JP5810143B2 - ジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロールへの経路が破壊された酵母細胞 - Google Patents
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Description
この発明は、遺伝子改変されたある種の酵母、及び遺伝子改変した酵母を用いて乳酸を産生する発酵方法に関する。
多くの酵母細胞において、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)を代謝することにより、グリセロールが産生される。多くの酵母種において、DHAPは、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GPD、系統名はsn-グリセロール−3−リン酸:NAD+2−オキシドリダクターゼ、EC 1.1.1.8)酵素により還元されて、グリセロール−3−リン酸(G3P)を形成する。G3Pは、グリセロール前駆体のみならず、脂質生合成のための前駆体の役目をする。G3Pは、グリセロール−3−ホスファターゼ酵素(GPP,系統名はグリセロール−1−リン酸ホスホヒドロラーゼ、EC 3.1.3.21)により脱リン酸化されて、グリセロールになる。
グリセロール産生は、グリセロール産生がなければより望ましい発酵産物を産生するために用いられる炭素を消費するので、グリセロール産生は、収量低下のかなりの原因である。さらに、グリセロールは、ATP及びNADH両者を消費して産生される。このことは、バイオマスや望ましい産物の産生からエネルギーを失わせる。これら両者の理由により、細胞によるグリセロール産生を減少させる又は除くことが望まれる。さらなる考察によると、グリセロール産生を減少又は除去することは、所望の産物の回収及び精製を単純化するであろう。
A.培養開始の際の規定された液体培地の組成が、5g/L硫酸アンモニウム、3g/Lリン酸二水素カリウム、0.5g/L硫酸マグネシウム、微量元素、ビタミン類、150g/Lグルコースを含む;
B.培養の際pHが3.0以下への低下又は7.0以上に上昇することを防ぐことが必要な場合、緩衝効果を持った発酵培地で、開始時のpHが3.5である;
C.培養がOD600が1.0までの酵母細胞を蒔種した;
D.培養温度が30℃;
E.培養が、グルコース濃度が10g/Lに低下するまで連続するが、120時間以上は連続しない;
F.空気混入及び攪拌を十分に行い、酸素取り込み速度が5.0±1.0mmol/L/hrになるようにする;
で培養された場合に、2.0g/L以下のグリセロールを産生する、全ゲノム重複以前の酵母種の変異酵母細胞である。
他の態様として、本発明は、野生型の酵母細胞種により本来産生される活性型ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ酵素の産生能を欠く、又は野生型の酵母細胞種により本来産生される活性型NADH+依存性グリセロールデヒドロゲナーゼ酵素の産生能を欠く、又は両者を欠く、遺伝的に改変された酵母種の細胞である。
本発明において"外因性"は宿主細胞にとってネイティブではない全ての遺伝子材料に関して意味する。
他の適切な酵母細胞は、Kurtzman and Robnett, "Phylogenetic relationships among yeasts of the 'Saccharomyces complex' determined from multigene sequence analyses.", FEMS Yeast Res. Vol. 4, pp. 417-432. (2003)図9(p430) に記載されたSaccharomyces コンプレックスの7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 or 14クレード(単系統群)の何れかに属する細胞である。上記Merico 2007及びKurtzmann著, "Phylogenetic circumscription of Saccharomyces, Kluyveromyces and other members of the Saccharomycetaceae ..." FEMS Yeast. Res. Vol. 4, pp. 233-245 (2003) (以後 "Kurtzman 2003"と表示する)において、これらのクレードは、それぞれ、Zygosaccharomyces, Zygotorulaspora, Torulaspora, Lachancea, Kluyveromyces, Eremothecium, Hanseniaspora及びSaccharomycodesの名前により表される。
他の適切な酵母細胞としては、Candida、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces、Pichia、Issatchenkia、及びHansenula属のもとに分類される酵母種である(しかしながらこれらに制限されない)。
前記いずれかの遺伝子の欠失又は破壊は、強制的進化、突然変異誘発、又は遺伝子工学法により為し遂げることができて、その後の適切な選択又はスクリーニングにより変異体を同定することができる。
グリセロールへの代謝経路を欠失又は破壊する遺伝子工学は、適切な欠失構築物の設計及び構築、また宿主細胞のこれらの構築物による形質変換を経る1又は2以上の手順を用いて通常為し遂げられる。本明細書において、用語"構築物"は、細胞を形質転換するために使われるDNA配列を表すために用いられる。この構築物は、例えば、円形のプラスミド又はベクターの形で、線型のプラスミド又はベクターの形であってもよく、又は円形プラスミド又はベクターの一部(プラスミド又はベクターを1又は2以上の制限酵素で消化して得られるような)であってもよく、又はプラスミド又はベクターを鋳型とするPCR産物であってもよい。成功した形質転換体を同定するために、選択又はスクリーニングを続ける。電気穿孔及び/又は化学的(塩化カルシウム−、又は酢酸リチウム−ベースの)形質転換法を用いることができる。
欠失構築物は、標的遺伝子及び/又はその上流(5')又は下流(3')隣接領域の2つのDNA配列を最初にクローニングすることにより都合よく組み立てられる。この配列は、好ましくは、不連続であるが、もし他の遺伝子材料(例えば、選択マーカーカセット)が構築物上のこの配列間に挿入されるならば、連続でもよい。この文脈において"不連続"は、野生型ゲノム内でDNA配列が互いに直接隣り合っておらず、野生型ゲノム内で、この遺伝子を欠失又は破壊するために、欠失されるべき領域によって互いに分けられていることを意味する。"連続した"配列は、野生型ゲノム内で互いに直接隣り合っている。これらの配列の1方は、標的遺伝子のプロモーターに対して5'領域プロモーター領域の全て又は一部、標的遺伝子コード領域の全て又は一部、又はこれらのいくつかの組合せを含んでもよい。他方の配列は標的遺伝子のターミネーターに対して3'領域、ターミネーター領域の全て又は一部、及び/又は標的遺伝子コード領域の全て又は一部を含むかもしれない。次に、欠失構築物は、宿主細胞の染色体上にネイティブに表れるように、互いに、同一方向に配向した2個の配列を含むように作成される。以下においてより詳細に記載するように、形質転換体の選択を可能にするために、一般的に、選択マーカーはこの2個の配列の間にクローンニングされる。宿主細胞を形質変換するために、この構築物を用いる。電気穿孔及び/又は化学的(塩化カルシウム−、又は酢酸リチウム−ベースの)形質転換法を用いることができる。
細胞のネイティブ代謝経路がジヒドロキシアセトンリン酸からジヒドロキシアセトンを経由するグリセロールへの経路を含む(ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ及びグリセロールデヒドロゲナーゼにより)場合、ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ又はグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の一方が欠失し又は破壊されてもよいし、ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ及びグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の両者が欠失し又は破壊されてもよい。これは同時に又は順次に起こってもよい。順次の場合いずれかの順に行われる。前記のように、このような遺伝子の機能性多重コピー又は多重対立遺伝子は全て欠失されることが好ましい。
特に興味ある細胞は、乳酸又はその塩を意味するラクタートを産生する。この場合、本発明の細胞は、ゲノムに組み込まれた、少なくとも1個の機能性外因性乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子を含む。LDH遺伝子は、機能性乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコード化した遺伝子である。機能性LDH酵素は、ピルビン酸塩からラクタートへの還元反応を触媒する酵素である。LDH遺伝子は、それぞれから細胞がL-又はD-乳酸エナンチオマー(対掌体、又はその塩))を産生する、L-LDH又はD-LDH、の何れかの産生に対して特異的である。本発明の改変した細胞は、L-及びD-LDH遺伝子の両者を含むことは可能である、従って、この細胞は両者の乳酸エナンチオマーを産生することができる。しかしながら、L-又はD-LDH遺伝子のみが存在して、細胞がより光学的に純粋な乳酸産物を産生することが好ましい。
特に適したLDH遺伝子としては、WO 03/049525の配列番号45に少なくとも60%、特に少なくとも80%、85%又は95%同一な、又はWO 03/049525の配列番号49と比較される、アミノ酸配列を持つ酵素をコード化する遺伝子がある。特に適したLDH遺伝子としてはまた、WO 03/049525の配列番号46又は50に少なくとも60%、80%、85%又は95%同一な、タンパク質配列を持つ酵素をコード化する遺伝子がある。
外因性LDH遺伝子は、1又は2以上のプロモーター及び1又は2以上のターミネーターの転写制御下にあり、これら両者は、改変した酵母細胞内で機能を有する。適切なプロモーター及び、ターミネーターは、選択マーカー遺伝子カセットに関して以前に記載した、及び、WO 99/14335、WO 00/71738、WO 02/42471、WO 03/102201、WO 03/102152及びWO 03/049525にもまた記載した。特に有用なプロモーターは、宿主細胞のPDCl、PGK、TEFl、又はTEF2遺伝子に対するプロモーターの機能性部分を含み、又はこのようなプロモーターに少なくとも80%,85%,90%又は95%同一である。特に好ましいターミネーターは、宿主細胞のPDC1遺伝子に対するターミネーターの機能性部分を含み、又はこれらに対して少なくとも80%,85%,90%又は95%同一である。
外因性LDH遺伝子は、宿主細胞のゲノム中にランダムに組み込まれる、又は1又は2以上の標的となる位置に組み込まれる。標的位置の例としては、PDC1遺伝子、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、グリセロール−3−ホスファターゼ遺伝子、ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ遺伝子又はグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子のような、意図的に欠失又は破壊した遺伝子の座位がある。外因性LDH遺伝子カセットは、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−3−ホスファターゼ、ジヒドロキシアセトンリン酸ホスファターゼ又はグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失又は破壊のための構築物上に存在してもよい、またこのようにして、同時に欠失又は破壊を備えた遺伝子の座位に挿入されたものでもよい。
酵母細胞を形質転換して、外因性LDH遺伝子カセットを導入するための方法は、WO 99/14335、WO 00/71738、WO 02/42471、WO 03/102201、WO 03/102152及びWO 03/049525に記載されている。いくつかの方法は、本発明に適用できる。
本発明の遺伝的に改変した酵母細胞は、細胞に1又は2以上の所望の特性を与える付加的な遺伝的改変を含んでもよい。
本発明のラクタート産生細胞において特に興味ある他の付加的な改変としては、少なくとも1個のL-又はD-ラクタート:フェリチトクロムcオキシドリダクターゼ遺伝子の欠失又は破壊である。
温度、細胞密度、基質(単数又は複数)の選択、栄養素の選択等のような他の発酵条件は、本発明にとって重要ではなく、また一般的に処理を経済的に行うために選択される。増殖期及び産生期の各期間の温度は、酵母株が高温に何処まで耐えられるかにある程度依存するが、培地の凍結温度から約50℃の範囲である。特に産生期において、好ましい温度は、約30〜45℃である。
産生期の間、発酵培地中の細胞濃度は、0.1から20乾燥細胞/L発酵培地の間、好ましくは0.1から5乾燥細胞/L発酵培地の間、より好ましくは1から3g乾燥細胞/L発酵培地である。発酵は、好気的に、ミクロ好気的に、又は嫌気的に行われる。もし望むならば、WO 03/102200に記載されているように、酸素取り込み速度をプロセス制御に用いることができる。本発明の細胞は、酸素取り込み速度が4から12,特に5から10mmol/L/hrにより特徴付けられるミクロ好気的条件下で培養する時、特によい成果を発揮することができる。
緩衝効果を伴う発酵において、酸の発酵産物は中和され、生成した相当する塩になる。従って、酸の回収は自由酸の再生を伴う。一般的に、これは細胞を取り除き、硫酸のような強酸で酸性にすることにより行われる。塩副産物が形成され(カルシウム塩が中和試薬であり、また硫酸が酸性化試薬である場合塩副産物はセッコウ)、これは、培地から分離される。その後、酸は培地から、T.B. Vickroy, Comprehensive Biotechnology, (M. Moo-Young編), Vol. 3, 38章, Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta,他, FEMS Microbiol. Rev., 1995, 16:221-231; U.S. Patent Nos. 4,275,234、4,771,001、5,132,456、5,420,304、5,510,526、5,641,406、及び5,831,122,及びWO 93/00440に記載されたように、液−液抽出、蒸溜、吸着等々の技術により回収される。
また、発酵過程の開始前又は開始時に、発酵培地のpHを酸産物のpKaと等しい又はそれ以下に合わせることにより酸産物を産生するための発酵を行うことは可能である。従って、培養を通してpHは、産物のpKaに等しい、又は以下に保たれる、又は発酵が進むに従い、酸のpKa以上まで増加することは許されてもよい。前者の場合、pHは好ましくは、約1.5から約3.5の間の範囲;約1.5から約3.2の間の範囲;又は約2.0から約3.0の間の範囲に保たれる。
本発明の細胞が発酵条件下で高い増殖能を示すことを見出した。細胞は、様々な用途にグリセロールを使うのでこれは驚くべきことであり、また野生型の酵母細胞において、グリセロールの役割は、NADH/NAD+をバランスさせる働きがあると信じられてきた。細胞自体のためのグリセロール産生量の低下を補うために、グリセロールを発酵培地中に加える事は、本発明の範囲内である。しかしながら、申請者等は、少なくともいくつかの発酵過程において、このようなことをしても少しも利益がなかったことを見出した。
実施例1A:K. marxianus CD607株の突然変異誘発及びグリコール酸耐性の変異株(CD853)の選択。
K. marxianus CD607株はWO 03/102152の実施例3Dに記載されている。この株には、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の欠失があり、またその座位に外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の挿入がある。CD607株の細胞を、紫外線に暴露して、突然変異誘起させた。
新しいYP(酵母抽出物プラスペプトン)+20g/Lグルコースプレートからの細胞を、2mLの酵母ペプトン+50g/Lグルコースに約6OD600単位を再懸濁した。10個のこの懸濁液の各125μL分量を10個の300μL96穴マイクロタイタープレートのウェルにピペットして加える。90〜99%の細胞を殺すために、このマイクロタイタープレートを12,500μJoule/cm2紫外線に対して暴露する。その後、細胞を選択培地にプレートする前に、このマイクロタイタープレートを暗黒中で、一晩、30℃で、攪拌(225rpm)し、細胞を回復させる。
その後、100μLのUV処理細胞懸濁液をポテトデキストロース寒天(PDA)+15g/Lグリコール酸プレートに蒔種し、グリコール酸耐性株を選択する。これらのプレートを、コロニーが表れるまで、30℃で、数日間インキュベートする。更なる解析のために単一コロニーを取り出す。
約2×108個の紫外線処理(突然変異誘発処理)した細胞を15g/Lグリコール酸を含むPDAプレートに蒔種し、30℃でインキュベートした。これらのプレート上で増殖したコロニーを30℃、225rpm振盪で一晩バッフル振盪フラスコ中及び緩衝剤なしのYP(酵母ペプトン)+100g/Lグルコース中で増殖させた。その後これらのフラスコから2g/L乾燥細胞重量取り出して、産生用のフラスコに接種した。YP+グルコース50g/Lの入った産生用フラスコを、30℃、70rpm振盪で培養した。WO 03/102201の実施例1Mに記載した方法を用いて、グルコース、ラクタート、エタノール及びピルビン酸塩をHPLCで時間を決めて測定するためにサンプルを取り出した。88時間後に26g/Lラクタートを産生する株をCD635株と表した。CD635株は、ラクタートを唯一の炭素源として増殖可能である。
CD853株はラクタートを唯一の炭素源として増殖できないので、ネイティブなL-乳酸:フェリチトクロムcオキシドリダクターゼ遺伝子(KmCYB2)がこの突然変異体では、非機能的になっていると示唆される。従って、フィデリティの高いFailSafe酵素及び鋳型としてゲノムDNAを用いたPCRにより、KmCYB2コード領域プラスKmCYB2コード領域から〜500bp上流及び下流をこの株から増幅する。得られた〜2.75kbpPCR産物をQiagenカラムにより精製して、全KmCYB2コード領域について配列決定した。CD853株は、KmCYB2遺伝子の62番目アミノ酸位置で4塩基の挿入が発見され、これがフレームシフト変異を起こし、76番目アミノ酸位置で停止コドン及び切り取られたタンパク質をもたらす。
pVR29(WO 03/102152の実施例1C及び図4に記載)と表されるプラスミドは、ピルビン酸デカルボキシラーゼプロモーター及びGAL10ターミネーターの制御下のTn903のカナマイシン抵抗性遺伝子(G418遺伝子)を含む。プラスミドpVR29を、MluI及びPstIで消化し、得られたG419遺伝子カセットを含む5.1kbp断片をゲルにより精製して、脱リン酸化する。K. marxianus GPD(KmGPD1F)遺伝子の上流の1.2kbp領域DNAを、配列番号14及び配列番号15をプライマーとして、K. marxianusゲノムDNAを鋳型として、PCR増幅する。PCR産物をゲルにより精製し、MluI及びPstIで消化し、pVR29プラスミド由来の5.1kbp断片と連結し、pBH158(図1)と名付けるプラスミドを作成する。プラスミドpBH158は、転写順に、KmGPD1F遺伝子の隣接1.2kbp上流及びG418発現カセットを含む。
第2の欠失ベクターのために、プラスミドpVR29をNgoMIV及びAatIIで消化し、G418発現カセットを含む4.7kbp断片をゲルで精製し、脱リン酸化する。KmGPD1F遺伝子の下流0.7kbp領域DNAを、配列番号16及び配列番号17と表されるプライマー及び、K. marxianusゲノムDNAを再び鋳型としてPCRで増幅する。このPCR産物をゲルで精製し、NgoMIV及びAatIIで消化し、pVR29の4.7kbp断片に連結し、pBH159(図2)と表されるプラスミドを作成する。プラスミドpBH159は、転写順に、G418発現カセット及びKmGPD1F遺伝子の隣接0.7kbp下流を含む。
プラスミドpBH158をMluI及びHindIIIで消化する。これらの制限酵素は、プラスミドを切断し、KmGPD1F遺伝子の隣接上流1.2kbp断片及びG418発現カセットの一部を含む、2.6kbp断片を作る。この断片を、アガロースゲルから抽出する。プラスミドpBH159をXhoI及びNgoMIVで消化する。これらの制限酵素は、プラスミドを切断し、G418発現カセットの一部及びKmGPD1F遺伝子の隣接下流0.7kbp断片を含む2.0kbp断片を作る。この断片をアガロースゲルから抽出する。2個の抽出した断片は、断片の末端に幾らかの重複部分をもつ全G418発現カセットを含む。
CD853株を一晩、YP+60g/Lグルコース+0.2M MES+1%エタノール、pH 6.5中で増殖させ、プラスミドpBH158からの2.6kbp断片及びpBH159からの2.0kbp断片を同時にエレクトロポレート(電気穿孔)させる。形質転換体を、30℃、YP+20g/Lグルコース+300μg/mLG418プレート上に藩種し、その後2日間増殖させて、選択する。15個の形質転換体を拾い上げ、YP+20g/Lグルコース+G418プレートに再ストリーク(筋状に再蒔種)して、一晩増殖させる。両断片で共形質転換し、また両断片がKmGPD1F座位に相同的に組み込まれた細胞だけがG418耐性であろう。
KmGPD1F遺伝子の欠失は、配列番号18及び配列番号19と表されるプライマーを用いたPCRにより証明される。7個の形質転換体は、PCRにより3.4kbpの単一バンドを示し、KmGPD1F遺伝子がこれらの形質転換体において、欠失されていることを示す。これらの形質転換体の1つは、CD1606株と表される。
プラスミドpVR29をMluI及びKpnIで消化し、得られたG418遺伝子カセットを含む5.1kbp断片をゲルで精製し、脱リン酸化を行う。ネイティブGPP遺伝子(KmHOR2遺伝子)の直接上流0.9kbp領域DNAを、配列番号20及び配列番号21と表わすプライマー及び、K. marxianusゲノムDNAを鋳型としてPCR増幅を行う。このPCR産物をゲルで精製し、MluI及びKpnIで消化し、プラスミドpVR29からの5.1kbp断片に連結し、pBH160(図3)と表されるプラスミドを作成する。プラスミドpBH160は、転写順に、KmHOR2遺伝子の隣接上流0.9kbp断片及び、G418発現カセットを含む。
プラスミドpVR29をNgoMIV及びSpeIで消化し、G418遺伝子カセットを含む4.7kbp断片をゲルで精製し、脱リン酸化を行う。KmHOR2遺伝子の直接下流0.8kbp領域DNAを、配列番号22及び配列番号23と表わすプライマー及び、K. marxianusゲノムDNAを鋳型としてPCR増幅を行う。このPCR産物をゲルで精製し、NgoMIV及びSpeIで消化し、pVR29からの4.7kbp断片に連結し、pBH161(図4)と表されるプラスミドを作成する。プラスミドpBH161は、転写順に、KmHOR2遺伝子の隣接下流0.8kbp断片及び、G418発現カセットを含む。
プラスミドpBH160をMluI及びHindIIIで消化する。これらの制限酵素によるプラスミド切断により、K. marxianus GPP遺伝子(KmHOR2遺伝子)の隣接上流0.9kbp領域DNA及びG418発現カセットの一部を含む2.3kbp断片が作成される。この断片をアガロースゲルから抽出する。プラスミドpBH161をXhoI及びNgoMIVで消化する。これらの制限酵素によるプラスミドの切断により、KmHOR2遺伝子の隣接上流0.8kbp及びG418発現カセットの一部を含む2.0kbp断片が作成される。この断片をアガロースゲルから抽出する。抽出したこの2個の断片は組みとなって、この断片の末端に幾らかの重複を持った全G418発現カセットを含む。
CD853株を一晩、YP+60g/Lグルコース+0.2M MES+1%エタノール、pH6.5中で増殖させ、プラスミドpBH160からの2.3kbp断片及びプラスミドpBH161からの2.0kbp断片を電気穿孔する。形質転換体をYP+20g/Lグルコース+300μg/mLG418プレート上で、30℃、2日間の増殖し、その後選択する。15個の形質転換体をYP+20g/Lグルコース+300μg/mLG418プレートに再ストリークし、一晩増殖させる。全ての形質転換体はこの培地で増殖する。両断片で共形質転換し、両断片がKmHOR2遺伝子座位に相同的に組み込まれた細胞のみが、G418耐性であろう。
KmHOR2遺伝子の欠失は、配列番号20及び配列番号21と表されるプライマーを用いたPCRにより証明される。3個の形質転換体は、3.8kbpの単一バンドを示し、KmHOR2遺伝子がこれらの形質転換体において、欠失されていることを示す。これらの形質転換体の1つは、CD1608株と表される。
CD853、CD1606及びCD1608株を個別にミクロ好気的条件下で培養する。CD1606及びCD1608株の場合、デュプリケート(一対の試料)の発酵を行う。夫々の場合、1段階バッチ培養反応容器を用いる。発酵培地は、規定された培地であり、硫酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、及び硫酸マグネシウム、微量元素、ビタミン類、発泡抑制剤、及び約90g/Lグルコースを含む。培地のpHは、水酸化カリウムを加えて、3.0に合わせる。培地を30℃に設定し、1mLの細胞を接種する。細胞を、30℃で攪拌しながら、酸素取り込み速度5〜6mmol/L/hrになるような好気的条件で、培養する。酸素取り込み速度は、WO 03/102,200に記載された方法に従い測定する。
発酵培地の試料を定時的に取りだし、ラクタート、酢酸塩、グリセロール及びピルビン酸塩を検定する。二酸化炭素産生は、反応容器から排出した気体の二酸化炭素含量の測定により行う。
CD853株(本発明の実施例ではない)は、発酵の初期段階からラクタート滴定濃度が約20g/Lになるまで、0.85g/L-hrの速度でラクタートを産生する。この時点までのラクタートの収量は、約70%である。その後、乳酸産生は約0.76g/L-hrまで低下し、またラクタート収量も僅かに低下する。この株による産生は、86時間後に停止し、この時点で、発酵培地は11g/Lグルコースを含む。ラクタート滴定濃度は、59g/Lである。全体としてのラクタート産生速度は、0.65g/L-hrであり、また全体としてのラクタート収量は70%である。CD853株の場合のピルビン酸塩、酢酸塩、グリセロール及び二酸化炭素収量は、それぞれ、0.6%、0%、5.1%及び14%である。バイオマス収量は、6.4%である。
CD1608株は初期の発酵段階から、ラクタート滴定濃度が約20g/Lになるまで、0.66g/L-hrの速度で乳酸を産生する。この時点までの、ラクタート収量は、約70〜75%である。その後、乳酸産生は約0.37g/L-hrまで低下し、またラクタート収量は僅かに低下する。この株による産生は137時間後に停止し、この時点で、発酵培地は、19g/Lグルコースを含む。ラクタート滴定濃度は、42g/Lである。全体としてのラクタート産生速度は、0.31g/L-hrであり、全体としてのラクタート収量は、59〜60%である。CD1608株の場合のピルビン酸塩、酢酸塩、グリセロール及び二酸化炭素収量は、それぞれ、0〜0.1%、0.8%、0%及び26〜28%である。バイオマス収量は、7.9〜8.2%である。これらの結果より、ネイティブKmHOR2遺伝子の欠失は、また、細胞のグリセロール産生能を妨害する。再び、この遺伝子の欠失(及び結果としてのグリセロール産生の欠乏)は細胞増殖に全く影響を持たない。
いくつかの酵母種(S. cerevisiae、K. marxianus、Y. lipolytica、P. jadinii、D. hansenii及びC. glabrata)由来の既知のグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をアライン(整列化)して、様々な遺伝子の間で高度に保存されている領域を同定する。2セットのディジェネレート(縮退した)プライマーを、高い相同性を有するこれらの領域から設計する。これらのセットは、それぞれ、配列番号24,配列番号25,及び配列番号26及び配列番号27と表わす。最初のセットのプライマー及びI. orientalisゲノムDNAを鋳型として用いて、PCRを行い、予想した〜200bp産物を得る。2番目のセットのプライマー及び鋳型としてI. orientalisゲノムDNAを用いて、再び、PCRを行い、予想通り〜400bpの産物を得る。2つのPCR産物をゲルで精製して、同一プライマーを用いて配列決定を行う。得られた部分配列を用いて、ゲノムウオーキングのためのプライマーを設計する。BD Clontech Genome Walking Kitを用いて、製造者の使用説明書に従い、配列番号28及び配列番号29と表されるプライマー及び、配列番号30及び配列番号31と表されるネステッドPCRプライマーを用いて、ゲノムウオーキングを行う。ゲノムウオーキングの上流及び下流から得られた配列をアラインして、以前に得た部分配列と融合させて、I orientalisグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を構築する。
プロモーター及びターミネーター領域を含む全K. marxianus CYB2(KmCVB2)遺伝子カセットを、CD21と表される野生型K. marxianus株のゲノムDNAより、配列番号32及び配列番号33と表されるプライマーを用いて、BamH1及びSalI制限酵素位置を導入して、PCR増幅する。PCR産物は、BamHI及びSalIで消化済みのpUC18と命名された商品ベクター(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA USA)と連結する。得られプラスミドをpMM25と表わす。
配列番号34と表される705bp配列をK. thermotoleransのゲノムDNAより、配列番号35及び配列番号36と表されるプライマーを用いて、Sph1及びSalI制限酵素位置を導入して、PCR増幅する。このK. thermotolerans配列は、如何なる活性タンパク質もコードしてない。プラスミドpMM25をSphI及びSalIで消化し、K. thermotolerans配列をKmCYB2カセットの上流(5')に連結し、pMM27として表されるプラスミドを作成する。
同一K. thermotolerans配列を、配列番号37及び配列番号38と表されるプライマーを用いて、BamHI及びXmaI制限酵素位置を加えてPCR増幅する。プラスミドpMM27をBamHI及びVmaIで消化し、このK. thermotolerans配列をKmCYB2カセットの下流(3')に連結し、pMM28(図5)と表されるプラスミドを作成する。プラスミドpMM28は、K. thermotolerans直列反復配列に隣接したKmCYB2カセットを、どちらも同一方向で、含む。
C. sonorensisのゲノムDNAから、C. sonorensis PGK1遺伝子の920bp断片を、配列番号39及び配列番号40と同定したプライマーを用いて、WO 02/042471の実施例22に記載した同一方法で得る。ゲノムDNAを増殖期のI. orientalis株から抽出し、10mM Tris−HCl+1mM EDTA(pH8)(TE)に再懸濁する。I. orientalisゲノムDNAをHindIIIで切断し、Southernブロットを調整し、C. sonorensis PGK1遺伝子をプローブとして、標準的方法で、ハイブリダイズする。アガロースゲルより〜2kb長の断片を抽出し、HindIII切断プラスミドにクローニングし、サイズ分画ライブラリーを作成し、E. coliに形質導入する。配列決定により証明されるように、PGK1プローブによるサイズ分画ライブラリーのコロニーハイブリダイゼーションにより、I. orientalis PGK1(IoPGK1)タンパク質コード配列の大部分持つが、プロモーター配列は持たないHindIII断片を含むプラスミドを抽出できる。
IoPGK1プロモーター領域を含むゲノム断片をライゲーションーメディエイティッド(連結反応介在)PCR増幅によって得る(Mueller, P.R.及びWold, B. 1989, "In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR." Science 246:780-786)。配列番号41と表されるリンカー及び配列番号42と表されるリンカーの混合物を、HaeIII−消化のI. orientalisゲノムDNAとT4DNAリガーゼ(New England BioLabs)を用いて連結する。この連結混合物の試料を、配列番号43と表される0.1μMのプライマー及び配列番号44と表される1μMプライマーを含む50μL PCR反応の鋳型として用いた。2UのDynazyme EXTを添加後、反応混合物を94℃3分加熱する。反応混合物を以下のように30サイクル繰り返す:94℃、1分;68℃、2分;及び72℃、2分;そして最後の伸長のために72℃、10分行う。第1PCR増幅の稀釈した試料を、0.05μMの配列番号45と同定したプライマー及び0.5μMの配列番号46と同定したプライマーを含む、ネステッドPCR反応(50μL)の鋳型として用いる。2UのDynazyme EXTを加えた後、反応混合物を94℃、3分加熱する。その後反応を以下のように30サイクル繰り返す:94℃、1分;67℃、2分;及び72℃、2分;そして最後の伸長に72℃、10分行う。
I. orientalis PGK1プロモーター領域を、配列番号51及び配列番号52と表わすプライマー、及び鋳型としてI. orientalisゲノムDNAを用いてPCR増幅する。断片をKlenow酵素を用いて埋めて平滑末端にし、XbaIで切断する。633bp断片をゲルで抽出し;その後pMI270(WO 03/049525の図4に記載)と表わすプラスミドをXhoIで消化し、Klenow酵素及び0.1mMdNTPを用いて埋めて平滑末端にし、XbaIで消化した4428bp断片に連結する。プラスミドpMI270はC. sonorensis PGK1プロモーター及びS. cerevisiae GAL10ターミネーターに連結したE. coliヒグロマイシン遺伝子を含む。得られたプラスミドは、pMI318(図6)と表される。プラスミドpMI318は、I. orientalis PGK1プロモーター及びS. cerevisiae GAL10ターミネーター制御下にあるE. coliヒグロマイシン遺伝子を含む。
プラスミドpMI318及びpMI320を、ApaI及びNotIで消化する。プラスミドpMI318由来の5008bp断片をプラスミドpMI320由来の1995bp断片と連結し、プラスミドpMI321(図7)を作成する。
ヒグロマイシン遺伝子(及びそのターミネーター)はプラスミドpMI321上の2コピーのIoPGK1プロモーター(これは直列反復配列として働く)の間に位置する。
野生型I. orientalis株ATCC PTA-6658のゲノムライブラリーを、製造者の提供した説明書に従い、SuperCos1 (Staratagene)コスミドベクターに構築する。PDC類似の配列を配列番号55及び配列番号56で表されるプライマーを用いて、本株のゲノムDNAよりPCR増幅する。PDC遺伝子の700bp断片を増幅する。WO 03/049525に記載される様に、プローブとして標識したPCR断片を用いたハイブリダイゼーション技法を用いて、ゲノムライブラリーをスクリーニングし、PDC遺伝子を含むコスミドクローンを抽出し、配列決定する。オープンリーディングフレーム(読み取り枠)の開始点の1000bpから167bp上流のI. orientalis PDC1A5'領域を、配列番号57及び配列番号58で表されるプライマー、及び鋳型としてI. orientalis PDC1AコスミドDNAを用いて、PCR増幅する。この断片をSalI及びSacIで切断する。836bp断片をゲルから抽出して、SalI及びSacIで消化したプラスミドpMI321(図7,実施例4C)から得た6992bp断片と連結する。得られたプラスミドをpMI355(図8)と名付ける。
PDC飜訳停止コドンの524bp上流から217bp下流の配列に相当するI. orientalis PDC1A3'領域を、配列番号59及び配列番号60で表されるプライマー及び鋳型として、I. orientalis PDC1AコスミドDNA(実施例4D)を用いて、PCR増幅する。断片をApaI及びSmaIで切断する。630bpの断片をゲルから抽出して、ApaI及びSmaIでpMI355プラスミド(図8、実施例4D)を消化して得た7809bp断片と連結する。得られたプラスミドをpMI357(図9)と名付ける。このプラスミドは、pMI355プラスミドのIoPDC1A遺伝子の5'隣接及び3'隣接の一部の間由来のヒグロマイシン及びLDHカセットを含む。
I. orientalis PDC1A3'領域の異なる区域を用いる以外、同じ方法で、プラスミドPMI356を構築する。
I. orientalis PGK1プロモーターを、配列番号61及び配列番号62で表されるプライマー及び鋳型としてI. orientalis ゲノムDNAを用いてPCR増幅する。断片をKlenow酵素及び0.1mM dNTPを用いて埋め、SphIを用いて切断する。669bp断片をゲルで抽出する。pMI233(WO 03/049525の図23Cに記載)と名付けられたプラスミドをXhoIで切断する。この断片をKlenow酵素で埋め、SphIで切断する。4534bp断片と669bp断片を連結し、得られたプラスミドをpMI319と名付ける。プラスミドpMI319は、S. cerevisiae MEL5 (ScMEL5)遺伝子及びIoPGK1プロモーター領域を含む。
プラスミドpMI319をApaIで切断し、T4ポリメラーゼにより平滑末端にして、NotIで切断する。2317bp断片をゲルから抽出する。この断片をプラスミドpMI357(実施例4E)をSalIで消化して得られる6498bp断片と連結し、Klenow酵素で平滑末端化し、NotIで切断する。得られたプラスミドは、pMI357プラスミドのヒグロマイシン遺伝子の代わりにScMEL5遺伝子(ネイティブターミネーターと共に)を含む。得られたプラスミドをpMI433(図10)と表わす。
プラスミドpMM28(図5,実施例4B)をBamHIで消化し、Klenow酵素で埋め、SalIで消化する。得られた4077bp断片をpMI433(図10,実施例4F)の2317bpのNotI(Klenow酵素で埋める)-SalI断片と連結する。得られたプラスミドをpMI445と表わす。
I. orientalis L−乳酸:フェリチトクロムcオキシドリダクターゼ(IoCYB2A)遺伝子(予想されたオープンリーディングフレームの開始の90から676bp下流の配列に相当)の3'隣接領域を、配列番号63及び配列番号64で表されるプライマー及び鋳型として、CYB2-2コスミドクローンを用いて、PCR増幅する。このPCR産物をSacI及びSmaIで消化し、607bp断片をプラスミドpMI445の6386bpSacI-SmaI断片と連結する。得られたプラスミドをpMI448と表わす。
IoCYB2A5'隣接領域(予想したオープンリーディングフレームの開始の913から487bp上流の配列に相当)を、配列番号65及び配列番号66で表されるプライマー及び鋳型として、再度、CYB2-2コスミドクローンを用いてPCR増幅を行う。PCR産物をSphIで消化し、この454bp断片をpMI448の部分消化により得られる6993bpSphI断片と連結する。得られたプラスミドをpMI449(図11)と表わす。
IoCYB2A5'隣接領域(予想したオープンリーディングフレームの開始の466から467bp上流の配列に相当)を、配列番号67及び配列番号68で表されるプライマー及び鋳型として、再度、CYB2-2コスミドクローンを用いてPCR増幅を行う。PCR産物をSphIで消化し、この493bp断片をpMI448の部分消化により得られる6993bpSphI断片と連結する。得られたプラスミドをpMI453と表わす。
IoCYB2A3'隣接領域(予想した停止コドンの402bp上流から77bp下流の配列に相当)を、配列番号69及び配列番号70で表されるプライマー及び、鋳型としてCYB2-2コスミドを用いてPCR増幅を行う。PCR産物をApaI及びSmaIで消化し、この506bp断片をプラスミドpMI453の6886bpApaI-SmaI断片と連結する。得られたプラスミドをpMI454(図12)と表わす。
5'CYB2A隣接相同体を削除するために、プラスミドpMI449をNdeI及びSbfIで消化する。6.8kbp断片をゲルで抽出し、脱リン酸化する。実施例4AからのIoGPD1遺伝子の302bp断片(この遺伝子の開始コドンから1〜302塩基対に相当)を、配列番号71及び配列番号72で表されるプライマーを用いて、PCR増幅する。PCR産物をゲルで精製し、NdeI及びSbfIで消化し、PMI449由来の6.8kbp断片と連結して、プラスミドpBH164を作成する。プラスミドpBH164をXmaI及びEcoRIで消化して、3'CYB2A隣接相同体を削除する。6.5kbp断片をゲルで精製し、脱リン酸化する。実施例4A由来のIoGPD1遺伝子の346bp断片(開始コドンから322〜668塩基対に相当)を、配列番号73及び配列番号74で表されるプライマーを用いてPCR増幅する。このPCR産物をゲルから精製し、XmaI及びEcoRIで消化し、pBH164から得た6.5kbp断片と連結して、pBH165を作成する(図13)。
プラスミドpBH165は、転写順に、IoGPD1遺伝子の302bp断片、第1のK. thermotolerans直列反復区域、MEL5遺伝子カセット、第2のK. thermotolerans直列反復区域、及びIoGPD1遺伝子の346bp断片を含む。ネイティブIoGPD1遺伝子座位(遺伝子の破壊を伴い)での挿入、その後MEL5遺伝子カセットのループアウトが設計される。
標準的方法で、野生型I. orientalis株ATCC PTA-6658をプラスミドpMI356で形質転換する。ヒグロマイシンプレート上で増殖する形質転換株を培養する。エタノールを産生しない形質転換体を選択して、Southern解析を行い、IoPDC1A両対立遺伝子の欠失、及び少なくとも1コピーのLhLDH遺伝子の組み込みを確認する。この株をCD1184と表わす。
酢酸リチウム法を用いて、CD1184株をプラスミドpMI449で形質転換し、形質転換体(青色コロニー)をYPD X-α-galプレート上のメリビアーゼ活性をベースに選択する。いくつかの形質転換体について、CD1184株のIoCYB2A遺伝子の置き換えを、コロニーPCR及びSouthern解析により確認した。Southern解析により確認したように、K. thermotolerans反復配列について相同組換え事象を介して、MEL5マーカーは、これらの形質転換体の一つからループアウトする。その後、プラスミドpMI454を用いて、第2のCYB2A対立遺伝子が、この形質転換体から欠失される。コロニーPCRによりこれらの形質転換体を解析により、1000bpCYB2A特異的PCR産物が不在なことが示される。前記のような組換えにより、プラスミドpMI454由来のMEL5マーカーは、第2のCYB2A対立遺伝子を欠失した形質転換体からループアウトする。この形質転換体は、CD1436株と表される。CD1436株は、両PDC1遺伝子(機能性L-LDH遺伝子カセットの置き換えにより)を欠失し、また2個のネイティブなIoCYB2A遺伝子の各々を欠失する。
暴露条件が8μL、1時間という以外、実施例1Aに述べた条件を用いて、CD1436株を、EMS突然変異誘起処理させる。突然変異誘起した細胞を6時間、200μLのYP+20g/Lグルコース培地中で回復させ、その後PDA+35g/L乳酸プレートに蒔種し、1週間、30℃で培養する。CD1436株より、より多くのラクタート、またより少ないグリセロールを産生する株を、CD1496株と表わす。
CD1184株を増殖させ、プラスミドpBH165をNdeI及びEcoRIで消化して得られた4.4kbp断片5μgで形質転換する。形質転換体を、X-α-gal(−−4−クロロー3−インドリル−aD―ガラクトピラノシド)を重層した酵母窒素塩基(YNB)+2%メリビオースプレート上で選択する。30℃で〜4日間の増殖後、青色形質転換体を見ることができる。8個の形質転換体を拾い上げ、X-α-galを含むYP+20g/Lグルコースプレート上に単一コロニーを蒔種する。各形質転換体当たり単一青色コロニーを拾い上げ、YP+20g/Lグルコースプレートに再ストリークする。ゲノムDNAを形質転換体より抽出する。IoGPD1遺伝子の1個の対立遺伝子の破壊が、配列番号75及び配列番号76と表わすプライマーを用いたPCRにより証明される。5個の形質転換体は、予期した〜2kb産物を示す。これらの形質転換体の一つを、CD1655株と表わす。ネイティブIoGPD1遺伝子の1コピーの破壊が、さらに、配列番号77及び配列番号78と表わすプライマーを用いたPCRにより証明される。
CD1665株をYP+100g/Lグルコース中、30℃で、数世代増殖させる。稀釈シリーズをx-α-galを重層したYP+20g/Lグルコースプレートに蒔種し、30℃一晩増殖させる。白色コロニー(MEL5マーカーカセットがループアウトしたことを示す)を選択し、YP+20g/Lグルコース+x-α-galプレートに再ストリークする。白色コロニーを選択する。ネイティブIoGPD1遺伝子の1対立遺伝子の破壊が配列番号69及び配列番号80で表されるプライマーを用いたPCRにより証明される。この形質転換体をCD1667株と表わす。
CD1496株を同様に形質転換する。PCRによる予期した〜2kbpバンドを表わす形質転換体をCD1657株と表わす。ネイティブIoGPD1遺伝子の1個の対立遺伝子の破壊が、CD1655株に対して記載した様に、PCRにより証明される。CD1657株をさらに数世代増殖させ、欠失したMEL5マーカー遺伝子カセットを示すコロニーを選択し、CD1671株と表わす。ネイティブIpGPD1遺伝子の1個の対立遺伝子の破壊が、以前に記載した様に、PCRにより証明される。
CD1667株を、プラスミドpBH165をNdeI及びEcoRIによる消化で得た、4.4kbp断片5μgで形質転換する。形質転換体を、x-α-galを重層したYNB+2%メリビオースプレート上で選択する。30℃〜4日間の増殖後、青色の形質転換体が可視となる。10個の形質転換体を拾い、単一コロニーをx-α-galを含むYP+20g/Lグルコースプレートに蒔種する。各形質転換体について、単一青色コロニーを拾い、YP+20g/Lグルコースプレートに再ストリークする。形質転換体より、ゲノムDNAを単離する。IoGPD1遺伝子の第2の対立遺伝子の破壊が、配列番号81及び配列番号82と表されるプライマーを用いたPCRにより、3個の形質転換体について証明される。これらの形質転換体の一つは、CD1688株と表される。
CD1671株を、同様に形質転換する。PCRにより、IoGPD1遺伝子の第2の対立遺伝子が1個の形質転換体において破壊されていることが証明され、この株をCD1690株と表わす。
1mLのCD1688株を、硫酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、及び硫酸マグネシウム、微量元素、ビタミン類、発泡抑制剤、及び、約50g/Lグルコースを含む、規定された培地を含む1段階バッチ培養反応器に接種する。細胞を加える前に、培地のpHを約3.5に合わせる。培養のpHは、細胞の増殖、及び乳酸の産生に従い、3,0まで低下することを認める。その後、水酸化カリウムの添加により、pHを約3.0に維持する。グルコースを、全体で136.1g/Lグルコースを添加するまで、発酵培地に約1〜2g/L/hr加える。細胞を空気混和の条件下で30℃で培養するが、この条件では酸素取り込み速度は約5.5〜5.6mmol/L/hrである。
CD1688株は、ラクタートをラクタート濃度が約70g/Lになるまで、1.02g/L-hrの速度で産生する。この時点までのラクタート収量は、約74%である。この株による産生は、77時間後に停止するが、この時点で発酵培地は、15.3g/Lグルコースを含む。全体としてのラクタートの産生速度は、1.06g/L-hrであり、また全体としてのラクタートの収量は、70%である。CD1688株の場合のピルビン酸塩、グリセロール及び二酸化炭素の収量は、夫々、1.9%、0%及び23.7%である。バイオマスの収量は3.5%である。
比較のために、CD1184株(本発明の例ではない)を同様な条件で培養する。CD1184株は、ラクタート濃度が約70g/Lになるまで、ラクタートを1.24g/L-hrの速度で産生する。この時点でのラクタート収量は約74%である。この株による産生は、77時間後に停止し、この時点での発酵培地は15.3g/Lグルコースを含む。全体としてのラクタート産生速度は、1.06g/L-hrであり、ラクタートの全体としての収量は、70%である。CD1184株のピルビン酸塩、グリセロール及び二酸化炭素の収量は、夫々、2.1%、9.3%、及び15.9%である。バイオマスの収量は、3.2%である。
これらの結果から、これらの発酵条件下で、ネイティブIoGPD1遺伝子の欠失により、細胞が測定できる量のグリセロールを産生しなくなることを示す。前と同様、この遺伝子の欠失(及び結果としてのグリセロール産生の欠如)は、細胞増殖に殆ど又は全く効果を持たない。
CD1688及びCD1184株を別々に、空気混合条件を酸素取り込み速度(OUR)が9.9〜10.0mmol/L/hrになるように選び、また培養中グルコースを加えないという以外は、実施例5に記載した一般的手法で培養する。CD1688株培養の際は、酵母殻を培地に加える。
これらの条件下で、CD1184株は、ラクタート濃度が約70g/Lになるまで、ラクタートを1.87g/L-hrの速度で産生する。この時点までのラクタート収量は、約73%である。この株による産生は、67.5時間後に停止し、この時点での発酵培地中のグルコース濃度は60g/Lから2.1g/Lに減少する。全体としてのラクタート産生速度は、1.43g/L-hrであり、ラクタートの全体としての収量は、70%である。CD1184株のピルビン酸塩、グリセロール及び二酸化炭素の収量は、夫々、2.1%、5.7%、及び21.5%である。バイオマスの収量は、4.4%である。
CD1688株は、ラクタート濃度が約70g/Lになるまで、ラクタートを1.68g/L-hrの速度で産生する。この時点までのラクタート収量は、約80%である。この株による産生は、78時間後に停止し、この時点での発酵培地中のグルコース濃度は53.5g/Lから4.8g/Lに減少する。全体としてのラクタート産生速度は、1.26g/L-hrであり、ラクタートの全体としての収量は、77%である。CD1688株のピルビン酸塩、グリセロール及び二酸化炭素の収量は、夫々、1.2%、0%、及び23.2%である。バイオマスの収量は、5.95%である。前と同様、これらの結果から、これらの発酵条件下で、ネイティブIoGPD1遺伝子の欠失により、細胞が測定できる量のグリセロールを産生しなくなることまた、この遺伝子の欠失(及び結果としてのグリセロール産生の欠如)は、細胞増殖に殆ど又は全く効果を持たないことを示す。さらに、IoGPD1の欠失は、全体としてのラクタート収量を改善する。
空気混合条件を選択して酸素取り込み速度が5.75mmol/L/hrになるようにし、また発酵培地がYP+70g/Lグルコースを含む以外、CD1690株を、実施例5に記載した一般的手法で培養する。
CD1690株は、ラクタート濃度が約70g/Lになるまで、ラクタートを0.66g/L-hrの速度で産生する。この時点までのラクタート収量は、約78%である。この株による産生は、121時間後に停止し、この時点での発酵培地中のグルコース濃度は127.9g/Lから23.8g/Lに減少する。全体としてのラクタート産生速度は、0.61g/L-hrであり、ラクタートの全体としての収量は、77%である。ピルビン酸塩、グリセロール及び二酸化炭素の収量は、夫々、0%、0%、及び31.1%である。バイオマスの収量は、2.4%である。再び、これらの結果から、これらの発酵条件下で、ネイティブIoGPD1遺伝子の両対立遺伝子の欠失により、細胞が測定できる量のグリセロールを産生しなくなることまた、この遺伝子の欠失は、細胞増殖に殆ど又は全く効果を持たないことを示す。
OURを5.2mmol/L/hrにして、またグリセロールを発酵培地に添加する以外、実施例5に記載した一般的手法(この実施例に記載した確立した培地を用いて)で、CD1690株を2回以上培養する。第1回目の培養において、0.1g/Lグリセロールを添加し、また第2回の培養において1.0g/Lグリセロールを添加する。
0.1g/Lグリセロールを添加する場合、CD1690株は、ラクタート濃度が約70g/Lになるまで、ラクタートを0.74g/L-hrの速度で産生する。この時点までのラクタート収量は、約78%である。この株による産生は、121時間後に停止し、この時点での発酵培地中のグルコース濃度は117.8g/Lから10.2g/Lに減少する。全体としてのラクタート産生速度は、0.68g/L-hrであり、ラクタートの全体としての収量は、76%である。ピルビン酸塩、グリセロール及び二酸化炭素の収量は、夫々、0.2%、0%、及び25.3%である。バイオマスの収量は、4.1%である。
非常に類似した結果が1.0g/Lグリセロール添加の場合得られる。期待とは外れて、これらの結果より、発酵培地にグリセロール添加しても、細胞のネイティブなグリセロール産生能を破壊しても、これらの形質転換体の増殖能、及びラクタート産生能には殆ど、又は全く効果がないことを示す。
ヒグロマイシン遺伝子カセットを配列番号83及び配列番号84と表わすプライマー及び鋳型としてプラスミドpMI356(実施例4E,図9を参照)を用いて、PCR増幅する。PCR条件は、95℃5分間(1回);30サイクルの95℃(30秒)、56℃(30秒)、及び72℃(2分間);その後72℃10分間を1回である。得られたPCR産物をSpeI及びSalIで消化し、同様に消化したプラスミドpBH165(実施例4H,図13)に連結し、プラスミドpTMC61を作成する(図14)。
野生型I. orientalis株ATCC PTA-6658を低濃度のグルコース及び高濃度の乳酸を含む培地中で連続的に、多数世代増殖させる。この条件下で良く増殖する1個の細胞を分離して、CD1822株と表わす。CD1822株は、炭素源としてグルコースを含む培地中で培養する場合、エタノール及びグリセロールを産生する。CD1822株を増殖させ、実施例4Kに記載した同様の手順で、プラスミドpBH165で形質転換する。実施例4Kに記載したように、形質転換体を、x-α-gal(5−ブロモー4−クロロ−3−インドリル−a―D−ガラクトピラノシド)を重層した酵母窒素塩基(YNB)+2%メリビオースプレート上で選択する、即ち青色コロニーを拾い上げ、YP+20g/Lグルコースプレートに再ストリークする。形質転換体よりゲノムDNAを抽出し、2セットのPCR反応により、欠失構築物の組み込みについて解析する。第1のPCRは、配列番号85及び配列番号86と表わすプライマーを用い、また第2のPCRは、配列番号87及び配列番号88と表わすプライマーを用いる。これらにより、産生されたPCR産物は、夫々2.0kbp及び1.4kbpであり、1つのGPD1対立遺伝子が破壊されていることを示す。配列番号85及び配列番号88で表すプライマーを用いて、第3のPCR反応を行い、0.8kbp産物を産生し、このことは形質転換体の中にGPD1対立遺伝子がなお存在することを示す。この形質転換体をCD2624株と表わす。
配列番号89及び配列番号90で表すプライマー及び鋳型として、pTMC61を用いて、PCRを行う。4.1kbp断片を得て、CD2624株を形質転換するために用いる。形質転換体をYPD+300μg/mlヒグロマイシン上で選択する。100個の形質転換体より夫々ゲノムDNAを抽出し3セットのPCR反応の鋳型として用いる。第1セットのPCRは、配列番号91及び配列番号88で表すプライマーを用いて、30個の形質転換体において、1.5kbp産物を産生する。第2のPCR反応は、これら30個の形質転換体からのゲノムDNAについて、配列番号85及び配列番号92のプライマーを用いて行う。10株は、予想した2.5kbp産物を示した。その後、これら10株由来のゲノムDNAを、配列番号85及び配列番号88で表すプライマーを用いて解析する。0.8kbp断片を産生しない2株において、GPD1両対立遺伝子が破壊されている。これらをYNB+2.0%メリビオースプレート上での増殖テストを行った。1株は、増殖可能で、CD2627株と表わす。
CD1822、CD2624、及びCD2627株をデュプリケートのミクロ好気的振盪フラスコ発酵容器中で培養する。これらの株を、〜100g/mLグルコースを含む規定された培地25mLを入れた250mLバッフルフラスコ中で、30℃、250rpm攪拌で一晩培養する。規定された培地については、指定量のグルコース添加及びニコチン酸量を5mg/Lまで増やす以外、Peter M. Bruinenberg, Johannes P. Van Dijken及びW. Alexander Schefferes, 1983, An Enzymatic Analysis of NADPH Production and Consumption in Candida utilis, J. General Microbiology vol.129, pp.965-971に記載されている。
100g/Lグルコースを含む50mLの規定された培地を入れた250mLバッフルフラスコにOD600が0.2になるまで、上記の培養液を接種する。これらのフラスコを30℃、22時間、100rpmで攪拌してインキュベートする。その後、グルコース、グリセロール、及びエタノールについて、培地をHPLCで解析する。バイオマス収量も測定する。
CD1822株は、22時間の培養中全てのグルコースを消費して、6.0g/kgグリセロール、34.54g/kgエタノール及び14.8OD600のバイオマスを産生する。
1個のGPD1対立遺伝子を破壊したCD2624株は、全グルコースを消費して、5.88g/kgグリセロール及び35.25g/kgエタノールを産生する。14.5OD600のバイオマスを産生する。
GPD1両対立遺伝子を破壊したCD2627株は、22時間に12.39g/kgを残して全てのグルコースを消費する。グリセロール産生は、0.34g/kgである。エタノール産生は、23.06g/kgであり、バイオマス産生は11.5OD600である。これらの結果から、I. orientalisにおけるGPD1対立遺伝子の破壊により、これらの条件下で、グルコース消費量は僅かに低下し、エタノール産生及びバイオマスは僅かに低下することが示される。しかしながら、CD2627株は、良く増殖し、また最低のグリセロール産生を伴いエタノールを良く産生する。これらの結果からさらに、GPD1欠失体の成長能及び、産生能は、PDC活性の破壊に依存せず、またピルビン酸塩からラクタートの経路の付加にも依らないことを示す。
Claims (6)
- 遺伝的に改変して、ジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロールへのネイティブな代謝経路が欠失した又は破壊され、このネイティブな代謝経路の欠失又は破壊として、少なくとも1個のネイティブなグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、若しくは少なくとも1個のネイティブなグリセロール−3−ホスファターゼ遺伝子、又はこれらの両方が欠失した若しくは破壊された、この細胞によって代謝可能な炭素源の存在下の発酵条件下で培養すると生育し、この炭素源の2重量%より少ない部分がこの細胞により消費されてグリセロールへ代謝される、種Pichia galeiformis、Pichia sp. YB-4149 (NRRL 記号表示)、Candida ethanolica、P. deserticola、P. membranifaciens又はP. fermentansの酵母細胞。
- 機能性乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子カセットを持ち、ラクタートを産生する請求項1に記載の細胞。
- ネイティブな代謝経路の欠失又は破壊として、少なくとも1個のネイティブなグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及び少なくとも1個のネイティブなグリセロール−3−ホスファターゼ遺伝子が欠失した又は破壊された請求項2に記載の細胞。
- ネイティブな代謝経路の欠失又は破壊として、少なくとも1個のネイティブなジヒドロキシアセトンホスファターゼ遺伝子が欠失した又は破壊された、ネイティブなグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子が欠失した又は破壊された、又はネイティブなジヒドロキシアセトンホスファターゼ遺伝子及びネイティブなグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の両者が欠失した又は破壊された請求項3に記載の細胞。
- ピルビン酸からエタノールへのネイティブな代謝経路が欠失した又は破壊された請求項2〜4のいずれか一項に記載の細胞。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の細胞を、発酵条件下かつ所望の発酵産物を産生するための炭素源の存在下で、培養することから成る発酵方法であって、グリセロール収量が、この細胞により消費される炭素源に対して2重量%より少ない発酵方法。
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