CN112522126B - 高产微生物油脂红酵母基因工程菌及其构建和培养方法 - Google Patents

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CN112522126B CN202011601319.1A CN202011601319A CN112522126B CN 112522126 B CN112522126 B CN 112522126B CN 202011601319 A CN202011601319 A CN 202011601319A CN 112522126 B CN112522126 B CN 112522126B
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Abstract

本发明公开了一株高产微生物油脂红酵母基因工程菌及其构建和培养方法。本发明以一株保藏编号为CCTCC NO：M 2019503、颜色突变的红酵母U13N3为出发菌株，通过设计特定gRNA序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，实现三酰甘油脂肪酶AOX2和ATG15功能同时缺失，构建了高产微生物油脂红酵母基因工程菌。本发明的红酵母基因工程菌，以甘油为碳源，发酵120h后胞内油脂含量最高达到0.854g/g干细胞，产油脂能力强，且由于出发菌株颜色突变，所提取油脂的色素含量低，简化了后续处理工艺，适用于工业化大规模生产。

Description

高产微生物油脂红酵母基因工程菌及其构建和培养方法
技术领域
本发明涉及一种高产微生物油脂红酵母基因工程菌及其构建和培养方法，属于基因工程菌领域。
背景技术
以可再生清洁能源替代资源日渐枯竭的化石能源已经成为全世界能源需求的发展共识。部分微生物(产油微藻、产油酵母、产油霉菌、产油细菌)所产油脂通过碱解、甲酯化反应后可以制备生物柴油。与化石来源柴油相比，这类生物柴油具有热值高、污染物排放少等优点。因此，在各种可再生能源研究中，以微生物油脂规模化生产为目的的第三代生物燃料技术研究越来越受到人们的重视。
在各类产油微生物中，产油酵母对培养条件要求低、油脂含量较高且油脂种类更适于制备生物柴油。红酵母(Rhodotorula spp.)能够积累超过自身细胞干重30％以上的油脂，能够耐受高密度发酵，是一类具有较大工业化应用潜力的产油酵母。但是，红酵母在积累微生物油脂的同时还会合成胡萝卜素类脂溶性有色化合物，造成粗提油脂颜色呈红棕色，加大了后处理难度。中国专利申请2019112415037公开了一株颜色突变为浅黄色的红酵母菌株，其油脂含量为0.551g/g干菌体，油脂在发酵液中浓度为18.2g/L。在合成生物油脂的同时，红酵母胞内的三酰甘油脂肪酶会降解已合成油脂，造成油脂积累速率下降。此外，红酵母细胞壁成分复杂且核酸G+C含量超过60％，常规基因工程操作方法很难对其进行改造。研究发现，CRISPR/Cas9基因编辑工具在红酵母基因操作中获得了成功(Schultz JC,Cao M,Zhao H.Development of a CRISPR/Cas9 system for high efficiencymultiplexed genedeletion in Rhodosporidiumtoruloides.Biotechnology andBioengineering.2019,116(8):2103-2109.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产微生物油脂红酵母基因工程菌及其构建和培养方法。
本发明所述的高产微生物油脂红酵母基因工程菌，以红酵母U13N3为出发菌株，通过设计特异性的gRNA表达盒，利用CRISPR/Cas9基因编辑工具以使得出发菌株三酰甘油分解途径上脂肪酶关键控制基因AOX2和ATG15碱基部分缺失，从而使脂肪酶失活，提高微生物油脂在胞内的积累量和油脂生产强度。所述的红酵母U13N3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019503，保藏日期为2019年6月28日，保藏地址为中国武汉市武汉大学，已在中国专利申请2019112415037充分公开。
本发明所述的高产微生物油脂红酵母基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
步骤1，合成能使红酵母Rhodotorula sp.U13N3的AOX2和ATG15基因功能同时缺失的序列片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤2，将上述序列依次通过限制性内切酶和T4 DNA连接酶的酶切和酶连作用与基础质粒NM1-5S-tRNA-SgH(来源于http://www.addgene.org/，ID：128178)连接组成含有gRNA功能的质粒；
步骤3，采用农杆菌转化法依次将含有Cas9酶的质粒NM9-SpCas9-NLS(来源于http://www.addgene.org/，ID：128177)和步骤2构建的质粒转入出发菌株红酵母Rhodotorula sp.U13N3，然后在抗性固体培养基中挑选阳性克隆，获得成功转化的高产微生物油脂红酵母基因工程菌。
本发明中，所述的抗性固体培养基的组成为：100μg/mL潮霉素B，120μg/mL G418，甘油30g/L，KH2PO42g/L，酵母粉1.5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，(NH4)2SO4 1.2g/L，琼脂15g/L。
本发明所述的高产微生物油脂红酵母基因工程菌的培养方法，包括以下步骤：
将生长在抗性固体培养基上的红酵母工程菌单菌落接种到含有种子培养基的摇瓶中，33～37℃振荡培养，然后接种至发酵培养基中，于33～37℃振荡发酵，在发酵培养的前48h维持发酵液pH在5.5～6.0，随后，调节并维持发酵液pH在3.8～4.2，直至发酵结束。
优选地，振荡培养和振荡发酵的转速为200～250rpm。
优选地，接种量为5％～10％。
优选地，发酵培养基的组成为：甘油30～100g/L，KH2PO4 2g/L，酵母粉1.5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，(NH4)2SO4 1.2g/L。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明采用的出发菌株红酵母Rhodotorula sp.U13N3对胡萝卜素合成能力缺失，在该出发菌株中所提取油脂色素含量极低，粗提油脂质量明显提高，明显降低后处理工艺难度，降低生产成本。
(2)本发明提供的序列中，两段特征序列能够同时实现对AOX2和ATG15基因的高效识别和切割，基因编辑成功率高。
(3)本发明的红酵母基因工程菌，发酵120h后，油脂含量最高达到0.854g/g干细胞，油脂浓度最高达到38.2g/L，远远高于出发菌株(出发菌株在同样培养条件下油脂含量为0.551g/g干菌体，油脂在发酵液中浓度为18.2g/L)，并且远高于现用产油菌株，其利用甘油作为碳源，具有极大的产业化应用潜力。
附图说明
图1为酵母菌落PCR鉴定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
(1)为实现红酵母Rhodotorula sp.U13N3的AOX2和ATG15基因功能同时缺失，合成下列序列：5’-ATCTGCGGCCATACCGCGATGAACACACCGCGTCTCGTCCGATCCGCGAAGTTAAGCATCGCAGGGGCCAGAGAGTATTGCCGTGGGTGACCAGGCGAGAACACTGTGCTGCCGCAGGTGGCGGTGTGGCCAAGTGGCACGGCACCTGTTTCCGGCGCAGGAGATCGAGGGTTCGATCCCCTTCACCGTCGCAAGTCCCAGATCCACTACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTTGGTACCCGGGATCTGCGGCCATACCGCGATGAACACACCGCGTCTCGTCCGATCCGCGAAGTTAAGCATCGCAGGGGCCAGAGAGTATTGCCGTGGGTGACCAGGCGAGAACACTGTGCTGCCGCAGGTGGCGGTGTGGCCAAGTGGCACGGCACCTGTTTCCGGCGCAGGAGATCGAGGGTTCGATCCCCTTCACCGTCGCTGGAAACTGGTACGATATCTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO.1)，其中5’-CAAGTCCCAGATCCACTACA-3’为针对AOX2操作所必须，5’-CTGGAAACTGGTACGATATC-3’为针对ATG15操作所必须。
步骤2，将上述序列依次通过限制性内切酶和T4 DNA连接酶的酶切和酶连作用与基础质粒NM1-5S-tRNA-SgH(来源于http://www.addgene.org/，ID：128178)连接组成含有gRNA功能的质粒；
步骤2，采用农杆菌转化法依次将含有Cas9酶的质粒NM9-SpCas9-NLS(来源于http://www.addgene.org/，ID：128177)与验证正确的含有gRNA功能的质粒导入红酵母U13N3中，随机挑取抗性培养皿上的单菌落鉴定，鉴定片段大小为360bp，所用DNAmaker为DL1000，获得成功转化的高产微生物油脂红酵母基因工程菌。琼脂糖凝胶电泳结果如图1。所挑取的12个转化子均有大小验证正确的条带，其中CK组为出发菌株对照，表明质粒已成功转入红酵母基因组。菌落PCR使用鉴定引物如下：
pRS-marker:5’-CGGCATCAGAGCAGATTGTA-3’(SEQ ID NO.2)，
pBR322ori-F:5’-GGGAAACGCCTGGTATCTTT-3’(SEQ ID NO.3)。
抗性固体培养基的组成为：100μg/mL潮霉素B，120μg/mL G418，甘油30g/L，KH2PO42g/L，酵母粉1.5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，(NH4)2SO4 1.2g/L，琼脂15g/L。
实施例2
挑取生长在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖-琼脂(YPD)固体培养基上的红酵母基因工程菌单菌落，用生理盐水稀释涂布于新鲜YPD培养基，待生长出单菌落后，按照上述方法重新稀释涂布。其中YPD固体培养基组成为：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖和2％琼脂。
经50次重复后，随机挑取两个单菌落，提取菌株的基因组DNA，采用扩增引物为：
AOX2 F:5'-ACCGCTTCACCTTCACCCG-3'(SEQ ID NO.4)，
AOX2 R:5'-TCCGCCGATCCACCACTTC-3'(SEQ ID NO.5)，
ATG15F:5'-CTTCCCGCCGTTATCAGCC-3'(SEQ ID NO.6)，
ATG15R:5'-CCGTCGTAGCAATCGCACA-3'(SEQ ID NO.7)。
以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后回收纯化PCR产物，交由苏州金唯智生物科技有限公司测序。测序结果与GenBank中的AOX2与ATG15基因的CDS序列进行比对，结果如下。分析结果表明，该工程菌株gRNA质粒可稳定存在并切割靶位点基因。
U13N3strand(+):CACCGCCATGAACCGAGGCGCCAGGTACATCACCTAGACCCTGAACAGCTTGCGCCC(SEQ ID NO.8)，
U13N3strand(-):GTGGCGGTACTTGGCTCCGCGGTCCATGTAGTGGATCTGGGACTTGTCGAACGCGGG(SEQ ID NO.9)，
AOX21:GTGGCGGTACTTGG
Figure BDA0002868877990000041
GTGGATCTGGGACTTGTCGAACGCGGG(SEQ IDNO.10)，
AOX22:GTGGCGGTACTTGGCTCC
Figure BDA0002868877990000042
GGATCTGGGACTTGTCGAACGCGGG(SEQ IDNO.11)，
U13N3strand(+):CGTGCGCCAAGGTGGGGCTGGGCTATAGCATGGTCAAAGGTCGCAGCCCGCAGCAC(SEQ ID NO.12)，
U13N3strand(-):GCACGCGGTTCCACCCCGACCCGATATCGTACCAGTTTCCAGCGTCGGGCGTCGTG(SEQ ID NO.13)，
ATG151:GCACGCGGTTCCA
Figure BDA0002868877990000051
GTACCAGTTTCCAGCGTCGGGCGTCGTG(SEQ IDNO.14)，
ATG152:GCACGCGGTTCCACC
Figure BDA0002868877990000052
TCGTACCAGTTTCCAGCGTCGGGCGTCGTG(SEQ IDNO.15)。
注：方框中碱基序列为工程菌株的AOX2和ATG15基因对比出发菌株的缺失部分。原间隔序列临近基序(PAM)识别位点用下划线标出，sgRNA序列用加粗标出。
实施例3
挑取1环生长在抗性固体培养基上的红酵母工程菌单菌落接种到含有20mL种子培养基的100mL摇瓶中，35℃培养，摇瓶转速200rpm，48h后得到种子培养液。种子培养基组成为：甘油80g/L，KH2PO42g/L，酵母粉1.5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，(NH4)2SO41.2g/L，pH为5.6。
将20mL种子液接种到含有80mL发酵培养基的500mL摇瓶中，35℃条件下培养，摇瓶转速200rpm，维持pH6.0不变，48h后调节发酵液pH至4.0并保持不变，120h后发酵结束。发酵培养基组成为：甘油100g/L，KH2PO42g/L，酵母粉1.5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，(NH4)2SO41.2g/L。
将所得的发酵液经离心处理，得到红酵母菌体。然后向菌体沉淀中加入6mol/L盐酸至菌体悬浮液中盐酸终浓度为4mol/L，随后65℃水浴处理30min，再用沸水浴处理10min，得到细胞破碎液。向菌体破碎液中加入等体积氯仿-甲醇(体积比2：1)混合液并充分振荡，离心收集含有油脂的下层有机相。减压蒸发除去有机溶剂后，回收剩余油脂。称重计算红酵母工程菌中油脂含量为0.854g/g干菌体，油脂在发酵液中浓度为38.2g/L。
按照上述相同的方法培养出发菌株Rhodotorula sp.U13N3、收集菌体并提取油脂。所有培养基均不含有抗生素。称重计算红酵母出发菌株中油脂含量为0.551g/g干菌体，油脂在发酵液中浓度为18.2g/L。
序列表
<110> 南京理工大学
<120> 高产微生物油脂红酵母基因工程菌及其构建和培养方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 526
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atctgcggcc ataccgcgat gaacacaccg cgtctcgtcc gatccgcgaa gttaagcatc 60
gcaggggcca gagagtattg ccgtgggtga ccaggcgaga acactgtgct gccgcaggtg 120
gcggtgtggc caagtggcac ggcacctgtt tccggcgcag gagatcgagg gttcgatccc 180
cttcaccgtc gcaagtccca gatccactac agttttagag ctagaaatag caagttaaaa 240
taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt ttttttggta 300
cccgggatct gcggccatac cgcgatgaac acaccgcgtc tcgtccgatc cgcgaagtta 360
agcatcgcag gggccagaga gtattgccgt gggtgaccag gcgagaacac tgtgctgccg 420
caggtggcgg tgtggccaag tggcacggca cctgtttccg gcgcaggaga tcgagggttc 480
gatccccttc accgtcgctg gaaactggta cgatatcttt tttttt 526
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggcatcaga gcagattgta 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggaaacgcc tggtatcttt 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accgcttcac cttcacccg 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccgccgatc caccacttc 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttcccgccg ttatcagcc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgtcgtagc aatcgcaca 19
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> 红酵母(Rhodotorula)
<400> 8
caccgccatg aaccgaggcg ccaggtacat cacctagacc ctgaacagct tgcgccc 57
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> 红酵母(Rhodotorula)
<400> 9
gggcgcaagc tgttcagggt ctaggtgatg tacctggcgc ctcggttcat ggcggtg 57
<210> 10
<211> 57
<212> DNA
<213> 红酵母(Rhodotorula)
<400> 10
gtggcggtac ttggctccgc ggtccatgta gtggatctgg gacttgtcga acgcggg 57
<210> 11
<211> 57
<212> DNA
<213> 红酵母(Rhodotorula)
<400> 11
gtggcggtac ttggctccgc ggtccatgta gtggatctgg gacttgtcga acgcggg 57
<210> 12
<211> 56
<212> DNA
<213> 红酵母(Rhodotorula)
<400> 12
cgtgcgccaa ggtggggctg ggctatagca tggtcaaagg tcgcagcccg cagcac 56
<210> 13
<211> 56
<212> DNA
<213> 红酵母(Rhodotorula)
<400> 13
gtgctgcggg ctgcgacctt tgaccatgct atagcccagc cccaccttgg cgcacg 56
<210> 14
<211> 56
<212> DNA
<213> 红酵母(Rhodotorula)
<400> 14
gcacgcggtt ccaccccgac ccgatatcgt accagtttcc agcgtcgggc gtcgtg 56
<210> 15
<211> 56
<212> DNA
<213> 红酵母(Rhodotorula)
<400> 15
gcacgcggtt ccaccccgac ccgatatcgt accagtttcc agcgtcgggc gtcgtg 56

Claims (6)

1.高产微生物油脂红酵母基因工程菌，其特征在于，以红酵母U13N3为出发菌株，其三酰甘油脂肪酶AOX2和ATG15功能同时缺失，所述的红酵母U13N3的保藏编号为CCTCC NO：M2019503；
通过以下步骤构建：
步骤1，合成能使红酵母U13N3的AOX2和ATG15基因功能同时缺失的序列片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤2，将上述序列依次通过限制性内切酶和T4 DNA连接酶的酶切和酶连作用与基础质粒NM1-5S-tRNA-SgH连接组成含有gRNA功能的质粒；
步骤3，采用农杆菌转化法依次将含有Cas9酶的质粒NM9-SpCas9-NLS和步骤2构建的质粒转入出发菌株红酵母U13N3，然后在抗性固体培养基中挑选阳性克隆，获得成功转化的高产微生物油脂红酵母基因工程菌。
2.根据权利要求1所述的高产微生物油脂红酵母基因工程菌，其特征在于，所述的抗性固体培养基的组成为：100µg/mL潮霉素B，120µg/mL G418，甘油30g/L，KH2PO42g/L，酵母粉1.5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，(NH4)2SO4 1.2g/L，琼脂15g/L。
3.根据权利要求1所述的高产微生物油脂红酵母基因工程菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将生长在抗性固体培养基上的红酵母工程菌单菌落接种到含有种子培养基的摇瓶中，33~37℃振荡培养，然后接种至发酵培养基中，于33~37℃振荡发酵，在发酵培养的前48h维持发酵液pH在5.5~6.0，随后，调节并维持发酵液pH在3.8~4.2，直至发酵结束。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，振荡培养和振荡发酵的转速为200~250 rpm。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，接种量为5%~10%。
6.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，发酵培养基的组成为：甘油30~100g/L，KH2PO4 2g/L，酵母粉1.5g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，(NH4)2SO4 1.2g/L。
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