CN101442910A

CN101442910A - 具有从磷酸二羟丙酮到甘油的途径被破坏的酵母细胞

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Publication number: CN101442910A
Application number: CNA2007800167830A
Authority: CN
Inventors: C·A·邓顿; P·苏米宁; A·阿里斯蒂多; B·J·拉什; K·科伊武兰塔; B·M·豪斯; T·W·麦马琳; K·罗伯格-佩雷斯
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 2006-03-13
Filing date: 2007-03-13
Publication date: 2009-05-27
Also published as: US20090053782A1; JP5443970B2; BRPI0709607B1; US20210155411A1; US20200377302A9; EP2001992A2; US20150315616A1; ES2620770T3; EP2001992B1; BRPI0709607A2; JP2009529879A; US20180257864A1; US11691817B2; CA2645361A1; PL2586313T3; EP2001992A4; WO2007106524A3; WO2007106524A2; EP2586313A1; US10899544B2

Abstract

酵母细胞经过遗传修饰而破坏了从二羟丙酮到甘油的天然代谢途径。在某些方面，所述酵母细胞属于克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)或伊萨酵母属(Issatchenkia)。在其它方面，所述酵母细胞能够产生至少一种有机酸，例如乳酸。所述酵母细胞的甘油产量明显低于其野生型菌株，并且所述酵母细胞的所需发酵产物的收率通常较高。本发明的酵母细胞在培养时通常生长良好，尽管它们的甘油产量下降。

Description

具有从磷酸二羟丙酮到甘油的途径被破坏的酵母细胞

本发明是在与美国能源部合同号DE-FC36-03GO13145下完成的。美国政府对本发明享有某些权利。

本申请要求于2006年3月13日申请的美国临时申请号60/781,674的优先权。

本发明涉及某种遗传修饰的酵母，并涉及使用这样的遗传修饰酵母而生产乳酸的发酵方法。

酵母在许多工业发酵中用作生物催化剂。人们对使用酵母发酵糖类以生产有机酸(例如乳酸)的兴趣一直在持续增加。在这样的发酵中，随着有机酸产生得越多，发酵培养基越来越酸化。大多数产生这些有机酸的细菌在强酸环境下表现不良——在这样的条件下它们要么无法生存，要么生产产物缓慢，以至于经济上不可行。所以，有必要缓冲培养基以维持较高pH。这对回收酸性形式的产品而言会带来困难。最好在较低pH下进行发酵，在这种情况下产品部分或全部呈酸性形式。

已经考虑了多种酵母作为这类低pH发酵的候选者。多种酵母能天然发酵己糖而产生乙醇，但是极少(如果有的话)能天然产生高收率的有机酸，例如乳酸。因此，已经进行了许多工作，对各种酵母进行遗传修饰，插入一个或多个能使细胞产生乳酸的基因。为了使糖代谢从乙醇生产转向乳酸生产，也对这些细胞进行遗传修饰，以破坏或缺失天然丙酮酸脱羧酶(PDC)基因。这项工作可参见例如WO 99/14335、WO 00/71738 A1、WO 02/42471 A2、WO 03/049525 A2、WO 03/102152A2和WO 03/102201 A2。

在许多这类酵母发酵中可高收率地产生甘油。甘油可作为细胞的渗透压保护剂。甘油的形成可有助于在发酵条件下再生氧化还原辅因子。

许多酵母细胞都产生甘油，即通过代谢磷酸二羟丙酮(DHAP)。在多种酵母中，DHAP通过甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD，系统名称为sn-甘油-3-磷酸：NAD+2-氧化还原酶，EC 1.1.1.8)还原，生成甘油-3-磷酸(G3P)。G3P作为脂质生物合成的前体以及甘油前体。G3P通过甘油-3-磷酸酶(GPP，系统名称为甘油-1-磷酸磷酸水解酶，EC 3.1.3.21)脱去磷酸，生成甘油。

甘油的产生有一个替代途径，该途径对某些酵母(例如粟酒裂殖酵母(S.pombe))而言是至关重要的。在该途径中，磷酸二羟丙酮通过磷酸二羟丙酮磷酸酶脱去磷酸，生成二羟丙酮。然后，再通过NADH+依赖性甘油脱氢酶(系统名称为甘油：NAD+2-氧化还原酶，EC 1.1.1.6)并伴随NADH氧化，使二羟丙酮转变为甘油。

因为产生甘油会消耗碳，而这些碳原本可用于产生更多所需发酵产物，所以这类甘油的产生是收率损失的重要来源。另外，产生甘油还会消耗ATP和NADH。这消耗了产生生物量或所需产物所需的能量。因为这些原因，所以最好使细胞减少或消除甘油的产生。进一步的考虑是，减少或消除甘油的产生还可简化对所需产物的回收和纯化。

一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株经遗传工程缺失其天然GPD基因，因此细胞丧失GPD酶并能阻止甘油的产生。参见Nissen等，“Anaerobic and aerobic batch cultivations of Saccharomycescerevisiae mutants impaired in glycerol synthesis”，Yeast，2000：16：463-474。Nissen等人报告，当两个天然GPD基因都被破坏之后，突变细胞在厌氧和好氧条件下生长都很差。根据Nissen等，突变细胞的甘油产量比野生型细胞少得多。Nissen等人假设，在双重缺失菌株中所观察的生长不良，是因为细胞NAD⁺贮库的缺失，因为甘油的产生不能氧化细胞中的NADH。

最好能提供这样的酵母细胞：所述细胞产生所需有机产物，而不产生或很少产生甘油，而且在好氧条件、厌氧条件或好氧条件和厌氧条件下也能生长良好。

一方面，本发明是全基因组重复前酵母种(pre-whole genomeduplication yeast species)的突变酵母细胞，所述细胞具有从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径的缺失或破坏。天然代谢途径的缺失或破坏可包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因的缺失或破坏。天然代谢途径的缺失或破坏可包括至少一个天然甘油-3-磷酸酶(GPP)基因的缺失或破坏。它可包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因和至少一个天然甘油-3-磷酸酶(GPP)基因的缺失或破坏。天然代谢途径的缺失或破坏可包括至少一个天然二羟丙酮磷酸磷酸酶基因的缺失或破坏、天然甘油脱氢酶基因的缺失或破坏、或这两个基因同时都缺失或破坏。

另一方面，本发明是全基因组重复前酵母种的突变酵母细胞，所述突变细胞当在以下标准微好氧条件下进行培养时，产生2.0g/L以下的甘油：

A.成分确定的含水培养基，其在培养开始时含有5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、痕量元素、维生素、150g/L葡萄糖；

B.培养开始时pH为3.5，培养期间如有必要则缓冲发酵培养基以防pH降至3.0以下或升至7.0以上；

C.接种酵母细胞培养至OD₆₀₀为1.0；

D.培养温度30℃；

E.持续培养直到葡萄糖浓度降至10g/L，但不超过120小时；

F.通气和搅拌以达到摄氧率为5.0±1.0mmol/L/hr。

另一方面，本发明是全基因组重复前酵母种的突变酵母细胞，所述细胞缺乏产生活性甘油-3-磷酸脱氢酶(GDP)的能力。对于本发明的目的，与野生型菌株酶活性相比，当细胞中某酶的活性降低至少75％、优选至少90％时，就认为细胞缺乏产生该酶的能力。可以采用合适测定方法，检测任一特定酶的酶活性。市售测定试剂盒可用于测定甘油-3-磷酸脱氢酶活性。这类产品的一个实例称为MK426(Takara Bio，Inc.)，得自Fisher Scientific，Pittsburgh，Pennsylvania。

另一方面，本发明是全基因组重复前酵母种的突变酵母细胞，所述细胞缺乏产生活性甘油-3-磷酸酶的能力。

另一方面，本发明是突变酵母细胞，所述细胞缺乏产生活性磷酸二羟丙酮磷酸酶的能力，而野生型酵母细胞可天然产生该酶；所述细胞缺乏产生活性NADH⁺依赖性甘油脱氢酶的能力，而野生型酵母细胞可天然产生该酶；或所述细胞同时缺乏产生这两种酶的能力。

另一方面，本发明是突变酵母细胞，所述细胞经过遗传修饰而产生有机酸产物，所述酵母细胞还具有从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径的缺失或破坏和从丙酮酸到乙醇的天然代谢途径的缺失或破坏。天然代谢途径的缺失或破坏可包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因的缺失或破坏。天然代谢途径的缺失或破坏可包括至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。它可包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因和至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。

已经发现，本发明的细胞在发酵条件下进行培养时，产生的甘油水平非常低。在发酵条件的范围内，发现甘油产量低于0.2g/L。令人吃惊的是，本发明的细胞在发酵条件下生长良好，尽管缺乏甘油产生，而且在某些实施方案中尽管缺乏甘油-3-磷酸产生。也发现本发明的细胞在某些情况下具有改善的耐酸性。因此，本发明也是发酵方法，其中在发酵条件下培养本发明上述方面的任一项的细胞，产生发酵产物，其中碳源至甘油的收率低于2％(重量)。

图1是描述pBH158质粒的图。

图2是描述pBH159质粒的图。

图3是描述pBH160质粒的图。

图4是描述pBH161质粒的图。

图5是描述pMM28质粒的图。

图6是描述pMI318质粒的图。

图7是描述pMI321质粒的图。

图8是描述pMI355质粒的图。

图9是描述pMI357质粒的图。

图10是描述pMI433质粒的图。

图11是描述pMI449质粒的图。

图12是描述pMI454质粒的图。

图13是描述pBH165质粒的图。

图14是描述pTMC61质粒的图。

本发明的酵母细胞是通过对宿主酵母细胞进行某些遗传修饰而制备的。当宿主酵母细胞为野生型菌株时，能天然代谢至少一种糖产生甘油。天然代谢途径可包括从磷酸二羟丙酮至甘油-3-磷酸再至甘油的代谢途径。天然途径可包括从磷酸二羟丙酮至二羟丙酮再至甘油的代谢途径。宿主细胞可含有这两种天然代谢途径。

当在本文中用于遗传材料(例如基因、启动子、终止子或其它DNA序列)时，术语“天然”是指该种酵母的野生型细胞基因组内存在的遗传材料(除了不影响功能的一对一突变之外)。“天然能力”(及其变形例如“天然能够”)是指野生型细胞表现指定功能的能力。例如，如果某种野生型细胞在任何遗传修饰之前具有代谢糖产生甘油的能力，则认为这种细胞具有天然能力。如果某基因在细胞内的功能是产生活性蛋白，就认为该基因在细胞内是“功能”基因。“天然途径”或“天然代谢途径”是指在该种酵母的野生型细胞中存在并具有活性的代谢途径。如果某种酶在该种酵母的野生型细胞中以活性形式产生的话，就认为该酶是由该种酵母“天然产生的”。

在本发明中，当用于任何遗传材料时，“外源”是指对宿主细胞而言不是天然的。

对本发明某些实施方案合适的宿主酵母细胞包括这样的酵母细胞：所述细胞并非来自经历古代(～1亿年前)全基因组重复事件的细胞系，参见Wolf等，“Molecular evidence for an ancientduplication of theentire yeast genome”，Nature 387，708-713(1997)(在下文称为“Wolf等1997”)，Langkjaer等，“Yeast genome duplication was followed byasynchronous differentiation of duplicated genes”，Nature 421，848-852(2003)和Merico等，“Fermentative lifestyle in yeasts belonging to theSaccharomyces complex”，FEBS Journal 274，967-989(2007)(在下文称为“Merico2007”)。这样的酵母细胞是来自一种或多种存在于全基因组重复事件时期的其它酵母细胞系，在本文中称为“全基因组重复前酵母(pre-whole genome duplication yeast)”。全基因组重复事件可看作是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和其它酵母在发酵能力进化上的关键，这些酵母都来自发生基因组重复的共同祖先(Merico2007)。在基因组重复中重复的一组基因包括编码甘油-3-磷酸脱氢酶和甘油-3-磷酸酶的基因，以及编码富马酸还原酶的基因，富马酸还原酶也参与维持氧化还原平衡(Wolfe等1997)。

其中合适的全基因组重复前酵母细胞是半子囊菌酵母细胞。半子囊菌酵母是单细胞酵母，隶属于酵母目(Saccharomycetales)。

其它合适的酵母细胞包括酵母复合群(Saccharomyces complex)的7、8、9、10、11、12、13或14进化枝(clade)的任何成员，参见Kurtzman和Robnett，＂Phylogenetic relationships among yeasts of the′Saccharomyces complex′determined from multigene sequence analyses.＂，FEMS Yaest Res.第4卷，第417-432页，图9(第430页)(2003)，通过引用结合到本文中。这些进化枝分别命名为接合酵母属(Zygosaccharomyces)、接合有孢圆酵母属(Zygotorulaspora)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、Lachancea、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假囊酵母属(Eremothecium)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)和类酵母属(Saccharomycodes)，参见Merico 2007，出处同上并参见Kurtzmann，“Phylogenetic circumscription of Saccharomyces，Kluyveromyces andother members of the Saccharomycetaceae...”FEMS Yaest.Res.第4卷，第233-245页(2003)(在下文称为“Kurtzman 2003”)。

其它合适的酵母细胞包括(但不限于)隶属于以下属的酵母细胞：假丝酵母属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)和汉逊酵母属(Hansenula)。

特别感兴趣的一类宿主细胞包括东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)/陆生伊萨酵母(I.terricola)进化枝中含有的任何物种。使用以下文献所述的方法，通过分析酵母26S核糖体DNA的可变D1/D2区，鉴定东方伊萨酵母/陆生伊萨酵母进化枝的成员：Kurtzman和Robnett，载于“Identification and Phylogeny of Ascomycetous Yeasts fromAnalysis of Nuclear Large Subunit(26S)Ribosomal DNAP artialSequences”，Antonie van Leeuwenhoek 73：331-371，1998，通过引用结合到本文中(在下文称为“Kurtzman和Robnett 1998”)。具体参见第349和361页。对上百种子囊菌26S核糖体DNA的可变D1/D2区进行分析表明，东方伊萨酵母/陆生伊萨酵母进化枝含有密切相关物种。与这些进化枝之外的酵母种类相比，东方伊萨酵母/陆生伊萨酵母进化枝与该进化枝内的其它成员在26S核糖体DNA的可变D1/D2区上表现出更大的相似性。因此，采用Kurtzman和Robnett的方法，可通过比较东方伊萨酵母/陆生伊萨酵母进化枝的相应核糖体DNA的D1/D2区，并与该进化枝的其它成员和进化枝以外的密切相关种类进行比较，鉴定东方伊萨酵母/陆生伊萨酵母进化枝的其它成员。东方伊萨酵母/陆生伊萨酵母进化枝内的酵母都是在更宽的毕赤酵母/伊萨酵母/Saturnispora/德克拉酵母(Dekkera)进化枝内的半子囊菌酵母。另一类感兴趣的宿主细胞是东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母(P.fermentans)进化枝，参见Kurtzman和Robnett 1998。该进化枝是最末端的进化枝，至少含有东方伊萨酵母、Pichia galeiformis、毕赤酵母YB-4149(NRRL命名)、乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)、P.deserticola、膜醭毕赤酵母(P.membranifaciens)和发酵毕赤酵母(P.fermentans)。

特别感兴趣的其它宿主细胞是酵母复合群的克鲁维酵母属进化枝内含有的任何物种，参见(作为进化枝11)Kurtzman和Robnett，＂Phylogenetic relationships among yeasts of the′Saccharomyces complex′determined from multigene sequence analyses.＂.FEMSYeastRes.第4卷，第417-432页，图9(第430页)，(2003)，通过引用结合到本文中，和Kurtzmann，“Phylogenetic circumscription of Saccharomyces，Kluyveromyces and other members of the Saccharomycetaceae...”FEMS Yeast Res.，第4卷，第233-245页，图1(2003)(在下文称为“Kurtzman 2003”)，通过引用结合到本文中。使用Kurtzman2003所述的多基因序列分析方法，克鲁维酵母属进化枝至少包括克鲁维酵母(S.kluyveri)、海尼克鲁维酵母(K.aestuaryii)、非发酵克鲁维酵母(K.nonfermentans)、乳酸克鲁维酵母(K.lactic)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)和多布克鲁维酵母(K.dobzhanskii)，并且还将包括该进化枝内的其它物种。

对这类酵母细胞特别感兴趣的是，当经遗传修饰后能产生有机酸，尤其是乳酸。一般而言，优选来自假丝酵母属、克鲁维酵母属和伊萨酵母属的宿主细胞。在突变细胞产生有机酸的实施方案中，以及在突变细胞产生除有机酸之外的另一种发酵产物(例如乙醇)的情况下，特别优选上述来自克鲁维酵母和东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝的宿主细胞。特别优选的宿主细胞是C.sonorensis、马克斯克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、C.methanosorbosa和东方伊萨酵母。最优选的细胞是马克斯克鲁维酵母、C.sonorensis和东方伊萨酵母。当首次表征东方伊萨酵母时，命名为库德齐维氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)。东方伊萨酵母的无性形式称为克鲁斯氏假丝酵母(Candida kruse)。马克斯克鲁维酵母和C.sonorensis的合适菌株包括以下文献中介绍的那些：WO 00/71738 A1、WO 02/42471 A2、WO03/049525 A2、WO 03/102152 A2和WO 03/102201A2。东方伊萨酵母的合适菌株是ATCC菌株32196和ATCC菌株PTA-6648。

至于代谢途径的“缺失或破坏”，是指与野生型细胞相比，该途径完全不起作用，或者其活性降低至少75％、优选至少90％。可通过减少所产生的活性酶的数量，通过降低所产生的活性酶的活性，或通过这两种方式的组合，就可降低某个途径的活性。至于基因的“缺失或破坏”，是指消除(缺失)基因的完整编码区，或修饰(例如通过缺失、插入或突变)基因编码区、其启动子、和/或其终止区，使得该基因不再产生活性酶，该基因产生活性酶的数量急剧减少(至少减少75％，优选至少减少90％)，或该基因产生的酶的活性急剧下降(至少下降75％，优选至少下降90％)。

大多数情况下，天然代谢途径的缺失或破坏将会包括至少一个GPD基因的缺失或破坏、至少一个GPP基因的缺失或破坏，或这两种基因同时缺失或破坏。在具有基于磷酸二羟丙酮磷酸酶和甘油脱氢酶的替代代谢途径的细胞(例如粟酒裂殖酵母)中，天然代谢途径的缺失或破坏通常会包括磷酸二羟丙酮磷酸酶基因的缺失或破坏、甘油脱氢酶基因的缺失或破坏、或这两种基因同时缺失或破坏。在具有这两种途径的细胞中，这两种途径可同时发生缺失或破坏。

本文所用的术语“甘油-3-磷酸脱氢酶基因”和“GPD基因”是指(a)编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白质的任何基因和/或(b)编码与SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6或SEQ.ID.NO.7所示的任何氨基酸序列具有至少50％、优选至少60％和更优选至少65％同一性的酶的任何染色体DNA序列。“甘油-3-磷酸脱氢酶活性”是指蛋白质催化DHAP至甘油-3-磷酸的反应的能力。就本发明的目的而言，DNA、RNA或蛋白质的氨基酸序列的％同一性可用BLAST(NCBIBasic Local Alignment Search Tool)2.2.1版软件(用默认参数)，方便地计算出来。用BLAST2.2.13版算法(用默认参数)，认为同一性评分为至少XX％的序列就是至少XX％同一性。BLAST软件可得自国立生物信息中心(National Center for Biological Information，Bethesda，Maryland)。

同样，本文所用的“甘油-3-磷酸酶基因”和“GPP基因”是指(a)编码具有甘油-3-磷酸酶活性的蛋白质的任何基因和/或(b)编码与SEQ.ID.NO.8、SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO11或SEQ.ID.NO12所示的任何氨基酸序列具有至少50％、优选至少60％和更优选至少65％同一性的蛋白质的任何染色体DNA序列。“甘油-3-磷酸酶活性”是指蛋白质催化甘油-3-磷酸脱磷酸而生成甘油的能力。

本文所用的术语“磷酸二羟丙酮磷酸酶”基因是指编码具有磷酸二羟丙酮磷酸酶活性的蛋白质的任何基因。本文所用的“甘油脱氢酶”基因是指(a)编码具有甘油脱氢酶活性的蛋白质的任何基因和/或(b)编码与SEQ.ID.NO.13所示的氨基酸序列具有至少50％、优选至少60％和更优选至少65％同一性的蛋白质的任何染色体DNA序列。“磷酸二羟丙酮磷酸酶活性”是指蛋白质催化磷酸二羟丙酮至二羟丙酮的反应的能力。“甘油脱氢酶活性”是指蛋白质催化二羟丙酮至甘油的还原反应的能力。

任何上述基因的缺失或破坏可通过强制进化、诱变或基因工程方法来完成，然后再经过合适的选择或筛选，以鉴定所需突变体。

在诱变方法中，在足以达到细胞高死亡率(60-99.9％，优选90-99.9％)的条件下，将细胞暴露给紫外辐射或诱变剂。然后将存活细胞倒平板并选择或筛选代谢活性缺失或破坏的细胞。在产甘油能力下降的基础上筛选具有所需突变的细胞。任何上述基因的破坏或缺失可通过PCR或DNA印迹分析方法来证实。

可通过设计和构建合适的缺失构建体并用这些构建体转化细胞，就可通过一个或多个步骤，方便地完成缺失或破坏通向甘油的代谢途径的遗传工程。本文所用的术语“构建体”是指用于转化细胞的DNA序列。构建体可以呈例如环状质粒或载体的形式，线状质粒或载体的形式，可以是环状质粒或载体的一部分(例如用一种或多种限制酶消化质粒或载体而得到)，或者可以是用质粒或载体作为模板而制备的PCR产物。进行选择或筛选以鉴定成功的转化子。可采用电穿孔和/或化学(例如基于氯化钙或乙酸锂)转化方法。

有关缺失构建体的以下讨论同样也可用于任何甘油-3-磷酸脱氢酶基因、甘油-3-磷酸酶基因、磷酸二羟丙酮磷酸酶基因或甘油脱氢酶基因的缺失或破坏。

可通过首先克隆靶基因的两个DNA序列和/或其上游(5’)或下游(3’)侧翼区，方便地装配缺失构建体。序列优选是不连续的，但也可以是连续的，如果在构建体的序列之间插入额外遗传物质(例如选择标记盒)的话。在这种情况下，“不连续”是指DNA序列在野生型基因组中并非彼此密切邻接，而是在野生型基因组中彼此被要缺失的区域间隔开，以便缺失或破坏基因。“连续”序列是在野生型基因组中彼此直接邻接的序列。一个这样的序列可包括在5’与靶基因启动子连接的区、全部或部分启动子区、全部或部分靶基因编码区或其组合。其它序列可包括在3’与靶基因终止子连接的区、全部或部分终止区、和/或全部或部分靶基因编码区。然后产生缺失构建体，其含有方向相同的两个序列，其彼此关系正如它们在宿主细胞染色体上天然存在的那样。通常，将选择标记克隆在序列之间，以便选择转化子，详述如下。该构建体用于转化宿主细胞。可采用电穿孔和/或化学(例如基于氯化钙或乙酸锂)转化方法。

在成功的转化子中，靶基因的基因座的同源重组事件引起功能基因的破坏或缺失。在该重组事件中缺失全部或部分天然靶基因、其启动子和/或终止子。如果缺失构建体在来自靶基因座的两个序列之间含有遗传物质(例如选择标记盒或结构基因盒)，则遗传物质插入到宿主细胞基因组的缺失物质的基因座上。可通过PCR分析或DNA印迹分析证实发生了所需缺失。

通常最好是缺失构建体也可包含功能性选择标记盒。但使用一个缺失构建体时，标记盒处于靶基因座5’序列的载体下游(即在3’方向)和靶基因座3’序列的上游(即在5’方向)。成功的转化子将会含有选择标记盒，这赋予成功转化细胞某些特性，可作为选择基础。“选择标记基因”是编码转化细胞在选择培养基中存活和/或生长所必需的蛋白质的基因。通常，选择标记基因编码这样的蛋白质：所述蛋白质(a)赋予抗生素抗性或其它毒素抗性，这些抗生素例如零霉素(zeocin)(印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)ble博来霉素抗性基因)、G418(Tn903的卡那霉素抗性基因)或潮霉素(大肠杆菌的氨基糖苷类抗生素抗性基因)，(b)补充细胞的营养缺陷(例如氨基酸亮氨酸缺陷(马克斯克鲁维酵母LEU2基因)或尿嘧啶缺陷(例如马克斯克鲁维酵母或酿酒酵母的URA3基因))；(c)使细胞能够合成无法得自简单培养基的关键性营养，或(d)赋予细胞在特定碳源上生长的能力(例如酿酒酵母的MEL5基因，该基因编码α-半乳糖苷酶(蜜二糖酶)并赋予在唯一碳源上生长的能力)。优选的选择标记包括零霉素(zeocin)抗性基因、G418抗性基因、MEL5基因和潮霉素抗性基因。另一个优选的选择标记是L-乳酸：高铁细胞色素c氧化还原酶(CYB2)基因盒，其使宿主细胞天然缺乏该基因或其天然CYB2基因最初已缺失或破坏。

选择标记盒还将包含启动子和终止序列，其与选择标记基因有效连接并可在宿主细胞中操作。一种合适类型的启动子是与酵母基因天然启动子具有至少50％、70％、90％、95％或99％同一性的启动子。更合适的一类启动子是与酵母基因天然启动子具有至少50％、70％、90％、95％或99％同一性的启动子。特别有用的启动子包括丙酮酸脱羧酶(PDC1)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)、L-(+)-乳酸-细胞色素c氧化还原酶(CYB2)、翻译延伸因子-1(TEF1)和翻译延伸因子-2(TEF2)基因的启动子，尤其是来自宿主细胞相应基因的启动子。一个尤其有用的启动子包括宿主细胞天然的PDC1、PGK、TEF1或TEF2基因的启动子的功能部分，或与这类PDC1、PGK、TEF1或TEF2启动子具有至少80％、85％、90％或95％同一性的序列。

一类合适的终止子是与酵母细胞天然基因的终止子具有至少50％、70％、90％、95％或99％同一性的终止子。终止子可以是与宿主细胞天然基因的终止子具有至少50％、70％、90％、95％或99％同一性的终止子。特别有用的终止子包括丙酮酸脱羧酶(PDC1)、木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)、L-乳酸：高铁细胞色素c氧化还原酶(CYB2)或异-2-细胞色素c(CYC)基因的终止子，或酵母的半乳糖基因家族的终止子，特别是所谓的GAL10终止子。一个特别优选的终止子包括宿主细胞天然的GAL10基因的终止子的功能部分，或与这类终止子具有至少80％、85％、90％或95％同一性的序列。

可以设计缺失构建体，使选择标记盒能够因随后的同源重组事件而发生自发缺失。要完成这一步的一个便利方式就是设计载体，使结构基因盒侧接直接重复序列。直接重复序列是宿主细胞天然或非天然的相同DNA序列，在构建体上呈各自相同的方向。直接重复序列的长度最好是约50-1500bp。直接重复序列不必编码任何东西。该构建体允许同源重组事件发生。这样的事件发生频率较低，导致细胞含有缺失的选择标记基因和一个直接重复序列。有必要将转化子在非选择性培养基上培养几轮，让一些细胞中发生自发同源重组。可根据自发缺失选择标记基因的细胞缺乏选择标记基因所赋予的选择特性，来选择或筛选这样的细胞。

靶基因缺失构建体也可含有结构基因盒，也位于5’侧翼区下游和3’侧翼区上游，但优选不在所具有的任何选择标记盒之内。这类构建体允许靶基因的自发缺失和结构基因的插入。所称“结构基因”，是指编码蛋白质的任何基因，而不是如上所述的靶基因或选择标记基因。各种各样的结构基因都可使用，但本发明特别感兴趣的基因是赋予细胞产生有机酸能力的基因，或赋予细胞消耗特定碳源(例如戊糖)的能力的基因。

在使用选择标记的情况下，可用一对缺失构建体(而非一个缺失构建体)进行转化。构建体对中的一个可含有来自靶基因座的第一序列和标记基因盒的一个非功能部分。构建体对的另一个则可含有来自靶基因座的第二序列和标记基因盒的另一个非功能部分。选择一起构成完整盒的标记基因盒的两部分。标记基因盒的两部分的每一端都共享共同序列，即部分盒在两部分的每一端都重复。用它们自发转化细胞，形成所需的缺失或破坏，并形成完整的功能性标记或结构基因盒。细胞比例将会在靶基因座上同源整合两种缺失构建体，并进行新的同源重组事件，以便从两个非功能片段重构功能性选择基因盒。根据选择标记所赋予的特性，选择成功的转化子。

当细胞的天然代谢途径包括磷酸二羟丙酮至甘油-3-磷酸再至甘油的途径(通过GDP和GPP酶)时，无论是GDP基因还是GPP基因都可发生缺失或破坏。GDP基因和GPP基因可同时缺失。在这种情况下，GDP基因和GPP基因的缺失或破坏可同时发生或序贯发生。如果细胞含有多个GDP基因或GPP基因，或所述基因的多个多等位基因，优选它们在细胞中的功能全都缺失。当细胞的天然代谢途径包括磷酸二羟丙酮至二羟丙酮再至甘油的途径(通过磷酸二羟丙酮磷酸酶和甘油脱氢酶)时，无论是磷酸二羟丙酮磷酸酶还是甘油脱氢酶基因都可发生缺失或破坏。磷酸二羟丙酮磷酸酶或甘油脱氢酶基因都可缺失或破坏，这可以是同时发生或是序贯发生，这样的序贯发生可按任何顺序进行。如前所述，所述基因的多功能拷贝或等位基因优选都缺失。

在本发明的某些方面，细胞能产生所需有机酸(或其盐)。这种能力表现为，在至少一组发酵条件下培养时，能将至少5％、至少10％、至少50％、至少70％、至少80％或至少90％(重量)的碳源转化为所需有机酸。因为几乎没有酵母细胞具有产生这些酸的天然能力，所以本发明的细胞在大多数情况下含有能让细胞产生该有机酸的至少一个功能性外源基因。

特别感兴趣的细胞产生乳酸(盐)，其中这是指乳酸或其盐。在这样的情况下，本发明的细胞含有整合到其基因组上的至少一个功能性外源乳酸脱氢酶(LDH)基因。LDH基因是编码功能性乳酸脱氢酶的基因。功能性LDH酶是催化丙酮酸(盐)还原成乳酸(盐)的酶。LDH基因是对L-LDH或D-LDH的产生具有特异性，这两种物质分别能使细胞产生L-或D-乳酸对映体(或其盐)。本发明的修饰细胞可能含有L-和D-LDH基因，因此能够产生乳酸对映体。然而，优选仅有L-LDH基因或仅有D-LDH基因存在，使细胞产生更多光学纯的乳酸产物。

合适的LDH基因包括来源于细菌、真菌、酵母或哺乳动物的LDH基因。L-LDH基因的具体实例是得自瑞士乳杆菌(L.helveticus)、干酪乳杆菌(L.casei)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、乳酸片球菌(P.acidilactici)和牛来源的那些。D-LDH基因的具体实例是得自瑞士乳杆菌(L.helveticus)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、植物乳杆菌(L.plantarum)和戊糖乳杆菌(L.pentosus)的那些。与这些L-LDH或D-LDH基因相同或具有至少80％同一性的功能基因是合适的。必要时，可对得自这些来源的天然基因进行诱变，以提供用常用真核起始密码子(ATG)起始的编码序列，或为了其它目的。优选的L-LDH基因是得自瑞士乳杆菌的L-LDH基因或与所述基因具有至少80％、85％、90％或95％同一性的L-LDH基因。另一个优选的L-LDH基因是得自巨大芽孢杆菌的L-LDH基因或与所述基因具有至少80％、85％、90％或95％同一性的L-LDH基因。一个优选的D-LDH基因是得自瑞士乳杆菌的D-LDH基因或与所述基因具有至少80％、85％、90％或95％同一性的D-LDH基因。

特别合适的LDH基因包括这样的基因：其编码的酶的氨基酸序列与WO 03/049525的SEQ.ID.NO.45或与WO 03/049525的SEQ.ID.NO.49具有至少60％、尤其是至少80％、85％或95％同一性。特别合适的LDH基因还包括这样的基因：其编码的酶的蛋白质序列与WO03/049525的SEQ ID.NO.46或50具有至少60％、80％、85％或95％同一性。

转化细胞可含有单个LDH基因或多个LDH基因，例如1-10个LDH基因，尤其是1-5个LDH基因。当转化细胞含有多个LDH基因时，每个基因可以是同一基因的拷贝，或者每个基因包含两个或更多不同LDH基因的拷贝。多拷贝的外源LDH基因可以整合在宿主细胞基因组的同一基因座上(这样它们就彼此邻接)或在若干基因座上。

外源LDH基因处于一个或多个启动子和一个或多个终止子的转录控制之下，这样的启动子和终止子在修饰酵母细胞中具有功能。对选择标记基因盒合适的启动子和终止子如上所述，也可参见WO99/14335、WO 00/71738、WO 02/42471、WO 03/102201、WO 03/102152和WO 03/049525。一个特别有用的启动子包括宿主细胞PDC1、PGK、TEF1或TEF2基因的启动子功能部分或与该启动子具有至少80％、85％、90％或95％同一性。一个特别优选的终止子包括宿主细胞PDC1基因的终止子功能部分或与其具有至少80％、85％、90％或95％同一性。

当多个外源LDH基因引入宿主细胞时，不同LDH基因可能处于不同类型的启动子和/或终止子控制之下。

外源LDH基因可随机整合在宿主细胞基因组中或插入到一个或多个靶位置上。靶位置的实例包括希望发生缺失或破坏的基因的基因座，例如PDC1基因、甘油-3-磷酸脱氢酶基因、甘油3-磷酸酶基因、磷酸二羟丙酮磷酸酶基因或甘油脱氢酶基因的基因座。可将外源LDH基因盒放入构建体中，用于缺失或破坏甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸酶、磷酸二羟丙酮磷酸酶或甘油脱氢酶的基因，而且其方式是可以同时插入到这些基因的基因座上以发生缺失或破坏它们。

转化酵母细胞以引入外源LDH基因盒的方法可参见WO99/14335、WO 00/71738、WO 02/42471、WO 03/102201、WO 03/102152和WO03/049525。这类方法可用于本发明。

也可修饰细胞，使之产生一种或多种其它有机酸。例如，用编码功能性β-丙氨酸/丙酮酸氨基转移酶的外源基因盒转化细胞，使细胞能够产生3-羟基丙酸。达到该目的的方法可参见WO 2005/118719。

本发明的遗传修饰酵母细胞可包含给细胞提供一个或多个所需贡献的额外遗传修饰。

在某些实施方案中，特别感兴趣的额外修饰包括丙酮酸脱羧酶基因的缺失或破坏。这可降低细胞产生乙醇的能力，这在有机酸(例如乳酸)是所需产物的情况下特别有利。如果宿主细胞含有多个PDC基因，特别优选所有PDC基因都缺失或破坏，尽管也可以缺失更少的这类PDC基因。使用以下文献所述的类似方法，可使PDC发生缺失：WO99/14335、WO 02/42471、WO 03/049525、WO 03/102152和WO03/102201。也可通过同时插入LDH基因盒或其它结构或选择标记基因盒，而使PDC发生缺失。在特别感兴趣的方法中，(1)克隆PDC基因的基因座的不连续序列，(2)产生含有不连续序列的构建体，和(3)用构建体转化宿主细胞。在部分转化子中，同源重组事件引起功能性PDC基因的缺失或破坏。必要时可重复该事件，以缺失或破坏多个PDC基因或等位基因。在某些种类的酵母(例如东方伊萨酵母)中，存在密切同源的多个PDC基因或等位基因。在至少某些这样的实例中已经发现，来自基因或等位基因的基因座的不连续序列可用于构建体，以缺失或破坏PDC基因或等位基因。用于破坏PDC基因的构建体可包含一个或多个功能性标记或结构基因盒，其插入到天然PDC基因5’侧接部分的下游和天然PDC基因3’侧接部分的上游。该方法允许在一个转化步骤中缺失PDC基因并插入功能基因盒。

另一个感兴趣的额外修饰是单独或共同赋予细胞发酵戊糖而产生所需发酵产物的能力。后一类修饰是(1)插入功能性木糖异构酶基因，(2)缺失或破坏能产生催化木糖转化为木糖醇的酶的天然基因，(3)缺失或破坏功能性木糖醇脱氢酶基因和/或(4)引起细胞过量表达功能性木酮糖激酶的修饰。将这些修饰引入酵母细胞的方法可参见例如WO 04/099381，通过引用结合到本文中。插入功能性木糖异构酶基因、缺失或破坏能产生催化木糖转化为木糖醇的酶的天然基因、缺失或破坏功能性木糖醇脱氢酶基因、以及修饰细胞以过量表达功能性木酮糖激酶的合适方法，可参见例如WO 04/099381，通过引用结合到本文中。

对本发明产乳酸细胞的另一个特别感兴趣的额外修饰包括缺失或破坏至少一个L-或D-乳酸：高铁细胞色素c氧化还原酶基因。

一般而言，本发明细胞的特征是合成甘油的能力下降。评价细胞合成甘油能力的一种有用方法是通过在上述标准微好氧条件下培养细胞。使用一种成分确定的含水发酵培养基，其在培养开始时含有5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、痕量元素、维生素和150g/L葡萄糖。培养开始时将pH调节到3.5。培养期间允许pH在范围内自由变动，除非在培养期间有必要缓冲发酵培养基，以防pH降至3.0以下或升至7.0以上。用足量的酵母细胞接种发酵培养基，其经评价产生OD₆₀₀ 1.0。培养温度为30℃。持续培养直到葡萄糖浓度降至5g/L，但不超过120小时。培养期间，选择通气和搅拌条件以达到摄氧率为5.0±1.0mmol/L/hr。在这些标准条件下，本发明的细胞通常产生不超过2.0g/L的甘油。更通常的是，在这些标准条件下它们产生不超过0.6g/L的甘油，在大多数情况下，在这些标准条件下它们产生不超过0.2g/L的甘油。在这些标准微好氧条件下，优选的细胞还产生至少10g/L的至少一种所需发酵产物，例如乙醇或有机酸(例如乳酸)。在这些条件下，细胞更优选产生至少40g/L、尤其是至少50g/L所需发酵产物。

可在如上所述的标准微好氧条件下或任何其它有用的发酵条件下培养本发明的细胞，以产生一种或多种所需发酵产物。乙醇是多种酵母可天然产生的发酵产物的一个实例。如上所述，可修饰细胞，使之产生其它所需发酵产物，包括有机酸，例如乳酸或3-羟基丙酸。也可修饰细胞，以产生其它发酵产物，包括其它酸或并非酸的其它产物。

在本发明的发酵方法中，在包含转化细胞可发酵的碳源的发酵培养基中培养本发明的细胞。碳源可以是己糖(例如葡萄糖)、或葡萄糖的寡聚物或其它多聚物，例如聚糖、麦芽糖、麦芽三糖或异麦芽三糖。碳源可以是另一种己糖，其中潘糖、果糖、果糖及其相应的寡聚物和多聚物都是实例。如果细胞天然具有或经修饰具有发酵戊糖的能力，则碳源可包括戊糖(例如木糖)或者木糖寡聚物或多聚物(例如木聚糖)。这类戊糖是含半纤维素生物量的合适水解产物。就寡聚糖而言，有必要将酶加入到发酵肉汤中，以将它们消化成相应的单糖，用于细胞发酵。

培养基通常含有特定细胞所需的营养物质，包括氮源(例如氨基酸、蛋白质、无机氮源例如氨或铵盐等)和各种维生素、矿物质等。可使用所谓的“复合培养基”或所谓的“成分确定”培养基。

认为温度、细胞密度、底物选择、营养物选择等其它发酵条件都不是本发明的关键，通常选择这些条件以提供经济的方法。各生长周期和生产周期的温度范围从培养基的冷冻温度至约50℃，尽管这在某些程度上取决于菌株耐受高温的能力。优选的温度、尤其是在生产周期中的温度为约30-45℃。

在生产周期中，发酵培养基的细胞浓度通常范围在0.1-20、优选0.1-5、甚至更优选1-3g干细胞/升发酵培养基。可以在好氧、微好氧或厌氧条件下进行发酵。如有必要，摄氧率可用于过程控制，参见WO 03/102200。在摄氧率为4-12mmol/L/hr、尤其是5-10mmol/L/hr的微好氧条件下，本发明的细胞表现特别好。

在细胞产生有机酸例如乳酸的优选情况下，在发酵生产周期中可缓冲培养基，使pH维持在约3.5至约9.0、或约4.5至约7.0的范围之内。合适的缓冲剂是可中和所产生的酸的碱性物质，其包括例如氢氧化钙、碳酸钙、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵、氨、氢氧化铵等。一般而言，常规发酵方法所用的缓冲剂也适用于本发明。

在缓冲发酵中，酸性发酵产物当其形成时就中和成相应的盐。因此对酸进行回收包括再生游离酸。通常通过除去细胞并用硫酸等强酸酸化发酵肉汤而达到这一目的。形成盐副产物(在钙盐作为中和剂、硫酸作为酸化剂的情况下，就形成石膏)，将其从肉汤中分离出来。然后通过液-液萃取、蒸馏、吸附等技术，从肉汤中回收酸，所述技术参见例如T.B.Vickroy，第3卷，Comprehensive Biotechnology第38章(M.Moo-Young编著)，Pergamon，Oxford，1985；R.Datta等，FEMSMicrobiol.Rev.，1995，16：221-231；美国专利号4,275,234、4,771,001、5,132,456、5,420,304、5,510,526、5,641,406和5,831,122以及WO93/00440。

或者，在培养期间，可允许发酵培养基的pH从高于酸产物的pKa的5.5或更高的起始pH下降至低于或等于酸发酵产物的pKa，例如约1.5至约3.5、约1.5至约3.0、或约1.5至约2.5的范围内。

也可在发酵之前或发酵过程开始时，将发酵肉汤的pH调至低于或等于产物酸的pKa，进行发酵以产生产物酸。此后整个培养过程的pH可维持在低于或等于产物酸的pKa，或可在发酵过程中升至高于酸的pKa。在前一种情况下，pH优选维持在约1.5至约3.5、约1.5至约3.2、或约2.0至约3.0的范围内。

在许多发酵条件下，本发明细胞的产甘油能力急剧下降。细胞产甘油能力下降表现为低的甘油收率。本发明的细胞通常代谢不到2％(重量)的碳源被转化为甘油。在大多数情况下，以培养中消耗的碳源重量计，甘油收率小于1％或甚至小于0.1％。优选细胞代谢至少40％、例如至少50％、60％、70％、80％或85％的碳源被转化为所需发酵产物。

已经发现，本发明的细胞在发酵条件下表现出良好的生长能力。这是令人吃惊的，因为在野生型酵母细胞中，甘油对细胞有各种用途，而且认为甘油的作用是平衡NADH/NAD⁺。本发明的范围包括将甘油添加到发酵培养基中，以补偿细胞自身缺乏的产甘油能力。然而，申请人发现，这样做没有益处，至少在某些发酵过程中。

提供以下实施例来说明本发明，但不得视为对本发明范围的限制。除非另有说明，否则所有份和百分率都以重量计。

实施例1A：马克斯克鲁维酵母菌株CD607的诱变和具有乙醇酸抗性的突变菌株(CD853)的选择。

马克斯克鲁维酵母菌株CD607描述于WO 03/102152实施例3D。该菌株缺失其丙酮酸脱羧酶基因并在该基因座上插入外源乳酸脱氢酶基因。将菌株CD607的细胞暴露给紫外光进行诱变。

将新鲜YP(酵母膏加蛋白胨)+20g/L葡萄糖平板的细胞重悬于2mL酵母蛋白胨+50g/L葡萄糖，至约OD₆₀₀为6。将10份125μl所述细胞悬液的等分试样吸至10孔300μl的96孔微量滴定板中。将微量滴定板暴露给12,500μJoule/cm²的紫外光，杀死90-99％的细胞。然后将微量滴定板在30℃避光处孵育过夜，同时搅拌(225rpm)，让细胞恢复，然后接种选择性平板。

再将100μl经紫外处理的细胞悬液接种土豆葡萄糖琼脂(PDA)+15g/L乙醇酸平板，选择乙醇酸抗性菌株。这些平板在30℃孵育几天直到出现菌落。分离单菌落用于进一步分析。

将约2×10⁸诱变处理的细胞接种到含有15g/L乙醇酸的PDA平板并在30℃孵育。将这些平板上生长的菌落在装有YP(酵母蛋白胨)+100g/L葡萄糖(无缓冲剂)的带挡板摇瓶中在30℃和225rpm搅拌下培养过夜。然后从这些摇瓶中取出2g/L细胞干重，接种生产瓶。将生产瓶在YP+50g/L葡萄糖中、在30℃和70rpm搅拌下培养。定期取样，使用例如WO 03/102201实施例1M所述方法，通过HPLC，测定葡萄糖、乳酸、乙醇和丙酮酸。88小时后产生约26g/L乳酸的菌株称为菌株CD635。菌株CD635能够以乳酸(盐)为唯一碳源而生长。

如上所述，将菌株CD635的细胞再次进行诱变步骤。选择能够在含25g/L乙醇酸的PDA上生长的所得诱变细胞的菌落。将乙醇酸抗性菌落在YP+100g/L葡萄糖的摇瓶中在30℃和250rpm搅拌下分别培养过夜。离心收集生物量，将2g/L干重的细胞接种到50mL YP+50g/L葡萄糖的带挡板摇瓶中。将摇瓶在30℃和250rpm搅拌下培养约92小时。与亲代菌株CD607和CD635相比，产生明显更高的终乳酸滴度的突变体称为菌株CD853。

菌株CD853不能以乳酸(盐)为唯一碳源而生长，这表明该突变体中天然L-乳酸(盐)：高铁细胞色素c氧化还原酶基因(KmCYB2)基因已经没有功能。因此，使用PCR，用高保真FailSafe酶和基因组DNA作为模板，自该菌株扩增KmCYB2编码区加上KmCYB2编码区上游和下游～500bp。通过Qiagen柱纯化，纯化所得～2.75kbp PCR产物，并对全和KmCYB2编码区测序。发现菌株CD853在KmCYB2基因的氨基酸位62上具有4碱基插入序列，导致移码突变，在氨基酸位76上产生终止密码子并截短该蛋白质。

实施例1B：GPD1F缺失载体pBH158(图1)和pBH159(图2)的构建。

一个称为pVR29的质粒(描述于WO 03/102152实施例1C和图4)含有处于丙酮酸脱羧酶启动子和GAL10终止子控制之下的Tn903的卡那霉素抗性基因(G418基因)。质粒pVR29用MluI和PstI消化，将由此得到的含G418基因盒的5.1kbp片段通过凝胶纯化并脱去磷酸。使用称为SEQ.ID.NO.14和SEQ.ID.NO.15的引物，并使用马克斯克鲁维酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增马克斯克鲁维酵母GPD(KmGPD1F)基因DNA上游的1.2kbp区。将PCR产物通过凝胶纯化，用MluI和PstI消化，然后与来自质粒pVR29的5.1kbp片段连接起来，产生质粒pBH158(图1)。按照转录顺序，质粒pBH158含有KmGPD1F基因的1.2kbp上游侧翼和G418表达盒。

对于第二缺失载体，质粒pVR29用NgoMIV和AatII消化，将含有G418表达盒的4.7kbp片段通过凝胶纯化，然后脱去磷酸。使用称为SEQ.ID.NO.16和SEQ.ID.NO.17的引物，并再次使用马克斯克鲁维酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增KmGPD1F基因的DNA下游0.7kbp区。PCR产物通过凝胶纯化，用NgoMIV和AatII消化，然后与pVR29的4.7kbp片段连接起来，产生质粒pBH159(图2)。按照转录顺序，质粒pBH159含有G418表达盒和KmGPD1F基因0.7kbp下游侧翼。

实施例1C：用质粒pBH158和pBH159(实施例1B，图1和图2)转化菌株CD853(实施例1A)，得到具有外源LDH基因、缺失天然PDC基因、具有破坏的天然CYB2基因并缺失天然GPD1F基因的转化子(菌株CD1606)。

质粒pBH158用MluI和HindIII消化。这些限制酶切割质粒，产生含有KmGPD1F基因的1.2kbp上游侧翼和部分G418表达盒的2.6kbp片段。该片段通过琼脂糖凝胶分离。质粒pBH159用XhoI和NgoMIV消化。这些限制酶切割质粒，产生含有部分G418表达盒和KmGPD1F基因0.7kbp下游侧翼的2.0kbp片段。该片段通过琼脂糖凝胶分离。这两个分离的片段一起含有完整G418表达盒，其中在片段两端有一些重叠。

将菌株CD853在YP+60g/L葡萄糖+0.2M MES+1％乙醇(pH6.5)中培养过夜，然后与来自质粒pBH158的2.6kbp片段和来自pBH159的2.0kbp片段同时进行电穿孔。在YP+20g/L葡萄糖+300μg/mL G418平板上在30℃选择转化子，接着培养2天。挑取15个转化子，在YP+20g/L葡萄糖+G418平板上重新划线，并培养过夜。只有共转化这两个片段、而且这两个片段都同源整合在KmGPD1F基因座上的细胞，才会对G418具有抗性。

使用称为SEQ.ID.NO.18和SEQ.ID.NO.19的引物，通过PCR证实KmGPD1F基因发生了缺失。7个转化子经PCR表现出单一的3.4kbp条带，表明这些转化子缺失KmGPD1F基因。这些转化子中的一个称为菌株CD1606。

实施例2A：GPP基因缺失载体pBH160(图3)和pBH161(图4)的构建。

质粒pVR29用MluI和KpnI消化，由此得到的含有G418基因盒的5.1kbp片段通过凝胶纯化并脱去磷酸。使用称为SEQ.ID.NO.20和SEQ.ID.NO.21的引物，并使用马克斯克鲁维酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增天然GPP基因(KmHOR2基因)上游紧靠着的0.9kbp DNA区。PCR产物通过凝胶纯化，用MluI和KpnI消化，然后与来自质粒pVR29的5.1kbp片段连接起来，得到质粒pBH160(图3)。按照转录顺序，质粒pBH160含有KmHOR2基因的0.9kbp上游侧翼和G418表达盒。

质粒pVR29用NgoMIV和SpeI消化，将含有G418表达盒的4.7kbp片段通过凝胶纯化并脱去磷酸。使用称为SEQ.ID.NO.22和SEQ.ID.NO.23的引物，并使用马克斯克鲁维酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增KmHOR2基因下游紧靠着的0.8kbp DNA区。PCR产物通过凝胶纯化，用NgoMIV和SpeI消化，然后与pVR29的4.7kbp片段连接起来，得到质粒pBH161(图4)。按照转录顺序，质粒pBH161含有G418表达盒和KmHOR2基因的0.8kbp下游侧翼。

实施例2B：用质粒pBH160和pBH161(实施例2A，图3和图4)转化菌株CD853(实施例1A)，得到具有外源LDH基因、缺失天然PDC基因、具有破坏的天然CYB2基因和缺失天然GPP基因的转化子(菌株CD1608)。

质粒pBH160用MluI和HindIII消化。这些限制酶切割质粒，产生含有马克斯克鲁维酵母GPP(KmHOR2)基因0.9kbp上游侧翼和部分G418表达盒的2.3kbp片段。该片段通过琼脂糖凝胶分离。质粒pBH161用XhoI和NgoMIV消化。这些限制酶切割质粒，产生含有KmHOR2基因0.8kbp上游侧翼和部分G418表达盒的2.0kbp片段。该片段通过琼脂糖凝胶分离。这两个分离的片段一起含有完整G418表达盒，其中在片段两端有一些重叠。

将菌株CD853在YP+60g/L葡萄糖+0.2M MES+1％乙醇(pH6.5)中培养过夜，然后与来自质粒pBH160的2.3kbp片段和来自质粒pBH161的2.0kbp片段同时进行电穿孔。在YP+20g/L葡萄糖+300μg/mL G418平板上在30℃选择转化子，接着培养2天。挑取15个转化子，在YP+20g/L葡萄糖+300μg/mL G418平板上重新划线，并培养过夜。所有转化子在该培养基上都能生长。只有共转化这两个片段、而且这两个片段都同源整合在KmHOR2基因座上的细胞，才会对G418具有抗性。

使用称为SEQ.ID.NO.20和SEQ.ID.NO.21的引物，通过PCR证实KmHOR2基因发生了缺失。3个转化子得到单一3.8kbp条带，表明缺失KmHOR2基因。这些转化子中的一个称为菌株CD1608。

实施例3：菌株CD853(实施例1A)、CD1606(实施例1C)和CD1608(实施例2B)的微好氧分批培养。

在微好氧条件下，分别培养CD853、CD1606和CD1608菌株。在菌株CD1606和CD1608的情况下，重复进行发酵。在每种情况下，使用单级分批反应器。发酵培养基是成分确定培养基，包含硫酸铵、磷酸二氢钾和硫酸镁、痕量元素、维生素、消泡剂和约90g/L葡萄糖。通过添加氢氧化钾，将培养基的pH调至约3.0。将培养基调节至30℃，接种1mL细胞。细胞在搅拌和通气条件(摄氧率为5-6mmol/L/hr)下在30℃培养。按照WO 03/102,200所述的方法测定摄氧率。

定时对发酵肉汤取样，测定乳酸、乙酸、甘油和丙酮酸。二氧化碳产量是通过测定反应器排放气体中二氧化碳含量而确定。

菌株CD853(并非本发明的实例)在发酵早期的乳酸收率为0.85g/L-hr，直到乳酸滴度为约20g/L。此时的乳酸收率为约70％。然后，乳酸产量放缓至约0.76g/L-hr，乳酸收率略微有所下降。该菌株在86小时后停止产酸，此时发酵肉汤含有11g/L葡萄糖。乳酸滴度为59g/L。乳酸总产率为0.65g/L-hr，乳酸总收率为70％。菌株CD853的丙酮酸、乙酸、甘油和二氧化碳的收率分别为0.6％、0％、5.1％和14％。生物量收率为6.4％。

菌株CD1606在发酵早期的乳酸产率为0.77-0.84g/L-hr，直到乳酸滴度为约20g/L。到这时的乳酸收率为约72-80％。然后，乳酸产量放缓至约0.39-0.41g/L-hr，乳酸收率略微有所下降。该菌株在137小时后停止产酸，此时发酵肉汤含有14-19g/L葡萄糖。乳酸滴度为43-45g/L。乳酸总产率为0.32-0.34g/L-hr，乳酸总收率为60-63％。菌株CD1606的丙酮酸、乙酸、甘油和二氧化碳的收率分别为0.1％、0.5％、0％和26-29％。生物量收率为7.9％。这些结果表明，缺失天然KmGPD1F基因能有效破坏细胞产甘油的能力。令人吃惊的是，该基因的缺失(和由此而来的甘油产量的缺失)对细胞生长没有或很少有影响。

菌株CD1608在发酵早期的乳酸产率为0.66g/L-hr，直到乳酸滴度为约20g/L。到这时的乳酸收率为约70-75％。然后，乳酸产量放缓至约0.37g/L-hr，乳酸收率略微有所下降。该菌株在137小时后停止产酸，此时发酵肉汤含有19g/L葡萄糖。乳酸滴度为42g/L。乳酸总产率为0.31g/L-hr，乳酸总收率为59-60％。菌株CD1608的丙酮酸、乙酸、甘油和二氧化碳的收率分别为0.0-0.1％、0.8％、0％和26-28％。生物量收率为7.9-8.2％。这些结果表明，缺失天然KmHOR2基因也能有效破坏细胞产甘油的能力。另外，该基因的缺失(和由此而来的甘油产量的缺失)对细胞生长没有影响。

实施例4A：东方伊萨酵母的天然GPD1基因及其上游和下游侧翼区的克隆。

对来自几种酵母(酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母、解脂西洋蓍霉(Y.lipolytica)、P.jadinii、汉逊德巴利酵母(D.hansenii)和光滑假丝酵母(C.glabrata))的已知甘油-3-磷酸脱氢酶基因进行比对，鉴定不同基因中的高度保守区。在高度同源的这些区域中设计两组简并引物。这些引物组经鉴定分别为SEQ.ID.NO.24和SEQ.ID.NO.25，以及SEQ.ID.NO.26和SEQ.ID.NO.27。用第一组引物和东方伊萨酵母基因组DNA作为模板，进行PCR，如期得到～200bp产物。再用第二组引物和东方伊萨酵母基因组DNA作为模板，进行PCR，如期得到～400bp产物。这两种PCR产物通过凝胶纯化，再用相同引物进行测序。用所得的部分序列，设计引物，用于基因组步测。用BD Clontech基因组步测试剂盒并按制造商的说明，使用称为SEQ.ID.NO.28和SEQ.ID.NO.29的最初PCR引物以及称为SEQ.ID.NO.30和SEQ.ID.NO.31的嵌套PCR引物，进行基因组步测。将得自上游和下游基因组步测的序列进行比对，然后与先前得到的部分序列一起构建东方伊萨酵母的甘油-3-磷酸脱氢酶基因。

实施例4B：在耐热克鲁维酵母直接重复序列之间含有KmCYB2基因盒的质粒(pMM28，图5)的构建。

使用称为SEQ.ID.NO.32和SEQ.ID.NO.33的引物，从称为CD21的野生型马克斯克鲁维酵母菌株基因组DNA，通过PCR扩增完整马克斯克鲁维酵母CYB2(KmCYB2)基因盒，包括启动子和终止子区，并引入BamHI和SalI限制位点。将PCR产物与经过BamHI和SalI消化的市售载体pUC18(来自Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA USA)连接在一起。所得质粒称为pMM25。

使用称为SEQ.ID.NO.35和SEQ.ID.NO.36的引物，自耐热克鲁维酵母基因组DNA，通过PCR扩增称为SEQ.ID.NO.34的705bp序列，并引入SphI和SalI限制位点。该耐热克鲁维酵母序列不编码任何活性蛋白质。质粒pMM25用SphI和SalI消化，再将耐热克鲁维酵母序列与KmCYB2盒上游(5’)连接起来，形成质粒pMM27。

使用称为SEQ.ID.NO.37和SEQ.ID.NO.38的引物，通过PCR扩增相同的耐热克鲁维酵母序列，并添加BamHI和XmaI限制位点。质粒pMM27用BamHI和XmaI消化，再将耐热克鲁维酵母序列与KmCYB2盒下游(3’)连接起来，形成质粒pMM28(图5)。质粒pMM28含有侧接耐热克鲁维酵母直接重复序列的KmCYB2盒，这两者方向相同。

实施例4C：含有潮霉素基因盒和瑞士乳杆菌LDH基因盒的质粒(pMI321，图7)的构建。

按照WO02/042471实施例22所述的同样方式，使用称为SEQ.ID.NO.39和SEQ.ID.NO.40的引物，自C.sonorensis基因组DNA，得到C.sonorensisPGK1基因的920bp探针片段。从培养的东方伊萨酵母菌株中分离基因组DNA，重悬于10mM Tris-HCl+1mM EDTA(pH8)(TE)。东方伊萨酵母基因组DNA用HindIII切割，再用标准方法，用C.sonorensis PGK1基因作为探针，进行DNA印迹和杂交。从琼脂糖凝胶分离出～2kb大小的片段，并克隆到HindIII切割的质粒上，产生按大小分级的文库(size-fractionated library)，再用于转化大肠杆菌。将按大小分级的文库与PGK1探针进行菌落杂交，从而分离出含有HindIII片段以及大部分东方伊萨酵母PGK1(IoPGK1)蛋白编码序列、但没有启动子序列的质粒(通过测序证实)。

用连接介导的PCR扩增，得到含有IoPGK1启动子区的基因组片段(Mueller，P.R.和Wold，B.1989，“In vivo footprinting of a musclespecific enhancer by ligation mediated PCR.”Science 246：780-786)。用T4DNA连接酶(New England BioLabs)，将称为SEQ.ID.NO.41的接头和称为SEQ.ID.NO.42的接头的混合物，与HaeIII消化的东方伊萨酵母基因组DNA连接。连接混合物样品用作模板，用于50μl PCR反应，其中含有0.1μM称为SEQ.ID.NO.43的引物和1μM称为SEQ.ID.NO.44的引物。加入2U的Dynazyme EXT之后，将反应混合物在94℃加热3分钟。如下进行30次循环的反应：94℃1分钟，68℃2分钟，72℃2分钟；最后在72℃延伸10分钟。在含有0.05μM称为SEQ.ID.NO.45的引物和0.5μM称为SEQ.ID.NO.46的引物的嵌套PCR反应物(50μl)中，将这个第一PCR扩增的稀释样品用作模板。加入2U的Dynazyme EXT之后，将反应混合物在94℃加热3分钟。然后，如下进行30次循环的反应：94℃ 1分钟，67℃ 2分钟，72℃ 2分钟；最后在72℃延伸10分钟。

分离～600bp PCR片段并测序。设计称为SEQ.ID.NO.47和SEQ.ID.NO.48的嵌套引物，与类似于以上的经鉴定为SEQ.ID.NO.49和SEQ.ID.NO.50的寡核苷酸一起，用于连接介导的PCR扩增，只是使用SspI消化的东方伊萨酵母DNA，采用65℃的退火温度进行PCR。

使用称为SEQ.ID.NO.51和SEQ.ID.NO.52的引物，并使用东方伊萨酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增东方伊萨酵母PGK1启动子区。用Klenow酶填补片段，再用XbaI消化。通过凝胶分离出633bp片段，与用XhoI消化质粒pMI270所得到的4428bp片段连接(参见WO03/049525图4)，用Klenow酶和0.1mM dNTP填补片段，再用XbaI消化。质粒pMI270含有与C.sonorensis PGK1启动子和酿酒酵母GAL10终止子连接的大肠杆菌潮霉素基因。所得质粒称为pMI318(图6)。质粒pMI318含有处于东方伊萨酵母PGK1启动子和酿酒酵母GAL10终止子控制之下的大肠杆菌潮霉素基因。

使用称为SEQ.ID.NO.53和SEQ.ID.NO.54的引物，并使用东方伊萨酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增东方伊萨酵母PGK1启动子。用Klenow酶和0.1mM dNTP填补片段，再用NcoI切割。通过凝胶分离出633bp片段。质粒pVR1(参见WO 03/102152图7)含有处于酿酒酵母TEF1启动子和酿酒酵母CYC1终止子控制之下的瑞士乳杆菌LDH基因。质粒pVR1用XhoI消化，用Klenow酶填补，再用NcoI切割。将来自质粒pVR1的7386bp片段与633bp的IoPGK1启动子片段连接起来。所得质粒称为pMI320。质粒pMI320含有处于IoPGK1启动子和酿酒酵母CYC1终止子控制之下的瑞士乳杆菌LDH基因。

质粒pMI318和pMI320用ApaI和NotI消化。将来自质粒pMI318的5008bp片段与来自质粒pMI320的1995bp片段连接起来，形成质粒pMI321(图7)。

潮霉素基因(及其终止子)位于质粒pMI321的两个拷贝的IoPGK1启动子之间，作为直接重复序列。

实施例4D：具有大肠杆菌潮霉素基因盒、瑞士乳杆菌LDH基因盒和IoPDC1A 5’侧翼区的质粒(pMI355，图8)的构建。

按照制造商的说明，将野生型东方伊萨酵母菌株ATCC PTA-6658的基因组文库构建到SuperCos1(Stratagene)粘粒载体中。使用称为SEQ.ID.NO.55和SEQ.ID.NO.56的引物，自该菌株的基因组DNA通过PCR扩增PDC样序列。扩增PDC基因的700bp片段。按照WO03/049525所述，用杂交技术，用带标记的PCR片段作为探针，筛选基因组文库，然后分离含有PDC基因的粘粒克隆并测序。用称为SEQ.ID.NO.57和SEQ.ID.NO.58的引物，并使用东方伊萨酵母PDC1A粘粒DNA作为模板，通过PCR扩增东方伊萨酵母可读框起始上游的1000bp至167bp的PDC1A5’区。该片段用SalI和SacI切割。通过凝胶分离836bp片段，然后与用SalI和SacI消化质粒pMI321(图7，实施例4C)所得到的6992bp片段连接起来。所得质粒称为pMI355(图8)。

实施例4E：含有IoPDC1A 5’侧翼区、大肠杆菌潮霉素基因盒、瑞士乳杆菌LDH基因盒和IoPDC1A 3’侧翼区的质粒(pMI356和pMI357(图9))的构建。

使用称为SEQ.ID.NO.59和SEQ.ID.NO.60的引物，并使用东方伊萨酵母PDC1A粘粒DNA(实施例4D)作为模板，通过PCR扩增对应于PDC翻译终止密码子的524bp上游至217bp下游序列的东方伊萨酵母PDC1A3’区。片段用ApaI和SmaI切割。通过凝胶分离630bp片段，与用ApaI和SmaI消化质粒pMI355(图8，实施例4D)所得到的7809bp片段连接起来。所得质粒称为pMI357(图9)。其在IoPDC1A基因的5’侧翼与部分3’侧翼之间含有来自质粒pMI355的潮霉素和LDH盒。

以同样方式构建质粒pMI356，除了使用不同部位的东方伊萨酵母PDC1A3’区以外。

实施例4F：含有IoPDC1A 5’侧翼区、ScMEL5基因盒、瑞士乳杆菌LDH基因盒和IoPDC1A 3’侧翼区的质粒pMI433(图10)的构建。

使用称为SEQ.ID.NO.61和SEQ.ID.NO.62的引物，并使用东方伊萨酵母基因组DNA作为模板，通过PCR扩增东方伊萨酵母PGK1启动子。用Klenow酶和0.1mM dNTP填补该片段，然后用SphI切割。通过凝胶分离669bp片段。质粒pMI233(参见WO03/049525图23C)用XhoI切割。用Klenow酶填补该片段，再用SphI切割。将4534bp和669bp片段连接起来，所得质粒称为pMI319。质粒pMI319含有酿酒酵母MEL5(ScMEL5)基因和IoPGK1启动子区。

质粒pMI319质粒用ApaI切割，用T4聚合酶产生平端，再用NotI切割。通过凝胶分离2317bp片段。将其与用SalI消化质粒pMI357(实施例4E)所得到的6498bp片段连接起来，用Klenow酶产生平端，再用NotI切割。所得质粒含有ScMEL5基因(具有其天然终止子)，其位置在质粒pMI357的潮霉素基因。所得质粒称为pMI433(图10)。

实施例4G：含有东方伊萨酵母CYB2 5’侧翼区、ScMEL5基因盒(位于耐热克鲁维酵母直接重复序列之间)和东方伊萨酵母CYB2 3’侧翼区的质粒pMI449(图11)和pMI454(图12)的构建。

质粒pMM28(图5，实施例4B)用BamHI消化，用Klenow酶填补，再用SalI消化。将由此得到的4077bp片段与pMI433(图10，实施例4F)的2317bp NotI(用Klenow酶填补)-SalI片段连接起来。所得质粒称为pMI445。

使用称为SEQ.ID.NO.63和SEQ.ID.NO.64的引物，并使用CYB2-2粘粒克隆作为模板，通过PCR扩增东方伊萨酵母L-乳酸：高铁细胞色素c氧化还原酶(IoCYB2A)基因3’侧翼区(对应于预测可读框起始90-676bp下游的序列)。所得PCR产物用SacI和SmaI消化，将所得607bp片段与质粒pMI445的6386bpSacI-SmaI片段连接在一起。所得质粒称为pMI448。

使用称为SEQ.ID.NO.65和SEQ.ID.NO.66的引物，并再次使用CYB2-2粘粒克隆作为模板，通过PCR扩增IoCYB2A5’侧翼区(对应于预测可读框起始913-487bp上游的序列)。所得PCR产物用SphI消化，将所得454bp片段与部分消化质粒pMI448所得到的6993bpSphI片段连接在一起。所得质粒称为pMI449(图11)。

使用称为SEQ.ID.NO.67和SEQ.ID.NO.68的引物，并再次使用CYB2-2粘粒克隆作为模板，通过PCR扩增IoCYB2A5’侧翼区(对应于预测可读框466-7bp上游)。所得PCR产物用SphI消化，将所得493bp片段与部分消化质粒pMI448所得到的6993bpSphI片段连接在一起。所得质粒称为pMI453。

使用称为SEQ.ID.NO.69和SEQ.ID.NO.70的引物，并使用CYB2-2粘粒作为模板，通过PCR扩增IoCYB2A3’侧翼区(对应于预测终止密码子402bp上游至77bp下游)。所得PCR产物用ApaI和SmaI消化，再将所得506bp片段与质粒pMI453的6886bpApaI-SmaI片段连接在一起。所得质粒称为pMI454(图12)。

实施例4H：含有IoGPD1基因上游片段、第一耐热克鲁维酵母直接重复部分、MEL5基因盒、第二耐热克鲁维酵母直接重复部分和IoGPD1基因下游片段的质粒(pBH165，图13)的构建。

质粒pMI449用NdeI和SbfI消化，切下5’CYB2A侧翼同源序列。6.8kbp片段通过凝胶纯化并脱去磷酸。使用称为SEQ.ID.NO.71和SEQ.ID.NO.72的引物，通过PCR扩增实施例4A的IoGPD1基因的302bp片段(对应于该基因起始密码子的碱基对1-302)。PCR产物通过凝胶纯化，用NdeI和SbfI消化，然后与质粒pMI449的6.8kbp片段连接起来，得到质粒pBH164。质粒pBH164再用XmaI和EcoRI消化，切下3’CYB2A侧翼同源序列。所得6.5kbp片段通过凝胶纯化并脱去磷酸。使用称为SEQ.ID.NO.73和SEQ.ID.NO.74的引物，通过PCR扩增实施例4A的IoGPD1基因的346bp片段(对应于起始密码子的碱基对322-668)。所得PCR产物通过凝胶纯化，用XmaI和EcoRI消化，然后与得自pBH164的6.5kbp片段连接起来，产生pBH165(图13)。

按照转录顺序，质粒pBH165含有IoGPD1基因的302bp片段、第一耐热克鲁维酵母直接重复部分、MEL5基因盒、第二耐热克鲁维酵母直接重复部分和IoGPD1基因的346bp片段。设计该质粒，用于在天然IoGPD1基因的基因座进行插入(以破坏该基因)，然后环出(loop-out)MEL5基因盒。

实施例4I：通过用质粒pMI356(实施例4F)转化野生型东方伊萨酵母菌株，一步产生具有缺失的IoPDC1A基因和IoPDC1B基因以及整合的LhLDH基因的东方伊萨酵母突变体(CD1184)。

使用标准方法，用质粒pMI356转化野生型东方伊萨酵母菌株ATCC PTA-6658。转化菌株在潮霉素平板上培养。选择一个不产乙醇的转化子，用于DNA印迹分析，证实其同时缺失两个IoPDC1A等位基因并插入至少一个拷贝的LhLDH基因。该菌株称为CD1184。

实施例4J：通过用质粒pMI449(实施例4G，图11)和pMI454(实施例4G，图12)相继转化菌株CD1184(实施例4I)，然后进行诱变，产生东方伊萨酵母突变菌株(CD1496)。

用乙酸锂方法，用质粒pMI449转化菌株CD1184，然后根据在YPD X-α-gal平板上的蜜二糖酶活性选择转化子(蓝色菌落)。在一些转化子上，通过菌落PCR和DNA印迹分析，证实菌株CD1184的IoCYB2A基因被取代。通过同源重组事件，通过耐热克鲁维酵母重复序列，从这些转化子中环出MEL5标记(通过DNA印迹分析证实)。然后用质粒pMI454，从该转化子中缺失第二CYB2A等位基因。通过菌落PCR分析转化子中缺失1000bp CYB2A特异性PCR产物。从具有通过上述重组而缺失的第二CYB2A等位基因的转化子中，环出来自质粒pMI454的MEL5标记。该转化子称为菌株CD1436。菌株CD1436同时缺失两个PDC1基因(被功能性L-LDH基因盒取代)并同时缺失其两个天然IoCYB2基因。

使用实施例1A所提出的条件(除了暴露条件为8μL达1小时之外)，对菌株CD1436进行EMS诱变。让诱变细胞在200μLYP+20g/L葡萄糖培养基中再培养6小时，然后倒在PDA+35g/L乳酸平板上，30℃孵育1周。比菌株CD1436产生较多乳酸和较少甘油的菌株称为菌株CD1496。

实施例4K：用质粒pBH165(实施例4H，图13)转化菌株CD1184(实施例4I)和CD1496(实施例4J)，接着环出选择标记，分别得到转化菌株CD1667和CD1671，其具有单个GPD1等位基因缺失。

培养菌株CD1184，用经NdeI和EcoRI消化质粒pBH165所得的5μg4.4kbp片段转化该菌株。在覆盖X-α-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃半乳糖苷)的酵母氮基础(YNB)+2％蜜二糖平板上选择转化子。在30℃生长～4天后可见蓝色转化子。挑取8个转化子，接种含有X-α-gal的YP+20g/L葡萄糖平板，以得到单菌落。挑取各转化子的蓝色单菌落，在YP+20g/L葡萄糖平板上重新划线。从转化子中分离基因组DNA。使用称为SEQ.ID.NO.75和SEQ.ID.NO.76的引物，通过PCR证实IoGPD1基因中有一个等位基因被破坏。5个转化子表现出预期的～2kb产物。这些转化子中的一个称为菌株CD1655。使用称为SEQ.ID.NO.77和SEQ.ID.NO.78的引物，通过PCR进一步证实天然IoGPD1基因中有一个拷贝被破坏。

将菌株CD1655在YP+100g/L葡萄糖上、在30℃生长几轮。将系列稀释液倒在覆盖X-α-gal的YP+20g/L平板上，在30℃生长过夜。选择白色菌落(这表明MEL5标记盒的环出)，并重新划线在YP+20g/L葡萄糖+X-α-gal平板上。选择白色菌落。使用称为SEQ.ID.NO.69和SEQ.ID.NO.80的引物，通过PCR证实天然IoGPD1基因中有一个等位基因被破坏。该转化子称为菌株CD1667。

以同样方式转化菌株CD1496。在PCR时显示出预期～2kbp条带的转化子称为菌株CD1657。通过如上所述用于菌株CD1655的PCR，证实天然IoGPD1基因中有一个等位基因被破坏。再将菌株CD1657培养几轮，选择具有MEL5标记基因盒缺失的菌落，称为菌株CD1671。通过如上所述的PCR，证实天然IoGPD1基因中有一个等位基因被破坏。

实施例4L：用质粒pBH165(实施例4H，图13)转化菌株CD1667(实施例4K)和CD1671(实施例4K)，分别得到转化菌株CD1688和CD1690，其两个IoGPD1等位基因都缺失。

用经NdeI和EcoRI消化质粒pBH165所得的5μg4.4kbp片段转化菌株CD1667。在覆盖X-α-gal的YNB+2％蜜二糖平板上选择转化子。在30℃生长～4天后可见蓝色转化子。挑取10个转化子，接种含有X-α-gal的YP+20g/L葡萄糖平板，以得到单菌落。挑取各转化子的蓝色单菌落，在YP+20g/L葡萄糖平板上重新划线。从转化子中分离基因组DNA。使用称为SEQ.ID.NO81和SEQ.ID.NO.82的引物，在三个转化子中，通过PCR证实IoGPD1基因中的第二等位基因被破坏。这些转化子中的一个称为菌株CD1688。

按照同样方式转化菌株CD1671。PCR显示，在一个称为菌株CD1690的转化子中，IoGPD1基因的第二等位基因被破坏。

实施例5：菌株CD1184(实施例4I)和CD1688(实施例4L)在OUR为5.5-5.6时的微好氧分批培养。

向含成分确定培养基(包含硫酸铵、磷酸二氢钾和硫酸镁、痕量元素、维生素、消泡剂和约50g/L葡萄糖)的单级分批培养反应器中，接种1mL菌株CD1688。将培养基的pH调至约3.5，然后再加入细胞。在细胞生长和开始产乳酸时，让培养物的pH降至3.0。此后，通过加入氢氧化钾，使pH维持在约3.0。向发酵物中添加葡萄糖约1-2g/L/hr，直到总共加入136.1g/L葡萄糖。在摄氧率为约5.5-5.6mmol/L/hr的通气条件下于30℃培养细胞。

菌株CD1688产生乳酸的速率为1.02g/L-hr，直到乳酸滴度为约70g/L。此时的乳酸收率约74％。在77小时后，该菌株停止生产，此时的发酵肉汤含有15.3g/L葡萄糖。乳酸总产率为1.06g/L-hr，乳酸总收率为70％。菌株CD1688的丙酮酸、甘油和二氧化碳的收率分别为1.9％、0％和23.7％。生物量收率为3.5％。

为了进行比较，在类似条件下培养菌株CD1184(并非本发明的实施例)。菌株CD1184产生乳酸的速率为1.24g/L-hr，直到乳酸滴度为约70g/L。此时的乳酸收率约74％。在77小时后，该菌株停止生产，此时的发酵肉汤含有15.3g/L葡萄糖。乳酸总产率为1.06g/L-hr，乳酸总收率为70％。菌株CD1184的丙酮酸、甘油和二氧化碳的收率分别为2.1％、9.3％和15.9％。生物量收率为3.2％。

这些结果表明，在这些发酵条件下，天然IoGPD1基因的缺失阻止细胞产生可检测量的甘油。如上所述，该基因的缺失(以及由此而来的甘油产量的缺失)对细胞生长没有或很少有影响。

实施例6：菌株CD1184(实施例4I)和CD1688(实施例4L)在OUR为9.9-10时的微好氧分批培养。

按照实施例5所述的类似方法，分别培养菌株CD1688和CD1184，除了选择通气条件使摄氧率为9.9-10.0mmol/L/hr，而且在培养期间不向系统中添加葡萄糖之外。将酵母外壳添加到菌株CD1688培养物中。

在这些条件下，菌株CD1184产生乳酸的速率为1.87g/L-hr，直到乳酸滴度为约70g/L。此时的乳酸收率约73％。在67.5小时后，该菌株停止生产，此时发酵肉汤中的葡萄糖浓度从60g/L降至2.1g/L。乳酸总产率为1.43g/L-hr，乳酸总收率为70％。菌株CD1184的丙酮酸、甘油和二氧化碳的收率分别为2.1％、5.7％和21.5％。生物量收率为4.4％。

菌株CD1688产生乳酸的速率为1.68g/L-hr，直到乳酸滴度为约70g/L。此时的乳酸收率约80％。在78小时后，该菌株停止生产，此时发酵肉汤中的葡萄糖浓度从53.5g/L降至4.8g/L。乳酸总产率为1.26g/L-hr，乳酸总收率为77％。菌株CD1688的丙酮酸、甘油和二氧化碳的收率分别为1.2％、0％和23.2％。生物量收率为5.95％。如上所述，这些结果表明，在这些发酵条件下，天然IoGPD1基因的缺失阻止细胞产生可检测量的甘油，而且该基因的缺失(以及由此而来的甘油产量的缺失)对细胞生长没有影响。另外，IoGPD1的缺失改善了乳酸的总收率。

实施例7：菌株CD1690(实施例4L)在OUR为5-6时的微好氧分批培养。

按照实施例5所述的类似方法，培养菌株CD1690，除了选择通气条件使摄氧率为5.75mmol/L/hr，而且发酵培养基为YP+70g/L葡萄糖之外。

在这些条件下，菌株CD1690产生乳酸的速率为0.66g/L-hr，直到乳酸滴度为约70g/L。此时的乳酸收率约78％。在121小时后，该菌株停止生产，此时发酵肉汤中的葡萄糖浓度降至23.8g/L(从培养开始时的127.9g/L)。乳酸总产率为0.61g/L-hr，乳酸总收率为77％。丙酮酸、甘油和二氧化碳的收率分别为0％、0％和31.1％。生物量收率为2.4％。另外，这些结果表明，在这些发酵条件下，两个天然IoGPD1等位基因的同时缺失阻止细胞产生可检测量的甘油，而且对细胞生长没有或很少有影响。

按照实施例5所述的一般性方法(使用其中所述的成分确定培养基)，培养菌株CD1690多两次，除了OUR为5.2mmol/L/hr且向发酵肉汤中添加甘油之外。第一轮加入0.1g/L甘油，第二轮加入1.0g/L甘油。

当加入0.1g/L甘油时，菌株CD1690产生乳酸的速率为0.74g/L-hr，直到乳酸滴度为约70g/L。此时的乳酸收率约78％。在121小时后，该菌株停止生产，此时发酵肉汤中的葡萄糖浓度降至10.2g/L(从培养开始时117.8g/L)。乳酸总产率为0.68g/L-hr，乳酸总收率为76％。丙酮酸、甘油和二氧化碳的收率分别为0.2％、0％和25.3％。生物量收率为4.1％。

当加入1.0g/L甘油时，得到非常类似的结果。

这些结果出乎意料地表明，向发酵培养基中添加甘油，对这些转化子生长和产生乳酸的能力没有或很少有影响，尽管细胞产甘油的天然能力被破坏。

实施例8A：含有IoGPD15’侧翼区、位于直接重复序列之间的大肠杆菌潮霉素基因盒和IoGPD13’侧翼区的质粒(pTMC61(图14))的构建。

使用称为SEQ.ID.NO.83和SEQ.ID.NO.84的引物，用质粒pMI356(实施例4E，参见图9)作为模板，通过PCR扩增潮霉素基因盒。PCR条件是95℃5分钟(一次)，30次循环(95℃(30秒)、56℃(30秒)和72℃(2分钟))，然后72℃10分钟一次循环。所得PCR产物用SpeI和SalI消化，连接在经同样消化的质粒pBH165(实施例4H，图13)上，得到质粒pTMC61(图14)。

实施例8B：转化所选择的具有质粒pBH165(实施例4H，图13)的野生型东方伊萨酵母菌株，然后环出选择标记，得到单个GPD1等位基因缺失的转化菌株CD2624。

野生型东方伊萨酵母菌株ATCC PTA-6658在含有低浓度葡萄糖和高浓度乳酸的培养基中连续培养多代。分离出在这些条件下生长良好的细胞，称为菌株CD1822。在含有葡萄糖为碳源的培养基中培养时，菌株CD1822产生乙醇和甘油。培养菌株CD1822，按照实施例4K所述的类似方法，用质粒pBH165转化。按照实施例4K所述，在覆盖X-α-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃半乳糖苷)的酵母氮基础(YNB)+2％蜜二糖平板上选择转化子，挑取蓝色菌落，在YP+20g/L葡萄糖平板上重新划线。从转化子中分离基因组DNA，并通过两组PCR反应，分析缺失构建体的整合。第一组使用的引物称为SEQ.ID.NO.85和SEQ.ID.NO.86，第二组使用的引物称为SEQ.ID.NO.87和SEQ.ID.NO.88。由此产生的PCR产物分别为2.0kbp和1.4kbp，表明已有一个GPD1等位基因被破坏。使用称为SEQ.ID.NO.85和SEQ.ID.NO.88的引物，完成第三组PCR反应；其产生0.8kbp产物，表明未被破坏的GPD1等位基因依然存在于转化子中。该转化子称为菌株CD2624。

实施例8C：用质粒pTMC61(实施例8A，图14)转化菌株CD2624(实施例8B)，得到转化菌株CD2627，其两个IoGPD1等位基因都同时缺失。

用称为SEQ.ID.NO.89和SEQ.ID.NO.90的引物并用质粒pTMC61作为模板，进行PCR。得到4.1kbp片段，用于转化菌株CD2624。在YPD+300μg/ml潮霉素上选择转化子。从100个转化子中分离基因组DNA，并在三组PCR反应中用作模板。第一组使用的引物称为SEQ.ID.NO.91和SEQ.ID.NO.88，在30个转化子中产生1.5kbp产物。第二组PCR反应在来自这30个转化子的基因组DNA上进行，使用称为SEQ.ID.NO.85和SEQ.ID.NO.92的引物。10个菌株表现出预期的2.5kbp产物。然后，用称为SEQ.ID.NO.85和SEQ.ID.NO.88的引物，分析这10个菌株的基因组DNA。不产生0.8kbp片段的2个菌株的两个GPD1等位基因同时被破坏。这些是在YNB+2.0％蜜二糖平板上培养物进行检测的。一个菌株能够生长，称为菌株CD2627。

实施例8D：菌株CD1822、菌株CD2624(实施例8B)和菌株CD2627(实施例8C)的微好氧培养。

菌株CD1822、CD2624和CD2627在微好氧摇瓶发酵中培养，一式两份。菌株在装有25mL成分确定培养基(含～100g/mL葡萄糖)的250mL带挡板摇瓶中，在30℃和250rpm搅拌下培养过夜。成分确定培养基按照以下文献所述：Peter M.Bruinenberg，Johannes P.VanDijken和W.Alexander Schefferes，1983，An Enzymatic Analysis ofNADPH Production and Consumption in Candida utilis，J.GeneralMicrobiology第129卷，第965-971页，除了视需要存在额外葡萄糖、而且烟酸增加至5mg/L之外。

所得培养物用于接种装有50mL成分确定培养基(含100g/L葡萄糖)的250mL带挡板摇瓶中，至OD₆₀₀为0.2。然后，将这些摇瓶在30℃以100rpm孵育22小时。然后通过HPLC分析培养基中的葡萄糖、甘油和乙醇。也测定生物量收率。

菌株CD1822在22小时培养期间消耗所有葡萄糖，产生6.0g/kg甘油、34.54g/kg乙醇，生物量达OD₆₀₀ 14.8。

一个GPD1等位基因被破坏的菌株CD2624消耗所有葡萄糖，产生5.88g/kg甘油和35.25g/kg乙醇。产生生物量达OD₆₀₀ 14.5。

两个GPD1等位基因同时被破坏的菌株CD2627在22小时期间消耗大约12.39g/kg葡萄糖。甘油产量为0.34g/kg。乙醇产量为23.06g/kg，产生生物量达OD₆₀₀ 11.5。这些结果表明，在这些条件下，东方伊萨酵母中GPD1等位基因的破坏，使葡萄糖消耗率有少量下降，乙醇产量和生物量产量有少量下降。然而，菌株CD2627生长良好，产生乙醇良好，甘油产量最少。这些结果还表明，GPD1缺失体的生长和生产能力并不依赖于PDC活性的破坏或从丙酮酸到乳酸途径的添加。

序列表

<110> 卡吉尔公司(CARGILL INCORPORATED)

Dundon，Catherine Asleson

Suominen，Pirkko

Aristidou，Aristos

Rush，Brian J.

Koivuranta，Kari

Hause，Benjamin Matthew

McMullin，Thomas W.

Roberg-Perez，Kevin

<120> 具有从磷酸二羟丙酮到甘油的途径被破坏的酵母细胞

<130> 1206A WO

<150> 60/781,674

<151> 2006-03-13

<160> 92

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 415

<212> PRT

<213> 东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)

<220>

<221> 其他特征

<222> (14)..(14)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 其他特征

<222> (161)..(161)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 其他特征

<222> (272)..(272)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 其他特征

<222> (287)..(287)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 其他特征

<222> (347)..(347)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 1

<210> 2

<211> 434

<212> PRT

<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)

<400> 2

<210> 3

<211> 391

<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 3

<210> 4

<211> 440

<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 4

<210> 5

<211> 400

<212> PRT

<213> 光滑假丝酵母(Candida glabrata)

<400> 5

<210> 6

<211> 389

<212> PRT

<213> 汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)

<400> 6

<210> 7

<211> 393

<212> PRT

<213> Pichia jadinii

<400> 7

<210> 8

<211> 248

<212> PRT

<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)

<400> 8

<210> 9

<211> 250

<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 9

<210> 10

<211> 271

<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 10

<210> 11

<211> 236

<212> PRT

<213> 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)

<400> 11

<210> 12

<211> 246

<212> PRT

<213> 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)

<400> 12

<210> 13

<211> 450

<212> PRT

<213> 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)

<400> 13

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

<210> 32

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

<210> 33

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

<210> 34

<211> 706

<212> DNA

<213> 耐热克鲁维酵母(K1uyveromyces thermotolerans)

<400> 34

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

<210> 36

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

<210> 42

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

<210> 44

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

<210> 50

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

<210> 51

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 51

<210> 52

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

<210> 53

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

<210> 54

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 54

<210> 55

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

<210> 56

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<220>

<221> 其他特征

<222> (21)..(21)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> 其他特征

<222> (33)..(33)

<223> n为a、c、g或t

<400> 56

<210> 57

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 57

<210> 58

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 58

<210> 59

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 59

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 60

<210> 61

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 61

<210> 62

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 62

<210> 63

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 63

<210> 64

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 64

<210> 65

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 65

<210> 66

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 66

<210> 67

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 67

<210> 68

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 68

<210> 69

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 69

<210> 70

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 70

<210> 71

<211> 33

<212> DNA

<213> SEQ.ID.N0.71

<400> 71

<210> 72

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 72

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 73

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>74

<210>75

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>75

<210>76

<211>22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 76

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

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Claims

1.一种全基因组重复前酵母细胞，所述细胞经过遗传修饰而缺失或破坏了从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径。

2.权利要求1的细胞，所述细胞是半子囊菌。

3.权利要求2的细胞，所述细胞在其可代谢的碳源存在下进行培养时，代谢以重量计2％以下碳源并由所述细胞消耗用以产生甘油。

4.权利要求3的细胞，所述细胞经过遗传修饰而产生有机酸。

5.权利要求4的细胞，所述细胞含有功能性LDH基因盒，而且所述细胞产生乳酸。

6.权利要求5的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因的缺失或破坏。

7.权利要求5的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。

8.权利要求5的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因的缺失或破坏以及至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。

9.权利要求5的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏可包括至少一个天然二羟丙酮磷酸酶基因的缺失或破坏、天然甘油脱氢酶基因的缺失或破坏、或者天然二羟丙酮磷酸酶基因和天然甘油脱氢酶基因两者同时缺失或破坏。

10.权利要求4-9中任一项的细胞，所述细胞含有从丙酮酸到乙醇的天然代谢途径的缺失或破坏。

11.一种属于酵母复合群的接合酵母属(Zygosaccharomyces)、接合有孢圆酵母属(Zygotorulaspora)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、Lachancea、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假囊酵母属(Eremothecium)或有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)进化枝(Kurtzman2003)的细胞，所述细胞经过遗传修饰而缺失或破坏了从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径。

12.权利要求12的细胞，所述细胞在其可代谢的碳源存在下进行培养时，代谢以重量计2％以下碳源并由所述细胞消耗用以产生甘油。

13.权利要求12的细胞，所述细胞经过遗传修饰而产生有机酸。

14.权利要求13的细胞，所述细胞含有功能性LDH基因盒，而且所述细胞产生乳酸。

15.权利要求14的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因的缺失或破坏。

16.权利要求14的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。

17.权利要求14的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因的缺失或破坏以及至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。

18.权利要求14的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏可包括至少一个天然二羟丙酮磷酸酶基因的缺失或破坏、天然甘油脱氢酶基因的缺失或破坏、或者天然二羟丙酮磷酸酶基因和天然甘油脱氢酶基因两者同时缺失或破坏。

19.权利要求13-18中任一项的细胞，所述细胞含有从丙酮酸到乙醇的天然代谢途径的缺失或破坏。

20.克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)或伊萨酵母属(Issatchenkia)的细胞，所述细胞经过遗传修饰而缺失或破坏了从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径。

21.权利要求20的细胞，所述细胞在其可代谢的碳源存在下进行培养时，代谢以重量计2％以下碳源并由所述细胞消耗用以产生甘油。

22.权利要求21的细胞，所述细胞经过遗传修饰而产生有机酸。

23.权利要求22的细胞，所述细胞含有功能性LDH基因盒，而且所述细胞产生乳酸。

24.权利要求23的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因的缺失或破坏。

25.权利要求23的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。

26.权利要求23的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因的缺失或破坏以及至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。

27.权利要求21-26中任一项的细胞，所述细胞含有从丙酮酸到乙醇的天然代谢途径的缺失或破坏。

28.一种属于酵母复合群的东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)/发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)进化枝(Kurtzman和Robnett，1998)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)进化枝(Kurtzman 2003)的细胞，所述细胞经过遗传修饰而缺失或破坏了从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径。

29.权利要求28的细胞，所述细胞在其可代谢的碳源存在下进行培养时，代谢以重量计2％以下碳源并由所述细胞消耗用以产生甘油。

30.权利要求29的细胞，所述细胞经过遗传修饰而产生有机酸。

31.权利要求30的细胞，所述细胞含有功能性LDH基因盒，而且所述细胞产生乳酸。

32.权利要求31的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因的缺失或破坏。

33.权利要求31的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。

34.权利要求31的细胞，其中所述天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因的缺失或破坏以及至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。

35.权利要求31的细胞，所述细胞是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)细胞。

36.权利要求35的细胞，所述细胞含有从丙酮酸到乙醇的天然代谢途径的缺失或破坏。

37.权利要求31的细胞，所述细胞是东方伊萨酵母细胞。

38.权利要求37的细胞，所述细胞含有从丙酮酸到乙醇的天然代谢途径的缺失或破坏。

39.一种经遗传修饰的全基因组重复前酵母种细胞，所述细胞当在以下标准微好氧条件下进行培养时，产生小于2.0g/L甘油：

C.接种酵母细胞培养至OD₆₀₀为1.0；

D.培养温度30℃；

E.持续培养直到葡萄糖浓度降至10g/L，但不超过120小时；

F.通气和搅拌以满足摄氧率为5.0±1.0mmol/升/小时。

40.权利要求39的细胞，所述细胞是半子囊菌。

41.权利要求39的细胞，所述细胞属于酵母复合群的接合酵母属、接合有孢圆酵母属、有孢圆酵母属、Lachancea、克鲁维酵母属、假囊酵母属或有孢汉逊酵母属进化枝(Kurtzman 2003)。

42.权利要求40的细胞，所述细胞属于克鲁维酵母属、假丝酵母属或伊萨酵母属。

43.权利要求39-42中任一项的细胞，所述细胞当在标准微好氧条件下进行培养时，产生不超过0.6g/L甘油。

44.权利要求43的细胞，所述细胞当在标准微好氧条件下进行培养时，产生至少10g/L所需发酵产物。

45.一种经遗传修饰的全基因组重复前酵母种细胞，所述经遗传修饰的细胞缺乏产生活性甘油-3-磷酸脱氢酶的能力，而所述酶是由其野生型酵母种细胞天然产生的。

46.权利要求45的细胞，所述细胞是半子囊菌。

47.权利要求45的细胞，所述细胞属于酵母复合群的接合酵母属、接合有孢圆酵母属、有孢圆酵母属、Lachancea、克鲁维酵母属、假囊酵母属或有孢汉逊酵母属进化枝(Kurtzman 2003)。

48.权利要求45的细胞，所述细胞属于克鲁维酵母属、假丝酵母属或伊萨酵母属。

49.权利要求44-48中任一项的细胞，所述细胞还缺乏产生活性甘油-3-磷酸酶的能力，而所述酶是由其酵母种细胞天然产生的。

50.一种全基因组重复前酵母种细胞，所述细胞缺乏产生活性甘油-3-磷酸酶的能力，而所述酶是由其酵母种野生型细胞天然产生的。

51.权利要求50的细胞，所述细胞是半子囊菌。

52.权利要求50的细胞，所述细胞属于酵母复合群的接合酵母属、接合有孢圆酵母属、有孢圆酵母属、Lachancea、克鲁维酵母属、假囊酵母属或有孢汉逊酵母属进化枝(Kurtzman 2003)。

53.权利要求50的细胞，所述细胞属于克鲁维酵母属、假丝酵母属或伊萨酵母属。

54.一种经遗传修饰的酵母种细胞，所述细胞缺乏产生活性磷酸二羟丙酮磷酸酶的能力，而所述磷酸酶是由其酵母种野生型细胞天然产生的；所述细胞还缺乏产生活性NADH⁺依赖性甘油脱氢酶的能力，而所述脱氢酶是由其酵母种野生型细胞天然产生的；或者所述细胞同时缺乏产生这两种酶的能力。

55.一种酵母细胞，所述细胞经过遗传修饰而产生有机酸产物，所述酵母细胞还具有从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径的缺失或破坏以及从丙酮酸到乙醇的天然代谢途径的缺失或破坏。

56.权利要求55的酵母细胞，其中从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸脱氢酶基因的缺失或破坏。

57.权利要求55的酵母细胞，其中从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。

58.权利要求57的酵母细胞，其中从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然甘油-3-磷酸酶脱氢酶基因的缺失或破坏和至少一个天然甘油-3-磷酸酶基因的缺失或破坏。

59.权利要求57的酵母细胞，其中从磷酸二羟丙酮到甘油的天然代谢途径的缺失或破坏包括至少一个天然磷酸二羟丙酮磷酸酶基因的缺失或破坏、天然甘油脱氢酶基因的缺失或破坏、或者天然磷酸二羟丙酮磷酸酶基因和天然甘油脱氢酶基因两者同时缺失或破坏。

60.权利要求55-59中任一项的酵母细胞，其中所述有机酸是乳酸。

61.一种发酵方法，其中权利要求1-3、11-12、20-21或28-29中任一项的细胞在发酵条件下、在碳源存在下进行培养时产生所需发酵产物，其中以所述细胞所消耗的碳源重量计，甘油收率小于2％。

62.权利要求61的发酵方法，其中以所述细胞所消耗的碳源重量计，所需发酵产物的产率至少为40％。

63.权利要求62的方法，其中以所述细胞所消耗的碳源重量计，甘油收率小于0.5％。

64.权利要求63的方法，其中所述所需发酵产物是乙醇。

65.一种发酵方法，其中权利要求4、13、22或30中任一项的细胞在发酵条件下、在碳源存在下进行培养时产生至少一种有机酸，其中以所述细胞所消耗的碳源重量计，甘油收率小于2％。

66.权利要求66的发酵方法，其中所述有机酸的产率以所述细胞所消耗的碳源重量计至少为40％，甘油收率以所述细胞所消耗的碳源重量计小于0.5％。

67.一种发酵方法，其中权利要求5-9、14-18、23-26或31-38中任一项的细胞在发酵条件下、在碳源存在下进行培养时产生乳酸，其中以所述细胞所消耗的碳源重量计，甘油收率小于2％。

68.权利要求67的发酵方法，其中乳酸的产率以所述细胞所消耗的碳源重量计至少为40％，甘油收率以所述细胞所消耗的碳源重量计小于0.5％。

69.一种发酵方法，其中权利要求1-3、11-12、20-21或28-29中任一项的细胞在发酵条件下、在碳源存在下进行培养时产生乙醇，其中以所述细胞所消耗的碳源重量计，甘油收率小于2％。