POX5的热点和解脂耶氏酵母Pox2、Pox3和Pox5中相应的残基。在表59中鉴定的一个或多个位置处的氨基酸可用非天然氨基酸置换，以用于修饰底物特异性的目的。
表59
实施例52：ATCC20336POX4和POX5突变体的功能分析
POX5中的“热点”残基和POX4中的一个残基的功能分析通过主要替换在这些位置处的丙氨酸或甘氨酸以测试他们是否改变酶的活性或底物特异性而进行。(G284E、E436G)突变体是基于之前描述的ACAD诱变研究。将得到的突变体克隆到pAA073或pAA335中并且整合到sAA2428中。这些克隆在48或72小时周期中如下在油酸的摇瓶发酵中测试。待测菌株的起始培养物(5mL)在SP92甘油培养基(6.7g/LDifco酵母氮基料、3.0g/LDifco酵母提取物、3.0g/L硫酸铵、1.0g/L磷酸二氢钾、1.0g/L磷酸氢二钾、75g/L甘油)中生长，在30℃、250rpm下孵育过夜，并用于接种25mL新鲜的SP92甘油培养基至初始OD600nm为0.4，并且在30℃、300rpm下孵育大约18小时。然后通过在4,000xg、4℃下离心10分钟沉淀细胞，之后重悬浮在12.5mL的TB-低N培养基(1.7g/L无氨基酸和硫酸铵的Difco酵母氮基料、3.0g/LDifco酵母提取物、1.0g/L磷酸二氢钾、1.0g/L磷酸氢二钾)中。加入油酸(562μl)以启动二酸生产。以下的表60显示了从这些发酵生产的所得的二酸：
表60
*结果来自单独的48小时发酵。
表61–一些本文提到的菌株的说明
菌株 遗传修饰
sAA496 pox4Δ,CPR750,P450A19
sAA617 pox4Δ,CPR750,acoataΔ/ACOATB,POX5
sAA620 pox4Δ,CPR750,acoataΔ/ACOATB,POX5,ura3
sAA632 pox4Δ,CPR750,acoataΔ/ACOATB,P450A19
sAA635 pox4Δ,CPR750,acoataΔ/ACOATB,P450A19
sAA722 pox4Δ,acs1Δ/ACS1
sAA741 pox4Δ,acs1Δ/ACS1,ura3
sAA776 pox4Δ,acs1Δ
sAA779 pox4Δ,acs1Δ,ura3
sAA811 pox4Δ,acs1Δ,P450A19
sAA810 pox4Δ,acs1Δ,P450A19,EcTESA
sAA865 pox4Δ,acs1Δ,fat1Δ/FAT1
sAA869 pox4Δ,acs1Δ,fat1Δ/FAT1,ura3
sAA875 pox4Δ,acs1Δ,fat1Δ
sAA886 pox4Δ,acs1Δ,fat1Δ,ura3
sAA1764 pox4Δ,acs1Δ,fat1Δ,eci1Δ/ECI1
sAA1860 pox4Δ,acs1Δ,fat1Δ,eci1Δ/ECI1,ura3
sAA2058 pox4Δ,pox5Δ,acs1Δ,fat1Δ,POX5(T287A)
sAA2109 pox4Δ,pox5Δ,acs1Δ,fat1Δ,POX4(D96A)
sAA2220 pox4Δ,acs1Δ,fat1Δ,eci1Δ
sAA2291 pox4Δ,pox5Δ/POX5,acs1Δ,fat1Δ
sAA2310 pox4Δ,pox5Δ/POX5,acs1Δ,fat1Δ,ura3
sAA2399 pox4Δ,pox5Δ,acs1Δ,fat1Δ
sAA2428 pox4Δ,pox5Δ,acs1Δ,fat1Δ,ura3
sAA2570 pox4Δ,pox5Δ,acs1Δ,fat1Δ,POX5(F98G)
sAA2645 pox4Δ,pox5Δ,acs1Δ,fat1Δ,POX5(S88A)
sAA2646 pox4Δ,pox5Δ,acs1Δ,fat1Δ,POX5(G284E)
sAA2648 pox4Δ,pox5Δ,acs1Δ,fat1Δ,POX5(S292A)
sAA2651 pox4Δ,pox5Δ,acs1Δ,fat1Δ,POX5(P95A,Q96A)
**sAA2780 pox4Δ,pox5Δ,acs1Δ,fat1Δ,POX4
注：小写和/或有Δ符号的基因表示缺失的基因。菌株sAA617、sAA620和sAA632包含“acoat”的一个等位基因的缺失并且对于acoat基因敲除是杂合的(例如，乙酰乙酰辅酶A硫解酶-/+)。
**菌株sAA2780包含内源POX4基因的缺失(即pox4Δ)并在PEX11启动子的控制下重新引入野生型POX4基因(即，POX4)。
实施例53：用于本文描述的操作的核苷酸和氨基酸序列
实施例54：另外的核苷酸和氨基酸序列
实施例55：某些非限制性实施方案的实例
下面列出了本发明技术的某些实施方案的非限制性实例。
A1.一种遗传修饰的酵母，其包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽或活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽，该酵母能够从包含一种或多种来自植物油的组分的原料生产二酸。
A2.实施方案A1的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的假丝酵母属酵母。
A2.1.实施方案A2的遗传修饰的酵母，其中所述假丝酵母属酵母选自热带假丝酵母和维斯假丝酵母。
A2.2.实施方案A1的遗传修饰的酵母，其中所述假丝酵母属酵母是遗传修饰的ATCC20336酵母。
A2.3.实施方案A2到A2.2中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽是POX4多肽。
A2.4.实施方案A2.3的遗传修饰的酵母，其中所述POX4多肽包含SEQIDNO:30的修饰的氨基酸序列。
A2.5.实施方案A2.3或A2.4的遗传修饰的酵母，其中所述POX4多肽在一个或多个选自下组的氨基酸位置处包含氨基酸修饰：88、90、96、98、99、100、102、103、302、309、310、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504和505。
A2.6.实施方案A2到A2.2中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽是POX5多肽。
A2.7.实施方案A2.6的遗传修饰的酵母，其中所述POX5多肽包含SEQIDNO:32的修饰的氨基酸序列。
A2.8.实施方案A2.6或A2.7的遗传修饰的酵母，其中所述POX5多肽在一个或多个选自下组的氨基酸位置处包含氨基酸修饰：81、82、83、84、85、86、88、93、94、95、96、98、102、284、287、290、291、292、294、295、428、429、436、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462和463。
A2.9.实施方案A2到A2.2中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A脱氢酶多肽选自ACAD、VLCAD、LCAD、MCAD和SCAD多肽。
A2.10.实施方案A2.9的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A脱氢酶多肽包含SEQIDNO:3685的修饰的氨基酸序列。
A2.11.实施方案A2.9或2.10的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A脱氢酶多肽在VLCAD位置461处包含氨基酸修饰。
A2.12.实施方案2.5、2.8和2.11中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述氨基酸修饰中的至少一个是氨基酸置换。
A2.13.实施方案A2.12的遗传修饰的酵母，其中所述一种或多种氨基酸置换中的至少一个是保守的。
A2.14.实施方案A2.12的遗传修饰的酵母，其中所述一种或多种氨基酸置换中的至少一个不是保守的。
A3.实施方案A1的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的耶氏酵母属酵母。
A3.1.实施方案A3.1的遗传修饰的酵母，其中所述耶氏酵母属酵母是解脂耶氏酵母。
A3.2.实施方案A3或A3.1的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽选自POX1多肽、POX2多肽、POX3多肽、POX4多肽、POX5多肽或POX6多肽。
A3.3.实施方案A3.2的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽选自SEQIDNO:3778至3783。
A4.实施方案A1的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的毕赤酵母属酵母。
A4.1.实施方案A4.1的遗传修饰的酵母，其中所述毕赤酵母属酵母选自巴斯德毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、克鲁弗毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、P.heedii和亚膜毕赤酵母。
A5.实施方案A1的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的酵母属酵母。
A5.1.实施方案A5.1的遗传修饰的酵母，其中所述酵母属酵母选自酿酒酵母、贝酵母、巴斯德酵母和卡尔酵母。
A6.实施方案A1的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的克鲁维酵母属酵母。
A6.1.实施方案A6.1的遗传修饰的酵母，其中所述克鲁维酵母属酵母选自乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母。
A7.实施方案A1到A6.1中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在N-末端环中包含氨基酸修饰。
A8.实施方案A1到A7中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Dα螺旋中包含氨基酸修饰。
A9.实施方案A1到A8中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Dα螺旋与E’α螺旋之间的环中包含的氨基酸修饰。
A10.实施方案A1到A9中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽包含对与原料组分中碳6到9有效接触的氨基酸的氨基酸修饰。
A11.实施方案A1到A10中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽包含对与原料组分中碳10到12有效接触的氨基酸的氨基酸修饰。
A12.实施方案A1到A11中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Lα螺旋中包含氨基酸修饰。
A13.实施方案A1到A12中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在位于Lα螺旋的C-末端的环中包含氨基酸修饰。
A14.实施方案A1到A13中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Lα螺旋与Mα螺旋之间的环中包含氨基酸修饰。
A15.实施方案A7到A14中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述氨基酸修饰包含氨基酸置换。
A16.实施方案A15的遗传修饰的酵母，其中所述氨基酸置换是保守的。
A17.实施方案A15的遗传修饰的酵母，其中所述氨基酸置换不是保守的。
A17.1.一种遗传修饰的酵母，其包含(i)活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽或活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽和(ii)改变烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰，其中所述酵母能够从包含一种或多种来自植物油的组分的原料生产二酸。
A18.实施方案A1到A17.1中任一项的遗传修饰的酵母，其包含降低烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰。
A18.1.实施方案A18的遗传修饰的酵母，其包含以下部分的破坏、缺失或敲除：(i)编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸或(ii)可操作地连接至编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸的启动子，由此所述烯酰辅酶A异构酶活性降低或去除。
A19.实施方案A18.1的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸。
A19.1.实施方案A1到A19中任一项的遗传修饰的酵母，其包含提高烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰。
A19.2.实施方案A19.1的遗传修饰的酵母，其包含(i)拷贝数增加的编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸或(ii)插入并可操作地连接至编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸的启动子。
A20.实施方案A18.1、A18.2和A19.2中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶多肽是对所述酵母为天然的多肽。
A20.1.实施方案A17.1到A20中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述酵母中一种或多种或全部烯酰辅酶A异构酶多肽类型的活性得到改变。
A20.2.实施方案A20.1的遗传修饰的酵母，其中所述酵母包含两种烯酰辅酶A异构酶多肽类型，并且所述多肽类型中的一种或两种得到改变。
A21.实施方案A17.1到A20中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶活性由假丝酵母属酵母中存在的多肽提供。
A22.实施方案A17.1到A21中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶活性由包含SEQIDNO:3675、3677、3800、3802、3803或3805的氨基酸序列的多肽提供。
A22.1.实施方案A17.1到A21中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是耶氏酵母属酵母。
A22.2.实施方案A22.1的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是解脂耶氏酵母。
A22.3.实施方案A22.2中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶活性由耶氏酵母属酵母或解脂耶氏酵母中存在的多肽提供。
A22.4.实施方案A22.2的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶活性由包含SEQIDNO:3804或3806的氨基酸序列的多肽提供。
A23.实施方案A1到A22.4中任一项的遗传修饰的酵母，其包含降低酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽的细胞质活性的遗传修饰。
A24.实施方案A1到A23中任一项的遗传修饰的酵母，其包含降低酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽的过氧化物酶体活性的遗传修饰。
A25.实施方案A23或A24的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽的多核苷酸。
A26.实施方案A25的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏ACS1多肽或ACS2多肽。
A27.实施方案A23到A26中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码长链酰基辅酶A合成酶多肽的多核苷酸。
A28.实施方案A27的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏FAT1多肽。
A29.实施方案A23到A28中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽是对所述酵母为天然的多肽。
A30.实施方案A29的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是假丝酵母属酵母。
A31.实施方案A30的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽包含选自SEQIDNO:80、82、84、158和159的氨基酸序列。
A32.实施方案A30的遗传修饰的酵母，其中所述FAT1多肽包含SEQIDNO:90的氨基酸序列。
A33.实施方案A1到A32中任一项的遗传修饰的酵母，其包含降低PXA多肽活性的遗传修饰。
A34.实施方案A33的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码所述PXA多肽的多核苷酸。
A35.实施方案A33或A34的遗传修饰的酵母，其中所述PXA多肽是PXA1或PXA2多肽，或PXA1多肽和PXA2多肽。
A36.实施方案A33到A35中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述PXA多肽对所述酵母是天然的。
A37.实施方案A36的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是假丝酵母属酵母。
A38.实施方案A37的遗传修饰的酵母，其中所述PXA1多肽包含SEQIDNO:92的氨基酸序列。
A39.实施方案A37的遗传修饰的酵母，其中所述PXA2多肽包含SEQIDNO:94的氨基酸序列。
A40.实施方案A1到A39中任一项的遗传修饰的酵母，其包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽，且不包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽。
A41.实施方案A1到A39中任一项的遗传修饰的酵母，其不包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽，且包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽。
A42.一种生产二酸的方法，其包括：
(1)使实施方案A1到A41中任一项的遗传修饰的酵母与原料接触，该原料包含一种或多种来自含有至少一种能够被所述酵母转化为二酸的不饱和植物脂肪酸的原料的组分；
(2)在从所述原料生产所述二酸的条件下培养所述酵母；并且
(3)使所述二酸氢化以去除碳链中的任何不饱和性。
A43.A42的方法，其中所述不饱和植物脂肪酸是亚油酸或亚麻酸。
A44.A43的方法，其中所述二酸是十二烷二酸或癸二酸。
B1.一种遗传修饰的酵母，其包含异源酰基辅酶A氧化酶多肽或异源酰基辅酶A脱氢酶多肽，该酵母能够从包含一种或多种来自植物油的组分的原料生产二酸。
B2.实施方案B1的遗传修饰的酵母，其中所述异源酰基辅酶A氧化酶多肽是天然的多肽。
B3.实施方案B1的遗传修饰的酵母，其中所述异源酰基辅酶A氧化酶多肽是活性的、修饰的多肽。
B4.实施方案B1的遗传修饰的酵母，其中所述异源酰基辅酶A脱氢酶多肽是天然的多肽。
B5.实施方案B1的遗传修饰的酵母，其中所述异源酰基辅酶A脱氢酶多肽是活性的、修饰的多肽。
B6.实施方案B1或B2的遗传修饰的酵母，其中所述异源酰基辅酶A氧化酶多肽选自具有SEQIDNO:51至SEQIDNO:3673所示的氨基酸序列的多肽。
B7.实施方案B1或B4的遗传修饰的酵母，其中所述异源酰基辅酶A脱氢酶多肽选自：SEQIDNO:3679至3683、3686、3689、3691、3693、3695、3697、3699、3701和3703。
B8.实施方案B1到B7中任一项的遗传修饰的酵母，其选自假丝酵母属酵母、耶氏酵母属酵母、毕赤酵母属酵母、酵母属酵母和克鲁维酵母属酵母。
B9.实施方案B8的遗传修饰的酵母，其选自热带假丝酵母、维斯假丝酵母、解脂耶氏酵母、巴斯德毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、克鲁弗毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、P.heedii、亚膜毕赤酵母、酿酒酵母、贝酵母、巴斯德酵母、卡尔酵母、乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母。
B10.实施方案B1到B9中任一项的遗传修饰的酵母，其包含降低烯酰辅酶A异构酶多肽活性的遗传修饰。
B11.实施方案B10的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码所述烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸。
B12.实施方案B10或B11的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶多肽是对所述酵母为天然的多肽。
B13.实施方案B12的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是假丝酵母属酵母。
B14.实施方案B13的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶多肽包含SEQIDNO:3675或3677的氨基酸序列。
B15.实施方案B1到B14中任一项的遗传修饰的酵母，其包含降低酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽的细胞质活性的遗传修饰。
B16.实施方案B1到B15中任一项的遗传修饰的酵母，其包含降低酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽的过氧化物酶体活性的遗传修饰。
B17.实施方案B15或B16的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码所述酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽的多核苷酸。
B18.实施方案B17的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏ACS1多肽或ACS2多肽。
B19.实施方案B15到B18中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码长链酰基辅酶A合成酶多肽的多核苷酸。
B20.实施方案B19的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏FAT1多肽。
B21.实施方案B15到B20中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽是对所述酵母为天然的多肽。
B22.实施方案B21的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是假丝酵母属酵母。
B23.实施方案B22的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽包含选自SEQIDNO:80、82、84、158和159的氨基酸序列。
B24.实施方案B21的遗传修饰的酵母，其中所述FAT1多肽包含SEQIDNO:90的氨基酸序列。
B25.实施方案B1到B24中任一项的遗传修饰的酵母，其包含降低PXA多肽活性的遗传修饰。
B26.实施方案B25的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码所述PXA多肽的多核苷酸。
B27.实施方案B25或B26的遗传修饰的酵母，其中所述PXA多肽是PXA1或PXA2多肽，或PXA1多肽和PXA2多肽。
B28.实施方案B25到B27中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述PXA多肽对所述酵母是天然的。
B29.实施方案B28的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是假丝酵母属酵母。
B30.实施方案B29的遗传修饰的酵母，其中所述PXA1多肽包含SEQIDNO:92的氨基酸序列。
B31.实施方案B29的遗传修饰的酵母，其中所述PXA2多肽包含SEQIDNO:94的氨基酸序列。
B32.实施方案B1到B31中任一项的遗传修饰的酵母，其包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽且不包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽。
B33.实施方案B1到B31中任一项的遗传修饰的酵母，其不包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽且包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽。
C1.实施方案A1到A41和B1到B31中任一项的遗传修饰的酵母，其包含一种或多种降低一种或多种天然的内源酰基辅酶A氧化酶多肽活性的遗传修饰。
C2.实施方案C1的遗传修饰的酵母，其包含降低所有天然的内源酰基辅酶A氧化酶多肽活性的遗传修饰。
C3.实施方案C1或C2的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰部分地阻断β氧化活性。
C4.实施方案A1到A41、B1到B33和C1到C3中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述二酸是C4到C24二酸。
C5.实施方案C4的遗传修饰的酵母，其中所述二酸是C10、C12、C14、C16、C18或C20二酸。
C6.实施方案C5的遗传修饰的酵母，其中所述二酸是C10二酸。
C7.实施方案C5的遗传修饰的酵母，其中所述二酸是C12二酸。
C8.实施方案C5的遗传修饰的酵母，其中所述二酸是C18二酸。
C9.实施方案C4到C8中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述二酸不包含不饱和性。
C10.实施方案C4到C8中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述二酸包含一个或多个不饱和性。
C10.1.实施方案C4到C10中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述二酸是二酸混合物中的主要二酸。
C11.实施方案A1到A41、B1到B33和C1到C10.1中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述原料包含基本上纯的油。
C12.实施方案A1到A41、B1到B33和C1到C10中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述原料包含多种脂肪酸。
C13.实施方案C12的遗传修饰的酵母，其中所述原料包含皂脚。
C14.实施方案C12的遗传修饰的酵母，其中所述原料包含脂肪酸馏出物。
C15.实施方案A1到A41、B1到B33和C1到C14中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述植物油来自选自棕榈、棕榈仁、椰子、大豆、红花、油菜、棕榈、棕榈仁或其组合的植物。
D1.一种生产二酸的方法，其包括：
使实施方案1到A41、B1到B33和C1到C15中任一项的遗传修饰的酵母与原料接触，该原料包含一种或多种来自能够被酵母转化为二酸的植物油的组分；并且
在从所述原料生产所需二酸的条件下培养所述酵母。
D2.实施方案D1的方法，其中所述二酸是C4到C24二酸。
D3.实施方案D2的方法，其中所述二酸是C10、C12、C14、C16、C18或C20二酸。
D4.实施方案D3的方法，其中所述二酸是C10二酸。
D5.实施方案D3的方法，其中所述二酸是C12二酸。
D6.实施方案D3的方法，其中所述二酸是C18二酸。
D7.实施方案D1到D6中任一项的方法，其中所述二酸不包含不饱和性。
D8.实施方案D1到D6中任一项的方法，其中所述二酸包含一个或多个不饱和性。
D8.1.实施方案D2到D8中任一项的方法，其中所述二酸是二酸混合物中的主要二酸。
D9.实施方案D1到D8.1中任一项的方法，其中所述原料包含基本上纯的油。
D10.实施方案D1到D8中任一项的方法，其中所述原料包含多种脂肪酸。
D11.实施方案D10的方法，其中所述原料包含皂脚。
D12.实施方案D10的方法，其中所述原料包含脂肪酸馏出物。
D13.实施方案D1到D12中任一项的方法，其中所述植物油来自选自棕榈、棕榈仁、椰子、大豆、红花、油菜、棕榈、棕榈仁或其组合的植物。
E1.一种分离的核酸，其包含编码来自酵母的修饰的酰基辅酶A氧化酶多肽的多核苷酸。
E2.实施方案E1的分离的核酸，其中所述修饰的酰基辅酶A氧化酶多肽在N-末端环中包含氨基酸修饰。
E3.实施方案E1的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Dα螺旋中包含氨基酸修饰。
E4.实施方案E1的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Dα螺旋与E’α螺旋之间的环中包含氨基酸修饰。
E5.实施方案E1的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽包含对与原料组分中碳6到9有效接触的氨基酸的氨基酸修饰。
E6.实施方案E1的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽包含对与原料组分中碳10到12有效接触的氨基酸的氨基酸修饰。
E7.实施方案E1的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Lα螺旋中包含氨基酸修饰。
E8.实施方案E1的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在位于Lα螺旋的C-末端的环中包含氨基酸修饰。
E9.实施方案E1的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Lα螺旋与Mα螺旋之间的环中包含氨基酸修饰。
E10.实施方案E2到E9中任一项的分离的核酸，其中所述氨基酸修饰包含氨基酸置换。
E11.实施方案E10的分离的核酸，其中所述氨基酸置换是保守的。
E12.实施方案E10的分离的核酸，其中所述氨基酸置换不是保守的。
E13.实施方案E1到E12中任一项的分离的核酸，其中所述酵母选自假丝酵母属酵母、耶氏酵母属酵母、毕赤酵母属酵母、酵母属酵母和克鲁维酵母属酵母。
E14.实施方案E13的分离的核酸，其中所述酵母选自热带假丝酵母、维斯假丝酵母、解脂耶氏酵母、巴斯德毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、克鲁弗毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、P.heedii、亚膜毕赤酵母、酿酒酵母、贝酵母、巴斯德酵母、卡尔酵母、乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母。
E15.实施方案E13的分离的核酸，其中所述酵母是假丝酵母属酵母。
E16.实施方案E15的分离的核酸，其中所述酵母选自热带假丝酵母和维斯假丝酵母。
E17.实施方案E16的分离的核酸，其中所述酵母是遗传修饰的ATCC20336酵母。
E18.实施方案E15到E17中任一项的分离的核酸，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽是POX4多肽。
E19.实施方案E18的分离的核酸，其中所述POX4多肽包含SEQIDNO:30的修饰的氨基酸序列。
E20.实施方案E18或E19的分离的核酸，其中所述POX4多肽在一个或多个选自下组的氨基酸位置处包含氨基酸修饰：88、90、96、98、99、100、102、103、302、309、310、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504和505。
E21.实施方案E15到E17中任一项的分离的核酸，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽是POX5多肽。
E22.实施方案E21的分离的核酸，其中所述POX5多肽包含SEQIDNO:32的修饰的氨基酸序列。
E23.实施方案E21或E22的分离的核酸，其中所述POX5多肽在一个或多个选自下组的氨基酸位置处包含氨基酸修饰：81、82、83、84、85、86、88、93、94、95、96、98、102、284、287、290、291、292、294、295、428、429、436、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462和463。
E24.实施方案E20或E23的分离的核酸，其中所述氨基酸修饰中的至少一个是氨基酸置换。
E25.实施方案E24的分离的核酸，其中所述氨基酸置换中的至少一个是保守的。
E26.实施方案E24的分离的核酸，其中所述氨基酸置换中的至少一个不是保守的。
F1.实施方案E1到E26中任一项的分离的核酸，其为表达载体。
F2.一种细胞，其包含实施方案E1到F1中任一项的核酸。
F3.实施方案F2的细胞，其为细菌。
F4.实施方案F2的细胞，其为酵母。
F5.实施方案F4的细胞，其为假丝酵母属酵母。
F6.实施方案F5的细胞，其中所述假丝酵母属酵母选自热带假丝酵母和维斯假丝酵母。
F7.实施方案F6的细胞，其中所述假丝酵母属酵母是遗传修饰的ATCC20336酵母。
F8.实施方案F4的细胞，其选自耶氏酵母属酵母、毕赤酵母属酵母、酵母属酵母和克鲁维酵母属酵母。
F9.实施方案F8的细胞，其选自解脂耶氏酵母、巴斯德毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、克鲁弗毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、P.heedii、亚膜毕赤酵母、酿酒酵母、贝酵母、巴斯德酵母、卡尔酵母、乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母。
G1.一种遗传修饰的酵母，其包含(i)活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽或活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽；(ii)改变烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰；和(iii)改变二烯酰辅酶A还原酶(DCR)活性的遗传修饰，其中所述酵母能够从包含一种或多种来自植物油的组分的原料生产二酸。
G2.实施方案G1的遗传修饰的酵母，其中所述原料包含至少一种长链不饱和脂肪酸。
G3.实施方案G2的遗传修饰的酵母，其中所述长链不饱和脂肪酸是亚油酸或亚麻酸。
G4.实施方案G1到G3中任一项的遗传修饰的酵母，其包含降低烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰。
G5.实施方案G4的遗传修饰的酵母，其包含以下部分的破坏、缺失或敲除：(i)编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸或(ii)可操作地连接至编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸的启动子，由此所述烯酰辅酶A异构酶活性降低或去除。
G6.实施方案G5的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸。
G7.实施方案G1到G6中任一项的遗传修饰的酵母，其包含提高烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰。
G8.实施方案G7的遗传修饰的酵母，其包含(i)拷贝数增加的编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸或(ii)插入并可操作地连接至编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸的启动子。
G9.实施方案G5、G6和G8中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶多肽是对酵母为天然的多肽。
G10.实施方案G1到G9中任一项的遗传修饰的酵母，其中在所述酵母中一种或多种或全部烯酰辅酶A异构酶多肽类型的活性得到改变。
G11.实施方案G10的遗传修饰的酵母，其中该酵母包含两种烯酰辅酶A异构酶多肽类型，并且所述多肽类型中的一种或两种得到改变。
G12.实施方案G1到G11中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶活性由假丝酵母属酵母中存在的多肽提供。
G13.实施方案G1到G12中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶活性由包含SEQIDNO:3675、3677、3800、3802、3803或3805的氨基酸序列的多肽提供。
G14.实施方案G1到G11中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶活性由耶氏酵母属酵母中存在的多肽提供。
G15.实施方案G14的遗传修饰的酵母，其中所述耶氏酵母属酵母是解脂耶氏酵母。
G16.实施方案G1到G15中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶活性由包含SEQIDNO:3804或3806的氨基酸序列的多肽提供。
G17.实施方案G1到G16中任一项的遗传修饰的酵母，其包含降低二烯酰辅酶A还原酶活性的遗传修饰。
G18.实施方案G17的遗传修饰的酵母，其包含以下部分的破坏、缺失或敲除：(i)编码二烯酰辅酶A还原酶多肽的多核苷酸或(ii)可操作地连接至编码二烯酰辅酶A还原酶多肽的多核苷酸的启动子，由此所述二烯酰辅酶A还原酶活性降低或去除。
G19.实施方案G18的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码二烯酰辅酶A还原酶多肽的多核苷酸。
G20.实施方案G1到G19中任一项的遗传修饰的酵母，其包含提高二烯酰辅酶A还原酶活性的遗传修饰。
G21.实施方案G20的遗传修饰的酵母，其包含(i)拷贝数增加的编码二烯酰辅酶A还原酶多肽的多核苷酸或(ii)插入并可操作地连接至编码二烯酰辅酶A还原酶多肽的多核苷酸的启动子。
G22.实施方案G18、G19和G21中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述二烯酰辅酶A还原酶多肽是对酵母为天然的多肽。
G23.实施方案G1到G22中任一项的遗传修饰的酵母，其中在所述酵母中一种或多种或全部二烯酰辅酶A还原酶多肽类型的活性得到改变。
G24.实施方案G23的遗传修饰的酵母，其中该酵母包含两种二烯酰辅酶A还原酶多肽类型，并且所述多肽类型中的一种或两种得到改变。
G25.实施方案G1到G24中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述二烯酰辅酶A还原酶活性由假丝酵母属酵母中存在的多肽提供。
G26.实施方案G1到G25中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述二烯酰辅酶A还原酶活性由包含SEQIDNO:3789、3791、3792或3793的氨基酸序列的多肽提供。
G27.实施方案G1到G26中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述二烯酰辅酶A还原酶活性由耶氏酵母属酵母中存在的多肽提供。
G28.实施方案G27的遗传修饰的酵母，其中所述耶氏酵母属酵母是解脂耶氏酵母。
G29.实施方案G1到G28中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述二烯酰辅酶A还原酶活性由包含SEQIDNO:3794或3795的氨基酸序列的多肽提供。
G30.实施方案G1到G29中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的假丝酵母属酵母。
G31.实施方案G30的遗传修饰的酵母，其中所述假丝酵母属酵母选自热带假丝酵母和维斯假丝酵母。
G32.实施方案G30的遗传修饰的酵母，其中所述假丝酵母属酵母是遗传修饰的ATCC20336酵母。
G33.实施方案G30到G32中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽是POX4多肽。
G34.实施方案G33的遗传修饰的酵母，其中所述POX4多肽包含SEQIDNO:30的修饰的氨基酸序列。
G35.实施方案G33或G34的遗传修饰的酵母，其中所述POX4多肽在一个或多个选自下组的氨基酸位置处包含氨基酸修饰：88、90、96、98、99、100、102、103、302、309、310、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504和505。
G36.实施方案G30到G35中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽是POX5多肽。
G37.实施方案G36的遗传修饰的酵母，其中所述POX5多肽包含SEQIDNO:32的修饰的氨基酸序列。
G38.实施方案G36或G37的遗传修饰的酵母，其中所述POX5多肽在一个或多个选自下组的氨基酸位置处包含氨基酸修饰：81、82、83、84、85、86、88、93、94、95、96、98、102、284、287、290、291、292、294、295、428、429、436、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462和463。
G39.实施方案G1到G38中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A脱氢酶多肽选自ACAD、VLCAD、LCAD、MCAD和SCAD多肽。
G40.实施方案G39的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A脱氢酶多肽包含SEQIDNO:3685的修饰的氨基酸序列。
G41.实施方案G39或G40的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A脱氢酶多肽在VLCAD位置461处包含氨基酸修饰。
G42.实施方案G35、G38和G41中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述氨基酸修饰中的至少一个是氨基酸置换。
G43.实施方案G42的遗传修饰的酵母，其中一种或多种氨基酸置换中的至少一个是保守的。
G44.实施方案G42的遗传修饰的酵母，其中一种或多种氨基酸置换中的至少一个不是保守的。
G45.实施方案G1到G29中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的耶氏酵母属酵母。
G46.实施方案G42的遗传修饰的酵母，其中所述耶氏酵母属酵母是解脂耶氏酵母。
G47.实施方案G45或G46的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽选自POX1多肽、POX2多肽、POX3多肽、POX4多肽、POX5多肽或POX6多肽。
G48.实施方案G47的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽选自SEQIDNO:3778至3783。
G49.实施方案G1到G29中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的毕赤酵母属酵母。
G50.实施方案G49的遗传修饰的酵母，其中所述毕赤酵母属酵母选自巴斯德毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、克鲁弗毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、P.heedii和亚膜毕赤酵母。
G51.实施方案G1到G29的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的酵母属酵母。
G52.实施方案G51的遗传修饰的酵母，其中所述酵母属酵母选自酿酒酵母、贝酵母、巴斯德酵母和卡尔酵母。
G53.实施方案G1到G29的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的克鲁维酵母属酵母。
G54.实施方案G53的遗传修饰的酵母，其中所述克鲁维酵母属酵母选自乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母。
G55.实施方案G1到G54中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在N-末端环中包含氨基酸修饰。
G56.实施方案G1到G55中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Dα螺旋中包含氨基酸修饰。
G57.实施方案G1到G56中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Dα螺旋与E’α螺旋之间的环中包含氨基酸修饰。
G58.实施方案G1到G57中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽包含对与原料组分中碳6到9有效接触的氨基酸的氨基酸修饰。
G59.实施方案G1到G58中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽包含对与原料组分中碳10到12有效接触的氨基酸的氨基酸修饰。
G60.实施方案G1到G59中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Lα螺旋中包含氨基酸修饰。
G61.实施方案G1到G60中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在位于Lα螺旋的C-末端的环中包含氨基酸修饰。
G62.实施方案G1到G61中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Lα螺旋与Mα螺旋之间的环中包含氨基酸修饰。
G63.实施方案G55到G62中任一项的遗传修饰的酵母，其中所述氨基酸修饰包含氨基酸置换。
G64.实施方案G63的遗传修饰的酵母，其中所述氨基酸置换是保守的。
G65.实施方案G63的遗传修饰的酵母，其中所述氨基酸置换不是保守的。
G66.一种生产二酸的方法，其包括：
(a)使实施方案G1到G65中任一项的遗传修饰的酵母与包含植物油的原料接触；并且
(b)在从所述原料生产二酸的条件下培养所述酵母。
G67.实施方案G66的方法，其包括从所述酵母中纯化所述二酸。
H1.一种生产二酸的方法，其包括：
(a)使实施方案A1到A44、B1到B33、C1到C15和G1到G65中任一的遗传修饰的酵母与包含能够被所述酵母转化为二酸的不饱和植物脂肪酸的原料接触；
(b)在从所述原料生产包含一个或多个不饱和性的二酸的条件下培养所述酵母；和
(c)氢化并去除所述不饱和性中的一个或多个。
H2.实施方案H1的方法，其中所述不饱和植物脂肪酸是亚油酸或亚麻酸。
H3.实施方案H2的方法，其中所述二酸是十二烷二酸或癸二酸。
***
本文述及的各专利、专利申请、出版物和文件的全文通过引用并入本文。对上述专利、专利申请、出版物和文件的引用并非承认上述任何一个属于相关的现有技术，也不视作承认这些出版物或文件的内容或日期。
可以在不脱离该技术的基本方面的情况下对以上内容作出修改。虽然已经参照一个或多个具体实施方案相当详细地描述了该技术，但本领域普通技术人员应该认识到，可对本申请具体公开的实施方案作出改变，而这些修改和改进仍落在该技术的范围和构思内。
本文适当地示例性描述的技术可在缺乏本文未具体公开的任何元素的情况下实施。因此，例如在本文中的各情况下，术语“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”中的任一个可替换为另两个术语中的任一个。所用的术语和表述是描述性而非限制性地使用的，此类术语和表述的使用不排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，并且各种修改在所请求保护的技术的范围内是可能的。术语“一个”或“一种”可指一个或多个其所修饰的元素(例如，“一种试剂”可表示一种或多种试剂)，除非上下文明确描述是所述元素中的一个或所述元素中的多于一个。本文所用的术语“约”是指在基础参数的10％以内的数值(即，加或减10％)，而在一串数值开始处使用的术语“约”修饰每一个数值(即，“约1、2和3”是指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量可包括90克至110克的重量。此外，在本文中描述一列数值时(例如，约50％、60％、70％、80％、85％或86％)，该列表包括其所有中间值和分数值(例如，54％、85.4％)。因此，应当理解，虽然已通过代表性实施方案和任选的特征具体公开了本发明的技术，但本领域技术人员可以想到本文所公开的概念的修改和改变，此类修改和改变被认为落在该技术的范围内。
该技术的某些实施方案在随后的权利要求书中阐述。

Claims (202)

1.一种遗传修饰的解脂耶氏酵母，其包含(i)活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽或活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽；(ii)改变天然烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰；和(iii)改变天然二烯酰辅酶A还原酶(DCR)活性的遗传修饰，其中所述酵母能够从包含一种或多种来自植物油的组分的原料生产二酸。
2.一种遗传修饰的酵母，其包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽或活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽，该酵母能够从包含一种或多种来自植物油的组分的原料生产二酸。
3.根据权利要求2所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的假丝酵母属酵母。
4.根据权利要求3所述的遗传修饰的酵母，其中所述假丝酵母属酵母选自：热带假丝酵母和维斯假丝酵母。
5.根据权利要求所述的遗传修饰的酵母，其中所述假丝酵母属酵母是遗传修饰的ATCC20336酵母。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽是POX4多肽。
7.根据权利要求6所述的遗传修饰的酵母，其中所述POX4多肽包含SEQIDNO:30的修饰的氨基酸序列。
8.根据权利要求6-7中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述POX4多肽在一个或多个选自下组的氨基酸位置处包含氨基酸修饰：88、90、96、98、99、100、102、103、302、309、310、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504和505。
9.根据权利要求3-5中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽是POX5多肽。
10.根据权利要求9所述的遗传修饰的酵母，其中所述POX5多肽包含SEQIDNO:32的修饰的氨基酸序列。
11.根据权利要求9-10中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述POX5多肽在一个或多个选自下组的氨基酸位置处包含氨基酸修饰：81、82、83、84、85、86、88、93、94、95、96、98、102、284、287、290、291、292、294、295、428、429、436、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462和463。
12.根据权利要求3-5中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A脱氢酶多肽选自：ACAD、VLCAD、LCAD、MCAD和SCAD多肽。
13.根据权利要求12所述的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A脱氢酶多肽包含SEQIDNO:3685的修饰的氨基酸序列。
14.根据权利要求12-13中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A脱氢酶多肽在VLCAD位置461处包含氨基酸修饰。
15.根据权利要求8、11和14中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述氨基酸修饰中的至少一个是氨基酸置换。
16.根据权利要求15所述的遗传修饰的酵母，其中所述一种或多种氨基酸置换中的至少一个是保守的。
17.根据权利要求15所述的遗传修饰的酵母，其中所述一种或多种氨基酸置换中的至少一个不是保守的。
18.根据权利要求2所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的耶氏酵母属酵母。
19.根据权利要求18所述的遗传修饰的酵母，其中所述耶氏酵母属酵母是解脂耶氏酵母。
20.根据权利要求18-19中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽选自：POX1多肽、POX2多肽、POX3多肽、POX4多肽、POX5多肽或POX6多肽。
21.根据权利要求20所述的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽选自：SEQIDNO:3778至3783。
22.根据权利要求2所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的毕赤酵母属酵母。
23.根据权利要求22所述的遗传修饰的酵母，其中所述毕赤酵母属酵母选自：巴斯德毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、克鲁弗毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、P.heedii和亚膜毕赤酵母。
24.根据权利要求2所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的酵母属酵母。
25.根据权利要求24所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母属酵母选自：酿酒酵母、贝酵母、巴斯德酵母和卡尔酵母。
26.根据权利要求2所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是遗传修饰的克鲁维酵母属酵母。
27.根据权利要求26所述的遗传修饰的酵母，其中所述克鲁维酵母属酵母选自：乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母。
28.根据权利要求2-27中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在N-末端环中包含氨基酸修饰。
29.根据权利要求2-28中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Dα螺旋中包含氨基酸修饰。
30.根据权利要求2-29中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Dα螺旋与E’α螺旋之间的环中包含氨基酸修饰。
31.根据权利要求2-30中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽包含对与原料组分中碳6到9有效接触的氨基酸的氨基酸修饰。
32.根据权利要求2-31中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽包含对与原料组分中碳10到12有效接触的氨基酸的氨基酸修饰。
33.根据权利要求2-32中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Lα螺旋中包含氨基酸修饰。
34.根据权利要求2-33中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在位于Lα螺旋的C-末端的环中包含氨基酸修饰。
35.根据权利要求2-34中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Lα螺旋与Mα螺旋之间的环中包含氨基酸修饰。
36.根据权利要求28-35中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述氨基酸修饰包含氨基酸置换。
37.根据权利要求36所述的遗传修饰的酵母，其中所述氨基酸置换是保守的。
38.根据权利要求36所述的遗传修饰的酵母，其中所述氨基酸置换不是保守的。
39.一种遗传修饰的酵母，其包含(i)活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽或活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽和(ii)改变烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰，其中所述酵母能够从包含一种或多种来自植物油的组分的原料生产二酸。
40.根据权利要求2-39中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含降低烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰。
41.根据权利要求40所述的遗传修饰的酵母，其包含以下部分的破坏、缺失或敲除：(i)编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸或(ii)可操作地连接至编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸的启动子，由此所述烯酰辅酶A异构酶活性降低或去除。
42.根据权利要求41所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸。
43.根据权利要求2-42中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含提高烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰。
44.根据权利要求43所述的遗传修饰的酵母，其包含(i)拷贝数增加的编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸或(ii)插入并可操作地连接至编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸的启动子。
45.根据权利要求40-44中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶多肽是对所述酵母为天然的多肽。
46.根据权利要求39-45中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母中一种或多种或全部烯酰辅酶A异构酶多肽类型的活性得到改变。
47.根据权利要求46所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母包含两种烯酰辅酶A异构酶多肽类型，并且所述多肽类型中的一种或两种得到改变。
48.根据权利要求39-45中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶活性由假丝酵母属酵母中存在的多肽提供。
49.根据权利要求39-48中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶活性由包含SEQIDNO:3675、3677、3800、3802、3803或3805的氨基酸序列的多肽提供。
50.根据权利要求39-48中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是耶氏酵母属酵母。
51.根据权利要求50所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是解脂耶氏酵母。
52.根据权利要求51所述的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶活性由耶氏酵母属酵母或解脂耶氏酵母中存在的多肽提供。
53.根据权利要求51所述的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶活性由包含SEQIDNO:3804或3806的氨基酸序列的多肽提供。
54.根据权利要求2-53中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含降低酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽的细胞质活性的遗传修饰。
55.根据权利要求2-54中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含降低酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽的过氧化物酶体活性的遗传修饰。
56.根据权利要求54或55所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽的多核苷酸。
57.根据权利要求56所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏ACS1多肽或ACS2多肽。
58.根据权利要求54-57中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码长链酰基辅酶A合成酶多肽的多核苷酸。
59.根据权利要求58所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏FAT1多肽。
60.根据权利要求54-59中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽是对所述酵母为天然的多肽。
61.根据权利要求60所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是假丝酵母属酵母。
62.根据权利要求61所述的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽包含选自SEQIDNO:80、82、84、158和159的氨基酸序列。
63.根据权利要求61所述的遗传修饰的酵母，其中所述FAT1多肽包含SEQIDNO:90的氨基酸序列。
64.根据权利要求2-63中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含降低PXA多肽活性的遗传修饰。
65.根据权利要求64所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码所述PXA多肽的多核苷酸。
66.根据权利要求64或65所述的遗传修饰的酵母，其中所述PXA多肽是PXA1多肽或PXA2多肽，或PXA1多肽和PXA2多肽。
67.根据权利要求64-66中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述PXA多肽对所述酵母是天然的。
68.根据权利要求67所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是假丝酵母属酵母。
69.根据权利要求68所述的遗传修饰的酵母，其中所述PXA1多肽包含SEQIDNO:92的氨基酸序列。
70.根据权利要求68所述的遗传修饰的酵母，其中所述PXA2多肽包含SEQIDNO:94的氨基酸序列。
71.根据权利要求2-70中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽，且不包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽。
72.根据权利要求2-70中任一项所述的遗传修饰的酵母，其不包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽，且包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽。
73.一种生产二酸的方法，其包括：
(1)使根据权利要求1-72中任一所述的遗传修饰的酵母与原料接触，该原料包含一种或多种来自含有至少一种能够被所述酵母转化为二酸的不饱和植物脂肪酸的原料的组分；
(2)在从所述原料生产所述二酸的条件下培养所述酵母；并且
(3)使所述二酸氢化以去除碳链中的任何不饱和性。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述不饱和植物脂肪酸是亚油酸或亚麻酸。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述二酸是十二烷二酸或癸二酸。
76.一种遗传修饰的酵母，其包含异源酰基辅酶A氧化酶多肽或异源酰基辅酶A脱氢酶多肽，该酵母能够从包含一种或多种来自植物油的组分的原料生产二酸。
77.根据权利要求76所述的遗传修饰的酵母，其中所述异源酰基辅酶A氧化酶多肽是天然的多肽。
78.根据权利要求76所述的遗传修饰的酵母，其中所述异源酰基辅酶A氧化酶多肽是活性的、修饰的多肽。
79.根据权利要求76所述的遗传修饰的酵母，其中所述异源酰基辅酶A脱氢酶多肽是天然的多肽。
80.根据权利要求76所述的遗传修饰的酵母，其中所述异源酰基辅酶A脱氢酶多肽是活性的、修饰的多肽。
81.根据权利要求76或77所述的遗传修饰的酵母，其中所述异源酰基辅酶A氧化酶多肽选自：具有SEQIDNO:51至SEQIDNO:3673所示的氨基酸序列的多肽。
82.根据权利要求76或79所述的遗传修饰的酵母，其中所述异源酰基辅酶A脱氢酶多肽选自：SEQIDNO:3679至3683、3686、3689、3691、3693、3695、3697、3699、3701和3703。
83.根据权利要求76-82中任一项所述的遗传修饰的酵母，其选自：假丝酵母属酵母、耶氏酵母属酵母、毕赤酵母属酵母、酵母属酵母和克鲁维酵母属酵母。
84.根据权利要求83所述的遗传修饰的酵母，其选自：热带假丝酵母、维斯假丝酵母、解脂耶氏酵母、巴斯德毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、克鲁弗毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、P.heedii、亚膜毕赤酵母、酿酒酵母、贝酵母、巴斯德酵母、卡尔酵母、乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母。
85.根据权利要求76-84中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含降低烯酰辅酶A异构酶多肽活性的遗传修饰。
86.根据权利要求85所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码所述烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸。
87.根据权利要求85或86所述的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶多肽是对所述酵母为天然的多肽。
88.根据权利要求87所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是假丝酵母属酵母。
89.根据权利要求88所述的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶多肽包含SEQIDNO:3675或3677的氨基酸序列。
90.根据权利要求76-89中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含降低酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽的细胞质活性的遗传修饰。
91.根据权利要求76-90中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含降低酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽的过氧化物酶体活性的遗传修饰。
92.根据权利要求90或91所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码所述酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽的多核苷酸。
93.根据权利要求92所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏ACS1多肽或ACS2多肽。
94.根据权利要求90-93中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码长链酰基辅酶A合成酶多肽的多核苷酸。
95.根据权利要求94所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏FAT1多肽。
96.根据权利要求90-95中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽是对所述酵母为天然的多肽。
97.根据权利要求96所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是假丝酵母属酵母。
98.根据权利要求97所述的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A合成酶(ACS)多肽包含选自SEQIDNO:80、82、84、158和159的氨基酸序列。
99.根据权利要求96所述的遗传修饰的酵母，其中所述FAT1多肽包含SEQIDNO:90的氨基酸序列。
100.根据权利要求76-99中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含降低PXA多肽活性的遗传修饰。
101.根据权利要求100所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码所述PXA多肽的多核苷酸。
102.根据权利要求100或101所述的遗传修饰的酵母，其中所述PXA多肽是PXA1多肽或PXA2多肽，或PXA1多肽和PXA2多肽。
103.根据权利要求100-102中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述PXA多肽对所述酵母是天然的。
104.根据权利要求103所述的遗传修饰的酵母，其中所述酵母是假丝酵母属酵母。
105.根据权利要求104所述的遗传修饰的酵母，其中所述PXA1多肽包含SEQIDNO:92的氨基酸序列。
106.根据权利要求104所述的遗传修饰的酵母，其中所述PXA2多肽包含SEQIDNO:94的氨基酸序列。
107.根据权利要求76-106中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽且不包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽。
108.根据权利要求76-106中任一项所述的遗传修饰的酵母，其不包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽且包含活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽。
109.根据权利要求1-108中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含一种或多种降低一种或多种天然的内源酰基辅酶A氧化酶多肽活性的遗传修饰。
110.根据权利要求109所述的遗传修饰的酵母，其包含降低所有天然的内源酰基辅酶A氧化酶多肽活性的遗传修饰。
111.根据权利要求109或110所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰部分地阻断β氧化活性。
112.根据权利要求1-111中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述二酸是C4到C24二酸。
113.根据权利要求112所述的遗传修饰的酵母，其中所述二酸是C10、C12、C14、C16、C18或C20二酸。
114.根据权利要求113所述的遗传修饰的酵母，其中所述二酸是C10二酸。
115.根据权利要求113所述的遗传修饰的酵母，其中所述二酸是C12二酸。
116.根据权利要求113所述的遗传修饰的酵母，其中所述二酸是C18二酸。
117.根据权利要求112-116中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述二酸不包含不饱和性。
118.根据权利要求112-116中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述二酸包含一个或多个不饱和性。
119.根据权利要求112-118中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述二酸是二酸混合物中的主要二酸。
120.根据权利要求1-119中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述原料包含基本上纯的油。
121.根据权利要求1-120中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述原料包含多种脂肪酸。
122.根据权利要求121所述的遗传修饰的酵母，其中所述原料包含皂脚。
123.根据权利要求121所述的遗传修饰的酵母，其中所述原料包含脂肪酸馏出物。
124.根据权利要求1-123中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述植物油来自选自棕榈、棕榈仁、椰子、大豆、红花、油菜、棕榈、棕榈仁或其组合的植物。
125.一种生产所需二酸的方法，其包括：
使根据权利要求1-124中任一项所述的遗传修饰的酵母与原料接触，该原料包含一种或多种来自能够被所述酵母转化为二酸的植物油的组分；并且
在从所述原料生产所需二酸的条件下培养所述酵母。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所需的二酸是C4到C24二酸。
127.根据权利要求125-126中任一项所述的方法，其中所需的二酸不包含不饱和性。
128.根据权利要求125-126中任一项所述的方法，其中所需的二酸包含一个或多个不饱和性。
129.根据权利要求125-128中任一项所述的方法，其中所需的二酸是二酸混合物中的主要二酸。
130.根据权利要求125-129中任一项所述的方法，其中所述原料包含基本上纯的油。
131.根据权利要求125-129中任一项所述的方法，其中所述原料包含多种脂肪酸。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述原料包含皂脚。
133.根据权利要求131所述的方法，其中所述原料包含脂肪酸馏出物。
134.根据权利要求125-133中任一项所述的方法，其中所述植物油来自选自棕榈、棕榈仁、椰子、大豆、红花、油菜、棕榈、棕榈仁或其组合的植物。
135.一种分离的核酸，其包含编码来自酵母的修饰的酰基辅酶A氧化酶多肽的多核苷酸。
136.根据权利要求135所述的分离的核酸，其中所述修饰的酰基辅酶A氧化酶多肽在N-末端环中包含氨基酸修饰。
137.根据权利要求135所述的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Dα螺旋中包含氨基酸修饰。
138.根据权利要求135所述的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Dα螺旋与E’α螺旋之间的环中包含氨基酸修饰。
139.根据权利要求135所述的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽包含对与原料组分中碳6到9有效接触的氨基酸的氨基酸修饰。
140.根据权利要求135所述的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽包含对与原料组分中碳10到12有效接触的氨基酸的氨基酸修饰。
141.根据权利要求135所述的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Lα螺旋中包含氨基酸修饰。
142.根据权利要求135所述的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在位于Lα螺旋的C-末端的环中包含氨基酸修饰。
143.根据权利要求135所述的分离的核酸，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Lα螺旋与Mα螺旋之间的环中包含氨基酸修饰。
144.根据权利要求135-143中任一项所述的分离的核酸，其中所述酵母选自：假丝酵母属酵母、耶氏酵母属酵母、毕赤酵母属酵母、酵母属酵母和克鲁维酵母属酵母。
145.根据权利要求144所述的分离的核酸，其中所述酵母选自：热带假丝酵母、维斯假丝酵母、解脂耶氏酵母、巴斯德毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、克鲁弗毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、P.heedii、亚膜毕赤酵母、酿酒酵母、贝酵母、巴斯德酵母、卡尔酵母、乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母。
146.根据权利要求144所述的分离的核酸，其中所述酵母是假丝酵母属酵母，其选自：热带假丝酵母和维斯假丝酵母。
147.根据权利要求146所述的分离的核酸，其中所述酵母是遗传修饰的ATCC20336酵母。
148.根据权利要求144-147中任一项所述的分离的核酸，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽是POX4多肽。
149.根据权利要求148所述的分离的核酸，其中所述POX4多肽包含SEQIDNO:30的修饰的氨基酸序列。
150.根据权利要求148或149所述的分离的核酸，其中所述POX4多肽在一个或多个选自下组的氨基酸位置处包含氨基酸修饰：88、90、96、98、99、100、102、103、302、309、310、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504和505。
151.根据权利要求144-147中任一项所述的分离的核酸，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽是POX5多肽。
152.根据权利要求141所述的分离的核酸，其中所述POX5多肽包含SEQIDNO:32的修饰的氨基酸序列。
153.根据权利要求151或152所述的分离的核酸，其中所述POX5多肽在一个或多个选自下组的氨基酸位置处包含氨基酸修饰：81、82、83、84、85、86、88、93、94、95、96、98、102、284、287、290、291、292、294、295、436、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462和463。
154.一种表达载体，其包含根据权利要求135-153中任一项所述的分离的核酸。
155.一种宿主细胞，其包含根据权利要求135-153中任一项所述的核酸。
156.根据权利要求155所述的宿主细胞，其为假丝酵母属酵母细胞，选自：热带假丝酵母和维斯假丝酵母。
157.根据权利要求156所述的宿主细胞，其中所述假丝酵母属酵母是遗传修饰的ATCC20336酵母。
158.根据权利要求155所述的宿主细胞，其选自：耶氏酵母属酵母、毕赤酵母属酵母、酵母属酵母和克鲁维酵母属酵母。
159.根据权利要求158所述的宿主细胞，其选自：解脂耶氏酵母、巴斯德毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、克鲁弗毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、P.heedii、亚膜毕赤酵母、酿酒酵母、贝酵母、巴斯德酵母、卡尔酵母、乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母。
160.一种遗传修饰的酵母，其包含(i)活性的、修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽或活性的、修饰的内源酰基辅酶A脱氢酶多肽；(ii)改变烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰；和(iii)改变二烯酰辅酶A还原酶(DCR)活性的遗传修饰，其中所述酵母能够从包含一种或多种来自植物油的组分的原料生产二酸。
161.根据权利要求160所述的遗传修饰的酵母，其中所述原料包含至少一种长链不饱和脂肪酸。
162.根据权利要求161所述的遗传修饰的酵母，其中所述长链不饱和脂肪酸是亚油酸或亚麻酸。
163.根据权利要求160-162中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含降低烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰。
164.根据权利要求163所述的遗传修饰的酵母，其包含以下部分的破坏、缺失或敲除：(i)编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸或(ii)可操作地连接至编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸的启动子，由此所述烯酰辅酶A异构酶活性降低或去除。
165.根据权利要求164所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸。
166.根据权利要求160-165中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含提高烯酰辅酶A异构酶活性的遗传修饰。
167.根据权利要求166所述的遗传修饰的酵母，其包含(i)拷贝数增加的编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸或(ii)插入并可操作地连接至编码烯酰辅酶A异构酶多肽的多核苷酸的启动子。
168.根据权利要求160-167中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述烯酰辅酶A异构酶活性由包含SEQIDNO:3675、3677、3800、3802、3803或3805的氨基酸序列的多肽提供。
169.根据权利要求160-167中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中烯酰辅酶A异构酶活性由耶氏酵母属酵母中存在的多肽提供。
170.根据权利要求169所述的遗传修饰的酵母，其中所述耶氏酵母属酵母是解脂耶氏酵母。
171.根据权利要求160-167中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中烯酰辅酶A异构酶活性由包含SEQIDNO:3804或3806的氨基酸序列的多肽提供。
172.根据权利要求160-171中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含降低二烯酰辅酶A还原酶活性的遗传修饰。
173.根据权利要求172所述的遗传修饰的酵母，其包含以下部分的破坏、缺失或敲除：(i)编码二烯酰辅酶A还原酶多肽的多核苷酸或(ii)可操作地连接至编码二烯酰辅酶A还原酶多肽的多核苷酸的启动子，由此所述二烯酰辅酶A还原酶活性降低或去除。
174.根据权利要求173所述的遗传修饰的酵母，其中所述遗传修饰破坏编码二烯酰辅酶A还原酶多肽的多核苷酸。
175.根据权利要求160-171中任一项所述的遗传修饰的酵母，其包含提高二烯酰辅酶A还原酶活性的遗传修饰。
176.根据权利要求175所述的遗传修饰的酵母，其包含(i)拷贝数增加的编码二烯酰辅酶A还原酶多肽的多核苷酸或(ii)插入并可操作地连接至编码二烯酰辅酶A还原酶多肽的多核苷酸的启动子。
177.根据权利要求160-176中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述二烯酰辅酶A还原酶活性由包含SEQIDNO:3789、3791、3792或3793的氨基酸序列的多肽提供。
178.根据权利要求160-177中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述二烯酰辅酶A还原酶活性由耶氏酵母属酵母中存在的多肽提供。
179.根据权利要求178所述的遗传修饰的酵母，其中所述耶氏酵母属酵母是解脂耶氏酵母。
180.根据权利要求160-177中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述二烯酰辅酶A还原酶活性由包含SEQIDNO:3794或3795的氨基酸序列的多肽提供。
181.根据权利要求160-180中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽是POX4多肽。
182.根据权利要求181所述的遗传修饰的酵母，其中所述POX4多肽包含SEQIDNO:30的修饰的氨基酸序列。
183.根据权利要求181或182所述的遗传修饰的酵母，其中所述POX4多肽在一个或多个选自下组的氨基酸位置处包含氨基酸修饰：88、90、96、98、99、100、102、103、302、309、310、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504和505。
184.根据权利要求160-180中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述内源酰基辅酶A氧化酶多肽是POX5多肽。
185.根据权利要求184所述的遗传修饰的酵母，其中所述POX5多肽包含SEQIDNO:32的修饰的氨基酸序列。
186.根据权利要求184所述的遗传修饰的酵母，其中所述POX5多肽在一个或多个选自下组的氨基酸位置处包含氨基酸修饰：81、82、83、84、85、86、88、93、94、95、96、98、102、284、287、290、291、292、294、295、428、429、436、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462和463。
187.根据权利要求160-186中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A脱氢酶多肽选自：ACAD、VLCAD、LCAD、MCAD和SCAD多肽。
188.根据权利要求187所述的遗传修饰的酵母，其中所述酰基辅酶A脱氢酶多肽包含SEQIDNO:3685的修饰的氨基酸序列。
189.根据权利要求160-188中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在N-末端环中包含氨基酸修饰。
190.根据权利要求160-189中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Dα螺旋中包含氨基酸修饰。
191.根据权利要求160-190中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Dα螺旋与E’α螺旋之间的环中包含氨基酸修饰。
192.根据权利要求160-191中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽包含对与原料组分中碳6到9有效接触的氨基酸的氨基酸修饰。
193.根据权利要求160-192中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽包含对与原料组分中碳10到12有效接触的氨基酸的氨基酸修饰。
194.根据权利要求160-193中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Lα螺旋中包含氨基酸修饰。
195.根据权利要求160-194中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在位于Lα螺旋的C-末端的环中包含氨基酸修饰。
196.根据权利要求160-195中任一项所述的遗传修饰的酵母，其中所述修饰的内源酰基辅酶A氧化酶多肽在Lα螺旋与Mα螺旋之间的环中包含氨基酸修饰。
197.一种生产二酸的方法，其包括：
(a)使根据权利要求160-196中任一项所述的遗传修饰的酵母与包含植物油的原料接触；并且
(b)在从所述原料生产二酸的条件下培养所述酵母。
198.根据权利要求197所述的方法，其包括从所述酵母中纯化所述二酸。
199.一种生产二酸的方法，其包括：
(1)使实施方案1-124和160-198中任一所述的遗传修饰的酵母与包含能够被所述酵母转化为二酸的不饱和植物脂肪酸的原料接触；
(b)在从所述原料生产包含一个或多个不饱和性的二酸的条件下培养所述酵母；和
(c)氢化并去除所述不饱和性中的一个或多个。
200.根据权利要求199所述的方法，其中所述不饱和植物脂肪酸是亚油酸或亚麻酸。
201.通过根据权利要求199-200中任一项所述的方法获得的二酸。
202.根据权利要求201所述的二酸，其中所述二酸是十二烷二酸或癸二酸。
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