BRPI0709607A2 - cédulas de levedura tendo caminho interropido a partir de diidroxi acetona fosfato para glicerol - Google Patents

Abstract

CéLULAS DE LEVEDURA TENDO CAMINHO INTERROMPIDO A PARTIR DE DIIDROXI ACETONA FOSFATO PARA GLICEROL. Células de levedura são geneticamente modificadas para interromper um caminho metabólico nativo a partir de diidroxi acetona para glicerol. Em certos aspectos, a célula de levedura é do gênero Kluyveromyces Candida ou Issatchenkia. Em outros aspectos, a célula de levedura é capaz de produzir pelo menos um ácido orgânico, tal como lactato. As células levedura produzem significantemente menos glicerol que as linhagens tipo selvagem, e usualmente produzem maiores rendimentos de desejados produtos de fermentação. Células de levedura da invenção freqúentemente crescem bem quando cultivadas, à despeito de sua reduzida produção de glicerol.

Description

"CÉLULAS DE LEVEDURA TENDO CAMINHO INTERROMPIDO A PARTIR DEDIIDROXI ACETONA FOSFATO PARA GLICEROL"

Esta invenção foi realizada sob contrato N° DE-FC36-03G013145 com o UnitedStates Department of Energy. O governo dos Estados Unidos tem certos direitos desta in-venção.

Este pedido reivindica prioridade de United States Provisional Application No.60/781 674, depositado em 13 de março de 2006.

Esta invenção refere-se a certa levedura geneticamente modificada, e processos defermentação para produção de ácido lático usando aquelas leveduras geneticamente modifi-cadas.

Leveduras são usadas como biocatalisadores em um número de fermentações in-dustriais. Há um crescente interesse em uso de levedura para fermentar açúcares a ácidosorgânicos como ácido lático. Na medida em que mais ácido orgânico é produzido nestasfermentações, o meio de fermentação se torna crescentemente ácido. Maioria de bactériasque produzem estes ácidos orgânicos não desempenham bem em ambientes fortementeácidos - elas também não sobrevivem sob aquelas condições ou também produzem tãolentamente que o processo se torna economicamente inviável. Como um resultado, torna-senecessário tamponar o meio para manter um pH alto. Isto causa dificuldade na recuperaçãode produto em forma ácida. É preferido conduzir a fermentação em um menor pH no qual oproduto está parcial ou inteiramente na forma ácida.

Espécies de levedura têm sido consideradas como candidatas para tais fermenta-ções de baixo pH. Muitas espécies de levedura fermentam naturalmente açúcares hexose aetanol, mas poucas se alguma produz naturalmente rendimentos significantes de ácidosorgânicos como ácido lático. Da mesma maneira, foram feitos esforços para modificar gene-ticamente várias espécies de leveduras para inserção de um ou mais genes que permitirão acélula produzir ácido lático. De modo a desviar metabolismo de açúcar de produção de eta-nol para produção de ácido lático, estas células também foram geneticamente modificadaspara interromper ou suprimir o gene piruvato descarboxilase (PDC) nativo. Este trabalho édescrito, por exemplo, em WO 99/14335, WO 00/71738 A1, WO 02/42471 A2, WO03/049525 A2, WO 03/102152 A2 e WO 03/102201 A2.

Glicerol é produzido em significante rendimento em muitas destas fermentações delevedura. Glicerol pode servir como um osmo-protetor para a célula. Formação de glicerolpode auxiliar regeneração de co-fatores de redox sob condições de fermentação.

Glicerol é produzido em muitas células de levedura através de metabolização de di-idroxi acetona fosfato (DHAP). Em maior parte de espécies de levedura, DHAP é reduzidopor uma glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD, nome sistemático enzima sn-glicerol-3-fosfato:NAD+ 2-óxido redutase, EC 1.1.1.8) para formar glicerol-3-fosfato (G3P). G3P servecomo um precursor para biossíntese de lipídeo assim como um precursor de glicerol. G3P édesfosforilado a glicerol por uma enzima glicerol-3-fosfatase (GPP, nome sistemático glice-rol-1-fosfato fosfoidrolase, EC 3.1.3.21).Existe um caminho alternativo para produção de glicerol, que é importante para al-gumas leveduras, como S. pombe. Neste caminho, diidroxi acetona fosfato é desfosforiladoem diidroxi acetona através de diidroxi acetona fosfato fosfatase. Diidroxi acetona é entãoconvertida em glicerol em conjunção com oxidação NADH por glicerol desidrogenase de-pendente de NADH+ (nome sistemático glicerol:NAD+ 2-óxido redutase, EC 1.1.1.6).Devido produção de glicerol consumir carbono que de outro modo pode ser usadopara produção de um produto de fermentação mais desejável, esta produção de glicerol re-presenta uma significante fonte de perda de rendimento. Em adição, produção de glicerolsurge às custas de ambos, ATP e NADH. Isto direciona energia afastando-se da produçãode biomassa ou o produto desejado. Por ambas razões, pode ser desejado reduzir-se oueliminar-se produção de glicerol pela célula. Ainda uma consideração é que a redução oueliminação de produção de glicerol pode simplificar recuperação e purificação do produtodesejado.Uma linhagem Saccharomyces cerevisiae foi geneticamente engenheirada para su-primir seus genes GPD nativos, assim privando a célula da enzima GPD e prevenindo pro-dução de glicerol. Ver Nissen et al., "Anaerobic and aerobic batch eultivations of Saccharo-myces cerevisiae mutants impaired in glycerol synthesis", Yeast, 2000:16:463-474. Nissen etal. relatam que as células de mutação cresceram muito pobremente sob ambas condiçõesanaeróbicas e aeróbicas quando ambos dos genes GPD nativos foram interrompidos. Deacordo com Nissen et al., as células de mutação produziram muito menos glicerol que ascélulas tipo selvagem. Nissen et al. fizeram a hipótese.de que o pobre crescimento visto naslinhagens deletantes duplas foi devido a um esgotamento de coleção de NAD+ de célula,porque produção de glicerol não foi disponível para oxidar NADH na célula.Pode ser desejável prover uma célula de levedura que produza um desejado produ-to orgânico, que produz pouco ou nenhum glicerol, e que também cresça bem sob condi-ções aeróbicas, condições anaeróbicas ou ambas condições aeróbica e anaeróbica.Em um aspecto, esta invenção é uma célula de levedura mutante de uma espéciede levedura de duplicação de genoma pré-total, tendo uma supressão ou interrupção de umcaminho metabólico nativo a partir de diidroxi acetona fosfato para glicerol. A supressão ouinterrupção do caminho metabólico nativo pode incluir uma supressão ou interrupção depelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD) nativo. A supressão ou inter-35 rupção do caminho metabólico nativo pode incluir uma supressão ou interrupção de pelomenos um gene glicerol-3-fosfatase (GPP) nativo. Ela pode incluir uma supressão ou inter-rupção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD) nativo e pelo menosum gene glicerol-3-fosfatase (GPP) nativo. A supressão ou interrupção do caminho metabó-lico nativo pode incluir uma supressão ou interrupção de pelo menos um gene diidroxi ace-tona fosfato fosfatase nativo, gene glicerol desidrogenase nativo, ou ambos.

Em um outro aspecto, esta invenção é uma célula de levedura mutante de uma es-pécie de levedura de duplicação de genoma pré-total, cuja célula mutante produz menosque 2,0 g/L de glicerol quando cultivada sob as seguintes condições micro-aeróbicas pa-drões:

A.meio aquoso définido contendo, no início de cultura, 5 g/L de sulfato de amônio, 3g/L de diidrogeno fosfato de potássio, 0,5 g/L de sulfato de magnésio, elementos em traços,vitaminas, 150 g/L de glicose;

B.pH no início de cultura de 3,5, com meio de fermentação sendo tamponado senecessário para prevenir queda do pH abaixo de 3,0 ou elevação acima de 7,0 durante acultura;

C.Cultura inoculada com a célula de levedura para uma OD600 de 1,0;

D.Temperatura de cultura de 30°C;

E.Cultura continuada até concentração de glicose ser reduzida para 10 g/L, masnão é continuada por mais de 120 horas;

F.Aeração e agitação suficientes para produzir uma taxa de tomada de oxigênio de5,0+/-1,0 mmoles/L/h.

Em um outro aspecto, esta invenção é uma célula de levedura mutante de uma es-pécie de levedura de duplicação de genoma pré-total, que carece de habilidade para produ-zir uma enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase (GDP) ativa. Para propósitos desta inven-ção, uma célula é considerada carecer de habilidade para produzir uma enzima ativa se aatividade de tal enzima na célula é reduzida por pelo menos 75%, preferivelmente pelo me-nos 90%, comparada à atividade daquela enzima na linhagem tipo selvagem. Atividade deenzima de qualquer enzima particular pode ser determinada usando apropriados processosde ensaio. Kits de ensaio comerciais são disponíveis para determinação de atividade deglicerol-3-fosfato desidrogenase. Um exemplo de um tal produto é designado como MK426por Takara Bio, Inc. e é disponível através de Fisher Scientific, Pennsylvania.

Em um outro aspecto, esta invenção é uma célula de levedura mutante de uma es-pécie de levedura de duplicação de genoma pré-total, que carece de habilidade para produ-zir uma enzima glicerol-3-fosfatase ativa.

Em um outro aspecto, esta invenção é uma célula de levedura mutante que carecede habilidade para produzir uma enzima diidroxi acetona fosfato fosfatase ativa que é nati-vãmente produzida por células tipo selvagem das espécies de levedura, carece de habilida-de para produzir uma enzima glicerol desidrogenase dependente de NADH+ ativa que é na-tivamente produzida por células tipo selvagem das espécies de levedura, ou ambas.Em um outro aspecto, esta invenção é uma célula de levedura mutante que é gene-ticamente modificada para produzir um produto ácido orgânico, a dita célula de leveduratendo uma supressão ou interrupção de um caminho metabólico nativo a partir de diisroxiacetona fosfato para glicerol e uma supressão ou interrupção de um caminho metabólico nativo a partir de piruvato para etanol. A supressão ou interrupção do caminho metabóliconativo pode incluir uma supressão ou interrupção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfatodesidrogenase nativo. A supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo pode incluiruma supressão ou interrupção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfatase nativo. Ela podeincluir uma supressão ou interrupção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidroge- nase nativo e pelo menos um gene glicerol-3-fosfatase nativo.

Células de acordo com a invenção foram verificadas produzirem níveis muito baixosde glicerol quando cultivadas sob condições de fermentação. Produção de glicerol foi verifi-cada estar abaixo de 0,2 g/L sob uma faixa de condições de fermentação. Surpreendente-mente, as células da invenção crescem bem sob condições de fermentação, à despeito de falta de produção de glicerol e em algumas realizações à despeito de falta de produção deglicerol-3-fosfato. As células da invenção também foram verificadas terem aperfeiçoada tole-rância a ácido em alguns exemplos. Da mesma maneira, a invenção é também um processode fermentação onde uma célula de qualquer um dos aspectos anteriores da invenção écultivada sob condições de fermentação para produzir um produto de fermentação, onde orendimento de fonte de carbono para glicerol é de menos que 2% em peso.

A Figura 1 é um diagrama mostrando o plasmídeo pBH158.

A Figura 2 é um diagrama mostrando o plasmídeo pBH159.

A Figura 3 é um diagrama mostrando o plasmídeo pBH160.

A Figura 4 é um diagrama mostrando o plasmídeo pBH161.

A Figura 5 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMM28.

A Figura 6 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI318.

A Figura 7 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI321.

A Figura 8 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI355.

A Figura 9 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI357.

A Figura 10 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI433.

A Figura 11 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI449.

A Figura 12 é um diagrama mostrando o plasmídeo pMI454.

A Figura 13 é um diagrama mostrando o plasmídeo pBH165.

A Figura 14 é um diagrama mostrando o plasmídeo pTMC61.

As células de levedura da invenção são obtidas através de realização de certasmodificações genéticas para uma célula de levedura hospedeira. A célula de levedura hos-pedeira é uma que, como uma linhagem tipo selvagem, é nativamente capaz de metabolizarpelo menos um açúcar a glicerol. O caminho metabólico nativo pode envolver um caminhometabólico a partir de diidroxi acetona fosfato para glicerol-3-fosfato para glicerol. O cami-nho nativo pode envolver um caminho metabólico de diidroxi acetona fosfato para diidroxiacetona para glicerol. Células hospedeiras podem conter ambos daqueles caminhos meta-bólicos nativos.

O termo "nativo", quando usado aqui com relação a materiais genéticos (por exem-plo, um gene, promotor, terminador ou outra seqüência de ADN), refere-se a materiais gené-ticos que são encontrados (à parte de mutações de indivíduo-para-indivíduo que não afetamfunção) dentro do genoma de células tipo selvagem daquelas espécies de levedura, "capa-cidade nativa" (e suas variações tal como "nativamente capaz" indica a habilidade de célulastipo selvagem para realizar a função indicada. Por exemplo, uma célula é nativamente capazde metabolizar um açúcar a glicerol se células tipo selvagem daquelas espécies que possu-em esta capacidade antes de quaisquer modificações genéticas. Um gene é consideradoser "funcional" dentro de uma célula se ele funciona dentro da célula para produzir uma pro-teína ativa. Um "caminho nativo" ou "caminho metabólico nativo" refere-se a um caminhometabólico que existe e é ativo em células tipo selvagem daquelas espécies de levedura.Uma enzima é "nativamente produzida" por um espécie de levedura se a enzima é produzi-da em forma ativa por células tipo selvagem daquela espécie de levedura.

Nesta invenção, "exógeno" significa com relação a qualquer material genético queele não é nativo para a célula hospedeira.

Apropriadas células hospedeiras para certas realizações da invenção incluem célu-las de levedura que não descendem de uma linha que sofreu o antigo evento de duplicaçãode genoma total (-100 milhões de anos atrás) descrito por Wolf et al., "Molecular evidencefor na ancient duplication of the entire yeast genome", Nature 387, 708-713 (1997) (daquipor diante "Wolf et al. 1997"), Langkjaer et al., et al., "Yeast genome duplication was followedby asynchronous differentiation of duplicated genes", Nature 421, 848-852 (2003) e Mericoet al., "Fermentative Iifestyle in yeasts belonging to the Saccharomyces complex", FEBSJournal 274, 967-989 (2007) (daqui por diante "Merico 2007"). Tais células de levedura aoinvés descendem de uma ou mais outras linhas de células de leveduras que existiram nomomento do evento de duplicação de genoma total, e são aqui referidas como "levedura deduplicação de genoma pré-total". O evento de duplicação de genoma total é visto como críti-co para a evolução das capacidades de fermentação de Sacchaeomyces cerevisiae e ou-tras espécies descendentes do ancestral comum no qual a duplicação de genoma ocorreu(Merico 2007). Incluídos no conjunto de genes duplicados na duplicação de genoma estãoaqueles codificando glicerol-3-fosfato desidrogenase e glicerol-3-fosfatase, como são genescodificando fumarato redutase que também está envolvida em manutenção de equilíbrioredox (Wolfe et al 1997).Entre as apropriadas células de levedura de duplicação de genoma pré-total estãocélulas de levedura hemiascomicetosas. Levedura hemiascomicetosa são leveduras de cé-lula simples classificadas dentro da ordem Saccharomycetales.

Outras células de leveduras apropriadas incluem aquelas caindo dentro de qualqueruma das clades 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 do complexo Saccharomyces, como descrito naFigura 9 (p. 430) de Kurtzman and Robnett, "Phylogenetic relationships among yeasts of the'Saccharomyces complex' determined from multigene sequence analyses", FEMS YeastRes. Vol. 4, pp. 417-432 (2003), aqui incorporado por referência. Aquelas clades são desig-nadas pelos nomes Zygosaccharomyces, Zygotorulaspora, Torulaspora, Lachancea, Kluyve-romyces, Eremothecium, Hanseniaspora, e Saccharomycodes, respectivamente, em Merico2007 supra, e em Kurtzmann, "Phylogenetic circumscription of Saccharomyces, Kluyve-romyces and other members of the Saccharomycetaceae..." FEMS Yeast. Res. Vol. 4, pp.233-245 (2003) (daqui por diante "Kurtzman 2003").

Outras células de levedura apropriadas incluem (mas não são limitadas a) célulasde leveduras classificadas sob os gêneros Candida, Saccharomyces, Schizosaccharomy-ces, Kluyveromyces, Pichia, lssatchenkia, e Hansenula.

Uma classe de células hospedeiras que são de particular interesse inclui qualqueruma daquelas de uma espécie contida em clade I. orientalis /I. terrícola. Membros da cladeI. orientalis / I. terrícola são identificados por análises do domínio D1/D2 variável do ADNribossômico 26S de espécies de leveduras, usando o processo descrito por KurtzmanandRobnett em "Identification and Phylogeny of Ascomycetous Yeasts from Analysisof NuclearLarge Subunit (26S) Ribosomal DNA Partial Sequences", Antonie van Leeuwenhoek 73:331-371, 1998, aqui incorporado por referência (daqui por diante "Kurtzman and Robnett 1998").Ver especialmente, p. 349 e 361. Análise do domínio D1/D2 variável do ADN ribossômico26S de centenas de ascomicetes revelou que a clade I. orientali / I. terrícola contem espé-cies relacionadas de perto. Membros da clade I. orientalis /I. terrícola exibem maior similari-dade no domínio D1/D2 variável do ADN ribossômico 26S para aquele de outros membrosda clade do que para aquela de espécies de leveduras fora da clade. Por isso, outro mem-bros da clade L. orientalis / I. terrícola podem ser identificados através de comparação dosdomínios D1/D2 de seu respectivo ADN ribossômico e comparando àquele de outros mem-bros da clade e espécies relacionadas de perto fora da clade, usando processos de Kurtz-man and Robnett. Espécies de leveduras dentro de clade I. orientalis /I. terrícola são todasas leveduras hemiascomicetosas dentro da clade Pichia / Issatchenkia / Saturnispora / Dek-kera mais ampla. Uma outra classe de células hospedeiras de interesse é a clade I. orienta-lis / P. fermentans como descrita por Kurtzman and Robnett 1998. Esta clade é a clade maisimportante que contem pelo menos as espécies lssatchenkia orientalis, Pichia galeiformis,Pichia sp. YB-4149 (designação NRRL), Candida ethanolica, P. deserticola, P. membranifa-ciens e Ρ. fermentans.

Outras células hospedeiras de particular interesse são quaisquer daquelas de es-pécies contidas na clade Kluyveromyces de complexo Saccharomyces, como descrito (comoClade 11) na Figura 9 (p. 430) de Kurtzman and Robnett1 "Phylogenetic relationships among yeasts of the 'Saccharomyces complex' determined from multigene sequence analyses".FEMS Yeast Res. Vol. 4, pp. 417-432 (2003), aqui incorporado por referência, e na Figura 1de Kurtzmann, "Phylogenetic circumscription of Saccharomyces, Kluyveromyces and othermembrs of the Saccharomycetaceae..." FEMS Yeast. Res., Vol. 4, pp. 233-245 (2003) (daquipor diante "Kurtzman 2003"), aqui incorporado por referência. A clade Kluyveromyces inclui pelo menos as espécies S. kluyveri, K. aestuaryii, K. nonfermentans, K. lactic, K. marxianuse K. dobzhanskii, e pode incluir adicionais espécies classificáveis dentro desta clade usandoos processos de análise de seqüência de multi-genes descritos em Kurtzman 2003.

Tais células de leveduras são de particular interesse quando geneticamente modifi-cadas para produção de um ácido orgânico, especialmente lactato. Células hospedeiras dosgêneros Candida, Kluyveromyces and Ittatchenkia são genericamente preferidas. Célulashospedeiras das clades Kluyveromyces e I. orientalis / P. fermentans descritas anteriormen-te são particularmente preferidas, naquelas realizações onde a célula mutante produz umácido orgânico, assim como em casos onde a célula mutante produz um outro produto defermentação (tal como, por exemplo, etanol) em adição a ou ao invés de um ácido orgânico. Células hospedeiras especialmente preferidas são C. sonorensis, K. marxianus, K. thermo-tolerans, C. methanosorbosa, e I. orientalis. Células mais preferidas são K. marxianus, C.sonorensis, e I. orientalis. Quando primeiro caracterizada, a espécie I. orientalis recebeu onome Pichia kudriavzevii. O anamorfo (forma assexual) de I. orientalis é conhecida comoCandida krusei. Apropriadas linhagens de K. marxianus e C. sonorensis incluem aquelasdescritas em WO 00/71738 A1, WO 02/42471 A2, WO 03/049525 A2, WO 03/102152 A2, eWO 03/102201 A2. Linhagens apropriadas de I. orientalis são linhagem ATCC 32196 e li-nhagem ATCC PTA-6648.

Por "supressão ou interrupção" de um caminho metabólico, é pretendido que o ca-minho é tanto feito completamente inoperante, como também sua atividade é reduzida por pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 90%, em relação à célula tipo selvagem. Ati-vidade de um caminho pode ser reduzida através de redução de quantidade de enzima ativaque é produzida, através de redução de atividade da enzima que é produzida, ou algumacombinação de ambas. Por "supressão ou interrupção" de um gene é pretendido que a intei-ra região codificante do gene seja eliminada (supressão), ou a região dificante do gene, seu promotor, e/ou região terminadora é modificada (tal como por supressão, inserção, ou muta-ção) de modo que o gene não mais produz uma enzima ativa, o gene produz uma quantida-de severamente reduzida (redução de pelo menos 75%, preferivelmente redução de pelomenos 90%) da enzima ativa, ou o gene produz uma enzima com atividade severamentereduzida (pelo menos 75% reduzida, preferivelmente pelo menos 90% reduzida).

Na maioria dos casos, a supressão ou interrupção do caminho metabólico nativoenvolverá uma supressão ou interrupção de pelo menos um gene GPD1 pelo menos um ge-ne GPP1 ou ambos. Em células como S. pombe, que têm um caminho metabólico alternativobaseado em diidroxi acetona fosfato fosfatase e glicerol desidrogenase, a supressão ou in-terrupção do caminho metabólico nativo usualmente inclui'ra uma supressão ou interrupçãodo gene diidroxi acetona fosfato fosfatase, gene glicerol desidrogenase, ou ambos. Em célu-las tendo ambos caminhos, supressões ou interrupções de ambos caminhos podem ser rea-lizadas.

Os termos "gene glicerol-3-fosfato desidrogenase" e "gene GPD" são aqui usadospara referirem-se a (a) qualquer gene que codifica uma proteína com atividade glicerol-3-fosfato desidrogenase e/ou (b) qualquer seqüência de ADN cromossômico que codifica umaenzima que é pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60% e mais preferivelmentepelo menos 65% idêntica a qualquer uma das seqüências de aminoácidos identificadas co-mo SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7. "Atividade glicerol-3-fosfato desidrogenase" refere-se àhabilidade de uma proteína catalisar a reação de DHAP a glicero!-3-fosfato. Para propósitosdesta invenção, porcentagem de identidade de seqüências de aminoácidos de ADN, ARNou proteínas podem ser convenientemente computadorizadas usando BLAST (NCBI BasicLocal Alignment Search Tool) version software 2.2.1 com parâmetros default. Seqüênciastendo um escore de identidade de pelo menos XX%, usando o algoritmo BLAST version2.2.13 com parâmetros default, são consideradas pelo menos XX% idênticas. O softwareBLAST é disponível do National Centerfor Biological Information, Bethesda, Maryland.

Similarmente, "gene glicerol-3-fosfatase" e "gene GPP" são aqui usados para de-signarem (a) qualquer gene que codifica uma proteína com atividade glicerol-3-fosfatasee/ou (b) qualquer seqüência de ADN cromossômico que codifica uma proteína que é pelomenos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, e mais preferivelmente pelo menos 65% i-dêntica a qualquer uma das seqüências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NOs: 8,9, 10, 11 ou 12. "Atividade glicerol-3-fosfatase" refere-se à habilidade de uma proteína cata-lisar a desfosforilação de glicerol-3-fosfato para formar glicerol.

O termo gene "diidroxi acetona fosfato fosfatase" é aqui usado para representarqualquer gene que codifica uma proteína com atividade diidroxi acetona fosfato fosfatase.Gene "glicerol desidrogenase" é aqui usado para representar (a) qualquer gene codificandouma proteína com atividade glicerol desidrogenase e/ou (b) qualquer seqüência de ADNcromossômico que codifica uma proteína que é pelo menos 50%, preferivelmente pelo me-nos 60% e mais preferivelmente pelo menos 65% idêntica à seqüência de aminoácidos iden-tificada como SEQ ID NO:13. "Atividade diidroxi acetona fosfato fosfatase" refere-se à habi-Iidade de uma proteína catalisar a reação de diidroxi acetona fosfato e diidroxi acetona. "Ati-vidade glicerol desidrogenase" refere-se à habilidade de uma proteína catalisar a redução dediidroxi acetona a glicerol.

A supressão ou interrupção de qualquer um dos genes anteriores pode ser realiza- da através de evolução forçada, mutagênese, ou processos de engenharia genética, segui-do por apropriada seleção ou peneiramento para identificar os desejados mutantes.

Em processos de mutagênese células são expostas a radiação ultravioleta ou umasubstância mutagênica, sob condições suficientes para obter uma alta taxa de eliminação(60-99,9%, preferivelmente 90-99,9%) das células. Células sobreviventes são então revesti- das e selecionadas ou peneiradas para células tendo a atividade metabólica suprimida ouinterrompida. Células tendo a desejada mutação podem ser selecionadas nas bases de suareduzida habilidade para produzir glicerol. Interrupção ou supressão de qualquer um dosgenes anteriores pode ser confirmada através de processos de análises de PCR ou Sou-thern.

Engenharia genética para suprimir ou interromper o caminho metabólico para glice-rol é convenientemente realizada em uma ou mais etapas via o desenho e construção deapropriadas construções de supressão e transformação da célula hospedeira com aquelasconstruções. O termo "construção" é aqui usado para representar uma seqüência de ADNque é usada para transformar uma célula. A construção pode ser, por exemplo, na forma deum plasmídeo circular ou vetor, na forma de um plasmídeo Iinearizado ou vetor, pode seruma porção de um plasmídeo circular ou vetor (tal como é obtido através de digestão deplasmídeo ou vetor com uma ou mais enzimas de restrição), ou pode ser um produto PCRpreparado usando um plasmídeo ou vetor como um molde. Seleção ou peneiramento sesegue para identificar transformantes bem sucedidos. Processos de eletroporação e/ou detransformação química (tal como baseado em cloreto de cálcio - ou acetato de lítio) podemser usados.

A seguinte discussão de construção de supressão é igualmente aplicável à supres-são ou interrupção de qualquer um dos genes glicerol-3-fosfato desidrogenase, glicerol-3-fosfatase, diidroxi acetona fosfato fosfatase ou glicerol desidrogenase.

Uma construção de supressão é convenientemente montada através de primeiroclonagem de duas seqüências de ADN do gene alvo e/ou suas regiões flanqueantes à mon-tante (5') ou à jusante (3'). As seqüências são preferivelmente não-contíguas, mas podemser contíguas se adicional material genético (tal como um cassete marcador de seleção) épara ser interposto entre as mesmas na construção. Neste contexto, "não-contígua" significaque as seqüências de ADN não são imediatamente adjacentes umas às outras no genomatipo selvagem, mas ao invés são separadas umas das outras no genoma tipo selvagem poruma área que é para ser suprimida de modo a suprimir ou interromper o gene. Seqüências"contíguas" são diretamente adjacentes umas às outras no genoma tipo selvagem. Uma dasseqüências pode incluir uma região 5' para o promotor do gene alvo, toda ou uma porção daregião promotora, toda ou uma porção da região de codificação de gene alvo, ou algumacombinação das mesmas. A outra seqüência pode incluir uma região 3' para o terminador do gene alvo, toda ou uma porção da região terminadora, e/ou toda ou uma porção da regi-ão codificante de gene alvo. Uma construção de supressão é então produzida contendo asduas seqüências orientadas na mesma direção em relação uma à outra como elas apare-cem nativamente sobre o cromossoma da célula hospedeira. Tipicamente um marcador deseleção é clonado entre as seqüências para permitir seleção de transformantes, como des-crito mais inteiramente abaixo. Esta construção é usada para transformar a célula hospedei-ra. Processos de transformação química (tal como baseados em cloreto de cálcio ou acetatode lítio) e/ou eletroporação podem ser usados.

Em transformantes bem sucedidos, um evento de recombinação homóloga no localdo gene alvo resulta na interrupção ou a supressão do gene funcional. Todo ou uma porção do gene alvo nativo, seu promotor e/ou terminador é suprimido durante este evento de re-combinação. Se a construção de supressão contem material genético entre as duas se-qüências tomadas do local alvo (tal como um cassete marcador de seleção ou cassete degene estrutural), este material genético é inserido no genoma de célula hospedeira no localdo material suprimido. Análises por PCR ou análises Southern podem ser realizadas paraconfirmar que a desejada supressão ocorreu.

É usualmente desejável que a construção de supressão também possa incluir umcassete marcador de seleção funcional. Quando uma construção de supressão simples éusada, o cassete marcador reside sobre o vetor à jusante (isto é, na direção 3') da seqüên-cia 5' a partir de local alvo e à montante (isto é, na direção 5') da seqüência 3'a partir do local alvo. Transformantes bem sucedidos conterão o cassete marcador de seleção, queproporciona à célula transformada com sucesso alguma característica que provê uma basepara seleção. Um "gene marcador de seleção" é um que codifica uma proteína necessáriapara a sobrevivência e/ou crescimento da célula transformada em um meio de cultura seleti-vo. Genes marcadores de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, (tais como, por exemplo, zeocina (gene de resistência a ble-omicina ble de Streptoalloteichus huindustanus), G418 (gene de resistência a canamicina deTn903) ou higromicina (gene de resistência a antibiótico aminoglicosídeo de E. coli)), (b)deficiências auxotróficas de complemento da célula (como, por exemplo, deficiência de ami-noácido Ieucina (gene LEU2 K. marxianus) ou deficiência de uracila (por exemplo, geneURA3 de K. marxianus ou S. cerevisiae)); (c) permitem a célula sintetizar nutrientes críticosindisponíveis de meios simples, ou (d) conferem habilidade para a célula crescer sobre umaparticular fonte de carbono, (tal como um gene MEL5 de S. cerevisiae, que codifica a enzi-ma alfa galactosidase (melibiase) e confere a habilidade para crescer sobre melibiose comoa única fonte de carbono). Marcadores de seleção preferidos incluem o gene de resistênciaa zeocina, gene de resistência a G418, um gene MEL5 e gene de resistência a higromicina.Um outro marcador de seleção preferido é um cassete de gene L-lactato:ferricitocromo cóxido redutase (CYB2), contanto que a célula hospedeira tanto nativamente careça de umtal gene como que seu gene(s) CYB2 nativo seja primeiro suprimido ou interrompido.

O cassete marcador de seleção ainda incluirá seqüências promotoras e terminado-ras, ligadas operativamente ao gene marcador de seleção, e que são operáveis na célulahospedeira. Um tipo apropriado de promotor é pelo menos 50%, 70%, 90%, 95% ou 99%idêntico a um promotor que é nativo para um gene de levedura. Um tipo mais apropriado depromotor é pelo menos 50%, 70%, 90%, 95% ou 99% idêntico a um promotor para um geneque é nativo para a célula hospedeira. Promotores particularmente úteis incluem promotorespara genes piruvato descarboxilase (PDC1), fosfoglicerato cinase (PGK)1 xilose redutase((XR), xilitol desidrogenase (XDH), L-(+)-lactato citocromo c óxido redutase (CYB2), fator deelongação de tradução-1 (TEF-1) e fator de elongação de tradução-2 ((TEF-2), especialmen-te a partir dos respectivos genes da célula hospedeira. Um promotor especialmente útil incluia porção funcional de um promotor para um gene nativo PDC1, PGK, TEF1, ou TEF2 para acélula hospdeira, ou uma seqüência que é pelo menos 80, 85, 90 ou 95% idêntica a um talpromotor PDC1, PGK, TEF1 ou TEF2.

Um tipo apropriado de terminador é pelo menos 50%, 70%, 90%, 95% ou 99% idên-tico a um terminador para um gene que é nativo para um célula de levedura. O terminadorpode ser pelo menos 50%, 70%, 90%, 95% ou 99% idêntico a um terminador para um geneque é nativo para a célula hospedeira. Terminadores particularmente úteis para genes piru-vato descarboxilase (PDC1), xilose redutase (XR), xilitol desidrogenase (XDH), L-lactato:ferricitocromo c óxido redutase (CYB2) ou isso-2-citocromo c (CYC), ou um termina-dor da família galactose de genes em levedura, particularmente o assim chamado termina-dor GQAL10. Um terminador especialmente preferido inclui uma porção funcional de umterminador para um gene GAL10 nativo para a célula hospedeira, ou uma seqüência que épelo menos 80, 85, 90 ou 95% idêntica a um tal terminador.

A construção de supressão pode ser desenhada de modo que o cassete marcadorde seleção possa tornar-se espontaneamente suprimido como um resultado de um subse-qüente evento de recombinação homóloga. Um meio conveniente de realizar isto é dese-nhar o vetor de modo que o cassete de gene estrutural seja flanqueado por seqüências derepetição direta. Seqüências de repetição direta são seqüências de ADN idênticas, nativasou não nativas para a célula hospedeira, e orientadas sobre a construção na mesma direçãocom relação umas às outras. As seqüências de repetição diretas são vantajosamente decerca de 50-1500 pb em comprimento. Não é necessário que as seqüências de repetiçãodiretas codifiquem algo. Esta construção permite a ocorrência de um evento de recombina-ção homóloga. Este evento ocorre com alguma baixa freqüência, resultando em células con-tendo uma supressão do gene marcador de seleção e uma das seqüências de repetiçãodireta. Pode ser necessário desenvolver transformantes para vários ciclos sobre meios não- seletivos para permitir a espontânea recombinação homóloga ocorrer em algumas das célu-las. Células nas quais o gene marcador de seleção tornou-se espontaneamente suprimidopodem ser selecionadas ou peneiradas nas bases de sua perda da característica de seleçãoproporcionada pelo gene marcador de seleção.

A construção de supressão de gene alvo também pode conter um cassete de gene estrutural, novamente localizado à jusante da região flanqueante 5' e à montante da regiãoflanqueante 3', mas preferivelmente não dentro de qualquer cassete marcador de seleçãoque possa estar presente. Uma tal construção permite a simultânea supressão do gene alvoe inserção de um gene estrutural. Por "gene estrutural", é pretendido qualquer gene quecodifica uma proteína, outro que não o gene alvo ou um gene marcador de seleção como descrito acima. Uma ampla variedade de genes estruturais pode ser usada, mas aqueles departicular interesse para esta invenção são um gene que confere à célula a habilidade paraproduzir um ácido orgânico, ou um gene que confere à célula a habilidade de consumir umaparticular fonte de carbono, tal como um açúcar pentose.

Em casos onde um marcador de seleção é usado, a transformação pode ser reali-zada com par de construções de supressão ao invés de uma única construção de supres-são. Uma do par conterá a primeira seqüência a partir do local do gene alvo e uma partenão-funcional do cassete de gene marcador. A outra do par conterá a segunda seqüência apartir do local do gene alvo e uma outra parte não-funcional do cassete de gene marcador.As duas partes do cassete de gene marcador são selecionadas de modo que juntas elas formam um cassete completo. As extremidades de cada uma das duas partes do cassete degene marcador compartilham uma seqüência comum, isto é, uma porção do cassete é du-plicada nas extremidades de cada uma das duas partes. A célula é transformada simultane-amente com estes para realização de desejada supressão ou interrupção, com a formaçãode um cassete de gene estrutural ou marcador funcional, completo. Uma proporção das cé- lulas integrará homogeneamente ambas construções de supressão no local alvo, e serãopresas ainda em um evento de recombinação homóloga para reconstituição de um cassetede gene de seleção funcional a partir de dois fragmentos não-funcionais. Transformantesbem sucedidos podem ser selecionados nas bases da característica proporcionada pelomarcador de seleção.

Quando o caminho metabólico nativo da célula inclui o caminho diidroxi acetonafosfato para glicerol-3-fosfato para glicerol (via enzimas GDP e GPP), tanto o gene(s) GDPcomo gene(s) GPP pode ser suprimido ou interrompido. Ambos genes GDP e GPP podemser suprimidos. Em tal caso, a supressão ou interrupção de ambos genes GDP e GPP podeser feita simultânea ou seqüencialmente em qualquer ordem. Se a célula contem múltiplosgenes GDP ou GPP1 ou múltiplos alelos de tais genes, é preferido suprimir todos aquelesque são funcionais na célula. Em casos onde o caminho metabólico nativo de célula inclui ocaminho diidroxi acetona fosfato para diidroxi acetona para glicerol (via diidroxi acetona fos-fato fosfatase e glicerol desidrogenase), tanto o gene diidroxi acetona fosfato fosfatase comoglicerol desidrogenase pode ser suprimido ou interrompido. Ambos genes diidroxi acetonafosfato fosfatase ou glicerol desidrogenase podem ser suprimidos ou interrompidos, o quepode ser feito simultânea ou seqüencialmente, em cujo caso isto pode ser feito em qualquerordem. Como antes, múltiplas cópias funcionais ou alelos de tais genes são preferivelmentetodas suprimidas.Em certos aspectos da invenção, a célula é capaz de produzir um desejado ácidoorgânico (ou seu sal). Esta capacidade é manifestada através de uma habilidade para con-verter pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelomenos 80% ou pelo menos 90%, em peso de uma fonte de carbono ao desejado ácido or-gânico quando cultivada sob pelo menos um conjunto de condições de fermentação. Namedida em que poucas células de levedura têm a habilidade nativa para produzir tais áci-dos, a célula da invenção na maioria dos casos conterá pelo menos um gene exógeno, fun-cional, que permite à mesma produzir o ácido.Células de particular interesse produzem lactato, pelo que é pretendido ácido láticoou um seu sal. Em tal caso, a célula da invenção contem pelo menos um gene lactato desi-drogenase (LDH) exógeno funcional integrado em seu genoma. Um gene LDH é um quecodifica uma enzima lactato desidrogenase funcional. Uma enzima LDH funcional é uma quecatalisa a redução de piruvato a lactato. Genes LDH são específicos para a produção der L-LDH ou D-LDH, que respectivamente permite a célula produzir o enantiômero L- ou D-ácidolático (ou seus sais). É possível que a célula modificada da invenção contenha ambos genesL- e D-LDH, e assim seja capaz de produzir ambos enantiômeros de ácido lático. Entretanto,é preferido que somente genes L- ou somente D-LDH estejam presentes, de modo que acélula produza um produto ácido lático mais oticamente puro.Apropriados genes LDH incluem aqueles obtidos de fontes bacterianas, fungos, le-vedura ou mamífero. Exemplos de específicos genes L-LDH são aqueles obtidos de L. hel-veticus, L. casei, B. megaterium, P. acidilactici e fontes bovinas. Exemplos de específicosgenes D-LDH são aqueles obtidos de L. helveticus, L. johnsonii, L. bulgaricus, L. delbrueckii,L. plantarum, e L. pentosus. Genes funcionais que são idênticos ou pelo menos 80% idênti-cos a quaisquer destes genes L-LDH ou D-LDH são apropriados. Os genes nativos obtidosa partir de qualquer uma destas fontes podem ser submetidos a mutagênese se necessáriopara prover uma seqüência codificante partindo com o usual códon de partida eucariótico(ATG), ou para outros propósitos. Um gene L-LDH preferido é aquele obtido de L. helveticusou um que é pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a tal gene. Um outro gene L-LDHpreferido é aquele obtido de B. megaterium ou um que é pelo menos 80%, 85%, 90% ou95% idêntico a tal gene. Um gene D-LDH preferido é aquele obtido de L. helveticus ou um que é pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a tal gene.

Genes LDH particularmente apropriados incluem aqueles que codificam uma enzi-ma com uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 60%, especialmente pelo menos80%, 85% ou 95%, idêntica a SEQ ID NO: 45 de WO 03/049525 ou comparada com SEQ IDNO: 49 de WO 03/049525. Genes LDH particularmente apropriados também incluem aque- Ies que codificam uma enzima tendo uma seqüência de proteína que é pelo menos 60%,80%, 85% ou 95% idêntica a SEQ ID NO: 46 ou 50 de WO 03/049525.

A célula transformada pode conter um gene LDH simples ou múltiplos genes LDH,tal como de 1 a 10 genes LDH, especialmente de 1 a 5 genes LDH. Quando a célula trans-formada contem múltiplos genes LDH, os genes individuais podem ser copias do mesmogene, ou incluem cópias de dois ou mais diferentes genes LDH. Múltiplas cópias do geneLDH exógeno podem ser integradas em um Iocus simples (assim são adjacentes umas àsoutras), ou em vários Ioci dentro do genoma de célula hospedeira.

O gene LDH exógeno está sob controle transcricional de um ou mais promotores eum ou mais terminadores, ambos os quais são funcionais na célula de levedura modificada.Apropriados promotores e terminadores são como descritos antes com relação ao cassetede gene marcador de seleção, e também são descritos em WO 99/14335, WO 00/71738,WO 02/42471, WO 03/102201, WO 03/102152 e WO 03/049525. Um promotor especialmen-te útil inclui a porção funcional de um promotor para um gene PDC1, PGK, TEF1 ou TEF2da célula hospedeira ou é pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a um tal promotor. Um terminador especialmente preferido inclui uma porção funcional de um terminador paraum gene PDC1 da célula hospedeira ou é pelo menos 80%, 85%, 90%, ou 95% idêntico aomesmo.

Quando múltiplos genes LDHexógenos são introduzidos na célula hospedeira, épossível para os diferentes genes LDH estarem sob o controle de diferentes tipos de promo- tores e/ou terminadores.

O gene LDH exógeno pode ser integrado randomicamente no genoma da célulahospedeira ou inserido em uma ou mais localizações alvejadas. Exemplos de localizaçõesalvejadas incluem o Iocus de um gene que é desejavelmente suprimido ou interrompido, talcomo aquele de um gene PDC1, um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase, um gene glice- rol-3-fosfatase, um gene diidroxi acetona fosfato fosfatase ou um gene glicerol desidrogena-se. O cassete de gene LDH exógeno pode residir sobre uma construção para a supressãoou interrupção de um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase, glicerol-3-fosfatase, diidroxiacetona fosfato fosfatase ou glicerol desidrogenase, e desta maneira ser inserido no Iocusde um tal gene simultaneamente com a supressão ou interrupção do mesmo.

Processos para transformação de uma célula de levedura para introdução de umcassete de gene LDH exógeno são descritos em WO 99/14335, WO 00/71738, WO02/42471, WO 03/102201, WO 03/102152, e WO 03/049525. Tais processos são aplicáveisa esta invenção.

A célula também pode ser modificada para permitir que a mesma produza um oumais outros ácidos orgânicos. Por exemplo, a célula pode ser transformada com um cassetede gene exógeno que codifica uma enzima beta alanina / piruvato amino transferase Οποίο-nal, assim permitindo a célula produzir ácido 3-hidroxi propiônico. Processos para realizaçãodisto são descritos em WO 2005/118719.

A célula de levedura geneticamente modificada da invenção pode incluir adicionaismodificações genéticas que proporcionam um ou mais atributos desejados às células.

Uma modificação adicional de particular interesse em algumas realizações incluiuma supressão ou interrupção de gene(s) piruvato descarboxilase. Isto reduz a habilidadede célula produzir etanol, o que é particularmente desejável em casos nos quais um ácidoorgânico tal como Iactato é o produto desejado. Se a célula hospedeira contem múltiplosgenes PDC, é especialmente preferido suprimir ou interromper todos os genes PDC, emboraseja possível suprimir menos que todos tais genes PDC. Supressão de PDC pode ser reali- zada usando-se processos análogos àqueles descritos em WO 99/14335, WO 02/42471,WO 03/049525, WO 03/102152 e WO 03/102201. Supressão de PDC também pode ser rea-lizada com simultânea inserção de um cassete de gene LDH ou outro cassete de gene mar-cador de seleção ou estrutural. Em um processo de particular interesse, (1) seqüências não-contíguas a partir do Iocus do gene(s) PDC são clonadas, (2) uma construção contendo as seqüências não-contíguas é produzida, e (3) a célula hospedeira é transformada com aconstrução. Um evento recombinante homólogo resulta em uma supressão ou interrupçãodo gene PDC funcional em uma porção dos transformantes. Isto pode ser repetido se ne-cessário para suprimir ou interromper múltiplos genes PDC ou alelos. Em algumas espéciesde levedura, como I. orientalis, genes PDC múltiplos ou alelos existem que são homólogosde perto. Foi verificado que em pelo menos alguns exemplos seqüências não-contíguas to-madas do Iocus de gene ou alelo podem ser usadas na construção para suprimir ou inter-romper ambos genes PDC ou alelos. A construção usada para interromper o gene(s) PDCpode incluir um ou mais cassetes de gene estrutural ou marcador funcionais inseridos à ju-sante da porção flanqueante 5' do gene PDC nativo e à montante das porções flanqueantes 3' do gene PDC nativo. Esta abordagem permite a supressão do gene PDC e inserção docassete de gene funcional em uma etapa de transformação simples.

Uma outra modificação adicional de particular interesse é uma (ou mais) que indivi-dual ou coletivamente confere à célula a habilidade para fermentar açúcares pentose paradesejáveis produtos de fermentação. Entre o último tipo de modificações estão (1) inserçãode um gene xilose isomerase funcional, (2) uma supressão ou interrupção de um gene nati-vo que produz uma enzima que catalisa a conversão de xilose a xilitol, (3) uma supressãoou interrupção de um gene xilitol desidrogenase funcional e/ou (4) modificações que fazem acélula superexpressar uma xilulo cinase funcional. Processos para introdução daquelas mo-dificações em células de levedura são descritos, por exemplo, em WO 04/099381, aqui in-corporado por referência. Processos apropriados para inserção de um gene xilose isomera-se funcional, supressão ou interrupção de um gene nativo que produz uma enzima que cata-lisa a conversão de xilose a xilitol, supressão ou interrupção de um gene xilitol desidrogena-se funcional modificando a célula para superexpressão de uma xilulo cinase funcional sãodescritos, por exemplo, em WO 04/099381, aqui incorporado por referência.

Uma outra modificação adicional de particular interesse em células produzindo Iac-tato da invenção inclui uma supressão ou interrupção de pelo menos um gene L- ou D-lactato:ferricitocromo c óxido redutase.

Em geral, a célula da invenção é caracterizada por uma habilidade reduzida parasintetizar gliceroi. Um processo útil para avaliação de uma habilidade de célula para sinteti-zar glicerol é através de cultura da célula sob as condições micro-aeróbicas padrões descri-tas anteriormente. Um meio de fermentação definido é usado, que contem no início de cultu-ra 5 g/L de sulfato de amônio, 3 g/L de diidrogeno fosfato de potássio, 0,5 g/L de sulfato demagnésio, elementos em traços, vitaminas e 150 g/L de glicose. O pH é ajustado para 3,5no início de cultura. O pH é permitido variar livremente durante a cultura, exceto que o meioé tamponado se necessário para evitar que o pH caia abaixo de 3,0 ou eleve-se acima de7,0 durante a cultura. O meio de fermentação é inoculado com células de levedura suficien-tes que são o objeto da avaliação para produzir uma OD600 de 1.0. A temperatura de culturaé de 30°C. A cultura é continuada até a concentração de glicose ser reduzida para 5 g/L,mas não é continuada por mais que 120 horas. Durante a cultura, condições de aeração eagitação são selecionadas para produzirem uma taxa de tomada de oxigênio de 5,0 ±1,0mmol/L/h. Sob estas condições padrões, células da invenção tipicamente produzem nãomais que 2,0 g/L de glicerol. Mais tipicamente, elas produzem não mais que 0,6 g/L de glice-rol sob estas condições e na maioria dos casos produzem não mais que 0,2 g/L de glicerolsob estas condições. Células preferidas também produzem, sob estas condições micro-aeróbicas padrões, pelo menos 10 g/L de pelo menos um produto de fermentação desejável,tal como etanol, ou um ácido orgânico como lactato. As células mais preferivelmente produ-zem pelo menos 40 e especialmente pelo menos 50 g/L do desejado produto de fermenta-ção sob estas condições.

A célula da invenção pode ser cultivada, sob as condições micro-aeróbicas padrõesdescritas anteriormente ou qualquer outro conjunto útil de condições de fermentação, paraproduzir um ou mais desejáveis produtos de fermentação. Etanol é um exemplo de um pro-duto de fermentação que muitas espécies de leveduras produzem naturalmente. Como dis-cutido anteriormente, as células podem ser modificadas para permitir que as mesmas pro-duzam outros produtos de fermentação desejáveis, incluindo ácidos orgânicos como Iactatoou ácido 3-hidroxi propiônico. As células podem ser modificadas para produzirem tambémoutros produtos de fermentação, incluindo outros ácidos ou outros produtos que não sãoácidos.

No processo de fermentação da invenção, a célula da invenção é cultivada em ummeio de fermentação que inclui uma fonte de carbono que é fermentável pela célula trans-formada. A fonte de carbono pode ser um açúcar hexose tal como glicose, ou um oligômeroou outro polímero de glicose tal como glicano, maltose, maltotriose ou isomaltotriose. A fontede carbono pode ser um outro açúcar hexose, do qual panose, frutose e seus respectivosoligômeros e polímeros são exemplos. Se a célula nativamente tem ou é modificada paraproporcionar uma habilidade para fermentar açúcares pentose, a fonte de carbono podeincluir um açúcar pentose tal como xilose, ou um oligômero ou polímero de xilose como xila-no. Tais açúcares pentose são apropriadamente hidrolisados de uma biomassa contendohemicelulose. Em caso de açúcares oligoméricos, pode ser necessário adicionar enzimas aocaldo de fermentação de modo a digerir estes ao correspondente açúcar monomérico parafermentação pela célula.

O meio tipicamente conterá nutrientes como requeridos pela particular célula, inclu-indo uma fonte de nitrogênio (como aminoácidos, proteínas, fontes de nitrogênio inorgânicascomo amônia ou sais de amônio, e semelhantes), e várias vitaminas, minerais e semelhan-tes. Um assim chamado meio "complexo" ou um assim chamado meio "definido" pode serusado.

Outras condições de fermentação, como temperatura, densidade de célula, seleçãode substrato(s), seleção de nutrientes, e semelhantes não são consideradas serem críticaspara a invenção e são genericamente selecionadas para provimento de um processo eco-nômico. Temperaturas durante cada uma da fase de crescimento e a fase de produção podevariar de acima de temperatura de congelamento do meio a cerca de 50°C, embora isto de-penda em alguma extensão da habilidade da linhagem tolerar temperaturas elevadas. Umatemperatura preferida, particularmente durante a fase de produção, é de cerca de 30-45°C.

Durante a fase de produção, a concentração de células no meio de fermentação es-tá tipicamente na faixa de 0,1 a 20, preferivelmente de 0,1 a 5, mesmo mais preferivelmentede 1 a 3 g de células secas / litro de meio de fermentação. A fermentação pode ser conduzi-da aerobicamente, micro-aerobicamente, ou anaerobicamente. Se desejado, taxa de tomadade oxigênio pode ser usada como um controle de processo, como descrito em WO03/102200. Células da invenção podem desempenhar especialmente bem quando cultiva-das sob condições micro-aeróbicas caracterizadas por uma taxa de tomada de oxigênio de 4a 12, especialmente de 5 a 10, mmoles/L/h.

Em casos preferidos nos quais a célula produz um ácido orgânico tal como lactato,o meio pode er tamponado durante a fase de produção da fermentação de modo que o pHseja mantido em uma faixa de cerca de 3,5 a cerca de 9,0, ou de cerca de 4,5 a cerca de7,0. Apropriados agentes tamponantes são materiais básicos que neutralizam o ácido namedida em que ele é formado, e incluem, por exemplo, hidróxido de cálcio, carbonato decálcio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio, carbonato de sódio,carbonato de amônio, amônia, hidróxido de amônio e semelhantes. Em geral, aqueles agen-tes tamponantes que têm sido usados em processos de fermentação convencionais tambémsão apropriados aqui.

Em uma fermentação tamponada, produtos de fermentação ácidos são neutraliza-dos ao correspondente sal quando eles são formados. Recuperação do ácido por isso en-volve regeneração do ácido livre. Isto é tipicamente feito através de remoção de células eacidulação de caldo de fermentação com um ácido forte tal como ácido sulfúrico. Um sub-produto sal é formado (gypsum no caso onde um sal de cálcio é o agente neutralizante eácido sulfúrico é o agente acidulante), que é separado do caldo. O ácido é então recuperadodo caldo através de técnicas tais como extração líquido - líquido, destilação, absorção, etc.,como são descritas em Τ. B. Vickroy, Vol. 3, Chapter 38 of Comprehensive Biotechnology,(ed. M. Môo-Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta, et al., FEMS Microbiol. Rev., 1995,16:221-231; patentes U.S. Nos. 4 275 234, 4 771 001, 5 132 456, 5 420 304, 5 510 526, 5641 406 e 5 831 122, e WO 93/00440.

Alternativamente, o pH do meio de fermentação pode ser deixado cair durante acultura a partir de um pH de partida que está acima de pKa do ácido produto, tipicamente5,5 ou maior, para ou abaixo de pKa do produto de fermentação ácido, tal como na faixa decerca de 1,5 a cerca de 3,5, na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 3,0, ou na faixa de cerca de1,5 a cerca de 2,5.

Também é possível conduzir-se a fermentação para produzir um produto ácido a-través de ajuste de pH do caldo de fermentação para ou abaixo de pKa do ácido produtoantes de ou no início do processo de fermentação. O pH a seguir pode ser mantido no ouabaixo do pKa do ácido produto por toda cultura, ou pode ser deixado aumentar acima depKa do ácido quando a fermentação procede. No caso anterior, o pH é preferivelmente man-tido dentro de faixa de cerca de 1,5 a cerca de 3,5, na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 3,2,ou na faixa de cerca de 2,0 a cerca de 3,0.

A célula da invenção tem uma habilidade agudamente reduzida de produzir glicerolsob muitas condições de fermentação. A reduzida habilidade da célula de produzir glicerol émanifestada por baixos rendimentos de glicerol. As células da invenção tipicamente metabo-Iizam menos que 2% em peso da fonte de carbono que é consumida a glicerol. Na maioriados casos, o rendimento de glicerol é menos que 1% ou mesmo menos que 0,1%, baseadono peso de fonte de carbono que é consumido na cultura. Preferivelmente, a célula metabo-Iiza pelo menos 40%, tal como pelo menos 50, 60, 70, 80 ou 85%, da fonte de carbono queé consumida para o desejado produto de fermentação.

Foi verificado que as células da invenção exibem boa habilidade para crescimentosob condições de fermentação. Isto é surpreendente, devido aos vários usos da célula paraglicerol e o papel de glicerol ser acreditado desempenhar no balanço de NADFH/NAD+ em células de levedura tipo selvagem. Está dentro do escopo da invenção adicionar glicerol aomeio de fermentação para compensar a diminuída capacidade de célula produzir glicerol porsi própria. Entretanto, os requerentes verificaram que assim fazendo rende pequeno benefí-cio, pelo menos em alguns processos de fermentação.

Os exemplos que se seguem são providos para ilustrarem a invenção, mas não são pretendidos limitarem seu escopo. Todas as partes e porcentagens são em peso a menosque de outro modo indicado.

Exemplo 1A:Mutagênese de K. marxianus linhagem CD607 e seleção de linhagemmutante (CD853) tendo resistência a ácido glicólico

K. marxianus linhagem CD607 é descrita no exemplo 3D de WO 03/102152. Esta linhagem tem uma supressão de seu gene piruvato descarboxilase e uma inserção de umgene Iactato desidrogenase exógeno naquele locus. Células de linhagem CD607 são sub-metidas a mutagênese via exposição a luz ultravioleta.

Células de uma placa de YP fresco (extrato de levedura plus peptona) + 20 g/L gli-cose são re-suspensas em 2 mL de peptona levedura + 50 g/L glicose para uma OD600 a-proximada de 6. Dez alíquotas de 125 μί desta suspensão de células são pipetadas em dezcavidades de uma placa de micro - titulação de 96 cavidades de 300 μί. A placa de micro -titulação é exposta a 12500 μϋουΐβ/αη2 de luz UV para matar 90-99% das células. A placade micro - titulação é então incubada no escuro por toda noite a 30°C com agitação (225rpm) para permitir que as células se recuperem antes de revestimento sobre placas de sele-ção.

100 μl das suspensões de células tratadas com UV são então revestidos sobreuma placa de agar de dextrose de batata (PDA) + 15 g/L de ácido glicólico para selecionarlinhagens resistentes a ácido glicólico. Estas placas são incubadas a 30°C por vários diasaté aparecimento de colônias.Uma colônia simples é isolada para ainda análises.

Aproximadamente 2 χ 108 células mutagenizadas são revestidas sobre placas PDAcontendo 15 g/L de ácido glicólico e incubadas a 30°C. Colônias que crescem sobre estasplacas são desenvolvidas por toda noite em frascos de agitação defletidos a 30°C e 225rpm, de agitação em YP (peptona levedura) +100 g/L glicose sem tampão. Frascos de pro-dução são então inoculados com 2 g/L de peso seco de células a partir destes frascos deagitação. Os frascos de produção são cultivados a 30°C e 70 rpm de agitação em YP + 50g/L de glicose. Amostras são periodicamente retiradas para medição de glicose, lactato, e-tanol e piruvato por HPLC usando processos tais como descrito no Exemplo 1M de WO03/102201. Uma linhagem que produz cerca de 26 g/L de lactato após 88 horas é designadacomo linhagem CD635. Linhagem CD635 é capaz de crescer sobre lactato como a únicafonte de carbono.

Células de linhagem CD635 são submetidas a uma adicional etapa de mutagênesecomo descrito acima. As resultantes células mutagenizadas são selecionadas para colôniasque são capazes de crescerem sobre PDA contendo 25 g/L de ácido glicólico. Colônias quesão resistentes a ácido glicólico são desenvolvidas separadamente por toda noite em YP +100 g/L de glicose em frascos de agitação a 30°C e 250 rpm de agitação. Biomassa é cole-tada por centrifugação e 2 g/L em peso de células secas são inoculados em 50 mL de YP +50 g/L de glicose em um frasco de agitação defletido. Os frascos são cultivados a 30°C e250 rpm de agitação por aproximadamente 92 horas. Um mutante que produz títulos finaissignificantemente maiores de lactato, comparado a linhagens parentes CD607 e CD635, édesignado como linhagem CD853.

Linhagem CD853 é incapaz de crescer sobre lactato como a única fonte de carbo-no, sugerindo que o gene L-lactato:ferricitocromo c óxido redutase (KmCYB2) tornou-senão-funcional neste mutante. Por isso, a região codificando KmCYB2 plus -500 pb e à ju-sante da região codificante KmCYB2 é amplificada a partir desta linhagem, usando PCRcom enzima FaiISafe de alta fidelidade e ADN genômico como o molde. O resultante produ-to de PCR de -2,75 kbp é purificado via purificação em coluna Qiagen e seqüenciado sobrea inteira região codificante KmCYB2. Linhagem CD853 é verificada ter uma inserção de qua-tro bases em posição de aminoácido 62 do gene KmCYB2, que causa uma mutação dedesvio de quadro, resultando em um códon de interrupção na posição de aminoácido 76 etruncando a proteína.

Exemplo 1B:Construção de vetores de supressão GPD1F pBH158 (Fig. 1) e p-BH159 (Fig. 2)

Um plasmídeo designado pVR29 (descrito no Exemplo 1C e Figura 4 de WO03/102152) contem o gene de resistência canamicina de Tn903 (gene G418) sob o controlede um promotor piruvato descarboxilase e um terminador GAL10. Plasmídeo pVR29 é dige-rido com Mlul e Pstl e um fragmento de 5,1 kbp contendo o cassete de gene G418 assimobtido é purificado em gel e desfosforilado. Uma região de 1,2 kbp de ADN à montnate dogene GPD de K. marxianus (KmGDPIF) é amplificada por PCR usando iniciadores identifi-cados como SEQ ID NO. 14 e SEQ ID NO. 15, com ADN genômico de K. marxianus comoum molde. O produto de PCR é purificado em gel, digerido com Mlul e Pstl. e ligado aofragmento de 5,1 kbp de plasmídeo pVR29 para produzir um plasmídeo designado comopBH158 (Fig. 1). Plasmídeo pBH158 contem, em ordem de transcrição, o flanco à montantede 1,2 kbp do gene KmGPDIF e o cassete de expressão G418.

Para o segundo vetor de supressão, plasmídeo pVR29 é digerido com NgoMIV eAatll e um fragmento de 4,7 kbp contendo o cassete de expressão G418 é purificado em gele desfosforilado. Uma região de 0,7 kbp de ADN à jusante do gene KmGPDI F é amplificadapor PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 16 e SEQ ID NO. 17, novamen-te usando ADN genômico de K. marxianus como um molde. O produto de PCR é purificadocom gel, digerido com NgoMIV e Aatll, e ligado ao fragmento de 4,7 kbp de pVR29 paraproduzir um plasmídeo designado como pBH159 (Fig. 2). Plasmídeo pBH159 contem, emordem de transcrição, o cassete de expressão G418 e o flanco à jusante de 0,7 kbp do geneKmGPDI F.

Exemplo 1 C:Transformação de Iinagem CD853 (Ex. 1A) com plasmídeos pBH158 epBH159 (Ex. 1B, Figs. 1 e 2) para produzir um transformante (linhagem CD1606) tendo umgene LDH exógeno, uma supressão de um gene PDC nativo, um gene CYB2 nativo inter-rompido e um gene GPD1F nativo suprimido

Plasmídeo pBH158 é digerido com Mlul e HindllI. Estas enzimas de restrição cor-tam o plasmídeo para produção de um fragmento de 2,6 kbp que contem o flanco à montan-te de 1,2 kbp do gene KmGPDIF e parte do cassete de expressão G418. Este fragmento éisolado a partir de um gel agarose. Plasmídeo pBH159 é digerido com Xhol e NgoMIV. Es-tas enzimas de restrição cortam o plasmídeo para produção de um fragmento de 2,0 kbpque contem uma porção do cassete de expressão G418 e o flanco à jusante de 0,7 kbp dogene KmGPDI F. Este fragmento é isolado a partir de um gel agarose. Os dois fragmentosisolados juntos contêm o inteiro cassete de expressão G418 com alguma duplicação nasextremidades dos fragmentos.

Linhagem CD853 é crescida por toda noite em YP + 60 g/L de glicose + MES 0,2 M+ etanol 1%, pH 6,5, e é eletroporada simultaneamente com o fragmento de 2,6 kbp deplasmídeo pBH158 e o fragmento de 2,0 kbp de pBH159. Transformantes são selecionadossobre placas de YP + 20 g/L de glicose + 300 μg/mL de G418 a 30°C seguindo 2 dias decrescimento. 15 transformantes são colhidos, novamente feitos listras para placas de YP +20 g/L de glicose + G418 e crescidos por toda noite. Somente células que foram co-transformadas com ambos fragmentos e nas quais ambos fragmentos tornaram-se homolo-gamente integrados no Iocus KmGPD1F serão resistentes a G418.

Supressão do gene KmGPD1F é verificada por PCR usando iniciadores identifica-dos como SEQ ID NO. 18 e SEQ ID NO. 19. Sete transformantes exibem uma banda sim-ples de 3,4 kbp através de PCR, indicando que o gene KmGPD1F é suprimido naquelestransformantes. Um destes transformantes é designado como linhagem CD1606.Exemplo 2A:Construção de vetores de supressão de gene GPP pBH160 (Fig. 3) epBH161 (Fig. 4).Plasmídeo pVR29 é digerido com Mlul e Kpnl e um fragmento de 5,1 kbp contendoo cassete de gene G418 assim obtido é purificado com gel e desfosforilado. Uma região de0,9 kbp de ADN imediatamente à montante do gene GPP nativo (gene KmHOR2) é amplifi-cada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 20 e SEQ ID NO. 21, u-sando ADN genômico de K. marxianus como o molde. O produto de PCR é é purificado comgel, digerido com Mlul e Kpnl1 e ligado ao fragmento de 5,1 kbp de plasmídeo pVR29 paraproduzir um plasmídeo designado como pBH160 (Fig. 3). Plasmídeo pBH160 contem, emordem de transcrição, o flanco à montante de 0,9 kbp do gene KmHOR2 e o cassete de ex-pressão de G418.Plasmídeo pVR29 é digerido com NgoMIV e Spel e um fragmento de 4,7 kbp con-tendo o cassete de expressão G418 é purificado em gel e desfosforilado. Uma região de 0,8kbp de ADN imediatamente à jusante do gene KmHOR2 é amplificada por PCR usando ini-ciadores identificados como SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23, usando ADN genômico de K.marxianus como o molde. O produto de PCR é purificado com gel, digerido com NgoMIV eSpel, e ligado ao fragmento de 4,7 kbp de pVR29 para produzir um plasmídeo designadocomo pBH161 (Fig. 4). Plasmídeo pBH161 contem, em ordem de transcrição, o cassete deexpressão G418 e o flanco à jusante de 0,8 kbp do gene KmHOR2.Exemplo 2B:Transformação de linhagem CD853 (Ex. 1A) com plasmídeos pBH160e pBH161 (Ex. 2A, Figs. 3 e 4) para produzir um transformante (linhagem CD1608) tendoum gene LDH exógeno, uma supressão de um gene PDC nativo, um gene CYB2 nativo in-terrompido e um gene GPP nativo suprimido.Plasmídeo pBH160 é digerido com Mlul e Hindlll. Estas enzimas de restrição cor-tam o plasmídeo para produção de um fragmento de 2,3 kbp que contem o flanco à montan-te de 0,9 kbp do gene GPP de K. marxianus ((KmHOR2) e parte do cassete de expressãoG418. Este fragmento é isolado a partir de um gel agarose. Plasmídeo pBH161 é digeridocom Xhol e NgoMIV. Estas enzimas de restrição cortam o plasmídeo para produção de umfragmento de 2,0 kbp que contem o flanco à montante de 0,8 kbp do gene KmHOR2 e partedo cassete de expressão G418. Este fragmento é isolado de um gel agarose. Os dois frag-mentos isolados contêm juntos o inteiro cassete de expressão G418 com alguma duplicaçãonas extremidades dos fragmentos.Linhagem CD853 é crescida por toda noite em YP + 60 g/L de glicose + MES 0,2 M35 + etanol 1%, pH 6,5, e é então eletroporada com ambos, o fragmento de 2,3 kbp de plasmí-deo pBH160 e o fragmento de 2,0 kbp de plasmídeo pBH161. Transformantes são selecio-nados sobre placas de YP + 20 g/L glicose + 300 μg/mL G418 a 30°C seguindo 2 dias decrescimento. 15 transformantes são feitos novamente listras para placas de YP + 20 g/Lglicose + 300 μg/mL G418 e crescidos por toda noite. Todos os transformantes crescemsobre este meio. Somente células que foram co-transformadas com ambos fragmentos enas quais ambos fragmentos tornaram-se homologamente integrados no Iocus KmHOR2serão resistentes a G418.

Supressão do gene KmHOR2 é verificada por PCR usando iniciadores identificadoscomo SEQ ID NO. 20 e SEQ ID NO. 21. Três transformantes renderam uma banda de 3,8kbp simples que é indicativa da supressão do gene KmHOR2. Um destes transformantes édesignado linhagem CD1608.

Exemplo 3:Cultivo de cultura em batelada micro - aeróbica de linhagens CD853(Ex. 1A), CD1606 (Ex. 1C) e CD1608 (Ex. 2B).

Linhagens CD853, CD1606 e CD1608 são separadamente cultivadas sob condi-ções micro - aeróbicas. Fermentações em duplicata são realizadas nos casos de linhagensCD1606 e CD1608. Em cada caso, um reator de cultura de batelada de estágio simples éusado. O meio de fermentação é um meio definido que inclui sulfato de amônio, diidrogenofosfato de potássio, e sulfato de magnésio, elementos em traços, vitaminas, agente anties-pumante, e cerca de 90 g/L de glicose. O pH do meio é ajustado para cerca de 3,0 atravésde adição de hidróxido de potássio. O meio é ajustado para 30°C e inoculado com 1 mL decélulas. As células são cultivadas a 30°C sob condições de agitação e aeração que condu- zem a uma taxa de tomada de oxigênio de 5-6 mmoles/L/h. Taxa de tomada de oxigênio édeterminada de acordo com os processos descritos em WO 03/102200.

Amostras do caldo de fermentação são periodicamente removidas e ensaiadas paralactato, acetato, glicerol e piruvato. Produção de dióxido de carbono é medida através dedeterminação de teor de dióxido de carbono de gases ventilados do reator.

Linhagem CD853 (não um exemplo da invenção) produz lactato em uma taxa de0,85 g/L-h através de estágios iniciais da fermentação, até o título de lactato ser aproxima-damente 20 g/L. Rendimento de lactato através deste ponto é cerca de 70%. Após este,produção de lactato diminui para cerca de 0,76 g/L-h e rendimento de lactato cai levemente.Produção para esta linhagem é interrompida após 86 horas, em cujo tempo o caldo de fer- mentação contem g/L de glucose. Título de lactato é 59 g/L. Taxa de produção de lactatototal é 0,65 g/L-h, e rendimento total de lactato é 70%. Rendimentos para piruvato, acetato,glicerol e dióxido de carbono para linhagem CD853 são 0,6%, 0%, 5,1% e 14%, respectiva-mente. Rendimento para biomassa é de 6,4%.

Linhagem CD1606 produz lactato em uma taxa de 0,77-0,84 g/L-h através de está-gios iniciais da fermentação, até o título de lactato ser aproximadamente 20 g/L. Rendimentode lactato através daquele ponto é cerca de 72-80%. Após isto, produção de lactato diminuipara cerca de 0,39-0,41 g/L-h e rendimento de lactato cai levemente. Produção para estalinhagem é interrompida após 137 horas, em cujo momento o caldo de fermentação contem14-19 g/L de glicose. Título de Iactato é 43-45 g/L. Taxa de produção de Iactato total é 0,32-0,34 g/L-h, e rendimento total para Iactato é de 60-63%. Rendimentos para piruvato, acetato,glicerol e dióxido de carbono para linhagem CD1606 são 0,1%, 0,5%, 0% e 26-29%, respec-tivamente. Rendimento para biomassa é de 7,9%. Estes resultados mostram que supressãodo gene KmGPDIF nativo é efetiva para interromper a capacidade de célula produzir glice-rol. Surpreendentemente, a supressão deste gene (e a resultante falta de produção de glice-rol) tem pequeno ou nenhum efeito sobre crescimento de célula.

Linhagem CD1608 produz Iactato em uma taxa de 0,66 g/L-h através de estágios i- niciais da fermentação, até o título de Iactato ser aproximadamente 20 g/L. Rendimento deIactato através deste ponto é cerca de 70-75%. Após isto, produção de Iactato diminui paracerca de 0,37 g/L-h e rendimento de Iactato cai levemente. Produção para esta linhagem éinterrompida após 137 horas, em cujo momento o caldo de fermentação contem 19 g/L deglicose. Título de Iactato é de 42 g/L. Taxa de produção total de Iactato é de 0,31 g/L-h, e rendimento total para Iactato é 59-60%. Rendimentos para piruvato, acetato, glicerol e dióxi-do de carbono para linhagem CD1608 são 0,0-0,1%, 0,8%, 0% e 26-28%, respectivamente.Rendimento para biomassa é 7,9-8,2%. Estes resultados mostram que supressão do geneKmHOR2 nativo também é efetiva para interromper a capacidade de célula produzir glicerol.Novamente, a supressão deste gene (e a resultante falta de produção de glicerol) não tem efeito sobre crescimento de célula.

Exemplo 4A:Clonagem de gene GPD1 nativo de I. orientalis junto com região flan-queante à montante e à jusante

Genes glicerol-3-fosfato desidrogenase conhecidos de várias espécies de leveduras(S. cerevisiae, K. Marxianus, Y. Iipolytica1 P. jadinii, D. hansenii e C. glabrata) são alinhados e regiões que são altamente conservadas entre os vários genes são identificadas. Dois con-juntos de iniciadores degenerados foram desenhados nestas regiões de alta homologia. Es-tes conjuntos são identificados como SEQ ID NO. 24 e SEQ ID NO. 25, e SEQ ID NO. 26 eSEQ ID NO. 27, respectivamente. PCR é realizada usando o primeiro conjunto de iniciado-res e ADN genômico de L. orientalis como o molde, e um produto de ~200 pb é obtido comoesperado. PCR é novamente realizada usando o segundo conjunto de iniciadores e ADNgenômico de I. orientalis como o molde, e um produto de -400 pb é obtido como esperado.Os dois produtos de PCR são purificados com gel e seqüenciados usando os mesmos inici-adores. Usando a seqüência parcial assim obtida, iniciadores são desenhados para cami-nhada de genoma. Caminhada de genoma é realizada usando o BD Clontech Genome Wal- king Kit de acordo com as instruções do fabricante, usando iniciadores de PCR primáriosidentificados como SEQ ID NO. 28 e SEQ ID NO. 29 e iniciadores de PCR aninhados identi-ficados como SEQ ID NO. 30 e SEQ ID NO. 31. Seqüências obtidas de ambas caminhadasde genoma à montante e à jusante são Iinhadas e fundidas com a seqüência parcial previa-mente obtida para construir o gene glicerol-3-fosfato desidrogenase de I. orientalis.

Exemplo 4B:Construção de um plasmídeo (pMM28, Fig. 5) contendo o cassete degene KmCYB2 entre seqüências de repetição direta de K. thermotolerans.

O inteiro cassete de gene CYB2 (KmCYB2) de K. marxianus, incluindo regiõespromotoras e terminadoras, é amplificado PCR a partir de ADN genômico de um K. marxia-nus tipo selvagem linhagem designada como CD21, com introdução de sítios de restriçãoBamHI e Sall1 através de PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 32 e SEQID NO. 33. O produto de PCR é ligado a um vetor comercial designado como pUC18 (deInvitrogen Corp., Carlsbad, Ca, USA) que é digerido com BamHI e Sall. O plasmídeo resul-tante é designado como pMM25.

Uma seqüência de 705 pb identificada como SEQ ID NO. 34 é amplificada por PCRa partir de ADN genômico de K. thermotolerans, com introdução de sítios de restrição Sphl eSall, usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 35 e SEQ ID NO. 36. Esta seqüên-cia de K. thermotolerans não codifica qualquer proteína ativa. Plasmídeo pMM25 é digeridocom Sphl e Sall e a seqüência de K. thermotolerans é ligada ao mesmo à montante (5') docassete KmCYB2 para formar um plasmídeo designado como pMM27.

Uma seqüência de K. thermotolerans idêntica é amplificada por PCR com adição desítios de restrição BamHI e Xmal, usando primers identificados como SEQ ID NO. 37 e SEQID NO. 38. Plasmídeo pMM27 é digerido com BamHI e Xmal e a seqüência de K. thermoto-lerans é ligada ao mesmo à jusante (3') a partir do cassete KmCYB2 para formar um plas-mídeo designado como pMM28 (Fig. 5). Plasmídeo pMM28 contem o cassete KmCYB2flanqueado por seqüências de repetição direta de K. thermotolerans, ambas orientadas namesma direção.

Exemplo 4C:Construção de um plasmídeo (pMI321, Fig. 7) contendo um cassete degene higromicina e um cassete de gene LDH de L. helveticus

Um fragmento de sonda de 920 pb do gene PGK1 de C. sonorensis é obtido deADN genômico de C. sonorensis na mesma maneira como descrito no Exemplo 22 de WO02/042471, usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 39 e SEQ ID NO. 40. ADNgenômico é isolado de uma linhagem de I. orientalis em crescimento e re-suspenso em Tris-HCI 10 mM + EDTA 1 mM (pH 8) (TE). O ADN genômico de I. orientalis é cortado com Hin-dlll e um Southern blot é prpearado e hibridizado usando processos padrões com o genePGK1 de C. sonorensis como uma sonda. Fragmentos de tamanho de ~2 kb são isolados degel agarose e clonados em um plasmídeo de corte Hindlllpara gerar uma biblioteca fracio-nada em tamanho, que é transformada em E. coli. Hibridização de col'Aonia da bibliotecafracionada em tamanho com a sonda PGK1 resulta em isolamento de um plasmídeo con-tendo um fragmento Hindlll com maioria das seqüências codificando proteína PGK1 (I-oPGK1) de I. orientalis mas nenhuma seqüência promotora, como verificado através de se-qüenciamento.

Fragmentos genômicos contendo a região promotora IoPGK1 são obtidos com am-plificação PCR mediada por ligação (Mueller, P.R. e Wold1 B. 1989, "In vivo footprinting of amuscle specific enhancer by Iigation mediated PCR". Science 246:780-786). Uma mistura deum Iigador identificado como SEQ ID NO. 41 e um Iigador identificado como SEQ ID NO. 42é ligada a ADN genômico de I. orientalis digerido com Haelll com T4 ADN Iigase (New En-gland BioLabs). Amostras das misturas de ligação são usadas como moldes para reaçõesPCR de 50 μΐ_ contendo 0,1 μΜ de um iniciador identificado como SEQ ID NO. 43 e 1 μΜ deum iniciador identificado como SEQ ID NO. 44. A mistura de reação é aquecida a 94°C por 3minutos após 2 U de Dynazyme EXT serem adicionadas. As reações são são feitas ciclos30 vezes como se segue: 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 68° e 2 minutos a 72°C, com umaextensão final de 10 minutos a 72°C. Uma amostra diluída desta primeira amplificação PCRé usada como o molde em uma reação PCR aninhada (50 μΙ_) contendo 0,05 μΜ de um ini-ciador identificado como SEQ ID NO. 45 e 0,5 μΜ de um iniciador identificado como SEQ IDNO. 46. A mistura de reação é aquecida a 94°C por 3 minutos após 2 U de Dynazyme EXTserem adicionadas. As reações são feitas ciclos 30 vezes como se segue: 1 minuto a 94°C,2 minutos a 67°C e 2 minutos em 72°C, com uma extensão final de 10 minutos a 72°C.

Um fragmento de PCR de -600 pb é isolado e seqüenciado. Iniciadores aninhadosidentificados como SEQ ID NO. 47 e SEQ ID NO. 48 são desenhados e usados em umaamplificação PCR mediada com ligação junto com oligonucleotídeos identificados comoSEQ ID NO. 49 e SEQ ID NO. 50 similarmente como acima, exceto que ADN de I. orientalisdigerido com Sspl é usado e a PCR é realizada usando uma temperatura de anelamento de65°C.

A região promotora PGK1 de I. orientalis é amplificada por PCR usando primers i-dentificados como SEQ ID NO. 51 e SEQ ID NO. 52 e o ADN genômico de I. orientalis comoo molde. O fragmento é enchido usando a enzima Klenow e então cortado com Xbal. Umfragmento de 633 pb é isolado com gel e ligado a um fragmento de 4428 pb obtido por di-gestão de um plasmídeo designado como pMI270 (descrito em Fig. 4 de WO 03/049525)com Xhol, enchendo o fragmento usando a enzima Klenow e dNTP 0,1 mM, e digerindo comXbal. Plasmídeo pMI270 contem o gene higromicina de E. coli ligado a um promotor PGK1de C. sonorensis e um terminador GAL10 de S. cerevisiae. O resultante plasmídeo é desig-nado pMI318 (Fig. 6). Plasmídeo pMI318 contem o gene higromicina de E. coli sob o contro-le do promotor PGK1 de I. orientalis e o terminador GAL10 de S. cerevisiae.

O promotor PGK1 de I. orientalis é amplificado por PCR usando iniciadores identifi-cados como SEQ ID NO. 53 e SEQ ID NO. 54 e ADN genômico de I. orientalis como o mol-de. O fragmento é enchido usando a enzima Klenow e dNTP 0,1 mM, e então corte comNcol. Um fragmento de 633 pb é isolado com gel. Plasmídeo pVR1 (descrito em WO03/102152, Figura 7) contem o gene LDH de L. helveticus sob o controle do promotor TEF1de S. cerevisiae e o terminador CYC1 de S. cerevisiae. Plasmídeo pVR1 é digerido comXhol, enchido usando a enzima Klenow1 e corte com Ncol. Um fragmento de 7386 pb deplasmídeo pVR1 é ligado ao fragmento de promotor IoPGKI de 633 pb. O plasmídeo resul-tante é designado pMI320. Plasmídeo pMI320 contem o gene LDH de L. helveticus sob ocontrole do promotor IoPGKI e terminador CYC1 de S. cerevisiae.

Plasmídeos pMI318 e pMI320 são digeridos com Apal e Notl. Um fragmento de5008 pb de plasmídeo pMI318 é ligado a um fragmento de 1995 pb de plasmídeo pMI320para formar plasmídeo pMI321 (Fig. 7).

O gene higromicina (e seu terminador) é posicionado sobre plasmídeo pMI321 en-tre duas cópias do promotor IoPGKI, que servem como seqüências de repetição direta.

Exemplo 4D:Construção de um plasmídeo (pMI355, Fig. 8) tendo o cassete de genehigromicina de E. coli, o cassete de gene LDH de L. heleticus, e a região flanqueante 5' I-oPDCIA

Uma biblioteca genômica de IvOrientaIis tipo selvagem linhagem ATCC PTA-6658 éconstruída no vetor cosmídeo SuperCosI (Stratagene) de acordo com instruções providaspelo fabricante. Seqüências semelhantes PDC são amplificadas por PCR a partir de ADNgenômico da linhagem com iniciadores designados como SEQ ID NO. 55 e SEQ ID NO. 56.

Um fragmento de 700 pb de um gene PDC é amplificado. A biblioteca genômica é separadausando técnicas de hibridização com fragmentos de PCR marcados como a sonda comodescrito em WO 03/049525 e clones cosmídeos contendo o gene PDC são isolados e se-qüenciados. A região 5' PDC1A de I. orientalis a partir de 1000 pb para 167 pb à montantedo início do quadro de leitura aberto é amplificada por PCR usando iniciadores identificadoscomo SEQ ID NO. 57 e SEQ ID NO. 58 e o ADN cosmídeo PDC1A de I. orientalis como omolde. O fragmento é cortado com Sall e Saci. Um fragmento de 836 pb é isolado com gel eligado a um fragmento de 6992 pb obtido por digestão de plasmídeo pMI321 ((Fig. 7, Exem-plo 4C) com Sall e Saci. O resultante plasmídeo é chamado pMI355 (Fig. 8).

Exemplo 4E:Construção de plasmídeos (pMI356 e pMI357 (Fig. 9)) contendo a re-gião flanqueante 5' loPDCIA, o cassete de gene higromicina de E. coli, o cassete de geneLDH de L. helveticus, e uma região flanqueante 3' loPDCIA.

A região 3' PDC1A de I. orientalis correspondendo a seqüências de 524 pb à mon-tante para 217 pb à jusante do códon de interrupção de tradução PDC é amplificada porPCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 59 e SEQ ID NO. 60 e o ADN cos-mídeo PDC1A de I. orientalis (Exemplo 4D) como o molde. O fragmento é cortado com Apale Smal. Um fragmento de 630 pb é isolado com gel e ligado a um fragmento de 7809 pbobtido por digestão de plasmídeo pMI355 (Fi. 8, Ex. 4D) com Apal e Smal. O resultanteplasmídeo é chamado pMl357 (Fig. 9). Ele contem cassetes higromicina e LDH de plasmí-deo pMI355 entre o flanco 5' e uma porção do flanco 3' do gene IoPDCI A.

Plasmídeo pMl356 é construído da mesma maneira, exceto uma diferente seção daregião 3'PDC1A de l. orientalis é usada.

Exemplo 4F:Construção de plasmídeo pMl433 (Fig. 10 contendo a região flanque-ante 5' loPDC1A, um cassete de gene ScMELõ, o cassete de gene LDH de L. helveticus e aregião flanqueante 3' loPDCI A.

O promotor PGK1 de l. orientalis é amplificado por PCR usando primers identifica-dos como SEQ ID NO. 61 e SEQ ID NO. 62 e o ADN genômico de l. orientalis como o mol-de. O fragmento é enchido usando a enzima Klenow e dNTP 0,1 mM, e então cortado comSphl. Um fragmento de 669 pb é isolado com gel. Um plasmídeo designado como pMl233(descrito na Fig. 23C de WO 03/049525) é cortado com Xhol. O fragmento é enchido com aenzima Klenow e cortado com Sphl. Os fragmentos de 4534 pb e 669 pb são ligados e oresultante plasmídeo é chamado pMI319. Plasmídeo pMl319 contem o gene MEL5 (Sc-MEL5) de S. cerevisiae e a região promotora loPGK1.

Plasmídeo pMl319 é cortado com Apal, tornado de extremidade embotada com T4polimerase, e cortado com Notl. Um fragmento de 2317 pb é isolado com gel. Ele é ligado aum fragmento de 6498 pb obtido através de digestão de plasmídeo pMl357 (Exemplo 4E)com Sall, tornando o mesmo embotado na extremidade com a enzima Klenow e então cor-tando com Notl. O resultante plasmídeo contem o gene ScMEL5 (com seu terminador nati-vo) no lugar do gene higromicina de plasmídeo pMl357. O resultante plasmídeo é designadopMl433 (Fig. 10).

Exemplo 4G:Construção de plasmídeos pMl449 (Fig. 11) e pMl454 (Fig. 12) con-tendo região flanqueante 5' CYB2 de l. orientalis, cassete de gene ScMEL5 entre seqüên-cias de reptição direta de K. thermotolerans e região flanqueante 3' CYB2 de l. orientalis.

Plasmídeo pMM28 (Fig. 5, Ex. 4B) é digerido com BamHl, enchido com a enzimaKlenow, e digerido com Sall. O fragmento de 4077 pb assim obtido é ligado a um fragmentoNotl (enchido com enzima Klenow)-Sall de 2317 pb de pMl433 (Fig. 10, Ex. 4F). O resultan-te plasmídeo é designado pMl445.

A região flanqueante 3' do gene L-lactato:ferricitocromo c óxido redutase (loCYB2A)de l. orientalis (correspondendo a seqüências 90 a 676 pb à jusante do início do quadro deleitura aberto previsto) é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ IDNO. 63 e SEQ ID NO. 64, usando um clone cosmídeo CYB2-2 como um molde. O produtode PCR é digerido com Sacl e Smal e o fragmento de 607 pb é ligado ao fragmento Sacl-Smal de 6386 pb de plasmídeo pMl445. O resultante plasmídeo é designado pMI448.

A região flanqueante 5' loCYB2A (correspondendo a seqüências de 913 a 487 pb àmontante do início do quadro de leitura aberto previsto) é amplificada por PCR usando inici-adores identificados como SEQ ID NO. 65 e SEQ ID NO. 66, novamente usando o clonecosmídeo CYB2-2 como um molde. O produto de PCR é digerido com Sphl e o fragmentode 454 pb é ligado ao fragmento de 6993 pb Sphl obtido através de digestão parcial depMI448. O resultante plasmídeo é designado pMI449 (Fig. 11).

A região flanqueante 5' loCYB2A (correspondendo a seqüências de 466 a 7 pb àmontante do quadro de leitura aberto previsto) é amplificada por PCR usando iniciadoresidentificados como SEQ ID NO. 67 e SEQ ID NO. 68, novamente usando o clone cosmídeoCYB2-2 como o molde. O produto de PCR é digerido com Sphl e o fragmento de 493 pb éligado ao fragmento Sphl de 6993 pb obtido através de digestão parcial de plasmídeopMI448. O resultante plamídeo é designado pMI453.

A região flanqueante 3' loCYB2A (correspondendo a seqüências de 402 pb à mon-tante a 77 pb à jusante do códon de interrupção previsto) é amplificada por PCR usandoiniciadores identificados como SEQ ID NO. 69 e SEQ ID NO. 70, usando o cosmídeo CYB2-2 como um molde. O produto de PCR é digerido com Apal e Smal e o fragmento de 506 pbé ligado ao fragmento Apal-Smal de 6886 pb de plasmídeo pMI453. O resultante plasmídeoé designado pMI454 (Fig. 12).

Exemplo 4H:Construção de um plasmídeo (pBH165, Fig. 13) contendo um fragmen-to à montante do gene IoGPDI, uma primeira seção de repetição direta de K. thermotole-rans, um cassete de gene MEL5, uma segunda seção de repetição direta de K. thermotole- rans, e um fragmento à jusante do gene IoGPDI.

Plasmídeo pMI449 é digerido com Ndel e Sbfl para excisar a homologia flanquean-te CYB2A. Um fragmento de 6,8 kbp é purificado com gel e desfosforilado. Um fragmento de302 pb do gene IoGPDI de Exemplo 4A (correspondendo a pares de bases 1-302 a partirde códon de inicíco do gene) é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 71 e SEQ ID NO. 72. O produto de PCR é purificado com gel, digerido comNdel e Sbfl, e ligado ao fragmento de 6,8 kbp de plasmídeo pMI449 para produzir plasmídeopBH164. Plasmídeo pBH164 é então digerido com Xmal e EcoRI para excisar a homologiaflanqueante CYB2A 3'. Um fragmento de 6,5 kbp é purificado com gel e desfosforilado. Umfragmento de 346 pb do gene IoGPDI de Exemplo 4A (correspondendo a pares de bases 322-668 a partir do códon de partida) é amplificado por PCR usando iniciadores identifica-dos como SEQ ID NO. 73 e SEQ ID NO. 74. O produto de PCR é purificado com gel, digeri-do com Xmal e EcoRI, e ligado ao fragmento de 6,5 kbp obtido de pBH164 para produzirpBH165 (Fig. 13).

Plasmídeo pBH165 contem, em ordem de transcrição, o fragmento de 302 pb do gene IoGPDI, uma primeira seção de repetição direta de K. thermotolerans, um cassete degene MEL5, uma segunda seção de repetição direta de K. thermotolerans, e o fragmento de346 pb do gene IoGPDI. Ele é desenhado para inserção no Iocus do gene IoGPDI nativo(com interrupção do gene), seguido por um loop-out do cassete de gene MEL5.

Exemplo 4l:Geração de um mutante de I. orientalis (CD1184) com genes loPDCIAe IoPDCIB suprimidos e gene LhLDH integrado em uma etapa através de transformação delinhagem de I. orientalis tipo selvagem com plasmídeo pMI356 (Ex. 4F).

I. orientalis tipo selvagem linhagem ATCC PTA-6658 é transformada com plasmí-deo pMI356 usando processos padrões. Linhagens transformadas que crescem sobre pla-cas de higromicina são cultivadas. Um transformante que não produz etanol é selecionadopara Southern analysis, que confirma a supressão de ambos alelos loPDCIA e inserção depelo menos uma cópia do gene LhLDH. Esta linhagem é designada CD1184.

Exemplo 4J:Geração de linhagem mutante de I. orientalis (CD 1496) através de trans-formação sucessiva de linhagem CDl 184 (Ex. 41) com plasmpMI449 (Ex. 4G, Fig. 11) epMI454 (Ex. 4G, Fig. 12), seguido por mutagênese.

Linhagem CDl 184 é transformada com plasmídeo pM449 usando o processo de ace-tato de lítio e transformantes (colônias azuis) são selecionados baseado em atividade melibia-se sobre placas YPD X-a-gal. A substituição do gene IoCYB2A de linhagem CDl 184 é con-firmada por PCR de colônia e análise Southern em alguns dos transformantes. O marcadorMEL5 é looped out de um daqueles transformantes via um evento de recombinação homólogaatravés de seqüências de repetição de K. thermotolerans, como confirmado por análise Sou-thern. O segundo alelo CYB2A é então suprimido deste transformante usando plasmídeopMI454. Transformantes são analisados por PCR de colônia para a ausência de um produto dePCR específico de CYB2A de 1000 pb. O marcador MEL5 de plasmídeo pMI454 é loopedout de um transformante tendo uma supressão do segundo alelo CYB2A via recombinaçãocomo antes. Este transformante é designado linhagem CD1436. Linhagem CD1436 tem umasupressão de ambos genes PDCl (com substituição através de um cassete de gene L-LDHfuncional), e uma supressão de cada um de seus dois genes IoCYB2 nativos.

Linhagem CD1436 é submetida a mutagênese SEM usando as condições mostra-das no Exemplo 1A, exceto que as condições de exposição são 8 μί por 1 hora. Célulasmutagenizadas são deixadas em recuperação por 6 horas em 200 μί de meio YP + 20 g/Lglicose e então revestidas sobre placas de PDA + 35 g/L de ácido lático e incubadas poruma semana a 30°C. Uma linhagem que produz mais Iactato e menos glicerol que linhagemCD1436 é designada linhagem CD1496.

Exemplo 4K:Transformação de linhagens CD1184 (Ex. 41) e CD1496 (Ex. 4J) complasmídeo pBH165 (Ex. 4H, Fig. 13), seguido por loop-out do marcador de seleção paraproduzir linhagens transformantes CD1667 e CD1671, respectivamente, que têm um aleloGPD1 simples suprimido.

Linhagem CD1184 é crescida e transformada com 5 μg do fragmento de 4,4 kbpobtido através de digestão de plasmídeo pBH165 com Ndel e EcoRI. Transformantes sãoselecionados sobre placas de base nitrogênio levedura (YNB) + 2% melibiose revestidascom x-a-gal(~4-cloro-3-indolil-aD-galacto piranosídeo). Transformantes de cor azul são visí-veis após ~4 dias de crescimento a 30°C. Oito transformantes são retirados e revestidospara colônias simples sobre placas de YP + 20 g/L de glicose contendo χ-α-gal. Uma colôniaazul simples para cada transformante é retirada e novamente feita tira para placas de YP +20 g/L de glicose. ADN genômico é isolado dos transformantes. Interrupção de um alelo dogene IoGPDI é verificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 75 eSEQ ID NO. 76. Cinco transformantes exibem o esperado produto de ~2 kb. Um daquelestransformantes é designado como linhagem CD1655. Interrupção de uma cópia do geneIoGPDI nativo é ainda verificada por PCR usando iniciadores designados como SEQ ID NO.77 e SEQ ID NO. 78.

Linhagem CDI655 é crescida por vários rounds em YP + 100 g/L glicose a 30°C.Uma série de diluições é revestida sobre placas YP + 20 g/L (??) revestidas com χ-α-gal, ecrescidas por toda noite a 30°C. Uma colônia branca (indicativa do loop-out do cassete mar-cador MEL 5) é selecionada e novamente feita listra para placas de YP + 20 g/L glicose + x-α-gal. Uma colônia branca é selecionada. Interrupção de um alelo do gene IoGPDI nativo éverificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 69 e SEQ ID NO. 80.Este transformante é designado como linhagem CD1667.

Linhagem CD1496 é transformada da mesma maneira. Um transformante exibindoa esperada banda de ~2 kbp em PCR é designada como linhagem CD1657. Interrupção deum alelo do gene IoGPDI nativo é verificada por PCR como descrito para linhagemCD1655. Linhagem CD1657 é ainda crescida por vários rounds, e uma colônia mostrandouma supressão do cassete de gene marcador MEL5 é selecionada e designada como Iinha-gem CD1671. lnterrupção9 de um alelo do gene IoGPDI nativo é verificada por PCR comoantes.

Exemplo 4L:Transformação de linhagens CD1667 (Ex. 4K) e CD1671 (Ex. 4K) complasmídeo pBH165 (Ex. 4H, Fig. 13) para produzir linhagens transformantes CD1688 eCD1690, respectivamente, com ambos alelos loGPDI suprimidos.

Linhagem CD1667 é transformada com 5 μg de um fragmento de 4,4 kbp obtido a-través de digestão de plasmídeo pBH165 com Ndel e EcoRI. Transformantes são selecio-nados sobre placas de YNB + 2% melibiose revestidas com χ-α-gal. Transformantes de corazul são visíveis após ~4 dias de crescimento a 30°C. Dez transformantes são retirados erevestidos para colônias simples sobre placas de YP + 20 g/L de glicose contendo χ-α-gal.

Uma colônia azul simples para cada transformante é retirada e novamente feita listra paraplacas de YP + 20 g/L glicose. ADN genômico é isolado dos transformantes. Interrupção dosegundo alelo do gene IoGPDI é verificada em três transformantes por PCR usando inicia-dores identificados como SEQ ID NO. 81 e SEQ ID NO. 82. Um destes transformantes édesignado como linhagem CD1688.

Linhagem CD1671 é transformada da mesma maneira. PCR mostra que o segundoalelo do gene IoGPDI é interrompido em um transformante, que é designado linhagemCD1690.

Exemplo 5:Cultivação de cultura de batelada micro-aeróbica de linhagens CD1184(Ex. 41) e CD1688 (Ex. 4L) em uma OUR de 5,5-5,6.

Um reator de cultura de batelada de estágio simples contendo um meio definidoque inclui sulfato de amônio, diidrogeno fosfato de potássio, e sulfato de magnésio, elemen-tos em traços, vitaminas, agente antiespumante, e cerca de 50 g/L de glicose é inoculadocom 1 mL de linhagem CD1688. O pH do meio é ajustado para cerca de 3,5 antes de adiçãodas células. O pH da cultura é deixado cair para 3,0 quando células crescem e começam aproduzir ácido lático. A seguir, pH é mantido em cerca de 3,0 através de adição de hidróxidode potássio. Glicose é alimentada para a fermentação em cerca de 1-2 g/L/h até um total de136,1 g/L de glicose terem sido adicionados, células são cultivadas a 30oC sob condiçõesde aeração que conduzem a uma taxa de tomada de oxigênio de ,cerca de 5,5-5,6 mmo-les/L/h.

Linhagem CD1688 produz Iactato em uma taxa de 1,02 g/L-h até o título de Iactato ser apro-ximadamente 70 g/L. Rendimento de Iactato através deste ponto é cerca de 74%. Produçãopara esta linhagem é interrompida após 77 horas, em cujo momento o caldo de fermentaçãocontem 15,3 g/L de glicose. Taxa de produção total de Iactato é de 1,06 g/L-h, e rendimentototal para Iactato é de 70%. Rendimentos para piruvato, glicerol e dióxido de carbono paralinhagem CD1688 são 1,9%, 0% e 23,7%, respectivamente. Rendimento para biomassa éde 3,5%.

Para comparação, linhagem CD1184 (não um exemplo da invenção) é cultivadasob condições similares. Linhagem CD1184 produz Iactato em uma taxa de 1,24 g/L-h até otítulo de Iactato ser aproximadamente 70 g/L. Rendimento de Iactato através deste ponto éde cerca de 74%. Produção para esta linhagem é interrompida após 77 horas, em cujo mo-mento o caldo de fermentação contem 15,3 g/L de glicose. Taxa de produção total de Iactatoé de 1,06 g/L-h, e rendimento total para Iactato é de 70%. Rendimentos para piruvato, glice-rol e dióxido de carbono para linhagem CD1184 são 2,1%, 9,3% e 15,9%, respectivamente.Rendimento para biomassa é de 3,2%.

Estes resultados mostram que sob estas condições de fermentação, supressão dosgenes IoGPDI nativos evita que a célula produza quantidades mensuráveis de glicerol. Co-mo antes, a supressão deste gene (e a resultante falta de produção de glicerol) tem peque-no ou nenhum efeito sobre crescimento de célula.

Exemplo 6:Cultivo de cultura de batelada micro - aeróbica de linhagens CD1184(Εχ. 41) e CD1688 (Εχ. 4L) em uma OUR de 9,9-10.

Linhagens CD1688 e CD1184 são cultivadas separadamente na maneira genéricadescrita no exemplo 5, exceto que condições de aeração são selecionadas para conduzirema uma taxa de tomada de oxigênio de 9,9-10,0 mmoles/L/h, e nenhuma glicose é alimentadapara o sistema durante a cultura. Cascas de levedura são adicionadas à cultura de linhagemCD1688.

Sob estas condições, linhagem CD1184 produz Iactato em uma taxa de 1,87 g/L-haté o título de Iactato ser aproximadamente70 g/L. Rendimento de Iactato através deste pon-to é de cerca de 73%. Produção para esta linhagem é interrompida após 67,5 horas, em cujo momento a concentração de glicose no caldo de fermentação foi reduzida de 60 g/Lpara 2,1 g/L. Taxa de produção total de Iactato é de 1,43 g/L-h, e rendimento total para Iac-tato é de 70%. Rendimentos para piruvato, glicerol e dióxido de carbono para linhagemCD1184 são 2,1%, 5,7% e 21,5%, respectivamente. Rendimento para biomassa é de 4,4%.

Linhagem CD1688 produz Iactato em uma taxxa de 1,68 g/L-h até o título de Iactato ser aproximadamente 70 g/L. Rendimento de Iactato através deste ponto é cerca de 80%.Produção para esta linhagem é interrompida após 78 horas, em cujo momento a concentra-ção de glicose no caldo de fermentação foi reduzida de 53,5 g/L para 4,8 g/L. Taxa de pro-dução total de Iactato é de 1,26 g/L-h, e rendimento total para Iactato é de 77%. Rendimen-tos para piruvato, glicerol e dióxido de carbono para linhagem CD1688 são 1,2%, 0% e 23,2%, respectivamente. Rendimento para biomassa é de 5,9%. Como antes, estes resulta-dos mostram que sob estas condições de fermentação, supressão dos genes IoGPDI nati-vos evita que a célula produza quantidades mensuráveis de glicerol e que a supressão des-te gene (e a resultante falta de produção de glicerol) não tem efeito sobre crescimento decélula. Em adição, supressão de IoGPDI aperfeiçoa rendimento total de lactato.

Exemplo 7:Cultivos de cultura em batelada micro - aeróbica de linhagem CD1690(Ex. 4L) em uma OUR de 5-6.

Linhagem CD1690 é cultivada na maneira genérica descrita no exemplo 5, excetoque condições de aeração são selecionadas para conduzirem a uma taxa de tomada deoxigênio de 5,75 mmoles/L/h, e o meio de fermentação é YP + 70 g/L glicose.

Sob estas condições, linhagem CD1690 produz lactato em uma taxa de 0,66 g/L-haté o título de lactato ser aproximadamente 70 g/L. Rendimento de lactato através desteponto é de cerca de 78%. Produção para esta linhagem é interrompida após 121 horas, emcujo momento a concentração de glicose no caldo de fermentação foi reduzida para 23,8 g/L(fora de 127,9 g/L providos para a cultura). Taxa de produção total de lactato é de 0,61 g/L- h, e rendimento total para lactato é de 77%. Rendimentos para piruvato, glicerol, e dióxidode carbono são 0%, 0% e 31,1%, respectivamente. Rendimento para biomassa é de 2,4%.Novamente, estes resultados mostram que sob estas condições de fermentação, supressãode ambos alelos IoGPDI nativos evita que a célula produza quantidades mensuráveis deglicerol, e tem pequeno ou nenhum efeito sobre crescimento de célula.

A linhagem CD1690 é cultivada mais duas vezes na maneira genérica descrita noExemplo 5 (usando o meio definido ali descrito), exceto que a OUR é de 5,2 mmoles/L/h eglicerol é adicionado ao caldo de fermentação. Na primeira corrida, 0,1 g/L de glicerol é adi-cionado e 1,0 g/L de glicerol é adicionado na segunda corrida.

Quando 0,1 g/L de glicerol é adicionado, linhagem CD1690 produz Iactato em umataxa de 0,74 g/L-h até o título de Iactato ser aproximadamente 70 g/L. Rendimento de Iactatoatravés deste ponto é de cerca de 78%. Produção para esta linhagem é interrompida após121 horas, em cujo momento a concentração de glicose no caldo de fermentação foi reduzi-da para 10,2 g (fora de 117,8 g/L providos para a cultura). Taxa de produção total de Iactatoé de 0,68 g/L-h, e rendimento total para Iactato é de 76%. Rendimentos para piruvato, glice-rol e dióxido de carbono são 0,2%, 0% e 25,3%, respectivamente. Rendimento para biomas-sa é de 4,1%.

Resultados muito similares são obtidos quando 1,0 g/L de glicerol é adicionado.

Estes resultados mostram inesperadamente que a adição de glicerol ao meio defermentação tem pequeno ou nenhum efeito sobre a habilidade destes transformantes cres-cerem e produzirem lactato, à despeito de interrupção da habilidade nativa da célula paraproduzir glicerol.

Exemplo 8A:Construção de um plasmídeo (pTMC61 (Fig. 14)) contendo a regiãoflanqueante 5' IoGPDI, o cassete de gene higromicina de E. coli entre repetições diretas, ea região flanqueante 3' IoGPDI.

O cassete de gene higromicina é amplificado por PCR usando iniciadores identifi-cados como SEQ ID NO. 83 e SEQ ID NO. 84, com plasmídeo pMI356 (Ex. 4E, ver Fig. 9)como o molde. Condições de PCR são 95°C por 5 minutos (uma vez), 30 ciclos de 95°C (30segundos), 56°C (30 segundos) e 72°C (2 minutos), seguido por um ciclo de 72°C por 10minutos. O resultante produto de PCR é digerido com Spel e Sall, e ligado sobre plasmídeopBH165 (Ex. 4H, Fig. 13), que foi similarmente digerido, para produzir plasmídeo pTMC61(Fig. 14).

Exemplo 8B:Transformação de linhagem de I. orientalis tipo selvagem selecionadacom plasmídeo pBH165 (Ex. 4H, Fig. 13), seguido por loop-out do marcador de seleção paraproduzir linhagem transformante CD2624, que tem um alelo GPD1 simples suprimido.

I. orientalis tipo selvagem linhagem ATCC PTA-6658 é crescida por muitas gera-ções em cultura contínua em um meio contendo uma baixa concentração de glicose e umaalta concentração de ácido lático. Uma célula que cresce bem sob estas condições é isoladae designada como linhagem CD1822. Linhagem CD1822 produz etanol e glicerol quandocultivada em um meio contendo glicose como a fonte de carbono. A linhagem CD1822 édesenvolvida e transformada com plasmídeo pBH165 da mesma maneira como descrito noExemplo 4K. Transformantes são selecionados sobre placas de base nitrogênio levedura(YNB) + 2% melibiose revestidas com χ-α-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galacto pirano-sídeo), como descrito no exemplo 4K, com uma colônia azul sendo retirada e feita novamen-te listra para placas de YP + 20 g/L de glicose. ADN genômico é isolado do transformante, eanalisado para integração da construção de supressão através de dois conjuntos de reaçõesPCR. O primeiro destes usou iniciadores designados como SEQ ID NO. 85 e SEQ ID NO.86, e o segundo destes foi realizado com iniciadores designados como SEQ ID NO. 87 eSEQ ID NO. 88. Estes produziram produtos de PCR de 2,0 kbp e 1,4 kbp, respectivamente, indicando que um dos alelos GPD1 foi rompido. Uma terceira reação PCR é realizada, u-sando iniciadores designados como SEQ ID NO. 85 e SEQ ID NO. 88; isto produz um pro-duto de 0,8 kbp indicando que um alelo GPD1 não-rompido está ainda presente no trans-formante. O transformante é designado como linhagem CD2624.

Exemplo 8C:Transformação de linhagem CD2624 (Ex. 8B) com plasmídeo pTMC61(Ex. 8A, Fig. 14) para produzir linhagens transformantes CD2627, tendo ambos alelos I-oGPD1 suprimidos

PCR é realizada usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 89 e SEQ IDNO. 90, com plasmídeo pTMC61 como o molde. Um fragmento de 4,1 kbp é obtido, e é u-sado para transformar linhagem CD2624. Transformantes são selecionados sobre YPD +300 μg/mL de higromicina. ADN genômico é isolado de 100 dos transformantes, e usadocomo um molde em três conjuntos de reações PCR. O primeiro usa iniciadores identificadoscomo SEQ ID NO. 91 e SEQ ID NO. 88, e produz um produto de 1,5 kbp em 30 dos trans-formantes. Uma segunda reação PCR é conduzida sobre ADN genômico daqueles 30 trans-formantes, usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 85 e SEQ ID NO. 92. Dezlinhagens exibiram o esperado produto de 2,5 kbp. ADN genômico daquelas dez linhagens éentão analisado usando iniciadores identificados como SEQ ID NO. 85 e SEQ ID NO. 88.Duas linhagens que não produzem um fragmento de 0,8 kbp têm ambos alelos GPD1 inter-rompidos. Estas são testadas para crescimento sobre placas de YNB + 2,0% melibiose.Uma linhagem é capaz de crescer, e é designada como linhagem CD2627.

Exemplo 8D:Cultivo micro - aeróbico de linhagem CD1822, linhagem CD2624 (E-xemplo 8B) e linhagem CD2627 (Exemplo 8C).

Linhagens CD1822, CD2624 e CD2627 são cultivadas em fermentações em frascode agitação micro - aeróbica em duplicata. As linhagens são crescidas por toda noite em 25mL de um meio definido contendo -100 g/mL de glicose, a 30°C e agitação de 250 rpm em frascos defletidos de 250 mL. O meio definido é como descrito em Peter M. Bruinenberg1Johannes P. Van Dijken and W. Alexander Schefferes, 1983, An Enzymatic Analysis ofNADPH Production and Consumption in Candida utilis, J. General Microbiology vol. 129, pp.965-971, exceto para a presença de adicional glicose como indicado e um aumento em áci-do nicotínico para 5 mg/L.

As resultantes culturas são usadas para inoculação de 50 mL do meio definido con-tendo 100 g/L de glicose em frascos defletidos de 250 mL para uma OD600 de 0,2. Estesfrascos são então incubados em 100 rpm por 22 horas a 30°C. O meio é então analisado porHPLC para glicose, glicerol e etanol. Rendimento para biomassa também é determinado.

Linhagem CD1822 consome toda glicose durante a cultura de 22 horas, produzindo6,0 g/kg de glicerol, 34,54 g/kg de etanol e biomassa para uma OD600 de 14,8.

Linhagem CD2624, que tem uma interrupção de um alelo GPD1, consome toda gli-cose, produzindo 5,88 g/kg de glicerol e 35,25 g/kg de etanol. Biomassa é produzida parauma OD600 de 14,5.

Linhagem CD2627, que tem uma interrupção de ambos alelos GPD1, consome12,39 g/kg da glicose durante 22 horas. Produção de glicerol é de 0,34 g/kg. Produção deetanol é de 23,06 g/kg e biomassa é produzida para uma OD600 de 11,5. Estes resultadosindicam que interrupção dos alelos GPD1 em I. orientalis resulta em uma pequena reduçãoem taxas de consumo de glicose, e uma pequena redução em produção de etanol e produ-ção de biomassa, sob estas condições. Entretanto, linhagem CD2627 cresce bem e produzetanol bem, com mínima produção de glicerol. Os resultados ainda indicam que a habilidadedos supressores GPD1 crescerem e produzirem não é dependente da interrupção de ativi-dade PDC ou a adição de um caminho a partir de piruvato para lactato.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Natureworks LLC

pundon, Catherine AslesonSuomi nen, Pi rkkoAristidou, AristosRush, Brian 3.Koivuranta, KariHause, Benjamin MatthewMcMuliin, Thomas W.Roberg-Perezt Kevi η

<120> "CÉLULAS DE LEVEDURA TENDO CAMINHO INTERROMPIDO A PARTIR DEDIIDROXIACETONA FOSFATO PARA GLICEROL"

<130> 1206A WO

<150> 60/781,674<151> 2006-03-13

<160> 92

<17 0> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 415

<212> PRT

<213> issatchenkia orientalis

<220>

<221> miscL_feature

<222> (14) .. (14)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid<220>

<221> misc_feature

<222> (161)..(161)

<223> Xaa can be any natural!y occurring amino acid<220>

<221> misc_feature

<222> (272)..(272)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid<220>

<221> misc_feature

<222> (287)..(287)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid<220>

<221> misc_feature

<222> (347)..(347)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 1

Met Phe Leu Ile Ser Lys ser Leu His Phe Thr Arg ser Xaa Ser Asn1 5 10 15

Thr lie Lys Thr Leu Asn Arg ser Asn Ile Lys Met Val Ser Pro Ala20 25 30

Glu Arg Leu Ser Thr Ile Ala ser Thr Ile Lys Pro Asn Arg Lys Asp35 40 45Ser Thr ser Leu Gln Pro GTu Asp Tyr Pro Glu His Pro Phe Lys Val50 55 60

Thr vai Val Gly ser Gly Asn Trp Gly Cys Thr Ile Ala Lys vai Ile65 70 75 80

Ala Glu Asn Thr Val Glu Arg Pro Arg Gln Phe.Gln Arg Asp vai Asn

85 90 95

Met Trp vai Tyr Glu Glu Leu Ile Glu Gly Glu Lys Leu Thr Glu Ile100 105 110

Ile Asn Thr Lys His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro Gly Ile Lys Leu115 120 125

Pro vai Asn vai vai Ala Val Pro Asp Ile vai Glu Ala Cys Ala Gly130 135 140

Ser Asp Leu Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu Pro Arg Il e145 150 155 160

Xaa Ser Gln Leu Lys Gly Lys Val Asn Pro Lys Ala Arg Ala ile ser

165 170 175

Cys Leu Lys Gly Leu Asp vai Asn Pro Asn Gly cys Lys Leu Leu ser180 185 190

Thr Val Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Tyr Cys Gly Ala Leu Ser Gly195 200 205

Ala Asn Leu Ala Pro Glu vai Ala Gln Cys Lys Trp ser Glu Thr Thr210 215 220

vai Ala Tyr Thr ile Pro Asp Asp Phe Arg Gly Lys Gly Lys Asp Ile225 230 235 240

Asp His Gln lie Leu Lys Ser Leu Phe His Arg Pro Tyr Phe His vai

245 250 255

Arg Val Ile ser Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala Gly Ala Leu Xaa260 265 270

Asn Val vai Ala Met Ala Ala Gly Phe vai Glu Gly Leu Gly Xaa Gly275 280 285

Asp Asn Ala Lys Ala Ala vai Met Arg Ile Gly Leu Val Glu Thr Ile290 295 300

Gln Phe Ala Lys Thr Phe Phe Asp Gly Cys His Ala Ala Thr Phe Thr305 3lO 315 320

His Glu Ser Ala Gly vai Ala Asp Leu Ile Thr Thr Cys Ala Gly Gly

325 330 335

Arg Asn Val Arg vai Gly Arg Tyr Met Ala Xaa His ser vai ser Ala340 345 350

Thr Glu Ala Glu Glu Lys Leu Leu Asn Gly Gln ser Cys Gln Gly Ile355 360 365

His Thr Thr Arg Glu Val Tyr Glu Phe Leu ser Asn Met Gly Arg Thr370 375 380

Asp Glu Phe Pro Leu Phe Thr Thr Thr Tyr Arg xle Ile Tyr Glu Asn385 390 395 400

Phe Pro Ile Giu Lys Leu Pro Glu Cys Leu Glu Pro vai Glu Asp405 410 415

<210> 2<211> 434<212> PRT

<213> Kluyveromyces marxianus<400> 2

Met lie Gln Phe Gly Arg ser Phe Cys Tyr Asn ser Ile vai Lys Ser1 5 10 15

Phe Gln Ile Arg Lys ser Ile Thr Arg Phe Arg Leu Thr Asp Ile Tyr20 25 30

Thr Asn Arg Val Thr Ile Asn Thr Arg Arg Asn Ile ser Asn Met Ser35 40 45

Pro Ala Ser Asp Arg Leu Lys Gln Thr Ser Ser Ile Leu Ser Lys Ser50 55 60

vai Glu Pro Lys Ala Asp ser Pro Phe Lys vai Thr vai Ile Gly Ser65 70 75 80

Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile Ala Lys Val vai Ala Glu Asn Cys Ala

85 90 95

Leu Arg Pro Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Asp Met Trp vai Phe Glu100 105 110

Glu Gln Ile Asp Gly Glu Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His115 120 125

Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro Gly Ile Lys Leu Pro Asn Asn Leu Val130 135 140

Ala Asn Pro Asp Ile Val Asp Ala Ala Lys Asp Ala Asp Ile Leu vai145 150 155 160

Phe Asn Ile pro His Gln Phe Leu Pro Lys Val Cys Ser Gln Leu Lys

165 170 175

Gly Lys Ile Lys Pro Gln Ala Arg Ala lie ser Cys Leu Lys Gly Phe180 185 190

Asp Val Gly Lys Asp Gly Val Lys Leu Leu ser Thr Tyr Ile Lys Asp195 200 205

Thr Leu Asn ile Glu Cys Gly Ala Leu ser Gly Ala Asri Leu Ala Pro210 215 220

Glu vai Ala Lys Glu Asn Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Ile225 230 235 240

Pro Glu Asp Tyr Lys Gly Ala Gly Lys Asp Val Asp His ser Leu Leu245 250 255

Lys Ãla Leu Phe His Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile His Asp260 265 270

vai Ala Gly Ile Ser Val Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Ile Ala Leu275 280 285

Gly Cys Gly Tyr Val Glu Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala290 295 300

Ala Ile Gln Arg vai Gly Leu Ser Glu Met Ile Thr Phe Gly Arg Met305 310 315 320

Phe Phe Pro Glu Cys Arg Val Glu Thr Phe Tyr Lys Glu ser Ala Gly

325 330 335

Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn vai Arg Val340 345 350

Ala Lys His Met Ala Ile Thr Gly Lys ser Ala Leu Glu Ala Glu Lys355 360 365

Glu Leu Leu Asn Gly Gln ser Ala Gln Gly lie Ile Thr Thr Lys Glu370 375 380

vai His Glu Trp Leu Glu Thr cyis Gly Lys lie Asn Glu Phe Pro Leu385 390 395 400Phe Glu Ala Ile Tyr Gln Ile Thr Tyr Gly Asn Ala ser Met Glu Gln405 410 415

Ile Pro Glu Met Ile Glu Glu Leu Glu Cys Ile Asp Tyr Asn Val Lys420 425 4B0

Lys His

<210> 3

<211> 391

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 3

Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn1 5 10 15

Ala Gly Arg Lys Arg Ser ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu20 25 30

Lys Pro Phe Lys vai Thr vai Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr35 40 45

Ile Ala Lys vai vai Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe50 55 60

Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu

65 70 75 80

Lys Leu Thr Glu Ile He Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu85 90 95

Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile100 105 110

Asp Ser vai Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn lie Pro His Gln115 120 125

Phe Leu Pro Arg Ile cys ser Gln Leu Lys Gly His vai Asp ser His130 135 140

Val Arg Ala lie Ser Cys Leu Lys.Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly145 150 155 160

Val Gln Leu Leu ser ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys165 170 175

Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His180 185 190Trp ser Glu Thr Thr vai Ala Tyr His lie Pro Lys Asp Phe Arg Gly195 200 205

Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arq210 215 220

pro Tyr Phe His vai ser vai lie Glu Asp vai Ala Gly He ser Ile225 230 235 240

Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val vai Ala Leu Gly Cys Gly Phe vai Glu

245 250 255

Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala ser Ala Ala Ile Gln Arg vai Gly260 265 270

Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg275 280 285

Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu ser Ala Gly vai Ala Asp Leu Ile Thr290 295 300

Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr305 310 315 320

ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln

325 330 335

Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu vai His Glu Trp Leu Glu340 345 350

Thr Cys Gly ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala vai Tyr Gln355 360 365

Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu370 375 380

Glu Leu Asp Leu His Glu Asp385 390

<210> 4

<211> 440

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 4

Met Leu Ala vai Arg Arg Leu Thr Arg Tyr Thr Phe Leu Lys Arg Thr1 5 10 15

His Pro Val Leu Tyr Thr Arg Arg Ala Tyr Lys Ile Leu Pro ser Arg20 25 30Ser Thr Phe Leu Arg Arg Ser Leu Leu Gln Thr GTn Leu His Ser Lys35 40 45

Met Thr Ala His Thr Asn Ile Lys Gln His Lys His Cys His Glu Asp50 55 60

His Pro Ile Arg Arg ser Asp ser Ala vai ser Ile vai His Leu Lys65 70 75 80

Arg Ala Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly ser Gly Asn Trp Gly Thr

85 90 95

Thr Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile100 105 110

Phe Glu Pro Glu vai Arg Met Trp vai Phe Asp Glu Lys Ile Gly Asp115 120 125

Glu Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn vai Lys Tyr130 135 140

Leu Pro Asn Ilé Asp Leu Pro His Asn Leu vai Ala Asp Pro Asp Leu145 150 155 160

Leu His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu vai Phe Asn Ile Pro His

165 170 175

Gln Phe Leu Pro Asn Ile vai Lys Gln Leu Gln Gly His vai Ala Pro180 185 190

His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys195 200 205

Gly vai Gln Leu Leu Ser Ser Tyr vai Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln210 215 220

Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu vai Ala Lys Glu225 230 235 240

His Trp Ser Glu Thr Thr vai Ala Tyr Gln Leu Pro Lys Asp Tyr Gln

245 250 255

Gly Asp Gly Lys Asp Val Asp His Lys Ile Leu Lys Leu Leu Phe His260 265 270

Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser275 280 285

lie Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val vai Ala Leu Ala cys Gly Phe vai290 295 300Glu Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu305 310 315 320

Gly Leu Gly Glu Ile Xle Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser

325 330 335

Lys vai Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu ser Ala Gly vai Ala Asp Leu Ile340 345 350

Thr Thr Cys ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Thr Tyr Met Ala355 360 365

Lys Thr Gly Lys ser Ala Leu Glu Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly370 375 380

Gln ser Ala Gln Gly Ile lie Thr cys Arg Glu vai His Glu Trp Leu385 390 395 400

Gln Thr Cys Glu Leu Thr Gln Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala vai Tyr

405 410 415

Gln lie Val Tyr Asn Asn vai Arg Met Glu Asp Leu Pro Glu Met Ile420 425 430

Glu Glu Leu Asp Ile Asp Asp Glu435 440

<210> 5<211> 400<212> PRT

<213> Candida glabrata<400> 5

Met ser Asn ser Ala Ala Gly Arg Leu Asn Gln Thr ser His Ile Leu1 5 10 15

Asn Glu Ser Ilè Lys Asn Asp Asp Ile ser Leu Arg Arg Ser Gln Pro20 25 30

Ser Thr Thr ser Leu Gln Ala Leu Glu His Pro Phe.Lys vai Thr Val35 40 4.5

Ile Gly ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr lie Ala Lys Val Val Ala Glu50 55 60

Asn Thr Ala Leu Asn Pro His Leu Phe Val Ser Arg Val Asp Met Trp65 70 75 80

Val Phe Glu Glu Lys Ile Asp Gly Lys Asn Leu Thr Glu Ile Ile Asn

85 90 95Glu Gln His Glu Asn Val Lye Tyr Leu Pro Asp Ile Lys Leu Pro Glu100 105 110

Asn Leu Val Ala Asn Pro Asn Leu xle Asp Ser vai Lys Gly Ala Asp115 120 125

Ile Leu lie Phe Asn Ile pro His Gln Phe Leu Pro Arg lie vai ser130 135 140

Asn Leu Lys Asn His Val Gly Pro His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu145 150 155 160

Lys Gly Phe Glu vai Gly Lys Lys Gly vai Gln Leu Leu ser ser Tyr165 170 175

Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln Cys Gly Ala Leu ser Gly Ala Asn180 185 190

Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu His Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala195 200 205

Tyr His Ile pro Lys Asp Phe Arg Gly Glu Gly Lys Asp vai Asp His210 215 220

Lys Leu Leu Lys Ala Leu Phe His Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val225 230 235 240

Ile Glu Asp vai Ala Gly Ile ser Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val245 250 255

vai Ala Leu Gly cys Gly Phe Val Glu Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn260 265 270

Ala Ala Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe275 280 285

Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu ser Arg Val Gln Thr Tyr Tyr Gln Glu290 295 300

ser Ala Gly vai Ala Asp Leu Ile Thr Thr cys ser Gly Gly Arg Asn305 310 315 320

Val Arg Val Ala Lys His Met Ala Lys Thr Gly Lys ser Ala Leu Asp325 330 335

Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln ser Ala Gln Gly Ile Ile Thr340 345 350

Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu Thr Cys Glu Met Thr His Glu355 360 365Phe Pro Leu Phe Glu ATa vai Tyr Gln Ile Val Tyr Asn Asn Val Pro370 375 380

Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu Glu Leu Glu Cys Ile Ala asd385 390 395 400

<210> 6

<211> 389

<212> PRT

<213> Debaryomyces hansenii

<400> 6

Met Ser Gln Tyr Arg Ala Asn Gln Arg Leu Gln Gln Leu Ser Asn lie.1 5 10 15

Leu Arg Pro Asn Gln Leu Ser Ala Glu Lys Ser Leu Lys Pro Glu Thr20 25 30

Pro Phe Lys vai Ala Val Ile Gly ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile35 40 45

Ala Lys Val Leu Ala Glu Asn Thr Ala Glu Lys Pro Asp Thr Phe Ala50 55 60

Lys Gln Val Asp Met Trp Val Phe Gln Glu Lys Ile Asp Gly Thr Asn65 70 75 80

Leu Thr Glu Ile Ile Asn Asn Lys His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro85 90 95

Gly Val Lys Leu Pro Glu Asn Leu His Ala Glu Pro Asp Ile Val Lys100 105 110

Ala Ala Gln Gly Ala Asp Leu Leu Val Phe Asn Leu Pro His Gln Phe115 120 125

Leu Pro Lys Ile Cys Lys Gln Leu Lys Gly Thr Leu Lys Pro Thr Thr130 135 140

Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Leu Glu Val Thr Pro Asp Gly Cys145 150 155 160

Lys Leu Leu Ser Thr Tyr Ile Thr Glu Asn Leu Gly Ile Glu Cys Gly165 170 175

Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Arg cys Lys Trp180 185 190

Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Asn Ile Pro Ala Asp Phe Lys Gly Pro195 200 205Gly Lys Asp Xle Asp Ser Ala vai Leu Lys Glu Ala Phe His Arg Pro210 215 220

Tyr Phe His vai Asn vai Ile Glu Asp vai Ala Gly vai ser vai Ala225 230 235 240

Gly Ala Leu Lys Asn Ile Val Ala Ile Ala Val Gly Phe Val Glu Gly

245 250 255

Leu Gly Trp Gly Asp Asn Ala Lys Ser Ala Ile Met Arg vai Gly Leu260 265 270

Ile Glu Thr Ile Asn Phe Ser Asn Met Phe Phe Pro Asn Ser Lys Pro275 280 285

Thr Thr Phe Thr His Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Xle Thr Thr290 295 300

Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Gly Arg His Met Ser Lys Thr305 310 315' 320

Gly Glu Ser Ala Glu Glu Ala Glu Lys Lys Leu Leu Asn Gly Gln Ser

325 330 335

Ser Gln Gly lie Ile Thr Ala Lys Glu Val His Glu Leu Leu ser Asn340 345 350

vai Gly Lys Thr Asp Gln Phe Pro Leu Phe Glu Ala Thr Tyr Gln Ile355 360 365

Ile Tyr Gly Asp Glu ser Ile Gln Asn Leu Pro Asn Leu Leu Glu Asp370 375 380

His Ser Leu Phe Lys385

<210> 7<211> 393<212> PRT

<213> Pichia jadinii<400> 7

Met Leu Arg Ile Gly Lys Leu Asn Leu Ser Thr Met ser ,ser Ala Gln1 5 10 -15

Gln Arg Leu Ala Gln vai Gly ser His Leu Thr Ala Gln Lys Gln ser20 25 30

Leu Ala Pro Gln Arg Pro Tyr Lys He Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn35 40 45Trp Gly Thr Thr Ile Ala Lys Val Leu Ala GlU Asn Ala Gly Leu Arg50 55 60

Pro His Leu Phe Gln His Gln vai Asp Met Trp vai Phe Glu Glu Lys65 70 75 80

lie Asn Gly vai Asn Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Gln His Glu Asn85 90 95

Val Lys Tyr Leu Pro Gly Ile Lys Leu Pro Lys Asn Leu His Ala Glu100 105 110

Pro Ser Ile vai Lys Ala Ala Glu Gly Ala Asp Leu Leu Val Phe Asn115 120 125

Xle Pro His Gln Phe Leu Pro Gly Ile Cys Lys Gln Leu ser Lys Ala130 135 140

Thr Leu Lys Pro His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Leu Glu145 150 155 160

Val Thr Pro Asn Gly Cys Lys Leu Leu Ser Thr Tyr Ile Thr Glu His165 170 175

Leu Gly Val His cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu180 185 190

vai Ala Lys Glu Lys Trp Ser Glu Thr Thr vai Ala Tyr Arg Leu Pro195 200 205

Asn Asp Phe Gln Gly His Gly Lys Asp Ile Asp Arg Tyr Val Leu Arg210 215 -- 220

Ala Ala Phe His Arg Pro Tyr Phe His vai Arg Val Ile Glu Asp Val225 230 235 240

Ala Gly Val Ser Leu Ala Gly Ala Leu Lys Asn vai vai Ala Leu Gly245 250 255

vai Gly Phe Val His Gly Leu Asn Trp Gly Asp Asn Ala Ala ser Ala260 265 270

Ile Gln Arg Phe Gly Leu Asn Glu Thr Ile Lys Phe Ala Glu vai Phe275 280 285

Phe Pro Gly Glu Thr Asn Gln Asp Thr Phe Thr Lys Glu Ser Ala Gly290 295 300

Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Arg Val305 310 315 320

Ala Lys Ala Met Ala Ile Thr Gly Lys Ser Ala Val Glu vai Glu Arq325 330 335

Glu Leu Leu Asn Gly Gln ser Ala Gln Gly Ile Ile Thr ser Lys Glu340 345 350

Val His Glu Leu Leu Ala Ala Lys Asn Leu Thr Lys Glu Phe Pro Leu355 360 365

Phe Glu Ala Ile Tyr Gln Ile Val Tyr Gly Thr Glu ser Ile Glu Arg370 375 380

Leu Pro Glu Leu Ile Glu Glu Asp Glu385 390

<210> 8<211> 248<212> PRT

<213> Kluyveromyces marxianus<400> 8

Met Ser Ala Ala Pro Ile ser Leu Arg vai Asn Ala Ala Leu Phe Asp1 5 10 15

vai Asp Gly Thr Leu Ile Ile ser Gln Gly Ala Ile Ala Glu Phe Trp20 25 30

Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr Phe Asp Ser Gln His Val Ile35 40 45

Asp Ile ser His Gly Trp Arg Thr Tyr Asp Val Ile Lys Lys Phe Ala50 55 60

Pro Asp Tyr Ala Asn Glu Glu Tyr vai Thr Lys Leu Glu Gly Glu Ile65 70 75 80

Pro Asp Lys Phe Gly Lys His Ala Ile Glu Val Pro Gly Ala Ile Lys85 90 95

Leu Cys Ala Ala Leu Asn Ala Leu Pro Lys Glu Lys Trp Ala Val Ala100 105 110

Thr ser Gly Thr Phe Glu Met Ala His Lys Trp Phe Asp Ile Leu Gly115 120 125

Ile Lys Arg Pro ser Asn Phe Ile Thr Ala Asn Asp vai Lys Asn Gly130 135 140

Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys Gly Arg Asn Gly Leu Gly Tyr145 150 155 160

ργο He Asn Glu Ala Asn pro Ala Ala ser Lys vai He vai Phe Glu165 170 175

Asp Ala Pro Ala Gly Ile Leu Ala Gly Lys Ala Ala Gly Cys Lys Ile180 185 190

Val Gly Ile Ala Ttir Thr Phe Asp Lys Gl u Phe Leu Xle Glu Lys Gly195 200 205

Cys Asp lie vai Ile Lys Asp His Thr Lys Leu Arg vai Ala Ala Tyr210 215 220

His Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Phe vai Phe Asp Glu Tyr Leu Tyr225 230 235 240

Ala Lys Asp Asp Leu Leu Glu Trp245

<210> 9<211> 250<212> PRT <213> saccharomyces cerevisiae

<400> 9

Met Gly Leu Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Lys vai Asn Ala Ala Leu1 5 .10 15

Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln Pro Ala Ile Ala Ala20 ?5 30

Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr Phe Asp Ala Glu His35 40 45

Val Ile Gln Val Ser His Gly Trp Arg Thr Phe Asp Ala Ile Ala Lys50 55 60

Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asn Glu Glu Tyr Val Asn Lys Leu Glu Ala65 70 75 80

Glu Ile Pro vai Lys Tyr Gly Glu Lys ser Ile Glu Val Pro Gly Ala85 90 95

Val Lys Leu Cys Asn Ala Leu Asn Ala Leu Pro Lys Glu Lys Trp Ala100 105 110

Val Ala Thr Ser Gly Thr Arg Asp Met Ala Gln Lys Trp Phe Glu His115 120 125

Leu Gly lie Arg Arg Pro Lys Tyr Phe Ile Thr Ala Asn Asp Val Lys130 135 140

Gln Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys Gly Arg Asn GTy Leu145 150 155 160

Gly Tyr Pro He Asn Glu Gln Asp Pro ser Lys Ser Lys Val Val Val165 170 175

Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ala Gly Cys180 185 190

Lys lie lie Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu Asp Phe Leu Lys Glu195 200 205

Lys Gly cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu ser Ile Arg Val Gly210 215 220

Gly Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu vai Glu Phe Ile Phe Asp Asp Tyr225 230 235 240

Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp245 250

<210> 10<21I> 271<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevi si ae<400> 10

Met Lys Arg Phe Asn Val Leu Lys Tyr Ile Arg Thr Thr Lys Ala Asn1 5 10 15

Ile Gln Thr Ile Ala Met Pro Leu Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Lys20 25 30

lie Asn Ala Ala Leu Phe Asp vai Asp Gly Thr Ile lie Ile Ser Gln35 40 45

Pro Ala Ile Ala Ala Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr50 55 60

Phe Asp Ala Glu His Val Ile His Ile Ser His Gly Trp Arg Thr Tyr65 70 75 80

Asp Ala lie Ala Lys Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asp Glu Glu Tyr Val85 90 95

Asn Lys Leu Glu Gly Glu Ile Pro Glu Lys Tyr Gly Glu His ser lie100 105 110

Glu vai Pro Gly Ala Val Lys Leu Cys Asn Ala Leu Asn Ala Leu Pro115 120 125

Lys Glu Lys Trp Ala VaT Ala Thr Ser Gly Thr Arg Asp Met ATa Lys130 135 140

Lys Trp Phe Asp Ile Leu Lys Ile Lys Arg Pro Glu Tyr Phe Ile Thr145 150 155 160

Ala Asn Asp vai Lys Gln Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys

165 170 175

Gly Arg Asn Gly Leu Gly Phe Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro ser Lys180 185 190

Ser Lys vai Val vai Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly195 200 205

Lys Ala Ala Gly Cys Lys Ile Val Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu210 215 220

Asp Phe Leu Lys Glu Lys Gly Cys Asp Ile Ile vai Lys Asn His Glu225 230 235 240

Ser Ile Arg vai Gly Glu Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu

245 250 255

Ile Phe Asp Asp Tyr Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp260 265 270

<210> 11<211> 236<212> PRT

<213> Schi zosaccharomyces pombe<400> 11

Met Ile Pro Glu Ala Cys Leu Phe Asp Met Asp Gly Leu Leu Val Asp1 5 10 15

Thr Glu ser Ile Tyr Thr Lys Ser Thr Asn Ile Ile Leu Lys Arg Tyr20 25 30

Asn Lys Gly Pro Phe Ser Met Glu Val Lys Ala Lys Met Met Gly Arg35 40 45

Thr ser Lys Glu Ala Ser Arg Ile Phe Leu Asp Trp Ser Gly lie Asp50 55 60

Leu Thr cys Glu Glu Tyr Ile Ala Leu Gln Arg Glu Thr Gln Ala Glu65 70 75 80

Leu Trp Arg His Thr Lys Pro Leu Pro Gly Val Met Asn Leu Leu Ser85 90 95

Lys Leu Lys Ser Leu Asn lie Pro Ile Ala Leu Ala Thr Ser Ser Asp100 105 110

Thr His Asn Phe Glu Lys Lys Ser Ala His Leu ser His Leu Phe Asp115 120 125

His Phe Asp Gly Asn Ile Ile Thr Gly Asp Asp Pro Arg Leu Pro Val130 135 140

Gly Arg Gly Lys Pro His Pro Asp Ile Trp Phe lie Ala Leu Lys Met145 150 155 160

Ile Asn Asp Lys Arg Lys Ala Gln Gly Gln Ala Glu Ile Leu Pro Glu165 170 175

Asn Cys Leu vai Phe Glu Asp Ser Ile Thr Gly Val Gln ser Gly Arg180 185 190

Ala Ala Gly Met Lys vai Val Trp vai Pro Asp Val Asn Ile Leu Pro195 200 205

Phe Phe Ser Leu Ser Pro Glu Gln Ala Ala Asp Lys His Ile Thr Lys210 215 220

vai Leu ser Leu Glu Asn Phe Asp Val Thr Lys Val225 230 235

<210> 12

<211> 246

<212> PRT

<213> Schizosaccharomyces pombe

<400> 12

Met Ala Ala Lys His Val Lys Tyr Met Ala Cys Leu Phe Asp Met Asp1 5 10 15

Gly Leu Leu Val Asp Ser Glu Thr Ile Tyr Thr Lys Thr Thr Asn Leu20 25 30

Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Asp Pro Leu Pro Ile ser vai Lys Ala35 40 45

Gln Met Met Gly Arg Pro Gly ser Ala Ala Ala Lys Val Val Ile Âsp50 55 60

Trp Ser Asn Ile Pro Met Thr Pro Gln Gln Phe Val Asp Glu Gln Gln65 70 75 80

Val Ile Arg Ala Lys Phe Trp ser ser Leu Lys Pro Met Pro Gly Ala85 90 95

Glu ser Leu lie Asn Asn Leu Ser Asn His Gly Ile Asp Ile Gly Val100 105 110

Cys Thr His Pro Tyr Ala Ile Ile Lys Thr Ala His Leu Lys His Ile115 120 125

Phe Glu Lys Phe Gly Lys Asn vai Ile Thr Gly Asp Asn pro ser Ile130 135 140

Ala Pro Gly Arg Gly Lys Pro Phe Pro Asp Ile Trp Leu Lys Val Leu145 150 155 160

Asn Leu Ile Asn Glu Ser Arg Lys Gln Arg Gly Leu Lys Ala Leu Thr

165 170 175

Pro ser Gln cys Ile Ala Phe Glu Asp ser Ile Pro Gly Val Lys Ser180 185 190

Ala Lys Ala Ala Gly Met His vai Ile Trp vai Pro Asp Ala Ala Ile195 200 205

Lys Asn Leu vai Gly Asp Gln Leu Asn Glu Ile vai Asp ser Gln Cys210 215 220

Glu Thr Leu Pro Ser Leu Ser Glu Phe Asp Ile Asn Lys Tyr Leu Asn225 230 235 240

Ile Asn ser Lys Gln Ala

245

<210> 13<211> 450<212> PRT

<213> Schi zosaccharomyces pombe<400> 13

Met Ile Gly Pro Arg Leu Cys Ala Ala Thr Pro Arg Phe Pro Leu Val1 5 10 15

Ser Leu Ala His Arg Asn Ser Lys vai Phe Ala Leu Ala Ser Ser Asn20 25 30

Ala Val Ala Gln Arg Trp Gly Lys Arg Phe Tyr Ala pro Ile Glu Thr35 40 45

Glu Thr Pro His Lys Val Gly vai Glu Phe Glu Glu ser Lys Asp Arg50 55 60

Ile Phe Thr ser pro Gln Lys Tyr vai Gln Gly Arg His Ala Phe Thr65 70 75 80

Arg Ser Tyr Met Tyr vai Lys Lys Trp Ala Thr Lys Ser Ala Val vai85 90 95

Leu Ala Asp Gln Asn VaT Trp Asn Ile Cys Ala Asn Lys Ile vai Asp100 105 110

ser Leu ser Gln Asn Gly Met Thr vai Thr Lys Leu Val ρ He Gly Gly115 120 125

Glu Ala Ser Leu vai Glu Leu Asp Lys Leu Arg Lys Gln Cys Pro Asp130 135 140

Asp Thr Gln Val lie Xle Gly vai Gly Gly Gly Lys Thr Met asd Ser145 150 155 160

Ala Lys Tyr Ile Ala His ser Met Asn Leu Pro Ser Ile Ile cys Pro165 170 175

Thr Thr Ala ser ser Asp Ala Ala Thr ser ser Leu ser Val Ile Tyr180 185 190

Thr Pro Asp Gly Gln Phe Gln Lys Tyr ser Phe Tyr Pro Leu Asn Pro195 200 205

Asn Leu Ile Phe Ile Asp Thr Asp Val Ile Val Arg Ala Pro Val Arg210 215 220

Phe Leu Ile ser Gly Ile Gly Asp Ala Leu ser Thr. Trp vai Glu Thr225 230 235 240

Glu ser Val Ile Arg Ser Asn Ser Thr Ser Phe Ala Gly Gly Val Ala245 250 255

ser Ile Ala Gly Arg Tyr Ile Ala Arg Ala Cys Lys Asp Thr Leu Glu260 265 270

Lys Tyr Ala Leu ser Ala Ile Leu ser Asn Thr Arg Gly Val Cys Thr275 280 285

Glu Ala Phe Glu Asn vai Val Glu Ala Asn Thr Leu Met ser Gly Leu290 295 300

Gly Phe Glu Asn Gly Gly Leu Ala Ala Ala His Ala Ile His Asn Gly305 310 315 320

Met Thr Ala Ile His Gly Pro vai His Arg Leu Met His Gly Glu Lys325 330 335vai Ala Tyr Gly Thr Leu vai Gln Val vai Leu Glu Asp Trp Pro Leu340 345 350

Glu Asp Phe Asn Asn Leu Ala ser Phe Met Ala Lys Cys His Leu Pro355 360 365

lie Thr Leu Glu. Glu Leu Gly ile Pro Asn- vai Thr Asp Glu Glu Leu370 375 380

Leu Met Val Gly Arg Ala Thr Leu Arg Pro Asp Glu ser Ile His Asn385 390 395 400

Met Ser Lys Lys Phe Asn Pro ser Gln Ile Ala Asp Ala Ile Lys Ala405 410 415

Val Asp ser Tyr ser Gln Lys Trp Gln Glu Gln Thr Gly Trp Thr Glu420 425 430

Arg Phe Arg Leu Pro Pro ser Arg His Ser Pro His Leu Thr Asp lie435 440 445

His Pro450

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 14

aaaaaaacgc gtggtggtga cccatccata ac

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 15

ttttttctgc agatcgatgg cgcgaacaag

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

*213> Artificial

<22 0>

<223> Primer

<400> 16

aaaaaagacg tcgaagagaa tcggactagg<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<21Β> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 17

ttttttgccg gcggatggag ggacaaatac 30

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 18

tggcggtagt cacaaggacg 20

<210> 19

<2U> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 19

agtgccgagg accgagaatc 20

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 20

aaaaaaacgc gtgtccctcc cacttacaac tc 32

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 21

ttttttggta· ccccggaacc catctggaaa tc 32

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> Primer<400> 22aaaaaaacta gttaggtcgc tggatgtcct ac

<210> 23<211> 30<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 23ttttttgccg gcaagtcggg catagaaggc

<210> 24<211> 21<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 24ggkgctaach tbgcymcmga r

<210> 25<211> 21<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 25dgtratbar.a tcrgcvacac c

<210> 26<211> 21<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 26krtygghycy ggtaactggg g

<210> 27<211> 21<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 27rtgraagtad ggtckgtgga a

<210> 28<211> 27<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 28ccattgccgg tgcactcaag aatgtcg

<210> 29<211> 27<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 29cgacattctt gagtgcaccg gcaatgg

<210> 30<211> 27<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 30ggctgctgga tttgtcgaag gtttagg

<210> 31<211> 27<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 31ccttgccttt acctctgaaa tcgtccg

<210> 32<211> 32<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 32tccccggtcg accggaactt agcttactcg tc

<210> 33<211> 32<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer<400> 33

ttgcgaggat cctgagtgca gtagctgtac ac 32

<2Χ0> 34

<211> 706

<212> DNA

<213> Kluyveromyces thermotolerans

<400> 34

cactcgcaag ctgtgccatc gcccaacggt taattataag aaatcaacat çagccaacaa 60ctattttcgt ccccctcttt tcagtggtaa cgagcaatta cattagtaag agactatttt 120cttcagtgat ttgtaatttt ttttcagtga tttgtaattc tttctcgaaa tatgcgggct 180waamtaatc-c ggacattcac tacatgcaag gaaaaacgag aaccgcggag atttcctcag 240taagtaacaa tgatgatctt tttacgcttc atcatcactt tccaaagttc taagctataa 300gttcaagcct agatacgctg aaaaactcct gaccaacaat gtaaagaaaa caattacaat 360tgtaaggttg aaaacatcta aaaatgaaat attttattgt acatgcacac cctgatagtc 420attctcttac ttcatccctg aaagacgtgg ctgtacaaga gttggaatcg caaggtcatg 480aggttaaagt tagtgatctt tatgctcaaa agtggaaggc ctcaatagac cgtgacgacw 540wmaaaaaama aamrmaagaa gagaggttaa aaatacccca agcttcttat gaagcgtatg 600ccagaggagc attaacaaaa gacgtaaatc aggaacagga aaaacttatt tgggcggact 660ttgtcatttt gtcgtttcct atatggtggt cttctatgcc ggctag 706

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 35

tgtcagcatg cactcgcaag ctgtgccatc

<210> 36

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 36

aaccttgtcg actagccggc atagaagacc acc

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer<400> 37

tgtcaggatc cactcgcaag ctgtgccatc

30

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 38

aaccttcccg ggtagccggc atagaagacc acc

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> Arti fi ci al

<220>

<223> Primer

<400> 39

aaccaaagaa ttgttgctgc ttt 23

<210> 40

<211» 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 41

gcggtgaccc gggagatctg aattc 25

<210> 42

<211> 12

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 40

ttcgaaaaca cctggtggac cgttc

25

<400> 42gaattcagat ct

12

<210> 43<211> 25<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 45

gcggtgaccc gggagatctg aattc

<210> 44<211> 27<212> DNA

<213> Artifici al

<220>

<223> Primer

<400> 44

ccaattctgc agcaactggc tttaacg

27

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<22 Os*

<223> Primer

<400> 45

gcggtgaccc gggagatctg aattc 25

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 46

gcctcaccat ttggtctgcc c 21

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213>- Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 47

gaçtccccgg agtgtcgaaa tatga 25

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer .

<400> 48

gtgatagçgg igtcctttcgc tacc

24<210> 49<211> 25<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 49gcggtgaccc gggagatctg aattc

<210> 50<211> 12<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 50gaattcagat ct

<210> 51<211> 36<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 51gcgatctcga gatttgctgc aacggcaaca tcaatg

<210> 52<211> 36<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 52ctagcatctg attgttgttg tcgttgtttt tgtttt

<210> 53<211> 36<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Primer

<400> 53gcgatctcga gatttgctgc aacggcaaca tcaatg

<210> 54<211> 36<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Primer<400> 54

acttggccat ggttgttgtt gttgtcgttg tttttg

<210> 55

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 55

ccggaattcg atatctgggc wggkaatgcc aaygarttra atgc

<210> 56

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> η is a, c, g, or t

<400> 56

cgcggattca ggcctcagta ngaraawgaa ccngtrttra arte

<210> 57

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 57

actgtcgagc tcagtatatg gaattgacgg ctcatc

<210> 58

<211> 38

<212> DNA

<213> Arti fi ci al

<220>

<223> primer

<400> 58

actgacgcgt cgacgtatca tttgtagccc acgccacc

<210> 59<211> 35

<212> ONA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 59

cctcccccgg gctgatagaa gggtgatatg taatt 35

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 60

ccaagagtta tggggcccca gttg 24

<210> 61

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220> ... .

<223> Primer

<400> 61

gcgatctcga gatttgctgc aacggcaaca tcaatg 36

<210> 62

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 62

tggactagta catgcatgcg gtgagaaagt agaaagcaaa cattgttgtt gttgttgtcg 60ttgtttttg 69

<210> 63

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 63

cctcccccgg ggatatcaaa gttatattat taatgattca ag 42

<210> 64

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> Primer<400> 64

ggacgagagc tcgggcccat gacttcagag ttgattttga gtc

<210> 65

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 65

ggacatgcat gcgagctcaa tgcgtgacac cgccatgatg gttg

<210> 66

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 66

ggacatgcat gctacgtacc ctgcagggca ccaacagcaa cacccacctg aa

<210> 67

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 67

ggacatgcat gcgagctcat agttgaacaa acactggcat ttg

<210> 68

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 68

ggacatgcat gctacgtacc ctgcaggtgt gtgcaactag gtttatgtgg ag

<210> 69

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 69

cctcccccgg ggatatctag ttagatagct cctcctccaa tcgaattatt age

<210> 70<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 70

ggacgagagc tcgggcccta cgtctatgta tcataaattt gg

<210> 71

<211> 33

<212> DNA

<213> SEQ. ID. NO. 71

<400> 71

aaaaaacata tggagatgtt aatatgtggg tct

<210> 72

<211> 33

<212> DNA

<213> Arti fi ci al

<220>

<223> Primer

<400> 72

ttttttcctg caggtcagta ataacagtgg aga

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>.

<223> Primer

<400> 73

aaaaaacccg gggtgcctta tcaggtgcta

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223» Primer

<400> 74

ttttttgaat tcaaggttgc agcatgacag

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 75

gagttcaccc gtccagatag<210> 76

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 76

ggacaacgta catggacgat tc

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 77

ctatctggac gggtgaactc

<210> 78

<211> IS

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 78

ggactggggg tgtacaat

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 79

cttgtgcagg ctcagacttg

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 80

caaggcattc tggcagcttc

<210> 81

<211» 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

22

20

18

20

20<223> Primer

<400> 81

cggcttccaa agcggactta cc

<210> 82

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 82

aaggccgaca gcccattcaa gg

<210> 83

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 83

gatacgtcga ccgcgatctc gagcg

<2ΐο> 84

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 84

gttactagtg gtacagagaa cttgtaaaca attc

<210> 85

<211> 27

<212> DNA

<213> Arti fi ci ai

<220>

<223> Primer

<400> 85

ggttatagcg gaaaacaccg ttgagag

<210> 86

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 86

ccgctagacc aacagtcatc tag

<210> 87<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 87

cttctatagg ttgagaccct cgg

<210> 88

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 88

gtgccatata tctaccaact ctaacg

<210> 89

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 89

catatggaga tgttaatatg tgggtc

<210> 90

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 90

caaggttgca gcatgacagc catcg

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 91

ggaccgatgg ctgtgtagaa

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer<400> 92

acggcctcca gaagaagatg

Claims (69)

1. Célula de uma levedura de duplicação de genoma pré-total, CARACTERIZADApelo fato de ser geneticamente modificada para suprimir ou interromper um caminho meta-bólico nativo a partir de diidroxi acetona fosfato para glicerol.

2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de serhemiascomicetosa.

3. Célula, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato que quan-do cultivada na presença de uma fonte de carbono que pode ser metabolizada pela célula,metaboliza menos que 2% do peso de fonte de carbono que é consumida pela célula a gli—cerol.

4. Célula, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de ser ge-neticamente modificada para produzir um ácido orgânico.

5. Célula, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de conterum cassete de gene LDH funcional, e que produz lactato.

6. Célula, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que asupressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrupçãode pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase nativo.

7. Célula, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que asupressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrupçãode pelo menos um gene glicerol-3-fosfatase nativo.

8. Célula, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que asupressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrupçãode pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase nativo e de pelo menos um geneglicerol-3-fosfatase nativo.

9. Célula, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que asupressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrupçãode pelo menos um gene diidroxi acetona fosfatase nativo, uma supressão ou interrupção deum gene glicerol desidrogenase nativo, ou uma supressão ou interrupção de ambos um ge-ne diidroxi acetona fosfatase nativo e um gene glicerol desidrogenase nativo.

10. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-9, CARACTERIZADApelo fato de conter uma supressão ou interrupção de um caminho metabólico nativo a partirde piruvato para etanol.

11. Célula dentro de Zygosaccharomyces, Zygotorulaspora, Torulaspora, Lachan-cea, Kluyveromyces, Eremothecium ou Hanseniaspora clades do complexo SaccharomycesKurtzman 2003), CARACTERIZADA pelo fato de ser geneticamente modificada para su-primir ou interromper um caminho metabólico nativo a partir de diidroxi acetona fosfato paraglicerol.

12. Célula, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de quequando cultivada na presença de uma fonte de carbono que pode ser metabolizada pelacélula, metaboliza menos que 2% do peso de fonte de carbono que é consumido pela célulaa glicerol.

13. Célula, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de sergeneticamente modificada para produzir um ácido orgânico.

14. Célula, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de con-ter um cassete de gene LDH funcional, e que produz lactato.

15. Célula, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de quea supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrup-ção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase nativo.

16. Célula, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de quea supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrup-ção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfatase nativo.

17. Célula, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de quea supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrup-ção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase nativo e de pelo menos umgene glicerol-3-fosfatase nativo.

18. Célula, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de quea supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrup-ção de pelo menos um gene diidroxi acetona fosfatase nativo, uma supressão ou interrup-ção de um gene glicerol desidrogenase nativo, ou uma supressão ou interrupção de ambosum gene diidroxi acetona fosfatase nativo e um gene glicerol desidrogenase nativo.

19. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-18,CARACTERIZADA pelo fato de conter uma supressão ou interrupção de um caminho meta-bólico nativo a partir de piruvato para etanol.

20. Célula dos gêneros Kluyveromyces, Candida ou Issatchenkia,CARACTERIZADA por ser geneticamente modificada para suprimir ou interromper um ca-minho metabólico nativo de diidroxi acetona fosfato para glicerol.

21. Célula, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de quequando cultivada na presença de uma fonte de carbono que pode ser metabolizada pelacélula, metaboliza menos que 2% do peso de fonte de carbono que é consumido pela célulaa glicerol.

22. Célula, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de sergeneticamente modificada para produzir um ácido orgânico.

23. Célula, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADA pelo fato de con-ter um cassete de gene LDH funcional, e que produz lactato.

24. Célula, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de quea supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrup-ção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase nativo.

25. Célula, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de quea supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrup-ção de um gene glicerol-3-fosfatase nativo.

26. Célula, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de quea supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrup-ção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase nativo e de pelo menos umgene glicerol-3-fosfatase nativo.

27. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 21-26,CARACTERIZADA pelo fato de conter uma supressão ou interrupção de um caminho meta-bólico nativo a partir de piruvato para etanol.

28. Célula dentro de clade I. orientalis / P. fermentans (Kurtzman and Robnett 1998) ou dentro de clade Kluyveromyces do complexo Saccharomyces (Kurtzman 2003),CARACTERIZADA pelo fato de ser geneticamente modificada para suprimir ou interromperum caminho metabólico nativo a partir de diidroxi acetona fosfato para glicerol.

29. Célula, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de quequando cultivada na presença de uma fonte de carbono que pode ser metabolizada pelacélula, metaboliza menos que 2% do peso de fonte de carbono que é consumido pela célulaa glicerol.

30. Célula, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADA pelo fato de sergeneticamente modificada para produzir um ácido orgânico.

31. Célula, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADA pelo fato de con- ter um cassete de gene LDH funcional, e que produz lactato.

32. Célula, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de quea supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrup-ção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase nativo.

33. Célula, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de que a supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrup-ção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfatase nativo.

34. Célula, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de quea supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo inclui uma supressão ou interrup-ção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase nativo e de pelo menos um gene glicerol-3-fosfatase nativo.

35. Célula, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de seruma célula K. marxianus.

36. Célula, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADA pelo fato de con-ter uma supressão ou interrupção de um caminho metabólico nativo a partir de piruvato aetanol.

37. Célula, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de seruma célula de I. orientalis.

38. Célula, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de con-ter uma supressão ou interrupção de um caminho metabólico nativo de piruvato para etanol.

39. Célula geneticamente modificada de uma espécie de levedura de duplicação degenoma pré-total, CARACTERIZADA pelo fato de produzir menos que 2,0 g/L de glicerolquando cultivada sob as seguintes condições micro-aeróbicas padrões:A.meio aquoso definido contendo, no início de cultura, 5 g/L de sulfato de amônio, 3g/L de diidrogeno fosfato de potássio, 0,5 g/L de sulfato de magnésio, elementos em traços,vitaminas, 150 g/L de glicose;B.pH de 3,5 no início de cultura, com o meio de fermentação sendo tamponado senecessário para prevenir que o pH caia abaixo de 3,0 ou se eleve acima de 7,0 durante acultura;C.Cultura inoculada com a célula de levedura para uma OD6oo de 1,0;D.Temperatura de cultura de 30°C;E.Cultura é continuada até a concentração de glicose ser reduzida para 10 g/L, masnão é continuada por mais que 120 horas;F.Aeração e agitação suficientes para produzir uma taxa de tomada de oxigênio de-5,0 ± 1,0 mmoles/L/h.

40. Célula, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADA pelo fato de serhemiascomicetosa.

41. Célula, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADA pelo fato de queestá dentro de clades Zygosaccharomyces, Zygotorulaspora, Torulaspora, Lachancea, Kluy-veromyces, eremothecium ou Hanseniaspora do complexo Saccharomyces (Kurtzman-2003).

42. Célula, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de queé do gênero Kluyveromyces, candida ou Issatchenkia.

43. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 39-42,CARACTERIZADA pelo fato de produzir não mais que 0,6 g/L de glicerol quando cultivadasob as condições micro - aeróbicas padrões.

44. Célula, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADA pelo fato de pro-duzir pelo menos 10 g/L de um desejado produto de fermentação quando cultivada sob ascondições micro - aeróbicas padrões.

45. Célula geneticamente modificada de uma espécie de levedura de duplicação degenoma pré-total, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula geneticamente modificadacarece de habilidade para produzir uma enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase ativa que énativamente produzida por células das espécies de levedura tipo selvagem.

46. Célula, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADA pelo fato de ser hemiascomicetosa.

47. Célula, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADA pelo fato de estardentro de clades Zygosaccharomyces, Zygotorulaspora, Torulaspora, Lachancea, Kluyve-romyces, Eremothecium, ou Hanseniaspora do complexo Saccharomyces (Kurtzman 2003).

48. Célula, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADA pelo fato de ser dos gêneros Kluyveromyces, Candida ou Issatchenkia.

49. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 44-48,CARACTERIZADA pelo fato de carecer de habilidade para produzir uma enzima glicerol-3-fosfatase ativa que é nativamente produzida por células das espécies de levedura.

50. Célula de uma espécies de levedura de duplicação de genoma pré-total,CARACTERIZADA por falta de habilidade para produzir uma enzima glicerol-3-fosfataseativa que é nativamente produzida por células tipo selvagem das espécies de levedura.

51. Célula, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADA pelo fato de serhemiascomicetosa.

52. Célula, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADA pelo fato de estar dentro de clades Zygosaccharomyces, Zygotorulaspora, Torulaspora, Lachancea, Kluyve-romyces, Eremothecium, ou Hanseniaspora do complexo Saccharomyces (Kurtzman 2003).

53. Célula, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADA pelo fato de serdos gêneros Kluyveromyces, Candida ou Issatchenkia.

54. Célula geneticamente modificada de uma espécie de levedura, CARACTERIZADA pelo fato de ter falta de habilidade para produzir uma enzima diidroxiacetona fosfato fosfatase ativa que é nativamente produzida por células tipo selvagem dasespécies de leveduras, carece de habilidade para produzir uma enzima glicerol desidroge-nase dependete de NADH+ ativa que é nativamente produzida por células tipo selvagem dasespécies de leveduras, ou ambas.

55. Célula de levedura, CARACTERIZADA pelo fato de ser geneticamente modifi-cada para produzir um produto ácido orgânico, a dita célula de levedura ainda tendo umasupressão ou interrupção de um caminho metabólico nativo de diidroxi acetona fosfato paraglicerol e uma supressão ou interrupção de um caminho metabólico nativo de piruvato paraetanol.

56. Célula de levedura, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADA pelofato de que a supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo de diidroxi acetonafosfato para glicerol inclui uma supressão ou interrupção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase nativo.

57. Célula de levedura, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADA pelofato de que a supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo de diidroxi acetonafosfato para glicerol inclui uma supressão ou interrupção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfatase nativo.

58. Célula de levedura, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADA pelofato de que a supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo de diidroxi acetonafosfato para glicerol inclui uma supressão ou interrupção de pelo menos um gene glicerol-3-fosfato desidrogenase nativo e de pelo menos um gene glicerol-3-fosfatase nativo.

59. Célula de levedura, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADA pelofato de que a supressão ou interrupção do caminho metabólico nativo de diidroxi acetonafosfato para glicerol inclui uma supressão ou interrupção de pelo menos um gene diidroxiacetona fosfato fosfatase nativo, uma supressão ou interrupção de um gene glicerol desi-drogenase nativo, ou uma supressão ou interrupção de ambos um gene diidroxi acetonafosfato fosfatase nativo e um gene glicerol desidrogenase nativo.

60. Célula de levedura de acordo com qualquer uma das reivindicações 55-59,CARACTERIZADA pelo fato de que o ácido orgânico é lactato.

61. Processo de fermentação, CARACTERIZADO pelo fato de que uma célula dequalquer uma das reivindicações 1-3, 11-12, 20-21 ou 28-29 é cultivada sob condições defermentação e na presença de uma fonte de carbono para produzir um desejado produto defermentação, onde rendimento de glicerol é de menos que 2% baseado no peso da fonte decarbono que é consumida pela célula.

62. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 61,CARACTERIZADO pelo fato de que o desejado produto de fermentação é produzido em umrendimento de pelo menos 40% baseado no peso da fonte de carbono que é consumidopela célula.

63. Processo, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADO pelo fato deque o rendimento de glicerol é menos que 0,5% baseado no peso da fonte de carbono que éconsumido pela célula.

64. Processo, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de odesejado produto de fermentação é etanol.

65. Processo de fermentação CARACTERIZADO pelo fato de que uma célula dequalquer uma das reivindicações 4, 13, 22 ou 30 é cultivada sob condições de fermentaçãoe na presença de uma fonte de carbono para produzir pelo menos um ácido orgânico, ondeo rendimento de glicerol é de menos que 2% baseado no peso da fonte de carbono que éconsumido pela célula.

66. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 66,CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido orgânico é produzido em um rendimento depelo menos 40% baseado no peso da fonte de carbono que é consumido pela célula e orendimento de glicerol é de menos que 0,5% baseado no peso da fonte de carbono que éconsumido pela célula.

67. Processo de fermentação CARACTERIZADO pelo fato de que uma célula dequalquer uma das reivindicações 5-9, 14-18, 23-26, ou 31-38 é cultivada sob condições defermentação e na presença de uma fonte de carbono para produzir lactato, onde o rendi-mento de glicerol é de menos que 2% baseado no peso da fonte de carbono que é consu-mido pela célula.

68. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 67,CARACTERIZADO pelo fato de que lactato é produzido em um rendimento de pelo menos40% baseado no peso da fonte de carbono que é consumido pela célula e o rendimento deglicerol é menos que 0,5% baseado no peso da fonte de carbono que é consumido pela cé-lula.

69. Processo de fermentação CARACTERIZADO pelo fato de que uma célula dequalquer uma das reivindicações 1-3, 11-12, 20-21 ou 28-29 é cultivada sob condições defermentação e na presença de uma fonte de carbono para produzir etanol, onde o rendimen-to de glicerol é menos que 2% baseado no peso de fonte de carbono que é consumido pelacélula.