CN106715678A - 提高产油酵母中的脂质生产 - Google Patents

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Abstract

公开了用于通过提高1型二酰甘油酰基转移酶(即DGA2)的活性和提高2型二酰甘油酰基转移酶(即DGA1)的活性来增加细胞的三酰甘油含量的方法和组合物。在一些实施方案中，还通过降低相同细胞中的三酰甘油脂肪酶的活性来改变细胞的三酰甘油含量。还公开了用于通过提高1型二酰甘油酰基转移酶(即DGA2)的活性或通过提高3型二酰甘油酰基转移酶(即DGA3)的活性来增加细胞的三酰甘油含量的方法和组合物。

Description

提高产油酵母中的脂质生产
相关申请
本申请要求2014年5月29日提交的美国临时专利申请号62/004,502、2014年8月6日提交的美国临时专利申请号62/033,853和2014年12月10日提交的美国临时专利申请号62/090,169的优先权的权益。
序列表
本申请含有序列表，其以ASCII格式电子提交且通过引用以其整体结合到本文中。2015年5月29日创建的所述ASCII副本命名为NGX-03225_SL.txt，大小为259,379字节。
发明背景
脂质是食物和化妆品工业中必不可少的成分，并且它们是生物柴油和生化工业中的重要前体。许多产油微生物产生脂质，包括充分表征的酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
可通过增量调节、减量调节或缺失涉及脂质途径的基因，来提高产油生物的脂质生产。最新数据表明二酰甘油酰基转移酶蛋白DGA1的活性可能是在产油生物中积累高水平脂质的重要因素。例如，据报告，解脂耶氏酵母中天然解脂耶氏酵母二酰甘油酰基转移酶蛋白DGA1的增量调节显著提高其脂质产量和产率(Metabolic Engineering 15:1-9(2013))。
解脂耶氏酵母DGA1蛋白是由解脂耶氏酵母二酰甘油酰基转移酶基因DGAT2编码的2型二酰甘油酰基转移酶。DGA1是脂质途径中的关键酶之一，参与三酰甘油(“TAG”)合成的最后步骤。三酰甘油是解脂耶氏酵母中贮存脂质的主要形式。酵母还含有1型二酰甘油酰基转移酶基因DGAT1，其编码DGA2蛋白。
可将二酰甘油酰基转移酶基因导入宿主基因组以影响脂质生产和组成，包括来自其它生物的DGA1和DGA2基因。例如其它产油酵母，例如圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)和斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)能够比野生型解脂耶氏酵母菌株积累显著更多的脂质，且与天然解脂耶氏酵母DGA1的过量表达相比，来自具有较高天然脂质生产水平的生物的DGA1蛋白的表达对解脂耶氏酵母脂质生产具有更大作用(USSN 61/943,664和PCT专利申请号PCT/US15/017227；通过引用结合到本文中)。
此外，已缺失参与脂质分解或参与从脂质生物合成中流出的途径的基因以提高细胞的脂质含量。例如，Dulermo等人证实三酰甘油脂肪酶基因TGL3的缺失使由解脂耶氏酵母积累的总脂质含量几乎翻倍(Biochimica Biophysica Acta 1831:1486-95 (2013))。
然而，功能性酶的成功的增量调节大多是不可预测的。例如，其它实验表明表达来自高山被孢霉(Mortierella alpine)的DGA1对解脂耶氏酵母脂质含量没有显著作用(美国专利7,198,937；通过引用结合到本文中)。同样，已表明在不存在其它遗传修饰时表达DGA2对酵母的脂质含量没有显著作用。
发明概述
在一些实施方案中，本发明涉及包含第一遗传修饰和第二遗传修饰的转化细胞，其中所述第一遗传修饰提高天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因，且所述第二遗传修饰提高天然2型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的2型二酰甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，转化细胞包含第三遗传修饰，其中所述第三遗传修饰降低细胞中三酰甘油脂肪酶的活性。
在一些实施方案中，本发明涉及包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰提高天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因。
在一些实施方案中，本发明涉及包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰提高天然3型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的3型二酰甘油酰基转移酶基因。
在某些方面，本发明提供增加细胞的脂质含量的方法，所述方法包括用第一核苷酸序列和第二核苷酸序列转化亲本细胞，其中所述第一核苷酸序列提高天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的1型二酰甘油酰基转移酶基因，且所述第二核苷酸序列提高天然2型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的2型二酰甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，所述方法包括用第三核苷酸序列转化亲本细胞，其中所述第三核苷酸序列降低三酰甘油脂肪酶的活性。上述方法还可用来改变细胞的脂质组成。
在某些方面，本发明提供增加细胞的脂质含量的方法，所述方法包括用核苷酸序列转化亲本细胞，其中所述核苷酸序列提高天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的1型二酰甘油酰基转移酶基因。上述方法还可用来改变细胞的脂质组成。
在某些方面，本发明提供增加细胞的脂质含量的方法，所述方法包括用核苷酸序列转化亲本细胞，其中所述核苷酸序列提高天然3型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的3型二酰甘油酰基转移酶基因。上述方法还可用来改变细胞的脂质组成。
在某些方面，本发明提供增加细胞的三酰甘油含量的方法，所述方法包括：(a)提供包含以下的细胞：(i)第一遗传修饰，其中所述第一遗传修饰提高天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因；和(ii)第二遗传修饰，其中所述第二遗传修饰提高天然2型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的2型二酰甘油酰基转移酶基因；(b)使所述细胞在表达第一和第二遗传修饰的条件下生长，从而产生三酰甘油；和(c)任选回收三酰甘油。在一些实施方案中，细胞包含第三遗传修饰，其中所述第三遗传修饰降低细胞中三酰甘油脂肪酶的活性。上述方法还可用来改变细胞的脂质组成。
在某些方面，本发明提供增加细胞的三酰甘油含量的方法，所述方法包括：(a)提供包含遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰提高天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因；(b)使所述细胞在表达该遗传修饰的条件下生长，从而产生三酰甘油；和(c)任选回收三酰甘油。
在某些方面，本发明提供增加细胞的三酰甘油含量的方法，所述方法包括：(a)提供包含遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰提高天然3型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的3型二酰甘油酰基转移酶基因；(b)使所述细胞在表达该遗传修饰的条件下生长，从而产生三酰甘油；和(c)任选回收三酰甘油。
附图简述
图1表示用于在解脂耶氏酵母菌株NS18 (获自ARS Culture Collection，NRRL# YB392)中表达二酰甘油酰基转移酶DGA1基因NG66的pNC243构建体的图。在转化前通过PacI/NotI限制酶切消化使载体pNC243线性化。“2u ori”表示来自2 μm圆形质粒的酿酒酵母(S. cerevisiae)复制起点；“pMB1 ori”表示来自pBR322质粒的大肠杆菌(E. coli) pMB1复制起点；“AmpR”表示用作用氨苄西林选择的标记的bla基因；“PR2”表示解脂耶氏酵母GPD1启动子-931至-1；“NG66”表示通过GenScript合成的天然圆红冬孢酵母DGA1 cDNA；“TER1”表示在终止(stop)后的解脂耶氏酵母CYC1终止子300个碱基对；“PR22”表示酿酒酵母TEF1启动子-412至-1；“NG3”表示用作用诺尔丝菌素选择的标记的诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei) Nat1基因；“TER2”表示在终止后的酿酒酵母CYC1终止子275个碱基对；“Sc URA3”表示用于在酵母中选择的酿酒酵母URA3营养缺陷型标记。
图2表示用于在解脂耶氏酵母菌株NS18中过量表达NG15基因(YlDga1)的pNC104构建体的图。在转化前通过PacI/NotI限制酶切消化使载体pNC104线性化。“2u ori”表示来自2 μm圆形质粒的酿酒酵母复制起点；“pMB1 ori”表示来自pBR322质粒的大肠杆菌pMB1复制起点；“AmpR”表示用作用氨苄西林选择的标记的bla基因；“ScGPM1p”表示解脂耶氏酵母GPD1启动子-764至-1；“hygR”表示用作用潮霉素B选择的标记的大肠杆菌hph基因表达盒；“ScGPM1t”表示在终止密码子后的酿酒酵母GPD1终止子406 bp；“ARS68”和“CEN1-1”表示解脂耶氏酵母染色体复制起点；“YlTEF1p”表示解脂耶氏酵母TEF启动子-406至+125；“YlDGA1”表示解脂耶氏酵母DGA1基因ORF (NG15)；“YlCYC1t”表示在终止后的解脂耶氏酵母CYC1终止子300个碱基对；“ScTEF1p”表示酿酒酵母TEF1启动子-412至-1；“NAT”表示用作用诺尔丝菌素选择的标记的诺尔斯链霉菌Nat1基因；“ScCYC1t”表示在终止后的酿酒酵母CYC1终止子275个碱基对；“URA3p-ScURA3-URA3t”表示用于在酵母中选择的酿酒酵母URA3营养缺陷型标记。
图3表示用于在解脂耶氏酵母中表达NG112基因(麦角菌(C. purpurea) DGA2)的pNC327构建体的图。在转化前通过PacI/AscI限制酶切消化使载体pNC327线性化。“2u ori”表示来自2 μm圆形质粒的酿酒酵母复制起点；“pMB1 ori”表示来自pBR322质粒的大肠杆菌pMB1复制起点；“AmpR”表示用作用氨苄西林选择的标记的bla基因；“PR3”表示解脂耶氏酵母TEF1启动子-406至+125；“NG112”表示通过GenScript合成的麦角菌DGA2基因；“TER1”表示在终止后的解脂耶氏酵母CYC1终止子300 bp；“PR1”表示解脂耶氏酵母TEF1启动子-406至-1；“NG76”表示用作用Zeocin选择的标记的印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)BLE基因；“TER7”表示在终止后的解脂耶氏酵母TEF1终止子400 bp；和“ScURA3”表示用于在酵母中选择的酿酒酵母URA3营养缺陷型标记。
图4包括标记为(A)、(B)和(C)的3个子图。该图表示针对解脂耶氏酵母菌株NS297、NS281、NS450、NS377和NS432通过基于荧光的测定法测量的脂质蓄积或通过气相色谱法测量的细胞干重百分比。NS297表达额外拷贝的解脂耶氏酵母DGA1；NS281表达圆红冬孢酵母DGA1；NS450表达圆红冬孢酵母DGA1和麦角菌DGA2；NS377表达圆红冬孢酵母DGA1并携带解脂耶氏酵母TGL3的缺失；NS432表达圆红冬孢酵母DGA1和麦角菌DGA2并携带解脂耶氏酵母TGL3的缺失。在子图(A)中，在48孔板中发酵96小时后，通过荧光测定法分析菌株，其中分析各构建体的2个或3个转化株。在子图(B)中，在50-mL长颈瓶中发酵96小时后，通过荧光测定法和气相色谱法分析菌株。在子图(C)中，在1-L生物反应器中发酵140小时后，通过气相色谱法分析菌株。NS281、NS377和NS432的数据是获自一式两份生物反应器发酵的平均数。NS450的数据表示获自单个生物反应器发酵的值。
图5表示用于在A. adeninivorans菌株NS252 (ATCC 76597)中过量表达NG167基因(AaDga1)的pNC363构建体的图。在转化前通过PmeI/AscI限制酶切消化使载体pNC363线性化。“2u ori”表示来自2 μm圆形质粒的酿酒酵母复制起点；“pMB1 ori”表示来自pBR322质粒的大肠杆菌pMB1复制起点；“AmpR”表示用作用氨苄西林选择的标记的bla基因；“ScURA3”表示用于在酵母中选择的酿酒酵母URA3营养缺陷型标记；“PR26 PGK1p”表示A. adeninivorans PGK1启动子-524至-1；“NG3 NatR”表示用作用诺尔丝菌素选择的标记的诺尔斯链霉菌Nat1基因；“ScFBA1t”表示在终止后的酿酒酵母FBA1终止子205 bp；“PR25AaADH1p”表示A. adeninivorans ADH1启动子-877至-1；“NG167 AaDGA1”表示A. adeninivorans DGA1基因ORF (NG167)；“TER16 CYC1t”表示在终止密码子后的A. adeninivorans CYC1终止子301 bp。
图6包括标示为“板1”、“板2”、“板3”和“板4”的4张图。各图显示基于荧光的脂质测定法的结果，其中485 nm/510nm处的荧光/600nm处的吸光度与细胞的脂质含量相关。x轴标记对应于用于下表2中界定的转化细胞的DGA表达构建体。对于各表达构建体，分析了8个转化株。NG168，其相当于A. adeninivorans DGA2基因，被作用阳性对照。来自解脂耶氏酵母(NG16)和球毛壳(Chaetomium globosum) (NG113)的DGA2显示对脂质含量的最显著的作用。
图7是用于在解脂耶氏酵母菌株NS598中表达NG288基因的pNC507载体的图。在转化前通过PmeI/AscI限制酶切消化使载体pNC507线性化。“2u ori”表示来自2 μm圆形质粒的酿酒酵母复制起点；“PR3”表示解脂耶氏酵母TEF1启动子-406至+125；“NG102”表示编码转化酶的酿酒酵母SUC2基因；“TER2”表示在终止后的酿酒酵母CYC1终止子275 bp；“PR4”表示解脂耶氏酵母EXP1启动子-999至-1；“NG288”表示通过GenScript合成的禾柄锈菌(Puccinia graminis) DGA1 cDNA；“TER1”表示在终止后的解脂耶氏酵母CYC1终止子300bp；“pMB1 ori”表示来自pBR322质粒的大肠杆菌pMB1复制起点；“AmpR”表示用作用氨苄西林选择的标记的bla基因。
图8包括标示为“板1”、“板2”和“板3”的3张图。各图显示基于荧光的脂质测定法的结果，其中485 nm/510nm处的荧光/600nm处的吸光度与细胞的脂质含量相关。x轴标记对应于用于下表2中界定的转化细胞的DGA表达构建体。对于各表达构建体，分析了8个转化株。亲本菌株NS598被用作阴性对照。
发明详述
概述
公开了用于产生其三酰甘油含量增加的转化细胞的方法和组合物。表达2型二酰甘油酰基转移酶DGA1增加可合成三酰甘油的蛋白质的量，并且在解脂耶氏酵母细胞中表达来自圆红冬孢酵母的DGA1蛋白有效增加细胞的三酰甘油含量(USSN 61/943,664和PCT专利申请号PCT/US15/017227；通过引用结合到本文中)。1型二酰甘油酰基转移酶DGA2也可催化三酰甘油的合成，且相对于仅DGA1，仔细选择的DGA1和DGA2转基因的表达可进一步增加产油细胞的脂质含量。具体地讲，表达来自圆红冬孢酵母的DGA1和来自麦角菌的DGA2的解脂耶氏酵母产生高的三酰甘油产量。最后，三酰甘油脂肪酶催化三酰甘油的降解，因此，三酰甘油脂肪酶的减量调节可增加细胞的三酰甘油含量。具体地讲，含有TGL3敲除和表达来自圆红冬孢酵母的DGA1的解脂耶氏酵母细胞产生比表达DGA1的对照高的三酰甘油产量(USSN 61/987,098和PCT专利申请号PCT/US15/28760；通过引用结合到本文中)。DGA1和DGA2表达与TGL3减量调节的组合可进一步提高三酰甘油产量。
DGA1和DGA2的同时表达伴以TGL3的减量调节可能是增加细胞的三酰甘油含量的有吸引力的方法；然而，影响代谢途径的蛋白质的操作大多是不可预测的。例如，解脂耶氏酵母中仅天然DGA2的过量表达不提高细胞的脂质生产效率，而DGA1增加脂质产量。DGA2定位于ER中，并在新形成的脂质小体中合成三酰甘油。相比之下，DGA1定位于脂质小体膜上，并在这些脂质小体内合成三酰甘油。未充分了解这种区别或一些其它差异是否影响细胞抑制遗传修饰的作用的能力。因此，不会预期与含有一种或两种遗传修饰的那些细胞相比，DGA1和DGA2表达与TGL3敲除的组合产生具有更高脂质含量的细胞。
公开了增加细胞的三酰甘油含量的DGA1和DGA2表达和TGL3减量调节的成功组合。例如，含有TGL3敲除并表达来自圆红冬孢酵母的DGA1和来自麦角菌的DGA2的解脂耶氏酵母菌株产生高的三酰甘油产量。
定义
冠词“a”和“an”在本文用来指冠词的语法客体的一个或一个以上(即是指至少一个)。举例来说，“一个要素”意指一个要素或超过一个要素。
术语“活性”是指细胞执行功能的总能力。例如，降低细胞中的三酰甘油脂肪酶的活性的遗传修饰可减少细胞中三酰甘油脂肪酶的量或降低三酰甘油脂肪酶的效率。三酰甘油脂肪酶敲除减少细胞中三酰甘油脂肪酶的量。或者，三酰甘油脂肪酶基因的突变可降低其三酰甘油脂肪酶蛋白产物的效率，而对细胞三酰甘油脂肪酶的量几乎没有作用。降低三酰甘油脂肪酶的效率的突变，例如通过改变一个或多个活性部位残基，可影响活性部位；例如通过在空间上封闭底物或产物，它们可损害酶的动力学；例如通过降低正确折叠的酶的比例，它们可影响蛋白质折叠或动力学；例如通过防止脂肪酶定位于脂质颗粒，它们可影响蛋白质定位；或例如通过加入一个或多个蛋白质切割位点或通过加入使蛋白质以蛋白水解为目标的一个或多个残基或氨基酸序列，它们可影响蛋白质降解。这些突变影响编码区。降低三酰甘油脂肪酶活性的突变可代替影响基因的转录或翻译。例如，三酰甘油脂肪酶增强子或启动子的突变可通过降低其表达而降低三酰甘油脂肪酶活性。使三酰甘油脂肪酶基因的非编码部分(例如其内含子)突变或缺失也可降低转录或翻译。此外，三酰甘油脂肪酶的上游调节子的突变可影响三酰甘油脂肪酶活性；例如，一个或多个阻遏物的过量表达可降低三酰甘油脂肪酶活性，而一个或多个激活物的敲除或突变同样可降低三酰甘油脂肪酶活性。
提高细胞中二酰甘油酰基转移酶的活性的遗传修饰可增加细胞中三酰甘油酰基转移酶的量或提高二酰甘油酰基转移酶的效率。例如，遗传修饰可简单地将额外拷贝的二酰甘油酰基转移酶插入细胞中，使得额外的拷贝转录并翻译成额外的功能性二酰甘油酰基转移酶。所加入的二酰甘油酰基转移酶基因对宿主生物可为天然的或来自不同的生物。或者，使天然二酰甘油酰基转移酶基因的非编码部分(例如其内含子)突变或缺失也可增加翻译。可通过加入引起更多转录的新的启动子，来改变天然二酰甘油酰基转移酶基因。同样，可将增强子加入二酰甘油酰基转移酶基因中以增加转录，或可使沉默子突变或从二酰甘油酰基转移酶基因中缺失以增加转录。天然基因的编码区的突变也可通过例如产生不与抑制性蛋白质或分子相互作用的蛋白质变体，来提高二酰甘油酰基转移酶活性。一个或多个激活物的过量表达可通过增加二酰甘油酰基转移酶蛋白的表达，来提高二酰甘油酰基转移酶活性，而一个或多个阻遏物的敲除或突变同样可提高二酰甘油酰基转移酶活性。
术语“生物活性部分”是指小于全长氨基酸序列、但显示全长序列的至少一种活性的氨基酸序列。例如，二酰甘油酰基转移酶的生物活性部分可指具有将酰基辅酶A和二酰甘油转化成三酰甘油的生物活性的DGA1或DGA2的一个或多个结构域。DGA1蛋白的生物活性部分包括包含以下氨基酸序列的肽或多肽：充分类似于或来源于DGA1蛋白的氨基酸序列，例如SEQ ID NO: 15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、51、53、55、57、59、61、63、65、67和69所示氨基酸序列，其包括比全长DGA1少的氨基酸，并显示DGA1蛋白的至少一种活性。同样，DGA2蛋白的生物活性部分包括包含以下氨基酸序列的肽或多肽：充分类似于或来源于DGA2蛋白的氨基酸序列，例如SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、71、73、75、77、79、81和83所示氨基酸序列，其包括比全长DGA2少的氨基酸，并显示DGA2蛋白的至少一种活性。同样，DGA3蛋白的生物活性部分包括包含以下氨基酸序列的肽或多肽：充分类似于或来源于DGA3蛋白的氨基酸序列，例如SEQ ID NO: 87和89所示氨基酸序列，其包括比全长DGA3少的氨基酸，并显示DGA3蛋白的至少一种活性。二酰甘油酰基转移酶的生物活性部分可包含例如100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695或696个氨基酸。通常，生物活性部分包含具有将酰基辅酶A和二酰甘油转化为三酰甘油的催化活性的结构域或基序。DGA1蛋白的生物活性部分可以是长为例如262个氨基酸的多肽。
术语“DGAT1”是指编码1型二酰甘油酰基转移酶蛋白的基因，例如编码DGA2蛋白的基因。
术语“DGAT2”是指编码2型二酰甘油酰基转移酶蛋白的基因，例如编码DGA1蛋白的基因。
术语“DGAT3”是指编码3型二酰甘油酰基转移酶蛋白的基因，例如编码DGA3蛋白的基因。
“二酰甘油酯”、“二酰甘油”和“甘油二酯”是由甘油和2个脂肪酸组成的酯。
术语“二酰甘油酰基转移酶”和“DGA”是指催化从二酰甘油形成三酰甘油酯的任何蛋白质。二酰甘油酰基转移酶包括1型二酰甘油酰基转移酶(DGA2)、2型二酰甘油酰基转移酶(DGA1)和3型二酰甘油酰基转移酶(DGA3)和催化上述反应的所有同系物。
术语“二酰甘油酰基转移酶，1型”和“1型二酰甘油酰基转移酶”是指DGA2和DGA2直向同源物(ortholog)。
术语“二酰甘油酰基转移酶，2型”和“2型二酰甘油酰基转移酶”是指DGA1和DGA1直向同源物。
术语“二酰甘油酰基转移酶，3型”和“3型二酰甘油酰基转移酶”是指DGA1和DGA1直向同源物。
术语“结构域”是指能够折叠成独立于蛋白质其余部分的稳定的三维结构的蛋白质氨基酸序列的一部分。
术语“药物”是指抑制细胞生长或增殖，从而提供对含有赋予药物抗性的基因的细胞选择优势的任何分子。药物包括抗生素、抗微生物药、毒素和杀虫药。
“干重”和“干细胞重量”意指在相对缺乏水时测定的重量。例如，提及产油细胞为包含以干重计规定百分比的具体组分，意指百分比根据除去基本上全部水分后细胞的重量计算。
术语“编码”是指包含编码区、编码区的一部分或其互补序列的核酸。DNA和RNA两者可编码基因。DNA和RNA两者可编码蛋白质。
术语“外源的”是指导入细胞的任何东西。“外源核酸”是通过细胞膜进入细胞的核酸。外源核酸可含有存在于细胞的天然基因组的核苷酸序列和/或之前不存在于细胞基因组的核苷酸序列。外源核酸包括外源基因。“外源基因”是编码已导入细胞(例如通过转化/转染)的RNA和/或蛋白质的表达的核酸，亦称为“转基因”。包含外源基因的细胞可称为重组细胞，可向其中导入其它的外源基因。外源基因可来自相对于转化的细胞是相同或不同的物种。因此，相对于内源的基因拷贝，外源基因可包括占据细胞基因组中的不同位置或在不同控制下的天然基因。外源基因可以一个以上拷贝存在于细胞中。外源基因可作为基因组的插入物(核或质体)或作为附加型分子保持在细胞中。
术语“表达”是指细胞中核酸或氨基酸序列(例如肽、多肽或蛋白质)的量。基因的表达增加是指该基因的转录增加。氨基酸序列、肽、多肽或蛋白质的表达增加是指编码氨基酸序列、肽、多肽或蛋白质的核酸的翻译增加。
本文所用术语“基因”可包括含有外显子，具体地说编码参与特定活性的多肽序列的多核苷酸序列的基因组序列。该术语进一步包括非来源于基因组序列的合成核酸。在某些实施方案中，基因缺乏内含子，因为它们根据cDNA和蛋白质序列的已知DNA序列合成。在其它实施方案中，基因是合成的非天然cDNA，其中密码子根据密码子使用经优化以在解脂耶氏酵母中表达。该术语可进一步包括包含上游、下游和/或内含子核苷酸序列的核酸分子。
术语“遗传修饰”是指转化的结果。根据定义每次转化引起遗传修饰。
本文所用术语“同系物”是指(a)相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入且具有与其来源于其中的未修饰蛋白质类似的生物和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，和(b)编码具有(a)中描述的相同特性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶的核酸。
“诱导型启动子”是介导有效连接的基因在响应特定刺激时转录的启动子。
术语“整合”是指作为细胞的基因组的插入物(例如染色体的插入，包括质体基因组的插入物)而在细胞中保持的核酸。
“呈有效连接”是指2个核酸序列，例如控制序列(通常为启动子)和连接序列(通常为编码蛋白质的序列，亦称编码序列)之间的功能连接。启动子如果可介导基因转录，则它与基因有效连接。
术语“敲除突变”或“敲除”是指防止天然基因转录和翻译成功能蛋白质的遗传修饰。
术语“天然”是指转化事件前的细胞或亲本细胞的组成。“天然基因”是指编码不是通过转化事件导入细胞的蛋白质的核苷酸序列。“天然蛋白质”是指由天然基因编码的氨基酸序列。
术语“核酸”是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的多聚形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并可执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、自连锁分析界定的基因座(loci/locus)、外显子、内含子、信使RNA (mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸结构的修饰如存在，则可在聚合物装配之前或之后赋予。例如可通过与标记组分缀合，进一步修饰多核苷酸。在本文提供的所有核酸序列中，U核苷酸与T核苷酸可互换使用。
术语“亲本细胞”是指细胞从其中传下来的每个细胞。细胞的基因组由亲本细胞的基因组和对亲本细胞基因组的任何后续遗传修饰组成。
本文所用术语“质粒”是指物理上与生物基因组DNA分离的环状DNA分子。可在导入宿主细胞之前使质粒线性化(本文称为线性化质粒)。线性化质粒可能不是自我复制的，但可整合至生物基因组DNA中并与之一起复制。
术语“部分”是指肽、寡肽、多肽、蛋白质结构域和蛋白质。编码“蛋白质的部分”的核苷酸序列包括可转录和/或翻译的核苷酸序列和必须进行待转录和/或翻译的一个或多个重组事件的核苷酸序列两者。例如，核酸可包含编码选择标记蛋白质的一个或多个氨基酸的核苷酸序列。可对该核酸进行改造以与编码该蛋白质的其余部分的一个或多个不同的核苷酸序列重组。这类核酸可用于产生敲除突变，因为仅与靶序列重组可能重新构成全长选择标记基因，而随机整合事件不可能导致可产生功能标志蛋白质的核苷酸序列。多肽的“生物活性部分”是存在于小于全长氨基酸序列但可执行与全长多肽相同的功能的多肽的氨基酸序列中的任何氨基酸序列。二酰甘油酰基转移酶的生物活性部分包括存在于可催化从二酰甘油和酰基辅酶A形成三酰甘油的全长二酰甘油酰基转移酶中的任何氨基酸序列。多肽的生物活性部分包括具有与全长肽相同活性的多肽的部分和具有比背景多的活性的每个部分。例如，相对于全长多肽，二酰甘油酰基转移酶的生物活性部分可具有0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9、100、100.1、100.2、100.3、100.4、100.5、100.6、100.7、100.8、100.9、101、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400%活性或更高。多肽的生物活性部分可包括缺乏将多肽靶向细胞区室的结构域的肽的部分。
“启动子”是指导核酸转录的核酸控制序列。如本文所用，启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列。启动子还任选包括远端增强子或阻遏物元件，其可位于距转录起始位点多达几千个碱基对。
“重组”是指由于导入外源核酸或改变天然核酸而被修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体。因此，例如，重组细胞可表达不存在于天然(非重组)形式的细胞内的基因或表达不同于由非重组细胞表达的那些基因的天然基因。重组细胞可包括而不限于编码基因产物或编码降低细胞中的活性基因产物水平的抑制元件(例如突变、敲除、反义、干扰RNA (RNAi)或dsRNA)的重组核酸。“重组核酸”是一般而言使用例如聚合酶、连接酶、外切核酸酶和内切核酸酶通过核酸操作最初在体外形成的核酸，或否则为正常不存在于自然界的形式。重组核酸可通过例如将两个或更多个核酸置于有效连接中来产生。因此，通过连接在自然界通常不连接的DNA分子在体外形成的分离的核酸或表达载体均被视为重组用于本发明的目的。重组核酸一旦制备并导入宿主细胞或生物中，它便可利用宿主细胞的体内细胞机器复制；然而，这类核酸一旦重组产生，虽然随后在胞内复制，但仍视为重组用于本发明的目的。同样，“重组蛋白”是采用重组技术，即通过重组核酸的表达制备的蛋白质。
术语“调节区”是指影响基因的转录或翻译但不编码氨基酸序列的核苷酸序列。调节区包括启动子、操纵基因、增强子和沉默子。
“转化”是指将核酸转移到宿主生物或宿主生物的基因组中，导致遗传学上稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物称为“重组”、“转基因的”或“转化的”生物。因此，可将本发明的分离多核苷酸掺入到能够导入宿主细胞中并在其中复制的重组构建体(通常为DNA构建体)中。所述构建体可以是包括能够在指定宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的复制系统和序列的载体。通常，表达载体包括例如在5'和3'调节序列的转录控制下的一个或多个克隆基因和选择标记。所述载体还可含有启动子调节区(例如控制诱导型或构成型的、环境或发育调节的或位点特异性表达的调节区)、转录起始位点、核糖体结合位点、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
术语“转化细胞”是指已进行转化的细胞。因此，转化细胞包含亲本基因组和可遗传的遗传修饰。
术语“三酰甘油酯”、“三酰甘油”、“甘油三酯”和“TAG”是由甘油和3个脂肪酸组成的酯。
术语“三酰甘油脂肪酶”是指可催化从三酰甘油上脱去脂肪酸链的任何蛋白质。三酰甘油脂肪酶包括TGL3、TGL4和TGL3/4。
术语“载体”是指核酸可籍此增殖和/或在生物、细胞或细胞组分间转移的工具。载体包括能够或不能自主复制或整合到宿主细胞染色体中的质粒、线性DNA片段、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子和人工染色体等。
微生物工程改造
A. 概述
在某些实施方案中，本发明涉及经遗传修饰以增加其三酰甘油含量或改变其脂质概况的微生物。
可将基因和基因产物导入微生物宿主细胞中。用于表达基因和核酸分子的合适的宿主细胞是广泛存在于真菌或细菌科内的微生物宿主。合适宿主菌株的实例包括但不限于真菌或酵母菌种，例如Arxula、曲霉属(Aspergillus)、Aurantiochytrium、假丝酵母属(Candida)、麦角菌属(Claviceps)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、地霉属(Geotrichum)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Kodamaea、白冬孢酵母属(Leucosporidiella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、Ogataea、毕赤酵母属(Pichia)、原壁菌属(Prototheca)、根霉属(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、银耳属(Tremella)、丝孢酵母属(Trichosporon)、Wickerhamomyces、耶氏酵母属(Yarrowia)或细菌菌种，例如变形菌和放线菌的成员以及以下属：不动杆菌属(Acinetobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、食酸菌属(Acidovorax)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridia)、链霉菌属(Streptomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)和棒杆菌属(Cornyebacterium)。解脂耶氏酵母和Arxula adeninivorans充分适合用作宿主微生物，因为它们可积累其重量的大部分作为三酰甘油。
含有指导外源蛋白高水平表达的调节序列的微生物表达系统和表达载体为本领域技术人员所知。这些的任一种可用于构建嵌合基因以产生本发明序列的基因产物的任一种。然后可通过转化技术将这些嵌合基因导入合适的微生物中以产生高水平表达的酶。
例如，可在合适的质粒中克隆编码酶的基因，且作为宿主的前述起始亲本菌株可用所得质粒转化。该方法可增加编码酶的每个基因的拷贝数，因此，可提高酶的活性。质粒不受特别限制，只要它赋予微生物子代所需的可遗传的遗传修饰。
可用于转化合适宿主细胞的载体或盒是本领域众所周知的。通常载体或盒含有指导相关基因转录和翻译的序列、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含带有转录起始控制的基因的区域5'和控制转录终止的DNA片段的区域3'。2个控制区可来源于与转化的宿主细胞同源的基因，虽然要了解所述控制区不一定来源于对选择作为生产宿主的具体物种是天然的基因。
可使用从天然来源分离的片段，通过克隆技术产生启动子、cDNA和3'UTR以及载体的其它元件(Greent和Sambrook，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，(第4版，2012)；美国专利号4,683,202；通过引用结合到本文中)。或者，元件可采用已知方法经合成产生(Gene 164:49-53 (1995))。
B. 同源重组
同源重组是互补DNA序列与同源物的区域对齐并与之交换的能力。将含有与被靶向的基因组序列(“模板”)同源的序列的转基因DNA (“供体”)导入生物中，然后在相应的同源基因组序列的位点上进行重组进入基因组。
在宿主生物中进行同源重组的能力具有许多可在分子遗传水平上针对其进行的实用意义，并可用于形成生产所需产物的微生物。通过其特殊的性质，同源重组是精确的基因打靶事件，因此，用相同的打靶序列产生的大多数转基因系就其表型而言可基本上相同，需要筛选少得多的转化事件。同源重组还将基因插入事件靶向宿主染色体，可能导致极好的遗传稳定性，甚至在缺乏遗传选择时。因为不同的染色体基因座可能影响基因表达，甚至来自外源启动子/UTR的表达，所以同源重组可以是查询不熟悉的基因组环境中的基因座并评价这些环境对基因表达的影响的方法。
采用同源重组的一种特别有用的基因工程方法是接受特异性宿主调节元件例如启动子/UTR以驱动高特异性方式的异源基因表达。
因为同源重组是精确的基因打靶事件，所以可用来精确修饰基因或目标区内的任何核苷酸，只要鉴定出足够的侧翼区。因此，同源重组可用作修饰影响RNA和/或蛋白质的基因表达的调节序列的手段。它还可用来修饰蛋白质编码区，力求改进酶活性例如底物特异性、亲和力和Km，由此影响宿主细胞代谢中所需的变化。同源重组提供操作宿主基因组的有力手段，导致基因打靶、基因转换、基因缺失、基因重复、基因倒位，并交换基因表达调节元件例如启动子、增强子和3'UTR。
通过使用含有内源序列段的打靶构建体以“靶向”内源宿主细胞基因组内的基因或目标区，可实现同源重组。所述打靶序列可位于基因或目标区的5'、基因/目标区的3'或甚至位于基因/目标区侧翼。可将所述打靶构建体作为具有额外载体骨架的超螺旋质粒DNA、无载体骨架的PCR产物或作为线性化分子转化到宿主细胞中。在某些情况下，通过用限制性内切酶切割转基因DNA，先将转基因DNA (供体DNA)内的同源序列暴露可能是有利的。该步骤可提高重组效率并减少非期望事件的出现。提高重组效率的其它方法包括采用PCR以产生含有与靶向的基因组序列同源的线性末端的转化性转基因DNA。
C. 载体和载体组分
鉴于本文的公开内容，用于转化本发明的微生物的载体可通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备。载体通常含有一个或多个基因，其中各基因编码所需产物(基因产物)的表达，并与调节基因表达或使基因产物靶向重组细胞中的特定位置的一个或多个控制序列有效连接。
1. 控制序列
控制序列是调节编码序列表达或将基因产物引导至细胞内或外的特定位置的核酸。调节表达的控制序列包括例如调节编码序列转录的启动子和终止编码序列转录的终止子。另一个控制序列是位于编码多腺苷酸化信号的编码序列末端的3'非翻译序列。将基因产物引导向特定位置的控制序列包括编码信号肽的那些，所述信号肽引导其所连接的蛋白质至细胞内或外的特定位置。
因此，用于基因在微生物中表达的示例性载体设计含有与在酵母中有活性的启动子有效连接的所需基因产物(例如选择标记、或酶)的编码序列。或者，如果载体不含与目标编码序列有效连接的启动子，则可将编码序列转化到细胞中，使得它在载体整合的点上与内源启动子有效连接。
用于表达基因的启动子可以是与该基因天然连接的启动子或不同的启动子。
启动子一般可表征为构成型或诱导型。构成型启动子一般是有活性的或功能性的以在任何时候(或者在细胞生活周期的某些时间)以相同的水平驱动表达。相反地，诱导型启动子只在响应刺激时有活性(或者使之无活性)或显著增量调节或减量调节。启动子的两个类型均适用于本发明的方法。可用于本发明的诱导型启动子包括在响应刺激时介导有效连接的基因转录的启动子，所述刺激例如外源提供的小分子、温度(热或冷)、培养基中缺氮等。合适的启动子可激活实质上沉默的基因的转录或增量调节(优选显著地)以低水平转录的有效连接基因的转录。
终止区控制序列的纳入是任选的，如果采用，则方便是首选，因为终止区是相对可交换的。终止区可以对转录起始区(启动子)是天然的，可以对目标DNA序列是天然的，或可以获自另一来源(参见例如Chen和Orozco，Nucleic Acids Research 16:8411 (1988))。
2. 基因和密码子优化
通常，基因包括启动子、编码序列和终止控制序列。当通过重组DNA技术装配时，基因可称为表达盒，并可侧接限制位点用于方便地插入用来将重组基因导入宿主细胞的载体中。表达盒可侧接基因组的DNA序列或其它核酸靶以利于通过同源重组使表达盒稳定整合到基因组中。或者，载体和其表达盒可保持未整合的(例如附加体)，在此情况下，载体通常包括复制起点，其能够为载体DNA提供复制。
存在于载体上的常见基因是编码蛋白质的基因，其表达允许将含有该蛋白质的重组细胞与不表达该蛋白质的细胞区分开来。所述基因及其相应的基因产物称为可选择标记或选择标记。多种选择标记的任一种可用于转基因构建体，构建体可用于转化本发明的生物。
对于重组蛋白的最佳表达，使用用最适被待转化的宿主细胞使用的密码子产生mRNA的编码序列是有益的。因此，转基因的适当表达可能需要转基因的密码子使用匹配在其中表达转基因的生物的特定的密码子偏倚。在这种作用基础上的确切机制有许多，但包括可获得的氨基酰化tRNA库与待在细胞中合成的蛋白质的适当平衡，在这种需要满足时，再配合转基因信使RNA (mRNA)更有效的翻译。当转基因中的密码子使用未被最优化时，可获得的tRNA库不足以允许转基因mRNA的有效翻译，导致核糖体停顿和终止以及可能的转基因mRNA不稳定。
C. 转化
细胞可通过任何合适的技术转化，包括例如生物射弹、电穿孔、玻璃珠转化和碳化硅晶须转化。用于将转基因导入微生物的任何方便的技术可用于本发明。可通过例如D. M.Morrison (Methods in Enzymology 68:326 (1979))的方法、通过用氯化钙增加受体细胞对DNA的通透性的方法(Mandel和Higa，J. Molecular Biology，53:159 (1970))等，实现转化。
转基因在产油酵母(例如解脂耶氏酵母)中表达的实例可见于文献中(Bordes等，J. Microbiological Methods，70:493 (2007)；Chen等，Applied Microbiology &Biotechnology 48:232 (1997))。外源基因在细菌(例如大肠杆菌)中表达的实例是众所周知的(Green和Sambrook，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，(第4版，2012))。
用于本发明微生物的转化的载体可通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备。在一个实施方案中，用于基因在微生物中表达的示例性载体设计含有编码与在微生物中有活性的启动子有效连接的酶的基因。或者，如果载体不含与目标基因有效连接的启动子，则基因可转化至细胞中，使得它在载体整合点上与天然启动子有效连接。载体还可含有编码蛋白质的第二基因。任选一个或两个基因之后是含有多腺苷酸化信号的3'非翻译序列。编码2个基因的表达盒可在载体上物理连接或在不同的载体上。还可使用微生物的共转化，其中同时使用不同的载体分子以转化细胞(Protist 155:381-93 (2004))。可任选根据在抗生素或其它选择标记存在时在缺乏抗性盒的细胞在其中无法生长的条件下生长的能力来选择转化细胞。
示例性的核酸、细胞和方法
A.二酰甘油酰基转移酶核酸分子和载体
在一些实施方案中，2型二酰甘油酰基转移酶是DGA1。例如，二酰甘油酰基转移酶可以是由选自以下的DGAT2基因编码的DGA1蛋白：Arxula adeninivorans、土曲霉(Aspergillus terreus)、Aurantiochytrium limacinum、麦角菌、密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum)、斯达氏油脂酵母、花药黑粉菌(Microbotryum violaceum)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、禾柄锈菌、倒卵形红冬孢酵母(Rhodosporidium diobovatum)、圆红冬孢酵母、牧草红酵母(Rhodotorula graminis)和解脂耶氏酵母。
DGAT2基因可具有SEQ ID NO: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70所示核苷酸序列。在其它实施方案中，DGAT2基因基本上与SEQ ID NO:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70相同，且核苷酸序列编码保持由SEQ ID NO: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70编码的蛋白质的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变所致核苷酸序列不同的蛋白质。在另一个实施方案中，DGAT2基因包含与SEQ ID NO: 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70有至少约70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高同一性的核苷酸序列。
DGA1蛋白可具有SEQ ID NO: 15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、51、53、55、57、59、61、63、65、67或69所示氨基酸序列。在其它实施方案中，DGA1蛋白基本上与SEQ ID NO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、51、53、55、57、59、61、63、65、67或69相同，并保持SEQ IDNO: 15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、51、53、55、57、59、61、63、65、67或69的蛋白质的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变所致氨基酸序列不同。在另一个实施方案中，DGA1蛋白包含与SEQ ID NO: 15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、51、53、55、57、59、61、63、65、67或69有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，1型二酰甘油酰基转移酶是DGA2。例如，二酰甘油酰基转移酶可以是由存在于选自以下生物的DGAT1基因编码的DGA2蛋白：Arxula adeninivorans、土曲霉、球毛壳、麦角菌、斯达氏油脂酵母、Metarhizium acridum、冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)、三角褐指藻、季也蒙毕赤酵母、圆红冬孢酵母、牧草红酵母、绿木霉(Trichoderma virens)和解脂耶氏酵母。
DGAT1基因可具有SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、72、74、76、78、80、82或84所示核苷酸序列。在其它实施方案中，DGAT1基因基本上与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、72、74、76、78、80、82或84相同，且核苷酸序列编码保持由SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、72、74、76、78、80、82或84编码的蛋白质的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变所致核苷酸序列上不同的蛋白质。在另一个实施方案中，DGAT1基因包含与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、72、74、76、78、80、82或84有至少约70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高同一性的核苷酸序列。
DGA2蛋白可具有SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、71、73、75、77、79、81或83所示氨基酸序列。在其它实施方案中，DGA2蛋白基本上与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、71、73、75、77、79、81或83相同，并保持SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、71、73、75、77、79、81或83的蛋白质的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变所致在氨基酸序列上不同。在另一个实施方案中，DGA2蛋白包含与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、71、73、75、77、79、81或83有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，3型二酰甘油酰基转移酶是DGA3。例如，二酰甘油酰基转移酶可以是由存在于选自以下生物的DGAT3基因编码的DGA3蛋白：蓖麻(Ricinus communis)和落花生(Arachis hypogaea)。
DGAT3基因可具有SEQ ID NO: 88或90所示核苷酸序列。在其它实施方案中，DGAT3基因基本上与SEQ ID NO: 88或90相同，且核苷酸序列编码保持由SEQ ID NO: 87或89编码的蛋白质的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变所致核苷酸序列上不同的蛋白质。在另一个实施方案中，DGAT3基因包含与SEQ ID NO: 88或90有至少约70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高同一性的核苷酸序列。
DGA3蛋白可具有SEQ ID NO: 87或89所示氨基酸序列。在其它实施方案中，DGA3蛋白基本上与SEQ ID NO: 87或89相同，并保持SEQ ID NO: 87或89的蛋白质的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变所致在氨基酸序列上不同。在另一个实施方案中，DGA3蛋白包含与SEQ ID NO: 87或89有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高同一性的氨基酸序列。
DGAT1、DGAT2或DGA3基因可包含保守取代、缺失和/或插入同时仍编码具有功能性二酰甘油酰基转移酶活性的蛋白质。例如，可针对具体的宿主细胞使DGAT1、DGAT2或DGA3密码子优化，出于方便可置换不同的密码子，以例如引入限制位点或产生最适PCR引物，或者可出于其它目的置换密码子。同样，可改变核苷酸序列以产生保守氨基酸取代、缺失和/或插入。
DGA1、DGA2和DGA3多肽可包含保守取代、缺失和/或插入同时仍保持功能性二酰甘油酰基转移酶活性。保守取代表是本领域众所周知的(Creighton，Proteins (第2版，1992))。
可采用重组DNA操作技术，容易地实现氨基酸取代、缺失和/或插入。用于操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。这些方法包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、Quick Change位点定向诱变(Stratagene，SanDiego，CA)、PCR介导的位点定向诱变和其它位点定向诱变方案。
为了测定2个氨基酸序列或2个核酸序列的百分比同一性，可对序列进行比对用于最佳比较目的(例如可将空位引入第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个中用于最佳比对，且可忽略不相同的序列用于比较目的)。用于比较目的比对的参比序列的长度可为参比序列长度的至少95%。然后可比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列上的位置被与第二序列上相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则该位置上的分子相同(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。考虑为了2个序列的最佳比对需要引入的空位的数目和空位的长度，2个序列间的百分比同一性随序列所共有的相同位置的数目而变。
2个序列间的序列比较和百分比同一性的测定可应用数学算法完成。在一个实施方案中，使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵，及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6长度权重，应用Needleman和Wunsch (J. Molecular Biology 48:444-453 (1970))算法(其被整合至GCG软件包的GAP程序(可获自http://www.gcg.com))，测定2个氨基酸序列间的百分比同一性。在又一个实施方案中，可采用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6长度权重，应用GCG软件包中的GAP程序(可获自http://www.gcg.com)测定2个核苷酸序列间的百分比同一性。在另一个实施方案中，可使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分，应用E. Meyers和W. Miller (ComputerApplications in the Biosciences 4:11-17 (1988))的算法(其被整合至ALIGN程序(2.0或2.0U版))，测定2个氨基酸或核苷酸序列间的百分比同一性。
可用来测定2个序列间的同一性的示例性计算机程序包括但不限于BLAST程序的套件，例如BLASTN、MEGABLAST、BLASTX、TBLASTN、TBLASTX和BLASTP及Clustal程序，例如ClustalW、ClustalX和Clustal Omega。
在对指定核酸序列相对于GenBank DNA Sequences和其它公共数据库中的核酸序列进行评价时，通常应用BLASTN程序进行序列检索。BLASTX程序对于针对GenBank ProteinSequences和其它公共数据库中的氨基酸序列，检索在所有读框中翻译的核酸序列是有效的。
应用例如CLUSTAL-W程序，进行所选序列的比对以确定两个或更多个序列间的“%同一性”。
“编码序列”或“编码区”是指当序列表达时，具有产生蛋白质产物(例如氨基酸或多肽)所必需的序列信息的核酸分子。编码序列可包含翻译区内的非翻译序列(包括内含子或5'或3'非翻译区)和/或由其组成，或可缺乏所述间插的非翻译序列(例如cDNA中)。
本说明书中提及包含核苷酸序列和/或由核苷酸序列组成的核酸所用的缩略语是常规一字母缩略语。因此当包括在核酸中时，如下缩写天然存在的编码核苷酸：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。同样，除非另有说明，否则本文提供的核酸序列为5' →3'方向。
本文所用术语“互补的”及其衍生词用于提及按照A与T或U配对而C与G配对的众所周知的规则的核酸配对。互补可以是“部分的”或“完全的”。在部分互补中，仅一些核酸碱基按照碱基配对规则匹配；而在完全或全部互补中，所有碱基按照配对规则匹配。如本文众所周知的，核酸链之间的互补程度可对核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著作用。所述杂交的效率和强度取决于检测方法。
如本文所用，“DGA1”意指二酰甘油酰基转移酶2型(DGAT2)。DGA1是膜内在蛋白质，其催化油生物合成中最后的酶步骤和植物、真菌和哺乳动物中的三酰甘油产生。DGA1可在改变产油生物的油中所产生的长链多不饱和脂肪酸的数量中起关键作用。DGA1与乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶(“ACAT”)有关。该酶负责将酰基从酰基辅酶A转移到1,2-二酰甘油(“DAG”)的sn-3位置形成三酰甘油(“TAG”) (由此参与TAG生物合成的最终步骤)。DGA1与植物和真菌(特别是有助于用作能源储备的碳贮存的油料种子)中的膜和脂质小体部分有关。TAG被认为是细胞中能量贮存的重要化学物质。已知DGA1调节TAG结构并指导TAG合成。
DGA1多核苷酸和多肽序列可衍生于具有极高的天然脂质蓄积水平的高产油生物(Bioresource Technology 144:360-69 (2013)；Progress Lipid Research 52:395-408(2013)；Applied Microbiology & Biotechnology 90:1219-27 (2011)；EuropeanJournal Lipid Science & Technology 113:1031-51 (2011)；Food Technology &Biotechnology 47:215-20 (2009)；Advances Applied Microbiology 51:1-51 (2002)；Lipids 11:837-44 (1976))。具有据报告约50%和更高脂质含量的生物列表见表1。圆红冬孢酵母和斯达氏油脂酵母具有最高的脂质含量。在表1的生物中，5种具有可公开获得的DGA1的序列：圆红冬孢酵母、斯达氏油脂酵母、A.limacinum、土曲霉和麦角菌(表1中用黑体字)。
表1. 具有据报告约50%和以上脂质含量的产油真菌列表。具有公开可获得的DGA1基因的序列的生物用黑体字表示。
用于提高DGA1的活性的核酸构建体描述于USSN 61/943,664和PCT专利申请号PCT/US15/017227 (通过引用结合到本文中)。图1显示用于在解脂耶氏酵母中表达圆红冬孢酵母DGA1基因NG66 (SEQ ID NO:20)的表达构建体pNC243。在转化前通过PacI/NotI限制酶切消化使DGA1表达构建体线性化。线性表达构建体各包括用于DGA1和Nat1基因(用作用诺尔丝菌素(NAT)选择的标记)的表达盒。
用于提高DGA2和/或其它二酰甘油酰基转移酶的活性的核酸构建体可采用上述方法和/或本领域已知的其它方法产生。图3显示用于在解脂耶氏酵母中表达麦角菌DGA2基因NG112 (SEQ ID NO:9)的表达构建体pNC327。在转化前通过PacI/AscI限制酶切消化使DGA2表达构建体线性化。线性表达构建体各包括用于DGA2和BLE基因(用作用Zeocin选择的标记)的表达盒。
用于提高DGA3和/或其它二酰甘油酰基转移酶的活性的核酸构建体可采用上述方法和/或本领域已知的其它方法产生。
B. 三酰甘油脂肪酶核酸分子和载体
三酰甘油脂肪酶通过脱去一个或多个脂肪酸链消耗细胞的三酰甘油。因此，降低细胞的净三酰甘油脂肪酶活性可增加细胞的三酰甘油。这种降低可通过降低酶的效率(例如通过使其活性部位氨基酸突变)，或通过降低酶的表达来实现。例如，TGL3敲除突变可降低三酰甘油脂肪酶的活性，因为它防止细胞转录TGL3。三酰甘油脂肪酶敲除描述于USSN 61/987,098和PCT专利申请号PCT/US15/28760 (通过引用结合到本文中)。
在一些实施方案中，三酰甘油脂肪酶是TGL3。在其它实施方案中，三酰甘油脂肪酶是TGL3/4或TGL4。
解脂耶氏酵母中的TGL3基因编码三酰甘油脂肪酶蛋白TGL3 (SEQ ID NO:41)，解脂耶氏酵母中的TGL4基因编码三酰甘油脂肪酶蛋白TGL4 (SEQ ID NO:85)。SEQ ID NO:42含有TGL3核苷酸序列、100个上游核苷酸和100个下游核苷酸。因此，SEQ ID NO:42核苷酸序列可用来设计能够与天然解脂耶氏酵母三酰甘油脂肪酶基因的核酸序列重组的核酸。同样，SEQ ID NO:86含有TGL4核苷酸序列。因此，SEQ ID NO:86核苷酸序列可用来设计能够与天然解脂耶氏酵母三酰甘油脂肪酶基因的核酸序列重组的核酸。
敲除盒SEQ ID NO: 49和50能够与解脂耶氏酵母中的天然TGL3基因重组。因此，在一些实施方案中，由SEQ ID NO: 49和50编码的核酸可用来在解脂耶氏酵母中产生三酰甘油脂肪酶敲除突变。SEQ ID NO: 49和50各自含有潮霉素抗性基因hph的部分。两个分离的序列均不编码功能蛋白质，但是2个序列在成功重组时能够编码赋予潮霉素抗性的功能性激酶。此外，SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50两者都不含有启动子或终止子，因此，它们依赖与解脂耶氏酵母TGL3基因的同源重组以用于hph基因转录和翻译。这样，可通过使细胞在含有潮霉素的培养基中生长，来选择成功转化的产油细胞。
可通过用引物NP1798 (SEQ ID NO:47)和引物NP656 (SEQ ID NO:46)扩增潮霉素抗性基因hph (SEQ ID NO:44)，来制备敲除盒SEQ ID NO:49。可通过用引物NP655 (SEQ IDNO:45)和引物NP1799 (SEQ ID NO:48)扩增潮霉素抗性基因hph (SEQ ID NO:44)，来制备敲除盒SEQ ID NO:50。
可采用不同的方法来设计降低解脂耶氏酵母中TGL3的活性的核酸(BiochimicaBiophysica Acta 1831:1486-95 (2013))。可采用本文公开的方法和本领域已知的其它方法降低其它物种中的三酰甘油脂肪酶活性。例如，可采用这些方法降低Arxula adeninivorans的TGL3基因(SEQ ID NO:36)、Arxula adeninivorans的TGL3/4基因(SEQ IDNO:38)或Arxula adeninivorans的TGL4基因(SEQ ID NO:40)的活性。
C. 转化细胞
在一些实施方案中，转化细胞是原核细胞，例如细菌细胞。在一些实施方案中，细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞、原生生物细胞、藻类细胞、禽细胞、植物细胞或昆虫细胞。
细胞可选自Arxula、曲霉属、Aurantiochytrium、假丝酵母属、麦角菌属、隐球菌属、小克银汉霉属、地霉属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、Kodamaea、白冬孢酵母属、油脂酵母属、被孢霉属、Ogataea、毕赤酵母属、原壁菌属、根霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母属、裂殖酵母属、银耳属、丝孢酵母属、Wickerhamomyces和耶氏酵母属。
在一些实施方案中，细胞选自Arxula adeninivorans、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus orzyae)、土曲霉、Aurantiochytrium limacinum、产朊念珠菌(Candida utilis)、麦角菌、浅白隐球菌、弯曲隐球菌、Cryptococcus ramirezgomezianus、地生隐球菌、Cryptococcus wieringae、刺孢小克银汉霉、日本小克银汉霉、Geotrichum fermentans、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、Kodamaea ohmeri、Leucosporidiella creatinivora、产油油脂酵母、斯达氏油脂酵母、子囊菌油脂酵母、深黄被孢霉、高山被孢霉(Mortierella alpina)、Ogataea polymorpha、Pichia ciferrii、季也蒙毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、树干毕赤酵母(Pichia stipites)、Prototheca zopfii、少根根霉、Rhodosporidium babjevae、圆红冬孢酵母、Rhodosporidium paludigenum、粘红酵母、胶红酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、脑状银耳、皮状丝孢酵母、发酵性丝孢酵母、Wickerhamomyces ciferrii和解脂耶氏酵母。
在某些实施方案中，转化细胞是耐高温酵母细胞。在一些实施方案中，转化细胞是马克斯克鲁维酵母。
在某些实施方案中，细胞是解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans。
D.提高细胞中的二酰甘油酰基转移酶的活性
可通过过量表达蛋白质，提高蛋白质的活性。可使用各种遗传修饰，在细胞中过量表达蛋白质。在一些实施方案中，遗传修饰增加天然二酰甘油酰基转移酶的表达。通过修饰天然二酰甘油酰基转移酶基因的上游转录调节子，例如通过增加转录激活物的表达或降低转录阻遏物的表达，使天然二酰甘油酰基转移酶过量表达。或者，天然二酰甘油酰基转移酶基因的启动子可通过与外源核酸重组而用构成型活性或诱导型启动子置换。
在一些实施方案中，遗传修饰编码至少一个拷贝的1型二酰甘油酰基转移酶基因。1型二酰甘油酰基转移酶基因可以是对细胞是天然的或来自不同物种的基因。在某些实施方案中，基因可遗传给转化细胞的子代。在一些实施方案中，基因是可遗传的，因为它定居在质粒上。在某些实施方案中，基因是可遗传的，因为它整合至转化细胞的基因组中。
在某些实施方案中，DGAT1基因是来自Arxula adeninivorans、土曲霉、球毛壳、麦角菌、斯达氏油脂酵母、Metarhizium acridum、冬虫夏草菌、三角褐指藻、季也蒙毕赤酵母、圆红冬孢酵母、牧草红酵母、绿木霉或解脂耶氏酵母的1型二酰甘油酰基转移酶基因。在某些实施方案中，通过用编码二酰甘油酰基转移酶基因的基因转化细胞，来表达二酰甘油酰基转移酶。遗传修饰可编码一个或一个以上拷贝的二酰甘油酰基转移酶基因。在某些实施方案中，遗传修饰编码至少一个拷贝的来自球毛壳、麦角菌、冬虫夏草菌或解脂耶氏酵母的DGA2蛋白。在一些实施方案中，遗传修饰编码至少一个拷贝的来自球毛壳、麦角菌或冬虫夏草菌的DGA2蛋白，且转化细胞是解脂耶氏酵母。在一些实施方案中，遗传修饰编码至少一个拷贝的来自球毛壳、麦角菌或解脂耶氏酵母的DGA2蛋白，且转化细胞是Arxula adeninivorans。
在一些实施方案中，遗传修饰编码至少一个拷贝的2型二酰甘油酰基转移酶基因。2型二酰甘油酰基转移酶基因可以是对细胞为天然的或来自不同物种的基因。在某些实施方案中，基因可遗传给转化细胞的子代。在一些实施方案中，基因是可遗传的，因为它定居在质粒上。在某些实施方案中，基因是可遗传的，因为它整合至转化细胞的基因组中。
在某些实施方案中，DGAT2基因是来自Arxula adeninivorans、土曲霉、Aurantiochytrium limacinum、麦角菌、密粘褶菌、斯达氏油脂酵母、花药黑粉菌、季也蒙毕赤酵母、三角褐指藻、禾柄锈菌、倒卵形红冬孢酵母、圆红冬孢酵母、牧草红酵母或解脂耶氏酵母的2型二酰甘油酰基转移酶基因。在某些实施方案中，通过用编码二酰甘油酰基转移酶基因的基因转化细胞，来表达二酰甘油酰基转移酶。遗传修饰可编码一个或一个以上拷贝的二酰甘油酰基转移酶基因。在某些实施方案中，遗传修饰编码至少一个拷贝的来自圆红冬孢酵母的DGA1蛋白。在一些实施方案中，遗传修饰编码至少一个拷贝的来自圆红冬孢酵母的DGA1蛋白，且转化细胞是解脂耶氏酵母。在一些实施方案中，遗传修饰编码至少一个拷贝的来自圆红冬孢酵母的DGA1蛋白，且转化细胞是Arxula adeninivorans。
在一些实施方案中，DGA1蛋白来自圆红冬孢酵母，DGA2蛋白来自球毛壳、麦角菌、冬虫夏草菌或解脂耶氏酵母。在一些实施方案中，DGA1蛋白来自圆红冬孢酵母，DGA2蛋白来自麦角菌、球毛壳或冬虫夏草菌，且转化细胞是解脂耶氏酵母。在一些实施方案中，DGA1蛋白来自圆红冬孢酵母，DGA2蛋白来自麦角菌、球毛壳或解脂耶氏酵母，且转化细胞是Arxula adeninivorans。
在一些实施方案中，遗传修饰编码至少一个拷贝的3型二酰甘油酰基转移酶基因。3型二酰甘油酰基转移酶基因可为对细胞是天然的或来自不同物种的基因。在某些实施方案中，基因可遗传给转化细胞的子代。在一些实施方案中，基因是可遗传的，因为它定居在质粒上。在某些实施方案中，基因是可遗传的，因为它整合至转化细胞的基因组中。
在某些实施方案中，DGAT3基因是来自蓖麻或落花生的3型二酰甘油酰基转移酶基因。在某些实施方案中，通过用编码二酰甘油酰基转移酶基因的基因转化细胞，来表达二酰甘油酰基转移酶。遗传修饰可编码一个或一个以上拷贝的二酰甘油酰基转移酶基因。在某些实施方案中，遗传修饰编码至少一个拷贝的来自蓖麻或落花生的DGA3蛋白。在一些实施方案中，遗传修饰编码至少一个拷贝的来自蓖麻或落花生的DGA3蛋白，且转化细胞是解脂耶氏酵母。在一些实施方案中，遗传修饰编码至少一个拷贝的来自蓖麻或落花生的DGA1蛋白，且转化细胞是Arxula adeninivorans。
在某些实施方案中，二酰甘油酰基转移酶基因可遗传给转化细胞的子代。在一些实施方案中，二酰甘油酰基转移酶基因是可遗传的，因为它定居在质粒上。在某些实施方案中，二酰甘油酰基转移酶基因是可遗传的，因为它整合至转化细胞的基因组中。
E. 降低细胞中的三酰甘油脂肪酶活性
在一些实施方案中，转化的产油细胞包含降低天然三酰甘油脂肪酶的活性的遗传修饰。所述遗传修饰可影响调节三酰甘油脂肪酶基因转录的蛋白质，包括降低转录激活物的表达和/或增加转录阻遏物的表达的修饰。影响调节物蛋白质的修饰可同时降低三酰甘油脂肪酶的表达和改变使细胞平衡转向脂质蓄积增加或脂质组成改进的其它基因表达概况。或者，遗传修饰可以是引入小干扰RNA或编码小干扰RNA的核酸。在其它实施方案中，遗传修饰由天然三酰甘油脂肪酶基因的核酸和调节区(包括操纵基因、启动子、来自启动子上游的序列、增强子和基因下游的序列)的同源重组组成。
在一些实施方案中，转化的产油细胞包含由同源重组事件组成的遗传修饰。在某些实施方案中，转化细胞包含由天然三酰甘油脂肪酶基因和核酸间的同源重组事件组成的遗传修饰。因此，遗传修饰使三酰甘油脂肪酶基因缺失，防止其转录，或防止可转录成完全活性的蛋白质的基因转录。同源重组事件可使天然三酰甘油脂肪酶基因的一部分突变或缺失。例如，同源重组事件可使天然三酰甘油脂肪酶活性部位中的一个或多个残基突变，由此降低脂肪酶的效率或使其无活性。或者，同源重组事件可影响翻译后修饰、折叠、稳定性或在细胞内的定位。在一些实施方案中，同源重组事件使启动子被驱动较少转录的启动子置换。在其它实施方案中，同源重组事件使启动子突变以损害其驱动转录的能力。在某些实施方案中，遗传修饰是三酰甘油脂肪酶敲除突变。敲除突变是优选的，因为它们消除消耗细胞的三酰甘油含量的途径，由此增加细胞的三酰甘油含量。
敲除突变可使一个或多个三酰甘油脂肪酶基因缺失。此外，敲除突变可使三酰甘油脂肪酶基因被编码不同蛋白质的基因置换。可将基因与外源启动子有效连接。在某些实施方案中，基因不与外源启动子连接，相反地，基因经配置以与三酰甘油脂肪酶基因重组，使得三酰甘油脂肪酶基因的启动子驱动基因的转录。因此，如果基因随机整合至细胞的基因组中，则基因不太可能表达。用于产生敲除的方法是本领域众所周知的(参见例如Fickers等, J. Microbiological Methods 55:727 (2003))。
在某些实施方案中，遗传修饰包含2个同源重组事件。在第一个事件中，编码基因的一部分的核酸与三酰甘油脂肪酶基因重组，而在第二个事件中，编码基因的其余部分的核酸与三酰甘油脂肪酶基因重组。基因的2个部分经设计，使得无一部分是有功能的，除非它们彼此重组。这2个事件进一步降低基因可在随机整合事件后表达的可能性。
在某些实施方案中，基因编码显性选择标记。因此，敲除细胞可通过筛选标记来选择。在一些实施方案中，显性选择标记是药物抗性标记。药物抗性标记是这样的显性选择标记，其当通过细胞表达时，允许细胞在通常抑制细胞生长和/或存活的药物的存在下生长和/或存活。可通过使细胞在药物存在下生长，来选择表达药物抗性标记的细胞。在一些实施方案中，药物抗性标记是抗生素抗性标记。在一些实施方案中，药物抗性标记赋予对选自以下药物的抗性：两性霉素B、克念菌素、非律平、哈霉素、那他霉素、制霉菌素、龟裂杀菌素、联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、氯利康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、艾沙康唑(Isavuconazole)、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬净、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、苯甲酸、环吡酮、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤普罗近、水蓼二醛、托萘酯、结晶紫、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、大观霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明、链霉素、氯碳头孢、厄他培南、多利培南、亚胺培南、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、Ceftarolinefosamil、头孢比罗、替考拉宁、万古霉素、替拉凡星、克林霉素、林可霉素、达托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、呋喃妥英、利奈唑胺、泊西唑利德、Radezolid、Torezolid、阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、克拉维酸盐、舒巴坦、三唑巴坦、克拉维酸盐、杆菌肽、多黏菌素E、多黏菌素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺(Sulfanilimide)、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑复方、复方新诺明、Sulfonamidochrysoidine、地美环素、多西环素、米诺环素、土霉素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷汀、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、梭链孢酸、甲硝唑、莫匹罗星、Platensimycin、奎奴普丁、达福普汀、甲砜霉素、替吉环素、替硝唑、甲氧苄啶、遗传霉素、诺尔丝菌素、潮霉素、博来霉素和嘌罗霉素。
在一些实施方案中，显性选择标记是营养标记。营养标记是当由细胞表达时，使细胞能够利用一种或多种特定的营养源生长或存活的显性选择标记。可通过使细胞在其中表达营养标记的细胞可存活和/或生长、但缺乏营养标记的细胞不能存活和/或生长的限制性营养条件下生长，来选择表达营养标记的细胞。在一些实施方案中，营养标记选自乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶、亚磷酸特异性氧化还原酶、α-酮戊二酸依赖性次磷酸双加氧酶、碱性磷酸酶、氨腈水合酶、三聚氰胺脱氨酶、氰尿酸酰胺水解酶、缩二脲水解酶、脲酰胺水解酶(amidolyase)、三聚氰酸一酰胺氨基水解酶、鸟嘌呤脱氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亚磷酸氢化酶、甘油磷酸二酯酶、对硫磷水解酶、亚磷酸脱氢酶、硫芴脱硫酶、芳族脱亚磺酸酶(Aromatic desulfinase)、NADH依赖性FMN还原酶、氨基嘌呤转运蛋白、羟胺氧化还原酶、转化酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纤维素酶和支链淀粉酶。
可采用不同的方法以敲除解脂耶氏酵母中的TGL3基因(参见例如Dulermo等,Biochimica Biophysica Acta 1831:1486 (2013))。可采用本文公开的方法和本领域已知的其它方法以敲除其它物种中的不同的三酰甘油脂肪酶基因。例如，可采用这些方法敲除Arxula adeninivorans的TGL3基因(SEQ ID NO:36)、Arxula adeninivorans的TGL3/4基因(SEQ ID NO:38)或Arxula adeninivorans的TGL4基因(SEQ ID NO:40)。
在一些实施方案中，遗传修饰降低天然三酰甘油脂肪酶基因的表达达0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%。
在一些实施方案中，遗传修饰降低天然三酰甘油脂肪酶基因的效率达0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%。
在一些实施方案中，遗传修饰降低天然三酰甘油脂肪酶基因的活性达0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%。
F. 降低细胞中的三酰甘油脂肪酶活性同时伴以表达二酰甘油酰基转移酶
在一些实施方案中，转化的产油细胞包含三酰甘油脂肪酶敲除突变和增加天然二酰甘油酰基转移酶的表达的遗传修饰。在某些实施方案中，转化的产油细胞包含三酰甘油脂肪酶敲除突变和编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的细胞的二酰甘油酰基转移酶基因的遗传修饰。在一些实施方案中，三酰甘油酰基转移酶基因被破坏，且表达DGA1和DGA2蛋白。
在一些实施方案中，一种核酸增加天然二酰甘油酰基转移酶的表达或编码至少一个拷贝的二酰甘油酰基转移酶基因，第二种核酸降低细胞中三酰甘油脂肪酶的活性。在一些实施方案中，相同的核酸编码至少一个拷贝的二酰甘油酰基转移酶基因且降低细胞中三酰甘油脂肪酶的活性。例如，经设计敲除三酰甘油脂肪酶基因的核酸还可含有一个拷贝的二酰甘油酰基转移酶基因。
G. 三酰甘油产生
在某些实施方案中，使转化细胞在外源脂肪酸、葡萄糖、乙醇、木糖、蔗糖、淀粉、淀粉糊精、甘油、纤维素和/或乙酸存在下生长。在培养时可加入这些底物以增加脂质产量。外源脂肪酸可包括硬脂酸酯、油酸、亚油酸、γ-亚麻酸、双高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳二烯酸和/或二十碳三烯酸。
在某些实施方案中，本发明涉及由本文所述修饰的宿主细胞产生的产物。在某些实施方案中，产物是油、脂质或三酰甘油。在一些实施方案中，产物是棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸或亚油酸。在某些实施方案中，产物是饱和脂肪酸。因此，产物可以是辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、二十二碳酸、木蜡酸或蜡酸。在一些实施方案中，产物是不饱和脂肪酸。因此，产物可以是肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、杉皮酸(sapienicacid)、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸或二十二碳六烯酸。
产物可选自脂质、三酰甘油酯、脂肪醇、脂肪酸、烷烃、烯烃、类异戊二烯、异戊二烯、角鲨烯、法呢烯、醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、2-丁醇、丁二烯、二醇、1,3丙二醇、1,4丙二醇、琥珀酸、己二酸、尼龙前体、柠檬酸、苹果酸、多元醇和赤藓糖醇。
与DGA1和DGA2有关的遗传修饰
在一些实施方案中，本发明涉及包含第一遗传修饰和第二遗传修饰的转化细胞，其中所述第一遗传修饰提高天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因，且所述第二遗传修饰提高天然2型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的2型二酰甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，细胞包含第三遗传修饰，其中所述第三遗传修饰降低细胞中三酰甘油脂肪酶的活性。
在一些实施方案中，本发明涉及转化细胞，其中第一遗传修饰编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，至少一个拷贝的1型二酰甘油酰基转移酶基因整合至所述细胞的基因组中。
1型二酰甘油酰基转移酶基因可以是来自Arxula adeninivorans、土曲霉、球毛壳、麦角菌、斯达氏油脂酵母、Metarhizium acridum、冬虫夏草菌、三角褐指藻、季也蒙毕赤酵母、圆红冬孢酵母、牧草红酵母、绿木霉或解脂耶氏酵母的1型二酰甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，1型二酰甘油酰基转移酶基因是来自麦角菌、球毛壳、冬虫夏草菌或解脂耶氏酵母的1型二酰甘油酰基转移酶基因。
在一些实施方案中，本发明涉及转化细胞，其中第二遗传修饰编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的2型二酰甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，至少一个拷贝的2型二酰甘油酰基转移酶基因整合至所述细胞的基因组中。
2型二酰甘油酰基转移酶基因可以是来自Arxula adeninivorans、土曲霉、Aurantiochytrium limacinum、麦角菌、密粘褶菌、斯达氏油脂酵母、花药黑粉菌、季也蒙毕赤酵母、三角褐指藻、禾柄锈菌、倒卵形红冬孢酵母、圆红冬孢酵母、牧草红酵母或解脂耶氏酵母的2型二酰甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，2型二酰甘油酰基转移酶基因是来自斯达氏油脂酵母或圆红冬孢酵母的2型二酰甘油酰基转移酶基因。
在一些实施方案中，本发明涉及转化细胞，其中第三遗传修饰是三酰甘油脂肪酶敲除突变。三酰甘油脂肪酶可由TGL3、TGL3/4或TGL4基因编码。
在一些实施方案中，细胞是Arxula adeninivorans；且所述三酰甘油脂肪酶包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39所示氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞是Arxula adeninivorans；且所述三酰甘油脂肪酶由SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ IDNO:40所示核苷酸序列编码。在其它实施方案中，细胞是解脂耶氏酵母；且所述三酰甘油脂肪酶包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:85所示氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞是解脂耶氏酵母；且所述三酰甘油脂肪酶由SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:86所示核苷酸序列编码。
与DGA2有关的遗传修饰
在一些实施方案中，本发明涉及包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰提高天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因。例如，遗传修饰可编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，至少一个拷贝的1型二酰甘油酰基转移酶基因整合至所述细胞的基因组中。
与DGA3有关的遗传修饰
在一些实施方案中，本发明涉及包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰提高天然3型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的3型二酰甘油酰基转移酶基因。例如，遗传修饰可编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的3型二酰甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，至少一个拷贝的3型二酰甘油酰基转移酶基因整合至所述细胞的基因组中。3型二酰甘油酰基转移酶基因可以是来自蓖麻或落花生的3型二酰甘油酰基转移酶基因。
转化细胞的物种
在一些实施方案中，本发明涉及转化细胞，其中所述细胞选自藻类、细菌、霉菌、真菌、植物和酵母。细胞可以是酵母。细胞可选自Arxula、曲霉属、Aurantiochytrium、假丝酵母属、麦角菌属、隐球菌属、小克银汉霉属、地霉属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、Kodamaea、白冬孢酵母属、油脂酵母属、被孢霉属、Ogataea、毕赤酵母属、原壁菌属、根霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母属、裂殖酵母属、银耳属、丝孢酵母属、Wickerhamomyces和耶氏酵母属。例如，细胞可选自Arxula adeninivorans、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、Aurantiochytrium limacinum、产朊念珠菌、麦角菌、浅白隐球菌、弯曲隐球菌、Cryptococcus ramirezgomezianus、地生隐球菌、Cryptococcus wieringae、刺孢小克银汉霉、日本小克银汉霉、Geotrichum fermentans、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、Kodamaea ohmeri、Leucosporidiella creatinivora、产油油脂酵母、斯达氏油脂酵母、子囊菌油脂酵母、深黄被孢霉、高山被孢霉、Ogataea polymorpha、Pichia ciferrii、季也蒙毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、树干毕赤酵母、Prototheca zopfii、少根根霉、Rhodosporidium babjevae、圆红冬孢酵母、Rhodosporidium paludigenum、粘红酵母、胶红酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、脑状银耳、皮状丝孢酵母、发酵性丝孢酵母、Wickerhamomyces ciferrii和解脂耶氏酵母。
产物
在某些方面，本发明涉及来源于上述细胞的产物。在一些实施方案中，产物是油、脂质或三酰甘油。产物可以是棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸或亚油酸。
与DGA1和DGA2有关的方法
在某些方面，本发明提供增加细胞的三酰甘油含量的方法，所述方法包括：(a)提供包含以下的细胞：(i)第一遗传修饰，其中所述第一遗传修饰提高天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因；和(ii)第二遗传修饰，其中所述第二遗传修饰提高天然2型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的2型二酰甘油酰基转移酶基因；(b)使所述细胞在表达第一和第二遗传修饰的条件下生长，从而产生三酰甘油；和(c)任选回收三酰甘油。上述方法还可用来改进细胞的脂质组成。细胞可另包含第三遗传修饰，其中所述第三遗传修饰降低细胞中三酰甘油脂肪酶的活性。
在某些方面，本发明提供增加细胞的脂质含量的方法，所述方法包括将亲本细胞用第一核苷酸序列和第二核苷酸序列转化，其中所述第一核苷酸序列提高天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的1型二酰甘油酰基转移酶基因，且所述第二核苷酸序列提高天然2型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的2型二酰甘油酰基转移酶基因。所述方法可进一步包括将所述细胞用第三核苷酸序列转化，其中所述第三核苷酸序列降低三酰甘油脂肪酶的活性。
第一核苷酸序列可包含1型二酰甘油酰基转移酶基因。在某些实施方案中，第一核苷酸序列编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQID NO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:83所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一核苷酸序列编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:83所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少80%序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一核苷酸序列编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:83所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一核苷酸序列编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:83所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分。在一些实施方案中，第一核苷酸序列编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:81所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分。
在一些实施方案中，第一核苷酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO: 84所示核苷酸序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO: 84所示核苷酸序列具有至少70%序列同源性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO: 84所示核苷酸序列具有至少95%序列同源性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO: 84所示核苷酸序列。在一些实施方案中，第一核苷酸序列包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:82所示核苷酸序列。
第二核苷酸序列可包含2型二酰甘油酰基转移酶基因。在一些实施方案中，第一核苷酸序列与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69所示核苷酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性。在一些实施方案中，第二核苷酸序列编码与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少80%序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二核苷酸序列编码与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二核苷酸序列编码SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分。在一些实施方案中，第二核苷酸序列编码SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:23所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分。在一些实施方案中，第二核苷酸序列编码SEQ ID NO:19所示氨基酸序列或其生物活性部分。
在一些实施方案中，第二核苷酸序列与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:70所示核苷酸序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性。在一些实施方案中，第二核苷酸序列与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:70所示核苷酸序列具有至少70%序列同源性。在一些实施方案中，第二核苷酸序列与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:70所示核苷酸序列具有至少95%序列同源性。在一些实施方案中，第二核苷酸序列包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:68或SEQ ID NO:70所示核苷酸序列。在一些实施方案中，第二核苷酸序列包含SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24所示核苷酸序列。在一些实施方案中，第二核苷酸序列包含SEQ ID NO:20所示核苷酸序列。
在某些实施方案中，第三核苷酸序列能够与三酰甘油脂肪酶基因中的核苷酸序列和/或三酰甘油脂肪酶基因调节区中的核苷酸序列重组。例如，三酰甘油脂肪酶可由TGL3、TGL3/4或TGL4基因编码。在一些实施方案中，细胞是Arxula adeninivorans；且所述三酰甘油脂肪酶包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39所示氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞是Arxula adeninivorans；且所述三酰甘油脂肪酶由SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:38或SEQ ID NO:40所示核苷酸序列编码。在其它实施方案中，细胞是解脂耶氏酵母；且所述三酰甘油脂肪酶包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:85所示氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞是解脂耶氏酵母；且所述三酰甘油脂肪酶由SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:86所示核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，第三核苷酸序列包含编码蛋白质或蛋白质的一部分的基因。蛋白质可赋予对药物的抗性。蛋白质可使细胞能够比不表达该蛋白质的相同物种的细胞更快地在营养源中生长或增殖。
在一些实施方案中，将亲本细胞用编码第一核苷酸序列的第一核酸和编码第二核苷酸序列的第二核酸转化。在其它实施方案中，将亲本细胞用编码第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的第一核酸转化。可将细胞用编码第三核苷酸序列的第三核酸转化，或者第一核酸或第二核酸可编码第三核苷酸序列。然而，在其它实施方案中，将亲本细胞用编码第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列的核酸转化。
与DGA2有关的方法
在某些方面，本发明提供增加细胞的三酰甘油含量的方法，所述方法包括：(a)提供包含遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰提高天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因；(b)使所述细胞在表达该遗传修饰的条件下生长，从而产生三酰甘油；和(c)任选回收三酰甘油。上述方法还可用来改进细胞的脂质组成。
在某些方面，本发明提供增加细胞的脂质含量的方法，所述方法包括用核苷酸序列转化亲本细胞，其中所述核苷酸序列提高天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的1型二酰甘油酰基转移酶基因。
核苷酸序列可包含1型二酰甘油酰基转移酶基因。在某些实施方案中，核苷酸序列编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:83所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:83所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少80%序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:83所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:81或SEQ ID NO:83所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:81所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分。
在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO: 84所示核苷酸序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列与SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:82或SEQ ID NO: 84所示核苷酸序列具有至少70%序列同源性。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO: 84所示核苷酸序列具有至少95%序列同源性。在一些实施方案中，核苷酸序列包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO: 84所示核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:82所示核苷酸序列。
与DGA3有关的方法
在某些方面，本发明提供增加细胞的三酰甘油含量的方法，所述方法包括：(a)提供包含遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰提高天然3型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的3型二酰甘油酰基转移酶基因；(b)使所述细胞在表达该遗传修饰的条件下生长，从而产生三酰甘油；和(c)任选回收三酰甘油。上述方法还可用来改进细胞的脂质组成。
在某些方面，本发明提供增加细胞的脂质含量的方法，所述方法包括用核苷酸序列转化亲本细胞，其中所述核苷酸序列提高天然3型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的3型二酰甘油酰基转移酶基因。
核苷酸序列可包含3型二酰甘油酰基转移酶基因。在某些实施方案中，核苷酸序列编码与SEQ ID NO:87或SEQ ID NO:89所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列编码与SEQ ID NO:87或SEQ ID NO:89所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少80%序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列编码与SEQ ID NO:87或SEQ ID NO:89所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQID NO:87或SEQ ID NO:89所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分。
在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:90所示核苷酸序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性。在一些实施方案中，第一核苷酸序列与SEQID NO:88或SEQ ID NO:90所示核苷酸序列具有至少70%序列同源性。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:90所示核苷酸序列具有至少95%序列同源性。在一些实施方案中，核苷酸序列包含SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:90所示核苷酸序列。
本领域技术人员将容易地认识到，本发明非常适于实现目标，并达到提及的目标和优势以及其中固有的目标和优势。本文所述实施方案无意限制本发明的范围。参照随附的描述、附图和权利要求书，将更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优势。
通过下列实施例进一步说明本说明书，所述实施例不应解释为以任何方式加以限制。所有引述的参考文献(包括本申请书全文中引述的参考文献书目、授权专利、公开的专利申请和GenBank登记号)的内容均通过引用明确结合到本文中。当通过引用予以结合的文件中的术语定义与本文所用术语抵触时，以本文使用的术语为准。
实施例
实施例1：提高DGA1蛋白(DGAT2基因)的活性的方法
用于表达DGA1的核酸构建体描述于USSN 61/943,664和PCT专利申请号PCT/US15/017227 (通过引用结合到本文中)。图1显示用于在解脂耶氏酵母中表达圆红冬孢酵母DGA1基因NG66 (SEQ ID NO:20)的表达构建体pNC243。在转化前通过PacI/NotI限制酶切消化使DGA1表达构建体线性化。线性表达构建体各包括用于DGAT2基因和Nat1基因(用作用诺尔丝菌素选择的标记的(NAT))的表达盒。
采用描述于Chen (Applied Microbiology & Biotechnology 48:232-35(1997))的转化方案，将DGA1表达构建体随机整合至解脂耶氏酵母菌株NS18 (获自ARSCulture Collection，NRRL# YB 392)的基因组中。在含500 µg/mL NAT的YPD板中选择转化株，并按下文实施例2所述通过荧光染色脂质测定法筛选蓄积脂质的能力。对于各表达构建体，分析了8个转化株。
对于大多数构建体，可能由于在只获得功能性Nat1盒的细胞中缺乏功能性DGA1表达盒所致，或由于DGA1整合的位点对DGA1表达的负面作用所致，在转化株之间有明显的菌落变异。尽管如此，所有转化株的脂质含量都显著增加。
如通过实施例2所述荧光测定法测量的，与亲本菌株NS18相比，天然解脂耶氏酵母DGA1 (NG15)在强启动子下的过量表达增加转化株的脂质含量达约2倍。通过圆红冬孢酵母DGA1 (NG66，NG67)和斯达氏油脂酵母DGA1 (NG68)的表达，产生显示最强荧光(是NS18的约3倍)的转化株。
在某些实验中，天然圆红冬孢酵母DGA1 (NG49)表达对解脂耶氏酵母中脂质生产的作用不如不含内含子的圆红冬孢酵母DGAT2基因的合成形式的作用的大。这种结果可能表明解脂耶氏酵母中圆红冬孢酵母DGAT2基因的基因剪接不是非常有效。在某些实验中，用于在解脂耶氏酵母中表达的圆红冬孢酵母DGA1基因的密码子优化对脂质生产没有积极作用。
实施例2：脂质测定法
将高压灭菌的多孔板的各孔充入含有0.5 g/L脲、1.5 g/L酵母提取物、0.85 g/L酪蛋白氨基酸、1.7 g/L YNB (无氨基酸和硫酸铵)、100 g/L葡萄糖和5.11 g/L邻苯二甲酸氢钾(25 mM)的过滤除菌的培养基。使用在YPD琼脂板中在30℃下孵育1-2天的酵母菌株接种多孔板的各孔。24孔板的各孔使用1.5 mL培养基，96孔板的各孔使用300 μL培养基。或者，使用酵母培养物接种高压灭菌的250 mL长颈瓶中的50 mL灭菌培养基。
多孔板用透气盖盖上，并在30℃、70-90%湿度和900 rpm下在Infors MultitronATR振荡器中孵育。或者，长颈瓶用铝箔覆盖，并在30℃、70-90%湿度和900 rpm下在NewBrunswick Scientific振荡器中孵育。96小时后，将20 μL 100%乙醇加入分析微量板中的20 μl细胞中，并在4℃下孵育30分钟。然后将20 μL细胞/乙醇混合物加入Costar 96孔黑色透明底板中的80 μl预先混合的溶液中，该溶液含有50 μL 1 M碘化钾、1 mM μL Bodipy493/503、0.5 μL 100% DMSO、1.5 μL 60% PEG 4000和27 μL水，将板用透明封条覆盖。在30℃下，用SpectraMax M2分光光度计(Molecular Devices)动力学测定法监测Bodipy荧光，并通过将荧光除以600 nm处的吸光度归一化。数据对一式三份生长实验取平均。
实施例3：表达DGA1的解脂耶氏酵母菌株的分析和筛选
为了选择具有最高脂质生产水平的菌株，对表达NG15 (解脂耶氏酵母DGA1)或NG66(圆红冬孢酵母DGA1)的解脂耶氏酵母菌株NS18转化株进行筛选。对于NG15，通过实施例2所述脂质测定法，针对最高脂质蓄积筛选出约50个菌落，最佳转化株命名为NS249。对于NG66，筛选出80个菌落，并选出8个最佳菌落用于进一步分析。
使菌株NS249和8个所选的NG66转化株在摇瓶中生长，并针对脂质含量通过脂质测定法和针对葡萄糖消耗通过HPLC进行分析。与具有在与圆红冬孢酵母DGAT2相同的启动子下表达的天然解脂耶氏酵母DGAT2基因的解脂耶氏酵母菌株相比，表达圆红冬孢酵母DGA1的解脂耶氏酵母菌株具有显著高的脂质含量。同时，NG66转化株比NS249利用显著多的葡萄糖，表明了NG66在将葡萄糖转化为脂质方面更有效。2种DGAT2基因间效率的差异可归因于圆红冬孢酵母DGA1在解脂耶氏酵母中更高的表达水平或圆红冬孢酵母DGA1的更高水平的比活性，或两者。
菌株NS125是用来自pNC104载体的解脂耶氏酵母DGA1表达盒转化的解脂耶氏酵母菌株NS18 (获自ARS Culture Collection，NRRL# YB 392)的衍生株(图2)。在转化前通过PacI/NotI限制酶切消化使pNC104构建体线性化。线性表达构建体包括用于解脂耶氏酵母DGAT2基因和Nat1基因(用作用诺尔丝菌素选择的标记(NAT))的表达盒。采用Chen(Applied Microbiology & Biotechnology 48:232-35 (1997))所述转化方案，将表达构建体随机整合至解脂耶氏酵母菌株NS18的基因组中。在含500 μg/mL NAT的YPD板上选择转化株，并通过实施例2所述荧光染色脂质测定法筛选蓄积脂质的能力。约100个转化株中筛选出的最佳转化株命名为NS125。
NS281菌株采用与菌株NS125类似的方法获得，不同的是使用pNC243构建体用于NS18菌株的转化(图1)。pNC243构建体含有圆红冬孢酵母DGAT2基因(NG66)而不是用于制备NS125的解脂耶氏酵母DGAT2基因。NS281菌株含有整合至解脂耶氏酵母基因组中的圆红冬孢酵母DGAT2基因。
实施例4：敲除解脂耶氏酵母中的三酰甘油脂肪酶敲除基因的方法
用于敲除解脂耶氏酵母TGL3基因同时表达DGAT2基因的核酸构建体描述于USSN 61/987,098和PCT专利申请号PCT/US15/28760 (两者通过引用结合到本文中)。敲除解脂耶氏酵母野生型菌株NS18 (获自NRLL# YB-392)及其表达DGA1的衍生物NS281中的TGL3基因。如上所述，NS281表达来自圆红冬孢酵母的DGA1基因。如下除去解脂耶氏酵母TGL3基因(YALI0D17534g，SEQ ID NO: 42)：使用引物对NP1798-NP656和NP655-NP1799 (SEQ ID NO:45-48)，通过PCR从含有潮霉素抗性基因(“hph,” SEQ ID NO: 44)的质粒扩增2片段缺失盒。按照USSN 61/819,746和PCT专利申请公布号WO 14/182657 (两者通过引用结合到本文中)研发的方案，将所得PCR片段(SEQ ID NO: 49和50)共转化至NS18和NS281。hph盒中启动子和终止子的省略和将hph编码序列剪切成2个PCR片段降低这些片段的随机整合将赋予潮霉素抗性的可能性。如果通过同源重组在TGL3基因座处整合使得TGL3启动子和终止子可指导其转录，则hph基因才可表达。通过PCR筛选潮霉素抗性菌落，以证实TGL3不存在和tgl3:: hyg特定产物的存在。NS18中TGL3的缺失产生菌株NS421。NS281中TGL3的缺失产生菌株NS377。
实施例5：过量表达DGA1和DGA2两者和含有TGL3缺失的细胞比不过量表达DGA2的 细胞蓄积更多TAG
为了测试将DGA1和DGA2表达与TGL3缺失结合导致解脂耶氏酵母中更高脂质蓄积的构思，使麦角菌的DGA2在菌株NS377中表达。如实施例4和USSN 61/987,098和PCT专利申请号PCT/US15/28760 (两者通过引用结合到本文中)所述，菌株NS377含有TGL3的缺失并表达来自圆红冬孢酵母的DGA1。根据证实来自麦角菌的DGA2与来自圆红冬孢酵母的DGA1组合提高解脂耶氏酵母的脂质含量的实验，选择来自麦角菌的DGA2。
图3显示用于在NS377中表达麦角菌DGA2的表达构建体pNC327的图。在转化前用PacI/AscI限制酶切消化使构建体线性化。线性表达构建体包括用于麦角菌DGA2基因和BLE基因(用作用Zeocin选择的标记(ZEO))的表达盒。转化株通过实施例2所述荧光脂质测定法分析，最高脂质生产株命名为NS432。
比较了菌株NS297、NS281、NS412、NS450、NS377和NS432的脂质生产。采用整批葡萄糖方法(在48孔板或50-ml长颈瓶中)或采用高细胞密度分批补料葡萄糖方法(在1-L生物反应器中)，使这一组菌株生长。通过荧光测定法或气相色谱法分析脂质含量，发现菌株NS432具有比其亲本菌株NS377和无TGL3敲除的菌株更高的脂质含量(图4)。这些结果表明TGL3敲除中DGA1和DGA2表达的优势。
实施例6：提高Arxula adeninivorans中DGA1、DGA2或DGA3的活性
针对在Arxula adeninivorans菌株NS252中的表达，选出29个编码来自不同供体的二酰甘油酰基转移酶(DGA) 1型(DGA2)、2型(DGA1)和3型(DGA3)的基因(表2)。用于在A. adeninivorans中表达DGA的表达构建体的图见图5，其中NG167靶为实例。所有其它DGA的构建体都相同，只是靶标可读框(ORF)除外。阴性对照包含代替DGA的大肠杆菌hph基因，其编码赋予对潮霉素B的抗性的磷酸转移酶。
表2. 用于在Arxula adeninivorans和解脂耶氏酵母中表达的二酰甘油酰基转移酶基因
基因ID 供体生物 基因 SEQ ID NO
NG15 解脂耶氏酵母 DGA1 16
NG16 解脂耶氏酵母 DGA2 2
NG66 圆红冬孢酵母 DGA2 20
NG69 斯达氏油脂酵母 DGA1 26
NG70 土曲霉 DGA1 28
NG71 麦角菌 DGA1 30
NG72 Aurantiochytrium limacinum DGA1 32
NG109 圆红冬孢酵母 DGA2 4
NG110 斯达氏油脂酵母 DGA2 6
NG111 土曲霉 DGA2 8
NG112 麦角菌 DGA2 10
NG113 球毛壳 DGA2 12
NG167 Arxula adeninivorans DGA1 34
NG168 Arxula adeninivorans DGA2 14
NG286 牧草红酵母 DGA1 52
NG287 花药黑粉菌 DGA1 56
NG288 禾柄锈菌 DGA1 58
NG289 密粘褶菌 DGA1 60
NG290 倒卵形红冬孢酵母 DGA1 62
NG291 三角褐指藻 DGA1A 64
NG292 三角褐指藻 DGA1B 66
NG293 三角褐指藻 DGA1C 68
NG294 三角褐指藻 DGA1D 70
NG295 三角褐指藻 DGA2 78
NG296 Metarhizium acridum DGA2 80
NG297 冬虫夏草菌 DGA2 82
NG298 绿木霉 DGA2 84
NG299 蓖麻 DGA3 88
NG300 落花生 DGA3 90
通过酵母介导的连接装配表达构建体。接下来，在转化前通过PmeI/AscI限制酶切消化使全长构建体线性化。线性表达构建体包括DGA的表达盒和用于诺尔斯链霉菌Nat1基因(用作用诺尔丝菌素(NAT)选择的标记)的表达盒。采用特别适于A. adeninivorans的方案，将表达构建体随机整合到A. adeninivorans NS252 (ATCC #76597)的基因组中。简单地说，2mL YPD用亲本A. adeninivorans培养物接种，并在旋转振荡器中在37°C下生长过夜。然后将0.5 mL过夜培养物接种到250长颈瓶中25 mL的新鲜YPD中，然后使其在37°C下生长3.5-4小时。将细胞以3000 rpm离心2分钟，弃去上清液。将细胞在无菌水中洗涤，并再次以3000rpm离心2分钟。将沉淀悬浮于2 mL包含40 μM二硫苏糖醇的100 mM乙酸锂中，并转移到微量离心管中。使悬液在旋转振荡器中在37℃下孵育1小时。将细胞以10,000 rpm沉淀10秒钟，弃去上清液。用轻轻吸放将细胞重新悬浮于1 mL水中，再次以10,000 rpm离心10秒钟，并弃去水。细胞通过用1 M冷的山梨糖醇吸放洗涤，然后再次以10,000 rpm离心10秒钟，弃去清液。将2 mL冷的1 M山梨糖醇加入沉淀中，并将管置于冰上。然后将40 μL细胞连同5 μL DNA一起加入预冷却的0.2 cm电穿孔杯中。以25 μF、200 ohms、1.5 kV对细胞进行电穿孔，时间常数为~4.9-5.0 ms。将细胞加入1 mL YPD中，在37℃下孵育过夜，将100 μL-500 μL细胞置于YPD琼脂上。
在含50 μg/mL NAT的YPD板上选择A. adeninivorans转化株。通过实施例2所述荧光染色脂质测定法，针对蓄积脂质的能力筛选转化株。脂质测定法的结果见图6。对于各表达构建体，分析了8个转化株。表达磷酸转移酶而非DGA的转化株用作阴性对照(“NegCont”)。在各板中具有相同的阴性对照和用作阳性对照的NG168的4个板中进行测定，以扣除板间的测定变化性。图6表明大多数所测的DGA显示对A. adeninivorans中的脂质含量的积极作用。相对于DGA1和DGA3，DGA2显示对A. adeninivorans中的脂质含量更显著的积极作用。来自解脂耶氏酵母(NG16)和球毛壳(NG113)的DGA2显示对A. adeninivorans中的脂质含量的最显著作用。
实施例7：提高解脂耶氏酵母中的DGA1、DGA2或DGA3的活性
在解脂耶氏酵母菌株NS598中表达编码来自表2所列不同供体的二酰甘油酰基转移酶1型、2型和3型的18个基因。菌株NS598是具有以下2种遗传修饰的解脂耶氏酵母菌株NS18(获自ARS Culture Collection，NRRL# YB 392)的衍生株：1)天然Δ9去饱和酶基因被来自A. adeninivorans的Δ9去饱和酶基因置换；和2)天然Δ12去饱和酶基因缺失并被大肠杆菌磷酸转移酶(其赋予潮霉素B抗性)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(其赋予对5-氟-2′-脱氧尿苷敏感性)的表达盒置换(参见美国临时专利申请号62/090,169，通过引用结合到本文中)。
用于在解脂耶氏酵母中表达DGA的表达构建体的图见图7，以NG288靶作为实例。所有其它DGA的构建体(NG112除外)都相同，不同的是靶标可读框。用于在NS589中表达NG112的表达构建体见图3。如下所述通过酵母介导的连接装配表达构建体，NG112基因除外，其描述于上文的实施例3。
在转化前通过PmeI/AscI限制酶切消化使构建体线性化。各线性表达构建体包括DGA基因和编码转化酶的酿酒酵母SUC2基因(用作用蔗糖选择的标记)的表达盒。采用Chen等(Applied Microbiology & Biotechnology 48:232-35 (1997))描述的转化方案，将表达构建体随机整合到NS598的基因组中。在含2%蔗糖的YNB板上选择解脂耶氏酵母转化株。通过实施例2所述荧光染色脂质测定法针对蓄积脂质的能力筛选转化株。脂质测定法的结果见图8。对于各表达构建体，分析了8个转化株。亲本菌株NS598用作阴性对照。测定在3个板中进行。图8中的数据表明所测的各DGA1和DGA3显示对解脂耶氏酵母的脂质含量的显著积极作用。一些DGA2也显示对解脂耶氏酵母的脂质含量的积极作用，其中麦角菌DGA2(NG112)显示了最大增加。这些结果不同于上文实施例6中针对A. adeninivorans所述的DGA筛选，这表明了不同DGA对脂质含量的作用是宿主生物特异性的。
通过引用结合
所有专利、公开的专利申请和本文引述的其它参考文献均通过引用结合到本文中。
等同内容
本领域技术人员应认识到，或能够只是采用常规实验便确定本文所述本发明的具体实施方案的许多等同内容。随附权利要求书中欲包括这类等同内容。

Claims (39)

1. 一种转化细胞，其包含第一遗传修饰和第二遗传修饰，其中：
所述第一遗传修饰提高细胞中的天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因；和
所述第二遗传修饰提高细胞中的天然2型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的2型二酰甘油酰基转移酶基因。
2. 权利要求1的转化细胞，其中：
所述第一遗传修饰编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因；和
所述第二遗传修饰编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的2型二酰甘油酰基转移酶基因。
3. 权利要求2的转化细胞，其中所述1型二酰甘油酰基转移酶基因是来自Arxula adeninivorans、土曲霉(Aspergillus terreus)、球毛壳(Chaetomium globosum)、麦角菌(Claviceps purpurea)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、Metarhizium acridum、冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、牧草红酵母(Rhodotorula graminis)、绿木霉(Trichoderma virens)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的1型二酰甘油酰基转移酶基因。
4.权利要求3的转化细胞，其中所述1型二酰甘油酰基转移酶基因是来自麦角菌、球毛壳、冬虫夏草菌或解脂耶氏酵母的1型二酰甘油酰基转移酶基因。
5. 权利要求2-4中任一项的转化细胞，其中所述2型二酰甘油酰基转移酶基因是来自Arxula adeninivorans、土曲霉、Aurantiochytrium limacinum、麦角菌、密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum)、斯达氏油脂酵母、花药黑粉菌(Microbotryum violaceum)、季也蒙毕赤酵母、三角褐指藻、禾柄锈菌(Puccinia graminis)、倒卵形红冬孢酵母(Rhodosporidium diobovatum)、圆红冬孢酵母、牧草红酵母或解脂耶氏酵母的2型二酰甘油酰基转移酶基因。
6.权利要求5的转化细胞，其中所述2型二酰甘油酰基转移酶基因是来自斯达氏油脂酵母或圆红冬孢酵母的2型二酰甘油酰基转移酶基因。
7.权利要求1-6中任一项的转化细胞，其另包含第三遗传修饰，其中所述第三遗传修饰降低细胞中三酰甘油脂肪酶的活性。
8.权利要求7的转化细胞，其中所述三酰甘油脂肪酶由TGL3、TGL3/4或TGL4基因编码。
9. 权利要求7或8的转化细胞，其中所述细胞是Arxula adeninivorans；且所述三酰甘油脂肪酶通过SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39所示氨基酸序列表示，或所述三酰甘油脂肪酶由SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40所示核苷酸序列编码。
10. 权利要求7或8的转化细胞，其中所述细胞是解脂耶氏酵母；且所述三酰甘油脂肪酶通过SEQ ID NO:41或SEQ ID NO: 85所示氨基酸序列表示，或所述三酰甘油脂肪酶由SEQID NO:42或SEQ ID NO:86所示核苷酸序列编码。
11.一种包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰提高细胞中的天然1型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因。
12.权利要求11的转化细胞，其中所述遗传修饰编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的1型二酰甘油酰基转移酶基因。
13. 权利要求12的转化细胞，其中所述1型二酰甘油酰基转移酶基因是来自Arxula adeninivorans、土曲霉、球毛壳、麦角菌、斯达氏油脂酵母、Metarhizium acridum、冬虫夏草菌、三角褐指藻、季也蒙毕赤酵母、圆红冬孢酵母、牧草红酵母、绿木霉或解脂耶氏酵母的1型二酰甘油酰基转移酶基因。
14.权利要求13的转化细胞，其中所述1型二酰甘油酰基转移酶基因是来自麦角菌、球毛壳、冬虫夏草菌或解脂耶氏酵母的1型二酰甘油酰基转移酶基因。
15.一种包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰提高细胞中的天然3型二酰甘油酰基转移酶的活性或编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的3型二酰甘油酰基转移酶基因。
16.权利要求15的转化细胞，其中所述遗传修饰编码至少一个拷贝的对细胞是天然的或来自不同物种的3型二酰甘油酰基转移酶基因。
17. 权利要求16的转化细胞，其中所述3型二酰甘油酰基转移酶基因是来自蓖麻(Ricinus communis)或落花生(Arachis hypogaea)的3型二酰甘油酰基转移酶基因。
18.权利要求1-8或11-17中任一项的转化细胞，其中所述细胞选自细菌、藻类、霉菌、真菌、植物和酵母。
19.权利要求18的转化细胞，其中所述细胞选自Arxula、曲霉属(Aspergillus)、Aurantiochytrium、假丝酵母属(Candida)、麦角菌属(Claviceps)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、地霉属(Geotrichum)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Kodamaea、白冬孢酵母属(Leucosporidiella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、Ogataea、毕赤酵母属(Pichia)、原壁菌属(Prototheca)、根霉属(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、银耳属(Tremella)、丝孢酵母属(Trichosporon)、Wickerhamomyces和耶氏酵母属(Yarrowia)。
20. 权利要求19的转化细胞，其中所述细胞选自Arxula adeninivorans、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus orzyae)、土曲霉、Aurantiochytrium limacinum、产朊念珠菌(Candida utilis)、麦角菌、浅白隐球菌(Cryptococcus albidus)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、Cryptococcus ramirezgomezianus、地生隐球菌(Cryptococcus terreus)、Cryptococcus wieringae、刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)、日本小克银汉霉(Cunninghamella japonica)、Geotrichum fermentans、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、Kodamaea ohmeri、Leucosporidiella creatinivora、产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)、斯达氏油脂酵母、子囊菌油脂酵母(Lipomyces tetrasporus)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、高山被孢霉(Mortierella alpine)、Ogataea polymorpha、Pichia ciferrii、季也蒙毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、树干毕赤酵母(Pichia stipites)、Prototheca zopfii、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、Rhodosporidium babjevae、圆红冬孢酵母、Rhodosporidium paludigenum、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、脑状银耳(Tremella enchepala)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)、发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)、Wickerhamomyces ciferrii和解脂耶氏酵母。
21. 一种改变细胞的脂质含量或组成的方法，所述方法包括用至少2个核苷酸序列转化亲本细胞，其中：
第一核苷酸序列提高1型二酰甘油酰基转移酶的活性或包含1型二酰甘油酰基转移酶基因；和
第二核苷酸序列提高2型二酰甘油酰基转移酶的活性或包含2型二酰甘油酰基转移酶基因。
22.权利要求21的方法，其中所述第一核苷酸序列包含1型二酰甘油酰基转移酶基因。
23. 权利要求22的方法，其中所述第一核苷酸序列编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:83所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。
24. 权利要求23的方法，其中所述第一核苷酸序列编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:81所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分。
25.权利要求21-24中任一项的方法，其中所述第二核苷酸序列包含2型二酰甘油酰基转移酶基因。
26. 权利要求25的方法，其中所述第二核苷酸序列编码与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQID NO:69所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。
27. 权利要求26的方法，其中所述第二核苷酸序列编码SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分。
28.权利要求21-27中任一项的方法，所述方法进一步包括用降低细胞中三酰甘油脂肪酶的活性的第三核苷酸序列转化亲本细胞。
29.权利要求28的方法，其中所述第三核苷酸序列能够与三酰甘油脂肪酶基因中的核苷酸序列和/或三酰甘油脂肪酶基因调节区中的核苷酸序列重组。
30.权利要求28或29的方法，其中所述三酰甘油脂肪酶由TGL3、TGL3/4或TGL4基因编码。
31. 权利要求28-30中任一项的方法，其中所述细胞是Arxula adeninivorans；且所述三酰甘油脂肪酶通过SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39所示氨基酸序列表示，或所述三酰甘油脂肪酶由SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40所示核苷酸序列编码。
32. 权利要求28-30中任一项的方法，其中所述细胞是解脂耶氏酵母；且所述三酰甘油脂肪酶通过SEQ ID NO:41或SEQ ID NO: 85所示氨基酸序列表示，或所述三酰甘油脂肪酶由SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:86所示核苷酸序列编码。
33.一种改变细胞的脂质含量或组成的方法，所述方法包括用核苷酸序列转化亲本细胞，其中核苷酸序列提高1型二酰甘油酰基转移酶的活性或包含1型二酰甘油酰基转移酶基因。
34.权利要求33的方法，其中所述第一核苷酸序列包含1型二酰甘油酰基转移酶基因。
35. 权利要求34的方法，其中所述第一核苷酸序列编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:83所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。
36. 权利要求35的方法，其中所述第一核苷酸序列编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:81所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分。
37.一种改变细胞的脂质含量或组成的方法，所述方法包括用核苷酸序列转化亲本细胞，其中核苷酸序列提高3型二酰甘油酰基转移酶的活性或包含3型二酰甘油酰基转移酶基因。
38.权利要求37的方法，其中所述第一核苷酸序列包含3型二酰甘油酰基转移酶基因。
39. 权利要求38的方法，其中所述第一核苷酸序列编码与SEQ ID NO:87或SEQ ID NO:89所示氨基酸序列或其任一个的生物活性部分具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。
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