JP2008523794A - 改善されたヤロウイア・リポリティカ変異株によるジカルボン酸の製造 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の目的は、従来技術の欠点を克服することである。実際に、アシル−CoAオキシダーゼをコードする遺伝子が破壊されたヤロウイア・リポリティカ変異体を用いて二塩基酸を生じさせることが有利には可能であることが発見された。
より詳細な方法では、本発明は、少なくとも1種のジカルボン酸を製造する方法であって、
(a)生育段階であって、(アシル−CoAオキシダーゼをコードする)POX2、POX3、POX4およびPOX5遺伝子が少なくとも破壊されたヤロウイア・リポリティカの変異株が、炭素源および窒素源を少なくとも含むエネルギー性の基質から本質的になる培養培地において培養される、段階と、
(b)生物変換段階であって、前記株が、エネルギー性の基質の存在下に少なくとも10個の炭素原子を有するn−アルカン、少なくとも10個の炭素原子を有する脂肪酸、これらの脂肪酸の1〜4個の炭素原子を有するアルキルエステル(例えば、メチルまたはエチルエステルの混合物)および天然油(グリセロールの脂肪酸エステルの混合物)の中から選択される生物変換基質に供される、段階と、
(c)形成されたジカルボン酸を回収する段階と
を包含する方法を提供する。
この株を得るための手順は、次の通りであり得る:
1)興味のある遺伝子の配列を決定する(または、この遺伝子の配列は、データバンクにおいて入手可能である);
2)対抗選択マーカー(counter-selectable marker)、例えば、マーカーURA3(これにより、Ura+表現型またはUra−表現型について選択し得る)を用いるPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)またはクローニングによって破壊用カセットを構築する;
3)削除された興味株を有する株を選択し(変換および軽質転換体の選択)(マーカーがURA3であれば有利にはUra+)、遺伝子崩壊をチェックする。
株MTLY74Leu+Ura−は変異株MTLY37から構築された。
(3a)脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油によって誘導可能なプロモーターpPOX2の制御下にNADPH−シトクロムリダクターゼおよびシトクロムP450モノオキシゲナーゼALK1を発現させるMTLY79。
この株は、MTLY37株またはMTLY66株の構築と同一の手順に従うことによって得られ得る。
この株は、株FT120の構築物と同一の手順に従うことによって得られ得る。
これらの実施例において、本発明者らは、二塩基酸の産生についての培養条件および培地組成の影響を試験した。そして、本発明者らは、変異体MTLY37により、ペプトンの使用が、特にバクト−トリプトンと関連して、二塩基酸の産生に非常に有利であることを観察した(実施例1および2)。
組成物:酵母抽出物10g・L−1、ペプトン10g・L−1、グルコース10g・L−1、寒天(Agar)20g・L−1のグロース培地(gelosed medium)において維持される、変異体MTLY37の予備培養が、0.30近くの予備培養培地の初期吸光度を提供する播種によって行われた。予備培養は、軌道攪拌下(200rpm)に24時間にわたり30℃で、25mLの培地(10g・L−1の酵母抽出物、10g・L−1のペプトン、20g・L−1のグルコース)を含有する500mLのフランジ付きフラスコにおいて行われる。
培養培地において、同一濃度でトリプトンをペプトンに置き換えることによって実施例1が繰り返される。培養130時間後に、9.9g・L−1のジカルボン酸が得られた。すなわち、実施例1と関連して約68%産生度が増加した。
オレインヒマワリ油が培養培地から除かれ、かつ、反応器内への1mLの二次制限(sublimiting)流量でのこの油の連続注入によって置き換えられて、実施例2が繰り返される。
変異体MTLY37を、CPRおよびALK1遺伝子を過剰発現させる変異体MTLY79によって置き換えることによって実施例3が繰り返される。130時間の培養後、16g・L−1のジカルボン酸が得られた。
変異体MTLY37を、CPRおよびALK2遺伝子を過剰発現させる変異体MTLY80によって置き換えることによって実施例3が繰り返される。130時間の培養後、16g・L−1のジカルボン酸が得られる。
変異体MTLY37を、CPR遺伝子のみを過剰発現させる変異体MTLY81によって置き換えることによって実施例3が繰り返される。130時間の培養後、16g・L−1のジカルボン酸が得られる。
変異体MTLY37を、6のPOX遺伝子が削除され、CPR遺伝子のみを過剰発現させる変異体FT120によって置き換えることによって実施例3が繰り返される。130時間の培養後、18g・L−1のジカルボン酸が得られる。
変異体MTLY37を、6のPOX遺伝子およびDGA1遺伝子が削除され、CPR遺伝子を過剰発現させる変異体FT130によって置き換えることによって実施例3が繰り返される。130時間の培養後、23g・L−1のジカルボン酸が得られる。
Claims (24)
- ジカルボン酸を製造する方法であって、
(a)生育段階であって、POX2、POX3、POX4およびPOX5遺伝子(アシル−CoAオキシダーゼをコードする)が少なくとも破壊された、ヤロウイア・リポリティカの変異株が、少なくとも1種の炭素源および窒素源を含むエネルギー性基質から本質的になる培養培地において培養される、段階と、
(b)生物変換段階であって、前記株が、エネルギー性基質の存在下に、少なくとも10個の炭素原子を有するn−アルカン、少なくとも10個の炭素原子を有する脂肪酸、前記脂肪酸の1〜4個の炭素原子を有するアルキルエステルおよび天然油の中から選択される生物変換基質に供される、段階と、
(c)形成されたジカルボン酸を回収する段階と
を包含する、方法。 - 用いられる変異体がMTLY37であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 用いられる変異体が、CPRおよびALK1遺伝子を過剰発現させるMTLY79であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 用いられる変異体が、CPRおよびALK2遺伝子を過剰発現させるMTLY80であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 用いられる変異体が、CPR遺伝子を過剰発現させるMTLY81であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 用いられる変異体が、CPR遺伝子を過剰発現させるFT120であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 用いられる変異体が、CPR遺伝子を過剰発現させるFT130であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記生物変換基質は、メチルエステルの混合物またはエチルエステルの混合物からなることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。
- 前記生物変換基質は、オレインヒマワリ油からなることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。
- 生物変換段階において、培養培地がペプトンを含むことを特徴とする請求項1〜7のいずれか1つに記載の方法。
- 生物変換段階において、培養培地が、二次的エネルギー性基質の供給を含み、該エネルギー性基質は、少なくとも1種のポリヒドロキシ化合物からなることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ポリヒドロキシ化合物は、グリセロールまたは糖であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 段階(c)において、ジカルボン酸は、カルシウム塩の形態での析出によって回収されることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1つに記載の方法。
- 生物変換条件下に、変異体MTLY66から、NADPH−シトクロムリダクターゼをコードするCPR遺伝子を過剰発現させるヤロウイア・リポリティカ変異株MTLY74 Leu+Ura−を、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油によって誘導可能なプロモーターpPOX2の制御下に選択マーカーLEU2およびCPR遺伝子を有する発現カセットを含有するJMP21−CPRベクターを変換することによって得る方法。
- 生物変換条件下に、ヤロウイア・リポリティカ変異株MTLY74から、NADPH−シトクロムリダクターゼをおよびシトクロムP450モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を過剰発現させるヤロウイア・リポリティカ変異株MTLY79を、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油によって誘導可能なプロモーターpPOX2の制御下に選択マーカーURA3と、ALK1遺伝子を有する発現カセットとを含有するJMP61−ALK1ベクターを変換することによって得る方法。
- 生物変換条件下に、ヤロウイア・リポリティカ変異株MTLY74から、NADPH−シトクロムリダクターゼおよびシトクロムP450モノオキシゲナーゼALK2をコードする遺伝子を過剰発現させるヤロウイア・リポリティカ変異株MTLY80を、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油によって誘導可能なプロモーターpPOX2の制御下に選択マーカーURA3と、ALK2遺伝子を有する発現カセットとを含有するJMP61−ALK2ベクターを変換することによって得る方法。
- 生物変換条件下に、変異株MTLY74から、NADPH−シトクロムリダクターゼをコードするCPR遺伝子を過剰発現させるヤロウイア・リポリティカ変異株MTLY81を、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは天然油タイプの生物変換基質によって誘導可能なプロモーターpPOX2の制御下にそれを発現させることによって得る方法であって、該ヤロウイア・リポリティカ変異株MTLY81は、マーカーURA3を有するJMP61プラスミドにより軽質転換させることによって変異体MTLY74を原栄養性にすることによって、原栄養性である、方法。
- ヤロウイア・リポリティカ変異株MTLY66から、ヤロウイア・リポリティカ変異株FT120 Leu−Ura−を得る方法であって、
下記表の段階(1)〜(4):
- 新ヤロウイア・リポリティカ変異株MTLY66。
- 新ヤロウイア・リポリティカ変異株MTLY81。
- 新ヤロウイア・リポリティカ変異株FT120。
- 新ヤロウイア・リポリティカ変異株FT130。
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