CN116855424A - 一株抑制解脂耶氏酵母菌的戊糖乳植物杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株抑制解脂耶氏酵母菌的戊糖乳植物杆菌及其应用。该戊糖乳植物杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2022年4月20日；保藏编号为CCTCC NO：M 2022431；分类学命名为戊糖乳杆菌Lactiplantibacillus pentosus L14。其具有明显抑制解脂耶氏酵母Yar.lipolytica生长的作用，将其应用于泡菜发酵中能够强化泡菜风味、促进泡菜发酵过程、降低泡菜中亚硝酸盐含量以及预防或减少泡菜液面生花。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一株抑制解脂耶氏酵母菌的戊糖乳植物杆菌及其应用。
背景技术
泡菜是家喻户晓的佐餐佳肴，其清脆爽口、风味独特、营养丰富，还具有促进消化、降低胆固醇、抗肿瘤等作用。泡菜在自然发酵过程中受氧气和温度的影响较大，一旦发酵条件不适(如温度升高或氧气进入等)，腐败微生物便有机可乘，致使泡菜产生不同程度的腐败。“生花”是常见的泡菜腐败现象，表现为泡菜液面出现白膜、泡菜水浑浊、泡菜质地变软、甚至伴有馊臭味等，造成严重经济损失。有研究表明，解脂耶氏酵母是泡菜膜醭中的主要微生物。
食品工业上使用的抑菌剂多为苯甲酸及其盐类、山梨酸及其盐类等，这些工业抑菌剂对食品本身的风味特征有一定影响，另外，若实际使用浓度超过限制则会造成安全隐患。因此，筛选出能抑制解脂耶氏酵母生长且具有提高风味品质作用的有益菌，将其应用于泡菜发酵中，预防生花现象的产生，从而提高泡菜产品的质量是具有重要意义的。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一株抑制解脂耶氏酵母菌的戊糖乳植物杆菌及其应用。该戊糖乳植物杆菌能够有效抑制解脂耶氏酵母的生长，并且能够预防或减少泡菜液面生花、强化泡菜风味。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一株戊糖乳植物杆菌，命名为L14，已保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2022年4月20日；保藏编号为CCTCC NO：M2022431；分类学命名为戊糖乳杆菌Lactiplantibacillus pentosus L14。
本发明的戊糖乳植物杆菌Lactiplantibacillus pentosus L14(简写为Lb.pentosus L14)从四川省成都市某厂的泡青菜中筛选获得。
其中，Lb.pentosus L14的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。扩增所述Lb.pentosus L14的16S rRNA基因序列的PCR引物为细菌通用引物27F(SEQ ID NO.3)5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’和1492R(SEQ ID NO.4)5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’。
将Lb.pentosus L14接种在MRS固体培养基中生长，其菌落特征为：呈乳白色，圆形，表面光滑，边缘整齐。
第二方面，本发明提供了上述戊糖乳植物杆菌在抑制酵母菌生长中的应用。
在一些实施例中，上述酵母菌包括解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica，简写为Yar.lipolytica)，其为造成泡菜液面生花的主要微生物。
第三方面，本发明提供了上述戊糖乳植物杆菌在强化泡菜风味中的应用。
第四方面，本发明提供了上述戊糖乳植物杆菌在预防或减少泡菜液面生花中的应用。
第五方面，本发明提供了上述戊糖乳植物杆菌在促进泡菜发酵中的应用。
第六方面，本发明提供了上述戊糖乳植物杆菌在降低泡菜中亚硝酸盐含量中的应用。
第七方面，本发明提供了一种含有上述戊糖乳植物杆菌和/或上述戊糖乳植物杆菌的发酵产物的微生物菌剂。
第八方面，本发明提供了一种解脂耶氏酵母抑制剂，该解脂耶氏酵母抑制剂含有上述戊糖乳植物杆菌和/或上述戊糖乳植物杆菌的发酵产物。
在本发明中，上述戊糖乳植物杆菌的发酵产物的制备步骤如下：将上述戊糖乳植物杆菌Lb.pentosus L14接种于MRS液体培养基中，于37℃下震荡培养24-48h；将培养后所得培养液在5000rpm下离心，获得上清液；上清液经0.45μm滤膜过滤，获得无菌发酵产物。
在制备上述微生物菌剂和解脂耶氏酵母抑制剂时，Lb.pentosus L14发酵产物的添加量≥100μL。
第九方面，本发明提供了一种抑制泡菜生花的方法，其包括：将上述戊糖乳植物杆菌Lb.pentosus L14接种于泡菜中，于25℃下密封发酵7天；
上述戊糖乳植物杆菌在泡菜中的活菌数≥106CFU/mL。
本发明具有以下有益效果：
本发明从四川泡青菜中筛选出一株戊糖乳植物杆菌Lb.pentosus L14，该Lb.pentosus L14具有明显抑制解脂耶氏酵母Yar.lipolytica生长的作用，将其应用于泡菜发酵中能够强化泡菜风味、促进泡菜发酵过程、降低泡菜中亚硝酸盐含量以及预防或减少泡菜液面生花。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为戊糖乳植物杆菌Lb.pentosus L14的系统发育树分析；
图2为戊糖乳植物杆菌Lb.pentosus L14及其无菌发酵产物对解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica生长的抑制活性。
图3为戊糖乳植物杆菌Lb.pentosus L14及其无菌发酵产物对解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica生物膜形成的抑制活性。
图4为戊糖乳植物杆菌Lb.pentosus L14对泡菜发酵过程中pH(A)、可滴定酸度(B)和亚硝酸盐(C)的影响。
图5为戊糖乳植物杆菌Lb.pentosus L14对泡菜发酵过程中挥发性风味物质含量的影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉8g/L，酵母提取物4g/L，葡萄糖20g/L，无水山梨醇单油酸酯1ml/L，磷酸氢二钾2g/L，三水醋酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，硫酸镁7H2O0.2g/L，硫酸锰4H2O 0.05g/L。121℃灭菌15分钟。
YPD液体培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。121℃灭菌15分钟。
YPD琼脂培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。121℃灭菌15分钟。
无菌萝卜汁培养基：萝卜300g/L(榨汁机榨成汁)，葡萄糖20g/L。121℃灭菌15分钟。
实施例中各项指标检测方法：泡菜发酵液的pH直接用pH计测定。可滴定酸度参照AOAC Official Method 942.15进行测定。亚硝酸盐含量按照国标《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》(GB 5009.33-2016)中的盐酸萘乙二胺法进行测定。泡菜的挥发性风味物质利用HS-SPME-GC-MS方法进行测定。
以下实施例中采用的解脂耶氏酵母筛选于生花泡菜，解脂耶氏酵母的ITS基因序列如SEQ ID NO.2所示。扩增上述Yar.lipolytica的ITS基因序列的PCR引物为ITS1F(SEQID NO.5)5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4R(SEQ ID NO.6)5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
实施例1
本实施例为菌株的分离与鉴定
筛选培养基：HiCromeTM Lactobacillus Selective Agar Base M2065。
(1)乳杆菌初筛
取20mL泡菜水，用无菌水离心(8000rpm,4℃)洗涤2次，将沉淀重悬至5mL无菌水中。将菌液分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5浓度。每个浓度吸取0.1mL涂布于筛选培养基上，每个浓度涂布3块平板。置于37℃恒温箱中培养3d。利用无菌接种针，挑取初筛培养基中的蓝绿色或蓝色菌落为潜在的乳杆菌，进行进一步验证。
(2)乳杆菌培养液的制备。
将上述挑取的单菌落接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以1％(v/v)的接种量，接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24h，制备得到培养液。
(3)Yar.lipolytica培养液的制备
将Yar.lipolytica接种于YPD液体培养基中，于28℃、160rpm下震荡培养48h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以1％(v/v)的接种量，接种于YPD液体培养基中，于28℃、160rpm下震荡培养48h，制备得到培养液。
(4)乳杆菌对Yar.Lipolytica产膜的抑制实验
1)置有5mL萝卜汁的试管于121℃灭菌20min，冷却后，以2％(v/v)的接种量接种上述步骤(2)制备得到的乳杆菌培养液和上述步骤(3)制备得到的Yar.lipolytica培养液。
2)对照：置有5mL萝卜汁的试管于121℃灭菌20min，冷却后，以2％(v/v)的接种量接种上述步骤(3)制备得到的Yar.lipolytica培养液。
3)将上述试管正放置于30℃恒温培养箱培养36h。
(5)菌株的鉴定
选取对Yar.Lipolytica膜噗抑制效果最好的菌株L14进行测序鉴定。系统发育树参照图1所示。鉴定结果表明，该菌株为Lactiplantibacillus pentosus L14。
实施例2
本实施例为Lb.pentosus L14或其发酵产物抑制解脂耶氏酵母的生长的试验
(1)Lb.pentosus L14培养液及其发酵产物的制备
将Lb.pentosus L14接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以1％(v/v)的接种量，接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24h，制备得到培养液；将制备得到的培养液于5000rpm下离心，获得上清液；上清液经0.45μm滤膜过滤，获得无菌发酵产物。
(2)Yar.lipolytica培养液的制备
将Yar.lipolytica接种于YPD液体培养基中，于28℃、160rpm下震荡培养48h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以1％(v/v)的接种量，接种于YPD液体培养基中，于28℃、160rpm下震荡培养48h，制备得到培养液。
(3)Lb.pentosus L14及其发酵产物的抑菌实验
1)15mL无菌YPD琼脂培养基倾注于培养皿中，待凝固后，取200μL上述步骤(2)制备得到的Yar.lipolytica培养液涂布。
2)在平板上依次摆放3个无菌牛津杯；取100μL上述步骤(1)制备得到的Lb.pentosus L14培养液分别加入到3个无菌牛津杯中。
3)在平板上依次摆放3个无菌牛津杯；取100μL上述步骤(1)制备得到的Lb.pentosus L14无菌发酵产物分别加入到3个无菌牛津杯中。
4)对照：在平板上依次摆放3个无菌牛津杯；取100μL MRS液体培养基分别加入到3个无菌牛津杯中。
5)将上述平板正放置于30℃恒温培养箱培养36h。
通过测量抑菌圈直径验证Lb.pentosus L14及其发酵产物在抑菌活性中的应用，结果如表1及图2所示。
表1Lb.pentosus L14及其发酵产物的抑菌能力
结果显示，采用本发明提供的Lb.pentosus L14或其发酵产物对解脂耶氏酵母的生长具有明显抑制作用。
实施例3
本实施例为Lb.pentosus L14或其发酵产物抑制Yar.lipolytica的生物膜形成的试验
(1)Lb.pentosus L14培养液及其发酵产物的制备
与上述实施例1中采用相同的方法。
(2)Yar.lipolytica培养液的制备
将Yar.lipolytica接种于YPD液体培养基中，于28℃、160rpm下震荡培养48h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以1％(v/v)的接种量，接种于YPD液体培养基中，于28℃、160rpm下震荡培养48h，制备得到培养液。
(3)Lb.pentosus L14及其发酵产物的抑膜实验
1)置有5mL萝卜汁的试管于121℃灭菌20min，冷却后，以2％(v/v)的接种量接种上述步骤(1)制备得到的Lb.pentosus L14培养液和上述步骤(2)制备得到的Yar.lipolytica培养液。
2)置有5mL萝卜汁的试管于121℃灭菌20min，冷却后，以2％(v/v)的接种量接种上述步骤(1)制备得到的Lb.pentosus L14无菌发酵产物和上述步骤(2)制备得到的Yar.lipolytica培养液。
3)对照：置有5mL萝卜汁的试管于121℃灭菌20min，冷却后，以2％(v/v)的接种量接种上述步骤(2)制备得到的Yar.lipolytica培养液。
4)将上述试管正放置于30℃恒温培养箱培养36h。
结果如图3所示，本发明提供的Lb.pentosus L14或其发酵产物对Yar.lipolytica生物膜的形成具有明显抑制作用。
实施例4
本实施例为Lb.pentosus L14在泡菜发酵中的强化应用的试验
(1)Lb.pentosus L14培养液的制备
与上述实施例1中采用相同的方法进行扩培。
(2)泡菜的制备
白萝卜的挑选、整理及清洗→切条入坛→加入冷却食盐水(平衡盐度为3％)→添加大蒜(0.5％)、生姜(1％)和辣椒(1％)→自然发酵(空白对照)、接种Lb.pentosus L14(约106CFU/mL，L14)→盐水封口→25℃发酵7天→成品。
(3)在泡菜发酵过程中的强化应用效果
如图4所示，发酵前期，接种Lb.pentosus L14组的产酸速度明显快于空白对照组，由此可见，接种Lb.pentosus L14有助于促进泡菜发酵代谢产酸，加快泡菜的发酵进程。接种Lb.pentosus L14组和空白对照组的亚硝酸盐含量呈现出相似的变化趋势，表现为在第1天达到峰值然后急剧下降，在发酵的第5天至第7天时则趋于平稳，但两组间亚硝酸盐峰值具有差异：空白对照(10.65mg/kg)>接种Lb.pentosus L14(7.33mg/kg)，表明Lb.pentosusL14有助于降低泡菜中的亚硝酸盐含量。
如图5所示，发酵3天后，接种Lb.pentosus L14组中挥发性化合物(除酸类以外)的总量均高于空白对照组，表明Lb.pentosus L14对于泡菜发酵过程中风味物质生成的贡献较大。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一株戊糖乳植物杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)，其特征在于，所述戊糖乳植物杆菌命名为Lactiplantibacillus pentosus L14，保藏编号为CCTCC NO：M 2022431。
2.如权利要求1所述的戊糖乳植物杆菌在抑制酵母菌生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述酵母菌包括解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
4.如权利要求1所述的戊糖乳植物杆菌在强化泡菜风味中的应用。
5.如权利要求1所述的戊糖乳植物杆菌在预防或减少泡菜液面生花中的应用。
6.如权利要求1所述的戊糖乳植物杆菌在促进泡菜发酵中的应用。
7.如权利要求1所述的戊糖乳植物杆菌在降低泡菜中亚硝酸盐含量中的应用。
8.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有如权利要求1所述的戊糖乳植物杆菌和/或如权利要求1所述的戊糖乳植物杆菌的发酵产物。
9.一种解脂耶氏酵母抑制剂，其特征在于，所述解脂耶氏酵母抑制剂含有权利要求1所述戊糖乳植物杆菌和/或权利要求1所述戊糖乳植物杆菌的发酵产物。
10.一种抑制泡菜生花的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的戊糖乳植物杆菌接种于泡菜中，于25℃下密封发酵7天；
所述戊糖乳植物杆菌在泡菜中的活菌数≥106CFU/mL。
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