JP2018537109A - 酵母細胞の破壊のための遺伝子カセット - Google Patents
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Abstract
(d)マーカ遺伝子として使用することができるURA3遺伝子;
(e)少なくとも1つの遺伝子破壊補助(gene disruption auxiliary:gda)配列;および
(f)当該標的遺伝子の上流および下流配列
を含み、当該gda配列が、少なくとも300bpから600bpの長さであり、ならびに配列番号39のヌクレオチド配列内から選択される、遺伝子カセットを提供する。
Description
本発明は、酵母細胞において標的遺伝子を破壊する手段を提供することにより、上記の問題を解決することを試みている。特に、酵母細胞を破壊する当該手段は、マーカ遺伝子、上流および下流配列を含む当該マーカ遺伝子の短鎖DNA断片、ならびに当該標的遺伝子の上流および下流配列を含む、ヌクレオチド配列を含む。中でも特に、当該マーカ遺伝子は、URA3遺伝子であり得、当該マーカ遺伝子の短鎖DNA断片は、URA3遺伝子の−420bpから+1158bpの配列(すなわち、URA3の開始コドンの420bp上流およびURA3の停止コドンの354bp下流)から選択される、約300bpから600bpの長さであり得る。
(a)マーカ遺伝子として使用することができるURA3遺伝子;
(b)少なくとも1つの遺伝子破壊補助(gene disruption auxiliary:gda)配列;および
(c)当該標的遺伝子の上流および下流配列、
を含み、
当該gda配列が、少なくとも300bpから600bpの長さであり、ならびに配列番号39およびその変異体のヌクレオチド配列内から選択される、遺伝子カセットが提供される。特に、当該gda配列は、URA3断片であり得る。
(a)マーカ遺伝子としてのURA3;
(b)−420bp(すなわち、当該開始コドンの420bp上流)においてその上流部位を有し、+1158bp(すなわち、停止コドンの354bp下流)においてその下流部位を有するURA3配列から選択されるgda配列、および
(c)当該カセットの各末端における標的遺伝子のホモロジアーム
を有する遺伝子カセットが、酵母株において遺伝子を効率的に欠失することができる場合に見出される。さらに、当該URA3遺伝子選択マーカは、繰り返し使用することができる。本発明の任意の態様により、当該配列の位置が、−nbpおよび/または+mbp(nおよびmが整数の場合)として表現される場合、位置基準は以下の通りである:コード領域におけるURA3遺伝子の開始コドンATGにおけるAの位置は+1bpとして指定され、当該開始コドンATGの上流における第1の塩基対(すなわち、Aの左側に隣接する第1の塩基対)の位置は、−1bpとして指定される。したがって、開始コドンATGのn塩基対上流の位置は−nbpとして指定され(開始コドンのnbp上流または−nbpとも呼ばれる)、当該開始コドンATGにおけるTの位置は+2bpとして指定され、当該開始コドンATGの下流において、ATGのAが第1の塩基(対)として指定される場合、m塩基(対)の位置は、+mbpとして指定される(開始コドンのmbp下流または+mbpとも呼ばれる)。付番のこの方法は、図3に示されている。
(1).標的遺伝子の上流および下流配列の調製:標的遺伝子の既知の塩基配列に従ってプロモータを設計する工程、標的遺伝子の上流および下流配列を得るためにPCRによって増幅する工程、または、標的遺伝子の既知の配列により標的遺伝子の上流および下流配列を合成する工程;この場合、標的遺伝子の上流および下流配列の長さは50bp以上である;
(2).URA3マーカ遺伝子の調製:C.トロピカリス、例えば、C.トロピカリスATTC20336、の染色体におけるURA3配列によりプロモータを設計する工程、上流調節配列、コード領域、および下流調節配列を含む、C.トロピカリスのURA3遺伝子を得るために、PCRによって増幅する工程;
(3).gda配列の調製:C.トロピカリス、例えば、C.トロピカリスATTC20336、の染色体におけるURA3配列によりプロモータを設計する工程、gda配列を得るためにPCRによって増幅する工程、この場合、当該gda配列は、URA3遺伝子コード領域および/または調節配列に由来し、ならびに300〜500bpの長さを有する;
(4).遺伝子崩壊カセットの構築:得られたgda配列を、URA3遺伝子配列の上流または下流に結合させて、gda−URA3またはURA3−gda断片を得る工程;当該配列を、それぞれ、標的遺伝子配列の上流および下流においてgda−URA3断片の両側に結合させ、その結果として、本発明の遺伝子破壊カセットを得る工程。
(1)本発明の任意の態様による遺伝子カセットの形質転換:酢酸リチウム法または塩化リチウム法によって、本発明の任意の態様による遺伝子カセットを、C.トロピカリス細胞、特にウラシル栄養要求性C.トロピカリス細胞に形質転換する工程、および形質転換体を作製するために、MM培養プレートに当該細胞を適用する工程;
(2)形質転換体の識別:MM培地において形質転換体の単一コロニを培養する工程、染色体DNAを抽出する工程、およびPCRによって増幅する工程;
(3)マーカ遺伝子の欠失(またはポップアウト):微生物濃度が適正なレベルに達するまで、30℃および200rpmでSM培地において当該遺伝子カセットの形質転換を施されたC.トロピカリス株を培養する工程、遠心分離して当該微生物を収集する工程、滅菌脱イオン水で洗浄する工程、FOAプレート上に適用する工程、および30℃で培養する工程;
(4)マーカ遺伝子の欠失の識別:当該増殖した単一微生物コロニをSMプレート上に播種し培養する工程、染色体DNAを抽出する工程、およびPCRによって識別する工程、ならびにURA3マーカ遺伝子欠失を示す突然変異株を得る工程、
を含む方法において使用することができる。
(a)マーカ遺伝子として使用することができるURA3遺伝子;
(b)少なくとも1つの遺伝子破壊補助(gda)配列;および
(c)標的遺伝子の上流および下流配列、
の全てを有し得る。
ウラシル栄養要求性菌株C.トロピカリスXZXを、遺伝子破壊のための標的菌株として使用した。当該ウラシル栄養要求性菌株は、物理的または化学的突然変異誘発の後にC.トロピカリスATTC20336のスクリーニングによって誘導し、当該突然変異株のURA3遺伝子のオープンリーディングフレームは、アミノ酸配列を変更したミスセンス突然変異を含んでいた。
組み換え効率
ポップアウト効率
遺伝子破壊カセットCAT1−gda488−URA3−CAT1の形質転換によるC.トロピカリスXZXにおける第1のCAT遺伝子の破壊
1.C.トロピカリスATTC20336株の培養
C.トロピカリスATTC20336を、SMまたはMM培地に播種し、染色体DNAを抽出するために所望の微生物濃度に達するまで、振盪フラスコにおいて30℃および200rpmで培養した。
2.C.トロピカリスATTC20336の染色体DNAの単離
(1)当該細胞を得るために遠心分離を実施し;(2)好適な量のソルビトール−Na2EDTAバッファ溶液(1mol/Lのソルビトール、0.1mol/LのNa2EDTA、pH7.5)を加えて、微生物懸濁液を形成し、次に、好適な量のSnailase溶液(50mg/mL)を加え、均一になるまで混合した後、酵母細胞壁を除去するために、37℃で4時間消化を行い;(3)遠心分離を行って当該細胞を収集し;上澄みを捨て、好適な量のトリス−HCl−Na2EDTA溶液(50mmol/Lのトリス、20mmol/LのNa2EDTA、pH7.4)を使用して当該細胞を穏やかに懸濁させ、好適な量のSDS溶液(100g/LのSDS)を加え、当該混合物を均一になるまで撹拌し、65℃で30分間インキュベートし;(4)微生物懸濁液が透明になった後、200μLの酢酸カリウム溶液(5mol/Lの酢酸カリウム)を加え、当該混合物を均一になるまで撹拌し、それを氷浴に1時間位置し;(5)遠心分離を12000rpmにおいて5分間行った。当該上澄みを新鮮なEPチューブに移し、等量のイソプロパノールを加え、当該混合物を均一になるまで撹拌し、次いで、室温で15分放置し;(6)遠心分離を1200rpmで5分間行い、上澄みを捨て、沈殿物を200μLの70%エタノール溶液で洗浄した。当該エタノール溶液を捨て、沈殿物を自然乾燥させ、33μLの滅菌水を加えて当該沈殿物を溶解させ、2μLのRNaseAを加え、当該混合物を均一になるまで撹拌し、それを、37℃で1時間インキュベートして当該RNAを消化させ;(7)インキュベートが完了した後、C.トロピカリスATTC20336の染色体DNAを得て、これは、PCRテンプレートとして直接適用することも、または−20℃で貯蔵することもできた。
3.URA3遺伝子断片およびTm−URA3ベクタの調製
C.トロピカリスATTC20336の染色体DNAをテンプレートとして使用し、URA3遺伝子の上流プライマURAU:5’−tactctaacgacgggtacaac−3’(配列番号1)、および下流プライマURAR:5’−acccgatttcaaaagtgcaga−3’(配列番号2)を、NCBIのC.トロピカリスのURA3遺伝子(GenBank Accession No.AB006207)に従って設計し、PCR増幅を実施して1581bpのサイズを有するURA3遺伝子断片(配列番号3)を生成した。当該URA3遺伝子断片を商業的ベクタのpMD18−Tベクタ(Takara Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd、大連、中国)にリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを得て、次いで、これを、増幅のために大腸菌(E.coli)JM109に導入した。当該遺伝子組換えプラスミドを、Tm−URA3と命名した。
4.gda488配列の調製(+671から+1158のURA3遺伝子断片)
C.トロピカリスATTC20336の染色体DNAをテンプレートとして使用し、上流プライマUgda488:5’−aactgcagttctgactggtaccgat−3’(配列番号4)および下流プライマDgda:5’−gcgtcgacacccgatttcaaaagtgcaga−3’(配列番号5)を使用して形成した合成gda488をPCRにおいて使用した。PCR増幅を実施して、gda488配列(配列番号6)を作製した。
5.PstIおよびSalIを使用して、上記のgda488断片および遺伝子組換えベクタTm−URA3をダブルダイジェストした。次いで、遺伝子組換えプラスミドを形成するためにリゲートし、それを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。この新しい遺伝子組換えプラスミドをTm−gda488−URA3と命名した。
6.C.トロピカリスATTC20336の染色体DNAをテンプレートとして使用し、CAT遺伝子の上流プライマCATU:5’−gtttaactttaagttgtcgc−3’(配列番号7)および当該下流プライマCATR:5’−tacaacttaggcttagcatca−3’(配列番号8)をPCRにおいて使用した。1881bpのサイズを有するCAT1遺伝子(配列番号9)を作製するためにPCR増幅を実施し、その後、それをpMD18−T Simple Vector(Takara Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd、大連、中国)商業的ベクタにリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを得て、増幅のためにそれを大腸菌JM109へと導入した。当該遺伝子組換えプラスミドをTs−CAT1と命名した。
7.遺伝子組換えプラスミドTs−CAT1をテンプレートして使用し、逆PCRプライマrCATU:5’−aactgcagccaaaattcagccaaccagt−3’(配列番号10)、およびrCATR:5’−gctctagaagatgattcaaccaggcgaac−3’(配列番号11)を使用して、逆PCRによって増幅し、上流および下流CAT遺伝子ホモロジアームを有する断片を得て、それを、CAT1−Ts−CAT1と命名した。
8.制限エンドヌクレアーゼPstIおよびXbaIを使用して、ベクタTm−gda488−URA3をダブルダイジェストした。当該gda488−URA3断片を回収し、PstIおよびXbaIでダブルダイジェストしたCAT1−Ts−CAT1断片によってリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを形成した。次いで、当該プラスミドを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。当該遺伝子組換えプラスミドをTs−CAT1−gda488−URA3と命名した。
9.テンプレートとしての遺伝子組換えプラスミドTs−CAT1−gda488−URA3およびCAT遺伝子上流/下流プライマCATU/CATRを使用して、PCR増幅を実施することにより、第1のCAT対立遺伝子破壊カセットを得て、それをCAT1−gda488−URA3−CAT1と命名した。
10.完全に構築した遺伝子破壊カセットCAT1−gda488−URA3−CAT1を、塩化リチウム形質転換法を使用してウラシル栄養要求性C.トロピカリスXZXに形質転換し、次いで、それをMMプレート上に適用した。当該形質転換体の増殖が完了した後、工程1および2の方法に従って単離した染色体DNAをPCR識別において使用し、正しい形質転換体として識別された菌株を菌株01−1と命名した。当該PCR識別プライマは、CATUおよびCATRであった。MMプレート上の形質転換体の総数は28であり、識別された形質転換体の数は24であり、正しい形質転換体として識別された形質転換体の数は6であり、遺伝子組換え効率は、1形質転換体/μgDNAであった(表1)。PCR識別結果を図5に示す。
11.菌株01−1の単一のコロニをSM液体培地に播種し、13から15のOD600である指定された細胞濃度が達成されるまで、振盪フラスコにおいて30℃および200rpmにおいて培養した。次いで、当該細胞を希釈し、細胞濃度の統計的測定のためにSMプレートに適用し;それを、同時に、FOAプレートに適用して、30℃で培養した。
12.3日後、当該SMプレートのカウントを計算し;5日後に、FOAプレートの突然変異株の数を計算し、単一のコロニを選んで、SM培養液に播種した。
13.工程1および2の方法に従って単離した染色体DNAをPCRによって識別した。PCR識別プライマは、CATUおよび、CAT遺伝子下流配列の外側からのプライマCATLD:5’−aatagaaactagcaatcggaa−3’(配列番号12)であった。URA3マーカ遺伝子の欠失の成功を示す菌株を識別し、菌株02と命名した。PCRを使用して、当該成功した菌株を識別し、これは、C.トロピカリスXZXにおける第1のCAT対立遺伝子を破壊カセットCAT1−gda488−URA3−CAT1およびCAT1−gda324−URA3−CAT1の形質転換によって破壊した後の、ポップアウトURA3マーカ遺伝子の発現を有していた。DNA配列決定により、マーカ遺伝子をポップアウトした後のCAT遺伝子座におけるPCR生成物CAT1−gda324−CAT1−CATLDの配列構造は、理論予測に一致し(2つの配列の同一性は97.23%であった)、同じ方向を有する2つのgda配列の間のマーカ遺伝子断片がポップアウトされていることが明らかとなった。当該結果はさらに、gda488破壊カセットによるURA3のポップアウトの識別も示していた。元のバンドは、2026bpのサイズを有し、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンド(CAT1−gda324−CAT1と、下流ホモロジアームの外側の145bpのDNAとを有する配列)は、1274bpのサイズを有する。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表2に示す。PCR識別結果を図6に示す。
遺伝子破壊カセットCAT1−gda324−URA3−CAT1の形質転換によるC.トロピカリスXZXにおける第1のCAT遺伝子の破壊
1.テンプレートとしてC.トロピカリスATTC20336の染色体DNA、プライマとして合成gda324配列の上流プライマUgda324:5’−aactgcagactaagcttctaggacgtcat−3’(配列番号13)および下流プライマDgda(配列番号5)を使用して、PCR増幅を実施して、gda324配列(+835から+1158のURA3遺伝子断片)(配列番号14)を作製した。
2.PstIおよびSalIを使用して、上記のgda324断片および遺伝子組換えベクタTm−URA3をダブルダイジェストして、当該断片をリゲートすることにより、新規の遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを増幅のために大腸菌JM109に導入した。このプラスミドをTm−gda324−URA3と命名した。
3.PstIおよびXbaIを使用して、ベクタTm−gda324−URA3をダブルダイジェストした。当該gda324−URA3断片を回収して、PstIおよびXbaIでダブルダイジェストしたCAT1−Ts−CAT1断片にリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。このプラスミドをTs−CAT1−gda324−URA3と命名した。
4.テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドTs−CAT1−gda324−URA3を使用して、実施例1の工程9の方法に従ってPCR増幅を実施して、第1のCAT対立遺伝子破壊カセットCAT1−gda324−URA3−CAT1を得た。
5.XZX菌株を実施例1の工程10に従って形質転換し、PCR識別を実施した。PCR識別結果を図7に示す。MMプレート上の形質転換体の総数は17であり、識別された形質転換体の数は11であり、正しく形質転換されたとして識別された形質転換体の数は4であり、遺伝子組換え効率は、1.24形質転換体/μgDNAであった(表1を参照のこと)。当該結果は、破壊カセットCAT1−gda245−URA3−CAT1(2464bpのサイズを有する)の様々な形質転換体、PCR生成物(URA3−CAT1)が1931bpのサイズを有する陽性形質転換体、特異的バンドを有さない偽陽性形質転換体、および破壊カセットCAT1−gda324−URA3−CAT1の様々な形質転換体を明確に示していた。PCRの結果も、PCR生成物(URA3−CAT1)が1931bpのサイズを有する陽性形質転換体を示した。テンプレートおよびコントロールとしてC.トロピカリスXZXの染色体DNAを使用した。当該PCRプライマは、URAU/CATRであった。
6.マーカ遺伝子の欠失を、実施例1の工程11〜13に従って実施し、PCR識別を行った。結果を図6に示す。マーカの左側のレーン1〜8は、マーカ遺伝子がポップアウトされた菌株である。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表2に示す。
遺伝子破壊カセットCAT1−gda245−URA3−CAT1の形質転換によるC.トロピカリスXZXにおける第1のCAT遺伝子の破壊
1.テンプレートとしてC.トロピカリスATTC20336染色体DNA、プライマとして合成gda245配列の上流プライマUgda:5’−aactgcagaatggatgtagcagggatggt−3’(配列番号15)および下流プライマDgda(配列番号5)を使用して、PCR増幅を実施して、gda245配列(+914から+1158のURA3遺伝子断片)(配列番号16)を作製した。
2.PstIおよびSalIを、上記のgda245断片および遺伝子組換えベクタTm−URA3のダブルダイジェストにおいて使用した。当該断片をリゲートして遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。このプラスミドをTm−gda245−URA3と命名した。
3.ベクタTm−gda245−URA3を、PstIおよびXbaIでダブルダイジェストした。当該gda245−URA3断片を回収し、PstIおよびXbaIでダブルダイジェストしたCAT1−Ts−CAT1断片にリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。このプラスミドをTs−CAT1−gda245−URA3と命名した。
4.テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドTs−CAT1−gda245−URA3を使用して、実施例1の工程9の方法に従ってPCR増幅を実施して、第1のCAT対立遺伝子破壊カセットCAT1−gda245−URA3−CAT1を得た。
5.XZX菌株を実施例1の工程10の方法に従って形質転換し、プライマURAU/CATRを用いてPCR識別を実施した。表7に示される識別結果は、MMプレート上の形質転換体の総数は21であり、識別された形質転換体の数は12であり、正しく形質転換されたとして識別された形質転換体の数は9であり、遺伝子組換え効率は、2.24形質転換体/μgDNAであることを示した(表1を参照のこと)。
6.マーカ遺伝子の欠失を、実施例1の工程11〜13に従って実施し、C.トロピカリスにおけるXZX第1のCAT対立遺伝子を破壊カセットCAT1−gda245−URA3−CAT1の形質転換によって破壊した後の、URA3マーカ遺伝子のポップアウトのPCR識別結果を図8に示しており、これは、当該PCR生成物が、マーカ遺伝子のポップアウト後の理論的に予測されるバンドサイズと一致していることを示した。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表2に示す。
遺伝子破壊カセットCAT1−gda143−URA3−CAT1の形質転換によるC.トロピカリスXZXにおける第1のCAT遺伝子の破壊
1.テンプレートとしてC.トロピカリスATTC20336染色体DNA、プライマとして合成gda143配列の上流プライマUgda143:5’−aactgcagtgcttgaaggtattcacgta−3’(配列番号17)および下流プライマDgda(配列番号5)を使用して、PCR増幅を実施して、gda143配列(+1016から+1158のURA3遺伝子断片)(配列番号18)を作製した。
2.PstIおよびSalIを使用して、上記のgda143断片および遺伝子組換えベクタTm−URA3をダブルダイジェストした。当該断片をリゲートして遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。このプラスミドをTm−gda143−URA3と命名した。
3.ベクタTm−gda143−URA3を、PstIおよびXbaIによってダブルダイジェストした。当該gda143−URA3断片を回収し、PstIおよびXbaIでダブルダイジェストしたCAT1−Ts−CAT1断片にリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。このプラスミドをTs−CAT1−gda143−URA3と命名した。
4.テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドTs−CAT1−gda143−URA3を使用して、実施例1の工程9の方法に従ってPCR増幅を実施して、第1のCAT対立遺伝子破壊カセットCAT1−gda143−URA3−CAT1を得た。
5.XZX菌株を実施例1の工程10の方法に従って形質転換して、PCR識別を実施し、結果は、MMプレート上の形質転換体の総数は31であり、識別された形質転換体の数は24であり、正しく形質転換されたとして識別された形質転換体の数は11であり、遺伝子組換え効率は、1.95形質転換体/μgDNAであることを示した(表1を参照のこと)。PCR識別結果を図9に示す。
6.マーカ遺伝子の欠失を、実施例1の工程11〜13の方法に従って実施し、C.トロピカリスXZXにおける第1のCAT対立遺伝子を破壊カセットCAT1−gda143−URA3−CAT1の形質転換によって破壊した後の、URA3マーカ遺伝子のポップアウトのPCR識別結果は、PCR生成物が、マーカ遺伝子のポップアウト後の理論的に予測されたバンドサイズと一致していることを示した。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表2に示す。PCR識別結果を図8に示す。
遺伝子破壊カセットCAT1−gda325−URA3−CAT1の形質転換によるC.トロピカリスXZXにおける第1のCAT遺伝子の破壊
1.テンプレートとしてC.トロピカリスATTC20336の染色体DNA、プライマとして合成gda325配列の上流プライマUgda325:5’−aactgcagtcgtgattgggttcatcgc−3’(配列番号19)および下流プライマDgda325:5’−gcgtcgaccaatgacgtcctagaagc−3’(配列番号20)を使用して、PCR増幅を実施して、gda325配列(+533から+857のURA3遺伝子断片)(配列番号21)を作製した。
2.PstIおよびSalIを使用して、上記のgda325断片および遺伝子組換えベクタTm−URA3をダブルダイジェストした。当該断片をリゲートして遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。このプラスミドをTm−gda325−URA3と命名した。
3.ベクタTm−gda325−URA3を、PstIおよびXbaIでダブルダイジェストした。当該gda325−URA3断片を回収し、PstIおよびXbaIでダブルダイジェストしたCAT1−Ts−CAT1断片にリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。このプラスミドをTs−CAT1−gda325−URA3と命名した。
4.テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドTs−CAT1−gda325−URA3を使用して、実施例1の工程9の方法に従ってPCR増幅を実施して、第1のCAT対立遺伝子破壊カセットCAT1−gda325−URA3−CAT1を得た。
5.XZX菌株を実施例1の工程10の方法に従って形質転換し、プライマURAU/CATRを用いてPCR識別を実施した(結果を図10に示す)。
6.マーカ遺伝子の欠失を、実施例1の工程11〜13の方法に従って実施し、PCR識別結果は、C.トロピカリスXZXにおける第1のCAT対立遺伝子を破壊カセットCAT1−gda325−URA3−CAT1の形質転換によって破壊した後の、URA3マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を示した。特に、当該結果は、gda325カセットによるURA3のポップアウトの識別を示した。元のバンド(CAT1遺伝子)は、1881bpのサイズを有し、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンド(CAT1−gda325−URA3遺伝子における+858bpから1158bpまでの断片−CAT1)は、1335bpのサイズを有していた。PCR識別(図11に示される結果)は、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンドのサイズが理論予測と一致することを確認した。当該コントロールは、テンプレートとしてC.トロピカリスXZXの染色体DNAを使用したPCR生成物であり、1881bpのサイズを有した(CAT1遺伝子)。当該PCR識別プライマは、CATU/CATRであった。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表2に示す。
遺伝子破壊カセットCAT1−URA3−gda305−CAT1の形質転換によるC.トロピカリスXZXにおける第1のCAT遺伝子の破壊
1.テンプレートとしてC.トロピカリスATTC20336の染色体DNA、プライマとして合成gda305配列の上流プライマUgda305:5’−gctctagatctaacgacgggtacaacga−3’(配列番号22)および下流プライマDgda305:5’−cggaattcacgtgactagtatggcaat−3’(配列番号23)を使用して、PCR増幅を実施して、gda305配列(−420から−116のURA3遺伝子断片)(配列番号24)を作製した。
2.XbaIおよびEcoRIを使用して、上記のgda305断片および遺伝子組換えベクタTm−URA3をダブルダイジェストした。当該断片をリゲートして遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。このプラスミドをTm−URA3−gda305と命名した。
3.ベクタTm−URA3−gda305を、PstIおよびEcoRIによってダブルダイジェストした。当該URA3−gda305断片を回収した。PstIおよびXbaIを使用して、CAT1−Ts−CAT1をダブルダイジェストした。次いで、pfu DNAポリメラーゼを使用して、CAT1−Ts−CAT1およびdpl305−URA3断片の付着末端を満たすことにより、平滑末端ライゲーションを実施して遺伝子組換えプラスミドを得て、次いで、それを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。このプラスミドをTs−CAT1−URA3−gda305と命名した。
4.テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドTs−CAT1−URA3−gda305を使用して、実施例1の工程9の方法に従ってPCR増幅を実施して、第1のCAT対立遺伝子破壊カセットCAT1−URA3−gda305−CAT1を得た。
5.当該XZX菌株を実施例1の工程10の方法に従って形質転換して、PCR識別を実施し、識別結果は、遺伝子破壊カセットCAT1−gda325−URA3−CAT1(実施例5)およびCAT1−URA3−gda305−CAT1の形質転換による、C.トロピカリスXZXにおける第1のCAT対立遺伝子の破壊を示した。次の工程のために、成功した形質転換体(真陽性)を選択した。PCR識別結果を図10に示す。
6.マーカ遺伝子の欠失を、実施例1の工程11〜13の方法に従って実施し、PCR識別結果は、C.トロピカリスXZXにおける第1のCAT対立遺伝子を破壊カセットCAT1−gda305−URA3−CAT1の形質転換によって破壊した後の、URA3マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を示した。特に、当該結果は、gda305カセットによるURA3のポップアウトの識別を示した。元のバンド(CAT1遺伝子)は、1881bpのサイズを有し、マーカ遺伝子がポップアウトされた後のバンド(CAT1−gda305−CAT1)は、993bpのサイズを有した。PCR識別は、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンドの長さが理論予測と一致することを確認した。当該コントロールは、テンプレートとしてC.トロピカリスXZXの染色体DNAを使用したPCR生成物であり、1881bpのサイズを有した(CAT1遺伝子)。当該PCR識別プライマは、CATI/CATRであった。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表2に示す。PCR識別結果を図11に示す。
遺伝子破壊カセットCAT1−URA3−gda302−CAT1の形質転換によるC.トロピカリスXZXにおける第1のCAT遺伝子の破壊
1.テンプレートとしてC.トロピカリスATTC20336の染色体DNA、プライマとして合成gda302配列の上流プライマUgda302:5’−gctctagacatacacagaaagggcatc −3’(配列番号25)および下流プライマDgda302:5’−cggaattcgtactgcaacatcacgg −3’(配列番号26)を使用して、PCR増幅を実施して、gda302配列(+17から+318のURA3遺伝子断片)(配列番号27)を作製した。
2.XbaIおよびEcoRIを使用して、上記のgda302断片および遺伝子組換えベクタTm−URA3をダブルダイジェストした。当該断片をリゲートして遺伝子組換えプラスミドを形成し、それを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。このプラスミドをTm−URA3−gda302と命名した。
3.ベクタTm−URA3−gda302を、PstIおよびEcoRIによってダブルダイジェストした。当該URA3−gda302断片を回収した。PstIおよびXbaIを使用して、CAT1−Ts−CAT1をダブルダイジェストした。次いで、pfu DNAポリメラーゼを使用して、CAT1−Ts−CAT1およびURA3−gda302断片の付着末端を満たすことにより、平滑末端ライゲーションを実施して遺伝子組換えプラスミドを得て、次いで、それを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。このプラスミドをTs−CAT1−URA3−gda302と命名した。
4.テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドTs−CAT1−URA3−gda302を使用して、実施例1の工程9の方法に従ってPCR増幅を実施して、第1のCAT対立遺伝子破壊カセットCAT1−URA3−gda302−CAT1を得た。
5.当該XZX菌株を実施例1の工程10の方法に従って形質転換し、PCR識別を実施し、この場合、当該識別結果は、遺伝子破壊カセットCAT1−URA3−gda302−CAT1の形質転換による、C.トロピカリスXZXにおける第1のCAT対立遺伝子の破壊の成功を示した。偽陽性形質転換体(元のCAT1遺伝子)のバンドは、1881bpのサイズを有し、陽性形質転換体または破壊カセット統合形質転換体(CAT1−URA3−gda302−CAT1)は、2521bpのバンドサイズを有した。当該PCRプライマは、CATU/CATRであった。PCR識別結果を図12に示す。
6.マーカ遺伝子の欠失を、実施例1の工程11〜13の方法に従って実施し、PCR識別結果は、C.トロピカリスXZXにおける第1のCAT対立遺伝子を遺伝子破壊カセットCAT1−URA3−gda302−CAT1の形質転換によって破壊した後の、URA3マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を示した。全てのレーンが、マーカ遺伝子のポップアウトの成功した菌株を示している。元のバンド(CAT1遺伝子の配列および下流配列)は、2026bpのサイズを有した。マーカ遺伝子のポップアウト後のバンド(CAT1−URA3遺伝子の−423bpから+16bpまで−gda302−CAT1および下流配列)は、1425bpのサイズを有した。使用したコントロールは、テンプレートとしてC.トロピカリスXZXの染色体DNAを用いたPCR生成物であり、2026bpのサイズ(CAT1遺伝子および下流配列)を有する。当該PCRプライマは、CATU/CATLDであった。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表2に示す。PCR識別結果を図13に示す。
遺伝子破壊カセットCAT1−hisG−URA3−hisG−CAT1の形質転換による、C.トロピカリスXZXにおける第1のCAT対立遺伝子の破壊
1.hisG断片の単離:PCR増幅を、2対のプライマhisG−F1:5’−ccggaattcttccagtggtgcatgaacgc−3’(配列番号28)およびhisG−R1:5’−cgcggattcgctgttccagtcaatcagggt−3’(配列番号29)ならびにhisG−F2:5’−acgcgtcgacttccagtggtgcatgaacgc−3’(配列番号30)およびhisG−R2:5’−aactgcaggctgttccagtcaatcagggt−3’(配列番号31)を使用して実施した。PCRを、テンプレートとしてプラスミドpCUB6を使用して、Koら(2006)において教示されるように実施して、2つの11kbのhisG断片を得た。これらを以下のように命名した:
・hisG1(配列番号32)、この場合、2つの末端はEcoRIおよびBam HI制限酵素の遺伝子座を有する;および
・hisG2(配列番号33)、この場合、2つの末端はSalIおよびPstI制限酵素の遺伝子座を有する。
2.制限酵素EcoRIおよびBam HIを使用して、hisG1断片を消化し、次いで、当該消化した断片を、同じ酵素で消化したTm−URA3プラスミドに挿入して、遺伝子組換えプラスミドTm−hisG1−URA3を得た。
3.制限酵素PstIおよびSalIを使用して、hisG1断片を消化し、次いで、当該消化した断片を、同じ酵素で消化したTm−hisG1−URA3プラスミドに挿入して、Tm−HUHと略される、遺伝子組換えプラスミドTm−hisG1−URA3−hisG2を得た。
4.PstIおよびEcoRIを使用して、当該遺伝子組換えプラスミドTm−HUHをダブルダイジェストし、ゲル再生(gel recycling)を使用して、hisG1−URA3−hisG2断片を得て;PstIおよびXbaIを使用して、CAT1−Ts−CAT1をダブルダイジェストし;次いで、pfu DNAポリメラーゼを使用して、CAT1−Ts−CAT1およびhisG1−URA3−hisG2断片の付着末端を満たすことにより、平滑末端ライゲーションを実施して遺伝子組換えプラスミドTs−CAT1−hisG1−URA3−hisG2を得た。
5.テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドTs−CAT1−hisG1−URA3−hisG2を使用して、実施例1の工程9の方法に従ってPCR増幅を実施して、第1のCAT対立遺伝子破壊カセットCAT1−hisG1−URA3−hisG2−CAT1を得た。
6.当該XZX菌株を実施例1の工程10の方法に従って形質転換し、PCR識別を実施し、この場合、当該識別結果は、遺伝子破壊カセットCAT1−hisG−URA3−hisG−CAT1の形質転換による、C.トロピカリスXZXにおける第1のCAT対立遺伝子の破壊を示した。陽性形質転換体または遺伝子破壊カセット統合形質転換体(hisG1)のPCR増幅バンドは、1149bpのサイズを有した。使用したPCRプライマは、His−F1およびHis−R1であった。PCR識別結果を図14に示す。
7.マーカ遺伝子の欠失を、実施例1の工程11〜13の方法に従って実施し、この場合、PCR識別結果は、C.トロピカリスXZXにおける第1のCAT対立遺伝子を遺伝子破壊カセットCAT1−hisG−URA3−hisG−CAT1の形質転換によって破壊した後の、URA3マーカ遺伝子のポップアウトの識別結果を示した。全てのレーンは、マーカ遺伝子がポップアウトされた菌株を示している。元のバンドは2026bpのサイズを有し、マーカ遺伝子のポップアウト後のバンド(CAT1−hisG−CAT1の配列および1つのCAT1遺伝子の下流配列)は、2078bpのサイズを有した。当該コントロールは、テンプレートとしてC.トロピカリスXZXの染色体DNAを使用し、2026bpのサイズを有した(CAT1遺伝子および1つの下流配列)。当該PCRプライマは、CATU/CATLDであった。マーカ遺伝子のポップアウト効率についての統計結果を表2に示す。PCR識別結果を図15に示す。
遺伝子破壊カセットCAT2−gda324−URA3−CAT2の形質転換による、C.トロピカリス02における第2のCAT対立遺伝子の破壊(URA3/URA3、cat::gda324/CAT)
1.テンプレートとしてC.トロピカリスATTC20336の染色体DNA、プライマとしてCAT2上流プライマCAT2ndU:5’−ctgaaggctccgacatcacc−3’(配列番号34)およびCAT2下流プライマCAT2ndR:5’−caaccttgtcggcgctgcta−3’(配列番号35)を使用して、PCR増幅を実施してCAT2断片(配列番号36)を作製し、その後に、それを市販のベクタであるpMD18−T Simple Vectorに結合させて遺伝子組換えプラスミドを得て、それを増幅のために大腸菌JM109に導入した。当該遺伝子組換えプラスミドをTs−CAT2と命名した。
2.テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドTs−CAT2、プライマとして逆PCRの上流プライマrCAR2ndU:5’−aactgcagatctgttttgaccgtccccgtg−3’(配列番号37)および下流プライマrCAT2ndR:5’−aactgcagatctgttttgaccgtccccgtg−3’(配列番号38)を使用して、逆PCR増幅を実施して、上流および下流CAT2遺伝子ホモロジアームを有する断片を得て、それを、CAT2−Ts−CAT2と命名した。
3.PstIおよびXbaIを使用して、ベクタTm−gda324−URA3をダブルダイジェストした。当該gda324−URA3断片を回収し、PstIおよびXbaIでダブルダイジェストしたCAT2−Ts−CAT2断片にリゲートすることにより、遺伝子組換えプラスミドを形成し、このプラスミドをTs−CAT2−gda324−URA3と命名した。当該プラスミドを、増幅のために大腸菌JM109に導入した。
4.テンプレートとして遺伝子組換えプラスミドTs−CAT2−gda324−URA3、プライマとしてCAT2遺伝子断片の上流および下流プライマCAT2ndUおよびCAT2ndRを使用して、PCR増幅を実施することにより、第2のCAT対立遺伝子を得て、それをCAT2−gda324−URA3−CAT2と命名した。
5.実施例1からの菌株02を、実施例1の工程10の方法に従って形質転換し、プライマとしてCAT2ndUおよびCATRを使用してPCR識別を実施することにより、遺伝子破壊カセットCAT2−gda324−URA3−CAT2の形質転換によるC.トロピカリス02における第2のCAT対立遺伝子(URA3/URA3、cat::gda324/CAT)の破壊に成功した菌株を識別した。破壊カセット統合形質転換体は、3027bpのサイズのPCR増幅バンド(CAT2−gda324−URA3−CAT2−CAT2の下流ホモロジアームからCAT1の下流ホモロジアームの断片−CAT1)を有する。使用するコントロールは、テンプレートとしてC.トロピカリスXZXの染色体DNAを用いるPCR生成物(CAT2遺伝子上流ホモロジアームからCAT1下流ホモロジアームのCAT遺伝子断片)であり、1312bpのサイズを有する。当該PCRプライマは、CAT2ndU/CATRであった。PCR識別結果を図16に示す。
6.マーカ遺伝子の欠失を、実施例1の工程11〜13の方法に従って実施し、PCR識別を、プライマとしてCAT2ndUおよびCATRを用いて実施した。PCR識別の際、C.トロピカリス02における第2のCAT対立遺伝子が遺伝子破壊カセットCAT2−gda324−URA3−CAT2の形質転換によって破壊された後の、URA3マーカ遺伝子のポップアウトが識別された。全てのレーンは、マーカ遺伝子がポップアウトされた菌株を示している。マーカ遺伝子のポップアウトされたバンド(CAT2−gda324−CAT2−CAT2下流ホモロジアームとCAT1下流ホモロジアームとの間の断片−CAT1)は、1444bpのサイズを有した。使用したコントロールは、テンプレートとしてC.トロピカリスXZXの染色体を用いたPCR生成物であり、1312bpのサイズの元のバンド(CAT2上流ホモロジアームからCAT1下流ホモロジアームの間のCAT1遺伝子断片)を有する。当該PCRプライマは、CAT2ndU/CATRであった。マーカ遺伝子のポップアウトは、配列決定によって検証した。PCR識別結果を図17に示す。
Claims (15)
- 酵母細胞において少なくとも1つの標的遺伝子の破壊のための遺伝子カセットであって、
(a)マーカ遺伝子として使用することができるURA3遺伝子;
(b)少なくとも1つの遺伝子破壊補助(gene disruption auxiliary:gda)配列;および
(c)該標的遺伝子の上流および下流配列、
を含み、
該gda配列が、少なくとも300bpから600bpの長さであり、ならびに配列番号39のヌクレオチド配列およびその変異体内から選択される、
遺伝子カセット。 - (b)前記gda配列が、300bpから500bpの長さである、請求項1に記載の遺伝子カセット。
- (b)前記gda配列が、配列番号40のヌクレオチド配列内から選択される、請求項2に記載の遺伝子カセット。
- (b)前記gda配列が、配列番号41のヌクレオチド配列内から選択される、請求項2に記載の遺伝子カセット。
- (b)前記gda配列が、配列番号42のヌクレオチド配列内から選択される、請求項2に記載の遺伝子カセット。
- (b)前記gda配列が、配列番号43のヌクレオチド配列内から選択される、請求項2に記載の遺伝子カセット。
- (b)前記gda配列が、配列番号16、14、18、21、および24からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列である、請求項1に記載の遺伝子カセット。
- 前記酵母細胞が、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilopsis)、カンジダ・クルーセイ(Candida krusei)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenular polymorpha)、イサタケンキア・オリエンタリス(Issatchenkia orientalis)、クルイベレイ・ラクチス(Kluyverei lactis)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロマイセス・マルシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)からなる群から選択される、請求項1に記載の遺伝子カセット。
- 前記酵母細胞が、ウラシル栄養要求性C.トロピカリス(C.tropicalis)である、請求項1に記載の遺伝子カセット。
- (a)前記URA3遺伝子が、配列番号3のヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の遺伝子カセット。
- (c)前記標的遺伝子の前記上流および下流配列の長さが、それぞれ、≧50bpである、請求項1に記載の遺伝子カセット。
- 少なくとも1種の酵母細胞において少なくとも1つの標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、該酵母細胞を、請求項1に記載の遺伝子カセットを含む少なくとも1種のベクタで形質転換する工程を含む、方法。
- 前記酵母細胞が、ウラシル栄養要求性C.トロピカリスである、請求項12に記載の方法。
- 前記gda配列が、配列番号16、14、18、21、および24からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列である、請求項12に記載の方法。
- 請求項1に記載の遺伝子カセットを含む、遺伝子組換え酵母細胞。
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