CN108779470A

CN108779470A - 用于酵母细胞中同源重组敲除的基因盒

Info

Publication number: CN108779470A
Application number: CN201580085816.1A
Authority: CN
Inventors: 陈献忠; 张利华; 项峥; 沈微; 李莉; M.珀特
Original assignee: Evonik Degussa China Co Ltd
Current assignee: Evonik China Co Ltd
Priority date: 2015-12-17
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2018-11-09
Also published as: WO2017101060A1; JP2018537109A; JP6858191B2; SG11201804966VA; US20190153475A1; EP3390640A1; EP3390640A4

Abstract

用于敲除酵母细胞中的至少一种靶基因的基因盒，所述盒包含：(a)作为标记基因的URA3基因；(b)至少一种基因破坏辅助(gda)序列；和(c)靶基因的上游和下游序列，其中所述gda序列是具有SEQ ID NO:39的核苷酸序列的至少300‑600个连续残基的序列。

Description

用于酵母细胞中同源重组敲除的基因盒

发明领域

本发明涉及用于破坏至少一种酵母细胞中的靶基因的基因盒。具体而言，基因标记可以包含可重复使用的选择标记和至少一种可用于破坏至少一种靶基因的表达的另外的破坏序列。

发明背景

众所周知酵母用于生产特定化合物和/或组合物的基因工程改造领域中。具体而言，酵母菌株可以进行遗传修饰以破坏特定基因的表达，因此使得这些遗传修饰的菌株可用于生产期望的化合物和/或组合物。酵母菌株的修饰使得可以获得具有不同或改进特性的酵母，其可以用于许多可能的应用中，其中有面包制作、食品工业、健康、化合物(例如酒精)的生产、酵母提取物的生产。

例如，已知一些酵母物种诸如酿酒酵母(S. cerevisiae)主要将己糖发酵成乙醇，而不是通常由细菌产生的产物的混合物。一些酵母具有使其成为各种类型发酵过程的良好候选者的其他特征，诸如对低pH环境的耐受性，对某些发酵副产物诸如乙酸和糠醛的耐受性，以及对乙醇本身的耐受性。因此，酵母细胞成为遗传操作的良好靶标，产生具有期望特征的遗传修饰的细胞。

在另一个实例中，热带假丝酵母(C. tropicalis)越来越多地用于发酵工业中。例如，热带假丝酵母，借助于ω-氧化途径的高效细胞内β-氧化组分，可以用于使用烷烃和脂肪酸作为唯一碳源和能量源来生产长链二羧酸(DCA)。这些DCA用于化学和制药工业中的广泛范围的应用中。目前，热带假丝酵母是发酵工业中最常用于生产二酸的菌株。热带假丝酵母也常用于木糖醇生产中。也已发现热带假丝酵母在环境保护领域，特别是在工业和农业废水的生物处理中显示许多益处，不仅显示分解易于生物降解的有机液体废物的能力，而且同时产生单细胞蛋白，其通过生产有价值的产品来减少环境污染并变废为宝。然而，热带假丝酵母是一种二倍体酵母，没有有性繁殖阶段，只是无性繁殖。热带假丝酵母具有许多其他生理特性，使其不同于酿酒酵母，并且因此对热带假丝酵母的遗传操作复杂得多。具体而言，热带假丝酵母中涉及的代谢网络非常复杂，并且在其直接应用于工业生产中存在许多缺点。由于该原因，出现了通过热带假丝酵母的代谢工程改造而改进菌株的新方法(HaasL, Cregg J等人, 1990)。使用这种转化系统，Picataggio等人进行了POX4和POX5基因的连续破坏以产生其中β-氧化途径被阻断的菌株，建立连续基因破坏系统(Picataggio S,Deanda K等人 1991)。为了重复使用URA3标记，他们筛选自发突变或使用分子方法来破坏引入的URA3基因。另一方面，Gao Hong等人基于使用潮霉素B对于破坏单拷贝CAT基因的抗性，使用G418抗性作为第二选择标记，并且构建了相应的破坏盒，并且实现了CAT基因双拷贝破坏(Gao Hong, 2005)。然而，仍然存在许多与使用抗生素抗性作为热带假丝酵母中的选择标记相关的问题，因为一些菌株对抗生素相当差，且因此这对基因转化和分子改进施加了限制。此外，热带假丝酵母具有将CTG密码子(通常翻译为亮氨酸)翻译为丝氨酸的特征性特性，并且这进一步增加了使用外源抗性基因的困难。此外，在二倍体酵母的基因破坏中经常需要多个抗性标记以完成多拷贝破坏，这进一步限制了抗性标记的使用。由于这些原因以及更多原因对热带假丝酵母的遗传操作已知是复杂的。

在Alani等人(Alani E, Cao L等人1987)的ura-blaster连续基因破坏系统中，hisG序列以相同方向插入URA3基因的每一侧上，这使整个基因破坏盒过大，并且因此非常难以通过PCR有效地扩增整个破坏盒(R. Bryce Wilson, Dana Davis等人 2000)。

目前可用的遗传修饰酵母细胞的方法缺乏效率和简单性使得生产遗传修饰的酵母细胞的过程变得复杂。因此，仍然需要提供用于获得改进的酵母菌株的新型方法，这些方法更快且更容易实施并且允许更有效地选择具有期望的改进的酵母菌株。

发明描述

本发明试图通过提供破坏酵母细胞中的靶基因的手段来解决上述问题。具体而言，破坏酵母细胞的手段包含核苷酸序列，其包含标记基因、所述标记基因的短DNA片段(包括上游和下游序列)以及靶基因的上游和下游序列。甚至更具体而言，所述标记基因可以是URA3基因，并且所述标记基因的短DNA片段长度可以是约300至600 bp，其选自URA3基因的-420bp至+ 1158 bp的序列(即URA3的起始密码子上游的420 bp和URA3的终止密码子下游的354bp)。

根据本发明的一个方面，提供了用于破坏酵母细胞中的至少一种靶基因的基因盒，其中所述基因盒包含：

(a) 能够用作标记基因的URA3基因；

(b) 至少一种基因破坏辅助(gda)序列；和

(c) 靶基因的上游和下游序列，

其中gda序列长度为至少300至600 bp，且选自SEQ ID NO: 39的核苷酸序列及其变体内。具体而言，gda序列可以是URA3片段。

根据本发明的任一方面的基因盒巧妙地利用了这样的事实：gda序列是URA3基因的片段，允许在酵母(在一个实例中，热带假丝酵母)的染色体复制期间URA3基因的高效丢失，并且因此可以有效地重复使用URA3标记基因。与常规基因破坏盒CAT1-hisG-URA3- hisG-CAT1(其使用在URA3标记基因两侧以相同方向插入的鼠伤寒沙门氏菌的hisG序列)相比，根据本发明的任一方面的基因盒使用相当短的gda序列并且仅需要插入一个gda序列，这急剧减少了破坏盒的长度，使其便于用于分子生物学操作诸如PCR中。此外，破坏盒的转化/重组效率可以被认为是显著优越的，导致热带假丝酵母基因破坏的整体效率的进一步实质性改进。

酵母选择标记基因可以选自能够被选择的已知基因：此类基因包括但不限于编码营养缺陷型标记的基因，诸如LEU2、HIS3、TRP1、URA3、ADE2和LYS2。或者，编码赋予宿主细胞耐药性的蛋白的基因可用作酵母选择标记。此类基因包括但不限于CAN1和CYH2。具体而言，如本文所用的“酵母可选择标记”是指编码蛋白的遗传元件，所述蛋白当在酵母中表达时使得能够通过所述蛋白的存在来选择酵母细胞。因此，任何含有和表达酵母可选择标记的酵母细胞可以与不含有和表达所述标记的另外类似酵母细胞区分。实例包括TRP1、HIS3、URA3和LEU2。具体而言，根据本发明的任一方面使用的酵母可选择标记可以是URA3基因。编码乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(EC4.1.1.23)(URA3基因)的DNA可用作根据本发明的任一方面的标记基因。该酶是几种酵母菌株中嘧啶生物合成中的必需酶。根据本发明的任一方面使用的该选择标记可以是可重复使用的。URA3基因序列或URA3基因是指包含上游调控序列、编码区和下游调控序列的盒。URA3基因代表这样的基因片段，其包含含有启动子区的5'非翻译区、编码乳清苷-5'-磷酸脱羧酶(EC4.1.1.23)的区域和含有终止子区的3'非翻译区。在一个实例中，URA3基因的碱基序列可以来自麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)，其可以在NCBI基因库数据库中公开为D12720。在另一个实例中，URA3基因可以来自热带假丝酵母STXX20336。具体而言，根据本发明的任一方面的URA3基因可以包含SEQ ID NO: 3的序列。由于URA3基因可重复用作方便的可选择标记的能力，可以认为使用其作为选择标记是有利的。URA3，营养缺陷型标记，可以方便地用于引入敲除突变。选择的标记，诸如URA3，也可以充当可选择标记和反可选择标记，以允许首先选择该标记，且然后在随后的选择步骤中消除该标记。URA3基因弹出效率可以被认为是稳定的。

由于不存在标记基因的功能性染色体拷贝，这些基因作为标记的用途限于对所讨论的营养物营养缺陷的宿主菌株。除非用标记基因的功能性等位基因转化为原养型，否则营养缺陷型酵母菌株只能在含有适当生长因子的培养基中繁殖。这种营养互补可以通过在确定的合成培养基中包括生长因子或通过使用富含相关生长因子的复合培养基组分(例如酵母提取物和蛋白胨)来实现。

根据本发明的任一方面的基因盒进一步包含至少一个URA3基因片段。该基因片段可被称为基因破坏辅助(gda)序列。根据本发明的任一方面令人惊讶地发现，当基因盒具有：

(a) URA3作为标记基因；

(b) 选自URA3基因的gda序列，且其上游位点在-420bp(即起始密码子上游420bp)，且其下游位点在+1158bp(即终止密码子下游354bp)，和

(c) 在盒的每个末端的靶基因的同源臂时，

其可以有效地缺失酵母菌株中的基因。此外，可以重复使用URA3基因选择标记。根据本发明的任一方面，在a序列的位置表示为-n bp和/或+m bp(其中n和m是整数)的情况下，位置标准如下：编码区中URA3基因的起始密码子ATG中A的位置被指定为+1 bp，且起始密码子ATG上游的第一个碱基对的位置(即，与A的左侧相邻的第一个碱基对)被指定为- 1 bp。因此，起始密码子ATG上游的n碱基对的位置将被指定为-nbp(也称为起始密码子上游的nbp或-nbp)，起始密码子ATG中T的位置被指定为+2bp，并且在起始密码子ATG的下游，其中ATG的A被指定为第一个碱基(对)，m碱基(对)的位置被指定为+mbp(也称为起始密码子下游的mbp或+mbp)。这种编号方法示于图3中。

具体而言，gda序列可以选自SEQ ID NO: 39内。

具体而言，gda序列的大小可以是100至600 bp。gda序列的长度可以变化。序列越短，制备基因盒的成本越便宜，因为需要使用越少的原材料(即培养基、dNTP等)。可以减小gda序列的大小以还获得可以小于本领域已知的用于相同目的的盒的盒。与使用hisG序列的常规基因破坏盒相比，根据本发明的任一方面的基因盒可以显示实质性改进的转化或重组效率。这通过提供的实施例得到证实。甚至更具体而言，根据本发明的任一方面，gda序列的大小可以是300至500bp。还令人惊讶地发现，当根据本发明的任一方面的基因盒的gda序列的长度为300-500 bp时，在转化至酵母菌株(例如尿嘧啶营养缺陷型热带假丝酵母)中后的URA3基因弹出效率可以相当地增加。具体而言，转化至酵母菌株中后的URA3基因弹出效率可以与常规hisG基因破坏盒的相当。由于根据本发明的任一方面的基因破坏盒的转化效率可以显著高于常规基因破坏盒的转化效率，所以可以实现酵母菌株、特别是热带假丝酵母的整体基因破坏效率的显著改进。在一个实例中，gda序列长度可以是约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600 bp。在另一个实例中，根据本发明的任一方面的gda序列可以长度是100-600bp、150-600、200- 600、250-600、300-600、350-600、400-600、100-550、100-500、100-450、100-400、100-350、100-300、150-600、150-550、150-500、150-450、150-400、150-350、200-550、200-500、200-450、200-400、250-550、250-500、250-450、250-400、250-350、300-550、300-500、300-450、300-400 bp、302-600 bp、302-500 bp、302-488bp、305-488 bp等。技术人员能够鉴定在每种情况下可以是合适的gda序列的长度，这取决于待被基因盒破坏的靶序列。具体而言，gda序列的大小可以是200至500bp。更具体而言，gda序列可以是300至500 bp。在一个实例中，gda序列的长度可以选自长度为143、245、302、305、324、325和488 bp。具体而言，gda序列的长度可以长度为324或325 bp。

在另一个实例中，根据本发明的任一方面，在基因盒中可以存在多于一个gda序列。具体而言，在基因盒中可以存在两个或三个gda序列。更具体而言，根据本发明的任一方面的基因盒仅包含一个gda序列，使得形成的盒将更短并因此更容易制备和使用。

gda序列长度可以变化的事实可以被认为有利于形成根据本发明的任一方面的基因盒。具体而言，对于同一染色体上的两个相邻基因(诸如热带假丝酵母POX4和POX2基因)的破坏可以非常方便，并且这为在研究热带假丝酵母基因中进一步使用分子生物学技术确立了基础。

此外，当根据本发明的任一方面的基因盒的gda序列的长度为300 bp至500 bp时，根据本发明的任一方面的基因盒转化至热带假丝酵母中后的URA3基因弹出效率急剧增加，因此进一步增加了热带假丝酵母基因破坏的整体效率。在阅读本说明书之后，根据本发明的任一方面的其他优点对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

根据本发明的任一方面，gda序列可以选自SEQ ID NO: 39的核苷酸序列及其变体内。具体而言，根据本发明的任一方面的gda序列可以是选自URA3基因序列的SEQ ID NO:39的核苷酸序列及其变体内的100-600bp、100-500bp、200-500bp、300-500bp。

术语“变体”可以分别指与参考氨基酸或核酸序列具有至少70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或99.5％同一性的氨基酸或核酸序列，其中优选地，除了功能(例如蛋白的催化活性，或分子的折叠或结构)必需的氨基酸以外的氨基酸被缺失、取代或通过插入替代，或者必需氨基酸以保守的方式被替代，以达到参考序列或由其衍生的分子的生物活性得以保留的效果。现有技术包括可用于比对两种给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的算法，参见Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 第3版,Thompson等人, Nucleic Acids Research 22, 4637-4680, 1994, 和Katoh等人, GenomeInformation, 16(1), 22-33, 2005。此类变体可以通过在氨基酸或核酸序列以及包含此类大分子或其变体的融合体中引入缺失、插入或取代来制备。在一个实例中，关于氨基酸序列，术语“变体”除了上述序列同一性以外，还包含相对于相应的参考或野生型序列包含一个或多个保守氨基酸变化的氨基酸序列，或者包含编码包含一个或多个保守氨基酸变化的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实例中，除了上述序列同一性程度以外，氨基酸序列或核酸序列的术语“变体”包含分别氨基酸序列或核酸序列的任何活性部分和/或片段，或任何编码氨基酸序列的活性部分和/或片段的核酸序列。具体而言，如本文所用的术语“活性部分”是指分别小于全长氨基酸序列或编码小于全长氨基酸序列的氨基酸序列或核酸序列，其中氨基酸序列或编码的氨基酸序列分别保留至少一些其基本生物活性。例如，蛋白酶的活性部分和/或片段能够水解多肽中的肽键。在一个实例中，如本文所用的术语“保留至少一些其基本生物活性”是指所讨论的氨基酸序列具有超出和不同于背景活性的生物活性和表征所述活性的动力学参数，更具体地k_cat和K_M，其在参考分子相对于特定底物显示的值的优选3个、更优选2个、最优选1个数量级内。在一个实例中，术语核酸的“变体”包括其互补链优选在严格条件下与参考或野生型核酸杂交的核酸。URA3和/或SEQ ID NO: 3的变体的实例可以包括但不限于AF040702.1、GQ268324.1、JX100416.1、AY033329.1、EU288194.1、GQ268324.1、AF321098.1、AF109400.1、U40564.1、K02207.1等。

在另一个实例中，根据本发明的任一方面的gda序列可以是选自URA3基因的-420bp至+318 bp的核苷酸序列(从起始密码子上游420 bp至下游318 bp)内的100-600bp、100-500bp、200-500 bp、300-500bp。具体而言，gda序列可以选自SEQ ID NO: 40内。在另一个实例中，根据本发明的任一方面的gda序列可以是选自URA3基因的+533 bp至+1158 bp的核苷酸序列(从起始密码子上游272 bp至下游354 bp)内的100-600bp、100-500bp、200-500 bp、300-500bp。具体而言，gda序列可以选自SEQ ID NO: 41内。在一个进一步实例中，根据本发明的任一方面的gda序列可以是选自URA3基因的+804 bp至+1158 bp的核苷酸序列(从起始密码子至起始密码子下游354 bp)内的100-600bp、100-500bp、200-500 bp、300-500bp。具体而言，gda序列可以选自SEQ ID NO: 42内。在又另一个实例中，根据本发明的任一方面的gda序列可以是选自URA3基因编码区的起始密码子的上游420 bp的核苷酸序列内的100-600bp、100-500bp、200-500bp、300-500bp。具体而言，gda序列可以选自SEQ ID NO: 43内。当使用SEQ ID NO: 3时，URA3基因的一部分的不同起始点和终止点的位置显示于图4中。

在一个实例中，gda序列的上游位点位于URA3基因的编码区中，并且gda序列的下游位点位于URA3基因的编码区的终止密码子和URA3基因的编码区的终止密码子下游354bp之间的区域中，例如，其具有SEQ ID NO. 6中所示的核苷酸序列。

在另一个实例中，根据本发明的任一方面的gda序列可以来自URA3基因编码区，例如，具有SEQ ID NO: 27中所示的核苷酸序列，或gda序列是具有URA3基因终止密码子作为其下游位点的序列。

在又另一个实例中，根据本发明的任一方面的基因盒包含选自SEQ ID NO: 18、16、27、24、14、21和6的gda序列。gda序列可以包含与选自SEQ ID NO: 18、16、27、24、14、21和6的任一序列至少50％的序列同一性。甚至更具体而言，根据本发明的任一方面的gda序列可以包含与SEQ ID NO: 16、14或21的核苷酸序列至少50％的序列同一性。更具体而言，gda序列可以包含与选自SEQ ID NO: 16、14或21的核苷酸具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、94、95、98、99、99.5或100%的序列同一性的核苷酸。

在一个实例中，根据本发明的一个方面的gda序列可以直接连接至URA3基因。具体而言，可以使用限制性酶将gda序列插入盒内的合适位点中。因此，gda序列可以直接连接至根据本发明的任一方面的盒中的URA3基因，并且可以没有将gda连接至URA3基因的接头序列。这使得产生根据本发明的任一方面的盒的过程简单且方便。根据本发明的任一方面的基因盒可以进一步包含靶基因的上游和下游序列，基因盒能够破坏所述靶基因在酵母菌株中的表达。所述基因盒可以包含与所述靶基因的上游(5′-)和下游(3′-)侧翼高度同一(即，同一性评分为80％或更高，优选为95％或更高，最优选为100％)的区域。这些区域中的任一个或两个可以包括靶基因的编码区的一部分以及各个启动子或终止子区的一部分或全部。在一个实例中，gda序列和URA3标记可以位于与靶基因的上游和下游侧翼高度同一的区域之间。所用的酵母菌株的任何天然基因可以充当用于插入根据本发明的任一方面的基因盒的靶标。

可以以已知方式，通过利用标记基因贡献的属性，或通过插入的基因贡献的其他特征(诸如产生乳酸的能力，无法产生乙醇，或在特定基质上生长的能力)选择成功的转化体。筛选可以通过PCR或Southern分析进行，以证实已经发生期望的插入和缺失，以证实拷贝数和鉴定基因至宿主细胞基因组中的整合点。可以使用已知的测定方法证实由插入的基因编码的酶的活性和/或缺乏由缺失基因编码的酶的活性。

根据本发明的任一方面，如本文所用的“靶基因”是指其沉默或破坏引起致病性酵母的生长、发育、繁殖或存活减少的基因。在一个实例中，与应用靶向酵母中非必需基因或非天然表达的基因的核苷酸序列的对照酵母相比，当酵母的必需基因被沉默时，此类基因的部分或完全沉默导致显著的酵母死亡率或显著的酵母控制。在另一个实例中，所用的靶基因可以是丙酮酸脱羧酶基因和/或CAT基因。

根据本发明的任一方面的基因盒可以包含靶基因的上游和下游序列。如本文所用的“同源臂”是指存在于根据本发明的任一方面的基因盒中的一对DNA区段；这些区段与靶基因的两个部分同源。由于该同源性，同源臂将能够经历与靶基因的同源重组。同源臂的长度为至少50 bp，以允许在酵母细胞中发生可观的同源重组率。更具体而言，同源臂可以长度是≥ 40、55、60、65、70、80、90、100。“同源臂”也可以被称为侧接靶基因的靶基因的向上和向下序列。与基因组DNA同源的两个DNA序列(向上和下游序列)侧接待缺失/破坏的DNA基因序列(靶基因)。这些侧接序列被称为同源臂。具体而言，这些同源臂对于酵母细胞上靶基因中的相应侧接序列是基本上同基因的。使用与靶基因基本上同基因的DNA有助于确保与靶序列重组的高效率。根据本发明的任一方面的基因盒至少包括同源臂内的阳性选择标记(URA3)，以便使得能够对重组评分。此类阳性选择标记可以赋予野生型酵母通常不表现出的表型；例如，对通常对靶细胞毒性的物质的抗性。在另一个实例中，根据本发明的任一方面的盒还包括同源臂外的一个或多个阴性选择标记，以便于鉴定适当的同源重组体。美国专利号5,464,764描述了此类“阳性-阴性”选择方法的用途。在成功基因靶向和同源重组后，将阳性选择标记并入同源臂内的基因组中代替靶向的基因区段，而排除阴性选择标记。因此，为了富集同源重组体，基因靶向的细胞在含有适当的阳性和阴性可选择化合物的培养基中生长。

在一个实例中，所述同源臂可以是核苷酸链之一的靶基因的≥ 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、特别是50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个连续核苷酸。上游和下游序列可以不是指靶基因的确切序列，而是指侧接靶基因的起始和终止密码子的区域。在另一个实例中，所述起始和终止密码子可以分别是上游和下游序列的一部分。在一个进一步实例中，靶基因的上游和下游序列长度可以各自为≥ 50 bp。

根据本发明的任一方面，可以使用任何酵母细胞。具体而言，所述酵母细胞可以选自白假丝酵母(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilopsis)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、多形汉逊酵母(Hansenular polymorpha)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、Kluyverei lactis、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。具体而言，酵母细胞可以是热带假丝酵母。营养缺陷型酵母菌株和相应的标记基因的一个重要应用领域是稳定维持表达载体，用于天然或异源蛋白的高水平生产。在一个实例中，根据本发明的任一方面使用的酵母细胞可以是尿嘧啶营养缺陷型热带假丝酵母。在一个具体实例中，可以在热带假丝酵母ATTC20336的物理或化学诱变后筛选和获得根据本发明的任一方面使用的热带假丝酵母尿嘧啶营养缺陷型菌株。

根据本发明的一个进一步方面，提供了破坏至少一种酵母细胞中至少一种靶基因的表达的方法，所述方法包括用根据本发明的任一方面的基因盒转化酵母细胞。

根据本发明的任一方面的方法可以适用于热带假丝酵母的双拷贝和多基因破坏。

在一个实例中，根据本发明的任一方面的基因盒的构建方法可以包括以下步骤：

(1). 制备靶基因的上游和下游序列：根据靶基因的已知碱基序列设计启动子，通过PCR扩增以获得靶基因的上游和下游序列，或根据靶基因的已知序列合成靶基因的上游和下游序列；靶基因的上游和下游序列的长度不小于50 bp；

(2). 制备URA3标记基因：根据热带假丝酵母(例如，热带假丝酵母ATTC 20336)的染色体中的URA3序列设计启动子，通过PCR扩增以获得热带假丝酵母的URA3基因，其包含上游调控序列、编码区和下游调控序列；

(3). 制备gda序列：根据热带假丝酵母(例如，热带假丝酵母ATTC 20336)的染色体中的URA3序列设计启动子，通过PCR扩增以获得gda序列，所述gda序列源自URA3基因编码区和/或调控序列，且具有300-500 bp的长度；

(4). 构建基因破坏盒：将获得的gda序列连接至URA3基因序列的上游或下游，以获得gda-URA3或URA3-gda片段；将靶基因序列上游和下游的序列分别连接至gda-URA3片段的两侧，因此获得本发明的基因破坏盒。

本发明的基因破坏盒可以表示为：靶基因的上游(或下游)序列-gda序列-URA3基因-靶基因的下游(或上游)序列，或靶基因的上游(或下游)序列-URA3基因-gda序列-靶基因的下游(或上游)序列。

本领域技术人员可以选择基于所选的gda序列来构建gda-URA3或URA3 -gda片段。例如，如果gda序列源自URA3基因的上游序列(包括编码区的上游调控序列或N端编码序列)并且将被插入URA3基因的3'末端，则将构建URA3 -gda片段，以便于随后的基因组合和URA3基因的弹出，即弹出在gdA序列和URA3基因中gda序列的相应来源序列之间的片段。

根据本发明的另一个方面，提供了根据本发明的任一方面的基因盒在酵母细胞、具体地热带假丝酵母细胞、更具体地尿嘧啶营养缺陷型热带假丝酵母细胞中破坏靶基因的用途。

根据本发明的一个进一步方面，提供了载体，其包含根据本发明的任一方面的基因盒。

根据本发明的又另一个方面，提供了细胞，其包含根据本发明的任一方面的基因盒。

根据本发明的一个进一步方面，提供了多细胞生物，其包含根据本发明的任一方面的基因盒。

在一个实例中，根据本发明的任一方面的基因盒可用于从热带假丝酵母菌株中缺失靶基因的方法，其包括以下步骤：

(1) 转化根据本发明的任一方面的基因盒：借助乙酸锂或氯化锂方法将根据本发明的任一方面的基因盒转化至热带假丝酵母细胞、特别是尿嘧啶营养缺陷型热带假丝酵母细胞中，并且将细胞应用至MM培养平板上以产生转化体；

(2) 鉴定转化体：在MM培养基上培养转化体的单一菌落，提取染色体DNA并通过PCR扩增；

(3) 标记基因丢失(或弹出)：在30℃和200rpm下在SM培养基中培养转化有基因盒的热带假丝酵母菌株，直至微生物浓度达到适当水平，离心以收集微生物，用无菌去离子水洗涤，应用至FOA平板上，并在30℃下培养；

(4) 鉴定标记基因丢失：将生长的单一微生物菌落接种至SM平板上，并培养，提取染色体DNA并通过PCR鉴定，并获得显示URA3标记基因丢失的突变菌株。

显示URA3标记基因丢失的突变菌株可用作第二轮基因破坏的宿主菌株。在该方法中，可以使用培养基和制剂，诸如下面：MM(没有氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础，YNB 6.7g/L；葡萄糖20 g/l；(NH₄)₂SO₄10 g/L)；SM (MM +尿嘧啶60 mg/L)；FOA培养基(SM + 5-氟乳清酸2g/L)。

借助于根据本发明的任一方面的基因盒，本发明提供了高效缺失热带假丝酵母的双拷贝靶基因的方法。在一个实例中，根据本发明的任一方面的该方法可用于从热带假丝酵母中缺失其他靶基因，包括CAT基因和PDC基因。在另一个实例中，根据本发明的任一方面的基因盒可用于缺失同一细胞中的两个等位基因。例如，所述基因盒可用于缺失热带假丝酵母细胞中的两个CAT等位基因。

标记基因弹出后该菌株的靶基因座(例如CAT基因座)的测序可以是用于确定靶基因丢失发生的确切位置和证实靶基因丢失的手段。例如，丢失可以发生在单个CAT等位基因座的两个CAT同源臂之间，并且该片段被gda序列取代。因此，可以在分子水平证明可以成功地破坏靶基因(诸如CAT基因的单拷贝)。此外，测序还可以证实双拷贝靶基因等位基因破坏。

在基于根据本发明的任一方面使用的可重复使用的选择标记的热带假丝酵母的基因破坏方法中，同源重组的原理可以首先通过如下使用：对营养缺陷型菌株的靶基因座进行与基因盒的位点特异性重组，功能破坏靶基因，然后可以重复使用标记基因来筛选具有破坏的靶基因的菌株。此后，可以使用5-FOA选择压力来筛选出显示URA3标记基因弹出的突变菌株，并且显示URA3标记基因的弹出的突变菌株可以用于破坏第二等位基因或其他基因。

根据本发明的任一方面的基因盒可以具有所有三种组分(a)、(b)和(c)：

(a) 能够用作标记基因的URA3基因；

(b) 至少一种基因破坏辅助(gda)序列；和

(c) 靶基因的上游和下游序列。

图1中提供了组分(a)、(b)和(c)的顺序的一些实例。根据本发明的任一方面的基因盒可以以任何顺序包含组分(a)、(b)和(c)。在一个实例中，根据本发明的任一方面的基因盒可以包含单一(b) gda序列。组分(b)可以位于(a) URA3基因的3’或5’末端。组分(c)的上游或下游序列可以位于不与(b)结合的(a)的另一端。可以确定，在URA3标记基因弹出期间，可以仅弹出gda序列和URA3基因内的相似序列之间的URA3基因片段。

附图简述

图1是各种基因破坏盒的结构图。

图2是实施例中的CAT基因破坏的流程图，并表明鉴定过程中引物的结合位点。(a)是破坏第一个CAT基因的流程图；且(b)是破坏第二个CAT基因的流程图。

图3是计算序列内与起始密码子相关的碱基对的手段的说明。

图4是热带假丝酵母ATTC 20336的URA3的部分序列(-423至+ 420bp)，其用用于获得根据本发明的任一方面的gda序列的特定碱基对进行注释。

图5是凝胶照片，其具有通过转化基因破坏盒CAT1-gda488-URA3-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT等位基因的鉴定结果。泳道1-24是破坏盒的各种转化体的PCR鉴定结果，且PCR引物是CATU和CATR。泳道1、7、8、11、12和17显示阳性转化体，其中单拷贝CAT基因被破坏，并且所有其他泳道都是假阳性转化体。2707 bp条带是显示破坏盒(CAT1-gda488-URA3-CAT1片段)的整合的条带，且1881 bp条带显示CAT1原始基因。

图6是凝胶照片，其具有通过转化破坏盒CAT1-gda488-URA3-CAT1和CAT1-gda324-URA3-CAT1而在热带假丝酵母XZX中破坏第一个CAT等位基因后弹出URA3标记基因的鉴定结果。标记左侧的泳道1-8显示通过gda324破坏盒的弹出URA3的鉴定，并且所有泳道都显示具有标记基因弹出的菌株。原始条带(具有CAT1基因和下游同源臂外部的145bp DNA的序列)具有2026 bp的大小，并且标记基因弹出后的条带(CAT1-gda324-CAT1的序列和下游同源臂外部的145bp DNA)具有1110 bp的大小。DNA测序揭示，该序列结构符合理论预测，并且弹出具有相同方向的两个gda序列之间的标记基因片段。标记右侧的泳道1-6显示通过gda488破坏盒弹出URA3的鉴定。原始条带具有2026 bp的大小，且标记基因弹出后的条带(CAT1-gda488-URA3-CAT1的序列和下游同源臂外部的145bp DNA)具有1274 bp的大小。泳道XZX显示使用热带假丝酵母XZX染色体DNA作为模板的PCR产物，大小为2026 bp。PCR引物是CATU/CATLD。

图7是凝胶照片，其具有通过转化基因破坏盒CAT1-gda324-URA3-CAT1和CAT1-gda245-URA3-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT等位基因的鉴定结果。标记左侧的泳道1-12显示破坏盒CAT1-gda245-URA3-CAT1的各种转化体的PCR鉴定结果(大小为2464bp)。泳道1-5、7-9和11是阳性转化体，PCR产物(URA3-CAT1)大小为1931 bp。其他泳道都是假阳性转化体，其没有特异性条带。标记右侧的泳道1-11显示破坏盒CAT1-gda324-URA3-CAT1的各种转化体的PCR鉴定结果。泳道1-3和8是阳性转化体，PCR产物(URA3-CAT1)大小为1931 bp，并且其他泳道都是没有特异性条带的假阳性转化体。泳道XZX显示使用热带假丝酵母XZX的染色体DNA作为模板的PCR扩增结果。PCR引物是URAU/CATR。

图8是凝胶照片，其具有通过转化破坏盒CAT1-gda245-URA3-CAT1和CAT1-gda143-URA3-CAT1而在热带假丝酵母XZX中破坏第一个CAT等位基因后弹出URA3标记基因的鉴定结果。标记左侧的通道1-4显示通过gda143盒弹出URA3的鉴定。泳道1-3是阳性转化体，原始条带(CAT1基因的序列和基因的下游序列)大小为2026bp，并且标记基因弹出后的条带大小(CAT1-gda143-CAT1的序列和下游同源臂外部的145 bp DNA)为929 bp。标记右侧的通道1-2显示通过gda245盒弹出URA3的鉴定，并且泳道1-2都是阳性转化体。原始条带具有2026 bp的大小，且标记基因弹出后的条带(CAT1-gda245-CAT1和下游同源臂外部的145bp DNA)具有1031 bp的大小。PCR产物的电泳结果符合标记基因弹出后理论预测的条带大小。泳道XZX显示使用热带假丝酵母XZX的染色体DNA作为模板的PCR产物，大小为2026 bp。PCR引物是CATU/CATLD。

图9是凝胶照片，其具有通过转化基因破坏盒CAT1-gda143-URA3-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT等位基因的鉴定结果。泳道5、9-14、16、20、23和24是阳性转化体，并且其他泳道都是假阳性转化体。阳性转化体的PCR产物(CAT1-gda143-URA3-CAT1)具有2389 bp的条带大小，并且原始条带(CAT1原始基因)具有1881 bp的大小。引物是CATU/CATR。假阳性转化体的条带(CAT1基因)具有1881 bp的大小。

图10是凝胶照片，其具有通过转化基因破坏盒CAT1-gda325-URA3-CAT1和CAT1-URA3-gda305-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT等位基因的鉴定结果。标记左侧的泳道1-11显示破坏盒CAT1-URA3-gda305-CAT1的各种转化体的PCR鉴定结果。泳道1、4、5和10是阳性转化体，并且其他泳道都是假阳性转化体。假阳性转化体的条带(CAT1基因)具有1881 bp的大小，并且基因破坏盒整合的转化体的条带(CAT1-URA3-gda305-CAT1)具有2524bp的大小。标记右侧的泳道1-12显示破坏盒CAT1-gda325-URA3-CAT1的各种转化体的PCR鉴定结果。泳道3、5和10-12是阳性转化体，并且其他泳道都是假阳性转化体。假阳性转化体的PCR产物的条带(CAT1原始基因)具有1881 bp的大小，并且基因破坏盒整合的转化体的条带(CAT1-gda325-URA3-CAT1)具有2544 bp的大小。泳道XZX显示使用热带假丝酵母XZX染色体DNA作为模板的PCR扩增的结果，大小为1881 bp (CAT1基因)。PCR引物是CATU/CATR。

图11是凝胶照片，其具有通过转化破坏盒CAT1-gda325-URA3-CAT1和CAT1-URA3-gda305-CAT1而在热带假丝酵母XZX中破坏第一个CAT等位基因后弹出URA3标记基因的鉴定结果。标记左侧的通道1-12显示用gda305盒弹出URA3的鉴定。泳道1-12是具有标记基因弹出的所有转化体。原始条带(CAT1基因)具有1881 bp的大小，且标记基因弹出后的条带(CAT1-gda305-CAT1)具有993 bp的大小。标记右侧的通道1-11显示通过gda325盒弹出URA3的鉴定。泳道2-10是阳性转化体。原始条带(CAT1基因)具有1881 bp的大小，且标记基因弹出后的条带(CAT1-gda325-URA3基因中的+858 bp至1158bp片段-CAT1)具有1335 bp的大小。PCR鉴定证实标记基因弹出后的条带符合大小的理论预测。泳道XZX是以热带假丝酵母XZX染色体DNA作为模板的PCR产物，大小为1881 bp(CAT1基因)。PCR引物是CATU/CATR。

图12是凝胶照片，其具有通过转化基因破坏盒CAT1-URA3-gda302-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT等位基因的鉴定结果。泳道1-7显示破坏盒CAT1-URA3-gda302-CAT1的各种转化体的PCR鉴定结果，泳道5和7是阳性转化体，且其他泳道是假阳性转化体。假阳性转化体的条带(CAT1原始基因)具有1881 bp的大小，且阳性转化体或破坏盒整合的转化体(CAT1-URA3-gda302-CAT1)具有2521 bp的条带大小。PCR引物是CATU/CATR。

图13是凝胶照片，其具有通过转化基因破坏盒CAT1-URA3-gda302-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT等位基因后弹出URA3标记基因的鉴定结果。泳道1-12显示通过gda302盒弹出URA3的鉴定。所有泳道都显示具有标记基因的成功弹出的菌株。原始条带(CAT1基因的序列和下游序列)具有2026 bp的大小。标记基因弹出后的条带(CAT1- URA3基因中的-423 bp至+ 16 bp -gda302 -CAT1和下游序列)具有1425 bp的大小。泳道XZX显示以热带假丝酵母XZX染色体DNA作为模板的PCR产物，大小为2026 bp (CAT1基因和下游序列)。PCR引物是CATU/CATLD。

图14是凝胶照片，其具有通过转化基因破坏盒CAT1-hisG-URA3-hisG-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT等位基因的鉴定结果。泳道1-48显示各种转化体的PCR鉴定结果。泳道2和42是阳性转化体，且其他泳道都是假阳性转化体，其不具有特异性扩增条带。阳性转化体或基因破坏盒整合的转化体(hisG1)的PCR扩增条带具有1149 bp的大小。PCR引物是His-F1和His-R1。

图15是凝胶照片，其具有通过转化基因破坏盒CAT1-hisG-URA3-hisG-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT等位基因后弹出的URA3标记基因的鉴定结果。泳道1-12显示hisG重复序列弹出URA3标记基因的效率的鉴定。所有泳道都显示标记基因弹出的菌株。原始条带具有2026 bp的大小，且标记基因弹出后的条带(CAT1-hisG-CAT1的序列和一个CAT1基因下游序列)具有2078 bp的大小。泳道XZX显示使用热带假丝酵母XZX染色体DNA作为模板的PCR产物，大小为2026 bp (CAT1基因和一个下游序列)。PCR引物是CATU/CATLD。

图16是凝胶照片，其具有通过转化基因破坏盒CAT2-gda324-URA3-CAT2破坏热带假丝酵母02中的第二个CAT等位基因(URA3/URA3, cat::gda324/CAT)的鉴定结果。泳道1-12显示各种转化体的PCR鉴定结果。泳道1、3、5、8和9是阳性转化体，并且其他泳道都是假阳性转化体。假阳性转化体不具有特异性扩增条带。破坏盒整合的转化体具有3027 bp的PCR扩增条带(从CAT2的下游同源臂至CAT1-CAT1的下游同源臂的CAT2-gda324-URA3-CAT2-片段)大小。泳道XZX显示以热带假丝酵母XZX染色体DNA作为模板的PCR产物(从CAT2基因上游同源臂至CAT1下游同源臂的CAT基因片段)，其具有1312 bp的大小。PCR引物是CAT2ndU/CATR。

图17是凝胶照片，其具有通过转化基因破坏盒CAT2-gda324-URA3-CAT2破坏热带假丝酵母02中的第二个CAT等位基因后弹出URA3标记基因的鉴定结果。泳道1-3显示通过gda324盒弹出URA3的鉴定。所有泳道都显示标记基因弹出的菌株。标记基因弹出的条带(CAT2-gda324-CAT2-CAT2下游同源臂和CAT1下游同源臂之间的片段 -CAT1)具有1444 bp的大小。泳道XZX显示以热带假丝酵母XZX染色体作为模板的PCR产物，其具有1312 bp的原始条带(CAT2上游同源臂至CAT1下游同源臂之间的CAT1基因片段)大小。PCR引物是CAT2ndU/CATR。

实施例

前面描述了优选实施方案，其，如本领域技术人员将理解，在不脱离权利要求的范围的情况下，可以进行设计、构建或操作的变化或修改。例如，这些变化旨在由权利要求的范围所涵盖。

方法和材料

尿嘧啶营养缺陷型菌株热带假丝酵母XZX用作基因破坏的靶菌株。尿嘧啶营养缺陷型菌株通过在物理或化学诱变后筛选热带假丝酵母ATTC 20336而衍生，并且突变菌株的URA3基因的开放阅读框包含改变氨基酸序列的错义突变。

具体方法如下：将作为起始菌株的热带假丝酵母ATTC 20336进行诱变11次，并用FOA选择培养基筛选，并且从FOA选择培养基(SM + 5-氟乳清酸2 g/L)中生长出总共127个菌落。将生长的菌落分别在SM平板和MM平板上培养。最后，鉴定13种URA3/URA3突变菌株；选择13种菌株中的3种，并且分别命名为热带假丝酵母XZW、热带假丝酵母XZX和热带假丝酵母XZB。DNA测序分析显示，URA3基因序列中的常见突变是在位置+608的碱基对处发生的碱基G至A的突变。引发的这种碱基突变改变了蛋白序列，并且是URA3基因的功能缺陷的主要原因(参见Zheng Xiang, Xianzhong Chen等人 2014)。

在本发明的实施例中使用以下培养基和组合物：MM(没有氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础，YNB 6.7 g/L；葡萄糖20g/L；(NH4)2SO4 10 g/L)；SM (MM +尿嘧啶60 mg/L)；和FOA培养基(SM + 5-氟乳清酸2g/L)。

在所有实施例中计算的重组效率和表1中所示的结果根据下式计算：

在所有实施例中计算的标记基因弹出效率和表2中所示的结果根据下式计算：

实施例1

通过转化基因破坏盒CAT1-gda488-URA3-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT基 因

1. 热带假丝酵母ATTC 20336菌株的培养。

将热带假丝酵母ATTC 20336接种于SM或MM培养基中，并在摇瓶中在30℃、200 rpm下培养，直至达到期望的微生物浓度以提取染色体DNA。

2. 热带假丝酵母ATTC 20336染色体DNA的分离。

(1)进行离心以获得细胞；(2)添加合适量的山梨醇-Na₂EDTA缓冲溶液(山梨醇1mol/L、Na₂EDTA 0.1 mol/L、pH 7.5)以形成微生物悬浮液，接下来添加合适量的蜗牛酶溶液(50 mg/mL)，混合直至均匀后，在37℃下进行消化4小时，以除去酵母细胞壁；(3)进行离心以收集细胞，弃去上清液，使用合适量的Tris-HCl-Na₂EDTA溶液(Tris 50 mmol/L、Na₂EDTA 20 mmol/L、pH 7.4)来轻轻悬浮细胞，添加合适量的SDS溶液(SDS 100 g/L)，并搅拌混合物直至均匀，并在65℃下孵育30分钟；(4)在微生物悬浮液变得澄清后，添加200μL乙酸钾溶液(乙酸钾5 mol/L)，搅拌混合物，直至均匀，并将其在冰浴中放置1小时；(5)以12000 rpm进行离心5分钟。将上清液转移至新的EP管，添加等体积的异丙醇，并搅拌混合物直至均匀，且然后使其在室温下静置15分钟；(6)以12000rpm进行离心5分钟，弃去上清液，将沉淀用200μL 70％乙醇溶液洗涤。弃去乙醇溶液，使沉淀自然干燥，添加33μL无菌水以溶解沉淀，添加2μL RNaseA，搅拌混合物直至均匀，并将其在37℃下孵育1小时以消化RNA；(7)孵育完成后，获得热带假丝酵母ATTC 20336染色体DNA，其可以直接作为PCR模板应用或储存在-20℃。

3. URA3基因片段和Tm-URA3载体的制备

使用热带假丝酵母ATTC 20336染色体DNA作为模板，根据NCBI中热带假丝酵母的URA3基因(GenBank登录号AB006207)设计URA3基因上游引物URAU:5'-tactctaacgacgggtacaac-3' (SEQ ID NO: 1)和下游引物URAR: 5'-acccgatttcaaaagtgcaga-3' (SEQ ID NO: 2)，进行PCR扩增以产生大小为1581 bp的URA3基因片段(SEQ ID NO: 3)。将URA3基因片段连接至商业载体pMD18-T载体(Takara Biotechnology (Dalian) Co.,Ltd, Dalian, China)以获得重组质粒，然后将其引入大肠杆菌JM109中用于扩增。重组质粒被命名为Tm-URA3。

4. gda488序列(从+671至+1158的URA3基因片段)的制备。

使用热带假丝酵母ATTC 20336染色体DNA作为模板，并在PCR中使用用上游引物Ugda488 5'-aactgcagttctgactggtaccgat-3' (SEQ ID NO: 4)和下游引物Dgda 5'-gcgtcgacacccgatttcaaaagtgcaga-3' (SEQ ID NO: 5)形成的合成的gda488序列。进行PCR扩增以产生gda488序列(SEQ ID NO. 6)。

5. 使用PstI和SalI来双重消化上述gda488片段和重组载体Tm-URA3。然后连接以形成重组质粒，将其引入大肠杆菌JM109中用于扩增。该新的重组质粒被命名为Tm-gda488-URA3。

6. 使用热带假丝酵母ATTC 20336染色体DNA作为模板，在PCR中使用CAT基因上游引物CATU 5'-gtttaactttaagttgtcgc-3' (SEQ ID NO: 7)和下游引物CATR:5'-tacaacttaggcttagcatca-3' (SEQ ID NO: 8)。进行PCR扩增以产生大小为1881 bp的CAT1基因(SEQ ID NO: 9)，其后将其连接至pMD18-T Simple Vector (Takara Biotechnology(Dalian)Co., Ltd, Dalian, China)商业载体以获得重组质粒，将其引入大肠杆菌JM109用于扩增。重组质粒被命名为Ts-CAT1。

7. 使用重组质粒Ts-CAT1作为模板，使用反向PCR引物rCATU:5'-aactgcagccaaaattcagccaaccagt-3' (SEQ ID NO: 10)和rCATR:5'-gctctagaagatgattcaaccaggcgaac-3' (SEQ ID NO: 11)以通过反向PCR扩增，并获得具有上游和下游CAT基因同源臂的片段，其被命名为CAT1-Ts-CAT1。

8. 使用限制性内切核酸酶PstI和XbaI来双重消化载体Tm-gda488-URA3。回收gda488-URA3片段并与PstI和XbaI双重消化的CAT1-Ts-CAT1片段连接以形成重组质粒。然后将质粒引入大肠杆菌JM109用于扩增。重组质粒被命名为Ts-CAT1-gda488-URA3。

9. 使用作为模板的重组质粒Ts-CAT1-gda488-URA3和CAT基因上/下游引物CATU/CATR，进行PCR扩增以获得第一个CAT等位基因破坏盒，被命名为CAT1-gda488-URA3-CAT1。

10. 使用氯化锂转化方法将完全构建的基因破坏盒CAT1-gda488-URA3-CAT1转化至尿嘧啶营养缺陷型热带假丝酵母XZX中，且然后应用至MM平板上。在完成转化体的生长后，在PCR鉴定中使用根据步骤1和2的方法分离的染色体DNA，并将鉴定为正确转化体的菌株命名为菌株01-1。PCR鉴定引物为CATU和CATR。MM平板上的转化体的总数为28，且鉴定的转化体数目为24，鉴定为正确转化的转化体的数目为6，重组效率为1转化体/μg DNA(表1)。PCR鉴定结果显示于图5中。

11. 将菌株01-1的单一菌落接种至SM液体培养基中，在摇瓶中在30℃和200 rpm下培养，直至达到指定的13-15的OD₆₀₀的细胞浓度。然后将细胞稀释并应用至SM平板用于统计测定细胞浓度；将其同时应用至FOA平板上并在30℃下培养。

12. 在3天后，计算SM平板计数；在5天后，计算FOA平板上的突变菌株的数目，并挑取单一菌落并接种于SM培养物中。

13. 通过PCR鉴定根据步骤1和2的方法分离的染色体DNA。PCR鉴定引物是CATU和来自CAT基因下游序列外侧的引物CATLD 5'-aatagaaactagcaatcggaa-3' (SEQ ID NO:12)。鉴定显示成功的URA3标记基因丢失的菌株，命名为菌株02。使用PCR来鉴定通过转化破坏盒CAT1-gda488-URA3-CAT1和CAT1-gda324-URA3-CAT1而在热带假丝酵母XZX中破坏第一个CAT等位基因后具有弹出的URA3标记基因的表达的成功菌株。DNA测序揭示，标记基因弹出后在CAT基因座处PCR产物CAT1-gda324-CAT1-CATLD的序列结构符合理论预测(两个序列的同一性为97.23％)，且具有相同方向的两个gda序列之间的标记基因片段弹出。结果还显示，通过gda488破坏盒鉴定弹出URA3。原始条带具有2026 bp的大小，且标记基因弹出后的条带(CAT1-gda488-URA3-CAT1的序列和下游同源臂外部的145bp DNA)具有1274 bp的大小。标记基因弹出效率的统计结果显示于表2中。PCR鉴定结果显示于图6中。

实施例2

通过转化基因破坏盒CAT1-gda324-URA3-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT基 因

1. 使用热带假丝酵母ATTC 20336染色体DNA作为模板、合成的gda324序列上游引物Ugda324 5'-aactgcagactaagcttctaggacgtcat-3' (SEQ ID NO. 13)和下游引物Dgda(SEQID NO: 5)作为引物，进行PCR扩增以产生gda324序列(从+ 835至+1158的URA3基因片段)(SEQ ID NO.14)。

2. 使用PstI和SalI来双重消化上述gda324片段和重组载体Tm-URA3，连接片段以形成新的重组质粒，将其引入大肠杆菌JM109用于扩增。该质粒被命名为Tm-gda324-URA3。

3. 使用PstI和XbaI来双重消化载体Tm-gda324-URA3。回收gda324-URA3片段并连接至PstI和XbaI双重消化的CAT1-Ts-CAT1片段以形成重组质粒，将其引入大肠杆菌JM109用于扩增。该质粒被命名为Ts-CAT1-gda324-URA3。

4. 使用重组质粒Ts-CAT1-gda324-URA3作为模板，根据实施例1的步骤9的方法进行PCR扩增，以获得第一个CAT等位基因破坏盒CAT1-gda324-URA3-CAT1。

5. 根据实施例1的步骤10转化XZX菌株并进行PCR鉴定。PCR鉴定结果显示于图7中。MM平板上的转化体的总数为17，鉴定的转化体的数目为11，鉴定为正确转化的转化体的数目为4，重组效率为1.24转化体/μg DNA(参见表1)。结果特异性显示破坏盒CAT1-gda245-URA3-CAT1(大小为2464bp)的各种转化体，阳性转化体(PCR产物(URA3-CAT1)大小为1931bp)，假阳性转化体(其没有特异性条带)和破坏盒CAT1-gda324-URA3-CAT1的各种转化体。PCR结果也显示阳性转化体，PCR产物(URA3-CAT1)大小为1931 bp。使用热带假丝酵母XZX的染色体DNA作为模板和对照。PCR引物是URAU/CATR。

6. 根据实施例1的步骤11-13进行标记基因丢失，并进行PCR鉴定。结果显示于图6中。标记左侧的泳道1-8是标记基因弹出的菌株。标记基因弹出效率的统计结果显示于表2中。

实施例3

通过转化基因破坏盒CAT1-gda245-URA3-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT基 因

1. 使用热带假丝酵母ATTC 20336染色体DNA作为模板、合成的gda245序列上游引物Ugda 5'-aactgcagaatggatgtagcagggatggt-3' (SEQ ID NO: 15)和下游引物Dgda(SEQ IDNO: 5)作为引物，进行PCR扩增以产生gda245序列(从+914至+1158的URA3基因片段)(SEQID NO: 16)。

2. PstI和SalI用于双重消化上述gda245片段和重组载体Tm-URA3。连接片段以形成重组质粒，将其引入大肠杆菌JM109中用于扩增。该质粒被命名为Tm-gda245-URA3。

3. 将载体Tm-gda245-URA3用PstI和XbaI双重消化。回收gda245-URA3片段并连接至PstI和XbaI双重消化的CAT1-Ts-CAT1片段以形成重组质粒，将其引入大肠杆菌JM109用于扩增。该质粒被命名为Ts-CAT1-gda245-URA3。

4. 使用重组质粒Ts-CAT1-gda245-URA3作为模板，根据实施例1的步骤9的方法进行PCR扩增，以获得第一个CAT等位基因破坏盒CAT1-gda245-URA3-CAT1。

5. 根据实施例1的步骤10的方法转化XZX菌株，并用引物URAU/CATR进行PCR鉴定。如图7中所示的鉴定结果显示，MM平板上的转化体的总数为21，鉴定的转化体的数目为12，鉴定为正确转化的转化体的数目为9，且重组效率为2.24转化体/μg DNA(参见表1)。

6. 根据实施例1的步骤11-13进行标记基因丢失，并且在通过转化破坏盒CAT1-gda245-URA3-CAT1在热带假丝酵母XZX中破坏第一个CAT等位基因后弹出URA3标记基因的PCR鉴定结果显示于图8中，其显示PCR产物符合标记基因弹出后的条带的理论预测的大小。标记基因弹出效率的统计结果显示于表2中。

实施例4

通过转化基因破坏盒CAT1-gda143-URA3-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT基 因

1. 使用热带假丝酵母ATTC 20336染色体DNA作为模板、合成的gda143序列上游引物Ugda143 5'-aactgcagtgcttgaaggtattcacgta-3' (SEQ ID NO: 17)和下游引物Dgda(SEQID NO: 5)作为引物，进行PCR扩增以产生gda143序列(从+1016至+1158的URA3基因片段)(SEQ ID NO.18)。

2. 使用PstI和SalI来双重消化上述gda143片段和重组载体Tm-URA3。连接片段以形成重组质粒，将其引入大肠杆菌JM109中用于扩增。该质粒被命名为Tm-gda143-URA3。

3. 将载体Tm-gda143-URA3通过PstI和XbaI双重消化。回收gda143-URA3片段并连接至PstI和XbaI双重消化的CAT1-Ts-CAT1片段以形成重组质粒，将其引入大肠杆菌JM109用于扩增。该质粒被命名为Ts-CAT1-gda143-URA3。

4. 使用重组质粒Ts-CAT1-gda143-URA3作为模板，根据实施例1的步骤9的方法进行PCR扩增，以获得第一个CAT等位基因破坏盒CAT1-gda143-URA3-CAT1。

5. 根据实施例1的步骤10的方法转化XZX菌株并进行PCR鉴定，结果显示，MM平板上的转化体的总数为31，鉴定的转化体的数目为24，鉴定为正确转化的转化体的数目为11，且重组效率为1.95转化体/μg DNA(参见表1)。PCR鉴定结果显示于图9中。

6. 根据实施例1的步骤11-13的方法进行标记基因丢失，并且在通过转化破坏盒CAT1-gda143-URA3-CAT1在热带假丝酵母XZX中破坏第一个CAT等位基因后弹出URA3标记基因的PCR鉴定结果显示PCR产物符合标记基因弹出后的条带的理论预测的大小。标记基因弹出效率的统计结果显示于表2中。PCR鉴定结果显示于图8中。

实施例5

通过转化基因破坏盒CAT1-gda325-URA3-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT基 因

1. 使用热带假丝酵母ATTC 20336染色体DNA作为模板、合成的gda325序列上游引物Ugda325 5'-aactgcagtcgtgattgggttcatcgc-3' (SEQ ID NO. 19)和下游引物Dgda3255'-gcgtcgaccaatgacgtcctagaagc-3' (SEQ ID NO. 20)作为引物，进行PCR扩增以产生gda325序列(从+533至+857的URA3基因片段)(SEQ ID NO. 21)。

2. 使用PstI和SalI来双重消化上述gda325片段和重组载体Tm-URA3。连接片段以形成重组质粒，将其引入大肠杆菌JM109中用于扩增。该质粒被命名为Tm-gda325-URA3。

3. 将载体Tm-gda325-URA3用PstI和XbaI双重消化。回收gda325-URA3片段并连接至PstI和XbaI双重消化的CAT1-Ts-CAT1片段以形成重组质粒，将其引入大肠杆菌JM109用于扩增。该质粒被命名为Ts-CAT1-gda325-URA3。

4. 使用重组质粒Ts-CAT1-gda325-URA3作为模板，根据实施例1的步骤9的方法进行PCR扩增，以获得第一个CAT等位基因破坏盒CAT1-gda325-URA3-CAT1。

5. 根据实施例1的步骤10的方法转化XZX菌株，并用引物URAU/CATR进行PCR鉴定(结果显示于图10中)。

6. 根据实施例1的步骤11-13的方法进行标记基因丢失，并且PCR鉴定结果显示在通过转化破坏盒CAT1-gda325-URA3-CAT1在热带假丝酵母XZX中破坏第一个CAT等位基因后弹出URA3标记基因的鉴定结果。具体而言，结果显示，通过gda325盒鉴定弹出的URA3。原始条带(CAT1基因)具有1881 bp的大小，且标记基因弹出后的条带(CAT1-gda325-URA3基因中的+858 bp至1158bp片段-CAT1)具有1335 bp的大小。PCR鉴定(结果显示于图11中)证实标记基因弹出后的条带符合大小的理论预测。对照是以热带假丝酵母XZX染色体DNA作为模板的PCR产物，大小为1881 bp(CAT1基因)。PCR鉴定引物为CATU/CATR。标记基因弹出效率的统计结果显示于表2中。

实施例6

通过转化基因破坏盒CAT1-URA3-gda305-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT基 因

1. 使用热带假丝酵母ATTC 20336染色体DNA作为模板、合成的gda305序列上游引物Ugda305 5'-gctctagatctaacgacgggtacaacga-3' (SEQ ID NO: 22)和下游引物Dgda3055'-cggaattcacgtgactagtatggcaat-3' (SEQ ID NO: 23)作为引物，进行PCR扩增以产生gda305序列(从-420至-116的URA3基因片段)(SEQ ID NO: 24)。

2. 使用XbaI和EcoRI来双重消化上述gda305片段和重组载体Tm-URA3。连接片段以形成重组质粒，将其引入大肠杆菌JM109中用于扩增。该质粒被命名为Tm-URA3-gda305。

3. 将载体Tm-URA3-gda305通过PstI和EcoRI双重消化。回收URA3-gda305片段。使用PstI和XbaI来双重消化CAT1-Ts-CAT1。然后使用pfu DNA聚合酶来填入CAT1-Ts-CAT1和dpl305-URA3片段的粘性末端，以进行平末端连接并获得重组质粒，然后将其引入大肠杆菌JM109用于扩增。该质粒被命名为Ts-CAT1-URA3-gda305。

4. 使用重组质粒Ts-CAT1-URA3-gda305作为模板，根据实施例1的步骤9的方法进行PCR扩增，以获得第一个CAT等位基因破坏盒CAT1-URA3-gda305-CAT1。

5. 根据实施例1的步骤10的方法转化XZX菌株并进行PCR鉴定，且鉴定结果显示通过转化基因破坏盒CAT1-gda325-URA3-CAT1(实施例5)和CAT1-URA3-gda305-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT等位基因。选择成功的转化体(真阳性)用于下一步。PCR鉴定结果显示于图10中。

6. 根据实施例1的步骤11-13的方法进行标记基因丢失，并且PCR鉴定结果显示在通过转化破坏盒CAT1-gda305-URA3-CAT1在热带假丝酵母XZX中破坏第一个CAT等位基因后弹出URA3标记基因的鉴定结果。具体而言，结果显示，通过gda305盒鉴定弹出的URA3。原始条带(CAT1基因)具有1881 bp的大小，且标记基因弹出后的条带(CAT1-gda305-CAT1)具有993 bp的大小。PCR鉴定证实标记基因弹出后的条带符合大小的理论预测。对照是以热带假丝酵母XZX染色体DNA作为模板的PCR产物，大小为1881 bp(CAT1基因)。PCR鉴定引物为CATI/CATR。标记基因弹出效率的统计结果显示于表2中。PCR鉴定结果显示于图11中。

实施例7

通过转化基因破坏盒CAT1-URA3-gda302-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT基 因

1. 使用热带假丝酵母ATTC 20336染色体DNA作为模板、合成的gda302序列上游引物Ugda302 5'-gctctagacatacacagaaagggcatc -3' (SEQ ID NO: 25)和下游引物Dgda3025'-cggaattcgtactgcaacatcacgg -3' (SEQ ID NO: 26)作为引物，进行PCR扩增以产生gda302序列(从+17至+318的URA3基因片段)(SEQ ID NO: 27)。

2. 使用XbaI和EcoRI来双重消化上述gda302片段和重组载体Tm-URA3。连接片段以形成重组质粒，将其引入大肠杆菌JM109中用于扩增。该质粒被命名为Tm-URA3-gda302。

3. 将载体Tm-URA3-gda302用PstI和EcoRI双重消化。回收URA3-gda302片段。使用PstI和XbaI来双重消化CAT1-Ts-CAT1。然后使用pfu DNA聚合酶来填入CAT1-Ts-CAT1和URA3-gda302片段的粘性末端，以进行平末端连接并获得重组质粒，然后将其引入大肠杆菌JM109用于扩增。该质粒被命名为Ts-CAT1-URA3-gda302。

4. 使用重组质粒Ts-CAT1-URA3-gda302作为模板，根据实施例1的步骤9的方法进行PCR扩增，以获得第一个CAT等位基因破坏盒CAT1-URA3-gda302-CAT1。

5. 根据实施例1的步骤10的方法转化XZX菌株，进行PCR鉴定，其中鉴定结果显示通过转化基因破坏盒CAT1-URA3-gda302-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个CAT等位基因的成功。假阳性转化体的条带(CAT1原始基因)具有1881 bp的大小，且阳性转化体或破坏盒整合的转化体(CAT1-URA3-gda302-CAT1)具有2521 bp的条带大小。PCR引物是CATU/CATR。PCR鉴定结果显示于图12中。

6. 根据实施例1的步骤11-13的方法进行标记基因丢失，并且PCR鉴定结果显示在通过转化破坏盒CAT1-URA3-gda302-CAT1在热带假丝酵母XZX中破坏第一个CAT等位基因后弹出URA3标记基因的结果。所有泳道都显示具有标记基因的成功弹出的菌株。原始条带(CAT1基因的序列和下游序列)具有2026 bp的大小。标记基因弹出后的条带(CAT1- URA3基因中的-423 bp至+ 16 bp-gda302-CAT1和下游序列)具有1425 bp的大小。使用的对照是以热带假丝酵母XZX染色体DNA作为模板的PCR产物，大小为2026 bp (CAT1基因和下游序列)。PCR引物是CATU/CATLD。标记基因弹出效率的统计结果显示于表2中。PCR鉴定结果显示于图13中。

比较例1

通过转化基因破坏盒CAT1-hisG-URA3-hisG-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中的第一个 CAT基因

1. hisG片段的分离：使用两对引物hisG-F1 5'-ccggaattcttccagtggtgcatgaacgc-3'(SEQ ID NO: 28)和hisG-R1 5'-cgcggattcgctgttccagtcaatcagggt-3' (SEQ ID NO: 29)以及hisG-F2 5'-acgcgtcgacttccagtggtgcatgaacgc-3' (SEQ ID NO: 30)和hisG-R2 5'-aactgcaggctgttccagtcaatcagggt-3' (SEQ ID NO: 31)进行PCR扩增。如Ko等人(2006)中所教导，使用质粒pCUB6作为模板，进行PCR，以获得两个1.1 kb hisG片段。这些被命名为：

- hisG1 (SEQ ID NO: 32)，其中两个末端具有EcoRI和Bam HI限制性酶基因座；和

- hisG2 (SEQ ID NO: 33)，其中两个末端具有SalI和PstI限制性酶基因座。

2. 使用限制性酶EcoRI和Bam HI来消化hisG1片段，然后将消化的片段插入已用相同酶消化的Tm-URA3质粒中，以获得重组质粒Tm-hisG1-URA3。

3. 使用限制性酶PstI和SalI来消化hisG2片段，然后将消化的片段插入已用相同酶消化的Tm-hisG1-URA3质粒中，以获得重组质粒Tm-hisG1-URA3-hisG2，其缩写为Tm-HUH。

4. 使用PstI和EcoRI来双重消化重组质粒Tm-HUH，并使用凝胶再循环来获得hisG1-URA3-hisG2片段；使用PstI和XbaI来双重消化CAT1-Ts-CAT1；然后使用pfu DNA聚合酶来填入CAT1-Ts-CAT1和hisG1-URA3-hisG2片段的粘性末端，以进行平末端连接，以获得重组质粒Ts-CAT1-hisG1-URA3-hisG2。

5. 使用重组质粒Ts-CAT1-hisG1-URA3-hisG2作为模板，根据实施例1的步骤9的方法进行PCR扩增，以获得第一个CAT等位基因破坏盒CAT1-hisG1-URA3-hisG2-CAT1。

6. 根据实施例1的步骤10的方法转化XZX菌株，进行PCR鉴定，其中鉴定结果显示通过转化基因破坏盒CAT1-hisG-URA3-hisG-CAT1破坏热带假丝酵母XZX中破坏的第一个CAT等位基因。阳性转化体或基因破坏盒整合的转化体(hisG1)的PCR扩增条带具有1149 bp的大小。使用的PCR引物是His-F1和His-R1。PCR鉴定结果显示于图14中。

7. 根据实施例1的步骤11-13的方法进行标记基因丢失，其中PCR鉴定结果显示在通过转化基因破坏盒CAT1-hisG-URA3-hisG-CAT1在热带假丝酵母XZX中破坏第一个CAT等位基因后URA3标记基因的弹出。所有泳道都显示标记基因弹出的菌株。原始条带具有2026bp的大小，且标记基因弹出后的条带(CAT1-hisG-CAT1的序列和一个CAT1基因下游序列)具有2078 bp的大小。对照使用热带假丝酵母XZX染色体DNA作为模板，其中大小为2026 bp(CAT1基因和一个下游序列)。PCR引物是CATU/CATLD。标记基因弹出效率的统计结果显示于表2中。PCR鉴定结果显示于图15中。

实施例8

通过转化基因破坏盒CAT2-gda324-URA3-CAT2破坏热带假丝酵母02中的第二个CAT等位基因(URA3/URA3, cat::gda324/CAT)

1. 使用热带假丝酵母ATTC 20336染色体DNA作为模板、CAT2上游引物CAT2ndU 5'-ctgaaggctccgacatcacc-3' (SEQ ID NO; 34)和CAT2下游引物CAT2ndR:5'-caaccttgtcggcgctgcta-3' (SEQ ID NO: 35)作为引物，进行PCR扩增以产生CAT2片段(SEQID NO: 36)，其后将其连接至商业载体pMD18-T Simple Vector以获得重组质粒，将其引入大肠杆菌JM109用于扩增。重组质粒被命名为Ts-CAT2。

2. 使用重组质粒Ts-CAT2作为模板、反向PCR上游引物rCAR2ndU:5'-aactgcagatctgttttgaccgtccccgtg-3' (SEQ ID NO: 37)和下游引物rCAT2ndR:5'-aactgcagatctgttttgaccgtccccgtg-3' (SEQ ID NO: 38)作为引物，进行反向PCR扩增以获得具有上游和下游CAT2基因同源臂的片段，其被命名为CAT2-Ts-CAT2。

3. 使用PstI和XbaI来双重消化载体Tm-gda324-URA3。回收gda324-URA3片段并连接至PstI和XbaI双重消化的CAT2-Ts-CAT2片段以形成重组质粒，其被命名为Ts-CAT2-gda324-URA3。将质粒引入大肠杆菌JM109用于扩增。

4. 使用重组质粒Ts-CAT2-gda324-URA3作为模板和CAT2基因片段上游和下游引物CAT2ndU和CAT2ndR作为引物，进行PCR扩增，以获得第二个CAT等位基因破坏盒，命名为CAT2-gda324-URA3-CAT2。

5. 根据实施例1的步骤10的方法转化来自实施例1的菌株02，使用CAT2ndU和CATR作为引物进行PCR鉴定，以鉴定通过转化基因破坏盒CAT2-gda324-URA3-CAT2在热带假丝酵母02中破坏第二个CAT等位基因的成功菌株(URA3/URA3, cat::gda324/CAT)。破坏盒整合的转化体具有3027 bp的PCR扩增条带(CAT2-gda324-URA3-CAT2-从CAT2的下游同源臂至CAT1-CAT1的下游同源臂的片段)大小。使用的对照是以热带假丝酵母XZX染色体DNA作为模板的PCR产物(从CAT2基因上游同源臂至CAT1下游同源臂的CAT基因片段)，其具有1312 bp的大小。PCR引物是CAT2ndU/CATR。PCR鉴定结果显示于图16中。

6. 根据实施例1的步骤11-13的方法进行标记基因丢失，并用CAT2ndU和CATR作为引物进行PCR鉴定。在PCR鉴定期间，鉴定了通过转化基因破坏盒CAT2-gda324-URA3-CAT2在热带假丝酵母02中破坏第二个CAT等位基因后弹出的URA3标记基因。所有泳道都显示标记基因弹出的菌株。标记基因弹出的条带(CAT2-gda324-CAT2-CAT2下游同源臂和CAT1下游同源臂之间的片段-CAT1)具有1444 bp的大小。使用的对照是以热带假丝酵母XZX染色体作为模板的PCR产物，其具有1312 bp的原始条带(CAT2上游同源臂至CAT1下游同源臂之间的CAT1基因片段)大小。PCR引物是CAT2ndU/CATR。通过测序验证弹出的标记基因。PCR鉴定结果显示于图17中。

根据实施例1的在标记基因弹出后在CAT基因座处的PCR产物CAT1-gda324-CAT1-CATLD的测序，揭示单个CAT等位基因的两个CAT1同源臂之间存在片段丢失，并且丢失的片段被gda序列取代。通过进行序列比较证实了这一点。因此，在分子水平证实了该CAT序列的单拷贝被破坏，并且还证实了在标记基因弹出的过程中，只有具有相同方向的两个gda序列之间的URA3基因片段弹出(在两个gda序列中，URA3基因中存在一个gda序列，另一个gda序列来自基因破坏盒，两个gda序列完全相同)。根据实施例8的在标记基因弹出后CAT基因座处的PCR产物CAT2-gda324-CAT2-CAT1的测序显示PCR产物的序列符合根据理论预测的序列(两个序列的同一性为97.05％)，并且只有两个CAT2同源臂之间的片段被gda片段替代。因此，在分子水平进一步验证双拷贝CAT等位基因破坏，显示所用的基因破坏盒可适用于热带假丝酵母的双拷贝和多基因破坏。

表1. 本发明的基因破坏盒和常规基因破坏盒的重组效率的比较。

从表1中显示的统计结果可以看出，使用gda143、gda245、gda324、gda488的基因破坏盒的转化/重组效率比现有技术的基因破坏盒(hisG-URA3-hisG)的转化/重组效率高一个数量级。

表2. gda序列长度对URA3基因弹出效率的影响。

从表2中所示的统计结果可以看出，当基因破坏盒的gda片段长度为143 bp时，URA3基因被有效地弹出。当gda片段长于300 bp时，URA3基因弹出效率显著更高，并且与常规HisG破坏盒的相当，这进一步改进了热带假丝酵母基因破坏的整体效率。

参考文献

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Ko BS, Kim J等人 (2006). “Production of xylitol from D-xylose by axylitol dehydrogenase gene-disrupted mutant of C. tropicalis.” Applied and Environmental Microbiology 2006, 72 (6): 4207-4213.

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序列表

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<120> 用于酵母细胞中同源重组敲除的基因盒

<130> 2015P00270CN

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> URAU引物

<400> 1

tactctaacg acgggtacaa c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> URAR引物

<400> 2

acccgatttc aaaagtgcag a 21

<210> 3

<211> 1578

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 3

tctaacgacg ggtacaacga gaattgtatt gaattgatca agaacatgat cttggtgtta 60

cagaacatca agttcttgga ccagactgag aatgcacaga tatacaaggc gtcatgtgat 120

aaaatggatg agatttatcc acaattgaag aaagagttta tggaaagtgg tcaaccagaa 180

gctaaacagg aagaagcaaa cgaagaggtg aaacaagaag aagaaggtaa ataagtattt 240

tgtattatat aacaaacaaa gtaaggaata cagatttata caataaattg ccatactagt 300

cacgtgagat atctcatcca ttccccaact cccaagaaaa aaaaaaagtg aaaaaaaaaa 360

tcaaacccaa agatcaacct ccccatcatc atcgtcatca aacccccagc tcaattcgca 420

atggttagca caaaaacata cacagaaagg gcatcagcac acccctccaa ggttgcccaa 480

cgtttattcc gcttaatgga gtccaaaaag accaacctct gcgcctcgat cgacgtgacc 540

acaaccgccg agttcctttc gctcatcgac aagctcggtc cccacatctg tctcgtgaag 600

acgcacatcg atatcatctc agacttcagc tacgagggca cgattgagcc gttgcttgtg 660

cttgcagagc gccacgggtt cttgatattc gaggacagga agtttgctga tatcggaaac 720

accgtgatgt tgcagtacac ctcgggggta taccggatcg cggcgtggag tgacatcacg 780

aacgcgcacg gagtgactgg gaagggcgtc gttgaagggt tgaaacgcgg tgcggagggg 840

gtagaaaagg aaaggggcgt gttgatgttg gcggagttgt cgagtaaagg ctcgttggcg 900

catggtgaat atacccgtga gacgatcgag attgcgaaga gtgatcggga gttcgtgatt 960

gggttcatcg cgcagcggga catggggggt agagaagaag ggtttgattg gatcatcatg 1020

acgcctggtg tggggttgga tgataaaggc gatgcgttgg gccagcagta taggactgtt 1080

gatgaggtgg ttctgactgg taccgatgtg attattgtcg ggagagggtt gtttggaaaa 1140

ggaagagacc ctgaggtgga gggaaagaga tacagggatg ctggatggaa ggcatacttg 1200

aagagaactg gtcagttaga ataaatattg taataaatag gtctatatac atacactaag 1260

cttctaggac gtcattgtag tcttcgaagt tgtctgctag tttagttctc atgatttcga 1320

aaaccaataa cgcaatggat gtagcaggga tggtggttag tgcgttcctg acaaacccag 1380

agtacgccgc ctcaaaccac gtcacattcg ccctttgctt catccgcatc acttgcttga 1440

aggtatccac gtacgagttg taatacacct tgaagaacgg cttcgtctga cccttgagct 1500

tcgcctcgtt gtaatgatta tacacatcca acgcttccaa cctcgataaa tggatcttct 1560

gcacttttga aatcgggt 1578

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 4

aactgcagtt ctgactggta ccgat 25

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ugda引物

<400> 5

gcgtcgacac ccgatttcaa aagtgcaga 29

<210> 6

<211> 488

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 6

ttctgactgg taccgatgtg attattgtcg ggagagggtt gtttggaaaa ggaagagacc 60

ctgaggtgga gggaaagaga tacagggatg ctggatggaa ggcatacttg aagagaactg 120

gtcagttaga ataaatattg taataaatag gtctatatac atacactaag cttctaggac 180

gtcattgtag tcttcgaagt tgtctgctag tttagttctc atgatttcga aaaccaataa 240

cgcaatggat gtagcaggga tggtggttag tgcgttcctg acaaacccag agtacgccgc 300

ctcaaaccac gtcacattcg ccctttgctt catccgcatc acttgcttga aggtatccac 360

gtacgagttg taatacacct tgaagaacgg cttcgtctga cccttgagct tcgcctcgtt 420

gtaatgatta tacacatcca acgcttccaa cctcgataaa tggatcttct gcacttttga 480

aatcgggt 488

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CATU引物

<400> 7

gtttaacttt aagttgtcgc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CATR引物

<400> 8

tacaacttag gcttagcatc a 21

<210> 9

<211> 1881

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 9

gtttaacttt aagttgtcgc aacaagtatt aaagaattcc accaaatcca ttatgccaat 60

tttgaaaaaa ccattctcca ccagccacgc aaagggtgac ttgttcaaat accagtcaca 120

attacccaag ttgcctgttc ctactttgga agaaaccgca tccaagtacc tcaagaccgt 180

tgagccattc ttgaaccaag agcaattgga atccaccaag gccaaagtcg ctgagtttgt 240

tagaccaggt ggtgccggtg aagccttgca agccagattg aacaactttg ccgccgacaa 300

ggacaactgg ttggctgaat tttgggacga ctatgcatac atgtcttata gagatcctgt 360

tgttccatat gtttcttact ttttcagtca caaggatgtc aagaacatca ttggccaaga 420

ccaattgttg aaggccactt tgattgctta ctacactatt gagttccaag aaaaggtttt 480

ggacgaaagt ttggacccag aagtcatcaa gggtaaccca ttctgtatga acgccttcaa 540

gtacatgttc aacaactcga gagttccagc tgaaggctcc gacatcaccc aacactacaa 600

cggtgaagaa aaccaatttt tcgttgtcat ctacaagaac aacttctaca aggttccaac 660

ccacaagaac ggccaaagat tgaccaaggg tgaaatctac agctacttgc aagaaatcaa 720

gaacgatgcc actccaaagg gtctcggttt gggtgctttg acctcattga acagagacga 780

atggttgagt gcctacaaca acttgttgaa gtccccaatc aacgaagctt ccttgggatc 840

catctttgct tccagctttg tcattgcctt ggactccaac aacccagtca ccattgaaga 900

aaaatccaag aactgctggc acggggacgg tcaaaacaga ttctttgaca agcctttgga 960

attcttcgtc agtgctaacg gtaactctgg tttccttggt gaacactcca gaatggacgc 1020

taccccaacc gtgcaattga acaacaccat ctacaagcaa atcttggaaa ccaatccaaa 1080

cgacttgatt gttgaaattg gttcttctgc tccaagattc ggcaatgctg aaatcttgcc 1140

tttcgacatc aacccaacca ccagagccaa catcaaagac gctattgcca agtttgacgc 1200

caccattgct gcccacgacg aagaaatctt ccaacactac ggttacggta agggattgat 1260

caagaagttc aaggtctccc cagatgccta cgtgcaattg ttgatgcaat tggcatactt 1320

caagtacacc ggcaagatca gaccaactta tgaatccgcc gccaccagaa agttcttgaa 1380

gggtagaacc gaaaccggta gaactgtttc caacgaatcc aagaagtttg ttgagacctg 1440

gtccgatcca aacgctagca gcgccgacaa ggttgccact ttccaagctg ccgctaagca 1500

acacgttgct tacttgtctg ctgccgccga tggtaagggt gtcgaccgtc acttgtttgg 1560

tttgaagcag atgattcaac caggcgaacc aatccctgaa atcttcactg acccaatctt 1620

tagctattct caaacctggt acatttcttc ttcccaagtc ccatctgaat tcttccaatc 1680

ttggggttgg tcgcaagtca ttgacgacgg tttcggtttg gcttacttga tcaacaacga 1740

ctggatccac gttcacattt cttgtaagag aggtaacggc ttgcaatccg accacttgaa 1800

atggtacttg gttgatagtg ctaacgaaat gaaggatgtc ttgactaagg gattattgac 1860

tgatgctaag cctaagttgt a 1881

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rCATU引物

<400> 10

aactgcagcc aaaattcagc caaccagt 28

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rCATR引物

<400> 11

gctctagaag atgattcaac caggcgaac 29

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CATLD引物

<400> 12

aatagaaact agcaatcgga a 21

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ugda324引物

<400> 13

aactgcagac taagcttcta ggacgtcat 29

<210> 14

<211> 324

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 14

actaagcttc taggacgtca ttgtagtctt cgaagttgtc tgctagttta gttctcatga 60

tttcgaaaac caataacgca atggatgtag cagggatggt ggttagtgcg ttcctgacaa 120

acccagagta cgccgcctca aaccacgtca cattcgccct ttgcttcatc cgcatcactt 180

gcttgaaggt atccacgtac gagttgtaat acaccttgaa gaacggcttc gtctgaccct 240

tgagcttcgc ctcgttgtaa tgattataca catccaacgc ttccaacctc gataaatgga 300

tcttctgcac ttttgaaatc gggt 324

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ugda245引物

<400> 15

aactgcagaa tggatgtagc agggatggt 29

<210> 16

<211> 245

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 16

aatggatgta gcagggatgg tggttagtgc gttcctgaca aacccagagt acgccgcctc 60

aaaccacgtc acattcgccc tttgcttcat ccgcatcact tgcttgaagg tatccacgta 120

cgagttgtaa tacaccttga agaacggctt cgtctgaccc ttgagcttcg cctcgttgta 180

atgattatac acatccaacg cttccaacct cgataaatgg atcttctgca cttttgaaat 240

cgggt 245

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ugda143引物

<400> 17

aactgcagtg cttgaaggta tccacgta 28

<210> 18

<211> 143

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 18

cttgaaggta tccacgtacg agttgtaata caccttgaag aacggcttcg tctgaccctt 60

gagcttcgcc tcgttgtaat gattatacac atccaacgct tccaacctcg ataaatggat 120

cttctgcact tttgaaatcg ggt 143

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ugda325引物

<400> 19

aactgcagtc gtgattgggt tcatcgc 27

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Dgda325引物

<400> 20

gcgtcgacca atgacgtcct agaagc 26

<210> 21

<211> 325

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 21

tcgtgattgg gttcatcgcg cagcgggaca tggggggtag agaagaaggg tttgattgga 60

tcatcatgac gcctggtgtg gggttggatg ataaaggcga tgcgttgggc cagcagtata 120

ggactgttga tgaggtggtt ctgactggta ccgatgtgat tattgtcggg agagggttgt 180

ttggaaaagg aagagaccct gaggtggagg gaaagagata cagggatgct ggatggaagg 240

catacttgaa gagaactggt cagttagaat aaatattgta ataaataggt ctatatacat 300

acactaagct tctaggacgt cattg 325

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ugda305引物

<400> 22

gctctagatc taacgacggg tacaacga 28

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Dgda305引物

<400> 23

cggaattcac gtgactagta tggcaat 27

<210> 24

<211> 305

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 24

tctaacgacg ggtacaacga gaattgtatt gaattgatca agaacatgat cttggtgtta 60

cagaacatca agttcttgga ccagactgag aatgcacaga tatacaaggc gtcatgtgat 120

aaaatggatg agatttatcc acaattgaag aaagagttta tggaaagtgg tcaaccagaa 180

gctaaacagg aagaagcaaa cgaagaggtg aaacaagaag aagaaggtaa ataagtattt 240

tgtattatat aacaaacaaa gtaaggaata cagatttata caataaattg ccatactagt 300

cacgt 305

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ugda302引物

<400> 25

gctctagaca tacacagaaa gggcatc 27

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Dgda302引物

<400> 26

cggaattcgt actgcaacat cacgg 25

<210> 27

<211> 302

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 27

catacacaga aagggcatca gcacacccct ccaaggttgc ccaacgttta ttccgcttaa 60

tggagtccaa aaagaccaac ctctgcgcct cgatcgacgt gaccacaacc gccgagttcc 120

tttcgctcat cgacaagctc ggtccccaca tctgtctcgt gaagacgcac atcgatatca 180

tctcagactt cagctacgag ggcacgattg agccgttgct tgtgcttgca gagcgccacg 240

ggttcttgat attcgaggac aggaagtttg ctgatatcgg aaacaccgtg atgttgcagt 300

ac 302

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HisG-F1引物

<400> 28

ccggaattct tccagtggtg catgaacgc 29

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HisG-R1引物

<400> 29

cgcggatccg ctgttccagt caatcagggt 30

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HisG-F2引物

<400> 30

acgcgtcgac ttccagtggt gcatgaacgc 30

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HisG-R2引物

<400> 31

aactgcaggc tgttccagtc aatcagggt 29

<210> 32

<211> 1157

<212> DNA

<213> 鼠伤寒沙门氏菌

<400> 32

ggatccgctg ttccagtcaa tcagggtatt gaagctcatg gtctttactc catcacaggg 60

ttccgcctta tccggcctac tgaacccaaa atatcaacgc attacgtagg cctgataagc 120

gcagcgccat caggcgtcag atcactccat catcttctcg atcggcagta ccagaatcga 180

gctggcgcca agcgctttca gtttctccat ggtttcccag aacaacgttt cgctgctgac 240

catgtgcatc gccacgcgct gttgctcgcc tgccagcggc agaattgtcg gcctttcggc 300

gcctggcagc agggcgataa cctcttccag tcgttcactt ggcgcgtgca tcatgatgta 360

tttcgattcg cgcgcctgaa tcacgccctg aatacgggtc agcaatttat cgatcagctg 420

ttgcttgctc tgtgccatct caccgtcgcg ctgaatcaga caggctttag agcggtagat 480

aacttcgact tcacgcaggc cgttagcttc aagcgtcgcg ccggtagaga ccaaatcgca 540

gatagcgtcg gccagccccg cgcgcggcgc gacttcgaca gaaccattta acagacacga 600

tttaaaagag acgcctttct ggtcgaggta gcgtttgagg aggtgcggat aagaggtagc 660

gatacgttta ccgtccagcg cggccgggcc gtcccaggct tcgtcaaccg gcgttgccag 720

cgataaacgg cagccgccga agtcaagacg gcgcagggtt aaatagcgtg gatcttcgcc 780

ctgcgcgcgg cggttgagta gctcttcttc cagcacgttt tcgccgataa taccgagatc 840

gaccacgcca tccatcacca gacccggaat gtcatcatca cgcacgcgca ggatatcaat 900

cggcatgttt tccgccatcg caatcaggcg ctgagtgtgt aaattaattt ttatgccgca 960

gcgggccagc aattctcgtg aatcatcgct taaacggcct gatttctgaa tagctatgcg 1020

taagcgggtg ttgtctaaca ttctgcgttc ctctttatcc tgtctgaacc ggtctgtatc 1080

gcgcgccaaa aaaaaagccc ccggaagatg atcttccggg ggctttctca tgcgttcatg 1140

caccactgga agaattc 1157

<210> 33

<211> 1157

<212> DNA

<213> 鼠伤寒沙门氏菌

<400> 33

ctgcaggctg ttccagtcaa tcagggtatt gaagctcatg gtctttactc catcacaggg 60

ttccgcctta tccggcctac tgaacccaaa atatcaacgc attacgtagg cctgataagc 120

gcagcgccat caggcgtcag atcactccat catcttctcg atcggcagta ccagaatcga 180

gctggcgcca agcgctttca gtttctccat ggtttcccag aacaacgttt cgctgctgac 240

catgtgcatc gccacgcgct gttgctcgcc tgccagcggc agaattgtcg gcctttcggc 300

gcctggcagc agggcgataa cctcttccag tcgttcactt ggcgcgtgca tcatgatgta 360

tttcgattcg cgcgcctgaa tcacgccctg aatacgggtc agcaatttat cgatcagctg 420

ttgcttgctc tgtgccatct caccgtcgcg ctgaatcaga caggctttag agcggtagat 480

aacttcgact tcacgcaggc cgttagcttc aagcgtcgcg ccggtagaga ccaaatcgca 540

gatagcgtcg gccagccccg cgcgcggcgc gacttcgaca gaaccattta acagacacga 600

tttaaaagag acgcctttct ggtcgaggta gcgtttgagg aggtgcggat aagaggtagc 660

gatacgttta ccgtccagcg cggccgggcc gtcccaggct tcgtcaaccg gcgttgccag 720

cgataaacgg cagccgccga agtcaagacg gcgcagggtt aaatagcgtg gatcttcgcc 780

ctgcgcgcgg cggttgagta gctcttcttc cagcacgttt tcgccgataa taccgagatc 840

gaccacgcca tccatcacca gacccggaat gtcatcatca cgcacgcgca ggatatcaat 900

cggcatgttt tccgccatcg caatcaggcg ctgagtgtgt aaattaattt ttatgccgca 960

gcgggccagc aattctcgtg aatcatcgct taaacggcct gatttctgaa tagctatgcg 1020

taagcgggtg ttgtctaaca ttctgcgttc ctctttatcc tgtctgaacc ggtctgtatc 1080

gcgcgccaaa aaaaaagccc ccggaagatg atcttccggg ggctttctca tgcgttcatg 1140

caccactgga agtcgac 1157

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CAT2ndU引物

<400> 34

ctgaaggctc cgacatcacc 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CAT2ndR引物

<400> 35

caaccttgtc ggcgctgcta 20

<210> 36

<211> 906

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 36

ctgaaggctc cgacatcacc caacactaca acggtgaaga aaaccaattt ttcgttgtca 60

tctacaagaa caacttctac aaggttccaa cccacaagaa cggccaaaga ttgaccaagg 120

gtgaaatcta cagctacttg caagaaatca agaacgatgc cactccaaag ggtctcggtt 180

tgggtgcttt gacctcattg aacagagacg aatggttgag tgcctacaac aacttgttga 240

agtccccaat caacgaagct tccttgggat ccatctttgc ttccagcttt gtcattgcct 300

tggactccaa caacccagtc accattgaag aaaaatccaa gaactgctgg cacggggacg 360

gtcaaaacag attctttgac aagcctttgg aattcttcgt cagtgctaac ggtaactctg 420

gtttccttgg tgaacactcc agaatggacg ctaccccaac cgtgcaattg aacaacacca 480

tctacaagca aatcttggaa accaatccaa acgacttgat tgttgaaatt ggttcttctg 540

ctccaagatt cggcaatgct gaaatcttgc ctttcgacat caacccaacc accagagcca 600

acatcaaaga cgctattgcc aagtttgacg ccaccattgc tgcccacgac gaagaaatct 660

tccaacacta cggttacggt aagggattga tcaagaagtt caaggtctcc ccagatgcct 720

acgtgcaatt gttgatgcaa ttggcatact tcaagtacac cggcaagatc agaccaactt 780

atgaatccgc cgccaccaga aagttcttga agggtagaac cgaaaccggt agaactgttt 840

ccaacgaatc caagaagttt gttgagacct ggtccgatcc aaacgctagc agcgccgaca 900

aggttg 906

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rCAT2ndU引物

<400> 37

aactgcagat ctgttttgac cgtccccgtg 30

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> rCAT2ndR引物

<400> 38

gctctagatc ttgcctttcg acatcaaccc 30

<210> 39

<211> 1578

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 39

tctaacgacg ggtacaacga gaattgtatt gaattgatca agaacatgat cttggtgtta 60

cagaacatca agttcttgga ccagactgag aatgcacaga tatacaaggc gtcatgtgat 120

aaaatggatg agatttatcc acaattgaag aaagagttta tggaaagtgg tcaaccagaa 180

gctaaacagg aagaagcaaa cgaagaggtg aaacaagaag aagaaggtaa ataagtattt 240

tgtattatat aacaaacaaa gtaaggaata cagatttata caataaattg ccatactagt 300

cacgtgagat atctcatcca ttccccaact cccaagaaaa aaaaaaagtg aaaaaaaaaa 360

tcaaacccaa agatcaacct ccccatcatc atcgtcatca aacccccagc tcaattcgca 420

atggttagca caaaaacata cacagaaagg gcatcagcac acccctccaa ggttgcccaa 480

cgtttattcc gcttaatgga gtccaaaaag accaacctct gcgcctcgat cgacgtgacc 540

acaaccgccg agttcctttc gctcatcgac aagctcggtc cccacatctg tctcgtgaag 600

acgcacatcg atatcatctc agacttcagc tacgagggca cgattgagcc gttgcttgtg 660

cttgcagagc gccacgggtt cttgatattc gaggacagga agtttgctga tatcggaaac 720

accgtgatgt tgcagtacac ctcgggggta taccggatcg cggcgtggag tgacatcacg 780

aacgcgcacg gagtgactgg gaagggcgtc gttgaagggt tgaaacgcgg tgcggagggg 840

gtagaaaagg aaaggggcgt gttgatgttg gcggagttgt cgagtaaagg ctcgttggcg 900

catggtgaat atacccgtga gacgatcgag attgcgaaga gtgatcggga gttcgtgatt 960

gggttcatcg cgcagcggga catggggggt agagaagaag ggtttgattg gatcatcatg 1020

acgcctggtg tggggttgga tgataaaggc gatgcgttgg gccagcagta taggactgtt 1080

gatgaggtgg ttctgactgg taccgatgtg attattgtcg ggagagggtt gtttggaaaa 1140

ggaagagacc ctgaggtgga gggaaagaga tacagggatg ctggatggaa ggcatacttg 1200

aagagaactg gtcagttaga ataaatattg taataaatag gtctatatac atacactaag 1260

cttctaggac gtcattgtag tcttcgaagt tgtctgctag tttagttctc atgatttcga 1320

aaaccaataa cgcaatggat gtagcaggga tggtggttag tgcgttcctg acaaacccag 1380

agtacgccgc ctcaaaccac gtcacattcg ccctttgctt catccgcatc acttgcttga 1440

aggtatccac gtacgagttg taatacacct tgaagaacgg cttcgtctga cccttgagct 1500

tcgcctcgtt gtaatgatta tacacatcca acgcttccaa cctcgataaa tggatcttct 1560

gcacttttga aatcgggt 1578

<210> 40

<211> 738

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 40

tctaacgacg ggtacaacga gaattgtatt gaattgatca agaacatgat cttggtgtta 60

cagaacatca agttcttgga ccagactgag aatgcacaga tatacaaggc gtcatgtgat 120

aaaatggatg agatttatcc acaattgaag aaagagttta tggaaagtgg tcaaccagaa 180

gctaaacagg aagaagcaaa cgaagaggtg aaacaagaag aagaaggtaa ataagtattt 240

tgtattatat aacaaacaaa gtaaggaata cagatttata caataaattg ccatactagt 300

cacgtgagat atctcatcca ttccccaact cccaagaaaa aaaaaaagtg aaaaaaaaaa 360

tcaaacccaa agatcaacct ccccatcatc atcgtcatca aacccccagc tcaattcgca 420

atggttagca caaaaacata cacagaaagg gcatcagcac acccctccaa ggttgcccaa 480

cgtttattcc gcttaatgga gtccaaaaag accaacctct gcgcctcgat cgacgtgacc 540

acaaccgccg agttcctttc gctcatcgac aagctcggtc cccacatctg tctcgtgaag 600

acgcacatcg atatcatctc agacttcagc tacgagggca cgattgagcc gttgcttgtg 660

cttgcagagc gccacgggtt cttgatattc gaggacagga agtttgctga tatcggaaac 720

accgtgatgt tgcagtac 738

<210> 41

<211> 626

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 41

tcgtgattgg gttcatcgcg cagcgggaca tggggggtag agaagaaggg tttgattgga 60

tcatcatgac gcctggtgtg gggttggatg ataaaggcga tgcgttgggc cagcagtata 120

ggactgttga tgaggtggtt ctgactggta ccgatgtgat tattgtcggg agagggttgt 180

ttggaaaagg aagagaccct gaggtggagg gaaagagata cagggatgct ggatggaagg 240

catacttgaa gagaactggt cagttagaat aaatattgta ataaataggt ctatatacat 300

acactaagct tctaggacgt cattgtagtc ttcgaagttg tctgctagtt tagttctcat 360

gatttcgaaa accaataacg caatggatgt agcagggatg gtggttagtg cgttcctgac 420

aaacccagag tacgccgcct caaaccacgt cacattcgcc ctttgcttca tccgcatcac 480

ttgcttgaag gtatccacgt acgagttgta atacaccttg aagaacggct tcgtctgacc 540

cttgagcttc gcctcgttgt aatgattata cacatccaac gcttccaacc tcgataaatg 600

gatcttctgc acttttgaaa tcgggt 626

<210> 42

<211> 354

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 42

atattgtaat aaataggtct atatacatac actaagcttc taggacgtca ttgtagtctt 60

cgaagttgtc tgctagttta gttctcatga tttcgaaaac caataacgca atggatgtag 120

cagggatggt ggttagtgcg ttcctgacaa acccagagta cgccgcctca aaccacgtca 180

cattcgccct ttgcttcatc cgcatcactt gcttgaaggt atccacgtac gagttgtaat 240

acaccttgaa gaacggcttc gtctgaccct tgagcttcgc ctcgttgtaa tgattataca 300

catccaacgc ttccaacctc gataaatgga tcttctgcac ttttgaaatc gggt 354

<210> 43

<211> 360

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母

<400> 43

atggttagca caaaaacata cacagaaagg gcatcagcac acccctccaa ggttgcccaa 60

cgtttattcc gcttaatgga gtccaaaaag accaacctct gcgcctcgat cgacgtgacc 120

acaaccgccg agttcctttc gctcatcgac aagctcggtc cccacatctg tctcgtgaag 180

acgcacatcg atatcatctc agacttcagc tacgagggca cgattgagcc gttgcttgtg 240

cttgcagagc gccacgggtt cttgatattc gaggacagga agtttgctga tatcggaaac 300

accgtgatgt tgcagtacac ctcgggggta taccggatcg cggcgtggag tgacatcacg 360

Claims

1.用于破坏酵母细胞中的至少一种靶基因的基因盒，其中所述基因盒包含：

(a) 能够用作标记基因的URA3基因；

(b) 至少一种基因破坏辅助(gda)序列；和

(c) 靶基因的上游和下游序列，

其中所述gda序列长度为至少300至600 bp，且选自SEQ ID NO: 39的核苷酸序列及其变体内。

2.根据权利要求1所述的基因盒，其中(b) 所述gda序列长度为300至500 bp。

3.根据权利要求2所述的基因盒，其中(b) 所述gda序列选自SEQ ID NO: 40的核苷酸序列内。

4.根据权利要求2所述的基因盒，其中(b) 所述gda序列选自SEQ ID NO: 41的核苷酸序列内。

5.根据权利要求2所述的基因盒，其中(b) 所述gda序列选自SEQ ID NO: 42的核苷酸序列内。

6.根据权利要求2所述的基因盒，其中(b) 所述gda序列选自SEQ ID NO: 43的核苷酸序列内。

7.根据权利要求1所述的基因盒，其中(b) 所述gda序列是选自SEQ ID NO: 16、14、18、21和24的至少一种核苷酸序列。

8.根据权利要求1所述的基因盒，其中所述酵母细胞选自白假丝酵母(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilopsis)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、多形汉逊酵母(Hansenular polymorpha)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、Kluyverei lactis、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。

9.根据权利要求1所述的基因盒，其中所述酵母细胞是尿嘧啶营养缺陷型热带假丝酵母。

10.根据权利要求1所述的基因盒，其中(a) 所述URA3基因包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列。

11.根据权利要求1所述的基因盒，其中(c) 所述靶基因的上游和下游序列长度各自为≥ 50 bp。

12.破坏至少一种酵母细胞中至少一种靶基因的表达的方法，所述方法包括用至少一种包含根据权利要求1所述的基因盒的载体转化酵母细胞。

13.权利要求12的方法，其中所述酵母细胞是尿嘧啶营养缺陷型热带假丝酵母。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述gda序列是选自SEQ ID NO: 16、14、18、21和24的至少一种核苷酸序列。

15.遗传修饰的酵母细胞，其包含根据权利要求1所述的基因盒。