KR100455096B1 - 재조합 지모모나스를 이용한 펜토스 발효 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 오탄당을 통상적으로 발효시키지 못하는 미생물을 오탄당을 발효시켜 에탄올을 생산하도록 유전학적으로 개질시킨 미생물 및 이를 이용한 발효공정에 관한 것이다.
미생물의 예로는 크실로스 아이소머라제, 크실룰로키나제, 트랜스알돌라제, 트랜스케톨라제, L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제를 위한 이콜라이 유전자와의 조합에 의해 형질 전환된 지모모나스 모빌리스를 들 수 있다.
첨가된 유전자의 발현은 지모모나스 모빌리스 보효소의 조절 하에 이루어진다.
새롭게 생성된 이들 미생물은 헤미셀룰로오스 및 셀룰로오스의 가수분해에 의해 생성되는 오탄당 및 글루코스를 발효시켜 에탄올을 제조하는 데 유용하다.
Description
미합중국 정부는 미합중국 에너지 관리국과 미드웨스트 연구 기관 (Midwest Research Institute) 사이의 협약 제 DE AC36-83C1110093호에 따른 본 발명의 권리를 갖는다. 본 특허 출원은 참조로서 그의 전체를 본 명세서에 병합한, 1994년 4월 15일자로 특허 출원된 특허출원 제 08/228,303 호의 일부 연속 출원이다.
본 발명은 셀룰로오스 생물 자원중의 크실로스 및 아라비노스 성분의 에탄올로의 발효에 유용하고, 크실로스 및 아라비노스를 대사하고, 크실로스 및 아라비노스 용도 및 펜토스 인산 경로 유전자를 가지는 재조합 지모모나스 모빌리스 균주에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 셀룰로오스 생물 자원 중의 크실로스 및 아라비노스 성분이 에탄올로 신속하고 효율적으로 발효하기 위하여 이들 균주를 사용하는 공정에 관한 것이다.
셀룰로오스 생물 자원은 옥수수 또는 사탕 수수보다 용이하게 입수할 수 있고, 보다 저렴하기 때문에 연료 에탄올을 제조하는데 선호되는 공급 재료이다. 그러나, 전형적인 셀룰로오스 공급 재료를 에탄올의 발효 제조를 위한 기질로서 효과적으로 이용하기 전에 실질적으로 극복해야 할 문제점이 많다.
전형적인 공급 재료는 약 35-45% 셀룰로오스, 30-40%, 헤미셀룰로오스, 15%, 리그닌 및 10%의 기타 성분으로 이루어져 있다. 셀룰로오스 부분은 헥토스 슈가, 글루코스의 중합체로 이루어져 있으며 헤미셀룰로오스 부분은 크실로스 및 아라비노스를 포함하는, 펜토스 슈가로 대부분 이루어져 있다.
글루코스 성분을 셀룰로오스에서 효과적으로 발효시킬 수 있는 미생물들은 공지되어 있는데 반하여, 헤미셀룰로오스의 크실로스 및 아라비노스가 에탄올로 전환하는 것은 어려우며, 이는 에탄올로 전환될 생물 자원에 있어서 경제적인 애로 사항 중의 하나로 남아 있다. 상용화 공정의 개발에 있어서 셀룰로오스 생물 자원 중의 크실로스 및 아라비노스 성분을 신속하고 효율적으로 이용하는 것이 바람직하다.
지모모나스 모빌리스는 식물 수액으로부터 제조된 용설란 및 야자수 와인 등의 알콜 음료의 제조에 있어서 천연 발효제로서 이용되는 박테리아이다. 지모모나스는 전통적인 효모 발효에 비해 생산성이 5배이상이며 5-10% 수율이 더 크기 때문에 공업적으로 에탄올을 생산하는 중요한 미생물이 될 수 있음이 제안되었다. 그의 잠재적인 가치 때문에, 글루코스 기재 공급 재료로부터 공업용 에탄올을 제조하기 위해 지모모나스를 사용하는 여러 공정들이 미합중국 특허 제 4,731,329 호, 동 제 4,812,410 호, 동 제 4,816,399 호 및 동 제 4,876,196호에 기재되어 있다.
지모모나스는 글루코스 기재 공급 재료로부터 연료용 알콜을 생산하는 중요한 미생물이 될 수 있지만, 그의 기질의 이용 범위는 글루코스, 슈크로스 및 프럭토스의 발효에 국한되며, 셀룰로오스 공급 재료 중에서 펜토스 성분의 발효에는 적합하지 않다. 지모모나스는 유일한 발효 산물로서 에탄올로 매우 효율적으로 글루코스를 에탄올로 발효시킬 수 있는 엔트너 두우더로프 경로 (Entner-Douderoff pathway)를 함유한다. 그러나, 지모모나스는 필수적인 펜토스 동화 작용 및 대사작용 경로가 결여되어 있기 때문에 셀룰로오스 생물 자원에서 펜토스 슈가를 천연적으로 발효시킬 수 없다. 따라서, 크실로스 및 아라비로스 등의 펜토스 슈가를 에탄올로 발효시키기 위해 이러한 미생물을 유전공학적으로 처리한다.
한가지 종으로부터 다른 종으로 유전자를 전이하여 발효되는 에탄올 생산을 증진시키기 위한 미합중국 특허 제 5,000,000 호 및 동 제 5,028,539 호와 같은 유전공학적 시도가 이루어져 왔다. 새로운 대사 경로를 창출하기 위한 효소를 포함하는 각종 효소의 발현 및 유전자 클로닝 역시 미합중국 특허 제 5,272,073 호, 동 제 5,041,378 호, 동 제5,168,056 호 및 동 제 5,266,475 호에서 나타나듯이 공지되어 있다. 그러나, 이들 발견중 어느 것도 펜토스 슈가를 에탄올로 미리 발효시킬 수 없는 미생물의 발효가능 범위를 성공적으로 확장시킬 수 없었다.
키산토모나스(Xanthomonas) 또는 클렙시엘라 (Klebsiella)로부터 지모모나스로의 펜토스 이화 경로를 도입하려는 시도는 성공적이지 못하였으며, 재조합 균주는 유일한 탄소 제공원으로서 크실로스 상에서 성장할 수 없었다(Feldmann 등, 1992. Appl. Microbiol. 38:354-361; Liu 등, 1988, J. Biotechnol. 7: 61-77 참조).
본 발명은 펜토스 슈가를 에탄올로 발효시킬 수 없는 지모모나스 등의 미생물에 크실로스 또는 아라비노스와 같은 펜토스 슈가의 발효를 위한 대사 경로를 성공적으로 도입시킨다. 먼저, 이러한 미생물들은 유일한 탄소 제공원으로서 크실로스 또는 아라비노스 상에서 성장할 수 있으며, 이들 펜토스 중 어느 것이나 에탄올로 직접적으로 발효시킬 수 있다.
한가지 실시예는 크실로스 아이소머라제 및 크실룰로키나제를 코딩한 유전자를 도입하는 것이고, 크실로스는 크실룰로스-5-P로 전환될 수 있다. 디른 실시예는 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, 및 L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제를 코딩한 유전자를 도입하는 것이며, L-아라비노스를 D-크실룰로스-5-P로 전환할 수 있다. 이어서, 펜토스 인산 경로에 효소를 코딩한 2 이상의 유전자를 도입함으로써 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제, 크실룰로스-5-P는 해당 엔트너 두우더로프 경로에 펜토스 대사 작용을 결합시키는 중요한 중간체로 더 전환될 수 있으며, 결과적으로 미생물이 펜토스를 에탄올로 대사시킬 수 있게 한다.
아라비노스 및 크실로스 만이 아닌, 크실룰로스-5-P로 전환될 수 있는 임의의 펜토스는 해당 엔트너 두우더로프 경로에 결합될 수 있으며, 결과적으로 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제를 코딩한 이들 2가지 유전자를 도입함으로써 에탄올을 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 실시예는 크실룰로스-5-P를 에탄올로 전환시킬 수 있는 임의의 펜토스를 발효시키기 위한 공정을 제공한다.
본 발명의 하나의 관점은 하나 또는 그 이상의 지모모나스 모빌리스 보효소의 조절 하에 클로닝된 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케롤라제를 코딩한 유전자를 함유하는 지모모나스 모빌리스의 조성물을 제공함으로써 상기 유전자들이 지모모나스 모빌리스의 상기 세포들 중에 동격으로 발현되고, 상기 세포를 성장하게 하고, 아라비노스를 직접적으로 에탄올로 발효하게 한다. 특히, 지모모나스 모빌리스 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAP) 보효소의 조절 하에 정확하게클로닝된 이콜라이로부터 얻은 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, 및 L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제 유전자, 및 지모모나스 모빌리스 에놀라제 (ENO) 보효소의 조절하에 정확하게 클로닝된 이콜라이로부터 얻은 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자를 함유하는 지모모나스 모빌리스의 조성물이 제공됨으로써, 상기 5가지 유전자 모두는 단일 플라스미드 벡터 상에 함유되고, 지모모나스 모빌리스의 상기 세포 내에 동격으로 발현되며, 상기 세포에 성장하고 아라비노스를 직접적으로 에탄올로 발효시킬 수 있게 된다.
본 발명의 다른 관점은 추가의 질소 제공원과 함께 탄소 제공원으로서 아라비노스를 함유하는 배양 배지 중에서 상기 유전학적으로 처리된 지모모나스 모빌리스의 균주를 배양시킴으로써 아라비노스 또는 아라비노스를 함유하는 셀룰로오스 공급 재료로부터 에탄올을 생산하는 공정을 제공한다.
본 발명의 또 다른 관점은 지모모나스 모빌리스에 의해 인지된 1개 이상의 보효소의 조절 하에 크실로스 아이소머라제, 크실룰로키나제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제를 코딩한 유전자를 함유하는 지모모나스 모빌리스의 조성물은 제공함으로써, 이들 유전자는 지모모나스 모빌리스에 발현된다. 이들 유전자는 지모모나스가 성장하고 이들 세포 상에서 크실로스를 에탄올로 직접적으로 발효시킬 수 있게 한다.
특히, 지모모나스 모빌리스 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAP) 보효소의 조절 하에 정확하게 클로닝된 이콜라이로부터 얻은 크실로스 아이소머라제 및 크실룰로키나제 유전자를 함유하는 지모모나스 모빌리스의 조성물이제공된다.
지모모나스 모빌리스 에놀라제 (ENO) 보효소의 조절 하에 정확하게 클로닝된 이콜라이로부터 얻은 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자 역시 지모모나스 모빌리스에 제공된다. 이들 4가지 유전자 모두는 이들 세포가 크실로스 상에서 성장시키고 크실로스를 에탄올로 직접적으로 발효시키게 하는 지모모나스 모빌리스의 세포에서 발현된다. 클로닝된 유전자는 임의의 수의 벡터 상에 제공될 수 있지만, 바람직하게 단일 플라스미드 벡터 상에 함유된다. 보다 바람직하게는 이들 유전자는 숙주 게놈으로 통합된다.
본 발명의 다른 국면은 상기 능력을 갖는 미생물의 배양액이다. 배양액은 기질 또는 기질 혼합물의 에탄올로의 대사에서 보조하기 위해 생물학적으로 순수하거나, 함께 혼합되거나 또는 다른 균주 또는 상이한 유기물과 혼합될 수 있다. 본 발명에 관련된 관점은 소량의 불순물을 견딜 수 있는 배양액 자체에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 관점은 펜토스를 함유하는 배지에 상기 유전학적으로 처리한 미생물을 배양시킴으로써 크실로스 또는 아라비노스, 그의 혼합물 또는 헤미셀룰로오스를 함유하는 셀룰로오스 공급 재료 등이 펜토스 슈가로부터 에탄올을 제조하는 공정이다.
본 발명의 또 다른 관점은 펜토스를 에탄올로 발효시킬 수 있는 능력을 갖고 있지 않은 지모모나스와 같은 미생물의 대사 경로의 변형이다. 이러한 미생물은 유일한 탄소 제공원으로서 아라비노스 또는 크실로스 상에서 성장할 수 있고, 아라비노스 또는 크실로스를 에탄올로 직접적으로 발효시킬 수 있다. 아라비노스를 에탄올로 전환시키기 위한 유전자를 도입함으로써, 아라비노스 발효 능력이 없는 미생물이 아라비노스를 에탄올로 발효시킬 수 있는 미생물로 전환될 수 있다. 마찬가지로, 크실로스를 에탄올로 전환시키기 위한 유전자를 도입함으로써, 크실로스 발효 능력이 없는 미생물이 크실로스를 에탄올로 발효시킬 수 있는 미생물로 전환될 수 있다.
트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제에 더하여 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, 및 L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제에 대한 유전자를 도입함으로서 지모모나스와 같은 미생물이 아라비노스를 에탄올로 대사시킬 수 있다. 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제에 더하여 크실로스 아이소머라제 및 크실롤루키나제에 대한 유전자를 도입하여 지모모나스와 같은 미생물이 크실로스를 에탄올로 대사시킬 수 있다.
본 발명은 유일한 탄소 제공원으로서 크실로스, 아라비노스 또는 다른 펜토스 슈가 단독 또는 이들의 조합물 상에서 성장하고 (하거나) 그로부터 효율적으로 에탄올을 제조할 수 있고, 확장된 기질 이용 범위를 갖는 재조합 지모모나스 및 다른 미생물 균주의 발전이다.
본 발명의 제조에 사용되는 미생물은 펜토스 슈가, 특히 크실로스 및 아라비노스를 분해 대사하기 위한 대사 경로를 형성하는 데 필요한 효소를 제조하도록 유전학적으로 변경될 수 있는 것이다. 이들 미생물은 천연적으로 대사 경로에 약간의 효소를 갖지만, 유전학적으로 변경될 때까지는 크실로스 또는 아라비노스를 에탄올로 발효시킬 수 없다.
유전적 변경 방식은 돌연변이 및 이종 DNA의 부가 등의 공지된 유전 공학 기술을 임의로 조합하여 사용할 수 있고, 단 미생물은 처리후 펜토스를 에탄올로 발효시킬 수 있다. 이종 DNA는 접합, 형질 전환, 형질 도입 또는 전기 영동 등의 임의의 통상적인 기술에 의해 미생물에 도입될 수 있다.
당을 에탄올로 발효시킬 수 있는 많은 미생물은 크실로스, 아라비노스 및 기타 펜토스 슈가를 에탄올로 전환시키기 위한 대사 경로를 구성하는 효소에 대한 유전자들 중 적어도 1개 이상이 결여되어 있다. 외인성 유전자는 대사 경로를 완료하기 위해 첨가될 수 있다. 숙주 미생물이 대사 경로에 효소를 이미 생산한 경우 모든 단계에 유전자를 첨가할 필요는 없다. 첨가되는 유전자 수는 개시된 미생물에 의존할 것이다.
천연적으로 생성된 지모모나스 모빌리스가 크실로스를 발효할 수 있게 할 때, 해당 에트너-두우더로프 경로를 사용하여 추가로 에탄올로 대사되는 중간체로 크실로스를 대사시킬 수 있는 효소를 생산하는 데 4가지 유전자가 필요하다. 천연적으로 생성된 지모모나스 모빌리스가 아라비노스를 발효할 수 있게 할 때, 해당 에트너-두우더로프 경로를 사용하여 추가로 에탄올로 대사되는 중간체로 아라비노스를 대사시킬 수 있는 효소를 생산하는 데 5가지 유전자가 필요하다.
고유의 지모모나스 유전자는 목적하는 대사 경로를 얻기 위한 필요한 효소 활성을 갖는 단백질을 제공하도록 공지된 유전자 조작 기술에 의해 변경될 수 있다. 변경된 유전자는 대사 경로를 완료하기 위해 다른 숙주로부터 도입된 1개 이상의 유전자로 보충될 수 있다, 이러한 방법은 숙주 세포에 첨가될 필요가 있는 유전자수가 감소됨으로써 유리하다. 예를 들면, 지모모나스의 천연 트랜스케톨라제는 이콜라이로부터 개시된 것과 같은 이종 트랜스케톨라제 유전자를 치환시키기 위해 사용될 수 있다.
수용자 미생물이 유일한 탄소 제공원으로서 크실로스, 아라비노스 또는 다른 펜토스를 발효시킬 수 있도록 충분한 유전자가 첨가될 수 있다. 이 미생물은 유일한 탄소 제공원으로서 크실로스, 아라비노스, 또는 이들을 조합하여 사용하여 성장 및 증식시킬 수 있거나 또는 그렇지 못하지만, 크실로스, 아라비노스, 또는 이들의 조합물을 에탄올로 발효시킬 수 있다.
유전자는 벡터에 의해 세포에 첨가될 수 있다. 이 벡터는 플라스미드, 코스미드 또는 세포의 DNA 및 임의의 거주 플라스미드와 화합할 수 있는 바이러스의 형태일 수 있다. 일반적으로, 벡터는 수용체 미생물의 DNA에 통합되거나 또는 이 벡터는 많은 미생물 세대에 걸쳐 벡터를 안정하게 유지시키기 위한 복제 원형을 갖는다. 이러한 복제 원형은 광범위의 스트린전시(stringency) 조건하에 복제를 위해 코딩될 수 있다.
유전자를 발현시키기 위해, 구조적 유전자는 일반적으로 DNA상의 보효소 영역으로부터 아래에 위치한다. 이 보효소는 수용체 미생물에 의해 인지되어야 한다. 보효소 외에, 발현을 증가하거나 조절하기 위한 조절 서열을 포함할 수 있다. 유발 인자 또는 억제 인자에 의해 발현이 조절됨으로써 수용체 미생물은 목적하는 경우에만 유전자를 발현시킨다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 크실로스, 아라비노스 또는 다른 펜토스 슈가 대사 경로 유전자는 펜토스를 대사하는 미생물로부터 얻어지며 이와 달리 펜토스 슈가를 에탄올로 발효시킬 수 없는 지모모나스에 첨가된다.
특히 바람직한 것은 식물 수액과 같은 슈가를 포함하는 액체를 알콜 음료로 발효시키기 위하여 전통적으로 사용되어 온 지모모나스 모빌리스이다. 지모모나스의 특정 균주는 1.5 % 이하의 염화 나트륨에 대해 내성이 있으며, 다른 돌연변이체는 아세트산, 기타 미생물 억제제, 고온 및(또는) 높은 에탄올 농도에 대해 내성이 있다. 숙주 균주의 선택은 사용된 기질에 의존한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 펜토스 대사 효소를 코딩한 유전자의 제공원은 크산토모나스 (Xanthomonas), 클렙시엘라 (Klebsiella), 이콜라이(E.Coli), 로도박터 (Rhodobacter), 플라보박테리움 (Flavobacterium), 아세토박터 (Acetobacter), 글루코노박터(Gluconobacter), 리조비움(Rhizo-bium), 애그로박테리움(Agrobacterium), 살모넬라 (Salmonella), 슈도모나스 (Pseudomonads) 및 지모모나스 (Zymomonas)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일반적으로, 펜토스 슈가 대사를 위한 유전자의 제공원은 성장용의 펜토스 슈가를 사용할 수 있는 임의의 그람 음성 박테리아이다. 유전자 제공원용의 바람직한 미생물은 이콜라이이다.
바람직한 유전자는 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제, 크실로스 아이소머라제, 크실룰로키나제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제를 코딩한다.
지모모나스에서 작용하는 보효소의 조절 하에 이들 유전자는 발현된다. 강력한 해당 보효소가 바람직하다. 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 및 에놀라제용 보효소가 특히 바람직하다. 상이한 유전자는 상이한 보효소의 조절 하 또는 다른 발현 변조 서열 하이다.
이들 유전자의 일부 또는 모두는 동일한 벡터 내에 함께 위치하거나 또는 상이한 벡터 상에 위치하거나 또는 게놈으로 통합된다. 이들의 발현은 미생물이 크실로스, 아라비노스 또는 다른 펜토스를 에탄올로 발효시킬 수 있도록 새롭게 형성된 대사 경로가 형성되게 한다. 바람직하게는, L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제, 크실로스 아이소머라제, 크실룰로키나제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제용의 유전자는 지모모나스에서 하나 또는 그 이상의 작용성 보효소의 조절 하에 있다. 벡터 상의 유전자는 임의의 서열일 수 있고, 서로 그룹화하거나 또는 서로에 대해 상대적으로 배향되며, 하나 이상의 보효소가 벡터 상에 존재하는 경우, 하나의 보효소로부터 전사 방향은 유전자의 발현에 부작용이 가지 않는다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 둘 또는 그 이상의 임의의 상기 유전자로 이루어진 유전 요소는 동일한 벡터 상에 위치한다. 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자를 모두 함유하는 플라스미드가 특히 바람직하다. 이들 벡터는 지모모나스에 의해 인지된 보효소의 조절 하의 유전자를 갖는 것이 바람직하다. 그 예는 플라스미드 pZBET, pZB4, pZB5 및 pZB206이며, 이들 모두는 둘 또는 그 이상의 상기 유전자를 코딩한 DNA를 운반하는 벡터이다.
유전자의 발현 및 이들의 대응하는 유전자 산물의 생성된 작용 활성은 지모모나스에서 중추 에트너-두우도르프 경로에 펜토스 대사를 결합시킨 신규한 생화학적 경로를 나타내며, 이는 이들 세포에 펜토스를 직접적으로 에탄올로 발효시킬 수 있게 한다. 벡터 상의 유전자는 서로 간섭하지 않으며 이들 유전자의 전사 방향에 대해 상대적인 임의의 배향이다. 아래의 예는 유전자들인 배향과 무관하게 본질적으로 동일한 방식으로 수행됨을 나타낸다.
본 발명에 따른 미생물은 배지 중에 함유된 크실로스, 아라비노스 및 기타 펜토스 슈가를 발효시켜 에탄올을 제조하기 위해 단독으로 또는 함께 사용될 수 있다. 배지는 글루코스와 같이, 다른 발효 가능한 슈가를 포함할 수 있다. 미생물의 성장을 원한다면, 미생물의 성장에 필요한 다른 영양소가 첨가될 수 있고, 미생물을 재생시킬 수 있다.
트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제는 펜토스 인산 경로의 중요한 효소이고, 크실룰로스-5-P로 전환될 수 있는 임의의 펜토스 슈가가 지모모나스에 의해 에탄올로 발효하는 데 필요하다. 본 발명의 바람직한 실시예는 펜토스 슈가를 크실로스-5-P로 전환시키는 임의의 다른 유전자 세트와 결합한 지모모나스에서 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제에 대한 유전자의 발현이다.
본 발명에 의해 발효시키기 적절한 펜토스 슈가로는 크실로스 및 아라비노스이나 제한되지는 않는다. 아라비노스의 발효에 필요한 첨가 유전자의 예로는 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자 외에 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제 유전자이다. 크실로스의 발효에 필요한 첨가 유전자의 예로는 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자 외에 크실로스 아이소머라제 및 크실룰로키나제 유전자이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 크실로스, 아라비노스 및 다른 펜토스용의 유전자, 및 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제용 유전지는 이들을 함유하는 미생물로부터 얻어지며, 지모모나스에서 발현된다. 천연 지모모나스 수송 단백질, 돌연변이된 지모모나스 수송 단백질를 통하여, 또는 클로닝된 수송 유전자의 뮤타게네시스의 존재 또는 부재하에 새로운 수송 유전자를 지모모나스에 클로닝시킴으로써 도입되는 새로이 조장된 트랜스포터를 첨가함으로서 펜토스가 지모모나스로 효율적으로 수송될 수 있다.
미생물의 성장 단계는 발효로부터 분리될 수 있다. 크실로스, 아라비노스, 및 기타 펜토스, 또는 그의 혼합물이 미생물의 성장을 위한 탄소 제공원으로서 사용될 수 있거나, 또는 제1 단계로서 충분한 수의 미생물이 존재할 때까지 임의의 배지(펜토스의 존재 또는 부재하) 상에서 미생물을 개별적으로 배양시킨 후, 제2 단계에서 발효용 펜토스를 함유하는 배지를 첨가할 수 있다.
2단계 방법을 사용하는 경우, 제2 단계동안 더 크게 발현할 수 있도록 신규 대사 경로에서 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
기질의 선택은 에탄올로 발효되는 기질의 비용 및 공급에 의한다. 전형적으로 단가가 낮은 펜토스의 공급원은 헤미셀룰로오스이다. 크실로스, 아라비노스 및 기타 펜토스는 증기 및(또는) 산 또는 알칼리 전-처리에 의해 헤미셀룰로오스 물질로부터 유리된다. 글루코스와 같이 보다 적은 양의 다른 당도 이러한 예비 처리 과정에서 분리되며 지모모나스에 의해 에탄올로 발효될 수 있다.
기질이 셀룰로오스 물질인 경우, 이 셀룰로오스는 동시에 또는 개별적으로 당으로 가수분해될 수 있고, 에탄올로 발효될 수도 있다. 헤미셀룰로오스가 일반적으로 셀룰로오스보다 용이하게 당으로 가수분해되기 때문에, 셀룰로오스 물질을 미리 가수분해시키고, 펜토스를 분리한 후, 증기, 산, 알칼리, 셀룰라제로서 또는 이들을 조합하여 처리함으로써 셀룰로오스를 가수분해시켜 글루코스를 형성하는 것이 바람직하다. 헥소스 및 펜토스는 본 발명의 미생물을 사용하여 동시에, 순차로, 개별적으로 또는 함께 에탄올로 발효시킬 수 있다. 원한다면, 헥소스는 펜토스보다는 효모, 천연 지모모나스와 같은 상이한 미생물에 의해 에탄올로 발효시킬 수 있다.
많은 발효 조건이 상기 본 발명의 배경 부분에서 언급한 참고 문헌에 나타낸 바와 같이 공지되어 있다. 지모모나스 모빌리스는 조건 혐기균이다. 원한다면, 이 미생물은 미생물 성장을 거의 제공하지 않고 97 %에 이르는, 당으로부터 에탄올로의 이론적 수율을 갖는다. 최적 pH는 약 3.5 내지 약 7.5 범위이다. 약 25% (글루코스에 기초함)에 이르는 기질 농도, 및 일부 조건하에서는 심지어 더 큰 농도가 사용될 수 있다. 다른 에탄올을 제조하는 미생물과 달리, 미생물의 생존을 위해 어떠한 단계에서도 산소가 필요하지 않다.
또한, 효모와 달리, 산소는 에탄올 생성을 극적으로 감소시키지 않거나 또는 세포 성장을 크게 증가시키지 않는다. 진탕은 필요하지는 않으나, 기질의 이용성 및 에탄올의 확산을 증대시킬 수 있다. 따라서, 발효 조건의 범위는 상당히 확대될 수 있다. 마찬가지로, 임의의 많은 공지된 유형의 장치가 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 미생물은 생물학적으로 순수한 배양액으로서 사용될 수 있거나, 또는 혼합 배양액 중에 미생물을 생산하는 다른 에탄올과 함께 사용될 수 있다. 크실로스를 발효시킬 수 있는 미생물은 아라비노스를 발효시킬 수 있는 미생물과 혼합될 수 있다. 이러한 혼합 펜토스 발효 배양액은 자체 배양될 수 있거나, 또는 글루코스를 발효시킬 수 있는 미생물과 혼합될 수 있다.
생물학적으로 순수한 배양액은 일반적으로 기질 이용을 최적화하기에 좀더 용이하나 혼합된 배양액은 기질 이용을 최대화할 수 있다. 기질의 분해를 보조하거나 또는 에탄올 생산을 증대시키기 위해 발효조에 효소를 첨가할 수도 있다. 일례로, 셀룰라제는 동일한 발효조 내에서 미생물에 의해 글루코스를 에탄올로 발효시킴과 동시에 셀룰로오스를 글루코스로 분해시키기 위해 첨가할 수 있다. 마찬가지로, 헤미셀룰라제는 헤미셀룰로오스를 분해시키기 위해 첨가할 수 있다.
유전학적으로 처리된 지모모나스를 사용하는 바람직한 실시예에서, 배양액은 다른 미생물에 의한 오염에 대해 비교적 내성이 있는 것으로 밝혀졌다. 뿐만 아니라, 지모모나스 배양액을 첨가하기 전에 기질에 이미 존재하는 유해한 미생물을 제거하거나 또는 무력화시키는 것이 바람직하다.
발효 후, 약 13 %에 이르는 농도로 얻을 수 있는 에탄올은 수용액으로부터 에탄올을 분리시키기 위해 공지된 임의의 많은 통상적인 기술에 의해 발효액으로부터 분리된다. 이러한 방법으로는 증발, 증류, 용매 추출 및 멤브레인 분리가 있다. 기질 또는 미생물의 입자는 분리 효율을 증대시키기 위해 에탄올 분리 전에 제거할 수 있다.
일단 발효가 완료되면, 과량의 미생물 및 발효되지 않은 기질은 전부 또는 일부가 재순환되거나 또는 제거될 수 있다. 제거되는 경우, 미생물은 치사되고, 건조되거나 또는 달리 처리될 수 있다. 이러한 혼합물은 동물의 사료, 비료로서 사용되거나, 연료로서 연소되거나 또는 폐기된다.
본 명세서에서 발효에 관한 논의는 일반적으로 배치 공정에 관한 것이지만, 전체 공정의 일부 또는 모두를 연속적으로 수행할 수 있다. 발효조 내에서 미생물을 정체시키기 위해, 유체로부터 고체 입자를 분리시킬 수 있다. 이는 원심 분리, 응결, 침착, 여과 등에 의해 수행할 수 있다. 이와 달리, 미생물은 발효조 내에 정체시키기 전에 또는 보다 용이하게 분리하기 위하여 유동될 수 있다.
달리 특별하게 지적하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술을 가진 자들이 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 하기 제한되지 않은 실시예를 사용함으로써 보다 양호하게 설명된다. 하기 실시예는 제한시키고자 하는 것이 아니라 설명의 목적으로 제공된다.
실시예 1
크실로스 아이소머라제 및 크실룰로키나제 유전자의 단리 및 지모모나스 GAP 보효소로의 융합
이콜라이 크실로스 아이소머라제 및 크실룰로키나제 유전자를 먼저 플라스미드 pLCl-3(Clark, L 및 J. Carbon, 1977, Cell. 9:91-99)으로부터 7 kb HpaI/EcoRI 제한 단편 상에서 얻었다. 이러한 DNA 단편은 한천 겔로부터 회수하였으며, pBlueScript 플라스미드 (Stratagene, LaJolla, CA)에서 SmaI/EcoRI에 서브클로닝되고, 이는 송아지 장의 포스파타제로 탈인산화되어 플라스미드 지정 pBSX를 생성한다.
과량의 DNA를 제거하기 위해, pBSX는 NsiI 및 HindIII 또는 NsiI 및 SmaI로 소화시켰다. T4 DNA 폴리머라제로 처리한 후, 소화된 DNA는 분자내 결찰을 선호하는 희석 조건하에 개별적으로 결찰된 후 이콜라이 HB101로 형질전환되었다. 암피실린 내성 피형질전환체로부터의 플라스미드 DNA를 제한 분석하여 기대되는 결실 유도체의 존재가 확증된다. 기대되는 587 bp NsiI/HindIII 결실을 갖는 플라스미드는 pXKH로 지정되며, 3'-플랭킹 크실로스 오페론 전사 터미네이터를 갖는 크실로스 아이소머라제 및 크실룰로키나제 유전자를 함유한다. 약 900 bp NsiI/SmaI 결실을 갖는 플라스미드는 pXKS로 지정되며, 3'-플랭킹 크실로스 오페론 전사 터미네이터가 없는 크실로스 아이소머라제 및 크실룰로키나제 유전자를 함유한다.
지모모나스에서 크실로스 아이소머라제 및 크실룰로키나제 유전자를 발현시키기 위해, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)-매개 중첩 신장 기술을 사용하여 지모모나스 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAP) 보효소에 이들을 정확하게 융합시켰다. 이러한 시도는 리보솜 결합 부위를 함유하는 GAP 보효소를 크실로스 아이소머라제 유전자의 해독 개시 코돈에 정확하게 융합시킬 수 있어, 그에 따라 크실로스 아이소머라제 및 크실룰로키나제 유전자의 발현은 GAP 보효소에 의해단독으로 조절될 수 있음이 확인된다.
이와 같이 정확한 융합을 달성하기 위해, GAP 보효소로 이루어진 GAP 구조 유전자의 5'-플랭킹 DNA 업스트림의 308 bp 및 크실로스 아이소머라제 구조 유전자의 제1 893 bp는 통상적인 결찰 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR에서 개별적으로 합성되었다. 개개의 DNA 단편은 아가로스 겔로부터 회수하고, GAP 보효소의 3'-말단 및 크실로스 아이소머라제의 5'-말단에서의 상보 말단이 어니일링된 제2 PCR에서 조합되었다. 5'GAP 및 3'-xylA 프라이머를 첨가함으로써 크실로스 아이소머라제 유전자의 5'-말단에 GAP 보효소를 정확히 융합시키는 1213 bp DNA 단편이 합성되었다.
GAP 보효소로 이루어진 308 bp DNA 단편을 합성하기 위해 사용된 프라이머는 GAP유전자(Conway 등, 1987, J. Bacteriol, 169:5653-5662)의 5'-플랭킹 영역의 공지된 DNA 서열을 기초로 하였으며, 다음을 포함한다:
제한 효소 XhoI 및 NotI에 대한 제한 부위로 이루어진 15 bp DNA 서열은 합성된 GAP 보효소의 5'-말단에 혼입되었다. 크실로스 아이소머라제 구조 유전자의 5'-말단에 대응하는 19 bp DNA 서열 (BOLD)은 합성된 GAP 보효소의 3'-말단에 첨가되었다.
크실로스 아이소머라제 구조 유전자의 제1 893 bp로 이루어진 DNA 단편을 합성하기 위해 사용된 프라이머는 그의 공지된 DNA 서열 (Lawlis 등, 1984, Appl. Environ. Microbiol. 47:15-21)을 기초로 하였으며, 다음을 포함한다:
GAP 보효소의 3'-말단에 대응하는 18 bp DNA 서열 (BOLD)은 합성된 크실로스 아이소머라제 구조 유전자 단편의 5'-말단에 첨가되었다.
크실로스 아이소머라제 유전자의 5'-말단에 대한 GAP 보효소의 정확한 융합으로 이루어진 1213 bp DNA 단편은 플라스미드 pXKH 및 pXKS에서 천연 크실로스 아이소머라제 보효소 및 크실로스 아이소머라제 유전자의 5'-말단을 함유하는 2.5 kb XhoI/SaII 제한 단편을 대체하기 위해 사용되었다. 1213 bp DNA 단편은 SalI 및 XhoI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, 제조한 아가로스 겔 전기 영동에 의해 미리 정제된, 플라스미드 pXKH 및 pXKS로부터 2개의 SaII/XhoI 제한 단편중 더 큰 것에 개별적으로 결찰되었다. 결찰된 DNA는 이콜라이 HB101을 형질 전환시키기 위해 사용되었으며, 암피실린 내성 피형질 전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한 분석함으로서 pGapXKHp 및 GapXKS로서 지정되는 플라스미드 DNA의 존재가 확증된다. NotI 제한 효소를 갖는 플라스미드를 소화시킴으로써 GAP 보효소의 조절하에 크실로스 아이소머라제 및 크실룰로키나제 유전자를 각각 함유하는 약 4.1 kb 및 4.4 kb 제한 단편을 유리시키며, 이후 GAP-xyIA/xyIB 오페론이라 칭한다. 이러한 구조는 제1 도에서 보여진다.
실시예 2
지모모나스 ENO 보효소의 조절 하에 합성 오페론의 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자의 단리 및 결찰
이콜라이 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자를 PCR-매개 중첩 신장에 의해 개별적으로 단리시키고, 합성적으로 결합시키고, 지모모나스 에놀라제 (ENO) 보효소에 정확하게 융합시켰다. 이콜라이 게놈의 0'-2.5'분에 편재된 트랜스알돌라제 유전자는 전체 게놈 DNA로부터 PCR 합성에 의해 얻었다. 트랜스알돌라제 유전자로 이루어진 954 bp DNA 단편을 합성하기 위해 사용된 프라이머는 그의 공지된 DNA 서열(Yura 등, 1992. Nucleic Acids Res, 20:3305-3308)을 기초로 하며, 다음을 포함한다:
ENO 보효소의 3'-말단에 대응하는 33 bp DNA 서열 (BOLD)은 합성된 트랜스알돌라제 유전자의 5'-말단에 첨가되었다. 제한 효소 XbaI에 대한 제한 부위에 대응하는 21 bp DNA 서열은 그의 후속 서브클로닝을 조장하기 위해 합성된 트랜스알돌라제 유전자의 3'-말단에 혼입시켰다.
ENO 보효소로 이루어진 196 bp DNA 단편을 합성하기 위해 사용된 프라이머는 ENO 유전자의 5'-플랭킹 영역의 공지된 DNA 서열 (Burnett 등, 1992, J. Bacteriol. 174: 6548-6553)을 기초로 하였으며, 다음을 포함한다:
제한 효소 BgIII에 대한 제한 부위에 대응하는 6 bp DNA 서열은 그의 후속 서브클로닝을 조장하기 위해 합성된 ENO 보효소의 5'-말단에 혼입시켰다. 트랜스알돌라제 유전자의 5'-말단에 대응하는 18 bp DNA 서열 (BOLD)은 합성된 ENO 보효소의 3'-말단에 첨가하였다.
이어서, 트랜스알돌라제 유전자 (tal)은 PCB-매개 중첩 신장에 의해 ENO 보효소에 정확하게 융합되었다. 이와 같이 정확한 융합을 달성하기 위해, ENO 보효소로 이루어진 ENO 구조 유전자의 196 bp 5'-플랭킹 DNA 업스트림 및 트랜스알돌라제 유전자로 이루어진 954 bp DNA 단편은 통상의 결합 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR에서 개별적으로 합성되었다. 개개의 DNA 단편은 아가로스 겔로부터 회수하고, ENO 보효소의 3'-말단 및 트랜스알돌라제 유전자의 5'-말단의 상보 말단이 어니일링된 제2 PCR에서 조합하였다. 이어서, 5'-ENO 및 3'-tal 프라이머를 첨가함으로써 트랜스알돌라제 유전자로 ENO 보효소가 정확히 융합하는 1174 bp DNA 단편이 합성되었다. 이러한 1174 bp DNA 단편은 XbaI 제한 효소로 소화시킨 후, 순차로 SmaI 제한 효소로 소화시키고, dTTP의 존재하에 Taq 폴리머라제로 처리하고, 마지막으로 XbaI로 소화시킨 플라스미드 pUC18에 결찰시켰다. 결찰된 DNA는 이콜라이 DH5α를 형질전환시키기 위해 사용되었으며, 암피실린 내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한분석하여 pEnoTAL로서 지정된 플라스미드의 존재가 확증된다.
트랜스케톨라제 유전자 (tktA)는 이콜라이 W3110 게놈 DNA로부터 PCR 합성에 의해 얻었다. 트랜스케톨라제 유전자로 이루어진 2077 bp DNA 단편을 합성하기 위해 사용된 프라이머는 그의 공지된 DNA 서열 (Sprenger, 1992, J. Bacteriol. 174:1707-1708)을 기초로 하였으며 다음을 포함한다:
제한 효소 XbaI에 대한 제한 부위로 이루어진 8 bp DNA 서열은 tktA 유전자의 5'-말단에 혼입되고, 제한 효소 BgIII에 대한 제한 부위로 이루어진 7 bp DNA 서열은 그의 후속 서브클로닝을 조장하기 위해 tktA의 3'-말단에 혼입되었다. PCR합성후, 트랜스케톨라제 유전자로 이루어진 2077 bp DNA 단편은 제조한 아가로스 겔 전기영동으로 정제하고, XbaI 제한 효소로 소화시킨 후, 순차로 HincII 제한 효소로 소화시키고, dTTP의 존재하에 Taq 폴리머라제로 처리하고, 마지막으로 XbaI로 소화시킨 플라스미드 pUC18에 결찰시켰다. 결찰된 DNA는 이콜라이 DH5α를 형질 전환시키기 위해 사용되었으며, 암피실린 내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한 분석함으로 pUC-TKT로서 지정된 플라스미드의 존재가 확증되었다.
이어서, 트랜스케톨라제 유전자는 ENO 트랜스알돌라제 융합의 다운스트림을 서브클로닝하여 ENO 보효소의 조절 하에 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자로 이루어진 합성 오페론을 생성하였다. 이를 행하기 위해, 플라스미드 pUC-TKT는 XbAI 및 SphI 제한 효소로 소화시키고, 트랜스케톨라제를 함유하는 약 2 kb 제한 단편은 준비한 아가로스 겔 전기 영동에 의해 정제되고, 동일한 제한 효소를 사용하여 미리 소화시킨 플라스미드 pEno-TAL에 결찰시켰다. 결찰된 DNA는 이콜라이 BH5α를 형질전환시키기 위해 사용되었으며, 암피실린 내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한 분석함으로서pEnoTAL/TKT로서 지정된 플라스미드의 존재가 확증되었다.
BgIII 제한 효소로 이러한 플라스미드를 소화시킴으로써 ENO 보효소의 조절 하에, 이후 ENO-tal/tktA 오페론으로 칭하는, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 오페론을 함유하는 약 3 kb 제한 단편을 유리시킨다. 이러한 구조는 제 1 도에서 보여진다.
실시예 3
왕복 벡터의 구축 및 크실로스 대사 및 펜토스 인산 경로 유전자의 지모모나스로의 전이
왕복 벡터는 크실로스 대사 및 펜토스 인산 경로 유전자가 지모모나스로 동시에 전이되도록 구축되었다. 지모모나스 모빌리스 ATCC 10988로부터의 작은 천연 2.7 kb 플라스미드는 준비한 아가로스 겔 전기 영동에 의해 정제하고, AvaI 제한 효소로 소화시킴으로써 선형화되고, 송아지 장의 포스퍼타제로 처리함으로써 탈인산화시킨 유사하게 소화된 플라스미드 pACYC184 (매사추세츠주 비벌리 소재 New England BioLabs)에 결찰시켰다. 결찰된 DNA는 이콜라이 HB101을 형질 전환시키기 위해 사용되었으며, 암피실린 내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한 분석함으로서 pZB186으로서 지정된 플라스미드의 존재가 확증되었다.
이어서, 이 플라스미드는 단일 NotI 제한 단편 상에서 크실로스 대사 유전자를 수용하도록 변조되었다. 플라스미드 pZB186은 EcoRI 제한 효소로 직선화시키고, 응집 단부는 DNA 폴리머라제의 Klenow 단편으로 처리함하여 충진시켰다. NotI 링커를 표준 방법에 따라 첨가한 후, 플라스미드는 Notl 제한 효소로서 소화되고 분자내 결찰을 선호하는 희석 조건 하에 결찰되었다. 결찰된 DNA는 이콜라이 DH5α를 형질전환시키기 위해 사용되었으며, 테트라사이클린 내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한 분석함으로서 pZB186 내의 첨가된 NatI 제한 부위의 존재가 확증되었다. 변조 플라스미드는 pZB188로 지정되었다.
이러한 왕복 벡터에 ENO-tal/tkt 오페론을 도입하기 위해, 플라스미드 pEnoTAL/TKT로부터의 약 3 kb BgIII 제한 단편을 준비한 아가로스 겔 전기 영동에의해 정제하고, 이콜라이 JM110을 통해 연속적으로 통과시킨 pZB188에 결찰시키고, BcII 제한 효소로 소화시킴으로써 직선화시키고, 송아지 장의 포스파타제로 처리함으로써 탈인산화되었다. 결찰된 DNA는 이콜라이 DH5α를 형질 전환시키기 위해 사용되었으며, 테트라사이클린 내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한 분석함으로서 pZBET로서 지정된 플라스미드의 존재가 확증되었다.
이러한 플라스미드에 GAP-xylA/xyIB를 도입하기 위해, 플라스미드 pGapXKH 및 pGapXKS로부터 얻은 약 4.1 kb 및 4.4kb NotI 제한 단편 각각을 준비한 아가로스 겔 전기 영동에 의해 정제하고, 개별적으로 NotI 직선화된 pZBET에 결찰시켰다. 결찰된 DNA는 이콜라이 HB101을 형질 전환시키기 위해 사용되었으며, 테트라사이클린 내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한 분석합으로서 기대되는 플라스미드의 존재를 확증하였다.
시계 방향 배향의 pGapXKH로부터의 GAP-xylA/xylB 오페론 및 반시계 방향 배향의 pEnoTAL/TKT로부터의 ENO-tal/tkt 오페론을 함유하는 플라스미드는 pZB4로 지정하였다. 시계 방향 배향의 pGapXKS로부터의 GAP-xylA/xylB 오페론 및 반시계 방향 배향의 pEnoTAL/TKT로부터의 ENO-tal/tkt 오페론을 함유하는 플라스미드는 pZB5로 지정하였다. pZB4 및 pZB5의 배향은 제 1 도에서 검토할 수 있다.
플라스미드 pZB4 및 pZB5는 16 kv/cm, 200 Ω 및 25 μF에서 10% (w/v) 글리세롤 40 μl 중의 DNA 4 μg으로 약 109세포/ml의 일렉트로포레이션에 의해 개별적으로 지모모나스 모빌리스 CP4로 형질 전환되었다.일렉트로포레이션(electroporation; DNA 삽입)후, 세포는 5 % 글루코스, 10 % 효묘 추출물 (Difco), 5 % 트립톤 (Difco), 0.25 % 황산암모늄, 0.02 % 이가 인산칼륨, 및 1 mM 황산마그네슘으로 이루어진 액체 배치에서 3-16 시간 동안 30 ℃에서 회수되었다. pZB4 및 pZB5를 함유하는 피형질전환체는 1.5 % 한천 및 테트라사이클린 (20 μg/ml)를 추가로 함유하는 동일한 배지에서 2일 이상 동안 30 ℃에서 혐기 배양시킨 후 단리시키고, 순차로 테트라사이클린 내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한 분석함으로서 확증되었다.
지모모나스 모빌리스 CP4 (pZB4)의 효소 분석은 크실로스 아이소머라제 (0.35 U/분/mg), 크실룰로키나제 (1.4 U/분/mg), 트랜스알돌라제 (1.9 U/분/mg) 및 트랜스케톨라제 (0.27 U/분/mg) 활성을 나타내며, 그에 따라 4가지 유전자의 발현이 확증된다. 이들 효소 활성은 왕복 벡터 (CP4[pZB186]) 만을 함유하는 대조 균주에서 검출할 수 없거나 또는 현저하게 낮다 (크실로스 아이소머라제 0.008/분/mg; 크실룰로키나제, 검출할 수 없음; 트랜스알돌라제, 0.014 U/분/mg; 및 트랜스케톨라제, 0.032 U/분/mg).
실시예 4
크실로스 대사 및 펜토스 인산 경로 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스의 발효 실행
크실로스 아이소머라제, 크실룰로키나제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스의 발효 실행은 1 % (W/V) 효묘 추출물 (Difco), 0.2 % 이가 인산칼륨, 및 5 % 글루코스, 또는 5 % 크실로스, 또는 2.5 %글루코스 및 2,5 % 크실로스로 이루어진 배지에서 측정되었다.
재조합 지모모나스 균주는 후기 로그 페이스까지 진탕 없이 작업 부피 80 ml으로 병내 5 % 글루코스 및 크실로스를 함유하는 30 ℃ 상기 배지에서 먼저 전파시켰다. 이어서, 이들 세포는 초기 OD600=0.05-0.1에서 250 ml 플라스크내 200 ml 상기 발효 배지에 접종시켰다. 배양액은 혼합을 위해 부드럽게 흔들면서 (150 rpm) CO2트랩을 사용하는 혐기적 조건하 30 ℃에서 성장시켰다. 세포 성장은 600 nm에서 광학 밀도로서 모니터하였다. 잔류하는 슈가 및 에탄올의 농도는 바이오-래드 아미넥스 (Bio-Rad Aminex) HPX-97H 칼럼을 사용하여 HPLC (HP 1090L) (델라웨어주 윌밍톤 소재 Hewlett Packard) 상에서 측정하였다.
제 2 도에 나타낸 결과는 왕복 벡터 (CP4[pZB186]) 만을 함유하는 대조 균주와 대조적으로, 첨가된 크실로스 아이소머라제, 크실룰로키나제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자를 함유하는 재조합체는 탄소 제공원으로서 크실로스로부터 에탄올을 생산하고 성장을 나타내었다. 재조합 균주는 94%의 이론적 수율로 대조 균주와 마찬가지로 효율적으로 글루코스로부터 에탄올을 생산한다. 재조합 균주는 79시간에 84%의 이론적 수율로 크실로스로부터 에탄올을 추가로 생산한다. 또한, 글루코스 및 크실로스의 조합에서, 재조합 균주는 글루코스 및 크실로스를 48 시간내에 88 %의 이론적 수율로 에탄올로 동시에 발효시킴으로써, 혼합 당 공급 재료가 동시에 발효되어 공정 디자인 이 진보되고 그에 대한 기초를 제공한다.
실시예 5
L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, 및 L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제 유전자의 단리 및 지모모나스 GAP 보효소로의 융합
L-아라비노스 아이소머라제 (araA), L-리불로키나제 (araB), 및 L-리불로스 5-포스페이트 4'-에피머라제 (araD) 유전자를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 합성으로 이콜라이 B/r (Lee 등, 1986, Gene 47:231-244)의 천연 araBAD 오페론으로부터 개별적으로 단리시키고, 신규 araBAD 오페론에 합성적으로 결합시켰다. L-리불로키나제, L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제 (araBAD) 유전자를 지모모나스에서 발현시키기 위해, 이들 유전자는 PCR-매개 중첩 신장 기술을 사용하여 지모모나스 글리세르알데히드-3 포스페이트 데히드로게나제 (GAP) 보효소에 정확하게 융합시켰다. 이러한 시도는 리보솜 결합 부위를 함유하는 GAP 보효소가 L-리불로키나제 유전자의 해독 개시 코돈에 정확하게 융합될 수 있고, 따라서 araBAD 유전자의 발현이 GAP 보효소에 의해 단독으로 조절될 수 있음이 확인된다.
이와 같이 정확하게 융합하기 위해, GAP 보효소로 이루어진 GAP 구조 유전자의 5'-플랭킹 DNA 업스트림의 308 bp 및 araB 구조 유전자의 제1 582 bp는 통상적인 결합 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR에서 개별적으로 합성되었다. 개개의 DNA 단편은 아가로스 겔로부터 회수하고, GAP 보효소의 3'-말단 및 araB 유전자의 5'-말단의 상보 말단이 어니일링된 제2 PCR에서 조합하였다. 이어서, 5'-GAP 및 3'-araB 프라이머를 첨가함으로써 araB 유전자에 GAP 보효소를 정확히 융합시켜는 902 bp DNA 단편이 합성되었다.
GAP 보효소로 이루어진 308 bp DNA 단편을 합성하기 위해 사용한 프라이머는 GAP 유전자 (Conway 등, 1987, J. Bacteriol, 169:5653-5662)의 5'-플랭킹 영역의 공지된 DNA 서열을 기초로 하였으며, 다음을 포함한다:
제한 효소 EcoRI 및 NotI에 대한 제한 부위로 이루어진 15 bp DNA 서열은 합성된 GAP 보효소의 5'-말단에 혼입되었다. araB 유전자의 5'-말단에 대응하는 16 bp DNA 서열 (BOLD)은 합성된 GAP 보효소의 3'-말단에 첨가되었다.
araB 유전자의 제1 582 bp로 이루어진 DNA 단편을 합성하기 위해 사용된 프라이머는 그의 공지된 DNA 서열 (Lee 등, 1986, Gene 47:231-244)를 기초로 하였으며, 다음을 포함한다:
GAP 보효소의 3'-말단에 대응하는 15 bp DNA 서열 (BOLD)은 합성된 araB 유전자 단편의 5'-말단에 첨가되었다.
제2 PCR 합성 후, 902 bp PCR 단편은 준비한 아가로스 겔 전기 영동에 의해 정제시키고, araB 유전자의 GAP 보효소가 정확이 융합된 891 bp EcoRI-KpnI DNA 단편을 생성하기 위하여 EcoRI 및 KpnI로 소화시켰다.
araB 및 araA 유전자의 3'-말단으로 이루어진 2679 bp DNA 단편은 이콜라이 B/r 염색체로부터 PCR 합성에 의해 얻었다. 이러한 DNA 단편을 합성하기 위해 사용된 프라이머는 그의 공지된 DNA 서열 (Lee 등, 1986, Gene 47:231-244)를 기초로 하며, 다음을 포함한다:
XbaI에 대한 제한 부위로 이루어진 26 bp DNA 서열은 araA 유전자 단편의3'-말단에 혼입시켰다. PCR 합성 후, 2679 bp PCR 단편은 준비한 아가로스 겔 전기 영동에 의해 정제시키고, araB 및 araA 유전자의 3'-말단으로 이루어진 2652 bp KpnI-XbaI DNA 단편을 생성하기 위하여 EcoRI 및 KpnI로 소화시켰다.
천연 araBAD 오페론의 araA와 araB 사이의 각각의 유전자 외적 회귀성 서열을 제거하기 위해, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제를 코딩한 araD 유전자는 PCR 합성을 사용하여 이콜라이 B/r 염색체로부터 개별적으로 단리시킨 후, araA의 3'-말단에 결합시켜 신규 araBAD 오페론을 형성하였다. araD 유전자로 이루어진 916 bp DNA 단편은 합성하기 위해 사용된 프라이머는 그의 공지된 DNA 서열 (Lee 등, 1986, Gene 47:231-244)를 기초로 하며, 다음을 포함한다:
XbaI에 대한 제한 부위로 이루어진 23 bp DNA 서열은 araD 유전자의 5'-말단에 혼입시키고, HindIII 및 NotI에 대한 제한 부위로 이루어진 19 bp DNA 서열을 그의 후속 서브클로닝을 조장하기 위해 araD 유전자의 3'-말단에 혼입시켰다. PCR 합성 후, 916 bp PCR 단편은 준비한 아가로스 겔 전기 영동에 의해 정제시키고, XbaI 및 HindIII로 소화시켜 araD로 이루어진 892 bp DNA 단편을 생성하였으며, 동일한 제한효소에 의해 소화된 플라스미드 pUC18에 결찰되었다. 결찰된 DNA는 이콜라이 DH5α를 형질 전화시키기 위해 사용되었으며, 암피실린-내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한 분석함으로서 pUC-araD로서 지정된는 플라스미드의 존재가 확증된다. 신규 araBAD 오페론을 구축하기 위해, araD를 araA의 3'-말단에 결합시켰다. 이를 행하기 위해, araB 및 araA 유전자의 3'-말단으로 이루어진 2652 bp KpnI-XbaI DNA 단편을 KpnI 및 XbaI 제한 효소로 소화시킨 pUC-araD에 결찰시켰다. 결찰된 DNA는 이콜라이 DH5α를 형질 전환시키기 위해 사용되었으며, 암피실린 내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한 분석함으로서 pUC-araB'AD로서 지정된 기대되는 플라스미드의 존재가 확증되었다. 플라스미드 pUC-araB'AD는 부분적으로 신규한 araBAD 오페론을 함유한다.
pBR322에서 EcoRI 및 HindIII 부위로 pUC18의 단편을 다중 클로닝시킨 EcoRI-HindIII를 삽입함으로써 구축된 플라스미드 pBRMCS는 신규한 Pgap-araBAD를 서브클로닝하기 위해 사용되었다 (이하 참조). 3544 bp araB'AD 단편은 pUC-araB'AD를 KpnI 및 HindIII로 소화시킨 후 준비한 아가로스 겔 전기 영동에 의해 단리시키고, 동일한 제한 효소로 소화시킨 pBRMCS에 결찰시켰다. 결찰된 DNA는 이콜라이 DH5α를 형질 전환시키기 위해 사용되었으며, 암피실린 내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한 분석하여 pBRMCS-araB'AD로서 지정된 기대되는 플라스미드의 존재를 확증하였다.
araB 유전자에 대한 GAP 보효소의 정확한 융합으로 이루어진, 미리 얻은 891 bp EcoRI-KpnI DNA 단편은 KpnI 및 EcoRI 제한 효소로 소화시킨 pBRMCS-araB'AD에 결찰시켰다. 결찰된 DNA는 이콜라이 DH5α를 형질 전환시키기 위해 사용되었으며,암피실린 내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한 분석하여 pBRgap- araBAD로서 지정된 기대되는 플라스미드의 존재를 확증하였다. 이러한 플라스미드를 NotI 제한효소로 소화시킴으로써 GAP 보효소의 조절 하에 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, 및 L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제 오페론을 함유하는 약 4.4 kb 제한단편을 유리시키며, 이후 Pgap-araBAD 오페론으로 칭한다 (제 3 도).
실시예 6
아라비노스 대사 및 펜토스 인산 경로 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드의 구축 및 지모모나스로의 전이
시계 방향 및 반시계 방향 배향의 지모모나스 모빌리스 에놀라제 (ENO) 보효소의 조절 하에 정확하게 클로닝된 이콜라이로부터 얻은 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자로 이루어진 Peno-tal/tktA 오페론을 함유하는 플라스미드 pZBT는 실시예 2에서 이미 구축하였다. 이러한 플라스미드에 Pgap-araBAD 오페론을 도입하기 위해, pBR-araBAD로부터의 약 4.4 kb NotI 제한 단편은 준비한 아가로스 겔 전기 영동에 의해 정제되고, NotI 직선화 pZBET에 개별적으로 결찰시켰다. 결찰된 DNA는 이콜라이 DH5α를 형질 전환시키기 위해 사용되었으며, 테트라사이클린 내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한분석하여 기대되는 플라스미드의 존재를 확증하였다.
시계 방향 배향의 Peno-tal/tktA 오페론 및 Pgap-araBAD 오페론을 함유하는 플라스미드는 pZB200으로서 지정하였다. 시계 방향 배향의 Peno-tal/tktA 오페론 및 반시계 방향 배향의 Pgap-araBAD 오페론을 함유하는 플라스미드는 pZB202로서 지정하였다. 시계 방향 배향의 Peno-tal/tktA 오페론 및 반시계 방향 배향의 Pgap-araBAD 오페론을 함유하는 플라스미드는 pZB204로서 지정하였다. 반시계 방향 배향의 Peno-tal/tktA 오페론 및 Pgap-araBAD 오페론을 함유하는 플라스미드는 pZB206으로서 지정하였다 (제 3 도).
플라스미드 pZB200, pZB202, pZB204 및 pZB206은 16 kv/cm, 200 Ω 및 25 μF에서 10% (W/V) 글리세롤 40 μl 중의 1.2 내지 3.0 μg DNA로서 약 109세포/ml의 일렉트로포레이션에 의해 개별적으로 지모모나스 모빌리스 ATCC39676으로 형질 전환시켰다. 일렉트로포레이션후, 세포는 5 % 글루코스, 10 % 효묘 추출물 (Difco), 5 % 트립톤(Difco), 0.25 % 황산암모늄, 0.02 % 이가 인산칼륨, 및 1 mM 황산마그네슘으로 이루어진 액체 배지 중에서 3-16 시간 동안 30 ℃에서 회수되었다. pZB200, pZB202, pZB204 및 pZB206을 함유하는 피형질전환체는 1.5 % 한천 및 테트라사이클린 (20 μg/ml)을 추가로 함유하는 동일한 배지에서 2일 이상 동안 30℃에 혐기 배양시킨 후 단리시키고, 순차로 테트라사이클린 내성 피형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 제한분석하여 확증하였다.
실시예 7
아라비노스 대사 및 펜토스 인산 경로를 함유하는 재조합 지모모나스의 발효 실행
L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스의 발효 실행은 1 % (w/v) 효묘 추출물 (Difco), 0.2 % 이가 인산칼륨, 및 2.5 % 아라비노스 또는 2.5 % 아라비노스와 2.5 % 글루코스로 이루어진 배지에서 평가되었다. 재조합 지모모나스 균주는 후기 로그 페이스까지 5 % 글루코스를 함유하는 상기 배지에서 30 ℃에서 먼저 전파시켰다. 이어서, 이들 세포를 600 nm에서 초기 OD600=0.15에 100 ml 병에 상기 발효 배지 95 ml에 접종시켰다. 배양액을 진탕 없이 30 ℃ 또는 37℃에서 성장시켰다.
제 4 도에 나타낸 결과는 왕복 벡터 (pZB186) 만을 함유하는 대조 균주와 대조적으로, 첨가된 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자 (pZB206)을 함유하는 재조합 균주가 유일한 탄소 제공원으로서 아라비노스 상에서 성장하고 그로부터 에탄올을 생산함을 나타낸다. 본 발명의 재조합 균주는 각각 96 시간 내에 30℃ 또는 37℃에서 91% 또는 96%의 이론적으로 소비된 당 수율로 아라비노스로부터 에탄올을 생산한다. 게다가, 글루코스 및 아라비노스의 조합에서, 재조합 균주는 두 당을 각각 96 시간 내에 30℃ 또는 37℃에서 89 % 또는 96 %의 이론적으로 소비된 당 수율로 에탄올로 발효시킴으로써 혼합 당 공급 재료의 동시 발효를 요하는 공정 디자인에 대한 기초가 제공된다.
실시예 8
글루코스 및 크실로스를 동시 발효시키기 위한 크실로스 대사 및 펜토스 인산 경로 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스의 용도
D-크실로스 아이소머라제, D-크실룰로키나제, 트랜스알돌라제, 및 트랜스케톨라제 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스의 발효 실행은 3.5 % (w/v) D-크실로스 및 6 % (w/v) D-글루코스의 혼합물 상에서 평가하였다. 발효는 37 ℃, 150 rpm의 진탕 속도에서 작동하는 세정되지 않은 500 mL 작업 용량의 발효조 내에서 수행되었으며, 1 리터당 약 0.6 g의 건조 세포 중량 (gDCM/L)으로 접종되었다. 발효 pH는 농축 수산화 칼륨을 자동으로 첨가하여 5.2로 조절하였다. 발효 배지는 1 % (w/v) 효묘 추출물 (Difco) 및 0.2 % (w/v) 이가 인산칼륨으로 이루어져 있으며, 플라스미드를 유지시키기 위해 테트라사이클린이 10 mg/L의 수준으로 첨가되었다.
크실로스를 이용하기 위해 효소를 코딩한 첨가된 유전자를 함유하는 실시예 3에서 얻은 재조합 균주는 6 % (w/v) 글루코스 및 3.5 % (w/v) 크실로스의 혼합물을 48시간 내에 약 42 g/L의 에탄올로 발효시켜 전체적으로 (순수하게) 86 %의 이론적 수율의 유용한 당을 얻었다.(제 5 도 참조)
실시예 9
셀룰로오스, 글루코스 및 크실로스를 동시 발효시키기 위한 크실로스 대사 및 펜토스 인산 경로 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스의 용도
실시예 3에서 생산한 바와 같은 D-크실로스 아이소머라제, D-크실룰로키나제, 트랜스알돌라제, 및 트랜스케톨라제 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스의 발효 실행은 3.5 % (w/v) D-크실로스, 3 % (w/v) D-글루코스 및 3 % (w/v) 시그마셀-50 미세결정질 셀룰로오스 (Sigma)의 혼합물상에서 평가되었다. 셀룰로오스를 가수분해시키기 위해 CPN 셀룰라제 효소 착물 (Iogen)이 셀룰로오스 1 그램당 25 여과지 단위 (FPU/ 셀룰로오스 g)의 하중으로 첨가되었다. 발효는 37 ℃, 150 rpm의 진탕 속도에서 세정되지 않은 500 mL 작업 용량의 발효조 내에서 수행되었으며, 1 리터당 약 0.6 g의 건조 세포 중량 (gDCM/L)으로 접종되었다. 발효 pH는 진한 수산화 칼륨을 자동으로 첨가하여 5.2로 조절하였다. 발효 배지는 1 % (w/v) 효묘 추출물 (Difco) 및 0.2 % (w/v) 이가 인산칼륨으로 이루어져 있으며, 플라스미드를 유지시키기 위해 테트라사이클린을 10 mg/L의 수준으로 첨가하였다.
외인성 셀룰라제하에, 크실로스를 이용하기 위해 코딩한 첨가된 유전자를 함유하는, 상기 실시예 3에서 얻은 재조합 균주는 3 % (w/v) 셀룰로오스, 3 % (w/v) 글루코스 및 3.5 % (w/v) 크실로스의 혼합물을 120 시간내 약 40 g/L의 에탄올로 발효시켜 전체적으로 (순수하게) 80 % 이상의 이론적 수율의 모든 잠재적으로 유용한 당을 얻었다. (제 6 도 참조)
실시예 10
셀룰로오스 및 크실로스를 동시 발효시키기 위한 크실로스 디사 및 펜토스 인산 경로 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스의 용도
D-크실로스 아이소머라제, D-크실룰로키나제, 트랜스알돌라제, 및 트랜스케톨라제 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스의 발효 실행은 3.5 % (w/v) D-크실로스 및 6 % (w/v) 시그마셀-50 미세결정질 셀룰로오스 (Sigma)의 혼합물 상에서 평가하였다. 셀룰로오스를 가수분해시키기 위해 CPN 셀룰라제 효소 착화합물(Iogen)이 셀룰로오스 1 그램당 25 여과지 단위 (FPU/ 셀룰로오스 g)의 하중으로 첨가되었다 .
37 ℃, 150 rpm의 진탕 속도에서 세정되지 않은 500 mL 작업 용량의 발효조 내에서 발효가 수행되었으며, 1 리터당 약 0.6 g의 건조 세포 중량 (gDCM/L)으로 접종되었다. 발효 pH는 진한 수산화 칼륨을 자동으로 첨가함으로써 5.2로 조절하였다. 발효 배지는 1 % (w/v) 효묘 추출물 (Difco) 및 0.2 % (w/v) 이가 인산칼륨으로 이루어져 있으며, 플라스미드를 유지시키기 위해 테트라사이클린이 10 mg/L의 수준으로 첨가되었다.
제 7 도에 나타낸 바와 같이, 외인성 셀룰라제하에, 크실로스를 이용하기 위해 코딩한 첨가된 유전자를 함유하는, 상기 실시예 3에서 얻은 재조합 균주는 6 % (w/v) 셀룰로오스 및 3.5 % (w/v) 크실로스의 혼합물을 120 시간 내에 약 38 g/L의 에탄올로 발효시켜 전체적으로 (순수하게) 72 % 이상의 이론적 수율의 모든 잠재적으로 유용한 당을 얻었다.
실시예 11
셀룰로오스, 글루코스 및 아라비노스를 동시 발효시키기 위한 아라비노스 대사 및 펜토스 인산 경로 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스의 용도
L-아라비노스, D-글루코스 및 셀룰로오스의 혼합물의 발효는 상기 실시예 7에 기재된 것과 같은 방식으로 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제, 트랜스알돌라제, 및 트랜스케톨라제 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 시도를 함으로써,75 % 이상의 잠재적으로 유용한 전체 당 (D-글루코스 + L-아라비노스)에 기초한 수율을 얻을 수 있다. 예를 들면, 2.5 % (w/v) L-아라비노스, 2.5 % (w/v) D-글루코스 및 2.5 % (w/v) 시그마셀-50 미세결정질 셀룰로오스 (Sigma)의 혼합물은 37 ℃, 150 rpm의 진탕 속도에서 세정되지 않은 500 mL 작업 용량의 발효조 내에서 1 리터당 약 0.6 g의 건조 세포 중량 (gDCM/L)의 접종 하중을 사용하여 발효시킬 수 있다.
이러한 경우에, 셀룰로오스를 가수분해시키기 위해 CPN 셀룰라제 (Iogen)등의 셀룰라제 효소 착화합물은 셀룰로오스 1 그램당 25 여과지 단위 (FPU/ 셀룰로오스 g)와 같은 적절한 하중으로 첨가될 수 있다. 발효 pH는 농축된 수산화 칼륨을 자동으로 첨가함으로써 pH 5.2와 같이 성장과 발효가 함께 되지않는 적절한 수준으로 조절되었다. 발효 배지는 1 % (w/v) 효묘 추출물 (Difco) 및 0.2 % (w/v) 이가 인산칼륨으로 이루어져 있으며, 플라스미드를 유지시키기 위해 테트라사이클린을 10 mg/L의 수준으로 첨가하였다.
실시예 12
셀룰로오스 및 아라비노스를 동시 발효시키기 위한 아라비노스 대사 및 펜토스 인산 경로 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스의 용도
L-아라비노스 및 셀룰로오스의 혼합물의 발효는 상기 실시예 10에 기재된 것과 같은 방식으로 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제, 트랜스알돌라제, 및 트랜스케톨라제 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 시도를 함으로써, 70 % 이상의잠재적으로 유용한 전체 당 (D-글루코스 + L-아라비노스)에 기초한 수율이 달성될 수 있다.
일례로, 2.5 % (w/v) L-아라비노스 및 5 % (w/v) 시그마셀-50 미세결정질 셀룰로오스 (Sigma)의 혼합물은 37 ℃, 150 rpm의 진탕 속도에서 세정되지 않은 500 mL 작업 용량의 발효조 내에서 1 리터당 약 0.6 g의 건조 세포 중량 (gDCM/L)의 접종 하중을 사용하여 발효시킬 수 있다. 이러한 경우에, 셀룰로오스를 가수분해시키기 위해 CPN 셀룰라제 (Iogen) 등의 셀룰라제 효소 착화합물은 셀룰로오스 1 그램당 25 여과지 단위 (FPU/ 셀룰로오스 g) 등의 적절한 하중으로 첨가될 수 있다. 발효 pH는 농축된 수산화 칼륨을 자동으로 첨가함으로써 pH 5.2와 같은 적절한 수준으로 조절하였다. 발효 배지는 1 % (w/v) 효묘 추출물 (Difco) 및 2 % (w/v) 이가 인산칼륨으로 이루어지며, 플라스미드를 유지시키기 위해 테트라사이클린을 10 mg/L의 수준으로 첨가하였다.
실시예 13
크실로스 및 아라비노스 및 글루코스의 혼합물, 크실로스 및 아라비노스 및 셀룰로오스의 혼합물, 또는 크실로스 및 아라비노스 및 글루코스 및 셀룰로오스의 혼합물을 동시 발효시키기 위한 아라비노스 대사 및 펜토스 인산 경로 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스와 조합한 크실로스 대사 및 펜토스 인산 경로 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스의 용도
L-아라비노스, D-크실로스, D-글루코스 및 셀룰로오스의 혼합물의 발효는 D-크실로스 아이소머라제, D-크실룰로키나제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스와 조합하여 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제, 트랜스알돌라제, 및 트랜스케톨라제 유전자를 함유하는 재조합 지모모나스로 이루어진 혼합 배양액을 사용함으로써 수행할 수 있다.
이러한 시도를 함으로서, 70 % 이상의 잠재적으로 유용한 전체 당 (D-글루코스 + D-크실로스 + L-아라비노스)에 기초한 수율이 달성될 수 있다. 일례로, 2 % (w/v) L-아라비노스, 2 % (w/v) D-크실로스, 2 % (w/v) D-글루코스 및 2 % (w/v) 시그마셀-50 미세결정질 셀룰로오스 (Sigma)의 혼합물은 37 ℃, 150 rpm의 진탕 속도에서 작동하는 세정되지 않은 500 mL 작업 용량의 발효조 내에서 크실로스 발효 균주 1 리터당 약 0.3 g의 건조 세포 중량 (gDCM/L)과 조합하여 아라비노스 발효 균주 1 리터 당 약 0.3 g의 건조 세포 중량 (gDCM/L)의 접종 하중을 사용하여 발효시킬 수 있다. 2가지 재조합 균주의 접종 비는 본 명세서에 인용된 바와 같이, 혼합물 중의 아라비노스:크실로스 비에 비례하여 동등하게 1:1로부터 변화할 수 있다.
이러한 특정 예에서, 셀룰로오스가 존재하기 때문에, 셀룰로오스를 가수분해시키기 위해 셀룰로오스 1 그램당 25 여과지 단위 (FPU/g) 등의 셀룰라제 효소 착화합물을 첨가한다. L-아라비노스, D-크실로스 및 D-글루코스의 혼합물 만을 발효시키는 경우, 셀룰라제 효소 착화합물은 첨가될 필요가 없다. 발효 pH는 진한 수산화칼륨을 자동으로 첨가함으로써 pH 5.2와 같이 적절한 수준으로 조절할 수 있다.
발효 배지는 1 % (w/v) 효묘 추출물 (Difco) 및 0.2 % (w/v) 이가 인산칼륨으로 이루어져 있으며, 두 균주에 의해 플라스미드를 유지시키기 위해 테트라사이클린을 10 mg/L의 수준으로 첨가하였다. 성장은 37 ℃에서 최소화될 수 있기 때문에, 균주 중의 하나는 나머지를 경쟁에서 제외시키거나 또는 뒤따라 잡지 않을 수 없다.
본 명세서에 사용된 문체 및 용어는 제한시키고자 하는 것이 아니라 설명하기 위한 목적으로 사용되었음을 이해해야 한다.
제 1 도는 재조합 플라스미드 pZB5를 제조하기 위한 공정의 개략도.
제 2 도는 탄소 제공원으로서 글루코스, 크실로스 또는 이들 두가지 당의 혼합물 상에서 성장할 때 대조용 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobillis) 및 pZB5를 함유하는 본 발명의 재조합 균주를 사용한 에탄올의 비교 수율을 나타내는 도면.
제 3 도는 재조합 플라스미드 pZB206을 제조하기 위한 공정의 개략도.
제 4 도는 탄소 제공원으로서 글루코스, 아라비노스 또는 이들 두 가지의 혼합물 상에서 성장할 때의 대조용 지모모나스 모빌리스 및 pZB206을 함유하는 본 발명의 재조합 균주를 사용한 에탄올의 비교 수율을 나타내는 도면.
제 5 도는 본 발명의 미생물에 의한 크실로스와 글루코스 혼합물의 공동 발효를 나타내는 도면.
제 6 도는 셀룰라아제 및 본 발명의 미생물에 의한 크실로스, 글루코스 및 셀룰로오스의 혼합물의 공동 발효를 나타내는 도면.
제 7 도는 셀룰라아제 및 본 발명의 미생물에 의한 크실로스 및 셀룰로오스 혼합물의 공동 발효를 나타내는 도면.
Claims (17)
- 아라비노스를 함유하는 공급 재료를 제공하고,아라비노스로부터 에탄올로 발효할 수 있도록 공급재료에 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제를 코딩하고 아라비노스를 에탄올로 발효시키는 데 필수적인 외인성 유전자를 포함하는 미생물 지모모나스 모빌리스를 첨가하고,미생물을 공급재료내의 아라비노스를 에탄올로 발효시킬 수 있게 하고, 그리고에탄올을 분리하는 단계로 구성되고,상기 외인성 유전자는 지모모나스 모빌리스 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제 및 상기 유전자에 5'로 위치된 지모모나스 모빌리스 엔돌라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나이상의 보효소의 조절하에 발현되고,상기 유전자는 상기 미생물이 아라비노스를 에탄올로 직접적으로 발효할 수 있도록 상기 미생물에서 발현되는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법.
- 제 35 항에 있어서,상기 외인성 유전자는 숙주 게놈으로 통합되는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 외인성 유전자는 벡터상에 위치되는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조 방법.
- 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 크실로스 및 아라비노스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 두 개이상의 당을 필수적으로 포함하는 혼합된 당 공급 재료를 제공하고,상기 공급 재료에 외인성 유전자를 함유하는 미생물 지모모나스 모빌리스를 첨가하고,공급 재료내에 함유된 당을 에탄올로 발효시킬 수 있게 하고, 그리고에탄올을 분리하고,상기 미생물은 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제를 코딩하는 이콜라이로부터의 외인성 유전자를 함유하는 지모모나스 모빌리스, 또는 크실로스 이소머라제, 크실룰로키나제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제를 코딩하는 이콜라이로부터의 외인성 유전자를 함유하고, 유일한 탄소원으로서 크실로스상에서 성장할 수 있고 88%의 이론적 수율로 크실로스로부터 에탄올로 발효될 수 있는 지모모나스 모빌리스인 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법.
- 제 4 항에 있어서,가수분해 셀룰라제 효소 착화합물을 첨가하는 것으로 추가 구성되고 상기 혼합된 당 공급 재료는 셀룰로스를 함유하는 것을 특징으로 에탄올의 제조방법.
- 유일한 탄소원으로서 아라비노스상에서 성장하고 상기 아라비노스를 에탄올로 발효하는 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제를 코딩하고 아라비노스를 에탄올로 발효시키는 데 필수적인 외인성 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물 지모모나스 모빌리스.
- 제 6 항에 있어서,상기 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제 유전자는 지모모나스 모빌리스 에놀라제 보효소의 조절하에서 발현되는 것을 특징으로 하는 미생물 지모모나스 모빌리스.
- 제 6 항에 있어서,상기 L-아라비노스 이소머라제, L-리불로키나제, 및 L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제 유전자는 지모모나스 모빌리스 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제 보효소의 조절하에서 발현되는 것을 특징으로 하는 미생물 지모모나스 모빌리스.
- 제 6 항에 있어서,상기 외인성 유전자는 이콜라이로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 미생물 지모모나스 모빌리스.
- 제 6 항에 있어서,상기 외인성 유전자는 상기 유전자에 5'로 위치되는 하나이상의 보효소의 조절하에서 발현되고, 상기 유전자는 상기 미생물에서 발현되는 것을 특징으로 하는 미생물 지모모나스 모빌리스.
- 제 9 항에 있어서,상기 유전자는 숙주 게놈으로 통합되는 것을 특징으로 하는 미생물 지모모나스 모빌리스.
- 제 9 항에 있어서,상기 유전자는 벡터상에 함유되는 것을 특징으로 하는 미생물 지모모나스 모빌리스.
- 제 12 항에 있어서,상기 벡터는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 미생물 지모모나스 모빌리스.
- L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제, 그리고지모모나스 모빌리스 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제 및 유전자의 발현을 조절하는 지모모나스 모빌리스에 의해 인식된 지모모나스 모빌리스 에놀라제로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나이상의 보효소를 코딩하는 유전자가 포함되는 것을 특징으로 하는 지모모나스 모빌리스 형질 전환용 벡터.
- 유일한 탄소원으로서 아라비노스상에서 성장하고 상기 아라비노스를 에탄올로 발효하는 L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제를 코딩하고 아라비노스를 에탄올로 발효시키는 데 필수적인 외인성 유전자를 함유하고,제 14항에 기재된 벡터를 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물 지모모나스 모빌리스.
- 제 9항에 있어서L-아라비노스 아이소머라제, L-리불로키나제, L-리불로스 5-포스페이트 4-에피머라제를 코딩하고 지모모나스 모빌리스 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제 보효소의 조절하에 발현되는 외인성 유전자 및, 트랜스알돌라제 및 트랜스케톤라제를 코딩하고 지모모나스 모빌리스 에놀라제 보효소의 조절하에서 발현되는 외인성 유전자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 미생물 지모모나스 모빌리스.
- 제 6항에 있어서,상기 유전자는 상호적으로 발현되는 것을 특징으로 하는 미생물 지모모나스 모빌리스.
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