WO2018045630A1 - 一种为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统 - Google Patents

一种为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统 Download PDF

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Abstract

一种克鲁维酵母的CRISPR/Cas9安全高效基因编辑系统，包括Cas9/gRNA融合质粒，质粒靶向克鲁维细胞的内源性DNA序列，并产生双链切口；还包括向克鲁维酵母细胞中转化供体DNA序列，该序列在双链切口处与靶位点产生同源重组，将Tag序列插入目标位点。该基因编辑系统能在克鲁维酵母中稳定复制、表达、并进行基因改造。

Description

一种为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统 技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及专为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统及其应用。
背景技术
微生物基因组改造主要依赖于内源性同源重组修复(endogenous homology-directed repair,HDR)和非同源性末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)两种生物学机制[1]。HDR的基本过程为，基因组发生双链断裂(double-strand breaks,DSBs)后，供体DNA(序列与断裂位点两侧序列同源)在断裂位点处与受损基因组序列发生同源重组，实现修复，这一过程不易引入插入或缺失突变[2]。NHEJ的基本过程为，断裂DNA两端直接连接，不借助供体DNA介导的同源重组，这一过程容易产生插入或缺失突变，引起密码子位移[3]。在正常条件下，HDR引起同源重组的概率很低，但是通过内切酶在基因组上产生切口，并向细胞内转化线性的同源DNA片段，可以极大地增加重组效率。而且将内切酶与具有位点识别功能的元件相结合，能实现高效的、特异性的基因组改造。
CRISPR/Cas(Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated)是广泛存在于细菌和古细菌中的一种生物防御系统[4]。其中经过改造的Ⅱ型系统，CRISPR/Cas9，成为现在广泛使用的基因组改造工具[5]。在guide RNA(gRNA)的介导下，Cas9蛋白识别基因组上protospacer adjacent motif(PAM)及其上游20bp序列，并在PAM上游3bp位置产生双链切口。在同时提供供体DNA(donor DNA)的情况下，被CRISPR/Cas9双链切开的基因可以HDR的方式重组入新的序列，以达到基因改造的目的[6]。
在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，利用CRISPR/Cas9系统进行基因组改造的实例很多，包括基因点突变、基因敲除和基因插入等[7-9]。比如，在现有技术中流行的pCAS质粒上同时具有Cas9基因序列及gRNA元件[10]，能够通过一次转化实现在酿酒酵母中的高效基因组改造。
克鲁维酵母(Kluyveromyces)是一种子囊孢子酵母，其中的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)是工业上广泛使用的酵母。例如乳酸克鲁维酵母是一种能够以乳酸作为其唯一的碳源和能源的酵母。与其他酵母相比，乳酸克鲁维酵母具有许多优点，如超强的分泌能力，良好的大规模发酵特性、食品安全的级别及同时具有蛋白翻译后修饰的能力等，其作为宿主系统表达药用蛋白也已显示出巨大的潜力。
然而，目前已有的用于CRISPR/Cas9基因编辑的载体在克鲁维酵母中均不能稳定复制和表达[11]，其中即使是常用于酿酒酵母的质粒也无法令人满意地用于克鲁维酵母的基 因编辑。因此，在目前报道的克鲁维酵母CRISPR/Cas9改造系统中，Cas9基因一直被直接插入到酵母基因组中。但是，这会造成Cas9蛋白的持续表达，对克鲁维酵母的工业生产存在一定安全隐患[12]。
综上所述，本领域迫切需要构建一个能够在克鲁维酵母中稳定复制和表达的高效安全CRISPR/Cas9系统，以便满足生物技术发展需要。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的就是提供了一种专为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统，该高效基因编辑系统不仅使得CRISPR/Cas9能在克鲁维酵母中稳定复制，而且安全高效表达，从而高效安全地完成克鲁维酵母基因组的高效编辑。
在本发明的第一方面，提供了一种适用于克鲁维酵母细胞基因编辑的CRISPR/Cas9系统(包括表达载体或质粒)，其包含下述元件：
(a)用于表达Cas9蛋白的第一表达盒；
(b)用于表达靶向gRNA的第二表达盒、或用于插入所述第二表达盒的多克隆位点；
(c)用于表达筛选标记基因的第三表达盒；和
(d)位于所述第一表达盒上游和/或下游的稳定元件。
在另一优选例中，所述的稳定元件是序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中，所述的第一表达盒的启动子为组成型或诱导型启动子。
在另一优选例中，所述的第一表达盒的启动子选自下组：pScRNR2、pScTEF1、pScPGK1。
在另一优选例中，所述的第二表达盒的启动子为组成型或诱导型启动子。
在另一优选例中，所述的第二表达盒的启动子选自下组：pKlSNR52、pScSNR52、ScTyr tRNA。
在另一优选例中，所述的第三表达盒的启动子为组成型启动子。
在另一优选例中，所述的第三表达盒的启动子选自下组：AmpR启动子。
在另一优选例中，所述的第一表达盒含有全长Cas9蛋白的编码序列。
在另一优选例中，所述的Cas9蛋白编码序列是经密码子优化的。
在另一优选例中，所述的Cas9蛋白编码序列如SEQ ID NO.:4所示。
在另一优选例中，所述的靶向gRNA是靶向克鲁维酵母细胞基因。
在另一优选例中，所述的靶向gRNA的序列如SEQ ID NO.:5所示。
在另一优选例中，所述的筛选标记选自下组：抗生素、荧光蛋白、或其组合。
在另一优选例中，所述的筛选标记基因选自下组：Kan、Amp、Hygro或其组合。
在另一优选例中，所述的表达载体为质粒。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：pKM-CAS1.0、pKM-CAS1.0-TRS1。
在另一优选例中，所述的pKM-CAS1.0-TRS1上各元件依次为pKlSNR52启动子，sgRNA序列，gRNA scaffold序列，AmpR启动子序列，AmpR抗性基因序列，pScRNR2启动子序列，K.lactis密码子优化的Cas9基因序列，SV40NLS序列，8×His序列，CYC1终止子序列，pKD1-SE序列，ori序列，2μori序列。
在本发明的第二方面，提供了一种利用优化的CRISPR/Cas9系统对克鲁维酵母基因组进行改造的方法，包括下述步骤：
a)向所述克鲁维酵母细胞中转化Cas9/gRNA融合质粒，该质粒靶向所述细胞的内源性DNA序列，并产生双链切口；
b)向所述克鲁维酵母细胞中转化供体DNA序列，该序列在双链切口处与靶位点产生同源重组，将Tag序列插入目标位点。
在另一优选例中，所述的克鲁维酵母为乳酸克鲁维酵母。
在另一优选例中，改造的基因为乳酸克鲁维酵母的细胞质苏氨酸氨酰tRNA合成酶Threonyl-tRNAsynthetase(Kl-TRS)基因。先检索Kl-TRS基因序列(http://www.uniprot.org/)，确定gRNA序列。
在另一优选例中，对Kl-TRS基因的改造为在基因末端插入一段长1302碱基对(bp)的标记Tag序列。
在另一优选例中，所述的本发明质粒是通过如下改造而构建的。对原始pCAS质粒进行一系列改造和系统优化，最终使标记Tag可以高效插入克鲁维酵母基因组中，并在克鲁维酵母中稳定遗传和表达。具体改造包括下述步骤：
a)在pCAS质粒中插入pKD1stabilizing element(SE)序列，构建成质粒pKM-Cas9-SE；
b)将pKM-Cas9-SE质粒中gRNA启动子置换为KlSNR52基因启动子，构建成质粒pKM-Cas9-SE-pKlSNR52；
c)将pKM-Cas9-SE-pKlSNR52质粒中Cas9序列替换为适合克鲁维酵母表达的KLCas9，构建成质粒pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52；
d)将pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52质粒中抗性基因Kan置换为Amp，完成质粒的最终改造，命名为pKM-CAS1.0；
e)将靶向Kl-TRS基因的gRNA插入pKM-CAS1.0中，构建成质粒pKM-CAS1.0-TRS1(SEQ ID NO.1)。
在另一优选例中，转化的供体DNA序列为线性双链DNA，该线性双链供体DNA序列包括插入靶位点的Tag序列以及与靶位点两侧序列同源的序列，具体构建与扩增步骤包括下述步骤：
a)以乳酸克鲁维酵母菌液为模板扩增同源臂序列，将同源臂序列插入pMD18质粒中，构建成中间质粒pKM-TRS-DD1；
b)将Tag序列插入pKM-TRS-DD1质粒两同源臂中间位置，构建成最终质粒 pKM-T-DD2；
c)以pKM-TRS-DD2为模板进行PCR扩增，得到线性双链供体DNA(SEQ ID NO.2)。
在另一优选例中，接着通过LiAc/SS carrier DNA/PEG方法将质粒转化进入克鲁维酵母细胞中，包括下述步骤：
a)将pKM-CAS1.0-TRS1质粒和线性供体DNA同时转化进入克鲁维酵母细胞中；
b)涂板后挑取单克隆于1mL液体YPD培养基中振荡培养。
在另一优选例中，本发明涉及一种CRISPR/Cas9质粒，包含与SEQ ID NO.1至少80％序列相同的核苷酸。
在另一优选例中，本发明涉及一种线性双链DNA，包含与SEQ ID NO.2至少80％序列相同的核苷酸。
本发明的第三方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞是克鲁维酵母细胞，并且所述的宿主细胞的基因组中未整合有Cas9蛋白基因，并且所述宿主细胞中含有本发明第一方面所述的克鲁维酵母细胞基因编辑的CRISPR/Cas9系统。
在本发明的第四方面提供了一种克鲁维酵母细胞基因编辑方法，包括步骤：
(i)提供克鲁维酵母细胞；
(ii)将本发明第一方面所述的用于克鲁维酵母细胞基因编辑的CRISPR/Cas9系统和任选的供体DNA导入所述的克鲁维酵母细胞，从而进行定点基因编辑。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示pKM-CAS1.0-TRS1与pCAS质粒转化克鲁维酵母效率对比图，pKM-CAS1.0-TRS1转化克鲁维酵母效率明显高于pCAS质粒的转化效率。
图2显示Kl-TRS基因gRNA位置示意图，其中方框中为PAM序列，加粗序列表示gRNA序列。其中Kl-TRS为乳酸克鲁维酵母细胞质色氨酸氨酰tRNA合成酶(Threonyl-tRNAsynthetase)基因，位于染色体F的567803..570037位点。
图3显示pKM-CAS1.0-TRS1质粒图谱。“promoter”为启动子，“terminator”为终止子；“scaffold”为框架。
图4显示pKM-TRS-DD2质粒图谱。“promoter”为启动子，“homologous arm right”表示右同源臂，“homologous arm left”表示左同源臂。
图5包括图5a和5b，显示基因组插入Tag序列的PCR验证结果图，图5a为琼脂糖 凝胶电泳图，其电泳条带大小为1274bp，阳性率达80％以上，图5b为三次重复试验的误差条形图，三次实验结果误差不明显，表明实验结果相对稳定。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过对各类载体元件(包括启动子元件、ori元件、Tag元件、筛选标记元件、以及其他元件)的大量筛选以及优化，首次构建了一种能够在克鲁维酵母中稳定复制和表达的高效安全CRISPR/Cas9系统。在此基础上，完成了本发明。
术语
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。本文中述及的所有出版物和其他参考文献都通过引用纳入本文。
如本文所用，术语“本发明的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统”、“本发明的基因编辑系统”、“本发明的为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统”、“本发明质粒”、“本发明表达载体”可互换使用，指经优化的、本发明第一方面中所述的基因编辑系统。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。
如本文所用，术语“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统
本发明提供了一种特别适用于克鲁维酵母的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统。所述的基因编辑系统包括质粒、或表达载体。
典型地，本发明基因编辑系统(如质粒)包括包含下述元件：
(a)用于表达Cas9蛋白的第一表达盒，其中；
(b)用于表达靶向gRNA的第二表达盒、或用于插入所述第二表达盒的多克隆位点；
(c)用于表达筛选标记基因的第三表达盒；和
(d)位于所述第一表达盒上游和/或下游的稳定元件。
在本发明的一个优选例中，所述的基因编辑系统是以pCAS质粒为基本骨架，通过引入多个合适元件，其中包括：KlSNR52基因启动子、适合克鲁维酵母表达的KLCas9编码元件、用于进一步提高稳定性的稳定序列元件以及任选的经优化筛选的抗性基因(如Amp)。
一种特别优选的本发明质粒为pKM-CAS1.0。
基于本发明的教导，对于本发明质粒中涉及的各元件(及其相应的核苷酸序列)，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得这些元件。这些方法例如但不限于：PCR，DNA 人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
在本发明的表达载体中，还含有用于基因编辑的gRNA的表达盒，其中，所述的编码gRNA的序列与相应的表达调控序列(如启动子)操作性相连。
本发明的表达载体可含有一个或多个筛选基因，也称作可筛选标记。典型的筛选基因编码蛋白可以(a)抵抗性的抗菌素等；(b)补偿营养缺陷或(c)提供关键的在培养基中没有的营养物质。
本发明的表达载体含有多个驱动基因转录的启动子。用于真核细胞转录的启动子有但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子，反转录病毒启动子，猴病毒40(SV40)前期启动子等；然而，优选的启动子选自下组：KlSNR52基因启动子、pScRNR2、pScTEF1、pScPGK1。
本发明的表达载体另一个特征是含有特定的稳定序列，从而使得其在克鲁维酵母能够进一步提高基因编辑的效率。
在一个优选例中，本发明还提供了一种制备本发明质粒的方法，它包括：对原始CRISPR/Cas9质粒进行的一系列序列改造和系统优化，以便于标记Tag可以高效插入克鲁维酵母基因组中，并在克鲁维酵母中稳定遗传和表达。
在另一优选例中，所述的制备本发明质粒的方法，包括下述步骤：
(a)在pCAS质粒中插入pKD1stabilizing element(SE)序列，构建成质粒pKM-Cas9-SE；
(b)将pKM-Cas9-SE质粒中gRNA启动子置换为KlSNR52基因启动子，构建成质粒pKM-Cas9-SE-pKlSNR2；
(c)将pKM-Cas9-SE-pKlSNR2质粒中Cas9序列替换为适合克鲁维酵母表达的KLCas9，构建成质粒pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52；
(d)将pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52质粒中抗性基因Kan置换为Amp，完成质粒的最终改造，命名为pKM-CAS1.0。
所述的pKM-CAS1.0即可作为工程质粒，用于克鲁维酵母的基因组定点编辑和改造。当插入针对不同基因或位点的gRNA的编码序列后，将形成的质粒导入克鲁维酵母，可高效进行基因编辑。
例如，在一个优选例中，可将靶向Kl-TRS基因的gRNA插入pKM-CAS1.0中，构建成质粒pKM-CAS1.0-TRS1。
在本发明中，将所述表达质粒导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。
基因编辑方法
本发明还提供了一种对克鲁维酵母基因组进行基因编辑的方法。
典型地，本发明方法可对基因组中不含有Cas9表达盒的克鲁维酵母进行高效的CRISPR/Cas9编辑，从而显著提高对这种非常适用于产业的克鲁维酵母的改造效率。
适用于本发明方法的克鲁维酵母没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)。
在一个优选例中，本发明对乳酸克鲁维酵母的细胞质苏氨酸氨酰tRNA合成酶Kl-TRS基因进行了定点基因改造，即在Kl-TRS基因末端插入一段长1302bp的标记Tag序列(或其他供体DNA序列)。
在另一优选例中，转化的供体DNA序列为线性双链DNA，该序列包括插入靶位点的Tag序列以及与靶位点两侧序列同源的序列。制备该供体DNA的方法包括下述步骤：
以乳酸克鲁维酵母菌液为模板扩增同源臂序列，将同源臂序列插入pMD18质粒中，构建成中间质粒pKM-TRS-DD1；
将待引入的片段(如Tag序列)插入pKM-T-DD1质粒两同源臂中间位置，构建成最终质粒pKM-TRS-DD2；
以pKM-TRS-DD2为模板进行PCR扩增，得到线性双链供体DNA。
在另一优选例中，可将最终形成的用于基因编辑的本发明质粒(如pKM-CAS1.0-TRS1质粒)和线性供体DNA，通过常规方法导入克鲁维酵母。例如，通过LiAc/SS carrier DNA/PEG方法将质粒转化进入克鲁维酵母细胞中。
在另一优选例中，将pKM-CAS1.0-TRS1质粒和线性供体DNA同时转化进入克鲁维酵母细胞中；涂板后挑取单克隆，随后进行培养(例如，于1mL液体YPD培养基中振荡培养)。
在本发明中，对于基因编辑的效率，可用常规方法进行检测。例如，通过PCR扩增检测Tag序列插入靶位点效率。在另一优选例中，所述检测包括下述步骤：在Tag序列内设计一条引物，在靶基因上位于同源臂外侧的序列设计一条引物，以单克隆菌液为模板进行PCR扩增，电泳检测阳性的为插入成功。
在另一优选例中，所述线性双链供体DNA应与靶位点的序列有一定的相同性或同源性。例如，至少80％序列相同性。在一个实施例中，所述的供体DNA包含与SEQ IDNO.2至少80％序列相同的核苷酸。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明首次提供了一种在克鲁维酵母中稳定复制和表达的质粒，使得CRISPR/Cas9能在克鲁维酵母中完成稳定、高效、安全的基因编辑的系统；
(b)本发明可以对基因组未插入Cas表达盒的克鲁维酵母进行高效基因编辑，从而显著提高工程菌的安全性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
实施例1—KL-CAS1.0系统改造
pKM-Cas9/gRNA质粒构建
现有技术中，酿酒酵母中使用的pCAS质粒上同时具有Cas9基因序列及gRNA元件，能够通过一次转化实现在酿酒酵母中的高效基因组改造，但是在克鲁维酵母中不能稳定复制和表达，如图1所示。本发明通过改造，构建了一种克鲁维酵母专用的，可以在克鲁维酵母中稳定复制、表达、并进行基因改造的新的安全高效CRISPR/Cas9基因编辑系统，将该基因编辑系统命名为KL-CAS1.0。本发明的克鲁维酵母以乳酸克鲁维酵母为实施例作说明，但不以此为限。
1A.KL-CAS1.0高效pKD1stabilizing element(SE)元件插入
pKD1是克鲁维酵母转化的常用质粒[13]，为了构建一种能在克鲁维酵母中稳定复制并表达的质粒，本发明在pCAS质粒中首先插入pKD1中的SE元件[14]。
pKD1SE元件(SEQ ID NO.3)由上海生工合成(上海，中国)，并以引物pKD1SE-F1:GGACGCTCGAAGCCGCGGTGAGCAAAAG(SEQ ID NO.6)和pKD1SE-R1:CCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCC(SEQ ID NO.7)进行扩增。以pCAS质粒为模板，以引物pCAS-F1:AGGAACCGTAAAAAGGCCG(SEQ ID NO.8)和pCAS-R1:GGCCTTTTGCTGGCCTTT(SEQ ID NO.9)进行扩增。将pCAS扩增产物8.5μL与pKD1SE扩增产物8.5μL混合，加入1μLDpn I，2μL10×digestion buffer，37℃温浴3h。将Dpn I处理后产物10μL加入100μL DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKM-Cas9-SE。
1B.KL-CAS1.0高效gRNA启动子置换
SNR52基因启动子是一种RNA polymerase III(Pol III)启动子，曾用于酿酒酵母CRISPR系统gRNA转录[7，15]。为了保证pKM-Cas9-SE质粒中gRNA在克鲁维酵母中高效转录，本发明第二步将pKM-Cas9-SE质粒中gRNA启动子置换为乳酸克鲁维酵母中SNR52基因的启动子。
以乳酸克鲁维酵母菌液为模板，以引物pKlSNR52-F1:TTATGCTTAAATGCGTATATGTGTTATGTATTGGTGAACCCAATGGGA AA(SEQ ID NO.10)和引物pKlSNR52-R1:AGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCCATCGTTACTTTCTCGGCAGTTCG(SEQ ID NO.11)进行扩增，得到KlSNR52启动子序列(位于染色体F的1157521...1157897位点)。以pKM-Cas9-SE质粒为模板，以引物pKM-Cas9-F1:GATGGCCGGCATGGTCCC(SEQ ID NO.12)和引物pKM-Cas9-R1:TACATAACACATATACGCATTTAAGCATAAACACGCAC(SEQ ID NO.13)进行扩增。将两次扩增产物各8.5μL，1μLDpn I，2μL10×digestion buffer混合，37℃温浴3h。将Dpn I处理后产物10μL加入100μL DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKM-Cas9-SE-pKlSNR52。
1C.KL-CAS1.0中乳酸克鲁维酵母专用Cas9的序列置换
为提高Cas9蛋白在乳酸克鲁维酵母中的活性，本发明将原质粒中Streptococcus pyogenes Cas9基因序列置换为优化过的，适合乳酸克鲁维酵母表达的KLCas9。
KLCas9序列由上海生工合成，并插入在pUC57质粒中。以pUC57-KLCas9质粒为模板，以pKM-Cas9-F1:TTAATACACGTATTTATTTGTCCAATTACCATGGATAAGAAATACTCTATCGGTTTG(SEQ ID NO.14)和引物pKM-Cas9-R1:AACTTTTCTTTTCTTTTTTGGCCCTCCACCATCACCACCTAATTGAGACAAAT(SEQ ID NO.15)进行扩增，得到KLCas9基因产物。以pKM-Cas9-SE-pKlSNR52质粒为模板，以pKM-Cas9-F2:GGTGGAGGGCCAAAAAAGAAAAG(SEQ ID NO.16)和pKL-Cas9-R2:GGTAATTGGACAAATAAATACGTGT(SEQ ID NO.17)进行扩增。将两次扩增产物各8.5μL，1μLDpn I，2μL10×digestion buffer混合，37℃温浴3h。将Dpn I处理后产物10μL加入100μL DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Kan抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52。
1D.KM-CAS1.0质粒抗性基因置换
因为原质粒与供体DNA中的抗性基因都是Kan，为了便于最终阳性克隆的筛选，本发明将原质粒中Kan基因置换为Amp基因。以pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52质粒为模板，以pKM-Cas9-F3:AGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCCTGTCGATTCGATACTAACGCC(SEQ ID NO.18)和pKM-Cas9-R3:TTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGGCTGGCCGGGTGACCCGGCG(SEQ ID NO.19)进行扩增。以pMD18质粒为模板，以Amp-F1:CGCGGAACCCCTATTTGTTT(SEQ ID NO.20)和Amp-R1:GAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGG(SEQ ID NO.21)进行扩增。将两次扩增产物各8.5 μL，1μLDpn I，2μL10×digestion buffer混合，37℃温浴3h。将Dpn I处理后产物10μL加入100μL DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，得到最终改造完成质粒，命名为pKM-CAS1.0。
实施例2—靶基因及gRNA序列确定
2A.乳酸克鲁维酵母靶标基因鉴定
在网站http://www.uniprot.org/进行序列搜索，物种“Kluyveromyceslactis”，关键词“ThreoninetRNAsynthetase”“ThrRS”“TRS”。这里以在此基因尾部插入一段标记DNA为例，其他目标基因或插入位置、序列均可采用类似方法操作。
i.在乳酸克鲁维酵母中存在两种TRS，分别存在于细胞质和线粒体中。检索到蛋白序列以后，在网站https://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.htmL上进行分析，确定检索蛋白存在于细胞质(不含线粒体识别序列，真核同源)还是线粒体(存在线粒体识别序列，原核同源)，挑选细胞质TRS基因(http://www.uniprot.org/uniprot/Q6CL41)作为目标基因,并命名为Kl-TRS。
ii.下载基因序列并在网址http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE-TYPE＝BlastSearch&PROG-DEF＝blastn&BLAST-PROG-DEF＝megaBlast&BLAST-SPEC＝OGP--28985--12363上进行BLAST比对分析，确定基因的染色体定位，并获取基因两端相邻序列信息。
2B.gRNA序列确定
在Kl-TRS基因终止密码子附近搜索PAM序列(NGG)，选择位于终止密码子上游，且最靠近终止密码子的PAM(位于染色体F的570038...570040位点)，并确定Kl-TRSgRNA序列(CTGATAATGTCTTGGCTTAA(SEQ ID NO.5)，位于染色体F的570018...570037位点)，如图2所示。
实施例3—靶序列pKM-Cas9质粒构建
本发明通过PCR-同源重组方法，将原质粒中的gRNA序列置换为Kl-TRSgRNA序列。具体步骤为：以pKM-CAS1.0质粒为模板，以引物pKM-Cas9-TRS-F1:CTTTCTGATAATGTCTTGGCTTAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG(SEQ ID NO.22)和引物pKM-Cas9-TRS-R1:GCTCTAAAACTTAAGCCAAGACATTATCAGAAAGTCCCATTCGCCAC(SEQ ID NO.23)进行扩增。将扩增产物17μL，1μLDpn I，2μL10×digestion buffer混合，37℃温浴3h。将Dpn I处理后产物10μL加入100μL DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆 在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKM-CAS1.0-TRS1，如图3所示。
实施例4—供体DNA质粒构建及线性供体DNA扩增
为了便于线性供体DNA的保存及扩增，本发明首先将供体DNA插入到pMD18质粒中，然后通过PCR扩增得到线性供体DNA序列。具体步骤为：以pMD18质粒为模板，以引物pMD18-F1:ATCGTCGACCTGCAGGCATG(SEQ ID NO.24)和引物pMD18-R1:ATCTCTAGAGGATCCCCGGG(SEQ ID NO.25)进行扩增。以乳酸克鲁维酵母菌液为模板，以引物KLLA-T-LF1:GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTTAATGTTTAAGGCTCGTGAACGTT(SEQ ID NO.26)和引物KLLA-T-RR1:GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTTATCTATGTTTATTGGCACACAAGC(SEQ ID NO.27)进行扩增。将两次扩增产物各8.5μL，1μLDpn I，2μL10×digestion buffer混合，37℃温浴3h。将Dpn I处理后产物10μL加入100μL DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKM-T-DD1。
以pKM-TRS-DD1为模板，以引物Thr-F1:TTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAAGGAATATCCAAACCGATCA(SEQ ID NO.28)和引物Thr-R1:ATTATACCATGTTCCTGTGATACCGGCTTCAGCCAAGACATTATCAGCTC(SEQ ID NO.29)进行扩增。以Tag质粒为模板，以引物Tag-F1:GAAGCCGGTATCACAGGAAC(SEQID NO.30)和引物Tag-R1:TTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG(SEQ ID NO.31)进行扩增。将两次扩增产物各8.5μL，1μLDpn I，2μL10×digestion buffer混合，37℃温浴3h。将Dpn I处理后产物10μL加入100μL DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激45s后，加入1mL LB液体培养基37℃振荡培养1h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取5个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pKM-TRS-DD2，如图4所示。
以pKM-T-DD2质粒为模板，以引物KLLA-T-LF1:GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTTAATGTTTAAGGCTCGTGAACGTT(SEQ ID NO.32)和引物KLLA-T-RR1:GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTTATCTATGTTTATTGGCACACAAGC(SEQ ID NO.33)进行扩增，得到线性供体DNA。
实施例5—优化的乳酸克鲁维酵母感受态制备和转化
本发明基于文献[16]中酵母感受态制备及转化方法，经过优化，应用于乳酸克鲁维酵母。
5A.乳酸克鲁维酵母感受态制备
将乳酸克鲁维酵母菌液在YPD固体培养基上划线并挑取单克隆，于25mL 2×YPD液体培养基中振荡培养过夜，取2mL菌液于50mL液体2×YPD培养基中继续振荡培养2-8h。20℃条件下3000g离心5min收集酵母细胞，加入500μL无菌水重悬，同样条件下离心收集细胞。配制感受态细胞溶液(5％v/v甘油，10％v/v DMSO)并将酵母细胞溶解于500μL该溶液中。分装50μL至1.5mL离心管中，-80℃保存。
5B.乳酸克鲁维酵母感受态转化
将感受态细胞置于37℃融化15-30s，13000g离心2min并去除上清。配制转化缓冲液：PEG 3350(50％(w/v))260μL，LiAc(1.0M)36μL，carrier DNA(5.0mg/mL)20μL，Cas9/gRNA质粒15μL，供体DNA 5μL，加入无菌水至最终体积360μL。热激后，13000g离心30s去除上清。加入1mL YPD液体培养基，培养2-3h，吸取200μL涂布于固体YPD(200μg/mL G418)培养基，培养2-3天至单菌落出现。
实施例6—乳酸克鲁维酵母基因组插入Tag序列检测
在乳酸克鲁维酵母转化后的平板上挑取10-20个单克隆，置于1mL YPD(200μg/mL G418)液体培养基中振荡培养过夜，以菌液为模板，以引物Tag-R2(Tag序列内引物):ACATACGAGCCTTCAGCATTACCAC(SEQ ID NO.34)和引物Thr-F2(供体DNA 5’外侧引物):CACGGTACCAGAATTTACAACACT(SEQ ID NO.35)进行PCR扩增检测，有阳性条带表明Tag序列插入靶位点成功，如图5a所示。同时图5b为三次重复试验的误差条形图，三次实验结果误差不明显，表明实验结果相对稳定。
SEQ ID NO.1：(原始序列)
Figure PCTCN2016105520-appb-000001
Figure PCTCN2016105520-appb-000002
Figure PCTCN2016105520-appb-000003
SEQ ID NO.2：(原始序列)
Figure PCTCN2016105520-appb-000004
Figure PCTCN2016105520-appb-000005
SEQ ID NO.3(原始序列)
Figure PCTCN2016105520-appb-000006
SEQ ID NO.4
Figure PCTCN2016105520-appb-000007
Figure PCTCN2016105520-appb-000008
SEQ ID NO.5:
Figure PCTCN2016105520-appb-000009
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (18)

  1. 一种利用优化的CRISPR/Cas9系统对克鲁维酵母基因组进行改造的方法，包括下述步骤：
    a)向所述克鲁维酵母细胞中转化Cas9/gRNA融合质粒，该质粒靶向所述克鲁维酵母细胞的内源性DNA序列，并产生双链切口；
    b)向所述克鲁维酵母细胞中转化供体DNA序列，该序列在双链切口处与靶位点产生同源重组，将Tag序列插入目标位点。
  2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克鲁维酵母是一种乳酸克鲁维酵母。
  3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，改造的基因为乳酸克鲁维酵母的细胞质苏氨酸氨酰tRNA合成酶Kl-TRS基因。
  4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，对Kl-TRS基因的改造为在基因末端插入一段长1302bp的标记Tag序列。
  5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，对原始CRISPR/Cas9质粒进行的一系列序列改造和系统优化，最终使标记Tag可以高效插入克鲁维酵母基因组中，并在克鲁维酵母中稳定遗传和表达，包括下述步骤：
    a)在pCAS质粒中插入pKD1stabilizing element(SE)序列，构建成质粒pKM-Cas9-SE；
    b)将pKM-Cas9-SE质粒中gRNA启动子置换为KlSNR52基因启动子，构建成质粒pKM-Cas9-SE-pKlSNR2；
    c)将pKM-Cas9-SE-pKlSNR2质粒中Cas9序列替换为适合克鲁维酵母表达的KLCas9，构建成质粒pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52；
    d)将pKM-KLCas9-SE-pKlSNR52质粒中抗性基因Kan置换为Amp，完成质粒的最终改造，命名为pKM-CAS1.0；
    e)将靶向Kl-TRS基因的gRNA插入pKM-CAS1.0中，构建成质粒pKM-CAS1.0-TRS1。
  6. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，转化的供体DNA序列为线性双链DNA，该序列包括插入靶位点的Tag序列以及与靶位点两侧序列同源的序列，包括下述步骤：
    a)以乳酸克鲁维酵母菌液为模板扩增同源臂序列，将同源臂序列插入pMD18质粒中，构建成中间质粒pKM-TRS-DD1；
    b)将Tag序列插入pKM-T-DD1质粒两同源臂中间位置，构建成最终质粒pKM-TRS-DD2；
    c)以pKM-TRS-DD2为模板进行PCR扩增，得到线性双链供体DNA。
  7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过LiAc/SS carrier DNA/PEG方 法将质粒转化进入克鲁维酵母细胞中，包括下述步骤：
    a)将pKM-CAS1.0-TRS1质粒和线性供体DNA同时转化进入克鲁维酵母细胞中；
    b)涂板后挑取单克隆于1mL液体YPD培养基中振荡培养。
  8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过PCR扩增检测Tag序列插入靶位点效率，包括下述步骤：在Tag序列内设计一条引物，在靶基因上位于同源臂外侧的序列设计一条引物，以单克隆菌液为模板进行PCR扩增，电泳检测阳性的为插入成功。
  9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，线性双链供体DNA包含与SEQIDNO.2至少80％序列相同的核苷酸。
  10. 一种CRISPR/Cas9质粒，其特征在于，其包含与SEQ ID NO.1至少80％序列相同的核苷酸。
  11. 一种适用于克鲁维酵母细胞基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述的系统为表达载体，其包含下述元件：
    (a)用于表达Cas9蛋白的第一表达盒；
    (b)用于表达靶向gRNA的第二表达盒、或用于插入所述第二表达盒的多克隆位点；
    (c)用于表达筛选标记基因的第三表达盒；和
    (d)位于所述第一表达盒上游和/或下游的稳定元件。
  12. 如权利要求11所述的系统，其特征在于，所述的稳定元件是序列如SEQ IDNO.:3所示。
  13. 如权利要求11所述的系统，其特征在于，所述的Cas9蛋白为KLCas9蛋白。
  14. 如权利要求11所述的系统，其特征在于，所述的第一表达盒的启动子选自下组：pScRNR2、pScTEF1、pScPGK1。
  15. 如权利要求11所述的系统，其特征在于，第二表达盒的启动子选自下组：pKlSNR52、pScSNR52、ScTyr tRNA。
  16. 一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是克鲁维酵母细胞，并且所述的宿主细胞的基因组中未整合有Cas9蛋白基因，并且所述宿主细胞中含有权利要求11所述的克鲁维酵母细胞基因编辑的CRISPR/Cas9系统。
  17. 如权利要求16所述的宿主细胞，其特征在于，所述的克鲁维酵母选自下组：马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)。
  18. 一种克鲁维酵母细胞基因编辑方法，其特征在于，包括步骤：
    (i)提供克鲁维酵母细胞；
    (ii)将权利要求11所述的用于克鲁维酵母细胞基因编辑的CRISPR/Cas9系统和任选的供体DNA导入所述的克鲁维酵母细胞，从而进行定点基因编辑。
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