CN112941119A - 一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法，本发明通过阻断甾醇酯途径(ΔARE1、ΔARE2)、三酰基甘油途径(ΔDGA1、ΔLRO1)和β氧化途径(ΔPXA2)富集脂肪酰辅酶A作为生产脂肪酸乙酯的前体物质，在此基础上整合表达根据酿酒酵母密码子优化的外源基因WS2(蜡酯合成酶)构建一条可以利用葡萄糖为底物，经过一系列反应形成脂肪酸乙酯的代谢通路，并提供一种适用于所构建的酿酒酵母工程菌的发酵方法，酿酒酵母工程菌的FAEE最高产量为1.35g/L，是目前报道的利用酿酒酵母产FAEE产量中较高的。

Description

一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法
技术领域
本发明属于代谢工程技术领域，尤其涉及一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法。
背景技术
脂肪酸乙酯是柴油的前体物质，现阶段对于通过细胞工厂生产FAEE的研究并不是很多，更多的集中在利用化学合成生产FAEE作为柴油的前体物质，不过化学合成高效率的背后却对环境和原料损耗方面有着极大的负担，因此从长远角度考虑，利用细胞工厂生产脂肪酸乙酯(FAEE)更顺应时代潮流。目前已有尝试在大肠杆菌E.coli、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、产油酵母Yarrowia lipolytica等微生物体内通过代谢途径改造生产FAEE。
酿酒酵母是一种适合微生物大规模长期培养的候选菌，被认为是最具潜力的大规模生产菌种。酿酒酵母生长周期短、发酵能力强、容易进行大规模培养等优点，一直是基础及应用研究的主要对象，在食品、医药等领域应用广泛。酿酒酵母也被用于其他具有重要工业价值代谢产物的发酵。但是，在酿酒酵母中单纯通过基因敲除阻断分支途径以及异源表达WS2等手段获得的FAEE最高产量为34mg/L，还不能够适用于工业生产。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法，通过阻断甾醇酯途径(ΔARE1、ΔARE2)、三酰基甘油途径(ΔDGA1、ΔLRO1)和β氧化途径(ΔPXA2)富集脂肪酰辅酶A作为生产脂肪酸乙酯的前体物质，在此基础上整合表达根据酿酒酵母密码子优化的外源基因WS2(蜡酯合成酶)构建一条可以利用葡萄糖为底物，反应形成脂肪酸乙酯的代谢通路，并提供一种适用于所构建的酿酒酵母工程菌的发酵方法，酿酒酵母工程菌的FAEE最高产量为1.35g/L，是目前报道的利用酿酒酵母产FAEE产量中较高的。
本发明的第一个目的是提供一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法，包括如下步骤：
在酿酒酵母宿主中，阻断甾醇酯途径、三酰基甘油途径和β氧化途径，并表达了蜡酯合成酶，构建得到产脂肪酸乙酯的酿酒酵母工程菌；
在所述的酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，发酵30～40h时一次性补加1～3％菜籽油并且开始按照6～10mL/h的流速流加乙醇；并在发酵罐中葡萄糖浓度低于4～6g/L后，开始补加葡萄糖，将发酵罐葡萄糖浓度维持在5～10g/L，进行发酵培养，得到含有脂肪酸乙酯的发酵液。
进一步地，阻断甾醇酯途径是通过敲除甾醇酰基转移酶ARE1和ARE2的编码基因。
进一步地，阻断三酰基甘油途径是通过敲除甘油酰基转移酶DGA1和LRO1的编码基因。
进一步地，阻断β氧化途径是通过敲除长链脂肪酸转运体PXA2的编码基因。
进一步地，所述的蜡酯合成酶WS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，在发酵培养过程中，pH维持在5～6，发酵前30～40h转速为180～220rpm，空气流量2～3vvm，30～40h后转速为350～450rpm，空气流量4～6vvm。
进一步地，在发酵培养之前，将所述的酿酒酵母工程菌活化后在种子培养基中培养得到种子液，再将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养。
进一步地，所述的种子培养基为(g/L)：酵母粉5～15，蛋白胨15～25，葡萄糖15～25。
进一步地，所述的发酵培养基为(g/L)：葡萄糖50～70、YNB 6～7、酵母粉15～20、蛋白胨 2～4、K2HPO47～8、KH2PO49～10、醋酸2～4。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明通过阻断甾醇酯途径(ΔARE1、ΔARE2)、三酰基甘油途径(ΔDGA1、ΔLRO1)和β氧化途径(ΔPXA2)富集脂肪酰辅酶A作为生产脂肪酸乙酯的前体物质，在此基础上整合表达根据酿酒酵母密码子优化的外源基因WS2(蜡酯合成酶)构建一条可以利用葡萄糖为底物，反应形成脂肪酸乙酯的代谢通路，并提供一种适用于所构建的酿酒酵母工程菌的发酵方法，酿酒酵母工程菌的FAEE最高产量为1.35g/L，是目前报道的利用酿酒酵母产FAEE产量中较高的。
附图说明
图1为本发明所构建的ARE1等5个基因敲除盒质粒示意图；
图2为ARE1等5个基因敲除的示意图；
图3为本发明所构建的WS2基因整合框质粒示意图；
图4为蜡酯合成酶基因WS2整合示意图；
图5(a)为BY4741,BYW2,BYD5W2在摇瓶发酵只添加葡萄糖条件下的OD；(b)为BY4741,BYW2,BYD5W2在摇瓶发酵只添加葡萄糖条件下的FAEE产量；(c)为FAEE8个不同碳链的混标气质；(d)为样品BYD5W2的FAEE检测气质图；
图6(a)为探索添加乙醇,菜籽油是否对FAEE产量有影响(b)为在添加乙醇和菜籽油为基础，探索FAEE最佳发酵时间(c)为确定添加乙醇、菜籽油，发酵时间为60h，探索乙醇首次添加的最佳时间；
图7左图为BYD5W2,BYD5W2*摇瓶OD，右图为BYD5W2,BYD5W2*摇瓶FAEE产量；
图8(a)为BYD5W2,BYD5W2*发酵罐OD(b)为BYD5W2,BYD5W2*发酵罐FAEE产量。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
所用的培养基配方：
(1)YPD培养基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20。
(2)LB培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠10。
(3)MM培养基(g/L)：YNB 6.7、葡萄糖20、硫酸铵10。
(4)SM培养基(g/L)：YNB 6.7、葡萄糖20、硫酸铵10、尿嘧啶0.06。
(5)5-FOA培养基：在SM培养基的基础上添加1g/L 5-FOA。
(6)摇瓶发酵培养基：葡萄糖20、YNB 6.7、酵母粉6、蛋白胨3、K2HPO4 7.2、KH2PO49.3、醋酸3、尿嘧啶0.06(尿嘧啶缺陷菌株培养时添加，尿嘧啶未缺陷菌株培养时不添加)。
(7)发酵罐培养基：葡萄糖60、YNB 6.7、酵母粉18、蛋白胨3、K2HPO4 7.2、KH2PO49.3、醋酸3、尿嘧啶0.06(尿嘧啶缺陷菌株培养时添加，尿嘧啶未缺陷菌株培养时不添加)。
发酵液细胞破碎以及脂肪酸乙酯萃取和检测
取发酵液10mL，加入1％蜗牛酶振荡混匀，置37度培养箱反应12h进行初步破壁处理，然后再利用超声波破碎仪在35W功率条件下冰上低温破碎100min进一步破壁，使细胞彻底释放出产物。在超声破碎细胞后立即向细胞液中加入20mL正己烷，上下颠倒使其充分混匀，在振荡仪上振荡15s后，7000rpm离心10min，分离并收集有机层。再重复添加正己烷进行二次萃取。在真空离心浓缩仪中利用正己烷的易挥发性对萃取的脂肪酸乙酯进行浓缩。将萃取后浓缩干的样品按比例复溶于正己烷中，过膜后取1mL进行气质检测。气质分析条件为： DB-5MS毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，进样器温度和柱温均为300℃。升温程序：起始80℃，维持1min；然后以2℃/min升温至100℃；15℃/min升温至280℃，保持 2min；最后以30℃/min升温至300℃，保持3min。质谱：EI离子源，四级杆检测器；电离能70eV，离子源表面温度为280℃。
表1引物序列
Figure BDA0002912017760000041
注：下划线是酶切位点序列实施例1：
酿酒酵母ARE1,ARE2,DGA1,LRO1,PXA2基因敲除盒质粒构建：
1.对酿酒酵母BY4741基因组进行分析，获得5个基因，分别为ARE1、ARE2、 DGA1、LRO1、PXA2基因，根据基因序列构建敲除盒。
2.以基因ARE1敲除盒构建为例，设计引物ARE1-F和ARE1-R，以酿酒酵母BY4741 基因组为模板，PCR扩增ARE1基因，经PCR试剂盒纯化后，与pMD19-T Simple载体进行连接，获得重组质粒Ts-ARE1。
3.以质粒Ts-ARE1为模板，设计引物ReARE1-F和ReARE1-R(分别添加XbaⅠ酶切位点)，反向PCR得到片段ARE1U-Ts-ARE1D，凝胶回收该片段，将该片段与质粒Ts-HO-gda-URA3同时经限制性内切酶XbaⅠ消化，凝胶回收后将片段ARE1U-Ts-ARE1D与片段 gda393-URA3连接，获得重组质粒Ts-ARE1-gda393-URA3，构建过程见图1。
酿酒酵母ARE1,ARE2,DGA1,LRO1,PXA2基因敲除过程：
1.以上述重组质粒为模板，用引物ARE1-F和ARE1-R，PCR得到敲除盒ARE1U-gda393-URA3-ARE1D；利用相似策略，构建其他基因敲除盒。
2.以尿嘧啶缺陷型菌株BY4741为出发菌株，以URA3基因为筛选标记，采用LiCl转化法将敲除盒依次转入酿酒酵母BY4741中。敲除盒转入宿主后涂布到MM固体培养基挑取转化子，提取基因组，PCR验证鉴定出正确转化子。
3.将上述步骤正确的转化子涂布到5-FOA培养基上，再次挑选转化子，提取基因组， PCR初步验证弹出URA3基因后，将PCR产物送至公司测序，序列比对无误后保藏正确菌株，命名为BYD5；此方法可以重复利用筛选标记URA3。ARE1基因敲除过程为例，具体敲除过程见图2。
实施例2：
酿酒酵母蜡酯合成酶基因WS2整合框质粒的构建：
1.对酿酒酵母BY4741基因组进行分析，选取高拷贝位点HO位点，根据基因序列构建整合框。首先设计引物HO-F和HO-R，以酿酒酵母BY4741基因组为模板，PCR扩增HO基因，经PCR试剂盒纯化后，与pMD19-T Simple载体进行连接，获得重组质粒Ts-HO。
2.以质粒Ts-HO为模板，设计引物ReHO-F和ReHO-R(分别添加XbaⅠ酶切位点)，反向PCR得到片段HOU-Ts-HOD,凝胶回收后将片段HOU-Ts-HOD与片段gda393-URA3(末端连接XbaⅠ酶切位点)连接，获得重组质粒Ts-HO-gda393-URA3。
3.以PMRI-21质粒为载体骨架，将GAL10启动子替换成酿酒酵母强启动子TDH3，蜡酯合成酶WS2基因是根据酿酒酵母密码子优化后的基因，两端带有酶切位点BamHI、XhoI，通过酶切连接可以将蜡酯合成酶WS2基因插入PMRI-21质粒启动子TDH3和终止子CYC1 之间，形成WS2的表达框，质粒命名为pMRI-21-TDH3-WS2-CYC1。用Sma I酶切Ts-HO- gda393-URA3将其线性化，最后通过一步连接将WS2表达框TDH3-WS2-CYC1连接到Ts- HO-gda393-URA3上形成重组质粒Ts-HO-gda393-URA3-TDH3-WS2-CYC1。
酿酒酵母蜡酯合成酶基因WS2整合过程：
1.以上述重组质粒为模板，用引物HO-F和HO-R，PCR得到WS2整合框HO-gda393-URA3-TDH3-WS2-CYC1，具体整合框构建过程见图3。
2.以BY4741中敲除了ARE1、ARE2、DGA1、LRO1、PXA2、URA3基因的菌株BYD5 为出发菌株，仍以URA3基因为筛选标记，采用LiCl转化法将整合框转入出发菌株中，整合框转入宿主后涂布到MM固体培养基挑取转化子，提取基因组，PCR验证鉴定出正确转化子。
3.将上述步骤正确的转化子涂布到5-FOA培养基上，再次挑选转化子，提取基因组， PCR初步验证弹出URA3基因后，将PCR产物送至公司测序，序列比对无误后保藏正确菌株，命名为酿酒酵母BYD5W2；此方法可以重复利用筛选标记URA3，具体整合和URA3敲除过程见图4。
此外，以BY4741为出发菌株，仍以URA3基因为筛选标记，采用LiCl转化法将酿酒酵母蜡酯合成酶基因WS2整合框转入出发菌株中，整合框转入宿主后涂布到MM固体培养基挑取转化子，提取基因组，PCR验证鉴定出正确转化子。将正确的转化子涂布到5-FOA培养基上，再次挑选转化子，提取基因组，PCR初步验证弹出URA3基因后，将PCR产物送至公司测序，序列比对无误后保藏正确菌株，命名为酿酒酵母BYW2。
实施例3：
以BY4741和BYW2为对照，将BY4741、BYW2和BYD5W2菌株分别于YPD固体平板上划线活化，置30℃培养箱中培养48h获得单菌落。从平板上挑取单菌落接种至10mL 的YPD液体培养基中培养36h后以2％接种量接种于50mL发酵液体培养基中，于30℃,200 rpm摇床中发酵培养60h，发酵过程中只补充葡萄糖，整个发酵过程中控制葡萄糖含量维持在10g/L。
结果如图5，如图5(a)所示，原始出发菌株BY4741的菌体浓度OD600最大为20.3，BYW2在出发菌株BY4741的基础上有些许提升，菌体浓度OD600达到21.7，而目的菌株 BYD5W2相较于BY4741与BYW2生长明显受限，菌体浓度OD600只能达到5.1，由此可见，甾醇酯途径、三酰基甘油途径以及β氧化途径的敲除会阻碍菌株的生长。
从菌株BY4741，BYW2和BYD5W2出发，如图5(b)所示，对FAEE产量进行测定，在只补加葡萄糖的发酵条件下，菌株BYD5W2的FAEE产量最高，为11.72mg/L；FAEE不同碳链混标质谱图如图5(c)所示，样品BYD5W2中FAEE检测质谱图如图5(d)所示。
实施例4：
酿酒酵母BYD5W2摇瓶发酵罐优化：
(1)采用YPD培养基活化酿酒酵母BYD5W2，接一个单菌落于10mLYPD培养基， 30℃，200rpm培养36h；
(2)将步骤(1)种子液以2％接种量接种于50mL发酵培养基中，30℃，200rpm发酵60h；
(3)以BYD5W2为出发菌株，首先对是否添加乙醇，菜籽油提升脂肪酸乙酯产量进行探索：1号摇瓶只补加葡萄糖，2号摇瓶补加葡萄糖和乙醇，3号摇瓶补加葡萄糖，乙醇和菜籽油；
(4)以步骤(3)为基础呢，探索脂肪酸乙酯最佳发酵时间，发酵时间取48h，60h，72h，84h，96h；
(5)以步骤(4)发酵条件为基础，探索乙醇最添加模式，一次性过量加入乙醇会对菌体生长在成影响，因此采用分批等量且以相同间隔时间添加乙醇，首次添加乙醇时间取12h， 16h，20h，24h，28h，32h，36h，40h，44h，48h，52h。
结果如图6，如图6(a)所示，只补加葡萄糖发酵时，BYD5W2的FAEE产量为11.72 mg/L，在此基础上补加乙醇，FAEE产量提升到36.1mg/L，相对于只补加葡萄糖FAEE产量提升了3.1倍；在此基础上继续补加2％菜籽油，FAEE产量进一步提升到59.3mg/L，相对于只补加葡萄糖FAEE产量提升了5.1倍。结果表明，FAEE发酵过程中补加乙醇和菜籽油会显著提升FAEE产量。
在摇瓶中添加乙醇和菜籽油，进行发酵时间的优化，分别发酵48h，60h，72h，84h，96h终止发酵，测定FAEE产量。如图6(b)所示，发酵时间为60h时FAEE产量最高，为 59.3mg/L。
确定发酵时间为60h后，我们对乙醇的添加模式进行探索，由于一次性加入过量乙醇会影响菌体生长所以我们采用分批等量的方式以相同间隔时间进行乙醇的添加。如图6(c)所示，首次补加乙醇时间取12h，16h，20h，24h，28h，32h，36h，40h，44h，48h，52 h，56h，发现在20h时开始补加乙醇，每次补加量为2％，间隔时间为6h时，FAEE产量达到最高，为144.4mg/L。
实施例5：
酿酒酵母已弹URA3菌株BYD5W2和未弹URA3菌株BYD5W2*进行发酵罐发酵优化：
(1)采用YPD培养基活化已弹URA3的酿酒酵母菌株BYD5W2和未弹URA3的酿酒酵母菌株BYD5W2*，分别接一个单菌落于10mLYPD培养基，30℃，200rpm培养36h；
(2)将步骤(1)种子液以2％接种量接种于50mLYPD培养基中，30℃，200rpm培养至OD＝2；
(3)将步骤(2)的二级种子液以10％接种量接种于3L发酵罐培养基中，发酵36h时一次性补加2％菜籽油并且开始流加乙醇，流速控制在8mL/h，并在发酵罐中葡萄糖浓度低于5g/L后，补加葡萄糖，将发酵罐葡萄糖浓度维持在5～10g/L之间，pH维持5.5，发酵前 36h转速控制在200rpm，空气流量3vvm，36h后转速提高到400rpm，空气流量5vvm，发酵总时间为72h。
对比了尿嘧啶缺陷菌株BYD5W2与尿嘧啶未缺陷菌株BYD5W2*的FAEE产量的差别，摇瓶数据如图7，如图7中左图所示，尿嘧啶缺陷的BYD5W2菌株最大菌体浓度OD600达到 5.1，这也是限制FAEE产量的重要因素之一，尿嘧啶未缺陷的BYD5W2*菌株最大菌体浓度 OD600可以达到8.8；如图7中右图所示，尿嘧啶缺陷的BYD5W2菌株的FAEE最高产量为 144.4mg/L，而尿嘧啶未缺陷的BYD5W2*菌株的FAEE最高产量达到了192.5mg/L；发酵罐数据如图8，如图8(a)所示，尿嘧啶缺陷的BYD5W2菌株最大菌体浓度OD600达到24.8，尿嘧啶未缺陷的BYD5W2*菌株最大菌体浓度OD600可以达到35.2；如图8(b)所示，尿嘧啶缺陷的BYD5W2菌株的FAEE最高产量为0.618g/L，而尿嘧啶未缺陷的BYD5W2*菌株的 FAEE最高产量达到了1.35g/L。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
gccaccatga agagattagg tactctagac gctagttggc ttgcagtcga atccgaagat 60
acgccaatgc acgtgggcac tctccaaatc ttctcattac cagaaggtgc tccagagaca 120
tttctacgtg atatggttac aaggatgaaa gaggcaggag atgttgcccc accatggggt 180
tacaagctcg catggtccgg tttccttggc agggttattg ctcctgcctg gaaggtagac 240
aaagatatcg atttggatta tcatgtccga catagtgcat tgccaagacc aggtggtgaa 300
agagagctag ggatacttgt ttctagatta cactccaacc ctttagattt ctctagacca 360
ctatgggaat gccatgtcat tgaaggtctt gaaaacaaca gatttgcact gtatactaag 420
atgcatcact ctatgattga tgggatatct ggagtaagat tgatgcaaag agtattgacc 480
actgacccag agagatgtaa catgcctcct ccatggacag ttagacctca ccagagaaga 540
ggagctaaaa cagataaaga ggcttctgtg cctgctgcgg tttctcaagc aatggacgcc 600
ttgaagctcc aagcggatat ggcccctaga ctatggcaag ctggcaatcg tctagtacat 660
tctgtcagac accctgagga tggcttaaca gctccattca ccggtccagt gtctgtcctt 720
aaccatagag ttacagcgca gagaagattc gctactcaac actaccaact agatagattg 780
aaaaacttag cgcatgccag tggtggttca ctgaatgata tagtgcttta cttatgtggt 840
actgccttga gaaggttttt ggctgagcag aataacttgc ctgacacacc tttaacggca 900
ggaattccag tgaatatcag accagctgat gacgaaggca ccggaacaca aatctcattc 960
atgattgcta gtttggctac tgacgaagct gatcctctca atagattaca acagatcaaa 1020
acctcaacac gaagggcgaa ggagcatctc caaaagttgc ctaagtcagc actaacacaa 1080
tacacaatgc tgctgatgtc accttacatc ttacaattga tgagcggatt gggaggtaga 1140
atgaggccag ttttcaatgt tactataagc aatgtccctg ggcctgaggg gacattgtat 1200
tacgaaggag ctagattgga agccatgtac ccagtttccc ttatcgccca cggtggtgcc 1260
ttgaacatca catgcctgtc ttacgctggc tcccttaact ttgggtttac cggttgtcgt 1320
gatactttac catcaatgca aaagttagca gtctatactg gtgaagcatt ggatgaactc 1380
gaatctctaa ttctgccacc aaagaagcgt gcccgtacta gaaagtaa 1428
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
atctacgtgt tcgcatggat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
cttgcccgta gaaacttggt 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
caatctataa cagtggacga cgag 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
cacaattcca ccagtcaccg t 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
ttctttgtct ctccgttc 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
ggcactaggt taatattccc 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
tctactttcc tttaaatagc cctt 24
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
tcaaatcgaa tgaaattgcc gt 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
agctcaatac gcaaacttca c 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
aaagcccgcc tagaatacga aat 23
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
tgctctagac ctgctcttcg acatgattcc g 31
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
tgctctagat ggctcttcat aacaaacacc 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
tgctctagaa ttccccaaca atatcagtgc 30
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
tgctctagat ttctaaagta ggtcccacg 29
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 16
tgctctagaa aaccaacttt tacgcttt 28
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 17
tgctctagaa catcataagc ctttgtcg 28
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 18
cggactagtc gctccaaagg cagttcca 28
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 19
cggactagtg tttctgctct ctcgcttg 28
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 20
tgctctagaa ctgcatctag ctctatcgga ag 32
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 21
tgctctagaa caattaagcc cagtgccaaa g 31
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 22
tctagaacag ggtgaacgtt acagaa 26
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 23
gtatggtgca ctctcagttt cgccctttga cgttg 35
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 24
ctgagagtgc accataccac a 21
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 25
tctagacccg ggttttcgcc ctttgacgtt 30
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 26
tatacgcgtc ggactagtac agggtgaacg ttacagaa 38
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 27
atcttcattg cgttttcgcc ctttgacgtt 30
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 28
cgtgcctgcg atgagatac 19
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 29
ggcgtatttc tactccagca 20
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 30
ccatggatga ggcccgcgga cagcatc 27
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 31
gttcaccctg ttctagagac gaccaggtca gctagggag 39
<210> 32
<211> 42
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 32
gcgaaaaccc gggtctagat tgtatcgaga tcacttttcg tg 42
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 33
ccatggtggg ccgaatcgcg taaaaag 27
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 34
gtgtggggga tcactatact agcgttgaat gttagcg 37
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 35
attacggatc cggggtttgt ttgtttatgt gtgtttattc 40
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 36
actttcaacg ttccagcctt c 21
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 37
cgtaaattgg aacgacgtga gta 23
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 38
gtctggattg gtggttct 18
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 39
gtgaacgata gatggacc 18
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 40
ggcactctcc aaatcttc 18
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 41
ctgcctcttt catccttg 18

Claims (9)

1.一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
在酿酒酵母宿主中，阻断甾醇酯途径、三酰基甘油途径和β氧化途径，并表达了蜡酯合成酶，构建得到产脂肪酸乙酯的酿酒酵母工程菌；
在所述的酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，发酵30～40h时一次性补加1～3％菜籽油并且开始按照6～10mL/h的流速流加乙醇；并在发酵罐中葡萄糖浓度低于4～6g/L后，开始补加葡萄糖，将发酵罐葡萄糖浓度维持在5～10g/L，进行发酵培养，得到含有脂肪酸乙酯的发酵液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，阻断甾醇酯途径是通过敲除甾醇酰基转移酶ARE1和ARE2的编码基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，阻断三酰基甘油途径是通过敲除甘油酰基转移酶DGA1和LRO1的编码基因。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，阻断β氧化途径是通过敲除长链脂肪酸转运体PXA2的编码基因。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蜡酯合成酶WS2的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵培养过程中，pH维持在5～6，发酵前30～40h转速为180～220rpm，空气流量2～3vvm，30～40h后转速为350～450rpm，空气流量4～6vvm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵培养之前，将所述的酿酒酵母工程菌活化后在种子培养基中培养得到种子液，再将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基为(g/L)：酵母粉5～15，蛋白胨15～25，葡萄糖15～25。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为(g/L)：葡萄糖50～70、YNB 6～7、酵母粉15～20、蛋白胨2～4、K2HPO4 7～8、KH2PO4 9～10、醋酸2～4。
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